BRPI0622185A2 - mÉtodo para a aquisiÇço de uma imagem digital de um resultado de aglutinaÇço, mÉtodo para a anÁlise de um ensaio de aglutinaÇço, mÉtodo para a extraÇço de um conjunto de caracterÍsticas, mÉtodo para a obtenÇço de uma funÇço de quantificaÇço f para uma diluiÇço, mÉtodo para a extraÇço de um resultado quantitativo para cada diluiÇço de uma amostra, mÉtodo para a avaliaÇço de um ensaio de aglutinaÇço e obtenÇço de um resultado semi-quantitativo - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA A AQUISIÇçO DE UMA IMAGEM DIGITAL DE UM RESULTADO DE AGLUTINAÇçO, MÉTODO PARA A ANÁLISE DE UM ENSAIO DE AGLUTINAÇçO, MÉTODO PARA A EXTRAÇçO DE UM CONJUNTO DE CARACTERÍSTICAS, MÉTODO PARA A OBTENÇçO DE UMA FUNÇçO DE QUANTIFICAÇçO F PARA UMA DILUIÇçO, MÉTODO PARA A EXTRAÇçO DE UM RESULTADO QUANTITATIVO PARA CADA DILUIÇçO DE UMA AMOSTRA, MÉTODO PARA A AVALIAÇçO DE UM ENSAIO DE AGLUTINAÇçO E OBTENÇçO DE UM RESULTADO SEMI-QUANTITATIVO. Trata-se de um método para a aquisição de uma imagem digital de um resultado de aglutinação, o qual compreende a execução de um ensaio de aglutinação em um substrato de reação que tem um conjunto de dimensões e características que permitam um padrão de aglutinação em um resultado do dito ensaio. A imagem do resultado é revelada. A imagem tem um fundo colorido que maximiza uma relação entre sinal e ruído. Além disso, a imagem foi passada através de um filtro que complementa uma ação do fundo colorido e realça os aglutinados na imagem enquanto aumenta adicionalmente a relação entre sinal e ruído.

Description

MÉTODO PARA A AQUISIÇÃO DE UMA IMAGEM DIGITAL DE UM RESULTADO DE AGLUTINAÇÃO, MÉTODO PARA A ANÁLISE DE UM ENSAIO DE AGLUTINAÇÃO, MÉTODO PARA A EXTRAÇÃO DE UM CONJUNTO DE CARACTERÍSTICAS, MÉTODO PARA A OBTENÇÃO DE UMA FUNÇÃO DE QUANTIFICAÇÃO F PARA UMA DILUIÇÃO, MÉTODO PARA A EXTRAÇÃO DE UM RESULTADO QUANTITATIVO PARA CADA DILUIÇÃO DE UMA AMOSTRA, MÉTODO PARA A AVALIAÇÃO DE UM ENSAIO DE AGLUTINAÇÃO E OBTENÇÃO DE UM RESULTADO SEMI-QUANTITATIVO

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se de maneira geral a um método para a análise automática de ensaios de aglutinação e, mais especificamente, apresenta um sistema de diagnóstico rápido, simples e automático que não requer equipamento caro e permite o registro de um ensaio de aglutinação e seu resultado para uso posterior. Além disso, o sistema é apropriado para amostras múltiplas de exibição e processamento descontínuo.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA CORRELATA

As reações de aglutinação são ferramentas de análise valiosas que podem ser aplicadas a muitos sistemas de reação nas quais ligações multivalentes entre reagentes são possíveis. Um imunoensaio de aglutinação de partículas é vantajoso pelo fato de requerer somente a mistura de uma amostra a ser testada com uma suspensão de partículas transportadoras insolúveis (por exemplo, látex) sensibilizada com um anticorpo ou um antígeno. Exemplos típicos são os imunoensaios que geralmente envolvem:

a) a mistura de uma amostra que contém um anticorpo com um antígeno (que corresponde ao anticorpo na amostra) e a observação da formação de imunocomplexo;

b) a mistura de uma amostra que contém um antígeno que contém pelo menos duas funções antigênicas (antígeno bivalente ou multivalente) com o anticorpo correspondente e a observação da formação de imunocomplexo;

c) a mistura de anticorpos monoclonais com uma amostra que contém pelo menos dois antígenos monovalentes diferentes e a observação da formação de imunocomplexo;

d) para quaisquer das reações mencionadas acima, o acoplamento do antígeno ou anticorpo às partículas, tais como partículas de látex, colóides, etc.; e a observação da formação de imunoaglutinado;

e) no caso das reações do tipo reagina plasmática rápida ("RPR") (por exemplo, para sorodiagnõstico de sífilis), a adição do carbono como um agente de visualização e a observação das reações de floculação;

f) para quaisquer das reações mencionadas acima, a aplicação das etapas acima aos antígenos presentes nas superfícies da célula em cujo caso o número de antígenos por unidade física é normalmente cem ou mais, e em cujo caso casos tais células possam ser aglutinadas por anticorpos monoclonais mesmo se cada molécula do antígeno for monovalente.

Tais reações são tipicamente observadas na superfície de um substrato sólido, tal como uma placa de vidro ou de plástico, ou na cavidade de uma placa de microtitulação. A superfície sólida é de preferência colorida para contrastar com a cor do aglutinado.

A formação de aglutinados visíveis depende da relação do antígeno/anticorpo. Se uma quantidade constante de anticorpo for misturada com quantidades crescentes de antígeno, três situações podem ser identificadas:

Um fenômeno pró-zona, caracterizado pela presença de anticorpo em excesso no sistema de teste e o qual ainda é caracterizado pela não ocorrência de qualquer reação de fase visível devido à inibição de formação de aglutinado pelo excesso de anticorpo.

Uma zona de equivalência caracterizada pela presença de antigeno e anticorpo em proporções ideais e a qual é ainda caracterizada pela formação de aglutinado e por reações de fases visíveis realçadas.

Um fenômeno pós-zona caracterizado pela presença de antigeno em excesso no sistema de teste e o qual é ainda caracterizado pela não ocorrência de reação visível.

Os fenômenos pró-zona e pós-zona podem ser corrigidos ao fazer diluições seriais de soro, reduzindo desse modo a concentração de antigeno ou anticorpo no sistema de teste, e otimizando as concentrações de antigeno e anticorpo.

As reações de aglutinação também podem ser realizadas com qualquer conjunto de moléculas que se ligam umas às outras, contanto que cada um dos reagentes tenha pelo menos dois sítios de ligação, ou é acoplado a uma partícula ou então ligado de modo que dois ou mais sítios de ligação por unidade física sejam criados. Os exemplos de sistemas com exceção dos anticorpos/antígenos que podem formar aglutinados são (poli) carboidratos/lectinas, biotinas ou compostos biotinilados/avidinas ou estreptoavidinas, seqüências correspondentes de ácidos nucléicos, qualquer receptor da proteína e seus ligantes correspondentes, etc.

Deve ser apreciado que os ensaios de aglutinação estão sendo utilizados há anos. Atualmente, muitos ensaios de aglutinação estão disponíveis aos médicos para o diagnóstico de várias doenças, e um número crescente de tais ensaios não requer que a amostra do paciente (por exemplo, sangue, urina, saliva, fazes) seja enviada a um laboratório de diagnóstico para análise. Tais ensaios de consultório permitem que os resultados sejam obtidos rapidamente e inseridos no registro do paciente no computador. Os resultados do teste também podem ficar disponíveis para médicos nas salas de emergência.

Os produtos baseados em aglutinação para a detecção e quantificação dos analitos foram produzidos para uma larga faixa de analitos. Muito cedo no campo técnico, foram desenvolvidos produtos para detecção do hormônio gonadotrópico coriônico humano (HCG) na urina, para diagnóstico de gravidez. Dois princípios diferentes foram utilizados: 1. produtos feitos com anticorpos em uma superfície da partícula, que permitem a aglutinação na presença do analito; e 2. produtos feitos com antígeno na superfície das partículas, e um reagente que contém anticorpos foi adicionado à amostra de teste. Nessa segunda variante, a aglutinação ocorreu na ausência ou em uma baixa concentração de analito como uma concentração mais alta de analito complexado com os anticorpos e foi impedida a aglutinação.

Além disso, foram produzidos reagentes de aglutinação para testes com drogas, incluindo drogas de prescrição e a maioria das drogas ilegais, e muitos hormônios não proteináceos, tais como testosterona, progesterona, estriol.

A aplicação das reações de aglutinação não fica restrita ao diagnóstico humano ou veterinário, elas também funcionam como grandes ferramentas em outros campos, incluindo a indústria agrícola, para a detecção de doenças das plantas (vírus, bactérias e fungos) e indústrias que requerem monitoramento dos processos (por exemplo, as várias indústrias alimentícias e similares).

Deve ser observado, no entanto, que os exemplos fornecidos acima não são considerados como uma lista completa de aplicações de ensaios de aglutinação e que muitas outras aplicações são possíveis.

Os analitos de proteína típicos para a tecnologia de aglutinação incluem a proteína C-reativa (CRP), a transferrina, a albumina, a pré-albumina, a haptoglobina, a imunoglobulina G, Μ, A e E, as apolipoproteínas, as lipoproteínas, a ferritina, o hormônio de estimulação da tireóide (TSH) e outros hormônios proteináceos, fatores de coagulação, plasminogênio, plasmina, fibrinogênio, produtos de degradação da fibrina, ativador de plasmogênio de tecido (TPA), as betamicroglobulinas, o antígeno prostático específico (PSA), o colágeno, os marcadores de câncer (por exemplo, CEA e alfa feto proteína) e as diversas enzimas e marcadores para dano celular (por exemplo, mioglobina e troponina IeT).

Além disso, foram produzidos muitos kits de teste de aglutinação para doenças infecciosas, incluindo a mononucleose, a infecção por estreptococo, a infecção por estafilococos, a infecção por toxoplasma, a infecção por tricomonas e a sífilis.

Tais reagentes e conjuntos de reagentes são baseados na detecção do próprio agente infeccioso ou na detecção dos anticorpos produzidos pelo corpo como reação à doença infecciosa.

Uma técnica médica típica para o ensaio de aglutinação consiste em misturar uma amostra com um ou mais reagentes de aglutinação. Os sítios de ligação no(s) reagente(s) de aglutinação ligam-se aos sítios correspondentes nos componentes da amostra, se estiverem presentes, e esta ligação resulta em aglutinados, que são agrupamentos visíveis de reagente e componente da amostra ligados. Desse modo, um reagente desejado pode ser misturado com uma amostra e a presença de aglutinados na mistura indica a presença do componente correspondente na amostra. Desse modo, é utilizado um teste de aglutinação de partícula em látex comercial em slide (tal como o Látex Toxocell, feito pela Biokit, de Barcelona, Espanha).

Um teste de aglutinação em látex com base em slide típico, tal como o Látex Toxocell, feito pela Biokit, de Barcelona, Espanha, é descrito abaixo.

Seleção Preliminar: A amostra de soro e o reagente em látex são misturados com um bastão de madeira em uma seção de slide por aproximadamente cinco minutos. O solvente da amostra é utilizado como um controle negativo. Em seguida, o slide é examinado sob luz direta e intensa para verificar a presença ou ausência de aglutinação. Os resultados são registrados de acordo com: reação positiva (3+ agregados grandes em fundo claro, 2+ agregados médios em um fundo ligeiramente turvo, 1+ agregados pequenos em um fundo turvo (para fins de ensaio, os agregados visíveis apenas em fundos leitosos podem ser considerados como uma indicação positiva) ou reação negativa (ausência de aglutinação: aspecto uniforme leitoso)).

Técnica de titulação: a amostra é submetida a duas diluições seriais com solvente da amostra sobre um único slide e é processada de acordo com o método de seleção preliminar descrito acima. No entanto, uma titulação de uma determinada amostra corresponde à diluição de soro mais elevada que ainda apresenta uma aglutinação claramente visível (+1 de acordo com a escala acima). Devido ao fato que as amostras são testadas em diluições duplicadas, a concentração real irá estar na faixa de concentração da primeira e da segunda diluições. Com esta técnica, não há nenhuma maneira de determinar a concentração real e a técnica é, desse modo, útil nos casos onde é a variação da concentração, ao contrário da concentração real, que é de interesse.

Embora as reações de aglutinação tradicionais sejam, de fato, de natureza quantitativa, a interpretação do resultado é tradicionalmente qualitativa.

No entanto, uma vez que é desejável que muitos dos analitos que podem ser objeto de tais reações de aglutinação sejam medidos quantitativamente, outros métodos mais complicados, como métodos ELISA, RIA, de imunofiltração ou de imunocromatografia, têm sido empregados.

Algumas patentes tentam lidar com o problema da análise quantitativa versus qualitativa no contexto de ensaios de aglutinado mediante a aplicação de um procedimento automático a uma imagem escaneada do ensaio de aglutinado. 0 pedido de patente internacional PCT. W00005571 descreve um dispositivo e um método para quantificação das reações de aglutinação com base em uma imagem digital da reação de aglutinação. Embora essa patente apresente exemplos em que as amostras com concentrações diferentes produzem valores diferentes nas características medidas, nenhuma evidência é apresentada com respeito à reproducibilidade de tais análises. Em alguns exemplos as curvas obtidas das características medidas versus concentração têm regiões extremamente pequenas onde a quantificação pode ser possível. Por último, mas não menos importante, a patente não estuda a reproducibil idade do processo, o que é imperativo para sistemas diagnósticos automáticos e gerais. Em diversos casos, os padrões de aglutinação incluem grandes variações que não são explicadas ao utilizar esses tipos de sistemas (vide a Figura 2). O método proposto pelo Pedido de Patente Internacional PCT W00005571 não trata deste problema. Uma vez que nenhum pré-processamento é aplicado à imagem antes da extração da característica, grandes variações no processo podem ocorrer devido à iluminação não uniforme, ruído, sujeira e bolhas, além de variações na própria amostra. Além disso, o procedimento para obter a reação é completamente manual, isto é, um bastão de madeira é utilizado para misturar os reagentes e distribuir os mesmos sobre uma superfície de placa. Isto na verdade piora a distribuição do aglutinados, uma vez que as partículas serão formadas irregularmente de um modo não reproduzível, o que faz com que as partículas aumentem em altura. Consequentemente, quaisquer resultados obtidos são tipicamente imprecisos.

No Pedido de Patente Norte-americano n° 5.541.417 um método similar é proposto. Uma imagem digital da reação de aglutinação é obtida e processada. A quantificação é baseada em um índice de aspereza que captura as variações locais de pixel. Esses tipos de descritores de textura são eficientes ao tratar de texturas uniformes. No entanto, tal como observado acima, no caso geral das reações de aglutinação, são esperadas grandes variações nos padrões de aglutinação.

Conforme afirmado anteriormente, essas variações são relacionadas freqüentemente com características da amostra que não podem ser inferidas a priori. Portanto, a aspereza produzirá diferentes valores de saída para amostras com concentrações iguais, mas diferentes padrões de aglutinação.

Em uma segunda realização, o pedido de patente propõe o uso de uma rede neural para generalizar variações de intensidade locais. As redes neurais devem ser ensaiadas ao utilizar dados de ensaio suficientemente ricos. Esta é uma limitação nos sistemas de diagnósticos em que os reagentes podem mudar com o passar do tempo, produzindo variações nos padrões de aglutinação. Portanto, mudanças freqüentes são feitas no sistema em que a rede deve ser ensaiada e enviada a todos os usuários do sistema. Por outro lado, tal como mencionado acima, as aglutinações com concentrações similares podem ter padrões de aglutinação diferentes (vide a Figura 2) e uma rede neural baseada somente em uma medida da aspereza terá problemas para quantificar precisamente a amostra.

Um outro exemplo de aplicação desta técnica envolve a sorologia de grupo sangüíneo, era que a aglutinação é o resultado da mistura de células vermelhas (que contêm um antígeno em particular) com um soro que contém o anticorpo correspondente. Os testes de tipo sangüíneo são feitos antes de uma pessoa receber uma transfusão de sangue e para verificar o tipo sangüíneo de uma mulher grávida. 0 sangue humano é classificado, ou tipificado, de acordo com a presença ou a ausência de determinados marcadores (chamados antígenos) na superfície das hemácias. Os antígenos mais importantes são os antígenos de grupo sangüíneo (ABO) e o antígeno do Rh. Portanto, os dois testes mais comuns de tipo sangüíneo são o ABO e os testes de Rh.

Com respeito a este tipo de ensaio de aglutinação, o Pedido de Patente Internacional PCT W08907255 tenta resolver um problema de operação normal com detectores automáticos para o teste de hemoaglutinação. No procedimento normal, a maneira pela qual o aglutinado se deposita nas paredes e no fundo da célula de amostra (ou depressão da placa) faz a detecção automática da dificuldade de aglutinação. Normalmente, um botão pequeno é formado no centro da superfície de reação, e outros depósitos ficam dispersos desigualmente pela superfície. 0 método parece resolver aqueles problemas somente nos casos em que uma detecção positiva/ negativa é necessária, comparando os valores de absorção das zonas centrais e periféricas do fundo da célula (ou placa). No entanto o método descrito não pode ser aplicado às amostras diluídas, encontradas geralmente quando a concentração de analito é baixa e/ou a diferença de absorção entre ambas as zonas é baixa e cada valor de absorção é próximo de zero (por causa da alta dispersão dos aglutinados).

Desse modo, foram realizados ensaios de aglutinação tradicionais somente semiquantitativamente, e a interpretação dos resultados obtidos desse modo é sujeita a incorreção de erro humano e não é freqüentemente reproduzível.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

Para superar algumas das desvantagens descritas acima, é apresentado um método para uma imagem digital de um resultado de aglutinação que compreende a realização de um ensaio de aglutinação um em substrato de reação que tem um conjunto de dimensões e características que permitem um padrão de aglutinação em um resultado do dito ensaio. A imagem do resultado é revelada. A imagem tem um fundo colorido que maximiza uma relação entre sinal e ruído. A imagem tem um fundo colorido que maximiza uma relação entre sinal e ruído. Além disso, a imagem foi passada através de um filtro que complementa uma ação do fundo colorido e realça os aglutinados na imagem enquanto aumenta adicionalmente a relação entre sinal e ruído.

Em um outro realce específico o padrão está relacionado a uma concentração de interesse na amostra.

Em um outro realce específico a imagem é obtida ao utilizar um scanner de leito plano.

Em um outro realce específico a imagem é obtida ao utilizar uma câmera.

Em um outro realce específico a imagem é obtida ao utilizar uma disposição de fotodetectores.

Outro aspecto da invenção é um método para a análise de um ensaio de aglutinação, o qual compreende a execução de um ensaio de aglutinação ao misturar um volume de uma diluição da amostra com um volume correspondente de pelo menos um elemento reativo e observar uma formação de aglutinados. Um controle negativo é preparado ao misturar um segundo volume de diluição da amostra igual ao volume da diluição da amostra da etapa com um segundo volume correspondente do elemento reativo. É obtida uma imagem digital das diluições da amostra. A imagem digital é processada contra uma curva de calibração para gerar um valor de resultado quantitativo representativo de um grau de aglutinação da amostra e do elemento reativo.

Em um outro realce específico o método compreende adicionalmente o processamento da imagem ao identificar e quantificar automaticamente as amostras presentes na imagem digital do ensaio.

Mais especificamente, o método compreende a extração de um conjunto de características. É obtida uma função de quantificação que mapeia as características medidas para a concentração real da amostra. É extraído um resultado quantitativo para cada amostra no ensaio. Ainda um outro aspecto da invenção diz respeito a um método para a extração de um conjunto de características que caracterizam um conjunto de resultados de aglutinação, em que o método compreende a aplicação de um filtro digital ou óptico para extrair um componente da imagem ou a parte de um espectro onde uma relação entre sinal e ruído entre os aglutinados e o fundo é maximizado. É aplicada uma transformação de cartola com um elemento estrutural esférico para obter uma imagem nova indicada como Rd e para atribuir o conjunto de pixels dentro de cada cavidade a uma matriz indicada como Rdi. Os pixels dentro de uma cavidade produzida pela reação de aglutinação são extraídos. É feita a computação de uma média dos pixels em Rdi. Um desvio padrão dos pixels em Rdi é computado. Pelo menos um outro descritor estatístico e de textura é computado. Uma área estimada dos aglutinados é determinada.

Em um outro realce específico o descritor estatístico e textural é pelo menos um dentre a Média, o Desvio Absoluto, Kurtosis e os momentos de Matrizes de co- ocorrência. Um outro aspecto da invenção é um método para obter uma função de quantificação F para uma diluição que mapeia um conjunto de características medidas para uma concentração real da amostra, em que o método compreende a confecção de uma tabela com as entradas: Diluição, Média e Concentração (UI/ml). Uma análise dos menores quadrados é aplicada a uma região acima de um ponto de resposta negativa e abaixo de um ponto de saturação para ajustar uma função paramétrica para a tabela. Limites seguros são obtidos para indicar um começo e um final de uma zona de quantificação e pesos de confiança. É obtido um valor de Th+, o qual define um conjunto de valores de uma característica que corresponda a aglutinações positivas.

Um outro aspecto da invenção é um método para a extração de um resultado quantitativo para cada diluição de uma amostra baseada em suas características de aglutinação, uma função de quantificação e um conjunto de diluições que o método compreende. Para cada característica de aglutinação (fi), fi é comparado com um valor de Th+ obtido que define os valores de uma característica que corresponde a aglutinações positivas. Se fi > Th+, uma diluição é declarada como positiva. Para uma última diluição positiva (fj), se fj cair dentro de uma região de quantificação, sua concentração Q é estimada como: Q = F(fj)*j. Os valores de Th+, fj e Q são validados se uma medida da área estiver acima de um limite de um controle negativo e abaixo da saturação. Um resultado final é obtido ao determinar uma média ponderada dos valores validados.

Um outro aspecto da invenção é um método para a avaliação de um ensaio de aglutinação, o qual compreende a obtenção de uma tabela de semiquantificação F ao utilizar um conjunto de amostras de pacientes etiquetadas. Um conjunto de técnicas de reconhecimento de padrão é aplicado para determinar um conjunto de limites que dividem cada aglutinação em uma classe de aglutinação com um erro de probabilidade mínimo. É obtido um limite Th+ que divide as reações de aglutinação positivas e negativas. Para cada amostra de paciente, um processo de semiquantificação é obtido para uma avaliação da aglutinação.

Mais especificamente, uma tabela de treinamento de semiquantificação F é obtida ao utilizar um processo que compreende para cada imagem em uma amostra de treinamento, o processamento de todas as reações com o método de extração de característica para obter um conjunto de características de aglutinação, a tabela é feita com entradas para Classificação e Característica da Aglutinação Obtida.

Mais especificamente, um resultado semiquantitativo para avaliar um ensaio de aglutinação é obtido utilizando um método que compreende a medição de uma característica que caracteriza a aglutinação. Um limite (Th+) é obtido. Para cada reação positiva, a tabela de semiquantificação F é utilizada para obter uma classificação de aglutinação.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Vários outros objetivos, características e vantagens adicionais da presente invenção tornar-se-ão totalmente percebidos à medida que os mesmos se tornem mais bem compreendidos quando considerados conjuntamente com os desenhos anexos, nos quais os mesmos caracteres de referência designam a mesma parte ou partes similares nas diversas vistas, e em que:

A Figura 1 é uma imagem escaneada da placa utilizada no Exemplo 1. No canto superior esquerdo há um controle negativo, parte inferior direita para cima há um conjunto de diluições para uma dada amostra. Partindo de uma diluição 1:1, as diluições 1:2, 1:4, 1:6, etc. foram produzidas. A Figura 2 mostra os resultados de aglutinação para três amostras com concentrações quase iguais, mas diferentes padrões de aglutinação .Da parte inferior para a superior, as diluições 1:1,1:2,1:4,1:8 e 1:16 são mostradas.

A Figura 3 mostra os resultados para um conjunto de imagens padrão (amostras) e um ajuste linear em pedaços para esses dados para quantificação.

A Figura 4 mostra uma imagem digital com as reações de aglutinação, contendo quatro testes de tipo sangüíneo.

A Figura 5 mostra a Tabela 1, que inclui os detalhes dos procedimentos aqui discutidos.

A Figura 6 mostra a tabela 2, que inclui os resultados de cada diluição.

A Figura 7 mostra a tabela 3, que inclui os resultados do Exemplo 1.

A Figura 8 mostra a tabela 4, que inclui os resultados do Exemplo 2.

A Figura 9 mostra a tabela 5, que inclui os resultados do Exemplo 2.

A Figura 10 mostra a tabela 6, que inclui os resultados obtidos com o processo de semiquantificação proposto com os resultados dados por um especialista.

A Figura 11 mostra a tabela 7, que apresenta uma matriz de confusão com os resultados de classificação.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Retomando com mais detalhes os desenhos, em que os caracteres de referência similares mostram elementos similares em diversas vistas, as figuras anexas ilustram um aparelho e um processo preferido para a análise quantitativa automática de ensaios de aglutinação que compreende:

a. um dispositivo de obtenção de imagem digital para obter uma imagem digital da reação de aglutinação, e

b. um conjunto de procedimentos para processamento de dados que processa a imagem digital para obter automaticamente um resultado quantitativo da reação de aglutinação.

0 sistema de obtenção de imagem pode ser um scanner de computador de leito plano de mesa ou qualquer outro dispositivo de imagem tal como uma câmera digital, uma videocâmera ou qualquer outra disposição de detectores de luz.

0 processamento de dados pode ser realizado por um conjunto de procedimentos executados em um computador pessoal, mas outros sistemas digitais mais específicos, como componentes eletrônicos personalizados, podem ser utilizados.

A imagem digital pode ter um número arbitrário de canais, obtido diretamente pelo sistema de obtenção ou produzido com outros métodos como filtragem e/ou processamento óptico ou digital.

O ensaio é executado em qualquer substrato apropriado, tal como uma placa plástica. A fim de prender cada amostra em uma área confinada, o substrato pode conter cavidades predefinidas de forma e dimensões apropriadas. Isto facilita a identificação de cada amostra e fixa a altura de cada amostra dados os volumes da amostra e os reagentes.

Por exemplo, a superfície da placa de reação pode ter uma forma de modo que a mistura de reação seja encerrada dentro de uma determinada região a fim de melhorar a reproducibilidade em leituras quantitativas. Isto pode ser conseguido por uma elevação circular na superfície plástica, que pode ser feita de acordo com métodos de produção padrão, ou pelo uso de uma placa de microtitulação.

A determinação do resultado quantitativo pode envolver a extração de um conjunto de características da imagem digital. Essas características caracterizam a distribuição do pixel para cada amostra no ensaio e o relacionam com um resultado quantitativo.

Como um exemplo do uso da invenção, o procedimento é aplicado a um kit de aglutinação em látex comercial para determinação quantitativa dos anticorpos a um determinado protozoário no soro. Outros usos da técnica mencionada incluem qualquer reação de aglutinação particulada onde um reagente, tal como o látex, é utilizado; aglutinação das hemácias; aglutinação bacteriana e RPRs, sendo que as partículas de carbono são utilizadas como meios contrastantes que permitem a observação da aglutinação, na qual os agregados e os meios são transparentes; etc.

Após a obtenção da imagem, a implementação do software proposto do presente procedimento fornece uma representação quantitativa da concentração de analito, que pode ser armazenada para referência posterior.

A determinação automática quantitativa dos resultados para cada amostra no ensaio pode envolver as seguintes etapas:

1. a determinação das áreas da imagem digital que correspondem a cada resultado de aglutinação da amostra,

2. a extração do conjunto de pixels que representa os resultados da aglutinação,

3. a computação de um conjunto de características para determinar o resultado quantitativo.

A extração da parte do pixel que na realidade pertence à aglutinação pode ser determinada por métodos de agrupamento que agrupam os pixels vizinhos de características similares, tais como nível de cinza, cor, textura, etc. [M.Sonka, V. Hlavac, R. Boyle."Image Processing, Analysis and Machine Vision", 1999, segunda edição, ITP Publising] . Os agrupamentos também podem ser utilizados para a determinação dos resultados quantitativos, computando, por exemplo, sua área, forma, distribuição da cor, número, etc. Alternativamente, as regiões de aglutinação podem ser extraídas com métodos de morfologia matemática, tais como abertura e fechamento seguidos por limites [M. Sonka, V. Hlavac, R. Boyle."Image Processing, Analysis and Machine Vision", 1999, segunda edição, ITP Publising].

O sistema de obtenção de imagem irá utilizar preferivelmente uma fonte de luz controlada e uniforme e possivelmente um fundo colorido a fim de realçar as diferenças entre a aglutinação e o fundo. Até mesmo no caso de uso de um scanner de leito plano ou outras fontes de luz controladas, é importante calibrar o sistema. Para isso, um objeto de calibração predefinido pode ser utilizado. 0 objeto de calibração pode ser utilizado antes, ou ao mesmo tempo, da obtenção da imagem do ensaio. Em ambos os casos, o sistema de processamento de dados vai comparar a imagem do objeto de calibração com uma referência armazenada do mesmo. 0 relacionamento entre ambas as imagens pode ser utilizado a fim de traduzir os valores de pixel obtidos para um sistema coordenado de referência ou para rejeitar a imagem se as condições de iluminação não puderem garantir a extração confiável dos resultados da aglutinação.

O mesmo objeto de calibração, ou outro, pode ser utilizado para determinar os parâmetros intrínsecos do sistema de obtenção, tais como a ampliação e outras distorções geométricas e de cor. 0 uso de um objeto de calibração fornecerá um relacionamento entre as características da imagem do pixel e as reais dimensões, posições e cores.

Embora o sistema descrito utilize a luz branca padrão, ele também pode utilizar um outro tipo de luz e fotodetectores destinados à extração da informação em outras partes do espectro, tais como infravermelho ou ultravioleta. O sistema também pode utilizar um conjunto de filtros ópticos e/ou digitais para realçar algumas partes do espectro.

Os procedimentos de processamento de dados da invenção pretendem identificar e quantificar automaticamente as amostras presentes na imagem digital do ensaio. O método inclui as seguintes etapas:

1. determinação da posição do substrato do ensaio na imagem,

2. extração das áreas de cada amostra,

3. extração dos pixels de dentro da imagem precedente que correspondem ao resultado de aglutinação,

4. extração de um conjunto de características que caracterizam os resultados de aglutinação, e

5. extração de um resultado quantitativo para cada amostra no ensaio.

DETERMINAÇÃO DA POSIÇÃO DO SUBSTRATO DE ENSAIO NA IMAGEM.

As áreas extraídas de cada amostra são examinadas para regiões de forma conhecida, correspondendo às cavidades predefinidas, sendo coloridas de modo diferente do fundo. 0 uso de fundos coloridos bem escolhidos facilita esta etapa (discutida abaixo). Além disso, a geometria do substrato do ensaio pode ser utilizada para localizar posições potenciais das amostras. Para detectar cavidades que contêm amostras, a imagem é pré-processada com uma abertura em nível de cinza com um elemento de estrutura esférica e é então limitada [M. Sonka, V. Hlavac, R. Boyle."Image Processing, Analysis and Machine Vision", 1999, segunda edição, ITP Publising]. Este processamento preenche os espaços vazios na amostra dentro da cavidade e aumenta o contraste entre as amostras e o fundo. Utilizando a forma conhecida das cavidades, os resultados desta etapa podem ser depois melhorados com um procedimento de correspondência do formato local.

Os pixels que correspondem à aglutinação são extraídos ao aplicar a transformação de cartola com um elemento estrutural esférico [M. Sonka, V. Hlavac, R. Boyle."Image Processing, Analysis and Machine Vision", 1999, segunda edição, ITP Publising]. Este processo subtrai o fundo e realça os aglutinados para obter uma imagem com aglutinados melhorados. A imagem digital resultante da transformação de cartola é indicada como IMD. Os pixels que correspondem à aglutinação podem então ser obtidos através de traçado de limite. Ao executar a operação da abertura as cristas da textura obtidas na imagem digital são extraídas. Essa textura é causada pela aglutinação e determinada principalmente pela aparência dos aglutinados. Esses aglutinados refletem a luz projetada pela fonte de luz e aparecem como pontos brilhantes (cristas) na imagem digital. Ao aplicar o processamento previamente mencionado os aglutinados são extraídos com sucesso ao cancelar o fundo não uniforme.

Sem esta etapa, a maioria das características computadas da aglutinação seria distorcida pelo fundo não uniforme e não se generalizaria para outros casos.

EXTRAÇÃO DE UM CONJUNTO DE CARACTERÍSTICAS QUE CARACTERIZAM OS RESULTADOS DA AGLUTINAÇÃO

Para cada cavidade que contém uma amostra, é medido um conjunto de características que caracterizam a aglutinação. Em alguns casos a aglutinação pode consistir em aglutinados grandes com alto contraste contra o fundo, em outros casos a aglutinação resulta em áreas texturizadas quase uniformes. No primeiro caso, a detecção pode ser realizada por meio de técnicas de traçar limites seguidos pela determinação da área, do número, etc., dos aglutinados, se somente a detecção da aglutinação for de interesse. Para o outro caso, um conjunto de características que caracterizam a textura deve ser identificado para a detecção e a quantificação da amostra.

O conjunto de características utilizado para classificação da textura pode ser composto de uma ou mais das características a seguir, além de outras: momentos estatísticos dos pixels de aglutinação (média, desvio padrão, kurtosis, etc.), momentos das matrizes de co-ocorrência, assinatura fractal, características espectrais tais como o espectro de Fourier, etc. [M. Sonka, V. Hlavac, R. Boyle."Image Processing, Analysis and Machine Vision", 1999, segunda edição, ITP Publising].

EXTRAÇÃO DA CARACTERÍSTICA DE AGLUTINAÇÃO UTILIZANDO A

TRANSFORMAÇÃO DE CARTOLA

Para levar em consideração a variabilidade inerente da técnica, é preferível que o método seja robusto e que possa lidar com os imprevistos e defeitos causados durante a manipulação da reação, tal como bolhas na amostra, manchas, linhas coloridas, etc., e problemas inerentes da técnica de obtenção, tais como a iluminação irregular. Para isso o método aplica uma etapa de pré-processamento antes de computar as características que eliminam esses artefatos. Conforme afirmado anteriormente, a iluminação irregular é cancelada ao realçar a aglutinação através da morfologia matemática.

A imagem da amostra é processada com uma transformação de cartola (para uma explicação detalhada da transformação de cartola, vide [M. Sonka, V. Hlavac, R.

Boyle."Image Processing, Analysis and Machine Vision", 1999, segunda edição, ITP Publising]). Este processo subtrai o fundo e realça os aglutinados. Em seguida, uma média ê computada sobre a imagem da amostra processada, o que demonstra ser uma característica eficaz. Uma vez que o volume da cavidade é ajustado a fim de obter uma camada fina de amostra, a média é um bom estimador para a força de aglutinação, e dessa maneira pode ser relacionado à concentração da amostra. Do mesmo modo, bolhas podem ser detectadas. Artefatos com cores similares às dos aglutinados podem ser detectados e removidos ao se observar suas formas e tamanhos.

É desejável que se tenha um volume total ideal em cada cavidade para que as características extraídas funcionem com sucesso como uma característica quantitativa. Finalmente, o volume total é relacionado a diversas propriedades físicas e mecânicas (tamanho das partículas do reagente, diâmetro da cavidade, agitação, etc.) da invenção. Esses parâmetros devem ser configurados e ajustados ao praticar as etapas restantes do processo proposto. Os parâmetros podem ser ajustados tal como segue:

A fim de realçar o contraste entre os aglutinados e o fundo, um fundo colorido pode ser utilizado. A seleção da cor de fundo depende do comprimento de onda da luz refletida pelos aglutinados (por exemplo: partículas de látex).

O volume e as dimensões da cavidade devem ser selecionados com base nos critérios a seguir. A cavidade deve ser suficientemente arredondada para evitar a sobreposição e a acumulação de aglutinados nos cantos (no caso de uma cavidade retangular ou quadrada ser utilizada) .

O volume da cavidade é limitado pelo acesso às micropipetas de baixo volume, para evitar o excesso desnecessário de elementos reativos caros, e a habilidade do usuário de manipular volumes pequenos de elementos reativos em um espaço pequeno (evitando a mistura espontânea) . Normalmente é aconselhável um volume entre 30 e 120 μΐ.

Além disso, as dimensões do slide de poliestireno também são limitadas pela área de captura do dispositivo de digitalização, e pelo menos duas cavidades devem estar na mesma imagem (uma para a amostra e outra para o controle negativo).

O diâmetro deve ser suficiente para evitar a sobreposição espontânea da amostra e do elemento reativo até que o operador o faça mediante o uso de um bastão. Ele também pode permitir a introdução e a extração da micropipeta sem problemas para facilitar o trabalho do operador.

Uma vez que o volume da cavidade é ajustado a fim de obter uma camada fina de amostra, a altura deve ser escolhida ao se considerar todas as preferências selecionadas previamente.

Os parâmetros utilizados durante o ensaio e o processo de quantificação devem garantir que a reação a ser quantificada caia dentro da região onde as características medidas e a concentração resultante têm um relacionamento conhecido. Isso está acima da zona de reação negativa e abaixo do nível de saturação.

Cuidado especial deve ser tomado com o controle da temperatura ambiente e a concentração da amostra de analito. Uma temperatura ambiente alta poderia aumentar a afinidade de aglutinação, por isso ê aconselhável realizar a análise em uma sala que esteja preferivelmente a 25°C ± 5°C.

Se os dados fornecidos pelo paciente indicarem que o analito tem uma alta concentração ou afinidade de aglutinação (em qualquer caso por uma análise prévia pelo teste conhecido baseado em slide), é aconselhável diluir a amostra até que a suposta concentração caia entre a zona de reação negativa e abaixo do nível de saturação. Outros parâmetros, como a pressão atmosférica ambiente, têm baixo impacto, mas sempre é preferível tentar a análise em uma sala fechada (para evitar a contaminação da amostra por poeira). Como sempre, é aconselhável que o operador seja muito bem treinado.

Dessa maneira, a imagem capturada tem correlação com a concentração real da amostra.

Se todas as condições precedentes forem observadas, as características extraídas, por exemplo, a média, tem uma correlação forte com a quantidade de aglutinação, e, portanto podem ser utilizadas como medidas de quantificação. A quantificação utiliza um conjunto de características que caracterizam os resultados da aglutinação.

Com o conjunto de características para cada amostra, os resultados podem quantificados. Para a quantificação, as características medidas são comparadas com as de um padrão conhecido. Isto é, o conjunto de características medidas é utilizado como argumento em uma função ou tabela de quantificação para obter o resultado da quantificação. Este resultado de quantificação pode ser avaliado por um elemento versado na técnica de produção ao usar os métodos conhecidos no estado da técnica.

Para obter a função ou tabela de quantificação, as amostras com títulos conhecidos são processadas com a mesma técnica. Diversos ensaios podem ser utilizados para melhorar os resultados, tais como as razões de relação de sinal melhoradas, que levam em conta a variabilidade da técnica intrínseca e tornam possível a generalização dos resultados enquanto evita um ajuste excessivo.

Com os resultados obtidos, os menores quadrados, os menores quadrados intensos ou um outro método [R. Burden, J. Faires. "Numerical Analysis", 2002, Thomson.]podem ser utilizados para ajustar uma função de quantificação aos resultados obtidos para a amostra padrão.

As características medidas da amostra são utilizadas como argumentos para a função de quantificação para fornecer a quantificação de amostras desconhecidas.

Diversas características e funções de quantificação podem ser utilizadas para melhorar os resultados. Para essa finalidade, as técnicas de combinação de classificadores podem ser utilizadas. Por exemplo, a quantificação de diversas diluições pode para melhorar os resultados, ou para considerar a combinação de um conjunto de características. Em ambos os casos as ponderações confiáveis também podem ser utilizadas. Em alguns casos, já se sabe que o método é mais sensível a algumas diluições, etc. Essas ponderações confiáveis podem ser obtidas junto com o processo do menor quadrado mencionado acima.

Este procedimento de calibração pode ser executado pelo técnico no laboratório, uma vez que nenhum equipamento extra é necessário.

Três exemplos de procedimentos básicos que compreendem o presente processo de quantificação automático são fornecidos abaixo.

PROCEDIMENTO 1: EXTRAÇÃO DA CARACTERÍSTICA

Para cada cavidade que contém uma reação de aglutinação, o procedimento para a extração das características que caracterizam o resultado da aglutinação deve executar as seguintes etapas:

1. Aplicação de um filtro digital ou óptico para extrair o componente da imagem ou parte de um espectro onde uma relação entre sinal e ruído entre os aglutinados e o fundo é maximizada. Por exemplo, um filtro ótico pode ser colocado entre a amostra e o sensor para capturar a parte desejada do espectro, ou as respostas do sensor multicanal como uma disposição de cores pode ser combinada para extrair o componente desejado.

2. Aplicar a transformação de cartola.

3. Extração da característica. Nesta etapa somente os pixels dentro da cavidade são considerados, ou seja, somente os pixels produzidos pela reação de aglutinação. O conjunto de pixels dentro da cavidade é aqui indicado como Rdi.

a. Computação de um desvio padrão dos pixels em Rdi: Std = std(Rdi).

b. Computação de outros descritores estatístico e de textura: Desvio Absoluto Médio, Kurtosis e os momentos de Matrizes de co-ocorrência etc.

c. Estimar a área dos aglutinados.

1. Extrair os aglutinados.

ii. Estimar a área dos aglutinados, Área.

PROCEDIMENTO 2: OBTENÇÃO DA FUNÇÃO DE QUANTIFICAÇÃO F

Para obter a função que mapeia as características medidas para a concentração real da amostra, é realizado um conjunto de ensaios em uma amostra padrão de concentração conhecida. Para construir a função de quantificação, é realizado um conjunto de diluições predefinidas para cada amostra.

1. Para cada ensaio padrão (imagem):

a. Processar todas as diluições padrão de acordo com o Procedimento 1 para obter as características de aglutinação de cada diluição.

b. Elaborar uma tabela com as entradas: Diluição, Característica e Concentração (Ul/ml).

2. Aplicar os menores quadrados, os menores quadrados intensos ou outro método para ajustar a curva de quantificação F desejada (por exemplo) uma função linear em pedaços aos dados previamente obtidos em (1) .

3. A obtenção de limites seguros para indicar um começo e um final de uma zona de quantificação e pesos de confiança.

PROCEDIMENTO 3: O PROCESSO DE QUANTIFICAÇÃO

Para a quantificação, todas as diluições da amostra são processadas. Para cada diluição, as características que caracterizam a aglutinação são medidas. Suponha que as diluições 1, 2, 4, 8, 16, etc. foram feitas e as características: fl, f2, f4, ..., fl6, ... etc., foram obtidas. Considere-se também uma função de quantificação F que mapeie essa característica em sua concentração (vide o procedimento 2).

1. se fi > Th+ a diluição é declarada positiva. Th+ é obtido junto com a função F e define os valores da característica que correspondem às aglutinações positivas.

2. Considere-se fj como a última diluição positiva.

3. Se fj cair dentro da região da quantificação, a concentração Q pode ser estimada como:

a. Q = F(fj)*j .

Para validar a medida, a área de aglutinados pode ser utilizada. As reações negativas possuem aglutinados pequenos. Uma vez que um controle negativo é utilizado, as amostras podem ser avaliadas considerando as diferenças da área. As diferenças grandes indicam um resultado positivo. Isto deve ser feito, uma vez que as características tendem a saturar em altas concentrações.

Para fazer uma estimativa mais robusta, a média de todas as diluições que caem dentro da zona de quantificação é computada. Elas podem ser determinadas a partir da última diluição positiva utilizando limites seguros apropriados obtidos junto com a função F.

EXEMPLOS

Exemplo 1. O exemplo a seguir foi executado ao realizar uma reação de aglutinação de toxoplasmose.

REQUISITOS DE AMOSTRA PARA 0 TESTE DE TOXOPLASMOSE:

O soro humano é coletado por centrifugação a partir do sangue humano coagulado, obtido por picada na veia. Os agentes conservantes devem ser evitados. Se o teste não for realizado no mesmo dia, o soro deve ser armazenado a 4°C por no máximo 4 8 horas; para períodos mais longos, é aconselhável congelar a amostra.

A reação pode ser executada sobre slides transparentes de poliestireno, com as áreas de reação delimitadas por bordas do mesmo material, definindo um circulo.

Materiais:

- pipetas automáticas de 30 e 60 μl.

- agulhas descartáveis.

- agitador orbital (velocidade entre 80 a 90 rpm).

- termômetro para medir de 32,00 a 122,00°F (que permite a medição dos décimos de grau).

- solvente da amostra: 8,5 g/l de NaCl, 1 g/l de BSA (soroalbumina bovina), 1 g/l de azida sódica, 1 litro de H2O sqf.

- Cronômetro.

REAGENTE EM LÁTEX

A diluição de um reagente em látex deve ser ajustada previamente de acordo com a Organização Mundial da Saúde (soro padrão). Isto é realizado pela aplicação da técnica de slide padrão, de modo que a última diluição em que uma aglutinação positiva é detectada corresponda a uma concentração de 10 IU/ml (unidades internacionais por ml de soro).

PREPARAÇÃO DA AMOSTRA:

A amostra deve ser descongelada e colocada a temperatura ambiente, antes do uso. Antes de executar o conjunto de determinações, o reagente em látex, os controles e o solvente devem alcançar uma temperatura ambiente. 0 ensaio deve ser realizado a uma temperatura entre 68,00 a 86,00°F. 0 reagente em látex deve ser agitado delicadamente antes do uso (evitando a produção de espuma).

SELEÇÃO PRELIMINAR:

1. Colocar um volume previamente determinado A de soro por meio de uma pipeta automática em uma extremidade das concavidades do slide. 2. Adicionar um volume previamente determinado B do reagente em látex na extremidade oposta.

3. Misturar ambas as gotas com um agitador, cobrindo toda a superfície, permitindo que o líquido alcance a borda da cavidade.

4. Colocar um volume previamente determinado A do solvente da amostra e misturá-lo com um volume previamente determinado B do reagente em látex na seção número 20 do slide. Isto será utilizado como controle negativo (Figura n° 2) .

5. Girar o slide a 80 rpm por cinco minutos.

6. Obter a imagem digital com o software associado contra um fundo escuro previamente determinado, cuja cor é selecionada para aumentar a definição das bordas dos agregados.

7. Se os resultados forem positivos, uma titulação deve ser feita para obter a concentração de soro do analito.

TITULAÇÃO:

As diluições da amostra devem ser feitas sobre o mesmo slide, tal como segue:

1. Adicionar um volume A do diluente da amostra em cada seção do slide.

2. Colocar um volume A da amostra na seção 1.

3. Misturá-lo com o solvente colocado previamente.

4. Utilizando a mesma pipeta, tomar e liberar o soro e os diluentes até que estejam bem misturados (por exemplo, uma diluição de 50%)

5. Pegar o volume A dessa diluição e transferir o mesmo à seção 2. Repetir os estágios I a IV.

6. Na última diluição, tomar o volume A e descartar o mesmo.

7. Obter a imagem digital com o software associado contra o fundo escuro previamente determinado, cuja cor é selecionada para aumentar a definição das bordas dos agregados.

8. Processar a imagem digital com os procedimentos 1 a 3 propostos abaixo. PROCEDIMENTO 1: PROCESSO DE EXTRAÇÃO DA CARACTERÍSTICA

Para cada cavidade que contém uma reação de aglutinação, o procedimento para a extração das características que caracterizam o resultado da aglutinação deve executar as seguintes etapas:

- 1. Aplicar a transformação de cartola com um elemento estrutural esférico para obter uma imagem nova que seja indicada como Rd.

- 2. Extração da característica. Nesta etapa somente os pixels dentro da cavidade são considerados, ou seja, somente os pixels produzidos pela reação de aglutinação. O conjunto de pixels dentro da cavidade é aqui indicado como Rdi.

a. Computar a média dos pixels em Rdi: Média = média (Rdi)

b. Computar o desvio padrão dos pixels em Rdi: Std = std(Rdi).

c. Computar outros descritores estatísticos e de textura: Desvio Absoluto Médio, Kurtosis e os momentos de Matrizes de co-ocorrência, etc.

d. Estimar a área dos aglutinados ao extrair os aglutinados utilizando um método de traçar limites e estimar a área dos aglutinados(Area = soma (A) ) .

PROCEDIMENTO 2 : OBTENÇÃO DA FUNÇÃO DE QUANTIFICAÇÃO F

Aqui, o foco está na característica da média e uma tabela de quantificação que utiliza a média para obter uma medida automática da concentração da amostra é computada.

1. Para cada ensaio padrão (imagem):

a. Processar todas as diluições padrão com o Procedimento 1 para obter as características de aglutinação de cada diluição.

b. Fazer uma tabela com as entradas: Diluição, Média, Concentração (Ul/ml).

2. Aplicar os menores quadrados para ajustar uma função linear em pedaços à tabela previamente obtida. 0 ajuste é aplicado na região acima da resposta negativa e abaixo da saturação.

3. Obter limites seguros para indicar um começo e um final de uma zona de quantificação e ponderações confiáveis.

PROCEDIMENTO 3 : 0 PROCESSO DE QUANTIFICAÇÃO (UTILIZANDO A MÉDIA

Para a quantificação, todas as diluições da amostra são processadas. Para cada diluição, a média que caracteriza a aglutinação é medida. Suponha que as diluições 1, 2, 4, 8, 16, etc., foram feitas e a média: ml, m2, m4, ..., ml6, ... etc., foram obtidas. Considere também uma função de quantificação F que mapeie os valores de média de acordo com sua respectiva concentração (vide o Procedimento 2).

1. Se mi > Th+ a diluição é declarada como positiva. Th+ é obtido junto com a função F e define os valores da característica que correspondem às aglutinações positivas.

2. Considere mj como a última diluição positiva.

3. Se mj cair dentro da região da quantificação, a concentração Q pode ser estimada como:

a. Q = F (mj) * j.

Para validar a medida, a área dos aglutinados pode ser utilizada. As reações negativas possuem aglutinados pequenos. Uma vez que um controle negativo é utilizado, as amostras podem ser avaliadas considerando as diferenças da área. As diferenças grandes indicam um resultado positivo. Isto deve ser feito, uma vez que as características tendera a saturar em altas concentrações.

Para fazer uma estimativa mais robusta, a média de todas as diluições que caem dentro da zona de quantificação é computada. Elas podem ser determinadas a partir da última diluição positiva e utilizando limites seguros apropriados obtidos junto com a função F.

CALIBRAÇÃO DO SISTEMA

Nestes exemplos, o volume A previamente determinado corresponde, mas não é limitado, a 60 μl, e o volume B previamente determinado corresponde, mas sem ficar a ele limitado, 3 0 μl.

Primeiramente, os resultados para a análise de um conjunto de amostras padrão com títulos conhecidos (IU/ml) são mostrados. As imagens digitais correspondentes são obtidas utilizando o método proposto. A imagem digital obtida é processada com o procedimento 2 para obter a função de quantificação F. Os detalhes de cada procedimento são indicados na Tabela 1, contida na Figura 5.

Na Figura 1, uma das imagens escaneadas é mostrada e os resultados de cada diluição são mostrados na Tabela 2, contida na Figura 6.

Em cada caso: o número da imagem (I, II, III... vii) , o IU/ml conhecido (4, 6, 8... 24) são mostrados e é obtido o valor médio de acordo com o Procedimento 1.

A Figura 3 contém os resultados para todas as imagens com as amostras da Tabela 1 e a curva de calibração F, obtidos após o ajuste de um par de linhas para as faixas [6.10] e [10.24] ao utilizar o Procedimento 2.

Os Exemplos 1-3, cujas tabelas estão contidas nas Figuras 7-9, incluem os resultados das análises das amostras com IU/ml desconhecido que são comparados com a técnica tradicional, manual, para referência. Com a técnica manual tradicional, não há nenhuma maneira de encontrar a concentração real, porque o procedimento normal considera como concentração do analito o valor da última diluição com aglutinação positiva. Na verdade o valor real estará compreendido entre a última diluição positiva e última diluição dobrada, portanto é impossível obter um valor real pela aplicação da técnica tradicional. 0 método proposto pode produzir resultados mais precisos e exatos.

Cada uma das tabelas que correspondem aos exemplos 1-3 contém a seguinte informação com respeito a cada cavidade: a diluição, IU/ml obtido pelo método da placa por aglutinação (referência: técnica tradicional), a característica da média computada de acordo com o Procedimento 1 (Média), IU/ml para cada diluição, IU/ml estimado utilizando cada diluição (multiplicando pela diluição) e IU/ml estimado utilizando todos os resultados válidos na terceira coluna utilizando o Procedimento 3. Os resultados não são mostrados para o valor obtido que caiu fora das zonas lineares especificadas. A quantização foi feita utilizando a característica média junto com a função linear em pedaços da Figura 3.

Para cada exemplo, o IU/ml estimado obtido por este método é maior ou igual ao suposto valor conhecido da amostra.

Exemplo 2. 0 exemplo 2 foi executado ao realizar uma reação de hemoaglutinação.

Neste exemplo é mostrada a aplicação do método proposto para a semiquantificação das reações de hemoaglutinação para o tipo sangüíneo.

A técnica tradicional de hemoaglutinação é basicamente quantitativa. No entanto, também é útil para que o hematologista tenha uma medida da classificação da aglutinação. As reações de aglutinação são classificadas em cinco classes: negativa, e quatro contagens positivas (1 a 4 cruzes), dependendo da força de aglutinação.

REQUISITOS DA AMOSTRA PARA 0 TESTE DE HEMOAGLUTINAÇÃO:

O sangue coletado com ou sem anticoagulante pode ser utilizado. Os testes são realizados preferivelmente o mais rápido possível após a coleta. As amostras são armazenadas de preferência a 2-8ñC para considerar possíveis atrasos na realização dos testes. 0 sangue obtido por picada no dedo pode ser testado diretamente pelo método de slide, mas para evitar a coagulação, o sangue coletado dessa maneira deve ser misturado com o reagente rapidamente.

A temperatura para realizar a reação de agrupamento do sangue é de preferência 25°C ±5°C, e os testes não devem ser realizados de preferência a 37°C. A reação pode ser executada sobre slides de poliestireno transparentes, com as áreas da reação delimitadas de preferência por bordas do mesmo material, definindo um círculo.

Materiais:

- Agitador orbital (velocidade entre 80 a 90 rpm).

- Termômetro - Cronômetro

- Slides de poliestireno transparentes

REAGENTES:

1. Soros aglutinantes monoclonais para determinação do grupo sangüíneo humano

2. Solução salina normal

PROCEDIMENTO:

1. Preparar a suspensão a aproximadamente 5-10% de RBCs (hemácias) em solução salina normal.

2. Adicionar uma gota dos reagentes correspondentes

3 0 (AntiB, AntiA, AntiAB, A para agrupamento reverso, B para agrupamento reverso, e AntiD) para cada cavidade respectiva.

3. Adicionar uma gota da suspensão de célula acima (AntiB, AntiA, AntiAB e AntiD) ou o soro (A para agrupamento reverso e B para agrupamento reverso).

4. Com bastões aplicadores separados, misturar bem cada mistura reagente de célula.

5. Girar o slide a 80 rpm por dois minutos.

6. Obter a imagem digital com o software associado contra um fundo branco previamente determinados. Uma vez que uma imagem digital é obtida, o processo de extração descrito nos exemplos acima é aplicado. As reações são classificadas como positivas ou negativas com base no número e na área dos aglutinados. As reações positivas podem subseqüentemente ser classificadas em quatro subclasses, dependendo da força de aglutinação, que por sua vez depende do número e da área dos aglutinados. Geralmente os técnicos definem quatro classes, identificadas com cruzes, com uma cruz para a aglutinação mais fraca e quatro cruzes para as aglutinações mais fortes. Em alguns casos um sinal de mais/menos pode ser utilizado para identificar a linha de borda das aglutinações. Com a mesma metodologia aqui descrita a classificação pode ser executada para identificar outro número de classes. O processo de quantificação é baseado na cor média do aglutinados (outras características podem ser utilizadas sozinhas ou combinadas para melhorar os resultados da classificação) . Por conseguinte, um resultado de semiquantificação para a reação de hemoaglutinação pode ser obtido.

UMA REALIZAÇÃO EXEMPLIFICADORA DO PROCESSO UTILIZADA PARA OBTER A TABELA DE SEMIQUANTIFICAÇÃO F.

Em uma realização exemplificadora, o foco é colocado na média da característica dos aglutinados e a computação de uma tabela de quantificação que é utilizada para obter uma medida automática da classificação da aglutinação de amostra. A tabela de quantificação a seguir é obtida ao utilizar o conjunto de amostras quantificadas por um elemento versado na técnica de produção.

1. Para cada imagem na amostra de ensaio:

Todas as reações são processadas com o método de extração apresentado para determinar as características da aglutinação.

Uma tabela que contém entradas para as seguintes propriedades é criada: Classificação de Aglutinação Fornecida, Característica.

2. Técnicas de reconhecimento padrão são aplicadas para encontrar os limites que dividem cada classe de aglutinação com erro de probabilidade mínimo. Nesta etapa é obtido o limite Th+, que distingue reações positivas e negativas.

PROCESSO DE SEMIQUANTIFICAÇÃO EXEMPLIFICADOR

Para cada reação, a característica que caracteriza a aglutinação é obtida.

1. Se mi>Th+ a diluição é considerada positiva ou então a reação é considerada negativa. Th+ é obtido junto com a tabela F e define os valores da característica que correspondem às aglutinações positivas.

2. Para cada reação positiva, a tabela de quantificação, a Tabela F, é utilizada para obter uma classificação da aglutinação: AS = F(mj).

Na Figura 4, uma imagem digital das reações de aglutinação é mostrada, no contexto de quatro testes de tipo sangüíneo. Cada coluna de cavidades contém uma amostra diferente. Cada fileira contém um reagente diferente: linha 1 - anti-B, linha 2 - anti-A, linha 3 - anti-AB, linha 4 - alfa, linha 5 - beta, linha 6 - anti-D. Como pode ser visto, o padrão de aglutinação tem grandes variações.

A Tabela 6, contida na Figura 10, apresenta os resultados obtidos junto com a quantificação dada por um elemento versado na técnica de produção. As células mostradas nos colchetes correspondem aos erros de classificação. Esses erros correspondem à classificação. 0 grupo sangüíneo obtido pelo sistema presentemente descrito não reflete nenhum erro.

O método descrito foi testado contra 500 reações e contém falsos negativos de apenas 1%. Os falsos negativos eram todos reações alfa ou beta e, portanto, é razoável concluir que os ditos falsos negativos não afetaram o resultado da tipificação. Por conseguinte, 0% de erro na tipificação de grupo foi obtido. Para verificação, na Tabela 7, contida na Figura 11, uma matriz de confusão para a classificação da contagem é mostrada.

Conforme pode ser observado, a maioria das amostras está classificada na classe correta. A maioria das amostras que não está classificada na classe correta desloca-se para as classes vizinhas, tal como esperado.

Outras modificações e variações na invenção serão aparentes aos elementos versados na técnica a partir das exposições e preceitos anteriores. Desse modo, embora somente determinadas realizações da invenção tenham sido especificamente descritas aqui, ficará evidente que várias modificações podem ser feitas na mesma sem que se desvie do caráter e do âmbito da invenção.

Claims (15)

1. MÉTODO PARA A AQUISIÇÃO DE UMA IMAGEM DIGITAL DE UM RESULTADO DE AGLUTINAÇÃO, caracterizado pelo fato de compreender: a) a execução de um ensaio de aglutinação em um substrato de reação que tem um conjunto de dimensões e características que permitem um padrão de aglutinação em um resultado do dito ensaio; e b) a revelação de uma imagem do dito resultado, em que a imagem tem um fundo colorido que maximiza uma relação entre sinal e ruído, e em que a imagem foi passada através de um filtro que complementa uma ação do fundo colorido e realça os aglutinados na imagem enquanto aumenta adicionalmente a relação entre sinal e ruído.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o padrão está relacionado a uma concentração de interesse na amostra.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a imagem é adquirida ao utilizar um scanner de leito liso.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a imagem é adquirida ao utilizar uma câmera.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a imagem é adquirida ao utilizar uma disposição de fotodetectores.

6. MÉTODO PARA A ANÁLISE DE UM ENSAIO DE AGLUTINAÇÃO, caracterizado pelo fato de compreender: a) a execução de um ensaio de aglutinação ao misturar um volume de uma diluição da amostra com um volume correspondente de pelo menos um elemento reativo e observando de uma formação de aglutinados; b) a preparação de um controle negativo ao misturar um segundo volume de diluição da amostra igual ao volume da diluição da amostra da etapa (a) com um segundo volume correspondente do elemento reativo da etapa (a); c) a obtenção de uma imagem digital das diluições da amostra processadas nas etapas (a) e (b) ; e d) o processamento da dita imagem digital contra uma curva de calibração para gerar um valor de resultado quantitativo representativo de um grau de aglutinação da amostra e do elemento reativo.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente e) o processamento da imagem ao identificar e quantificar automaticamente as amostras presentes na imagem digital do ensaio.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente: f) a extração de um conjunto de características; g) a obtenção de uma função de quantificação que mapeia as características medidas para a concentração real da amostra; e h) a extração de um resultado quantitativo para cada amostra no ensaio.

9. MÉTODO PARA A EXTRAÇÃO DE UM CONJUNTO DE CARACTERÍSTICAS, que caracterizam um conjunto de resultados de aglutinação, em que o método é caracterizado pelo fato de compreender: a) a aplicação de um filtro digital ou óptico para extrair um componente da imagem ou a parte de um espectro onde uma relação entre sinal e ruído entre os aglutinados e o fundo é maximizada; b) a aplicação de uma transformação de cartola com um elemento estrutural esférico para obter uma imagem nova indicada como Rd e para atribuir o conjunto de pixels dentro de cada cavidade a uma matriz indicada como Rdi; c) a extração dos pixels dentro de uma cavidade produzidos pela reação de aglutinação; d) a computação de uma média dos pixels em Rdi; e) a computação de um desvio padrão dos pixels em Rdi; f) a computação de pelo menos um outro descritor estatístico e de textura; e g) a determinação de uma área estimada dos aglutinados.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o descritor estatístico e textual é pelo menos um dentre a Média, o Desvio Absoluto, Kurtosis e os momentos de Matrizes de co-ocorrência.

11. MÉTODO PARA A OBTENÇÃO DE UMA FUNÇÃO DE QUANTIFICAÇÃO F PARA UMA DILUIÇÃO, que mapeia um conjunto de características medidas para uma concentração real da amostra, em que o método é caracterizado pelo fato de compreender: a) a elaboração de uma tabela com as entradas: Diluição, Média e Concentração (Ul/ml); b) a aplicação de uma análise dos menores quadrados a uma região acima de um ponto de resposta negativa e abaixo de um ponto de saturação para ajustar uma função paramétrica para a tabela; c) a obtenção de limites seguros para indicar um começo e um final de uma zona de quantificação e pesos de confiança; e d) a obtenção de um valor de Th+, o qual define um conjunto de valores de uma característica que corresponda a aglutinações positivas.

12 . MÉTODO PARA A EXTRAÇÃO DE UM RESULTADO QUANTITATIVO PARA CADA DILUIÇÃO DE UMA AMOSTRA, baseada em suas características de aglutinação, uma função de quantificação e um conjunto de diluições, em que o método é caracterizado pelo fato de compreender: a) para cada característica de aglutinação (fi), a comparação de fi com um valor de Th+ obtido que define os valores de uma característica que corresponde a aglutinações positivas; b) se f1 > Th+, a declaração de uma diluição como positiva; c) para uma última diluição positiva (fj), se fj cair dentro de uma região de quantificação, a estimativa de sua concentração Q como: Q = F(fj)*j; d) a validação dos valores de Th+, fj e Q se uma medida da área estiver acima de um limite de um controle negativo e abaixo da saturação; e e) a obtenção de um resultado final ao determinar uma média ponderada dos valores validados.

13. MÉTODO PARA A AVALIAÇÃO DE UM ENSAIO DE AGLUTINAÇÃO, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) obtenção de uma tabela semi-quantificação F ao utilizar um conjunto de amostras de pacientes etiquetadas; b) aplicação de um conjunto de técnicas de reconhecimento de padrão para determinar um conjunto de limites que dividem cada aglutinação em uma classe de aglutinação com um erro de probabilidade mínimo; c) obtenção de um limite Th+ que divida as reações de aglutinação positivas e negativas; e d) para cada amostra de paciente, aplicação de um processo de semi-quantificação para uma avaliação da aglutinação.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a obtenção de uma tabela de treinamento de semi-quantificação F ao utilizar um processo que compreende: h) para cada imagem em uma amostra de treinamento, o processamento de todas as reações com o método de extração de característica para obter um conjunto de características de aglutinação; e i) a elaboração de uma tabela com entradas para Classificação e Característica da Aglutinação Obtida.

15. OBTENÇÃO DE UM RESULTADO SEMI-QUANTITATIVO para avaliar um ensaio de aglutinação de acordo com o método conforme definido na reivindicação 13, caracterizada pelo fato de compreender: e) a medição de uma característica que caracteriza a aglutinação; f) a obtenção de um limite (Th+); e g) para cada reação positiva, a utilização da tabela de semi-quantificação F para obter uma classificação de aglutinação.