BRPI0614999A2 - método de produção de um pó seco e o referido pó seco - Google Patents

Abstract

MéTODO DE PRODUçãO DE UM PO SECO E O REFERIDO Pó SECO A presente invenção refere-se a métodos e composições de secagem por atomização de material celular que permitem a conservação do material celular. Em um aspecto, o material celular é seco por atomização com uma quantidade de excipiente. Em um outro aspecto, o material celular é seco por atomização usando um crioprotetor.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DEPRODUÇÃO DE UM PÓ SECO E O REFERIDO PÓ SECO".

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS

Este Pedido de Patente reivindica a prioridade ao Pedido de Pa-tente U.S. N0 de série 60/707.425, depositado em 11 de agosto de 2005, ePedido de Patente U.S. N0 de série 60/788.133, depositado em 31 de marçode 2006. Os conteúdos inteiros de ambos os Pedidos de Patente anterioressão aqui incorporados por referência.

ANTECEDENTES

A presente invenção refere-se as formas secas de partículasvirais, organismos celulares, e outros materiais ligados à membrana que po-dem ser de grande utilidade nas indústrias farmacêutica e de saúde geral.As formas celulares secas (DCF) apresentam a utilidade do armazenagem alongo prazo, a facilidade de processamento, e liberação para o alimento,agricultura e aplicações na saúde humana. Exemplos de DCF incluem leve-dura seca para aplicações alimentares, células crioconservadas (por exem-plo, células sangüíneas), e todas as células para liberação genética (Trsic-Milanovic et al., J. Serb. Chem. Soe, 66:435 - 42, 2001; Diniz-Mendes et al.,Biotechnol. Bioeng., 65:572-8, 1999; e Seville et al., J. Gene Med., 4:428-37,2002).

As DCF são geralmente preparadas por dois métodos: i) Iiofiliza-ção ou secagem por congelamento, que envolve a secagem em massa secadas suspensões aquosas da forma celular ou ii) crioconservação, que envol-ve a infusão de níveis elevados de crioprotetor nas suspensões aquosascelulares e a diminuição da temperatura da suspensão para baixo de O0C emuma taxa prescrita que minimiza a morte celular. Uma desvantagem de Iiofi-lização (ou secagem por congelamento) e a crioconservação é a dificuldadena preparação de DCF em grandes volumes a um baixo custo ao mesmotempo que preserva a maior parte do material celular (Kirsop and Snell, eds.,1984, Maintenance of Microorganisms: A Manual of Laboratory Methods,London, Academic Press). Ambas as técnicas são limitadas pela transfe-rência de massa através da membrana da bicamada de lipídio e tensõesosmóticas relacionadas.

A liofilização é utilizada na preparação comercial da vacina deBacillus Calmette-Guerin (BCG). A BCG é administrada por meio de injeçãoem milhões de recém-nascidos anualmente para proteger contra a tubercu-lose (TB), uma doença causada por uma bactéria chamada o bacilo do tu-bérculo ou Mycobacterium tuberculosis (Roche et al., Trends Microbiol,3:397-401, 1995). Atualmente, a TB é a sexta maior causa de morte e a epi-demia global está crescendo em uma taxa anual estimada de 3%. O apare-cimento da AIDS e as suas ligações com a TB trouxeram uma maior urgên-cia de uma nova vacina, uma vez que a BCG é apenas moderadamente efi-caz durante o período de tempo de uma vulnerabilidade da pessoa à infec-ção por TB, tipicamente os primeiros 30 anos de vida de uma pessoa (Fine,Lancet, 346:1339-1345, 1995). Uma razão potencial para a falta de eficáciada BCG é a baixa viabilidade da BCG nas DCF fabricadas.

SUMÁRIO

A invenção se baseia, em parte, na descoberta de novos méto-dos e composições de material celular seco por atomização que apresentamrendimento significativo do produto, alta atividade do organismo (por exem-plo, viabilidade), e boas propriedades de processamento de pó. As formascelulares secas, por exemplo, produzidas pelas composições e métodos a-qui descritos, possuem um baixo teor de água e podem ser adequadas paraadministração a um indivíduo por inalação. As formas celulares secas retêma atividade durante um período de tempo quando armazenadas em tempera-turas acima do congelamento, permitindo uma facilidade de armazenagem(por exemplo, armazenagem de longo prazo) e liberação. Estas proprieda-des permitem os métodos e composições aqui descritas serem úteis parapreparações de vacina, por exemplo, a serem administradas por injeção,administração oral ou inalação.

Em um aspecto, a invenção inclui pós secos com menos do quecerca de 10% (por exemplo, menos do que cerca de 8%, 5%, 4%, 3%, 2%ou 1%) de água, por exemplo, água livre, um material celular, e pelo menos25% (por exemplo, pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%,92%, 94%, 96%, 98%, 99%, ou mais) de um excipiente em peso seco. Emalgumas modalidades, os pós são produzidos sem congelamento. Em algu-mas modalidades, os pós são produzidos pela secagem por atomização. Emalgumas modalidades, o material celular inclui bactérias (por exemplo, bacté-rias do gênero Mycobacterium, por exemplo, M tuberculosis, M. smegmatis,ou Bacillus Calmette-Guerin), vírus, micróbios eucarióticos, células de mamí-fero (por exemplo, glóbulos vermelhos, células tronco, granulócitos, fibro-blastos ou plaquetas), organelas ligadas a membrana, lipossomas, biorreato-res com base na membrana, ou sistemas de liberação de fármaco com basena membrana. Em algumas modalidades, a relação de massa do excipientepara o número de unidades de material celular é pelo menos 0,25 pg de ex-cipiente por unidade de material celular (por exemplo, pelo menos, 0,25, 0,5,1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10.000 ou 20.000 pg deexcipiente por unidade de material celular). Em algumas modalidades, a re-lação da massa de excipiente para massa de material celular é pelo menos0,1 (por exemplo, pelo menos 0,25, 0,5, 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50,100, 200, 500, 1000 ou 2000). Em algumas modalidades quando o pó incluicélulas vivas (por exemplo, bactérias), mais do que 0,5% (por exemplo, 1%,2%, 4%, 5%, 6%, 8%, 10%, 12%, 15%, 18%, 20%, 25% ou mais) das célulassão viáveis. Em algumas modalidades, as células vivas no pó retêm mais doque 1/1000 (por exemplo, mais do que 1/500, 1/200, 1/100, 1/50, 1/20 ou1/10) de sua viabilidade inicial após a armazenagem em mais do que 0°C(por exemplo, mais do que 4°C, 10°C, 20°C, 25°C, 30°C, 40°C ou 50°C) du-rante um período maior do que 10 dias (por exemplo, 20, 30, 40, 50, 60, 70,80, 90, 100, 110 ou 120 dias). Em algumas modalidades, o(s) excipiente(s)inclui(em) leucina, manitol, trealose, dextrano, lactose, sacarose, sorbitol,albumina, glicerol, etanol, ou suas misturas. Em algumas modalidades, ospós não incluem crioprotetor, por exemplo, crioprotetor adicionado ou umaquantidade significativa de crioprotetor (por exemplo, um crioprotetor quenão é o excipiente). Em algumas modalidades, os pós não incluem sal, porexemplo, sal adicionado ou uma quantidade significativa de sal. Os pós se-cos podem ser formuladas como composições farmacêuticas, por exemplo,para administração por inalação.

Em outro aspecto, a invenção inclui métodos de produção depós secos que incluem materiais celulares mediante o fornecimento de umasolução aquosa, incluindo, pelo menos 0,01 mg/ml (por exemplo, pelo me-nos 0,1, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100 ou 200 mg/ml) de excipiente(s) e pelo menos105 unidades/ml (por exemplo, pelo menos 106, 107, 108, 109 ou 1010 unida-des/ml) de um material celular, e secagem por atomização da solução sobcondições de produzir um pó seco que inclui o material celular com menosdo que cerca de 10% (por exemplo, menos de cerca de 8%, 5%, 4%, 3%,2% ou 1%) de água, por exemplo, água livre, em peso. Em algumas modali-dades, a relação de massa de excipiente para o número de unidades de ma-terial celular é de pelo menos 0,25 picograma de excipiente por unidade dematerial celular (por exemplo, pelo menos, 0,25, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100,200, 500, 1000, 2000, 5000, 10000 ou 20000 pg de excipiente por unidadede material celular). Em algumas modalidades, a relação de massa de exci-piente para massa de material celular é pelo menos 0,1 (por exemplo, pelomenos 0,25, 0,5, 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000 ou2000). Em algumas modalidades em que o material celular inclui bactérias(por exemplo, bactérias Gram-positivas), a solução não contém sal ou crio-protetor adicionado. Em algumas modalidades em que o material celularesinclui células eucarióticas (por exemplo, células de mamífero), a soluçãopode incluir sais ou outros solutos suficientes para minimizar a pressão os-mótica.

Em algumas modalidades, a solução inclui pelo menos 10% (porexemplo, pelo menos 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%,94%, 96%, 98% , 99%, ou mais) de excipiente em peso seco. Em algumasmodalidades, a solução inclui menos do que 1010 unidades/ml (por exemplo,menos do que 109, 108, 107 ou 106 unidades/ml) de um material celular. Emalgumas modalidades, o material celular inclui bactérias (por exemplo, bacté-rias do gênero Mycobacterium, por exemplo, M. tuberculosis, M. smegmatis,ou Bacillus Calmette-Guerin), vírus, micróbios eucarióticos, células de mamí-fero (por exemplo, glóbulos vermelhos, células troncos, granulócitos, fibro-blastos, ou plaquetas), organelas ligadas à membrana, lipossomas, biorrea-tores com base na membrana, ou sistemas de liberação de fármaco combase na membrana. Em algumas modalidades, o(s) excipiente(s) inclue(m)leucina, manitol, trealose, dextrano, lactose, sacarose, sorbitol, albumina,glicerol, etanol, ou suas misturas. Em algumas modalidades, a solução a-quosa não contém um crioprotetor, por exemplo, um crioprotetor que nãoseja o excipiente. Em algumas modalidades, os métodos ainda incluem aformulação do pó seco em uma composição farmacêutica, por exemplo, paraadministração por inalação. A invenção inclui também pós secos que inclu-em um material celular que são produzidos pelos novos métodos.

Em um outro aspecto, a invenção inclui métodos de secagempor atomização de um material celular para minimizar o dano ao materialatravés da redução da tensão osmótica. A tensão osmótica pode ser reduzi-da através da obtenção de um valor inicial para o raio de uma unidade domaterial celular (também aqui referido como uma célula), a ser secado poratomização (Rc(O)), selecionando os valores para cada um de (i) diferençanas temperaturas de entrada e saída de gás de um secador por atomização(ΔΤ), (ii) tamanho médio de gotícula (Rd)1 (iii) calor latente da vaporização deum solvente (λ), (iv) permeabilidade hidráulicos de uma membrana do mate-rial celular a um crioprotetor (Lp)1 (v) moles de soluto extracelular (xes), (vi)moles de soluto intracelular (x's), (vii) moles de crioprotetor extracelular (xecp),(viii) concentração intracelular inicial de crioprotetor (Clcp(O))l e (ix) númerode células (nceiis), avaliando a equação 36 utilizando os valores selecionados

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e, se Rc(t) for mantido dentro de um limite mínimo e máximo durante umtempo de secagem predito, secagem por atomização do material celular u-sando as condições dos valores selecionados para minimizar danos ao ma-terial. Em algumas modalidades, os métodos também incluem a determina-ção de um tempo de secagem predito. O limite mínimo e máximo pode serselecionado para minimizar os danos ao material. Por exemplo, o limite mí-nimo pode ser pelo menos cerca de 60% (por exemplo, pelo menos 70%,80%, 90%, 95%, 98% ou 99%) do raio inicial.

Por exemplo, o limite máximo pode ser no máximo 160% (porexemplo, no máximo 140%, 125%, 110%, 105%, 102% ou 101%) do raioinicial. Em algumas modalidades, o material celular inclui bactérias (por e-xemplo, bactérias do gênero Mycobacterium, por exemplo, M. tuberculosis,M. smegmatis, ou Bacillus Calmette-Guerin), vírus micróbios eucarióticos,células de mamífero (por exemplo, glóbulos vermelhos, células tronco, gra-nulócitos, fibroblastos ou plaquetas), organelas ligadas a membrana, Iipos-somas, biorreatores com base na membrana, ou sistemas de liberação defármaco com base na membrana. Em algumas modalidades, o crioprotetor éadicionado ao material celular (por exemplo, dentro ou forma do materialcelular) imediatamente antes da secagem por atomização. Em algumas mo-dalidades, os métodos ainda incluem a formulação do pó seco em umacomposição farmacêutica, por exemplo, para administração por inalação. Ainvenção inclui também pós secos que incluem um material celular que sãoproduzidos pelos novos métodos.

Em mais um outro aspecto, a invenção inclui métodos de produ-zir um pó seco incluindo menos do que cerca de 10% (por exemplo, menosdo que cerca de 8%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1%) de água, por exemplo, águalivre, e bactérias do gênero Mycobacterium mediante o fornecimento de umasolução aquosa incluindo pelo menos 0,01 mg/ml (por exemplo, pelo menos0,1, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100 ou 200 mg/ml) de excipiente(s) e pelo menos 105unidades formadoras de colônia/ml (por exemplo, pelo menos 106, 107, 108,109 ou 1010 unidades formadoras de colônia/ml) de bactérias do gênero My-cobacterium, e secagem por atomização da solução sob condições de pro-duzir um pó seco incluindo menos do que cerca de 10% (por exemplo, me-nos do que cerca de 8%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1 %) de água, por exemplo,água livre, e bactérias do gênero Mycobacterium. Em algumas modalidades,a solução inclui pelo menos 0,25 pg de excipiente por unidade formadora decolônia (por exemplo, pelo menos 0,5, 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 35 ou 50 pg deexcipiente por unidade formadora de colônia) de bactérias do gênero Myco-bacterium. Em algumas modalidades, a solução aquosa não contém um cri-oprotetor, por exemplo, um crioprotetor que não é o excipiente. Em algumasmodalidades, as bactérias do gênero Mycobacterium são M. tuberculosis, M.smegmatis, M. bovis, ou bactérias do Bacillus Calmette-Guerin. Em algumasmodalidades, os métodos ainda incluem a formulação do pó seco em umacomposição farmacêutica, por exemplo, para administração por inalação oupor injeção após o pó ser reconstituído em um veículo farmaceuticamenteaceitável líquido. Em algumas modalidades, os métodos adicionais incluem aformulação do pó seco como uma vacina, por exemplo, para administraçãopor inalação ou por injeção após o pó ser reconstituído em um veículo far-maceuticamente aceitável líquido. A invenção inclui também pós secos queincluem bactérias do gênero Mycobacterium que são produzidos pelos novosmétodos.

Em outro aspecto, a invenção inclui composições de vacina queincluem um pó seco com menos do que cerca de 10% (por exemplo, menosdo que cerca de 8%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1%) de água, por exemplo, águalivre, um material celular, e pelo menos 25% (por exemplo, pelo menos 30%,40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, ou mais) deum excipiente em peso seco. Em algumas modalidades, o pó seco é produ-zido por um método aqui descrito. A composição de vacina pode ser formu-lada para administração parenteral ou mucosa (por exemplo, oral ou inala-ção). Em algumas modalidades, o material celular inclui bactérias (por e-xemplo, bactérias do gênero Mycobacterium, por exemplo, M. tuberculosis,M. smegmatis, ou Bacillus Calmette-Guerin), vírus, micróbios eucarióticos,células de mamífero (por exemplo, glóbulos vermelhos, células tronco, gra-nulócitos, fibroblastos ou plaquetas), ou organelas ligadas à membrana. Ascomposições de vacina podem incluir um ou mais adjuvantes. Em algumasmodalidades, um ou mais adjuvantes são secados por atomização com omaterial celular para formar o pó seco. Em algumas modalidades, o um oumais adjuvantes são misturados com o pó seco seguinte a sua produção.

A invenção inclui também métodos de imunização mediante aadministração a um indivíduo (por exemplo, um ser humano ou animal), deuma composição de vacina que inclui um pó seco aqui descrito. Em algumasmodalidades, o pó seco é produzido por um método aqui descrito. A compo-sição de vacina pode ser formulada para administração parenteral ou muco-sa (por exemplo, oral ou inalação). Em algumas modalidades, o indivíduo éum bebê, criança ou adulto. Em algumas modalidades, o material celularinclui bactérias (por exemplo, bactérias do gênero Mycobacterium, por e-xemplo, M tuberculosis, M. smegmatis, ou Bacillus Calmette-Guerin), vírus,micróbios eucarióticos, células de mamífero (por exemplo, glóbulos verme-lhos, células tronco, granulócitos, fibroblastos ou plaquetas), ou organelasligadas à membrana. As composições de vacina para uso nos métodos deimunização podem incluir um ou mais adjuvantes.

Em outros aspectos, a invenção inclui métodos de armazena-mento de um pó seco aqui descrito, mantendo o pó em uma temperaturaacima do congelamento, por exemplo, entre 4°C e 50°C (por exemplo, entre4°C e 40°C, entre 4°C e 30°C, entre 4°C e 20°C, entre 4°C e IO0Cf entre10°C e 50°C, entre 10°C e 40°C, entre 10°C e 30°C) por um período de tem-po de pelo menos um dia (por exemplo, pelo menos uma semana, duas se-manas, três semanas, um mês, dois meses, três meses, quatro meses, cincomeses, seis meses, sete meses, oito meses, nove meses, dez meses, onzemeses, um ano, ou por mais tempo). Em algumas modalidades, o pó seco émantido na temperatura ambiente. Em algumas modalidades, o pó seco éproduzido por um método aqui descrito. Em algumas modalidades o pó secoé formulado como um produto farmacêutico ou composição de vacina.

Em ainda outros aspectos, a invenção inclui métodos de trans-porte de um produto farmacêutico ou composição de vacina, que inclui umpó seco com menos do que cerca de 10% (por exemplo, menos do que cer-ca de 8%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1%) de água, por exemplo, água livre, ummaterial celular, e pelo menos 25% (por exemplo, pelo menos 30%, 40%,50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, ou mais) de umexcipiente em peso seco. Os métodos incluem a produção do produto far-macêutico ou composição de vacina que inclui um pó seco (por exemplo, umpó seco produzido por um método aqui descrito) e transporte do produtofarmacêutico ou composição de vacina em uma temperatura acima do con-gelamento, por exemplo, entre 4°C e 50°C (por exemplo, entre 4°C e 40°C,entre 4°C e 30°C, entre 4°C e 20°C, entre 4°C e 10°C, entre 10°C e 50°C,entre 10°C e 40°C, entre 10°C e 30°C). Em algumas modalidades, o produtofarmacêutico ou composição de vacina é transportado em temperatura am-biente.

A não ser que de outra maneira definida, todos os termos técni-cos e científicos aqui usados possuem o mesmo significado como comumen-te entendida por um versado na técnica a qual esta invenção pertence. Em-bora os métodos e os materiais similares ou equivalentes àqueles aqui des-critos possam ser utilizados na prática ou teste da presente invenção, osmétodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações,pedidos de patente, patentes, e outras referências aqui mencionadas sãoincorporadas por referência em suas totalidades. Em caso de conflito, o pre-sente relatório descritivo, incluindo as definições, regulará. Além disso, osmateriais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não são destinadosa serem limitativos.

Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são a-presentados nos desenhos acompanhantes e na descrição abaixo. Outrosaspectos, objetos e vantagens da invenção serão evidentes da descrição edesenhos, e das reivindicações.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é um diagrama representando um modelo de materialcelular rodeada por água. Rc significa o raio da célula. Ces, Cecp, Cis e Cicpindicam as concentrações de sal extracelular, crioprotetor extracelular, salintracelular e crioprotetor intracelular, respectivamente.

A Figura 2A é uma representação bidimensional de membranasparalelas.

A Figura 2B é uma representação bidimensional de margens deplatô convexas.

A Figura 3 é uma micrógrafo eletrônica do produto secado poratomização de 80:20 Leu: M. smegmatis.

A Figura 4 é uma micrógrafo eletrônico do produto secado poratomização de 95:5 Leu: M. smegmatis.

A Figura 5 é um micrógrafo de fluorescência do produto secadopor atomização de 90:10 Leu: M. smegmatis. As M. smegmatis que foramutilizadas expressam GFP1 e apresentam fluorescência no micrógrafo.

A Figura 6 é um micrógrafo eletrônico de 95:5 Leu: M. smegma-tis após armazenagem em 25°C durante uma semana.

A Figura 7 é um gráfico de soluções numéricas descrevendo ovolume relativo de células (WV0), em uma gotícula de secagem sob condi-ções: (a) maior quantidade de crioprotetor dentro da célula do que fora dacélula; (b) nenhum crioprotetor; (c) quantidades iguais de crioprotetor dentroe fora da célula.

A Figura 8 é um gráfico que representa o efeito de glicerol e salsobre a viabilidade de M. smegmatis secada por atomização como um resul-tado da tensão osmótica similar.

A Figura 9 é um gráfico que representa o rendimento de viabili-dade da M. smegmatis versus a porcentagem de solução de excipiente (leu-cina) no pó secado por atomização.

A Figura 10 é uma gráfico linear que representa o rendimento deviabilidade de M. smegmatis durante um tempo em três condições de arma-zenagem para os pós leucina/smeg 50:50.

A Figura 11 é um gráfico linear que representa o rendimento deviabilidade de M. smegmatis durante um tempo em três condições de estabi-lidade para os pós leucina/smeg 95:5. Os resultados mostrados são a médiade cinco experimentos.

As Figuras 12A e 12B são gráficos lineares que representam orendimento de viabilidade de M. smegmatis durante um tempo em três con-dições de estabilidade para o pó leucina/smeg 95:5 com ou sem monofosfo-lipídeo A.A Figura 13 é um gráfico que representa o rendimento de viabili-dade de 95:5 e 50:50 Leu:M. smegmatis secadas por atomização na presen-ça de tensoativos tiloxapol e Pluronic®-F68.

A Figura 14 é um gráfico linear que representa o rendimento deviabilidade de M. bovis BCG durante um tempo em duas condições de ar-mazenagem.

A Figura 15 é um micrógrafo de células de fibroblasto de ca-mundongo embriônico NIH 3T3 viável 1 mês após a secagem por atomiza-ção.

A Figura 16 é uma série de imagens de micrógrafo em contrastede fase 20X dos fibroblastos cardíacos de rato de primeira colheita no dia 3e dia 8 após secagem por atomização.

A Figura 17 é uma série de imagens de micrógrafo em contrastede fase 20X dos fibroblastos de camundongo embrionário NIH 3T3 no dia 3e dia 8 após secagem por atomização.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A invenção diz respeito a novas composições e métodos para aprodução de formas celulares secas (DCF). Estas composições e métodosfacilitam a produção de formas secas de material celular em grandes volu-mes e com boas características de processamento e viabilidade celular. Emuma modalidade preferida, os materiais celulares são secos com concentra-ções iniciais de excipiente tipicamente pelo menos 50% (por exemplo, pelomenos 60%, 70%, 80% ou 90%) em peso seco. No entanto, em alguns e-xemplos as concentrações de excipiente iniciais podem ser tão baixas quan-to 25%. Estes excipientes podem ser selecionados ou processados de umatal forma que os materiais celulares são secos com crioprotetores para redu-zir a pressão osmótica durante o processo de secagem.

As composições e os métodos aqui descritos podem ser utiliza-dos para secar qualquer material celular, por exemplo, um material celularrelevante para aplicações farmacêuticas, agrícolas ou alimentares. O "mate-rial celular" é aqui usado de modo trocável com "material ligado à membra-na" e refere-se ao material delimitado por uma membrana composta de umabicamada lipídica. Os materiais celulares exemplares incluem bactérias (porexemplo, bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, e suas formas em va-cina), vírus ligado à membrana (por exemplo, HIV), micróbios eucarióticos(por exemplo, leveduras), células de mamífero (por exemplo, células sangüí-neas (por exemplo, células sangüíneas do cordão umbilical), plaquetas, célu-las troncos, granulócitos, fibroblastos, células endoteliais (por exemplo, célu-las endoteliais vasculares), células musculares, células da pele, células damedula, e outras células), organelas ligadas a membrana (por exemplo, mi-tocôndrias), lipossomas, biorreatores com base na membrana (Bosquillon etal., J. Control Release, 99:357-367, 2004), e sistemas de liberação de fár-maco com base na membrana (Smith et al., Vaccine , 21:2805-12, 2003).

Outros exemplos de materiais celulares incluem vírus ligados àmembrana (por exemplo, vírus da influenza, vírus da raiva, vírus da vacínia,vírus do Nilo Ocidental, HIV, HVJ (vírus Sendai), vírus da hepatite B (HBV),ortopoxvírus (por exemplo, vírus da varíola e vacínia), vírus da herpes sim-ples (HSV), e outros herpesvírus). Outros materiais celulares exemplaresincluem agentes causadores de doenças infecciosas virais (por exemplo, aAIDS, Complexo Relacionado com a AIDS, varicela, resfriado comum, infec-ção por citomegalovírus, febre do carrapato do Colorado, febre da dengue,febre hemorrágica ebola, parotite epidêmica, doença da mão pé e boca, he-patite, herpes simples, herpes zoster, papiloma vírus humano (HPV), influ-enza (gripe), febre Lassa, sarampo, febre hemorrágica Marburg, mononucle-ose infecciosa, cachumba, poliomielite, leucencefalopatia, raiva, rubéola,SARS, varíola, Encefalite viral, gastroenterite viral, meningite viral, pneumo-nia viral, doença West Nile e febre amarela), agentes causadores de doen-ças infecciosas bacterianas (por exemplo, antraz, meningite bacteriana, bru-celose, campilobacteriose, doença de arranho de gato, cólera, difteria, tifoepidemico, gonorréia, impetigo, legionelose, hanseníase (doença de Han-sen), leptospirose, listeriose, doença de Lymel melioidose, infecção por Es-tafilococo aureus resistente à meticilina (MRSA)1 nocardiose, coqueluche,praga, pneumonia pneumocócica, psitacose, febre Q, febre maculosa RockyMountain (RMSF), salmonelose, febre escarlate, shigelose, sífilis, tétano,tracoma, tuberculose, tularemia, febre tifóide, tifo e trato urinário), agentescausadores de doenças infecto parasitárias (por exemplo, tripanossomíaseAfricana, amebíase, ascaridíase, babesiose, doença de Chagas, clonorchia-se, criptosporidiose, cisticercose, difilobotriase, dracunculiase, equinococo-se, enterobiase, fascioliase, fasciolopsiase, filariase, infecção amébica de devida livre, giardiase, gnatostomiases, himenolepiase, isosporiase, kala-azar,leishmaniose, malária, metagonimiase, miíase, oncocercose, pediculose,infecção de oxiúro, sarna, esquistossomose, teniase, toxocaríase, toxoplas-mose, trichinelose, triquinose, trichuriase e tripanossomíase), e agentes cau-sadores de doenças infecciosas fúngicas (por exemplo, aspergilose, blasto-micose, dandidíase, doccidioidomicose, driptococose, histoplasmose, e tineapedis). Adicionalmente, versões atenuadas (por exemplo, auxotrófico) ver-sões dos agentes causadores de doença e agentes relacionados que podempromover imunidade contra os agentes que causam doenças (por exemplo,BCG e vacínia) podem ser utilizados nos métodos aqui descritos, por exem-plo, para a produção de vacinas (ver, por exemplo, Sambandamurthy et al,Nat. Med., 9:9, 2002; Hondalus et al., Infect. Immun., 68:2888 - 98, 2000; eSampson et al., Infect. Immun., 72:3031-37, 2004).

Os excipientes para uso com os métodos e as composições aquidescritas incluem, mas não são limitados a estes, carboidratos compatíveis,polipeptídeos naturais e sintéticos, aminoácidos, tensoativos, polímeros, oucombinações destes. Os excipientes típicos terão um coeficiente de reflexãoinferior a 1,0 (por exemplo, menos do que 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2ou 0,1) com relação a membrana do material celular a ser secado (ver, porexemplo, Adamski and Anderson, Biophys J., 44:79-90,1983; e Janacek andSigler, Physiol. Res., 49:191-195, 2000). Os carboidratos adequados incluemmonossacarídeos, tais como galactose, D-manose, sorbose, dextrose, e si-milares. Os dissacarídeos, tais como a lactose, trealose, maltose, sacarose,e similares também podem ser usados. Outros excipientes incluem ciclodex-trinas, tais como 2-hidroxpropil-p-ciclodextrina; e polissacarídeos, tais comoraffinose, maltodextrinas, dextranos, e similares; e alditóis, tais como o mani-tol, xilitol, sorbitol, e similares. Os polipeptídeos adequados incluem o dipep-tídeo aspartame. Os aminoácidos adequados incluem qualquer um dos ami-noácidos de ocorrência natural que formam um pó sob as técnicas de pro-cessamento farmacêutico padrão e incluem os aminoácidos não polares (hi-drofóbicos) e os aminoácidos polares (descarregados, positivamente carre-gados e negativamente carregados), tais aminoácidos são geralmente con-siderados seguros (GRAS) pela FDA. Exemplos representativos de aminoá-cidos não polares incluem alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalani-na, prolina, triptofano e valina. Exemplos representativos de aminoácidosdescarregados polares incluem cisteína, glutamina, serina, treonina e tirosi-na. Exemplos representativos de aminoácidos polares positivamente carre-gados incluem arginina, histidina e lisina. Exemplos representativos de ami-noácidos negativamente carregados incluem ácido aspártico e ácido glutâ-mico. Os polímeros orgânicos sintéticos adequados incluem poli[1-(2-oxo-1-pirrolidinil)etileno], isto é, povidona ou PVP.

Composições Secas

Os materiais tipicamente celulares são secados com quantida-des relativamente pequenas de excipientes, freqüentemente envolvendo ocongelamento. Na ausência de congelamento, os pós resultantes tendem aconter uma quantidade significativa de água, devido ao fato de que os mate-riais celulares não podem, excetuando o congelamento, ser secados abaixode um determinado conteúdo de água (por exemplo, aproximadamente 40%de água em peso), e ainda permanecer ativos. Os pós secos com boas pro-priedades de processamento e estabilidade requerem tipicamente menos doque 10% e preferivelmente menos do que 5% de água em peso. Isso ocorreporque grandes frações de água levam a forças capilares significativas entreas partículas do pó e assim a agregação do pó. Para atingir a DCF com boascaracterísticas de processamento e estabilidade do pó, portanto, envolve asecagem por atomização com uma grande quantidade de excipiente. Especi-ficamente, para atingir pós secos com teor de água total inferior a 10% ou5%, pelo menos 25% em peso (por exemplo, pelo menos 30%, 40%, 50%,60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, ou mais) de excipientedeve ser secado com a forma celular, resultando em um pó seco que contémuma fração de peso relativamente pequena de celulares material, que, em-bora retendo água suficiente para permanecer ativo, não apresenta tantaágua no pó tal como para prejudicar as propriedades de processamento glo-bais do pó.

A secagem por atomização é um processo padrão utilizado naalimentação, produtos farmacêuticos e agroindústrias. Na secagem por ato-mização, a umidade é evaporada de um alimento pulverizado mediante amistura de gotículas pulverizadas com um meio de secagem (por exemplo,ar ou nitrogênio). Este processo seca as gotículas de sua substância volátil edeixa ficar os componentes não voláteis das partículas "secas" que são deum tamanho, morfologia, densidade e conteúdo volátil controlados pelo pro-cesso de secagem. A mistura sendo pulverizada pode ser um solvente, e-mulsão, suspensão ou dispersão. Muitos fatores do processo de secagempodem afetar as propriedades das partículas secas, incluindo o tipo de bico,tamanho de tambor, a taxa de fluxo da solução volátil e gás em circulação, eas condições ambientais (Sacchetti and Van Oort, Spray Drying and Super-critical Fluid Particie Generation Techniques, Glaxo Wellcome Inc., 1996).

Tipicamente, o processo de secagem por atomização envolvequatro processos, dispersão de uma mistura em pequenas gotículas, misturada pulverização e um meio de secagem (por exemplo, o ar), evaporação daumidade do pulverizador, e a separação do produto seco do meio de seca-gem (Sacchetti and Van Oort, Spray Drying and Supercritical Fluid ParticleGeneration Techniques, GlaxoWeIIcome Inc., 1996).

A dispersão da mistura em pequenas gotículas aumenta muito aárea superficial do volume a ser secado, resultando em um processo de se-cagem mais rápido. Tipicamente, uma energia mais elevada de dispersãoleva a gotículas menores obtidas. A dispersão pode ser executada por qual-quer meio conhecido na técnica, incluindo bicos de pressão, bicos de doisfluidos, pulverizadores rotativos, e bicos ultrassônicos (Hinds, Aerosol Teeh-nology, 2nd Edition, New York, John Wiley and Sons, 1999). Em algumasmodalidades, a mistura é pulverizada com uma pressão menor do que 1,38MPa (200 psi).Após a dispersão (pulverização) da mistura, a pulverização re-sultante é misturada com um meio de secagem (por exemplo, ar). Tipica-mente, a mistura ocorre em um fluxo contínuo de ar aquecido. O ar quentemelhora a transferência de calor para as gotículas de pulverização e aumen-ta a taxa de evaporação. A corrente de ar pode ser esgotada para a atmos-fera após secagem e reciclada ou reutilizada. O fluxo de ar é tipicamentemantido pelo fornecimento de pressão positiva e/ou negativa no final da cor-rente (Sacchetti and Van Oort, Spray Drying and Supercritical Fluid ParticleGeneration Techniques, Glaxo Wellcome Inc., 1996).

Quando as gotículas entram em contato com o meio de seca-gem, a evaporação ocorre rapidamente devido à grande área superficial es-pecífica e pequena dimensão das gotículas. Baseado nas propriedades dosistema de secagem, um nível residual de umidade pode ser mantido dentrodo produto seco (Hinds, Aerosol Technology, 2nd Edition, New York, JohnWiley and Sons, 1999).

O produto é depois separado do meio de secagem. Tipicamente,a separação primária do produto ocorre na base da câmara de secagem, e oproduto é depois recuperado usando, por exemplo, um ciclone, precipitadoreletrostático, filtro ou purificador (Masters et al., Spray Drying Handbook.Harlow, UK, Longman Scientific and Technical, 1991).

As propriedades do produto final, incluindo o tamanho das partí-culas, umidade final e rendimento dependem de muitos fatores do processode secagem. Tipicamente, os parâmetros tais como a temperatura de entra-da, taxa de fluxo de ar, taxa de fluxo da alimentação líquida, tamanho dagotícula, e concentração da mistura são ajustados para criar o produto dese-jado (Masters et al., Spray Drying Handbook, Harlow, UK1 Longman Scienti-fic and Technical, 1991).

A temperatura de entrada refere-se à temperatura do meio desecagem aquecido, tipicamente ar, como medido antes da circulação dentroda câmara de secagem. Tipicamente, a temperatura de entrada pode serajustada conforme desejado. A temperatura do meio de secagem no sítio derecuperação do produto é referida como a temperatura de saída, e é depen-dente da temperatura de entrada, da taxa de fluxo do meio de secagem, e aspropriedades da mistura pulverizada. Tipicamente, as temperaturas de en-trada superiores fornecem uma redução na quantidade de umidade no pro-duto final (Sacchetti and Van Oort, Spray Drying and Supercritical Fluid Par-ticle Generation Techniques, Glaxo Wellcome Inc., 1996).

A taxa de fluxo de ar refere-se ao fluxo do meio de secagem a-través do sistema. O fluxo de ar pode ser fornecido por manter a pressãopositiva e/ou negativa no final ou dentro do sistema de secagem por atomi-zação. Tipicamente, as taxas de fluxo de mais elevadas levam à um tempode permanência menor das partículas no dispositivo de secagem (isto é, otempo de secagem) e levam a uma maior quantidade de umidade residualno produto final (Masters et al., Spray Drying Handbook, Harlow1 UK1 Long-man Scientific and Technical, 1991).

A taxa de fluxo da alimentação líquida refere-se à quantidade delíquido liberado na câmara de secagem por unidade de tempo. Quanto maiselevada a produção do líquido, tanto mais energia é necessária para evapo-rar as gotículas nas partículas. Assim, as taxas de fluxo mais elevadas le-vam a temperaturas de saída mais baixas. Tipicamente, a redução da taxade fluxo embora mantendo a temperatura de entrada e a taxa de fluxo de arconstantes reduz o teor de umidade do produto final (Masters et al., SprayDrying Handbook, Harlow, UK, Longman Scientific and Technical, 1991).

O tamanho de gotícula refere-se ao tamanho das gotículas dis-persas pelo bocal do pulverizador. Tipicamente, gotículas menores fornecemteor de umidade mais baixo no produto final com tamanhos de partícula me-nores (Hinds, Aerosol Technology, 2nd Edition, New York, John Wiley andSons, 1999).

A concentração da mistura de ser secada por atomização tam-bém influencia o produto final. Tipicamente, concentrações mais elevadaslevam a maiores tamanhos de partícula do produto final, uma vez que hámais material por gotícula pulverizada (Sacchetti and Van Oort, Spray Dryingand Supercritical Fluid Particle Generation Techniques, Glaxo Wellcome Inc.,1996).Os sistemas de secagem por atomização são comercialmentedisponíveis, por exemplo, da Armfield, Inc. (Jackson, NJ), Brinkmann Instru-ments (Westbury, NY), BUCHI Analytical (New Castle, DE), Niro Inc (Colum-bia, MD), Sono-Tek Corporation (Milton, NY), Spray Drying Systems, Inc.(Randallstown, MD), and Labplant, Inc. (North Yorkshire, England).

O teor de umidade final do pó secado por atomização pode serdeterminado por qualquer meio conhecido na arte, por exemplo, por análisetermogravimétrica. O teor de umidade é determinado pela análise termogra-vimpetrica mediante o aquecimento do pó, e pela medição da massa perdidadurante a evaporação da umidade (Maa et al., Pharm. Res., 15:5, 1998).Tipicamente, para uma amostra que contém material celular (por exemplo,bactérias), a água será evaporada em duas fases. A primeira fase, referidacomo água livre, é principalmente o teor de água do excipiente seco. A se-gunda fase, referida como água confinada, é principalmente o teor de águado material celular. A água tanto livre quanto confinada pode ser medida pa-ra determinar se o pó contém um teor de umidade desejado no excipiente ouno material celular (Snyder et al., Analytica Chimica Acta, 536:283-293,2005).

Redução da Tensão Osmótica durante a Secagem por atomização

Os excipientes introduzidos na solução celular a ser secada poratomização podem ser selecionados e/ou introduzidos de uma tal maneiracomo para minimizar a tensão osmótica total sobre as membranas dos mate-riais celulares e, por conseguinte, para manter a atividade. Embora seja im-portante, pelas razões descritas acima, manter uma fração de massa dese-jada de excipiente em relação à fração de massa do material celular, a natu-reza destes excipientes, e o meio em que eles são introduzidos antes dasecagem por atomização, podem ser importantes e mesmo críticos para aviabilidade celular.

Para o material celular, a secagem das gotículas em um tamborde secagem por atomização pode ser vista como análoga ao congelamentode um organismo em um processo de crioconservação padrão, como mos-trado na figura 1 (James, "Maintenance of Parasitic Protozoa by Cryopreser-vation", Maintenance of Microorganisms, Academic Press, London, 1984.).

Quando uma gotícula contendo um organismo se evapora, aconcentração de sal (Ces) na gotícula (e fora da célula) aumentará em rela-ção à concentração de sal no organismo (Cls). A razão é que a membranacelular é impermeável à transferência de sal, embora seja relativamentepermeável à transferência de água. A conseqüência é que a secagem degotícula aumenta a concentração de sal na evaporação da gotícula e cria atensão osmótica na membrana celular (causada pelo desequilíbrio da con-centração de sal de ambos os lados da membrana), que faz com que a águaseja empurrada para fora da célula. Este processo de desidratação pode serconsiderado como a tentativa da membrana da em mecanicamente reduzir apressão osmótica mediante a eliminação do desequilíbrio da concentraçãode sal (Batycky et al., Phil. Trans. Roy. Soe. Lond., A355:2459-88, 1997).

A "desidratação" de material celular durante a evaporação dagotícula é essencialmente o mesmo processo que surge quando o materialcelular sofre congelamento. Para evitar uma desidratação excessiva, quepode, como descrito acima, submeter a Iise o material celular, as técnicasassociadas com o campo de crioconservação, a saber, o uso de crioproteto-res e o controle dos ciclos de congelamento e descongelamento, têm sidodesenvolvidas. Os crioprotetores são substâncias farmacologicamente iner-tes que permeiam a membrana celular em um ritmo mais lento do que o daágua, mas mais rápido do que o do sal. Como estas técnicas são relevantespara os métodos de secagem por atomização do material celular, elas sãobrevemente revistas abaixo (Karlsson and Toner, Biomaterials, 17: 243-256,1996).

Em primeiro lugar, dada a semipermeabilidade da membranaaos crioprotetores, os crioprotetores liberam uma pressão osmótica sobre amembrana - aquela que é proporcional à concentração de crioprotetor e, pa-ra a maioria dos crioprotetores bem-sucedidos aquela que está muito próxi-ma da pressão osmótica liberada pelo sal na concentração equivalente. Istosignifica que as membranas celulares que são imersas em meio aquoso con-tendo crioprotetor de magnitude semelhante de concentração de sal imper-meável tenderão a experimentar tensão osmótica e condições não isotônicasque são significativamente influenciadas pela presença de material crioprote-tor. A difusão de crioprotetor através da membrana, portanto, fornece ummeio para compensar as pressões osmóticas mesmo nas circunstâncias on-de as concentrações de sal são desiguais em ambos os lados da membrana.Por esta razão, os crioprotetores fornecem um mecanismo para a difusãodas tensões osmóticas. Os crioprotetores adequados para uso com os novosmétodos incluem, mas não são limitados a estes, sulfóxido de dimetila, etile-no glicol, propileno glicol e glicerol (Chesne and GuiIIoUzo, Cryobiology,25:323-330, 1988.). Em algumas modalidades, os crioprotetores são excluí-dos da mistura seca.

Nos protocolos de crioconservação, os crioprotetores são adi-cionados nas suspensões de material celular em uma concentração (C6cp)que é significativo em relação à concentração de sal. É de salientar que estaadição pode ser controlada de forma a não sujeitar as células à pressão os-mótica excessiva, ou seja, o crioprotetor pode ser adicionado em uma taxaque é suficientemente lenta de modo que os crioprotetores possam se difun-dir através da membrana celular e não desidratar a célula. Então, durante ocongelamento - que leva à formação de gelo fora da célula devido aos crio-protetores naturais dentro da célula, aumentando assim a concentração desal fora da cela - o crioprotetor é capaz de difundir em toda a membranacelular e aumentar a concentração celular interna, o que aumenta a concen-tração interna de crioprotetor (Clcp). Isto libera a pressão osmótica sobre amembrana celular, especialmente se o congelamento ocorre em uma taxabastante lenta. Desta forma, os crioprotetores contribuem para a conserva-ção da viabilidade celular, explicando a sua utilização para preservar san-gue, esperma, e outras células úteis (Karlsson and Toner, Biomaterials, 17:243-256, 1996).

Não obstante sua analogia à crioconservação, a secagem poratomização fornece uma vantagem distinta com relação ao material celularque é especialmente relevante para a utilização em grande escala. A crio-conservação das células é contestada pelos grandes volumes de suspen-sões celulares em que os requisitos cinéticos de transferência de massa(envolvidos na adição ou remoção de crioprotetor, e congelamento de célu-las) são muito diferentes na escala celular e de suspensão, quando este formaior do que a anterior. Esta pode ser uma das razões pelas quais o conge-lamento de sangue por métodos padrão de crioconservação não é facilmen-te aplicável ao congelamento de todo órgãos. A secagem por pulverizaçãoautomaticamente divide a suspensão celular em pequenos volumes (ou seja,gotículas) que podem ser vagamente vistos como pequenas unidades decrioconservação. A elevação não requer um aumento significativo no volumedas gotículas pulverizadas: de preferência, a elevação é alcançada atravésdo aumento do tamanho do recipiente de secagem por atomização, aumen-tando o fluxo de suspensão através do bico, e outras medidas de elevaçãopadrão.

A secagem por atomização pode assim fornecer um método pa-ra a produção de grandes volumes de DCF com maior atividade do que deoutro modo seria alcançado através das técnicas de crioconservação e Iiofili-zação.

Na seqüência, um formalismo teórico é descrito o qual forneceregra para formas celulares de secagem por atomização em uma maneiraque minimiza a tensão da membrana e, portanto, maximiza a viabilidade. Osmétodos que se baseiam na utilização de crioprotetores e no controle dosparâmetros secagem por atomização padrão, por exemplo, tipo de solvente,temperatura do gás de entrada e dimensões do bocal de secagem por ato-mização e velocidade de rotação (tamanho da gotícula).

Os métodos determinam a taxa em que as gotículas pulveriza-das podem ser secadas dentro de um ambiente aquecido tal que, na pre-sença de agentes crioconservantes, o raio da membrana do material coloca-do em suspensão pode ser modulado. Assim, a membrana pode ser impedi-da de encolher abaixo da Rcmim ou expandir acima da Rcmax. Para o propósitode ilustração no caso de Rcmin, todo o material colocado em suspensão nãoencolherá abaixo de um raio crítico (Rccri) como uma conseqüência da desi-dratação osmoticamente movida. Em casos de paredes celulares rígidas,esta condição pode simplesmente ser equiparada com uma tensão críticaque leva à desativação. Primeiro, a geometria idealizada e as concentraçõesdentro do problema são consideradas, seguido por uma consideração doscinemáticos em duas condições limitativas. Depois disso, as equações defluido dinâmico e transferência de massa são desenvolvidas para descrevera taxa de variação dos raios da célula como uma função dos parâmetros dosistema.

Pode-se imaginar uma suspensão de células onde, a título deilustração, as células são esferas com um raio em equilíbrio Rc0. Dentro dascélulas, existem sais e crioprotetores em concentrações Cis e Cicp dentro dascélulas e fora da célula em concentrações de Ces e Cecp. .

Após a secagem por atomização, as gotículas individuais de ma-terial colocado em suspensão são formadas. Aqui, assume-se que as célulaspermanecem homogeneamente distribuídas na solução de pulverização eprocesso de pulverização e estão, portanto, em igualdade de concentraçãonas gotículas pulverizadas individuais. A taxa de fluxo, que pode ser fisica-mente controlada durante a secagem por atomização pode ser explicitamen-te resolvida por:

<formula>formula see original document page 23</formula>

onde a é a taxa de gotículas criadas por unidade de tempo, é nceii é o núme-ro de células colocadas em suspensão em cada gotícula pulverizada indivi-dual, N é o número total de células no volume, e t0é a quantidade de temporequerida para pulverizar o volume V0.

A fração de volume das células na suspensão de ser pulverizadaserá referida como φ0 onde

<formula>formula see original document page 23</formula>

e N é o número total de células no volume de suspensão <p0.

Estas gotículas são assumidas de possuir um raio uniforme Rd0tal que a fração de material celular pode ser expressa como<formula>formula see original document page 24</formula>

onde η é o número de células colocadas em suspensão em cada gotículapulverizada individual.

Assumindo a homogeneidade, as quatro concentrações Ces,C cp> Cs) CCp medidas na suspensão original são iguais à concentração inici-al de sal e crioprotetor dentro da célula de cada gotícula pulverizada. Estasconcentrações irão mudar com o passar do tempo com base nas mudançasno diâmetro da gotícula e diâmetro da célula, uma vez que o número abso-luto de moles de sal e crioprotetor deve ser conservado dentro de cada go-tícula.

Xs β X s, θ Xcp θ X Cp, significam os moles de sal e crioprotetorrespectivamente dentro do exterior e interior das células após a sua disper-são dentro das gotículas individuais. Isto dá:

<formula>formula see original document page 24</formula>

Aqui Vcexcluido é o volume de cada célula individual em que o sale/ou crioprotetor é incapaz de divisão, e será considerado uma constantecom respeito ao tempo. Os parâmetros x's e xes (representando os moles desal dentro e fora da célula) também são constantes com respeito ao tempodevido à impermeabilidade do sal através da membrana. As únicas variáveisde tempo nestas expressões depois se tornam Rc e Rd, e os moles de crio-protetor dentro e fora da célula são x'cp e xecp.

Cada gotícula individual evaporará no tambor de secagem poratomização em uma taxa dependente das condições exteriores, tamanho dagotícula, a volatilidade da gotícula etc. Inicialmente, as células individuaisserão, em média, de longe removidas uma da outra dada a natureza de dilu-ição inicial da suspensão (<po « 1). Durante um tempo, as células cada vezmais entrarão em contato íntimo, tal que se pode imaginar dois casos Iimita-tivos:

Aqui, <p(t) « 1 durante o processo de secagem. Neste caso, as-sume-se que cada célula individual é isolada e respondendo à evolução daconcentração de sal e crioprotetor (e conseqüentemente pressão osmótica),como se fosse colocado em suspensão dentro de um banho infinito. A sime-tria do problema (ver abaixo com relação às considerações de transferênciade massa) é tal que as gotículas e células totais se contraem (ou expandem)radialmente. Portanto, considerando a Figura 1, o perfil de velocidade criadodentro e ao redor da célula individual devido às pressões osmóticas e nãodevido ao movimento de fluido pode ser expresso como:

<formula>formula see original document page 25</formula>

onde Ir é o vetor unitário dirigido ao longo da coordenada r em um sistemade coordenadas esférica que se originam no centro da célula e vr(t) é amagnitude da velocidade radial.

Além do mais, dado que a célula e os fluidos da gotícula são in-compressíveis.

<formula>formula see original document page 25</formula>

Visto que a velocidade radial no centro da célula deve ser zero,conclui-se que

<formula>formula see original document page 25</formula>

em toda a parte. Esta conclusão implica que qualquer movimento radial damembrana celular deve ser "não material", o que significa que o movimentoda membrana não é igual ao movimento médio de massa do fluido contíguo.

O caso 1 é, portanto, um problema em que a evolução das célu-las individuais dentro da gotícula é difusamente dirigida.

No limite da <p0 -> 1, as células individuais dentro da gotícula desecagem situam-se em um contato extremamente íntimo. A evolução dasmembranas celulares, como conseqüência da pressão osmótico, é determi-nada dentro de um ambiente onde as membranas celulares se nivelam pró-ximas às células adjacentes ou curva em uma forma convexa nas proximi-dades dos chamados "Plateau borders". Estas circunstâncias de membranasão mostradas na Figura 2.

Vários dos pressupostos básicos no Caso 1 já não são válidasno Caso 2. Em primeiro lugar, dado o contato íntimo das células e resistên-cia à transferência de massa na fase "contígua" da gotícula causados pelovolume excluído das células, aumentos nas concentrações de sal e criopro-tetor na fase externa ou contínua não se podem esperar que sejam instantâ-neos em relação ao transporte de água através da membrana celular. Istosignifica que como o volume de gotícula continua a diminuir, a concentraçãode sal e crioprotetor na periferia da gotícula aumentará significativamente emrelação à concentração perto do centro da gotícula, assim as células próxi-mas da periferia da gotícula sofrerão pressão osmótica elevada enquanto ascélulas no centro passarão por pouco ou nenhuma pressão osmótica. O ob-jetivo de minimizar cada expansão ou contração radial da célula durante oprocesso de secagem então possui significado ambíguo, uma vez que cadacélula irá experimentar uma variedade de condições ao longo do tempo. Ouo objeto no Caso 2 é minimizar a dilatação da célula com relação às célulasmais vulneráveis, aquelas na periferia, ou salvar o maior número de célulasdentro da gotícula dado os constrangimentos de tempo razoáveis sobre asecagem. (Observar que as últimas restrições de secagem requeridas paraminimizar a morte celular na periferia podem no limite requerer a secagemde lentidão infinita.)

Para o propósito desta análise, as considerações remanescen-tes permanecerão centradas exclusivamente no Caso 1.

Dois problemas de transferência de massa significativos podemser identificados para o Caso 1. O primeiro diz respeito à transferência demassa do sal e crioprotetor dentro da gotícula de secagem dado que a con-centração de sal e crioprotetor aumenta uniformemente dentro da gotículade secagem, em função do tempo. Devido à capacidade de diluição da sus-pensão celular, o problema de secagem da gotícula pode ser consideradoseparadamente. Este último problema é aquele de uma secagem de gotículaaquosa esférica em uma quantidade contínua de ar quente.

O problema de transferência de massa de uma célula esféricadentro de um ambiente livre onde a concentração de sal e crioprotetor exter-na repentinamente muda de forma uniforme, foi anteriormente resolvido porBatycky et al. (1997). Em sua análise, o fluido celular é descrito como umaquantidade contínua, onde a concentração de sal e crioprotetor dentro dacélula é vista como homogeneizada, ou especialmente rateada, sobre o flui-do de citossólico e organelas internas. Usando a definição padrão para pres-são osmótica sobre a membrana, o Reynolds Transport Theorem e umadescrição da lei Darcy de permeabilidade de água através da membrana,pode ser mostrado que a velocidade da membrana é,

<formula>formula see original document page 27</formula>

onde Lp é a permeabilidade hidráulica da membrana (m/satm) e σ, conheci-do como o coeficiente de reflexão (O < σ < 1), representa a fração pela quala permeabilidade da membrana para crioprotetor é diminuída em relação aosal.

A taxa de tempo da mudança da concentração de sal e criopro-tetor dentro da célula na membrana pode ser determinada pela solução comas equações de conservação da transferência de massa associadas. Nãoobstante a concentração elevada de sal e agente de crioconservação dentroda célula, a difusão Fickian é assumida para o sal e crioprotetor constante.

Seguindo Batycky et al. (1997) e incorporando os resultados de Edwardsand Davis (Chem. Eng. Sci., 50:1441-54, 1995), estas difusões são expres-sas como coeficientes de curso-escala (D s, ZTcp), que refletem a presençade organelas dentro da célula.

As equações diferenciais que regem a concentração de sal po-dem ser expressas em Batycky et al. (1997):

<formula>formula see original document page 27</formula><formula>formula see original document page 28</formula>

dadas as condições iniciais

Cs = Cs(O)1 em t = O1 onde Ff (t) = H emt = O (16)

Na equação acima, Cls e Cls são relacionados por

<formula>formula see original document page 28</formula>

Estas equações podem ser resolvidas para produzir:

<formula>formula see original document page 28</formula>

As equações diferenciais que regem a concentração de criopro-tetor podem ser expressas em Batycky et al. (1997):

<formula>formula see original document page 28</formula>

sujeitas às condições limites,

<formula>formula see original document page 28</formula>

com as condições iniciais de

Ccp = Ccp(O), em t = 0 (23)

Ff (t) = Ff0, e m t = 0 (24)

e as relações onde

Ccp = Ccpi 1 - θ+ tca+ Κθ), V r,t (25)onde θ é a fração osmoticamente inativa da célula (organelas), κ = coeficien-te de absorção da lei de Henry, α a superfície específica das organelas, e Ko coeficiente de divisão nas organelas.

A resolução destas equações com Eq. (14) produz (Batycky etal. 1997)

<formula>formula see original document page 29</formula>

Aqui λη são eigenvalores das raízes não zero da equação trans-cendental

βλη = Xau(Xn) (28)

com Psp a taxa de entrada de soluto semipermeável na célula e o coeficienteβ definido como

<formula>formula see original document page 29</formula>

Observar que enquanto λη são essencialmente constantes sobrea escala temporal rápida de difusão eles lentamente mudam no tempo sobrea escala temporal de expansão da membrana celular. A equação (28) dizrespeito ao raio da célula Rc(t) na concentração de sal e criopreservaçãoexterna que por sua vez depende da taxa de evaporação da gotícula. Estaconexão é descrita abaixo.

Muitos pesquisadores têm examinado uma secagem de gotículaesférica em uma fase gasosa particularmente quando os efeitos de convec-ção no gás são negligenciados. A evaporação dentro de um secador por a-tomização é dependente da taxa reguladora da evaporação e tempo depermanência da evaporação. O tempo de permanência é uma função domovimento de pulverização-ar no secador. No caso de gotículas que se mo-vimentam em relação às condições de fluxo de ar circundante, as condiçõesde fluxo ao redor da gotícula em movimento influenciam a taxa de evapora-ção. Neste caso, a gotícula é completamente influenciada pelo fluxo de aronde a velocidade relativa entre o ar e as gotículas é muito baixa. De acordocom a teoria de camada limite, a taxa de evaporação para uma gotícula quese move com velocidade relativa zero é idêntica à evaporação nas condi-ções de ar parado. Assim, a evaporação da gotícula através da secagem poratomização é modelada como um mecanismo similar para evaporação nascondições de ar parado.

Tanto experimental quanto teoricamente, a conexão geral obser-vada entre o raio de gotícula e os parâmetros de controle do processo desecagem por atomização é dada por (Masters, 1991, Spray Drying Handbo-ok, Longman Scientific and Technical, Harlow, UK):

<formula>formula see original document page 30</formula>

com D = 2RC, Kd a condutividade térmica média da película gasosa que cir-cunda uma gotícula em evaporação, pi a densidade da fase gasosa, λ o ca-lor latente de vaporização da gotícula, e LMTD a diferença de temperaturamédia logarítmica definida por

<formula>formula see original document page 30</formula>

onde ΔΤ0 e AT1 são as diferenças da ^mperatura inicial e final entre as gotí-culas e a fase gasosa.

A integração de (30) produz

<formula>formula see original document page 30</formula>

onde

<formula>formula see original document page 30</formula>

Substituição de (32) em (6) e (7) diz respeito às concentraçõesinstantâneas de sal e crioprotetor com os parâmetros de evaporação da go-tícula:<formula>formula see original document page 31</formula>

O método de secagem por atomização pode ser expresso emtermos da seguinte equação diferencial:

<formula>formula see original document page 31</formula>

Ao avaliar a equação acima, pode-se determinar as condiçõescom relação às temperaturas de gás de entrada e saída do secador de ato-mização (isto é, ΔΤ), o tipo de bico e velocidade de rotação para o tamanhode gotícula (Rd), o tipo de solvente (λ), e o tipo de crioprotetor (Lp) necessá-rio para minimizar a tensão, permitir a manutenção de Rcmin < Rc(t) < Remax,ou para maximizar a tensão sobre o material ligado a membrana colocadoem suspensão. Estas regras encontram seus paralelos nas regras de crio-conservação paraiâxas de congelamento e descongelamento das células.

Composições Farmacêuticas

As formas celulares secas aqui descritas, por exemplo, produzi-das com as novas composições ou pelos novos métodos, podem ser prepa-radas como composições farmacêuticas, por exemplo, composições de va-cina. O material celular pode ser secado por atomização com vários diluen-tes, cargas, sais, tampões, estabilizantes, solubilizantes, e outros materiaisfarmaceuticamente aceitáveis bem-conhecidos na técnica para produzir umpó farmacêutico. Alternativamente, seguinte a secagem por atomização, oproduto pode ser formulado com pelo menos um dos vários diluentes, car-gas, sais, tamponantes, estabilizantes, solubilizantes, adjuvantes e outrosmateriais farmaceuticamente aceitáveis bem-conhecidos na técnica paraproduzir uma composição farmacêutica, por exemplo, um pó farmacêutico. Otermo "farmaceuticamente aceitável", significa um material não tóxico quenão interfere com a eficácia da atividade biológica do(s) ingrediente(s) ati-vo(s). As características da composição podem depender da via de adminis-tração. Em algumas modalidades, as composições podem ser armazenadasem uma temperatura controlada antes da administração.

A administração de uma composição farmacêutica (por exemplo,uma composição farmacêutica contendo uma forma celular seca) pode serrealizada em uma variedade de meios convencionais, tais como inalação,ingestão oral, ou injeção cutânea, subcutânea ou intravenosa. A administra-ção por inalação é preferida. Em algumas modalidades, as composições sãoadministradas como uma vacina.

As formas celulares secas podem ser formuladas pela inalaçãoutilizando um dispositivo médico, por exemplo, um inalador (ver, por exem-plo, as Patentes U.S. n25 6.102.035 (um inalador de pó) e 6.012.454 (um ina-lador de pó seco). O inalador pode incluir compartimentos separados para oscompostos ativos em um pH adequado para a armazenagem e um outrocompartimento para um tamponante de neutralização, e um mecanismo paracombinar o composto com um tampão neutralizante imediatamente antesda pulverização. Em uma modalidade, o inalador é um inalador de dose medida.

Os três sistemas comuns utilizados para liberar fármacos local-mente nas passagens aéreas pulmonares incluem inaladores de pó seco(DPIs), inaladores de dose medida (MDIs) e nebulizadores. Os MDIs, usadosno método mais popular de administração por inalação, pode ser utilizadopara liberar medicamentos em uma forma solubilizada ou como uma disper-são. Tipicamente os MDIs compreendem um Freon ou outros propulsores depressão de vapor relativamente elevada que força a medicação aerosolizadapara dentro do trato respiratório após ativação do dispositivo. Ao contráriodos MDIs, os DPIs geralmente confiam inteiramente nos esforços inspirató-rios do paciente para introduzir um medicamento em uma forma de pó secopara os pulmões. Os nebulizadores formam um aerossol de medicamento aser inalado mediante a comunicação de energia para uma solução líquida. Aliberação pulmonar direta dos fármacos durante ventilação de líquido ou la-vagem pulmonar usando um meio fluoroquímico também foi explorada. Es-tes e outros métodos podem ser usados para liberar uma forma celular seca.Os dispositivos de inalação exemplares são descritos nas Patentes U.S. n—6.732.732 e 6.766.799.

As composições podem ser convenientemente liberadas sob aforma de uma apresentação de pulverização por aerossol a partir de emba-lagens pressurizadas ou um nebulizador, com o uso de um propulsor ade-quado, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetra-fluoroetano, dióxido de carbono, ou outro gás adequado. No caso de um ae-rossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada pela exis-tência de uma válvula para liberar uma quantidade medida. Cápsulas e car-tuchos para uso em um inalador ou insuflador podem ser formulados con-tendo a forma celular seca.

Embora não necessário, os intensificadores de liberação taiscomo tensoativos podem ser utilizados para aumentar ainda mais a libera-ção pulmonar. Um "tensoativo" como aqui usado refere-se a um compostohidrófilo e componentes Iipofílicos que promovem a absorção de um fármacoatravés da interação com uma interface entre duas fases imiscíveis. Os ten-soativos são úteis com partículas secas por várias razões, por exemplo, re-dução da aglomeração de partícula, a redução da fagocitose macrófaga, etc.Quando acoplado com tensoativo pulmonar, uma absorção mais eficiente docomposto pode ser alcançada porque os tensoativos, tais como DPPC,grandemente facilitarão a difusão do composto. Os tensoativos são bem-conhecidos na técnica e incluem, mas não são limitados a estes, fosfoglice-rídeos, por exemplo, fosfatidilcolinas, L-alfa-fosfatidilcolina dipalmitoíla(DPPC) e difosfatidil glicerol (DPPG); hexadecanol; ácidos graxos; polietilenoglicol (PEG); polioxietileno-9; éter aurílico; ácido palmítico; ácido oléico; trio-leato de sorbitano (Span® 85); glicocolato; surfactina; poloxômero; ésteresde ácido graxo sorbitano; trioleato de sorbitano; tiloxapol; e fosfolipídios.

Em outro aspecto, as formas celulares secas podem ser formu-ladas com um veículo farmaceuticamente aceitável tendo um tamanho departícula que não é respirável, ou seja, é de um tal tamanho que não serálevado para dentro dos pulmões em qualquer quantidade significativa. Estaformulação pode ser uma mistura uniforme de partículas menores da formacelular seca (por exemplo, menos do que 10 μιτι), com partículas maiores doveículo (por exemplo, cerca de 15 a 100 μηι). Após a dispersão, as partícu-las menores são depois respiradas para dentro dos pulmões enquanto aspartículas maiores são geralmente retidas na boca. Os veículos adequadospara mistura incluem excipientes cristalinos ou amorfos que possuem umgosto aceitável e são toxicologicamente inócuos, quer inalados ou tomadospor via oral, por exemplo, os sacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos.Os exemplos representativos incluem lactose, manitol, sacarose, xilitol e si-milares.

Para administração oral, os pós farmacêuticos podem ser formu-lados, por exemplo, como comprimidos ou cápsulas preparadas pelos meiosconvencionais com excipientes farmaceuticamente aceitáveis tais como a-gentes de ligação (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpir-rolidona ou hidroxipropil metilcelulose); cargas (por exemplo, lactose, celulo-se microcristalina, ou fosfato de cálcio hidrogênio); lubrificantes (por exem-plo, estearato de magnésio, talco ou sílica); desintegrantes (por exemplo,amido de batata ou amido glicolato de sódio); ou agentes umectantes (porexemplo, Iauril sulfato de sódio). Os comprimidos podem ser revestidos pormétodos bem-conhecidos na técnica. As preparações líquidas para adminis-tração oral podem tomar a forma de, por exemplo, soluções, xaropes oususpensões, ou elas podem ser apresentadas como um produto seco paraconstituição com água ou outro veículo adequado antes da sua utilização.Tais preparações líquidas podem ser preparadas por meios convencionaiscom aditivos farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes de suspensão(por exemplo, xarope de sorbitol, derivados de celulose, ou gorduras comes-tíveis hidrogenadas); agentes emulsificantes (por exemplo, Iecitina ou acá-cia), veículos não aquosos (por exemplo, óleo amêndoa, ésteres oleosos,álcool etílico, ou óleos vegetais fracionados); e preservativos (por exemplo,metila ou propil-p-hidroxibenzoatos, ou ácido sórbico). As preparações tam-bém podem conter tampões, sais, flavorizantes, colorantes, e agentes ado-çantes conforme apropriado.

As composições podem ser formuladas para administração pa-renteral por injeção, por exemplo, mediante injeção de bolus ou infusão con-tínua. O ingrediente ativo pode ser fornecido na forma de pó para constitui-ção com um veículo adequado, por exemplo, água livre de pirogênio estéril,antes da sua utilização. As formulações para injeção podem ser apresenta-das na forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipi-entes de múltiplas doses, com um preservativo acrescentado. As composi-ções podem tomar tais formas como suspensões, soluções ou emulsões emveículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes tais como agentes desuspensão, estabilizantes e/ou dispersantes.

Adiuvantes

As vacinas da invenção podem ser formuladas com outros agen-tes imunorreguladores. Em particular, as composições de vacina podem in-cluir um ou mais adjuvantes. Os adjuvantes que podem ser utilizados nascomposições de vacina aqui descritos incluem, mas não são limitados a es-tes:

A. Composições Contendo Mineral

As composições contendo minerais adequadas para uso comoadjuvantes aqui descritos incluem sais minerais, tais como sais de alumínioe sais de cálcio. Também são incluídos sais minerais tais como hidróxidos(por exemplo, oxiidróxidos), fosfatos (por exemplo, hidroxifosfatos, ortofosfa-tos), sulfatos, etc (por exemplo, ver capítulos 8 e 9 de Vaccine Design (1995)eds. Powell & Newman. ISBN: 030644867X. Plenum), ou misturas de dife-rentes compostos minerais (por exemplo, uma mistura de um fosfato e umaadjuvante de hidróxido, opcionalmente com um excesso do fosfato), com oscompostos tomando qualquer forma adequada (por exemplo, gel, cristalina,amorfa, etc.), e com adsorção ao(s) sal(is) sendo preferida. As composiçõescontendo minerais também podem ser formuladas como uma partícula desal de metal (Publicação PCT N- WO 00/23105).

Os sais de alumínio podem ser incluídos nas composições aquidescritas tais que a dose de Al3+ está entre 0,2 e 1,0 mg por dose. Em umamodalidade, o adjuvante à base de alumínio para uso nas presentes compo-sições é alume (sulfato de alumínio potássio (AIK(SO4)2)), ou um derivado dealume, tal como aquele formado in situ mediante a mistura de um antígenoem tampão de fosfato com alume, seguido por titulação e precipitação comuma base tal como o hidróxido de amônio ou hidróxido de sódio.

Um outro adjuvante à base de alumínio para uso em formula-ções de vacina da presente invenção é adjuvante de hidróxido de alumínio(Al(OH)3) ou oxiidróxido de alumínio cristalino (AIOOH), que é um excelenteadsorvente, tendo uma área superficial de aproximadamente 500 m2/g. Al-ternativamente, adjuvante de fosfato de alumínio (AIPO4) ou hidroxifosfatode alumínio, que contém grupos fosfato em lugar de alguns ou todos os gru-pos de hidroxila de adjuvante de hidróxido de alumínio é fornecido. Os adju-vantes de fosfato de alumínio aqui fornecidos são amorfos e solúveis emmeio acídico, básico e neutro.

Em outra modalidade, o adjuvante para uso com as presentescomposições compreende tanto fosfato de alumínio quanto hidróxido de a-lumínio. Em uma modalidade mais particular desta, o adjuvante possui umamaior quantidade de fosfato de alumínio do que hidróxido de alumínio, talcomo uma relação de 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 ou maior do que9:1, em peso de fosfato de alumínio para hidróxido de alumínio. Mais particu-larmente, os sais de alumínio podem estar presentes em 0,4 a 1,0 mg pordose de vacina, ou 0,4 a 0,8 mg por dose de vacina, ou 0,5 a 0,7 mg por do-se de vacina, ou ao redor de 0,6 mg por dose de vacina.

Geralmente, o(s) adjuvante(s) com base em alumínio preferi-do(s), ou relação de múltiplos adjuvantes à base de alumínio, tais como fos-fato de alumínio para hidróxido de alumínio, são selecionados pela otimiza-ção da atração eletrostática entre as moléculas tal que o antígeno carregauma carga oposta como o adjuvante no pH desejado. Por exemplo, o adju-vante de fosfato de alumínio (ponto isoelétrico = 4) adsorve lisozima, masnão albumina no pH 7,4. A albumina deve ser o alvo, o adjuvante de hidróxi-do de alumínio seria selecionado (ponto isoelétrico = 11,4). Alternativamen-te, o pré-tratamento de hidróxido de alumínio com fosfato reduz seu pontoisoelétrico, tornando-o um adjuvante preferível para os antígenos mais bási-cos.

B. Emulsões Oleosas

As composições de emulsão oleosa adequadas para uso comoadjuvantes nas composições incluem emulsões de esqualeno-água. Os ad-juvantes particularmente preferidos são emulsões de óleo em água submí-crons. As emulsões de óleo em água submícrons preferidas para uso aquisão emulsões de esqualeno/água opcionalmente contendo quantidades va-riáveis de MTP-PE, tais como uma emulsão de óleo em água submícron con-tendo de 4 a 5% p/v de esqualeno, 0,25 a 1,0% p/v de Tween® 80 (monoolea-to de polioxieltilenossorbitano), e/ou 0,25 a 1,0% de Span® 85 (trioleato desorbitano), e, opcionalmente, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isogluatminil-L-alani-na-2-(1 '-2'-dipalmitoil-s-n-glicero-3-hidroxifosforilóxi)etilamina (MTP-PE), porexemplo, a emulsão de óleo em água submícron conhecida como "MF59"(International Publication N9 WO 90/14837; Patentes U.S. n25 6.299.884 e6.451.325, e Ott et ai., "MF59-Design and Evaluation of a Safe and PotentAdjuvant for Human Vaccines" in Vaccine Design: The Subunit and AdjuvantApproach (Powell, M. F. and Newman, M. J. eds.) Plenum Press, New York,1995, pp. 277-296). A MF59 contém de 4 a 5% p/v de esqualeno (por exem-plo, 4,3%), de 0,25 a 0,5% p/v Tween® 80, e 0,5% p/v Span® 85 e opcio-nalmente contém várias quantidades de MTP-PE, formuladas em partículassubmícrons usando um microfluidificador tal como o microfluidificador Model110Y (Microfluidics, Newton, Mass). Por exemplo, a MTP-PE pode estar pre-sente em uma qúantidãde de cerca de 0 a 500 μg/dose, mais preferivelmen-te de 0 a 250 μg/dose e o mais preferível de 0 a 100 pg/dose. Por exemplo,a "MF59-100" contém 100 pg de MTP-PE por dose, e assim por diante. AMF69, uma outra emulsão de óleo em água submícron para uso neste do-cumento, contém 4,3% p/v de esqualeno, 0,25% p/v Tween® 80, e 0,75%p/v Span® 85 e opcionalmente MTP-PE. Mais uma outra emulsão de óleoem água submícron é MF75, também conhecida como SAF, contendo 10%de esqualeno, 0,4% de Tween® 80, 5% de Pluronic® - polímero bloqueadoL121, e thr-MDP, também microfluidificado em uma emulsão submícron.MF75-MTP significa uma formulação MF75 que inclui MTP, tal como de 100a 400 pg de MTP-PE por dose.

As emulsões de óleo em água submícrons, métodos para a suafabricação e agentes imunoestimulantes, tais como peptídeos de muramila,para utilização nas composições, são descritos com detalhes na PublicaçãoInternacional Nq WO 90/14837 e Patentes U.S. n22 6.299.884 e 6.451.325.

Adjuvante de Freund completo (CFA) e adjuvante de Freund in-completo (IFA) também podem ser usados como adjuvantes nas composi-ções objetos.

C. Formulações de Saponina

As formulações de saponina, também podem ser utilizadas co-mo adjuvantes no composições. As saponinas são um grupo heterólogo deesterol glicosídeos e triterpenóide glicosídeos que são encontrados nas cas-cas, folhas, caules, raízes e até mesmo flores de uma grande variedade deespécies vegetais. As saponinas isoladas da casca da árvore Quillaia sapo-naria Molina foram amplamente estudado como adjuvantes. As saponinastambém podem ser comercialmente obtidas das Smilax ornata (salsaparri-lha), Gypsophilla paniculata (véu de noiva) e Saponaria officianalis (raiz desabão). As formulações adjuvantes de saponina incluem formulações purifi-cadas, tais como QS21, bem como formulações lipídicas, tais como comple-xos imunoestimulantes (ISCOMs).

As composições de saponina foram purificadas utilizando Cro-matografia de Camada Fina de Alto Desempenho (HP-TLC) e CromatografiaLíquida de Alto Desempenho de Fase Reversa (RP-HPLC). As frações puri-ficadas específicas utilizando estas técnicas foram identificadas, incluindoQS7, QS17, QS18, QS21, QH-A1 QH-B e QH-C. Tipicamente, a saponina éQS21. Um método de produção de QS21 é descrito na Patente U.S. n25.057.540. As formulações de saponina podem também compreender umesterol, tal como colesterol (ver, Publicação PCT N9 WO 96/33739).

As combinações de saponinas e colesteróis podem ser usadaspara formar partículas únicas chamadas Complexos Imunoestimulantes (IS-COMs). Os ISCOMs tipicamente também incluem um fosfolipídeo tal comofosfatidiletanolamina ou fosfatidilcolina. Qualquer saponina conhecida podeser usada nos ISCOMs. Preferencialmente, o ISCOM inclui um ou mais dosQuil A, QHA e QHC. Os ISCOMs são ainda descritos na EP 0109942, WO96/11711 e WO 96/33739. Opcionalmente, os ISCOMS podem ser desprovi-dos de (um) detergente(s) adicional(is). Ver o WO 00/07621.

Uma análise do desenvolvimento de adjuvantes com base emsaponina pode ser observada em Barr, et al., Advanced Drug Delivery Revi-ews (1998) 32:247-271. Ver também Sjolander1 et al., Advanced Drug Deli-very Reviews (1998) 32:321 -338.

D. Virossomas e Partículas Semelhantes a Vírus (VLPs)

Os Virossomas e Partículas Semelhantes a Vírus (VLPs) tam-bém podem ser usados como adjuvantes com as presentes composições.Estas estruturas geralmente contêm uma ou mais proteínas de um vírus op-cionaimente combinadas ou formuladas com um fosfolipídeo. Elas são ge-ralmente não patogênicas, não replicantes e geralmente não contêm qual-quer genoma viral nativo. As proteínas virais podem ser recombinantementeproduzidas ou isoladas de vírus inteiros. Estas proteínas virais adequadaspara uso em virossomas ou VLPs incluem proteínas derivadas do vírus dainfluenza (tal como HA ou NA), vírus da Hepatite B (tal como proteínas denúcleo ou capsídeas), vírus da hepatite E1 vírus do sarampo, vírus Sindbis1Rotavírus, vírus da doença do pé e boca, Retrovírus, vírus Norwalk1 Papilo-ma vírus humano, HIV, RNA-fagos, Οβ-fago (tais como proteínas de reves-timento), GA-fago, fr-fago, AP205 fago, e Ty (tal como proteína Ty retrotras-poson PI). As VLPs são debatidas ainda nos WO 03/024480, WO03/024481, e Niikura et al., Virology (2002) 293:273-280; Lenz et al., Journalof Immunology (2001) 5246-5355; Pinto, et al., Journaloflnfectious Diseases(2003) 188:327-338; and Gerber et al., Journal of Virology (2001)75(10):4752-4760. Os virossomas são debatidos ainda na por exemplo,Gluck et al., Vaccine (2002) 20: B10-B16. Os virossomas da influenza re-constituídos imunopotencializados (IRIV) são utilizados como o sistema deliberação do antígeno da subunidade no produto INFLEXAL® trivalente in-tranasal (Mischler & Metcalfe (2002) Vaccine 20 Suppl 5:B17-23), e no pro-duto INFLUVAC PLUS®.

Ε. Derivados Baeterianos ou Mierobianos

Os adjuvantes adequado para uso nas presentes composiçõesincluem derivados bacterianos ou microbianos tais como:

(1) Derivados não Tóxicos de Lipopolissacarídeo Enterobacteriano (LPS)

Tais derivados incluem Monofosforil lipídio A (MPL) e MPL 3-0-deacilada (3dMPL). O 3dMPL é uma mistura de monofosforil lipídio 3 De-O-acilado A com 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Uma forma de "partículas peque-nas" preferida de monofosforil lipídio 3 De-O-acilado A é descrita na EP O689454. Tais "partículas pequenas" de 3dMPL são pequenos o suficientepara serem filtradas estéreis através de uma membrana de 0,22 mícron (verEP O 689 454). Outros derivados de LPS não-tóxicos incluem imitações demonofosforil lipídio A, tais como derivados de aminoalquil glicosaminida fos-fato, por exemplo, RC-529. Ver Johnson et al. (1999) Bioorg. Med. Chem.Lett., 9:2273-2278.

(2) Derivativos de Lipídeo A

Os derivados de lipídio A incluem derivados de Iipfdios A de Es-cherichia coli tais como OM-174. OM-174 é descrito, por exemplo, em Me-raldi et al., Vaccine (2003) 21: 2485 - 2491; e Pajak, et al., Vaccine (2003)21:836-842.

(3) Oliqonucleotídeos Imunoestimuladores

Os oligonucleotídeos imunoestimuladores adequados para usocomo adjuvantes incluem seqüências de nucleotídeo contendo um motivoCpG (uma seqüência contendo uma citosina não metilada seguida de gua-nosina e ligada por uma ligação de fosfato). O RNA de filamento duplo bac-teriano ou oligonucleotídeos contendo seqüências palindrômicas ou poli(dG)também foram mostrados serem imunoestimulaores.

Os CpGs podem incluir modificações/análogos de nucleotídeostais como modificações de fosforotioato e podem ser de filamento duplo oufilamento único. Opcionalmente, a guanosina pode ser substituída com umanálogo tal como 2'-deóxi-7-deazaguanosina. Ver, Kandimalla, et al., NucleieAcids Research (2003) 31(9): 2393-2400; WO 02/26757 e WO 99/62923 pa-ra exemplos de possíveis substituições de análogo. O efeito do adjuvante ofCpG oligonucleotídeos é ainda debatido em Krieg, Nature Medicine (2003)9(7): 831-835; McCIuskie, et al., FEMS Immunology and Medicai Microbio-logy (2002) 32:179-185; WO 98/40100; Patente U.S. ne 6.207.646; PatenteU.S. n2 6.239.116 e Patente U.S. n2 6.429.199.

A seqüência de CpG pode ser direcionada para TLR9, tal comoo motivo GTCGTT ou TTCGTT. Ver, Kandimalla, et al., Biochemical SocietyTransactions (2003) 31 (part 3): 654-658. A seqüência de CpG pode ser es-pecífica para induzir uma resposta imune Th1, tal como um CpG-A ODN, oupode ser mais específica para induzir uma resposta das células B, tal comoum CpG-B ODN. Os CpG-A e CpG-B ODNs são debatidos em Blackwell1 etal., J Immunol. (2003) 170(8):4061-4068; Krieg, TRENDS in Immunology(2002) 23(2): 64- 65 e WO 01/95935. Tipicamente, o CpG é um CpG-A ODN.

Tipicamente, o CpG oligonucleotídeo é construído de modo quea extremidade 5' seja acessível para os reconhecimento do receptor. Opcio-nalmente, duas seqüências de CpG oligonucleotídeo podem ser ligadas emsuas extremidades 3' para formar "imunômero". Ver, por exemplo, Kandimal-la, et al., BBRC (2003) 306:948-953; Kandimalla, et al., Biochemical SocietyTransactions (2003) 31 (part 3):664-658; Bhagat et al., BBRC (2003)300:853-861 e WO 03/035836.

(4) Toxinas de ADP-Ribosilação e Derivativos Detoxificados Destas.

As toxinas de ADP-ribosilação bacterianas e seus derivados de-toxificados podem ser utilizadas como adjuvantes nas composições. Tipica-mente, a proteína é derivada de E. coli (isto é, enterotoxina lábil ao calor deE. coli "LT), cólera ("TAC"), ou coqueluche ("PT"). O uso de toxinas de ADP-ribosilação detoxificadas como adjuvantes da mucosa é descrito no WO95/17211 e como adjuvantes parenterais no WO 98/42375. Preferivelmente1o adjuvante é um mutante LT detoxificado tal como LT-K63, LT-R72 e L-TR192G. O uso de toxinas de ADP-ribosilação e seus derivados detoxifica-dos, em particular LT-K63 e LT-R72, como adjuvantes, pode ser observadonas seguintes referências: Beignon1 et al., Infection and Immunity (2002)70(6):3012-3019; Pizza, et al., Vaccine (2001) 19:2534-2541; Pizza, et al.,Int. J. Med. Microbiol. (2000) 290(4-5):455-461; Scharton-Kersten et al., In-fection and Immunity (2000) 68(9):5306-5313; Ryan et al., Infection and Im-munity (1999) 67(12):6270-6280; Partidos et al., Immunol. Lett. (1999)67(3):209-216; Peppoloni et al., Vaccines (2003) 2(2):285-293; e Pine et al.,J. Control Release (2002) 85(l-3):263-270. Referência numérica para substi-tuições de aminoácido é tipicamente baseada nos alinhamentos das subuni-dades AeB das toxinas de ADP-ribosilação apresentadas em Domenighiniet al., Mol. Microbiol (1995) 15(6):1165-1167.

F. Bioadesivos e Mucoadesivos

Os bioadesivos e mucoadesivos também podem ser utilizadoscomo adjuvantes nas composições objeto. Os bioadesivos adequados inclu-em microesferas de ácido hialurônico esterificadas (Singh et al. (2001) J.Cont. Rele. 70:267-276) ou mucoadesivos tais como derivados reticuladosde ácido poliacrílico, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, polissacarídeos ecarboximetilcelulose. Quitosano e seus derivados também podem ser usa-dos como adjuvantes nas composições. Ver, por exemplo, o WO 99/27960.

G. Partículas

As micropartículas e nanopartículas (por exemplo, nanopartícu-las poliméricas) também podem ser usadas como adjuvantes nas composi-ções. As micropartículas (tipicamente partículas de -100 nm a -150 pm dediâmetro, por exemplo, -200 nm a -30 pm de diâmetro ou -500 nm a -10pm de diâmetro) e as nanopartículas (tipicamente partículas de -10 nm a-1000 nm, por exemplo, -10 nm a -100 nm de diâmetro, -20 nm a -500 nmde diâmetro, ou -50 nm a -300 nm de diâmetro) podem ser formadas a par-tir de materiais que são biodegradáveis e não tóxicos (por exemplo, um po-li(ácido α-hidróxi), um ácido poliidroxibutírico, um poliortoéster, um poliani-drido, uma policaprolactona, etc, com poli(lactídeo-co-glicolídeo). Opcional-mente, as partículas podem ser tratadas para terem uma superfície negati-vãmente carregada (por exemplo, com SDS) ou uma superfície positivamen-te carregada (por exemplo, com um detergente catiônico, tal como CTAB).As partículas podem ser planejadas com relação a especificidade, tais queelas liberam uma concentração aumentada de um agente em um local dese-jado. Ver, por exemplo, Matsumoto et al., Intl. J. Pharmaceutics, 185:93-101,1999; Williams et al., J. Controlled Release, 91:167-172, 2003; Leroux et al.,J. Controlled Release, 39:339-350, 1996; Soppimath et al., J. Controlled Re-lease, 70:1-20, 2001; Chawla et al., Intl. J. Pharmaceutics, 249:127-138,2002; Brannon-Peppas, Intl. J. Pharmaceutics, 116, 1-9, 1995; Bodmeier etal., Intl. J. Pharmaceutics, 43:179-186, 1988; Labhasetwar et al., Adv. DrugDelivery Reviews, 24:63-85, 1997; Pinto-Alphandary et al., Intl. J. Antimicro-bial Agents, 13:155-168, 2000; Potineni et al., J. Controlled Release, 86:223-234, 2003; Kost et al., Adv. Drug Delivery Reviews, 46:125-148, 2001; eSaltzman et al., Drug Discovery, 1:177-186, 2002.

As partículas, de preferência nanopartículas, podem ser incorpo-radas nos agregados estruturados na escala de tamanho mícron, com umaestrutura ou matriz consistindo em uma mistura de moléculas lipofílicas e/ouhidrófilas (normalmente "excipientes" farmacêuticos). As nanopartículas po-dem ser formadas nos métodos anteriormente mencionados e incorporadasno material celular como o corpo da partícula, sobre a superfície das partícu-las ou encapsuladas dentro das partículas. A estrutura ou matriz de partículaagregada pode incluir excipientes farmacêuticos tais como lipídios, ãminoá-cidos, açúcares, polímeros e pode também incorporar ácido nucléico e/oupeptídeo e/ou proteína e/ou antígenos de molécula pequena. As combina-ções de material antigênico também podem ser empregadas. Estas partícu-las agregadas podem ser formadas nos seguintes métodos.

O pedido de patente U.S. N5 de Série 2004/0062718 descreveum método de fabricação de partículas agregadas de nanopartícula porosas(PNAPs) para uso como vacinas. O antígeno pode ser associado com asnanopartículas mediante a preparação das nanopartículas, sendo ligado nasuperfície das nanopartículas ou encapsulado dentro das nanopartículas oupode ser integrado na estrutura das micropartículas, que depois extrai imu-nidade tanto humoral quanto celular. Outros métodos exemplares de PNAPssão descritos em Johnson and Prud'homme, Austral. J. Chem., 56:1021-1024,2003.Estas partículas agregadas, como descrito em Edwards, et al.,Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 19:12001-12005, 2002, produzem partículasmaiores de partículas da subunidade menores (chamado partículas Trojanporque mantêm as propriedades únicas da suas menores subunidades en-quanto também mantêm as características principais das partículas maio-res). O agente pode ser encapsulado dentro das partículas de subunidadeou dentro das partículas maiores produzidas a partir dos agregados de partí-cula menores.

As partículas podem estar na forma de um pó seco adequadopara inalação. Em uma modalidade particular, as partículas podem ter umadensidade empacotada de menos do que cerca de 0,4 g/cm3. As partículasque têm uma densidade empacotada de menos do que cerca de 0,4 g/cm3são aqui mencionadas como "partículas aerodinamicamente leves". Maispreferíveis são as partículas tendo uma densidade empacotada de menos doque cerca de 0,1 g/cm3. As partículas aerodinamicamente leves possuemum tamanho preferido, por exemplo, um diâmetro geométrico médio em vo-lume (VMGD) de pelo menos cerca de 5 mícrons. Em uma modalidade, oVMGD é de cerca de 5 mícrons a cerca de 30 mícrons. Em uma outra moda-lidade, as partículas têm um VMGD variando de cerca de 9 mícrons a cercade 30 mícrons. Em outra modalidade, as partículas possuem um diâmetromédio, um diâmetro médio em massa (MMD), um diâmetro revestido médioem massa (MMED) ou uma diâmetro geométrico médio em massa (MMGD)de pelo menos 5 mícrons, por exemplo, de cerca de 5 a cerca de 30 mí-crons. As partículas aerodinamicamente leves preferivelmente possuem "di-âmetro aerodinâmico médio em massa" (MMAD), aqui também referido co-mo "diâmetro aerodinâmico", entre cerca de 1 mícron e cerca de 5 mícrons.Em uma modalidade, o MMAD está entre cerca de 1 mícron e cerca de 3mícrons. Em outra modalidade, o MMAD está entre cerca de 3 mícrons ecerca de 5 mícrons.

Em uma outra modalidade, as partículas possuem uma densida-de de massa revestida, também aqui referida como "densidade de massa"de menos do que cerca de 0,4 g/cm3. A densidade de massa revestida deuma partícula isotrópica é definida como a massa da partícula dividida pelovolume revestido da esfera mínimo dentro do qual ela pode ser delimitada.

A densidade empacotada pode ser medida utilizando instrumen-tos conhecidos por aqueles versados na técnica, como o Dual Platform Mi-croprocessor Controlled Tap Density Tester (Vankel, NC) ou um instrumentoGeopyc® (Micrometrics Instrument Corp., Norcross, Ga. 30093). A densida-de empacotada é uma medida padrão da densidade de massa revestida. Adensidade empacotada pode ser determinada utilizando o método de USPBulk Density and Tapped Density, United States Pharmacopia convention,Rockville, Md., 10th Supplement, 4950-4951, 1999. Os aspectos que podemcontribuir para diminuir a densidade empacotada incluem textura superficialirregular e estrutura porosa.

O diâmetro das partículas, por exemplo, seu VMGD, pode sermedido usando um instrumento de sensoriamento da zona elétrica como umMultisizer lie, (Coulter Electronic, Luton, Beds, England), ou um instrumentode difração a laser (por exemplo Helos1 fabricado pela Sympatec, Princeton,N.J.). Outros instrumentos para medição do diâmetro de partícula são bem-conhecidos na técnica. O diâmetro das partículas em uma amostra variarádependendo dos fatores tais como a composição de partícula e os métodosde síntese. A distribuição do tamanho das partículas em uma amostra podeser selecionada para permitir a deposição ideal dentro dos sítios visadosdentro do trato respiratório.

As partículas podem ser fabricadas com o material apropriado,rugosidade superficial, diâmetro e densidade empacotada para a liberaçãolocalizada nas regiões selecionadas do aparelho respiratório tais como opulmão pleno ou as vias aéreas superiores ou centrais. Por exemplo, a den-sidade mais elevada ou partículas maiores podem ser utilizadas para a libe-ração nas vias aéreas superiores, ou uma mistura de partículas de tamanhovariável em uma amostra, fornecida com o mesmo ou diferente agente tera-pêutico pode ser administrada nas diferentes regiões alvos do pulmão emuma administração. As partículas tendo um diâmetro aerodinâmico variandode cerca de 3 a cerca de 5 mícrons são preferíveis para liberação nas viasaéreas centrais e superiores. As partículas tendo um diâmetro aerodinâmicovariando de cerca de 1 para cerca de 3 mícrons são preferidas para a libera-ção no pulmão pleno.

O impacto inercial e a resolução gravitacional dos aerossóis sãomecanismos predominantes de deposição nas vias aéreas e ácinos dospulmões durante as condições de respiração normal (Edwards, J. AerosolSci., 26: 293-317, 1995). A importância de ambos os mecanismos de depo-sição aumenta em proporção com a massa dos aerossóis e não com o vo-lume da partícula (ou revestida). Visto que o sítio da deposição de aerossolnos pulmões é determinado pela massa do aerossol (pelo menos para aspartículas de diâmetro aerodinâmico médio maior do que aproximadamente1 mícron), a diminuição da densidade empacotada mediante o aumento dasirregularidades superficiais da partícula e porosidade de partícula permite aliberação de volumes revestidos de partícula maiores para os pulmões, to-dos os outros parâmetros físicos sendo iguais.

O diâmetro aerodinâmico pode ser calculado para fornecer adeposição máximo dentro dos pulmões, anteriormente alcançada pela utili-zação de partículas muito pequenas de menos do que cerca de cinco mí-crons de diâmetro, preferivelmente entre cerca de um e cerca de três mí-crons, que são depois submetidos à fagocitose. A seleção das partículas quetêm um diâmetro maior, mas que são suficientemente leves (daí a caracteri-zação "Aerodinamicamente leve"), resulta em uma liberação equivalente nospulmões, mas as partículas de tamanho maior não são submetidas a fagoci-tose. A liberação melhorada pode ser obtida através do uso de partículascom uma superfície áspera ou desigual em relação àquelas com uma super-fície lisa.

As partículas adequadas podem ser fabricadas ou separadas,por exemplo, por filtração ou centrifugação, para fornecer uma amostra departícula com uma distribuição de tamanho pré-selecionada. Por exemplo,maior do que cerca de 30%, 50%, 70% ou 80% das partículas em uma a-mostra pode ter um diâmetro dentro de uma faixa selecionada de pelo me-nos cerca de 5 mícrons. A faixa selecionada dentro da qual uma certa per-centagem das partículas deve cair pode estar, por exemplo, entre cerca de 5e cerca de 30 mícrons, ou de forma ideal entre cerca de 5 e cerca de 15 mí-crons. Em uma modalidade preferida, pelo menos uma parte das partículaspossuem um diâmetro entre cerca de 9 e cerca de 11 mícrons. Opcional-mente, a amostra de partícula também pode ser fabricada em que pelo me-nos cerca de 90%, ou opcionalmente cerca de 95% ou cerca de 99%, possuium diâmetro dentro da faixa selecionada. A presença da proporção maiselevada das partículas de diâmetro maior aerodinamicamente leves na a-mostra de partícula aumenta a liberação de agentes terapêuticos ou de di-agnóstico aqui incorporados no pulmão pleno. As partículas de diâmetrogrande geralmente significam partículas tendo um diâmetro geométrico mé-dio de pelo menos cerca de 5 mícrons.

As partículas preferidas para direcionar as células que apresen-tam o antígeno ("APC") possuem um diâmetro mínimo de 400 nm, o limitepara fagocitose por APCs. As partículas preferidas para se movimentar atra-vés dos tecidos e células-alvo para captação possuem um diâmetro mínimode 10 nm. A formulação final pode formar um pó seco que é adequado paraa liberação pulmonar e estável em temperatura ambiente.

H. Lipossomas

Exemplos de formulações de Iipossoma adequadas para utiliza-ção como adjuvantes são descritos na Patente U.S. n- 6.090.406, PatenteU.S. ns 5.916.588, e EP 0 626 169.

I. Formulações de Éter de Polioxietileno e Éster de Polioxietileno

Os adjuvantes adequados para uso nas composições inclueméteres de polioxietileno e ésteres de polioxietileno. Ver, por exemplo, o WO99/52549. Tal formulação pode ainda incluir tensoativos de éster de polioxie-tileno sorbitano em combinação com um octoxinol (WO 01/21207), assimcomo tensoativos de éter ou éster polioxietileno alquílico em combinaçãocom pelo menos um tensioativo não iônico adicional tal como um octoxinol(WO 01/21152). Os éteres de polioxietileno preferidos são selecionados doseguinte grupo: éter polioxietileno-9-laurílico (lauret 9), éter de polioxietileno-9-esteorílico, éter polioxietileno-8-esteorílico, éter polioxietileno-4-laurílico,éter polioxietileno-35-laurílico e éter polioxietileno-23-laurílico.J. Polifosfazeno (PCPP)

As formulações de PCPP são descritas, por exemplo, em Andri-anov et al., Biomaterials (1998) 19(l-3):109-l 15 e Payne et a\., Adv. Drug.Delivery Review (1998) 31 (3):185-196.

K. Peptídeos de Muramila

Exemplos de peptídeos de muramila adequados para utilizaçãocomo adjuvantes incluem N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP),N-acetil-normuramil-1-alanil-d-isoglutamina (nor-MDP) e N-cetilnuramll-1-ala-nil-d-isoglutaminll-1 -alanina-2-(1 '^'-dipalmitolI-s-n-glicero-S-hidroxiosforilóxi)-etilamina MTP-PE).

L. Compostos de Imidazoquinolina

Exemplos de compostos de imidazoquinolina adequados parauso como adjuvantes nas composições incluem Imiquimod e seus análogos,descritos ainda em Stanley, Clin. Exp. Dermatol. (2002) 27 (7):571-577; Jo-nes, Curr. Opin. Investig. Drugs (2003) 4(2):214-218; e Patentes U.S. n-4.689.338, 5.389.640, 5.268.376, 4.929.624, 5.266.575, 5.352.784,5.494.916, 5.482.936, 5.346.905, 5.395.937, 5.238.944, 5.525.612.

M. Compostos de Tiosemicarbazona

Exemplos de compostos de tiosemicarbazona, assim como osmétodos de formulação, fabricação e triagem de todos os compostos ade-quados para utilização como adjuvantes nas composições incluem aquelesdescritos no WO 04/60308. As tiosemicarbazonas são particularmente efica-zes no estímulo das células mononucleares sangüíneas periféricas humanaspara a produção de citocinas, tais como TNF-a.

N. Compostos de Triptantrina

Exemplos de compostos de triptantrina, assim como os métodosde formulação, fabricação e triagem de todos os compostos adequados parautilização como adjuvantes nas composições incluem aqueles descritos noWO 04/64759. Os compostos de triptantrina são particularmente eficazes noestímulo das células mononucleares sangüíneas periféricas humanas para aprodução de citocinas, tais como TNF-a.O. Imunomoduladores Humanos

Os imunomoduladores humanos adequados para uso como ad-juvantes nas composições incluem citocinas, tais como interleucinas (porexemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 , etc), interferons (por exem-pio, interferon-γ), fator de estimulação da colônia macrófagá, e fator da ne-crose tumoral.

As composições podem também compreender combinações deaspectos de um ou mais dos adjuvantes acima identificados. Por exemplo,as seguintes composições adjuvantes podem ser utilizadas na invenção:

(1) uma saponina e um emulsão de óleo em água (WO 99/11241);

(2) uma saponina (por exemplo, QS21) + um derivado de LPS não tóxico(por exemplo, 3dMPL) (ver WO 94/00153);

(3) uma saponina (por exemplo, QS21) + um derivado de LPS não tóxico(por exemplo, 3dMPL) + um colesterol;

(4) uma saponina (por exemplo, QS21)+ +3dMPL + IL-12 (opcionalmen-te + um esterol) (WO 98/57659);

(5) combinações de 3dMPL com, por exemplo, QS21 e/ou emulsões deóleo em água (ver pedidos de patente européia 0835318, 0735898 e0761231);

(6) SAF, contendo 10% Squalane, 0,4% Tween® 80, 5% polímero debloco Pluronic® L121, e thr-MDP, microfluidificado em uma emulsãosubmícron ou submetido a vórtice para gerar uma emulsão com ta-manho de partícula maior;

(7) Sistema adjuvante Ribi® (RAS), (Ribi Immunochem) contendo 2%Squalene, 0,2% Tween® 80, e um ou mais componentes da paredecelular bacteriana do grupo constituído por monofosforilipídio A(MPL), dimicolato de trealose (TDM), e esqueleto da parede celular(CWS), preferivelmente MPL + CWS (Detox®);

(8) um ou mais sais minerais (tais como um sal de alumínio) + um deri-vado não tóxico de LPS (tal como 3dPML); e

(9) um ou mais sais minerais (tais como um sal de alumínio) + um oligo-nucleotídeo imunoestimulador (tal como uma seqüência de nucleotí-deo incluindo um motivo CpG).

Os sais de alumínio e MF59 são adjuvantes típicos para usocom vacinas injetáveis. As toxinas bacterianas e bioadesivas são adjuvantestípicos para uso com as vacinas mucosamente liberadas, tais como as vaci-nas nasais ou inaladas. Os adjuvantes adicionais úteis nas vacinas muco-sais são debatidos, por exemplo, em Stevceva and Ferrari, Curr. Pharm.Des., 11:801-11, 2005, and Cox et al., Vet. Res., 37:511-39, 2006.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Secagem por atomizacão de uma Suspensão de M. smegmatis

Para ilustrar que a secagem por atomização das formas celula-res sem excipiente leva a um pó que é muito úmido para se produzir ou pro-cessar, a Mycobacterium smegmatis foi utilizada como um microorganismomodelo. Os pós secos foram formados pela secagem por atomização utili-zando um Buchi® Mini Spray Dryer B-290 (Brinkmann Instruments, West-bury, NY), com temperatura de entrada, taxa de fluxo, e concentração deexcipiente todas controladas.

O microorganismo foi secado por atomização sem excipientepresente. Uma solução de M. smegmatis pura foi lavada com PBS-Tween®80 e colocado novamente em suspensão em 90 ml de água para uma con-centração de bactéria de 3 χ 108 CFU/ml. Com condições ambientais de19,5°C e 48% de umidade, a solução de M. smegmatis foi secada por atomi-zação com uma temperatura de entrada de 130°C, uma temperatura de saí-da de 50°C, e uma taxa de fluxo de 22 ml/min. O bloco de bactéria agregadodentro do cilindro do secador de atomização e deixado de emitir a partir dociclone como um pó. O material coletado dentro do secador de atomizaçãoestava úmido e quase impossível de se processar.

Exemplo 2: Secagem por atomizacão de M. smegmatis com Leucina

Para ilustrar que quantidades relativamente pequenas de excipi-ente não levam a um pó seco com êxito, M. smegmatis foi secada por atomi-zação usando Ieucina como um excipiente modelo. A solução seca consistiaem 80% (em peso) de uma solução de Ieucina em 4 mg/ml e 20% de umasuspensão de M. smegmatis em 3 χ 109 CFU/ml para uma solução de 400ml. As soluções foram misturadas em linha exatamente antes de alcançar obico de pulverização. Com as condições ambientais de 20°C e 69% de umi-dade, a solução foi secada por atomização com uma temperatura de entradade 150°C, uma temperatura de saída de 60°C, e uma taxa de fluxo de 8ml/min. O tamanho de gotícula médio foi estimado em 50 a 60 mícrons. Esteprocesso produziu o produto através do ciclone do secador de atomização,mas o produto era excessivamente úmido com baixo rendimento. Um póamarelado foi obtido o qual continha bactérias viáveis (Figura 3). No entanto,este pó se acumulou e apresentou propriedades fracas de fluxo.

Exemplo 3: Secagem por atomização de M. smeamatis com Concentraçõesmais Elevadas de Leucina

Concentrações mais elevadas de excipiente tais como Ieucinapodem levar a um bom pó secado por atomização, e concentrações aindamais elevadas de excipiente aumentam a viabilidade do organismo. Maisuma vez, soluções de 400 ml foram preparadas através da mistura de 90% e95% de uma solução de leucina, em 4 mg/ml com 10% e 5% de uma sus-pensão de M. smegmatis em 3 χ 109 CFU/ml. Novamente, as soluções forammisturadas em linha exatamente antes de alcançar o bico do pulverizador.Com condições ambientais de 20°C e 69% de umidade, as soluções foramsecadas por atomização com uma temperatura de entrada de 150°C, umatemperatura de saída de 55°C, e uma taxa de fluxo de 8 ml/min. O tamanhomédio da gotícula foi estimado em 50 a 60 mícrons.

A Tabela 1 fornece os resultados das operações de secagempor atomização. Em todos os casos, a secagem por atomização resultou emum pó branco viável fino, adequado para a dispersão de aerossol, com ren-dimento elevado do produto. A viabilidade foi medida como unidades forma-doras de colônia em placas de ágar 7H9 com higromicina. A viabilidade deorganismo significativamente mais elevada (cerca de 20 a 80 vezes) foi ob-servada para os pós de 95:5 (leucina:smeg) (Figura 4), em comparação comos pós 90:10, ilustrando a importância do excipiente adicionado para prote-ger o microrganismo durante a secagem por atomização. O conteúdo de á-gua é calculado com base na aparência grosseira do pó. Análise termogra-vimétrica (TGA) é usada para a análise quantitativa do conteúdo de água. AFigura 5 é um micrógrafo fluorescente que descreve M. smegmatis que ex-pressa a proteína fluorescente verde (GFP), que foi secada usando pulveri-zação 90:10 leucina:smeg. Este micrógrafo mostra que apenas uma subsé-rie das partículas do pó contém M. smegmatis fluorescente (verde).

Tabela 1.

Secagem por atomização de M. smegmatis com Ieucina

<table>table see original document page 52</column></row><table>

O rendimento do produto na Tabela 1 é medido como a propor-ção de massa no produto final comparado com a massa dos solutos na solu-ção pulverizada. A massa do produto final inclui qualquer água residual nopó. Tipicamente, uma parte da massa adere ao mecanismo de secagem enão é recuperável.

Exemplo 4: Secagem por atomização de M. smegmatis com Manitol

Para demonstrar que a secagem por atomização de microorga-nismos pode ser realizada com outros excipientes, outras experiências foramexecutadas utilizando o açúcar manitol. Uma solução de excipiente consistiaem 95% de uma solução de manitol em 10 mg/ml e 5% de uma suspensãode M. smegmatis em 3 χ 109 CFU/ml em uma solução de 200 ml foi produzi-da através da mistura em linha exatamente antes de alançar o bico de pulve-rização. Com as condições ambientais de 21,9°C e 63% de umidade, a solu-ção foi secada por atomização com uma temperatura de entrada de 145°C,uma temperatura de saída de 55°C, e uma taxa de fluxo de 12 ml/min. Otamanho médio da gotícula foi estimado em 50 a 60 mícrons. A secagem poratomização produziu um pó branco viável fino, adequado para a dispersãode aerossol, com 50% de rendimento do produto, que incluía as bactériasviáveis.

Exemplo 5: Viabilidade da M. smeamatis Seca Durante a Armazenagem

Para determinar a viabilidade da M. smegmatis secada por ato-mização durante a armazenagem, a secagem por atomização foi realizadacomo no Exemplo 3, e os pós resultantes foram armazenados em recipien-tes selados durante uma a duas semanas a 4°C, 25°C e 40°C. A viabilidadefoi medida como unidades formadoras de colônias em placas. O pó de Ieuci-na:smeg 95:5 reteve a viabilidade substancial após uma semana de arma-zenagem a 4°C ou 25°C, mas não foi significativamente viável após armaze-nagem a 40°C. O pó de leucina:smeg 90:10 reteve a viabilidade após umasemana de armazenagem a 4°C, mas não era viável em temperaturas maiselevadas. Um micrógrafo eletrônico de pó de leucina:smeg 95:5 após umasemana de armazenagem a 25°C é mostrado na figura 6.

Exemplo 6: Modelagem da Secagem por atomização com Crioprotetor

Para mostrar que a maneira em que o excipiente é introduzidodurante a secagem por atomização pode desempenhar um fator importantena retenção da viabilidade, a Equação 36 foi utilizada para modelar o volumede um material celular durante a secagem por atomização sob três condi-ções diferentes: sem crioprotetor, com concentrações iguais de crioprotetorno interior e no exterior da célula, e com uma concentração mais elevada decrioprotetor dentro do que fora da célula (Figura 7). O objetivo era mostrarum paradigma pelo qual a tensão de membrana pode ser minimizada atra-vés da introdução de crioprotetor (excipiente), dentro da célula, fora da célu-la, ou em ambos os lados da célula.

A modelagem foi feita usando o programa Mathematica® (Wol-fram, Inc., Champaign, IL). Para os três gráficos, o raio da célula inicial(Rc(O)) foi fixado em 1 pm, o raio inicial de gotícula (Rd0) foi fixado em 25 pm,em relação aos volumes da célula foram traçados em gráfico duranteum tempo. Lp foi fixado em 1,0 Mm/(atm min); Rgás foi fixado em0,08205745867258821 (atm L)/(K mol); T foi fixado em 295,15 K. Em todosos três casos, k = - (KdLMTDy^pi) (Eq, 33). A LMTD foi determinada porfixar uma temperatura de entrada de 500°C, uma temperatura de saída de200°C, uma temperatura de gotícula inicial de 20°C e uma temperatura degotícula final de 65°C. Estes valores foram alimentados para a Equação 30para dar LMTD = ((500°C - 20°C) - (200°C - 65°C))/(2,303 * Iog10 ((500°C -20°C)/(200°C - 65°C))). Kd foi fixado em 0,02 kcal/(m hr°C); λ foi fixado em530 kcal/kg; pi foi fixado em 1000 kg/m3. O número de células (ncéiuias) foifixado em 100, e o volume excluído (VexCiuído) foi fixado em 0,46 vez o volumeinicial. D*cp foi fixado em 10"6.

Para o traço (a) na Figura 7, onde a concentração de crioprotetoré mais baixa fora do que dentro da célula, a quantidade de sal extracelular(xes) foi fixada em 0,26 M vez o volume de gotícula inicial (Vd0 = 4/3 π (Rdo)3).a quantidade nos sal intracelular (x's) foi fixada em 0,26 M vezes o volume degotícula inicial, a quantidade de crioprotetor extracelular (xecp) foi fixada em 0mol, e a concentração de crioprotetor intracelular (Cdcp(O)) foi fixada em 1 M.A Equação 36 foi avaliado pelos tempos de 0 a 0,105 segundo utilizandoestas condições de dar o traço (a).

Para o traço (b) na figura 7, onde não há crioprotetor fora oudentro da célula, a quantidade de sal extracelular e intracelular (xes e x's) foicada uma fixada em 0,26 M vez o volume inicial da gotícula. A quantidade(Xecp) e concentração (Cdcp(O)) de crioprotetor intracelular foram fixadas em 0mol e 0 M, respectivamente. A Equação 36 foi avaliada pelos tempos de 0 a0,105 segundo usando estas condições para dar o traço (b).

Para o traço (c) na figura 7, onde a concentração de crioprotetordentro da célula é igual à concentração de crioprotetor fora da célula, aquantidade de sal extracelular e intracelular (xes e x's) foi fixada em 0,26 Mvez o volume inicial da gotícula. As concentrações de crioprotetor dentro(Cdcp(O)) e fora da célula foram fixadas em 1 M, dando uma quantidade decrioprotetor fora da célula (xecp), de 1 M vezes o volume de gotícula inicial. AEquação 36 foi avaliada pelos tempos de 0 a 0,105 segundo utilizando estascondições para dar o traço (c).

Estes resultados mostram que um perfil de excursão de volumemuito diferente (ou tensão da membrana) é obtido dependendo do métodode introdução do excipiente crioprotetor. Esta visão pode levar aos métodosde secagem por atomização das formas celulares que minimiza a perda daatividade celular.

Exemplo 7: Otimização da Viabilidade Celular mediante a Minimizacão daTensão Osmótica da Membrana com M. smeamatis

Para ilustrar como a minimização da tensão de membrana podemelhorar viabilidade celular seca, soluções de 400 ml foram preparadas co-mo no Exemplo 3 mediante a mistura de 95% de uma solução de Ieucina em4 mg/ml com 5% de uma suspensão de M. smegmatis em 3 χ 109 CFU/ml.Neste caso, no entanto, glicerol não foi adicionado à suspensão de M.smegmatis. Estas mesmas soluções foram também secadas por atomizaçãosem glicerol e utilizando solução salina isotônica (0,9% NaCI) em lugar deágua destilada em todos os exemplos anteriores. Mais uma vez, as soluçõesforam misturadas em linha exatamente antes de alcaçarem o bico de pulve-rização. Com as condições ambientais de 20°C e 69% de umidade, as solu-ções foram secadas por atomização com uma temperatura de entrada de150°C, uma temperatura de saída de 55°C, e uma taxa de fluxo de 8 ml/min.O tamanho médio de gotícula foi estimado em 50 a 60 mícrons.

Tabela 2.

Secagem por atomização 95:5 (M. smegmatis/leucina) com e sem glicerol

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A Tabela 2 fornece os resultados das operações de secagempor atomização para as misturas de 95:5 leucina/smeg com e sem glicerol.Em todos os casos, a secagem por atomização resultou em um pó brancoviável fino, adequado para a dispersão de aerossol, com alto rendimento deproduto. A viabilidade foi medida como unidades formadoras de colônias emplacas de ágar 7H9 com higromicina. A viabilidade de organismo significati-vãmente mais elevada foi observada para os pós de 95:5 (leucina:smeg)sem glicerol do que aquele com glicerol. Quando a mistura de 95:5 (leuci-na:smeg) foi secada por atomização sem glicerol e com solução salina iso-tônica a 0,9%, a viabilidade celular baixa foi observada em relação com o95:5 (leucina:smeg) sem glicerol e sem sal (Figura 8), ilustrando a importân-cia de remover as substâncias osmoticamente ativas da solução secada poratomização para proteger o microrganismo durante a secagem por atomização.

Estes resultados confirmam a previsão do Exemplo 6 de que apresença de crioprotetor ou sal durante a secagem de uma suspensão dematerial celular pode levar a tensão significativa nas membranas celulares,resultando em viabilidade reduzida, presumivelmente da morte celular duran-te a secagem por atomização.

Exemplo 8: Conteúdo de Células Aumentado nos Pós Secados por atomiza-cão com Alta Viabilidade de M. smeamatis

Para ilustrar que a retenção da alta viabilidade das células seca-das por atomização pode conduzir a uma água livre mais baixa no pó seca-do por atomização e, por conseguinte, conteúdo de células mais elevado,soluções de 400 ml foram preparadas, como no Exemplo 7, mediante a mis-tura de 90%, 50%, 40%, 30%, 20% e 10% de uma solução de Ieucina em 4mg/ml, com 10%, 50%, 60%, 70%, 80% e 90% de suspensão de M. smeg-matis em 3 χ 109 CFU/ml - sem glicerol e sem sal. Mais uma vez, as solu-ções foram misturadas em linha exatamente antes de alcançar o bico depulverização. Com as condições ambientais de 20°C e 69% de umidade, assoluções foram secadas por atomização com uma temperatura de entradade 150°C, uma temperatura de saída de 55°C, e uma taxa de fluxo de 8ml/min. O tamanho médio de gotícula foi estimado em 50 a 60 mícrons.

A Figura 9 mostra os resultados de viabilidade das operações desecagem por atomização. Como nos exemplos anteriores, a viabilidade caiucom concentrações mais baixas de excipiente, demonstrando que níveis e-levados de excipiente são requeridos para uma boa viabilidade celular. Noentanto, ao contrário dos exemplos anteriores, pós secos finos com boa via-bilidade foram obtidos com concentrações de excipiente tão baixas quanto50%. Isto parece indicar que as concentrações mais baixas de excipiente(inferiores a 90%) podem proporcionar bons resultados quando a integridadecelular é mantida, e/ou quando nenhum aditivo é utilizado que, como no ca-so de glicerol, permanece um líquido em temperatura ambiente. A viabilida-de foi medida como unidades formadoras de colônias em placas de 7H9 á-gar com higromicina e os resultados apresentados com quatro repetiçõespor relação.

Estes resultados demonstram que a eliminação da crioprotetorresultou em viabilidade celular aumentada em concentrações reduzidas deexcipiente.

Exemplo 9: Estabilidade do Prazo de Validade dos Pós Secados por atomi-zacão com M. smesmatis

Para ilustrar que a viabilidade das células pode ser mantida duraalgum período de tempo após a secagem e sem congelamento, os pós pre-parados no Exemplo 8 com 50:50 e 95:5 leucina:M smegmatis foram coloca-dos em condições de armazenagem de volume a 4°C, 25°C e 40°C, e a via-bilidade e foi medida como unidades formadoras de colônias em placas de7H9 ágar com higromicina.

As figuras 10 e 11 mostram os resultados da viabilidade para osdois pós como uma função de tempo. A viabilidade foi mantida durante vá-rios meses, com as perdas mais dramáticas na viabilidade nos primeiros 3meses e estabilizada durante períodos de tempo mais longos. Os pós arma-zenados em condições de 4°C mantiveram mais do que um décimo da viabi-lidade original em mais de 3 meses. Os pós armazenados em condições de25°C mantiveram a viabilidade acima do limiar 106 ideal para a liberação, eos pós armazenados em condições de 40°C mantiveram a viabilidade duran-te 2 meses. A diferença de viabilidade ao longo do tempo entre os pós 50:50e 95:5 foi provavelmente devido à diferença nas concentrações de bactérias,que influenciam o teor de água, dentro dos pós.

Exemplo 10: Efeito da Estabilidade usando Monofosfolipídeo A

O efeito de uma substância lipofílica, Monofosfolipídeo A (M-pLA), sobre a estabilidade de M. smegmatis secada por atomização foi de-terminado. Os experimentos foram conduzidos para descobrir se um reves-timento oleoso poderia ser usado como um método de reter a água internadentro das bactérias para aumentar a sua viabilidade em pontos de tempomais longos. As M. smegmatis foram secadas por atomização como acimacom 95% 4 g/ml de solução de Ieucina e 5% suspensão de M. smegmatis,juntamente com 0,25% MpLA. A solução foi secada por atomização comuma temperatura de entrada de 124°C e uma temperatura de saída de 45°C.As condições ambientais foram 31,6°C com 34% de umidade relativa. Estascondições obtiveram um rendimento de massa de 66%.

Como mostrado nas Figuras 12A e 12B, as bactérias tratadascom MpLA eram comparativamente capazes de manter a viabilidade para asbactérias tratadas não MpLA durante um período de tempo de 16 semanas.A viabilidade é medida seguinte a armazenagem de até um ano.

Exemplo 11: Efeito de Vários Tensoativos

Para ilustrar que os resultados precedentes podem ser obtidoscom múltiplos agentes de dispersão sem um efeito sobre a viabilidade, asformulações smegmatis 95:5 e 50:50 foram preparadas usando 0,05% tilo-xapol (agente de dispersão utilizado nos exemplos anteriores), com 0,05% e0,1% Pluronic® - F68. Os resultados destas experiências são mostrados naFigura 13. A utilização destes Pluronic® - F68 não significativamente influ-enciou a viabilidade dos pós resultantes em comparação com aqueles pro-duzidos utilizando tiloxapol.

Exemplo 12: Estabilidade do Prazo de Validade de Pós Secados por atomi-zacão com M. bovis BCG

Para ilustrar a aplicabilidade das nossas conclusões em um or-ganismo de vacina, executamos experiências semelhantes com M. bovisBCG. Preparam-se pós de 95:5 Ieucina:M bovis BCG utilizando o mesmoprocedimento como o Exemplo 3, sem sal ou crioprotetor, e colocado o ma-terial seco em condições de armazenagem de volume a 4°C, 25°C e 40°C, ea viabilidade foi medido como unidades formadoras de colônias em placasde 7H9 ágar. A Figura 14 mostra os resultados da viabilidade para os doispós como uma função de tempo de até três meses. Os pós armazenados emcondições de 4°C amplamente mantiveram a sua viabilidade original duranteos três meses de armazenagem. Os pós armazenados em condições de25°C mantiveram viabilidade similar com algumas perdas em três meses.

Estes resultados da viabilidade são similares aos resultados mostrados paraa bactéria M. smegmatis nas figuras 9 e 10.

Exemplo 13: Secagem por atomizacão das Células de Mamífero

Para mostrar que a formulação com concentração elevada deleucina com tensão osmótica da membrana mínima pode ainda ser aplicadanas células não bacterianas, temos executado experiências com fibroblastosde camundongo embrionário NIH 3T3 cultivados e fibroblastos cardíacos derato de colheita primária.

Preparam-se três formulações: coloca-se em suspensão 1 mi-lhão de células fibroblastos por mililitro com 4 miligramas de Ieucina per mili-litro de água destilada em relações de solução de leucina/solução de célulasvolume/volume de 30/70, 50/50 e 70/30. Secou-se por atomização estasformulações com condições similares àquelas usadas no Exemplo 3 com M.smegmatis.

Todos os experimentos indicam que os fibroblastos cardíacos derato da colheita primária e os fibroblastos de camundongo embrionário NIH3T3 são aproximadamente iguais na sua capacidade de sobreviver ao pro-cesso de secagem por atomização. A concentração mais elevada de Ieucinapareceu conduzir em maior viabilidade sobre a secagem por atomização; noentanto, dado que as membranas celulares do fibroblasto são menos rígidasdo que as membranas bacterianas e mais sensíveis à pressão osmóticaproduzida pelas substâncias intracelulares osmoticamente ativas, maior via-bilidade e menor pressão osmótica líquida foram obtidas pelas células comsecagem por atomização em PBS (Tabela 3) ou solução "Tyrode" (Tabela4). As Células e Ieucina foram ambas colocadas em suspensão em PBS ouTyrode e secadas por atomização como acima em relações de solução deleucina/solução de células volume/volume de 30/70, 50/50 e 70/30. No últi-mo caso, os fibroblastos de camundongo embrionário NIH 3T3 viáveis foramrecuperados após a secagem por atomização e observados 1 mês após asecagem por atomização como mostrado na Figura 15.

Tabela 3.

Formulação de solução salina tamponada de fosfato (PBS)

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Tabela 4.

Formulação de Solução de Eletrólito Extracelular de Mamífero de Tvrode

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Após a secagem por atomização, os fibroblastos de camundon-go embrionário NIH 3T3 viáveis e fibroblastos de rato de colheita primáriaforam recuperados das formulações 70/30, 50/50 e 30/70 e plaqueados. AsFiguras 16 e 17 mostram células plaqueadas nos dias 3 e 8 após a secagempor atomização. Estas figuras mostram que a concentração de excipientemais elevada (concentração de leucina) produz números de células viáveismais elevados após a secagem.

OUTRAS MODALIDADES

Várias modalidades da invenção foram descritas. No entanto,ficará entendido que diversas modificações podem ser feitas sem divergir doespírito e escopo da invenção. Conseqüentemente, outras modalidades es-tão dentro do escopo das reivindicações que seguem.

Claims (25)

1. Método de produção de um pó seco que compreende um ma-terial celular envolto por uma membrana de bicamada de lipídio, caracteriza-do pelo fato de que o método compreende:fornecer uma solução aquosa sem sal adicionado, a soluçãocompreendendo pelo menos 0,01 mg/ml de excipiente e pelo menos 105 u-nidades/ml do material celular; esecar por atomização a solução sob condições para produzir umpó seco com menos do que 10% de água em peso compreendendo o mate-rial celular.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que mais do que 0,5% do material celular é viável.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que ainda compreende remover osmoticamente as substâncias ati-vas a partir da solução aquosa em uma quantidade eficaz para proteger omaterial celular durante a secagem por atomização.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a solução aquosa não contém sal.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o material celular compreende bactérias, vírus, micróbios eucari-óticos, células de mamífero, organelas ligadas a membrana, lipossomas,biorreatores com base na membrana, ou sistemas de liberação de fármacocom base na membrana.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que o material celular compreende bactérias.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelofato de que as bactérias são bactérias Mycobacterium tuberculosis ou Myco-bacterium smegmatis.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelofato de que as bactérias são bactérias de Bacillus Calmette-Guerin (BCG).

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o material celular compreende células de mamífero.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que as células de mamífero compreendem glóbulos vermelhos, célu-las tronco, granulócitos, fibroblastos, ou plaquetas.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a solução aquosa compreende micropar-tículas ou nanopartículas formadas a partir de um poli(ácido α-hidróxi), umácido poliidroxibutírico, um poliortoéster, um polianidrido, ou uma policapro-lactona com poli(lactídeo-co-glicolídeo).

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o excipiente compreende leucina, manitol,trealose, dextrano, lactose, sacarose, sorbitol, albumina, glicerol, etanol, oumisturas destes.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a formulação do póseco em uma composição farmacêutica.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a secagem por atomização compreende:obter um valor inicial para um raio de uma unidade de materialcelular a ser secado por atomização (Rc(O));determinar um tempo de secagem predito;selecionar os valores para cada um de(i) diferença nas temperaturas da entrada e saída de gás de umsecador por atomização (Δ7~);(ii) tamanho médio de gotícula (Rd)](iii) calor latente da vaporização de um solvente (λ);(iv) permeabilidade hidráulica de uma membrana do material celularem um crioprotetor (Lp);(v) moles de soluto extracelular (Xfs);(vi) moles de soluto extracelular (Xis)](vii) moles de crioprotetor (Xecp)](viii) concentração intracelular inicial de crioprotetor (Ccp(O)); e(ix) número de células (nCéiuias);<formula>formula see original document page 63</formula>usar os valores; ese R°(t) for mantido dentro de um limite mínimo e máximo sobreo tempo de secagem predito,secar por atomização o material celular usando as condiçõesdos valores selecionados.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pe-lo fato de que a solução aquosa não contém sal ou um crioprotetor.

16. Pó seco produzido por um método como definido em qual-quer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o pócompreende:menos do que cerca de 10% de água em peso, eum material celular envolto por uma membrana de bicamada delipídio.

17. Pó seco de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que ainda compreende pelo menos 25% de um excipiente empeso seco.

18. Pó seco de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que mais do que 0,5% do material celular é viável.

19. Pó seco de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracteri-zado pelo fato de que o pó não compreende sal ou um crioprotetor.

20. Pó seco de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracteri-zado pelo fato de que o material celular compreende bactérias, vírus, micró-bios eucarióticos, células de mamífero, organelas ligadas a membrana, Ii-possomas, biorreatores com base na membrana, ou sistemas de liberaçãode fármaco com base na membrana.

21. Pó seco de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que o material celular compreende bactérias.

22. Pó seco de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que mais do que 1 % do material celular é viável.

23. Pó seco de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelo fato de que as bactérias são bactérias Mycobacterium tuberculosis ouMycobacterium smegmatis.

24. Pó seco de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelo fato de que as bactérias são bactérias de Bacillus Calmette-Guerin(BCG).

25. Pó seco de acordo com qualquer uma das reivindicações 17a 24, caracterizado pelo fato de que o excipiente compreende leucina, mani-tol, trealose, dextrano, lactose, sacarose, sorbitol, albumina, glicerol, etanol,ou misturas destes.