WO2008010697A1 - Fármaco a base de curcumina para el tratamiento de infección parasitaria provocada por la giardia lamblia - Google Patents

Fármaco a base de curcumina para el tratamiento de infección parasitaria provocada por la giardia lamblia Download PDF

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curcumin
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giardia lamblia
parasitic infection
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Maria Luisa MENDOZA MAGAÑA
Rafael Cortes Zarate
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Herrera Ramirez Mario Alberto
Mendoza Magana Maria Luisa
Rafael Cortes Zarate
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to a new therapeutic proposal for the treatment of intestinal infections and, more specifically, relates to a new drug derived from curcumin whose cytotoxic effect on Giardia lamblia makes it a viable, highly effective alternative for the treatment. of giardiosis.
  • Intestinal parasitic diseases continue to be a public health problem worldwide. According to Savioli and cois. (1992) and Chan and cois. (1998), even when G. lamblia is lodged in the small intestine, it has also been found in some rare places for its microhabitat, such as gastric level as described by Doglioni and cois. (1992). Annually more than 1,000,000,000 people suffer from some type of parasitosis, (Upcroft and Upcro ⁇ 2001), which represents approximately 20% of the world's population. On the other hand, giardiosis occurs in approximately 55% of reported cases of parasites worldwide, according to reports from the National Institutes of Health of the United States of America (2002).
  • Giardia Lamblia is a protozoan of the family of Phylum Sarcomastigophora, of the Zoomastiphora class of the order of the Vaccinonadida, is one of the most common flagellate in the human digestive tract and is highly infectious, and is one of the most important causes to global level of intestinal infections produced by unicellular organisms.
  • the drugs commonly used to control and eradicate this infection frequently exhibit side effects that cause the patient to leave the treatment and also have appeared strains of G. lamblia resistant to these drugs. Therefore, the search for new alternative therapeutic proposals for this parasitic disease is very important.
  • Giardia lamblia is one of the most common parasites found in the human intestinal tract that can cause an acute or chronic infection known worldwide as giardiosis.
  • Clinical symptoms include: nausea, stomach cramps, diarrhea, vomiting, malabsorption syndrome, steatorrhea, weight loss, headache, poor school performance, and mental and physical development deficiencies that become more severe in childhood .
  • cytotoxic effect refers to the changes that a substance exerts on living organisms that lead to its destruction and the mechanisms of action can be direct or indirect, can cause necrosis or apoptosis and They can be specific or nonspecific.
  • Metronidazole (nitroimidazole) has an effect on the overall structure of the parasite, but not on the integrity of the ventral disc since it seems to be ultrastructurally almost intact. Metronidazole is capable of inducing ruptures in DNA strands, so this effect is the basis for its contraindication during the first trimester of pregnancy, since apparently this effect is not specific for the elimination of parasites and could potentially exert changes. teratogenic (Sisson et al., 2000, Oxberry et al., 1994, Campanati and Monteiro-Leal, 2002).
  • albendazole has an in vitro effectiveness superior to metronidazole, while in vivo the effectiveness for both is 95-97% (Cedillo-Rivera and Mu ⁇ oz, 1992, Campanati and Monteiro-Leal 2002, Nash and Rice 1998, Chavez and cois. 1992). Furazolidone affects adhesion capacity but not viability (Farthing
  • Furazolidone acts by inhibiting NADH and NADPH oxidase affecting the transport of electrons in the respiratory chain and this system in the giardia is coupled in the cell membrane, being an immediate target for furazolidone.
  • this drug has side effects such as: nausea, vomiting, colitis, anal itching, hemolysis due to glucose deficiency 6 dehydrogenated phosphate, headache, bipersensitivity reactions, hypotension, morbilliform vesicular rash, arthralgia, urticaria (Dictionary of specialties pharmaceuticals from 2003) and inhibition of monoamine oxidase.
  • psychotic episodes have been reported in patients carrying the human immunodeficiency virus.
  • this drug is contraindicated in those under 1 month of age, since it can develop hemolytic anemia by inducing glutability instability.
  • this drug is mutagenic in bacteria and has been shown to cause mammary tumors in rats and lung tumors in mice when they have been administered in high doses and in chronic form (Gardner and HiIl 2001).
  • Quinacrine was initially developed as an antimalarial agent and subsequently it was also documented that it had antigiardiosis effects. Quinacrine causes activation by pyruvate-ferrodoxin-oxidoreductase and consequently the formation of nitrogen free radicals. Also, she interferes with DNA synthesis by blocking the pairing for adenine incorporation (Speelman 1985, Edlind 1989, Chopra and Roberts 1992, New Antimicrobial Agents Approved by the Food and Drug Administration in 2002 and New Indications Previously Approved Agents 2003).
  • this drug has undesirable side effects such as: vomiting, discoloration of the skin and the sclera of a greenish yellow, as well as urine, headache, tremor and can induce psychosis, which is uncommon, as well as causes dermatitis exfoliative Occasionally, it induces retinopathies, in some individuals it induces glucose 6 phosphate dehydrogenase deficiency, it can cause hemolysis, and it is contraindicated in pregnancy because it has been linked to the congenital appearance of spina bifida and renal agenesis, although they have never been shown carcinogenic effects due to their DNA binding action (Gardner and HiIl 2001).
  • Nitazoxanide is a nitrotiazole benzamido derivative (Theodos et al., 1998), developed as an antiparasitic, especially against diarrheal diseases, and no toxicity has been demonstrated in preclinical studies.
  • This drug is well tolerated and has a spectrum similar to that of metronidazole (Mcvay and Rolfe 2000), although collaterally it can cause diarrhea, abdominal pain, flatulence, nausea, vomiting, dyspepsia, xerostomia, yellowish-green urine and headache. (Guttner et al., 2003).
  • the side effects of the aforementioned drugs represent in most cases the main reason for the patient to interrupt their medication and thus do not obtain the desired result in the treatment of parasitic disease.
  • the main object of the present invention is to propose a new therapeutic alternative for the treatment of giardiosis, derived from the evaluation of the anti-protozoan activity of curcumin, the main constituent of turmeric.
  • curcumin the main constituent of turmeric.
  • cultures of axenic G. lamblia (Portland 1 strain) were exposed to different curcumin concentrations. Its effects on the growth and adhesion capacity of the parasite and its morphology were evaluated. The ability of curcumin to induce an effect similar to apoptosis has also been evaluated.
  • curcumin inhibited the growth of trophozoites and adhesion by more than 50% depending on dose and time. Morphological changes were described as protrusions or bumps formed under the cytoplasmic membrane, deformation due to cell agglutination and swelling or swelling. Curcumin induced an effect similar to apoptosis as a function of dose and time. In conclusion, curcumin exhibited a cytotoxic effect on G. lamblia inhibiting Adherent capacity and parasite growth, induced morphological alterations and caused changes similar to apoptosis.
  • Figure 1 is a graph illustrating the effect of curcumin on the growth of Giardia lamblia trophozoites in vitro. Each point represents the average S.D ⁇ of triplicate determinations.
  • Figure 2 is a graph of the effect of curcumin on the viability of trophozoites of Giardia lamblia.
  • Figures 3A to 3E are representative electronic images of morphological alterations in trophozoites of Giardia lamblia exposed to different concentrations of curcumin, where Figure: 3A shows trophozoites with normal morphology after exposure to ethanol used as a negative control; 3B shows cells exposed to albendazole as a positive control; 3C cells exposed to curcumin at a concentration of 0.3 ⁇ M; 3D cells exposed to curcumin at a concentration of 30 ⁇ M; and 3 E cells exposed to curcumin at a concentration of 100 ⁇ M. Note the formation of giant vacuoles indicated with an arrow in the images in Figures 3C to 3E.
  • Figures 4A to 4D are electronic images of apoptosis detected by the TUNNEL method of trophozoites of G. lamblia that have been exposed to curcumin, where the figures show correspond: (4A) to the negative control; (4B) to curcumin at a concentration of 0.3 ⁇ M for 6 hours; and (4C) and (4D) at the same concentration of curcumin for 24 hours. Note in Figure 4C the presence of residual structures (nuclei and cytoskeletons) of a trophozoite of G. lamblia that has exploded.
  • Figures 5A to 5D are representative electronic images of the detection of phosphatidylserine translocation as an indicator of a curcumin-induced apoptotic event, where the figures show the following images: (5A) G. lamblia trophozoites exposed to ethanol as a group negative control, in which the cells are completely viable; (5B) cells exposed to 10 ⁇ M of metronidazole; (5C) cells exposed to 0.3 ⁇ M curcumin; and (5D) curcumin exposed cells in a concentration of 100 ⁇ M for 72 hours.
  • 5A G. lamblia trophozoites exposed to ethanol as a group negative control, in which the cells are completely viable
  • Turmeric ⁇ C ⁇ rcuma longa lynri is a perennial plant, with long green lanceolate leaves with an approximate height of 50 centimeters and has yellow or violet flowers.
  • the primary rhizome is oval and oblong, while the secondary is short and attached to a large tubercle 2 to 5 cm long and 1 to 1.8 cm thick, is yellow or dark yellow.
  • the rhizome of turmeric is dried and pulverized, it is used worldwide as a condiment. It is the main ingredient of curry and prepared mustard, in which it confers the yellow color.
  • Turmeric contains approximately 4% to 10% curcumin and its chemical formula is C 21 H 20 O 6 which corresponds to a diphenolic compound.
  • the curcumin used for the experiments of the present work corresponds to a compound produced by Sigma Chemical Co. C 1396 (EC No. 207-280-5), which is an extract of curcuminoids where 65% is curcumin.
  • Curcumin is stable in the stomach and small intestine, so its high lipophilicity allows rapid gastrointestinal absorption by passive diffusion, after administration it is metabolized and excreted mainly by bile and feces and also by urine. As published by Ram ⁇ rez-Tortosa and cois., 2000, in studies in rats it has been found that 35% of oral doses between 2.5 and 1000 mg / kg, are excreted in feces, (Holder et al., 1978, Ravindranath and Chandrasekhara, 1982), 65% being absorbed, after administration it is first biotransformed into dihydrocurcumin and tetrahydrocurcumin, and these compounds are subsequently converted to monoglucuronic conjugates (Pan et al., 1999).
  • curcumin The main metabolites of curcumin in vivo are glucuronides of curcumin, dihydrocurcumin and tetrahydrocurcumin and are excreted in the bile ducts between 50 and 60% in about 5 hours (Heath et al., 2003).
  • Turmeric also contains natural curcumin derivatives called curcuminoids that have been identified by calorimetric and thin layer chromatography methods. Pharmacologically, curcumin has been shown to possess anti-inflammatory activity in animal models.
  • This activity is exercised by a mechanism that involves the suppression of the expression of the nuclear factor kappa B, which is prior to the sites that code for the expression of proinflammatory cytokines (IL-I, IL-6 and TNF ⁇ ) so which consequently decreases the expression of these cytokines (Miguel and cois 2002, Kaltscmidt and cois. 2002; Chan Marión and cois. 1998).
  • proinflammatory cytokines IL-I, IL-6 and TNF ⁇
  • curcumin there are numerous articles about the great variety of pharmacological activities of curcumin, such as antimicrobial, protective of the respiratory system both high and low, anti-asthmatic, potent anti-inflammatory, immunomodulatory activity, lipid-lowering and antioxidant (Mesa and cois., 2000) . Recently, he has been documented antiparasitic activity (Araujo and León in 2001). The anti-parasitic effect of curcumin has been described against Leishmania major (Rasmunsen et al. 2000; Koide et al., 2001; Salen et al., 2002)
  • Curcumin has also demonstrated antiparasitic activity against L. major, L infantum and L. tropic with a better in vitro effect compared to pentamidine, which is the drug of choice against this parasite (Salen et al., 2002).
  • a concentration of 15 ⁇ M curcumin stopped the growth of Leishmania strains at 72 hours in vitro. Curcumin in this parasite inhibits DNA synthesis and consequently interrupts the cell cycle, however, the mechanism by which it exerts this effect is still unknown (Saleheen et al., 2002).
  • Curcumin in a concentration of 50 ⁇ M for 24 hours stopped the growth and viability of L. major in vitro by up to 100%. Using a concentration of 100 ⁇ M curcumin, it was effective to decrease the viability of Leishmania cultures at concentrations of 0.25 x 10 6 - 2.0 x 10 6 cells / ml. Apparently, the antioxidant property of curcumin is not involved in the mechanism of leishmanicidal action (Koide et al., 2001).
  • curcumin Asai and Kuffan, 1992. In humans they have been tested up to 8 gr / day without toxic effects (Cheng et al., 2001), as well as 5 to 10% of the diet in rodents (Sambaiah et al., 1982), while another tumor inhibitor , equally or less effective (dithiol-thione), was toxic at 0.05% of the diet (Rao et al., 1995). The biggest part (90%) of curcumin given orally is metabolized in the tract in both humans and mice (Ireson et al., 2002).
  • curcumin is not genotoxic (Vijayalaxmi et al., 1980; Wargovich et al., 1985; Azuine et al., 1992; Li et al., 1998; Murria and Pizzorno, 1999; Shukla and cois., 2003).
  • curcumin reverses the damage of known genotoxic agents, behaving as anti- genotoxic with the micronucleus test (Azuine and cois., 1992b; Abraham and cois., 1996; Li and cois., 1998), in Salmonella tiphimurium (Azuine et al., 1992b) and in chromosome analysis it has been documented as non-clastogenic (Mukhopadhyay et al., 1998; Murria and Pizzorno, 1999). A human study (Hastak et al., 1997) showed that micronucleus frequencies are not modified in subjects treated with curcumin.
  • curcumin protected individuals exposed to benzo [a] pyrene by decreasing the frequency of micronuclei in bone marrow cells and leukocytes in patients with submucosal fibrosis.
  • the antigenotoxic potential of curcumin was evaluated with the Salmonella typhimurium reverse mutation test and with bone marrow cell chromosome analysis of mice inhibiting cyclophosphamide and benzo [a] pyrene damage (Shulka and cois., 2003 ).
  • TESTS G. lamblia trophozoites of the Portland 1 (Pl) strain were grown in TYI- medium
  • the initial inoculum was 5 x 10 4 parasites / ml from an exponentially growing crop.
  • the tubes were placed in an ice-water bath for 30 minutes, and the trophozoites were released and counted using the Neubauer chamber.
  • G. lamblia trophozoites were inoculated in TYI-S-33 medium and incubated at 37 ° C and every 24 hours the number of parasites was counted. The multiplication of the parasites was quantified for 6 days to construct a graph of the time against the logarithm of the number of parasites per milliliter.
  • curcumin dissolved in ethanol was added to fit the concentrations of 0.3, 3, 30 and 100 ⁇ M (0.1, 1.1, 11.0 and 38.8 ⁇ g / ml, respectively) of medium using a maximum volume of 226 ⁇ l of the curcumin stock solution.
  • ethanol was added, which served as a vehicle in a volume of 226 ⁇ l, and two control tubes were left intact in each experiment.
  • the concentration of 0.3 ⁇ M caused a decrease in growth of 164,000 p / ml against 240,000 p / ml of the control (p ⁇ 0.03).
  • the concentration of 3 ⁇ M caused further growth decrease of 136, 150 p / ml against 240,000 p / ml of the control (p ⁇ 0.01).
  • the concentration of 30 ⁇ M caused a more evident decrease of 108,000 p / ml against 240,000 p / ml of the control (p ⁇ 0.005).
  • the concentration of 100 ⁇ M produced the largest growth decrease of 102,500 p / ml against 240,000 p / ml of the control (p ⁇ 0.004).
  • the concentration of 0.3 ⁇ M caused a decrease of 420,000 p / ml against 875,000 p / ml of the control (p ⁇ 0.001).
  • the 3 ⁇ M concentration caused a sharp decrease in Giardia growth of 145,250 p / ml against 875,000 of the control (p ⁇ 0.001).
  • the concentration of 30 ⁇ M the decrease in growth was even more severe 125,500 p / ml against 875,000 p / ml of the control (p ⁇ 0.001).
  • the concentration of 100 ⁇ M did not allow further growth of Giardia, 41,000 p / ml against 875,000 p / ml of the control (p ⁇ .001).
  • the concentration of 0.3 ⁇ M showed a decrease in growth of 565,000 p / ml against 1'20O 5 OOO p / ml of the control ( ⁇ ⁇ 0.002).
  • the concentration of 30 ⁇ M further reduced growth to 31,750 p / ml against 1 '200.0OO p / ml of the control (p ⁇ 0.001); and finally the concentration of 100 ⁇ M brought down the growth of 30,500 p / ml against 1 '200,000 p / ml of the control (p ⁇ 0.001).
  • Figure 1 also includes comparing them with the effect of the drug albendazole at a concentration of 0.3 ⁇ M, observing that in a similar way the growth of Giardia was inhibited in all exposure times at the indicated concentration.
  • tubes were inoculated with 150,000 trophozoites and incubated for 24, 48 and 72 hours after curcumin exposure with concentrations of 0.3, 30 and 100 ⁇ M for each time. Every 24 hours the number of parasites was counted before placing the tubes in an ice bath at 4 ° C. The result was the population of non-adhering or free parasites in the culture medium. Subsequently, the same tubes were placed in an ice bath at 4 ° C for 30 minutes to obtain the total population of trophozoites (both free and attached parasites). The difference between the total and the free population gave us the number of parasites that were found attached at each of the incubation and curcumin concentration times.
  • Adhesion curve It was found that with the concentration of 0.3 ⁇ M of curcumin at all times an increase in the adhesion of the trophozoites was observed compared to the control. The loss of adhesion is very important with the concentrations of 30 and 100 ⁇ M as can be seen in Table 2. This being a dose / response effect, since at higher curcumin concentrations there was a greater loss of adhesion. In the concentrations of 30 and 100 ⁇ M the lack of mobility of the parasites was more evident, increasing their size.
  • TdT-FragEL Fram End Labeling of Oncogene Research Products
  • the trophozoites are collected from the tubes by centrifugation at 3000 rpm and placed on a slide treated with polylysine and allowed to air dry, fixed with 4% paraformaldehyde in PBS for 30 minutes and washed with PBS to remove excess fixative. The trophozoites are then incubated for 10 to 30 minutes with the equilibrium buffer at room temperature.
  • the TdT tidal reaction mixture (mixture of labeled and unlabeled deoxynucleotides at an optimal ratio for DNA fragment with TdT fragment) was prepared, and 57 ⁇ l of the TdT tidal reaction mixture and 3 ⁇ l of the enzyme TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) are incubated at 37 ° C for an hour and a half. 100 ⁇ l of buffer (0.5M EDTA, pH 8) was added for 5 minutes and a TBS wash was performed. Subsequently, 100 ⁇ l of blocking buffer containing 2 ⁇ l of the 50X conjugate with 98 ⁇ l of blocking buffer (4% BSA in PBS) were added. Immediately afterwards, 100 ⁇ l of diluted Ix conjugate was added and incubated for 30 minutes.
  • buffer 0.5M EDTA, pH 8
  • blocking buffer containing 2 ⁇ l of the 50X conjugate with 98 ⁇ l of blocking buffer (4% BSA in
  • the cells were subsequently washed with TBS IX and the developing solution was added with diaminobenzidine (DAB) and the reaction was stopped with distilled water.
  • DAB diaminobenzidine
  • Apoptotic trophozoite nuclei were labeled with biotinylated nucleotides that reacted with the streptavidin / peroxidase conjugate which then reacted with H2O2 in the presence of DAB as a chromogen, developing brown brown coloration. Finally, photographic records were made using an inverted microscope (Olympus 1X70) equipped with high resolution digital camera and the Image-Pro plus (Media Cybernetics) image analysis program was used.
  • phosphatidylserine by the method of Annexin V-Cy3
  • the cellular changes involved in the apoptosis process include the loss of lipid asymmetry during the early stages of apoptosis.
  • phosphatidylserine In living cells, phosphatidylserine is transported to the inner layer of the cell membrane by the enzyme translocates Mg-ATP-dependent aminophospholipid.
  • phosphatidylserine is transported to the outer layer of cytoplasmic membrane and is available for annexin (a protein that binds to phosphatidylserine in the presence of Ca) to bind and be labeled with a fluorochrome (Cy3.18) that fixes in red.
  • annexin a protein that binds to phosphatidylserine in the presence of Ca
  • the present study was conducted in order to confirm the induction of apoptosis and also detect the possible neuronal necrosis caused by the exposure of Giardia to curcumin, for which the study was performed using the Annexin V-CY3 apoptosis detection test (Sigma -Aldrich).
  • the binding buffer was diluted in deionized water.
  • 2.32 mg of 6-carboxyfluorescein diacetate (6- CFDA) was diluted in 0.1 ml of acetone.
  • the double marking solution was prepared with 1 ⁇ g / ml of annexin V Cy3.18 (AnnCy3) and 6-CFDA 500 ⁇ M diluted in binding buffer.
  • the cells in each well were washed with the binding buffer three times.
  • Double tidal solution (AnnCy3 + 6-CFDA) was added to the cells and incubated for 10 minutes in the dark. Then 5 washes were performed with the binding buffer to remove the excess dye. AnnCy3 is observed in red and 6- CFDA is observed in green. Immunofluorescent tides were observed in viable cells (marked with 6-CFDA, green), early apoptotic (marked with AnnCy3 and 6-CFDA, green and red) and necrotic (marked with AnnCy3, red).
  • the giardias cell bodies exposed to the vehicle (ethanol) were observed without apparent changes, since they fluoresce in apple-green color typical of viable cells.
  • the giardias exposed to metronidazole showed frank necrosis that fluoresces in red with cytoplasmic remains scattered around the cells.
  • the students' T tests were used to identify significant statistical differences between experimental groups and as a post-hoc test the Kruskal-Wallis test was applied.
  • curcumin has shown antiparasitic activity against Leishmania spp, Trypanosoma brucei and Plasmodium falciparum.
  • the in vitro curcumin cototoxic activity against G. lamblia trafozoites has been analyzed with excellent results.
  • curcumin caused a statistically significant decrease from the concentration of 0.3 ⁇ M at 24 hours post exposure. This difference was evidently increased in the highest concentrations (3, 30 and 100 ⁇ M), agreeing with the times and concentrations reported for the in vitro effect of curcumin against Leishmania spp. (Koide et al. 2002 and Salen and cois 2002). Therefore, this new therapeutic alternative could be more accepted and better tolerated by infected individuals than They have abandoned treatment with albendazole or other antiparasitic agents because of their side effects.
  • the adhesion of the trophozoites to the intestinal epithelium is vital, if it lacks this capacity they would be dragged by peristalsis and the transit of the intestinal content, therefore the ability of the parasite to establish the infection is an important aspect. Due to this, the effect of curcumin on this event was evaluated by finding that the effect of curcumin caused a loss of adhesion of trophozoites in vitro is more than 95% with concentrations of 30 and 100 ⁇ M.
  • the measurement of the viability of the parasites to a cytotoxic compound provides information on the reversibility of the cytotoxic effect of said compound, since once exposed for different periods in independent tests, all are incubated with fresh medium for 48 hours more.
  • the effect of curcumin on the viability of the parasite was clearly evident in the parasites exposed to the concentration of 30 ⁇ M after 48 hours, where the effect was irreversible as the trophozoites no longer recovered.
  • the effect of curcumin on the viability of the parasite was even more drastic when analyzing the effect of the concentration of 100 ⁇ M since since 24 hours of exposure the parasites no longer recovered their viability. This effect is comparable to that of other antigiardiosis compounds, such as albendazole and metronidazole, which cause a loss of viability at similar concentrations only if these drugs present problems of patient tolerance to treatment.
  • the morphological alterations shown in the structure of the G. lamblia exposed to curcumin were very drastic within the first 24 hours with concentrations of 30 and 100 ⁇ M.
  • the trophozoites showed deformations in the membrane with bulges so prominent that they caused the rounding and subsequently the destruction of the parasite, finding spherical shapes and cell debris at 48 and 72 hours after the exposure of curcumin.
  • TUNNEL DNA fragmentation
  • Annexin CY3 that allows to distinguish apoptotic cells and necrotic cells.
  • the rationale for this method is based on the asymmetry of the phospholipids that make up the cell membrane. Under normal conditions, phosphatidylserine is found on the inner side of the membrane, while when the cell undergoes apoptotic changes, said phospholipid occurs on the outer side.
  • Annexin belongs to a group of phospholipid-binding proteins, in particular annexin V recognizes phosphotidylserine and binds only when it occurs on the outer face of apoptotic cells.
  • Annexin is conjugated to Cy3.18 which is a fluorescent compound that, when excited, fluoresces in red and, in addition, the preparation contains 6- carboxyfluorescein diacetate that is a viable cell marker and fluoresces in green. In such a way that apoptotic cells exhibit fluorescence in red and green simultaneously, necrotic cells only fluoresce in red and healthy cells fluoresce in green. In the experiments performed the exposed giardias from 0.3 ⁇ M to 100 ⁇ M presented apoptotic cells.
  • the suspension produced is allowed to stand for 1 week at 4 o C to assess the sedimentation rate.
  • a method for treatment of giardiosis indicated for a pediatric patient with the previous suspension is to administer a dose of 1.46 mg / kg of weight three times a day until reaching a total daily dose of 22.0 mg, for 7 days.
  • One method for treatment of giardiosis indicated for a pediatric patient who requires it is to administer a dose of 11 mg of the curcumin preparation in capsules three times a day for 7 days.
  • the method for treatment of giardiosis for an adult patient is to administer a dose of 22 mg of the curcumin preparation in capsules four times a day for 7 days.

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Abstract

Una composición farmacéutica preparada a base de curcumina para el tratamiento de una infección parasitaria, específicamente aquella causada por la giardia lamblia, cuyos efectos citotóxicos sobre el parásito inhiben su capacidad de crecimiento y de adhesión, y además induce alteraciones morfológicas y efectos similares a la apoptosis en dicho parásito. La nueva composición formulada a base del derivado de una planta es una alternativa viable y altamente eficaz para el tratamiento de giardiosis que se caracteriza porque, a diferencia de otros fármacos utilizados para tratar el mismo padecimiento, no provoca efectos secundarios que induzcan al paciente a la suspensión del tratamiento.

Description

FÁRMACO A BASE DE CURCUMINA PARA EL TRATAMIENTO DE INFECCIÓN PARASITARIA PROVOCADA POR LA GIARDIA LAMBLIA
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
1. Campo de la Invención.
La invención se relaciona con una nueva propuesta terapéutica para el tratamiento de infecciones intestinales y, más específicamente, se refiere a un nuevo fármaco derivado de la curcumina cuyo efecto citotóxico sobre la Giardia lamblia lo convierte en una alternativa viable, altamente eficaz, para el tratamiento de la giardiosis.
2. Arte previo relacionado
Las enfermedades parasitarias intestinales continúan siendo un problema de salud pública a nivel mundial. Según Savioli y cois. (1992) y Chan y cois. (1998), aún cuando la G. lamblia se hospeda en el intestino delgado, también se ha encontrado en algunos lugares poco comunes para su microhábitat como puede ser a nivel gástrico según lo describe Doglioni y cois. (1992). Anualmente más de 1,000,000,000 de personas padecen algún tipo de parasitosis, (Upcroft y Upcroñ 2001), lo cual representa aproximadamente el 20% de la población mundial. Por su parte, la giardiosis ocurre en aproximadamente un 55% de los casos reportados de parásitos a nivel mundial, según reportes de los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos de Norteamérica (2002).
La Giardia Lamblia es un protozoario de la familia de los Phylum Sarcomastigophora, de la clase Zoomastiphora del orden de los Diplomonadida, es uno de los flagelados más comunes en el tracto digestivo humano y es altamente infectante, y es una de las causas más importantes a nivel mundial de infecciones intestinales producidas por organismos unicelulares. Los fármacos comúnmente empleados para controlar y erradicar esta infección exhiben frecuentemente efectos colaterales que hacen que el paciente abandone el tratamiento y además han aparecido cepas de G. lamblia resistentes a estos fármacos. Por ello, es muy importante la búsqueda de nuevas propuestas terapéuticas alternativas para esta enfermedad parasitaria.
Las enfermedades en humanos y animales provocadas por parásitos de protozoarios tienen gran impacto en la salud pública. La Giardia lamblia es uno de los parásitos más comunes encontrados en el tracto intestinal humano que pueden provocar una infección aguda o crónica conocida mundialmente como giardiosis. Los síntomas clínicos incluyen: nauseas, retortijones estomacales, diarrea, vómito, síndrome de mala absorción, esteatorrea, pérdida de peso, dolor de cabeza, bajo rendimiento escolar y deficiencias en el desarrollo mental y físico que se agudiza de manera mas intensa en la infancia.
Para el tratamiento de la giardiosis se han desarrollado varios fármacos que son capaces de ejercer efectos citotóxicos de diversos tipos sobre el parásito (Gardner y HiIl, 2001). En el contexto de la presente invención, el término "efecto citotóxico" se refiere a los cambios que una sustancia ejerce sobre organismos vivos que conducen a la destrucción del mismo y los mecanismos de acción pueden ser directos o indirectos, pueden provocar necrosis o apoptosis y pueden ser específicos o inespecíficos.
El grupo de los nitroimidazoles (Upcroñ y Upcroft, 2001), bencimidazoles (Katiyar y cois., 1994), nitrofuranos, quinacrina y recientemente nitazoxanida, este último de reciente introducción en México, siendo un anti-parasitario polivalente sobre el cual existen pocos estudios (Ponce-Macotela y cois., 2001, Ortiz y cois., 2001), en una publicación de Belkin-Valdovinos en 2004 encontró que no hay diferencias estadísticas significativas entre tres poblaciones manejadas, dos poblaciones con dos diferentes dosis de nitazoxanida y una población con albendazol.
El metronidazol (nitroimidazol) tiene efecto sobre la estructura general del parásito, más no sobre la integridad del disco ventral ya que al parecer ultraestructuralmente éste se mantiene casi intacto. El metronidazol es capaz de inducir rupturas en las cadenas de ADN por lo que este efecto es la base para su contraindicación durante el primer trimestre de la gestación, ya que al parecer este efecto no es específico para la eliminación de parásitos y podría potencialmente ejercer cambios teratogénicos (Sisson y cois., 2000, Oxberry y cois., 1994, Campanati y Monteiro- Leal, 2002). El efecto teratogénico se ha documentado tanto en ratas como en ratones a altas dosis y por largos periodos, mientras que en humanos no se han documentado eventos teratogénicos atribuibles al metronidazol (Gardner y HiIl 2001, Fahrig y Engelke l997). El albendazol del grupo de los bencimidazoles detiene el crecimiento in vitro, provocando pérdida de la estructura y desorganización de los microtúbulos, ya que interfiere con la polimerización uniéndose a la subunidad β-tubulina (Harder y cois. 2001). Además, el albendazol provoca desensamble de las microcintas que contienen giardina. También provoca desensamble completo del disco ventral, lo que causa pérdida de la adhesión afectando la viabilidad del parásito (Samuelson, 1999). Comparativamente, el albendazol tiene una efectividad in vitro superior al metronidazol, mientras que in vivo la efectividad para ambos es de 95-97% (Cedillo-Rivera y Muñoz, 1992, Campanati y Monteiro-Leal 2002, Nash y Rice 1998, Chávez y cois. 1992). La furazolidona afecta la capacidad de adhesión pero no la viabilidad (Farthing
1996) y es capaz de bloquear el ciclo celular de la giardia en fases S y G2-M. Es uno de los anti-giardiósicos autorizados por la Federal Food and Drug Administration (FDA) en los Estados Unidos de Norteamérica. La furazolidona actúa inhibiendo la NADH y NADPH oxidasa afectando el transporte de electrones en la cadena respiratoria y este sistema en la giardia se encuentra acoplado en la membrana celular, siendo un blanco inmediato para la furazolidona. Sin embargo, este fármaco presenta efectos colaterales como son: nauseas, vómitos, colitis, prurito anal, hemolisis por deficiencia de glucosa 6 fosfato deshidrogenada, dolor de cabeza, reacciones de bipersensibilidad, hipotensión, erupción vesicular morbiliforme, artralgias, urticaria (Diccionario de especialidades farmacéuticas del 2003) e inhibición de la monoamino oxidasa. Además, se han reportado episodios sicóticos en pacientes portadores del virus de la inmunodeficiencia humana. También, este fármaco esta contraindicado en los menores de 1 mes de edad, ya que puede desarrollar anemia hemolítica por inducir inestabilidad del glutation. Adicionalmente, este fármaco es mutagénico en bacterias y se ha demostrado que causa tumores mamarios en ratas y tumores pulmonares en ratones cuando se les ha administrado en dosis altas y en forma crónica (Gardner y HiIl 2001).
La quinacrina fue inicialmente desarrollada como agente antimalaria y posteriormente también se documentó que tenía efectos antigiardiósicos. La quinacrina provoca la activación por la piruvato-ferrodoxin-oxidoreductasa y en consecuencia la formación de radicales libres de nitrogenados. También, ella interfiere en la síntesis del ADN bloqueando el apareamiento para la incorporación de adenina (Speelman 1985, Edlind 1989, Chopra y Roberts 1992, New Antimicrobial Agents Approved by the Food and Drug Administration in 2002 and New Indications Previously Approved Agents 2003). Sin embargo, este fármaco tiene efectos colaterales indeseables como: vómitos, decoloración de la piel y de la esclerótica de un amarillo verdoso, así como de la orina, cefalea, temblores y puede inducir psicosis, lo cual es poco común, así como causa dermatitis exfoliativa. Ocasionalmente, induce retinopatías, en algunos individuos induce deficiencia de glucosa 6 fosfato deshidrogenasa, puede provocar hemolisis, y está contraindicado en el embarazo porque se le ha ligado a la aparición congénita de espina bífida y agenesia renal, aunque nunca se le han demostrado efectos cancerígenos por su acción de unión al ADN (Gardner y HiIl 2001).
La nitazoxanida es un derivado nitrotiazol benzamido (Theodos y cois., 1998), desarrollado como antiparasitario, especialmente contra enfermedades diarreicas, y no se le ha demostrado toxicidad en estudios preclínicos. Este fármaco es bien tolerado y tiene un espectro similar al del metronidazol (Mcvay y Rolfe 2000), aunque colateralmente puede provocar diarrea, dolor abdominal, flatulencia, nauseas, vómitos, dispepsia, xerostomía, coloración amarillo-verdosa de la orina y dolor de cabeza (Guttner y cois., 2003). Desafortunadamente, los efectos colaterales de los fármacos antes referidos representa en la mayoría de los casos el principal motivo de que el paciente interrumpa su medicación y con ello no se obtenga el resultado deseado en el tratamiento de la enfermedad parasitaria. Estos inconvenientes han obligado a la búsqueda de un tratamiento terapéutico alternativo basado en un fármaco de origen natural que no tenga los mismos efectos colaterales indeseables en el paciente para que éste no abandone su tratamiento.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
El objeto principal de la presente invención es proponer una nueva alternativa terapéutica para el tratamiento de la giardiosis, derivada de la evaluación de la actividad anti-protozoaria de la curcumina, el principal constituyente de la cúrcuma. Para tal efecto, se expusieron cultivos de G. lamblia axénica (cepa Pórtland 1) a diferentes concentraciones de curcumina. Se evaluaron sus efectos en la capacidad de crecimiento y de adhesión del parásito y la morfología del mismo. También ha sido evaluada la capacidad de la curcumina para inducir un efecto similar a la apoptosis.
De acuerdo con los resultados del estudio, todas las concentraciones de curcumina inhibieron el crecimiento de trofozoítos y la adhesión en más del 50% en función de la dosis y el tiempo. Se describieron los cambios morfológicos como protrusiones o protuberancias formadas debajo de la membrana citoplásmica, deformación debida a la aglutinación celular y la tumefacción o hinchazón. La curcumina indujo efecto similar a la apoptosis en función de la dosis y el tiempo. En conclusión, la curcumina exhibió un efecto citotóxico en la G. lamblia inhibiendo la capacidad adherente y crecimiento del parásito, indujo alteraciones morfológicas y provocó cambios similares a la apoptosis.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 es una gráfica que ilustra el efecto de la curcumina sobre el crecimiento de trofozoítos de Giardia lamblia in vitro. Cada punto representa el S. D. ± promedio de determinaciones por triplicado.
La figura 2 es una gráfica del efecto de la curcumina sobre la viabilidad de trofozoítos de la Giardia lamblia.
Las figuras 3A a 3E son imágenes electrónicas representativas de alteraciones morfológicas en trofozoítos de Giardia lamblia expuestos a diferentes concentraciones de curcumina, en donde la figura: 3A muestra los trofozoítos con morfología normal después de exposición a etanol utilizado como control negativo; 3B muestra las células expuestas a albendazol como control positivo; 3C las células expuestas a la curcumina a una concentración de 0.3 μM; 3D células expuestas a la curcumina a una concentración de 30 μM; y 3 E células expuestas a la curcumina a una concentración de 100 μM. Obsérvese la formación de vacuolas gigantes indicadas con flecha en las imágenes de las figuras 3C a 3E. Las figuras 4A a 4D son imágenes electrónicas de la apoptosis detectada mediante el método TÚNEL de trofozoítos de G. lamblia que han sido expuestos a la curcumina, en donde las figuras muestran corresponden: (4A) al control negativo; (4B) a la curcumina a una concentración de 0.3 μM durante 6 horas; y (4C) y (4D) a la misma concentración de curcumina durante 24 horas. Nótese en la figura 4C la presencia de estructuras residuales (núcleos y citoesqueletos) de un trofozoíto de G. lamblia que ha explotado.
Las figuras 5A a 5D son imágenes electrónicas representativas de la detección de la translocación de fosfatidilserína como indicadora de un evento apoptótico inducido por la curcumina, en donde las figuras muestran las siguientes imágenes: (5A) trofozoítos de G. lamblia expuestos a etanol como grupo de control negativo, en la que las células son completamente viables; (5B) células expuestas a 10 μM de metronidazol; (5C) células expuestas a 0.3 μM de curcumina; y (5D) células expuestas a curcumina en una concentración de 100 μM durante 72 horas. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA MODALIDAD PREFERTOA
DE LA INVENCIÓN
Como se ha mencionado antes, existe una gran variedad de tratamientos para la giardiosis, a los cuales en la mayoría de los casos el paciente no se apega por los efectos colaterales que desencadenan y además de que gran parte de la población de áreas marginadas no tiene medios económicos para iniciar el tratamiento, lo que provoca que los tratamientos queden inconclusos y se propague la giardiosis. Por este motivo, es muy importante explorar nuevas alternativas de tratamiento más inocuas y tolerables para el paciente a fin de contrarrestar el impacto de la giardiosis en la salud humana.
La cúrcuma {Cúrcuma longa lynri) es una planta perenne, de hojas largas lanceoladas de color verde claro con una altura aproximada de 50 centímetros y posee flores amarillas o violáceas. El rizoma primario es oval y oblongo, mientras que el secundario es corto y unido a un tubérculo grande de 2 a 5 cm de largo y 1 a 1.8 cm de grueso, es amarillo o amarillo oscuro. El rizoma de la cúrcuma se deseca y se pulveriza, se usa en todo el mundo como condimento. Es el principal ingrediente del curry y de la mostaza preparada, en los cuales confiere el color amarillo.
La cúrcuma contiene aproximadamente entre el 4% y 10% de curcumina y su fórmula química es C21H20O6 que corresponde a un compuesto difenólico. La curcumina utilizada para los experimentos del presente trabajo corresponde a un compuesto producido por Sigma Chemical Co. C 1396 (EC No. 207-280-5), que es un extracto de curcuminoides donde el 65% es curcumina.
La curcumina es estable en el estómago y en el intestino delgado, por lo que su elevada lipofilia le permite una rápida absorción gastrointestinal por difusión pasiva, tras su administración se metaboliza y se excreta principalmente por bilis y heces y también por orina. De acuerdo con lo publicado por Ramírez-Tortosa y cois., 2000, en estudios realizados en ratas se ha encontrado que el 35 % de las dosis orales entre 2.5 y 1000 mg/kg, se excreta por heces, (Holder et al., 1978, Ravindranath y Chandrasekhara, 1982), absorbiéndose el 65%, tras la administración se biotransforma primero en dihidrocurcumina y tetrahidrocurcumina, y estos compuestos son convertidos posteriormente a conjugados monoglucurónicos (Pan et al., 1999). Los principales metabolitos de la curcumina in vivo son los glucurónidos de curcumina, de dihidrocurcumina y tetrahidrocurcumina y se excretan por vías biliares entre el 50 y 60% en alrededor de 5 horas (Heath et al., 2003). La cúrcuma contiene además derivados naturales de la curcumina denominados curcuminoides que se han identificado por métodos calorimétricos y de cromatografía de capa fina. Farmacológicamente, se ha demostrado que la curcumina posee actividad antiinflamatoria en modelos animales. Esta actividad la ejerce por un mecanismo que involucra la supresión de la expresión del factor nuclear kappa B, el cual se encuentra previo a los sitios que codifican para la expresión de citocinas proinflamatorias (IL-I, IL-6 y TNF α) por lo que en consecuencia disminuye la expresión de estas citocinas (Miguel y cois 2002, Kaltscmidt y cois. 2002; Chan Marión y cois. 1998).
Existen numerosos artículos acerca de la gran variedad de actividades farmacológicas de curcumina, como son la de antimicrobiano, protector del sistema respiratorio tanto alto como bajo, antiasmático, potente anti-infiamatorio, actividad inmunomodularora, hipolipemiante y antioxidante (Mesa y cois., 2000). Recientemente, se le ha documentado actividad antiparasitaria (Araujo y León en 2001). El efecto anti-parasitario de la curcumina se ha descrito contra Leishmania major (Rasmunsen y cois. 2000; Koide y cois., 2001; Salen y cois., 2002)
La curcumina ha demostrado también la actividad antiparasitaria contra L. mayor, L infantum y L. trópica con un mejor efecto in vitro en comparación con pentamidina, que es el fármaco de elección contra este parásito (Salen y cois., 2002). Una concentración de 15 μM de curcumina detuvo el crecimiento de las cepas de Leishmania a 72 horas in vitro. La curcumina en este parásito inhibe la síntesis de ADN y en consecuencia interrumpe el ciclo celular, sin embargo, el mecanismo por el cual ejerce este efecto es aún desconocido (Saleheen y cois., 2002).
La curcumina en concentración de 50 μM durante 24 horas paró el crecimiento y viabilidad de L. mayor in vitro hasta en un 100%. Utilizando una concentración de 100 μM de curcumina fue efectiva para disminuir a un 100% la viabilidad de cultivos de Leishmania en concentraciones de 0.25 x 106 - 2.0 x 106 células/ml. Aparentemente, la propiedad antioxidante de la curcumina no esta involucrada en el mecanismo de acción leishmanicida (Koide y cois., 2001).
Respecto a la toxicidad de la curcumina, ésta no es considerada tóxica aun en dosis altas (Soai y Kuffan, 1992). En humano han sido probados hasta 8 gr/día sin efectos tóxicos (Cheng y cois., 2001), al igual que del 5 al 10% de la dieta en roedores (Sambaiah y cois., 1982), mientras que otro inhibidor de tumores, igual o menos efectivo (ditiol-tiona), fue tóxico a 0.05% de la dieta (Rao y cois., 1995). La mayor parte (90%) de la curcumina suministrada por vía oral es metabolizada en el tracto tanto en humanos como ratones (Ireson y cois., 2002).
Diversos estudios in vivo en ratones indican que la curcumina no es genotóxica (Vijayalaxmi y cois., 1980; Wargovich y cois., 1985; Azuine y cois., 1992; Li y cois., 1998; Murria y Pizzorno, 1999; Shukla y cois., 2003). En algunos casos, la curcumina revierte el daño de agentes genotóxicos conocidos, comportándose como anti- genotóxica con la prueba de micronúcleos (Azuine y cois., 1992b; Abraham y cois., 1996; Li y cois., 1998), en Salmonella tiphimurium (Azuine y cois., 1992b) y en análisis de cromosomas se ha documentado como no clastogénica (Mukhopadhyay y cois., 1998; Murria y Pizzorno, 1999). Un estudio en humano (Hastak y cois., 1997) demostró que las frecuencias de micronúcleos no se modifican en sujetos tratados con curcumina.
Por otra parte, la curcumina protegió a individuos expuestos a benzo[a]pireno disminuyendo la frecuencia de micronúcleos en células de médula ósea y en leucocitos en pacientes con fibrosis submucosa. En un estudio posterior, el potencial antigenotóxico de curcumina se evaluó con la prueba mutación reversa de Salmonella typhimurium y con análisis de cromosomas de células de médula ósea de ratones inhibiendo el daño por ciclofosfamida y benzo[a]pireno (Shulka y cois., 2003).
Como se refiere aquí antes, existen ya una gran variedad de fármacos encaminados al tratamiento de enfermedades parasitarias, entre ellas la giardiosis, sin embargo, sus efectos colaterales fuerzan en la mayoría de los casos a que el paciente desista de su tratamiento. Igualmente, se ha desarrollado una buena cantidad de estudios que han comprobado las bondades de la curcumina aplicada en tratamientos de enfermedades parasitarias provocadas por otros parásitos distintos de la Giardia lamblia, sin embargo, hasta hoy ninguno de ellos ha sido probado específicamente al tratamiento terapéutico de la giardiosis con los resultados favorables que se describirán más adelante.
Habida cuenta de lo anterior, se procedió a evaluar el efecto citotóxico de la curcumina a diferentes concentraciones y a diferentes tiempos de exposición sobre trofozoítos de G. lamblia. Para ello, se desarrollaron los siguientes ensayos:
1. Evaluación del efecto de la curcumina a diferentes concentraciones sobre la curva de crecimiento de G. lamblia, en diferentes tiempos de exposición.
2. Evaluación de la viabilidad de los trofozoítos de G. lamblia tratados con curcumina, a diferentes concentraciones y tiempos de exposición. 3. Estudio del efecto de la curcumina sobre la adhesión del parásito.
4. Análisis de los cambios sobre la morfología de los trofozoítos de G. lamblia expuestos a curcumina.
5. Comparación del efecto de albendazol contra el efecto de curcumina sobre los trofozoítos de G. lamblia.
6. Evaluación de la capacidad de la curcumina en la inducción de apoptosis en trofozoítos de G. lamblia.
ENSAYOS: Se cultivaron trofozoítos de G. lamblia de la cepa Pórtland 1 (Pl) en medio TYI-
S-33 a 37° C complementado con 0.5 mg/ml de bilis bovina y 10% de suero bovino inactivado (Gordts y cois., 1985; y Korman y cois., 1990). Para el mantenimiento de la cepa se realizaron subcultivos cada tercer día.
Todos los experimentos se realizaron bajo las siguientes condiciones: • Tubos de plástico de 13 x 30 mm con 8.5 mi de medio TYI-S-33, recién preparado.
• El inoculo inicial fue de 5 x 104 parásitos/ml proveniente de un cultivo en fase exponencial de crecimiento.
• Para la cuenta de parásitos, se colocaron los tubos en baño de agua-hielo durante 30 minutos con lo cual se desprenden los trofozoítos y su conteo se realizó utilizando la cámara de Neubauer.
• Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
EVALUACIÓN DEL EFECTO DE CURCUMINA SOBRE LA MULTIPLICACIÓN DE TROFOZOÍTOS DE G. LAMBLIA
Curva de Crecimiento.
Para obtener la curva de crecimiento, los trofozoítos de G. lamblia se inocularon en medio TYI-S-33 e incubaron a 37° C y cada 24 horas se contó el número de parásitos. La multiplicación de los parásitos se cuantificó durante 6 días para construir una gráfica del tiempo contra el logaritmo del número de parásitos por mililitro.
Curva de crecimiento en presencia de curcumina.
Los experimentos para estudiar el efecto de la curcumina se realizaron por triplicado, la curcumina disuelta en etanol se adicionó para ajustaría a las concentraciones de 0.3, 3, 30 y 100 μM (0.1, 1.1, 11.0 y 38.8 μg/ml, respectivamente) de medio utilizando un volumen máximo de 226 μl de la solución stock de curcumina. Para el grupo de control se adicionó el etanol que sirvió como vehículo en un volumen de 226 μl, además se dejaron en cada experimento dos tubos de control intactos.
Curva de la multiplicación de trofozoítos de G. lamblia
Se inocularon inicialmente 150,000 trofozoítos de G. lamblia por mi, se realizaron lecturas cada 24 horas durante 170 horas con lo que estructuró la curva de crecimiento normal. Se alcanzó un pico máximo de 2'169,000 trofozoítos por mi. a las 96 horas de incubación.
Para los experimentos con curcumina el curso temporal de crecimiento alcanzó un pico máximo de 1 '200,000 parásitos por mi (p/ml) a las 72 horas. Por lo tanto, los tiempos óptimos para el análisis del efecto de la curcumina quedaron definidos a las 24, 48 y 72 horas posteriores al inoculo del parásito y a la administración de curcumina en los tubos de cultivo. El crecimiento de la G. lamblia disminuyó en todas las concentraciones de curcumina utilizadas y en todos los tiempos de exposición, como a continuación se indica:
A las 24 horas, la concentración de 0.3 μM provocó una disminución del crecimiento de 164,000 p/ml contra 240,000 p/ml del control (p< 0.03). La concentración de 3 μM provocó mas disminución en el crecimiento de 136, 150 p/ml contra 240,000 p/ml del control (p<0.01). La concentración de 30 μM causó una disminución más evidente de 108,000 p/ml contra 240,000 p/ml del control (p<0.005). Finalmente, la concentración de 100 μM produjo la mayor disminución de crecimiento de 102,500 p/ml contra 240,000 p/ml del control (p<0.004). A las 48 horas, la concentración de 0.3 μM provocó una disminución de 420,000 p/ml contra 875,000 p/ml del control (p<0.001). La concentración de 3 μM causó una disminución fuerte en el crecimiento de Giardia de 145,250 p/ml contra 875,000 del control (p<0,001). En la concentración de 30 μM la disminución de crecimiento fue aún más severa 125,500 p/ml contra 875,000 p/ml del control (p<0.001). Finalmente, la concentración de 100 μM no permitió más crecimiento de Giardia, 41,000 p/ml contra 875,000 p/ml del control (pθ.001).
A las 72 horas, la concentración de 0.3 μM presentó una disminución del crecimiento de 565,000 p/ml contra 1 '20O5OOO p/ml del control (ρ<0.002). Con la concentración de 3 μM se observó una disminución severa del crecimiento 61,750 p/ml contra l '200,000 p/ml del control (p<0.001). La concentración de 30 μM redujo aún más el crecimiento a 31,750 p/ml contra 1 '200,0OO p/ml del control (p<0.001); y finalmente la concentración de 100 μM abatió el crecimiento de 30,500 p/ml contra 1 '200,000 p/ml del control (p<0.001).
El resumen de los datos anteriores se contiene en la siguiente Tabla 1
Crecimiento de Giardia lamblia en presencia de curcumina
Figure imgf000013_0001
La representación gráfica de estos mismos resultados se puede apreciar en la figura 1, que incluye además la comparación de los mismos con el efecto del fármaco albendazol a una concentración de 0.3 μM, observándose que de manera similar se inhibió el crecimiento de Giardia en todos los tiempos de exposición a la concentración indicada.
Curva de crecimiento en presencia de albendazol.
Adicionalmente, para evaluar el efecto de anti-giardiósicos convencionales, se utilizó 0.3 μM (0.1 μg/ml) de albendazol. Para estos experimentos, el fármaco se adicionó desde el primer inoculo del parásito y se valoró el efecto a las 24, 48 y 72 horas de incubación. En cuanto al porcentaje de inhibición, se observó que las concentraciones de 30 y 100 μM no tuvieron diferencias con respecto a la concentración utilizada para albendazol a las 48 y 72 horas, inhibiéndose la multiplicación de los trofozoítos en más del 80 %. Estos datos están representados en la figura 1.
EVALUACIÓN DE VIABILIDAD DE LOS TROFOZOÍTOS DE G. LAMBLIA EN PRESENCIA DE CURCUMINA.
Para determinar la viabilidad se realizaron incubaciones de 150,000 trofozoítos de G. lamblia durante 24, 48 y 72 horas de exposición con 0.3, 30 y 100 μM de curcumina. Al final de cada tiempo de exposición, se colocaron los tubos sobre agua- hielo por espacio de 30 minutos. Posteriormente, se centrifugaron a 3,000 rpm durante 10 minutos, se decantó el sobrenadante y se agregó medio de cultivo fresco (sin curcumina) para incubarse durante 48 horas adicionales, al cabo del cual se realizó el conteo en cámara de Neubauer y con ello determinar el número de trofozoítos viables después de su exposición con curcumina. Con los datos anteriores se determinó el porcentaje de viabilidad tomando como 100% al control con etanol.
Curva de viabilidad. Se encontró que las concentraciones de 30 y 100 μM de curcumina inhibieron la multiplicación de los trofozoítos en forma irreversible, mientras que a la concentración de 0.3 μM, el recuento de parásitos decaía en los tiempos estudiados y se mantuvo una cuenta baja.
El número de trofozoítos que permanecieron viables después de la incubación con curcumina durante 24, 48 y 72 horas, y su posterior incubación con medio de cultivo fresco durante otras 48 horas, con el control alcanzó 1 '657,500 trofozoítos a las 24 horas, 1 '420,500 a las 48 horas y 945,250 a las 72 horas. Con la concentración de 0.3 μM de curcumina se contabilizaron 704,250, 482,250 y 252,000 trofozoítos a las 24, 48 y 72 horas respectivamente. Y con la concentración de 30 μM de curcumina únicamente hubo crecimiento a las 24 horas con 3,750 trofozoítos, en tanto que a las 48 y 72 horas no se presentó crecimiento. Finalmente, se perdió la viabilidad de los trofozoítos con la concentración de 100 μM de curcumina en todos los tiempos de incubación. Estos datos se muestran en la figura 2.
EFECTO DE CURCUMINA SOBRE LA ADHESIÓN DE TROFOZOÍTOS DE GIARDIA LAMBLIA
Para realizar este experimento se inocularon tubos con 150,000 trofozoítos y se incubaron durante 24, 48 y 72 horas posteriores a la exposición de curcumina con concentraciones de 0.3, 30 y 100 μM para cada uno de los tiempos. Cada 24 horas se realizó el conteo del número de parásitos antes de colocar los tubos en baño de hielo a 4° C. El resultado fue la población de parásitos no adheridos o libres en el medio de cultivo. Posteriormente, los mismos tubos se colocaron en baño de hielo a 4° C durante 30 minutos para obtener la población total de trofozoítos (tanto parásitos libres como adheridos). La diferencia entre la población total y la libre nos dio el número de parásitos que se encontraron adheridos en cada uno de los tiempos de incubación y concentración de curcumina.
Curva de adhesión. Se encontró que con la concentración de 0.3 μM de curcumina en todos los tiempos se observó un aumento en la adhesión de los trofozoítos comparado con el control. La pérdida de la adhesión ñie muy importante con las concentraciones de 30 y 100 μM como se puede observar en la Tabla 2. Siendo éste un efecto dosis/respuesta, ya que a mayores concentraciones de curcumina existió mayor pérdida de la adhesión. En las concentraciones de 30 y 100 μM fue más evidente la falta de movilidad de los parásitos, aumentando el tamaño de los mismos.
Tabla 2 Porcentaje de adhesión
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ANÁLISIS DE LOS CAMBIOS SOBRE LA MORFOLOGÍA DE LOS TROFOZOÍTOS DE G. LAMBLIA EXPUESTOS A LA CURCUMINA.
Para la evaluación microscópica de los parásitos, todos los tubos se colocaron en baño de hielo a 4° C durante 30 minutos, con esto los trofozoítos se desprendieron agitando suavemente los tubos en 5 ocasiones; una alícuota de 20 μl se mezcló con un volumen igual de azul de tripano (4 mg/ml) y se observó en un microscopio invertido Olympus 1X50, con el objetivo de 45 X. Las imágenes se digitalizaron con una videocámara Hitachi modelo KP-D50 color digital, utilizándose para su análisis posterior el programa de análisis de imágenes Image-Pro de Media Cybernetics. A cada una de las muestras se le valoraron los cambios en la morfología del trofozoíto. Para la adquisición de imágenes se mezclaron 500 μl del cultivo con 500 μl de formaldehído a una concentración final del 3%.
Se observó desde las 24 horas, y en las diferentes concentraciones, que la curcumina provocó alteraciones en la morfología del parásito, específicamente se formaron irregularidades en su superficie, con presencia de abultamientos (vesículas distendidas). A partir de las 48 horas se definió el efecto como una hinchazón y redondeamiento del trofozoito, siendo la pérdida de la motilidad más severa en las concentraciones más altas de curcumina. En la concentración de 100 μM se observaron fuertes abultamientos de algunas regiones del parásito, con un aparente crecimiento de una vesícula previa abarcando toda la superficie del parásito. El control positivo con albendazol mostró cambios con pérdida total de la forma del parásito, pero sin la presencia de vesículas. El control de vehículo expuesto a etanol no mostró cambios morfológicos durante los diferentes tiempos de incubación (figuras 3A a 3E).
APOPTOSIS EN TROFOZOÍTOS DE G. LAMBLIA EXPUESTOS A CURCUMINA.
Para la detección de apoptosis se utilizó la prueba de fragmentación de ADN, TdT-FragEL (Fragment End Labeling de Oncogene Research Products) para el mareaje de la fragmentación de ADN en núcleos apoptóticos en los trofozoítos de Giardia. Esta técnica consta de los siguientes pasos: mareaje de los fragmentos de ADN, terminación y detección del ADN.
Los trofozoítos se recolectan de los tubos por centrifugación a 3000 rpm y se colocan sobre un portaobjetos tratado con polilisina y se dejan secar al aire, se fijan con paraformaldehido al 4% en PBS durante 30 minutos y se lavan con PBS para eliminar el exceso de fijador. Luego se incuban los trofozoítos durante 10 a 30 minutos con el buffer de equilibrio a temperatura ambiente. Enseguida, se preparó la mezcla de reacción de mareaje TdT (mezcla de deoxinucleótidos marcados y no marcados a una proporción óptima para mareaje de fragmentos de ADN con TdT), y 57 μl de la mezcla de reacción de mareaje TdT y 3 μl de la enzima TdT (transferasa deoxinucleotidil terminal) se incuban a 37° C durante una hora y media. Se adicionaron 100 μl de buffer (EDTA 0.5M, pH 8) durante 5 minutos y se realizó un lavado con TBS. Posteriormente, se adicionaron 100 μl de buffer de bloqueo que contiene 2 μl del conjugado 50X con 98 μl de buffer de bloqueo (BSA al 4% en PBS). Inmediatamente después se agregaron 100 μl de conjugado diluido Ix y se incubó durante 30 minutos.
Posteriormente se lavaron las células con TBS IX y se agregó la solución de revelado con diaminobenzidina (DAB) y se detuvo la reacción con agua destilada.
Los núcleos de trofozoítos apoptóticos se marcaron con nucleótidos biotinilados que reaccionaron con el conjugado de streptavidina/peroxidasa que luego reaccionó con el H2O2 en presencia de DAB como cromógeno, desarrollando coloración café marrón. Finalmente se hicieron registros fotográficos utilizando un microscopio invertido (Olympus 1X70) equipado con cámara digital de alta resolución y se utilizó el programa de análisis de imágenes Image-Pro plus (Media Cybernetics).
Se detectaron cambios sugerentes de apoptosis con un patrón dosis/respuesta, en las concentraciones mayores se observó más del 90% de los núcleos de los trofozoítos con marca sugestiva de apoptosis con el método de detección de fragmentación de ADN (TUNNEL).
La concentración de 3 μM de curcumina provocó a las 6 horas postexposición la aparición de aproximadamente un 30% de parásitos con núcleos apoptóticos. Esta misma concentración a las 24 horas demostró que cerca del 100% de los protozoitos tuvieron núcleos apoptóticos. En algunas preparaciones se observaron trofozoítos que aparentemente habían explotado ya que sólo había núcleos con restos del citoesqueleto aparentemente sin restos de membranas por microscopía óptica (figuras 4A a 4D).
Detección de fosfatidilserina por el método de Annexina V-Cy3) Los cambios celulares involucrados en el proceso de apoptosis incluyen la pérdida de la asimetría de lípidos durante las etapas tempranas de apoptosis. En las células vivas, la fosfatidilserina es transportada a la capa interna de la membrana celular por la enzima trasnlocasa aminofosfolípido dependiente de Mg-ATP. Durante la apoptosis, la fosfatidilserina es transportada a la capa externa de membrana citoplásmica y queda disponible para que la anexina (proteína que se une a la fosfatidilserina en presencia de Ca) se una y quede marcada con un fluorocromo (Cy3.18) que fiouresce en rojo.
El presente estudio se realizó con el fin de confirmar la inducción de apoptosis y además detectar la posible necrosis neuronal producida por la exposición de Giardia a curcumina, para lo cual se realizó el estudio utilizando la prueba de detección de apoptosis Annexin V-CY3 (Sigma-Aldrich). Previamente, se diluyó el buffer de unión en agua desionizada. Se diluyeron 2.32 mg de 6-carboxifluoresceina diacetato (6- CFDA) en 0.1 mi de acetona. La solución de doble mareaje se preparó con 1 μg/ml de anexina V Cy3.18 (AnnCy3) y 6-CFDA 500μM diluido en buffer de unión. Las células en cada pocilio se lavaron con el buffer de unión tres veces. Se agregó solución de doble mareaje (AnnCy3+6-CFDA) sobre las células y se incubaron durante 10 minutos en la oscuridad. Después se realizaron 5 lavados con el buffer de unión para retirar el exceso de colorante. La AnnCy3 se observa de color rojo y la 6- CFDA se observa de color verde. Se observaron los mareajes inmunofluorescentes en células viables (marcadas con 6-CFDA, verde), apoptóticas tempranas (marcadas con AnnCy3 y 6-CFDA, verde y rojo) y necróticas (marcadas con AnnCy3, rojo).
Finalmente, se hicieron registros fotográficos utilizando un microscopio invertido (Olympus 1X70) equipado con sistema de fluorescencia y con cámara digital de alta resolución. Para la captura se utilizó el programa de análisis de imágenes Image- Proplus (Media Cybernetics).
Los cuerpos celulares de giardias expuestas al vehiculo (etanol) se observaron sin cambios aparentes, ya que fluorescen en color verde manzana típico de las células viables. Las giardias expuestas a metronidazol se mostraron en franca necrosis que fluorescen en color rojo con restos del citoplasma dispersos alrededor de las células.
Mientras que la concentración de 0.3 μM a las 72 horas post-exposición indujo cambios tipo apoptosis como células que fluorescen tanto en rojo-naranja y verde simultáneamente. Cuando las giardias se observaron en la concentración de 100 μM a las 72 horas mostraron una coloración más rojiza. En ambos casos es notoria la pérdida de la morfología normal (figuras 5 A a 5D).
Análisis Estadístico
Se utilizaron las pruebas de T de students para identificar diferencias estadísticas significativas entre grupos experimentales y como preuba pos-hoc se aplicó la prueba de Kruskal-Wallis.
CONCLUSIONES.
En estudios realizados in vitro la curcumina ha mostrado actividad antiparasitaria contra Leishmania spp, Tripanosoma brucei y Plasmodium falciparum. En la presente invención, se ha analizado la actividad cototóxica de la curcumina in vitro contra trafozoítos de G. lamblia con excelentes resultados.
En lo referente al crecimiento de los trofozoitos encontramos que la curcumina provocó una disminución estadísticamente significativa desde la concentración de 0.3 μM a las 24 horas post exposición. Dicha diferencia se incrementó evidentemente en las concentraciones más altas (3, 30 y 100 μM), concordando esto con los tiempos y concentraciones reportados para el efecto in vitro de la curcumina contra Leishmania spp. (Koide y cols.2002 y Salen y cois 2002). Por ende, esta nueva alternativa terapéutica podría ser mas aceptada y mejor tolerada por los individuos infectados que han abandonado el tratamiento con albendazol u otros antiparasitarios por sus efectos colaterales.
Asimismo, el porcentaje de inhibición del crecimiento que se ha encontrado en otros parásitos (por ejemplo, Leishmanias y tripanosomas) tratados con curcumina fue comparable con los que encontramos para el caso del G. lamblia, ya que se encontró una inhibición que alcanzó desde el 80% hasta el 100% en la concentración del lOOμM, por lo que la actividad in vitro es similar en estos protozoarios.
Para G. lamblia es vital la adherencia de los trofozoítos al epitelio intestinal, si careciera de esta capacidad serían arrastrados por el peristaltismo y el tránsito del contenido intestinal, por lo tanto es un aspecto importante la capacidad del parásito para establecer la infección. Debido a ello, se evaluó el efecto de la curcumina sobre este evento encontrándose que el efecto de la curcumina provocó una pérdida de la adhesión de los trofozoítos in vitro es más del 95% con las concentraciones de 30 y 100 μM.
La medición de la viabilidad de los parásitos a un compuesto citotóxico proporciona información sobre la reversibilidad del efecto citotóxico de dicho compuesto, ya que una vez expuestos por periodos diferentes en ensayos independientes, todos son incubados con medio fresco por 48 horas más. En el presente caso, el efecto de la curcumina sobre la viabilidad del parásito fue claramente evidente en los parásitos expuestos a la concentración de 30 μM a partir de las 48 horas, en donde el efecto fue irreversible al ya no recuperarse los trofozoítos. El efecto de la curcumina sobre la viabilidad del parásito fue aún más drástico al analizar el efecto de la concentración de 100 μM ya que desde las 24 horas de exposición los parásitos ya no recuperaron su viabilidad. Este efecto es comparable al de otros compuestos antigiardiósicos, como albendazol y metronidazol, que provocan una pérdida de la viabilidad a concentraciones similares solo que éstos fármacos presentan problemas de tolerancia del paciente al tratamiento.
Las alteraciones morfológicas mostradas en la estructura de la G. lamblia expuesta a la curcumina fueron muy drásticas dentro de las primeras 24 horas con las concentraciones de 30 y 100 μM. Los trofozoítos presentaron deformaciones en la membrana con abultamientos tan prominentes que provocaron el redondeamiento y posteriormente la destrucción del parásito, encontrando formas esféricas y restos celulares a las 48 y 72 horas posteriores a la exposición de la curcumina.
Los resultados anteriores hacen pensar que existe un blanco primario para estos compuestos que altera la capacidad de la membrana celular para regular la osmolaridad del trofozoito. Si esto es cierto, entonces el mecanismo se podría analizar estudiando las corrientes iónicas en la membrana de la giardia.
El efecto citotóxico de los compuestos con actividad antigiardiosica se puede definir entre los que causan apoptosis y los que causan necrosis. Para abordar este aspecto del daño citotóxico utilizamos dos métodos, el de detección de fragmentación de DNA (TUNNEL), que se fundamenta en la adición enzimática de nucléotidos marcados con biotina, que posteriormente son identificados por su unión con estreptavidina-peroxidasa y se revela con DAB. Este método nos permitió identificar que la concentración de 3 μM a 6 horas de exposición indujo fragmentación de ADN en aproximadamente 30% de los parásitos, mientras que a las 24 horas el 100% de los parásitos presentaba fragmentación de DNA.
El otro método empleado para corroborar el fenómeno de apoptosis fue el de Anexina CY3 que permite distinguir células apoptóticas y células necróticas. El fundamento de este método se basa en la asimetría de los fosfolípidos que constituyen la membrana celular. En condiciones normales la fosfatidilserina se encuentra en la cara interna de la membrana, mientras que cuando la célula sufre cambios apoptóticos dicho fosfolípido se presenta en la cara externa. La anexina pertenece a un grupo de proteínas que se unen a fosfolípidos, en particular la anexina V reconoce a la fosfotidilserina y se une solo cuando se presenta en la cara externa de células apoptóticas. La anexina esta conjugada a Cy3.18 que es un compuesto fluorescente que al excitarlo fluoresce en rojo y además la preparación contiene diacetato de 6- carboxifluoresceina que es marcador de células viables y fluoresce en verde. De tal manera que las células apoptóticas exhiben fluorescencia en rojo y verde simultáneamente, las células necróticas solo fluorescen en rojo y las células sanas fluorescen en verde. En los experimentos realizados las giardias expuestas desde 0.3 μM hasta 100 μM presentaron células apoptóticas.
Métodos de preparación de un fármaco para el tratamiento de giardiosis
EJEMPLO 1
(Formulación en suspensión - Uso pediátrico) a) Se prepara un extracto alcohólico (etanol) de curcumina que contenga aproximadamente 7.3 mg/ml a partir de cúrcuma comercial; b) Se separan del extracto preparado, 20 mi y se agregan a 10 g de almidón de trigo o de maíz y esta mezcla se calienta en horno a aproximadamente 60° C hasta que se evapora totalmente y queda solo el almidón impregnado de curcumina; c) Se colocan en agitación 0.5 g de metilcelulosa, 0.09 g de metilparabeno,
0.01 g de propilparabeno, 60 mi de agua purificada estéril y 2 mi de propilenglicol; y d) Una vez disueltos completamente los componentes de la etapa anterior, se mezclan poco a poco (gentilmente) y con agitación, la mezcla resultante de la etapa c) y la curcumina impregnada en almidón hasta obtener una suspensión sin grumos.
A la suspensión obtenida se le puede agregar jarabe de maíz con saborizantes hasta completar 100 mi.
La suspensión producida se deja reposar durante 1 semana a 4o C para valorar la velocidad de sedimentación.
Un método para tratamiento de giardiosis indicado para un paciente pediátrico con la suspensión anterior consiste en administrar una dosis de 1.46 mg/Kg de peso por tres veces al día hasta alcanzar una dosis total diaria de 22.0 mg, durante 7 días.
EJEMPLO 2
(Formulación en cápsulas de gelatina - Uso pediátrico = 11 mg de curcumina) a) Se prepara un extracto alcohólico (etanol) de curcumina que contenga aproximadamente 7.3 mg/ml a partir de cúrcuma comercial; b) Se separa del extracto preparado 200 mi y se agregan a 100 g de almidón de trigo o de maíz y esta mezcla se calienta en horno a aproximadamente
60° C hasta que se evapore totalmente y quede solo el almidón impregnado de curcumina; y c) Se agrega 0.1 g de ácido cítrico y 0.1 g de benzoato de sodio como conservadores y estabilizantes. Se llenan cápsulas de gelatina con 750 mg de la preparación obtenida.
Un método para tratamiento de giardiosis indicado para un paciente pediátrico que lo requiera consiste en administrar una dosis de 11 mg de la preparación de curcumina en cápsulas tres veces al día durante 7 días. El método para tratamiento de giardiosis para un paciente adulto consiste en administrar una dosis de 22 mg de la preparación de curcumina en cápsulas cuatro veces al día durante 7 días.
Aunque esta invención ha sido descrita en el contexto de su modalidad preferida, para los especialistas en la materia será evidente que el alcance de la presente invención se extiende más allá de la modalidad específicamente descrita a otras modalidades alternas y/o usos de la invención que sean obvias y derivables de la misma. Además, aunque la invención se ha mostrado y descrito en detalle con apego a un modo de realización ejemplificativa, algunas otras modificaciones o cambios serán claramente obvios para especialistas en particular con base en la descripción que antecede. Por consiguiente, se estima que pueden hacerse varias combinaciones de las características específicas y aspectos de las modalidades descritas que caerían indiscutiblemente dentro del alcance de la invención.
Habida cuenta de lo anterior, se pretende que el alcance de la invención no deberá estar limitado por las modalidades particularmente descritas, sino que dicho alcance deberá estar definido por una lectura razonable de las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un método para preparar un fármaco en suspensión de uso pediátrico a base de curcumina, que comprende: a) preparar un extracto alcohólico (etanol) de curcumina que contenga aproximadamente 7.3 mg/ml a partir de cúrcuma comercial; b) separar del extracto preparado 20 mi y agregarlos a 10 g de almidón de trigo o de maíz y calentar esta mezcla en horno a aproximadamente 60° C hasta que se evapore totalmente y quede solo el almidón impregnado de curcumina; c) colocar en agitación 0.5 g de metilcelulosa, 0.09 g de metilparabeno, 0.01 g de propilparabeno, 60 mi de agua purificada estéril y 2 mi de propilenglicol; d) una vez disueltos completamente los componentes de la etapa anterior, mezclar poco a poco (gentilmente) y con agitación la mezcla resultante de la etapa c) y la curcumina impregnada en almidón hasta obtener una suspensión sin grumos.
2. El método de la reivindicación 1, en el que a la suspensión obtenida se le agrega un saborizante en jarabe de maíz hasta completar 100 mi.
3. Un método para preparar un fármaco en cápsulas de gelatina con 11 mg o 22 mg de curcumina para uso pediátrico o para adulto, respectivamente, que comprende: a) preparar un extracto alcohólico (etanol) de curcumina que contenga aproximadamente 7.3 mg/ml a partir de cúrcuma comercial; b) separar del extracto preparado 200 mi (pediátrico) o 400 mi (adulto) y agregarlos a 100 g de almidón de trigo o de maíz y calentar en horno esta mezcla a aproximadamente 60° C hasta que se evapore totalmente y quede solo el almidón impregnado de curcumina; c) agregar 0.1 g de ácido cítrico y 0.1 g de benzoato de sodio como conservadores y estabilizantes; y d) en que se llenan cápsulas de gelatina con 750 mg de la preparación obtenida.
5. Un método para tratamiento de un paciente que padece una infección parasitaria provocada por la giardia lamblia, el cual consiste en administrar al paciente una cantidad farmacológicamente efectiva de una preparación que comprende curcumina para inducir efectos citotóxicos en la giardia lamblia.
6. El método de la reivindicación 5, en el que a un paciente pediátrico se le administra una dosis en suspensión de 1.46 mg/ICg de peso por tres veces al día hasta alcanzar una dosis total diaria de 22.0 mg, durante 7 días.
7. El método de la reivindicación 5, en el que a un paciente pediátrico que lo requiera se le administra una dosis de 11 mg en cápsulas tres veces al día durante 7 días.
8. El método de la reivindicación 5, en el que a un paciente adulto que lo requiera se le administra una dosis de 22 mg en cápsulas cuatro veces al día durante 7 días.
9. El método de la reivindicación anterior en el que el fármaco esta preparado en forma de suspensión, cápsulas o supositorios. 10. Un fármaco en suspensión para el tratamiento de una infección parasitaria provocada por giardia lamblia, que comprende: a) un extracto de curcumina en concentración desde 0.3 μM hasta 100 μM; y b) una solución preparada a base de 0.5 g de metilcelulosa, 0.09 g de metilparabeno, 0.01 g de propilparabeno, 60 mi de agua purificada estéril y 2 mi de propilenglicol.
11 Un fármaco en cápsulas para el tratamiento de una infección parasitaria provocada por giardia lamblia, que comprende: a) un extracto de curcumina en concentración desde 0.3 μM hasta 100 μM ; y b) 0.1 g de ácido cítrico y 0, 1 g de benzoato de sodio como conservadores y estabilizantes.
12. Una formulación para tratar una infección parasitaria provocada por giardia lamblia que comprende una cantidad efectiva de un derivado de cúrcuma
13. Un método para tratar una infección parasitaria por giardia lamblia que comprende administrar a un paciente que así lo requiera una cantidad efectiva de un fármaco en suspensión preparado a base de curcumina.
14. Un método para tratar una infección parasitaria provocada por giardia lamblia que comprende administrar a un paciente que así lo requiera una cantidad efectiva de un fármaco en cápsulas preparado a base de curcumina.
15. Un método para tratar una infección parasitaria provocada por giardia lamblia que comprende administrar a un paciente que así lo requiera una cantidad efectiva de un fármaco derivado de la planta cúrcuma.
16. El método de la reivindicación 15, en el que el fármaco derivado de la planta cúrcuma es curcumina.
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