BRPI0708654A2 - pró-fármacos melhorados de análogos de cc-1065 - Google Patents

Abstract

PRó-FáRMACOS MELHORADOS DE ANáLOGOS DE CC-1065. A presente invenção refere-se a prá-fármacos de análogos do antibiótico antitumoral CC-1 065 tendo um grupo protetor clivável contendo um ácido sulfónico contendo carbamato de fenila, no qual o grupo de proteção confere uma solubilidade em água melhorada em relação ao pró-fármaco, e no qual o pró-fármaco também tem uma porção, tal como um sulfeto ou um dissulfeto, que pode se conjugar a um reagente de aglutinação celular, tal como um anticorpo. O uso terapêutico de tal conjugado de pró-fármaco também é descrito; tais pró-fármacos de agentes citotóxicos possuem uso terapêutico porque podem liberar os pró-fármacos citotóxicos em uma população específica de células para a conversão enzimática no fármaco citotóxico de um modo especificamente destinado.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PRÓFÁRMACOS MELHORADOS DE ANÁLOGOS DE CC-1065".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a novos pró-fármacos de agentescitotóxicos e os seus usos terapêuticos. Mais especificamente, a invençãorefere-se a novos pró-fármacos de agentes citotóxica que são os análogosda CC-1065 e compreendendo tanto uma porção da ligação química a umagente de aglutinação celular como um grupo de proteção que é clivado invivo. Os pró-fármacos podem ser quimicamente ligados aos agentes de a-glutinação celular para fornecer reagentes terapêuticos capazes de ser ati-vados e liberados in vivo, e entregue a populações de célula específicas emuma maneira visada.

Antecedentes da Invenção

Muitos relatórios apareceram que são dirigidos ao apontamentode células de tumor com o fármaco do anticorpo monoclonal conjuga {Selaet al, in Immunoconjugates, pp. 189-216 (C. Vogel, ed. 1987); Ghose et al, inTargeted Drugs, pp. 1-22 (E. Goldberg, ed. 1983); Diener et al, in AntibodyMediated Deiivery Systems, pp. 1-23 (J. Rodwell, ed. 1988); Pietersz et al, inAntibody Mediated Delivery Systems, pp. 25-53 (J. Rodwell, ed. 1988); Bu-mol et al, in Antibody Mediated Deiivery Systems, pp. 55-79 (J. Rodwell, ed.1988); G.A. Pietersz & K.Krauer, 2 J. Drug Targeting, 183-215 (1994); R. V.J. Chari, 31 Adv. Drug Deiivery Revs., 89-104 (1998); WA Blattler & R.V.J.Chari, in Anticancer Agents, Frontiers in Câncer Chemotherapy, 317-338,ACS Symposium Series 796; and I. Ojima et al eds, American Chemical So-ciety 2001}. Os fármacos de Citotóxico, tais como metotrexato, daunorubicin,doxorrubicina, vincristina, vinblastine, melphalan, mitomycin C, chlorambucil,calicheamicin e maytansinoids foram conjugados a vários anticorpos mono-clonais murino. Em alguns casos, as moléculas de fármaco foram ligadas àsmoléculas de anticorpo por uma molécula de veículo intermediária, tais comoalbumina de soro {Garnett et al, 46 Câncer Res. 2407-2412 (1986); Ohkawaet al, 23 Câncer Immunol. Immunother. 81-86 (1986); Endo et al, 47 CâncerRes. 1076-1080 (1980)}, dextran {Hurwitz et al, 2 Appl Biochem. 25-35(1980); Manabi et al, 34 Biochem. Pharmacol. 289-291 (1985); Dillman et al,46 Câncer Res. 4886-4891 (1986); e Shoval et al, 85 Proc. Nati Acad. Sei.U.S.A. 8276-8280 (1988)}, ou Polyglutamic Acid {Tsukada et al, 73 J. NatLCane. Inst 721-729 (1984); Kato et al, 27 J. Med. Chem. 1602-1607 (1984);Tsukada et al, 52 Br. J. Câncer 111-116(1985)}.

Uma ampla faixa de Iigantes está disponível agora para a prepa-ração de tais imunoconjugados, incluindo tanto Iigantes cliváveis quanto não-cliváveis. Os testes de citotoxilogia in vitro, entretanto, revelaram que os con-jugados anticorpo-fármaco raramente atingem a mesma potência citotóxicaque os fármacos não-conjugados livres. Isto sugeriu que os mecanismospelos quais as moléculas do fármaco são liberados dos anticorpos conjuga-dos são muito ineficientes. Os trabalhos iniciais na área de imonutoxinasmostraram que os conjugados formados via pontes de dissulfeto entre osanticorpos monoclonais e as toxinas das proteínas cataliticamente ativadasforam mais citotóxicos do que os conjugados contendo outros Iigantes {Lam-bert et al, 260 J. Biol. Chem. 12035-12041 (1985); Lambert et al, em Immu-notoxins 175-209 (A. Frankel, ed. 1988); Ghetie et al, 48 Câncer Res. 2610-2617 (1988)}. Essa citotoxicidade melhorada foi atribuída à alta concentra-ção intracelular de glutationa reduzida contribuindo para a clivagem eficienteda ligação dissulfeto entre a molécula de anticorpo e a toxina. Os maitansi-nóides e a caliqueamicina foram os primeiros exemplos de fármacos alta-mente citotóxicos que foram ligados a anticorpos monoclonais via ligaçõesdissulfeto. Os conjugados de anticorpos destes fármacos mostraram possuiruma alta potência in vitro e uma excepcional atividade antitumoral nos mode-Ios de xenoenxerto de tumor humano em camundongos {R. V. J. Chari et al.,52 Câncer Res., 127-131 (1992); C. Liu et al., 93, Proc. Natl. Acad. ScL,8618-8623 (1996); LM. Hinman et al., 53, Cancer Res., 3536-3542 (1993); eP.R. Hamann et al, 13, BioConjugate Chem., 40-46 (2002)}.

Um candidato atraente para a preparação de tais conjugadosdocitotóxico é o CC-1065, que é um potente antibiótico antitumor isolado a par-tir da cultura de Streptomyces zelensis. O CC-1065 é aproximadamente1000 vezes mais potente in vitro do que o são os fármacos anticâncer co-mumente usados, tais como doxorrubicina, metotrexato e vincristina {B.K.Bhuyan et al., Câncer Res., 42, 3532-3537 (1982)}.

A estrutura da CC-1065 (Composto 1, figura 1A) foi determinadapela cristalografia de raios X {Martin, D. G. et al, 33 J. Antibiotics 902-903(1980), e Chidéster, C. G., et al, 103 J. Am. Chem. Soe. 7629-7635 (1981)}.

A molécula de CC-1065 consiste em 3 porções de pirroloindol substituídasligadas por ligações amida. A subunidade "A" tem um anel de ciclopropilacontendo o único carbono assimétrico na molécula. Embora somente a con-figuração relativa deste carbono esteja disponível a partir dos dados de raiosX, a configuração absoluta foi inferida como 3b-fí 4a-S, usando DNA comoum reagente quiral {Hurley, L. H. et al, 226 Science 843-844 (1984)}. As su-bunidades "B" e "C" da CC-1065 são porções pirroloindol idênticas.

A potência citotóxica da CC-1065 foi correlacionada com a suaatividade de alquilação e a sua atividade de ligação com o DNA ou de inter-calação do DNA. Estas duas atividades residem em partes separadas damolécula. Assim, a atividade de alquilação está contida na subunidade ciclo-propanopirroloindol (CPI) e a atividade de ligação com o DNA reside em du-as subunidades pirroloindol (figura 1A).

Entretanto, embora o CC-1065 tenha certas características atra-tivas como um agente citotóxico, tem limitações no uso terapêutico. A admi-nistração de CC-1065 a camundongos causou elevação de hepatotoxicidadetardia levando à mortalidade no dia 50 depois de uma dose intravenosa úni-ca de 12,5 pg/kg {V. L. Reynolds et al., J. Antibiotics, XXIX, 319-334 (1986)}.

Isto incentivou esforços para desenvolver compostos análogos que não cau-sassem toxicidade tardia, e foi descrita a síntese de análogos mais simplesmodelados sobre o CC-1065 {M.A. Warpehoski et al., J. Med. Chem., 31,590-603 (1988)}. Em outra série de análogos, a porção CPI foi substituídapor uma porção ciclopropanobenzenindol (CBI) {D.L Boger et al., J. Org.Chem., 55, 5823-5833, (1990), D.L. Boger et al., BioOrg. Med. Chem. Lett, 1,115-120 (1991)}. Esses compostos mantêm a elevada potência in vitro dofármaco parental, sem causar a toxicidade tardia em camundongos. Domesmo modo que o CC-1065, esses compostos são agentes de alquilaçãoque se ligam à ranhuras menores do DNA de um modo covalente capaz decausar a morte da célula. Entretanto, a avaliação clínica dos análogos maispromissores, adolesina e carzelesina, levou a resultados decepcionantes{B.F. Foster et al., Investigational New Drugs, 13, 321-326 (1996); I. Wolff etal., Clin. Câncer Res., 2, 1717-1723 (1996)}. Estes fármacos expõem pobresefeitos terapêuticos por causa de suas elevadas toxicidades sistêmicas.

A eficácia terapêutica dos análogos da CC-1065 pode ser muitomelhorada pela modificação da distribuição in vivo através da liberação dire-cionada ao sítio do tumor, resultando em uma toxicidade mais baixa para ostecidos não visados, e assim, a uma toxicidade sistêmica mais baixa. Paraatingir esta meta, foram descritos os conjugados dos análogos e dos deriva-dos da CC-1065 com os agentes de aglutinação celular que são especifica-mente direcionados para células de tumor {Patentes Americanas N9 US5.475.092; US 5.585.499; US 5.846.545}. Esses conjugados exibem tipica-mente uma elevada citotoxicidade direcionada específica in vitro, e uma ex-cepcional atividade antitumoral nos modelos de xenoenxerto de tumor hu-mano em camundongos {R.V. J. Chari et al., Câncer Res., 55, 4079-4084(1995)}. Os agentes de aglutinação celular são tipicamente solúveis somenteem meio aquoso, e são normalmente guardados em soluções aquosas. As-sim, esses análogos devem possuir uma solubilidade em água suficientepara levar em conta uma reação eficiente com agentes de aglutinação celu-lar e a subseqüente formulação na solução aquosa. Além disso, para que osagentes conjugados de ligação celular tenham uma vida útil de armazena-mento, é importante que os análogos da CC-1065 que estejam ligados a es-ses agentes de aglutinação celular sejam estáveis por um longo período detempo em soluções aquosas.

Os análogos da CC-1065 até aqui descritos (vide, por exemplo,figuras 1B e 1C) são somente ligeiramente solúveis em água. Por causa dabaixa solubilidade dos análogos da CC-1065, as reações de conjugação comagentes de aglutinação celular atualmente devem ser realizadas em soluçõesaquosas extremamente diluídas. Por isso, estes pró-fármacos devem ter umanelhor solubilidade em água em c omparação com os fármacos parentais.Do mesmo modo, os análogos da CC-1065 que foram descritosaté aqui são bastante instáveis em soluções aquosas pelas razões que seseguem. A forma "seco" do fármaco é espontaneamente convertida na formaciclopropila, que então pode alquilar o DNA, caso o mesmo esteja presente.

Entretanto, a reação competitiva da forma ciclopropil com a água resulta naabertura do anel de ciclopropil para produzir o composto hidróxi, que é inati-vo. Assim, existe a necessidade de proteger a porção reativa dos análogosda CC-1065 de modo a estender a sua vida útil em solução aquosa, por e-xemplo, através do desenvolvimento de pró-fármacos dos análogos da CC-1065. Há, por isso, uma necessidade de desenvolver pró-fármacos dos aná-logos da CC-1065 que são muito estáveis durante o armazenamento emsoluções aquosas. Preferivelmente, estes pró-fármacos só devem ser con-vertidos em fármacos ativos in vivo. Uma vez que o pró-fármaco for infundi-do em um paciente, ela deve ser preferivelmente eficientemente convertidono fármaco ativo.

A carzelesina é um pró-fármaco em que o grupo fenólico daadolesina está protegido como um carbamato de fenila {L.H. Li et al., CâncerRes., 52, 4904-4913 (1992)}. Entretanto, esta pró-fármaco é muito instávelpara uso terapêutico, e também não permite nenhum aumento na solubilida-de em água em comparação com o fármaco parental. Em um segundo e-xemplo, o resíduo fenólico de um análogo CC-1065 foi glicosado para pro-duzir um pró-fármaco (Patente Americana US 5.646.298). Entretanto, estapró-fármaco não é convertido no fármaco ativo in vivo, e necessita da admi-nistração adicional de uma enzima de uma fonte bacteriana par ser converti-da na forma citotóxica.

Existem poucos exemplos de fármacos de anticâncer, não-relacionadas com o CC-1065, que foram convertidos em pró-fármacos solú-veis em água. No fármaco anticâncer irinotecano, o grupo fenólico é protegi-do por um carbamato de 4-piperidino-piperidino. Foi informado que este gru-po de proteção confere ao fármaco solubilidade em água. Além disso, o pró-fármaco é prontamente convertido in vivo ao fármaco ativo nos seres huma-nos, presumivelmente pela enzima carboxilesterase, que naturalmente existeno soro humano, no tecido de tumor e em alguns órgãos {A. Sparreboom, 4,CHn. Câncer Res., 2747-2754 (1998). L. P. Rivory et al., 52, Biochem Phar-macol., 1103-1111 (1996)}.

Similarmente, o fármaco anticâncer de fosfato de etoposídio éum exemplo de um pró-fármaco possuindo um grupo de proteção fosfatoque é rapidamente convertido no fármaco ativo in vivo, presumivelmente pe-la hidrólise por fosfatase alcalina endógena {S.Z. Fields et al., 1 Clin. CâncerRes., 105-111 (1995)}.

Recentemente R.Y. Zhao et al. (Patente Americana US6.756.397 B2) descrevem uma primeira classe de pró-fármacos solúveis emágua dos análogos da CC-1065 compreendendo substituintes carbamatosou fosfatos no anel fenólico da porção de alquilação da molécula. Os presen-tes inventores descobriram que a solubilidade de compostos contendo essestipos de substituintes pode ser pouco satisfatória sob condições fisiológicas.Além disso, esses compostos podem necessitar a ação de agentes específi-cos, tais como as fosfatases para sua conversão na forma biologicamenteativa. Há, por isso, uma necessidade geral de análogos da CC-1065 queaumentem a solubilidade na solução aquosa e/ou que possam ser pronta-mente solúveis em condições fisiológicas. Adicionalmente, é altamente dese-jável facilitar a sua conjugação aos agentes de aglutinação celular em solu-ções aquosas, conservando a sua atividade biológica. Além disso, para re-duzir os efeitos tóxicos colaterais, seria vantajoso fornecer o análogo CC-1065 na forma de um pró-fármaco que seja convertido no fármaco citotóxicopredominantemente no sítio terapêutico desejado e preferivelmente pela hi-drólise espontânea em pH fisiológico. Todas estas vantagens e outras maissão fornecidas pela invenção aqui descrita, tal como será evidenciado parauma pessoa versada na técnica pela leitura das seguintes descrições e e-xemplos.

Sumário da Invenção

O objetivo da presente invenção é fornecer pró-fármacos dosanálogos da CC-1065, que melhoram a solubilidade no meio aquoso. Esse eoutros objetivos foram atingidos fornecende pró-fármacos nas quais o grupofenólico da porção de alquilação da molécula é protegido por uma funciona-lidade que fornece um fármaco estável durante o armazenamento em solu-ção aquosa ácida. Além disso, o grupo de proteção confere uma solubilidadeaumentada em água ao fármaco em comparação com um análogo despro-tegido. O grupo de proteção é prontamente clivado in vivo em um pH fisioló-gico para produzir o fármaco ativo correspondente. Nos pró-fármacos aquidescritas, o substituinte fenólico é protegido como um ácido sulfônico con-tendo carbamato de fenila possuindo uma carga elétrica em um pH fisiológi-co, melhorando assim a solubilidade em água. Para melhorar também a so-lubilidade em água, um espaçador opcional de polietileno glicol pode ser in-troduzido no Iigante entre a subunidade indolil e a ligação clivável, tal comoum grupo dissulfeto. A introdução deste espaçador não altera a potência dofármaco.

Uma modalidade mais específica da invenção fornece um pró-fármaco compreendendo um análogo de um fármaco citotóxica contendoseco-ciclopropanobenzenoindol possuindo um grupo de proteção, que me-lhora a solubilidade e a estabilidade em água e que pode ser clivado in vivoem um pH fisiológico. o pró-fármaco dessa modalidade específica tem umaprimeira subunidade e uma segunda subunidade que estão ligadas por umaligação amida a partir do grupo amina secundária da porção pirrol da primei-ra subunidade para a carboxila C-2 da segunda subunidade. A primeira su-bunidade é mostrada como a fórmula (I), e está conjugada na segunda su-bunidade, que é selecionada entre as fórmulas (ll)-(XI):<formula>formula see original document page 9</formula><formula>formula see original document page 10</formula>

ou os seus sais, hidratos, ou sais hidratados farmaceuticamenteaceitáveis ou as estruturas cristalinas polimorfas desses compostos ou osseus isômeros óticos, racematos, diastereoisômeros ou enanciômeros,

Em que:

Y representa um grupo de saída selecionado de, mas não Iimi-tado a, um haleto (fluoreto, cloreto, brometo ou iodeto), metano sulfonato,para-toluenossulfonato, trifluorometano sulfonato, mononitro ou dinitro feno-lato. Preferivelmente o grupo de saída é um cloreto ou um brometo.

R, R', Ri a R6 são cada um independentemente hidrogênio, al-quil(Ci-C3) linear, metóxi, hidroxila, amina primária, amina secundária, aminaterciária, ou amida ou um Iigante que promove a ligação do pró-fármaco aum agente de aglutinação celular, onde tal ligação é preferivelmente via umaligação sulfeto ou uma ligação dissulfeto, e com a condição de que pelo me-nos um entre R, R', Ri a R6 seja um ligante. Preferivelmente, R é um ligante.O ligante pode compreender um espaçador de polietileno glicol.

R7 é o grupo de proteção que pode ser clivado in vivo e melhoraa solubilidade em água do fármaco citotóxico contendo o ciclopropanoben-zenoindol, e é um ácido sulfônico contendo carbamato de fenila. R7 tem afórmula geral XII:

<formula>formula see original document page 11</formula>

em que R9 é H ou um alquil(CrC4) linear ou ramificado. R10, R11,R12, R13 são idênticos ou diferentes com pelo menos um sendo um grupo -X-S03"M+ com M+ sendo H+ ou o cátion derivado de um átomo do grupo IA, talcomo Na+, K+, etc, e X sendo uma ligação direta ou um espaçador escolhidode uma molécula de hidrocarboneto de C1 a C4 linear ou ramificada, do tipoalquila, alquenila ou alquinila, um -O-alquila-, um -S-alquila- e uma amino-alquil e os outros R-io, R11, R12, R13 sendo H, um alquil(CrC4) linear ou rami-ficado, -O-alquila, -S-alquila, hidroxila, amina primária, amina secundária, ouamida, haleto, nitro, azida.

De acordo com uma modalidade preferida, o pró-fármaco dapresente invenção está de acordo com a fórmula:em que Y, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 e R são definidos tal comoacima e onde R é um Iigante tal como aqui definido ou os seus sais, hidra-tos, ou sais hidratados, farmaceuticamente aceitáveis ou as estruturas crista-linas polimorfas desses compostos ou os seus isômeros óticos, racematos,diastereoisômeros ou enanciômeros.

Preferivelmente, o dito pró-fármaco é escolhido do grupo consis-tindo em:

(S)-N-[2-{(1 -clorometil)-1,2-diidro-5-[(3-hidroxissulfonilfenil) ami-nocarbonilóxi]-3H-benzenoindolil-3}carbonil]-1H-indolil-5]-5-[(3-metilditiopro-panoil)-amino]-1 H-indol-2-carboxamida;

(S)-N-[2-{(1-clorometil)-1,2-diidro-5-[(3-hidroxissulfonilfenil)-ami-nocarbonilóxi]-3H-benzenoindolil-3}carbonil]-1H-indolil-5]-5-[(3-mercapto-propanoil)-amino]-1 H-indol-2-carboxamida;

(S)-N-[2-{(1 -clorometil)-1,2-diidro-5-[(3-hidroxissulfonilmetil-fenil)aminocarbonilóxi]-3H-benzenoindolil-3}carbonil]-1 H-indolil-5]-5-{[3-(2-piridilditio)-propanoil]-amino}-1 H-indol-2-carboxamida;

(S)-N-[2-{(1 -clorometil)-1,2-diidro-5-[(3-hidroxissulfonilmetil-fenil)aminocarbonil-óxi]-3H-benzenoindolil-3}carbonil]-1H-indolil-5]-5-[(3-mercapto-propanoil)-amino]-1H-indol-2-carboxamida;

(S)-N-[2-{(1 -clorometil)-1,2-diidro-5-[(3-hidroxissulfonilmetil-fenil)aminocarbonilóxi]-3H-benzenoindolil-3}carbonil]-1H-indolil-5]-5-[(3-mercaptopropanoil)-amino]-1 H-indol-2-carboxamida;

ou os seus sais, hidratos, ou sais hidratados, farmaceuticamen-te aceitáveis ou as estruturas cristalinas polimorfas desses compostos ou osseus isômeros óticos, racematos, diastereoisômeros ou enanciômeros.

De acordo com outra modalidade preferida, o pró-fármaco estáde acordo com a fórmula:<formula>formula see original document page 13</formula>

em que Y, R1l R2l R3, FU, Rs, Re, R7 e R são definidos tal comoacima e onde R é um Iigante tal como definido acima, ou os seus sais, hidra-tos, ou sais hidratados, farmaceuticamente aceitáveis ou as estruturas crista-linas polimorfas desses compostos ou os seus isômeros óticos, racematos,diastereoisômeros ou enanciômeros.

Preferivelmente1 o dito pró-fármaco é escolhido do grupo consis-tindo em:

ácido (S)-3-((1-(clorometil)-3-(5-(3-mercaptopropanamida)-1H-indol-2-carbonil)-2,3-diidro-1H-benzenoindolilóxi-5)carbonilamino) benzenos-sulfônico;

ácido (S)-3-((1-(clorometil)-3-(5-(3-(metildissulfanil) propanami-da)-1H-indol-2-carbonil)-2,3-diidro-1H-benzenoindolilóxi-5)carbonilamino)benzenossulfônico;

ou os seus sais, hidratos, ou sais hidratados, farmaceuticamenteaceitáveis ou as estruturas cristalinas polimorfas desses compostos ou osseus isômeros óticos, racematos, diastereoisômeros ou enanciômeros.

Os pró-fármacos de acordo com a invenção podem ser usadosem conjugados citotóxicos nos quais um agente de aglutinação celular é li-gado a um ou vários pró-fármacos de acordo com a presente invenção porum grupo ligante.

O dito grupo ligante compreende o dito ligante tal como acimadefinido ligado a uma função reativa através de um tiol, um sulfeto ou umdissulfeto do agente de aglutinação ceiuiar.

Os agentes de aglutinação celular incluem anticorpos e frag-mentos dos mesmos, interferons, linfocinas, vitaminas, hormônios e fatoresde crescimento. Também são fornecidas as composições farmacêuticas con-tendo tais conjugados.

O conjugado citotóxico pode ser usado em um método para tra-tar um paciente pela administração de uma quantidade eficaz da composi-ção farmacêutica acima mencionada. De acordo com o tipo de célula ao qualse liga o agente de aglutinação celular selecionado, muitas doenças podemser tratadas ou in vivo, ou ex vivo, ou in vitro. Tais doenças incluem, por e-xemplo, o tratamento de muitos tipos de cânceres, incluindo linfomas, Ieu-cemias, câncer do pulmão, da mama, do cólon, da próstata, dos rins, dopâncreas, e similares.

Assim, são fornecidos pró-fármacos dos análogos da CC-1065que melhoram a solubilidade e a estabilidade em solução aquosa, e queconservam a citotoxicidade quando ativadas para produzir um fármaco dealquilação, e que são úteis no direcionamento a tipos específicos de célulapor meio da conjugação a um agente de aglutinação celular específico.

Breve Descrição das Figuras

A figura 1A mostra a estrutura da CC-1065 e as suas subunida-des A, B, e C.

A figura 1B e a figura 1C mostram as estruturas de dois análo-gos conhecidos da CC-1065.

A figura 1D mostra a preparação do intermediário DC1 SMe (videtambém a Patente Americana US 6534660 B1).

A figura 2 mostra as estruturas de exemplo dos análogos e pró-fármacos da CC-1065 de acordo com a presente invenção.

A figura 3 mostra as estruturas de exemplo dos pró-fármacoscontendo polietileno glicol de acordo com a presente invenção.

As figuras 4A, e 4C são esquemas de síntese para o preparo de(S)-N-[2-{(1 -clorometil)-1,2-diidro-5-[(3-hidroxissulfonilfenil) aminocarboniló-xi]-3H-benzenoindolil-3}carbonil]-1H-indolil-5]-5-[(3-metilditiopropanoil)-ami-no]-1 H-indol-2-carboxamida (DC07SMe); (S)-N-[2-{(1-clorometil)-1,2-diidro-5-[(3-hidroxissulfonilfenil)-aminocarbonilóxi]-3H-benzenoindolil-3}carbonil]-1 H-indolil-5]-5-[(3-mercapto-propanoil)-amino]-1 H-indol-2-carboxamida (DC07);(S)-N-[2-{(1-clorometil)-1,2-diidro-5-[(3-hidroxissulfonilmetil-fenil)aminocarbo-nilóxi]-3H-benzenoindolil-3}carbonil]-1 H-indolil-5]-5-{[3-(2-piridilditio)-propa-noil]-amino}-1H-indol-2-carboxamida (DC08SPy); e (S)-N-[2-{(1-clorometil)-1,2-diidro-5-[(3-hidroxissulfonilmetil-fenil)aminocarbonilóxi]-3H-benzenomlil-3}carbonil]-1 H-indolil-5]-5-[(3-mercapto-propanoil)-amino]-1 H-indol-2-car-boxamida (DC08); ácido (S)-3-((1-(clorometil)-3-(5-(3-(metildissulfanil)pro-panamida)-1H-indol-2-carbonil)-2,3-diidro-1H-benzenoindolilóxi-5)carbonil-amino)benzenossulfônico (DC101SMe); ácido (S)-3-((1-(clorometil)-3-(5-(3-mercaptopropanamida)-1H-indol-2-carbonil)-2,3-diidro-1H-benzenoindolilóxi-5)carbonilamino) benzenossulfônico (DC107).

A figura 5 mostra o esquema que representa o processo de ati-vação/inativação das fármacos em um pH fisiológico.

A figura 6 mostra os dados de citotoxicidade in vitro da DC07-SMe e da DCI-SMe através das células RAMOS e das células HL60, comuma exposição de 5 dias.

A figura 7 mostra os dados de citotoxicidade in vitro da DCI-SPye DC07-SPy através das células RAMOS e das células HL60.

A figura 8 mostra os dados de citotoxicidade in vitro da DC08-SPy através das células RAMOS e das células Namalwa.

A figura 9 mostra os dados de citotoxicidade in vitro de DC101-SMe e DC107-SMe através das células RAMOS e das células HL-60.

A figura 10 mostra os dados de citotoxicidade in vitro da MY9-6-DC07 (ligação dissulfeto) através das células KARA e RAMOS.

A figura 11 mostra os dados de citotoxicidade in vitro dahuC242-DC07 (ligação tioéter) através das células COL0205 e A-375.

Descrição Detalhada da Invenção

Os presentes inventores descobriram que a estabilidade, a solu-bilidade em água e a utilidade de certos análogos da CC-1065 são melhora-das pela proteção da porção de alquilação do análogo com um grupo de pro-teção conveniente. Os inventores forneceram desse mode pró-fármacos dosanálogos da CC-1065 possuindo solubilidade aquosa melhorada e que sãocapazes também de ligação com os agentes de aglutinação celular atravésdos quais a eficácia terapêutica de tais pró-fármacos dos análogos da CC-1065 é melhorada pela modificação da distribuição in vivo através da libera-ção direcionada do pró-fármaco no sítio do tumor, resultando em uma toxici-dade mais baixa para os tecidos não-direcionados, e assim uma toxicidadesistêmica mais baixa. O pH fisiológico substancialmente converte o pró-fármaco na sua forma ativa do fármaco, e, nas modalidades possuindo umIigante clivável ao agente de aglutinação celular, é liberada a forma ativa dofármaco do análogo da CC-1065, aumentando assim adicionalmente da suaatividade citotóxica. Alternativamente, o Iigante do agente de aglutinaçãocelular pode ser primeiro clivado dentro da célula de destino para liberar opró-fármaco, seguida pela conversão endógena na forma do fármaco ativo.

Para atingir esta meta, os inventores sintetizaram pró-fármacosde exemplo (Figuras 2 a 4B) dos análogos da CC-1065 que são pró-fármacos citotóxicos contendo seco-ciclopropanobenzenoindol (CBI) com-preendendo: (a) uma primeira subunidade de acordo com a fórmula (I) que éprotegida na hidroxila fenólica por um grupo de proteção para melhorar asolubilidade em água e que é clivado in vivo em um pH fisiológico, e (b) umasegunda subunidade possuindo a estrutura representada por uma das fór-mulas de (II) a (XI) e compreendendo um Iigante para a conjugação do pró-fármaco a um agente de aglutinação celular. O Iigante pode conter um espa-çador de polietileno glicol (Figura 3). A remoção do grupo de proteção dopró-fármaco produz uma forma ativa do fármaco que conserva a elevadacitotoxicidade do fármaco parental. O Iigante é usado para a conjugação aosagentes de aglutinação celular, preferivelmente compreendendo uma ligaçãodissulfeto ou uma ligação sulfeto (ou aqui denominado tioéter).

Foi mostrado anteriormente que a ligação de fármacos altamen-te citotóxicas a anticorpos usando uma conexão clivável, tais como uma li-gação dissulfeto, assegura a liberação do fármaco totalmente ativo dentro dacélula, e que tais conjugados são citotóxicos de um modo específico para oantígeno {R. V. J. Chari et al, 52 Câncer Res. 127-131 (1992); R.V.J. Chariet al., 55 Câncer Res. 4079- 4084 (1995); e Patentes Americanas N9.5.208.020 e 5.475.092}. Na presente invenção, os inventores descrevem asíntese de pró-fármacos dos análogos da CC-1065, os procedimentos parasua conjugação a anticorpos monoclonais e os procedimentos para a medi-ção in vitro da citotoxicidade e a especificidade de tais conjugados. Assim apresente invenção fornece compostos úteis para a preparação de agentesterapêuticos direcionados à eliminação de células doentes ou anormais quedevem ser mortas ou lisadas, tal como as células de tumor, as células infec-tadas por vírus, as células infectadas por microorganismos, as células infec-tadas por parasita, células autoimunes (células que produzem autoanticor-pos), as células ativadas (aquelas envolvidas em rejeição de enxertos ou nadoença enxerto versus hospedeiro), ou qualquer outro tipo de células doen-tes ou anormais, expondo efeitos colaterais mínimos.

Assim, esta invenção ensina à síntese de análogos do pró-fármaco e os derivados da CC-1065 que pode estar quimicamente ligado aum agente de aglutinação celular e isto mantém, quando da liberação dogrupo protetor, a elevada citotoxicidade do composto de origem CC-1065.

Além disso, quando da ativação, esses compostos quando ligados a um a-gente de aglutinação celular são citotóxicos para as células nas quais o a-gente de aglutinação celular se liga e é muito menos tóxico para as célulasnão destinadas.

Pró-fármacos da Presente Invenção

Os pró-fármacos de acordo com a presente invenção compre-endem um análogo da CC-1065 no qual o grupo fenólico da porção de alqui-lação da molécula é protegido e o pró-fármaco, também compreende umIigante capaz de conjugar o pró-fármaco a um agente de aglutinação celular,o pró-fármaco pode compreender uma primeira e uma segunda subunidadesque estão ligadas via uma ligação amida.

De acordo com certas modalidades da presente invenção, o pró-fármaco do análogo da CC-1065 tem uma primeira subunidade que é umaseco-CBI(unidade ciclopropanobenzenoindol) na sua forma halometil aberta,em que a primeira subunidade tem uma hidroxila fenólica que é protegidopor um grupo de proteção solúvel em água que pode ser clivado in vivo.

A segunda subunidade do pró-fármaco de certas modalidades da presenteinvenção compreende um análogo da subunidade B ou das subunidadescombinadas B e C da CC-1065 (Figura 1) que são derivados ou do2-carbóxi-indol ou do 2-carbóxi-benzofurano, ou de ambos, e são represen-tados pelas fórmulas de (II) à (XI). Como pode ser apurado a partir da CC-1065 natural e das propriedades dos análogos que foram publicados {porexemplo, Warpehoski et al, 31 J. Med. Chem. 590-603 (1988), Boger et al,66 J. Org. Chem. 6654-6661 (2001)}, as subunidades BeC também podemcompreender outros heterociclos ou heterociclos substituído e assim, podemtransportar substituintes diferente em posições diferentes nos anéis indol ebenzofurano, correspondente a posições de Ri a R6 das fórmulas (II) a (XI),e ainda conservar a atividade citotóxica potente.

Para ligar o pró-fármaco do análogo da CC-1065 a um agentede aglutinação celular, o pró-fármaco deve incluir primeiro uma porção quepermita aos derivados serem ligados a um agente de aglutinação celular viauma ligação, tal como uma ligação dissulfeto, uma ligação sulfeto (ou aquidenominada tioéter), um grupo ácido lábil, um grupo foto lábil, um grupo pep-tidase lábil, ou um grupo esterase lábil. Os análogos do pró-fármaco sãopreparados para que eles contenham uma porção necessária para ligar oanálogo a um agente de aglutinação celular via, por exemplo, uma ligaçãodissulfeto, uma ligação tioéter, um grupo ácido lábil, um grupo foto lábil, umgrupo peptidase lábil, ou um grupo esterase lábil. Para melhorar adicional-mente a solubilidade em soluções aquosas, o Iigante pode conter um espa-çador de polietileno glicol (Figura 3).

Preferivelmente, é usada uma ligação dissulfeto porque o ambi-ente redutor da célula visada resulta em clivagem do dissulfeto e liberaçãodo pró-fármaco (ou do fármaco, dependendo da seqüência relativa da cliva-gem do pró-fármaco do agente de aglutinação celular e da hidrólise do grupode proteção), com um aumento associado da citotoxicidade.

Mais especificamente, de acordo com qualquer umas modalida-des da presente invenção, o pró-fármaco de um análogo da CC-1065 com-preende a primeira e a segunda subunidades que são covalentemente liga-das via uma ligação amida do grupo amina secundária da porção pirrol daprimeira subunidade ao grupo carbóxi C-2 da segunda subunidade possuin-do as fórmulas de (II) a (XI).

Dentro de fórmulas de (II) a (XI), o Iigante permite a ligação dopró-fármaco de um análogo da CC-1065 a um agente de aglutinação celular.

O Iigante pode conter um espaçador de polietileno glicol. Os exemplos inclu-em porções que permitem ligações via a ligação dissulfeto, uma ligação tioé-ter, um grupo ácido lábil, um grupo foto lábil, um grupo peptidase lábil, ou umgrupo esterase lábil, e são bem-conhecidas na técnica {vide, por exemplo,Patente Americana N9 US 5.846.545, que é aqui incorporada pela referên-cia}. As porções preferidas são aquelas que permitem a ligação via uma Ii-gação dissulfeto, por exemplo um tiol (DC1, DC07, DC08) ou um dissulfeto(DCI-SMe, dC07-os SMe, DC08SPy, vide as Figuras 2 a 4B). Dissulfetosmisto contendo qualquer grupo de partida terminal, tal como tiometil (DCI-SMe, DC07-SMe), DC08SPy, glutationa, alquil tiol, piridiltio, aril tiol, nitropiri-diltio, hidroxicarbonil piridiltio, (nitro) hidroxicarbonil piridiltio, e similares po-dem ser usados contanto que tais dissulfetos sejam capazes de sofrer umareação de troca de dissulfeto na ligação do pró-fármaco com um agente deaglutinação celular. O Iigante pode compreender opcionalmente adicional-mente uma região de espaçador interposta entre o grupo reativo da porçãoque permite a ligação e o 2-carbóxi-indol ou porção derivada 2-carbóxi-benzofurano.

Preferivelmente, o dito Iigante está de acordo com a fórmula:

-G-D-(Z)p-S-Z';

onde:

O G é uma ligação simples ou dupla, -O-, -S- ou -NT-;

O D é uma ligação simples ou -E, -E-NT-, -E-NT-F-, -Ε-O-, -E-O-F-, -E-NT-CO-, -E-NT-CO-F-, -Ε-CO-, -CO-E-, -E-CO-F, -E-S-, -E-S-F-, -E-NT-C-S-, -E-NT-CS-F-;

onde T é H ou um alquil(CrC6) linear ou ramificado;

onde EeF são os mesmos ou diferentes e são independente-mente escolhidos de moléculas lineares ou ramificadas do tipo -(OCH2)i.alquil(0-CH2CH2)j-, -alquil-(0-CH2CH2)ralquila-, -(O-CH2CH2)i-, -(0-CH2CH2)i-Cicloalquil-(O-CH2CH2)j-, -(O-CHsCHsJi-heterocíclicoíO-CHaCHs)j, -(O-CH2CH2)i-aril(0-CH2CH2)j-, -(O-CH^Haíi-heteroaril(O-CHgCH)j-, -alquil-(0-CH2CH2)ralquil-(0-CH2CH2)j-, -alquil-(0-CH2CH2)r, -alquil-(0-CH2CH2)rcicloalquil-(0-CH2CH2))-, -alquil-(0-CH2CH2)i-heterocíclico(0-CH2CH2)r, -alquil-(0-CH2CH2)i-aril(0-CH2CH2)j-, -alquil(0-CH2CH2)rheteroaril(0-CH2CH2)r, -ciclo-alquil-alquila-, -alquil-cicloalquila-, -heterocíclico-alquila-, -alquil-heterocí-clico-, -alquil-aril-, -aril-alquila-, -alquil-heteroaril-, -heteroaril-alquila-;

onde i e j, são números inteiros idênticos ou diferentes e inde-pendentemente escolhidos de O, 1 a 2.000;

Z é -alquila- linear ou ramificado;

ρ é 0 ou 1;

Z' representa H, um grupo protetor tiol tal como COR, R20 ouSR2o, em que R20 representa H, metila, alquila, opcionalmente cicloalquila,arila, heteroarila ou heterocíclico substituídos.

As seguintes modalidades ou quaisquer combinações das mesmas são preferidas:

- G é uma ligação simples ou -NT-;

- G é -NT-;

- D é -CO-E-;

- E é um -alquila- linear ou ramificado;

- ρ é 0;

- Z' é H ou SR2O, em que R20 representa alquila ou heteroarila;

As modalidades preferidas do ligante incluem

(CH2)PNHCO(CH2)mSZ, (CH2)pNHCOC6H4(CH2)mSZ, (CH2)pO(CH2)mSZ,(CH2)pNHCO(CH2)m(O-CH2CH2)nSZ, (CH2)PNHC0C6H4(CH2)m(0-CH2CH2)nSZ,(CH2)pO(CH2)m(O-CH2CH2)nSZ, (CH2)pNHCO(CH2)mCH(Me)SZ, (CH2)p-NHCOC6H4(CH2)mCH(Me)SZ1 (CH2)p(CH2)mCH(Me)SZ1 (CH2)PNHC0(CH2)m(0-CH2CH2)nCH(Me)SZ, (CH2)PNHCOC6H4(CH2)m(O-CH2CH2)nCH(Me)SZ, (CH2)p-O(CH2)m(O-CH2CH2)nCH(Me)SZ1 (CH2)pNHCO(CH2)mC(Me)2SZ1 (CH2)p-NHCOC6H4(CH2)mC(Me)2SZ, (CH2)pO(CH2)mC(Me)2SZ, (CH2)pNHCO(CH2)m.(O-CH2CH2)nC(Me)2SZ, (CH2)pNHCOC6H4(CH2)m(O-CH2CH2)nC(Me)2SZ,(CH2)pO(CH2)m(O-CH2CH2)nC(Me2)SZ, (CH2)pOC6H4(CH2)mSZ1 (CH2)pOC6H4-(CH2)mCH(Me)SZ1 (CH2)POC6H4(CH2)m(O-CH2CH2)nCHMeSZ, (CH2)pOC6H4-(CH2)mCMe2SZ ou (CH2)pOC6H4(CH2)m(O-CH2CH2)nC(Me)2SZ, em que o Zrepresenta H, um grupo protetor tiol, tal como Ac, R8 ou SR8, em que R8 re-presenta metila, alquila linear, alquila ramificada, alquila cíclica, arila simplesou substituído ou heterocíclico, e m representa um número inteiro de O a 10,η representa um número inteiro de O até 2.000, ρ representa um número in-teiro de Oa 10.

Os exemplos de alquila linear representados por R8 incluem me-tila, etila, propila, butila, pentila e hexila. Os exemplos de alquila ramificadarepresentado por R8 incluem isopropila, isobutila, sec-butila, terc.-butila, iso-pentila e 1-etil-propila. Os exemplos de alquila cíclica representada por R8incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila e cicloexila. Os exemplos de ari-la simples representados por R8 incluem fenila e naftila. Os exemplos de ari-la substituída representado por R8 incluem arila, tal como fenila ou naftilasubstituída com grupos alquila, com o halogênio, tal como Cl, Br, F, gruposnitro, grupos amino, grupos ácidos sulfônico, grupos ácidos carboxílicos,grupos hidróxi e grupos alcóxi. Heterocíclicos representados por R8 sãocompostos em que: os heteroátomos são selecionados de O, N, e S, e osexemplos incluem furila, pirrollila, piridila, (por exemplo, um grupo pirimidinasubstituído na posição 2) e tiofeno.

As modalidades mais preferidas de Iigante incluem(CH2)PNHCO(CH2)2SH, (CH2)pNHCO(CH2)2C(Me)2SH, (CH2)pNHCO(CH2)2SSCH3,(CH2)pNHCO(CH2)2(O-CH2CH2)rSH, (CH2)pNHCO(CH2)2(O-CH2CH2)nC(Me)2SSCH3e (CH2)pNHCO(CH2)2(O-CH2CH2)nSSMe.

Dentro das fórmulas de (II) a (XI), R, R', R1 a R6, quem pode seros mesmos ou diferentes, independentemente representam o hidrogênio,alquil(CrC3) linear, metóxi, hidroxila, amina primária, amina secundária, a-mina terciária, ou amida ou um ligante, contanto que pelo menos um de R,R', Ri a R6 seja um ligante. Preferivelmente, o R é um ligante. Os exemplosdo substituinte contendo um grupo amina primária são metil amino, etil ami-no, e isopropil amino. Os exemplos do substituinte contendo um grupo aminasecundária são dimetil amino, dietil amino, e etil-propil amino. Os exemplosde grupos amida incluem N-metil-acetamida, N-metil-propionamida, N-acetamida, e N-propionamida.

Dentro de fórmulas de (II) a (XI), R7 está um grupo protetor cli-vável in vivo que melhora a solubilidade em água do fármaco citotóxico con-tendo o do seco-ciclopropanobenzenoindol, em que: o dito grupo pode serescolhido do sulfônico contendo carbamato de fenila de acordo com a fórmu-la geral XII:

<formula>formula see original document page 22</formula>

onde R9 é H ou um alquil(Ci-C4) linear ou ramificado. Ri0, Rn,R12 R13 são idênticos ou diferentes com pelo menos um sendo o grupo -X-S03"M+ com o M+ sendo H+ ou o cátion derivado de um átomo do grupo IA,tal como Na+, K+, etc. e X sendo uma ligação direta ou um espaçador esco-lhido de uma molécula de hidrocarboneto de C1 a C4 linear ou ramificada,do tipo alquila, alquenila ou alquinila, -O-alquila-, -S-alquila- e aminoalquila eoutro R10, R-11, R12 ou R13 sendo H, um alquil(Ci-C6) linear ou ramificado, -Ο-alquila, -S-alquila, hidroxila, amina primária, amina secundária, ou amida,haleto, nitro, azida.

Os exemplos de alquila linear representada por R9, R10, R11, R12ou R13 incluem o metila, etila, propila, butila, pentila e hexila.

Os exemplos de alquila ramificada representada por R9, R10,R11, R12 ou R13 incluem isopropila, isobutila, sec-butila, terc-butila, isopentilae 1-etil-propila. Os exemplos de alquila cíclica representado por R9, R10, Rn,R12 ou R13 incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila e cicloexila.

Assim, carbamatos de fenila contendo sulfônico resultam em se-rem cliváveis pela hidrólise em um pH fisiológico que ocorre em soro e plasma.

Os pró-fármacos dos análogos da CC-10650 contendo sulfetoou dissulfeto e contendo mercapto de acordo com a presente invenção po-dem ser avaliados in vitro quanto às suas capacidades de suprimir a prolife-ração de várias linhagens celulares não-desejadas sob as condições de in-cubação. As linhagens celulares tais como, por exemplo, a linhagem dascélulas RAMOS e HL60 podem ser facilmente usadas para a avaliação dacitotoxicidade desses compostos. As células a serem avaliadas podem serexpostas aos compostos durante 24 horas e as frações de sobrevivência dascélulas podem ser medidas em ensaios diretos por métodos conhecidos. Osvalores de IC5o podem então ser calculados dos resultados dos ensaios.

Tal como aqui utilizado, a expressão "ligável a um agente de a-glutinação celular" se refere aos pró-fármacos análogos da CC-1065 com-preendendo pelo menos um ligante, ou um precursor da mesma, convenien-te para ligar os ditos derivados a um agente de aglutinação celular; os Iigan-tes preferidos contêm ligações tiol, sulfeto ou dissulfeto, ou precursores dasmesmas.

Tal como aqui utilizado, a expressão "ligada a um agente de a-glutinação celular" se refere à molécula conjugada compreendendo pelomenos um pró-fármaco análogo da CC-1065 ligada a um agente de agluti-nação celular via um ligante conveniente, ou um precursor da mesma; Iigan-tes preferidos contêm ligações tiol, sulfeto ou dissulfeto, ou precursores dasmesmas.

A expressão "agente de aglutinação celular" aqui incluído tam-bém inclui os agentes de aglutinação celular modificados, em que o dito a-gente de aglutinação celular é modificado por um agente de modificação pa-ra melhorar a reatividade do dito agente de aglutinação celular através defunções reativas, por exemplo, mercapto, sulfeto ou ligações dissulfeto doligante do pró-fármaco análoga da CC-1065. Os ditos reagentes de modifi-cação incluem N-sulfossuccinimidil-4-(5-nitro-2-piridilditio) butanoato(SSNPB), succinimidil 4-[N-maleimidometil] cicloexano-1-carboxilato(SMCC), éster N-hidroxissuccinimida do ácido 4-(2-piridilditio) butanóico(SPDB), e similares tal como aqui discutido.

Tal como aqui utilizado, o termo "análogo" se refere a um com-posto compreendendo uma forma quimicamente modificada de um compos-to específico ou de uma classe do mesmo, e que mantém a característica deatividades farmacêutica e/ou farmacológica do dito composto ou classe.

Tal como aqui utilizado, o termo "paciente" se refere a um ani-mal, tal como um animal de procriação, de companhia ou com objetivos depreservação, ou preferivelmente um ser humano ou uma criança humana,que sofra de, ou tenha o potencial para sofrer de uma ou das várias doençase condições aqui descritas.

Tal como aqui utilizado, "uma quantidade terapeuticamente efi-caz" se refere a uma quantidade de um composto de acordo com a presenteinvenção que é eficaz na prevenção, redução, eliminação, tratamento oucontrole dos sintomas das doenças e condições aqui descritas. O termo"controle" tem como objetivo se referir a todos os processos em que possahaver uma redução da velocidade, a suspensão, detenção, ou paralisaçãoda progressão das doenças e condições aqui descritas, mas não necessari-amente indica uma eliminação total de todos os sintomas das condições edoenças, e é destinado a incluir o tratamento profilático.

Tal como aqui utilizado, o termo "farmaceuticamente aceitável"se refere àqueles compostos, materiais, excipientes, composições ou formasde dosagem que estão, dentro dos limites do juízo médico sólido, que é a-dequado para o contato com os tecidos de seres humanos e animais semexcessivas toxicidade, irritação, resposta alérgica ou outras complicaçõescom problema mensuráveis em uma proporção razoável de benefício/risco.

Tal como aqui utilizado, o temo "sais farmaceuticamente aceitá-veis" se refere a derivados dos compostos descritos em que o composto deorigem é modificado fazendo sais ácidos ou básicos dos mesmos. Os saisfarmaceuticamente aceitáveis incluem os sais não-tóxicos convencionais ouos sais de amônio quaternário do composto de origem formado, por exem-plo, de ácidos inorgânicos ou orgânicos não-tóxicos. Por exemplo, tais saisnão-tóxicos convencionais incluem os derivados de ácidos inorgânicos talcomo clorídrico, hidrobromídrico, sulfúrico, sulfâmico, fosfórico, nítrico e simi-lares; e os sais preparados de ácidos orgânicos tal como acético, propiônico,succínico, tartárico, cítrico, metano sulfônico, benzenossulfônico, glucorôni-co, glutâmico, benzóico, salicílico, toluenossulfônico, oxálico, fumárico, male-ico, láctico e similares. Os sais de adição também incluem sais de amônio,tais como trometamina, meglumina, epolamina, etc., sais metálicos, tais co-mo sódio, potássio, cálcio, zinco ou magnésio.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis de acordo com a presenteinvenção podem ser sintetizados do composto de origem contendo uma por-ção básica ou ácida por métodos químicos convencionais. Geralmente, taissais podem ser preparados reagindo o ácido livre ou formas básicas dessescompostos com uma quantidade estequiométrica adequada da base ou áci-do em água ou em um solvente orgânico, ou em uma mistura dos dois. Ge-ralmente, os meios não-aquosos como éter, acetato de etila, etanol, isopro-panol, ou acetonitrila são preferidos. As listas de sais convenientes são en-contradas no Remington1S Pharmaceutical Sciences, 178 ed., Mack Publi-shing Company, Easton, PA, 1985, p. 1418, a divulgação do qual sendo aquiincorporada pela referência.

De acordo ainda com um objetivo adicional, a presente invençãotambém se refere ao processo para a preparação dos compostos da inven-ção.

Os compostos e o processo de acordo com a presente invençãopodem ser preparados por diversos modos bem-conhecidos aos versadosna técnica. Os compostos podem ser sintetizados, por exemplo, por aplica-ção ou adaptação dos métodos descritos abaixo, ou variações dos mesmostal como pode ser apreciado pelo técnico versado. As modificações e assubstituições adequadas serão prontamente evidentes e bem-conhecidas ouprontamente obteníveis da literatura científica para os versados na técnica.

Particularmente, tais métodos podem ser encontrados no R.C.Larock, Comprehensive Organic Transformations, WiIey-VCH Publishers,1999.

Será apreciado que os compostos de acordo com a presente in-venção podem conter um ou mais átomos de carbono assimetricamentesubstituídos, e podem ser isolados em oticamente ativos ou formas racêmi-cas. Assim, todas as formas quirais, diastereoisoméricas, racêmicas e todasas formas de isoméricas geométricas de estrutura são envolvidas, a menosque uma determinada forma isomérica ou estereoquímica seja especifica-mente indicada. É bem-conhecido na técnica como preparar e isolar taisformas oticamente ativas. Por exemplo, as misturas de estereoisômeros po-dem ser separadas por técnicas-padrão incluindo, mas não limitadas a, aresolução de formas racêmicas, normais e quiral por cromatografia de faseinversa, pela formação do sal da forma preferida, pela recristalização, e simi-lares, ou pela síntese quiral de materiais de partida quiral ou pela síntesedeliberada dos centros quirais direcionados.

Os compostos de acordo com a presente invenção podem serpreparados por várias vias sintéticas.

Compostos da presente invenção podem ser preparados poruma variedade de rotas sintéticas.

Os reagentes e os materiais de partida estão comercialmentedisponíveis, ou prontamente sintetizados por técnicas bem-conhecidas poruma pessoa com habilidade normal na técnica. Todos os substituintes, amenos que de outra maneira não indicado, são tal como anteriormente defi-nidos.

Nas reações descritas daqui por diante, pode ser necessárioproteger grupos funcionais reativos, por exemplo, grupos hidróxi, amino, imi-no, tio ou carbóxi, onde esses são desejados no produto final, para evitar asua participação não desejada nas reações. Os grupos de proteção conven-cionais podem ser usados conforme a prática padrão, vide or exemplo, T.W.Greene e P. G. M. Wuts em Protective Groups in Organic Chemistry, 3a ed.,John Wiley and Sons, 1999; J. F. W. McOmie em Protective Groups in Orga-nic Chemistry, Plenum Press, 1973.

Algumas reações podem ser realizadas na presença de umabase. Não há nenhuma determinada restrição na natureza da base a serusada nesta reação, e qualquer base convencionalmente usada em reaçõesdeste tipo pode ser igualmente usada aqui, contanto que ela não tenha ne-nhum efeito contrário sobre outras partes da molécula. Os exemplos de ba-ses convenientes incluem: hidróxido de sódio, carbonato de potássio, trieti-lamina, hidretos de metal alcalino, tal como hidreto de sódio e hidreto de po-tássio; compostos de alquil lítio, tais como metil lítio e butil lítio; e alcóxidosde metais alcalinos, tal como metóxido de sódio e etóxido sódio.

Normalmente, as reações são realizadas em um solvente ade-quado. Vários solventes podem ser usados, contanto que eles não tenhamnenhum efeito contrário sobre a reação ou sobre os reagentes envolvidas.

Exemplos de solventes convenientes incluem: os hidrocarbonetos, que po-dem ser aromático, alifático ou hidrocarboneto cicloalifático, tal como hexa-no, cicloexano, benzeno, tolueno e xileno; amidas, tal como dimetilformami-da; álcoois, tal como etanol e metanol e éteres, tais como éter dietílico e te-traidrofurano.

Ás reações podem ser realizadas dentro de uma ampla faixa detemperaturas. Em geral, se considera conveniente realizar a reação em umatemperatura de de 0°C a 15°C (mais preferivelmente, da temperatura ambi-ente a 100°C). O tempo necessário para a reação também pode variar am-piamente, dependendo de muitos fatores, notavelmente da temperatura dareação e da natureza dos reagentes. Entretanto, contanto que a reação sejaefetuada sob as condições preferidas acima delineadas, um período de 3horas a 20 horas será normalmente suficiente.

O composto assim preparado pode ser recuperado da misturareacional por meios convencionais. Por exemplo, os compostos podem serrecuperados destilando o solvente da mistura reacional ou, se necessário,depois da destilação do solvente da mistura reacional, vertendo o resíduoem água seguido pela extração com um solvente orgânico imiscível na águae destilando do solvente do extrato. Adicionalmente, o produto, se desejado,pode ser adicionalmente purificado por várias técnicas bem-conhecidas, taiscomo recristalização, reprecipitação ou várias técnicas de cromatografia,notavelmente por coluna de cromatografia ou por crometografia preparativaem camada fina.

O processo para a preparação de um composto de acordo coma fórmula da invenção é também um objetivo de acordo com a presente invenção.

O processo para a preparação dos compostos de acordo com afórmula compreende a etapa de proteção do grupo fenólico da porção dealquilação do análogo correspondente da CC-1065 por um ácido sulfônicocontendo a função de carbamato. Esta reação pode ser realizada pela apli-cação ou adaptação dos métodos para proteção dos grupos OH com umafunção de carbamato divulgada em T.W. Greene e P. G. M. Wuts no Protee-tive Groups in Organic Chemistry, 3a ed., John Wiley and Sons, 1999 ou J. F.W. McOmie no Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, 1973.

Geralmente, esta reação é realizada com CDI/DMA e o derivadoaminofenilsulfonato correspondente de acordo com a fórmula:

<formula>formula see original document page 28</formula>

O processo pode incluir uma etapa adicional de isolamento doproduto obtido.

Preparação dos Agentes de aglutinação Celular.

Os compostos do pró-fármaco de acordo com a presente inven-ção podem ser usados conjugados com um agente de aglutinação celularcomo agentes terapêuticos eficazes. Os agentes de aglutinação celular po-dem ser de qualquer tipo conhecido, ou que se torne conhecida, e inclui pep-tídios e não-peptídios. Geralmente, esses podem ser anticorpos (especial-mente anticorpos monoclonais) ou um fragmento de um anticorpo contendopelo menos um sítio de ligação, linfocinas, hormônios, fatores de crescimen-to, moléculas de transporte de nutrientes (tais como transferrina), ou qual-quer outra molécula ou substância de ligação celular.

Os exemplos mais específicos dos agentes de aglutinação celu-lar que podem ser usados incluem:

- anticorpos monoclonais;

- anticorpos de cadeia simples;- fragmentos de anticorpos, tais como Fab1 Fab1 F(ab')2 e Fv{Parham, 131 J. Immunol. 2895-2902 (1983); Spring et al, 113 J. Immunol.470-478 (1974); Nisonoff et al, 89 Arch. Biochem. Biophys. 230-244 (1960)};

- interferons;

- peptídios;

- linfocinas, tal como IL-2, IL-3, IL-4, IL-6;

- hormônios, tais como insulina, TRH (hormônios de liberação datirotropina), MSH (hormônio estimulante de melanócito), hormônios ésterói-des, tais como androgênios e estrogênios;

- fatores de crescimento e fatores estimuladores de colônia, tais

como EGF, TGFa1 fator de crescimento semelhante a insulina (IGF-I1 IGF-II)G-CSF, M-CSF e GM-CSF {Burgess, 5 Immunology Today 155-158(1984)};

- vitaminas, tais como folato e

- transferrina {OKeefe et al, 260 J. BioL Chem. 932-937 (1985)}.

A tecnologia de anticorpo monoclonal permite a produção deagentes de aglutinação celular extremamente seletivos na forma de anticor-pos monoclonais específicos. Particularmente bem-conhecidas são as técni-cas para criar anticorpos monoclonais produzidos imunizando camundongos,camundongos, hamsteres ou qualquer outro mamífero com o antígeno deinteresse, tais como uma célula-alvo intacta, os antígenos isolados da célula-alvo, um vírus inteiro, um vírus inteiro atenuado e a proteínas virais, tais co-mo proteínas de revestimento virais.

A seleção do agente de aglutinação celular adequado é umaquestão de escolha que depende da determinada população de células quedeve ser direcionada, mas os anticorpos monoclonais em geral são preferi-dos se nenhum adequado estiver disponível.

Por exemplo, o anticorpo monoclonal MY9 é um IgGi anticorpodo murino que se liga especificamente ao antígeno CD33 { J. D. Griffin et al8 Leukemia Res., 521 (1984)} e pode ser usado se as células de objetivoexpressarem o CD33 como na doença da leucemia mielogenosa aguda (A-ML). Similarmente o anticorpo monoclonal anti-B4 é uma IgGi do murino,que se liga ao antígeno CD19 nas células B {Nadler et al, 131 J. Immunol.244-250 (1983)} e pode ser usado se as células de objetivo forem células Bou células doentes que expressam este antígeno tal como no Iinfoma nãoHodgkin ou na leucemia linfoblástica crônica.

Adicionalmente, a GM-CSF que se liga a células mielóides podeser usada como um agente de aglutinação celular a células doentes de leu-cemia mielogenosa aguda. A IL-2, que se liga às células T ativadas, podeser usada para a prevenção da rejeição de transplante de enxerto, para te-rapia e prevenção da doença de enxerto contra o hospedeiro, e para o tra-tamento da leucemia da Célula T aguda. O MSH, que se liga a melanocitos,pode ser usado para o tratamento do melanoma.

Preparação dos Conjugados do pró-fármaco.

Os conjugados dos pró-fármacos e um agente de aglutinaçãocelular podem ser formados usando qualquer técnica. Uma indolila, benzofu-ranoila, bisindolila, bisbenzofuranoila, indolil-benzofuranoila, ou derivadobenzofuranoil-indolil acoplado ao análogo seco-CBI pode ser preparado con-tendo um grupo amino livre e depois ligado a um anticorpo ou outro agentede aglutinação celular via um Iigante ácido lábil, ou por um Iigante fotolábil.Os compostos do pró-fármaco podem ser condensados com um peptídiopossuindo uma seqüência adequada e posteriormente ligados a um agentede aglutinação celular para produzir um Iigante peptidase lábil. Os compos-tos citotóxicos podem ser preparados para conter um grupo hidroxila primá-rio, que pode ser succinilado e ligado a um agente de aglutinação celularpara produzir um conjugado que pode ser clivado por esterases intracelula-res para liberar o pró-fármaco livre. Preferivelmente, os compostos do pró-fármaco são sintetizados para conter um grupo tiol livre ou protegido, com ousem um espaçador contendo o PEG, e depois um pró-fármaco contendo umou mais sulfeto, dissulfeto ou tiol, cada um covalentemente ligado ao agentede aglutinação celular via uma ligação dissulfeto ou uma ligação tioéter.

Conjugados representativos da invenção são conjugados dospró-fármacos dos análogos da CC-1065 com anticorpos, fragmentos de anti-corpos, fatores de crescimento epidérmico (EGF), hormônio estimulante demelanócito (MSH), hormônio estimulante de tireóide (TSH), estrogênio, aná-logos do estrogênio, androgênio, e análogos do androgênio.

Os exemplos representativos para a preparação dos vários con-jugados dos pró-fármacos dos análogos da CC-1065 e os agentes de agluti-nação celular são descritos abaixo.

Liqante Dissulfeto: o anticorpo huMy-9-6 é uma forma genetica-mente humanizada do anticorpo monoclonal do murino My-9-6 dirigido con-tra o antígeno CD33 encontrado na superfície das células mielóides huma-nas, incluindo a maioria de casos de leucemia mielóide aguda (AML) (EJ.Favaloro, K.F. Bradstock, A. Kabral1 P. Grimsley & M. C. Berndt, DiseaseMarkers, 5(4):215 (1987); M.G. Hoffee, D. Tavares, R.J. Lutz1 Robert J., Pe-dido de Patente Internacional. (2004) WO 2004043344). O My-9-6 pode serusado para a preparação de conjugados. O anticorpo é modificado com pro-pionato de N-succinimidil-3-piridilditio tal como anteriormente descrito {J.Carlsson1 H. Drevin e R. Axen1 Biochem. J., 173:723 (1978)} para introduzir,em média, 4 grupos piridilditio por molécula de anticorpo. O anticorpo modifi-cado é reagido com o pró-fármaco contendo tiol para produzir um conjugadocom ligação dissulfeto.

Liaante Tioéter: os derivados contendo tiol de acordo com a pre-sente invenção pode ser ligado a anticorpos e outros agentes de aglutinaçãocelular via uma conexão de tioéter tal como anteriormente descrito (PatenteUS N2 5.208.020). O anticorpo ou outro agente de aglutinação celular podeser modificado com o composto comercialmente disponível, tal como o N-succinimidil-4-(maleimidometil)-cicloexanocarboxilato (SMCC), N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)-cicloexano-1-carbóxi-(6-amidocaproato),que é um análogo de cadeia longa da SMCC (LC-SMCC). Esses reagentesde reticulação formam derivados Iigantes não-cliváveis de porções a base demaleimida.

Os reagentes de reticulação compreendendo uma porção a ba-se de haloacetila incluem aminobenzoato de N-succinimidil-4-(iodoacetila)(SIAB)1 iodoacetato de N-succinimidila (SIA)1 bromoacetato de N-succinimidila (SBA) e propionato de N-succinimidil 3-(bromo-acetamida)(SBAP). Esses reagentes de reticulação formam derivados Iigantes não-cliváveis de porções a base de haloacetila. O agente de aglutinação celularmodificado pode ser reagido com um fármaco contendo tiol para fornecer umconjugado ligado por ligação tioéter.

Liqante Ácido Lábil: os pró-fármacos contendo grupo de aminode acordo com a presente invenção podem ser ligadas a anticorpos e outrosagentes de aglutinação celular via um Iigante ácido lábil como anteriormentedescrito. { W. A. Blattler et al, Biochemistry 24, 1517-1524 (1985); PatentesAmericanas N9 US 4.542.225. 4.569.789. 4.618.492. 4.764.368}.

Similarmente um pró-fármaco contendo um grupo hidrazido deacordo com a presente invenção pode ser ligado à porção de carboidrato deanticorpos e outra célula os agentes de aglutinação via um Iigante ácido lábilhidrazona {para exemplos de Iigantes vide B. C. Laguzza et al, J. Med.Chem., 32, 548-555 (1989); R. S. Greenfield et al, Câncer Res., 50, 6600-6607(1990)}.

Ligante Foto Lábil: o grupo de Amina contendo os pró-fármacosde acordo com a presente invenção pode ser ligado a anticorpos e outrosagentes de aglutinação celular via um Iigante foto lábil como anteriormentedescrito {P. Senter et al, Photochemistry and Photobiology, 42, 231-237(1985); Patente Americana Ne. US 4.625.014}.

Liqante Peptidase Lábil: o grupo de Amina contendo os pró-fármacos de acordo com a presente invenção também pode ser ligado aosagentes de aglutinação celular via espaçadores de peptídio. Foi mostradoanteriormente que os espaçadores de peptídio curtos entre fármacos e veí-culos de proteína macromoleculares são estáveis no soro mas são pronta-mente hidrolized por peptidases intracelular { A. Trouet et al, Proc. NatL A-cad. ScL, 79, 626-629 (1982)}. O grupo amino contendo contende pró-fármacos pode ser condensado com agentes de condensação de utilizaçãode peptídios, tais como 1-etil-3-carbodiimida-HCI (3-dimetilaminopropil)(EDC-HCI) para fornecer um derivado de peptídio que pode ser ligado aosagentes de aglutinação celular.

Liqante Esterase Lábil: os pró-fármacos de acordo com a pre-sente invenção que carrega um hidróxi alquil grupo podem ser succiniladocom o anidrido succínico e depois ligado a um agente de aglutinação celularpara produzir um conjugado que pode ser clivado por esterases intracelularpara liberar o fármaco livre. {Para exemplos vide E. Aboud-Pirak et al, Bio-chem Pharmacol., 38, 641-648 (1989)}.

O conjugado análogo da CC-1065 de anticorpos, fragmentos deanticorpo, ou hormônios de proteína ou peptídio, ou fatores de crescimentode proteína ou peptídio e outras proteínas é feito do mesmo modo por méto-dos conhecidos. Por exemplo, os peptídios e os anticorpos podem ser modi-ficados com reagentes de aglutinação cruzada, tais como propionato de N-succinimidil 3-(2-piridilditio), pentanoato de N-succinimidil 4-(2-piridilditio)(SPP), 4-succinimidil-oxicarbonil-a-metil-a-(ditio-2-piridil)-tolueno (SMPT), N-succinimidil-3-butirato (2-piridilditio) (SDPB), succinimidil piridil-ditiopropionato (SPDP), 4-(2-piridilditio) ácido butanóico N-hidrosuccinimidaéster (SPDB), succinimidil 4-[N-maleimidometil] cicloexano-1-caboxilato(SMCC), N-sulfossuccinimidil-3-(2-(5-nitro-piridilditio) butirato (SSNPB), 2-iminotiolano, ou anidrido S-acetilsuccínico por métodos conhecidos. Vide,Carlsson et al, 173 Biochem. J. 723-737 (1978); Blattler et al, 24 Biochem.1517-1524 (1985); Lambert et al, 22 Biochem. 3913-3920 (1983); Klotz et al,96 Arch. Biochem. Biophys. 605 (1962); e Liu et al, 18 Biochem. 690 (1979),Blakey e Thorpe, 1 Antibody, Immunoconjugates and Radio-pharmaceuticals, 1-16 (1988), Worrell et al 1 Anti-Cancer Drug Design 179-184 (1986). O agente de aglutinação celular contendo tiol livre ou protegidoassim produzido é então reagido com um análogo do pró-fármaco daCC61065 contendo dissulfeto ou tiol para produzir o conjugado. O conjugadopode ser purificado pela coluna de cromatografia-padrão, HPLC ou por filtra-ção em gel.

Preferivelmente, o anticorpo monoclonal ou o agente de conju-gado de aglutinação celulardo com o análogo do pró-fármaco CC-1065 sãoaqueles que são ligados via uma ligação dissulfeto, tal como discutido aci-ma, que são capazes de liberar os análogos do pró-fármaco da CC-1065.

Tal conjugado de ligação celular pode ser preparado por méto-dos conhecidos tal como modificação de anticorpos monoclonais com succi-nimidil piridil-ditiopropionato (SPDP) (Carlsson et al, 173 Biochem. J. 723-737 (1978)). O grupo tiopiridil resultante então é deslocado pelo tratamentocom análogos do pró-fármaco da CC-1065 contendo tiol para produzir con-jugados ligados por dissulfeto. A conjugação por este método é totalmentedescrita na Patente Americana Ng US 5.585.499, que é aqui incorporado pe-la referência.

Alternativamente, em caso dos análogos arilditio do pró-fármacoda CC-1065, a formação do conjugado de ligação celular é efetuada pela odeslocamento direto do aril-tiol do análogo do pró-fármaco da CC-1065 porgrupos sulfidrila anteriormente apresentados nas moléculas de anticorpo. Osconjugados contendo 1 a 10 análogos do pró-fármaco da CC-1065 ligados viauma ponte de dissulfeto são prontamente preparados por qualquer método.

De acordo com um objetivo adicional, a presente invenção tam-bém se refere a composições farmacêuticas compreendendo uma moléculaconjugada da invenção ou um composto de acordo com a fórmula (I) comodefinido acima juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável.

De acordo com um objetivo adicional, a presente invenção tam-bém se refere a um método de eliminação ou inibição do crescimento decélulas, populações de célula preferivelmente selecionadas compreendendoo contato com células de objetivo ou tecido contendo células de objetivo comuma quantidade eficaz da composição farmacêutica de acordo com a pre-sente invenção.

A população de células selecionadas é aquela composta de cé-lulas cancerosas e/ou proliferativas.

De acordo com um objetivo adicional, a presente invenção tam-bém se refere a um método de tratamento, tratamento preferivelmente sele-tivo, do câncer compreendendo a administração de uma quantidade eficazda composição farmacêutica de acordo com a presente invenção a um paci-ente que esteja necessitado da mesma.

De acordo com a presente invenção, "o tratamento seletivo docâncer" se refere ao extermínio de células cancerosas e/ou proliferativassubstancialmente sem extreminar as células normais e/ou não-proliferativas.De acordo com um objetivo adicional, a presente invenção tam-bém se refere o uso de uma molécula conjugada da invenção ou um com-posto de acordo com a fórmula (I) como definido acima para a preparaçãode um medicamento para o tratamento do câncer.

O método para inibir o crescimento de populações de célula se-lecionadas pode ser praticado in vitro, in vivo, ou ex vivo.

Os exemplos de em usos in vitro incluem tratamentos de cultu-ras de célula para eliminar todas as células exceto variantes desejadas quenão expressam o antígeno de objetivo; ou eliminar variantes que expressamo antígeno indesejado.

As condições dos não-clínicos no uso in vitro são prontamentedeterminadas pelo técnico versado.

Os exemplos de exceto usos de vivo incluem tratamentos domedula óssea autóloga antes do seu transplante no mesmo paciente paraeliminar células doentes ou malignas: tratamentos do medula óssea antes dasua transplantação para eliminar células T competentes e prevenir "a doen-ça do enxerto contra o hospedeiro" (GVHD).

O tratamento ex vivo para retirar células de tumor ou células Iin-fóides do medula óssea antes da transplantação autóloga no tratamento decâncer ou no tratamento da doença autoimune, ou retirar células T e outrascélulas linfóides de medula óssea alogenêica ou tecido antes do transplantepara prevenir GVHD, pode ser realizada como se segue. A medula óssea écolhida do paciente ou outro indivíduo e depois incubada em meio contendosoro ao qual é acrescentado o agente citotóxico da invenção, em uma faixade concentrações de aproximadamente 10 μΜ a 1 pM, durante aproxima-damente 30 minutos a aproximadamente 48 horas a aproximadamente 37°C.As condições exatas da concentração e o tempo da incubação (=dose) sãoprontamente determinadas pelo técnico versado. Depois da incubação ascélulas de medula óssea são lavadas com médio contendo soro e devolvidasao paciente pela infusão i.v. de acordo com os métodos conhecidos. Em cir-cunstâncias onde o paciente recebe outro tratamento, tal como uma seçãode quimioterapia ablativa ou irradiação de corpo total entre o tempo da co-lheita da medula e a reinfusão das células tratadas, as células de medulatratadas são guardadas congeladas em equipamento médico-padrão decongelamento por nitrogênio líquido.

Para clínico no uso de vivo, o agente citotóxico da invenção seráfornecido como soluções que são testadas para a esterilidade e para níveisendotoxin ou como um sólido Iiofilizado que pode ser redissolvido em águaestéril da injeção. Os exemplos de protocolos convenientes da administraçãoconjugada são como se segue. Conjugados são dados semanalmente du-rante 6 semanas como um i.v. bolo. As doses de Bolo são dadas em 50 para400 ml da salina normal à qual a albumina de soro humana (por exemplo,0,5 a 1 ml de uma solução concentrada da albumina de soro humana, 100mg/mL) pode ser acrescentada. As dosagens serão aproximadamente 50 pga 10 mg/kg do peso corporal por semana, i.v. (faixa de variação da 10 pg a100 mg/kg por injeção). Seis semanas depois para o tratamento, o pacientepode receber um segundo curso para o tratamento. Os protocolos clínicosespecíficos quanto à via de administração, excipientes, diluentes, dosagens,tempos, etc., podem ser determinados pelo técnico versado como as autori-zações de situação clínicas.

Os exemplos de condições médicas que podem ser tratadas se-gundo o in vivo ou exceto métodos vivo de eliminar populações de célulaselecionadas incluem a malignidade de qualquer tipo incluindo, por exemplo,o câncer do pulmão, da mama, do cólon, próstata, rim, pâncreas, ovário, eórgãos linfáticos; melanomas; doenças autoimunes, tais como Iupus sistêmi-co, artrite reumatóide, e múltipla esclerose; as rejeições de enxerto, tais co-mo rejeição de transplante renal, rejeição de transplante de fígado, rejeiçãode transplante de pulmão, rejeição de transplante cardíaca, e medula ósseatransplantam a rejeição; enxerto contra doença de hospedeiro; infecçõesvirais, tais como infecção de CMV, infecção de VIH, AIDS, etc.; infecção bac-teriana; e infecções de parasita, tais como giardiasis, amoebiasis, schisto-somiasis, e outros como determinado por uma pessoa versada na técnica.

A identificação daqueles pacientes quem precisam para o trata-mento de doenças aqui descritas e condições é bem dentro da capacidade eo conhecimento de uma pessoa versada na técnica. A um veterinário ou ummédico versado na técnica podem identificar prontamente, pelo uso de tes-tes clínicos, exame físico, história médica/história de família ou testes bioló-gicos e diagnósticos, aqueles pacientes quem precisam de tal tratamento.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser prontamentedeterminada pelo diagnóstico do atendente, como uma pessoa versada natécnica, pelo uso de técnicas convencionais e observando resultados obtidosem circunstâncias análogas. Para a determinação da quantidade terapeuti-camente eficaz, diversos fatores são encontrados pelo atendente através dodiagnóstico incluindo, mas não limitados a: o tipo de paciente; o seu tama-nho, idade, e saúde geral; a doença específica implicada; o grau de envolvi-mento ou a gravidade da doença; a resposta do paciente individual; o deter-minado composto administrado; o modo de administração; a característicabioviabilidade para a preparação administrada; o regime de dose seleciona-do; o uso de medicação de acompanhador; e outras circunstâncias relevantes.

A quantidade de um composto de acordo com a fórmula (I) ouconjugado, que deve atingir o efeito biológico desejado, variará dependendode diversos fatores, incluindo as características químicas (por exemplo, hi-drofobicidade) dos compostos empregados, a potência dos compostos, otipo da doença, espécies às quais o paciente pertence, o estado doentio dopaciente, a via de administração, a biodisponibilidade do composto pela viaescolhida, todos os fatores que ditam as quantidades de dose necessária, aliberação e o regime a de administração.

Tal como aqui utilizado, "excipiente farmaceuticamente aceitá-vel" inclui qualquer veículo, diluentes, adjuvantes, ou transportes, tais comoagentes conservantes ou antioxidantes, enchedores, agentes desintegran-tes, agentes umectantes, agentes emulsificantes, agentes de suspensão,solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos eantifúngicos, agentes isotônicos e agentes de retardo de absorção e simila-res. O uso de tais meios e agentes de substâncias ativas farmacêuticas ébem-conhecido na técnica. Exceto na medida em que quaisquer meios ouagentes convencionais sejam incompatíveis com o componente ativo, é con-templado o seu uso nas composições terapêuticas. Os ingredientes ativossuplementares também podem ser incorporados nas composições comocombinações terapêuticas convenientes.

No contexto da presente invenção, o termo "tratando" ou "trata-mento", tal como aqui utilizado, significa reverter, aliviar, inibir o progressode, ou prevenir o distúrbio ou a condição à qual tal termo se aplica, ou um oumais sintomas de tal distúrbio ou condição.

Em termos gerais, os compostos da presente invenção podemser fornecidos em uma solução aquosa de tampões fisiológicos contendo de0,1 a 10% p/v do composto para administração parenteral. As variações dedose típicas são de 1 pg/kg a 0,1 g/kg do peso corporal por dia; uma faixa devariação da dose preferida é de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg do peso corporal pordia ou uma dose equivalente em uma criança humana. A dosagem preferidado fármaco a ser administrada provavelmente dependerá de tais variáveiscomo o tipo e o ponto da progressão da doença ou distúrbio, a situação desaúde total do determinado paciente, a eficácia biológica relativa do compos-to selecionado, a formulação do composto, a via de administração (intrave-nosa, intramuscular, ou outra), as propriedades farmacocinéticas do com-posto pela via de administração escolhida, e a velocidade (bolo ou infusãocontínua) e o horário de administrações (o número de repetições em um da-do período de tempo).

Os compostos de acordo com a presente invenção são tambémcapazes de serem administrados na forma de dose única, em que o termo"dose única" significa uma dose única que seja capaz de ser administrada aum paciente, e que possa ser prontamente manipulada e empacotada, per-manecendo como uma unidade de dosagem fisicamente e quimicamenteestável compreendendo o próprio composto ativo, ou como uma composiçãofarmaceuticamente aceitável, como descrito daqui por diante. Como tal, asvariações de dose diárias totais típicas são de 0,01 a 100 mg/kg do pesocorporal. Por meio da orientação geral, as doses de unidade de seres huma-nos percorrem de 1 mg a 3000 mg por dia. Preferivelmente a faixa de varia-ção da unidade de dosagem é aquela administrada de 1 a 500 mg de uma aseis vezes por dia, e mesmo mais preferivelmente de 10 mg a 500 mg, umavez por dia. Os compostos aqui fornecidos podem ser formulados em com-posições farmacêuticas pela mistura com um ou mais excipientes farmaceu-ticamente aceitáveis. Tais composições de dose unitária podem ser prepa-radas para o uso via administração oral, particularmente na forma de com-primidos, cápsulas simples ou cápsulas de gel macio; ou intranasalmente,particularmente na forma de pó, gotas nasais, ou aerossóis; ou dermicamen-te, por exemplo, topicamente com ungüentos, cremes, loções, géis ou borri-fos, ou via emplastos transdérmicos.

As composições podem ser convenientemente administradas naforma de dosagem de unidade e podem ser preparadas por qualquer um dosmétodos bem-conhecidos na técnica farmacêutica, por exemplo, tal como odescrito no Remington: The Science and Pratice of Pharmacy, 208 edição,Gennaro, A. R., Ed.; Lippincott Williams e Wilkins: Filadélfia, PA, 2.000.

As formulações preferidas incluem composições farmacêuticasnas quais um composto de acordo com a presente invenção está formuladopara a administração oral ou parenteral.

Para administração oral, comprimidos, pílulas, pó, cápsulas,pastilhas e similares podem conter um ou mais de alguns dos seguintes in-gredientes, ou compostos de natureza semelhante: um Iigante tal como celu-lose microcristalina, ou goma tragacanto; um diluente, tal como amida oulactose; um dispersante, tal como amido e derivados de celulose; um lubrifi-cante, tal como estearato de magnésio; um agente de deslizamento, tal co-mo dióxido de silício coloidal; um agente adoçante, tal como sacarose ousacarina; ou um agente aromatizante, tal como hortelã-pimenta, ou salicilatode metila. As cápsulas podem estar na forma de uma cápsula dura ou cáp-sula macia, que são geralmente feitos de misturas de gelatina opcionalmentemisturadas com plastificantes, bem como uma cápsula de amido. Adicional-mente, as formas de unidade de dosagem podem conter vários outros mate-riais que modificam a forma física da unidade de dosagem, por exemplo,revestimentos de açúcar, goma laca, ou agentes entéricos. Outras formas dedosagem oral de xarope ou de elixir podem conter reagentes adoçantes,preservativos, tinturas, corantes, e aromatizantes. Adicionalmente, os com-postos ativos podem ser incorporados por preparações e formulações dedissolução rápida, liberação modificada ou de liberação retardada e, e emque tais formulações de liberação retardade sejam preferivelmente bimodais.Os comprimidos preferidos contêm lactose, amido de milho, silicato de mag-nésio, croscarmelose de sódio, povidona, estearato de magnésio, ou talcoem qualquer combinação.

As preparações líquidas para a administração parenteral inclu-em soluções aquosas ou não-aquosas estéreis, suspensões, e emulsões. Ascomposições líquidas também podem incluir agentes ligantes, tampões, pre-servativos, agentes quelantes, adoçantes, aromatizantes e corantes, e simi-lares. Os solventes não aquosos incluem álcoois, propileno glicol, polietilenoglicol, óleos vegetais, tais como óleo de oliva, e ésteres orgânico, tais comooleato de etila. Os veículos aquosos incluem misturas de álcoois e água,meio tamponador e salina. Especialmente, o polímero Iactide biodegradávele biocompatível, copolímero lactidio/glicolídio, ou copolímeros polioxietileno-polioxipropileno podem ser excipientes úteis para controlar a liberação doscompostos ativos. Os veículos intravenosos podem incluir o fluido e os repo-sitores de nutrientes, repositores de eletrólitos, tal como os baseados nadextrose de Ringer, e similares. Outros sistemas de liberação parenteral po-tencialmente úteis para esses compostos ativos incluem as partículas decopolímero do etileno - acetato de vinila, as bombas osmóticas, sistemas deinfusão implantáveis e lipossomas.

Os modos alternativos de administração incluem formulaçõespara inalação, que incluem meios tais como pó seco, aerossol, ou gotas.Eles podem ser soluções aquosas contendo, por exemplo, polioxietileno-9-lauril éter, glicocolato e deoxicolato, ou soluções oleosas para administraçãona forma de gotas nasais, ou como um gel a ser aplicado intranasalmente.As formulações para administração oral incluem, por exemplo, drágeas oucomprimidos e também podem incluir uma base com sabor, tal como saca-rose ou acácia, e outros excipientes, tal como glicocolato. As formulaçõesconvenientes para a administração retal são preferivelmente apresentadascomo supositórios de dose unitária, com um veículo de base sólida, tal comomanteiga de cacau, e pode incluir um salicilato.

As formulações para aplicação tópica à pele preferivelmente to-mam a forma de um ungüento, creme, loção, pasta, gel, borrifo, aerossol, ouóleo. Os veículos que podem ser usadas incluem gel de petróleo, lanolina,polietileno glicol, álcoois, ou as suas combinações. As formulações conveni-entes para a administração transdérmica podem ser apresentadas comoemplastos separados e podem ser emulsões lipofílicas ou armazenadas emtampão, soluções aquosas, dissolvidas e/ou dispersadas em um polímero ouem um adesivo.

Citotoxicidade in vitro dos Conjugados entre os Agentes de aglutinação celu-lar e os pró-fármacos de acordo com a presente invenção.

A citotoxicidade dos pró-fármacos de acordo com a presente in-venção e o seu conjugado com os reagentes de aglutinação celular podemser medidos depois da clivagem do grupo de proteção e da conversão nofármaco ativo. A citotoxicidade a linhagens celulares não-aderentes, tais co-mo Namalwa e HL60 podem ser medidas pela extrapolação de retorno decurvas de proliferação de célula tal como descrito em Goldmacher et al, 135J. Immunol. 3648-3651 (1985). Citotoxicidade desses compostos a linhagenscelulares aderentes, tais como A-375 e SCaBER pode ser determinado porensaios clonogênicos tal como descrito em Goldmacher et al, 102 J. CellBioi 1312-1319 (1986).

Agente Terapêutico e Método para Inibição do Crescimento das Populaçõesda Célula Selecionada.

A presente invenção também fornece um reagente terapêuticopara inibir o crescimento de populações de célula selecionadas compreen-dendo:

(a) uma quantidade de citotóxica de um ou mais dos pró-fármacos acima descritas ligadas a um agente de aglutinação celular, e

(b) um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitá-vel.Similarmente a presente invenção fornece um método para inibiro crescimento de populações de célula selecionadas compreendendo conta-tar com uma população de célula ou tecido suspeito de conter células da ditapopulação de célula selecionada com uma quantidade citotóxica de um a-gente citotóxico compreendendo uma ou várias dos pró-fármacos acimamencionadas ligadas a um agente de aglutinação celular.

O agente citotóxico é preparado tal como descrito acima. Os ve-ículos convenientes, os diluentes, e excipientes farmaceuticamente aceitá-veis são bem-conhecidos e podem ser determinados por aqueles com habi-Iidade na técnica como aqules autorizados de situação clínicas.

Os exemplos de veículos, diluentes e/ou excipientes convenien-tes incluem: (1) o tampão de fosfato salino Dulbecco, pH de aproximada-mente 7,4, contendo de aproximadamente 1 mg/ml a 25 mg/ml de albuminade soro humano, (2) salina a 0,9% (0,9% pM de NaCI), e (3) 5% (pN) de dextrose.

O método para inibir o crescimento de populações de célula se-lecionadas pode ser praticado in vitro, in vivo, ou ex vivo.

Os exemplos de usos in vitro incluem tratamentos de culturas decélula para eliminar todas as células exceto variantes desejadas que nãoexpressam o antígeno de objetivo; ou eliminar variantes que expressam oantígeno indesejado.

As condições não-clínicas de uso in vitro são prontamente de-terminadas pelo técnico versado.

Os exemplos de usos ex vivo incluem tratamentos da medulaóssea autóloga antes do seu transplante no mesmo paciente para eliminarcélulas doentes ou malignas; tratamentos da medula óssea antes da suatransplantação para eliminar células T competentes e prevenir a "doença doenxerto contra o hospedeiro" (GVHD).

O tratamento clínico ex vivo para retirar células de tumor ou cé-lulas linfóides da medula óssea antes da transplantação autóloga no trata-mento do câncer ou no tratamento da doença autoimune, ou retirar células Te outras células linfóides da medula ou tecido ósseo alogênico antes dotransplante para prevenir a GVHD, pode ser realizado como se segue. Omedula óssea é colhida do paciente ou outro indivíduo e depois incubada emmeio contendo soro ao qual é acrescentado o agente citotóxico da invenção,em uma faixa de variação de concentrações de aproximadamente 10 μΜ a 1pM, durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 48 horas emaproximadamente 37°C. As condições exatas da concentração e o tempo daincubação (=dose) são prontamente determinadas pelo técnico versado. De-pois da incubação as células de medula óssea são lavadas com um meiocontendo soro e devolvidas ao paciente por infusão i.v. de acordo com osmétodos conhecidos. Em circunstâncias onde o paciente recebe outro trata-mento, tal como uma seção de quimioterapia ablativa ou irradiação de corpototal entre o tempo da colheita do medula e a reinfusão das células tratadas,as células de medula tratadas são guardadas congeladas em equipamentomédico-padrão de congelamento por nitrogênio líquido.

Para o uso clínico in vivo, o agente citotóxico da invenção seráfornecido como soluções que são testadas para a ésterilidade e para níveisendotoxin ou como um sólido Iiofilizado que pode ser redissolvido em águaestéril da injeção. Os exemplos de protocolos convenientes da administraçãoconjugada são como se segue. Conjugados são dados semanalmente du-rante 6 semanas como um bolo i.v. As doses de bolo são dadas de 50 ml a400 ml da salina normal a que albumina de soro humana (por exemplo, 0.5 a1 mL de uma solução concentrada da albumina de soro humana, 100mg/mL) pode ser acrescentado. As dosagens serão aproximadamente 50 pga 10 mg/kg do peso corporal por semana, i.v. (faixa de variação da 10 [ig a100 mg/kg por injeção). Seis semanas depois para o tratamento, o pacientepode receber um segundo curso para o tratamento. Os protocolos clínicosespecíficos quanto à via de administração, excipientes, diluentes, dosagens,tempos, etc., podem ser determinados pelo técnico versado como as garna-tias de situações clínicas.

Os exemplos das condições médicas que podem ser tratadas deacordo com os métodos in vivo ou ex vivo para eliminar as populações decélulas selecionadas incluem os tumores malignos de qualquer tipo incluin-do, por exemplo, o câncer do pulmão, da mama, do cólon, próstata, rim, pân-creas, ovário, e órgãos linfáticos; melanomas; doenças autoimunes, tais co-mo Iupus sistêmico, artrite reumatóide, e esclerose múltipla; as rejeições deenxerto, tais como rejeição de transplante renal, rejeição de transplante defígado, rejeição de transplante de pulmão, rejeição de transplante cardíaco,e rejeição de transplante de medula óssea; doença de enxerto contra hos-pedeiro; infecções virais, tais como infecção de CMV, infecção de VIH, AIDS,etc.; infecção bacteriana; e infecções de parasita, tais como giardíase, ame-bíase, esquistossomíase e outras moléstias tal como determinado por umapessoa versada na técnica.

Exemplos

A invenção será ilustrada agora quanto à não limitação de e-xemplos. A menos que de outro modo seja declarado, todos os por cento, asproporções, partes, etc. são pelo peso.

Materiais e Métodos

Os pontos de fusão foram medidos usando um aparelho eletro-térmico e não foram corrigidos. Os espectros de RMN foram registrados emum espectrômetro Bruker AVANCE400 (de 400 MHz). As trocas químicassão informadas em ppm emrelação ao TMS como um padrão interno. Osespectros de massa foram obtidos usando um sistema Bruker Esquire 3000.

Os espectros ultravioleta foram registrados em um espectrofotômetro HitachiU1200. A HPLC foi realizada usando um sistema Beckman Coulter 125GOLD equipado com um sistema Beckman Coulter GOLD 168 detector decomprimento de onda variável e um Radialpak da Waters (uma coluna defase inversa C-18). A cromatografia de camada fina foi realizada em placasde sílica gel TLC da Analtech GF. A sílica gel para a coluna de cromatografiaem flash foi proveniente da Baker. O tetraidrofurano foi seco pela destilaçãosobre do sódio metálico. A dimetilactamida e dimetilformamida foram secapor destilação sobre hidreto de cálcio sob pressão reduzida. Todos outrossolventes usados foram em grau de reagente ou em grau HPLC.

A síntese de pró-fármacos DC07 (7a), DC08 (8a) e DC107 (Fi-gura 4) é aqui descrita. DC07 e DC08 bem como DC107 são derivados dofármaco parental DC1 e DC101, enquanto DC09 (9a) pode ser preparado dofármaco parental DC5 polietilenoglicada que foi descrita na Patente US Nq6.756.397 B2 (Figura 3). o pró-fármaco DC07 é extremamente estável emsoluções aquosas em pH 5,5 ou abaixo, e pode ser convertida no fármacoparental DC1 pela incubação em soro ou plasma. Estes fármacos tambémmelhoram a solubilidade em água comparando com DC1. A incubação deDC07SMe no soro de camundongos converte-o no fármaco parentalDCISMe.

As linhagens celulares humanas de câncer HL60, Namalwa, A-375, COL0205 e RAMOS foram obtidas da Coleção de Cultura Americanade Tipos (ATCC). KARA é uma linhagem de células de tumor de murino quefoi transfectada de modo estável com o antígeno CD33 humano.

Exemplo 1.

Preparação de (S)-N-f2-((1 -clorometil)-1.2-diidro-5-r(3-hidroxissulfonil-fenil)aminocarbonilóxi1-3H-benzenoindolil-3)carbonill-1H-indolil-51-5-r(3-metilditiopropanoil)-amino1-1 H-indol-2-carboxamida (DC07-SMe, 7b).

A uma solução de 11,6 mg (0,017 mmol) de DCISMe (1-[S]-(clorometil)-5-hidróxi-3-{{5-[5-(3-metilditiopropionil)indolil-2-carbonilamino]-indolil-2}carbonil}-1,2-diidro-3H-benzenoindol) em 2,5 ml de DMA foi acres-centado 3,0 μΙ de DlΡΕΑ. Depois foi agitada sob Ar por 3 minutos, 4,0 mg decarbonildiimidazol (1,46 eq) foram acrescentados. A mistura foi agitada du-rante duas horas e o TLC mostrou que todo o DCISMe foi consumido, foiacrescentado 16 mg recém preparados (3 eq) do sal diisopropiletilamina 3-aminobenzenosulfonato (pH 5). A mistura foi agitada sob Ar durante a noitee HPLC mostrou a reação concluída. A mistura foi evaporada com a bombade óleo e purificada com uma coluna C-18 (1,0 χ 5 cm) eluída com 100% deácido acético a 0,01% até 50% de ácido acético a 0,01% e 50% de THF. Asfrações foram coletadas e evaporadas para produzir 11,8 mg do compostodo título (DC07SMe);

1H RMN (DMF-d7) 11,85 (br, 2H), 11,79 (s, 1H), 11,70 (s, 1H),10,53 (s, 1H), 10,27 (s, 1H), 10,03 (s, 1H), 8,50 (s, 1H), 8,41 (S, 1H), 8,21 (d,1H, J = 1,7 Hz), 8,17 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 8,12 (m, 1H), 7,46 (dd, 1H, J = 1,9,8,8 Hz), 7,66 (m, 2Η), 7,61 (d, 1 Η, J = 8,9 Hz), 7,58 (m, 2H), 7,48 (d, 1 Η, J =1,4 Hz), 7,45 (dd, 1 Η, J = 1,9, 8,8 Hz), 7,35 (d, 1H1 J = 1,6 Hz), 5,01 (t, 1 Η,J = 10,0 Hz), 4,84 (dd, IH1 J = 2,2, 10,9 Hz), 4,49 (m, 2H), 4,21 (dd, 1H, J =3,2, 11,3 Hz), 4,10 (m, 2H), 3,12 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 2,49 (s, 3H); 13C RMN172,52, 170,33, 169,54, 162,94, 161,20, 160,41, 152,67, 147,94, 142,69,139,11, 134,73, 134,56, 133,72, 133,37, 133,18, 132,16, 130,72, 128,76,128,41, 128,34, 125,71, 125,61, 124,07, 123,16, 121,51, 120,05, 118,36,113,54, 1 12,97, 1 12,92, 112,16, 111,61, 108,14, 107,56, 106,78, 104,02,69,03, 67,95, 67,37, 55,84, 54,91, 48,13, 42,71, 37,05, 34,10, 23,12; MSm/z+ 831,14 (M+H)+, 883,0, 883,9, 884,9 (M+Na)+, 905,0, (M+K)+ 920,9,922,9; MS m/z 880,8, 881,8, 882,8, 883,8 (M-H)-.

Exemplo 2.

Preparação de (S)-N-[2-((1-clorometil)-1.2-diidro-5-[(3-hidroxissulfonilfenil)-aminocarbonilóxi]-3H-benzenoindolil-3)carbonin-1H-indolil-5]-5-[(3-mercapto-propanoil)-amino1-1H-indol-2-carboxamida (DC07, 7a).

Uma solução de 10 mg (0,104 mmol) de TCEP em 2 ml de H2Ofoi ajustada a pH 7,0 com a adição de NaHCO3 em pó. À solução foram a -crescentados 15 mg de DC07SMe em 3 ml de DMA seguidos da adição de 5mg de DTT em 1,0 ml 200 mM de NaH2PO4, pH 4,5. Depois foi agitado porduas horas e a MS mostrou que o pico de DC07SMe (m/z 883 (M-1)) desa-pareceu, a mistura foi concentrada e purificada com HPLC preparativa emcoluna C-18 eluída com 60% de NaH2PO4 a 10 mM e DMA a 40% até DMAa 80% durante 40 minutos. As frações foram coletadas, concentradas, redis-solvidas em DMA, filtrados os sais, evaporados novamente para produzir 13mg de DC07.

MS m/z 835,1 (M-H)" 836,1, 837,1, 838,1.

Exemplo 3.

Preparação de (S)-N-r2-(-1,2-diidro-5-(1-clorometil) f(3-hidroxissulfonilmetil-fenil) aminocarbonilóxil -3H-benzenoindolil-3) carbonill-1 H-indolil-51-5-(f3-(2-piridilditio)-propanoin-amino)-1H-indol-2-carboxamida (DC08SPy):

A 21,0 mg de (DCISPy) em 2 ml de DMA foram acrescentados10 microlitros de diisopropiletilamina (DIPEA). Depois a mistura foi agitadapor 3 minutos sob Ar, foram acrescentados 8,0 mg de carbonil diimidazol(CDI), e a mistura foi agitada por duas horas, verificou-se por HPLC em umacoluna C-18, que o DCISPy foi completamente reagido com o CDI. À misturaforam acrescentados 20 mg de ácido 4-aminobenzil sulfônico e 10 microlitrosde DlΡΕΑ. Depois foi agitada durante uma noite, a mistura foi concentrada epurificada por HPLC em uma coluna C-18 eluída com DMA a 30% emNaH2PO4 a 10 mM, pH 4,0 até DMA a 80% em NaH2PO4 a 10 mM, pH 4,0. Afração foi coletada, e concentrada para produzir 20,2 mg do composto dotítulo. 1H RMN (DMF-d7) 11,67 (d, 2H, J = 9,9 Hz), 10,58 (s, 1H), 10,23 (s,1H), 9,81 (s, 1H), 8,86 (dddd, 1H, J = 0,8, 1,6, 2,5, 14,6), 8,41 (S, 1H), 8,27-8,20 (m, 4H), 8,12 (m, 1H), 7,95 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 7,83 (m, 1H), 7,71 (dd,1H, J = 2,0, 9,9 Hz), 7,60-7,51 (m, 4H), 7,47-7,40 (m, 4H), 7,30 (d, 1H, J =1,6 Hz), 4,90 (t, 1H, J = 10,0 Hz), 4,75 (dd, 1H, J = 2,2, 10,9 Hz), 4,33 (m,1H), 4,15 (dd, 1H, J = 3,2, 11,3 Hz), 4,11 (s, 2H), 3,97 (dd, 1H, J = 7,8, 11,0Hz), 3,29 (t, 2H, J = 6,9 Hz), 2,76 (m, 3H); 13C RMN 172,35, 162,93, 161,20,160.41, 155,77, 151,36, 147,94, 142,69, 140,14, 139,11, 134,73, 134,56,133,82, 133,37, 132,97, 132,16, 131,49, 129,22, 128,82, 128,34, 125,01,125,61, 124,17, 123,76, 121,81, 120,05, 119,32, 116,43, 113,31, 112,97,112,92, 112,16, 11 1,61, 108,14, 107,56, 106,83, 101,78, 67,37, 56,37,48,13, 42,71, 37,00, 34,10; MS m/z 958,34 (M-1).

Ácido 4-aminobenzil sulfônico:

Em um frasco PAR de hidrogenação de 250 ml foram carrega-dos ácido 4-nitrobenzil sulfônico (6,80 g, 31,34 mmols), Pd/C de 10% (0,4 g),CH3OH (150 ml) com algumas gotas de água, e purgado com hidrogênio. Amistura reacional foi agitada com pressão de 13,8 N/cm2 de H2 por uma noi-te. O catalisador foi retirado por filtração com celite e o solvente foi evapora-do. O composto bruto foi co-evaporado três vezes com 3 χ 50 ml de água ecristalizado com água/THF/EtAc/tolueno (1:10:10:100) para fornecer 5,3 g(91%) do composto do título. 1H RMN (D2H), 7,28 (dd, 2H, J = 2,2, 4,3 Hz),6,95 (dd, 2H, J = 2,2, 4,3 Hz), 4,10 (s, 2H); 13C RMN 134,30, 127,10, 121,04,120.42, 59,14; MS m/z 186,35 (M-H).Acetato de 4-nitrofeniltiol:

À solução de 5 ml (69,95 mmols) do ácido tiolacético e 12 ml detrietilamina em 75 ml do tolueno foi acrescentado gota a gota 7,5 g (34,71mmols) do brometo 4-nitrobenzila em 100 ml de 1:2 THF/Tolueno durante 4horas. A mistura foi continuamente agitada durante a noite, evaporada e cris-talizada com EtAc/tolueno/hexano para produzir 7,1 g (96%) do composto dotítulo. 1H RMN (CDCI3) 8,13 (ddd, 2H, J = 2,5, 4,5, 9,3 Hz), 7,44 (ddd, 2H, J= 2,5, 4,5 9,3 Hz), 4,14 (s, 2H), 2,35 (S, 3H); 13C RMN 194,53, 145,73,129,91, 124,07, 32,93, 30,50; MS M+ 234,34 (M+Na).

Ácido 4-nitrobenzil sulfônico:

7,0 g do acetato 4-nitrofeniltiol foram acrescentados em 150 mlde uma solução 1:3 de H202/HAc em 5 porções por 4 horas e a mistura foicontinuamente agitada durante uma noite. A mistura foi evaporada e co-evaporada três vezes com 3 χ 50 ml de água, cristalizada comCH30H/THF/tolueno para produzir 6,82 g (95%) do composto do título. 1HRMN (D2H) 8,02 (ddd, 2Hi J = 2,7, 4,6, 11,1 Hz), 7,20 (ddd, 2H, J = 2,6, 4,6,11,1 Hz), 4,1 1 (s, 2H); 13C RMN 141,70, 139,30, 129,91, 122,07, 59,15; MSm/z 216,21 (M-H).

Exemplo 4.

Preparação de (S)-N-[2-((1 -clorometil)-1,2-diidro-5-[(3-hidroxissulfonilmetil-fenil)aminocarbonilóxi1-3H-benzenoindolil-3}carbonil]-1H-indolil-5]-5-[(3-mercaptopropanoil)-amino]-1H-indol-2-carboxamida (DC08).

Uma solução de 10 mg (0,104 mmol) de TCEP em 2 ml de H2Ofoi ajustada ao pH 7,0 com a adição de NaHCO3 em pó. À solução foi acres-centado 15 mg de DC08SPy em 3 ml de DMA seguidos da adição de 5 mgde DTT em 1,0 ml 200 mM NaH2PO4, pH 4,5. Depois foi agitada por duashoras e o MS mostrou que o pico do DC08SPy {m/z 883 (M-1)) desapare-ceu, a mistura foi concentrada e purificada por HPLC preparativa em colunac-18 eluída com 60% de NaH2PO4 a 10 mM/40% de DMA até 20% deNaH2PO4 a 10 mM/80% de DMA, durante 40 minutos. As frações coleciona-das foram coletadas, concentradas à secura, redissolvida em DMA, filtradosos sais, evaporados novamente para produzir 13 mg de DC08. MS m/z849,1 (M-H)1 850,1, 851,1.

Exemplo 5.

(S)-N-(2-(1 -(clorometil)-5-hidróxi-2,3-diidro-1 H-benzenoindol-3-carbonil)-1 H-indolil-5)-3-(metildissulfanil) propanamida (DC1.01SMe).

A uma solução do sal de hidrocloreto de 5-hidróxi-3-amino-1-[S]-(clorometil)-l ,2-diidro-3H-benzenoindol, (155 mg, 0,57 mmol) e ácido 5-(3-(metil-dissulfanil) propanamida)-1H-indol-2-carboxílico (170 mg, 0,55 mmol)em 7,0 ml de DMA foi acrescentado EDC (300 mg, 1,56 mmol) sob Ar.

A mistura foi agitada por uma noite, e depois foi evaporada à secura, purifi-cada por cromatografia em SiO2 (THF de 20% a 40% em tolueno) e cristali-zada com THF/tolueno/hexano para produzir 218 mg (76%) de DC10iSMe.1H RMN (DMF-d7) 1 1,63 (s, 1H), 10,56 (s, 1H), 9,95 (s, 1H), 8,23 (s, 2H),7,93 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 7,56 (dd, 1H, J = 2,0, 8,1 Hz), 7,52 (s, 1H), 7,47 (dd,1H, J = 1,9, 8,9 Hz), 7,41 (d, 1H, J = 1,7 Hz), 7,25 (d, 1H, J = 1,7 Hz), 4,88(dd, 1H, J = 8,7, 11,0 Hz), 4,73 (dd, 1H, J = 2,3, 10,9 Hz), 4,31 (m, 1H), 4,12(dd, 1H, J = 3,1, 11,0 Hz), 3,95 (dd, 1H, J = 8,4, 11,2 Hz), 3,21 (t, 2H, J =7,1 Hz), 2,71 (t, 2H, J = 7,1 Hz), 2,45 (s, 3H); 13C RMN 169,54, 161,06,155,36, 134,21, 133,39, 132,54, 131,05, 128,39, 127,99, 123,98, 123,74,123,46, 123,31, 118,88, 115,99, 1 12,87, 112,31, 106,40, 101,33, 55,93,48,10, 42,61, 36,92, 30,81, 25,34, MS m/z+ 548,2 (M+Na), 550,2 (Μ+2+Na).

Ácido 5-(3-(metildissulfanil) propanamida)-1 H-indol-2-carboxílico.

À solução de ácido 3-(metildissulfanil) propanóico (1,18 g, 7,76mmols) em 50 ml de DMA foi acrescentado hidroxissuccinimida (1,14 g, 9,90mmols) e EDC (1,91 g, 9,96 mmols) sob argônio. A mistura foi agitada du-rante uma noite. Depois do término confirmado por TLC (1:6 de E-tAc/hexano), a mistura foi usada diretamente para a etapa seguinte sem pu-rificação adicional.

À solução de ácido 5-amino-1 H-indol-2-carboxílico (1,32 g, 7,49mmols) em 50 ml de 1:4 de Na2HPO4 a 0,5 M, pH 8,0/DMA a 0°C foi acres-centado gota a gota a solução do éster NHS acima preparado durante umahora. Depois da adição, a mistura foi continuamente agitada a 4°C por umahora e depois na temperatura ambiente por uma hora. A mistura foi concen-trada e purificada em cromatografia sobre Si02 eluída comTHF/tolueno/ácido acético (de 1%:4:02 a 1%:2:0,02) para produzir o produtodo título (1,62 g, 70%). 1H RMN (DMF-d7) 12,80 (br, 0,8 H), 11,66 (s, 1H),9,96 (s, 1H), 8,17 (s, 1Ή), 7,44 (s, 2H), 7,14 (d, 1H, J = 2,0 Hz), 3,20 (t, 2H, J=6,9 Hz), 2,72 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 2,37 (s, 3H). 13C RMN 169,53, 163,45,135,24, 133,38, 130,12, 127,99, 119,13, 113,10, 112,27, 108,04, 36,88,30,60. MS m/z 309,20 (M-1).

Exemplo 6.

Ácido (S)-3-((1 -(clorometil)-3-(5-(3-(metildissulfanil) propanamida)-1 H-indol-2-carbonil)-2,3-diidro-1 H-benzenoindolilóxi-5) carbonilamino) benzenossulfõ-nico (DC107SMe).

A uma solução de DC101 SMe ((S)-N-(2-(1 -(clorometil)-5-hidróxi-2,3-diidro-1 H-benzenoindol-3-carbonil)-1 H-indolil-5)-3-(metildissulfanil) pro-panamida, 100 mg 0,19 mmol) em 10 ml de DMA foi acrescentado DIPEA(35 μΙ, 0,20 mmol). Depois a mistura foi agitada sob Ar por 3 minutos, e fo-ram acrescentados 32,0 mg (0,20 mmol) de carbonildiimidazol. A mistura foiagitada durante 2 horas e a TLC mostrou que todo o DC101SMe foi consu-mido, então o sal 3-aminobenzenosulfonato diisopropiletilamina recém pre-parado (65 mg, 0,21 mmol) foi acrescentado. A mistura foi agitada sob Ar por24 h e a HPLC mostrou a reação concluída para formar DC107SMe [ácido(S)-3-((1-(clorometil)-3-(5-(3-(metil-isulfanil) propanamida)-1 H-indol-2-carbonil)-2,3-diidro-1 H-benzenoindolilóxi-5) carbonilamino) benzenossulfôni-co]. A mistura foi concentrada a ~5 ml com a bomba de óleo e usada direta-mente para a etapa seguinte sem purificação adicional.

Exemplo 7.

Ácido_(S)-3-((1-(clorometil)-3-(5-(3-mercaptopropanamida)-1H-indol-2-carbonil)-2.3-diidro-1 H-benzenoindolilóxi-5) carbonilamino) benzenossulfôni-co (DC107).

À solução concentrada acima mencionada foi acrescentado 60mg (0,62 mmol) de TCEP em 10 ml de 1:1 DMA/ NaH2PO4 a 0,4 M, pH 4,0.

Depois foi agitada sob Ar por 4 h, a mistura foi concentrada e purificada comuma coluna C-18 eluída com de 90% de ácido acético a 0,01% em DMA até40% de ácido acético a 0,01% em DMA. As frações foram coletadas e eva-poradas para produzir 94 mg (73%, duas etapas) de ácido (S)-3-((1-(clorometil)-3-(5-(3-mercaptopropanamida)-1H-indol-2-carbonil)-2,3-diidro-1H-benzenoindolilóxi-5) carbonilamino) benzenossulfônico (DC107). 1H RMN(DMF-d7) 11,63 (s, 1H), 10,51 (s, 1H), 9,89 (s, 1H), 8,33 (s, 2H), 7,93 (d, 1H,J = 8,3 Hz), 7,58 (m, 2H), 7,52 (m, 2H), 7,47 (m, 2H), 7,41 (m, 1H), 7,38 (m,1H), 7,25 (d, 1H, J = 1,7 Hz), 4,87 (dd, 1H, J = 8,7, 11,0 Hz), 4,74 (dd, 1H, J= 2,3, 10,9 Hz), 4,32 (m, 1H), 4,12 (dd, IH1J = 3,0, 11,0 Hz), 3,93 (dd, 1H, J= 8,4, 11,2 Hz), 3,21 (t, 2H, J = 7,1 Hz), 2,70 (t, 2H, J = 7,1 Hz); 13C RMN169,55, 161,30, 155,46, 150,21, 143,45, 134,22, 133,37, 132,54, 131,35,130,31, 128,38, 127,95, 123,78, 123,72, 123,48, 123,33, 121,41, 118,88,115,90, 112,88, 112,35, 106,44, 101,38, 55,95, 48,60, 42,67, 36,90, 25,01,MS m/z 676,90 (M-H), E34Onm = 19025 M"W1.

Conjugação de DC07 a anticorpos monoclonais.

O anticorpo huMy9-6, gue se liga ao antígeno CD33 preferivel-mente expressado na superfície de células AML humanas, foi selecionadopara a conjugação do DC07.

Exemplo 8.

Preparação de huMv9-6-SSNPB-DC07: um conjugado com ligação dissulfeto.

Na primeira etapa, o anticorpo foi reagido com o agente de mo-dificação N-sulfossuccinimidil 5-nitro-2-piridilditiobutanoato (SSNPB) paraintroduzir grupos nitropiridilditio. Uma solução de anticorpo huMy9-6 em umaconcentração de 8,5 mg/mL em um tampão aquoso contendo fosfato de po-tássio a 0,05 M, cloreto de sódio a 0,05 M, ácido etilenodiaminatetra-acético(EDTA) a 2 mM, 3% de dimetilacetamida (DMA), pH 6,5, foi tratado com umexcesso molar de 7,5 vezes de uma solução de SSNPB (20 mM armazena-do em DMA). A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente por 90minutos e purificada sobre uma coluna de Sephadex G25 pré-empacotadaque tinha sido anteriormente equilibrada com um tampão aquoso contendoNaH2PO4 a 0,1 M, NaCI a 50 mM, pH 6,5. A amostra purificada produziu98% do produto. Uma pequena alíquota do anticorpo modificado foi tratadacom ditiotreitol para clivar o nitro-piridil dissulfeto e o nitro-piridina-2-tionaliberado foi analisado espectrometricamente:

£325nm = 10.964 M"1citi"1 e s280nm = 3.344 M1 cm"1 a nitro-piridina-2-tiona, e £280nm = 206.460 M"1cm"1 o anticorpo. Uma média de 5,0 gruposnitro-piridildissulfeto foi ligada por cada molécula do anticorpo.

O anticorpo modificado foi diluído a 2,0 mg/mL no tampão acimamencionado em pH 6,5 com DMA a 5% e depois tratado com uma soluçãode DC07 em DMA, com um excesso de 2,5 fármacos por ligante. A misturade conjugação reagiu na temperatura ambiente durante 30 minutos. A mistu-ra reacional foi purificada pela passagem por uma coluna de Sephacril S300de filtração em gel, que foi anteriormente equilibrada em DMA a 20%,NaH2PO4 a 0,1 M, NaCI a 50 mM, pH 5,0. As frações contendo o conjugadoDC07 do anticorpo monomérico foram coletadas e dializadas em citrato a 10mM, NaCI de 135 mM, pH 5,0. O conjugado final foi analisado espectrome-tricamente usando dos seguintes coeficientes de extinção; S34Onm = 38.000M"1cm"1, S28Onm = 23.000 M"1cm"1 o fármaco, e S28Onm = 206.460 M"1cm"1 oanticorpo. O conjugado continha 3,5 fármacos por anticorpo.

Exemplo 9.

Preparação do huMy9-6-SMCC-DC07: um conjugado com ligação tioéter.

Na primeira etapa, o anticorpo foi reagido com o agente de mo-dificação succinimidil 4-(N-maleimidometil) cicloexano-1-carboxilato (SMCC).

Uma solução do anticorpo huMy9-6 em uma concentração de 8,5 mg/mL emum tampão aquoso contendo fosfato de potássio a 0,05 M, cloreto de sódio a0,05 M e ácido etilenodiaminatetra-acético (EDTA) a 2 mM, DMA a 3%, pH6,5 foi tratada com um excesso molar de 8,5 vezes de uma solução deSMCC (20 mM em DMA) na temperatura ambiente por 90 minutos. O anti-corpo modificado foi purificado sobre uma coluna Sephadex G25 pré-empacotada que foi anteriormente equilibrada em um tampão aquoso con-tendo NaH2PO4 a 0,1 M, NaCI a 50 mM, pH 6,5. A amostra purificada foi a-nalisada sespectrometricamente (S280nm = 206.460 M1 cm"1) para calcular aconcentração do anticorpo. A concentração de ligante ligado foi determinadapor um procedimento estabelecido que indiretamente mede a quantidade deligante disponível para a reação com o tiol contendo o aminoácido, cisteína.Foram determinados 6,0 Iigantes por modificação posterior de anticorpo.

O anticorpo modificado foi diluído a 2,0 mg/mL em NaH2PCXi a0,1 M, NaCI a 50 mM, DMA a 5%, pH 6,5 e tratado com DC07 a 0,20 mM(2,5 mois de DC07/ligante). Permitiu-se que a reação de conjugação prosse-guisse na temperatura ambiente durante 80 minutos. A reação então foi aci-dificada com o ácido acético a 5% e submetida à análise usando um sistemaHPLC equipado com uma coluna analítica de exclusão de tamanho (SEC)equilibrada com DMA a 20%, NaH2PO4 a 0,1 M, NaCI a 50 mM, pH 5,0 quelevou em conta a separação do anticorpo/conjugado do fármaco a partir doDC07 não reagido. O eluente da coluna foi controlado para absorbância a280 nM e 340 nM. A proporção de DC07 para o anticorpo foi determinadaespectgrofotometricamente como sendo de 3,5. (£34onm = 38.000 M-1Cm-1,e28onm = 23.000 M-1Cm'1 para o fármaco, e E28Onm = 206.460 M^cm"1 para oanticorpo).

Cálculo de proporção Fármaco/Ab a partir da análise de SEC:

DC07 = /W38000

huMy9-6 = [(A28o-(23.000*A34o))/38.000]/206.460

Fármaco/Ab = DC07/My9-6

Exemplo 10.

Resultados Biológicos.

Citotoxicidade do DC07-SMe (Figura 2) e do DCI-SMe (Figura1D) através de células RAMOS e HL60/S foi medido in vitro com uma expo-sição de 5 dias. Os resultados são dados na figura 6. Os IC5o são mostradosabaixo.

<table>table see original document page 53</column></row><table>

Foi medida a citotoxicidade de DCI-SPy e DC07-SPy atravésde células RAMOS e células HL60. Os resultados são dados na figura 7 e osIC50 são mostrados abaixo.<table>table see original document page 54</column></row><table>

A citotoxicidade do DC08-SSPy foi medida através das célulasRAMOS e Namalwa. Os resultados são dados na figura 8 e os IC5o são mos-trados abaixo.

<table>table see original document page 54</column></row><table>

A citotoxicidade do MY9-6-DC07 (ligação dissulfeto) foram me·didas através do antígeno positivo para células Kara e do antígeno negativopara células RAMOS. Os resultados são dados na figura 10 e os IC5o sãomostrados abaixo.

<table>table see original document page 54</column></row><table>

A citotoxicidade do huC242-DC07 (ligação tioéter) foi medidaatravés do antígeno positivo para as células COLO 205 e do antígeno nega-tivo para as células A-375. Os resultados são dados na figura 11 e os IC5osão mostrados abaixo.

<table>table see original document page 54</column></row><table>

Certas Patentes e publicações impressas foram referidas napresente descrição, e os ensinamentos das mesmas são aqui cada um in-corporado em suas respetivas totalidades pela referência.

Embora a invenção tenha sido descrita detalhadamente e comreferência a modalidades específicas da mesma, será evidente para umapessoa versada na técnica, que várias alterações e modificações podem serfeitas na mesma sem fugir do espírito e alcance da mesma.

Claims (34)

1. Pró-fármaco compreendendo um análogo da CC-1065 noqual o grupo fenólico da porção de alquilação da molécula é protegido porum grupo de proteção que aumenta a solubilidade em água da dita pró-fármaco, e em que o dito pró-fármaco adicionalmente compreende um Iigan-te capaz de conjugar a dita pró-fármaco a um agente de aglutinação celular,caracterizado pelo fato de que o grupo protetor é um carbamato contendoácido sulfônico.

2. Pró-fármaco de acordo com a reivindicação 1, em que o aná-logo da CC-1065 é selecionado do grupo consistindo em análogos formadosde uma primeira subunidade de acordo com a fórmula (I) covalentementeligado a uma segunda subunidade de acordo com as Fórmulas (II), (III)1 (IV),(V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X) ou (XI) via uma ligação amida do grupo aminosecundário da porção pirrol da primeira subunidade para a carboxila C-2 dasegunda subunidade, em que a fórmula (I) é como se segue:<formula>formula see original document page 55</formula>Em que as fórmulas de (II) a (XI) são como se segue:<formula>formula see original document page 55</formula><formula>formula see original document page 56</formula>em que Y representa um grupo de saída selecionado de um ha-leto (fluoreto, cloreto, brometo ou iodeto), metano sulfonato, para-toluenossulfonato, trifluorometano sulfonato, mononitro ou dinitro fenolato.Em que R, R', R1 a R6 são cada um independentemente hidro-gênio, alquil(C1-C3) linear, metóxi, hidroxila, amina primária, amina secundá-ria, amina terciária, ou amida ou um Iigante que promove a ligação do pró-fármaco a um agente de aglutinação celular, com a condição de que pelomenos um entre R, R', R1 a R6 seja um ligante.E em que: R7 é o dito ácido sulfônico contendo o grupo protetorcarbamato, ou os seus sais, hidratos, ou sais hidratados, farmaceuticamenteaceitáveis ou as estruturas cristalinas polimorfas desses compostos ou osseus isômeros óticos, racematos, diastereoisômeros ou enanciômeros.

3. Pró-fármaco de acordo com a reivindicação 2, em que R7 éum ácido sulfônico contendo carbamato de fenila de acordo com a fórmulageral XII:<formula>formula see original document page 57</formula>onde R9 é H ou um alquil ramificado, cíclico ou linear, R10, Rn,R-12, R13 são idênticos ou diferentes com pelo menos um sendo um grupo -X-SO3 M+ com M+ sendo H+ ou o cátion derivado de um átomo do grupo IA1 e Xsendo uma ligação direta ou um espaçador escolhido de uma molécula dehidrocarboneto de C1 a C4 linear ou ramificada do tipo alquileno, alquenila oualquinila, um -O-alquila-, um -S-alquila- e uma aminoalquila e os outros R10,R11, R12, R13 sendo H, um alquil(C1-C6) linear ou ramificado, -O-alquila, -S-alquila, hidroxila, amina primária, amina secundária, ou amida, halogênio,nitro, azida.

4. Pró-fármaco de acordo com a reivindicação 3, em que Rg = H.

5. Pró-fármaco de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em queR10, R11, R12, R13 são -X-S03"M+e os outros são H.

6. Pró-fármaco de acordo com as reivindicações de 2 a 5, emque R', R1 a R6 são hidrogênios e R é um ligante.

7. Pró-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, em que o dito ligante compreende um substituinte contendouma ligação tiol, sulfeto ou dissulfeto.

8. Pró-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, em que o dito ligante compreende um polietileno glicol de a-cordo com a fórmula -(OCH2CH2)n-, em que η é um número inteiro de 1 a 2.000.

9. Pró-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, em que o dito grupo ligante está de acordo com a fórmula:-G-D-(Z)p-S-Z';onde:G é uma ligação simples ou dupla, -O-, -S- ou -NT-;D é uma ligação simples ou é -E, -E-NT-, -E-NT-F-, -Ε-O-, -E-O- F-, -E-NT-CO-, -E-NT-CO-F-, -Ε-CO-, -CO-E-, -E-CO-F, -E-S-, -E-S-F-, -E-NT-C-S-, -E-NT-CS-F-;onde T é H ou um alquil(Ci-C6) linear ou ramificado;onde EeF são os mesmos ou diferentes e são independente-mente escolhidos de moléculas lineares ou ramificadas dos tipos-(OCH2)IaIquiI(O-CH2CH2)j-, -alquila-(0-CH2CH2)i-alquila-, -(O-CH2CH2)i-,-(O-CH2CH2)I-CiCloaIquiIa-(O-CH2CH2)i-, -(0-CH2CH2)i-heterocíclico(0-CH2CH2)j,-(0-CH2CH2)i-aril(0-CH2CH2)j-, -(O-CH2CH2)rIieteroariI(O-CH2CH2)r, -alquila-(0-CH2CH2)ralquila-(0-CH2CH2)j-, -alquila-(0-CH2CH2)r, -alquila-(0-CH2CH2)rcicloal-quil(0-CH2CH2)j-, -alquila-(0-CH2CH2)rheterocíclico(0-CH2CH2)r, -alquila-(0-CH2CH2)i-aril(0-CH2CH2)j-, -alquil(0-CH2CH2)rheteroaril(0-CH2CH2)r) -ciclo-alquil-alquila-, -alquila-cicloalquila-, -heterocíclico-alquila-, -alquila-heterocí-clico-, -alquila-aril-, -aril-alquila-, -alquila-heteroaril-, -heteroaril-alquila-;Onde i e j, são números inteiros idênticos ou diferentes e inde-pendentemente escolhidos de O, 1 a 2.000;Zé -alquila- linear ou ramificado;ρ é 0 ou 1;Z' representa H, um grupo protetor tiol tal como COR, R20 ouSR2O, em que R2O representa H, metila, alquila, opcionalmente cicloalquila,arila, heteroaril ou heterocíclico substituídas.

10. Pró-fármaco de acordo com a reivindicação 9, em que: G éuma ligação simples ou -NT-.

11. Pró-fármaco de acordo com a reivindicação 9 ou 10, em queG é -NT-.

12. Pró-fármaco de acordo com a reivindicação 9, 10 ou 11, emque D é -CO-E-.

13. Pró-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindica-ções de 9 a 12, em que E é um -alquila- linear ou ramificado.

14. Pró-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindica-ções de 9 a 13, em que: ρ é 0.

15. Pró-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindica-ções de 9 a 14, em que: Z' é H ou SR20, em que R20 representa alquila ouheteroarila.

16. Pró-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindica-ções de 1 a 15, em que o dito Iigante é escolhido de (CH2)PNHCO(CH2)mSZ,(CH2)pNHCOC6H4(CH2)mSZ, (CH2)pO(CH2)mSZ, (CH2)pNHCO(CH2)m(O-CH2CH2)nSZ,(CH2)pNHCOC6H4(CH2)ID(O-CH2CH2)nSZ, (CH2)pO(CH2)m(O-CH2CH2)nSZ,(CH2)pNHCO(CH2)mCH(Me)SZ, (CH2)pNHCOC6H4(CH2)mCH(Me)SZ1 (CH2)p(CH2)mCH(Me)SZ1(CH2)pNHCO(CH2)m(O-CH2CH2)nCH(Me)SZ, (CH2)pNHC0C6H4(CH2)m(0-CH2CH2)nCH(Me)SZ,(CH2)pO(CH2)m(O-CH2CH2)nCH(Me)SZ1 (CH2)pNHCO(CH2)mC(Me)2SZ1 (CH2)PNHCOC6H4.(CH2)mC(Me)2SZ, (CH2)pO(CH2)mC(Me)2SZ, (CH2)pNHCO(CH2)m(O-CH2CH2)nC(Me)2SZ,(CH2)pNHCOC6H4(CH2)m(O-CH2CH2)nC(Me)2SZ1 (CH2)pO(CH2)m(O-CH2CH2)nC(Me2)SZ1(CH2)pOC6H4(CH2)171SZ, (CH2)pOC6H4(CH2)mCH(Me)SZ, (CH2)p0C6H4(CH2)m(0-CH2CH2)nCHMeSZ, (CH2)pOC6H4(CH2)mCMe2SZ ou (CH2)pOC6H4(CH2)m(C)-CH2CH2)nC(Me)2SZ, em que o Z representa H, um grupo protetor tiol, talcomo Ac, Re ou SRe, em que Re representa metila, alquila linear, alquila ra-mificada, alquila cíclica, arila simples ou substituída ou heterocíclica, e mrepresenta um número inteiro de O a 10, η representa um número inteiro deO até 2.000, ρ representa um número inteiro de O a 10.

17. Pró-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindica-ções de 1 a 16, em que o dito Iigante é escolhido de (CH2)PNHCO(CH2)2SH,(CH2)pNHCO(CH2)2C(Me)2SH1 (CH2)pNHCO(CH2)2SSCH3, (CH2)pNHC0(CH2)2(0-CH2CH2JrSH, (CH2)pNHCO(CH2)2(O-CH2CH2)nC(Me)2SSCH3 e (CH2)PNHCO(CH2)2.(O-CH2CH2)nSSMe.

18. Pró-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindica-em que Y, R2, R2, R3, R4, R5, Rô, R7 e R são como definidos nasreivindicações de 2 a 17 e onde R é um Iigante como definido nas reivindica-ções de 7 a 17, ou os seus sais, hidratos, ou sais hidratados, farmaceutica-mente aceitáveis ou as estruturas cristalinas polimorfas desses compostosou os seus isômeros óticos, racematos, diastereoisômeros ou enanciômeros.

19. Pró-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindica-ções precedentes, que é:(S)-N-[2-{(1 -clorometil)-1,2-diidro-5-[(3-hidroxissulfonilfenil) ami-nocarbonilóxi]-3H-benzenoindolil-3}carbonil]-1 H-indolil-5]-5-[(3-metilditiopro-panoil)-amino]-1H-indol-2-carboxamida;(S)-N-[2-{(1 -clorometil)-1,2-diidro-5-[(3-hidroxissulfonilfenil)-ami-nocarbonilóxi]-3H-benzenoindolil-3}carbonil]-1H-indolil-5]-5-[(3-mercapto-propanoil)-amino]-1 H-indol-2-carboxamida;(S)-N-[2-{(1 -clorometil)-1,2-diidro-5-[(3-hidroxissulfonilmetil-fenil)aminocarbonilóxi]-3H-benzenoindolil-3}carbonil]-1H-indolil-5]-5-{[3-(2-piridilditio)-propanoil]-amino}-1 H-indol-2-carboxamida;(S)-N-[2-{(1-clorometil)-1,2-diidro-5-[(3-hidroxissulfonilmetil-fenil)aminocarbonil-óxi]-3H-benzenoindolil-3}carbonil]-1H-indolil-5]-5-[(3-mercapto-propanoil)-amino]-1H-indol-2-carboxamida;(S)-N-[2-{(1-clorometil)-1,2-diidro-5-[(3-hidroxissulfonilmetil-fenil)aminocarbonilóxi]-3H-benzenoindolil-3}carbonil]-1H-indolil-5]-5-[(3-mercaptopropanoil)-amino]-1 H-indol-2-carboxamida;Ou os seus sais, hidratos, ou sais hidratados, farmaceuticamen-te aceitáveis ou as estruturas cristalinas polimorfas desses compostos ou osseus isômeros óticos, racematos, diastereoisômeros ou enanciômeros.

20. Pró-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindica-ções de 1 a 17, em que a mesma consiste na Fórmula:<formula>formula see original document page 61</formula>em que Y, Ri, R2, R3, R4, R5, R6, R7 e R são como definidos nasreivindicações de 2 a 17, e onde R é um Iigante como definido nas reivindi-cações de 7 a 17, ou os seus sais, hidratos, ou sais hidratados, farmaceuti-camente aceitáveis ou as estruturas cristalinas polimorfas desses compostosou os seus isômeros óticos, racematos, diastereoisômeros ou enanciômeros.

21. Pró-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindica-ções de 1 a 17 e 20 que é o:ácido (S)-3-((1 -(clorometil)-3-(5-(3-mercaptopropanamida)-1 H-indol-2-carbonil)-2,3-diidro-1 H-benzenoindolilóxi-5)carbonilamino)benzenos-sulfônico;ácido (S)-3-((1-(clorometil)-3-(5-(3-(metildissulfanil) propanami-da)-1 H-indol-2-carbonil)-2,3-diidro-1 H-benzenoindolilóxi-5) carbonilamino)benzenossulfônico;ou os seus sais, hidratos, ou sais hidratados, farmaceuticamenteaceitáveis ou as estruturas cristalinas polimorfas desses compostos ou osseus isômeros óticos, racematos, diastereoisômeros ou enanciômeros.

22. Conjugado de pró-fármaco compreendendo um agente deaglutinação celular ligado por um grupo Iigante a um ou vários dos pró-fármacos como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes.

23. Conjugado de pró-fármaco de acordo com a reivindicação- 22, em que os ditos agentes de aglutinação celular são escolhidos de anti-corpos e fragmentos dos mesmos, interferons, linfocinas, vitaminas, hormô-nios e fatores de crescimento.

24. Conjugado de pró-fármaco de acordo com a reivindicação 22ou 23, em que os ditos agentes de aglutinação celular são anticorpos oufragmentos dos mesmos.

25. Conjugado de pró-fármaco de acordo com as reivindicações- 22, 23 ou 24, em que o grupo Iigante compreende o Iigante ligado a umafunção reativa através de a tiol, sulfeto ou dissulfeto.

26. Composição farmacêutica compreendendo um pró-fármacocomo definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 21, e um veículofarmaceuticamente aceitável.

27. Composição farmacêutica compreendendo o conjugado co-mo definido em qualquer uma das reivindicações de 22 a 25, e um veículofarmaceuticamente aceitável.

28. Uso de um pró-fármaco como definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 21, para o preparo de um medicamento para o trata-mento do câncer.

29. Uso de um conjugado como definido em qualquer uma dereivindicações de 22 a 25, para o preparo de um medicamento para o trata-mento do câncer.

30. Processo para a preparação de um composto como definidoem qualquer uma das reivindicações de 1 a 21, compreendendo a etapa deproteger o grupo fenólico da porção de alquilação do análogo corresponden-te da CC-1065 por um ácido sulfônico contendo a função de carbamato.

31. Processo de acordo com a reivindicação 30, em que: a rea-ção é realizada com CDI/DMA (carbonildiimidazol/dimetilamina) e o derivadoamino-fenilsulfonato correspondente de acordo com a fórmula:<formula>formula see original document page 63</formula>onde Rg1 R10, Rn, R12 R13 são como definidos na reivindicação 3.

32. Processo para a preparação de acordo com as reivindica-ções 30 ou 31, que adicionalmente compreende a etapa de hidrolisação oproduto obtido.

33. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 30 a 32, que adicionalmente compreende a etapa de isolamento do pro-duto desejado.

34. Processo para a preparação de um conjugado como definidoem qualquer uma das reivindicações de 22 a 25, compreendendo a etapaonde um análogo da CC-1065 como definido em qualquer uma das reivindi-cações de 1 a 21, compreendendo um sulfeto, dissulfeto ou grupo tiol, é rea-gido com um agente de aglutinação celular compreendendo uma função rea-tiva através do sulfeto, dissulfeto ou tiol para que o análogo e o agente deaglutinação celular sejam ligados em conjunto via uma ligação covalentesulfeto ou dissulfeto.