BRPI0617456A2

BRPI0617456A2 - vacina À base de vetor lentiviral

Info

Publication number: BRPI0617456A2
Application number: BRPI0617456-6A
Authority: BR
Inventors: Pierre Charneau; Philippe Despres
Original assignee: Pasteur Institut
Priority date: 2005-10-17
Filing date: 2006-10-17
Publication date: 2011-07-26
Also published as: CA2626079A1; KR20080066042A; ZA200803058B; AU2006310173B2; US20070087354A1; WO2007052165A2; CN101291688A; US8158413B2; EP1948228A2; WO2007052165A3; AU2006310173A1; JP2009511623A

Abstract

<B>VACINA À BASE DE VETOR LENTIVIRAL<D>A presente invenção refere-se a métodos para provocar respostas humorais, métodos de imunização e métodos de vacinação usando vetor lentiviral. Além disso, apresentam-se composições imunogênicas e vacinas para vírus do Nilo Ocidental.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VACINA À BASE DE VETOR LENTIVIRAL".

Descrição da Invenção

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a um vetor lentiviral, a métodosde transferência de genes, imunização e vacinação usando o vetor lentiviral,a processos para a produção de polipeptídios recombinantes, a anticorposgerados contra esses polipeptídios e ao uso dessas moléculas em métodosdiagnósticos, kits, composições imunogênicas, vacinas e terapia antiviral.

Antecedentes da Invenção

Nos últimos anos, vetores de transferência de genes Ientiviraisganharam um considerável interesse na comunidade de terapia genética.Essa reputação sem igual é devida à sua capacidade de transferir de manei-ra eficiente e estável genes terapêuticos ou repórteres a uma grande varie-dade de células e tecidos de importância chave para intervenção terapêuti-ca, como células-tronco hematopoiéticas, cérebro, fígado e retina (vide [1-4],entre outros). Os vetores Ientivirais conseguem uma elevada eficiência detransdução, independentemente do status proliferativo das células alvo, su-perando, dessa forma, uma das principais limitações dos vetores retroviraisderivados de oncovírus, em que a transdução se restringe a células em divisão.

Essa vantagem se reflete em inúmeros testes pré-clínicos bem-sucedidos em vários modelos animais de doenças humanas (vide [5-11],entre outros), e se traduzirá indubitavelmente em sua exploração em umnúmero crescente de ensaios clínicos.

Mais recentemente, os vetores Ientivirais também se mostraramvetores de vacinação promissores. A maioria dos estudos até agora focali-zou a indução de respostas imunes celulares no campo de imunoterapia an-titumoral [12-18], alguns poucos também focalizaram a indução de imunida-de celular protetora contra vírus [19-21],

Sua capacidade de transduzir células dendríticas (DCs) não emdivisão com alta eficiência, ex vivo [12, 14, 15, 19], assim como in vivo [13,18, 22], responde por sua capacidade de gerar fortes respostas CTL.

De fato, relatos usando vetores Ientivirais para estimular imuni-dade antitumoral mostram resultados muito promissores. DCs humanastransduzidas por vetores Ientivirais que expressem antígenos tumorais esti-mulam respostas CTL específicas in vitro [12, 14, 15, 18]. Em camundongos,a injeção de particulares de vetores Ientivirais ou DCs transduzidas com ve-tor Ientiviral induzem respostas imunes celulares antitumorais fortes e espe-cíficas [13, 15, 18] e conferem proteção contra desafios tumorais [12, 17].Essas respostas são mais potentes do que as obtidas pela imunização clás-sica com peptídio mais adjuvante [13] ou mesmo células apresentadoras deantígeno (APCs) pulsadas com peptídio, quer ensaiadas ex vivo [20], quer invivo [16, 21]. A vantagem observada poderia ser devida à apresentação con-tínua do antígeno em APCs transduzidas com vetor, em contraste com aapresentação de antígeno transitória que se segue ao pulso com peptídio deAPCs [16, 20],

Até agora, pouco se sabe da capacidade de vetores Ientiviraisde estimular uma imunidade protetora à base de anticorpos. Todavia, suaalta eficiência de transdução também poderia lhes conferir uma forte capaci-dade de induzir imunidade humoral. Além disso, seu tropismo aparentemen-te preferencial para DCs, quando injetado in vivo [13, 18, 22], poderia au-mentar ainda mais sua capacidade de gerar uma imunidade protetora base-ada em anticorpo, pois DCs são estimulantes poderosos de células T CD4,que são necessárias para o desenvolvimento correto de uma resposta imuneà base de células B. Além disso, em um cenário de vacinação, a expressãoestável do antígeno de células transduzidas poderia evitar a necessidade devárias injeções.

De fato, é amplamente aceito que a resposta imune humoral é ocomponente essencial da imunidade protetora contra o Vírus do Niio Ociden-tal (WNV) [23 - 25]. A E-glicoproteína de invólucro de WNV, que possui epí-topos neutralizadores [26], gera respostas imunes protetoras, quando injeta-da como um antígeno recombinante [27] ou expressada por DNA nu [28] ouum vetor de sarampo replicativo [29]. O fato de a transferência passiva deanticorpos neutralizadores contra a forma solúvel da E glicoproteína de invó-lucro (sE) de WNV cepa IS-98-ST1 proteger camundongos contra encefalitepor WNV também demonstra que a resposta humoral é suficiente para a pro-teção contra desafio com WNV [29].

O WNV é um flavivírus transportado por mosquitos no sorocom-plexo de encefalite japonesa da família Flaviviridae. É transmitido em ciclosnaturais entre aves e mosquitos, mas pode infectar muitas espécies de ma-míferos [30]. WNV zoonótico recentemente se tornou uma grande preocupa-ção de saúde na América do Norte, no Oriente Médio e na Europa devido àemergência de uma cepa mais virulenta em Israel em 1998 e, então, em No-va Iorque em 1999 (Isr98/NY99). Manifestações clínicas graves da infecçãopor WNV essencialmente envolvem o sistema nervoso central e podem cau-sar mortalidade significativa em seres humanos e em uma grande gama deespécies de animais, particularmente cavalos e aves (para uma revisão, vide[30]). Como conseqüência, há uma demanda urgente pelo desenvolvimentode uma vacina eficiente que possa conferir uma imunidade rápida, forte e delonga duração.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção ajuda a atender a essas necessidades na técnica.Esta invenção se refere ao potencial de vetores Ientivirais de gerar uma res-posta imune humoral. Investigou-se se a imunização com uma vacina debase Ientiviral poderia proteger contra a infecção pelo Vírus do Nilo Ociden-tal (WNV). Descobriu-se, surpreendentemente, que vetores Ientivirais podemgerar imunidade protetora com base em anticorpos.

Na presente invenção, avaliou-se o potencial de uma vacina àbase de vetor Ientiviral de gerar imunidade humoral contra o Vírus do NiloOcidental (WNV), um flavivírus transportado por mosquitos que causa ence-falite em seres humanos, aves e cavalos. Notavelmente, uma única imuniza-ção com uma dose diminuta de TRIP/sEwnv, um vetor Ientiviral que expressaa forma solúvel secretada da E-glicoproteína de invólucro (sEwnv) da cepaIS-98-ST1 altamente virulenta de WNV, induziu uma resposta humoral espe-cífica e proteção contra infecção por WNV em um modelo de camundongoda encefalite por WNV. Essa única imunização gerou uma imunidade humo-ral de longa duração, protetora e esterilizante apenas uma semana após oprimeiro contato. Esses resultados demonstram a aplicabilidade de vetoresIentivirais como vacinas não replicantes eficientes contra patógenos para osquais uma resposta humoral neutralizadora seja ativamente requerida paraimunidade protetora. o vetor Ientiviral TRIP/sEWnv parece ser uma ferramen-ta promissora para vacinação veterinária contra WNV zoonótico.

Assim, esta invenção apresenta um método de produção de an-ticorpos in vivo, compreendendo a administração de um vetor Ientiviral a umanimal, em que o lentivírus compreende um ácido nucléico heterólogo quecodifica um antígeno, e em que o antígeno gera uma resposta humoral noanimal. A invenção engloba um vetor Ientiviral que induz imunidade protetoraa um animal necessitado, incluindo, por exemplo, imunidade protetora delonga duração e imunidade esterilizante. Em uma modalidade, o animal ne-cessitado é selecionado de seres humanos, cavalos, aves, galinhas, porcos,gado, incluindo bovinos, ovinos e caprinos, roedores, incluindo hamsters,ratos e camundongos, animais de estimação e répteis.

Esta invenção também apresenta um método de produção deanticorpos in vivo, compreendendo a administração de um vetor Ientiviral aum animal, em que o lentivírus compreende um ácido nucléico heterólogoque codifica um antígeno, e em que o antígeno gera uma resposta humoralno animal, em que o vetor Ientiviral induz imunidade protetora contra um mi-croorganismo infeccioso. Em uma modalidade, o microorganismo infecciosoé o Vírus do Nilo Ocidental. Em outra modalidade, e o vetor Ientiviral com-preende um ácido nucléico que codifica um peptídio ou polipeptídio portandopelo menos um epítopo Β. O polipeptídio portando pelo menos um epítopo Bpode ser, por exemplo, uma proteína de membrana de microorganismo ouseu fragmento e, em particular, a E-glicoproteína de invólucro do Vírus doNilo Ocidental ou seu fragmento. O vetor Ientiviral pode compreender uma Eglicoproteína truncada na terminação carboxila do Vírus do Nilo Ocidental,sem a região de ancoragem transmembrana, por exemplo, uma E-glicoproteína truncada na terminação carboxila compreendendo os resíduos1 - 441 da E-glicoproteína de invólucro de vírus do Nilo Ocidental cepa IS-98-ST1. Em outra modalidade, o ácido nucléico heterólogo codifica uma va-riante da E-glicoproteína de invólucro do Vírus do Nilo Ocidental. A invençãoengloba um ácido nucléico heterólogo variante que se hibridiza sob condi-ções de hibridização rigorosa, que serão descritas adiante, a um ácido nu-cléico do Vírus do Nilo Ocidental cepa IS-98-ST1, que codifica a E-glicoproteína de invólucro.

A invenção também apresenta um método de vacinação de umanimal contra infecção pelo Vírus do Nilo Ocidental, compreendendo a ad-ministração a um animal necessitado, uma ou mais vezes, de um vetor Ienti-viral compreendendo um ácido nucléico que codifica um peptídio portandopelo menos um epítopo Β. O peptídio portando pelo menos um epítopo Bpode ser, por exemplo, uma proteína de membrana de microorganismo ouseu fragamento e, em particular, E-glicoproteína de invólucro do Vírus doNilo Ocidental ou seu fragmento, com um veículo e/ou adjuvante fisiológicoaceitável. Vias de administração adequadas in vivo incluem, por exemplo,uma via intraperitoneal, via intravenosa, via intramuscular, via oral, via mu-cosa, via sublingual, via intranasal, via subcutânea ou via intradérmica. Viasadequadas ex vivo incluem a administração de células autólogas transduzi-das com o vetor Ientiviral [isto é, Células Apresentadoras de Antígeno (APC)como células dendríticas (DC) ou células B]. Em uma modalidade, o ácidonucléico heterólogo codifica um peptídio ou polipeptídio portando pelo me-nos um epítopo B. Em uma modalidade preferida, o polipeptídio codifica umaproteína de membrana ou seu fragmento. Em outra modalidade preferida, oácido nucléico heterólogo codifica E glicoproteína truncada na terminaçãocarboxila do Vírus do Nilo Ocidental, sem a região de ancoragem transmem-brana. Em outra, a E glicoproteína truncada na terminação carboxila com-preendendo os resíduos 1 - 441 da E-glicoproteína de invólucro de vírus doNilo Ocidental cepa IS-98-ST1. Uma modalidade preferida desta invençãoengloba a administração do vetor Ientiviral em um número limitado de dosescomo, por exemplo, uma única dose ou duas ou três doses. Em uma moda-lidade, essa dose compreende, por exemplo, partículas de vetor equivalen-tes a 0,5 ng a 5.000 ng de antígeno p24. Em camundongos, a dose preferidapode variar de 0,5 ng a 50 ng, ao passo que, em cavalos, a dose preferidapode variar de 50 ng a 500 ng. A invenção engloba o tratamento de animaiscomo, por exemplo, seres humanos, cavalos, aves, galinhas, porcos, gado,incluindo bovinos, ovinos e caprinos, roedores, incluindo hamsters, ratos ecamundongos, animais de estimação e répteis.

A invenção também apresenta um método para a vacinação deum animal contra infecção por microorganismo, compreendendo a adminis-tração a um animal necessitado, uma ou mais vezes, de um vetor Ientiviralcompreendendo um ácido nucléico heterólogo que codifique uma proteínade membrana imunogênica, ou seu fragmento, desse microorganismo. Con-forme aqui usado, o termo microorganismo engloba vírus, bactérias e parasi-tas.

Em uma modalidade preferida, a invenção apresenta um métodopara a vacinação de um animal necessitado contra uma infecção por vírus,como uma infecção por falvivírus, e, em particular, um método para a vaci-nação de um animal necessitado contra infecção pelo Vírus do Nilo Ociden-tal, por administração de um vetor Ientiviral compreendendo uma variante daE-glicoproteína de invólucro do Vírus do Nilo Ocidental, ou seu fragmento,com um veículo e/ou adjuvante fisiológico aceitável. A invenção engloba ummétodo de vacinação em que o ácido nucléico heterólogo se hibridiza, sobcondições de hibridização rigorosa, a um ácido nucléico de Vírus do Nilo O-cidental cepa IS-98-ST1, que codifica E-glicoproteína de invólucro. Em umamodalidade, o vetor Ientiviral é administrado uma vez, por exemplo, em umadose de partículas de vetor equivalentes a 0,5 ng a 5.000 ng de antígenop24. O animal necessitado pode incluir seres humanos, cavalos, aves, gali-nhas, porcos, gado, incluindo bovinos, ovinos e caprinos, roedores, incluindohamsters, ratos e camundongos, animais de estimação, como cães e gatos,e répteis.

A invenção também apresenta uma composição imunogênicacompreendendo um vetor lentiviral, em que o vetor Ientiviral compreende umácido nucléico heterólogo que codifica um antígeno em uma quantidade sufi-ciente para induzir uma resposta imunogênica ou protetora in vivo e um veí-culo farmaceuticamente aceitável para ele. A invenção engloba uma compo-sição imunogênica, em que o ácido nucléico heterólogo codifica um peptídioportando pelo menos um epítopo B. Um peptídio portando pelo menos umepítopo B pode ser, por exemplo, uma proteína de membrana de microorga-nismo, ou seu fragmento, e, em particular, E-glicoproteína de invólucro doVírus do Nilo Ocidental, ou seu fragmento, ou uma E glicoproteína truncadana terminação carboxila do Vírus do Nilo Ocidental, sem a região de ancora-gem transmembrana. Em uma modalidade, a E-glicoproteína truncada naterminação carboxila compreende os resíduos 1 - 441 da E-glicoproteína deinvólucro de vírus do Nilo Ocidental cepa IS-98-ST1.

A invenção também apresenta uma composição imunogênicacompreendendo um vetor lentiviral, em que o vetor Ientiviral compreende umácido nucléico heterólogo que codifica um antígeno em uma quantidade sufi-ciente para induzir uma resposta imunogênica ou protetora in vivo, e um veí-culo farmaceuticamente aceitável para ele, e em que o ácido nucléico hete-rólogo codifica uma variante da E-glicoproteína de invólucro do Vírus do NiloOcidental. Em um exemplo, o ácido nucléico heterólogo se hibridiza, sobcondições de hibridização rigorosa, a um ácido nucléico de Vírus do Nilo O-cidental cepa IS-98-ST1, que codifica E-glicoproteína de invólucro.

A invenção engloba um vetor lentiviral que dirige a expressão deum ácido nucléico heterólogo, em que o vetor compreende o promotor pre-coce imediato do citomegalovírus, e em que o ácido nucléico heterólogo co-difica E-glicoproteína de invólucro do Vírus do Nilo Ocidental, ou seu frag-mento. O ácido nucléico heterólogo pode codificar, por exemplo, E glicopro-teína truncada na terminação carboxila do Vírus do Nilo Ocidental, sem aregião de ancoragem transmembrana. Em uma modalidade, a E-glicoproteína truncada na terminação carboxila compreende os resíduos 1 -441 da E-glicoproteína de invólucro de vírus do Nilo Ocidental cepa IS-98-ST1. A invenção também apresenta uma célula hospedeira substancialmen-te purificada transfectada ou transduzida com esse vetor lentiviral, e um mé-todo para a produção do polipeptídio E-glicoproteína de invólucro do Vírusdo Nilo Ocidental, ou seu fragmento, compreendendo o cultivo de uma célulahospedeira transfectada ou transduzida com esse vetor lentiviral, sob condi-ções que promovam a expressão, e recuperação do polipeptídio da célulahospedeira ou do meio de cultura.

A invenção também apresenta um vetor lentiviral que dirige aexpressão de um ácido nucléico heterólogo, em que o vetor compreende opromotor precoce imediato do citomegalovírus, e em que o ácido nucléicoheterólogo codifica E-glicoproteína de invólucro do Vírus do Nilo Ocidental.Em uma modalidade, o ácido nucléico heterólogo se hibridiza, sob condiçõesde hibridização rigorosa, a um ácido nucléico de Vírus do Nilo Ocidental ce-pa IS-98-ST1, que codifica E-glicoproteína de invólucro. A invenção englobauma célula hospedeira substancialmente purificada transfectada ou transdu-zida com esse vetor lentiviral, e um método para a produção de uma variantede E-glicoproteína de invólucro do Vírus do Nilo Ocidental, compreendendoo cultivo de uma célula hospedeira transfectada ou transduzida com essevetor lentiviral, sob condições que promovam a expressão, e recuperação dopolipeptídio da célula hospedeira ou do meio de cultura.

A invenção também apresenta um vetor lentiviral que dirige aexpressão de um ácido nucléico heterólogo, em que o vetor compreende opromotor precoce imediato do citomegalovírus, e em que o ácido nucléicoheterólogo compreende proteína fluorescente verde. A invenção tambémengloba uma célula hospedeira substancialmente purificada transfectada outransduzida com esse vetor lentiviral.

A invenção engloba um método de vacinação contra um agentepatogênico, compreendendo a administração de um vetor lentiviral a um a-nimal necessitado, em que o vetor lentiviral compreende um ácido nucléicoheterólogo que codifica um antígeno, e em que o antígeo gera anticorposcontra o agente patogênico. A invenção engloba, por exemplo, um métodode vacinação em que a administração do vetor lentiviral gera imunidade hu-moral de longa duração. A invenção também engloba, por exemplo, um mé-todo de vacinação em que a administração do vetor lentiviral gera anticorposneutralizadores contra o agente patogênico. O animal necessitado pode in-cluir, por exemplo, seres humanos, cavalos, aves, galinhas, porcos, gado,incluindo bovinos, ovinos e caprinos, roedores, incluindo hamsters, ratos ecamundongos, animais de estimação, como cães e gatos, e répteis. Em umamodalidade, o vetor Ientiviral compreende um ácido nucléico que codifica E-glicoproteína de invólucro do Vírus do Nilo Ocidental, ou seu fragmento, e oagente patogênico é o Vírus do Nilo Ocidental. Em outra modalidade, a E-glicoproteína de invólucro do Vírus do Nilo Ocidental não possui uma regiãode ancoragem transmembrana. Em outra, a administração do vetor Ientiviralcompreende pelo menos uma dose de partículas de vetor equivalente a 0,5ng a 5.000 ng de antígeno p24.

A invenção também apresenta um método para distribuir DNApara a produção de anticorpos in vivo, compreendendo a administração deum vetor Ientiviral a um animal, em que o vetor Ientiviral compreende umácido nucléico heterólogo que codifica um antígeno, e em que o antígenogera uma resposta humoral no animal. A invenção engloba um vetor Ientivi-ral que induz imunidade humoral protetora em um animal necessitado. Emuma modalidade, o animal necessitado é selecionado de seres humanos,cavalos, aves, galinhas, porcos, gado, incluindo bovinos, ovinos e caprinos,roedores, incluindo hamsters, ratos e camundongos, animais de estimação erépteis.

Esta invenção também apresenta um método para distribuir DNApara a produção de anticorpos in vivo, compreendendo a administração deum vetor Ientiviral a um animal, em que o vetor Ientiviral compreende umácido nucléico heterólogo que codifica um antígeno, e em que o antígenogera uma resposta humoral no animal, em que o vetor Ientiviral induz imuni-dade protetora contra o Vírus do Nilo Ocidental. Em uma modalidade, o vetorIentiviral pode compreender um ácido nucléico que codifica uma E-glicoproteína de invólucro do Vírus do Nilo Ocidental, ou seu fragmento. Ovetor Ientiviral pode compreender um ácido nucléico que codifica E glicopro-teína truncada na terminação carboxila do Vírus do Nilo Ocidental, sem aregião de ancoragem transmembrana, por exemplo, uma E glicoproteínatruncada na terminação carboxila compreendendo os resíduos 1 - 441 da E-glicoproteína de invólucro de vírus do Nilo Ocidental cepa IS-98-ST1. Emoutra modalidade, o ácido nucléico heterólogo codifica uma variante da E-glicoproteína de invólucro do Vírus do Nilo Ocidental. A invenção englobaum ácido nucléico heterólogo variante que se hibridiza, sob condições dehibridização rigorosa, a um ácido nucléico do Vírus do Nilo Ocidental cepaIS-98-ST1 que codifica a E-glicoproteína de invólucro.

A invenção também engloba um método compreendendo a ad-ministração de um vetor Ientiviral a um animal, em que o vetor Ientiviral com-preende um ácido nucléico heterólogo que codifica um antígeno, e em que oantígeno gera uma resposta humoral no animal. A invenção engloba um ve-tor Ientiviral que induz imunidade humoral protetora em um animal necessi-tado. Em uma modalidade, o animal necessitado é selecionado de sereshumanos, cavalos, aves, galinhas, porcos, gado, incluindo bovinos, ovinos ecaprinos, roedores, incluindo hamsters, ratos e camundongos, animais deestimação e répteis.

A invenção também apresenta um método compreendendo aadministração de um vetor Ientiviral a um animal, em que o vetor Ientiviralcompreende um ácido nucléico heterólogo que codifica um antígeno, em queo antígeno gera uma resposta humoral no animal, e em que o antígeno ex-pressado no animal depois de sua transdução com o vetor Ientiviral induzimunidade protetora contra um microorganismo infeccioso como, por exem-plo, Vírus do Nilo Ocidental. Em uma modalidade, o vetor Ientiviral compre-ende um ácido nucléico que codifica uma proteína de membrana de um mi-croorganismo infeccioso (em particular, que codifica uma proteína de invólu-cro e, mais preferencialmente, a E-glicoproteína de invólucro do Vírus doNilo Ocidental, ou seu fragmento). O vetor Ientiviral pode compreender umácido nucléico que codifica a E glicoproteína truncada na terminação carbo-xila do Vírus do Nilo Ocidental, sem a região de ancoragem transmembrana,por exemplo, uma E-glicoproteína truncada na terminação carboxila compre-endendo os resíduos 1 - 441 da E-glicoproteína de invólucro de vírus do NiloOcidental cepa IS-98-ST1. Em outra modalidade, o ácido nucléico heterólo-go codifica uma variante da E-glicoproteína de invólucro do Vírus do NiloOcidental. Em uma modalidade, a invenção engloba um ácido nucléico hete-rólogo que se hibridiza, sob condições de hibridização rigorosa, àquelesdescritos a seguir, por exemplo, a um ácido nucléico do Vírus do Nilo Oci-dental cepa IS-98-ST1, que codifica a E-glicoproteína de invólucro.

Objetos e vantagens adicionais da invenção serão apresenta-dos, em parte, na descrição a seguir e, em parte, serão óbvios com a descri-ção, ou podem ser aprendidos pela prática da invenção. Os objetos e vanta-gens da invenção serão obtidos e atingidos por meio dos elementos e com-binações particularmente indicadas nas reivindicações anexas.BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 mostra a expressão de sEwnv em células 293T transdu-zidas com TRIP/sEwnv· (A) Representação esquemática do vetor TRIP/sEwnv- OcDNA de IS-98-ST1 que codifica sEWnv foi subclonado do plasmídio TOPO/sEwnv [29] no vetor Ientiviral TRIP entre os sítios de clonagem BsiWI e Bs-sHII e sob o controle do promotor precoce imediato do citomegalovírus hu-mano (CMVie). LTR = Repetição Terminal Longa. (B) Detecção da proteínasEwnv em células 293T transduzidas com TRIP/sEwnv- As células 293T fo-ram transduzidas com a quantidade de partículas de vetor TRIP/sEwnv equi-valente a 100 ng/mL de antígeno p24 (esquerda), ou deixadas não transdu-zidas (direita). 48 horas após a transdução, as células 293T foram imunotin-gidas com HMAF anti-WNV (Fluido Ascítico de Camundongo Hiperimune).

A figura 2 mostra a detecção de anticorpos anti-EWiw em sorosde camundongos vacinados com TRI P/s Ewnv- Células Vero foram infectadascom WNV cepa IS-98-ST1 (WNV) ou falsamente infectadas (sem vírus). Li-sados celulares radiomarcados foram imunoprecipitados com soros imunesreunidos (diluição a 1:100). As amostras foram analisadas por SDS-15%PAGE sob condições não redutoras. (A) Soros de camundongos imunizadoscom TRIP/sEwnv coletados nos dias 6, 13, 20 e 27 após a imunização (p.i.)(B) Soros de camundongos BALB/c-MBT congênicos resistentes inoculadoscom WNV (soros para WNV). Anti-soros para vírus da Iinfocoriomeningite(LCMV) foram usados como um controle negativo. As glícoproteínas estrutu-rais de WNV C, prM e E e as proteínas não estruturais NS3 e NS2A sãomostradas. (C) Soros de camundongos imunizados com TRIP/sEwnv coleta-dos 21 dias após o desafio com WNV, que foi realizado 7 ou 14 dias após aimunização. Como controle positivo, antígenos virais foram imunoprecipita-dos com HMAF anti-WNV.

A figura 3 mostra que a inativação térmica de partículas de vetorTRIP/sEwnν abole a transdução. Células 293T foram transduzidas com umvetor TRIP/GFP (66 ng de antígeno p24 por mL), inativadas termicamente(70SC durante 10 min)-ou não. 48 h após a transdução, a expressão de GFPfoi detectada por FACS.

A figura 4 mostra a seqüência de ácido nucléico (SEQ ID NO: 9)da forma secretada de E-glicoproteína de Vírus do Nilo Ocidental cepa IS-98-ST1, com códons de partida e de parada adicionados nas extremidadesda seqüência.

A figura 5 mostra a seqüência de ácido nucléico (SEQ ID NO:10) da forma secretada de E-glicoproteína de Vírus do Nilo Ocidental cepaIS-98-ST1.

A figura 6 mostra a seqüência de ácido nucléico (SEQ ID NO:11) da forma secretada de E-glicoproteína de Vírus do Nilo Ocidental cepaIS-98-ST1. A seqüência de sinal na terminação N está sublinhada.

A figura 7 mostra a seqüência de aminoácidos do Domínio Ill(SEQ ID NO: 12) da E-glicoproteína de Vírus do Nilo Ocidental cepa IS-98-ST1.

A figura 8 mostra a seqüência de ácido nucléico completa dovetor Ientiviral pTRIPsEWNV (SEQ ID NO: 13) portanto a seqüência heterólo-ga da E-glicoproteína de Vírus do Nilo Ocidental truncada do Vírus do NiloOcidental cepa IS-98-ST1.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Foram descobertos vetores Ientivirais para induzir respostashumorais protetoras. Em uma modalidade, os vetores Ientivirais são vetoresretrovirais deficientes em replicação, compreendendo seqüências ativas eisnecessárias para a transcrição reversa (regiões PPT 3', PBS e R das LTRs),importação nuclear (cPPT-CTS) e integração (psi), e um ácido nucléico "hete-rólogo que codifica um antígeno. Nesta modalidade, proteínas estruturais eenzimáticas são fornecidas em "trans". Os vetores Ientivirais podem com-preender seqüências de repetição de integração (IR) e Tips da LTR, assimcomo seqüências transcricionais como ORF e promotores. A partícula devetor Ientiviral pode ser pseudotipada por qualquer invólucro viral ou nãoviral para facilitar sua entrada na célula alvo. Um sítio preferido no vetor Ien-tiviral para inserção do ácido nucléico heterólogo está entre as dois LTRs,conforme explicado abaixo. Alternativamente, o ácido nucléico heterólogopode ser, por exemplo, inserido nas regiões U3 ou U5 das LTRs, ou forneci-do como um substituto para as regiões U3 ou U5 das LTRs.

Em uma modalidade, o vetor Ientiviral compreende um ácido nu-cléico heterólogo que codifica um peptídio portando pelo menos um epítopoB. Em modalidades preferidas, o ácido nucléico heterólogo codifica uma pro-teína de membrana de um microorganismo infeccioso como, por exemplo,uma proteína de invólucro. Em uma modalidade preferida, o ácido nucléicoheterólogo codifica E-glicoproteína de invólucro do Vírus do Nilo Ocidental,ou seu fragmento.

O termo "vetor lentiviral" significa que o vetor contém uma se-qüência polinucleotídica que: (1) não está associada a todo ou a parte de umpolinucleotídeo ao qual esteja associado na natureza, (2) está ligada a umpolinucleotídeo diferente daquele ao qual está ligado na natureza, ou (3) nãoocorre na natureza. Vetores Ientivirais da invenção englobam vetores deri-vados de, por exemplo, HIV-1, HIV-2, SIV (vírus da imunodeficiência símia),EIAV (vírus da anemia infecciosa eqüina), FIV (vírus da imunodeficiênciafelina), CAEV (vírus da artrite encefalite caprina) e VMV (vírus Visna/maedi).Vetores Ientivirais também englobam lentivírus quiméricos derivados de pelomenos dois lentivírus diferentes.

Os termos "polipeptídio" e "proteína", usados aqui de maneiraintercambiável, referem-se a uma forma polimérica de aminoácidos de qual-quer comprimento e inclui aminoácidos química ou bioquimicamente modifi-cados ou derivatizados, assim como polipeptídios com estruturas principaispeptídicas modificadas. O termo inclui proteínas de fusão, como proteínasde fusão GST e proteínas PEGiIadas1 proteínas de fusão com uma seqüên-cia de aminoácidos heteróloga, fusões com seqüências líderes heterólogasou homólogas, com ou sem resíduos metionina N-terminais; proteínas imu-nologicamente etiquetadas; e outras.

Um "fragmento" de uma seqüência polipeptídica se refere a umaseqüência polipeptídica que seja mais curta que a seqüência de referência,mas que retenha uma função ou atividade biológica que seja reconhecidacomo a mesma do polipeptídio de referência. Essa atividade pode incluir, porexemplo, a capacidade de estimular uma resposta imune. Um fragmentoretém pelo menos um epítopo do polipeptídio de referência.

O termo "purificado", conforme aqui usado, significa que um po-lipeptídio essencialmente livre de associação com outras proteínas ou poli-peptídios, por exemplo, como um produto de purificação de cultura de célu-las hospedeiras recombinantes ou como um produto purificado de uma fontenão recombinante. O termo "substancialmente purificado", conforme aquiusado, refere-se a uma mistura que contenha um polipeptídio e seja essen-cialmente livre de associação com outras proteínas ou polipeptídios, excetopela presença de proteínas conhecidas que possam ser removidas usando-se um anticorpo específico, e esses polipeptídios substancialmente purifica-dos podem ser usados como um antígeno.

O termo "antígeno", conforme aqui usado, significa uma subs-tância capaz de estimular uma resposta imune. Antígenos preferidos englo-bam pelo menos um epítopo B, em que um epítopo B é capaz de gerar umaresposta imune humoral. Esses antígenos preferidos incluem, por exemplo,antígenos de superfície, como proteínas de invólucro ou outras de membra-na, e seus fragmentos.

O termo "patógeno", conforme aqui usado, significa um agentecausador específico de doença e pode incluir, por exemplo, qualquer bacté-ria, vírus ou parasita.

O termo "doença", conforme aqui usado, significa uma interrup-ção, cessação ou transtorno da função, sistema ou órgão do corpo. Doençaspreferidas incluem doenças infecciosas.O temro "imunidade humoral", conforme aqui usado, significaanticorpos gerados por um antígeno e todos os processos acessórios que aacompanham.

O termo "imunidade humoral protetora", conforme aqui usado,significa uma resposta imune humoral que confere o componente essencialde proteção contra um patógeno.

O termo "imunidade humoral esterilizante", conforme aqui usado,significa uma resposta imune humoral que impede o estabelecimento dequalquer infecção detectável por um patógeno.

O termo "imunidade humoral de longa duração", conforme aquiusado, significa que algum aspecto da imunidade humoral é detectável trêsmeses após a administração do antígeno como, por exemplo, anticorposgerados pelo antígeno. Métodos adequados de detecção de anticorpos in-cluem, mas não se limitam a, métodos como ELISA, imunofluorescência (I-FA), testes de neutralização de redução de foco (FNRT), imunoprecipitaçãoe Western Blotting.

O termo "resposta humoral neutralizadora", conforme aqui usa-do, significa que os anticorpos gerados durante a imunidade humoral blo-queiam diretamente a capacidade de um patógeno de infectar células.

O termo "resposta rápida", conforme aqui usado, significa que aimunidade humoral protetora é conferida até três semanas após a adminis-tração do antígeno. O termo "resposta muito rápida", conforme aqui usado,significa que a imunidade humoral protetora é conferida até uma semanaapós a administração do antígeno.

Reações de hibridização podem ser realizadas sob condições dediferente "rigor". Condições que aumentam o rigor de uma reação de hibridi-zação são conhecidas na técnica. Por exemplo, condições rigorosas tantopara hibridização de DNA/DNA, quanto de DNA/RNA são descritas emSambrook e Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3ã Ed., ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001. Além disso,aqueles versados na técnica saberiam como modificar as condições quandonecessário para o grau de rigor requerido para uma hibridização particular.Exemplos de condições relevantes incluem (em ordem de rigorcrescente); temperaturas de incubação de 25SC, 37eC, 509C e 68eC; concen-trações de tampão de 10 χ SSC, 6 χ SSC, 1 χ SSC, 0,1 χ SSC (em que 1 χSSC é 0,15 M de NaCI e 15 mM de tampão citrato) e seus equivalentes, u-sando outros sistemas de tampão; concentrações de formamida de 0%,25%, 50% e 75%; tempos de incubação de 5 minutos a 24 horas; 1, 2 oumais etapas de lavagem; tempos de incubação de lavagem de 1, 2 ou 15minutos; e soluções de lavagem de 6 χ SSC, 1 χ SSC, 0,1 χ SSC ou águadesionizada.

Um exemplo de condições de hibridização rigorosas é a hibridi-zação a 50eC e 0,1 χ SSC (15 mM de cloreto de sódio/1,5 mM de citrato desódio). Outro exemplo de condições de hibridização rigorosas é a incubaçãodurante uma noite a 429C em uma solução contendo 50% de formamida, 1 χSSC (150 mM de NaCI, 15 mM de citrato de sódio), 50 mM de fosfato desódio (pH 7,6), 5 χ solução de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano e 20μg/mL de DNA de esperma de salmão desnaturado e cisalhado, seguido porlavagem dos filtros em 0,1 χ SSC a cerca de 659C. Um exemplo adicional decondições de alto rigor inclui a hibridização aquosa (por exemplo, livre deformamida) em 6 χ SSC (em que 20 χ SSC contém 3,0 M de NaCI e 0,3 Mde citrato de sódio), 1% de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 65QC durantecerca de 8 horas ( ou mais), seguido por uma ou mais lavagens em 0,2 χSSC, 0,1% de SDSa 659C.

Um polipeptídio "variante", conforme aqui citado, significa umpolipeptídio substancialmente homólogo ao polipeptídio de referência, masque tenham uma seqüência de aminoácidos diferente da de polipeptídios dereferência devido a uma ou mais deleções, inserções ou substituições. Aseqüência de aminoácidos variante é, de preferência, pelo menos 90% idên-tica ao polipeptídio de referência e, o mais preferivelmente, pelo menos 95%idêntica. A porcentagem de identidade pode ser determinada, por exemplo,por comparação da informação de seqüência usando-se o programa decomputador GAP, versão 6.0, descrito por Devereux et al. (Nucl. Acids Res.12:387, 1984) e disponível no Grupo de Computação Genética da Universi-dade de Wisconsin (UWGCG). 0 programa GAP utiliza o método de alinha-mento de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), conforme revi-sado por Smith e Waterman (Adv. Appl. Math 2:482, 1981). Os parâmetrosde default preferidos para o programa GAP incluem: (1) uma matriz de com-paração binária (contendo um valor de 1 para identidades e O para não iden-tidades) para nucleotídeos, e a matriz de comparação ponderada de Gribs-kov e Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, conforme descrita por Sch-wartz e Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, FundaçãoNacional de Pesquisa Biomédica, pp. 353-358, 1979; (2) uma penalidade de3,0 para cada vão e uma penalidade de 0,10 adicional para cada símbolo emcada vão; e (3) nenhuma penalidade para vãos de extremidades.

Variantes podem compreender seqüências conservadoramentesubstituídas, significando que um dado resíduo de aminoácido é substituídopor um resíduo com características físico-químicas similares. Exemplos desubstituições conservadoras incluem a substituição de um resíduo alifáticopor outro, como lie, Vai, Leu ou Ala entre si, ou substituições de um resíduopolar por outro, como entre Lys e Arg; Glu e Asp; ou Gln e Asn. Outras subs-tituições conservadoras, por exemplo, substituições de regiões inteiras comcaracterísticas de hibrofobicidade similares, são bem-conhecidas. Variantesde polipeptídios de ocorrência natural também estão englobadas pela inven-ção. Exemplos dessas variantes são proteínas que resultam de eventos dejunção de mRNA alternados ou de clivagem proteolítica dos polipeptídios.Variações atribuíveis a proteólise incluem, por exemplo, diferenças nas ter-minações por expressão em diferentes tipos de células hospedeiras, devidoà remoção proteolítica de um ou mais aminoácidos terminais dos polipeptí-dios. Variações atribuíveis a deslocamento de quadro incluem, por exemplo,diferenças nas terminações por expressão em diferentes tipos de célulashospedeiras, devido a diferentes aminoácidos.

O termo "se liga especificamente a", no contexto da ligação deanticorpos, refere-se à ligação de alta avidez e/ou alta afinidade de um anti-corpo a um polipeptídio específico ou, mais precisamente, a um epítopo es-pecífico de um polipeptídio específico. A ligação do anticorpo a esse epítopoé tipicamente mais forte que a ligação do mesmo anticorpo a qualquer outroepítopo ou qualquer outro polipeptídio que não compreenda o epítopo. Esseanticorpo é tipicamente produzido por injeção do polipeptídio específico emum animal para gerar a produção de anticorpos. Esse anticorpo pode sercapaz de se ligar a outros polipeptídios em um nível fraco, embora detectá-vel (por exemplo, 10% ou menos da ligação mostrada ao polipeptídio de in-teresse). Essa ligação fraca, ou ligação de fundo, é prontamente discernívelda ligação de anticorpo específico, por exemplo, com o uso de controles a-,propriados. Em geral, anticorpos da invenção se ligam especificamente a umpolipeptídio específico com uma afinidade de ligação de 10-7 M ou mais, depreferência 10-8 M ou mais (por exemplo, 10-9 Μ, 10-10 Μ, 10-11 e etc.).

Um "veículo farmaceuticamente aceitável" se refere a uma cargasólida, semi-sólida ou líquida, diluente, material de encapsulação ou auxiliarde formulação não tóxico de qualquer tipo convencional. Um "veículo farma-ceuticamente aceitável" é não tóxico para os receptores às dosagens e con-centrações empregadas e é compatível com outros ingredientes da formula-ção. Por exemplo, o veículo para uma formulação contendo polipeptídios depreferência não inclui agentes oxidantes e outros compostos que sejam sa-bidamente prejudiciais para polipeptídios. Veículos adequados incluem, masnão se limitam a, água, dextrose, glicerol, salina, etanol e suas combina-ções. O veículo pode conter agentes adicionais, como agentes umectantesou emulsificadores, agentes de tamponamento de pH ou adjuvantes que in-tensifiquem a eficácia da formulação. Veículos tópicos incluem petróleo lí-quido, palmitato de isopropila, polietileno glicol, etanol (95%), monolauratode polioxietileno (5%) em água, ou Iauril sulfato de sódio (5%) em água. Ou-tros materiais, como antioxidantes, umectantes, estabilizadores da viscosi-dade e agentes similares podem ser adicionados quando necessário. Inten-sificadores da penetração percutânea, como Azone, também podem ser in-cluídos,

A seqüência do genoma completo do Vírus do Nilo Ocidentalcepa IS-98-ST1 (ou STD) está disponível no GenBank número de acesso AF481864 (Gl: 19387527, versão de 21 de maio de 2002).A invenção apresenta polipeptídios de E-glicoproteína de invólu-cro isolados ou purificados, ou homogêneos, do Vírus do Nilo Ocidental, tan-to recombinantes, quanto não recombinantes. Variantes e derivados de poli-peptídios de E-glicoproteína de invólucro nativa que podem ser usados comoantígenos podem ser obtidos por mutações de seqüências nucleotídicas quecodifiquem polipeptídios de E-glicoproteína de invólucro nativa. Alteraçõesda seqüência de aminoácidos nativa podem ser feitas por qualquer um dosinúmeros métodos convencionais. As mutações podem ser introduzidas emIoci particulares por síntese de oligonucleotídeos contendo uma seqüênciamutante, flanqueados por sítios de restrição que permitam a ligação a frag-mentos da seqüência nativa. Após a ligação, a seqüência reconstruída resul-tante codifica um análogo com a inserção, substituição ou deleção de ami-noácido desejada.

Alternativamente, podem-se empregar procedimentos de muta-gênese específicos para sítio e direcionados a oligonucleotídeo, para forne-cer um gene alterado, em que códons predeterminados possam ser altera-dos por substituição, deleção ou inserção. Métodos exemplificativos da pre-paração das alterações acima expostas são apresentados por Walder et al.(Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques,janeiro de 1985, 12-19); Smith et al. {Genetic Engineering: Principies andMethods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488,1985); Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154:367, 1987); e patentes norte-americanas ns 4.518.584 e 4.737.462, todos aqui incorporados por referência.

Em um aspecto da invenção, o vetor Ientiviral pode ser utilizadopara preparar anticorpos que se liguem especificamente a polipeptídios. Otermo "anticorpos" pretende incluir anticorpos policlonais, anticorpos mono-clonais, seus fragmentos, como os fragmentos F(ab')2 e Fab, assim comoquaisquer parceiros de ligação produzidos de maneira recombinante. Osanticorpos são definidos como se ligando especificamente se eles se ligarama polipeptídios de E-glicoproteína de invólucro com uma Ka maior que ouigual a cerca de 107 M'1. As afinidades de parceiros de ligação ou anticorpospodem ser prontamente determinadas usando-se técnicas convencionais,por exemplo, aquelas descritas por Scatchard et ai., Ann. Ν. Y. Acad. Sei.51:660 (1949). Anticorpos policlonais podem ser prontamente gerados a par-tir de várias fontes, por exemplo, cavalos, vacas, cabras, ovelhas, cães, gali-nhas, coelhos, camundongos ou ratos, usando procedimentos bem-conhecidos na técnica.

Vetores de expressão recombinantes podem ser preparados u-sando-se métodos bem-conhecidos. Para uma revisão das técnicas de bio-logia molecular, vide Sambrook e Russell, Molecular Cloning: A LaboratoryManual, CSHL Press 2001, 3a Ed. Os vetores de expressão podem incluiruma seqüência de enxerto, como a seqüência de E-glicoproteína de invólu-cro do Vírus do Nilo Ocidental, operacionalmente ligada a seqüências nucle-otídicas reguladoras de transcrição ou tradução adequadas, como aquelasderivadas de um gene de mamífero, micróbio, vírus ou inseto. Exemplos deseqüências reguladoras incluem promotores, operadores ou intensificadoresde transcrição, um sítio de ligação ribossomal de mRNA e seqüências apro-priadas que controlem o início e término de transcrição e tradução. As se-qüências nucleotídicas estão "operacionalmente ligadas" quando a seqüên-cia reguladora se relaciona funcionalmente com a seqüência de enxerto. As-sim, uma seqüência nucleotídica promotora está operacionalmente ligada auma seqüência de E-glicoproteína de invólucro se a seqüência nucleotídicapromotora controlar a transcrição da seqüência de DNA da E-glicoproteínade invólucro. A capacidade de se replicar nas células hospedeiras deseja-das, normalmente conferida por uma origem de replicação, e um gene deseleção pelo qual transformantes sejam identificados também podem serincorporados no vetor de expressão.

Além disso, seqüências que codificam peptídios de sinal apro-priados que não estejam naturalmente associados à seqüência de enxertopodem ser incorporados em vetores de expressão.

Células hospedeiras adequadas para expressão incluem proca-riotos, levedura ou células eucarióticas superiores. Vetores de clonagem eexpressão apropriados para uso com hospedeiros celulares bacterianos,fúngicos, de levedura e de mamífero são descritos, por exemplo, em Pou-wels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nova Iorque(1985).

Uma vez que o vetor Ientiviral da invenção tenha sido obtido,pode ser usado para produzir anticorpos policlonais e monoclonais. Assim,uma proteína ou polipeptídio expressaod in vivo ou ex vivo por meio do vetorIentiviral da invenção pode ser usado para imunizar um hospedeiro animalpor técnicas conhecidas na técnica. Essas técnica normalmente envolvem ainoculação, mas podem envolver outros modos de administração. Umaquantidade suficiente do vetor Ientiviral é administrada para criar uma res-posta imunogênica no hospedeiro animal. Pode-se usar qualquer hospedeiroque possa ser infectado por lentivírus. Uma vez que o animal tenha sido i-munizado, e tempo suficiente tenha passado para começar a produzir anti-corpos contra o antígeno, podem-se recuperar anticorpos policlonais. O mé-todo geral compreende a remoção de sangue do animal e a separação dosoro do sangue. O soro, que contém anticorpos contra o antígeno, pode serusado como um anti-soro para o antígeno. Alternativamente, os anticorpospodem ser recuperados do soro. A purificação por afinidade é uma técnicapreferida para a recuperação de anticorpos policlonais contra o antígeno dosoro.

Anticorpos monoclonais contra os antígenos da invenção tam-bém podem ser preparados. Um método para a produção de anticorpos mo-noclonais reativos com os antígenos compreende as etapas de infecção dohospedeiro com o vetor lentiviral; recuperação de células produtoras de anti-corpos do baço do hospedeiro; fusão das células produtoras de anticorposcom células de mieloma deficientes na enzima hipoxantina-guanina fosfori-bosil transferase para formar hibridomas; seleção de pelo menos um doshibridomas por crescimento em um meio compreendendo hipoxantina, ami-nopterina e timidina; identificação de pelo menos um dos hibridomas queproduz um anticorpo contra o antígeno, cultivo do hibridoma identificado paraproduzir anticorpos em uma quantidade recuperável; e recuperação dos an-ticorpos produzidos pelo hibridoma em cultura.Esses anticorpos policlonais ou monoclonais podem ser usadosem várias aplicações. Entre essas está a neutralização de proteínas corres-pondentes. Também podem ser usados para detectar antígenos virais empreparações biológicas ou na purificação das proteínas, glicoproteínas ousuas misturas correspondentes, por exemplo, quando usados em colunascromatográficas de afinidade.

Os polipeptídios de E-glicoproteína de invólucro podem ser usa-dos como antígenos para identificar anticorpos contra o Vírus do Nilo Oci-dental em materiais e para determinar a concentração dos anticorpos nessesmateriais. Assim, os antígenos podem ser usados para determinação quali-tativa ou quantitativa do vírus em um material. Esses materiais incluem teci-do animal e células animais, assim como fluidos biológicos, como fluidoscorporais de animais, incluindo soros de animais. Quando usados como umreagente em um imunoensaio para determinar a presença ou concentraçãodos naticorpos contra o Vírus do Nilo Ocidental, os antígenos proporcionamum ensaio que é conveniente, rápido, sensível e específico.

Mais particularmente, os antígenos podem ser empregados paraa detecção de infecção por microorganismos patogênicos (em particular,Vírus do Nilo Ocidental) por meio de imunoensaios que sejam bem-conhecidos para uso na detecção ou quantificação de componentes humo-rais em fluidos. Assim, interações antígeno-anticorpo podem ser diretamenteobservadas ou determinadas por reações secundárias, como precipitação ouaglutinação. Além disso, também se podem empregar técnicas de imunoele-troforese. Por exemplo, pode-se utilizar a combinação clássica de eletrofore-se em ágar seguida por reação com anti-soro, assim como eletroforese bi-dimensional, eletroforese foguete e imunoetiquetagem de padrões de gel depoliacrilamida (Western Blot ou imunotransferência). Outros imunoensaiosem que antígenos da presente invenção podem ser empregados incluem,mas não se limitam a, radioimunoensaio, ensaio de imunoprecipitação com-petitiva, imunoensaio de enzima e ensaio de imunofluorescência. Deve-seentender que se podem empregar técnicas turbidimétricas, colorimétricas enefelométricas. Prefere-se um imunoensaio baseado na técnica de WesternBlot.

Os imunoensaios podem ser realizados por imobilização de umdos imunorreagentes sobre a superfície de um veículo, enquanto se retém aimunorreatividade do reagente. O imunorreagente recíproco pode ser nãoetiquetado ou etiquetado, de modo que a imunorreatividade também sejaretida. Essas técnicas são particularmente adequadas para uso em imuno-ensaios de enzima, como ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) eimunoensaio de enzima por inibição competitiva (CIEIA).

Quando qualquer um dos imunorreagentes está fixado em umsuporte sólido, o suporte normalmente é um material de vidro ou plástico.Preferem-se materiais de plástico moldados na forma de placas, tubos, gló-bulos ou discos. Exemplos de materiais de plástico adequados são poliesti-reno e cloreto de polivinila. Se o imunorreagente não se ligar prontamente aosuporte sólido, pode-se posicionar um material de veículo entre o reagente eo suporte. Exemplos de materiais de veículo adequados são proteínas, comoalbumina sérica bovina, ou reagentes químicos, como glutaraldeído ou uréia.O revestimento da fase sólida pode ser realizado usando-se técnicas con-vencionais.

A invenção apresenta um vetor Ientiviral imunogênico e, maisparticularmente, um vetor Ientiviral protetor para gerar uma resposta proteto-ra contra o Vírus do Nilo Ocidental. Esses vetores Ientivirais podem ser, por-tanto, empregados como vacinas virais por administração do vetor Ientiviral aum animal suscetível a um microorganismo patogênico (uma bactéria, umvírus, um parasita) e são utilizáveis na prevenção de infecções. Em umamodalidade, os vetores Ientivirais da invenção compreendem um ácido nu-cléico heterólogo que codifica uma proteína de membrana de flavivírus, porexemplo, do Vírus do Nilo Ocidental, e são utilizáveis para prevenir infec-ções, por exemplo, infecção pelo Vírus do Nilo Ocidental. Podem-se empre-gar modos de administração convencionais. Por exemplo, a administraçãopode ser realizada pelas vias oral, respiratória, parenteral, via sublingual, viaintranasal, via subcutânea ou via intradérmica.

As composições de vacina da invenção são administradas demaneira compatível com a formulação da dosagem e em uma quantidadeque seja terapeuticamente eficaz e imunogênica. A quantidade a ser admi-nistrada depende do sujeito a ser tratado, incluindo, por exemplo, a capaci-dade do sistema imune do indivíduo de induzir uma resposta imune.

O cronograma de imunização dependerá de vários fatores, comoa suscetibilidade do hospedeiro à infecção, o peso do hospedeiro e a idadedo hospdeiro. Uma única dose da vacina da invenção pode ser administradaao hospedeiro, ou se pode seguir um curso primário de imunização, em quevários doses sejam administradas a intervalos de tempo. Doses subseqüen-tes usadas como reforços podem ser administradas quando necessário apóso curso primário.

Uma resposta imunogênica pode ser obtida por administraçãodo vetor Ientiviral da invenção ao hospedeiro em uma quantidade de cercade 10 a cerca de 500 microgramas de antígeno por quilograma de peso cor-poral, de preferência de cerca de 50 a cerca de 100 microgramas de antíge-no por quilograma de peso corporal. As proteínas e vacinas da invenção po-dem ser administradas juntamente com um veículo fisiologicamente aceitá-vel. Por exemplo, pode-se empregar um diluente como água ou uma soluçãosalina.

Para melhor atingir os objetivos de acordo com as finalidades dapresente invenção, descreve-se um kit capaz de diagnosticar uma infecçãopor Vírus do Nilo Ocidental. Esse kit, em uma modalidade, contém os anti-corpos desta invenção, que são capazes de se ligarem à E-glicoproteína deinvólucro do Vírus do Nilo Ocidental. Esse kit, em outra modalidade, contémos polipeptídios desta invenção, que são capazes de detectar a presença ouausência de anticorpos que se ligam ao polipeptídio de E-glicoproteína deinvólucro.

Esta invenção será descrita em maiores detalhes nos Exemplosa seguir.

Exemplo 1: Materiais e Métodos

Cultura celular e preparações de vírus. Células 293T humanas ecélulas Vero de rim de macaco verde africano foram cultivadas em meio Ea-gle modificado de Dulbecco (DMEM) Glutamax (GIBCO) suplementado com10% ou 5% de Soro de Novilho Fetal (FCS) inativado por calor, respectiva-mente. A cepa IS-98-ST1 de WNV (GenBank número de acesso AF 481864)[31], uma variante intimamente relacionada à cepa NY99 [32 - 34], foi pro-pagada em monocamadas de células AP61 de mosquito Aedes pseudoscu-tellaris. A purificação em gradientes de sacarose e a titulação do vírus emcélulas AP61 por ensaio de imunodetecção de foco (FIA) usando Fluido As-cítico de Camundongo Hiperimune anti-WNV (HMAF) foram efetuadas con-forme anteriormente descrito [29, 31, 35]. Os títulos de infectívidade foramexpressos como Unidades Formadoras de Focos (FFU).

Construção e produção do vetor lentiviral. O cDNA de 1,4 kb quecodifica a E glicoproteína truncada na terminação carboxila, sem a região deancoragem transmembrana (resíduos E-1 a E-441; chamado de sEwnv) deWNV cepa IS-98-ST1 é descrito em outro lugar [29]. O cDNA que codificasEwnv já foi modificado por PCR para ser flanqueado nas extremidades dequadro de leitura aberta por sítios de endonucleases de restrição BsiWI eBssHII. O cDNA foi digerido com BsiWI e BssHII e, então, clonado nos sítiosBsiWI e BssHII únicos do plasmídio pTRIP AU3 CMV. O plasmídio de vetorresultante pTRIP.AU3.CMV.sEwnv (daqui por diante chamado de p-TRIP/sEwiw) contém a seqüência de sE glicoproteína de IS-98-ST1 sob ocontrole do promotor precoce imediato de citomegalovírus (CMVie).

Partículas de vetor foram produzidas por co-transfecção comfosfato de cálcio transitória de células 293T com o plasmídio de vetor p-TRIP/sEwnv. um plasmídio de encapsidação (p8.7; [36]), e um plasmídio deexpressão de invólucro VSV-G (pHCMV-G; [37]) conforme anteriormentedescrito [38]. A quantificação do teor de antígeno p24 de partículas de vetorconcentradas foi feita com um kit de ELISA HIV-1 p24 comercial (Perkin El-mer LifeSciences).

PCR quantitativa. Para a detecção das seqüências de U5-R no vetorlentiviral, os iniciadores e sondas usados foram os seguintes: sondas LTR-FL 5'-CACAACAGACGGGCACACACTACTTGA-fluoresceína-3' (SEQ ID N0:1),LTR-LC 5'-RED640-CACTCAAGGCAAGCTTTATTGAGGC-fosforilada-3'(SEQ ID N0:2), iniciadores AA55M

5'-GCTAGAGATTTTCCACACTGACTAA-3 (SEQ ID NO:3), M667 δ'-GGCTAACTAGGGAACCCACTG-S' (SEQ ID NO:4) [39]. Para a detecção deCD3, as seqüências dos iniciadores e sondas foram as seguintes: sondasCD3-P1

5'-GGCTGAAGGTTAGGGATACCAATATTCCTGTCTC-fluoresceína-3' (SEQID NO:5), CD3-P2

5'-RED705-CTAGTGATGGGCTCTTCCCTTGAGCCCTTC-fosforilada-S'(SEQ ID NO:6) e iniciadores CD3-in-F δ'-GGCTATCATTCTTCTTCAAGGTA-S'(SEQ ID NO:7) e CD3-in-R 5'-CCTCTCTTCAGCCATTTAAGTA-S' (SEQ IDNO:8). Os iniciadores e sondas foram sintetizados por Proligo (França). ODNA genômico de aproximadamente 3,106 células 293T transduzidas comvetor Ientiviral foi isolado 48 h após a transdução usando o Minikit de DNAno Sangue QIAamp® (QIAGEN, GmbH, Hilden). Para a análise de PCR emtempo real, 5μΙ_ de DNA foram misturados com 15pL de uma mistura-mestrade PCR consistindo em 1X Jumpstart® Taq ReadyMix® (Sigma), 1,9 mM deMgCI2, 1,5 μΜ de iniciadores direto e reverso (AA55M/M667 ou CD3-in-F/CD3-in-R), 200 nM das sondas (LTR-FL/LTR-LC ou CD3-P1/CD3-P2) e1,5 unidade de Taq DNA Polimerase (Invitrogen). As amplificações foramrealizadas em um LightCycIer 2.0 (Roche Applied Science), usando um ciclode 95°C durante 3 min e 40 ciclos de 95eC durante 5 s, 55SC durante 15 s e12-C durante 10 s. Para levar em consideração qualquer possível contami-nação com plasmídio dos estoques de vetor, DNA de células 293T transdu-zidas com vetor inativado com calor (10 min a 70QC) foi sempre testado emparalelo. Para controles negativos, usaram-se 5 μΙ_ de DNA genômico decélulas não transduzidas. Cada amostra de DNA foi testada em duplicata, ese relataram os valores médios. Diluições seriadas de dez vezes de concen-tração conhecida do plasmídio pTripCD3, contendo as seqüências relevan-tes U5-R e CD3, foram amplificadas em paralelo com amostras de DNA paragerar uma curva padrão.

O número total de cópias de vetor por célula foi calculado pornormalização do número de cópias de U5-R com relação ao número de célu-las 293T, conforme quantificado pelo número de cópias de moléculas deCD3 na mesma amostra de DNA genômico, e, então, subtração do númerode cópias obtidas das células transduzidas com vetor e inativadas com calor.

Anti-soros de camundongo contra WNV. Fluido Ascítico de Ca-mundongo Hiperimune anti-WNV (HMAF) foi obtido por imunização repetidade camundongos adultos com WNV cepa IS-98-ST1 , seguido por inoculaçãode sarcoma 180. Os soros contra WNV foram obtidos por imunização decamundongos congênicos BALB/c-MBT resistentes a WNV com 103 FFU de.IS-98-ST1, conforme anteriormente descrito [31]. Anticorpos anti-WNV poli-clonais de camundongo foram coletados 1 mês após a inoculação.

Imunização de camundongos e desafio com WNV. Todos os ex-perimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes doEscritório do Laboratório de Cuidados com Animais do Instituo Pasteur. Ca-mundongos 129 de seis a oito semanas de idade foram inoculados por intra-peritoneal (i.p.) com doses variáveis de partículas de vetor TRIP/sEwnv em0,1 mL de PBS de Dulbecco (DPBS; pH 7,5) suplementado com albuminasérica bovina a 0,2% tamponada (DPBS/0,2% de BSA, Sigma). O desafiocom WNV foi realizado por inoculação i.p. da cepa neurovirulenta de WNVIS-98-ST1 (DL50 i-P- = 10 FFU), conforme anteriormente descrito [29, 31]. Oscamundongos desafiados foram monitorizados diariamente quanto a sinaisde morbidade ou mortalidade, durante até 21 dias.

Medição das respostas de anticorpos séricos. Os camundongosforam sangrados pela via periorbital, e os soros foram inativados com calordurante 30 min a 56SC. Os anticorpos anti-WNV foram detectados por ELISAusando WNV IS-98-ST1 purificado com sacarose como antígeno viral [29,31]. Imunoglobulina anticamundongo conjugada a peroxidase (H+L) (Jack-son Immuno Research) a uma diluição de 1:4.000 e IgM (específica paracadeia μ) ou IgG (específica para cadeia γ) anticamundongo conjugada aperoxidase (Sigma) a uma diluição de 1:20.000 foram usadas como anticor-pos secundários. O título final foi calculado como a recíproca da última dilui-ção que gerava duas vezes a densidade óptica (DO) de soros de camun-dongos inoculados com TRIP/GFP que serviram de controles negativos.Anticorpos neutralizadores anti-WNV foram detectados por umteste de neutralização por redução de foco (FRNT) em células Vero, confor-me anteriormente descrito [29]. O título final foi calculado como a recíprocaou a diluição de soro mais elevada testada que reduzia o número de FFU em90% (FRNT90).

Ensaio de radioimunoprecipitação. Células Vero cultivadas emum balão de 25 cm2 foram infectadas com WNV cepa IS-98-ST1 a uma altamultiplicidade de infecção. 20 h após a infecção, as células foram submeti-das a fome durante 1 h em DMEM depletado de metionina (ICN Biomedi-cals) e radiomarcadas com 100 μΟί/ιηΙ- de Trans35S-Label™/mL (ICN Bio-medicals) durante 3 h. Depois de três lavagens com PBS frio, as células fo-ram Iisadas com tampão de Iise RIPA (50 mM de Tris-CI, 150 mM de NaCI,mM de EDTA, 1% de Triton X-100, 0,5% de desoxicolato, 0,1% de SDS,pH 8,0) suplementado com 25 μς/mL de aprotinina (Sigma) durante 10 min a4°C. Os lisados de células foram, então, clarificados por centrifugação a10.000 rpm durante 5 min a 49C. O ensaio de radioimunoprecipitação (RIP)foi efetuado conforme anteriormente descrito [29, 40]. Os antígenos viraisforam imunoprecipitados com anticorpos anti-WNV de camundongo. As a -mostras foram analisadas por SDS-15% de PAGE sob condições não redu-toras.

Ensaios de imunofluorescência indireta e citometria de fluxo. Pa-ra a análise de imunofluorescência indireta (IF), células 293T humanas culti-vadas em um Glass-Labteks de 8 câmaras (Nunc) foram transduzidas compartículas de vetor TRIP/sEWNV- Após 48 h, as células foram fixadas comparaformaldeído a 3% (PFA) em PBS durante 20 min e permeabilizadas com0,1% de Triton X-100 em PBS durante 4 min. As células foram incubadascom um HMAF anti-WNV a uma diluição de 1:100 em PBS durante 1 h. Apósbloqueio com DPBS/0,2% de BSA, as células foram adicionalmente incuba-das com um anticorpo IgG anticamundongo conjugado a Cy3 (AmershamPharmacia) a uma diluição de 1:500 em DPBS/0,2% de BSA. Os núcleosdas células foram visualizados com DAPI. As lâminas foram examinadasusando-se um microscópio Zeiss Axioplan com o sistema ApoTOme.Para a análise de citometria de fluxo, células 293T cultivadas embalões de 25 cm2 foram transduzidas com TRIP/GFP, inativado com calor(70ºC durante 10 min) ou não. Em 48 h, as células foram soltas, lavadas efixadas com 2% de PFA. A intensidade de fluorescência de GFP foi medidapor FACS e analisada com o software CellQuest.

Exemplo 2: Expressão da forma secretada da E glicoproteína de WNV pelovetor Ientiviral TRIP recombinante

Para avaliar se a imunização com uma vacina à base de vetorlentiviral pode proteger contra encefalite por WNV, gerou-se um vetor lentivi-ral, TRIP/sEwnv, que expressa uma forma solúvel da E glicoproteína doWNV cepa IS-98-ST1 (sEwnv) sob o controle do promotor precoce imediatode CMV (CMVi.e.) (figura 1A). Demonstramos anteriormente a secreção efici-ente de sEwnv no meio de cultura de células infectadas por um vetor de sa-rampo recombinante [29]. A expressão de sEwnv em células 293T transduzi-das com vetor Ientiviral foi examinada por imunofluorescência (figura 1B). 48h após a transdução, uma alta fração de células foram imunotingidas comum padrão que sugere que o sEwnv migrou através da via secretória.

A quantidade de partículas físicas no estoque de vetor usadoneste estudo foi determinada por um ensio ELISA comercialmente disponívelcontra a proteína de capsídeo de HIV-1 p24 (Perkin Elmer Lifescience). Otítulo real do estoque de vetor foi calculado com base na transferência doDNA do vetor para células alvo, usando um ensaio de PCR quantitativa. Aquantificação tanto de uma seqüência específica do vetor (U5), quanto deum Iocus celular (CD3) fornece o número de cópias de DNA de vetor médiopor célula. Isso permite uma titulação precisa da preparação de vetor. O es-toque de vetor TRIP/sEWnv usado neste estudo foi titulado em células 293Thumanas a 5,2 χ 107 unidades de transdução (TU) por ml_ (correspondendoa aproximadamente 900 TU/ng de p24 em células 293T humanas). Por ra-zões de simplicidade, será expressada, nas seções a seguir, a quantidadede partículas de vetor usada como ng de antígeno p24.

Exemplo 3: Uma única imunização com TRIP/sEwnv induz fortes respostasde anticorposPara avaliar a resposta imune humoral induzida pelo vetor Ienti-viral que expressa sEwnv, grupos de camundongos 129 adultos foram inocu-Iados i.p. com uma única dose de partículas de vetor equivalente a 500 ngde antígeno p24. Os vetores codificavam sEwnv ou proteína GFP como con-trole. Os camundongos foram sangrados periorbitalmente 6, 13, 20 ou 27dias após a imunização, e os soros individuais ou reunidos foram testadosquanto a anticorpos totais anti-WNV, IgG e IgM usando-se um ELISA especí-fico para isotipo já descrito [29]. A atividade neutralizadora in vitro dos sorosfoi ensaiada por um teste de neutralização de redução de foco (FRNT) [29].

Nenhum anticorpo anti-WNV foi detectado nos soros de camun-dongos de controle imunizados com TRIP/GFP. Soros de camundongos i-munizados com TRIP/sEwnv foram primeiro testados individualmente, e dife-renças muito pequenas entre os animais foram observadas (média ± DP nodia 6 = 0,5 ± 0,3; dia 13 = 1,3 ± 0,5; dia 21 = 1,3 ± 0,15; dia 27 = 1,4 ± 0,15),assim, nos experimentos seguintes, foram usados soros reunidos. Em ca-mundongos imunizados com TRIP/sEwnv, os anticorpos totais contra WNVera detectáveis tão cedo quanto 6 dias após a imunização, embora presen-tes em uma baixa concentração. Como esperado nesse momento, apenasanticorpos IgM anti-WNV foram detectados nos soros imunes. As respostasde anticorpos totais aumentaram 10 vezes até atingir um platô no dia 13, eforam, então, mantidas com o tempo. Nesses momentos posteriores (dia 13,20, 27), os anticorpos IgM desapareceram, para serem substituídos por IgG(Tabela 1). Esses soros eram reativos com E-glicoproteína de WNV de Iisa-dos de células Vero infectadas com IS-98-ST1, conforme demonstrado peloensaio RIP (figura 2A).

Um teste de neutralização de redução de foco (FRNT) mostrouque os soros de camundongos imunizados com TRIP/sEwnv continham ní-veis detectáveis de anticorpos anti-WNV neutralizadores tão cedo quanto 6dias após a imunização (Tabela 1). Juntos, esses dados mostram que semonta uma resposta imune de anticorpos anti-WNV precoce e específica emcamundongos inoculados com uma única dose de partículas de vetorTRIP/sEwnv-Tabela 1. Resposta de anticorpos de camundongos inoculados comTRIP/sEwnv

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a. Grupos de 6 camundongos 129 adultos foram inoculados i.p. com umaquantidade de partículas de vetor Ientiviral correspondendo a 500 ng de an-tígeno p24.

Exemplo 4: Imunização com TRIP/sEwnv confere proteção pre-coce de camundongos contra encefalite por WNV

Para se estabelecer se a imunidade humoral gerada em camun-dongos após a vacinação com TRIP/sEWnv era protetora, tirou-se vantagemde um modelo de camundongo para desafio com WNV. De fato, algumascepas de camundongos são extremamente sensíveis ao desafio com WNV[31, 41], desenvolvem uma doença neuroinvasiva letal similar à encontradaem seres humanos [32, 42] e morrem poucos dias após a inoculação. Gru-pos de camundongos 129 que receberam uma única dose de 500 ng de p24de partículas de vetor TRIP/sEwnv ou TRIP/GFP foram desafiados por viai.p. com 1.000 DL50 i.p. de WNV cepa IS-98-ST1 uma ou duas semanas de-pois do primeiro contato.

Notavelmente, todos os camundongos imunizados comTRIP/sEwnv foram protegidos contra o desafio viral (1.000 DL50 i.p.) tão cedoquanto 7 dias após o primeiro contato. Todos os camundongos imunizadoscom o vetor de controle TRIP/GFP ou com DPBS morreram até 11 dias apóso desafio (Tabela 2). De maneira interessante, os anticorpos totais contraWNV aumentaram dez vezes após o desafio, sugerindo que uma respostasecundária eficaz era montada em camundongos imunizados comTRIP/sEwnv (Tabela 2). Resultados equivalentes foram obtidos em camun-dongos BALB/c (dados não mostrados). Esses resultados indicam que a va-cinação comTRIP/sEwNv confere uma resposta imune protetora muito rápidae completamente protetora contra um desafio de alto WNV.

Tabela 2. Proteção rápida por TRIP/sEwnv contra infecção por WNV

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a. Grupos de camundongos 129 adultos foram inoculados i.p. com uma úni-ca dose de partículas de vetor Ientiviral correspondendo a 500 ng de antíge-no p24 ou com DPBS.

Exemplo 5: Imunização com TRIP/sEwnv gera imunidade antiviral esterilizante

Para determinar se uma primo-infecção com WNV pode ocorrerou não em animais vacinados com o desafio, realizaram-se ensaios RIP emsoros reunidos de camundongos imunizados, coletados antes e 21 dias de-pois do desafio com WNV.

A proteína E era primeiro detectável por ensaio RIP no dia 13após a imunização usando-se soros reunidos de camundongos imunizadoscom TRIP/sEwnv (figura 2A). A falta de detecção de anticorpos contra E emsoros imunes de uma semana pode ser atribuída à baixa avidez da proteínaA por lgM em nosso ensaio RIP. Soros de camundongos de controle imuni-zados com TRIP/GFP não reagiram com proteína E de WNV.

De maneira importante, soros pós-desafio de camundongos va-cinados com TRIP/sEwnv não precipitaram nenhuma proteína viral além da E(figura 2C). Essa falta de reatividade contra quaisquer proteínas de WNVdiferentes da E (como preM e proteínas não estruturais NS2a, NS2b e NS3)indica claramente a ausência de uma replicação de WNV in vivo com o de-safio em animais vacinados. Nos camundongos da cepa BALB/c-MBT, que éresistente à encefalite por WNV, os soros são prontamente reativos com to-das as proteínas virais (figura 2B). Assim, a vacinação comTRIP/sEwNv con-fere imunidade esterilizante completa a camundongos.

Exemplo 6: A proteção conferida por uma única injeção de TRIP/sEwnv é delonga duração.

A seguir, determinamos se uma única imunização com a vacinaà base de vetor Ientiviral tem o potencial de gerar imunidade protetora delongo prazo contra infecção por WNV. Grupos de camundongos 129 foramimunizados por via i.p. com partículas de vetor TRIP/sEwnv equivalentes a500 ng de antígeno p24 ou com a mesma quantidade de vetor TRIP/GFP comocontrole. Três meses depois, os camundongos foram sangrados periorbitalmen-te, e os soros reunidos de cada grupo foram testados por ELISA e FRNT. Osníveis de anticorpos em camundongos imunizados com TRIP/sEwnv aindaeram notavelmente altos 3 meses após uma única injeção de vetor(1:30.000), e os anticorpos neutralizadores persistiam (Tabela 3). Os ca-mundongos foram, então, desafiados por via i.p. com uma DL50 de 1.000 deWNV IS-98-ST1. Nem morbidade nem mortalidade foram observadas emcamundongos imunizados com TRIP/sEwnv, ao passo que todos os camun-dongos de controle morreram em até 10 dias (Tabela 3). Os títulos de anti-corpos totais, assim como os anticorpos anti-WNV neutralizadores aumenta-ram após o desafio, sugerindo que uma resposta secundária eficaz era mon-tada em camundongos imunizados com TRIP/sEwnv três meses antes (Ta-bela 3).

Assim, uma única dose do vetor lentiviral que codifica sEWnv éeficiente para conferir imunidade protetora de longo prazo em camundongos.

Tabela 3. Proteção de longo prazo por TRIP/sEWnv contra infecção por WNV

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a. Grupos de camundongos 129 adultos foram imunizados por via i.p. compartículas de vetor Ientiviral correspondendo a 500 ng de antígeno p24.

b. Determinado por ELISA em soros reunidos inativados com calor.

c. FRNT: Teste de Neutralização de Redução de Foco: a diluição de soromais alta que reduzia o número de FFU de WNV em pelo menos 90%.

d. Os camundongos foram inoculados i.p. com DL50 de 1.000 de WNV cepaIS-98-ST1, três meses após a imunização. A sobrevivência foi registradadurante 21 dias.

ND: não detectado (< 100)

NA: não aplicável

Exemplo 7: Uma única dose diminuta de TRIP/sEWnv confere proteção totale rápida

Para determinar a dose de vacina protetora mínima, grupos decamundongos 129 foram inoculados uma vez com uma ampla faixa de do-ses de vacina TRIP/sEwnv, variando de 1,5 ng a 500 ng de antígeno p24.

Uma semana após o primeiro contato, os camundongos imunizados foramdesafiados por via i.p. com DL50 de 1.000 de WNV IS-98-ST1. Como espe-rado, todos os camundongos que receberam 500 ng de p24 do vetorTRIP/GFP de controle morreram até 11 - 13 dias após o desafio. Uma pro-teção de 100% foi conseguida após a injeção de uma única dose de vetorTRIP/sEwnv tão baixa quanto 50 ng de p24. Doses menores conferiram ape-nas proteção parcial, permitindo, assim, calcular uma dose protetora de 50%em camundongos adultos de 6,2 ng de antígeno p24 (Tabela 4). Deve-senotar que esses experimentos de dose-proteção foram realizados nas condi-ções de desafio mais rigorosas, com um desafio precoce no dia 7 após avacinação e com um inóculo de desafio viral altamente letal (DL5o de 1.000).Como as concentrações de anticorpos totais aumentaram dez vezes entreos dias 7 e 14 (Tabela 1), é provável que a dose protetora de 50% teria sidoainda menor que 6,2 ng se determinada apenas uma semana depois.

Esses resultados demonstram que uma dose diminuta de partí-culas de vetor conseguem uma imunidade rápida e completamente protetoraem camundongos. Essa proteção de 100% é conseqüência de uma transdu-ção de células in vivo real pelas partículas de vetor. Um tratamento térmico(10 min a 70eC) das partículas de vetor que abroga a capacidade de trans-dução de vetores Ientivirais (figura 3) também abroga a proteção (Tabela 4),descartando a possibilidade de uma proteção conferida por DNA de plasmí-dio ou proteínas sEwnv residuais contaminando o estoque de vetor.

Tabela 4. Proteção dependente da dose por TRIP/sEwnv contra infecção porWNV

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a. Grupos de camundongos 129 adultos foram inoculados i.p. com uma úni-ca dose de partículas de vetor lentiviral.

b. Os camundongos foram inoculados i.p. com DL50 de 1.000 de WNV cepaIS-98-ST1 uma semana após o primeiro contato. A sobrevivência foi regis-trada durante 21 dias.

c. Determinado por ELISA em soros reunidos inativados com calor.

d. As partículas de vetor Ientiviral foram inativadas com calor durante 10 mina 7OsC.

NA: não aplicável

Esta invenção apresenta a primeira evidência de que vetoresIentivirais são ferramentas eficientes para gerar uma resposta imune humo-ral protetora contra um patógeno. Além da capacidade agora bem-descritadesses vetores de induzir fortes respostas imunes celulares [12-15, 17, 18,21], este trabalho alarga a aplicabilidade de vetores Ientivirais como ferra-mentas de vacinação contra patógenos para os quais uma resposta humoralneutralizadora seja um braço ativo do sistema imune.

O vetor TRIP/sEwnv foi capaz de induzir uma resposta imunemuito precoce, de longa duração e completamente protetora contra WNV,independentemente da dose letal usada em camundongos. De maneira im-portante, essa imunidade foi conseguida por uma única imunização comuma dose diminuta de partículas de vetor.

Essas características fazem do TRIP/sEwnv um candidato a va-cina promissor contra WNV. Em particular, a necessidade urgente de umavacina veterinária eficiente que possa ser usada em populações animaissuscetíveis no caso de um surto de WNV justifica ensaios envolvendo o ve-tor TRIP/sEwnv Ientiviral em animais, particularmente cavalos e aves. Alémdisso, a imunização profilática de grandes grupos de animais com vacinas àbase de vetor Ientiviral também serviria como provas de conceitos de toxici-dade e segurança sólidas, proporcionando a percepção necessária e, porfim, pavimentando o caminho para o possível uso de vetores Ientivirais comoferramentas de vacinação profilática em seres humanos.

Várias linhas de argumentos tornam o vetor Ientiviral TRIP/sEwnvum poderoso candidato a vacina para uso veterinário. Em primeiro lugar, aproteção conferida ocorre logo após a imunização. Isso poderia ser de gran-de importância no contexto de um surto de WNV, em que uma rápida prote-ção de animais sensíveis é crucial. A natureza exata dessa resposta imuneprotetora prococe não foi totalmente determinada. Uma semana após a imu-nização, anticorpos IgG ainda não são detectáveis, e anticorpos IgM prova-velmente representam a proteção observada. Demonstrou-se que a transfe-rência passiva de IgM anti-WNV policlonal protege camundongos contra odesafio com WNV, demonstrando o papel crítico desse isotipo no controledas fases iniciais da infecção por WNV [43]. Todavia, não pode-se excluir acontribuição de respostas celulares inatas ou adaptativas contra antígenosde WNV para a proteção precoce observada [44]. Em segundo lugar, o vetorlentiviral TRIP/sEWnv é completamente eficaz com uma única dose diminuta.Isso torna esse candidato a vacina interessante em termos de custo e pode-ria permitir o desenvolvimento de protocolos para vacinação em massa, deinteresse particular para a proteção de galinhas. É importante notar que adose requerida para uma imunidade protetora completa poderia ter sido ain-da superestimada em nosso protocolo experimental com camundongo. Defato, demonstrou-se que células murídeas têm uma permissividade menor atransdução de vetor Ientiviral do que outras células de mamíferos, incluindocélulas de seres humanos (dados não mostrados e [4, 45]). Células de avesmostram uma melhor permissividade à transdução do que células murídeas(dados não mostrados), permitindo predizer que doses diminutas de vacinade vetor Ientiviral seriam eficazes em aves. Além disso, a dose protetora de50% de 6,2 ng de antígeno p24 das partículas de vetor TRIP/sEwnv foi calcu-lada sob as condições de desafio mais rigorosas (desafio precoce no dia 7após a vacinação e uma dose letal de DL50 de 1.000). Dado que as concen-trações de anticorpos totais aumentam dez vezes entre os dias 7 e 14, a do-se protetora de 50% provavelmente teria sido ainda menor do que 6,2 ng secalculada apenas uma semana depois. Em terceiro lugar, em virtude do tro-pismo ubíquo do invólucro VSV-G usado para pseudotipagem das partículasde vetor [37], a vacina de vetor Ientiviral pode ser teoricamente usada, semnenhuma modificação, em qualquer espécie de vertebrado: cavalos, avez emamíferos de zoológico em risco. Uma consideração final é que a imunidadeprotetora conferida pelo vetor é esterilizante, nenhuma replicação viral ocor-re após o desafio com WNV. Isso poderia representar uma importante van-tagem se a vacina tivesse de ser usada para imunização de aves. De fato,embora se acredite que cavalos, seres humanos e outros mamíferos sejamhospedeiros finais da infecção com WNV, sabe-se que as aves são hospe-deiros amplificadores e que participam na manutenção de uma epidemia[30]. Além disso, a literatura recente mostra que hamsters experimentalmen-te infectados com WNV que sobrevivem à doença aguda podem continuar aespalhar WNV infeccioso na urina durante até 52 dias [46]. Se isso puder sergeneralizado a outros mamíferos suscetíveis ao WNV, uma vacina esterili-zante poderia se tornar crucial para o controle da epidemia de WNV.

Várias vacinas de WNV para uso veterinário foram propostas.Uma licenciada nos EUA em 2003 para cavalos é um vírus inativado e comadjuvante (website do Fort Dodge: www.equinewestnile.com). Essa prepara-ção inativada gera respostas humorais de baixa magnitude em cavalos e,portanto, requer várias injeções, seguidas por reforços anuais. Essa vacinade vírus morto não gera anticorpos neutralizadores em flamingos chilenos egaviões de cauda vermelha [47]. Uma varíola de canário recombinante quecodifica as proteínas preM/E do WNV também foi licenciada em 2004 [48].Entretanto, esse candidato também requer duas injeções a intervalos de 5semanas. Nenhuma dessas vacinas confere proteção absoluta aos cavalosvacinados. Outras estratégias, como DNA nu que codifica proteínas pre M eE de WNV [28] também são consideradas.

Candidatos a vacinas contra WNV estão sendo desenvolvidos,na maioria dos casos, para uso humano. Demonstrou-se que uma vacina desarampo viva que expressa a forma secretada da E-glicoproteína de WNVprotege eficientemente camundongos contra encefalite por WNV [29]. Duasvacinas vias atenuadas recombinantes, WNV/febre amarela quimérica eWNV/Dengue 4, contendo os genes pre M e E do WNV clonado na estruturaprincipal da cepa de vacina 17D do vírus da febre amarela ou do vírus dadengue 4, foram testadas. Estudos pré-clínicos em camundongos e macacosmostram que ambas as vacinas são protetoras contra desafio com WNV [49-51]. Entretanto, o uso de vírus vivo atenuado quimérico poderia apresentarpreocupações de segurança: a recombinação entre diferentes espécies deflavivírus é possível, conforme demonstrado por flavivírus recombinantes deocorrência natural [52, 53].

O potencial de uso de vacinas à base de vetor lentiviral, parauso humano ou veterinário, requer um projeto cuidadoso do vetor e estudosde segurança pré-clínica rigorosos. Preocupações de segurança quanto aouso de vetores integrativos são justificadas em vista dos recentes relatos decasos de leucemia no ensaio SCID. X1. Esses efeitos adversos graves estãodiretamente relacionados à integração do vetor retroviral derivado de Molo-ney em íntima proximidade do proto-oncogene LM02 em células tronco he-matopoiéticas [54].

Entretanto, as aplicações de vacinação com vetores Ientivirais apre-senta menores riscos. Em oposição à terapia genética à base de células tronco,que envolve a ampla proliferação de células transduzidas e a persistência damodificação genética durante toda a vida do paciente, células transduzidas emum cenário de vacinação expressam o antígeno relevante e, portanto, são alvosda resposta imune gerada. Acredita-se que células que expressam o antígeno,APCs ou não, sejam eliminadas do organismo vacinado em semanas ou meses.Além disso, no caso particular da vacinação por injeções subcutâneas ou intra-venosas, demonstrou-se que partículas de vetor lentiviral pseudotipadas VSV-Gtêm como alvo essencialmente DCs [13, 18], uma APC profissional que não sedivide com curta meia-vida in vivo após a ativação. Todavia, tanto o tropismocelular do vetor, quanto a falta de persistência das seqüências do vetor devacinação, dependendo da via de injeção e dose do vetor, terão de ser cui-dadosamente determinados para cada protocolo de vacinação.

Vetores Ientivirais parecem ser ferramentas promissoras paravacinação contra o Vírus do Nilo Ocidental e provavelmente outras zoonosesou patógenos emergentes.

Outras modalidades da invenção ficarão claras para aquelesversados na técnica depois de se considerar o relatório e a prática da inven-ção aqui exposta. Pretende-se que o relatório e os exemplos sejam conside-rados como apenas exemplificativos, com o verdadeiro âmbito e espírito dainvenção sendo indicados pelas reivindicações a seguir.Referências

1. Sirven A, Pflumio F, Zennou V, et al. The human immunodeficiency virustype-1 central DNA flap is a crucial determinant for Ientiviral vector nuclearimport and gene transduction of human hematopoietic stem cells. Blood2000;96:4103-4110.

2. Zennou V, Serguera C, Sarkis C, et al. The HIV-1 DNA flap stimulates HIVvector-mediated cell transduction in the brain. Nat Biotechnol 2001; 19:446-450.

3. Takahashi M, Miyoshi H, Verma IM, et al. Rescue from photoreceptor de-generation in the rd mouse by human immunodeficiency virus vector- media-ted gene transfer. J Virol 1999; 73:7812-7816.

4. Giannini C, Morosan S, Tralhao JG, et al. A highly efficient, stable, andrapid approach for ex vivo human Iiver gene therapy via a FLAP Ientiviralvector. Hepatology 2003; 38:114-122.

5. Kootstra NA, Matsumura R, and Verma IM. Efficient production of humanFVIII in hemophilic mice using Ientiviral vectors. Mol Tfter 2003; 7:623-631.

6. Kordower JH, Emborg ME, Bloch J, et al. Neurodegeneration prevented byIentiviral vector delivery of GDNF in primate models of Parkinson's disease.Science 2000; 290:767-773.

7. Benhamida S, Pflumio F, Dubart-Kupperschmitt A, et al. TransducedCD34+ cells from adrenoleukodystrophy patients with HlV-derived vector media-te long-term engraftment of NOD/SCID mice. Mol Ther 2003; 7:317- 324.

8. Biffi A, De Palma M, Quattrini A, et al. Correction of metachromatic Ieu-kodystrophy in the mouse model by transplantation of genetically modifiedhematopoietic stem cells. J Clin Invest 2004; 113:1118-1129.

9. Pawliuk R, Westerman KA, Fabry MÉ, et al. Correction of sickle cell diseasein transgenic mouse models by gene therapy. Science 2001; 294:2368-2371.

10. Puthenveetil G, Scholes J, Carbonell D, et al. Successful correction of thehuman beta-thalassemia major phenotype using a ientiviral vector. Blood2004;104:3445-3453.

11. Ralph GS, Radcliffe PA, Day DM, et al. Silencing mutant SOD1 usingRNAi protects against neurodegeneration and extends survival in an ALSmodel. Nat Med 2005; 11:429-433.12. Breckpot K1 Dullaers Μ, Bonehill Α, et al. Lentivirally transduced dendriticcells as a tool for câncer immunotherapy. J Gene Med 2003; 5:654-667.

13. Esslinger C, Chapatte L1 Finke D, et al. In vivo administration of a Ientivi-ral vaccine targets DCs and induces efficient CD8(+) T cell responses. J CHnInvest 2003; 111:1673-1681.

14. Esslinger C, Romero P, and MacDonaId HR. Efficient transduction ofdendritic cells and induction of a T-cell response by third-generation Ientivec-tors. Hum Gene Ther 2002; 13:1091-1100.

15. Firat H, Zennou V, Garcia-Pons F, et al. Use of a Ientiviral flap vector forinduction of CTL immunity against melanoma. Perspectives for immunothe-rapy. J Gene Med 2002; 4:38-45.

16. He Y1 Zhang J, Mi Z, et al. Immunization with Ientiviral vector-transduceddendritic cells induces strong and Iong-Iasting T cell responses and therapeu-tic immunity. J Immunol 2005,174:3808-3817.

17. Metharom P, Ellem KA, Schmidt C, et al. Lentiviral vector-mediated tyro-sinase-related protein 2 gene transfer to dendritic cells for the therapy of me-lanoma. Hum Gene Ther 2001; 12:2203-2213.

18. Palmowski MJ1 Lopes L, Ikeda Y, et al. Intravenous injection of a Ientiviralvector encoding NY-ESO-1 induces an effective CTL response. J Immunol2004; 172:1582-1587.

19. Dyall J, Latouche JB, Schnell S, et al. Lentivirus-transduced human mo-nocyte-derived dendritic cells efficiently stimulate antigen-specific cytotoxic Tlymphocytes. Blood 2001; 97:114-121.

20. Rohrlich PS, Cardinaud S, Lule J, et al. Use of a Ientiviral vector enco-ding a HCMV-chimeric IE1-pp65 protein for epitope Identification in HLA- Trans-genic mice and for ex vivo stimulation and expansion of CD8(+) cytotoxic T cellsfrom human peripheral blood cells. Hum Immunol 2004; 65:514-522.

21. Zarei S, Abraham S, Arrighi JF, et al. Lentiviral transduction of dendritic cellsconfers protective antiviral immunity in vivo. J Virol 2004; 78:7843- 7845.

22. VandenDriessche T, Thorrez L, Naldini Li et al. Lentiviral vectors contai-ning the human immunodeficiency virus type-1 central polypurine tract canefficiently transduce nondividing hepatocytes and antigen- presenting cells invivo. Blood 2002,100:813-822.

23. Engle MJ, and Diamond MS. Antibody prophylaxis and therapy againstWest Nile virus infection in wild-type and immunodeficient mice. J Virol 2003;77:12941-12949.

24. Diamond MSi Shrestha B, Marri A, et al. B cells and antibody play criticalroles in the immediate defense of disseminated infection by West Nile ence-phalitis virus. J Virol 2003; 77:2578-2586.

25. Ben-Nathan D, Lustig S, Tarn G1 et al. Prophylactic and therapeutic effi-cacy of human intravenous immunoglobulin in treating West Nile virus infec-tion in mice. J Infect Dis 2003; 188:5-12.

26. Beasley DW1 and Barrett AD. Identification of neutralizing epitopes withinstructural domain III of the West Nile virus envelope protein. J Virol 2002; 76:13097-13100.

27. Wang T, Anderson JF, Magnarelli LA, et al. Immunization of mice againstWest Nile virus with recombinant envelope protein. J Immunol 2001;167:5273-5277.

28. Davis BS, Chang GJ, Cropp B, et al. West Nile virus recombinant DNAvaccine protects mouse and horse from virus challenge and expresses invitro a noninfectious recombinant antigen that can be used in enzyme-linkedimmunosorbent assays. J Virol 2001; 75:4040-4047.

29. Despres P, Combredet C, Frenkiel MP1 et al. Live measles vaccine ex-pressing the secreted form of the West Nile virus envelope glycoprotein pro-tects against West Nile virus encephalitis. J Infect Dis 2005; 191:207-214.

30. Dauphin G, Zientara S, Zeller H, et al. West Nile: worldwide current situationin animais and humans. Comp Immunol Microbiol Infect Dis 2004; 27:343-355.

31. Mashimo T, Lucas M, Simon-Chazottes D, et al. A nonsense mutation inthe gene encoding 2'-5'-oligoadenylate synthetase/L1 isoform is associatedwith West Nile virus susceptibility in Iaboratory mice. Proc Natl Acad Sci U SA 2002; 99:11311-11316.

32. Lucas M, Frenkiel MP, Mashimo T, et al. The Israeli strain IS-98-ST1 ofWest Nile virus as viral model for West Nile encephalitis in the Old World.Virol J 2004; 1:9.

33. Lanciotti RS, Ebel GD, Deubel V, et al. Complete genome sequencesand phylogenetic anaiysis of West Nile virus strains isolated from the UnitedStates, Europe, and the Middle East. Virology 2002;298:96-105.

34. Charrel RN, Brault AC, Gallian P, et al. Evolutionary relationship betweenOld World West Nile virus strains. Evidence for viral gene flow between Áfri-ca, the Middle East, and Europe. Virology 2003; 315:381-388.

35. Despres P, Frenkiel MP, and Deubel V. Differences between cell mem-brane fusiop activities of two dengue type-1 isolates reflect modifications ofviral structure. Virology 1993; 196:209-219.

36. Zufferey Ri Nagy D, Mandei RJ, et al. Multiply attenuated Ientiviral vectorachieves efficient gene delivery in vivo. Nat Biotechnol 1997; 15:871-875.

37. Yee JK, Miyanohara A, LaPorte P, et al. A general method for the gene-ration of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection ofprimary hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 1994; 91:9564- 9568.

38. Zennou V, Petit C, Guetard D, et al. HIV-1 genome nuclear import is me-diated by a central DNA flap. Cell 2000; 101:173-185.

39. Brussel A, and Sonigo P. Anaiysis of early human immunodeficiency vi-rus type 1 DNA synthesis by use of a new sensitive assay for quantifying in-tegrated provirus. J Virol 2003; 77: 10119-10124.

40. Despres P, Griffin JW, and Griffin DE. Effects of anti-E2 monoclonal anti-body on sindbis virus replication in AT3 cells expressing bcl-2. J Virol 1995;69:7006-7014.

41. Deubel V, Fiette L, Gounon P, et al. Variations in biological features ofWest Nile viruses. Ann N Y Acad Sci 2001; 951:195-206.

42. Ceccaldi PE, Lucas M, and Despres P. New insights on the neuropatho-Iogy of West Nile virus. FEMS Microbiol Lett 2004; 233:1-6.

43. Diamond MS, Sitati EM, Friend LD, et al. A criticai role for induced IgM in theprotection against West Nile virus infection. J Exp Med 2003; 198:1853-1862.

44. Shrestha B, and Diamond MS. Role of CD8+ T cells in control of WestNile virus infection. J Virol 2004; 78:8312-8321.

45. Nguyen TH, Oberholzer J, Birraux J, et al. Highly efficient Ientiviral vec-tor-mediated transduction of nondividing, fully reimplantable primary hepa-tocytes. Mol Ther 2002; 6: 199-209.

46. Tonry JH1 Xiao SY1 Siirin Μ, et al. Persistent shedding of West Nile virusin urine of experimentally infected hamsters. Am J Trop Med Hyg 2005;72:320-324.

47. Nusbaum KE1 Wright JC, Johnston WB1 et al. Absence of humoral res-ponse in flamingos and red-tailed hawks to experimental vaccination with akilled West Nile virus vaccine. Avian Dis 2003; 47:750-752.

48. Minke JM, Siger L, Karaca K, et al. Recombinant canarypoxvirus vaccinecarrying the prM/E genes of West Nile virus protects horses against a WestNile virus-mosquito challenge. Arch Virol Suppl 2004:221-230.

49. Arroyo J, Miller C, Catalan J, et al. ChimeriVax-West Nile virus Iive-attenuated vaccine: preclinical evaluation of safety, immunogenicity, and effi-cacy. J Virol 2004; 78: 12497-12507.

50. Pletnev AG, Putnak R, Speicher J, et al. West Nile virus/dengue type 4virus chimeras that are reduced in neurovirulence and peripheral virulencewithout Ioss of immunogenicity or protective efficacy. Proc Natl Acad Sci USA2002;99:3036-3041.

51. Pletnev AG, Claire MS, Elkins R, et al. Molecularly engineered Iive-attenuated chimeric West Nile/dengue virus vaccines protect rhesus mon-keys from West Nile virus. Virology 2003; 314: 190-195.

52. Seligman SJ, and Gould EA. Live flavivirus vaccines: reasons for caution.Lancet 2004; 363:2073-2075.

53. Gould EA, Moss SR, and Turner SL. Evolution and dispersai of encepha-Iitic flaviviruses. Arch Virol Suppl 2004:65-84.

54. Hacein-Bey-Abina S, Von Kalle C, Schmidt M, et al. LM02-associatedclonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Sci-ence 2003; 302:415-419.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> INSTITUT PASTEUR

CHARNEAU, PIERRE

DESPRES, PHILIPPE

<120> VACINA À BASE DE VETOR LENTIVIRAL

<130> BLOcp226/135PCT

<140> 11/250,616<141> 2005-10-17

<160> 13

<170> PatentIn Ver. 3.3

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Sonda sintética

<400> 1

cacaacagac gggcacacac tacttga

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Sonda sintética

<400> 2

cactcaaggc aagctttatt gaggc

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Iniciador Sintético

<400> 3

gctagagatt ttccacactg actaa

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Iniciador Sintética

<400> 4ggctaactag ggaacccact g 21

<210> 5<211> 34<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Sonda sintética

<400> 5

ggctgaaggt tagggatacc aatattcctg tctc 34

<210> 6 . "<211> 30<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Sonda sintética<400> 6

ctagtgatgg gctcttccct tgagcccttc 30

<210> 7<211> 23<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Iniciador sintética

<400> 7

ggctatcatt cttcttcaag gta 23

<210> 8<211> 22<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<22 0>

<223> Descrição da seqüência artificial: Iniciador sintética

<400> 8

cctctcttca gccatttaag ta 22

<210> 9<211> 1380<212> DNA

<213> Vírus West Nile<400> 9

atgagagttg tgtttgtcgt gctattgcttcttggaatga gcaacagaga cttçttggaagttctcgaag gcgacagctg cgtgactatcaagatgatga atatggaggc ggtcaacctgaccgtcagcg atctctccac caaagctgcgaaacgtgctg acccagcttt tgtgtgcaga

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<210> 10<211> 1374<212> DNA

<213> Vírus West Nile<400> 10

agagttgtgt ttgtcgtgct attgcttttgggaatgagca acagagactt cttggaaggactcgaaggcg acagctgcgt gactatcatgatgatgaata tggaggcggt caacctggcagtcagcgatc tctccaccaa agctgcgtgccgtgctgacc cagcttttgt gtgcagacaatgcggattat ttggcaaagg aagcattgacgcaataggaa gaaccatctt gaaagagaatggaccaacta ctgtggagtc gcacggaaacgggagattca gcatcactcc tgcggcgcctgaggtgacag tggactgtga accacggtcaactgttggaa caaagacgtt cttggtccattggagcagtg ctggaagtac tgtgtggaggccacacgcca cgaagcagtc tgtgatagcagctttggctg gagccattcc tgtggaatttcatttgaagt gtagagtgaa gatggaaaaatgttcaaagg ctttcaagtt tcttgggactttggaattgc agtacactgg cacggatggatcattgaacg acctaacgcc agtgggcagagccacggcca acgctaaggt cctgattgaagtggtgggca gaggagaaca acagatcaatggcaaagcct ttacaaccac cctcaaaggagcttgggact ttggatcagt tggaggggtg

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<210> 11<211> 458<212> PRT

<213> Vírus West Nile<400> 11

Arg Val Val Phe Val Val Leu Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala Tyr Ser1 5 10 15

Phe Asn Cys Leu Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Leu Glu Gly Val Ser20 25 30

Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Val Thr35 40 45

Ile Met Ser Lys Asp Lys Pro Thr Ile Asp Val Lys Met Met Asn Met50 55 60Glu Ala Val Asn Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Leu Ala Thr65 70 75 80

Val Ser Asp Leu Ser Thr Lys Ala Ala Cys Pro Thr Met Gly Glu Ala85 90 95

His Asn Asp Lys Arg Ala Asp Pro Ala Phe Val Cys Arg Gln Gly Val100 105 110

Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser115 120 125

Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Thr Lys Ala Ile Gly Arg130 135 140

Thr Ile Leu Lys Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Ala Ile Phe Val His145 150 155 160

Gly Pro Thr Thr Val Glu Ser His Gly Asn Tyr Ser Thr Gln Val Gly165 170 175

Ala Thr Gln Ala Gly Arg Phe Ser Ile Thr Pro Ala Ala Pro Ser Tyr180 185 190

Thr Leu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Glu Val Thr Val Asp Cys Glu Pro195 200 205

Arg Ser Gly Ile Asp Thr Asn Ala Tyr Tyr Val Met Thr Val Gly Thr210 215 220

Lys Thr Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe Met Asp Leu Asn Leu Pro225 230 235 240

Trp Ser Ser Ala Gly Ser Thr Val Trp Arg Asn Arg Glu Thr Leu Met245 250 255

Glu Phe Glu Glu Pro His Ala Thr Lys Gln Ser Val Ile Ala Leu Gly260 265 270

Ser Gln Glu Gly Ala Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Pro Val275 280 285

Glu Phe Ser Ser Asn Thr Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys290 295 300

Arg Val Lys Met Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Val305 310 315 320

Cys Ser Lys Ala Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His325 330 335

Gly Thr Val Val Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys340 345 350

Lys Val Pro Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro Val355 360 365

Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala Asn370 375 380

Ala Lys Val Leu Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile385 390 395 400

Val Val Gly Arg Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser405 410 415Gly Ser Ser Ile Gly Lys Ala Phe Thr Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln420 425 430

Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly435 440 445

Gly Val Phe Thr Ser Val Gly Lys Ala Val450 455

<210> 12<211> 94<212> PRT

<213> Vírus West Nile<400> 12

Thr Thr Tyr Gly Val Cys Ser Lys Ala Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro1 5 10 15

Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly20 25 30

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Val Ala Thr Ala Asn Ala Lys Val Leu Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe65 70 75 80

Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Glu Gln Gln Ile85 90

<210> 13<211> 4555<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Seqüência Sintética de Vetor lenti-viral pTRIP/Ewnv

<400> 13

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Claims

1. Uso de um vetor lentiviral, compreendendo um ácido nucléicoheterólogo que codifica um antígeno, e em que a expressão do antígeno emuma célula de um animal provoca uma resposta imune no dito animal, para apreparação de um medicamento capaz de produzir anticorpos quando admi-nistrado ao dito animal.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, em que o antígeno éselecionado do grupo que consiste em um antígeno de superfície e um antí-geno de membrana.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a respostahumoral induz uma imunidade protetora em um animal necessitado, a ditaimunidade protetora sendo uma imunidade protetora de longa duração ouuma imunidade esterilizadora.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, em que a expressão do antígeno induz imunidade protetora contra ummicroorganismo patogênico.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, em que o microorga-nismo patogênio é um flavivírus.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, em que o microorga-nismo patogênio é o vírus do Nilo Ocidental.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, em que o ácido nucléico heterólogo codifica uma E-glicoproteína de invó-lucro, seu fragmento ou uma variante da dita E-glicoproteína de invólucro devírus do Nilo Ocidental.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, em que o dito fragmen-to é selecionado no grupo que consiste em E-glicoproteína truncada na ter-minação carboxila do vírus do Nilo Ocidental, sem a região de ancoragemtransmembrana, e E-glicoproteína truncada na terminação carboxila com-preendendo os resíduos 1 - 441 da E-glicoproteína de invólucro de vírus doNilo Ocidental cepa IS-98-ST1.

9. Uso de um vetor lentiviral, compreendendo um ácido nucléicoheterólogo selecionado do grupo que consiste em um ácido nucléico heteró-logo que codifica uma proteína de superfície de um microorganismo, ou seufragmento, e uma variante de uma proteína de membrana superficial ou seufragmento, com um veículo e/ou adjuvante fisiológico aceitável, para a pre-paração de uma vacina contra uma infecção por microorganismos, capaz deser administrada a um animal necessitado, uma ou mais vezes.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, em que o microorga-nismo é o vírus do Nilo Ocidental, e em que o ácido nucléico heterólogo co-difica E-glicoproteínaiáe invólucro do vírus do Nilo Ocidental, sua variante ouseu fragmento, com um veículo e/ou adjuvante fisológico aceitável.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, em que o vetorlentiviral é administrado por uma via intraperitoneal, via intravenosa, via in-tramuscular, via oral, via mucosa, via sublingual, via subcutânea, via intrana-sal ou via intradérmica.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, em que o vetor Ienti-viral é administrado por uma via intramuscular, e em que o animal necessi-tado é um cavalo.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 11, em que o vetor Ienti-viral é administrado por uma via intranasal ou uma via intradérmica, e emque o animal necessitado é um ser humano.

14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 13,em que o ácido nucléico heterólogo codifica um fragmento de uma E-glico-proteína de invólucro do vírus do Nilo Ocidental selecionado no grupo queconsiste em E-glicoproteína truncada na terminação carboxila do vírus doNilo Ocidental, sem a região de ancoragem transmembrana, e E-glicopro-teína truncada na terminação carboxila compreendendo os resíduos 1 - 441da E-glicoproteína de invólucro de vírus do Nilo Ocidental cepa IS-98-ST1.

15. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 14, em que o vetor Ientiviral é administrado uma vez e compreende uma do-se de partículas de vetor equivalente a 0,5 ng a 5.000 ng de antígeno p24, 30 de preferência uma dose de partículas de vetor equivalente a 0,5 ng a 50 ngde antígeno p24 e, mais preferivelmente, uma dose de partículas de vetorequivalente a 50 a 500 ng de antígeno p24.

16. Composição imunogênica compreendendo um vetor Ientivi-ral, em que o vetor Ientiviral compreende um ácido nucléico heterólogo quecodifica um antígeno em uma quantidade suficiente para induzir uma respos-ta imunogênica ou protetora in vivo, e um veículo farmaceuticamente aceitá-vel para ele.

17. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação-16, em que o ácido nucléico heterólogo codifica uma proteína de superfíciede um microorganismo, ou seu fragmento.

18. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação-16, em que o ácido nucléico heterólogo codifica E-glicoproteína de invólucrode um flavivírus, ou seu fragmento.

19. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação-18, em que o ácido nucléico heterólogo codifica E-glicoproteína de invólucrode um vírus do Nilo Ocidental ou seu fragmento.

20. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação-19, em que o ácido nucléico heterólogo é selecionado do grupo que consisteem um ácido nucléico heterólogo que codifica E-glicoproteína truncada naterminação carboxila do vírus do Nilo Ocidental, sem a região de ancoragemtransmembrana, ácido nucléico heterólogo que codifica E-glicoproteína trun-cada na terminação carboxila compreendendo os resíduos 1 - 441 da E-glicoproteína de invólucro de vírus do Nilo Ocidental cepa IS-98-ST1, e ácidonucléico heterólogo que codifica uma variante da E-glicoproteína de invólu-cro do vírus do Nilo Ocidental.

21. Vetor Ientiviral que dirigi a expressão de um ácido nucléicoheterólogo, em que o ácido nucléico heterólogo codifica E-glicoproteína dovírus do Nilo Ocidental, sua variante ou seus fragmentos, e em que o vetorcompreende um promotor selecionado de promotor precoce imediato de ci-tomegalovírus, promotor CAG, promotor EFIalfa, promotor PGK, promotorSVero e promotor MND.

22. Vetor lentiviral, de acordo com a reivindicação 21, em que oácido nucléico heterólogo é selecionado do grupo que consiste emum ácidonucléico heterólogo que codifica E-glicoproteína truncada na terminaçãocarboxila do vírus do Nilo Ocidental, sem a região de ancoragem transmem-brana, e ácido nucléico heterólogo que codifica E-glicoproteína truncada naterminação carboxila compreendendo os resíduos 1 - 441 da E-glicoproteínade invólucro de vírus do Nilo Ocidental cepa IS-98-ST1.

23. Vetor lentiviral, de acordo com a reivindicação 22, em que ovetor compreende pTRIP/sEwNv.

24. Célula hospedeira substancialmente purificada, transfectadaou transduzida com o vetor lentiviral como definido em qualquer uma dasreivindicações de 21 a 23.

25. Método para a produção de polipeptídio da E-glicoproteínade invólucro do vírus do Nilo Ocidental, sua variante ou seu fragmento, com-preendendo o cultivo de uma célula hospdeira como definido na reivindica-ção 24 sob condições que promovam a expressão, e recuperação do poli-peptídio da célula hospedeira ou do meio de cultura.

26. Vetor lentiviral que dirige a expressão de um ácido nucléicoheterólog, em que o vetor compreende o promotor precoce imediato de ci-tomegalovírus, e em que o ácido nucléico heterólogo compreende proteínafluorescente verde.

27. Célula hospedeira substancialmente purificada, transfectadaou transduzida com o vetor lentiviral como definido na reivindicação 26.

28. Uso de um vetor lentiviral compreendendo um ácido nucléicoheterólogo que codifica um antígeno, e em que o antígeno gera anticorposcontra o agente patogênio, para a preparação de uma vacina contra um a-gente patogênio, capaz de ser administrada a um animal necessitado.

29. Uso, de acordo com a reivindicação 28, em que a adminis-tração do vetor lentiviral gera anticorpos de imunidade humoral ou neutrali-zadores de longa duração contra o agente patogênico.

30. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 e-29, em que o vetor lentiviral compreende um ácido nucléico que codifica E-glicoproteína de invólucro do vírus do Nilo Ocidental, ou seu fragmento, e emque o agente patogênio é o vírus do Nilo Ocidental.

31. Uso, de acordo com a reivindicação 30, em que a E-glico-proteína de invólucro do vírus do Nilo Ocidental não possui uma região deancoragem transmembrana.

32. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 28a 31, em que a administração de vetor Ientiviral compreende pelo menosuma dose de partículas de vetor equivalente a 0,5 a 5.000 ng de antígenop24.

33. Uso, de acordo com a reivindicação 3, 9 ou 28, em que oanimal necessitado é selecionado de seres humanos, cavalos, pássaros,galinhas, porcos, gado, roedores, animais de estimação e répteis.

34. Uso, de acordo com a reivindicação 7, 9, 20 ou 21, ou méto-do, como definido na reivindicação 25, em que o ácido nucléico heterólogocodifica uma variante da E-glicoproteína de invólucro do vírus do Nilo Oci-dental e se hibridiza sob condições de hibridização rigorosa a qualqer fita deum ácido nucléico do vírus do Nilo Ocidental cepa IS-98-ST1 que codifique a E-glicoproteína de invólucro.