TW200813028A

TW200813028A - Improved prodrugs of CC-1065 analogs

Info

Publication number: TW200813028A
Application number: TW096107668A
Authority: TW
Inventors: Robert Zhao; Ravi V J Chari
Original assignee: Sanofi Aventis
Priority date: 2006-03-07
Filing date: 2007-03-06
Publication date: 2008-03-16
Also published as: EP1993999A1; NO20083910L; UY30190A1; US8012978B2; AU2007222123A1; AR059767A1; WO2007102069A1; PE20080691A1; US20110280890A1; EP1832577A1; IL193673A0; JP2009529030A; BRPI0708654A2; MA30322B1; KR20080106919A; US20090028821A1; DOP2007000041A; MX2008011431A; EA200870327A1; CA2642870A1

Description

200813028 (1) 九、發明說明【發明所屬之技術領域】本發明係關於新穎胞毒劑前藥及彼等的治療用途。更特定言之，本發明關於新穎胞毒性前藥，彼等爲cc_1065 的同藥物且其同時包含一用於化學鍵聯到細胞結合劑的基團及一可在活體內（in vivo)斷裂的保護基。該等前藥可化學鍵聯到細胞結合劑以提供能夠在活體內被活化且釋放出之治療劑，且可用目標導向方式遞送到特定細胞族群。【先前技術】許多報告問世且都關於用單株抗體-藥物共軛物目標導向到腫瘤細胞{Sela et al，in Immunoconjugates，ρρ· 198-216 ( C. Vogel，ed· 1 987 ) ; Ghose et al，in Targeted

Drugs, pp. 1-22( E. Goldberg, ed· 1 983 ) ; D i e n e r et al，in Antibody Mediated Delivery Systems， pp. 1-23 ( J. Rodwell, ed. 1988) ； Pietersz et al, in Antibody Mediated

Delivery Systems, pp. 2 5 -5 3 ( J. Rodwell, ed. 1 98 8 ) i Bumol et al，in Antibody Mediated Delivery Systems，pp. 5 5- 79 ( J. Rodwell, ed. 1988 ) ； G.A. Pietersz & K. Krauer, 2 J. Drug Targeting, 1 83 -2 1 5 ( 1 994 ) ； R.V.J. Chari, 31 A d v. Drug Delivery Revs·，89-104 ( 1 998 ); W.A. Blattler & R.V.J. Chari, in Anti cancer Agents, Frontiers in Cancer Chemotherapy， 3 1 7-3 3 8， ACS

Symposium Series 796; and I. Ojima et a 1 eds, American 200813028

Chemical Society 2001}。胞毒性藥物諸如氨甲嗓B令（ methotrexate )、柔紅黴素（daunorubicin)、阿黴素（ doxorubicin )、長春花驗（v i n c r i s t i n e )、長春鹼（ vinblastine )、左旋溶肉瘤素（melphalan)、絲裂黴素C 、苯丁酸氮芥（chlorambucil )、卡奇黴素（ calicheamicin)和類美坦生（maytansinoids)業經共軛到多種鼠類單株抗體。於某些情況中，藥物分子係透過中間載體分子聯結到抗體分子；諸如用血清白蛋白{Garnett et al，46 Cancer Res. 2407-2412 ( 1986) ; Ohkawa et a 1, 23

Cancer Immunol. Immunother. 8 1 -86 ( 1 9 8 6 ) ； Endo et al， 4 7 Cancer Res. 1076-1080 ( 1980) }，葡聚糖{Hurwi tz et al? 2 Appl. Biochem. 2 5 -3 5 ( 1 980 ) ； Manabi et al，34

Biochem. Pharmacol. 2 8 9-29 1 ( 1 985 ) ； D i 11 m a n e t a 1，4 6

Cancer Res. 48 8 6-489 1 ( 1 986 ) ； and Shoval et al，8 5

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A· 8276-8280 ( 1 98 8 ) }，或聚穀胺酸{Tsukada et al ,73 J· Natl· Cane· Inst· 72 1 -729 ( 1 984 ) ； Kato et al，27 J. Med. Chem. 1 602- 1 607 ( 1 984 ) ;Tsukada et al，52 Br. J. Cancer 111-116 ( 1985) }。如今有廣多種聯結子（linkers )可用來製備此等免疫共軛物’包括可斷裂與不可斷裂的聯結子。不過，試管內 (in vitro )胞毒性試驗已揭露出抗體-藥物共軛物罕於達到與游離未共軛藥物相同的胞毒效力。此可推測藥物分子從共軛抗體釋放出所用的機制非常沒有效率。在免疫毒素範疇中的早期硏究顯示透過在單株抗體與催化活性蛋白質 -5- 200813028 (3) 毒素之間的二硫化橋聯所形成的共軛物比含有其他聯，結子的共軛物更具胞毒性{Lambert et al，260 J· Biol· Chem· 12035-1204 1 ( 1 9 8 5 ) ; Lambert et al，in Immunotoxins 175-209 ( A. Frankel，e d. 1 9 8 8 ) ； Ghetie e t al，48 Cancer

Res. 26 1 0-26 1 7 ( 1 988 ) }。此種改善的胞毒性歸因於在抗體分子與毒素之間的二硫鍵之有效率斷裂所致經還原的穀胱甘肽（glutathione )之高細胞內濃度。類美坦生與卡奇黴素爲已透過二硫鍵聯結到單株抗體的高胞毒性藥物之首現例子。此等藥物的抗體共軛物業經證明擁有高試管內效力及在小鼠體內的人類腫瘤異種移植模型中之異常抗腫瘤活性{R. V. J. Chari et al·, 52 Cancer Res.，127-131 ( 1992 ); C. Liu et al·，93，Proc. Natl. Acad. Sci., 86 1 8-8623 (1 9 9 6 ) ; L. M. Hinman e t al·，53，Cancer Res.，3 5 3 6- 3 5 4 2 ( 1 9 9 3 ) ; and P.R. Hamann et al，13，BioConjugate

Chem·，40-46 ( 2002) } o 一種製備此等胞毒性共軛物所用的具吸引性之候選物爲 CC-1065，此爲一種從 Streptomyces zelensis 培養液離析出的強效抗腫瘤抗生素。CC- 1 065在試管內比常用的抗癌藥物，諸如阿黴素、氨甲喋呤和長春花鹼更強效約 1000 -倍{Β· K. Bhuyan e t a 1., Cancer Res·, 42, 3532-3537 (1 9 8 2 )卜 CC- 1 065的結構（化合物1，圖1 A )業經用x-射線晶體學測定過{Martin，D. G. et al, 33 J. Antibiotics 902-903 (1980 ) ，and Chidester，C. G·，et al，103 J. A m. C h e m · 200813028 (4)

Soc· 7629-7635 ( 1981) }。C-1065 分子係由 3 個經取代的吡咯并吲哚部份經醯胺鍵聯結所構成。” A”次單元具有一含有該分子中唯有的不對稱碳的環丙基環。雖然從X-射線數據只能得到此等碳之相對構型，不過經由使用 DNA作爲手性劑（Chiral reagent)業已將其絕對構型推知爲3b-R、4a-S {Hurley, L. H. e t al，2 2 6 Science 843 - 844 ( 1 9 84 )}。CC- 1 065的”B”和’’C”次單元爲相同的吡咯并吲哚部份。 CC- 1 065的胞毒性效力業經與其烷基化活性及其 DNA-結合或DNA-插入活性相關聯。此兩種活性係存在於該分子的個別部份之中。例如，烷基化活性係包含在環丙烷吡咯并吲哚（CPI)次單元中而DNA-結合活性存在於兩個吡咯并吲哚次單元中（圖1 A )。不過，雖CC- 1 065具有某些作爲胞毒劑的吸引性特徵，其在治療用途上仍具有限制。給小鼠投予C- 1 065會造成延遲的肝毒性，導致在單一 12.5微克/公斤的靜脈內劑量後的第 50 天死亡{V. L. Reynolds et al·，J. Antibiotics， XXIX，319-334 ( 1986) }。此已激勵開發不會引起延遲毒性的同系物之努力，且已有述及以CC- 1 065模型化的更簡單同系物之合成{M. A. Warpehoski et al.，J. Med. Chem.， 3 1，590-603 ( 1 988 ) }。於另一系列的同系物中，CPI部份係以環丙烷苯并吲哚（CBI)部份予以置換{D.L· Boger et al·，J. Org. Chem·，55，5 823 -5 8 3 3，（ 1 990 ) ，D.L·

Boger et a]·，BioOrg. Med. Chem. Lett., 1，1 1 5 - 1 20 ( 1 99 1 200813028 (5) )}。此等化合物維持其母體藥物之高試管內效力，不會引起在小鼠體內的延遲毒性。如同CC- 1 065 —般，此等化合物係以共價方式結合到DNA的小溝以造成細胞死亡之烷基化劑。不過，最有希望的同系物，Adozelesin和 Carzelesin，的臨床評估卻導致令人失望的結果{B· F· Foster et al., Investigational New Drugs, 1 3, 32 1 -3 26 ( 1 996 ) ； I. Wolff et al·，Clin. Cancer Res·，2,1 7 1 7- 1 723 ( 1 996 ) }。此等藥物都因爲彼等的高全身性毒性而顯示不良的治療效用。 CC- 1 065的治療效力可經由透過目標導引到腫瘤部位改變活體內（in vivo)分布，導致對非目標組織的較低毒性，及因而，較低的全身性毒性，而大幅地改良。爲了達到此目標，已有述及CC- 1 065同系物和衍生物與可特異地目標導向到腫瘤細胞的細胞結合劑之共軛物{美國專利； 5,475,092; 5,585,499; 5,846,545}。此等共軛物典型地顯示出試管內高目標特異性胞毒性，及在小鼠體內的人類腫瘤異種移植模型中之異常抗腫瘤活性{R. V. J. Chari et al·，Cancer Res·, 55，4079-4084 ( 1995) } 〇細胞結合劑典型地只溶於水性介質內，且通常貯存於水溶液中。因此，此等同系物必須擁有足夠的水溶性以促成與細胞結合劑的有效反應及隨後在水溶液中的調配。此外，爲了使細胞結合劑共軛物具有可用的擱置壽命，重要者爲要聯結到此等細胞結合劑的C C -1 〇 6 5同系物要在水溶液內穩定一段長時間。 200813028 (6) 螫、到目前爲止所述及的CC- 1 065同系物（參閱， 1B和1C )都只微溶於水中。因爲CC_ 1 065同系物解度，現今與細胞結合劑的共軛反應都必須在極稀液內實施。如此一來，此等前藥必須具有相較於母高的水溶性。此外，到目前爲止已述及的CC- 1 06 5同系物都原因而在水溶液中頗不穩定。該藥物的seco -形式地轉變爲環丙基形式，此隨即可能將DNA烷基化在時。不過，環丙基形式與水的競爭反應會導致環的打開產生羥基化合物，其爲非活性者。因此，有護CC- 1 065同系物的反應性部份以延長彼等在水溶可用壽命，例如經由CC- 1 06 5同系物的前藥之開發再者，也因而有需要開發出在水溶液內貯存之常穩定之CC-1065同系物之前藥。較佳者，此等前只在活體內才轉化成活性藥物。在該前藥經注輸到內之後，其較佳者應該有效地轉化成活性藥物。

Carzelesin爲一種前藥，其中在adozelesin中被以苯基胺基甲酸酯形式保護住{L. H. Li et al.， Res·，52，4904-4913 ( 1992) }。不過，此前藥用於途時太不穩定，且相比於母藥也沒有提供水溶性的於第二個例子中，CC- 1 065同系物的酚殘基係經糖成前藥（美國專利5,646,298 )。不過，此前藥不體內轉化成活性藥物，且需要額外地投予來自細菌素將其轉化成胞毒性形式。例如圖的微溶的水溶藥更提因下述會自然，若存丙基環需要保液中的〇際爲非藥必須病人體的酚基 Cancer 治療用增加。化而製能在活源之酵 -9- 200813028 (7) 有一些與CC- 1 065無關的抗癌藥物例子業經轉化成水溶性前藥。於抗癌藥i r i η 〇 t e c a η中，係以4 -哌Π定基·哌啶基胺基甲酸鹽保護其酚基。業經報導者，此保護基可賦予該藥物水溶性。此外，該前藥可在人類活體內輕易地轉化成活性藥物，也許是經由在人體血清、腫瘤組織及某些器官內天然存在的酵素羧基酯酶所致{A. Sparreboom，4, Clin. Cancer Res·，2747-2754 ( 1 998 ) . L. P. Rivory et al., 52, Biochem Pharmacol., 1 1 03 - 1 1 1 1 ( 1 9 9 6 ) } o 類似地，抗癌藥物etopeside磷酸酯爲具有磷酸酯保護基且可在活體內迅速轉化爲活性藥物的前藥之一例子，其可能是透過由內源性鹼性磷酸酶的水解所致{S. Z. Fields et al.，1 Clin· Cancer Res·，1 05- 1 1 1 ( 1 995 ) } 〇最近，R. Y. Zhao et al. ( US 6,756,3 97 B2)揭示 CC-1 065同系物的第一類水溶性前藥，其包括在分子的烷基化部份所具酚環上的胺基甲酸酯或磷酸酯取代基。本案發明人發現含此等類型的取代基之化合物所具溶解度在生理條件可能仍不足。此外，此等化合物可能需要特定藥劑諸如磷酸酯酶的作用來轉化彼等成爲生物學活性形式。因此，對於在水溶液中具有增加的溶解度及/或可輕易溶解在生理條件中的CC- 1 065同系物存在著普遍的需要。此外，有十分需要來促成彼等在水溶液中對細胞結合劑的共軛拚合，同時還保存彼等的生物學活性。此外，爲了減低毒性副作用，有利地爲提供呈可主要在所欲治療部位轉化成胞毒性藥物且較佳者是透過在生理p Η的自然水解者之前藥形 -10- 200813028 (8) 、式的C C - 1 0 6 5同系物。所有此等和更多的優點都由本文所述發明提供，如由諳於此技者在閱讀下面的揭示和實施例後所明白者。【發明內容】本發明的目的爲提供CC- 1 06 5同系物的前藥，其在水性介質中具有提高的溶解度。此項和其他的目的經由提供其中在分子的烷基化部份所具酚基以能使藥物在貯存於酸性水溶液內具穩定性的官能性予以保護所得前藥而達成。此外，該保護基可賦予該藥物相對於未保護同系物較增加的水溶性。該保護基可在生理pH下之活體內輕易地斷裂而得到對應的活性藥物。於本文所述前藥中，酚取代基係保護成含磺酸的苯基胺基甲酸酯形式，其在生理pH下帶電荷，且因而具有提高的水溶性。爲了進一步提高水溶性，可在吲哚次單元與可斷裂鍵聯諸如二硫基之間的聯結子之中導入隨意的聚乙二醇間隔子（Spacer )。此間隔子的導入不會變更該藥物的效力。本發明一更特定具體實例提供一種前藥，其包含一具有保護基的含Seco-環丙烷并苯并吲哚胞毒性藥物之同系物，其可提高水溶性和穩定性且可在生理pH下活體內斷裂。此特定具體實例的前藥具有第一次單元與第二次單元，由第一次單元的吡咯部份所含二級胺基至第二次單元所含C-2羧基之醯胺鍵所聯結。第一次單元爲如式（I )所示者，且共軛到選自式（II )·( XI )中的第二次單元： -11 - 200813028

R5

(Π)

OH)

HOOC

(VH)

HOOC

-12- (VIII) 200813028 (10)

或彼等的藥學上可接受之鹽類、水合物、或水合鹽類、或此等化合物的多形性晶體結構，或彼等的光學異構物、外消旋物、非鏡像異構物或鏡像異構物，其中： Y表選自，但不限於，鹵基（氟基、氯基、溴基或碘基）、甲烷磺酸酯基、對-甲苯磺酸酯基、三氟甲烷磺酸酯基、單硝基或二硝基苯氧基之中的脫離基。較佳者該脫離基爲氯基或溴基。 R、R’、Ri-Re各自獨立地爲氫、Ri-Rs線型烷基、甲氧基、羥基、一級胺基、二級胺基、三級胺基、或醯胺基或爲提供前藥對細胞結合劑的鍵聯之聯結子，此處此等鍵聯較佳地係通過硫鍵或二硫鍵，且其限制條件爲R、R’、

Ri-R6中至少有一者爲聯結子。較佳地，R爲聯結子。該聯結子可包含聚乙二醇間隔子。 R7爲保護基，其可在活體內（in vivo)斷裂且其可提高含環丙烷并苯并吲哚的胞毒性藥物之水溶性，且其爲含 -13- 200813028 (11) 礦酸的苯基胺基甲酸酷。R?具有通式XII:

(XII) 此處R9爲Η或r r . ^ _ Λ C】_C4支鏈型或線型烷基。、R12、R丨3爲相同或不円去 _ . 十同者’其中至少一者爲_X-S〇3-m + 基，其中M +爲H +或衍乐白生自IAS矢原子的陽離子，諸如Na + 、Κ+、等’且X爲直接鍵或爲選自〇至c"泉型或支鏈型院基、烯基或決基， 0β ^ 一〜"，一 U >兀趣…· b沅棊-和胺棊烷基之間隔子且其他的Ri〇、Ru、&2或R"爲H、C】_C0支鏈型或線型烷基、-0烷基、4烷基、羥基、一級胺基、二級胺基、或醯胺基、鹵基、硝基、疊氮基。根據一較佳具體實例，本發明前藥具有下式：

所定義者且其中R爲本文所定義的聯結子，或彼等的藥學上可接受之鹽類、水合物、或水合鹽類 ’或此等化合物的多形性結晶結構或彼等的光學胃_ %、消旋物、非鏡像異構物或鏡像異構物。較佳者，該前藥係選自下列所構成的群組： (S) -N-[2-{ ( 1-氣甲基）-1，2 -一氫·5-[ ( 3_ 經基 _磺醯基苯基）胺基羰氧基]-3Η-苯并（e)吲哚-3-基}锻基]_ -14 200813028 ’ （12) ， 1 Η-吲哚-5-基]-5-[ ( 3-甲基二硫基丙醯基）-胺基]-1 Η-吲哚-2-羧醯胺； (S) -N-[2-{ ( 1-氯甲基）-1，2·二氫-5-[ (3·羥基-磺醯基苯基）胺基羰氧基]-3Η-苯并（e)吲哚-3-基}羰基]-1H-吲哚-5-基]-5-[ ( 3-氫硫基丙醯基）-胺基]-1H-吲哚- 2-羧醯胺； (S) -N-[2-{ ( 1-氯甲基）-1，2·二氫-5-[ ( 3·羥基-磺醯基甲基苯基）胺基羰氧基]-3Η-苯并（e )吲哚-3-基}羰基]-1H-吲哚-5-基]-5-{[3- ( 2-吡啶基二硫基）-丙醯基]-胺基}-1Η-吲哚-2-羧醯胺； (S) -Ν·[2-{ ( 1-氯甲基）-1，2·二氫- 5·[ ( 3-羥基-磺醯基甲基苯基）胺基鑛氧基]-3Η -苯并（e)卩引哚-3-基}羰基]-1H-吲哚-5-基]-5-[ ( 3-氫硫基丙醯基）-胺基]_1H_D引哚-2-羧醯胺； (S) -N-[2-{ ( 1-氯甲基）-1，2-二氫-5- [ ( 3-經基-磺醯基甲基苯基）胺基羰氧基]-3H -苯并（e)卩引哄_3_基}_ 基]·1Η·卩引哄-5 -基]-5-[ ( 3·氫硫基丙醯基）-胺基]引哚-2-羧醯胺；或彼等的藥學上可接受之鹽類、水合物、或水合鹽類 ’或此等化合物的多形性結晶結構或彼等的光學異構物、消旋物、非鏡像異構物或鏡像異構物。根據另一較佳具體實例，該前藥具有下式： -15- 200813028 (13)

其中 Y、Rl、R2、R3、R4、R$、R6、R7 和 R 皆爲上面所定義者且其中R爲本文所定義的聯結子，或彼等的藥學上可接受之鹽類、水合物、或水合鹽類，或此等化合物的多形性結晶結構或彼等的光擧異構物、消旋物、非鏡像異構物或鏡像異構物。較佳者，該前藥係選自下列所構成的群組： (S) -3-( (1-(氯甲基）-3- (5- (3 -氫硫基丙醯胺基）-1H-吲哚-2-羰基）-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基氧基）羰基胺基）苯磺酸； (S ) -3- ( ( 1-(氯甲基）-3- ( 5· ( 3-(申基二硫基 )丙釀胺基）-ΙΗ-卩引哄-2-鑛基）-2,3· 一氣苯并[e] 口引哚-5-基氧基）羰基胺基）苯磺酸；或彼等的藥學上可接受之鹽類、水合物、或水合鹽類，或此等化合物的多形性結晶結構或彼等的光擧異構牧j、消旋物、非鏡像異構物或鏡像異構物。本發明前藥可用於胞毒性共軛物中，其中〜,細胞，結# 劑係透過一聯結基聯結到一或多個本發明前藥。該聯結基包含上面所定義的聯結子，其聯結到對該細胞結合劑所含硫醇、硫鍵或二硫鍵具反應性之官能基。細胞結合劑包括抗體和其片段，干擾素，淋巴,細胞活 -16- 200813028 . (14) . 素，維生素，激素和生長因子。本發明也提供含有此等共軛物之藥學組成物。該胞毒性共軛物可用於一種治療患者的方法中，包括投予有效量的上述藥學組成物。根據所選細胞結合劑所結合的細胞類型，可以經由活體內（in vivo )、活體外（ex vivo )或試管內（in vitro )任一方式治療許多種疾病。此等疾病包括，例如，許多類型癌症（包括淋巴瘤，白血病，肺癌、乳房癌、結腸癌、前列腺癌、腎癌、胰臟癌、和類似者）的治療。如此，本發明提供CC- 1 065同系物之前藥，其具有改善的水溶液內的溶解性和穩定性，且其在被活化產生烷基化藥物之時保留胞毒性，且其可經由利用對特定細胞結合劑的共軛而用在標靶特定細胞類型。發明之詳細說明本案發明人發現經由用適當的保護基將同系物的烷基化基團保護基可提高某些CC- 1 06 5同系物的穩定性，水溶性和用處。本案發明人藉此提供CC- 1 065同系物的前藥，其具有提高的水溶性且其進一步能夠聯結到細胞結合劑，由此經由透過前藥目標導向性遞送到腫瘤部位改變活體內分布，導致對非目標組織的較低毒性，因而降低系統性毒性，而提高此等CC- 1 065同系物的前藥之治療效力。生理 pH將該前藥實質地轉化爲其活性藥物形式，且於具有對細胞結合劑的可切斷聯結子之具體實例中，會釋放出該 -17- 200813028 ^ (15) k cc- 1 065同系物的活性藥物形式，因而進一步提活性。或者’可先在目標細胞內斷裂對細胞結合子以釋放出前藥，接著在內源地轉化成活性藥物爲了達到此目標，本案發明人合成CC-1065 範例前藥（圖 2-4B)，彼等爲含seco-環丙烷并 (C BI )的胞毒性前藥，其包含·· （ a )式（I ) 元’其在酚羥基處經保護基保護以提高水溶性且理PH活體內斷裂，及（b)具有由式（11)-( 一者表出的結構之第二次單元，且其包含一聯結該前藥共軛到細胞結合劑。該聯結子可包含聚乙子（圖3 )。將該前藥的保護基移除產生保留母高胞毒性之活性藥物形式。聯結子係用來共軛到劑，較佳者係包含二硫鍵或硫鍵（於本文中稱爲: 先前已證實將高胞毒性藥物使用可切斷的鍵二硫鍵聯結到抗體可確保完全活性藥物釋放到細且此等共軛物係具抗原特異性方式的胞毒性者 Chari et al，52 Cancer Res. 1 2 7- 1 3 1 ( 1 992 )； Chari et al., 5 5 Cancer Res. 4079-4048 ( 1 995 ) 專利第 5,208,020和5,475,092}。於本發明中，人述及CC- 1 06 5同系物前藥的合成，彼等共軛到的程序及測量此等共軛物的試管內胞毒性與特異序。因此，本發明提供有用的化合物，用以製備消除要殺死或溶解的病態或異常性細胞諸如腫瘤毒感染細胞、微生物感染細胞、寄生物感染細胞高胞毒性劑的聯結〇同系物的苯并吲哚第一次單其可在生 XI )中任子用於將二醇間隔體藥物的細胞結合流_ )。聯，諸如胞內部， {R. V. J. R. V. J. ;及美國本案發明單株抗體性所用程治療劑以細胞、病、自體免 -18- 200813028 ^ (16) . 疫性細胞（產生自體抗體之細胞）、活化細胞（涉及在移植體排斥或移植體對宿主疾病中者）或任何其他類型的病態或異常性細胞，同時展現出最小副作用。如此，本發明教導CC- 1 065前藥同系物和衍生物之合成；彼等可化學聯結到細胞結合劑且在釋出保護基之後，維持母體化合物CC- 1 06 5的高度胞毒性。另外，在活化之後，此等化合物於聯結到細胞結合劑時對該細胞結合劑所結合到細胞具有胞毒性而對非目標細胞則具遠較爲低的毒性。本發明的前藥根據本發明的前藥包含CC-1065同系物，其中該分子的烷基化部份所含酚基係經保護住且該前藥進一步包含一能夠將該前藥共軛到細胞結合劑之聯結子。該前藥可包含通過一醯胺鍵聯結的第一和第二兩個次單元。根據本發明某些具體實例，該CC-1065同系物的前藥具有一第一次單元，其爲呈其開放鹵甲基形式的sec〇-CBI (環丙烷并苯并吲哚單元），其中該第一次單元具有用可活體內斷裂的水溶性保護基保護住之酚羥基。本發明某些具體實例的前藥所含第二次單元包含CC-1 065所含B次單元或合倂B和C次單元的同系物（圖1)，彼等爲2-羧基-吲哚或2-羧基苯并呋喃衍生物，且爲式（u ) - ( ΧΙ ) 所表者。如從天然CC- 1 06 5和從業經公開的同系物所具性質可確定者{如，Warpehoski et al，31 J. Med. Chem. 590- -19- 200813028 (17) 603 ( 1988)，Boger e t al，66 J. Org· C hem. 6654-6661 ( 20 0 1) }，B和C次單元也可包含其他雜環或取代雜環且因而可在吲哚或苯并呋喃環上的不同位置載有不同取代基，對應於式（II ) - ( XI )的位置者，且仍保留強力胞毒活性。爲了將CC- 1 065同系物的前藥聯結到細胞結合劑，該前藥必須先包括一基團使該衍生物可通過鍵聯諸如二硫鍵、硫鍵（或於本文中稱爲硫醚）、酸-不穩定基、光不穩定基、肽酶不穩定基、或酯酶不穩定基，聯結到細胞結合劑。該前藥同系物係經製備成使得彼等包含一將該同系物通過，例如，二硫鍵、硫醚鍵、酸不穩定基、光不穩定基、肽酶不穩定基、或酯酶不穩定基，聯結到細胞結合劑所需的基團。爲了進一步提高在水溶液中的溶解度，該聯結子可含一聚乙二醇間隔子（圖3 )。較佳者爲使用二硫鍵聯，因爲目標細胞的還原性環境可導致二硫鍵的斷裂及前藥的釋放（或藥物釋放，取決於前藥從細胞結合劑斷裂及保護基水解之相對順序），伴隨著胞毒性之增加。更特定言之，根據本發明某些具體實例’ CC- 1 06 5同系物的前藥包含第一和第二兩個次單元，彼等係通過從第一次單元的吡咯基團所含二級胺基對有式（Π ) - ( XI )的第二次單元所含C-2羧基之醯胺鍵而共價鍵聯。在式（II ) - ( XI )內，聯結子可促成CC- 1 065同系物的前藥對細胞結合劑之鍵聯。該聯結子可含聚乙二醇間 -20- 200813028 ^ (18) ^ 隔子。其例子包括可促成通過二硫鍵、硫醚鍵、酸不穩定基、光不穩定基、肽酶不穩定基、或酯酶不穩定基發生鍵聯之基團，且其爲技藝中熟知者{參閱，例如，美國專利 5,846,545，其以引用方式納入本文}。較佳基團爲可通過二硫鍵促成鍵聯者，例如硫醇（DC1、DC07、DC08 )或二硫化物（CDl-SMe，CD07-SMe，DC08SPy，參閱圖 2-4B )。也可以使用含任何終端脫離基的混合二硫化物，諸如含硫甲基（DCl-SMe、DC07-SMe) ，DC08SPy、穀胱甘肽、烷基硫醇、吡啶基硫基、芳基硫醇、硝基吡啶基硫基、羥基羰基吡啶基硫基、（硝基）烴基羰基-吡啶基硫基，和類似者，但其限制條件爲此等二硫化物能夠進行二硫鍵交換反應用以將該前藥偶合到細胞結合劑。該聯結子可隨意地進一步包含一插置在鍵聯促成部份所含反應性基與 2-羧基-吲哚或2-羧基-苯并呋喃衍生部份之間的間隔子區〇較佳者，該聯結子具有下式： -G-D-(Z)p-S-Z’ 此處 G爲單鍵或雙鍵，-〇-、-S-或-NT-; D 爲單鍵或-E-、-E-NT-、-E-NT-F-、-E-Ο-、-E-0-F· 、-E-NT-CO-、-E-NT-CO-F-、-E-CO-、-CO-E-、-E_CO-F-、-E-S·、-E-S-F-、-E-NT-C-S，、-E-NT-CS-F，此處T爲Η或C ! - C 6支鏈型或線型烷基；此處Ε和F爲相同或不同者且爲獨立地選自線型或支 •21 - 200813028 β (19) . 鏈型-(〇CH2CH2) i 烷基（OCH2CH2) j-、 -烷基(OCH2CH2 ) i-烷基-、-(〇CH2CH2 ) i-、 -(OCH2CH2) i 環烷基（OCH2CH2) j-、- ( OCH2CH2) i 雜環基(OCH2CH2 ) j— - ( OCH2CH2 ) i 芳基（OCH2CH2) j-、-(OCH2CH2 ) i 雜芳基（OCH2CH2 ) J·、-烷基-( OCH2CH2 ) i 院基（OCH2CH2 ) j-、-垸基-(〇CH2CH2 ) i-、-烷基-(〇CH2CH2 ) i 環烷基（OCH2CH2 ) j-、 -烷基-(〇CH2CH2 ) i 雜環基（OCH2CH2 ) j-、 -烷基-(0CH2CH2 ) i 芳基（OCH2CH2 ) j-、-烷基-( OCH2CH2 ) i雜芳基（OCH2CH2 ) j-、-環烷基-烷基-、烷基-環烷基·、-雜環基-烷基-、-烷基-雜環基-、-烷基-芳基-、-芳基·烷基-、烷基-雜芳基-、-雜芳基-烷基-; 此處i和j爲相同或不同的整數且爲獨立地選自0、1 至 2000 ; Z爲線型或支鏈型-烷基-; P爲0或1 ; Z’表Η，硫醇保護基諸如COR、R2G或SR2G，其中 R2Q表Η、甲基、烷基、經隨意取代的環烷基、芳基、雜芳基或雜環基。下列具體實例或彼等的任何組合爲較佳者： -G爲單鍵或-NT-; -G 爲-NT-; -D 爲-CO-E-; • -E爲線型或支鏈型-烷基-; -22- 200813028 (20) 霉 -P 爲〇， -Z’爲Η或SR2〇，其中R2〇表烷基或雜芳基。聯結子的較佳具體實例包括 (CH2 ) pNHCO ( CH2 ) mSZ、 (CH2 ) pNHCOC6H4 ( CH2 ) mSZ、( CH2 ) pO ( CH2 ) mSZ 、(CH ) pNHCO ( CH2 ) m ( OCH2CH2 ) nSZ、 (CH2 ) pNHCOC6H4 ( CH2) m ( OCH2CH2) nSZ > (CH2) pO ( ch2 ) m ( OCH2CH2 ) nSZ > (CH2 ) pNHCO ( CH2 ) mCH ( Me ) SZ、 (CH2 ) pNHCOC6H4 ( CH2) mCH ( Me) SZ、 (CH2 ) p O ( C H 2 ) mCH ( Me ) SZ、 (CH2 ) pNHCO ( CH2) m ( OCH2CH2) nCH ( Me) SZ ' (CH2 ) pNHCOC6H4 ( CH2) m ( OCH2CH2) n C H ( Me) SZ 、（CH2)pO(CH2)m(OCH2CH2)nCH(Me)SZ、 (CH2 ) pNHCO ( CH2 ) mC ( Me ) 2SZ、 (CH2 ) pNHCOC6H4 ( CH2 ) mC ( Me ) 2SZ、 (CH2) pO ( CH2 ) mC ( Me ) 2SZ、 (CH2 ) pNHCO ( CH2 ) m ( OCH2CH2 ) nC ( Me ) 2SZ、 (CH2 ) pNHCOC6H4 ( CH2 ) m ( OCH2CH2 ) nC ( Me) 2SZ 、(CH2 ) pO ( CH2 ) m ( OCH2CH2 ) nC ( Me2 ) SZ、 (CH2 ) pOC6H4 ( CH2 ) mSZ、 (CH2 ) pOC6H4 ( CH2 ) mCH ( Me) SZ、 (C H 2 ) pOC6H4 ( CH2 ) m ( OCH2CH2 ) nCHMeSZ > (CH2 ) pOC6H4 ( CH2 ) mCMe2SZ 或 -23- 200813028 (21) * , (CH2 ) p〇C6H4 ( CH2 ) m ( OCH2CH2 ) nC ( Me ) 2SZ，其中Z表H，硫醇保護基諸如Ac、R8或SR8，其中r8表甲基、線型烷基、支鏈型烷基、環狀烷基、單純或經取代的芳基或雜芳基或雜環基，且m表〇至10的整數，n表〇至2000的整數，ρ表0至10的整數。 R8所表線型烷基的例子包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基。R8所表支鏈型烷基的例子包括異丙基、異丁基、第二丁基、第三丁基、異戊基和1-乙基-丙基。R8 所表環狀烷基的例子包括環丙基、環丁基、環戊基和環己基。Rs所表簡單芳基之例子包括苯基和萘基。R8所表經取代芳基的例子包括經烷基，鹵素，諸如Cl、Br、F、硝基、胺基、磺酸基、羧酸基、羥基和烷氧基取代的芳基諸如苯基和萘基。R8所表雜環類爲其中雜原子係選自〇、N 和S的化合物，且其例子包括呋喃基、吡咯基、吡啶基、 (如，2 -取代嘧啶基）和噻吩。聯結子的最佳具體實例包括 (CH2 ) pNHCO ( CH2 ) 2SH、 (CH2 ) pNHCO ( CH2 ) 2C ( Me ) 2SH、 (CH2) pNHCO ( CH2 ) 2SSCH3 ' (CH2 ) pNHCO ( CH2 ) 2 ( OCH2CH2 ) nSH、 (CH2) pNHCO ( CH2 ) 2 ( OCH2CH2 ) nC ( Me ) 2SSCH3 和 (CH2 ) pNHCO ( CH2 ) 2 ( OCH2CH2 ) nSSMe〇於式（II) - (IX)內，R、R’、Ri至R6，可相同或相異，獨立地各表氫、α-(：3線型烷基、甲氧基、羥基、一 -24- 200813028 (22) 級胺基、二級胺基、三級胺基、或醯胺基或聯結子，但其限制條件爲R、R’、R,至R6中至少一者爲聯結子。較佳者，R爲聯結子。含一級胺基的取代基之例子爲甲胺基、乙胺基、和異丙胺基。含二級胺基的取代基之例子爲二甲胺基、二乙胺基和乙丙胺基。醯胺基的例子包括N-甲基-乙醯胺基、N-甲基-丙醯胺基、N-乙醯胺基、和N-丙醯胺在式（II ) - ( XI )內，R7爲活體內可斷裂的保護基，其可提高含seco-環丙烷并苯并吲哚的胞毒性藥物之水溶性，其中該基可選自通式XII的含磺酸基之苯基胺基甲酸酯：

其中R9爲Η或CrO支鏈型或線型烷基。r1()、Rh 、R12、R13爲相同或相異者，且其中至少一者爲-X_S〇T M +基，其中M +爲H +或衍生自1A族原子的陽離子，諸如 Na+、K +等，且X爲直接鍵聯或選自C1至C4線型或支鏈型院基、嫌基或炔基、-0 -院基-、-S -院基-和胺基院基之中的間隔子’且他Rio、Rii、Ri2或R13爲H、Ci-C6支鏈型或線型院基’ -Ο -院基、-S -院基、經基、一級胺基、二級胺基、或醯胺基、鹵素、硝基、疊氮基。 R9、R I 〇、R丨丨、R 12或R丨3所表線型烷基的例子包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基。r9、r1g、Rh、r12 -25- 200813028 ^ (23) β 或R13所表支鏈型烷基的例子包括異丙基、異丁基、第二丁基、第三丁基、異戊基和1-乙基-丙基。R9、R1G、Ru 、R ! 2或R ! 3所表環狀烷基的例子包括環丙基、環丁基、環戊基和環己基。如此，含磺酸基的苯基胺基甲酸酯變成可：在血清和血漿中發生的生理pH下之水解所斷裂。本發明CC- 1 065同系物的含硫鍵或二硫鍵及含硫醇之前藥可在培育條件下試管內評估彼等壓劑各種不想要的細胞素的增殖之能力。諸如Ramos和HL60等細胞系都可以容易地用來評估此等化合物的胞毒性。要評估的細胞可經暴露於該等化合物24小時且用已知方法經直接檢定測量細胞的存活分數。然後從檢定結果可計算出IC 5 〇値。如本文中所用者，表達語”可聯結到細胞結合劑”是指 CC- 1 065同系物前藥包含至少一個聯結子或其先質適於將該等衍生物結合到細胞結合劑；較佳聯結子包含硫醇、硫鍵、或二硫鍵、或彼等的先質。如本文中所用者，表達語”聯結到細胞結合劑，，指的是共軛分子’其包含通過適當聯結子，或其先質結合到細胞結合劑之至少一種CC-1065同系物前藥；較佳聯結子包含硫醇、硫鍵或二硫鍵、或彼等的先質。表達語”細胞結合劑”於本文中也包括經改質的細胞結合劑’其中該細胞結合劑係經改質劑改質過以改良該細胞結合劑對CC- 1 065同系物前藥的聯結子所含反應性官能，例如氫硫基、硫鍵或二硫鍵之反應性。該等改質劑包括 -26- 200813028 (24) 砸 • 磺酸基丁二醯亞胺基-4- ( 5-硝基-2-吡啶基二酸酯（SSNPB ) 、4-〔 N-順丁烯二醯亞胺基甲基 1-羧酸丁二醯亞胺基酯（SMCC) 、4-(2-吡啶基丁酸N-羥基丁二醯亞胺酯（SPDB )，等如下文者。於用在本文中時，術語”同系物”係指一種化包含一特定化合物或其類別的經化學改質形式，該化合物或類別所特具的藥學及/或藥理學活性。於用在本文中時，術語”病患”指的是動物，飼育、陪伴或保育目的的有用動物、或較佳者人兒童、罹患、或有可能罹患一或多種本文所述疾〇於用在本文中時，”治療有效量"指的是可以防、減輕、消除、治療或控制本文所述疾病和狀之本發明化合物的量。術語’’控制M意欲指稱所有中可能減緩、中斷、阻止、或停止本文所述疾病進展，但不一定表明所有疾病和狀況徵候的完全意欲包括預防性處理。於用在本文中時，術語’’藥學上可接受”指的醫學判斷範圍內，適合於人類和動物的組織接觸度的毒性、刺激、過敏回應或與合理效益/風險的其他問題倂發症，之彼等化合物、材料、賦形物或劑型。於用在本文中時，”藥學上可接受的鹽類”指硫基）丁〕環己烷-一硫基）要S寸論到合物，其且其保持諸如用於類或人類病和狀況有效地預況的徵候程序，其和狀況的消除，且是在完善而沒有過比例相稱劑、組成的是所揭 -27- 200813028 (25) . 示的化合物之衍生物，其中母體化合物係經由製成其酸鹽或鹼鹽而改質。藥學可接受的鹽類包括從，例如，無毒的無機或有機酸形成的母體化合物之習見無毒性鹽類或季銨鹽類。例如，此等習見的無毒性鹽類包括從無機酸諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、胺基磺酸、磷酸、硝酸和類似者所衍生者；及從有機酸諸如醋酸、丙酸、丁二酸、酒不酸、檸檬酸、甲院磺酸、苯磺酸、glucoronic、穀胺酸、苯甲酸水楊酸、甲苯磺酸、草酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、乳酸和類似者所製備的鹽。其他加成鹽包括銨鹽，諸如 tromethamine、葡甲胺、epolamine等；金屬鹽類諸如鈉、鉀、鈣、鋅或鎂等鹽。本發明藥學可接受的鹽類可從含鹼性或酸性基團的母體化合物以慣用的化學方法合成。通常，此等鹽類可經由令此等化合物的游離酸或鹼形式與化學計算量的恰當鹼或酸在水或有機溶劑中，或在兩者的混合物中反應而製備。通常，較佳者爲非水性介質如醚、醋酸乙酯、乙醇、異丙醇、或乙腈。適當鹽類的名單可參閱Remington’s Pharmaceutical Sciences，17 th e d., Mack Publishing Company，Easton，PA，1985，p. 1418，其揭示內容以弓 f 用方式納入本文。根據又另一目的，本發明也關於本發明化合物的製備方法。本發明化合物和方法可用諳於此技者所熟知的許多方式予以製備。該等化合物可，例如應用或調整下述方法’ -28- 200813028 • (26) . 或熟練者所了解的變異形式予以合成。恰當的爲諳於此技者從科學文獻可輕易明白且熟知或〇特別者，此等方法可在R.C. Larock，Cc Organic Transformations, Wiley-VCH Publish 找到。要了解者，本發明化合物可包含一或多個代的碳原子，且可離析成光學活性或消形形式結構的所有手性、非鏡像異構性、消旋型等形何異構形式都包含在內，除非有特定地明示出學或異構形式。如何製備和離析此等光學活性中熟知者。例如，可用標準技術，包括，但不形式能拆分；正相、逆相、與手性層析術；優再結晶化；和類似者，來分離立體異構物的混由手性合成，可從手性起始物或目標手性中心〇本發明化合物可由多種合成途徑予以製備始物都是商業上可取得者，或可由諳於此技者順利合成者。除非有不同的表明，否則所有取前定義者。於後文所述反應中，可能需要保護在最後的反應性官能基，例如，羥基、胺基、亞胺基基，以避免彼等基非所欲地參與在反應中。慣可根據標準作業來使用，例如，可參閱T. W. 修改和取代 •順利取用者 mprehensi ve ers, 1 9 9 9 φ 經不對稱取。因此，一式及所有幾特定立體化形式係技藝限於，消旋先鹽形式；合物；或經的審慎合成。藥劑和起以熟知技術代基都是先產物中需要、硫基或羧用的保護基 Greene and -29- 200813028 ^ (27) P. G. M. Wuts in Protective Groups in Organic Chemistry, 3rd ed·，John Wiley and Sone, 1 999; J. F. W. McOmie in Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, 1 973 〇某些反應可在鹼存在中進行。對於要用在此反應中的鹼之本質沒有特別的限制，且在此類型反應中慣用的任何鹼都同等地可用於此處，其限制條件爲其對分子的其他部份沒有不利的影響。適當鹼的例子包括：氫氧化鈉、碳酸鉀、三乙胺、鹼金屬氫化物、諸如氫化鈉和氫化鉀、烷基鋰化合物，諸如甲基鋰和丁基鋰；及鹼金屬烷氧化物諸如甲氧化鈉和乙氧化鈉。通常，反應係在適當溶劑內進行。有多種溶劑可以使用，但其限制條件爲對反應或對涉及的藥劑沒有不良影響。適當溶劑的例子包括：烴類，其可爲芳族、脂族或環脂族烴類，諸如己烷、環己烷、苯、甲苯、和二甲苯；醯胺類，諸如二甲基甲醯胺；醇類諸如乙醇和甲醇；及醚類，諸如乙醚和四氫呋喃。該等反應可在廣溫度範圍內進行。通常，我們發現合宜地係在從0 °C至1 3 5 °c (更佳者從室溫到1 0 0 °C )的溫度下進行反應。反應所需的時間也可能廣泛地變異，取決於許多因素，顯著者爲反應溫度和藥劑本質。不過，只要反應係在上述較佳條件下實施，通常從3小時至2 0小時的期間即足夠所用。經如此製備的化合物可從反應混合物以慣用手段回收 -30- 200813028 (28) 。例如，可經由從反應混合物蒸掉溶劑或，於需要時，在從反應混合物蒸掉溶劑後，將殘餘物傾倒在水中接著用水不混溶性有機溶劑予以萃取且從萃取液蒸掉溶劑，而回收該等化合物。此外，該產物可，於需要時，以多種熟知技術，諸如再結晶、再沈澱或各種層析術技術，顯著地爲管柱層析術或製備型薄層層析術，予以進一步純化。本發明式化合物的製備方法爲本發明的另一目的。該式化合物的製備方法包括以含磺酸的胺基甲酸酯官能保護相應的CC- 1 065同系物所含烷基化部份的酯基。此反應可經由應用或調適在T. W. Greene and P. G. M. Wuts in Protective Groups in Organic Chemistry，3rd ed” John

Wiley and Sons，1 999 或 J. F. W. McOmie in Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, 1 9 7 3 中戶斤揭示的用胺基甲酸酯官能保護〇H基之方法予以進行。通常，此反應係用 CDI/DMA和對應的具有下式之胺基苯基磺酸酯衍生物來進行：

此處R9、Rio、Rh、Ri2、和R13皆爲對式（XII )所定義者。該方法可包括離析出所得產物之後續步驟。細胞結合劑之製備 -31 - 200813028 ^ (29) . 本發明前藥化合物可用與細胞結合劑的共軛物之形式作爲有效治療劑。細胞結合劑可爲現行已知，或即將知道的任何類型，且包括肽類和非肽類。通常，此等可爲抗體 (尤其是單株抗體）或含至少一結合部位的抗體片段；淋巴細胞活素；激素；生長因子；營養分運載分子（諸如轉鐵蛋白）；或任何其他的細胞結合分子或物質。可用的細胞結合劑之更特別例子包括： -單株抗體； -單鏈抗體； -抗體片段諸如 Fab、Fab’、F ( aV ) 2 和 Fv{Parham， 131 J. Immunol. 2895-2902 ( 1 983 ) ； Spring et al，113 J.

Immunol. 470-478 ( 1 9 74 ) ； Nisonoff et al, 89 Arch.

Biochem. Biophys. 230-244 ( 1960) }； -干擾素； -肽類； -淋巴細胞活素諸如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6 ; -激素諸如胰島素；TRH (促甲狀腺素釋放激素）； MSH (促黑色素細胞激素）；類固醇激素，諸如雄激素和雌激素； -生長因子和群落刺激因子諸如EGF、TGF α、似胰島素生長因子（IGF-1、IGF-II) ; G-CSF; M-CSF 和 GM-CSF {Burgess, 5 Immunology Today 155-158 ( 1984) }；維生素；諸如葉酸；及 •轉鐵蛋白{ 〇 · K e e f e e i a 1，2 6 0 J . B i 〇 1. C h e m · 9 3 2 - 9 3 7 -32- 200813028 (30) (1985)卜單株抗體技術可促成呈特異性單株抗體形式的極端選擇性細胞結合劑之製造。技藝中特別熟知者爲選出經由將小鼠、大鼠、倉鼠或任何其他哺乳動物用目標抗原諸如完整目標細胞、從目標細胞離析出的抗原、完整病毒，經衰減的完整病毒，及病毒蛋白質諸如病毒外殼蛋白質，予以免疫化所產生的單株抗體所用的技術。恰當細胞結合劑的選擇爲抉擇之事，取決於要目標導向的特別細胞族群，但若可得到恰當者時，通常較佳者爲單株抗體。例如，單株抗體MY9爲一種可特異地結合CD33抗原的鼠類 IgGi 抗體{J· D· Griffin et al 8 Leukemia Res·，521

(1 984 ) }且其可在目標細胞表現CD33，如在急性骨髓性白血病（AML )疾病中。類似地，單株抗體-B4爲一種鼠類IgG,，其可結合到B細胞上的CD19抗原{Nadler et al， 13 1 J. Immunol· 2 44-25 0 ( 1 9 83 ) }且可用在目標細胞爲 B 細胞或可表現此抗原的疾病細胞諸如非-Hodgkin’s淋巴瘤或慢性淋巴母細胞性白血病之中。此外，可結合髓樣細胞的GM-CSF可用爲對來自急性骨髓性白血病的疾病細胞之細胞結合劑。IL2，其可結合到活化T-細胞，可用來預防移植體排斥，用於治療和預防植體-對-宿主疾病，及用於治療急性T-細胞白血病。可結合到黑細胞的MSH可用來治療黑色瘤。 •33- 200813028 , (31) . 前藥共軛物之製備前藥和細胞結合劑的共軛物可以使用任何技術予以形成。可以製備經偶合到seco-CBI同系物的吲哚基、苯并呋喃基、雙-吲哚基、雙-苯并呋喃基、吲哚基-苯并呋喃基或苯并呋喃基-吲哚基衍生物以包含游離胺基，然後通過酸不穩定聯結子，或光不穩定性聯結子聯結到抗體或其他細胞結合劑。該前藥化合物可與具有適當序列的肽縮合且隨後聯結到細胞結合劑以製造肽酶不穩定性聯結子。胞毒性化合物可經製備成包含第一羥基，其可經丁二醯基化且聯結到細胞結合劑以製造可被細胞內酯酶斷裂以釋放出游離前藥之共軛物。較佳者，該前藥化合物係經合成爲含有游離或經保護的硫醇基，其中可帶或不帶含PEG的間隔子，且之後，將含一或多個硫鍵、二硫鍵或硫醇的前藥分別通過二硫鍵或硫醚鍵共價地聯結到細胞結合劑。本發明代表性共軛物爲CC- 1 065同系物前藥與抗體、抗體片段、表皮生長因子（EGF )、促黑色素細胞激素（ MSH )、促甲狀腺激素（TSH)、雌激素、雌激素同系物、雄激素、和雄激素同系物之共軛物。 CC- 1 065同系物前藥與細胞結合劑的各種共軛物之代表性製備例子都要在下面說明之。二硫化物聯結子：抗體huMy-9-6爲針對人類骨髓樣細胞，包括大部份急性骨髓性白血球（A M L )病例者，之表面上出現的CD33抗原的鼠類單株抗體My-9-6之基因工程處理的人化形式（E · J . F a v a 1 〇 r ο，K · F · B r a d s t 〇 c k，A · -34- 200813028 _ (32)

Kabral，P. Grimsley & M. C. Berndt，Disease Markers，5 ( 4) ： 2 1 5 ( 1 987 ) ； M. G. Hoffee, D. Tavares, R. J. Lutz，

Robert J.9 PCT Int. Appl. ( 2004 ) WO 2004043344 ) o My- 9-6可用來製備共軛物。該抗體依先前所述用丙酸N-丁二醯亞胺基-3-卩比11 定基一硫酯予以改質{J· Carlsson，H. Drevin & R· Axen，Biochem· J·，173 : 723 ( 1978) }以產生，平均，4個吡啶基二硫基每抗體分子。經改質的抗體與含硫醇的前藥反應而製成經二硫鍵聯結的共軛物。硫醚聯結子：本發明含硫醇的衍生物可依先前所述通過硫醚鍵聯而聯結到抗體和其他細胞結合劑（美國專利第 5，2 0 8，0 2 0號）。該抗體或其他細胞結合劑可用諸如下列市售化合物予以改質：4 -(順丁烯二醯亞胺基甲基）環己烷羧酸N-丁二醯亞胺酯（SMCC) 、N-丁二醯亞胺基-4-( N-順丁嫌二醯亞胺基甲基）-環己烷羧基—（6_醯胺基乙酸酯）（其爲SMCC的”長鏈"同系物（LC-SMCC))。此等父聯劑形成衍生自以順丁烯二醯亞胺基爲底質的基團之不可斷裂性聯結子。包含以鹵乙醯基爲底質的基團之交聯劑包括丁二醯亞胺基-4-(碘乙醯基）_胺基苯甲酸酯（siab )、碘乙酸N -丁一醯亞胺基酯（SIA)、溴乙酸1丁二醯亞胺基酯 (SBA)和3-(溴·乙醯胺基）丙酸& 丁二醯亞胺基酯（ S B AP )。此等父聯劑會形成從以鹵乙醯基爲底質的基團衍生之不可斷裂性聯結子。經改質的細胞結合劑可與含硫醇的藥物反應而提悮經硫醚聯結的兵顿物。 -35- 200813028 ^ (33) . 酸不穩定聯結子：本發明含胺基的前藥可通過前述酸不穩定聯結子聯結到抗體和其他細胞結合劑。{W. A · Blattler et al，Biochemistry 24，1 5 1 7- 1 5 24 ( 1 98 5 )；美國專利第 4,542,225、4,569,789、4,618,492、 4,764,368 號}。類似地，本發明含醯肼基的前藥可通過酸不穩定的腙聯結子聯結到抗體和其他細胞結合劑的醣部份{有關腙聯結子的例子可參閱 B. C. Laguzza et al，J. Med. Chem.，32, 5 4 8 -5 5 5 ( 1 9 89 ) ； R. S. Greenfield et al? Cancer Res., 50，6600-6607 ( 1 990 ) } 〇光不穩定聯結子：本發明含胺基的前藥可通過前述光不穩定聯結子聯結到抗體和其他細胞結合劑{P. Senter et al，Photochemistry and P h o t o b i o 1 o g y，42，23 1 -23 7 ( 1 9 8 5 );美國專利第4,625,0 14號}。肽酶不穩定聯結子：本發明含胺基的前藥也可通過肽間隔子聯結到細胞結合劑。先前已證實者，在藥物與巨分子蛋白質載劑之間的短肽間隔子在血清中穩定但會被細胞內肽酶輕易地水解{A. Trouet et al，Proc. Natl. Acad. Sci.， 79，625-529 ( 1982) }。該含胺基的前藥可使用縮合劑諸如1 -乙基-3 - ( 3 -二甲胺基丙基）碳化二硫亞胺-H C1 ( EDC-HC1 )與肽縮合而給出可聯結到細胞結合劑的肽衍生物。酯酶不穩定聯結子：載有羥基烷基的本發明前藥可用丁二酸酐予以丁二醯基化後，聯結到細胞結合劑以產生可 -36- 200813028 β (34) , 被細胞內酯酶斷裂而釋出游離藥物之共軛的{相關例子可參考 E. Aboud-Pirak e t al，Biochem Pharmacol., 38，641-648 ( 1 989 )卜抗體、抗體片段、蛋白質或肽激素、蛋白質或肽生長因子與其他蛋白質的CC-1065同系物共軛物係以相同方式經由已知方法予以製造。例如，肽和抗體可用交聯劑諸如 3- ( 2-吡啶二硫基）丙酸N-丁二醯亞胺基酯、4- ( 2-吡啶二硫基）戊酸N-丁二醯亞胺基酯（SPP) 、4-丁二醯亞胺基-氧羰基-α -甲基-α-(2-吡啶二硫基）-甲苯（SMPT) 、丁酸Ν-丁二醯亞胺基- 3-(2-吡啶二硫基）酯（SDPB) 、吡啶二硫基丙酸丁二醯亞胺基酯（SPDP ) 、4- ( 2-吡啶二硫基）丁酸N-氫丁二醯亞胺酯（SPDB ) 、4-〔 N-順丁烯二醯亞胺基甲基〕環己烷-1-羧酸丁二醯亞胺基酯（ SMCC ) 、丁酸N-磺酸基丁二醯亞胺基-3- ( 2- ( 5-硝基吡啶二硫基）酯（SSNPB) 、2-亞胺基硫雜環戊烷、或S-乙醯基丁二酸酐，以已知方法予以改質。參閱，Car Is son et al9 173 Biochem. J. 723 -73 7 ( 1 978 ) ； Blattler et al, 24

Biochem. 1 5 1 7- 1 5 24 ( 1 9 8 5 ) ； Lambert et al? 22 Biochem. 3913-3920 ( 1983 ) ; Klotz et al，96 Arch· Biochem·

Biophys. 605 ( 1 962 );和 Liu et al，18 Biochem. 690 ( 1 979 )，Blakey and Thorpe，1 Antibody，

Immunoconj ugates & Radio-pharmaceuticals, 1-16 ( 1988 )，Worrell et al 1 Anti-Cancer Drug Design 1 79- 1 84 ( 1 9 8 6 )。經如此衍生的含游離或經保護的硫醇之細胞結合 -37- 200813028 (35) • 劑隨即可與含二硫鍵或硫醇的CC6 1 065前藥同系製造共軛物。該共軛物可用標準的管柱層析術、凝膠過濾予以純化。較佳者，單株抗體-或細胞結合劑-CC-1065 物共軛物爲通過二硫鍵接合者，如上面討論者，遞送CC- 1 065前藥同系物。此等細胞結合性共軛物可用已知方法製備諸吡啶二硫基丙酸丁二醯亞胺酯（SPDP )改質單 Carlsson e t al，17 3 B i o c h e m . J . 723-737 ( 1 9 7 8 ) 用含硫酯的CC- 1 06 5前藥同系物處理而置換所得以製成經二硫鍵聯結的共軛物。以此方法進行的整地載於美國專利5,5 8 5，499之中，其以引用方文。或者，於芳基二硫基- CC-1065前藥同系物的細胞結合性共軛物的形成係以事先導到抗體分子基直接置換CC-1065前藥同系物的芳基硫醇而完 1至1 0個通過二硫橋聯聯結的C C - 1 0 6 5前藥同軛物可由任一種方法順利地製備。根據另一目的，本發明亦有關一種藥學組成含本發明之共軛物分子或以上所定義之式（I) 藥學上可接受之載體。根據另一目的，本發明也關於一種殺死細胞胞生長之方法，該細胞較佳地係選自細胞族群，括令目標細胞或含目標細胞的組織接觸一有效量物反應以 HPLC 或前藥同系彼等能夠如經由用株抗體（ )。然後硫吡啶基共輒經完式納入本情況中，中的硫氫成。含有系物之共物，其包化合物及或抑制細該方法包的本發明 -38- 200813028 (36) ^ 藥學組成物。該所選細胞族群爲彼等癌性細胞及/或增殖性細胞根據另一目的，本發明也關於一種治療，較佳者性治療癌症之方法，包括將一有效量的本發明藥學組投予有需要治療的病患。根據本發明，”癌症的選擇性治療”係指殺死癌性及/或增殖性細胞而實質地不殺死正常細胞及/或非增細胞。根據另一目的，本發明也關於本發明共轭分子或定義的式（I )化合物在治療癌症所用醫藥品的製備用途。抑制所選細胞族群的生長所用方法可在試管內 vitro)、活體內（in vivo)或活體外（ex vivo)實施試管內用途的例子包括處理細胞培養物以殺死除會表現目標抗原的所欲變異體以外之所有細胞；或殺表現非所欲抗原的變異體。非臨床試管內用途的條件可由熟練者輕易地決定活體外用途的例子包括在將自體骨髓於移植到相患之前的處理以殺死疾病或惡質性細胞；在骨髓移植處理以殺死T細胞及防止植體對宿主疾病（GVHD )。在癌治療或自體免疫病治療中瘤體活體外處理以體移植之前從骨髓移除腫瘤細胞或淋巴樣細胞，或在之前從同種異基因型骨髓或組織移除T細胞和其他淋細胞以預防GVHD，可按下述進行。從病患或其他個選擇成物細胞殖性上面上之了不死會〇同病之前在自移植巴樣體收 -39- 200813028 _ (37) . 穫骨髓後在含有血清且加入本發明胞毒劑的培養基內在37 t培育約3 0分至約4 8小時，其中該胞毒劑濃度爲從約1 0 μ Μ至1 ρΜ。濃度與培育時間的正確條件（=劑量）可由熟練者輕易地決定。於培育之後，用含血清的培養基洗骨髓細胞且根據已知方法以靜脈內（i. ν.)注輸送回給病患。於收穫骨髓時與處理後細胞的再注輸之間病患接受其他治療諸如摘除式化療或整個身體照射過程之情況中，可將處理過的骨髓細胞使用標準醫療設備置於液氮中冷凍貯存〇對於臨床活體內用途，可將本發明胞毒劑以檢驗過無菌性和內毒素含量的溶液形式或可再溶於無菌注射用水的冷凍乾燥固體形式供給。適當的共軛物投予方案如下所述。將共軛物以靜脈內快速濃注方式每週給予一次共6週。濃注劑係在50至400毫升正常食鹽水中給出，其中可加入人類血清白蛋白（如，0.5至1毫升人類血清白蛋白濃縮溶液（1〇〇毫克/毫升））。劑量爲約50微克至10毫克 /公斤體重每週，靜脈內（每次注射爲1〇微克至1〇〇毫克/ 公斤之範圍）。於處理6週後，病患可接受第二療程。有關投予途徑、賦形劑、稀釋劑、劑量、時間、等特定臨床方案可由熟練者按臨床情勢所許而決定。可根據殺死所選細胞族群的活體內或活體外方法予以治療之醫療條件例子包括任何類型的惡質性，包括肺、乳房、結腸、前列腺、腎、胰、卵巢、和淋巴性器官等的癌 ;黑瘤；自體免疫疾病，諸如系統性狼瘡、風濕關節炎、 -40- 200813028 (38) _ 及複發性硬化；植體排斥，諸如腎植體排斥、肝植體排斥、肺植體排斥、植體對宿主疾病；病毒感染，諸如CMV 感染、HIV感染、AIDS、等；細菌感染、及寄生體感染、諸如賈第鞭毛蟲病（giardiasis )、阿米巴病（amoebiasis )、血吸蟲病；及由諳於此技者所定之其他者。需要治療本文所述疾病和狀況的彼等患者之鑑定係在諳於此技者的能力與知識之內者。諳於此技的獸醫師或醫師可經由使用臨床檢驗、物理檢查、醫療/家族史、或生物學和診斷檢驗，而順利鑑定出有需要此種治療之患者。治療有效量可由主治診斷師，如諳於此技者，經由使用習用技術及經由在類似情況下所得觀察結果而順利地決定。在決定治療有效量之中，主治診斷師要考慮到許多因素，包括，但不限於：患者物種；其大小、年齡、和一般健康情況；涉及的特定疾病；涉及程度或嚴重性；個別患者的回應；所投予的特別化合物；投予方式·，所投予的製劑之生物利用率特性；所選服藥法；共同藥劑之使用；及其他相關情況。要達到所欲生物學效用所需的式（I )化合物或共軛物的量係依多種因素而變異，包括所用化合物的化學特性 (如，疏水性），該化合物的效力，疾病類型、病患所屬物種、病患的疾病狀態、投予途徑，依該所選途徑的化合物生物利用途，指定所需劑量的所有因素，要投予的遞送和服藥性。於用在本文中時，”藥學可接受的賦形劑”包括任何載 -41 - 200813028 (39) . 劑、稀釋劑、佐劑、或媒劑，諸如防腐劑、抗氧化劑、塡料、崩解劑、濕潤劑、乳化劑、懸浮劑、溶劑、分散介質、塗料、抗菌劑、抗真菌劑、等張劑、吸收延遲劑和類似者。此等介質和藥劑對藥學活性物質的用途係技藝中熟知者。除了到目前爲止對活性物質不相容的任何習用介質或藥劑之外，其在治療組成物中的用途都是可擬及者。補充性活性成份也可摻加在該組成物內作爲適當的治療組合。於本發明範疇中，術語’’治療” t r e a t i n g M或 "treatment”），在用於本文中之時，意指逆反、減輕、抑制進展或預防此等術語所應用的失調症或狀況、或此等失調症或狀況的一或多種徵候。一般而言，本發明化合物可於生理緩衝劑水溶液中提供到供非經腸投予用而含0 · 1至1 0 % w/v之化合物。典型劑量範圍爲從1微克/公斤至〇· 1克/公斤體重每天；較佳劑量範圍爲從0.01毫克/公斤至10毫克/公斤體重每天或在人類兒童體內的相當劑量。要投予的藥物之較佳劑量可能決定於諸如下列變數：疾病或失調症的類型和進展程度 •，特定病患的整體健康狀態；所選化合物的相對生物學效力；該化合物的調合物；投予途徑（靜脈內、肌肉內、或他者）；該化合物依所選遞送徑途的藥物代謝動力學性質 :及投予速度（快速濃注或連續注輸）及時程（在一所給時間內的重複次數）。本發明化合物也可用單位劑量形式投予，其中術語” 單位劑量”意指一單一劑’其能投予到病患，且其可輕易 -42- 200813028 (40) . 地處置和包裝，保持爲物理和化學上穩定的單位劑形式，包含著活性成份本身，或者藥學上可接受的組成物形式，如前文所述者。以此形式，典型的總每曰劑量範圍爲從 0.01至100毫克/公斤體重。作爲一般指引者，人類用的單位劑量爲從1毫克至3000毫克每天。較佳者，該單位劑量係每天投予一至六次，每次1至500毫克，且甚至更佳者每天一次從1 0毫克至5 0 0毫克。本發明所提供的化合物可經由與一或多種藥學上可接受的賦形劑摻合而調配成藥學組成物。此種單位劑量組成物可經製備供經口投予使用，特別是呈片劑，單純膠囊或軟質凝膠膠囊形式者；或供鼻內投予，特別是呈粉末、辱滴劑、或氣霧劑形式者 ;或經皮投予，例如，局部用者，呈軟膏、乳膏、洗劑、凝膠或噴霧劑形式、或通過透皮貼片者。該組成物可合宜地以單位劑型投予且可用藥學技藝中熟知的方法予以製備，例如，在Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 2 0th e d ； Gennaro，A. R.，Ed.；

Lippincott Williams & Wilkins : Philadelphia，PA, 2000 之中所述者。較佳調合物包括其中將本發明化合物調配成供經口或非經腸投予用之藥學組成物。對於經口投予者，片劑、九劑、粉末、膠囊、糖錠劑和類似者可包含一或多種任何下列成份，或具相似本質之化合物：黏合劑諸如微晶纖維素、或黃蓍膠；稀釋劑諸如澱粉或乳糖；崩解劑諸如澱粉和纖維素衍生物；潤滑劑諸 -43- 200813028 (41) . 如硬脂酸鎂；助流劑諸如膠體二氧化矽；增甜劑諸如蔗糖或糖精；或調味劑諸如薄荷或水楊酸甲酯。膠囊可爲硬質膠囊或軟質膠囊之形式，其通常是用隨意地摻合增塑劑之明膠所製成；以及澱粉膠囊之形式。此外，劑量單位形式可包含各種可修改劑量單位的物理形式之其他材料，例如，糖塗料、蟲膠、或腸溶性藥劑。其他口服劑型糖漿或酏劑可包含增甜劑、防腐劑、染料、著色劑、和調味劑。此外，可將活性化合物摻加在快溶性，調節釋放或持續釋放性製劑與調合物中，且其中此等持續釋放性調合物較佳者爲雙-峯型者（b i - m 〇 d a 1 )。較佳的片劑包含於任何組合中的乳糖、玉米澱粉、矽酸鎂、交聯羧甲基纖維素鈉、普維酮（povidone)、硬脂酸鎂、或滑石。供非經腸投予用的液體製劑包括無菌水或非水性溶液、懸浮液和乳液。該液體製劑也可包括黏合劑、緩衝劑、防腐劑、鉗合劑、增甜劑、調味劑和著色劑，及類似者。非水性溶劑包括醇類、丙二醇、聚乙二醇、植物油諸如橄檀油、及有機酯類諸如油酸乙酯。水性載劑包括醇類與水的混合物、緩衝介質、和食鹽水。特別者，可以使用生物相容性’生物可降解性乳交酯聚合物、乳交醋/乙交醋共聚物、或聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物作爲賦形劑以控制活性化合物之釋放。靜脈內媒劑可包括流體和營養補充劑、電解質補充劑’諸如以Ringer’s有旋糖爲底質者，及類似者。用於此等活性化合物的其他潛在可用非經腸遞送系統包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物粒子，滲透泵，可植入 -44- 200813028 (42) ^ 式注輸系統，和微脂粒。其他投予方式包括供吸入用的調合劑，其粉、氣霧劑、或滴劑等工具。彼等可爲含有，化乙烯-9-月桂基醚、甘胺膽酸鹽、及脫氧膽酸或爲油溶液用於以鼻滴劑形式投予、或爲供鼻膠。供經頰投予的調合物包括，例如，菱錠或可包括調味基質，諸如蔗糖或阿膠，及其他賦胺膽酸鹽。適合經直腸投予的調合物較佳地係栓藥形式，具有固體底質載劑，諸如可可豆脂水楊酸酯。供局部塗佈至皮膚的調合物較佳地乳膏、洗劑、糊劑、凝膠、噴劑、氣霧劑、或可用的載劑包括石油凍膠、羊毛脂、聚乙二醇彼等的組合。適用於透皮投予的調合物可呈現形式且可爲親脂性乳液或經緩衝的水溶液，| 分散在聚合物或黏著劑中者。細胞結合劑與本發明前藥之間的共軛物之性本發明前藥及彼等與細胞結合劑的共軛物以在切掉保護基且轉化爲活性藥物後予以測量性細胞系諸如N a m a 1 w a和H L 6 0之胞毒性可以曲線的例外推法（back-extrapolation)予以測 Gold m acher et al，135 J. Immunol. 3648-3651 所述者。此等化合物對黏附性細胞系諸如包括諸如乾例如，聚氧之水溶液、內塗佈之凝軟錠劑且也形劑諸如甘呈單位劑量，且可包括係採軟膏、油之形式。、醇類、或爲離散貼片 I溶解及/或試管內胞毒之胞毒性可。對非黏附由細胞增殖量，諸如在 (1985)中 A-375 和 -45- 200813028 (43) SCaBER白勺胞毒性可用株落產生檢定法(clonogenic assays )予以測定，如在 Goldmacher et al·，102 J. Cell Biol. 1312-1319 ( 1986)中所述者。抑制所選細胞族群的生長所用治療劑和方法本發明也提供一種抑制所選細胞族群的生長所用治療劑，其包含： (a ) —胞毒性量的一或多種上述經聯結到細胞結合劑之前藥；及 (b )藥學上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑。類似地，本發明提供一種抑制所選細胞族群的生長之方法，其包括令一細胞族群或疑似含有來自該所選細胞族群的細胞接觸一胞毒用量的包含一或多種上述經聯結到細胞結合劑的前藥。該胞毒劑係按上述製備者。適當的藥學上可接受之載劑、稀釋劑、和賦形劑皆爲熟知者且可由諳於此技者依臨床情況所許而決定。適當載劑、稀釋劑及/或賦形劑的例子包括：（1 ) Dulbecco’s磷酸鹽緩衝食鹽水，pH約7.4，含約1毫克/毫升至25毫克/毫升的人類血清白蛋白，（2) 0.9%食鹽水 (0.9% w/v NaCl )，和（3 ) 5 % ( w/v )右旋糖。抑制所選細胞族群的生長之方法可在試管內’活體內或活體外實施。試管內用途的例子包括處理細胞培養物以殺死不會表 -46- 200813028 (44) ^ 現出目標抗原的所欲變異體以外之所有細胞；或殺列出非所欲抗原的變異體。非臨床試管內用途的條件可由熟練者輕易地決定活體外用途的例子包括在將同體骨髓移植到相同體內之前給予處理以殺死疾病或惡質性細胞；在骨髓之前處理彼等骨髓以殺死勝任性T細胞及預防植體-主疾病（GVHD )。在癌症治療中或自體免疫疾病治療中於自體移植從骨髓移除細胞或淋巴樣細胞的臨床活體外處理，或植之前從同種異基因骨髓或組織移除T細胞和其他淋細胞以預防GVHD，都可按下述進行。從病患或其他收穫骨髓後，在含血清的培養基內溫育，於其中加入明胞毒劑，濃度從約10 // Μ至ΙρΜ，置於約37t下分鐘至約4 8小時。濃度和溫育時間（三劑量）的正件可由熟練者輕易地決定。於溫育之後，用含血清的基洗該骨髓細胞且根據已知方法經由靜脈內注輸送回患。於骨髓收穫時與經處理過的細胞再注輸之間病患其他治療諸如摘除式化療或總體式照射的情況中，該理過的骨髓細胞係使用標準設備冷凍儲存在液氮中。對於臨床活體內用途，可將本發明胞毒劑以經檢無菌性與內毒性含量的溶液形式或可再溶解於無菌注水的經冷凍乾燥固體形式供給。共軛物投予的適當方例子如下述。以靜脈內濃注方式每週給予共轭物共6 濃注劑量係在50至400毫升正常食鹽水中給出，於表現 1病患 ί移植對-宿 ί之前 :在移 :巴樣，個體本發約30 確條培養到病接受經處驗過射用案之週。其中 -47- 200813028 ^ (45) ^ 可加入人類血清白蛋白（如，〇·5至1毫升的濃縮人類血清白蛋白溶液，1 〇〇毫克/毫升）。劑量爲每週靜脈內（ i.v.)投予約50微克至1〇毫克/公斤體重（每注射爲1〇微克至100毫克/公斤之範圍）。治療6週後，可讓病患接受第二療程。有關投予途徑、賦形劑、稀釋劑、劑量、時間、等的特定臨床方案可由熟練者視臨床情況需要而決定。可以根據殺死所選細胞族群的活體內或活體外方法治療的醫學狀況之例子包括任何類型的惡質性，包括，例如肺、乳房、結腸、前列腺、腎、胰、卵巢和淋巴器官等的癌症；黑瘤；自體免疫疾病，諸如系統性狼瘡、風濕關節炎、和復發性硬化；植體排拆，諸如腎移植排斥、肝移植排斥、肺移植排斥、心移植排斥、和骨髓移植排斥；植體 ^寸宿主疾病；病毒感染，諸如CMV感染、HIV感染、 AIDS等；細菌感染；及寄生體感染，諸如賈第鞭毛蟲病、阿米巴病、血吸蟲病；及由諳於此技者所定之其他者。【實施方式】實施例至此’要爹照非限制性實施例來闡述本發明。除非別有不同敘述，否則所有百分比、比例、部份，等皆以重量計。材料與方法 -48- 200813028 ^ (46) . 熔點係使用電熱裝置測量且都未矯正過。NMR光譜係在Bruker AVANCE400 ( 40 0MHz)光譜儀上記錄。化學偏移係相對於作爲內標準的TM S之ppm報告出。質譜係使用Bruker Esquire 3 000系統取得。紫外光譜係在Hitachi U1200光譜光度計上記錄。HPLC係使用Beckman Coulter GOLD 125 系統，裝配 Beckman Coulter 系統 GOLD 168 可變波長偵測器與Waters Radi alp ak (—種逆相C-l 8管柱）而實施。薄層層析術係在Anal tech GF矽膠TLC板上實施。快速管柱層析術用的矽膠係來自Baker。四氫呋喃係在鈉金屬上蒸餾予以脫水。二甲基乙醯胺和二甲基甲醯胺係經由在氫化鈣上，減壓下脫水。所有其他溶劑都是試藥級或HPLC級。前藥 DC07 ( 7a) 、DC08 ( 8a)和 DC107 (圖 4)的合成爲本文所述者。DC07和DC08以及DC107都是衍生自母體藥物DC1和DC101，而DC09(9a)可從美國專利 6,756,397 B2中所述的經聚乙二醇化母體藥物DC5製備（圖3)。前藥DC07在ρΗ5·5或更低的水溶液中極爲穩定，且可經由在血清或血漿中溫置而轉化成母體藥物DC1。此等藥物也具有比DC1數提高的水溶液。DC07SMe在小鼠血清中的溫置將其轉化成母體藥物D C 1 S M e。人類癌細胞系 HL60、Namalwa、A-375、COLO205 和 Ramos 都是得自 the American Type Culture Collection ( ATCC ) 。Kara爲業經用人類C D 3 3抗原穩定地轉染之鼠類腫瘤細胞系。 -49 - 200813028 (47) 實施例1 (S ) -N-[2-{ ( 1-氯甲基）-1，2-二氫- 5-[ ( 3-羥基磺醯基苯基）胺基羰氧基]-3H-苯并（e)吲哚-3-基}羰基]-1Η· 吲哚-5-基]-5 ·[( 3-甲基二硫基丙醯基）-胺基]-1 Η-吲哚- 2-羧醯胺（DC07-SMe，7b)之製備於 11.6 毫克（0.017 莫耳）DCISMe (1-[S]_ (氯甲基）-5·羥基-3-{{5-[5·(3-甲基二硫基丙醯基）-吲哚-2-基羰基胺基]吲哚-2-基}羰基}-1，2-二氫-3Η-苯并（e)吲哚 )在2.5毫升DMA中的溶液內加入3.0微升的DIPEA。在 Ar下攪拌3分鐘之後，加入4.0毫克的羰基二咪唑（1.46 當量）。將該混合物攪拌2小時，TLC顯示出所有的 DC IS Me都消耗掉，然後力日入新鮮製備的16毫克（3當量 )3-胺基苯磺酸二異丙基乙胺鹽（pH 5 )。在Ar下攪拌該混合物整夜且HPLC顯示反應完全。用油泵將混合物蒸發且使用C-18管柱（1.0 X 5厘米）以從100%的〇·〇1 %醋酸到50%含0.01%醋酸和50%THF的溶液予以溶析純化。將液份合倂且蒸發而得到1 1.8毫克的標題化合物（DC07-SMe) ； ]H NMR ( DMF-d7 ) 11.85(br，2H ) ，11.79(s ，1H) ，11.70(s，lH) ，10.53(s，lH) ，10.27(s， 1 H ) ，10.03 (s，lH) ，8.05(s，lH) ，8.41(s，lH) ，8.2 1 ( d，1 H，J = 1 .7Hz ) ，8 . 1 7 ( d，1 H，J = 8 · 4 H z ) ’ 8.12(m，1H) ，7.46(dd，1H，J=1.9，8.8Hz) ，7.66( m，2H) ，7.61(d，lH，J = 8.9Hz) ，7.58(m’2H) ’ -50- 200813028 (48) 7.48 ( d，1H，J = 1.4Hz )， 7.45 ( dd， 1H，J = =1 .9，8.8Hz )，Ί · 35 ( d，1 H ，J=1 .6Hz ) ，5.01 ( t，1H， J = 1 0.0Hz ) ，4.84 (dd，1 H ，J = 2.2， 10.9Hz )， 4.49 ( m，2H )， 4.21 ( dd，1H，J: = 3.2，1 1.3Hz ) ，4.1 0 ( m， 2H ) ，3· 12 (t，2H，J = 7.0Hz ) » 2.49 (s，3H )； 13C NMR 1 72.52， 170.33 ，169.54 ， 162.94 ，161.20， 160.4 1 ，152.67 ， 147.94 ，142.69 ， 139.11 ，134.73 ， 134.56 ，133.72 ， 133.37 ，1 33·18， 132.16 ，130.72 ， 128.76 ，128.41 ， 128.34 ，125.71 ， 125.61 ，124.07 ， 123.16 ，121.51， 120.05 ，118.36, 113.54 ，112.97， 112.92 ，112.16， 111.61 ，108.14， 1 07.56， 106.78， 104.02， 69.03 ， 67.95 ，67.3 7 ， 55.84 ， 54.91 ， 48.13 ， 42.7 1，3 7.0 5，34.10， 23.12 ； MS m/z+ 83 1 . 1 4 ( M + H ) +，883 •0 ， 883 • 9， 8 84.9 ( 〔M+Na) + ，905.0 ， (M+K) + 920.9 ， 922.9 ； MS m/z' 880.8，8 8 1.8 ，882.8 ， 8 8 3 .8 ( M-H ) ·。實施例2 ( S ) -N-[2-{ (1 -氯甲基）-1，2-二氫-5-[ (3-羥基-磺醯基苯基）胺基羰氧基]-3H-苯并（e)吲哚-3-基}羰基]-1H-吲哚-5-基]-5-[ ( 3-氫硫基丙醯基）-胺基]-1H-吲哚- 2-羧醯胺（DC07，7a)之製備將10毫克（0.104毫莫耳）TCEP在2毫升H20中的溶液經由添加NaHC03粉末調整到pH 7.0。於此溶液中加入15毫克DC07SMe/3毫升DMA溶液接著加入5毫克 -51 - 200813028 (49) • DTT/1.0 毫升 200mM NaH2P04，ρΗ4·5 溶液。於攪拌 2 小時且MS顯示DC07SMe譜峯（m/z 883 (Μ-1))消失之後，將混合物濃縮且用製備型HPLC c-18管柱以從60% 1 OmM NaH2P04 和 40 % DMA 至 80 % DMA 溶析 40 分鐘予以純化。將收集到的液份合倂，濃縮，再溶於DMA中，濾出鹽，再蒸發而得 13毫克DC070MS m/z- 835.1 (M-1) ，8 3 6. 1，8 3 7. 1 ，83 8. 1 ° 實施例3 (S) -Ν-[2·{ ( 1-氯甲基）-1，2-二氫-5-[ ( 3-羥基-磺醯基甲基苯基）胺基羰氧基]-3H-苯并（e)吲哚-3-基}羰基]-1H -卩引哄-5-基]-5-{[3- ( 2 -卩比卩定基一*硫基）-丙酸基]-胺基}-111-吲哚-2-羧醯胺（DC08SPy)之製備於21.0毫克DCISPy在2毫升DMA中的溶液內加入 10微升的二異丙基乙胺（DIPEA)。在Ar下攪拌3分鐘之後，加入8.0毫克的羰基二咪唑（CDI)，且將該混合物攪拌2小時，以HPLC在C-18管柱上檢查，DCISpy都與CDI完全反應掉。於該混合物中加入20毫克4-胺基苯甲基磺酸和10微升的DIPEA。在攪拌整夜之後，將混合物濃縮且 HPLC在 C-18管柱上以從 30°/〇DMA/1 0 mM NaH2P04，pH 4·0 到 8 0% D M A /1 0 m Μ N aH 2 Ρ Ο 4，ρ Η 4 · Ο 予以溶析純化。將液份合倂，濃縮而得到20.2毫克的標題化合物。NMR(DMF-d7) 11.67(d，2H，J = 9.9Hz) ，10.58(s，lH) ，10.23 (s，lH) ，9.81(s，lH)， -52- 200813028 (50) 8.86 ( dddd，1 Η ，J = 0.8， 1 .6，2· 5，1 4.6 ) ，8·41 ( s ， 1H )， 8. 27-8.20 ( m，4H ) ，8.12 ( m， 1H ) ，7·95 ( d ， 1H ，J = 8. 2 Η z ) ，7 .83 ( m ， 1 Η )， 7.71 (dd ，1 Η ，J = 2.0 9.9Hz ) ，7.60, 7.51 ( m， 4Η )， 7.47-7.40 ( m ，4H ) ， 7.30 ( d，1H，. J= 1 .6Hz ) ，4.90 (t， 1H， J=1 C I.OHz ) ， 4.75 ( dd ， 1H ， J = 2.2，10.9Hz ) 4.33 (m， 1H ) ，4· 1 5 ( dd， 1H，J = 3.2，，1 1 ·3Ηζ ) ，4· 1 1 (s ’ 2H ) ，3. 97 ( dd 1H， J = 7.8，1 1 .0Hz ) ，3 · 29 ( t， 2H， J = 6. 9Hz ) ，2.76 ( m ， 3H )；,3C NMR 172. 35 ， 162.93 ，16] L20， 160.41 5 155.77 ，15 1.36 ，147.94 ，142. 69 ， 140. 14 ， 139.11 9 134.73 ，134.56 ，133.82 ，133. 3 7， 132. 97 ， 132.16 1 13 1. 49 ，129.22 ，128.82 ，1 28.34， 125. 0 1 ， 125.61 J 124. 17 ，123.76 » 121.81 ，120. 05， 119. 3 2， 116.43 5 113. 3 1 ，112.97 ，112.92 ，112. 16 ， 111. 6 1 ， 108.14 ， 107. 56 ，106.83 ，10 1 .78， 67.3 7，，56·: 37，48.13 ，42.17 ， 3 7.00， 34.10 ； MS m/z- 95 8.3 4 ( M-l ) o 4- 胺基苯甲基磺酸：於 25 0毫升Par氫化瓶中給入4-硝基苯甲基磺酸 ( 6.80 克 :，31.34毫莫耳）， 1 0%Pd/C ( 0.4 克）、 C H 3 〇 H ( 1 50 毫升）加數滴的水，且用氫氣。用 2 Op s i H2將反應混合物搖動整夜。經由濾過矽藻土 (c e 1 i t e ) 濾掉觸媒後，蒸掉溶劑。將粗製化合物與 3x50 毫升 •水共蒸發三次且用水 /THF/EtA c /甲苯（1 :10: 10: 100 ) 予以結晶化而 -53- 200813028 . (51) • 得 5.3 克（91 % )標題化合物。】H NMR ( D20 ) > 7.28 ( dd，2H，J = 2.2，4·3Ηζ) ，6·95 ( dd，2Η，J = 2.2，4.3Hz )，4.10(s，2H ) ； I3C NMR 134.30，127.10，121.04， 1 20.42，59.14 ； MS m/z* 1 86.3 5 ( M-H)。 4-硝基苯基硫醇醋酸酯：於5毫升（69.95毫莫耳）硫醇醋酸和12毫升三乙胺在75毫升甲苯中的溶液內逐滴加入7.5克（34.71毫莫耳 )4-硝基苯甲基溴在100毫升1: 2 THF/甲苯中的溶液共 4小時。將該混合物連續攪拌整夜，蒸發且用EtAc/甲苯/ 己烷結晶化而得7.1克（96% )標題化合物。4 NMR ( CDC13 ) 8.13 ( ddd，2H，J = 2.5，4.5，9·3Ηζ) ，7.44 ( ddd，2Η，J = 2.5，4.5，9·3Ηζ) ，4·14 ( s，2Η ) ，2.35 ( s，3Η ) ; 13C NMR 1 94.53，1 45.73，129.91，1 24.07， 3 2.93，3 0.5 0 ； MS 234.34 ( M + Na )。 4-硝基苯甲基磺酸：將7.0克4-硝基苯硫醇醋酸酯於4小時中分5份加到 150毫升1 : 3H202/HAc溶液中並將混合物連續攪拌整夜。將混合物蒸發且用 3x50毫升水共蒸發三次，用 CH30H/THF/甲苯結晶化而得6.82克（95%)標題化合物。NMR ( D20 ) 8.02 ( ddd，2H，J = 2.7，4·6，1 1 . 1 Hz )

，7·20 ( ddd，2Η，J = 2.6，4.6，1 1 . 1 Hz ) ，4.11 ( s，2H );13C NMR 141.70，139.30，129.91，122.07，59.15; -54- 200813028 . (52) ^ MS m/z- 216.21 ( M-H) 〇實施例4 (S) -N-[2-{ ( 1-氯甲基）-1，2-二氫-5-[ ( 3-羥基-磺醯基甲基苯基）胺基羰氧基]·3Η-苯并（e )吲哚-3-基}羰基]-1H-吲哚-5-基]-5-[ ( 3-氫硫基丙醯基）·胺基]-1H-吲哚-2-羧醯胺（DC08 )之製備將10毫克（0.104毫莫耳）TCEP在2毫升H20中的溶液經由添加NaHC03粉予以調整到PH7.0。於該溶液中加入 15毫克 DC08SPy/3毫升 DMA，接著加入 5毫克 DTT/1.0 毫升 200mM NaH2P04，ρΗ4·5。於攪拌 2 小時且 MS顯示DC08SPy峰（m/z 883(Μ-1))消失後，用製備型 HPLC c-18 管柱以從 60% 10mM NaH2PO4/40%DMA 至 20% 10mM NaH2PO4/80°/。DMA溶析40分鐘予以純化。將收集到的液份合倂，濃縮乾，再溶於DMA中，濾掉鹽，再蒸發而得 13 毫克 DC08。MSm/z· 849.1 (M-H) ，850.1 ，85 1.1° 實施例5 (3)-〜（2-(1-(氯甲基）-5-羥基-2,3-二氫-111-苯并〔e〕吲哚-3-羰基）·1Η-吲哚-5-基）-3-(甲基二硫基）丙醯胺（DClOlSMe ) 於5·羥基-3-胺基-1-〔 S〕-(氯甲基）-1，2-二氫-3H- 苯并〔e〕吲哚，鹽酸鹽（155毫克，〇·57毫莫耳）和5- -55- 200813028 ^ (53) , (3-(甲基二硫基）丙醯胺）-1Η-吲哚·2-羧酸（170毫克，0.55毫莫耳）在7.0毫升DMA中的溶液內於Ar下加入 EDC ( 3 00毫克，1.56毫莫耳）。攪拌整夜後，將混合物蒸發乾，以Si02層析術純化（20°/。至40%THF/甲苯）且用 THF/甲苯/己烷結晶化而得218毫克（76%) DC1()1SMe。 lU N M R ( D Μ F - d 7 ) 11.63 (s，1H ) ，10.56 (s，1 H )， 9.95 ( s , 1 H ) ，8 • 23 ( s , 2H ) ，7.93 ( d，1H ，J = 8.3Hz )， 7. 56 (dd，1H ，J=2.0 ，8· 1 Hz ) ，7.52 ( s ，1H )， 7.47 ( dd ，1H ， J= 1.9, 8.9Hz ) ，7.4 1 ( d，1H ，J = 1.7Hz )， 7. 25 (d，1H ，J = 1 .7H z )， 4.88 (dd，1H ，J = 8.7， 1 1 ·0Ηζ ) ，4.73 ( dd ， 1 H， J = 2.3 ，10 • 9Hz ) ，4 .3 1 (m， 1Η ) 4. 12 ( dd ， 1H， J = 3 .1，1 1 .OH z) » 3.95 (dd 卜1H ，J = 8. 4， 11.2Hz) ，3· 21 ( t，2H :，J = 7.1Hz)， 2.71 (t， 2H， J =7. 1 Hz )， 2.45 (s ，3H )；丨 3C NMR 169 • 54， 161. 06 5 1 5 5.3 6， 134 • 21 ， 133. 3 9 ， 132.54 ， 13 1 .05， 128. 39 J 1 27.99， 123 .98 ， 123. 7 4 ， 123.46 ， 123, .3 1 ， 118. 88 115.99， 112.87 ， 1 12. 3 1 ， 1 06.40 ， 101, .33 ， 55.93 ， 48.10，42 .6 1 ， 36. 92 ， 30.81 ，25.34 ° MS m/z + 548. 2 ( :M + N a ) ，5 5 0 · 2 (M + 2 + Na )° 5- ( 3-(甲基二硫基）丙醯胺基）-1H-吲哚-2-羧酸於3-(甲基二硫基）丙酸（ι·18克，7.76毫莫耳）在50毫升DMA中的溶液在氬氣下加入羥基丁二醯亞胺（ 1.14克，9.90毫莫耳）和EDC (1.91克，9.96毫莫耳） •56- 200813028 (54) ^ 。將混合物攪拌整夜。於以TLC ( 1 : 6EtAc/己烷）確定反應完全後，將混合物不再純化而直接用於下一步驟。

於5-胺基-1H-吲哚-2-羧酸（1.32克，7.49毫莫耳）在 50 毫升 1:4 0.5M Na2HP04，pH8.0/DMA 中的溶液在 (TC下一小時內逐滴加入上面製備的NHS酯溶液。添加之後，在4 °C下連續攪拌該混合物一小時，然後在室溫下攪拌一小時。將混合物濃縮且在Si02層析術上用THF/甲苯/ 醋酸（1 : 4 : 02%至1 : 2 : 0.02% )溶析純化而得標題產物（1.62 克，70%)。】H NMR ( DMF-d7 ) 12.80 ( br， 0·8Η) ，11.66(s，lH) ，9.96(s，lH) ，8.17(s，lH )，7.44 ( s，2H ) ，7.14 ( d，1H，J = 2.0Hz ) ，3.20 ( t ，2H，J = 6.9Hz ) ，2.72 ( t，2H，J = 7.0Hz ) ，2.37 ( s， 3H ) 。13C NMR 1 69.5 3，1 63.4 5，1 3 5.24，1 3 3.3 8，130.12 ，1 27.99，119.13，113.10，112.27，1 08.04，3 6.8 8， 30.60。MS m/z-309.20 ( M-l)。實施例6 (S) -3-( (1-(氯甲基）-3-(5-(3-(甲基二硫基 )丙醯胺基）-1H-吲哚-2-羰基）-2,3-二氫-1H-苯并〔e〕吲哚-5-基氧基）羰基胺基）苯磺酸（DC107SMe) 於 DClOlSMe ( ( S) -N- ( 2- ( 1-(氯甲基）-5-羥基- 2,3-二氯-111-苯并〔6〕卩引哄，3-幾基）-11^-卩引哄-5-基）-3-(甲基二硫基）丙醯胺，100毫克，0.19毫莫耳）在10 毫升DMA中的溶液內加入DIP EA (35微升，0.20毫莫耳 -57- 200813028 (55) . )。在Ar下攪拌3分鐘後，加入32.0毫克（0.20毫莫耳 )羰基二咪唑。攪拌該混合物2小時且TLC顯示所有 DXIOlSMe都消耗掉，然後力日入新鮮製備的3-胺基苯磺酸二異丙基胺鹽（65毫克，0.21毫莫耳）。在Ar下攪拌該混合物24小時且HPLC顯示反應完全而形成DC107SMe〔 (S) -3-( (1-(氯甲基）-3-(5-(3-(甲基二硫基）丙醯胺基）-1H-吲哚-2-羰基）-2,3-二氫-1H-苯并〔e〕吲哚-5-基氧基）羰胺基）苯磺酸〕。將該混合物用油泵濃縮到〜5毫升且不再純化而直接用於下面步驟。實施例7 (S)-3-( (1-(氯甲基）-3-(5-(3-氫硫基丙醯胺基）-1H-吲哚-2-羰基）-2,3-二氫-1H-苯并〔e〕吲哚-5-基氧基）羰基胺基）苯磺酸（DC 107) 於上面的濃縮溶液中加入60毫克（0.62毫莫耳） TCEP/10 毫升 1:1 DMA/0.4M NaH2P04，ρΗ4·0。在 Ar 下攪拌4小時後，將混合物濃縮且用C18管柱以從90% 0.01%醋酸/DMA至40% 0.01%醋酸/DMA溶析純化。將液份合倂且蒸發而得94毫克（73%二步驟）的（5)-3-(( 1-(氯甲基）-3- ( 5- ( 3-氫硫基丙醯胺基）-1H-吲哚-2-羰基）-2,3-二氫-1H·苯并〔e〕吲哚-5-基氧基）羰胺基）苯碯酸（DC107) 。4 NMR(DMF-d7) 11.63 (s，1H)， 10.51 (s，lH) ，9.89(s，lH) ，8.33(s，2H) ，7.93 (d，1H，J = 8.3Hz) ，7.58 (m，2H ) ，7·52 (m，2H) -58- 200813028 ， (56) β ，7.47(m，2Η) ，7.41 (m，1Η) ，7.38(m，1H) ’ 7·25 (d，1H，J = 1.7 H z ) ，4.87 (dd，1H，J = 8.7，11.0Hz )，4.74 ( dd，1H，J = 2 · 3，1 〇 · 9 H z ) ，4 · 3 2 ( m，1 H )， 4.12 ( dd， 1H， J = 3.0 ，1 1 • OHz ) 3.93 ( dd， 1H， J = 8.4 ，1 1.2Hz) ，3. 21 ( t ，2H ，3 = 7 • 1 Hz ) 2.70 (t， 2H， J = 7.1 Η z ) ；13C NMR 169. 55 ， 161· 30， 155.46 ，150 • 21， 143· 45 ，1 34.22 ，133 • 37 ，132. 54 ，1 3 1 .35， 130. 3 1 ， 128.38 ，1 27.95 ，123 • 78 ，123. 72 ，1 23 • 48 ， 123. 33， 121. 41 ，1 18.88 ，115 .90 ，1 12. 88 ，1 12 • 35， 106. 44 ， 101. 38 ，59 ，·95， 48.60 ，42.67， 36 • 90， 25.01 〇 MS m/z' 676. 90 (Μ- Η ) c 、6 3 4 0 i im= 1 9025M m'1 c ) DC70對單株抗體的共軛拼合。選擇可優先結合到在人類AML細胞表面上表現出的CD33抗原之huMy9-6抗體用於DC07的共軛拼合。實施例8 huMy9-6-SSNPB-DC07之製備：一種二硫鍵結共軛物於第一步驟中，令抗體與改質劑5-硝基-2-吡啶基二硫基丁酸N-磺酸基丁二醯亞胺基酯（SSNPB)反應以導入硝基吡啶基二硫基。對濃度爲8.5毫克/毫升在含有〇.〇5 Μ磷酸鉀，0.05M氯化鈉，2 mM伸乙二胺四乙酸（EDTA )，3%二甲基乙醯胺（DMA ) ，pH 6·5的緩衝水溶液內之huMy9-6抗體，使用7.5倍莫耳超量的SSNPB溶液（ 2 0 mM在DMA內的儲液）予以處理。在室溫下攪拌反應 -59- 200813028 (57) , 混合物9 0分鐘後，於已經事先平衡到含有〇 . 1 μ N a Η 2 Ρ Ο 4 ，50 mM NaCl，pH 6.5 的緩衝水溶液之 Sephadex G25 預-塡充管柱上純化。純化過的樣品產生98%的產物。對一小液份的改質抗體用二硫蘇糖醇處理以斷裂硝基吡啶基二硫基且對釋放出的硝基吡啶基二硫酮以光譜光度計法檢定：對硝基吡啶基二硫酮ε 3 2 5 nm = 1 0,964 M·1 cm·1且ε 28〇nm =3,344 M·1 cm·1 且對於抗體 ε 28〇nm = 206,460 M·1 cm·1 。每莫耳抗體聯結著平均5.0個硝基吡啶基二硫基。將改質抗體在含5% DMA的上述pH 6.5緩衝液中稀釋到2.0毫克/毫升後，用DC07在DMA中的溶液處理，其中有2.5藥物每聯結子之藥物超量。在室溫下反應該共軛混合物30分鐘。將反應混合物通過事先在20% DMA， 0.1 M NaH2P〇4，50 mM NaCl，pH 5.0 中平衡過的 Sephacryl S3 00膠濾管柱予以純化。將含有單體型抗體-DC07共軛物的液份合倂且透析到10 mM檸檬酸鹽，135 mM NaCl，pH 5.0中。將最後共軛物使用下列消光係數以光譜光度計法檢定：藥物的ε 34Gnm = 38,000 M·1 cnT1且 ε 28〇nm = 23,000 M·1 cm·1 且抗體的 ε 28〇nm = 206,460 M·1 cm'1 。該共軛物含有3.5藥物每抗體。實施例9 huMy9-6-SMCC-DC07之製備：一種硫醚鍵結共軛物於第一步驟中，令抗體與改質劑4- ( N-順丁烯二醯亞胺基甲基）環己烷-1-羧酸丁二醯亞胺基酯（SMCC)反應 -60- 200813028 (58)

• 。對濃度爲8.5毫克/毫升在含有〇·〇5 Μ磷酸鉀，0.05M

氯化鈉，2 mM伸乙二胺四乙酸（EDTA ) ，3% DMA，pH 6 ·5的緩衝水溶液內之huMy 9-6抗體，使用8.5倍莫耳超量的SMCC溶液（20 mM在DMA內）在室溫下處理90分鐘。將改質抗體於已經事先平衡到含有〇. 1 M NaH2P04， 50 mM NaCl ’ pH 6.5的緩衝水溶液之Sephadex G25預·塡充管柱上純化。對純化過的樣品以光譜光度計法檢定（ε 28Gnm = 206,460 M」cnT1 )以計算抗體的濃度。用經建立的程序測定經結合的聯結子之濃度，其中係直接測量可用來與含硫醇胺基酸，半胱胺酸，反應的聯結子之量。經測定出6.0個聯結子每抗體後改質。將改質抗體在 0.1 M NaH2P04，50 mM NaCl，5% DMA，pH 6.5中稀釋到2.0毫克/毫升後，用0.20 mM DC07 (2.5莫耳DCO 7/聯結子）予以處理。在室溫下進行該共軛反應80分鐘。然後用5%醋酸將反應酸化且使用裝備著經事先在 20% DMA，0.1 M NaH2P04，50 mM NaCl ，pH 5.0中平衡過的分析型尺寸排斥（SEC )管柱之 HPLC系統予以分析，其可將抗體-藥物公軛物從未反應的 DC07分離開。監測從管柱出來的溶析液在280奈米和340 奈米之吸光度。以光譜光度計法測定DC07對抗體的比例而得 3.5。（藥物的 ε 34〇nm = 3 8,000 M·1 cm·1 且 ε 28〇nm = 23,000 NT1 cm·1 且抗體的 ε 28Gnm = 206,460 1VT1 cm·1) o 從SEC分析計算藥物/Ab比例： -61 - 200813028 ^ (59) β DC07 = Α34〇/3 8000 huMy9-6 = [( Α280- ( 23 0 0 0 1 Α340 ) ) /3 8 0 0 0 ]/2 0 64 6 0 藥物 /Ab = DC07/My9-6 實施例1 〇生物學結果 • DC07-SMe (圖 2)和 DCl-SMe (圖 1D)對 Ramos 和HL60/S細胞的胞毒性係用5-天暴露在試管內測量。結果給於圖6中。I C 5 〇如下所示濃度（M) 細胞系 DCl-SMe DC07-SMe HL60/S 3.6χ1〇·μΜ 3χ10'ηΜ Ramos 6.2χ101ηΜ 1·2χ10·ηΜ • DCl-SPy 和 DC07-SPy 對 Ramos 和 HL60 細胞的胞毒性都有測量。結果給於圖7中且IC 5 0如下所示。 DCl-SPy ： DC07-SPy ：細胞系 IC5〇(M) 細胞系 IC5〇(M) Ramos 7.5x1 O'12 Ramos 2.8X10-】1 HL60 7.5x1 O'12 HL 2‘OxlO·11 -62- 1 D C 0 8 · S S P y對N a m a 1 w a和R a m 〇 s細胞的胞毒性都有測量。結果給予圖8中且I C 5 0如下所示。 200813028 (60) 細胞系 IC5〇(M) N am al w a 4.2x1 〇·10Μ Ramos 4·2χ1 (Γ10Μ • M Y9-6-DC 07 (經二硫鍵聯結）對於抗原陽性Kara 和抗原陰性Ramos細胞的胞毒性都有測量。結果給於圖 10中且1C 5α如下所示。_

細胞系 1 IC5〇(M) Kara 8.006x 1 (T13M Ramos 1.01 5x1 〇-9M • huC242-DC07 (硫醚聯結）針對抗原陽性 COLO 205細胞和抗原陰性A-3 75細胞的胞毒性都有測量。結果給於圖1 1中且IC5G如下所示。細胞系 IC5〇(M) COLO205 A-375 1 ·3χ1 0·9Μ 本揭示中有提及某些專利和印刷文章，彼等的教導皆以彼等的個別全文以引用方式納入本文。雖然本發明業已詳細且參照其指定具體實例予以說明過’不過對於諳於此技者顯而易知者，可對其作出各種改變和修飾而不違離其旨意和範圍。 -63- 200813028 (61) 【圖式簡單說明】圖1A顯示出CC- 1 065及其次單元a、b和c的結構〇圖1 B和圖1 C顯示出兩種已知的C C - 1 0 6 5同系物之結構。圖1D顯示出中間體DCISMe的製備（也參閱美國專利 6534660 B1) 〇圖2顯示出範例CC- 1 065同系物和本發明前藥之結構〇圖3顯示出本發明範例含聚乙二醇前藥之結構。圖4A、B和C爲製備（S) -Ν-[2-{(1-氯甲基）-1，2-二氫- 5-[(3-羥基磺醯基苯基）胺基羰氧基]-3H-苯并（e )吲哚-3-基}羰基]-1H-吲哚-5-基]-5-[ ( 3-甲基二硫基丙醯基）-胺基]-1H-吲哚-2-羧醯胺（DC07SMe) ; (S) -N-[2- { ( 1-氯甲基）-1，2-二氫- 5-[ ( 3·羥基磺醯基苯基）胺基羰氧基]-3Η-苯并（e)吲哚-3-基}羰基]-1Η-吲哚-5-基]-5-[( 3-氫硫基丙醯基）-胺基]-1H-吲哚-2-羧醯胺（DC07);( S) ·Ν-[2-{(1-氯甲基）-1，2-二氫- 5-[(3·羥-磺醯基甲基苯基）胺基羰氧基]-3Η-苯并（e)吲哚-3-基}羰基]-1Η·吲哚-5 ·基]· 5 - {[ 3 - ( 2 -吡啶基二硫基）-丙醯基]-胺基} - 1 Η -吲哚-2-羧醯胺（DC08Spy);和（S) -Ν·[2-{ ( 1-氯甲基）-1,2-二氫-5-[ ( 3-羥基磺醯基甲基-苯基）胺基羰氧基]-3Η-苯并（e )吲哚-3 -基}羰基]-1 Η -吲哚-5 -基]-5 - [( 3 -氫硫基 -64- 200813028 (62) » ^ 丙醯基）-胺基:Ι-1Η-吲哚-2-羧醯胺（DC08) ; (S)-3-( (1-(氯甲基）-3-(5-(3-(甲基二硫基）丙醯胺基）-1H-吲哚-2-羰基）·2,3_二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基氧基）羰基胺基）苯磺酸（DClOlSMe) ; (S) -3-( (1-(氯甲基）-3- ( 5- ( 3-氫硫基丙醯胺基）-1H-吲哚-2-羰基） 2,3_二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基氧基）羰基胺基）苯磺酸（ DC107 )之合成流程。圖5顯示繪出藥物在生理pH的活化/失活程序之流程〇圖 6 顯示出 DC07-SMe 和 DCl-SMe 對 Ramos 和 HL60 細胞，5天暴露所得試管內胞毒性數據。圖7顯示出DC〗-SPy和DC07-Spy對Ramos和HL60 細胞的試管內胞毒性數據。圖8顯示出DC08-Spy對RAMOS和Namalwa細胞的試管內胞毒性數據。圖 9 顯示出 DC101-SMe 和 DC107-SMe 對 HL-60 和 Ramos細胞的試管內胞毒性數據。圖1〇顯示出 MY9-DC07 (二硫鍵聯）對1<^1^& RAMOS細胞的試管內胞毒性數據。圖11顯示出huC242-DC07(硫醚鍵聯）對COLO205 & A_3 7 5細胞的試管內胞毒性數據。 -65-

Claims

200813028 十、申請專利範圍 1· 一種包含CC-1065同系物的前藥，其中該分子的烷基化部份所含酚基以可增加該前藥水溶性之保護基予以保護’且其中該前藥進一步包含能夠將該前藥共軛到細胞結合劑之聯結子，其特徵在於該保護基爲含磺酸的胺基甲酸酯。 2.如申請專利範圍第1項之前藥，其中該CC-1〇65 同系物係選自由式（I)第一次單元透過該第一次單元的吡咯部份所含二級胺基到式（II) 、（III) 、（IV)、（ V ) 、（VI) 、（VII) 、（VIII) 、（IX) 、（X)或（ XI )第二次單元的C-2羧基之醯胺鍵而共價聯結到該第二次單元所形成的同系物所組成之群組，其中該式（I)爲下示者：

其中該式（II) - (XI)爲下示者：

-66- 200813028 (2) R5

R5 HOOC

R4 (V)

(VI) HOOC

(VII) .〇 R

(VIII) HOOC

(IX)

-67- (XI) 200813028

其中Y表選自鹵基（氟基、氯基、溴基或碘基）、甲烷磺酸酯基、對-甲苯磺酸酯基、三氟甲烷磺酸酯基、單硝基或二硝基苯氧基之中的脫離基；其中R、R’、Ri_r6各自獨立地爲氫、C〗-C3線型烷基、甲氧基、經基、一級胺基、二級胺基、三級胺基、或醯胺基或爲提保該觔藥對細胞結合劑的鍵聯之聯結子，其限制條件爲R、R ’、R i - r6中至少一者爲聯結子；且其中R7爲該含磺酸的胺基甲酸酯保護基，或彼等的藥學上可接受之鹽類、水合物、或水合鹽類 ’或此等化合物的多形性結晶結構或彼等的光學異構物、消旋物、非鏡像異構物或鏡像異構物。 3 ·如申請專利範圍第2項之前藥，其中該R7爲具有通式XII的含磺酸之苯基胺基甲酸酯：

此處R9爲H或支鏈型、環狀或線型烷基，Rio、Ru 、R】2、R】3爲相同或不同者而其中至少一者爲-x-so3.m + 基’其中M +爲H或衍生自ΙΑ族原子的陽離子，且X爲直接鍵或爲選自C 1 _ C4線型或支鏈型伸院基、嫌基或块基’ -〇 k基-、-s棱基-和胺基烷基之間隔子而其他的、R】i、R丨2或R丨3馬H、C】-C6支鏈型或線型烷基、_〇烷 -68- 200813028 (4) 基、-S烷基、羥基、一級胺基、二級胺基、或醯胺基、鹵基、硝基、疊氮基。 4 ·如申請專利範圍第3項之前藥，其中R 9 = Η。 5 ·如申請專利範圍第3或4項之前藥，其中R! 〇、 Rh、Ri2或R13中有一者爲υ〇3·Μ +基且其他者爲η。 6 ·如申請專利範圍第1至4項中任一項之前藥，其中R’、Ri-R6皆爲氫且R爲聯結子。 7 ·如申請專利範圍第1至4項中任一項之前藥，其中該聯結子包含一含硫醇、硫鍵或二硫鍵的取代基。 8 ·如申請專利範圍第1至4項中任一項之前藥，其中該聯結子包含式- (OCH2CH2) n-之聚乙二醇，其中η爲從1至2000之整數。 9 ·如申請專利範圍第1至4項中任一項之前藥，其中該聯結子具有下式： _G-D- ( Z ) p-S-Z，此處 G爲單鍵或雙鍵，-0-、-S-或-ΝΤ-; D 爲單鍵或-E-'-E-NT-'-E-NT-F-'-E-O-'-E-O-F-、-E-NT-CO-、-E-NT-CO-F-、-E-CO-、-CO-E-、-E-CO-F-、-E-S-、-E-S-F-、-E-NT-C-S-、-E-NT-CS-F ; 此處T爲11或支鏈型或線型烷基；此處E和F爲相同或不同者且爲獨立地選自線型或支鏈型-(〇CH2CH2 ) i 院基（OCH2CH2 )』-、-院基（ OCH2CH2 ) i-j：完基-、-(OCH2CH2) i-、- ( OCH2CH2) i 環 -69- 200813028 (5) 烷基(OCH2CH2 ) j -、- ( OCH2CH2 ) i 雜環基 (OCH2CH2 ) J — - ( OCH2CH2 ) i 芳基（OCH2CH2) j-、 -(OCH2CH2) i 雜芳基（〇CH2CH2) j -、-院基 -(OCH2CH2 ) i 烷基（OCH2CH2 ) J -、-院基-(och2ch2 ) i -、-烷基-(OCH2CH2 ) i 環烷基 (OCH2CH2) j-、-烷基-(OCH2CH2) i 雜環基 (OCH2CH2 ) J - ' -烷基-(〇ch2ch2) i 芳基 (OCH2CH2) J-、-烷基-(OCH2CH2) i 雜芳基 (OCH2CH2 ) j •、-環烷基·烷基-、烷基-環烷基-、-雜環基-烷基-、-烷基-雜環基-、-烷基-芳基-、-芳基-烷基-、烷基-雜芳基-、-雜芳基-烷基-; 此處i和j爲相同或不同的整數且爲獨立地選自0、1 至 2000 ; Z爲線型或支鏈型-烷基-; P爲0或1， Z’表Η，硫醇保護基諸如COR、R2G或SR2〇，其中 R20表Η、甲基、烷基、經隨意取代的環烷基、芳基、雜芳基或雜環基。 10·如申請專利範圍第9項之前藥，其中G爲單鍵或-NT-。 11·如申請專利範圍第9項之前藥，其中G爲-NT_。 12.如申請專利範圍第9項之前藥，其中D爲·CO-E- 〇 1 3 ·如申請專利範圍第9項之前藥，其中E爲線型或 -70- 200813028 (6) ^ 支鏈型-烷基-。 14.如申請專利範圍第9項之前藥，其中p爲0。 1 5 .如申請專利範圍第9項之前藥，其中Z ’爲Η或 SR2〇，其中R2G表烷基或雜芳基。 16.如申請專利範圍第1或9項之前藥，其中該聯結子係選自（CH2) pNHCO ( CH2 ) mSZ、 (CH2 ) pNHCOC6H4 ( CH2 ) mSZ、( CH2 ) pO ( CH2 ) mSZ 、（CH)pNHCO(CH2)m(OCH2CH2)nSZ、 (ch2 ) pNHCOC6H4 ( CH2 ) m ( OCH2CH2 ) nsz、 (ch2 ) pO ( ch2 ) m ( OCH2CH2 ) nsz、 (CH2 ) pNHCO ( CH2 ) mCH ( Me ) SZ、 (CH2 ) pNHCOC6H4 ( CH2 ) mCH ( Me ) SZ、 (CH2) pO ( CH2 ) mCH ( Me ) SZ、 (CH2 ) pNHCO ( CH2 ) m ( OCH2CH2 ) nCH(Me) SZ、 (CH2 ) pNHCOC6H4 ( CH2) m ( OCH2CH2) nCH ( Me) SZ 、(CH2 ) pO ( CH2 ) m ( OCH2CH2 ) nCH ( Me ) SZ、 (CH2 ) pNHCO ( CH2 ) m c ( M e ) 2SZ、 (CH2 ) pNHCOC6H4 ( CH2 ) mC ( Me ) 2SZ、 (CH2) pO ( CH2 ) mC ( Me ) 2SZ、 (C H 2 ) pNHCO ( CH2 ) m ( OCH2CH2 ) nC ( Me ) 2SZ、 (CH2 ) pNHCOC6H4 ( CH2 ) m ( OCH2CH2 ) nC ( Me ) 2SZ 、（CH2)pO(CH2)m(OCH2CH2)nC(Me2)SZ、 (CH2 ) pOC6H4 ( CH2 ) mSZ、 (CH2 ) pOC6H4 ( CH2 ) mCH ( Me ) SZ、 -71 - 200813028 (7) (CΗ2 ) pOC6H4 ( CH2 ) m ( OCH2CH2 ) nCHMeSZ、 (CH2 ) pOC6H4 ( CH2 ) mCMe2SZ 或 (CH2) pOC6H4 ( CH2 ) m ( OCH2CH2 ) nC ( Me) 2SZ，其中Z表H，硫醇保護基諸如Ac、R8或SR8，其中R8表甲基、線型烷基、支鏈型烷基、環狀烷基、單純或經取代的芳基或雜環基，且m表0至10的整數，η表0至2000之整數，Ρ表〇至10之整數。 17.如申請專利範圍第1或9項之前藥，其中該聯結子係選自（CH2) pNHCO(CH2) 2SH、 (CH2 ) pNHCO ( CH2 ) 2C ( Me ) 2SH、 (CH2 ) pNHCO ( CH2 ) 2SSCH3 ' (CH2 ) pNHCO ( CH2) 2 ( OCH2CH2) nSH > (CH2 ) pNHCO ( CH2 ) 2 ( OCH2CH2 ) nC ( Me ) 2SSCH3 和 (CH2 ) pNHCO ( CH2 ) 2 ( OCH2CH2 ) nSSMe。 18·如申請專利範圍第1或9項之前藥，其中其由下式者所組成：

其中Y、R,、R2、尺3、R4、R5、R6、R7和R皆爲在申請專利範圍第2至1 7項中所定義者且其中R爲申請專利範圍第7 -1 7項中所定義的聯結子’ 或彼等的藥學上可接受之鹽類、水合物、或水合鹽類，或此等化合物的多形性結晶結構或彼等的光擧異構物、 200813028 (8) ^ 消旋物、非鏡像異構物或鏡像異構物。 19.如申請專利範圍第1或9項之前藥，其爲： (S ) -N-[2-{ ( 1-氯甲基）-1，2-二氫-5-[ ( 3-羥基-磺釀基苯基）胺基鑛氧基]-3H -本并（e) D引哄-3-基}幾基]_ 1H -卩引哄-5-基]-5-[ ( 3 -甲基一·硫基丙釀基）-胺基]-1H-D引哚-2-羧醯胺； (S) -N-[2-{ ( 1-氯甲基）-1，2-二氫-5-[ ( 3-羥基-磺醯基苯基）胺基羰氧基]-3H-苯并（e)吲哚-3-基}羰基]-1H-吲哚-5-基]-5-[ ( 3-氫硫基丙醯基）-胺基]-1H-吲哚- 2- 羧醯胺； (S) -N-[2-{ ( 1-氣甲基）-1，2 - 一·氣-5- [ ( 3-經基-礦醯基甲基苯基）胺基羰氧基]-3H-苯并（e )吲哚-3-基}羰基]-1H-吲哚-5-基]-5-{[3- ( 2-吡啶基二硫基）-丙醯基]-胺基}-1Η-吲哚-2-羧醯胺； (S) -N-[2-{ ( 1-氣甲基）-1，2 - 一氨-5- [ ( 3-經基-礦醯基甲基苯基）胺基羰氧基]-3H-苯并（e )吲哚-3-基}羰基]-1H-吲哚-5-基]-5-[ ( 3-氫硫基丙醯基）-胺基]-1H·吲哚-2-羧醯胺； (S ) -N-[2-{ ( 1-氯甲基）-1，2-二氫-5-[ ( 3-羥基-磺釀基甲基苯基）胺基鑛氧基]-3H -苯并（e) D引噪-3-基}類基]-1H-吲哚-5-基]-5-[ ( 3-氫硫基丙醯基）-胺基]-1H-吲哚-2-羧醯胺；或彼等的藥學上可接受之鹽類、水合物、或水合鹽類，或此等化合物的多形性結晶結構或彼等的光學異構物、 -73- 200813028 , (9) • 消旋物、非鏡像異構物或鏡像異構物。 2〇·如申請專利範圍第1或9項之前藥，其中其由下式者所組成：

其中Y、R】、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R皆爲在申請專利範圍第2至1 7項中所定義者且其中R爲申請專利範圍第7 -1 7項中所定義的聯結子，或彼等的藥學上可接受之鹽類、水合物、或水合鹽類 ’或此等化合物的多形性結晶結構或彼等的光學異構物、 '消旋物、非鏡像異構物或鏡像異構物。 2 1 ·如申請專利範圍第1或9項之前藥，其爲： (S ) -3- ( ( 1-(氯甲基）-3- ( 5- ( 3-氫硫基丙醯胺基）吲哚-2-羰基）-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基氧基）幾基胺基）苯磺酸； (S ) -3- ( ( 1-(氯甲基）-3- ( 5- ( 3-(甲基二硫基 )丙醯胺基）-1H-吲哚-2-羰基）-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基氧基）羰基胺基）苯磺酸；或彼等的藥學上可接受之鹽類、水合物、或水合鹽類 ’或此等化合物的多形性結晶結構或彼等的光學異構物、消旋物、非鏡像異構物或鏡像異構物。 22. —種前藥共軛物，其包含透過聯結基聯結到一或 -74- 200813028 (10) ^ 多種前述申請專利範圍中任一項所述前藥之細胞結合劑。 23. 如申請專利範圍第22項之前藥共軛物，其中該細胞結合劑係選自抗體和其片段、干擾素、淋巴細胞活素、維生素、激素和生長因子。 24. 如申請專利範圍第22或23項之前藥共軛物，其中該細胞結合劑爲抗體或其片段。 2 5.如申請專利範圍第22或23項之前藥共軛物，其中該聯結基包含聯結到對硫醇、硫鍵或二硫鍵具有反應性的官能基的聯結子。 26. —種藥學組成物，其包含申請專利範圍第1至21 項中任一項所述前藥與藥學上可接受的載劑。 27· —種藥學組成物，其包含申請專利範圍第22至 2 5項中任一項所述共軛物與藥學上可接受的載劑。 28· —種申請專利範圍第1至21項中任一項所述前藥於製備用於治療癌症之藥劑之用途。 29· —種申請專利範圍第22至25項中任一項所述共軛物於製備用於治療癌症之藥劑之用途。 30· —種製備申請專利範圍第1至21項中任一項所述前藥之方法，其包括以含磺酸的胺基甲酸酯官能基保護對應的CC- 1 065同系物的烷基化部份所含酚系基之步驟。 3 1 ·如申請專利範圍第3 0項之方法，其中此反應係使用CDI/DMA (羰基二咪唑/二甲胺）與對應的下式胺基-苯基磺酸酯衍生物進行 -75- 200813028 (11)

此處R9、R i G、R n、R】2和R】3皆爲申請專利範圍第3 項中所定義者。 3 2 ·如申請專利範圍第3 〇或3丨項之製備方法，其進一步包括將所得產物水解之步驟。 3 3 ·如申請專利範圍第3 〇或3丨項之方法，其進一步包括分離出所欲產物之步驟。 3 4 · —種製備申請專利範圍第2 2至2 5項中任一項所述共軛物之方法，其包括將包含硫鍵、二硫鍵、或硫醇基的申請專利範圍第1至2 1項中任一項所述c C - 1 0 6 5同系物與包含對於硫鍵、二硫鍵、或硫醇具反應性的官能基之細胞結合劑反應使得該同系物和該細胞結合劑透過共價硫鍵或二硫鍵聯結在~起之步驟。 -76-