BRPI0618847A2 - novos adjuvantes com base em conjugados de bisaciloxipropilcisteìna e derivados e seus usos em composições farmacêuticas - Google Patents

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Abstract

NOVOS ADJUVANTES COM BASE EM CONJUGADOS DE BISACILOXIPROPILCISTEìNA E DERIVADOS E SEUS USOS EM COMPOSIçõES FARMACêUTICAS. A presente invenção se refere a novos adjuvantes e aos usos em composições farmacêuticas, tais como vacinas. Em particular, a presente invenção proporciona novos conjugados do tipo bisaciloxicisteina úteis como adjuvantes e/ou imunomoduladores para vacinação profilática e/ou terapêutica no tratamento de doenças infecciosas, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, tumores, alergias, bem como para o controle de fertilidade em populações de seres humanos e animais. Os compostos são particularmente úteis não apenas como adjuvantes sistêmicos, mas, de preferência, mucosais. Além disso, a invenção se refere a seus usos como ingredientes ativos em composições farmacêuticas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "NOVOS ADJUVANTES COM BASE EM CONJUGADOS DE
BISACILOXIPROPILCISTEÍNA E DERIVADOS E SEU USO EM COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS"
CAMPO DA PRESENTE INVENÇÃO
A presente invenção se refere a novos adjuvantes do tipo bisaciloxipropilcisteína é a usos em composições farmacêuticas, tal como em vacinas. Em particular, a presente invenção proporciona novos compostos úteis como adjuvantes e/ou imunomoduladores para vacinação profilática e/ou terapêutica no tratamento de doenças infecciosas, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, tumores, alergias, bem como para o controle de fertilidade em seres humanos ou populações de animais. Os compostos são particularmente úteis não apenas como adjuvantes sistêmicos, mas de preferência mucosos. Além disso, a invenção se refere a seus usos como ingredientes ativos em composições farmacêuticas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Doenças infecciosas são a principal causa de morbidade e mortalidade, somando um terço das mortes as quais ocorrem no mundo a cada ano. Além disso, agentes infecciosos são diretamente responsáveis por pelo menos 15% de novos cânceres e eles também parecem estar envolvidos na patofisiologia de várias doenças crônicas (por exemplo, doenças inflamatórias, vasculares e degenerativas). Doenças infecciosas tradicionais são também altamente dispendiosas em termos de custos associados à saúde de pacientes infectados e perda de produtividade no trabalho.
As principais estratégias usadas para prevenir doenças infecciosas são terapia e profilaxia. Vacinação tem se tornado a medida de custo mais eficaz para prevenir infecções. Contudo, ainda existem muitas doenças para as quais vacinas ainda não estão disponíveis ou as vacinas disponíveis não são completamente satisfatórias em virtude da baixa eficácia, alta reatogenicidade, pobre estabilidade e/ou altos custos. Assim, há uma necessidade urgente por vacinas novas e aperfeiçoadas.
A despeito do fato de que as vacinas têm sido tradicionalmente usadas para a profilaxia de doenças infecciosas, descobertas recentes sugerem que elas são também uma ferramenta poderosa para a imunoterapia de doenças transmissíveis (por exemplo, hepatite viral, infecções por Helicobacter pylori, infecções pelo herpes vírus, etc.). Além disso, vacinas podem ser usadas para imunoterapia ou imuno-profilaxia de doenças autoimunes, doenças inflamatórias, tumores, alergias e para o controle de fertilidade em populações de seres humanos e/ou animais. Em particular, a última aplicação parece requerer a estimulação de respostas eficientes das mucosas a nível do trato reprodutivo.
A maioria das doenças infecciosas está restrita às membranas mucosas ou os agentes etiológicos precisam transitar pela mucosa durante as etapas iniciais da infecção. Portanto, é desejável obter não apenas uma resposta sistêmica, mas também uma imune da mucosa como um resultado de vacinação, desse modo, bloqueando a infecção (isto é, colonização) e desenvolvimento da doença. Isso pode resultar em uma proteção mais eficiente contra infecção, facilitando também a erradicação de doenças para as quais seres humanos são os únicos reservatórios (isto é, bloqueando a transmissão para hospedeiros suscetíveis). Vacinas parenteralmente administradas estimulam
principalmente respostas sistêmicas, enquanto que vacinas administradas através de uma via mucosa imitam a resposta imune estimulada por infecções naturais e podem levar à respostas eficientes e sistêmicas da mucosa. Em virtude da compartimentalização evidente do sistema imune sistêmico e mucoso, vacinas parenteralmente administradas são menos eficazes na proteção contra patógenos mucosos (McGhee, J. R., Mestecky, J., Dertzbaugh, M.T., Eldridge, J. H., Hirasawa, M. e Kiyono, H. (1992) : The mucosal immune system: from fundamental concepts to vaccine development. Vaccine 10, 75-88). Assim, administração de imunogênios através da via raucosa é requerida para obter proteção total. Contudo, a maioria das vacinas disponíveis são administradas através da via parenteral, desse modo, estimulando uma imunidade sistêmica no indivíduo.
A administração de vacinas através da via mucosa oferece várias vantagens com relação à vacinação parenteral. Essas vantagens incluem uma facilidade de administração, a possibilidade de auto-administração (por exemplo, através de aplicação intranasal, retal ou oral), a eliminação da chance de infecção cruzada indesejada em virtude do uso de agulhas infectadas ou trabalho não estéril, menores taxas de efeitos colaterais, maior aceitação pelo público, melhor conformidade aos protocolos de vacinação (isto é, incremento da eficácia global), logística de administração mais simples e menores custos de distribuição, sendo particularmente adequada para programas de imunização em massa. Contudo, a compartimentalização ao nível do sistema imune mucoso tem de ser levada em consideração. Na verdade, respostas imunes as quais podem ser observadas após vacinação intranasal podem não ocorrer necessariamente após imunização oral ou intra-retal. Por exemplo, vacinação oral pode não estimular respostas eficientes nos tratos genito-urinários e/ou respiratórios.
Infelizmente, a distribuição de antígenos através da via mucosa está associada a um grande problema, isto é, os antígenos distribuídos através dessa via geralmente são pobremente imunogênicos. Isso é o resultado de diferentes mecanismos, tais como (i) eliminação acelerada de antígenos através de mecanismos de proteção não específicos do hospedeiro (por exemplo, atividade ciliar, peristaltismo) , (ii) degradação de antígeno por enzimas locais, (iii) alteração de antígeno e/ou modificação estrutural como um resultado de pH extremo (por exemplo, ácido no estômago, alcalino no intestino), (iv) pobre penetração do antígeno através da mucosa, (v) acesso limitado de antígenos da vacina à células apresentando antígeno e (vi) tolerância periférica local.
Para superar esses problemas, diferentes estratégias têm sido usadas, tais como contenção de antígeno ou associação com partículas físicas ou biológicas (por exemplo, micropartícuias, inóculos bacterianos) , o uso de virossomas ou partículas semelhantes a vírus, o uso de lipossomas ou ISCOMS, o uso de plantas transgênicas, produção de antígeno através de veículos bacterianos ou virais atenuados e/ou sua administração com adjuvantes mucosos. Contudo, a despeito do corpo pesado de evidência experimental gerado em estudos pré-clinicos durante os últimos anos, quase nenhum candidato tem sido transferido para a canalização de desenvolvimento de vacina.
0 uso de adjuvantes ótimos exerce um papel crucial em vacinação. Antigenos administrados sem adjuvante apenas raramente mediam uma resposta imune adequada. Além disso, não apenas a resistência, mas também a qualidade da resposta imune estimulada importa. Estimulação de um padrão de imunização incorreto pode levar à reações imunopatológicas e exacerbação dos sintomas de infecção. Nesse contexto, o adjuvante pode ajudar a auxiliar na resposta imune desejada. Em outras palavras, um adjuvante pode modular a resposta imune ou redirecioná-la para um equilíbrio na direção desejada.
Substâncias referidas como "adjuvantes" são aquelas as quais são adicionadas e/ou co-formuladas em uma imunização ao antigeno real (isto é, a substância a qual provoca a resposta imune desejada) de forma a intensificar a resposta imune humoral e/ou célular ("Lexikon der Biochemie und Molekularbiologie", 1. Band, Spektrum, Akademischer Verlag 1995). Isto é, adjuvantes são compostos tendo propriedades de imuno-potencialização, em particular quando co- administrados com antigenos. O uso de muitos adjuvantes é baseado unicamente na experiência e o efeito não pode ser precisamente explicado nem previsto. Os seguintes grupos de adjuvantes são tradicionalmente usados em particular: hidróxido de alumínio, emulsões de óleos minerais, saponinas, detergentes, compostos de silício, tiouréia, endotoxinas de bactérias gram-negativas, exotoxinas de bactérias gram-positivas, bactérias vivas atenuadas, mortas ou partes das mesmas.
Uma visão geral sobre os adjuvantes presentemente conhecidos e sistemas de distribuição, por exemplo, as partículas mencionadas acima, ICOMS, lipossomas e partículas semelhantes a vírus, para vacinas baseadas em proteína-DNA e RNA, é fornecida em Vajdy e colaboradores, Immunol. Cell Biol., 2004, 82, 617-627. No mesmo, as abordagens atualmente disponíveis em imuno-potencialização de vacinas mucosas são discutidas.
Isto é, vários adjuvantes mucosos têm sido descritos os quais servirão como uma alternativa para os adjuvantes úteis para administração sistêmica, por exemplo, veja Vajdy e colaboradores, supra. Esses adjuvantes mucosos incluem enterotoxina sensível ao calor e mutantes detoxifiçados da mesma. Em particular, mutantes geneticamente detoxifiçados de enterotoxina sensível ao calor de E. coli têm sido desenvolvidos como adjuvantes mucosos úteis. Além disso, toxina do cólera de vibriões do cólera é conhecida como um adjuvante útil para vacinação mucosa. Ainda, a aplicação de dinucleotideos de CpG não metilados foi descrita. Foi mostrado que CpG pode tender a uma resposta imune Thl e pode modular respostas imunes pré-existentes. Saponinas são também descritas como substâncias imunomodulatórias, predominantemente via a indução de citocinas especificas as quais, então, modulam e/ou ativam a resposta imune.
Infelizmente, a maioria dos compostos descritos acima que são úteis como adjuvantes mucosos não são utilizáveis em virtude de sua toxicidade intrínseca, por exemplo, alojamento retrógrado aos tecidos neurais de toxóides e/ou toxinas bacterianas nos derivados após vacinação nasal.
Além disso, como adjuvantes que podem ser úteis em vacinação mucosa, o seguinte foi descrito:
A molécula MAPL-2 e derivados da mesma, tais como conjugados de bisaciloxipropilcisteína, por exemplo, uma molécula de bispalmitoiloxicisteína-PEG, são conhecidos por representar estimulantes potentes para macrófagos. A utilidade de MAPL-2 como um adjuvante foi mostrada anteriormente, veja, por exemplo, W02004/009125 e W02 003/084568. Em particular, foi demonstrado que MALP-2 pode atuar como um adjuvante eficaz que intensifica a resposta imune, por exemplo, estimulando uma expressão intensificada de anticorpos IgA antígeno-específicos.
Além disso, foi mostrado que MALP-2 pode ativar células dendríticas e células B, ambas exercem um papel importante na indução de uma resposta imune humoral específica. Além disso, estudos primários demonstram que uma combinação de proteína tat de HIV-I biologicamente ativa e MALP-2 sintética pode ser uma vacina promissora, com o componente MALP-2 como um adjuvante eficaz, por exemplo, através da via mucosa.
Contudo, os conjugados de bisaciloxipropilcisteína tendo uma unidade de polialquileno, conforme descrito no WO 2004/009125, BPPcisPEG ou BPPcisMPEG são obteníveis como moléculas polidispersas tendo diferenças apenas no tamanho da unidade de polialquileno e, assim, tendo uma ampla faixa de tamanho molecular. Conseqüentemente, não é possível purificar conjugados de um único tamanho através de técnicas conhecidas e industrialmente aplicáveis.
Há ainda uma necessidade de proporcionar adjuvantes sendo mais estáveis e ativos, isto é, tendo uma biodisponibilidade aperfeiçoada, assim, permitindo redução da dosagem dos adjuvantes nas vacinas. Além disso, há ainda uma necessidade de proporcionar compostos tendo solubilidade aperfeiçoada em solventes hidrofílicos e sendo aperfeiçoados quanto a seu tempo de residência no corpo, em particular sendo mais estáveis contra o metabolismo e excreção. Além disso, são requeridos novos compostos que tenham uma vida útil aperfeiçoada.
Assim, nenhum desses adjuvantes mucosos previamente descritos foi ainda aprovado mas, hoje em dia, apenas dois adjuvantes sistêmicos receberam aprovação para ser administrados a seres humanos e, conseqüentemente, são usados para o preparo de vacinas humanas. Esses adjuvantes são Alume e MF59. Contudo, ambos não são eficazes como adjuvantes mucosos.
Têm sido feitas pesquisas intensivas em anos recentes por novos adjuvantes, incluindo aqueles para a administração pela mucosa. Descobriu-se que apenas algumas poucas substâncias são capazes de intensificar respostas da mucosa. Dentre essas, algumas atuam como veículos aos quais os antlgenos devem ser ligados ou fundidos. . Muito poucos adjuvantes "verdadeiros" universalmente empregáveis que são misturados aos antígenos foram descobertos, conforme esboçado acima.
Conseqüentemente, há uma necessidade na técnica em proporcionar novos compostos úteis como adjuvantes, particularmente como adjuvantes mucosos e/ou como vacinas. Em particular, há uma necessidade de adjuvantes mucosos capazes de estimular uma forte resposta imune, que represente uma resposta imune equilibrada ou ajustada envolvendo componentes humorais e celulares, assim, permitindo profilaxia ou tratamento eficaz de várias doenças e condições, especificamente de doenças infecciosas ou câncer. Além disso, a biodisponibilidade dos referidos adjuvantes deverá ser boa, com excelente atividade e estabilidade, assim, permitindo reduzir a dosagem e aumentar a bio-segurança dos adjuvantes.
Assim, o objetivo da presente invenção é o fornecimento de adjuvantes mucosos os quais podem estimular e/ou intensificar e/ou modular a resposta imune (pré- existente) em um indivíduo ou pessoa. Em particular, a invenção é baseada no objetivo de desenvolver uma faixa de novos adjuvantes altamente ativos, particularmente adjuvantes mucosos os quais são não tóxicos para seres humanos e os quais podem ser empregados com uma variedade de ingredientes ativos para auxiliar em vacinas convencionais ou novas tais como, em particular, vacinas profiláticas ou terapêuticas, incluindo vacinas de DNA e câncer.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
Esse problema técnico é resolvido pelo fornecimento das modalidades conforme caracterizado nas reivindicações. A presente invenção se refere, de modo geral, ao fornecimento de novos conjugados, sais ou solvatos dos mesmos, úteis como compostos imunomodulatórios, em particular, como adjuvantes, de preferência como adjuvantes mucosos. Além disso, a presente invenção se refere a novos produtos farmacêuticos compreendendo os conjugados conforme descrito aqui com veículo(s) farmaceuticamente aceitável(is), opcionalmente junto com ingredientes ativos adicionais.
Isto é, a presente invenção se refere ao fornecimento do uso de compostos ou conjugados específicos úteis como adjuvantes e/ou imunomoduladores em vacinação terapêutica ou profilática. Os referidos compostos e conjugados são úteis como adjuvantes sistêmicos e são particularmente úteis como adjuvantes mucosos que são aplicados por via mucosa no indivíduo.
Os presentes inventores descobriram agora que formas específicas de conjugados de bisaciloxipropilcisteína são particularmente úteis como adjuvantes em vacinas para vacinação terapêutica ou profilática. Em particular, compostos conforme descrito aqui demonstram a aplicabilidade como adjuvantes parenterais e, em particular, como adjuvantes mucosos em baixas doses. Conforme usado aqui, o termo "adjuvante" significa substâncias as quais são adicionadas e/ou co-formuladas em uma imunização ao antígeno ativo, isto é, a substância que provoca a resposta imune desejada, de forma a intensificar, estimular ou modular a resposta imune humoral e/ou mediada por céulas (celular) contra o antígeno ativo. De preferência, o adjuvante de acordo com a presente invenção também é capaz de intensificar ou estimular a resposta imune inata.
O termo "terapia" ou "tratamento" se refere a um processo que se destina a produzir uma alteração benéfica na condição de um indivíduo, tal como um mamífero, por exemplo, um ser humano, freqüentemente referido como um paciente, ou animal. Uma alteração benéfica pode, por exemplo, incluir um ou mais de: restauração de função, redução de sintomas, limitação ou retardo de progressão de uma doença ou distúrbio, condição ou prevenção, limitação ou retardo de deterioração do estado de saúde, doença ou distúrbio do paciente. Tal terapia usualmente abrange a administração de um fármaco, dentre outros.
Conforme usado aqui, o termo "sistema de distribuição" se refere a um sistema que é mais inerte e tem menos efeitos imunomodulatórios do que adjuvantes e que protege e distribui a vacina ao local de interesse através do local de administração. Em particular, o sistema de distribuição permite apresentação mais eficiente do antígeno ao sistema imune. Exemplos de sistemas de distribuição são vírus ou partículas semelhantes a vírus, ISCOM, nanopartículas, micropartículas, lipossomas, virossomas, partículas semelhantes a polioma, vacinas atenuadas e partículas semelhantes a vírus.
Conforme usado aqui, o termo "peguilado" se refere à conjugação de uma porção do composto com porção(ões) do conjugado contendo pelo menos duas unidades de polialquileno. Em particular, o termo peguilado se refere à conjugação da porção do composto a uma porção do conjugado tendo pelo menos duas unidades de polietileno glicol. 0 termo "peguilado" não inclui formas tendo uma peguilação linear do resíduo de bisaciloxipropilcisteína.
Conforme usado aqui, o termo "mucoso(a)" se refere à superfície mucosa do corpo, tal como a mucosa nasal, oral, gastro-entérica, retal, urinaria, conjuntiva, glandular, por exemplo, glândula mamaria, epitelial.
Conforme usado aqui, o termo "conjugado" se refere a compostos compreendendo uma porção de conjugado e uma porção de composto. A porção de composto é um resíduo de bisaciloxipropilcisteína. O termo "porção de conjugado" se refere a uma porção a qual é ligada ao resíduo de bisaciloxipropilcisteína. A porção de conjugado objetiva aumentar a aplicabilidade dos compostos divulgados aqui.
Conforme usado aqui, o termo "estrutura antigênica" ou "antígeno" se refere a uma estrutura capaz de causar uma resposta imune celular ou humoral. A estrutura antigênica, também conhecida como epítopo, é a parte do antígeno a qual é apresentada por MHC ou moléculas semelhantes ao MHC. Ainda, o epítopo ou estrutura antigênica representa a parte de um antígeno reconhecida por anticorpos dirigidos contra o referido antígeno.
Conforme usado aqui, o termo "modular uma resposta imune" se refere a qualquer alteração do estado atual da resposta imune. A resposta imune pode ser modulada na medida em que a resposta é estimulada ou uma resposta imune pré-existente é intensificada ou diminuída. Além disso, a resposta imune pode ser modulada desviando a resposta imune de uma resposta imune mais humoral para uma mais celular ou vice versa. Ainda, a resposta imune pode ser modulada trocando ou redirecionando a resposta de um Thl para Th2 ou Th3 ou vice versa, em particular uma resposta Thl/Th2 equilibrada. Além disso, a modulação da resposta imune pode abranger a ativação ou intensificação da resposta imune inata.
Conforme usado aqui, o termo "individuo" ou "pessoa", que são usados aqui permutave lmente, se refere a um indivíduo ou uma pessoa que precisa de uma terapia ou profilaxia. De preferência, a pessoa ou indivíduo é um vertebrado, ainda mais preferivelmente um mamífero, particularmente de preferência, um ser humano.
Conforme usado aqui, o termo "veículo" se refere a um diluente, adjuvante, excipiente ou mesmo veículo.
Em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere ao uso de um conjugado de bisaciloxipropilcisteína de acordo com a fórmula 1:
<formula>formula see original document page 17</formula>
onde:
R1 e R2 podem ser idênticos ou diferentes e são porções acila;
L é uma porção ligante selecionada do grupo NH, 0 ou OCO; R3 é uma porção conjugada covalentemente ligada compreendendo pelo menos duas unidades de polialguileno glicol da fórmula:
<formula>formula see original document page 18</formula>
A qual pode ser idêntica ou diferente, onde
X1 é hidrogênio ou um hidrocarboneto o qual pode conter heteroátomo(s), por exemplo, grupo alquila ou alcóxi C1-C6 simples ou ramificado.
R4 é, independentemente, qualquer um de hidrogênio, OH, um grupo C1-C6 alquila simples ou ramificado, OR5 ou CO-
R5 é, independentemente, qualquer um de hidrogênio ou um grupo C1-C6 alquila simples ou ramificado;
R6 é, independentemente, qualquer um de hidrogênio, OH7 OR5 OU NR7R8;
R7 e R8 são, independentemente, qualquer um de hidrogênio ou hidrocarboneto, o qual pode conter heteroátomo(s) e o qual pode formar um anel;
η é um número inteiro de 1 a 100;
χ é, independentemente, um número inteiro de 1 a 10;
y é um número inteiro de 0 a 10, como adjuvante(s) para vacinação terapêutica ou profilática.
Em um segundo aspecto, a presente invenção se refere a um derivado de bisaciloxipropilcisteina de acordo com a fórmula (I) , onde Ri e R2 são como definidos acima, L é amino-3 1-desoóxiadenosina, amino-3 1-desoxiguanosina, amino- 3 '-desoxiinosina ou amino-3 1-desoxixantina e R3 pode estar ausente ou pode ser covalentemente ligado a um resíduo de purina, por exemplo, na posição 6 do anel de purina e é definido conforme esboçado acima. De preferência, o referido derivado é S-[2,3-bis(palmitoilóxi)-(2S ou 2R)- propil]-L-cisteinilcarbóxi-3'Amino-3'-desoxiadenosina (BPPcisAda).Alternativamente,o derivado de bisaciloxipropilcisteina de acordo com a fórmula (1) pode ainda ser succinilado.
De preferência, o conjugado é caracterizado pelo fato de que os resíduos Ri e R2, os quais podem ser idênticos ou diferentes, são independentemente um grupo acila C7-C25, de preferência alcano, alqueno ou alquino grupos C8-C22, , e as posições insaturadas estão, de preferência, na configuração eis, os resíduos de alcanos, alcenos e alcinos podem ser resíduos lineares, ramificados ou cíclicos os quais podem ser substituídos. Pelo termo "os quais podem ser substituídos" entenda- se uma substituição por um grupo C1-C6 alquila ou um grupo C1-C6 alcóxi simples ou ramificado e/ou por um halogênio, grupo hidroxila ou grupo carboxila.
A porção conjugada do conjugado de acordo com a presente invenção é covalentemente ligada, uma porção de conjugado fisiologicamente tolerada, a qual é adequada para conversão do resíduo de bisaciloxipropilcisteína a uma forma mais solúvel em água. A porção de conjugado é caracterizada pelo fato de que ela proporciona boa solubilidade em solventes hidrofílicos, tal como água, e não é imunogênica. Ainda, a porção de conjugado proporciona estabilidade consideravelmente maior à protease, uma diminuição significativa na imunogenicidade e um retardo perceptível de excreção renal. A nova estrutura peguilada abrange a molécula de fármaco quase que completamente, assim, protegendo-a eficazmente contra degradação prematura por anticorpos e enzimas endógenas. Além disso, com o auxílio desse reagente de disfarce, o fármaco pode impedir ataques pelo sistema imune e processos de degradação enzimática, pode atingir seu destino sem impedimentos e exercer seu efeito terapêutico eficazmente. Assim, a quantidade de adjuvante ou ingrediente ativo necessário para obter os efeitos desejados pode ser significativamente reduzida, ao mesmo tempo em que melhora a biodisponibilidade.
Em particular, a porção conjugada do conjugado reivindicado aqui é uma porção contendo pelo menos duas unidades de polialquileno glicol as quais não estão em série, mas estão presentes em uma estrutura ramificada. Estrutura ramificada significa que as unidades são direta ou indiretamente ligadas covalentemente via uma molécula de ramificação e a referida molécula de ramificação é direta ou indiretamente ligada ao resíduo de bisaciloxipropilcisteína da fórmula:
<formula>formula see original document page 21</formula>
os quais podem ser idênticos ou diferentes; onde
X1 é hidrogênio ou um hidrocarboneto o qual pode conter heteroátomo(s), tal como um grupo C1-C6 alquila simples ou ramificado ou um grupo alcóxi simples ou ramificado;
R4 é, independentemente, qualquer um de hidrogênio, OH, um grupo Ci-C6 alquila reto ou ramificado, OR5 ou CO-R6;
R5 é, independentemente, qualquer um de hidrogênio ou uma C1-C6 alquila reta ou ramificada;
R6 é, independentemente, qualquer um de hidrogênio, OH, OR5 ou NR7Re; R7 e R8 são, independentemente, qualquer um de hidrogênio ou hidrocarboneto o qual pode conter heteroátomo(s) e que pode formar um anel;
η é um número inteiro de 1 a 100;
χ é, independentemente, um número inteiro de 1 a 10;
y é um número inteiro de 0 a 10.
De preferência, η é um número inteiro de 2 a 50, tal como 2 a 10, em particular 3 a 5.
y é, de preferência, um número inteiro de 1 a 5, em particular 1 a 3, em outra modalidade preferida, y é 0.
De preferência, χ é um número inteiro de 2, 3 ou 4, em particular 2.
X1 é, de preferência, OR9, N(R9)2, SR9 ou COOR9, em que cada R9 é individualmente hidrogênio, benzila ou C1-C6 alquila reta ou ramificada, de preferência um grupo C1-C6 alcóxi reto ou ramificado, tal como um grupo metóxi, etóxi ou propóxi.
R4 é, de preferência, um átomo de hidrogênio.
Assim, a unidade de polialquileno glicol mencionada acima pode, de preferência, . conter pelo menos duas subunidades de etileno glicol, propileno glicol ou butileno glicol ou combinações das mesmas. A extensão de cadeia de cada uma das unidades de polialquileno glicol pode estar na faixa de 1 a 100 subunidades, de preferência 2 a 50 subunidades, tal como 2 a 10 subunidades, particularmente na faixa de 3 a 5 subunidades.
As unidades de polialquileno presentes no conjugado de acordo com a presente invenção não têm uma porção de conjugado linear, mas ao menos duas unidades estão presentes em uma forma ramificada, por exemplo, mostrada nas Figuras 10 e 11. Particularmente preferida, a subunidade de polialquileno glicol é um resíduo de metõxipolialquilenoglicol-carbonila, em que a porção alquileno é uma porção etileno ou propileno.
Conseqüentemente, a forma peguilada, conforme definido aqui, permite aumentar a solubilidade em solventes hidrofílicos e ambiente hidrofílico. Além disso, a porção de conjugado permite proteger a porção de composto, isto é, a porção adjuvante mucosa ativa, contra degradação enzimática, modificação estrutural em virtude de alteração do pH, remoção mecânica, etc. Assim, primariamente, a estabilidade do composto é aumentada. Outro efeito benéfico de conjugação é aumentar o tempo de retenção no indivíduo, por exemplo, retardar a excreção renal, ao mesmo tempo em que é bem tolerado, por exemplo, sendo não imunogênico, pelo referido organismo. Assim, o conjugado de acordo com a presente invenção mostra uma biodisponibilidade aperfeiçoada, ao mesmo tempo em que permite redução da dosagem necessária para estimular o efeito desejado.
Além disso, os conjugados ou derivados de acordo com a presente invenção mantêm sua atividade mesmo após armazenamento durante 2 meses em temperatura ambiente, conforme mostrado na Figura 12.
Especificamente, a porção de conjugado compreende pelo menos quatro cadeias tendo unidades de polialquileno glicol. O conjugado pode ser um composto ramificado em que cada braço contém uma unidade de polialquileno glicol. Particularmente preferidas são porções de conjugado em que a unidade de polialquileno glicol é uma unidade de polietileno, polipropileno ou polibutileno glicol.
Em uma modalidade particularmente preferida, a porção de composto que está sendo covalentemente ligada à porção de conjugado é uma porção ramificada em que pelo menos dois braços contendo unidades de polietileno glicol tendo 3 a 5 subunidades de etileno glicol e um grupo metóxi na extremidade livre do grupo polietileno. Em particular, a porção ramificada compreende 4 ou 6 ou 8 braços, cada um tendo 3 subunidades de etileno glicol e um grupo metóxi na extremidade livre do grupo polietileno.
Em particular, o conjugado é caracterizado pelo fato de que a porção conjugada é um PEG de 4 braços ( (S)-10- Amino-6, 9,13,16-tetraoxo-N,N',8,14-tetracis(3, 6, 9,12- tetraoxatridec-1-il)-5,8,14,17-tetraazahenicosano-l,21- diamida), PEG de seis ou de oito, conforme descrito no WO 2004108634, o qual é incorporado aqui em sua totalidade. Outra porção de conjugado adequada compreendendo pelo menos duas unidades de polietileno são obteníveis, por exemplo, da Celares GmbH, Berlin, veja http://www.celares.com ou Nektar Therapeutics, www.nektar.com/peg e exemplos específicos são mostrados na Figura 9.
Uma modalidade particularmente preferida é o composto de fórmula (2), conforme mostrado na Figura 11.
Os conjugados descritos aqui podem estar na forma de sais não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Sais incluem sais de adição de ácido, tais como sais com ácidos inorgânicos (por exemplo, ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido nítricô e ácido fosfórico) ou com ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético, ácido propiônico, ácido maleico, ácido oleico, ácido palmítico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido fumárico, ácido glutâmico, ácido pantotênico, ácido lauril-sulfônico, ácido metano-sulfônico e ácido ftálico).
Os conjugados podem estar na forma de solvatos dos mesmos (por exemplo, hidratos). Além disso, os conjugados podem formar sais com íons catiônicos, tais como íons metálicos, em particular íons de metal alcalino ou alcalino terroso ou NH4+.
De preferência, o conjugado de acordo com a presente invenção é um conjugado de S-[2,3-bis(acilóxi)-(2S)- propil]-L-cisteinilcarbóxi, de preferência um conjugado de S-[2 , 3-bis(palmitoilóxi)-(2S)-propil]-L-cisteinilcarbóxi.
Em outra modalidade, o conjugado é um conjugado de S- [2,3-bis(acilóxi)-(2R)-propil]-L-cisteinilcarbóxi, de preferência um conjugado de S-[2,3-bis(palmitoilóxi)-(2R)- propil]-L- cisteinilcarbóxi.
Os conjugados conforme descrito acima podem ser adicionalmente usados como um imunomoduladores em uma composição farmacêutica para prevenção ou tratamento de doenças infecciosas, cânceres, tumores, doenças auto- imunes, alergias, processos inf lamatórios crônicos ou agudos e para controlar a fertilidade em populações de seres humanos e animais. A síntese de conjugados pode ser conduzida através de métodos .conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, um grupo hidroxila pode ser convertido em um resíduo de halogênio, por exemplo, Cl, Br, I e esse resíduo pode reagir com conjugados modificados tendo um grupo amino livre. Por exemplo, a síntese de conjugados peguilados é descrita em Veronese F.M., Biomaterials 22 (2001), 405-417 e Kodera Υ. e colaboradores, Prog. Polym. Sei. (1998), 23, 1233-1271, os quais são incorporados aqui por referência.
Em uma modalidade preferida, o(s) conjugado(s) ou sais ou solvatos dos mesmos são úteis como adjuvante(s) mucoso(s), em particular para administração intranasal, intra tecido Iinfóide associado nasal, oral, intra-retal, conjuntivo, intra-vaginal, intratecal, intrabrônquica, intrapulmonar ou intra-uretral, administração nos dutos de leite da mama ou através de inalação. Particularmente preferida é a administração intranasal ou a administração através de inalação usando formulações de aerossol adequadas. Formulações de aerossol úteis para administração de vacinas são conhecidas na técnica.
Os conjugados ou sais ou solvatos dos mesmos são também adequados como adjuvante(s) sistêmico(s). Assim, os adjuvantes descritos aqui são também aplicáveis como adjuvante(s) parenterais, em particular em administração subeutânea, tópica (vacinação transcutânea), intravenosa, intradérmica, tópica ou intramuscular.
O adjuvante da invenção pode ser ligado através de todos os métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica ao antigeno ou molécula ativa destinada à vacinação, ser incorporado junto com a última em partículas físicas (por exemplo, micropartículas, nanopartículas, lipossomas, complexos imuno-estimulantes, polímeros), biológicas (bactérias, partes bacterianas) , virossomas ou ser misturado com o antígeno. Por exemplo, o adjuvante pode ser co-formulado ou misturado com o antígeno. Para ligação a veículos, também é possível proporcionar moléculas de transporte ou proteínas de transporte como veículo.
0(s) conjugado(s) ou sais ou solvatos do(s) mesmo(s) é/são, de preferência, presente(s) em um preparado com o componente de vacinação ativo (por exemplo, o antígeno) o qual é adequado e proporcionado para administração intranasal, intra-NALT (tecido linfóide associado nasal), aerossol oral, intra-retal, conjuntiva, intravaginal, intra-uretral ou para administração aos dutos de leite da mama. Particularmente, o preparado é proporcionado em uma formulação adequada para ser captada via o trato respiratório ou o trato gastrintestinal. Alternativamente, o adjuvante mucoso da invenção pode estar presente em um kit para co-administração com uma vacina através de uma das vias antes mencionadas e pode ser adaptado, portanto, onde apropriado. Isto é, a vacina pode ser administrada simultânea, seqüencial ou separadamente do componente de vacinação ativo. Assim, os conjugados de acordo com a presente invenção dirigem a resposta imune a uma resposta Thl/Th2 equilibrada. Também, os referidos conjugados podem tender à resposta imune através de intensificação desta resposta Th2.
Em outra modalidade, a presente invenção se refere a métodos de tratamento de indivíduos que sofrem com uma doença ou condição de saúde que pode ser tratada através de modulação da resposta imune, compreendendo administração, ao referido indivíduo, de uma quantidade eficaz de um produto farmacêutico compreendendo os conjugados, sais e solvatos dos mesmos, conforme definido aqui, como um adjuvante, particularmente como um adjuvante mucoso junto com um componente de vacinação ativo e, opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável.
De preferência, o método se refere ao tratamento de indivíduos que sofrem com uma doença infecciosa, em que esta doença é produzida por um agente infeccioso selecionado dentre aqueles que causam doença humana ou animal ao nível do trato respiratório, trato gastrintestinal, trato genito-urinário, sistema osteoarticular, pele ou mucosa.
Os conjugados ou sais ou solvatos dos mesmos, conforme definido aqui, são particularmente úteis como adjuvantes mucosos para ativação ou intensificação, in vitro e/ou in vivo, de função de células apresentando antígeno para uma intervenção terapêutica ou profilática. Isso significa que os adjuvantes podem estimular macrófagos, podem estimular ou intensificar a resposta imune humoral, por exemplo, intensificação ou estimulação da produção de anticorpos. Além disso, os adjuvantes também podem intensificar ou estimular a resposta imune celular, por exemplo, aumentando a proliferação de células T. Além disso, é possível usar o(s) adjuvante(s) para estimulação ex vivo em cultura de células, por exemplo, para a produção de células dendríticas, etc. Essas células obtidas através de estimulação ex vivo podem ser usadas para transferência de células autólogas em transplante ou como uma vacina baseada em células contra doenças ou condições de saúde, tais como as doenças e condições mencionadas acima, incluindo câncer, doença autoimune ou alergias.
Além disso, os conjugados de acordo com a presente invenção são úteis para objetivação de células in vitro, ex vivo e/ou in vivo expressando, por exemplo, o sistema receptor da família Toll incluindo, mas não limitado a, o receptor TLRl , TLR-2 e/ou TLR-6 para uma intervenção profilática ou terapêutica no indivíduo. De preferência, o uso do conjugado de acordo com a presente invenção permite melhorar a eficácia da vacina através de objetivação de células expressando o receptor Toll 2 e/ou Toll 6.
Assim, no caso do uso dos conjugados ou sais ou solvatos dos mesmos, conforme definido aqui, como um adjuvante, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção é, de preferência, uma vacina compreendendo os referidos compostos ou conjugados ou sais ou solvatos dos mesmos como adjuvante(s) farmaceuticamente aceitável(is) junto com o componente de vacinação ativo (por exemplo, o antígeno) e, opcionalmente, um veículo, diluente, conservante, outro adjuvante que não o adjuvante de acordo com a presente invenção, imunomodulador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
O componente de vacinação ativo pode ser qualquer componente adequado para estimular, intensificar ou modular uma resposta imune em um indivíduo. 0 componente de vacinação ativo é adequado particularmente para administração intranasal, intra-NALT, oral, intra-retal, conjuntivo, intravaginal, aerossolizada ou intra-uretral ou administração aos dutos de leite da mama.
Por exemplo, o componente de vacinação ativo, o ingrediente ativo da composição farmacêutica, compreende pelo menos um ou mais diferentes antígenos na forma de peptídeos, proteínas, polissacarídeos, glicolipídios ou DNA que codifica os mesmos ou inóculos bacterianos, virossoma ou vacinas atenuadas.
De preferência, o(s) antígeno(s) é(são) antígeno(s) tumorígeno(s) ou antígeno(s) derivado(s) de agentes infecciosos. Os agentes infecciosos incluem aqueles agentes os quais normalmente entram no organismo do indivíduo através de cruzamento da membrana mucosa. A composição farmacêutica compreendendo adjuvante(s) de acordo com a presente invenção, um componente de vacinação ativo, opcionalmente um veículo, diluente, conservante, outro adjuvante que não o adjuvante de acordo com a presente invenção, imunomodulador ou excipiente adicional pode, adicionalmente, conter componentes tais como compostos tais como uma ou mais moléculas antiinf lamatórias, anti- angiogênicas, citotóxicas, moléculas imunomodulatórias, de preferência citocinas, quimiocinas, ligante CD40, moléculas co-estimulatórias ou anticorpos ou misturas dos mesmos.
Contudo, os conjugados e sais e solvatos dos mesmos, conforme definido aqui, para o uso como adjuvantes também podem ser um componente de uma composição farmacêutica proporcionada em uma formulação adequada para administração parenteral, em particular em administração subcutânea, transcutânea (vacinação tópica), intravenosa, intradérmica ou intramuscular. Ainda, os compostos de acordo com a presente invenção são úteis em terapia de tumor, incluindo a geração in vitro ou em produção in vitro de células autólogas para transferência adotiva de células em terapia de tumor e transplante. Além disso, os adjuvantes são úteis para a indução de tolerância cruzada contra componentes microbianos, tais como endotoxinas, para proteger contra choque séptico ou outras formas graves de doenças induzidas por componentes microbianos.
Além disso, os compostos em si, conforme definido aqui, podem mostrar uma atividade farmacêutica, por exemplo, ser úteis na profilaxia e tratamento de várias doenças e condições de saúde, tais como câncer, doenças infecciosas, choque séptico, processos crônicos e inflamatórios, doenças autoimunes, alergias, etc.
Conseqüentemente, os conjugados, sais ou solvatos dos mesmos também são úteis para o preparo de um produto farmacêutico para prevenir ou tratar doenças infecciosas, choque séptico, câncer, tumores, doenças autoimunes, alergias ou processos inflamatórios agudos ou crônicos.
Os conjugados de acordo com a presente invenção e sais ou solvatos dos mesmos podem ser usados como ingredientes ativos em produtos farmacêuticos úteis para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas, choque séptico, tumores, doenças autoimunes, alergias ou processos inflamatórios crônicos ou agudos. Em particular, os conjugados ou sais ou solvatos dos mesmos estão contidos em produtos farmacêuticos úteis para a prevenção ou tratamento de câncer e/ou tumores, tais como melanoma, câncer de próstata, mama, cólon-retal, estômago, garganta e pescoço, pancreático, cervical, ovariano, ósseo, leucemia e de pulmão; infecções virais, tais como hepatite B, hepatite C, vírus de imunodeficiência humana, Helicobacter pylori, herpes vírus; etc.; infecções bacterianas, tais como tuberculose, lepra e listeriose e infecções parasíticas, tal como malária.
Assim, em outro aspecto, a presente invenção se refere âs composições farmacêuticas compreendendo conjugados, sais ou solvatos dos mesmos, conforme definido aqui, em particular conjugados contendo pelo menos uma porção de conjugado compreendendo pelo menos duas unidades de polialquileno glicol, conforme definido aqui, sais ou solvatos dos mesmos e, opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável. Tais composições farmacêuticas compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz dos conjugados e, opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode ser administrada com um veículo fisiologicamente aceitável a um paciente, conforme descrito aqui. Em uma modalidade especifica, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência regulatória ou outra farmacopéia geralmente reconhecida para uso em animais e, mais particularmente, em seres humanos. O termo "veiculo" se refere a um diluente, adjuvante, excipiente ou mesmo veículo com o qual o produto terapêutico é administrado. Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo aqueles originários de petróleo, animal, vegetal ou sintéticos, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e semelhantes. Água é um veículo preferido quando a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. Soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol também podem ser empregadas como veículos líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite em pó desnatado, glicerol, propileno glicol, água, etanol e semelhantes. A composição, se desejado, também pode conter quantidades mínimas de agentes de umedecimento ou emulsif icação ou agentes parà tamponamento de pH. Essas composições podem tomar a forma de soluções, suspensões, emulsões, tabletes, pílulas, cápsulas, pós, formulações com liberação sustentada e semelhantes. A composição pode ser formulada como um supositório, com aglutinantes e veículos tradicionais, tais como triglicerídeos. Formulação oral pode incluir veículos padrões, tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, magnésio, carbonato, etc. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são descritos em "Remington1S Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin (18a ed. , Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)).
Tais composições conterão uma quantidade terapeuticamente eficaz dos conjugados e sais ou solvatos antes mencionados dos mesmos, de preferência na forma purificada, junto com uma quantidade adequada de veículo de modo a proporcionar a forma para administração apropriada ao paciente. A formulação deverá se adequar ao modo de administração.
Tipicamente, o veículo farmacêutica ou terapeuticamente aceitável é um meio veículo o qual não interfere com a eficácia da atividade biológica dos ingredientes ativos e o qual não é tóxico para o hospedeiro ou paciente.
Em outra modalidade preferida, a composição é formulada de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a seres humanos. Tipicamente, composições para administração intravenosa são soluções em tampão aquoso isotônico estéril. Onde necessário, a composição pode também incluir um agente de solubilização e um anestésico local, tal como lidocaína, para diminuir a dor no local de injeção. Geralmente, os ingredientes são fornecidos separadamente ou misturados juntos em uma forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado isento de água em um recipiente hermeticamente vedado, tal como uma ampola ou sache, indicando a quantidade de agente ativo. Onde a composição tem de ser administrada através de infusão, ela pode ser distribuída com uma garrafa de infusão contendo água de grau farmacêutico estéril ou solução salina. Onde a composição é administrada através de injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina pode ser fornecida, de modo que os ingredientes possam ser misturados antes de administração.
A composição farmacêutica para uso com relação à invenção pode ser formulada como formas neutras ou salinas. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles formados com ânions, tais como aqueles derivados de ácido clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc. e aqueles formados com cátions, tais como aqueles derivados de sódio, potássio, amônio, cálcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol,
histidina, procaína, etc.
"Quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz", conforme aplicado às composições da presente invenção, se refere à quantidade de composição suficiente para induzir a um resultado biológico desejado. Esse resultado pode ser alívio dos sinais, sintomas ou causas de uma doença ou qualquer outra alteração desejada de um sistema biológico.
Na presente invenção, o resultado envolverá, tipicamente, um aumento nas respostas imunes à infecção ou uma supressão das respostas a processos inflamatórios.
Ensaios in vitro podem ser opcionalmente empregados para ajudar a identificar faixas ótimas de dosagem. A dose precisa a ser empregada na formulação também dependerá da via de administração e da gravidade da doença ou distúrbio e deverá ser decidida de acordo com o julgamento do médico e cada circunstância do paciente. Doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas de dose-resposta derivadas de sistemas de teste modelo com animais ou in vitro. De preferência, a composição farmacêutica é administrada diretamente ou em combinação com um adjuvante.
O termo "administrada" significa administração de uma dose terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica antes mencionada compreendendo os conjugados e sais e solvatos dos mesmos, conforme definido aqui, a um indivíduo. Por "quantidade terapeuticamente eficaz" entenda-se uma dose que produz os efeitos para os quais ela é administrada. A dose exata dependerá da finalidade do tratamento e será determinável por aqueles habilitados na técnica usando métodos conhecidos. Conforme é conhecido na técnica e descrito acima, ajustes para distribuição sistêmica versus localizada, idade, peso corporal, saúde geral, sexo, dieta, momento de administração, interação de fármaco e a gravidade da condição podem ser necessários e serão determináveis através de experimentação de rotina por aqueles habilitados na técnica.
Em ainda outra modalidade, a presente invenção se refere a métodos de tratamento de indivíduos que sofrem de doenças infecciosas, choque séptico, tumores, doenças autoimunes, alergias ou processos inflamatórios crônicos ou agudos, compreendendo a etapa de administração ao referido indivíduo de uma quantidade eficaz de um produto farmacêutico, compreendendo um conjugado, sais ou solvatos do mesmo como um ingrediente ativo e, opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável. Em particular, o método é útil para prevenção ou tratamento de câncer e/ou tumores, tais como melanoma, câncer de próstata, mama, cólon-retal, estômago, garganta e pescoço, pancreático, ovariano, cervical, ósseo, leucemia e de pulmão; infecções virais, tais como hepatite B, hepatite C, virus da imunodeficiência humana, Helicobacter pylori, herpes vírus, etc.; infecções bacterianas, tais como tuberculose, lepra e listeriose e infecções parasíticas, tal como malária.
Ainda, a composição farmacêutica pode conter componentes adicionais, por exemplo, compostos tais como uma ou mais moléculas antiinflamatórias, anti-angiogênicas, citotóxicas, moléculas imunomodulatórias, de preferência quimiocinas, citocinas, ligante CD40, moléculas co- estimulatórias ou anticorpos ou misturas dos mesmos.
Além disso, a composição farmacêutica descrita aqui pode ser caracterizada pelo fato de que os componentes da composição farmacêutica estão associados e/ou incorporados e/ou revestidos a uma partícula física, de preferência micropartícula, nanopartícula, lipossoma, ISCOM,
copolímeros e/ou partícula biológica, de preferência inóculos bacterianos.
Os métodos são aplicáveis à terapia humana e aplicações veterinárias. Os compostos descritos aqui tendo a atividade terapêutica desejada podem ser administrados em um veículo fisiologicamente aceitável a um paciente, conforme descrito aqui. Dependendo da maneira de introdução, os compostos podem ser formulados em uma variedade de formas, conforme discutido abaixo. a concentração de composto terapeuticamente eficaz na formulação pode variar de cerca de 0,1-100% em peso. Os agentes podem ser administrados sozinhos ou em combinação com outros tratamentos.
A administração da composição farmacêutica pode ser feita em uma variedade de formas, conforme discutido acima, incluindo, mas não limitado a, oralmente, subcutaneamente, transcutaneamente (vacinação tópica), intradermicamente, intravenosamente, intra-arterial, intranodal, intramedularmente, intratecal, intraventricular, intranasalmente, conjuntiva, intrabrônquica, transdérmica, intra-retalmente, intraperitonealmente, intramuscularmente, intrapulmonar, vaginalmente, retalmente ou intra- ocularmente. Em alguns casos, por exemplo, no tratamento de feridas e em inflamação, agente farmaceuticamente eficaz pode ser diretamente aplicado como uma solução em spray seco.
Os presentes fatores físicos e clínicos determinarão o regime de dosagem. Uma dose típica pode, por exemplo, estar na faixa de 0,001 a 1000 μg; contudo, doses abaixo ou acima dessa faixa exemplificativa são consideradas, especialmente considerando-se os fatores antes mencionados. Além disso, o uso dos conjugados tendo múltiplas unidades de polialquileno permite redução na quantidade requerida dos referidos conjugados por dosagem para obter imunomodulação eficaz ou capacidade adjuvante em indivíduos. Em particular, usando conjugados tendo múltiplas unidades de polialquileno, tal como a molécula mostrada na Figura 10, PEG de 4 braços BPPcisGlyc, é possível reduzir a dosagem dos adjuvantes significativamente quando comparado com BPPcisPEG.
Em ainda outro aspecto, a presente invenção se refere ao uso do(s) conjugado (s) ou sais ou solvatos do(s) mesmo(s), conforme definido aqui, em um preparado farmacêutico para controlar a fertilidade em populações de seres humanos ou animais.
Finalmente, a presente invenção se refere a kits compreendendo os conjugados de acordo com a presente invenção ou sais ou solvatos dos mesmos. Em particular, o kit é útil para o preparo de composições farmacêuticas. Opcionalmente, o kit contém instruções para preparo da composição farmacêutica.
Em uma modalidade preferida do mesmo, o kit contém os conjugados de acordo com a presente invenção, sais ou solvatos dos mesmos como um adjuvante e um antígeno compreendendo uma estrutura antigênica e, opcionalmente, um veículo, diluente, conservante, outros adjuvantes que não o adjuvante de acordo com a presente invenção, imunomoduladores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis e instruções para preparo de uma vacina.
Essas e outras modalidades são divulgadas e abrangidas pelas reivindicações e na descrição e exemplos da presente invenção. Literatura adicional referente a qualquer um dos métodos, usos e compostos a serem empregados de acordo com a presente invenção pode ser adquirida de bibliotecas públicas usando, por exemplo, dispositivos eletrônicos. Por exemplo, o banco de dados público "Medline" pode ser utilizado, o qual está disponível na Internet, por exemplo, sob http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Publvled/medline.html.
Outros bancos de dados e endereços, tais como http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.tigr.org/, são conhecidos por aqueles habilitados na técnica e também podem ser obtidos usando, por exemplo, http://www.google.de. Uma visão geral de informação de patente em biotecnologia e uma inspeção de fontes relevantes de informação de patente útil para pesquisa retrospectiva e para atualização é fornecida em Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1: Δ Figura 1 mostra os resultados para estudos in vitro usando células dendriticas primárias. Culturas de células dendriticas primárias derivadas de medula óssea foram obtidas de camundongos BALB/c através de maturação in vitro de precursores usando GM-CSF recombinante (5 χ IO4 U/mL). Células dendriticas maduras foram estimuladas com 10 ng/mL de lipopolissacarideo de E. coli (LPS) ou 50 e 100 ng/mL de PEG de 4 braços BPPcisGlyc e BPPcisAda, respectivamente. Então, as células foram . duplamente marcadas com anticorpos específicos para CDllc (marcador de célula dendritica) em combinação com anticorpos anti-CD40, anti-CD54, anti-CD80, anti-CD86, anti-classe I ou MHC ou ant i-classe II do MHC. A expressão de CD40, CD80, CD54, CD86, anti classe I do MHC e classe II do MHC em células por CDllc foi analisada através de citometria de fluxo.
Figura 2: A Figura 2 ilustra as respostas celulares de células de baço re-estimuladas usando diferentes concentrações de PEG de 4 braços BPPcisGlyc ou BPPcisAda como adjuvante. As respostas proliferativas de células T de células do baço de camundongos Balb/c foram re-estimuladas in vitro durante 4 dias na presença de diferentes concentrações de 40 μg/mL de PEG de 4 braços BPPcisGlyc solúvel ou até 20 μg/mL de BPPcisAda. Os resultados são expressos como contagens por minuto (A) e (C) e índices de estimulação (cpm de amostras/cpm em células de controle não estimuladas) (B).
Figura 3: A Figura 3 demonstra as respostas celulares estimuladas após vacinação usando diferentes concentrações de PEG de 4 braços BPPcisGlyc como adjuvante, respostas proliferativas de células T β-galactosidase-específicas (30 μg/dose) apenas ou β-galactosidase misturada através das vias i.p. ou i.n. com β-galactosidase (30 μg/dose) apenas ou β-galactosidase misturada com diferentes doses de PEG de 4 braços BPPcisGlyc ou BPPcisPEG nos dias 0, 14 e 28. No dia 38 pós-imunização primária, os animais foram sacrificados e as células do baço foram re-estimuladas in vitro durante 4 dias na presença de diferentes concentrações de β-galactosidase solúvel. Os resultados são expressos como incorporação de timidina e como índices de estimulação (cpm de amostras/cpm em células de controle não estimuladas) (A) após administração i.n. ou como a incorporação de timidina e como índices de estimulação (cpm de amostras/cpm em células de controle não estimuladas) (B) após administração parenteral. (C) mostra o índice de estimulação para BPPcisAda. Figura 4: A Figura 4 mostra a dependência da concentração sobre a ativação de macrófago determinada por meio de produção de monóxido de nitrogênio (determinada espectroscopicamente a OD 550 nm). A liberação de NO de macrófagos re-estimulados usando diferentes concentrações (diluições seriais) do ativador de macrófago PEG de 4 braços BPPcisGlyc como adjuvante. Como controle positivo, a liberação de NO em macrófagos em resposta à diluições seriais de Malp-2 e em resposta à moléculas de PEG de 4 braços (controle negativo) são mostradas.
Figura 5: A Figura 5 ilustra as respostas humorais após vacinação usando PEG de 4 braços BPPcisGlyc e BPPcisAda, respectivamente, como adjuvante. Os camundongos foram imunizados através das vias. intranasal (i.n.) e subcutânea, transcutânea (vacinação tópica) (s.c.) com β- galactosidase (30 μg/mL) apenas ou β-galactosidase misturada com PEG de 4 braços BPPcisGlyc ou BPPcisAda nos dias 0, 14 e 28. No dia 38 pós-imunização primária, amostras de soro foram coletadas e a titulação de anticorpos β-galactosidase-especificos foi determinada através de ELISA. Como um controle, um grupo no qual os animais foram imunizados com β-galactosidase apenas foi usado (A). Em (B) e (C), a cinética de IgG no soro antígeno-específica é mostrada para vacinação intranasal (B) e vacinação parenteral (C), respectivamente. (D) demonstra que vacinação i.n. ou s.c. usando BPPcisAda resulta em uma expressão intensificada de IgG antígeno- específica. As diferenças eram estatisticamente significativas a ρ < 0,05 (*) com relação a camundongos que receberam antígeno apenas. Um representante de quatro experimentos independentes é mostrado. SEM é indicado por linhas verticais.
Figura 6 : A Figura 6 mostra a expressão de IgA secretória específica da β-gal em lavagens pulmonares e vaginais de camundongos imunizados i.n. As diferenças eram estatisticamente significativas a ρ < 0,05 (*) com relação a camundongos que receberam antígeno apenas. Um representante de quatro experimentos independente é mostrado. SEM é indicado por linhas verticais.
Figura 7: A Figura 7 mostra os perfis de Th em camundongos vacinados após re-estimulação in vitro. Citocinas secretadas por células de baço re-estimuladas in vitro foram determinadas em camundongos imunizados com CBA. Os resultados são expressos como as proporções de concentração de citocina (IL-10, a citocina mais proeminente detectada) (B) e (D) o índice de estimulação (A) e (C) . Figura 8: A Figura 8 proporciona a análise de isotipos de IgG específicos para beta-Gal em soro de camundongos imunizados. Isotipos de IgG específicos de anti-beta-Gal dos grupos imunizados com PBS, (controle) beta-Gal + PEG de 4 braços BPPcisGlyc ou BPPcisPEG (Figura 8A) ou BPPcisAda ou Ada apenas (Figura 8B) ou beta-Gal apenas em camundongos imunizados através da via i.n. ou s.c. foram determinados através de ELISA. Os resultados são expressos como titulações de end point. As titulações de IgG representam a média de cinco animais por grupo experimental. As diferenças eram estatisticamente significativas a ρ < 0,05 (*) com relação a camundongos que receberam antígeno apenas. Um representante de quatro experimentos independentes é mostrado. SEM é indicado por linhas verticais.
Figura 9: A Figura 9 proporciona o perfil de citocina (IFN γ, IL-4 e IL-2) secretada por células de baço re- estimuladas in vitro de camundongos vacinados com PEG de 4 braços BPPcisGlyc ou BPPcisMPEG (A) ou BPPcisAda (B) e o antígeno modelo β-gal (30 μg) apenas. Os resultados são expressos como unidades de formação de ponto com a base subtraída nos grupos imunizados com relação a camundongos de controle não imunizados. As diferenças eram estatisticamente significativas a ρ < 0,05 (*) com relação a camundongos que receberam antigeno apenas.
Figura 10: A Figura 10 proporciona exemplos específicos das unidades de polialquileno utilizáveis como parte da porção de conjugado de acordo com a presente invenção.
Figura 11: A Figura 11 mostra um conjugado particularmente preferido de acordo com a presente invenção, PEG de 4 braços BPPcisGlyc.
Figura 12: A Figura 12 demonstra que PEG de 4 braços BPPcisGlyc é estável após armazenamento durante 2 meses em temperatura ambiente.
Figura 13: A Figura 13 é um esquema da síntese de PEG de 4 braços BPPcisGlyc.
EXEMPLOS
Síntese de PEG de 4 braços BPPcisGlyc
0,1 mmol 27 mg) de 31-Amino-31-deoxiadenosina (3'- Ada) foram dissolvidos em 10 mL de DMSO excluindo a umidade. Após o que, 31-Ada foi incubado durante 30 min. com 0,125 mmoles de BPPcisGlyc (112 mg), 0,12 mmoles de diisopropil carbodiimida (DIC, 18,6 μl) e 0,12 mmoles de 1- hidroxibenzotriazola (HOBt, 16,2 mg). Após incubação durante a noite, o composto foi seco a vácuo, o resto foi misturado com metanol e restou um pó sólido branco amorfo (67 mg, rendimento de 59%) . 47 mg desse composto foram colocados em 1 mL de piperidina a 20% (em dimetilformamida (DMF) ) e secos a vácuo após 15 min. 0 livre foi limpo através de cromatografia em coluna (SC), a qual foi enchida com gel de silica (eluente: diclorometano e metanol em uma proporção de 9:1). Após essas etapas, 22 mg (rendimento de 60%) de um pó sólido branco amorfo foram obtidos. A estrutura química foi analisada através de 1H-RMN e análise espectral de massa. Havia duas possibilidades para otimizar a solubilidade e estabilidade de BPPcisAda: a) fosforilação seletiva do grupo 51-OH ou b) peguilação da posição 6 da estrutura do anel de adenina.
Síntese de PEG de 4 braços BPPcisGlyc
433 mg (0,48 mmoles) de composto 2 (veja figuras 13) foram dissolvidos em 10 mL de diclorometano anidro (DCM). Após curta incubação, diisopropilcarbodiimida a 80 MI (0,52 mmoles) 3 e 52 mg de hidroxibenzoatriazola anídrica (0,38 mmoles) 4 foram adicionados à solução. Após 15 min, a solução foi terminada com 216 mg de Celares 4braçosPEG (0,17 mmoles) 1 e 2,5 mL de dimetilf ormamida anidra (DMF) . Após mistura da solução durante a noite sob exclusão de umidade, a sonda foi concentrada via um evaporador de rotação. O resíduo foi dissolvido em uma pequena quantidade de DCM (cerca de 100 μΐ) e purificado através de cromatografia em coluna com gel de silica em DCM/metanol em uma proporção de 95:5/90:10. O composto 6 protegido contra fMOC foi dissolvido em 3 mL de DMF a qual foi completada com piperidina (20%) e, após 10 min., concentrado. O composto 6 foi purificado através de cromatografia em coluna com gel de silica e DCM/metanol em uma proporção de 95:5 e 85:15. Subseqüentemente, 200 mg (60% de composto 1) de composto 6 purificado foram caracterizados através de análise espectral por EM e RMN.
1. Estimulação in vitro de células dendríticas primárias de murino derivadas de medula óssea com PEG de 4 braços BPPcisGlyc ou BPPcisAda
Protocolo experimental: Culturas de células dendríticas primárias derivadas de medula óssea foram obtidas de camundongos BALB/c após uma maturação in vitro de precursores na presença de GM-CSF recombinante (5 χ 10^4 U/mL), de acordo com protocolos estabelecidos. Células dendríticas maduras foram estimuladas com 10 ng/mL de lipopolissacarídeo de E. coli (LPS) ou 5 ng/mL de PEG de 4 braços BPPcisGlyc. Após 12, 24 e/ou 48 h de estimulação, as células foram analisadas através de citometria de fluxo para avaliar a expressão de marcadores na superfície os quais são relevantes para sua capacidade de apresentação de antígeno. De forma a identificar compostos os quais podem ter potencial como adjuvantes para aplicações in vivo no campo de vacinologia, uma primeira seleção in vitro baseada no uso de culturas de células dendríticas primárias derivadas de medula óssea foi estabelecida. Células dendríticas foram selecionadas, uma vez que elas representam as células que apresentam antígenos mais eficientes e elas exercem um papel chave em respostas imunes primárias in vivo. Assim, culturas de células dendríticas foram tratadas com as porções testadas ou LPS, o qual foi usado como um controle positivo. Em diferentes intervalos de tempo, as amostras foram tomadas, coradas com anticorpos fluorescentemente marcados específicos para marcadores celulares críticos para as capacidades de apresentação de antígeno de células dendríticas e analisadas através de citometria de fluxo.
Os resultados obtidos (Figura 1) demonstraram que, em contraste ao controle positivo, a expressão de CD54 e as moléculas co-estimulatórias CD86 e CD80 foram super- reguladas em células dendríticas tratadas com PEG de 4 braços BPPcisGlyc. Por outro lado, o efeito sobre a expressão de CD4 0 foi marginal, se houve. Moléculas co- estimulatórias distribuem sinais os quais, além da apresentação dos epítopos processados por moléculas da classe Il do MHC, são essenciais para a ativação eficiente de células Τ. Foi anteriormente reportado que a capacidade adjuvante de adjuvantes mucosos bem estabelecidos, tal como toxina do cólera, envolve a super-regulação seletiva da expressão de moléculas co-estimulantes.
Para testar a capacidade estimulante de BPPcisAda sobre a maturação e ativação de CDs derivadas de medula óssea, CDs imaturas foram estimuladas in vitro com BPPcisAda. Marcadores na superfície sobre CDs estimuladas por CDllc+ foram investigados através de análise por citometria de fluxo (FACS) após 16 ou 40 h de pré- tratamento. Conforme mostrado na Figura 1B, a pré-incubação com 50 ng/mL de BPPcisAda resultou em uma expressão aumentada de moléculas das classes I e II do MHC. A expressão da molécula co-estimulatória CD86 também foi super-regulada após estimulação com BPPcisAda. CDs estimuladas com BPPcisAda também mostraram uma expressão intensificada da molécula de adesão ICAM-I (CD54). Nenhuma diferença na expressão de marcadores na superfície foi observada quando a concentração de MALP-2 foi intensificada para 100 ng/mL (não mostrado). Os resultados obtidos demonstram que pré-incubação de CDs imaturas com BPPcisAda resultou em ativação celular com expressão aumentada de moléculas das classes I e II o MHC, CD86 e CD54. 2. PEG de 4 braços BPPcisAda ou BPPcisGlyc estimulam eficientes respostas proliferativas in vitro mediadas por células T
Protocolo Experimental: Baços foram removidos e levados para análise de respostas imunes celulares. As células foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bezerro, 100 U/mL de penicilina, 50 μς/mL de estreptomicina, 2-mercaptoetanol a 5 χ IO"5 MeL- glutamina a 1 mM (GIBCO BRL, Karlsruhe, Alemanha) e mantidas a 37 0C em uma atmosfera umidif içada com 5% de CO2. Suspensões dos nódulos linfáticos e células do baço foram ajustadas para 5 χ IO6 células/mL em meio completo, as células foram cultivadas com 100 μΐ por poço em uma placa de microtitulação com 96 poços com fundo plano (Nunc) e as placas foram incubadas durante 4 dias na presença de diferentes concentrações de β-gal solúvel. Cada concentração foi testada em quadruplicata. Durante as 18 h finais de cultura, 1 μΟί de [3H]-timidina (Amersham International, Freiburg, Alemanha) foram adicionados a cada poço. As células foram, então, coletadas sobre filtros de papel (Filtermat A; Wallac, Freiburg, Alemanha) usando um coletor de células (Inotech, Wohlen, Suiça) e a quantidade de [3H]-timidina incorporada no DNA de células em proliferação foi determinado através de um contador de β- cintilação (Wallac 1450, Micro-Trilux). Os resultados são expressos como a média aritmética de captação de [3H]- timidina em cpm.
Respostas imunes mediadas por células T foram investigadas 48 h através de medição da proliferação de células recuperadas de baços após re-estimulação com PEG de 4 braços BPPcisGlyc ou BPPcisAda. Células de baço re- estimuladas com PEG de 4 braços ou Ada foram escolhidas como um controle negativo. A administração de PEG de 4 braços BPPcisGlyc ou BPPcisAda disparou a indução de uma resposta proliferativa eficiente a niveis sistêmicos (células de baço) com alto indice de estimulação (Figura 2).
3. PEG de 4 braços BPPcisGlyc ou BPPcisAda estimulam eficientes respostas proliferativas mediadas por células T quando co-administrados com antigenos solúveis
Protocolo Experimental: Baços de camundongos fêmeas BALB/c (H-2d, Harlan Winkelmann) de 6 semanas de idade foram removidos e levados para análise de respostas imunes celulares. As células foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bezerro, 100 U/mL de penicilina, 50 μg/mL de estreptomicina, 2-mercaptoetanol a 5 χ IO"5 M e L-glutamina a 1 mM (GIBCO BRL, Karlsruhe, Alemanha) e mantidas a 370C em uma atmosfera umidifiçada com 5% de CO2. Suspensões de dos nódulos linfáticos e células do baç-o foram ajustadas para 5 χ IO6 células/mL em meio completo, as células foram cultivadas com 100 μΐ por poço em uma placa de microtitulação com 96 poços com fundo plano (Nunc) e as placas foram incubadas durante 4 dias na presença de diferentes concentrações de β-gal solúvel. Cada concentração foi testada em quadruplicata. Durante as 18 h finais de cultura, 1 μΟί de [3H]-timidina (Amersham International, Freiburg, Alemanha) foi adicionado à cada poço. As células foram, então, coletadas sobre filtros de papel (Filtermat A; Wallac, Freiburg, Alemanha) usando um coletor de células (Inotech, Wohlen, Suiça) e a quantidade de [3H]-timidina incorporada no DNA de células em proliferação foi determinado através de um contador de β- cintilação (Wallac 1450, Micro-Trilux) . Os resultados são expressos como a média aritmética de captação de [3H]- timidina em cpm.
Respostas imunes mediadas por células T foram investigadas no dia 38 através de medição da proliferação de células recuperadas dos baços após re-estimulação in vitro com β-gal. Assim, os camundongos foram imunizados com β-galactosidase apenas ou β-galactosidase misturada com diferentes quantidades de PEG de 4 braços BPPcisGlyc ou BPPcisAda. Trinta e oito dias após vacinação, células do baço foram purificadas, re-estimuladas in vitro na presença de 20 μg/mL de β-galactosidase e sua capacidade proliferativa foi estimulada através de medição de incorporação de [3H]-timidina em seu DNA usando um contador de β-cintilação. Células de baço de animais imunizados apenas através de injeção s.c. de β-gal, as quais foram escolhidas como um controle positivo, exibiam uma resposta proliferativa significativa quando comparadas com o grupo não imunizado (Figura 3A). Outro aumento na proliferação foi notado em células do baço de animais co-administrados com PEG de 4 braços BPPcisGlyc e antigeno (p < 0,05). De nota, a resposta proliferativa de células T mais forte foi observada com células de baço de camundongos imunizados com PEG de 4 braços BPPcisGlyc e β-gal através da via i.n. e/ou s.c. Enquanto administração i.n. de β-gal apenas falhou em induzir a uma proliferação celular detectável, co- administração de PEG de 4 braços BPPcisGlyc disparou a indução de uma resposta proliferativa a níveis sistêmicos (células de baço), mostrado pelo índice de estimulação aumentado (Figura 3B). O uso do novo adjuvante mucoso PEG de 4 braços BPPcisGlyc em dosagens de 0,54 nmoles ou 2,71 nmoles, respectivamente, resultou em um aumento estatisticamente significativo (p < 0,05) da proliferação de células T. Ainda, conforme demonstrado na Figura 3A, PEG de 4 braços BPPcisGlyc em doses de 10 vezes abaixo das doses de BPPcisPEG levou a niveis iguais de estimulação. 4. Ensaio de liberação de monóxido de nitrogênio
Em resumo, macrófagos peritoneais de camundongos C3H/HeJ foram usados como a fonte de macrófago. Eles foram cultivados em placas de microtitulação com 96 poços e estimulados simultaneamente com IFN-γ e uma diluição serial de ativador de macrófago. Na medida em que necessário (isto é, R-Malp-2/padrão), os ativadores de macrófago foram dissolvidos em octilglicosideo a 25 mM na primeira etapa de diluição e, então, ainda diluídos com meio. Após um tempo de incubação de 45-48 horas, o nitrato foi reduzido com reductase de nitrato e a substância inicial, monóxido de nitrogênio, foi determinada, como a soma de nitrato e nitrito, usando reagente de Griess. 1 unidade (U)/mL é definida como a diluição na qual estimulação máxima ocorre.
Os resultados do teste de ativação de macrófago são mostrados na Figura 4. Pode ser observado a partir da figura que PEG de 4 braços BPPcisGlyc, isto é, um ativador de macrófago de acordo com a presente invenção, tem um potencial acentuadamente maior para ativação de macrófagos que tem o Malp-2 conhecido. A Figura 4 mostra que PEG de 4 braços BPPcisGlyc já obtém o mesmo grau de ativação de macrófago em uma concentração a qual é aproximadamente 10 a 100 vezes menor do que aquela de Malp-2. A Figura 4, além disso, mostra que esse efeito de ativação notável e inesperado no caso de PEG de 4 braços BPPcisGlyc não é perceptivelmente aperfeiçoado através de adição de um solubilizante, nesse caso, octilglicosídeo, enquanto que tal adição é requerida para que o efeito de Malp-2 seja visualizado otimamente. O novo conjugado de PEG de 4 braços BPPcisGlyc de acordo com a presente invenção, portanto, não requer qualquer solubilização adicional e possivelmente fisiologicamente desvantajosa, por meio de um solvente orgânico ou detergente. Outra vantagem de PEG de 4 braços BPPcisGlyc quando comparado com Malp-2 é a maior estabilidade, a qual pode ser atribuída ao fato da proteção com o PEG de 4 braços.
5. Co-administração intranasal e intraperitoneal de PEG de 4 braços BPPcisGlyc ou BPPcisAda com um antígeno solúvel estimula respostas humorais sistêmicas eficientes
Protocolo Experimental: camundongos BALB/c fêmeas de seis-oito semanas de idade (H-2d) foram adquiridos da Harlan Winkelmann GmbH (Borchen, Alemanha) e tratados de acordo com as diretrizes locais e da Comunidade Européia. Grupos de 5 camundongos foram, cada um, imunizados nos dias 1, 14 e 28 com 50 μ9 de β-gal (Boehringer, Mannheim, Alemanha), sozinho ou com 0,54 ou 2,71 nmoles PEG de 4 braços BPPcisGlyc sintético, 4 nmoles de BPPcisPEG ou BPPcisAda (10 μg, 10,8 nmoles) ou Ada apenas (10 μg) . Para imunização intranasal (i.n.), 10 μΐ foram aplicados a cada narina, enquanto que, para injeção s.c., β-gal com ou sem PEG de 4 braços BPPcisGlyc foi resuspenso em 250 μl de PBS. Amostras de soro foram coletadas em diferentes pontos de tempo (dias 0, 13, 27 e 38) após imunização e armazenadas a -200C antes de determinação de anticorpos β-gal- específicos. Placas de ensaio Nunc-Immuno MaxiSorp com 96 poços (Nunc, Roskilde, Dinamarca) foram revestidas com 100 μL de β-gal (Boehringer, Mannheim, Alemanha) a 5 μg/ml em tampão de carbonato a 0,05M (pH de 9,6) por poço. Diluições seriais de duas vezes de soros ou lavagens em PBS com BSA a 1% e Tween 20 a 0,05% foram adicionadas (100 μl/poço) e as placas incubadas durante 2 h a 37°C. Após lavagem, IgG biotinilada anti-camundongo de cabra específica para cadeia Y (Sigma Chemie, Deisenhofen, Alemanha) foi adicionada e as placas foram incubadas durante mais 1 h a 37°C. Após quatro lavagens, 100 μΐ de estreptavidina conjugada a peroxidase (Pharmingen) foram adicionados às células e as placas incubadas a 37°C durante 3 0 min. Após quatro lavagens, as reações foram reveladas com ABTS em tampão de citrato- fosfato a 0, IM (pH de 4,35) contendo H2O2 a 0,01%. Os pontos finais das titulações foram expressos como o Iog2 recíproco da última diluição, o que proporcionou uma densidade a 405 nm de 0,1 unidade acima dos valores dos controles negativos após 15 a 30 min de incubação.
Considerando os resultados encorajadores obtidos nos estudos preliminares, foi decidido analisar em detalhes as respostas imunes obtidos através de estimulação com PEG de 4 braços BPPcisGlyc como adjuvante pelas duas vias mais efetivas, isto é, s.c. e i.n. e comparar com um adjuvante mucoso bem estabelecido. Assim, a capacidade de PEG de 4 braços BPPcisGlyc de estimular respostas imunes humorais eficientes foi avaliada, através da determinação dos títulos de anticorpos específicos para β-gal. Conforme mostrado na Figura 5, administração i.n. de β-gal apenas (30 μg/dose) resultou na indução de títulos muito baixos de anticorpo, mesmo após o segundo reforço. Em contraste, na presença de PEG de 4 braços BPPcisGlyc ou BPPcisAda, administração i.n. de β-gal induziu a títulos muito altos de IgG específica em todos os camundongos já após uma dose (Figura 5B). A cinética e eficácia global das respostas de anticorpo obtidas usando PEG de 4 braços BPPcisGlyc foram similares àquelas observadas através de administração de β- gal através da via s.c.
Uma capacidade adjuvante significativa também foi observada quando PEG de 4 braços BPPcisGlyc ou BPPcisAda foi administrado através da via s.c. Especificamente, co- injeção de PEG de 4 braços BPPcisGlyc ou BPPeisAda resultou em títulos de IgG específicos para β-gal aumentados em comparação com animais imunizados com β-gal apenas (Figuras 5C e D) . Essa diferença já estava presente após a primeira imunização e foi mantida nas injeções de reforço. Titulações similares de anticorpo foram detectadas no dia 38 em animais imunizados através da via i.n. ou s.c. Contudo, respostas primárias após co-administração de PEG de 4 braços BPPcisGlyc eram mais pronunciadas quando por imunização i.n.
6. Co-administração intranasal de PEG de 4 braços BPPcisGlyc ou BPPcisAda com iam antígeno solúvel estimula respostas eficientes de anticorpo mucoso
Protocolo Experimental: No dia 38, os camundongos foram sacrificados e a amostragem final foi realizada. Lavagens vaginais e pulmonares foram obtidas através de fluxo dos órgãos com 1 ml de PBS suplementado com EDTA a 50 mM, BSA a 0,1% e PMSF a 10 mM. As lavagens foram, então, centrifugadas para remover os restos (10 min a 3000 χ g) e os fluidos de sobrenadante foram armazenados a -20°C. Para determinar a concentração de IgA total presente nas lavagens pulmonares e vaginais, diluições seriais das amostras correspondentes foram incubadas em placas de microtitulação que foram previamente revestidas com IgA anti-camundongo de cabra (Sigma Chemie), como anticorpos de captura (100 μl/poço). Diluições seriais de IgA de camundongo purificada (Sigma Chemie) foram usadas para gerar uma curva padrão.
Para investigar a capacidade de PEG de 4 braços BPPcisGlyc ou BPPcisAda de estimular respostas mucosos contra antígenos co-administrados através da via i.n., a produção de IgA β-gal-específica em lavagens pulmonares e vaginais (Figura 6A) ou para BPPcisAda (Figura 6B) de animais imunizados foram analisadas. Um BPPcisMPEG de controle foi usado. Esse composto compreende a conjugação de BPPcis com um tipo de PEG o qual tem um maior peso molecular (peso molecular médio de 5000 Da) ao invés do PEG comumente usado (peso molecular médio de 2000 Da). Enquanto imunização i.n. apenas com β-gal falhou em estimular a produção de níveis detectáveis de IGA específica para β-gal em lavagens pulmonares, um aumento significativo nos níveis de IgA antígeno-específica foi detectado em animais imunizados com β-gal e PEG de 4 braços BPPcisGlyc (Figura 6A). Co-administração de PEG de 4 braços BPPcisGlyc resultou na estimulação de produção de IgA eficiente também em locais mucosos distantes, conforme demonstrado pela presença de concentrações significativas de IgA específica para β-gal em lavagens vaginais (Figura 6A) . Nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observada nos níveis de anticorpos mucosos, específicos para β-gal entre animais imunizados com diferentes doses de PEG de 4 braços BPPcisGlyc. Os mesmos resultados foram obtidos usando BPPcisAda (10 μg) , veja Figura 6B. Em camundongos BALB/c, administração intranasal de diferentes doses de BPPcisAda mais β-Gal estimulou níveis significativamente maiores de respostas de IgA específicas para β-Gal em Lavagens Bronco Alveolares (LBA) e lavagens vaginais (LV), bem como de respostas de IgG específicas para β-Gal em soros do que administração intranasal apenas com ovalbumina (OVA). Adicionalmente, a administração intranasal de β-gal com BPPcisAda intensifica significativamente os níveis de IgGl e IgG2a específicos para β-gal ou OVA (não mostrado). Ainda, níveis significativos de IL-2 e IL-4 foram induzidos em todos os grupos co-administrados com BPPcisAda (Figura 6B).
7. Análise de padrões de células T auxiliares usando PEG de 4 braços BPPcisAda ou BPPcisGlyc como adjuvante Protocolo Experimental:
ELISA Isotyp: Placas de ensaio ELISA Nunc-Immuno MaxiSorp com 96 poços (Nunc, Roskilde, Dinamarca) foram revestidas com 100 μl de β-gal (Boehringer, Mannheim, Alemanha) a 5 μg/ml em tampão de carbonato a 0,05M (pH de 8,2) por poço. Diluições seriais de duas vezes de soros ou lavagens em PBS com BSA a 1% e Tween 20 a 0,05% foram
adicionadas (100 μl/poço) e as placas incubadas durante 2 h a 37°C. Após lavagem, IgG1 ou IgG2a anti-camundongo de rato conjugada à biotina (Pharmingen, Hamburg, Alemanha) foram adicionadas para determinar as subclasses de IgG. As placas foram incubadas durante mais 1 h a 37°C. Após quatro lavagens, 100 μl de estreptavidina peroxidase-conjugada (Pharmingen) foram adicionados às células e as placas incubadas a 37°C durante 30 min. Após quatro lavagens, as reações foram reveladas com ABTS em tampão de citrato- fosfato a 0,1M (pH de 4,35) contendo H2O2 a 0,01%. Para determinar a concentração de subclasses de IgG no soro, curvas padrões foram obtidas através de revestimento dos poços com uma IgG anti-camundongo de cabra específica para isotipo e, então, através de incubação com anticorpos de IgGl ou IgG2a de camundongo purificada (Dianova, Hamburg, Alemanha).
0 padrão das diferentes subclasses dos isotipos de IgG antígeno específico para β-gal presentes no soro de camundongos vacinados é mostrado na Figura 8. A Figura 8A mostra os resultados para administração intranasal de β-gal pura, β-gal e BPPcisMPEG ou PEG de 4 braços BPPcisGlyc. 0 protocolo para vacinação foi idêntico ao protocolo descrito no Exemplo 2. Conforme pode ser determinado a partir da Figura 8, a quantidade de anticorpos antígeno-específicos do subtipo IgGl e do isotipo IgG2a estava fortemente aumentada após administração intranasal do antígeno usando PEG de 4 braços BPPcisGlyc ou BPPcisAda como adjuvante mucoso. Ainda, também no caso de administração sistêmica, aqui administração subcutânea, a expressão do isotipo IgGl, bem como do isotipo IgG2a é fortemente aumentada para BPPcisAda, veja Figura 8B. Os dados representam a titulação média de um grupo de 5 animais.
Assim, o uso de c-diAMP permite estimular uma forte resposta de anticorpo antígeno-específica. 0 disparo pode ser observado não apenas após administração intranasal, mas também após administração parenteral.
Arranjo em Leito Citométrico: sobrenadantes de cultura de células em proliferação foram coletados nos dias 2 e 4, e armazenados a -70°C. Determinações de IFN-γ, TNF-a, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-IO e IL-12 foram realizadas através de análise de arranjo em leito citométrico usando o kit comercial da BD, usando as instruções do fabricante. Uma curva padrão foi gerada para cada citocina usando as citocinas de murino recombinantes correspondentes (Pharmingen). Sondas foram incubadas em temperatura ambiente durante mais 2 h. As sondas foram, então, analisadas através de citometria de fluxo, conforme descrito pelo protocolo da BD.
Para caracterizar o tipo de resposta Th estimulada após imunização, o teor de IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-12 e TNF-a foi medido em sobrenadantes de células de baço re-estimuladas in vitro (Figura 7). Dentre essas citocinas, descobriu-se que IL-IO era a mais proeminente, sugerindo que um padrão de resposta Th2 dominante foi estimulado. Os níveis de IL-10 eram significativamente maiores em camundongos vacinados com PEG de 4 braços BPPcisGlyc através da via i.n. Na verdade, a forte estimulação de secreção de IL-10 é congruente com o papel exercido por essa citocina na inibição de síntese de citocina por células Thl, a intensificação de proliferação de células Bea estimulação de produção de IgA.
Para BPPcisAda, a produção de IL-10 foi significativamente aumentada no baço. Um nível muito alto de IL-10 foi induzido através de aumento da dose do antígeno β-gal, enquanto que os níveis de IFN-γ, TNF-α, IL- 2 e IL-6 mostraram apenas um aumento mais fraco na secreção de citocina em resposta ao antígeno β-gal no baço. Para avaliar a resposta imune celular epítopo-específica induzida pela co-administração de BPPcisAda através das vias intranasal, subcutânea ou intramuscular, células T CD8+ que produzem IFN-α foram analisadas após estimulação de esplenócitos com os peptídeos de β-gal restrito ã classe I do MHC (TPHPARIGL) ou OVA (SINFEKL). O número de células T CD8+ que secretam IFN-α foi significativamente diminuído em comparação com grupos imunizados com β-gal ou grupos tratados com OVA apenas (não mostrado). Esses resultados demonstraram que a co-administração mucosa e parenteral de BPPcisAda induz a uma resposta imune Th2 dominante.
De modo interessante, uma menor secreção de citocinas- Thl IL- 2 e IFN-α também foi estimulada em células de camundongos vacinados com β-gal e PEG de 4 braços BPPcisAda ou BPPcisGlyc através da via i.n. Esses resultados confirmam que, embora respostas do tipo Th2 sejam prevalentes, PEG de 4 braços BPPcisAda ou BPPcisGlyc também ajuda a estimular as células Thl.
8. Análise dos padrões de células T auxiliares estimuladas usando PEG de 4 braços BPPcisGlyc ou BPPcisAda como adjuvante através de Elispot
Protocolo Experimental: Baços foram removidos e levados para análise de respostas imunes celulares. As células foram cultivadas em RPMI 16040 suplementado com soro fetal de bezerro a 10%, 100 U/mL de penicilina, 50 μg/mL, de estreptomicina, 2-mercaptoetanol a 5 χ 10~5 MeL- glutamina a 1 mM (GIBCO BRL, Karlsruhe, Alemanha) e mantidas a 370C em uma atmosfera umidifiçada com 5% de CO2. Suspensões de nódulos linfáticos e células de baço foram ajustadas para 5 χ IO6 células/mL em meio completo, as células foram cultivadas com 100 μl por poço em uma placa de microtitulação com fundo redondo com 96 poços (Nunc) e as placas foram incubadas durante 4 dias na presença de diferentes concentrações de β-gal solúvel. Placas ELISPOT revestidas com 100 μl/poço de anticorpo de captura purificado a 100 μg/mL em tampão de revestimento foram incubadas a 4°C durante a noite. Após seis etapas de lavagem, as placas foram bloqueadas com 200 μl/poço de RPMI-1640 completo em temperatura ambiente durante 1 hora. As células ativadas foram cultivadas a 100 μl por poço e incubadas a 37°C em uma incubadora umidifiçada com 5% de CO2 durante 24 horas ou 48 horas. Após cinco etapas de lavagem com tampão de lavagem e uma etapa com água destilada, 100 μl/poço do anticorpo de detecção biotinilado com uma concentração de 1 μg/mL em Diluente de Ensaio foram adicionados e incubados em temperatura ambiente durante duas horas. Após outras etapas de lavagem, 100 μl/poço do AV-HRP em uma diluição de 1/1000 em Diluente de Ensaio foram adicionados e incubados em temperatura ambiente durante 30 minutos. Após outras etapas de lavagem, 100 mL/poço de Solução de Substrato AEC foram adicionados e revelados em temperatura ambiente durante 20-60 minutos até que pontos visíveis aparecessem. Após etapas de lavagem com (3x) 200 μl/poço de água destilada, as placas foram secas ao ar e analisadas através de contagem dos pontos através de um leitor ELISPOT. Cada concentração' foi testada em triplicata.
Um incremento no número de células esplênicas que produ zem XFN-Ot foi observado em animais imunizados com β— gal e PEG de 4 braços BPPcisGlyc ou BPPcisAda (Figuras 9A e 9B) em resposta à re-estimulação com um peptídeo abrangendo o epítopo imunodominante restrito à classe I do MHC de β-galactosidase. Além disso, uma expressão intensificada de células esplênicas que produzem IL-2 e IL- 4 foi mostrada em camundongos imunizados com β-gal e PEG de 4 braços BPPcisGlyc ou BPPcisAda através da via i.n. e mesmo através da via s.c.

Claims (32)

1. Conjugado de bisaciloxipropilcisteína caracterizado pelo fato de ser de acordo com a fórmula 1: onde <formula>formula see original document page 72</formula> R1 e R2 podem ser idênticos ou diferentes e são porções acila; L é uma porção ligante selecionada do grupo NHi O, S ou OCO; R3 é uma porção conjugada covalentemente ligada compreendendo pelo menos duas unidades de polialquileno glicol da fórmula: <formula>formula see original document page 72</formula> a qual pode ser idêntica ou diferente, onde X1 é um hidrogênio oü um hidrocarboneto o qual pode conter heteroátomo(s); R4 é, independentemente, qualquer um de hidrogênio, OH7 um grupo C1-C6 alquila reto ou ramificado, OR5 ou CO-R5; R5 é, independentemente, qualquer um de hidrogênio ou um grupo C1-C6 alquila reto ou ramificado; R6 é, independentemente, qualquer um de hidrogênio, OH, OR5 ou NR7R8; R7 e R8 são, independentemente, qualquer um de hidrogênio ou hidrocarboneto, o qual pode conter heteroátomo(s) e o qual pode formar um anel; η é um número inteiro de 1 a 100; χ é, independentemente, um número inteiro de 1 a 10; y é um número inteiro de 0 a 10.
2. Conjugado de bisaciloxipropilcisteína caracterizado pelo fato de ser de acordo com a fórmula 1: <formula>formula see original document page 73</formula> onde R1 e R2 podem ser idênticos ou diferentes e são porções acila; L é amino-3'-deoxiadenoaina, amino-3'-deoxiguanosina, amino-3'-deoxiinosina ou amino-3'-deoxixantina; e R3 pode estar ausente ou pode ser covalentemente ligado ao resíduo de purina e é pelo menos uma unidade de polialquileno glicol da fórmula: <formula>formula see original document page 74</formula> a qual pode ser idêntica ou diferente; onde X1 é um hidrogênio ou um hidrocarboneto o qual pode conter heteroátomo(s); R4 é, independentemente, qualquer um de hidrogênio, 0H, um grupo Ci-C6 alquila reto ou ramificado, OR5 ou CO-R6; R5 é, independentemente, qualquer um de hidrogênio ou um grupo C1-C6 alquila reto ou ramificado; R6 é, independentemente, qualquer um de hidrogênio, OH, OR5 ou NR7R8 ; R7 e R8 são, independentemente, qualquer um de hidrogênio ou hidrocarboneto, o qual pode conter heteroátomo (s) e o qual pode formar um anel; η é um número inteiro de 1 a 100; χ é, independentemente, um número inteiro de 1 a 10; y é um número inteiro de 0 a 10.
3. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que os resíduos Ri e R2, os quais podem ser idênticos ou diferentes, são um grupo acila C7-C25.
4. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 3, caracterizado pelo fato de que o grupo acila é um grupo C8-C22 alquila reta, cíclica ou ramificada, C8-C22 alquenila reta, cíclica ou ramificada, C8-C22 alquinila reta, cíclica ou ramificada o qual pode ser opcionalmente substituído.
5. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o conjugado é um conjugado de S-[2,3-bis(acilóxi)-(2S)- propil] -L-cisteinilcarbóxi, de preferência um conjugado de S- [2, 3-bis (palmitoilóxi) - (2S) -propil] -L-cisteinilcarbóxi.
6. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o conjugado é um conjugado de S-[2,3-bis(acilóxi)-(2R)- propil]-L-cisteinilcarbóxi, de preferência um conjugado de S- [2,3 -bis (palmitoilóxi) - (2R) -propil] -L-cisteinilcarbóxi.
7. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que, em R3, as unidades de polialquileno glicol são compostas de unidades de etileno glicol, propileno glicol e/ou butileno glicol ou combinações das mesmas e η é um número inteiro de 3a 50.
8. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que X1 é, independentemente, um grupo metóxi ou etóxi.
9. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que, em R3, as unidades de polialquileno glicol são unidades de metoxipolietileno glicol em que η é, independentemente, de -3 a 10, de preferência independentemente de 3 ou 4.
10. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a porção conjugada é (S)-10-amino-6,9,13,16-tetraoxo- N, N' , 8,14- tetrakis (3,6,9,12-tetraoxatridec-l-il) -5, 8,14,17- tetraazahenicosano-1,21-diamida.
11. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o conjugado é o conjugado de acordo com a fórmula (2):
12. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender um conjugado conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 e um veículo, diluente, conservante, adjuvantes, imunomoduladores ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
13. Uso de um conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 caracterizado pelo fato de ser para o preparo de um produto farmacêutico para prevenir ou tratar doenças infecciosas, choque séptico, câncer, tumores, doenças autoimunes, alergias ou processos inflamatórios crônicos ou agudos.
14. Uso de um conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 caracterizado pelo fato de ser para o preparo de um produto farmacêutico para controlar a fertilidade em populações de seres humanos ou animais.
15. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a doença infecciosa é produzida por um agente infeccioso selecionado dentre aqueles que causam doença em seres humanos ou animais ao nível do trato respiratório, trato gastrintestinal, trato genito-urinário, sistema óaseo-articular, sistema cardiovascular, sistema neurõnal, pele ou mucosa.
16. Uso de um conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 caracterizado pelo fato de ser para ativação ou intensificação in vitro e/ou in vivo da função de apresentação de antígeno de células que apresentam antígeno para uma intervenção terapêutica ou profilática.
17. Uso de um conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 caracterizado pelo fato de ser para estimulação de macrófagos e células dendríticas e a produção de anticorpo ou o preparo de vacinas baseadas em células como estimulantes imunes.
18. Uso de um conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 caracterizado pelo fato de alvejar células in vitro, in vivo ou ex vivo expressando moléculas de receptor semelhante a Toll, tais como o receptor TLR-I, TLR-2 e/ou TLR-6, para uma intervenção profilática ou terapêutica.
19. Uso de um conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 caracterizado pelo fato de melhorar a eficácia de vacina através de ter como alvo células expressando o receptor Toll 2 e/ou Toll 6.
20. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender um composto.ou conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 à 11 como um adjuvante, um ingrediente farmaceuticamenté ativo e um veiculo, diluente, conservante, outros adjuvantes que não os compostos ou conjugados de acordo com qualquer uma das reivindicações de -1 a 9, imunomoduladores ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
21. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica é uma vacina profilática ou terapêutica.
22. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizada pelo fato de que o(s) ingrediente(s) ativo(s) compreende(m) pelo menos um ou mais diferentes antigenos na forma de peptídeos, proteínas, polissacarídeos, glicolipídios ou DNA que codifica os mesmos e/ou sistemas de distribuição de antígeno, tais como virossomas, partículas físicas, de preferência micropartícuias, nanopartícuias, lipossoma, ISCOM, copolímero e/ou partícula biológica, de preferência inóculos bacterianos, partículas semelhantes a vírus (VLP), partículas semelhantes â polioma (PLP) ou vacinas atenuadas.
23. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que os antigenos são antígeno(s) tumorígeno(s) ou antígeno(s) derivado(s) de agentes infecciosos para prevenir ou tratar doenças infecciosas, choque séptico, câncer, tumores, doenças autoimunes, alergias ou processos inflamatórios crônicos ou agudos.
24. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 a 23, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é misturado ou co-formulado com o antígeno.
25. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 0 a 24, caracterizada pelo fato de ainda compreender uma ou mais moléculas anti- inflamatórias, moléculas anti-angiogênicas, moléculas citotóxicas, moléculas imunomodulatórias, de preferência quimiocinas, citocinas, ligante CD4 0, moléculas co- estimulatórias ou anticorpos ou misturas dos mesmos.
26. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 a 25, caracterizada pelo fato de que o(s) antígeno(s) e/ou conjugado está(ão) associado(s) e/ou incorporado(s) e/ou revestido(s) sob uma partícula física, de preferência micropartícula, nanopartícula, lipossoma, ISCOM, copolímero e/ou partícula biológica, de preferência inóculos bacterianos, virossomas, partículas semelhantes a vírus (VLP), partículas semelhantes a polioma (PLP) ou vacinas atenuadas.
27. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 a 26, caracterizada pelo fato de ser fornecida em uma formulação adequada para administração mucosal, em particular para administração intranasal, intra NALT, oral, intra-retal, intrapulmonar, intrabrônquica, intratecal, conjuntival, intra-vaginal ou intra-uretral, administração para dentro dos dutos mamários da mama ou através de inalação.
28. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 0 a 26, caracterizada pelo fato de ser fornecida em uma formulação adequada para administração parenteral, em particular em administração subcutânea, transcutânea (vacinação tópica), intravenosa, intradérmica ou intramuscular.
29. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 a 28, caracterizada pelo fato de ser uma composição combinada para uso simultâneo, separado ou seqüencial na prevenção ou tratamento de doenças infecciosas, cânceres, tumores, doenças autoimunes ou alergias, ou processos inflamatórios crônicos ou agudos ou para controlar a fertilidade em populações de seres humanos e animais.
30. Kit caracterizado pelo fato de compreender um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11.
31. Kit, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de compreender um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 como um adjuvante e uma estrutura antigênica e, opcionalmente, um veículo, diluente, conservante, outros adjuvantes que não os conjugados conforme definidos em qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, imunomoduladores ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
32. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de conter um conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 como imunomodulador para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas, cânceres, tumores, doenças autoimunes ou alergias ou processos inflamatórios crônicos ou agudos ou para controlar a fertilidade em populações de seres humanos e animais.
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