BRPI0621872A2 - métodos para preparar um fármaco em suspensão e em cápsulas para uso pediátrico e para adulto a base de curcumina, formulação e fármacos em suspensão e em cápsulas para o tratamento de uma infecção parasitária causada por giárdia lamblia e métodos para tratar um infecção parasitária provocada por giárdia lamblia - Google Patents

Abstract

MéTODOS PARA PREPARAR UM FáRMACO EM SUSPENSãO E EM CáPSULAS PARA USO PEDIáTRICO E PARA ADULTO A BASE DE CURCUMINA, FORMULAçãO E FáRMACOS EM SUSPENSãO E EM CáPSULAS PARA O TRATAMENTO DE UMA INFECçãO PARASITáRIA CAUSADA POR GIáRDIA LAMBLIA E MéTODOS PARA TRATAR UMA INFECçãO PARASITáRIA PROVOCADA POR GIáRDIA LAMBLIA. A invenção refere-se a uma composição farmacêutica baseada em curcumina para o tratamento de uma infecção parasitária, especificamente infecção parasitária causada por giárdia lamblia, cujos efeitos citotóxicos. No parasita inibem o crescimento e capacidade de adesão do mesmo e induz alterações morfológicas e efeitos similares ao da apoptose no dito parasita. A nova composição formulada, a qual é baseada em um derivado de planta, é uma alternativa viável e altamente eficaz para o tratamento de giardioses, caracterizada pelo fato de que, ao contrário de outras drogas usadas para tratar dita enfermidade, não produz efeitos colaterais que forcem o paciente a suspender o tratamento.

Description

MÉTODOS PARA PREPARAR UM FÁRMA.CO EM SUSPENSÃO E EM CÁPSULAS PARA USO PEDIÁTRICO E PARA ADULTO A BASE DE CURCUMINA, FOR- MULAÇÃO E FÁRMACOS EM SUSPENSÃO E EM CÁPSULAS PARA O TRATA- MENTO DE UMA INFECÇÃO PARASITÁRIA CAUSADA POR GIÁRDIA LAM- BLIA E MÉTODOS PARA TRATAR UMA INFECÇÃO PARASITÁRIA PROVO- CADA POR GIÁRDIA LAMBLIA

.1.Campo da invenção

A invenção refere-se a uma nova proposta terapêu- tica para o tratamento de infecções intestinais e, mais es- pecificamente, refere-se a um novo fármaco derivado de cur- cumina cujo efeito citotóxico sobre a Giárdia lamblia o converte em uma alternativa viável, altamente eficaz para o tratamento da giardiose.

.2. Estado da -técnica relacionado

As enfermidades parasitárias intestinais continu- am sendo um problema de saúde pública a nivel mundial. Se- gundo Saviole e cols. (1992) e Chan e cols. (1998), quando a G.lamblia se hospeda no intestino delgado, também são en- contradas em alguns lugares pouco comuns para seu microha- bitat, como pode ser a nivel gástrico segundo descreve Do- glioni e cols. (1992). Anualmente mais de 1.000.000.000 de pessoas padecem de algum tipo de parasitose, (Upcroft e Up- croft 2001) , o que representa aproximadamente 20% da popu- lação mundial. De sua parte, a giardiose ocorre em aproxi- madamente em 55% dos casos divulgados de parasitas a nivel mundial, segundo relatórios dos Institutos Nacionais de Sa- úde dos Estados Unidos da América (2002).

A Giardia lamblia é um protozoário da família dos Phylum Sarcomastigophora, da classe Zoomastiphora, da ordem dos Diplomonadida, é um dos tormentos mais comuns encon- trados no trato digestivo humano e é altamente infeccio- so, e é uma das causas mais importantes a nivel mundial de infecções intestinais produzidas por organismos unicelula- res. Os fármacos comumente empregados para controlar e er- radicar esta infecção exibem freqüentemente efeitos co- laterais que fazem com que o paciente abandone o trata- mento e, além disso, surgiram cepas de G. 30 lamblia resis- tentes a estes fármacos. Por isso, é muito importante a procura de novas propostas terapêuticas alternativas para esta enfermidade parasitária.

As enfermidades em seres humanos e animais provocadas por parasitas de protozoários têm grande im- pacto na saúde pública. 0 Giardia lamblia é um dos parasi- tas mais comuns encontrados no trato intestinal humano que podem provocar uma infecção aguda ou crônica conhecida mun- dialmente como giardose. Os sintomas clínicos incluem: náu- seas, dores estomacais, diarréia, vômito, síndrome de má absorção, esteatorreia, perda de peso, dor de cabeça, baixo rendimento escoar e deficiências no desenvolvimento mental e físico que se acentua de maneira mais intensa na infân- cia .

Para o tratamento da giardose desenvolveram-se vá- rios fármacos que são capazes de exercer efeitos citotóxi- cos de diversos tipos sobre a parasita (Gardner e Hill, 2001) . No contexto da presente invenção, o termo "efeito citotóxico" refere-se às mudanças que uma substância exer- ce sobre organismos vivos que conduzem à destruição do mes- mo e os mecanismos de ação podem ser diretos ou indire- tos, podem provocar necrose ou apoptose e podem ser espe- cíficos ou inespecificos.

O grupo dos nitroimidazóis (Uperoft e Uperoft, 2001), benzimidazóis (Katiyar e cols., 1994), nitrofura- nos, quinacrina e recentemente nitazoxanida, este último de recente introdução no México, sendo um antiparasitário polivalente sobre o qual existem poucos estudos (Ponce- Macotea e cols., 2001, Ortiz e cols., 2001), em uma pu- blicação de Belkin-Valdovinos em 2004 constatou que não há diferenças estatísticas significativas entre três populações manipuladas, duas populações com duas doses di- ferentes de nitazoxanida e uma população com albendazol.

0 metronidazol (nitroimidazol) tem efeito sobre a estrutura geral do parasita, mas não sobre a inte- gridade do disco ventral já que pela aparência ul- tra estruturalmente este se mantém quase intacto. 0 metro- nidazol é capaz de induzir rupturas nas cadeias de ADN pelo que este efeito é a base para sua contra- indicação durante o primeiro trimestre da gestação, já que pela aparência este efeito não é específico para a eliminação de parasitas e poderia potencialmente exercer alterações teratogênicas (Sisson e cols., 2000, Oxber- ry e cols., 1994, Campanati e Monteiro- Leal, 2002). O efeito teratogênico foi documentado tanto em ratas como em ratos em altas doses e por longos períodos, enquanto que em seres humanos não foram documentados eventos te- ratogênicos atribuíveis ao metronidazol (Gardner e Hill 2001, Fahrig e Engelke 1997). O albendazol do grupo dos benzimidazóis detém o crescimento in vitro, provocando perda da estrutura e desorganização dos microtúbulos, uma vez que interfere com a polimerização unindo-se à subunidade β-tubulina (Harder e cols. 2001). Além disso, o albendazol provoca desencaixe das microcintas que contêm giardina. Também provoca desen- caixe completo do disco ventral, o que causa perda da ade- rência afetando a viabilidade do parasita (Samuelson, .1999). Comparativamente, o albendazol tem uma eficiência in vitro superior ao metronidazol, enquanto que in vivo a efi- ciência para os dois é de 95-97% (Cedillo-Rivera e Mufloz, .1992, Campanati e Monteiro-Leal 2002, Nash e Rice 1998, Chávez e cols. 1992).

A furazolidona afeta a capacidade de aderên- cia, mas não a viabilidade (Farthing 1996) e é capaz de bloquear o ciclo celular da giardia em fases S e G2-M. Constitui um dos anti-giardiósicos autorizados pea Federal Food and Drug Administration (FDA) nos Estados Unidos da América do Norte. A furazolidona atua inibindo a oxidase de NADH e NADPH afetando o transporte de elétrons na cadeia respiratória e este sistema na giardia encontra-se acoplado na membrana celular, sendo um alvo imediata para a furazo- lidona. Não obstante, este fármaco apresenta efeitos cola- terais tais como: náuseas, vômitos, colite, prurido anal, hemólise por deficiência de glicose 6 fosfato desidrogena- do, dor de cabeça, rações de hipersensibilidade, hipoten- são, erupção vesicular morbiliforme, artralgias, urticária (Diccionario de especialidades farmacêuticas de 2003) e inibição do monoamino oxidasa. Além disso, reporta- ram-se episódios sicóticos em pacientes portadores do ví- rus da imunodeficiência humana. Também, este fármaco está contra-indicado para os menores de 1 mês de idade, já que pode desenvolver anemia hemolítica por induzir instabili- dade da glutação. Adicionalmente, este fármaco é mutagênico em bactérias e foi demonstrado que provoca tumores mamários em ratas e tumores pulmonares em ratos quando lhes é administrado em doses altas e de forma crônica (Gardner e Hill 2001) .

A quinacrina foi inicialmente desenvolvida co- mo agente antimalárico e posteriormente, também, se do- cumentou que possuía efeitos anti-giardiósicos. A quinacri- na provoca a ativação por piruvato-ferrodoxin- oxidoreductase e como conseqüência a formação de radicais livres de nitrogenados. Também, ela interfere na síntese do ADN bloqueando o emparelhamento para a incorporação de adenina (Speelman 1985, Edlind 1989, Chopra e Roberts 1992, New Antimicrobial Agents Approved by the Food and Drug Ad- ministration in 2002 and New Indications Previously Ap- proved Agents 2003). Não obstante, este fármaco tem efei- tos colaterais indesejáveis, tais comop: vômitos, descolo- ração da pele e da esclerótica de um amarelo esverdeado, assim como da urina, cefaléia, tremores e pode induzir psi- cose, o que é pouco comum, assim como causa dermatite ex- foliativa. Ocasionalmente, induz retinopatias, em alguns indivíduos induz deficiência de glicose 6 fosfato desi- drogenada, pode provocar hemólise, e está contra-indicado na gravidez porque se encontra ligado ao aparecimento con- gênito de espinha bifida e agenesia renal, muito embora nunca tenha demonstrado efeitos cancerígenos por sua ação de união ao ADN (Gardner e Hill 2001).

A nitazoxanida é um derivado nitrotiazol benzamido (Theodos e cols., 1998), desenvolvido como antiparasitário, especialmente contra enfermidades diarréicas, e não demons- trou toxicidade em estudos pré-clinicos. Este fármaco é bem tolerado e tem um espectro assemelhado àquele do metronidazol (Mcvay e Rolfe 2000), ainda que colate- ralmente possa provocar diarréia, dor abdominal, flatulên- cia, náuseas, vômitos, dispepsia, xerostomía, coloração amarelo-esverdeada da urina e dor de cabeça (Guttner e cols., 2003) .

Infelizmente, os efeitos colaterais dos fárma- cos anteriormente referidos representam na maioria dos casos o principal motivo de que o paciente interrompa sua medicação e com isso não se obtenha o resultado desejado no tratamento da enfermidade parasitária. Estes inconveni- entes obrigaram a procura de um tratamento terapêutico alternativo baseado em um fármaco de origem natural que não tenha os mesmos efeitos colaterais indesejáveis no paciente para que este não abandone o seu tratamento.

Sumário da Invenção

0 objeto principal da presente invenção é o de propor uma nova alternativa terapêutica para o trata- mento da giardiose, derivada da avaliação da atividade an- ti-protozoária da curcumina, o principal constituinte da cúrcuma. Para esse efeito, expuseram-se cultivos de G. Iamblia axénica (cepa Pórtand 1) a diferentes concentrações de curcumina. Avaliaram-se seus efeitos na capacidade de crescimento e de aderência do parasito e a morfologia do mesmo. Também, se avaliou a capacidade da curcumina para induzir um efeito similar à apoptose.

De acordo com os resultados do estudo, todas as concentrações de curcumina inibiram o crescimento de trofozoitos e. a aderência em mais de 50% em função da dose e do tempo. Serão descritas as alterações morfológicas como protrusões ou protuberâncias formadas debaixo da membrana citoplásmica, deformação, devida à aglutina- ção celular e à tumefação ou inchação. A curcumina in- duziu efeito similar à apoptose em função da dose e do tem- po. Em conclusão, a curcumina exibiu um efeito citotóxico na G. Iamblia inibindo a capacidade aderente e crescimen- to do parasita, induziu alterações morfológicas e provo- cou alterações similares na apoptose.

Descrição Breve dos Desenhos A figura 1 é um gráfico que ilustra o efeito da curcumina sobre o crescimento de trofozoitos de Giar- dia lamblia in vitro. Cada ponto representa o S.D. ± médio de determinações em triplicado.

A figura 2 é um gráfico do efeito da curcumina sobre a viabilidade de trofozoitos da Giardia lamblia.

As figuras 3A a 3E são imagens eletrônicas repre- sentativas de alterações morfológicas em trofozoitos de Giardia lamblia expostos a diferentes concentrações de curcumina, onde a figura: 3A mostra os trofozoitos com morfolog ia normal depois de exposição a etanol utilizado como controle negativo; 3B mostra as células expostas a albendazol como controle positivo; 3C as células expos- tas à curcumina sob uma concentração de 0,3 μΜ; 3D célu- las expostas à curcumina sob uma concentração de 30 μΜ; e .3E células expostas à curcumina sob uma concentração de .100 μΜ. Observe-se a formação de vacuolas gigantes indi- cadas com flecha nas imagens das figuras 3C a 3E.

As figuras 4A a 4D são imagens eletrônicas da apoptose detectada mediante o método TÚNEL de tro- fozoitos de G. Iamblia que foram expostos à curcumina, onde as figuras mostram correspondência: (4A) ao controle negativo; (4B) à curcumina sob uma concentração de 0,3 μΜ durante 6 horas; e (4C) e (4D) sob a mesma concentra- ção de curcumina durante 24 horas. Observe-se na figura 4C a presença de estruturas residuais (núcleos e citoesquele- tos) de um trofozoito de G. Iamblia que foi explorado.

As figuras 5A a 5D são imagens eletrônicas repre- sentativas da detecção da translocação de fosfatidilse- rina como indicadora de um evento apoptótico induzido pela curcumina, onde as figuras mostram as seguintes ima- gens: (5A) trofozoitos de G. Iamblia expostos a etanol como grupo de controle negativo, em que as células são completamente viáveis; (5B) células expostas a 10 μΜ de metronidazol; (5C) células expostas a 0,3 μΜ de curcumina; e (5D) células expostas a curcumina em uma concentração de .100 μΜ durante 72 horas. Descrição Detalhada da Modalidade Preferida da Invenção

Como se mencionou anteriormente, existe uma grande variedade de tratamentos para a giardiose, aos quais na maioria dos casos o paciente não se apega pelos efeitos co- laterais que desencadeiam e além de que grande parte da po- pulação de áreas marginais não tem meios econômicos para iniciar o tratamento, o que faz com que os tratamentos fi- quem por terminar e se propague a giardiose. Por este mo- tivo, é muito importante explorar novas alternativas de tratamento mais inócuas e toleráveis para o paciente a fim de contra-restar o impacto da giardiose na saúde humana.

A cúrcuma (Carmina longa lynn) é uma planta perene, de folhas largas lanceoladas de cor verde claro, com uma altura aproximada de 50 centímetros e possui flores amarelas ou violáceas. 0 rizoma primário é oval e oblongo, enquanto que o secundário é curto e unido a um tubérculo grande de 2 a 5 cm de largura e 1 a 1,8 cm de grossura, é amarelo ou amarelo escuro. 0 rizoma da cúrcuma é desseca- do e pulverizado, sendo usado em todo o mundo como condi- mento. É o principal ingrediente do curry e da mostarda preparada, que lhe conferem a cor amarela.

A cúrcuma contém aproximadamente entre 4% e 10% de curcumina e sua fórmula química é C2iH2o06 que corresponde a um composto difenólico. A curcumina utilizada para as experiências do presente trabalho corresponde a um composto produzido pela Sigma Chemical Co. C1396 (EC No. .207-280-5), que é um extrato de curcuminóides onde 65% é curcumina. A curcumina é estável no estômago e no intestino delgado, pelo que sua elevada lipofilia lhe permite uma rá- pida absorção gastrintestinal por difusão ceva, depois de sua administração se metaboliza e se excreta principal- mente por bilis e fezes e, também, por urina. De acordo com o que foi publicado por Ramirez-Tortosa e cols., 2000, em estudos realizados em ratos constatou-se que 35% das do- ses orais entre 2,5 e 1000 mg/kg, são excretados pelas fe- zes, (Holder et al., 1978, Ravindranath e Chandrasekhara, 1982), absorvendo-se 65%, após a administração biotransfor- ma-se primeiro em diidrocurcumina e tetraidrocurcumi- na, e estes compostos são convertidos posteriormente a conjugados monoglicurônicos (Pan et al., 1999). Os princi- pais metabolitos da curcumina in vivo são os glicu- rónidos de curcumina, de diidrocurcumina e tetraidro- curcumina e são excretados por vias biliares entre 50 e 60% em torno de 5 horas (Heath et al., 2003).

A cúrcuma contém além disso derivados naturais da curcumina denominados curcuminóides que são identificados por métodos calorimétricos e de cromatografia de capa fi- na. Farmacologicamente, demonstrou-se que a curcumina pos- sui atividade antiinflamatória em modelos de animais. Esta atividade é exercida por um mecanismo que envolve a su- pressão da expressão do fator nuclear kapa Β, o qual se encontra anterior aos locais que codificam para a expres- são de citoquinas proinflamatórias (IL-I, IL-6 e TNF a) pelo que em conseqüência diminui a expressão destas cito- quinas (Miguel e cols 2002, Kaltscmidt e cols. 2002; Chan Marion e cols. 1998).

Existem numerosos artigos relativamente à grande variedade de atividades farmacológicas de curcumina, co- mo são a de antimicrobiano, protetor do sistema respira- tório, tanto alto como baixo, antiasmático, potente antiin- flamatório, atividade imunomoduladora, hipolipemiante e ant ioxidante (Mesa e cols., 2000). Recentemente, documentou-se para a mesma atividade antiparasitária (Arau- jo e León em 2001) . O efeito antiparasitário da curcumina foi descrita contra Leishmania major (Rasmunsen e cols. 2000; Koide e cols., 2001; Salen e cols., 2002)

A curcumina demostrou, também, a atividade antipa- rasitária contra L. mayor, L infantum e L. tropica com um melhor efeito in vitro em comparação com pentamidi- na, que é o fármaco de preferência contra este parasita (Salen e cols., 2002). Uma concentração de 15 μΜ de curcu- mina deteve o crescimento das cepas de Leishmania a 72 ho- ras in vitro. A curcumina neste parasita inibe a síntese de ADN e em conseqüência interrompe o ciclo celular, não obstante, o mecanismo pelo qual exerce este efeito é ainda desconhecido (Saleheen e cols., 2002).

A curcumina em concentração de 50 μΜ durante 24 ho- ras parou o crescimento e viabilidade de L. mayor in vitro em até 100%. A utilização de uma concentração de 100 μΜ de curcumina foi efetiva para diminuir em 100% a viabilidade de cultivos de Leishmania em concentrações de 0,25 χ 10"6 - 2,0 χ 10"6 células/ml. Aparentemente, a propriedade antioxi- dante da curcumina não está involucrada no mecanismo de a- ção leismanicida (Koide e cols., 2001).

Com relação à toxicidade da curcumina, esta não é considerada tóxica mesmo em doses altas (Soai e Kuffan, 1992). Em seres humanos testaram-se até 8 g/dia sem efeitos tóxicos (Cheng e cols., 2001), da mesma forma que de 5 a 10% da dieta em roedores (Sambaiah e cols., 1982), enquanto que outro inibidor de tumores, igual ou menos efetivo (ditiol-tiona), foi tóxico a 0,05% da dieta (Rao e cols., 1995). A maior parte (90%) da curcumina administrada por via oral é metabolizada no trato tanto em seres humanos quanto em ratos (Ireson e cols., 2002).

Diversos estudos in vivo em ratos indicam que a curcumina não é genotóxica (Vijayaaxmi e cols., 1980; War- govich e cols., 1985; Azuine e cols., 1992; Li e cols., 1998; Munia e Pizzorno, 1999; Shuka e cols., 2003). Em alguns casos, a curcumina reverte o dano de agentes genotóxicos conhecidos, comportando-se como anti- genotóxica com a prova de micronúcleos (Azuine e cols., 1992b; Abraham e cols., 1996; Li e cols., 1998), em Salmonela tiphimurium (Azuine e cols., 1992b) e em aná- lise de cromossomas se documentou como não castogênica (Mu- khopadhyay e cols., 1998; Murria e Pizzorno, 1999). Um estudo em ser humano (Hastak e cols., 1997) demostrou que as freqüências de micronúcleos não se modificam em pes- soas tratadas com curcumina.

Por outro lado, a curcumina protegeu indivíduos ex- postos a benzo[a]pireno diminuindo a freqüência de micronú- cleos em células de medula óssea e em leucócitos em paci- entes com fibrose submucosa. Em um estudo posteri- or, avaliou-se o potencial antigenotóxico da curcumina com a prova de mutação reversa de Salmonela typhimurium e com análise de cromossomas de células de medula óssea de ratos inibindo a deterioração por ciclofosfamida e ben- zo[a]pireno (Shulka e cols., 2003).

Como se mencionou anteriormente neste contexto, já existe uma grande variedade de fármacos destinados ao tra- tamento de enfermidades parasitárias, entre eles a giar- diose, não obstante, seus efeitos colaterais forçam na maioria dos casos a que o paciente desista de seu trata- mento. Igualmente, desenvolveu-se uma boa quantidade de estudos que comprovaram os benefícios da curcumina aplicada em tratamentos de enfermidades parasitárias provo- cadas por outros parasitas diferentes da Giardia lamblia, não obstante, até agora nenhum deles foi experimentado es- pecificamente no tratamento terapêutico da giardiose com os resultados favoráveis que serão descritos mais adiante.

Considerando-se o exposto, realizou-se a avaliação do efeito citotóxico da curcumina sob diferentes concentra- ções e em diferentes tempos de exposição sobre trofozoítos de G. lamblia. Para isso, desenvolveram-se os seguintes en- saios :

.1. Avaliação do efeito da curcumina sob diferen- tes concentrações sobre a curva de crescimento de G. lamblia, em diferentes tempos de exposi- ção .

2. Avaliação da viabilidade dos trofozoitos de G. Iamblia tratados com curcumina, sob diferen- tes concentrações e tempos de exposição.

3. Estudo do efeito da curcumina sobre a aderên- cia do parasito.

4. Análise das alterações sobre a morfologia dos trofozoitos de G. Iamblia expostos à curcumina.

5. Comparação do efeito de albendazol contra o efeito de curcumina sobre os trofozoitos de G. lamblia.

6. Avaliação da capacidade da curcumina na indu- ção de apoptose em trofozoitos de G. lamblia.

ENSAIOS:

Cultivaram-se trofozoitos de G. lamblia da ce- pa Pórtland 1 (Pl) em meio TYI-S-33 a 37°C complementa- do com 0,5 mg/ml de bilis bovina e 10% de soro bovino de- sativado (Gordts e cols., 1985; e Korman e cols., 1990). Para a manutenção da cepa realizaram-se subcultivos a cada terceiro dia.

Todas as experiências foram realizadas sob as se- guintes condições:

• Tubos de plástico de 13 χ 30 mm com 8,5 ml de meio TYI-S-33, recém preparado.

• 0 inóculo inicial foi de 5 χ IO4 parasitas/ml proveniente de um cultivo em fase exponencial de crescimento.

• Para a contagem de parasitas, colocaram-se os tubos em banho de água-gelo durante 30 minutos com o qual se desprendem os trofozoitos e sua contagem realizou-se utilizando-se a câmara de Neubauer.

• Todas as experiências foram realizadas em tri- plicata.

AVALIAÇÃO DO EFEITO DE CURCUMINA SOBRE A MULTIPLICAÇÃO DE TROFOZOITOS DE G. Iamblia

Curva de Crescimento.

Para se obter a curva de crescimento, inocularam-se os trofozoitos de G. Iamblia em meio TYI-S-33 e incubaram- se a 37°C e a cada 24 horas contou-se o número de parasi- tas. A multiplicação dos parasitas foi quantificada duran- te 6 dias para construir um gráfico do tempo contra o Io- garitmo do número de parasitas por mililitro. Curva de crescimento em presencia de curcumina.

As experiências para estudar o efeito da curcu- mina foram realizadas em triplicado, a curcumina dissol- vida em etanol foi adicionada para ajustar às concentrações de 0,3, 3, 30 e 100 μΜ (0,1, 1,1, 11,0 e 38,8 yg/ml, res- pectivamente) de meio utilizando-se um volume máximo de 226 μΐ da solução estoque de curcumina. Ao grupo de controle adicionou-se o etanol que serviu como veiculo em um volume de 226 μl, além disso se deixaram em cada experiência dois tubos de controle intactos.

Curva da multiplicação de trofozoitos de G. Iamblia

Inocularam-se inicialmente 150.000 trofozoitos de G. Iamblia por ml, realizaram-se leituras a cada 24 horas durante 170 horas, com o que se estruturou a curva de crescimento normal. Alcançou-se um pico máximo de 2'169.000 trofozoitos por ml nas 96 horas de incubação.

Para as experiências com curcumina o curso tempo- ral de crescimento alcançou um pico máximo de 1'200.000 parasitas por ml (p/ml) nas 72 horas. Portanto, os tempos ótimos para a análise do efeito da curcumina ficaram defi- nidos nas 24, 48 e 72 horas posteriores à inoculação do parasita e à administração de curcumina nos tubos de cultivo. O crescimento da G. Iamblia diminuiu em todas as concentrações de curcumina utilizadas e em to- dos os tempos de exposição, tal como se indica em seguida:

Nas 24 horas, a concentração de 0,3 provocou uma diminuição do crescimento de 164.000 p/ml contra 240.000 p/ml do controle (p< 0,03). A concentração de 3μΜ provo- cou mais diminuição no crescimento de 136.150 p/ml con- tra 240.000 p/ml do controle (p<0,01). A concentração de 30 μΜ causou uma diminuição mais evidente de 108.000 p/ml con- tra 240.000 p/ml do controle (p<0,005). Finalmente, a con- centração de 100 μΜ produziu a maior diminuição de cresci- mento de 102.500 p/ml contra 240.000 p/ml do controle (p<0,004).

Nas 48 horas, a concentração de 0,3 μΜ provocou uma diminuição de 420.000 p/ml contra 875.000 p/ml do controle (p<0,001). A concentração de 3 μΜ causou uma di- minuição forte no crescimento de Giardia de 145.250 p/ml contra 875.000 do controle (p<0,001). Na concentração de 30 μΜ a diminuição de crescimento foi ainda mais séria 125.500 p/ml contra 875.000 p/ml do controle (p<0,001). Finalmente, a concentração de 100 glVI não permitiu mais crescimento de Giardia, 41.000 p/ml contra 875.000 p/ml do controle (p<0,001).

Nas 72 horas, a concentração de 0,3 μΜ apresentou uma diminuição do crescimento de 565.000 p/ml contra 1*200.000 p/ml do controle (p<0,002). Com a concentração de 3 μΜ observou-se uma diminuição rigorosa do crescimento 61.750 p/ml contra 1'200.000 p/ml do controle (p<0,001). A concentração de 30 μΜ reduziu ainda mais o crescimento para 31.750 p/ml contra 1'200.000 p/ml do controle (p<0, 001) ; e finalmente a concentração de 100 μΜ abateu o crescimento de 30.500 p/ml contra 1'200.000 p/ml do con- trole (p<0,001).

0 resumo dos dados anteriores encontra-se exposto na seguinte Tabela 1

Crescimento de Giardia lamblia na presença de curcumina

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A representação gráfica destes mesmos resultados pode ser apreciada na figura 1, que inclui além disso a comparação dos mesmos com o efeito do fármaco albendazol a uma concentração de 0,3 μΜ, observándose que de maneira similar se inibiu o crescimento de Giardia em todos os tempos de exposição à concentração indicada. Curva de crescimento em presença de albendazol.

Adicionalmente, para avaliar o efeito de anti- giardiósicos convencionais, utilizou-se 0,3 μΜ (0,1 μg/nm) de albendazol. Para estas experiências, adicio- nou-se o fármaco desde o primeiro inóculo do parasita e avaliou-se o efeito nas 24, 48 e 72 horas de incubação. Quanto à percentagem de inibição, observou-se que as con- centrações de 30 e 100 μΜ no tiveram diferenças com rela- ção à concentração utilizada para albendazol às 48 e 72 horas, inibindo-se a multiplicação dos trofozoitos em mais de 80%. Estes dados estão representados na figura 1.

AVALIAÇÃO DE VIABILIDADE DOS TROFOZOITOS DE G. LABLIA NA PRESENÇA DE CURCUMINA.

Para se determinar a viabilidade, realizaram-se incubações de 150.000 trofozoitos de G. Iamblia durante 24, 48 e 72 horas de exposição com 0,3, 30 e 100 μΜ de curcumina. Ao final de cada tempo de exposição, coloca- ram-se os tubos sobre água-gelo durante 30 minutos. Pos- teriormente, centrifugaram-se a 3.000 rpm durante 10 mi- nutos, decantou-se o sobrenadante e agregou-se meio de cultivo fresco (sem curcumina) para incubar-se durante 48 horas adicionais, ao final do qual se realizou a conta- gem em câmara de Neubauer e com isso determinar o núme- ro de trofozoitos viáveis depois da sua exposição com curcumina. Com os dados expostos anteriormente deter- minou-se a percentagem de viabilidade tomando como 100% o controle com etanol. Curva de viabilidade.

Verificou-se que as concentrações de 30 e 100 μΜ de curcumina inibiram a multiplicação dos trofozoitos em forma irreversível, enquanto que sob concentração de 0,3 μΜ, a recontagem de parasitas decaía nos tempos estudados e manteve-se uma contagem baixa.

0 número de trofozoitos que permaneceram viáveis depois da incubação com curcumina durante 24, 48 e 72 horas, e sua posterior incubação com meio de cultivo fresco durante outras 48 horas, com o controle alcançou .1.657.500 trofozoitos nas 24 horas, 1.420.500 nas 48 horas e 945.250 nas 72 horas. Com a concentração de 0,3 μΜ de curcumina contabilizaram-se 704.250, 482.250 e 252.000 tro- fozoitos nas 24, 48 e 72 horas, respectivamente. E com a concentração de 30 μΜ de curcumina unicamente houve cres- cimento nas 24 horas com 3.750 trofozoitos, enquanto que nas 48 e 72 horas não se apresentou crescimento. Finalmen- te, perdeu —se a viabilidade dos trofozoitos com a concen- tração de 100 μΜ de curcumina em todos os tempos de incuba- ção. Estes dados encontram-se expostos na figura 2.

EFEITO DE CURCUMINA SOBRE A ADERÊNCIA DE TROFOZOITOS DE GIARDIA LAMBLIA

Para se reali zar esta experiência inocularam—se tu— bos com 150.000 trofozoitos e incubaram—se durante 24, 48 e .72 horas posteriores à exposição de curcumina com concen- trações de 0,3, 30 e 100 μΜ para cada um dos tempos. A cada 24 horas realizou-se a contagem do número de para- sitas antes de se colocarem os tubos em banho de gelo a 4°C. O resultado foi o povoamento de parasitas não ade- rentes ou livres no meio de cultivo. Posteriormente, colo- caram-se os mesmos tubos em banho de gelo a 40C durante 30 minutos para obter-se o povoamento total de trofozoitos (tanto parasitas livres como aderentes) . A diferença entre a população total e a livre nos proporcionou o número de parasitas que se encontraram aderentes em cada um dos tem- pos de incubação e concentração de curcumina.

Curva de aderência.

Constatou-se que com a concentração de 0,3 μΜ de curcumina em todos os tempos se observou-se um aumento na aderência dos trofozoitos comparado com o controle. A perda da aderência foi muito importante com as concentrações de 30 e 100 μΜ como se pode observar na Tabela 2. Sendo este um efeito dose/resposta, já que sob maiores concentrações de curcumina apresentou-se maior perda de aderência. Nas concentrações de 30 e 100 μΜ foi mais evidente a falta de mobilidade dos parasitas, aumen- tando o tamanho dos mesmos.

Tabela 2

Percentagem de Aderência

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ANALISE DAS ALTERAÇÕES SOBRE A MORFOLOGIA DOS TROFOZOITOS DE G. LAMBLIA EXPOSTOS À CURCUMINA. Para a avaliação microscópica dos parasitas, colo- caram-se todos os tubos em banho de gelo 40C durante 30 minutos; com isto os trofozoitos desprenderam-se ao a- gitar-se suavemente os tubos em 5 ocasiones; misturou-se uma alíquota de 20 μΐ com um volume igual de azul de tripano (4 mg/ml) e observou-se em um microscópio in- vertido Olympus 1X50, com a objetiva de 45 X. Digita- lizaram-se as imagens com uma vídeo câmara Hitachi modelo KP-D50 cor digital, utilizando-se para sua aná- Iise posterior o programa de análise de imagens Image-Pro de Media Cybernetics. Para cada uma das mostras estimaram- se as alterações na morfologia do trofozoíto. Para a a- quisição de imagens misturaram-se 500 μΐ do cultivo com 500 μΐ de formaldeído com uma concentração final de 3%. Observou-se desde as 24 horas, e nas diferentes concentrações, que a curcumina provocou alterações na morfologia do parasita, especificamente formaram-se ir- regularidades em sua superfície, com presença de avulta- mentos (vesículas distendidas). A partir das 48 horas de- finiu-se o efeito como uma inchação e arredondamento do trofozoito, sendo a perda da mobilidade mais séria nas concentrações mais altas de curcumina. Na concentração de .100 μΜ observaram-se fortes avultamentos de algumas regi- ões do parasita, com um aparente crescimento de uma vesí- cuia prévia abarcando toda a superfície do parasita. O controle positivo com albendazol mostrou alterações com perda total da forma do parasita, porém sem a presen- ça de vesículas. O controle de veículo exposto a etanol não mostrou alterações morfológicas durante os diferentes tempos de incubação (figuras 3A a 3E).

APOPTOSE EM TROFOZOÍTOS DE G. LAMBLIA EXPOSTOS A CURCUMINA.

Para a detecção de apoptose utilizou-se a prova de fragmentação de ADN, TdT-FragEL (Fragment End Abeling de Oncogene Research Products) para a marcação da fragmenta- ção de ADN em núcleos apoptóticos nos trofozoitos de Giar- dia. Esta técnica consta das seguintes etapas: marcação dos fragmentos de ADN, terminação e detecção do ADN.

Recoletam-se os trofozoitos dos tubos por centri- fugação a 3000 rpm e colocam-se sobre um portaobjetos tra- tado com polilisina e deixam-se secar ao ar, fixam-se com paraformaldeido a 14% em PBS durante 30 minutos e lavam-se com PBS para eliminar o excesso de fixador. Imediatamente incubam-se os trofozoitos durante 10 a 30 minutos com o tampão de equilíbrio sob temperatura ambiente. Em se- guida, preparou-se a mistura de reação de marcação TdT ( mistura de deoxinucleotídeos marcados e não marcados em uma proporção ótima para marcação de fragmentos de ADN com TdT), e 57 μΜ da mistura de reação de marcação TdT e 3 μΐ da enzima TdT (transferase deoxinucleotidil terminal) incubados a 370C durante uma hora e meia. Adicionam-se 100 μΐ de tampão (EDTA 0,5M, pH 8) durante 5 minutos e realizou-se uma lavagem com TBS . Posteriormente, adicionaram-se 100 μΜ de tampão de bloqueio que contém 2 μΐ do conjugado 50X com 98 μΐ de tampão de bloqueio (BSA a4% em PBS). Logo em seguida agregaram-se 100 μΐ de conju- gado diluído Ix e incubou-se durante 30 minutos.

Posteriormente lavaram-se as células com TBS IX e agregou-se a solução de revelação com diaminobenzidina (DAB) e sustou-se a reação com água destilada.

Os núcleos de trofozoítos apoptóticos foram marca- dos com nucleotídeos biotinilados que reagiram com o con- jugado de estreptavidina/peroxidase que logo reagiu com o H2 02 na presença de DAB como cromógeno, desenvolvendo co- loração de castanho café. Finalmente executaram-se regis- tros fotográficos utilizando-se um microscópio invertido (Olympus 1X70) equipado com câmara digital de alta resolu- ção e utilizou-se o programa de análise de imagens Image- Pro plus (Media Cybernetics).

Detectaram-se alterações sugestivas de apoptose com um padrão dose/resposta, nas concentrações maiores observou-se mais de 90% dos núcleos dos trofozoítos com marca sugestiva de apoptose com o método de detecção de fragmentação de ADN (TUNNEL) .

A concentração de 3 μΜ de curcumina provocou nas 6 horas pós-exposição o aparecimento de aproximadamente 30% de parasitas com núcleos apoptóticos. Esta mesma concen- tração nas 24 horas demostrou que cerca de 100% dos proto- zoitos tiveram núcleos apoptóticos. Em algumas preparações observaram-se trofozoítos que aparentemente explodido, já que só havia núcleos com restos do citoesqueleto aparente- mente sem restos de membranas por microscopia óptica (fi- guras 4A a 4D) .

Detecção de fosfatidilserina pelo método de Annexina V-Cy3) As alterações celulares envolvidas no processo de apoptose incluem a perda da assimetria de lipidios durante as etapas antecipadas de apoptose. Nas células vivas, a fosfatidilserina é transportada para a capa inter- na da membrana celular pela enzima trasnlocasa aminofos- folipideo dependente de Mg-ATP. Durante a apoptose, a fosfatidilserina é transportada à capa externa de membrana citoplásmica e fica disponível para que a anexina (pro- teína que se une à fosfatidilserina na presença de Ca) se una e fique marcada com um fluoro cromo (Cy3.18) que fluoresce em vermelho.

O presente estudo foi realizado com o fim de con- firmar a indução de apoptose além de detectar a possível necrose neuronal produzida pela exposição de Giardia à curcumina, para o que se realizou o estudo utilizando- se a prova de detecção de apoptose Annexin V-CY3 (Sigma- Aldrich). Previamente, diluiu-se o tampão de união em á- gua desionizada. Diluiram-se 2,32 mg de diacetato de 6- carboxifluoresceína (6-CFDA) em 0,1 ml de acetona. A so- lução de dupla marcação foi preparada com 1 pg/ml de anexi- na V Cy3.18 (AnnCy3) e 6-CFDA 500 μΜ diluído em tampão de união.

As células em cada cavidade foram lavadas com o tampão de união três vezes. Adicionou-se so- lução de dupla marcação (AnnCy3+6-CFDA) sobre as célu- las e incubaram-se durante 10 minutos no escuro. Depois realizaram-se 5 lavagens com o tampão de união para reti- rar o excesso de corante. A AnnCy3 é identificada pela cor vermelha e a 6CFDA é identificada pela cor verde. Se- rão observadas as marcações imunofluorescentes em células viáveis (marcadas com β-CFDA, verde), apoptóticas antecipa- das (marcadas com AnnCy3 e β-CFDA, verde e vermelho) e ne- cróticas (marcadas com AnnCy3, vermelho).

Finalmente, realizaram-se registros fotográfi- cos utilizando-se um microscópio invertido (Olympus 1X7 0) equipado com sistema de fluorescência e com câmara digital de alta resolução. Para a captura utilizou-se o programa de análise de imagens Image-Proplus (Media Cyber- netics).

Os corpos celulares de giardias expostas ao veicu- lo (etanol) foram observados sem alterações, já que fluo- rescem em cor verde maçã típico das células viáveis. As gi- ardias expostas a metronidazol apresentaram-se em franca necrose que fluoresce na cor vermelha com restos do ci- toplasma dispersos em torno das células. Enquanto que a concentração de 0,3 μΜ em 72 horas pós-exposição induziu alterações tipo apoptose como células que fluorescem tanto em vermelho-laranj a e verde simultaneamente. Quando se observaram as giardias sob a concentração de 100 μΜ nas 72 horas, mostraram uma coloração mais avermelhada. Nos dois casos, é notória a perda da morfologia normal (fi- guras 5A a 5D) .

Análise Estatística

Utilizaram-se as provas de T de students para i- dentificar diferenças estatísticas significativas entre grupos experimentais e como prova pós-hoc aplicou-se a prova de 20 Kruskal-Wallis.

CONCLUSÕES.

Em estudos realizados in vitro a curcumina mostrou atividade antiparasitária contra Leishmania spp, Tripanosoma brucei e Pasmodium falciparum. Na presen- te invenção, analizou-se a atividade citotóxica da curcu- mina in vitro contra trafozoitos de G. Iamblia com exce- lentes resultados.

No que se refere ao crescimento dos trofozoitos constatou-se que a curcumina provocou uma diminuição es- tadisticamente significativa desde a concentração de 0,3 às 24 horas pós-exposição. A dita diferença foi incremen- tada evidentemente nas concentrações mais altas (3, 30 e 100 μΜ), concordando isto com os tempos e concentra- is ções reportados para o efeito in vitro da curcumina con- tra Leishmania spp. (Koide e cols.2002 e Salen e cols 2002). Pelo que, esta nova alternativa terapêutica po- derá ser mais aceita e melhor tolerada pelos pacientes in- fectados que abandonaram o tratamento com albendazol ou outros antiparasitários por seus efeitos colaterais.

Além disso, a percentagem de inibição do cresci- mento que se encontrou em outros parasitas (por exemplo, Leishmanias e tripanosomas) tratados com curcumina foi comparável com aqueles encontrados para o caso do G. lamblia, já que se encontrou uma inibição que alcançou desde 80% até 100% na concentração de 100 μΜ, pelo que a atividade in vitro é similar nestes protozoários.

Para G. lamblia é vital a aderência dos trofozoi- tos ao epitélio intestinal, se carecessem desta capacidade seriam arrastados pelo peristaltismo e o trânsito do con- teúdo intestinal, portanto é um aspecto importante a capa- cidade do parasita para estabelecer a infecção. Devido a isto, avaliou-se o efeito da curcumina sobre este evento constatando-se que o efeito da curcumina provocou uma per- da da aderência dos trofozoitos in vitro que é maior do que 95% com as concentrações de 30 e 100 μΜ.

A medição da viabilidade dos parasitas a um com- posto citotóxico proporciona informação, sobre a re- versibilidade do efeito citotóxico de dito compos- to, já que uma vez expostos por períodos diferen- tes em ensaios independentes, todos são incubados com meio fresco por 48 horas mais. No presente caso, o efeito da curcumina sobre a viabilidade do parasita foi clara- mente evidente nos parasitas expostos à concentração de .30 μΜ a partir das 48 horas, quando o efeito foi irre- versível por não se recuperarem s trofozoitos. 0 efei- to da curcumina sobre a viabilidade do parasita foi ain- da mais drástico ao analisar-se o efeito da concentração de 100 μΜ, já que desde as 24 horas de exposição os para- sitas não conseguiram recuperar a sua viabilidade. Este efeito é comparável ao de outros compostos anti- giardiósicos, como o albendazol e o metronidazol, que pro- .25 vocam uma perda da viabilidade em concentrações similares, só que estes fármacos apresentam problemas de tolerância do paciente ao tratamento.

As alterações morfológicas mostradas na estrutura da G. Iamblia exposta à curcumina foram muito drásticas dentro das primeiras 24 horas com as concentrações de 30 e .100 μΜ. Os trofozoitos apresentam deformações na membrana com avultamentos tão proeminentes que provocaram o arre- dondamento e posteriormente a destruição do parasita, encontrando formas esféricas e restos celulares nas 48 e 72 horas posteriores à exposição da curcumina.

Os resultados anteriores fazem pensar que existe uma intermitência primária para estes compostos que altera a capacidade da membrana celular para regular a osmolari- dade do trofozoito. Se isto é certo, então o mecanismo poderia ser analisado estudando-se as correntes iônicas na membrana da giardia.

0 efeito citotóxico dos compostos com atividade antigiardósica pode ser definido entre os que causam apop- tose e os que causam necrose.

Para abordar este aspecto do dano citotóxico utilizam-se dois métodos: o de detecção de fragmenta- ção de DNA (TUNNEL), que se fundamenta na adição enzimá- tica de nucleotideos marcados com biotina, que posteri- ormente são identificados por sua união com estreptavi— dina-peroxidase e se revela com DAB. Este método per- mitiu aos inventores identificar que a concentração de 3 μΜ a 6 horas de exposição induziu fragmentação de ADN em aproximadamente 30% dos parasitas, enquanto que nas 24 ho- ras 100% dos parasitas apresentavam fragmentação de DNA.

0 outro método empregado para corroborar o fenôme- no de apoptose foi o de Anexina CY3 que permite distin- guir células apoptóticas e células necróticas. 0 fun- damento deste método baseia-se na assimetria dos fosfoli- pideos que constituem a membrana celular. Em condições normais, a fosfatidilserina encontra-se na face interna da membrana, enquanto que quando a célula sofre alterações apoptóticas o dito fosfolipideo apresenta-se na face ex- terna. A anexina pertence a um grupo de proteínas que se unem a fosfolipídeos, em particular a anexina V reconhece a fosfotidilserina e se une somente quando se apresenta na face externa de células apoptóticas. A anexina está con- jugada a Cy3.18 que é um composto fluorescente que ao ser excitado fluoresce em vermelho e, além disso, a pre- paração contém diacetato de β-carboxifluoresceina que é marcador de células viáveis e fluoresce em verde. De tal forma que as células apoptóticas exibem fluorescên- cia em vermelho e verde simultaneamente, as células necró- ticas somente fluorescem em vermelho e as células saudá- veis fluorescem em verde. Nas experiências realizadas, as giardias expostas desde 0,3 μΜ até 100 μΜ apresentaram células apoptóticas.

Métodos de preparação de iam fármaco para o tratamento de giardiose

EXEMPLO 1

(Formulação em suspensão — Uso pediátrico)

a) Prepara-se um extrato alcoólico (etanol) de cur- cumina que contenha aproximadamente 7,3 mg/ml a partir de curcuma comercial;

b) Separam-se do extrato preparado, 20 ml e adi- cionam-se a 10 g de amido de trigo o de milho e aquece-se esta mistura em forno a aproximadamente 60°C até que se evapore totalmente e fica só o amido impregnado de curcumi- na;

c) Colocam-se em agitação 0,5 g de metilce- lulose, 0,09 g de metiIparabeno, 0,01 g de propilpara- beno, 60 ml de água purificada estéril e 2 ml de propileno- glicol; e

d) Uma vez dissolvidos completamente os componentes da etapa anterior, misturam-se pouco a pouco (suavemente) e com agitação, a mistura resultante da etapa c) e a curcumi- na impregnada em amido até obter-se uma suspensão sem gru- mos.

À suspensão obtida pode-se adicionar xarope de mi- lho com aromatizantes até completar 100 ml.

Deixa-se em repouso a suspensão produzida durante 1 semana a 40C para aumentar velocidade de sedimentação.

Um método para tratamento de giardioses indicado para um paciente pediátrico com a suspensão anterior consiste em administrar uma dose de 1,46 mg/Kg de peso três vezes ao dia até alcançar uma dose total diária de .22,0 mg, durante 7 dias.

EXEMPLO 2

(Formulação em cápsulas de gelatina - Uso pediátrico = 11 mg de curcumina)

a) Prepara-se um extrato alcoólico (etanol) de cur- cumina que contenha aproximadamente 7,3 mg/ml a partir de curcuma comercial;

b) Separam-se do extrato preparado 200 ml e adicio- na-se a 100 g de amido de trigo o de milho e aquece- se esta mistura em forno a aproximadamente 60°C até que se evapore totalmente e fique somente o ami- do impregnado de curcumina; e

c) Adiciona-se 0,1 g de ácido citrico e 0,1 g de benzoato de sódio como conservadores e estabilizantes.

Preenchem-se cápsulas de gelatina com 750 mg da preparação obtida.

Um método para tratamento de giardioses indicado para um paciente pediátrico que necessite do mesmo con- siste em administrar uma dose de 11 mg do preparado de curcumina em cápsulas três vezes ao dia durante 7 dias.

0 método para tratamento de giardiose para um paci- ente adulto consiste em administrar uma dose de 22 mg do preparado de curcumina em cápsulas quatro vezes ao dia du- rante 7 dias.

Muito embora esta invenção fosse descrita no con- texto de sua modalidade preferida, para aqueles versados na matéria será evidente que o alcance da presente inven- ção estende-se além da modalidade especificamente des- crita a outras modalidades alternativas e/ou usos da in- venção que sejam óbvias e decorrentes da mesma. Além dis- so, muito embora a invenção fosse exposta e descrita em detalhe com referência a um modo de realização exemplifi- cativa, algumas outras modificações ou alterações serão claramente óbvias para especialistas em particular com ba- se na descrição precedente. Por conseguinte, considera-se que podem realizar-se várias combinações das característi- cas específicas e aspectos das modalidades descritas que incidirão indiscutivelmente dentro do alcance da invenção.

Considerando-se o que ficou exposto, pretende-se que o alcance da invenção não fique limitado pelas moda- lidades particularmente descritas, mas que dito alcan- ce deverá ficar definido por uma leitura equilibra- da das reivindicações expostas em seguida.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para preparar um fármaco em suspensão para uso pediátrico a base de curcumina, caracterizado por compreender: a) Preparar um extrato alcoólico (etanol) de curcumina que contenha aproximadamente 7,3 mg/ml a partir de curcuma comercial; b) Separar 20 ml do extrato preparado e adicionar a 10 g de almidão de trigo ou de milho e aquecer essa mistura no forno a aproximadamente 60°C, até que se evapore totalmente e fique apenas o almidão impregnado de curcumina; c) Colocar em agitação 0,5 g de metilcelulose,0,09 g de metilparabeno, 0,01 g de propilparabeno, 60 ml de água purificada estéril e 2 ml de propilenglicol; d) uma vez dissolvidos completamente os componentes da etapa anterior, misturar pouco a pouco (gentilmente) e com agitação a mistura resultante da etapa c) e a curcumina impregnada em almidão até obter uma suspensão sem grumos.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que à solução obtida se adiciona um saborizante em xarope de milho até completar 100 ml.

3. Método para preparar um fármaco em cápsulas de gelatina com 11 mg ou 22 mg de curcumina para uso pediátrico ou para adulto, respectivamente, caracterizado por compreender: a) Preparar um extrato alcoólico (etanol) de curcumina que contenha aproximadamente 7,3 mg/ml a partir de curcuma comercial; b) Separar 200 ml (pediátrico) ou 400 ml (adulto) do extrato preparado e adicionar a 100 g de almidão de trigo ou de milho e aquecer essa mistura no forno a aproximadamente 60°C, até que se evapore totalmente e fique apenas o almidão impregnado de curcumina; c) adicionar 0,1 g de ácido cítrico e 0,1 g de benzoato de sódio como conservantes e estabilizantes; e d) encher cápsulas de gelatina com 750 mg da preparação obtida.

4. Método para o tratamento de um paciente que padece de uma infecçao parasitária provocada por Giavdia Lamblial caracterizado por administrar ao paciente uma quantidade farmacologicamente efetiva de uma preparação que compreende curcumina para induzir efeitos citotóxicos na por Giárdia Lamblia.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a um paciente pediátrico se administra uma dose em suspensão de 1,46 mg/Kg de peso por três vezes ao dia até alcançar uma dose total diária de -22,0 mg durante sete dias.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a um paciente pediátrico que necessite, se administra uma dose de 11 mg em cápsulas três vezes ao dia durante sete dias.

7. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a um paciente adulto que necessite, se administra uma dose de 22 mg em cápsulas quatro vezes ao dia durante sete dias.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o fármaco está preparado em forma de suspensão, cápsulas ou supositórios.

9. Fármaco em suspensão para o tratamento de uma infecção parasitária causada por Giárdia Lamblia, caracterizado por compreender: a) um extrato de curcumina em concentração de 3,0 μΜ até 100 μΜ; e b) uma solução preparada à base de 0,5 g de metilcelulosa, 0,09 g de metilparabeno, 0,01 g de propilparabeno, 60 ml de água purificada estéril e 2 ml de propilenglicol.

10. Fármaco em cápsulas para o tratamento de uma infecção parasitária causada por Giárdia Lamblia, caracterizado por compreender: a) um extrato de curcumina em concentração de 3,0 μΜ até 100 μΜ; e b) 0,1 g de ácido cítrico e 0,1 g de benzoato de sódio como conservantes e estabilizantes.

11. Formulação para tratar uma infecção parasitária causada por Giárdia Lamblia, caracterizado por compreender uma quantidade efetiva de um derivado de curcuma.

12. Método para tratar uma infecção parasitária provocada por Giárdia Lamblia, caracterizado por administrar a um paciente que necessite uma quantidade efetiva de um fármaco em suspensão preparado à base de curcumina.

13. Método para tratar uma infecção parasitária provocada por Giárdia Lamblia, caracterizado por administrar a um paciente que necessite uma quantidade efetiva de um fármaco em cápsulas preparado à base de curcumina.

14. Método para tratar uma infecção parasitária provocada por Giárdia Lamblia, caracterizado por administrar ao paciente que necessite uma quantidade efetiva de um fármaco derivado da planta curcuma.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato do fármaco derivado da planta curcuma ser curcumina.