BRPI0613548A2 - composições de cuidado pessoal e métodos para seu uso - Google Patents

Abstract

COMPOSIçõES DE CUIDADO PESSOAL E MéTODOS PARA SEU USO. A presente invenção refere-se a peptídeos e peptídeos suportados para tratar várias doenças e condições. Em modalidades particularmente preferidas, a presente invenção provê composições e métodos para cuidado pessoal. Em algumas modalidades, a presente invenção provê composições para uso em cuidado da pele e/ou do cabelo, assim como composições cosméticas. Em modalidades particularmente preferidas alternativas, a presente invenção provê peptídeos e peptídeos suportados para tratar doenças da pele, como rosácea. Em algumas modalidades particularmente preferidas, os peptídeos suportados da presente invenção são peptídeos anti-VEGF. Em modalidades particularmente preferidas alternativas, os peptideos anti-VEGF são expressados em uma proteína de suporte de esqueleto. Em algumas modalidades mais preferidas, a proteína de esqueletocompreende BBI.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕES DE CUIDADO PESSOAL E MÉTODOS PARA SEU USO".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a peptídeos e peptídeos suporta-dos para tratar várias doenças e condições. Em modalidades particularmen-te preferidas, a presente invenção provê métodos e composições de cuidadopessoal. Em algumas modalidades, a presente invenção provê composiçõespara uso em cuidado da pele e/ou do cabelo, assim como composiçõescosméticas. Em modalidades particularmente preferidas alternativas, a pre-sente invenção provê peptídeos e peptídeos suportados para tratar doençasda pele, como rosácea. Em algumas modalidades particularmente preferidas,os peptídeos suportados da presente invenção são peptídeos anti-VEGF. Emmodalidades alternativas particularmente preferidas, os peptídeos anti-VEGFsão expressos em uma proteína do esqueleto ("scaffold proteins"). Em al-gumas modalidades mais preferidas, a proteína esqueletocompreende BBI.

Antecedentes da Invenção

Angiogênese é o desenvolvimento de um suprimento de sanguea uma dada área de tecido. A angiogênese faz parte do desenvolvimentoembriônico normal e revascularização de leitos de feridas, assim como devi-do aos estímulos do crescimento de vasos por células inflamatórias ou ma-lignas. A angiogênese é também o processo através do qual os tumores oucondições inflamatórias derivam um suprimento de sangue através da gera-ção de microvasos.

A angiogênese é regulada em tecidos de câncer normais e ma-lignos pelo balanço dos estímulos angiogênicos e inibidores angiogênicosinibidores que são produzidos no tecido alvo e em sítios distantes (vide, Fi-dler et ai, [1998]; e McNamara et ai, [1998]). Fator de crescimento endoteli-al vascular-A (VEGF, também conhecido como fator de permeabilidade vas-cular, "VPF") é um estimulante primário de angiogênese. VEGF é uma cito-cina multifuntional que é induzida por hipoxia e mutações oncogênicas e po-de ser produzida por uma ampla variedade de tecidos (vide, Kerbel et ai,[1998]; e Mazure et ai, [1996]).O reconhecimento de VEGF como um estímulo primário de an-giogênese em condições patológicas tem levado a várias tentativas de blo-quear a atividade de VEGF. Anticorpos de receptor anti-VEGF inibidores,constructos de receptor solúveis, estratégias anti-sentido, aptâmeros de RNAcontra VEGF e inibidores de VEGF receptor tirosina quinase de peso mole-cular baixo (RTK) foram, todos, propostos para uso na interferência com asinalização de VEGF (vide, Siemeister et ai, [1998]). De fato, anticorposmonoclonais contra VEGF foram mostrados como inibindo o crescimento dexenoenxertos de tumor e a formação de ascitos em camundongos (vide, Kimet ai, [1993]; Asano et ai, [1998]; Mesiano et ai, [1998]; Luo et ai, [1998a] e[1998b]; e Borgstrom et ai, [1996] e [1998]).

RTKs compreendem uma grande família de receptores de trans-membrana para fatores de crescimento de polipeptídeo com atividades bio-lógicas diversas. A função intrínseca de RTKs é ativada quando da ligaçãodo ligando que resulta em fosforilação do receptor e substratos celularesmúltiplos e subseqüentemente em várias respostas celulares, (vide, Ullrich &Schlessinger, Cell 61:203-212 [1990]).

Angiogênese, envolvendo VEGF e RTKs não está somente en-volvida no desenvolvimento de câncer, como muitas outras doenças ou con-dições afetando diferentes sistemas fisiológicos são dependentes de angio-gênese, como artrite e placas ateroscleróticas (ossos e ligamentos) retinopa-tia diabética, glaucoma neovascular, degeneração macular, ocular, tracomae neovascularização de enxerto da córnea (olho), psoríase, escleroderma,rosácea, hemangioma e cicatrizes hipertróficas (pele), adesões vasculares eangiofibroma (sistema sangüíneo).

VEGF é um fator de angiogênese de principal importância para avascularização da pele (Detmar [2000]). A expressão de VEGF é reguladade modo positivo na epiderme hiperplásica de psoríase (Detmar e Yeo et ai[1995]), na cicatrização de feridas e em outras doenças caracterizadas porangiogênese melhorada (Detmar [2000], supra). A super-expressão marcadade VEGF na epiderme de camundongos trangênicos foi relatada como resul-tando em melhorada vascularização da pele com números iguais de vasossangüíneos tortuosos e vazados (Ver por exemplo, Brown et al. [1998]).Também, a síntese crônica de VEGF na pele de camundongos leva ao pri-meiro modelo de murinos histologicamente equivalente de psoríase humana(Xia et al. [2003]) que é reversível por agentes de ligação específicos paraVEGF.

Proteases estão envolvidas em vários processos biológicos. Aruptura do equilíbrio entre proteases e inibidores de protease é com freqüên-cia associada com destruição de tecido patológico. De fato, vários estudosfocalizaram o papel de proteases em dano ao tecido, e pensa-se que o equi-librio entre proteases e inibidores de protease é um determinante principalna manutenção da integridade do tecido. As serina proteases de células in-flamatórias, incluindo neutrófilos, estão implicadas em vários distúrbios in-flamatórios, como enfisema pulmonar, artrite, dermatite atópica e psoríase.

As proteases também parecem funcionar na difusão de algunscânceres. As células normais existem em contato com uma rede de proteínacomplexa, chamada a matriz extracelular (ECM). A ECM é uma barreira aomovimento de células e células de câncer devem projetar modos para rom-per suas fixações, degradar, e se movimentar através da ECM a fim de for-mar metástases. As proteases são enzimas que degradam outras proteínase auxiliam, como se pensa há muito tempo, na liberação das células de tu-mor de seu local original por mastigação da ECM. Estudos recentes sugeri-ram que elas podem promover mudanças de forma e motilidade através daativação de uma proteína na membrana da célula de tumor chamada recep-tor ativado por protease 2 (PAR2). Isto leva a uma cascata de reações intra-celulares que ativam o aparelho de motilidade da célula. Assim, formula-se ahipótese de que uma das primeiras etapas na metástase de tumor é umareorganização da forma celular, como que forma uma protrusão distinta emuma borda voltada para a direção de migração. A célula então migra atravésda parede do vaso sangüíneo e se movimenta para locais distais, eventual-mente refixando-se e formando um tumor metastático. Por exemplo, as célu-las epiteliais prostáticas humanas secretam, constitutivamente, antígeno es-pecífico de próstata (PSA), uma serina protease similar a calicreína, que éum componente normal do plasma seminal. A protease atua para degradar amatriz extracelular e facilitar a invasão de células cancerosas.

Os inibidores de protease sintéticos e naturais foram mostradospara inibir a promoção de tumor em vivo e em vitro. As investigações anteri-ores têm indicado que alguns inibidores de protease pertencendo a uma fa-mília de proteínas estruturalmente relacionadas classificadas como inibido-res de serina protease ou SERPINS, são conhecidos para inibir várias prote-ases incluindo tripsina, catepsina G, trombina, e calicreína de tecido, assimcomo elastase de neutrófilos. Os SERPINS são extremamente eficazes naprevenção / supressão de transformação induzida por carcinogenes em vitroe carcinogenese em sistemas de modelos de animais. A liberação sistêmicade inibidores de protease purificados aparentemente reduz a inflamação dasjuntas e também a destruição de ossos e cartilagem.

A administração tópica de inibidores de protease encontra usoem tais condições como dermatite atópica, uma forma comum de inflamaçãoda pele, que pode estar localizada em algumas porções ou envolver porçõesgrandes do corpo. A atividade de despigmentação de inibidores de proteasee sua capacidade de evitar a pigmentação induzida por ultra-violeta foramdemonstradas tanto em vitro como em vivo. (Ver por exemplo, Paine et ai.,J.Invest. Dermatol., 116:587-595 [2001]). Os inibidores de protease tambémforam relatados para facilitar a cicatrização de feridas. Por exemplo, inibidorde protease de leucócitos secretórios foram demonstrados como revertendoa destruição de tecido e acelerando o processo de cicatrização de feridasquando topicamente aplicado. Além disso, inibidores de serina também po-dem ajudar a reduzir a dor em pacientes com Iupus eritematoso (Ver por e-xemplo, Patente US N2 6537968).

O inibidor de protease Bowman-Birk (BBI) é uma designação deuma família de inibidores de enzima tripsina e quimotripsina de peso molecu-lar baixo, estáveis, encontrados em sojas e em outras sementes, principal-mente sementes Ieguminosas e materiais vegetais. BBI compreende umafamília de proteína ligadas a dissulfeto com um peso molecular de cerca de8 kD (Ver por exemplo, Chou et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 71:1748-1752[1974]; Yavelow et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:5395-5399 [1985]; eYavelow et al., Câncer Res. (Suppl.) 43:2454s-2459s [1983]). BBI tem umaestrutura pseudo-simétrica de dois domínios tricíclicos contendo, cada, umlaço nativo de ligação independente, o laços nativos contendo sítios de Iiga-ção tanto para tripsina como quimotripsina (vide, Liener, em Summerfield eBunting (eds), Advances em Legume Science. Royal Bot. Gardens, Kew1England). Estes sítios de ligação tem, cada, uma estrutura de laço canônico,que é um motivo encontrado em vários inibidores de serina proteinase (Bodee Huber, Eur. J. Biochem., 204:433-451 [1992]). Comumente, como em umdos inibidores de soja, um dos laços nativos inibe tripsina e os outros inibemquimotripsina (vide, Chen et al., J. Biol. Chem., 267:1990-1994 [1992]; Wer-ner & Wemmer, Biochem., 31:999-1010 [1992]; Lin et al., Eur. J. Biochem.,212:549-555 [1993]; e Voss et al., Eur. J. Biochem., 242:122-131 [1996]) a-pesar de em outros organismos (por exemplo, Arabidopsis), ambos os laçossão específicos para tripsina.

STI inibe a atividade proteolítica de tripsina pela formação de umcomplexo estequiométrico estável (Ver por exemplo, Liu, Chemistry and Nu-tritional Value of Soybean Components, In: Sovbeans. Chemistrv. Techno-logy and Utilization. pp. 32-35, Aspen Publishers, Inc., Gaithersburg, Md.,[1999]). STI consiste em 181 resíduos de aminoácidos com duas pontes dis-sulfeto e é de forma grosseiramente esférica (Ver por exemplo, Song et al.,J. Mol. Biol., 275:347-63 [1998]). O laço inibidor de tripsina está dentro daprimeira ponte dissulfeto. O inibidor de tripsina de soja de tipo Kunitz (STI)tem desempenhado um papel chave no estudo anterior de proteinases, ten-do sido usado como o substrato principal no trabalho bioquímico e cinéticoque levou à definição do mecanismo padrão de ação de inibidores de protei-nase.

Eglin C é uma proteína monomérica pequena que pertence àfamília de inibidor de quimotripsina de batata dos inibidores de serina prote-ase. As proteínas que pertencem a esta família são geralmente pequenas(60-90 resíduos de aminoácidos em comprimento) e não contém ligaçõesdissulfeto. Eglin C, no entanto, é altamente resistente à desnaturação poracidificação ou calor apesar da falta de ligações dissulfeto para ajudar a es-tabilizar sua estrutura terciária. A proteína ocorre naturalmente no parasitaHirudo medicinalis.

Como notado acima, inibidores de protease interferem com aação de proteases. Os inibidores de protease naturalmente ocorrendo po-dem ser encontrados em vários alimentos como grãos de cereais (aveia,cevada e milho), couve-de-bruxelas, cebolas, beterraba, trigo, painço miúdoe amendoim. Uma fonte de interesse é a soja. O nível médio de inibidores deprotease presentes em soja é em torno de 1,4 por cento e 0,6 por cento paraKunitz e Bowman-Birk respectivamente, dois dos mais importantes inibidoresde protease. Notavelmente, estes baixos níveis tornam impraticável isolar oinibidor de protease natural para aplicações clínicas e outras. De fato, ape-sar de muita pesquisa na arena de cuidado pessoal, permanece a necessi-dade na técnica para composições de cuidado pessoal que tem característi-cas desejadas sem modificação química indesejável das proteínas. Tambémpermanece a necessidade na técnica para um método de liberação de umaproteína em uma composição de cuidado pessoal de modo a eficazmenteliberar a proteína em uma forma utilizável.

Sumário da Invenção

A presente invenção provê peptídeos e peptídeos suportadospara tratar várias doenças e condições. Em modalidades particularmentepreferidas, a presente invenção provê composições e métodos de cuidadopessoal. Em algumas modalidades, a presente invenção provê composiçõespara uso em cuidado da pele e/ou do cabelo, assim como composiçõescosméticas. Em modalidades particularmente preferidas alternativas, a pre-sente invenção provê peptídeos e peptídeos suportados para tratar doençasda pele, como rosácea. Em algumas modalidades particularmente preferi-das, os peptídeos suportados da presente invenção são peptídeos anti-VEGF. Em modalidades particularmente preferidas alternativas, os peptí-deos anti-VEGF são expressados em uma proteína do esqueleto. Em algu-mas modalidades mais preferidas, a proteína do esqueletocompreende BBI.

Em algumas modalidades preferidas, a presente invenção provêcompostos cosméticos e/ou farmacêuticos apropriados para melhorar a apa-rência da pele. A presente invenção ainda provê peptídeos que bloqueiam aligação de uma proteína. Em algumas modalidades preferidas, a proteína éVEGF. Em algumas modalidades particularmente preferidas, o peptídeo éexpressado em um esqueletoresistente a protease. em algumas modalida-des especialmente preferidas, o esqueletoé um inibidor de protease (por e-xemplo, BBI, STI, ou inibidor de quimotripsina Elgin). Em algumas modalida-des mais preferidas, o inibidor de protease é BBI.

Em algumas modalidades, a presente invenção provê composi-ções de cuidado pessoal compreendendo um suporte de esqueleto, em queo esqueletocompreende pelo menos um inibidor de protease e pelo menosum peptídeo selecionado dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOS: 1-17.Em modalidades alternativas, qualquer uma das seqüências de peptídeosadicionais providas aqui encontram uso na presente invenção. Em outrasmodalidades, seqüências adicionais encontram uso na presente invenção,incluindo mas não limitadas a SEQ ID NOS:20-25, 31, 32-34, 43, e 238. Emainda outras modalidades, pelo menos uma seqüência de peptídeos é sele-cionada dentre o grupo consistindo em YNLYGWT (SEQ ID NO:1), KY-YLYWW (SEQ ID NO:239), WYTLYKW (SEQ ID N0:240), TYRLYWW (SEQID NO:241), RYSLYYW (SEQ ID NO:242), YYLYYWK (SEQ ID NO:243),NYQLYGW (SEQ ID NO:244), TLWKSYW (SEQ ID NO:245), TKWPSYW(SEQ ID NO:246), PLWPSYW (SEQ ID NO:247), RLWPSYW (SEQ IDNO:248), TLWPKYW (SEQ ID NO:249), KYDLYWW (SEQ ID NO:33), RY-DLYWW (SEQ ID N0:250), DYRLYWW (SEQ ID NO:251), DYKLYWW (SEQID NO:34), EYKLYWW (SEQ ID NO:252), e RYPLYWW (SEQ ID NO:253).Em algumas modalidades particularmente preferidas, a seqüência de peptí-deos compreende o motivo especificado em SEQ ID NO:31. Em ainda outrasmodalidades, o esqueletocompreende uma seqüência de aminoácidos sele-cionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOS:22-25.

Em outras modalidades adicionais, o inibidor de protease é sele-cionado dentre o grupo consistindo em inibidor de Bowman-Birk, inibidor detripsina de soja, e inibidor de quimotripsina Elgin. Em algumas modalidadesparticularmente preferidas, o inibidor de Bowman-Birk é um inibidor modifi-cado de Bowman-Birk. Em outras modalidades, o esqueletocompreende decerca de 0,001 por cento, em peso, a cerca de 5 por cento, em peso, dacomposição de cuidado pessoal, enquanto em modalidades alternativas, oesqueletocompreende de cerca de 0,01 por cento, em peso, a cerca de 2,0por cento, em peso, da composição de cuidado pessoal, e em outras moda-lidades adicionais, o esqueletocompreende de cerca de 0,01 por cento, empeso, a cerca de 1 por cento, em peso, da composição de cuidado pessoal.

A presente invenção também provê composições de cuidadopessoal compreendendo composições de cuidado da pele. Em algumas mo-dalidades preferidas, as composições de cuidado da pele são selecionadasdentre o grupo consistindo em cremes para pele, loções, pulverizações, e-mulsões, suspensões coloidais, espumas, aerossóis, líquidos, géis, soros, esólidos. Em modalidades adicionais, as composições de cuidado da pele sãolíquidos umectantes de limpeza corporal, líquidos de limpeza corporal, lim-padores antimicrobianos, cremes protetores da pele, loções corporais, cre-mes faciais, cremes umectantes, emulsões de limpeza facial, géis faciais,soros faciais, limpadores faciais à base de tensoativos, géis esfoliantes faci-ais, tratamentos antiacne, tonalizantes faciais, cremes esfoliantes, máscarasfaciais, bálsamos pós-barba, bálsamos pré-barba, composições de bronze-amento, composições de clareamento da pele, composições redutoras devermelhidão da pele, filtros solares, depilatórios, inibidores do crescimentode cabelo, e radioprotetores. Em modalidades adicionais, as composiçõesde cuidado da pele compreendem composições aplicadas topicamente, devenda direta, tratamentos antifungos, tratamentos antiacne, protetores dapele, filtros solares, desodorantes, e antiperspirantes.

Em algumas modalidades preferidas, as composições de cuida-do da pele são capazes de clarear a tonalidade da pele, enquanto em moda-lidades alternativas as composições de cuidado da pele são capazes de re-duzir a vermelhidão na tonalidade da pele. Em ainda outras modalidades, ascomposições de cuidado da pele são capazes de evitar o escurecimento datonalidade da pele, enquanto em modalidades adicionais, as composiçõesde cuidado da pele são capazes de evitar o desenvolvimento da cor da pele.

Em algumas modalidades preferidas, as composições de cuidado da pelesão radioprotetoras. Em modalidades alternativas, as composições de cui-dado da pele compreendem pelo menos um radioprotetor. Em algumas mo-dalidades particularmente preferidas, os radioprotetores são selecionadosdentre o grupo consistindo em filtros solares. Em algumas modalidades maispreferidas, o filtros solares são selecionados dentre filtros solares não resis-tentes à água, filtros solares muito resistentes à água, e filtros solares água-em-silicone.

A presente invenção também provê composições de cuidadopessoal que são capazes de evitar o crescimento de cabelo. Em algumasmodalidades, o cabelo é selecionado dentre o grupo consistindo em cabelofacial, pêlos das pernas, pêlos do braço, e pêlos do torso.

A presente invenção também provê composições de cuidadopessoal que são composições de cuidado do cabelo. Em algumas modalida-des, a composição de cuidado do cabelo é selecionada dentre o grupo con-sistindo em xampus, condicionadores, composições para modelar o pentea-do do cabelo, colorantes para cabelo, formulações de ondas permanentes,cremes, géis, espumas, pulverizações, emulsões, suspensões coloidais, lí-quidos, espumas, e sólidos. Em outras modalidades, as composições decuidado do cabelo compreendem pelo menos um radioprotetor. Em algumasmodalidades preferidas, o radioprotetor é um filtro solar selecionado dentrefiltros solares não resistentes à água, filtros solares muito resistentes à água,e filtros solares água-em-silicone. Em algumas modalidades, a composiçãode cuidado do cabelo é radioprotetor.

A presente invenção ainda provê composições de cuidado pes-soal que são composições de cuidado oral. Em algumas modalidades prefe-ridas, as composições de cuidado oral são selecionadas dentre o grupo con-sistindo em pastas de dentes, géis de dentes, colutórios, líquidos para lim-peza oral, composições anticáries, composições de branqueamento dosdentes, gomas de mascar, adesivos para dentaduras, e refrescantes bucais.

A presente invenção também provê composições de cuidadopessoal que são composições cosméticas. Em algumas modalidades prefe-ridas, as composições cosméticas são selecionadas dentre géis para os o-Ihos, sombras para os olhos, batons de ponto de derretimento elevado, ba-tons, brilhos para os lábios, bálsamos para os lábios, rimei, lápis para osolhos, formulações de pó compacto, e bases. Em algumas modalidades pre-feridas, as composições de maquiagem compreendem pelo menos um pigmento.

Em algumas modalidades preferidas, a composição de maquia-gem compreendendo pelo menos um pigmento é um rimei selecionado den-tre rimei não à prova d'água, rimei à prova d'água, rimei avolumador, rimeiextensor, rimei enrolador, rimei anidro à prova d'água, rimei à base d'água,e tratamentos dos cílios e sobrancelhas.

Em outras modalidades adicionais, as composições de maquia-gem são formulações de pó compacto selecionadas dentre pós soltos, blu-shes, sombras para os olhos, e pós de bronzeamento. Em ainda outras mo-dalidades, as composições de maquiagem são bases selecionadas dentrebases água-em-óleo, bases água-em-silicone, bases óleo-em-água, bastõesanidros para maquiagem, e bases creme-a-pó.

A presente invenção ainda prove composições de cuidado pes-soal tendo um suporte de esqueleto, em que o esqueletocompreende a se-qüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO:19. Em modalidadesadicionais, o esqueletoainda compreende a seqüência de aminoácidos (s)especificada em SEQ ID NOS:20 e/ou 21. Em modalidades alternativas, aseqüência de aminoácidos (s) especificada em SEQ ID NOS: 20 e/ou 21é/são substituída(s) por pelo menos um peptídeo tendo uma seqüência deaminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOS:1-17.

Em modalidades alternativas, qualquer uma das seqüências de peptídeosprovidas aqui encontra uso como uma substituição de SEQ ID NOS:20 e/ou21. Em modalidades alternativas, qualquer uma das seqüências de peptí-deos adicionais providas aqui encontra uso na presente invenção. Em outrasmodalidades, seqüências adicionais encontram uso na presente invenção,incluindo mas não limitadas a SEQ ID NQS:20-25, 31, 32-34, 43, e 238. Emainda outras modalidades, a pelo menos uma seqüência de peptídeos é se-lecionada dentre o grupo consistindo em YNLYGWT (SEQ ID NO:1), KY-YLYWW (SEQ ID NO:239), WYTLYKW (SEQ ID N0:240), TYRLYWW (SEQID NO:241), RYSLYYW (SEQ ID NO:242), YYLYYWK (SEQ ID NO:243),NYQLYGW (SEQ ID NO:244), TLWKSYW (SEQ ID NO:245), TKWPSYW(SEQ ID NO:246), PLWPSYW (SEQ ID NO:247), RLWPSYW (SEQ IDNO:248), TLWPKYW (SEQ ID NO:249), KYDLYWW (SEQ ID NO:33), RY-DLYWW (SEQ ID N0:250), DYRLYWW (SEQ ID NO:251), DYKLYWW (SEQID NO:34), EYKLYWW (SEQ ID NO:252), e RYPLYWW (SEQ ID NO:253).

Em algumas modalidades particularmente preferidas, a seqüência de peptí-deos compreende o motivo especificado em SEQ ID NO:31. Em ainda outrasmodalidades, o esqueletocompreende uma seqüência de aminoácidos sele-cionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOS:22-25.

A presente invenção também provê métodos para fabricar ascomposições de cuidado pessoal da presente invenção, compreendendocombinar uma quantidade efetiva do esqueletoe pelo menos um veículo ouexcipiente fisiologicamente aceitável.

A presente invenção ainda provê métodos para modificar a tona-lidade da pele de um indivíduo, compreendendo as etapas de: prover pelomenos uma composição compreendendo a composição de cuidado pessoalda presente invenção; ii) prover um indivíduo a ser tratado; e aplicar a com-posição ao indivíduo em uma área em que modificações na tonalidade dapele do indivíduo é desejada. Em algumas modalidades, a modificação datonalidade da pele compreende clarear a tonalidade da pele do indivíduo.

Em algumas modalidades alternativas, a modificação da tonalidade da pelecompreende reduzir a vermelhidão na tonalidade da pele do indivíduo. Emoutras modalidades adicionais, os métodos compreendem a composição decuidado pessoal compreendendo a seqüência de aminoácidos especificadaem SEQ ID NO:19. Em modalidades alternativas dos métodos, a composi-ção de cuidado pessoal compreende pelo menos uma das seqüências deaminoácidos especificada em SEQ ID NOS:20 e 21. Em ainda outras moda-lidades dos métodos, pelo menos uma das seqüências de aminoácidos es-pecificada em SEQ ID N0S:2Ü e 21 é substituída por pelo menos um peptí-deo tendo uma seqüência de aminoácidos selecionada dentre o grupo con-sistindo em SEQ ID NOS:1-17. Em modalidades alternativas, qualquer umadas seqüências de peptídeos adicionais providas aqui encontra uso comouma substituição de SEQ ID NOS:20 e/ou 21. Em outras modalidades, se-qüências adicionais encontram uso na presente invenção, incluindo mas nãolimitadas a SEQ ID NOS:20-25, 31, 32-34, 43, e 238. Em ainda outras moda-lidades, a pelo menos uma seqüência de peptídeos é selecionada dentre ogrupo consistindo em YNLYGWT (SEQ ID NO:1), KYYLYWW (SEQ IDNO:239), WYTLYKW (SEQ ID N0:240), TYRLYWW (SEQ ID NO:241),RYSLYYW (SEQ ID NO:242), YYLYYWK (SEQ ID NO:243), NYQLYGW(SEQ ID NO:244), TLWKSYW (SEQ ID NO:245), TKWPSYW (SEQ IDNO:246), PLWPSYW (SEQ ID NO:247), RLWPSYW (SEQ ID NO:248),TLWPKYW (SEQ ID NO:249), KYDLYWW (SEQ ID NO:33), RYDLYWW(SEQ ID N0:250), DYRLYWW (SEQ ID NO:251), DYKLYWW (SEQ IDNO:34), EYKLYWW (SEQ ID NO:252), e RYPLYWW (SEQ ID NO:253). Emalgumas modalidades particularmente preferidas, a seqüência de peptídeoscompreende o motivo especificado em SEQ ID NO:31. Em ainda outras mo-dalidades, o esqueletocompreende uma seqüência de aminoácidos selecio-nada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOS:22-25.

A presente invenção também provê métodos para modificar ocrescimento de cabelo de um indivíduo, compreendendo as etapas de: pro-ver a composição de cuidado pessoal da presente invenção; prover um indi-víduo a ser tratado; e aplicar a composição ao indivíduo em uma área emque modificações no crescimento de cabelo do indivíduo são desejadas. Emalgumas modalidades, a modificação do crescimento de cabelo compreendeinibir o crescimento de cabelo do indivíduo, em que o cabelo a ser inibido éselecionado dentre o grupo consistindo em cabelo facial, pêlos das axilas,pêlos das pernas, pêlos do torso, e pêlos do braço, e cabelo da cabeça. Emoutras modalidades adicionais, os métodos compreendem a composição decuidado pessoal compreendendo a seqüência de aminoácidos especificadaem SEQ ID NO:19. Em modalidades alternativas dos métodos, a composi-ção de cuidado pessoal compreende pelo menos uma das seqüências deaminoácidos especificada em SEQ ID NOS:2(3 e 21. Em ainda outras moda-lidades dos métodos, pelo menos uma das seqüências de aminoácidos es-pecificada em SEQ ID NOS:20 e 21 é substituída por pelo menos um peptí-deo tendo uma seqüência de aminoácidos selecionada dentre o grupo con-sistindo em SEQ ID NOS: 1-17. Em algumas modalidades alternativas, qual-quer uma das seqüências de peptídeos adicionais providas aqui encontrauso como uma substituição de SEQ ID NOS:20 e/ou 21. Em outras modali-dades, seqüências adicionais encontram uso na presente invenção, incluin-do mas não limitadas a SEQ ID NOS:20-25, 31, 32-34, 43, e 238. Em aindaoutras modalidades, a pelo menos uma seqüência de peptídeos é selecio-nada dentre o grupo consistindo em YNLYGWT (SEQ ID NO:1), KYYLYWW(SEQ ID NO:239), WYTLYKW (SEQ ID N0:240), TYRLYWW (SEQ IDNO:241), RYSLYYW (SEQ ID NO:242), YYLYYWK (SEQ ID NO:243), NY-QLYGW (SEQ ID NO:244), TLWKSYW (SEQ ID NO:245), TKWPSYW (SEQID NO:246), PLWPSYW (SEQ ID NO:247), RLWPSYW (SEQ ID NO:248),TLWPKYW (SEQ ID NO:249), KYDLYWW (SEQ ID NO:33), RYDLYWW(SEQ ID N0:250), DYRLYWW (SEQ ID NO:251), DYKLYWW (SEQ IDNO:34), EYKLYWW (SEQ ID NO:252), e RYPLYWW (SEQ ID NO:253). Emalgumas modalidades particularmente preferidas, a seqüência de peptídeoscompreende o motivo especificado em SEQ ID NO:31. Em ainda outras mo-dalidades, o esqueletocompreende uma seqüência de aminoácidos selecio-nada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOS:22-25.

Em algumas modalidades, a presente invenção provê compos-tos cosméticos e/ou farmacêuticos para melhorar a aparência da pele com-preendendo pelo menos um polipeptídeo ou um peptídeo. Em algumas mo-dalidades preferidas, o polipeptídeo ou peptídeo liga a VEGF. Em modalida-des alternativas, a ligação do polipeptídeo ou peptídeo a VEGF bloqueia aatividade a jusante do VEGF. Em algumas modalidades, os compostos com-preendem pelo menos um peptídeo, enquanto em outras modalidades, oscompostos compreendem pelo menos um polipeptídeo. Em algumas modali-dades preferidas, o peptídeo tem uma seqüência de aminoácidos seleciona-da dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOS:1-17. Em ainda outras moda-lidades, o peptídeo tem uma seqüência de aminoácidos selecionada dentreo grupo consistindo em KYDLYWW (SEQ ID NO:33) e DYKLYWW (SEQ IDNO:34). Em modalidades preferidas adicionais, o peptídeo tem uma seqüên-cia de ligação conservada, a seqüência sendo XXLWPXWC (SEQ IDNO: 15). Em algumas modalidades preferidas, a seqüência compreende SEQID NO: 15. Em outras modalidades, a seqüência compreende uma seqüênciade aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOS:1-17. Em outras modalidades, a seqüência compreende uma seqüência deaminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOS:22-25.

Em modalidades preferidas alternativas, os compostos têm uma seqüência,a seqüência sendo pelo menos 70%, preferivelmente 80%, mais preferivel-mente 90%, e o mais preferivelmente 95% homóloga com as seqüênciasespecificadas aqui. Em algumas modalidades preferidas, o polipeptídeo temum peso molecular que está preferivelmente entre 500 Dáltons e 30.000 Dál-tons, mais preferivelmente entre 1000 Dáltons e 10.000 Dáltons, e o maispreferivelmente de 1500 Dáltons a 8.000 Dáltons.

Em algumas modalidades preferidas, os compostos encontramuso na melhora da pele em um organismo (isto é, indivíduo) tendo um dis-túrbio de pele. Em algumas modalidades preferidas, o distúrbio de pele é umdistúrbio de pele angiogênico. Em modalidades preferidas adicionais, o dis-túrbio de pele é pelo menos um selecionado dentre o grupo consistindo empsoríase, úlceras vénosas, acne, rosácea, verrugas, eczema, hemangiomase linfangiogênese, etc. Em algumas modalidades particularmente preferidas,o distúrbio de pele é rosácea.

Em outras modalidades preferidas, a presente invenção provêcompostos cosméticos e/ou farmacêuticos para melhorar a aparência dapele. Nestas modalidades preferidas, os compostos compreendem pelo me-nos um peptídeo ou polipeptídeo e pelo menos um suporte de esqueleto, opeptídeo ou polipeptídeo sendo expressados no suporte de esqueleto. Emalgumas modalidades particularmente preferidas, o pelo menos um peptídeoou polipeptídeo é um laço. Em outras modalidades particularmente preferi-das, o laço é fechado por uma ligação dissulfeto. Em algumas modalidadespreferidas, o polipeptídeo ou peptídeo liga a VEGF. Em modalidades alterna-tivas, a ligação do polipeptídeo ou peptídeo em VEGF bloqueia a atividade ajusante do VEGF. Em algumas modalidades particularmente preferidas, opeptídeo é expressado em um esqueletoresistente a protease. Em algumasmodalidades especialmente preferidas, o esqueletoé um inibidor de protease(por exemplo, BBI, STI, ou inibidor de quimotripsina Elgin). Em algumas mo-dalidades mais preferidas, o inibidor de protease é BBI.

Em algumas modalidades preferidas, os compostos ainda com-preendem pelo menos um peptídeo. Preferivelmente, o peptídeo tem umaseqüência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQID NOS: 1-17. O mais preferivelmente, os compostos compreendem umaseqüência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQID NOS.22-25. Em algumas modalidades preferidas, o peptídeo tem umaseqüência de ligação conservada, a seqüência sendo XXLWPXWC (SEQ IDNO: 15). Em algumas modalidades preferidas, os compostos têm uma se-qüência, a seqüência sendo pelo menos 70%, preferivelmente 80%, maispreferivelmente 90%, e o mais preferivelmente 95% idêntica às seqüênciasespecificadas aqui. O peso molecular do peptídeo está preferivelmente entre500 Dáltons e 45,000 Dáltons, mais preferivelmente entre 1000 Dáltons e12,000 Dáltons, e o mais preferivelmente de 1500 Dáltons a 10.000 Dáltons.

Em algumas modalidades preferidas, os compostos compreendem pelo me-nos um polipeptídeo.

A presente invenção provê composições compreendendo pelomenos um peptídeo selecionado dentre o grupo consistindo em SEQ IDNOS:1-17, em que o peptídeo liga a um fator de crescimento endotelial vas-cular. Em algumas modalidades preferidas, o peptídeo é expressado em umesqueletoresistente a protease. Em modalidades preferidas alternativas, oesqueletocompreende um inibidor de protease. Em algumas modalidadesmais preferidas, o inibidor de protease é selecionado dentre o grupo consis-tindo em inibidor de Bowman-Birk, inibidor de tripsina de soja, e inibidor dequimotripsina Elgin. Em algumas modalidades mais preferidas, o esqueletoéinibidor de Bowman-Birk. Em ainda outras modalidades, o esqueletoresisten-te a protease e o peptídeo compreendem uma proteína de fusão. Em algu-mas modalidades particularmente preferidas, a composição compreendeuma seqüência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo emSEQ ID NOS:22-25. Em modalidades adicionais, o esqueletocompreende aseqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO:19. Em ainda outrasmodalidades, o esqueletocompreende pelo menos uma das seqüências deaminoácidos especificada em SEQ ID NOS:2C) e 21. Em outras modalidadesadicionais, pelo menos uma das seqüências de aminoácidos especificadaem SEQ ID NOS:20 e 21 é substituída por pelo menos um peptídeo tendouma seqüência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo emSEQ ID NOS: 1-17.

A presente invenção também provê composições cosméticase/ou farmacêuticas compreendendo o, pelo menos, um peptídeo que liga aum fator de crescimento endotelial vascular. Em algumas modalidades, acomposição é capaz de modular a angiogênese. Em modalidades adicionais,a composição ainda compreende um esqueletocompreendendo um inibidorde protease. Em algumas modalidades preferidas, o inibidor de protease éselecionado dentre o grupo consistindo em inibidor de Bowman-Birk, inibidorde tripsina de soja, e inibidor de quimotripsina Elgin. Em algumas modalida-des preferidas, o esqueletoé inibidor de Bowman-Birk. Em algumas modali-dades particularmente preferidas, o esqueletocompreende a seqüência deaminoácidos especificada em SEQ ID NO:19. Em algumas modalidades al-ternativas, o esqueletocompreende pelo menos uma das seqüências de a-minoácidos especificada em SEQ ID NOS:2() e 21. Em modalidades aindapreferidas, pelo menos uma das seqüências de aminoácidos especificadaem SEQ ID NOS:20 e 21 é substituída por pelo menos um peptídeo tendouma seqüência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo emSEQ ID NOS:1-17.

A presente invenção também provê métodos para modular angi-ogênese compreendendo : i) prover uma composição compreendendo umpeptídeo contido dentro de um suporte de esqueleto; ii) prover um indivíduoa ser tratado; e iii) aplicar a composição ao indivíduo em uma área em quemodulação de angiogênese é desejada. Em algumas modalidades, o peptí-deo liga a um fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Em algumasmodalidades preferidas, o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) éVEGF-A. Em modalidades ainda preferidas, o esqueletoé selecionado dentreo grupo consistindo em inibidor de Bowman-Birk, inibidor de tripsina de soja,e inibidor de quimotripsina Elgin. Em algumas modalidades particularmentepreferidas, o esqueletoé inibidor de Bowman-Birk. Em algumas outras moda-lidades, o esqueletocompreende a seqüência de aminoácidos especificadaem SEQ ID NO: 19. Em ainda outras modalidades, o esqueletocompreendepelo menos uma das seqüências de aminoácidos especificada em SEQ IDNOS:20 e 21. Em algumas modalidades particularmente preferidas, pelomenos uma das seqüências de aminoácidos especificada em SEQ IDNOS:20 e 21 é substituída por pelo menos um peptídeo tendo uma seqüên-cia de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ IDNOS:1-17. Em modalidades ainda mais particularmente preferidas, o esque-Ietoe o peptídeo são codificados por uma seqüência de aminoácidos sele-cionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOS:22-25.

A presente invenção também provê métodos para diminuir a ati-vidade de um fator de crescimento endotelial vascular compreendendo asetapas de: i) prover um indivíduo; e ii) administrar a composição compreen-dendo pelo menos um peptídeo que liga ao fator de crescimento endotelialvascular ao indivíduo, sob condições tais que a atividade do fator de cresci-mento endotelial vascular é diminuída. Em algumas modalidades, o fator decrescimento endotelial vascular (VEGF) é VEGF-A. Em algumas modalida-des particularmente preferidas, a composição compreende uma seqüênciade aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOS:22-25.

Em algumas modalidades preferidas adicionais, os compostossão usados para a melhora da pele em um organismo (isto é, um indivíduo)tendo um distúrbio de pele. Em modalidades preferidas adicionais, o distúr-bio de pele é pelo menos um selecionado dentre o grupo consistindo empsoríase, úlceras venosas, acne, rosácea, verrugas, eczema, hemangiomase linfangiogênese, etc. Em algumas modalidades particularmente preferidas,o distúrbio de pele é rosácea.

Em ainda outras modalidades, a presente invenção provê com-posições cosméticas e/ou farmacêuticas compreendendo pelo menos umpolipeptídeo ou peptídeo, como especificado aqui, e um veículo ou excipien-te fisiologicamente aceitável. Preferivelmente, o composto está presente emuma quantidade de cerca de 0,0001% a cerca de 5% em peso com base nopeso total da composição. Também preferivelmente, o composto está pre-sente em uma quantidade de cerca de 0,001% a cerca de 0,5% em pesocom base no peso total da composição. Composição pode estar na forma deum veículo emulsificado, como um creme ou loção nutriente, um gel estabili-zado ou sistema de dispersão, um soro de tratamento, um sistema de distri-buição lipossomal, uma máscara ou porção tópica, um sistema de limpeza àbase de tensoativos como um xampu ou líquido de limpeza corporal, umadispersão ou emulsão aerossolizada ou pulverizada, um condicionador dapele ou cabelo, auxiliar de penteado, ou um produto pigmentado como ma-quiagem, assim como outras preparações de maquiagem e cosméticas a-propriadas. Em algumas modalidades, o veículo é preferivelmente pelo me-nos um selecionado dentre o grupo consistindo em água, propileno glicol,etanol, propanol, glicerol, butileno glicol e polietileno glicol.

Em ainda outras modalidades, a presente invenção provê meiospara diminuir a atividade e/ou níveis de VEGF. Em algumas modalidadespreferidas, a atividade e/ou níveis de VEGF são diminuídos na epiderme. Emalgumas modalidades, o método compreende aplicar uma quantidade efetivade pelo menos um dos compostos como aqui descritos em um organismoem necessidade do mesmo.

Em modalidades adicionais, a presente invenção provê aplica-ções para o tratamento de cabelo e/ou da pele, assim como aplicações cica-trização de feridas, tratamento de doenças proliferativas, etc. Assim, a pre-sente invenção provê composições e métodos apropriados para aplicaçãoem/ sobre seres humanos e outros animais.Descrição das Figuras

Figura 1 apresenta um resumo de seqüências de clones de fa-gos de ligação a VEGF (SEQ ID NOS: 1-12). Vinte e quatro clones de fagosforam seqüenciados após 3 ciclos de bateia. A árvore de alinhamento deseqüência indica um motivo de seqüência altamente conservado AC-XLWPXXWC (SEQ ID NO: 14). O número em parênteses representa a fre-qüência da seqüência dentro dos 24 clones seqüenciados após o terceirociclo de triagem por bateia.

Figura 2 apresenta resultados de um ELISA de fagos para de-monstrar a ligação de clones únicos para VEGF e não para BSA. Equivalen-tes quantidades de fagos foram avaliados para determinar sua afinidade deligação relativa para hVEGFi65- O número de clone e a seqüência randomi-zada (SEQ ID NOS:1-7, e 13) são indicados abaixo cada símbolo. Os fagosligados a marcação foram detectados com anti-M13-HRP. O HRP foi monito-rado com substrato ABTS em um A4OSnm após 30 minutos (n=3).

Figura 3 apresenta resultados de uma análise de ligação BIA-CORE de peptídeo de ligação a VEGF. As curvas de ligação foram obtidoscomo descrito em Exemplos. Dados foram configurados a um modelo dereação de dois estados com mudança conformacional: Análito (A) liga a Ii-gando (B) para formar complexo AB. Complexo AB muda para AB* que nãopode dissociar diretamente em A + B. Painel A apresenta resultados parapeptídeo biotinilado CK37281. ka1=2,84e3 M"1s"1, kd1=0,0122 s"1, ka2=1,5e-3 s"1kd2=3,36e'3 s"1 KD=1,92e"6 M. Painel B apresenta resultados para CK37283(6000 RU VEGF, 3500 RU TNFa sem tampão somente subtração);ka1=1,24e4 M1S1, kd1=0,318 s"1, ka2=6,34e-3 s"1· kd2=1,23e'3 s"1 KD=4,90e'6M. Painel C apresenta resultados para peptídeo de controle v114 (1000 RUVEGF, 850 RU TNFa. Dados foram configurados para 1:1 ligação Langmuirka1=7,51e5 IVT1S"1 kd1=0,167 S1 KD=2,23e"7 M.

Figura 4 apresenta mapas de plasmídeo usados nos Exemplos.Painel A apresenta o mapa para fagomídeo de expressão de pCB04WT paraexpressão de beta-lactamase etiquetada His6X C-terminal. Painel B apre-senta o mapa para fagomídeo stuffer pME22 N-terminal para clonagem u-sando sítios de restrição Bbs1. Painel C apresenta o mapa para fagomídeode expressão de fusão pCM01 N-terminal aVEGF-BLA.

Figura 5 apresenta um resumo da estratégia de clonagem defusão N-terminal usando sítios de clonagem Bbsl (SEQ ID NOS:227-237).

Figura 6 apresenta um gel SDS-PAGE de fusões de beta-lactamase purificado de etiqueta His com peptídeos. Versões de BLA purifi-cadas com IMAC e diferentes peptídeos foram concentrados e carregadossobre um gel SDS PAGE (4-12%). Trilhas 1 & 10: marcadores MW. Trilha 2:pCB04 (WT com etiqueta 6Xhis); Trilhas 3,4,5,6: pCM01 um esqueletodeproteína de fusão N-terminal VEGF-BLA e Trilhas 7,8: proteína de fusãopCM02 a quimotripsina-BLA N-terminal.

Figura 7 apresenta um gráfico mostrando que a fusão aVEGFpeptídeo-BLA liga especificamente a VEGF. Concentrações aumentadas depCM01 (fusão de peptídeo aVEGF -BLA) e pCB04 (WT) foram adicionadas acavidades revestidas com VEGF de uma placa de microtitulação. A atividadede nitrocefina ligada residual foi medida após lavagem 5X com tampão deteste de nitrocefina (0,125% n-octil-beta-D-glucopiranosídeo em PBS).

Figura 8 apresenta um gráfico mostrando inibição de proliferaçãode HUVEC induzida por VEGF por peptídeo anti-VEGF (círculos cheios).Proliferação foi monitorada por incorporação radioativa de 3H timidina (n =3). Anticorpo anti-VEGF (círculos abertos) foi usado como um controle posi-tivo, como descrito nos Exemplos.

Figura 9 apresenta o gene BBI e seqüências de aminoácidos(SEQ ID NOS: 18 e 19, respectivamente) projetados para eficiente clonagem.Esta seqüência compreende o cassete de expressão usado em E.coli. Elacodifica a proteína pro-BBI com uma etiqueta C-terminal His e tem seqüên-cias extras nas extremidades 5' e 3' para clonagem no vetor de expressãode E. coli. A seqüência de sinal de proteína está em itálico enquanto o laçode tripsina (CTKSNPPQC; SEQ ID N0:20) e o laço de quimotripsina(CALSYPAQC; SEQ ID NO:21) são realçados em negrito e em caixas.

Figura 10 apresenta um gel SDS PAGE mostrando resultados dereduplicação de BBI anti-VEGF. BBI anti-VEGF foi reduplicado na presençaou ausência de subtilisina BPN' Y217L. As trilhas são as seguintes: Trilha 1:tampão de reduplicação Hampton Foldit 11, -subtilisina; Trilha 2: tampão dereduplicação Hampton Foldit 11, +subtilisina: Trilha 3: tampão de reduplica-ção Hampton Foldit 13, -subtilisina; Trilha 4, tampão de reduplicação Hamp-ton Foldit 13, + subtilisina; e Trilha 5, marcadores de peso molecular.

Figura 11 apresenta um gráfico mostrando que BBI-VEGF1(SEQ ID NO:22) liga especificamente a VEGF.

Figura 12 apresenta um gráfico mostrando resultados HUVECpara peptídeos projetados.

Figura 13 apresenta seqüências de três fusões de BBI-VEGF,BBI-VEGF1 (SEQ ID NO:22), BBI-VEGF2 (SEQ ID NO:23) e BBI-VEGF12(SEQ ID NO:24). Fusões BBI-VEGF1 e BBI-VEGF2 tem somente um doslaços de ligação substituído, fusão BBI-VEGF12 tem ambos os laços de liga-ção substituídos.

Figura 14 apresenta as seqüências de DNA e de aminoácidos docassete de expressão aprE-BCE103-BBI-Histag (EcoR\-Hinà\\\) clonado novetor de integração pJM103 (SEQ ID NOS:35 e 36).

Figura 15 apresenta uma mapa esquemático do vetor de ex-pressão de pJM103BBIhis.

Figura 16 apresenta as seqüências de DNA e de aminoácidos de12BBIck81do sítio de fusão BCE103 (em BamH\) na extremidade do gene(SEQ ID NOS:37 e 38). As seqüências CK37281 de peptídeos (ACYN-LYGWTC (SEQ ID NO:43)) são inseridas tanto nos laços inibidores de tripsi-na como de quimotripsina.

Figura 17 apresenta um gráfico mostrando títulos de 2BBIck81ativos versus inativos (por inibição de tripsina) e a relação das atividades deBCE103 celulase para 2BBck81 com vários agentes redutores de tiol adicio-nados durante o crescimento da cultura. Nesta Figura, BME = 2-mercaptoetanol, Cyt = cisteína, Glut = glutationa reduzida, DTT = ditiotreitol).

Figura 18 apresenta um gráfico mostrando ativação de BCE-lnk2-2BBIck81 com 2-mercaptoetanol (bME) após a purificação parcial porcromatografia de troca tônica.Figura 19 apresenta um gráfico mostrando resultados de umaanálise de competição de 2BBIck81 versus ligação de anticorpo anti-VegFpara VegF.

Figura 20 apresenta a seqüência do fragmento de DNA sintéticotransportando H. insolens PDI-(hiPDI) que foi inserido no vetor de expressão deB. subtilis BBI1 assim como a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NOS:39 e 40)Figura 21 apresenta as seqüências de DNA e de aminoácidos doaprE-cutinase cassete de expressão que foi ligado nos sítios EcoRI-SamHIde p2JM103-lnk2-2BBIck81 (SEQ ID NOS:41 e 42).

Descrição da Invenção

A presente invenção provê peptídeos e peptídeos suportadospara tratar várias doenças e condições. Em modalidades particularmentepreferidas, a presente invenção provê composições e métodos de cuidadopessoal. Em algumas modalidades, a presente invenção provê composiçõespara uso em cuidado da pele e/ou do cabelo, assim como composiçõescosméticas. Em modalidades particularmente preferidas alternativas, a pre-sente invenção provê peptídeos e peptídeos suportados para tratar doençasda pele, como rosácea. Em algumas modalidades particularmente preferi-das, os peptídeos suportados da presente invenção são peptídeos anti-VEGF. Em modalidades particularmente preferidas alternativas, os peptí-deos anti-VEGF são expressados em uma proteína do esqueleto. Em algu-mas modalidades mais preferidas, o proteína esqueletocompreende BBI.

Como descrito em maiores detalhes aqui, a presente invençãoprovê composições para uso em numerosos aspectos de cuidado pessoal,incluindo mas não limitadas cuidado do cabelo e pele, assim como cosméti-cos (por exemplo, maquiagem). Por exemplo, a presente invenção provêcomposições que encontram uso em cuidado pessoal diário, cuidado da pe-le, cuidado do sol (por exemplo, filtros solares, assim como bronzeadores),cuidado do cabelo (por exemplo, xampus, condicionadores com e sem en-xágüe, tônicos para cabelo, pulverizações para cabelo, géis, espumas, es-pumas, produtos para fixar, colorantes para cabelo, formulações permanen-tes, outros produtos de limpeza e para modelar o penteado, etc.), cuidadoapós a exposição ao sol à pele, cabelo e lábios, cuidado oral (por exemplo,pastas de dentes e géis, líquidos para limpeza oral, enxágües, etc.), banhos(por exemplo, líquidos de lavagem, sabões para chuveiro, sabões para ba-nho, sais, pérolas, etc.), clareadores da pele, tratamentos de limpeza paracondições da pele (por exemplo, espinhas, acne, tonalizantes da pele, etc.),depilatórios, lenços úmidos, desodorantes, antiperspirantes, máscaras faci-ais, barbear (por exemplo, cremes barbear, géis, etc.), pós-barbear, desca-mação da pele (por exemplo, esfoliantes), produtos de cuidado íntimo (porexemplo, produtos de higiene feminina), refrescantes pessoais, cuidado dospés. A presente invenção também provê composições que encontram usoem cosméticos (por exemplo, bases, rimei, sombras para os olhos, lápis deolho, batons, brilhos para os lábios, blushes, etc.). Contempla-se que ascomposições da presente invenção irão encontrar uso em várias formas,incluindo mas não limitadas a sólidos, líquidos, suspensões coloidais, emul-sões, óleos, géis, aerossóis, espumas, pós, pulverizações de bomba, etc.,assim como sendo usados em conjunto com itens como lenços úmidos, etc.De fato, contempla-se que a presente invenção irá encontrar uso em qual-quer forma apropriada para o(s) uso(s) pretendido (s).

Salvo indicado de outra forma, a prática da presente invençãoenvolve técnicas convencionais comumente usadas em biologia molecular,microbiologia, e DNA recombinaste, que são conhecidos do versado. Estastécnicas são conhecidas do versado e são descritos em numerosos textos etrabalhos de referência (Ver por exemplo, Sambrook et ai, "Molecular Clona-gem: A Laboratory Manual", 2a. ed. (Cold Spring Harbor), [1989]); e Ausubel etai, "Current Protocols in Molecular Biology" [1987]). Todas as patentes, pe-didos de patentes, artigos e publicações mencionados aqui, tanto supra co-mo infra, são assim expressamente incorporados aqui por referência.

Salvo indicado de outra forma aqui, todos os termos técnicos ecientíficos usados aqui tem o mesmo significado como comumente conheci-dos do versado na técnica à qual a invenção pertence. Por exemplo, Single-ton e Sainsbury, Dictionary of Microbioiogy and Molecular Biology, 2d Ed.,John Wiley e Sons, NY (1994); e Hale e Marham, The Harper Collins Dictio-nary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) proporcionam aos versados natécnica com dicionários gerais de muitos dos termos usados na invenção.

Apesar de quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos co-mo aqui descritos encontrem uso na prática da presente invenção, os méto-dos e materiais preferidos são como aqui descritos. Assim, os termos defini-dos imediatamente abaixo são os mais completamente descritos por refe-rência ao relatório como um todo. Também, como usado aqui, o singular "o""a" e "um" incluem a referência no plural, salvo especificado em contrárioclaramente. As faixas numéricas são inclusivas dos números definidos nafaixa. Salvo especificado em contrário, os ácidos nucléicos são escritas daesquerda à direita em orientação 5' para 3', as seqüências de aminoácidossão escritas da esquerda à direita em orientação amino para carbóxi, res-pectivamente. Será entendido que a invenção não é limitada à metodologiaparticular, protocolos, e reagentes descritos, como estes podem variar, de-pendendo do contexto onde são usados pelos versados na técnica.

Além disso, os cabeçalhos providas aqui não são limitações dosvários aspectos ou modalidades da invenção que podem ter referência aorelatório como um todo. Assim, os termos definidos imediatamente abaixosão mais completamente definido por referência ao relatório como um tudo.Mesmo assim, a fim de facilitar a compreensão da invenção, vários itens sãodefinidos abaixo.

Definições

Como usado aqui, o termo esqueletorefere-se a um inibidor deprotease tendo uma seqüência de peptídeos heteróloga e/ou modificada in-corporada aqui. Em modalidades preferidas, o termo esqueletorefere-se auma seqüência de proteína de tipo selvagem, em que uma seqüência varian-te é introduzida. Em algumas modalidades, o esqueletotem porções (por e-xemplo, partes ou todos de um ou ambos laços), que são substituídos comseqüência(s) heteróloga(s). Por exemplo, as seqüências BBI tendo seqüên-cias anti-VEGF (AV) incorporadas como aqui provido, encontram uso como"suportes "scaffold". De fato, a presente invenção engloba seqüências à ba-se de BBI, mas que tem diferenças estruturais e funcionais de BBI de tiposelvagem.

Como usado aqui, o termo "fator de crescimento endotelial vas-cular" (VEGF) refere-se a proteínas com a capacidade de estimular o cres-cimento vascular, incluindo os designados "VEGF-A" como conhecido dosversados na técnica.

Como usado aqui, o termo "anti-VEGF" ("aVEGF" e "AV") refere-se a peptídeos e outras composições que reconhecem, (isto é, ligam) aVEGF. Em modalidades preferidas, estes peptídeos/composições modulema atividade de VEG F.

O termo "angiogênese" refere-se aos processos biológicos queresultam no desenvolvimento de vasos sangüíneos e/ou aumentam a vascu-Iaridade de tecido em um organismo. Em modalidades particulares aqui, otermo refere-se ao processo através do qual os tumores ou outros tecidos derápida proliferação derivam um suprimento de sangue através da geração demicrovasos.

Os termos "doença angiogênica", "distúrbio angiogênico", e "dis-túrbio angiogênico de pele", são usados em referência a um distúrbio, ge-ralmente um distúrbio de pele ou distúrbio relacionado que ocorre como umaconseqüência de ou que resulta em vascularização aumentada em tecido.Com freqüência, a etiologia da doença angiogênica é desconhecida. No en-tanto, se a angiogênese for uma causa real de um estado doentio ou é sim-plesmente uma condição do estado doentio não é importante, mas da inibi-ção de angiogênese no tratamento ou reversão de um estado doentio oucondição é um aspecto importante da presente invenção. Assim, não se pre-tende que a presente invenção seja limitada a qualquer mecanismo particu-lar de ação.

Exemplos de distúrbios angiogênicos de peles que são apropri-ados para tratamento utilizando compostos da presente invenção incluem,mas não são limitados a psoríase, acne, rosácea, verrugas, eczema, he-mangiomas e linfangiogênese, síndrome de Sturge-Weber, neurofibromato-se, esclerose tuberosa, doença inflamatória crônica, e artrite. Qualquer dis-túrbio de pele que tem como uma caracterização primária ou secundária,vascularização aumentada, é considerado um distúrbio de pele angiogênicoaqui. Assim, os compostos providos pela presente invenção encontram usono tratamento de uma ampla variedade de doenças e/ou condições.

O termo "rosácea" é usado para descrever acne, rosácea, oueritematosa caracterizados por dilatação vascular e folicular tipicamente en-volvendo o nariz e porções contíguas das bochechas. A rosácea pode variarde muito branda, mas hiperplasia persistente a extensivas das glândulassebáceas a pápulas profundas e pustúlas e pode ser acompanhada por te-langiectasia dos sítios eritematosos afetados. Esta condição é também refe-rida como "rosácea hipertrófica" ou "rinofima", dependendo da severidade dacondição. Pretende-se que o termo englobe todas as várias formas da con-dição.

O termo "verruga" é usado para descrever crescimento pequeno,geralmente duro sobre a pele. Também conhecido como "verruca", verrugassão crescimentos da cor da pele que são caracterizados por hipertrofia cir-cunscrita das papilas do cório, com espessamento das camadas de malpigi-ano, granulação e ceratina da epiderme. Verucca vulgaris, um subconjuntode verrugas ou verruca, é caracterizada por infecção dos queratinórios porpapilomavírus humano.

O termo "psoríase" é usado para descrever uma condição dapele que é caracterizada pela erupção de maculopápulas circunscritas, dis-cretas e confluentes, avermelhadas, com escamas prateadas. Apesar denão se pretender que a presente invenção seja limitada a qualquer área cor-poral particular, lesões psoriáticas tipicamente ocorrem nos cotovelos, joe-lhos, couro cabelo e tronco. Microscopicamente, estas lesões demonstramparaqueratose característica e alongamento das cristas do plexo.

O termo "acne" é usado para descrever uma condição da pelecaracterizada por erupções inflamatórias foliculares, papulares e pustularesenvolvendo o aparelho sebáceo. Apesar de existirem numerosas formas deacne, a mais comum é conhecida como acne simplex ou acne vulgaris que écaracterizada por erupções da face, dorso superior e peito, primariamentecompreendendo comedones, cistos, pápulas e pústulas em uma base infla-matória. A condição ocorre primariamente durante puberdade e adolescên-cia devido a um aparelho sebáceo superativo que se acredita seja afetadopela atividade hormonal.

O termo "eczema" é um termo genético usado para descrevercondições inflamatórias agudas ou crônicas da pele, tipicamente eritemato-so, edematoso, papular, vesicular e/ou formação de cascas. Estas condiçõessão com freqüência seguidas por liquenificação, formação de escamas eocasionalmente, por escurecimento do e, com pouca freqüência, hiperpig-mentação. Eczema é com freqüência acompanhado por uma seção de co-ceira e queimação. As vesículas dos eczemas se foram devido a espongioseintraepidérmico. Eczema é às vezes referido coloquialmente como "herpesda pele", "herpes seco" e "herpes com escamas". Existem numerosas sub-categorias de eczema, sendo todas tratadas por um ou mais dos compostosde acordo com a presente invenção.

Como usado aqui, "CK" seguido por um número inteiro refere-sea um peptídeo específico. Várias seqüências de peptídeos que encontramuso com a presente invenção são providas aqui (Ver por exemplo, Figura 1).

Como um exemplo, CK37281 refere-se a uma seqüência de peptídeos YN-LYGWT (SEQ ID NO:1) que é também é incluída em várias outras seqüên-cias (por exemplo, "ACYNLYGWTCGGG" (SEQ ID NO:238).

Como usado aqui, em algumas modalidades, o "composto"compreende a proteína "completa", (isto é., em seu comprimento completecomo ele ocorre em natureza (ou como mudado)), enquanto em outras mo-dalidades compreende uma forma truncada de uma proteína. Assim, em al-gumas modalidades, os compostos da presente invenção são ou truncadosou de "comprimento completo." Além disso, em algumas modalidades, atruncagem está localizada na extremidade N-terminal, enquanto em outrasmodalidades a truncagem está localizada na extremidade C-terminal da pro-teína. Em outras modalidades, o composto falta uma ou mais porções (porexemplo, subseqüências, seqüências de sinal, domínios ou porções), sejaativo ou não.

O termo "organismo" é usado em todo o relatório para descreverum animal, preferivelmente um ser humano, ao qual o tratamento, incluindotratamento profilático, com os compostos de acordo com a presente inven-ção é provido. Para tratamento destas infecções, condições ou estados do-entios que são específicos para um animal específico, como um pacientehumano, o termo organismo refere-se a este animal específico.

As "células hospedeiras" usadas na presente invenção geral-mente são hospedeiros procarióticos ou eucarióticos que contêm um vetorde expressão e/ou gene de interesse. Células hospedeiras são transforma-das ou transfectadas com vetores construídos usando técnicas de DNA re-combinante. Estas células hospedeiras transformadas são capazes de oureplicar vetores codificando variantes de proteína ou expressando a deseja-da variante de proteína. Nos casos de vetores que codificam a pre- ou pre-pro-forma de uma variante de proteína, estas variantes, quando expressa-das, são tipicamente secretadas da célula hospedeira para dentro do meiode célula hospedeira.

O termo "quantidade efetiva" é usado em todo o relatório paradescrever concentrações ou quantidades de compostos de acordo com apresente invenção que podem ser usados para produzir uma mudança favo-rável na doença ou condição tratada, seja a mudança de crescimento decabelo ou prevenção de crescimento de cabelo.

Como usado aqui, "ativo" (e "ativos") refere-se a uma composi-ção que confere um benefício a um indivíduo sendo tratado. Por exemplo,em modalidades preferidas, a presente invenção provê composições de cui-dado pessoal compreendendo BBI-AV, um "ativo primário" que funciona paraproporcionar benefício à área em que é aplicado. Assim, em algumas moda-lidades, BBI-AV está presente em formulações de cuidado da pele e servepara modificar a tonalidade da pele de indivíduos ao qual é aplicado. Não sepretende que o termo seja limitado a BBI-AV, porque existem adicionaisconstituintes presente nas composições de cuidado pessoal da presente in-venção que conferem benefícios. Em algumas modalidades preferidas, estesconstituintes adicionais são englobados pela designação "ativos secundá-rios." Ativos primários e secundários são coletivamente referidos como "ati-vos" aqui.Como usado aqui, "composto de vitamina B3" significa um com-posto tendo a fórmula:

em que R é - CONH2 (isto é, niacinamida), - COOH (isto é, ácido nicotínico)ou - CH2OH (isto é, álcool nicotinílico); seus derivados; e sais de qualquerum dos acima.

Como usado aqui, "não vasodilator" significa que um éster nãodá comumente uma resposta de rubor visível após aplicação na pele daspresentes composições. Contempla-se que a maior parte da população geralnão deve experimentar uma resposta de rubor visível, apesar dos compostospoderem causar vasodilação não visível a olho nu.

Como usado aqui, "retinóide" inclui todos os análogos naturaise/ou sintéticos de Vitamina A e/ou compostos similares a retinol que possu-em a atividade biológica de Vitamina A em/sobre a pele, assim como os i-sômeros geométricos e estereoisômeros destes compostos. No entanto, nãose pretende que o termo seja limitado a estes compostos, como o termo en-globa álcool de vitamina A (retinol) e seus derivados como aldeído de vita-mina A (retinal), ácido de vitamina A (ácido retinóico) e ésteres de vitamina A(por exemplo, acetato de retinila, propionato de retinila e palmitato de retini-la), etc. Pretende-se ainda que o termo englobe ácidos retinóico todo-trans eácidos 13-cis- retinóicos. Pretende-se também que o termo englobe compo-sições que são encapsuladas assim como providas para uso em várias for-mas. Os termos "retinol" e "retinal" preferivelmente compreendem os com-postos todos-trans. Os retinóides preferivelmente usados para a formulaçãoda presente invenção é todo-trans-retinol, geralmente referido como "retinol" aqui.

Como usado aqui, "carotenóide" é usado em referência a β-caroteno, licopeno, luteína, astaxantina, zeaxantina, criptoxantina, citrana-xantina, cantaxantina, bixina, p-apo-4-carotenal, 3-apo-8-carotenal, ésteresp-apo-8-carotenóicos, sozinhos, assim como em combinação. Carotenóidesque são preferivelmente usados são β-caroteno, licopeno, luteína, astaxanti-na, zeaxantina, citranaxantina e cantaxantina. Em algumas modalidades,carotenóides são utilizados em forma cristalina, assim como em formula-ções, incluindo mas não limitadas a pós secos (Ver por exemplo, pós secos,como descrito em EP 0 065 193; aqui incorporado por referência).

Em algumas modalidades, o uso preferido nos casos de licopeno,astaxantina e cantaxantina é um pó seco contendo licopeno-, astaxantina- ecantaxantina, por exemplo LYCOVIT^, LUCANTIN® Pink e LUCANTIN®Vermelho (pós 10% secos respectivamente de licopeno, astaxantina e can-taxantina, comercialmente disponíveis de BASF AG, Ludwigshafen, Germany.

Como usado aqui, o termo "bioatividade" refere-se uma relaçãode causa e efeito entre a composição e um sistema biológico. Assim, o ter-mo é usado pelos versados na técnica de biotecnologia e ciências biológicascomo a expressão que descreve uma relação de causa e efeito entre umacomposição molecular e um material biológico vivo (por exemplo, tecido, cé-lulas, etc.).

Como usado aqui como um nome, o termo "bioativo" refere-se auma composição que demonstra bioatividade quando de administração a ummaterial biológico vivo (por exemplo, tecido, células, etc.). O termo é usadocomo sinônimo com "composto bioativo."

Como usado aqui, "goma de silicone" significa silicones de pesomolecular elevado tendo um peso molecular médio em excesso de cerca de200.000 e preferivelmente de cerca de 200.000 a cerca de 4,000.000. Pre-tende-se que a definição englobe gomas de polialquil e poliaril siloxano nãovoláteis.

Como usado aqui, o termo "polipeptídeo" refere-se a um com-posto feito de uma cadeia única de resíduos de aminoácidos ligados por li-gações de peptídeo. O termo "proteína" aqui pode ser sinônimo com o termo"polipeptídeo" ou pode fazer referência, além disso, a um complexo de doisou mais polipeptídeos. O significado exato é conhecido dos versados na técnica.

Como usado aqui, os termos "cassete de expressão" e "vetor deexpressão" referem-se a constructos de ácido nucléico geradas recombinan-te ou sinteticamente, com séries de elementos de ácido nucléico especifica-dos que permitem a transcrição de um particular ácido nucléico em uma cé-lula alvo. O cassete de expressão recombinante pode ser incorporado emum plasmídeo, cromossomo, DNA mitocondrial, DNA plastídio, vírus, oufragmento de ácido nucléico. Tipicamente, a porção recombinante do casse-te de expressão de um vetor de expressão inclui, dentre outras seqüências,uma seqüência de ácido nucléico a ser transcrita e um promotor. O termo"cassete de expressão" pode ser usado interpermutavelmente aqui com"constructo DNA" e seus equivalentes gramaticais.

Como usado aqui, os termos "vetor" e "vetor de clonagem" refe-rem-se a constructos de ácido nucléico projetadas para transferir as seqüên-cias de ácido nucléico em células.

Como usado aqui, o termo "vetor de expressão" refere-se a umvetor que tem a capacidade de incorporar e expressar fragmentos de DNAheterólogos em uma célula estranha. Muitos vetores de expressão procarió-ticos e eucarióticos são comercialmente disponíveis. Seleção de apropriadosvetores de expressão está de acordo com o conhecimento dos versados natécnica. .........

Como usado aqui, o termo "plasmídeo" refere-se a constructosde DNA circulares de filamento duplo (ds) usadas como um vetor de clona-gem, e que formam um elemento genético auto-replicante extracromossomalem alguns eucariotes ou integram no hospedeiro os cromossomos.

Como usado aqui, o termo "expressão" refere-se ao processopelo qual um polipeptídeo é produzido com base na seqüência de ácido nu-cléico do gene ou dos peptídeos sintéticos químicos. O processo inclui tantoa transcrição como a tradução do gene para produzir polipeptídeo/proteína.

Como usado aqui, o termo "gene" significa o segmento de DNAenvolvido em produção de uma cadeia de polipeptídeo que pode ou não in-cluir regiões precedentes ou após a região de codificação.

Como usado aqui, os termos "molécula de ácido nucléico" e "se-qüência de ácido nucléico" incluem seqüências de qualquer forma de ácidonucléico, incluindo, mas limitadas a moléculas de RNA, DNA e cDNA. Seráentendido que, como um resultado da degenerescência do código genético,uma multiplicidade de seqüências nucleotídicas codificando uma dada prote-ína pode ser produzido, além dos mutantes de proteínas.

Como usado aqui, "códon" refere-se a uma seqüência de trêsnucleotídeo os em uma molécula de DNA ou mRNA que representa a instru-ção para incorporação de um aminoácido específica em uma cadeia de poli-peptídeo.

Como usado aqui, o termo "ponte dissulfeto" ou "ligação dissul-feto" refere-se a uma ligação formada entre os átomos de enxofre de resí-duos de cisteína em um polipeptídeo ou uma proteína. Nesta invenção, umaponte dissulfeto ou ligação dissulfeto pode estar ocorrendo não naturalmentee introduzida por meio de mutação por pontos.

Como usado aqui, o termo "ponte de sal" refere-se a uma liga-ção formada entre resíduos carregados de modo oposto, aminoácidos emum polipeptídeo ou proteína. Nesta invenção, uma ponte de sal pode estarocorrendo não naturalmente e ser introduzida por meio de mutação por pontos.

Como usado aqui, uma "enzima" refere-se a uma proteína oupolipeptídeo que catalisa pelo menos uma reação química.

Como usado aqui, o termo "atividade" refere-se a qualquer ativi-dade associada com uma proteína particular, como atividade enzimática as-sociada com a protease. Em algumas modalidades, a atividade é atividadebiológica. Em outras modalidades, atividade engloba a ligação de proteínasa receptores que resulta em efeitos a jusante mensuráveis (por exemplo,ligação de VEGF a seu receptor cognato). "Atividade biológica" refere-se aqualquer atividade que seria normalmente atribuída a esta proteína por umversados na técnica.

Como usado aqui, o termo "protease" refere-se a uma enzimaque degrada as ligações peptídeo.

Como usado aqui, "ligação peptídeo" refere-se à ligação químicaentre grupo carbonila de um aminoácido e o grupo amino de outro aminoáci-do.

Como usado aqui, "tipo selvagem" refere-se a uma seqüência ouuma proteína que é nativa ou ocorrendo naturalmente.

Como usado aqui, "mutações em pontos" refere-se a uma mu-dança em um nucleotídeo o único de DNA, especialmente onde a mudançaresulta em uma mudança de seqüência em uma proteína.

Como usado aqui, "mutante" refere-se a uma versão de um or-ganismo ou proteína onde a versão é diferente da do tipo selvagem. A mu-dança pode ser efetuada por métodos bem-conhecidos dos versados natécnica, por exemplo, mutação por pontos em que a proteína resultante podeser referida como um mutante.

Como usado aqui, "mutagênese" refere-se ao processo de mu-dança de uma composição (por exemplo, proteína) de uma composição detipo selvagem (por exemplo, proteína) em uma composição mutante ou vari-ante (por exemplo, proteína).

Como usado aqui, "substituído" e "substituições" referem-se asubstituição(s) de um resíduo de aminoácidos ou base de ácido nucléicobase em uma seqüência parental. Em algumas modalidades, a substituiçãoenvolve a substituição de um resíduo ou base naturalmente ocorrendo.

Como usado aqui, "modificação" e "modificar" referem-se aqualquer mudança(s) em uma seqüência de aminoácido ou ácido nucléico,incluindo, mas não limitado a deleções, inserções, interrupções, e substitui-ções. Em algumas modalidades, a modificação envolve a substituição de umresíduo ou base naturalmente ocorrendo.

Como usado aqui, "porção funcional de um polipeptídeo secre-tado" e seus equivalentes gramaticais referem-se a polipeptídeo secretadotruncado que retém sua capacidade de duplicar em uma configuração nor-mal, apesar de truncada. Em algumas modalidades, contempla-se que resí-duos suficientes de um domínio do polipeptídeo naturalmente secretado de-ve estar presente para permitir que ele duplique em sua configuração normalindependentemente do polipeptídeo desejado ao qual ele é fixado. No entan-to, na maior parte dos casos, a porção do polipeptídeo secretado é tanto cor-retamente duplicada como resulta em secreção aumentada como compara-do com sua ausência. Similarmente, na maior parte dos casos, a truncagemdo polipeptídeo secretado significa que a porção funcional retém uma funçãobiológica. Em uma modalidade preferida, o domínio catalítico de um polipep-tídeo secretado é usado, apesar de outros domínios funcionais poderem serusados, por exemplo, os domínios de ligação de substrato. Adicionalmente,modalidades preferidas usam o domínio catalítico e toda ou parte da regiãodo ligante.

Como usado aqui, "laço" refere-se a uma seqüência de aminoá-cidos, por exemplo 3-20 aminoácidos, mais preferivelmente 5-15 aminoáci-dos, ainda mais preferivelmente 5-10 aminoácidos, e o mais preferivelmente7-9 aminoácidos, que conecta elementos estruturais de uma proteína. Esteselementos incluem, mas não são limitados a folhas beta e elementos helicoi-dais e o laço de conexão de uma beta-"grampo de cabelo" Em algumas mo-dalidades, o laço é ainda estabilizado através do uso dé ligações covalentes.Em algumas modalidades preferidas, as ligações covalentes compreendemligações dissulfeto, especialmente como aqui provido. Em modalidades al-ternativas, os laços são estabilizados pelo uso de outros meios, incluindomas não limitadas a amidas, ligações hidrogênio, e/ou ponte de sais. Emoutras modalidades, os laços estão localizados na superfície de proteínas epodem ser alterados, como aqui provido, para conferir propriedades adicio-nais (por exemplo, desejáveis) às proteínas requeridas.

Como usado aqui, "oligonucleotídeo" refere-se a uma seqüêncianucleotídica curta que pode ser usada, por exemplo, como um iniciador emuma reação usada para criar mutantes de proteínas.

Como usado aqui, os termos "um oligonucleotídeo tendo umaseqüência nucleotídica codificando um gene" e "polinucleotídeo tendo umseqüência nucleotídica codificando um gene", significa uma seqüência deácido nucléico compreendendo a região de codificação de um gene ou, emoutras palavras, a seqüência de ácido nucléico que codifica um produto degene. A região de codificação pode estar presente em forma de cDNA, DNAgenômico ou RNA. Quando presente em uma forma de DNA, o oligonucleo-tídeo ou polinucleotídeo pode ser de filamento único (isto é, o filamento sen-tido) ou filamento duplo. Os elementos de controle como melhorado-res/promotores, junções de emenda, sinais de poliadenilação, etc. podemser colocados em proximidade íntima à região de codificação do gene senecessário para permitir a iniciação apropriada de transcrição e/ou proces-samento correto do transcrito de RNA primário. Alternativamente, a regiãode codificação utilizado no vetor de expressão da presente invenção porconter melhoradores/promotores endógenos, junções de emenda, seqüên-cias de intervenção, sinais de poliadenilação, etc. ou uma combinação deelementos de controle tanto endógenos como exógenos.

Como usado aqui, o termo "iniciador" refere-se a um oligonu-cleotídeo, ou ocorrendo naturalmente como em um digesto de restrição puri-ficado ou produzido sinteticamente, que é capaz de atuar como um ponto deiniciação de síntese quando colocado sob condições em que síntese de umproduto e extensão de iniciador que é complementar a um filamento de ácidonucléico é induzida, (isto é, na presença de nucleotídeos e um agente indu-tor como DNA polimerase e em temperatura e pH apropriados). O iniciador épreferivelmente de filamento único para uma eficiência máxima em amplifi-cação, mas alternativamente pode ser de filamento duplo. Se de filamentoduplo, o iniciador é primeiro tratado para separar seus filamentos antes deserem usados para preparar produtos de extensão. Preferivelmente, o inici-ador é um oligodesoxirribonucleotídeo. O iniciador deve ser suficientementelongo para iniciar a síntese de produtos de extensão na presença do agenteindutor. O comprimento exato dos iniciadores irá depender de muitos fatores,incluindo temperatura, fonte de iniciador e o uso do método.

Como usado aqui, o termo "sonda" refere-se a um oligonucleotí-deo (isto é, uma seqüência de nucleotídeos), ou ocorrendo naturalmentecomo em um digesto de restrição purificado ou produzido sinteticamente,recombinantemente ou amplificação por PCR, que é capaz de hibridizar emoutro oligonucleotídeo de interesse. A sonda pode ser de filamento único oude filamento duplo. Sondas são utilizáveis na detecção, identificação e iso-lamento de particulares seqüências de genes. Contempla-se que qualquersonda usada na presente invenção será rotulada como qualquer "molécularepórter" de modo que é detectável em qualquer sistema de detecção, inclu-indo, mas não limitado a enzima (por exemplo, ELISA, assim como testeshistoquímicos com base em enzima), sistemas fluorescentes, radioativos, eluminescente. Não se pretende que a presente invenção seja limitada aqualquer sistema de detecção particular ou rótulo.

Como usado aqui, o termo "marcação", quando usado em refe-rência à reação de cadeia polimerase, refere-se a região de ácido nucléicoligada pelos iniciadores usados para reação de cadeia polimerase. Assim, a"marcação" é procurada para ser classificado de outras seqüências de ácidonucléico. Um "segmento" é definido como uma região de ácido nucléico den-tro de uma seqüência de marcação.

Como usado aqui, o termo "reação de cadeia polimerase" ("P-CR") refere-se a um método bem-conhecido na técnica (Ver por exemplo,Patente U.S. Nes 4.683.195 4.683.202, e 4.965.188, incorporadas aqui porreferência), para aumentar a concentração de um segmento de uma se-qüência de marcação em uma mistura de DNA genômico sem clonagem oupurificação. Este processo para amplificar a seqüência de marcação consisteem introdução de um grande excesso de dois iniciadores de oligonucleotí-deos para a mistura de DNA contendo a seqüência de marcação desejada,seguido por uma seqüência precisa de ciclos térmicos na presença de umaDNA polimerase. Os dois iniciadores são complementares a seus respecti-vos filamentos da seqüência de marcação de filamento duplo. Para efetuar aamplificação, a mistura é desnaturada e os iniciadores então anelados emsuas seqüências complementares dentro da molécula de marcação. Após oanelamento, os iniciadores são estendidos com uma polimerase de modo aformar um novo par de filamentos complementares. As etapas de desnatura-ção, anelamento e iniciador e extensão polimerase podem ser repetidas mui-tas vezes (isto é, desnaturação, anelamento e extensão constituem um "ci-clo"; podem ser numerosos "ciclos") para obter uma elevada concentraçãode um segmento amplificado da desejada seqüência de marcação. O com-primento do segmento amplificado da desejada seqüência de marcação édeterminado pelas posições relativas dos iniciadores um com relação a cadaoutro, e assim, este comprimento é um parâmetro controlável. Devido aoaspecto de repetição do processo, o método é referido como a "reação decadeia polimerase" (aqui depois "PCR"). Porque os desejados segmentosamplificados da seqüência de marcação se tornam as seqüências predomi-nantes (em termos de concentração) na mistura, eles são ditos como sendo"amplificados por PCR".

Como usado aqui, os termos "produto PCR", "fragmento PCR" e"produto de amplificação" referem-se à mistura resultante de compostos a-pós dois ou mais ciclos das etapas PCR de desnaturação, anelamento e ex-tensão estarem completos. Estes termos englobam o caso onde se tem aamplificação de um ou mais segmentos de uma ou mais seqüências de marcação.

Como usado aqui, o termo "reagentes de amplificação" refere-seaos reagentes (trifosfatos de desoxirribonucleotídeo, tampão, etc.), necessá-rios para a amplificação exceto pelos iniciadores, gabarito de ácido nucléicoe a enzima de amplificação. Tipicamente, reagentes de amplificação juntocom outros componentes de reação são colocados e contidos em um vasode reação (tubo de teste, microcavidade, etc.).

Como usado aqui, o termo "RT-PCR" refere-se à replicação eamplificação de seqüências de RNA. Nestes método, transcrição reversa écopulada a PCR, com maior freqüência usando o procedimento de uma en-zima em que uma polimerase termoestável é empregada, como descrito empatente US N2 5.322.770, aqui incorporada por referência. Em RT-PCR, ogabarito de RNA é convertido em cDNA devido a atividade de transcriptasereversa da polimerase, e então amplificado usando a atividade de polimeri-zação da polimerase (isto é, como em outros métodos PCR).

Como usado aqui, o termo "hibridização" refere-se ao processopelo qual um filamento de ácido nucléico se une com um filamento comple-mentar através de formação de pares de bases, como conhecido na técnica.

Como usado aqui, "estringência máxima" refere-se ao nível dehibridização que tipicamente ocorre a cerca de Tm-5°C (5°C abaixo do Tmda sonda); "estringência elevada" a cerca de 5°C a 10°C abaixo Tm; "estrin-gência intermediária" a cerca de 10°C a 20°C abaixo Tm; e "estringênciabaixa" a cerca de 20°C a 25°C abaixo Tm. Como será entendido pelos ver-sados na técnica, uma hibridização de estringência máxima pode ser usadapara identificar ou detectar seqüências polinucleotídicas enquanto uma hibri-dização estringência intermediária ou baixa pode ser usada para identificarou detectar homólogos de seqüência polinucleotídica.

As frases"substancialmente similar" e "substancialmente idênti-co" nos contextos de dois ácidos nucléicos ou polipeptídeos tipicamente sig-nificam que um polinucleotídeo ou polipeptídeo compreende uma seqüênciaque tem pelo menos 75% seqüência de identidade, preferivelmente pelomenos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, ainda mais preferivel-mente 95%, o mais preferivelmente 97%, às vezes tanto como 98% e 99%de identidade seqüência, comparado com a seqüência de referência (isto é,tipo selvagem). Identidade de seqüência pode ser determinada usando pro-gramas conhecidos como BLAST, ALIGN, e CLUSTAL usando parâmetrospadrão. (Ver por exemplo, Altschul, et ai, J. Mol. Biol. 215:403-410 [1990];Henikoff et ai, Proc. Natl. Acad Sei. USA 89:10915 [1989]; Karin et ai, Proc.Natl Acad. Sci USA 90:5873 [1993]; e Higgins et ai, Gene 73:237 - 244[1988]). Software para realizar as análises BLAST é publicamente disponívelno National Center for Biotechnology Information. Também, bases de dadospodem ser pesquisadas usando FASTA (Pearson et al., Proc. Natl. Acad.Sei. USA 85:2444-2448 [1988]).

Como usado aqui, "resíduos equivalentes" referem-se a proteí-nas que compartilham resíduos de aminoácidos particulares. Por exemplo,resíduos equivalentes podem ser identificados por determinação da homolo-gia a um nível de estrutura terciária para uma proteína (por exemplo, VEGF)cuja estrutura terciária foi determinada por cristalografia de raios-X. Os resí-duos equivalentes são definidos como os para as coordenadas atômicas dedois ou mais dos átomos de cadeia principal de um resíduo particular de a-minoácidos de uma proteína tendo resíduos equivalentes putativos e umaproteína de interesse (N em N, CA em CA, C em C e O em O) estão dentrode 0,13 nm e preferivelmente 0,1 nm após alinhamento. O alinhamento éobtido após o melhor modelo ter sido orientado e posicionado para dar a so-breposição máxima de coordenadas atômicas de átomos de proteína nãohidrogênio analisadas. O modelo preferido é o modelo cristalográfico dandoo fator R menor para os dados experimentais de difração à maior resoluçãodisponível, determinado usando métodos conhecidos dos versados na técni-ca de cristalografia e caracterização de proteína /análise.

Em algumas modalidades, modificação é preferivelmente feitana "seqüência de DNA precursor" que codifica uma seqüência de aminoáci-dos da enzima precursora, mas pode ser pela manipulação da proteína pre-cursora. No caso de resíduos que não são conservados, a substituição deum ou mais aminoácidos é limitada a substituições que produzem uma vari-ante que tem uma seqüência de aminoácidos que não corresponde a umaencontrada em natureza. No caso de resíduos conservados, estas substitui-ções não devem resultar em uma seqüência ocorrendo naturalmente. Deri-vados providos pela presente invenção ainda incluem modificação(s) quími-ca(s) que mudam as características da proteína.

Em algumas modalidades preferidas, um gene de proteína é li-gado em um plasmídeo de expressão apropriado. O gene de proteína clona-do é então usado para transformar ou transfectar uma célula hospedeira afim de expressar o gene de proteína. Em algumas modalidades, este plas-mídeo replica nos hospedeiros, no sentido de que ele contém os elementosbem-conhecidos necessários para a replicação de plasmídeo ou o plasmí-deo pode ser projetado para integrar no cromossomo hospedeiro. Os ele-mentos necessários são providos para expressão de genes efetiva (por e-xemplo, um promotor ligado operativamente ao gene de interesse). Em al-gumas modalidades, estes elementos necessários são supridos como o pró-prio promotor homólogo do gene, se ele for reconhecido (isto é, transcrito,pelo hospedeiro), um terminador de transcrição (uma região de poliadenila-ção para células hospedeiras eucarióticas) que é exógena ou é suprida pelaregião de terminador endógena do gene de proteína. Em algumas modalida-des, um gene de seleção como um gene de resistência a antibiótico quepermite a manutenção cultural contínua de células hospedeiras infectadascom plasmídeo - por crescimento em meios contendo antimicrobianos étambém incluído.

Como usado aqui, os termos "endonucleases de restrição" e"enzimas de restrição" referem-se a enzimas bacterianas, sendo que cadacorta o DNA de filamento duplo em ou próximo de uma seqüência nucleotí-dica específica.

Como usado aqui, o termo "molécula de DNA recombinante"como usado aqui refere-se a uma molécula e DNA que é composta de seg-mentos de DNA unidos juntos por meio de técnicas biológicas moleculares.

O termo "proteína recombinante" ou "polipeptídeo recombinante"como usado aqui refere-se a uma molécula de proteína que é expressada deuma molécula de DNA recombinante.

O termo "proteína nativa" como usado aqui para indicar que aproteína não contém resíduos de aminoácidos codificados por seqüênciasde vetor; isto é, a proteína nativa contém somente os aminoácidos encontra-dos em uma proteína, como ela ocorre na natureza. Uma proteína nativapode ser produzida por meios recombinantes ou pode ser isolada de umafonte ocorrendo naturalmente.

Como usado aqui o termo "porção" quando em referência a umaproteína (como em "uma porção de uma dada proteína") refere-se a frag-mentos desta proteína. Os fragmentos podem estar na faixa de tamanho dequatro resíduos de aminoácidos para a seqüência completa de aminoácidosmenos um aminoácido.

Como usado aqui, o termo "proteína de fusão" refere-se a umaproteína quimérica contendo uma proteína de interesse (isto é, VEGF e seusfragmentos) unidos a um fragmento de proteína exógeno (o parceiro de fu-são que consiste em uma proteína VEGF). Em algumas modalidades, o par-ceiro de fusão melhora a solubilidade da proteína VEGF como expressadosem uma célula hospedeira, podendo prover uma etiqueta de afinidade parapermitir a purificação da proteína de fusão recombinante da célula hospedei-ra ou sobrenadante de cultura, ou ambos. Se desejado, a proteína de fusãopode ser removida de uma proteína de interesse (isto é, VEGF e/ou seusfragmentos) por uma variedade de meios enzimáticos ou químicos conheci-dos na técnica.

Os termos "em combinação operável", "em ordem operável" e"ligado operativamente" como usado aqui referem-se à ligação de seqüên-cias de ácido nucléico em tal modo que as moléculas de ácido nucléico ca-pazes de dirigir a transcrição de um dado gene e/ou a síntese de uma molé-cula de proteína desejada são produzidas. O termo também refere-se a liga-ção de seqüências de aminoácidos em tal modo que uma proteína funcionalé produzida.

Como usado aqui o termo "região de codificação" quando usadoem referência a um gene estrutural refere-se a seqüências nucleotídicas quecodificam os aminoácidos encontrados nos polipeptídeos nascentes comoum resultado de tradução de uma molécula de mRNA. A região de codifica-ção é ligada, em eucariotes, no lado 5' pelo tripleto de nucleotídeo "ATG"que codifica o iniciador metionina e no lado 3' por um dos três tripletos queespecificam os códons de parada (isto é, TAA1 TAG1 TGA).

Como usado aqui, o termo "gene estrutural" refere-se a uma se-qüência de DNA codificando para RNA ou uma proteína. Em contraste, "ge-nes regulatórios" são genes estruturais que codificam produtos que contro-lam a expressão de outros genes (por exemplo, fatores de transcrição).

Como usado aqui, o termo "purificado" ou "para purificar" refere-se a remoção de contaminantes de uma amostra. Por exemplo, polipeptí-deos aVEGF ou VEGF recombinante são expressados em células hospedei-ras e os polipeptídeos são purificados pela remoção de proteínas de célulahospedeira; a porcentagem de polipeptídeos aVEGF ou VEGF recombinanteé assim aumentada nas amostras.

Como usado aqui, o termo "substancialmente puro" quando apli-cado a proteínas ou seus fragmentos da presente invenção significa que asproteínas são essencialmente isentas de outras substâncias em uma exten-são prática e apropriada para seus usos pretendidos. Em particular, as pro-teínas são suficientemente puras e são suficientemente isentas de outrosconstituintes biológicos das células hospedeiras de modo a serem utilizáveisem, por exemplo, seqüenciamento de proteínas, e/ou produção de prepara-ções farmacêuticas.

Como usado aqui, o termo "proteína de marcação" refere-se auma proteína (por exemplo, enzima, hormônio, etc.), cuja ação seria bloque-ada por uma ligação dos inibidores variantes providos aqui.

Como usado aqui, os termos "seqüência variante" e "seqüênciasvariantes" referem-se à(s) seqüência(s) de polipeptídeo curta(s) que substi-tuem os laços de ligação do inibidor de protease tipo selvagem. A seqüênciavariante não precisa ter o mesmo comprimento como a seqüência do laço deligação que ela está substituindo no inibidor de protease tipo selvagem.

O termo "isolado" quando usado em relação a um ácido nucléi-co, como em "oligonucleotídeo isolado" ou "polinucleotídeo isolado" refere-se a uma seqüência de ácido nucléico que é identificada e separada de pelomenos um ácido nucléico contaminante com o qual ela está comumente as-sociada em sua fonte natural. O ácido nucléico isolado está presente emuma tal forma ou configuração que é diferente da em que ele é encontradona natureza. Em contraste, ácidos nucléicos não isolados como ácidos nu-cléicos como DNA e RNA encontrados nos estados em que eles existem nanatureza. Por exemplo, uma dada seqüência de DNA (por exemplo, um ge-ne) é encontrada no cromossomo da célula hospedeira em proximidade aosgenes vizinhos; as seqüências de RNA, como uma seqüência de mRNA es-pecífica codificando uma proteína específica, são encontradas na célula co-mo uma mistura com numerosos outros mRNAs que codificam uma multitu-de de proteínas. No entanto, ácido nucléico isolado codificando uma proteínaVEGF inclui, a título de exemplo, este ácido nucléico em células comumenteexpressando uma proteína VEGF onde o ácido nucléico está em um localcromossômico diferente do das células naturais ou é de outra forma flanque-ado por uma seqüência diferente de ácido nucléico do que a encontrada nanatureza. O ácido nucléico, oligonucleotídeo, ou polinucleotídeo isolado po-de estar presente em forma de filamento único ou de filamento duplo. Quan-do um ácido nucléico, oligonucleotídeo ou polinucleotídeo isolado deve serutilizado para expressar uma proteína, o oligonucleotídeo ou polinucleotídeoirá conter, em um mínimo, o filamento sentido ou codificando (isto é, o oligo-nucleotídeo ou polinucleotídeo pode ser de filamento único), mas pode con-ter tanto os filamentos sentido como anti-sentido (isto é, o oligonucleotídeoou polinucleotídeo pode ser de filamento duplo).

Como usado aqui, uma "composição compreendendo uma dadaseqüência polinucleotídica" refere-se amplamente a qualquer composiçãocontendo a dada seqüência polinucleotídica. Composição pode estar emqualquer forma, particularmente uma forma que é apropriada para adminis-tração.

Como usado aqui, um composto é dito como estando "em umaforma apropriada para administração" quando o composto pode ser adminis-trado a um ser humano ou outro animal por qualquer via desejada (por e-xemplo, tópica, oral, etc.).

Como usado aqui, "quantidade efetiva e segura" refere-se a umaquantidade suficiente de um material que significantemente induz uma modi-ficação positiva para a área sobre a qual o material é aplicado e também nãoresulta na produção de sérios efeitos laterais (em uma relação ris-co/benefício razoável). A quantidade efetiva e segura do material pode variarcom a pele particular ou outra parte do corpo sendo tratada, a idade do indi-víduo sendo tratado, a severidade da condição sendo tratada, a duração detratamento, a natureza de terapia concorrente, o material específica usado, oveículo particular utilizado, etc. Os versados na técnica são capazes de ajus-tar a concentração das composições de cuidado pessoal providas aqui paraa aplicação desejada das composições.

Como usado aqui, o termo "composição de cuidado pessoal"refere-se a um produto para aplicação à pele, cabelo, unhas, cavidade oral emembranas relacionadas para o fim de melhorar, limpar, embelezar, tratar,e/ou cuidar destas superfícies e membranas.

Em algumas modalidades, a composição de cuidado pessoalestá na forma de um veículo emulsificado, como um creme ou loção nutrien-te, um gel estabilizado ou sistema dispersante, como amaciante da pele,uma emulsão nutriente, um creme nutriente, um creme de massagem, umsoro de tratamento, um sistema de distribuição lipossomal, uma máscara ouporção tópica facial, um sistema de limpeza à base de tensoativos como umxampu ou líquido de limpeza corporal, uma dispersão ou emulsão aerossoli-zada ou pulverizada, um condicionador da pele ou cabelo, auxiliar de pente-ado, ou um produto pigmentado como maquiagem em forma líquida, creme,sólida, anidra ou lápis. No entanto, não se pretende que a presente invençãoseja limitada a qualquer forma particular, como várias formas encontram usona presente invenção.

Produtos de cuidado pessoal pode ser classificados/descritoscomo compostos cosméticos, de venda direta ("OTC") que encontram usoem aplicações de cuidado pessoal (por exemplo, cosméticos, cuidado dapele, cuidado oral, cuidado do cabelo, cuidado das unhas). Em algumas mo-dalidades, o polímero de proteína de seqüência de repetição é adicionado auma composição de cuidado pessoal como a composição de cuidado do ca-belo, a composição de cuidado da pele, a composição de cuidado das u-nhas, a composição cosmética, ou qualquer uma de suas combinações.

Como usado aqui, "composição cosmética" refere-se a composi-ções que encontram uso nos cosméticos. A definição do The Food Drug andCosmetic Act (FD&C Act) é usada aqui. Assim, cosméticos são definidos porseus usos pretendidos, como artigos destinados a serem esfregados, despe-jados, aspergidos ou pulverizados sobre, introduzidos em ou de outra formaaplicados ao corpo humano para limpeza, embelezamento, promoção daatratividade ou alteração da aparência. Estas composições proporcionambenefícios não terapêuticos e não são reguladas como fármacos. No entan-to, em algumas situações, as composições cosméticas são incorporadas emcomposições farmacêuticas para prover benefícios cosméticos (por exemploprodutos para tratar doenças da pele ou do cabelo, mas também contémcomposições cosméticas por seus benefícios colorantes ou outros). Tam-bém, pretende-se que a presente invenção englobe o uso de cosméticos emanimais diferentes dos seres humanos.

Como usado aqui, os termos "composições farmacêuticas" e"composições terapêuticas" referem-se a composições como fármacos queproporcionam benefícios médicos em vez de apenas benefícios cosméticos.Nos Estados Unidos, as composições farmacêuticas e terapêuticas são a-provadas pelo Food and Drug Administration para o tratamento e/ou preven-ção de condições particulares.

Como usado aqui, o termo "fármaco" é definido como tal na defi-nição do FD&C Act. Assim, fármacos são definidos como artigos destinadospara uso em diagnose, cura, mitigação, tratamento ou prevenção de doença,e artigos (diferentes de alimentos) destinados a afetar a estrutura ou qual-quer função do corpo do homem ou de outros animais.

Como usado aqui, "deixar" refere-se a uma composição que éaplicada a um indivíduo e não removida (por exemplo, para limpar por lava-gem, enxágüe, etc.) durante um período de tipicamente de pelo menos vá-rias horas (por exemplo, 4-12 horas) antes da área exposta à composiçãoser limpa.

Como usado aqui, uma composição de "enxágüe" é uma com-posição que é aplicada e limpa (por exemplo, por lavagem, exangue, etc.)logo após sua aplicação (geralmente em cerca de 30 minutos de aplicação).Em algumas modalidades preferidas, as composições de enxágüe são for-muladas de modo a depositar uma quantidade efetiva de ativo(s) sobre aárea tratada.

Como usado aqui, o termo "benefício cosmético" refere-se auma mudança cosmética desejada que resulta da administração de umacomposição de cuidado pessoal. Os benefícios cosméticos incluem mas nãosão limitados a melhoras nas condição da pele, cabelo, unhas, e a cavidadeoral. Em modalidades preferidas, pelo menos um benefício cosmético é pro-vido pelas composições de cuidado da pele, cuidado do cabelo, cuidado dasunhas, e maquiagem da presente invenção.

Como usado aqui, "cosmeticamente aceitável" refere-se a mate-riais que são apropriados para uso em contato com tecidos de humanos e/ououtros animais, sem indevida toxicidade, incompatibilidade, instabilidade,irritação, respostas alérgicas, etc., de acordo com uma relação benefí-cio/risco razoável.

Como usado aqui, "composição de cuidado da pele" refere-se acomposições que são aplicadas à pele a fim de prover propriedades benéfi-cas, incluindo mas não limitadas a minimização de rugas, remoção de rugas,descoloração, coloração, amaciamento da pele, suavização da pele, depila-ção, limpeza, etc. Em algumas modalidades particularmente preferidas, apresente invenção provê composições de cuidado da pele que melhoramtonalidade da pele. Nestas modalidades, a melhora compreende a reduçãode rugas, suavização da textura da pele, modificação da coloração da pele,e outros desejados benefícios cosméticos. Em outras modalidades, a com-posição de cuidado da pele está em uma forma selecionada dentre o grupoconsistindo em líquidos de limpeza corporal, líquidos umectantes de limpezacorporal, desodorante líquidos de limpeza corporal, limpadores antimicrobia-nos, tratamentos de proteção da pele, loções corporais, cremes faciais, cre-mes umectantes, emulsões de limpeza facial, limpadores faciais à base detensoativos, géis esfoliantes faciais, tonalizantes faciais, cremes esfoliantes,máscaras faciais, loções após-barba, bálsamos, e/ou composições radiopro-tetoras (por exemplo, filtros solares).

Como usado aqui, "melhorar a aparência visual da pele" refere-se a qualquer benefício obtido através do uso das composições de cuidadopessoal da presente invenção. Exemplos de benefícios incluem mas não sãolimitados à redução da visual aparência de poros (por exemplo, redutores dotamanho dos poros), redutores imperfeições e/ou manchas na cor da pele,incluindo clarear regiões hiper pigmentadas da pele e/ou nivelar a pigmenta-ção da pele, aliviar a secura, eliminar pontos grossos, secos, melhorar a ca-pacidade da pele de reter umidade e/ou se proteger dos estresses ambien-tais, reduzir a aparência de linhas e rugas finas melhorar aparência e tonali-dade da pele, aumentar a firmeza e a elasticidade da pele, diminuir a perdade firmeza da pele, aumentar o brilho e clareza da pele, aumentar o proces-so de renovação da pele, e/ou remover o cabelo veloso. Melhorar a aparên-cia visual da pele também engloba a regulação das rugas, atrofia, clarea-mento da pele, escurecimento da pele, suavidade da pele, e/ou redução daaparência visual de poros.

Como usado aqui, "modificar a tonalidade da pele" refere-se auma mudança na cor da pele, escurecimento ou clareamento da cor da pele.No entanto, em outros contextos, o termo é também usado em referência amodificações na saúde do tecido muscular e conectivo da pele (isto é, nãoestá relacionado com a cor da pele, mas com a firmeza da pele).

Como usado aqui, "clareamento da tonalidade da pele" e "clare-amento da pele" referem-se uma diminuição na escuridade da pele visuali-zada por olho e/ou meios mecânicos. Pretende-se que o termo englobequalquer faixa de clareamento observável (isto é, "branqueamento") da tona-lidade da pele. Em algumas modalidades, o termo engloba diminuir a con-centração de melanina presente na pele, incluindo as áreas da pele com hi-perpigmentação devido a presença de sinais de idade, melasma, cloasma,sardas, hiperpigmentação pós-inflamatório, e/ou hiperpigmentação induzidapela pele.

Como usado aqui, "região hiperpigmentada" refere-se a umaregião localizada de pele mais escura com relação à tonalidade base da pelede um indivíduo particular. Por exemplo, em modalidades preferidas, regiõeshiperpigmentadas são areas com aumentos localizados em melanina.

Como usado aqui, "prevenir escurecimento da pele", "prevenirescurecimento da tonalidade da pele", "evitar o escurecimento da tonalidadeda pele", "evitar o desenvolvimento da cor da pele", e outras frases equiva-lentes referem-se a tonalidade da pele que é observada como uma pele demenor pigmentação ou escuridade comparada a uma pele não tratada apósradiação UV e/ou exposição solar. Assim, em algumas modalidades particu-larmente preferidas, as composições da presente invenção provêem um be-nefício por prevenir os efeitos do escurecimento da pele associados comexposição solar e/ou Radiação UV. Pretende-se que o termo englobe qual-quer faixa de diferença observável entre pele exposta ao sol que é protegidado escurecimento e pele exposta ao sol que não é protegida.

Como usado aqui, "nivelar a tonalidade da pele" refere-se a nive-lar a cor da pele em uma área de aplicação. Em modalidades preferidas, afrase refere-se ao uso de composições da presente invenção para tornar acor da pele igual ou prover um menor contraste na cor da pele em uma oumais regiões da pele.

Como usado aqui, "reduzir a vermelhidão na tonalidade da pele"refere-se a uma diminuição da cor vermelha da pele, como observado visu-almente ou por outros meios.

Como usado aqui, "inibir o crescimento de cabelo" e "inibição docrescimento de cabelo" referem-se a uma diminuição observada do compri-mento e/ou espessura do cabelo. Assim, em algumas modalidades preferi-das, aplicação de uma composição de cuidado pessoal da presente inven-ção provê um benefício em diminuir o comprimento e/ou espessura do cabe-lo, como comparado a uma área em que a composição de cuidado pessoalda presente invenção não foi aplicada. Em algumas modalidades, a reduçãoobservada do crescimento de cabelo e/ou espessura está em uma faixa demenos do que 1% a mais do que 99%, como comparado a áreas não trata-das, enquanto em outras modalidades, a redução observada é de cerca de100% a cerca de 90%, de cerca de 90% a cerca de 80%, de cerca de 80% acerca de 70%, de cerca de 70% a cerca de 60%, de cerca de 60% a cercade 50%, de cerca de 50% a cerca de 40%, de cerca de 40% a cerca de 30%,de cerca de 30% a cerca de 20%, de cerca de 20% a cerca de 10%, de cer-ca de 10% a cerca de 1%. De fato, não se pretende que o termo seja limita-do a qualquer redução percentual particular, desde que a redução seja ob-servável por meios visuais (isto é a olho nu) ou outros meios. Pretende-setambém que o termo englobe "evitar o crescimento de cabelo" a qualquergrau, como descrito acima. Não se pretende que o termo seja limitado acompleta prevenção de crescimento de cabelo (isto é, não se observa cres-cimento de cabelo).

Como usado aqui, "composição de cuidado do cabelo" refere-sea composições que são aplicadas ao cabelo para prover propriedades bené-ficas como espessamento, afinamento, coloração, descoloração, limpeza,condicionamento, amaciamento, modelagem, etc. Em algumas modalidades,a composição de cuidado do cabelo está em uma forma selecionada dentreo grupo consistindo em xampus, condicionadores, tratamentos anticaspa,auxiliar de penteados, condicionadores do penteado, reparo do cabelo ousoros de tratamento, loções, cremes, pomadas, e tratamentos químicos. Emoutras modalidades, os auxiliares de penteado são selecionados dentre ogrupo consistindo em pulverizações, espumas, enxágües, géis, espumas, esuas combinações. Em outras modalidades, o química tratamentos são se-lecionado dentre o grupo consistindo em ondas permanentes, relaxadoresde ondas, e permanentes, semipermanentes, tratamentos temporários decor e suas combinações.

Como usado aqui, "composições de maquiagem" referem-se apreparações cosméticas que são usados para embelezar, cuidar, manter, ouaumentar a aparência de um ser humano ou outro animal. "Composições demaquiagem" incluem, mas não são limitados a cosméticos coloridos, comorimei, batons, lápis para os lábios, sombras para os olhos, lápis para os o-Ihos, rouges, pós faciais, bases, blushes, e esmalte de unhas. Em algumasmodalidades, a composição cosmética da presente invenção está em umaforma selecionada dentre o grupo consistindo em géis para os olhos, som-bras para os olhos, batons de ponto de derretimento elevado, batons, brilhospara os lábios, bálsamos para os lábios, rimei, lápis de sobrancelhas, lápispara os olhos, formulações de pó compacto, bases, pigmentos revestidoscom proteínas, e suas combinações. Em outras modalidades, as composi-ções cosméticas compreendem composições de maquiagem. Em ainda ou-tra modalidade, a composição de cuidado das unhas está em uma formaselecionada dentre o grupo consistindo em esmalte de unhas, tratamento decutículas, esmalte brilhante de unhas, tratamento de unhas, e removedor deesmalte brilhante.

Como usado aqui, "composições de cuidado oral" referem-se acomposições de cuidado pessoal apropriados para uso na boca, incluindomas não limitadas a formas selecionadas dentre o grupo consistindo empastas de dentes, géis de dentes, colutórios, refrescantes bucais, tratamen-tos de branqueamento, e substratos de veículos inertes.

Como usado aqui, o termo "fase dispersa" é usado pelos versa-dos na técnica de tecnologia de emulsão como a fase que existe como partí-culas pequenas ou gotículas em suspensão em e circundadas por uma fasecontínua. A fase dispersa é também conhecida como a fase "interna" ou"descontínua".

Como usado aqui, "melhoradores de penetração" referem-se acomposições que facilitam a penetração através da barreira do estrato cór-neo superior para as camadas mais profundas da pele. Exemplos de melho-radores da penetração incluem, mas não são limitados a, propileno glicol,azônio, etoxidiglicol, dimetil isosorbídeo, uréia, etanol, dimetil sulfóxido, mi-croemulsões, lipossomas, e nanoemulsões.

Como usado aqui, os termos "emulsificante" e "tensoativo" refe-rem-se a compostos que dispersam e colocam em suspensão a fase disper-sa dentro da fase contínua de um material. Tensoativos encontram uso par-ticular em produtos destinados para limpeza da pele e/ou cabelo. Em formasparticulares de realização, o termo "tensoativo(s)" é usado em referência aagentes tensoativos, ou usados como emulsificantes ou para outros fins ten-soativos como limpeza da pele.

Em várias modalidades, a presente invenção também inclui "a-gentes protetores" como absorvedores de UV (por exemplo, metoxicinamatode octila, benzofenona-3, dióxido de titânio, e salicilato de octila); agentesformadores de películas (por exemplo, copolímero VP/Eicoseno); agentescosmecêuticos (por exemplo, peptídeos e proteínas, ácidos alfa hidróxi, ederivados de retinol e ácido retinóico); antioxidantes (por exemplo, tocoferole seus derivados e ácido ascórbico e seus derivados); vitaminas (por exem-plo, B, D, K e seus derivados); antiperspirante ativos (por exemplo, hidróxidode alumínio e hidróxido de zircônio); agentes depilantes (por exemplo, saistioglicolato); agentes antiacne (por exemplo, ácido salicílico e peróxido debenzoíla); abrasivos e esfoliantes (por exemplo, silicatos, pedra-pome, e po-lietileno); e extratos de plantas, frutas, vegetais e/ou fontes marinhas.

Assim, em algumas modalidades, a presente invenção provêcomposições compreendendo qualquer filtro UV-A e UV-B orgânico, por exem-plo mas não limitados aos seguintes:<table>table see original document page 52</column></row><table><table>table see original document page 53</column></row><table>

Em algumas modalidades, a presente invenção provê composi-ções compreendendo pigmentos, incluindo, mas não limitados a pigmentosinorgânicos com base em óxidos de metal e/ou outros compostos levementesolúveis em água ou compostos de metal insolúveis como óxidos de zinco(ZnO), titânio (TiO2), ferro (por exemplo, Fe2O3), zircônio (ZrO2), sílica (SiO2)1manganês (por exemplo, MnO), alumínio (AI2O3), oxido de cério (por exem-pio, Ce2O3), e composições mistas destes óxidos, assim como suas mistu-ras. Em algumas modalidades preferidas, os óxidos de metal são microfinos,enquanto em modalidades preferidas alternativas, os óxidos de metal são detipo pigmento. Em outras modalidades adicionais, os pigmentos são "reves-tidos" de modo que eles são tratados na superfície. Em algumas modalida-des preferidas, o revestimento compreende uma camada de película fina,hidrofóbica, enquanto em outras modalidades, o revestimento compreendeuma camada de película fina, hidrofílica.

Como usado aqui, os termos "pigmento", "pigmento colorido" e"corante" usados em referência às composições da presente invenção en-globam qualquer composto que proporciona uma cor à composição e/ouconfere uma cor à superfície (por exemplo, pele e/ou cabelo) na composiçãoem que é aplicado. Em algumas modalidades, os corantes e pigmentos sãoselecionados da lista de colorantes cosméticos provida pelo Cosmetic Direc-tive ou EC. Na maior parte dos casos, estes corantes e pigmentos são idên-ticos aos corantes aprovados para alimentos. Pigmentos/corantes preferidosincluem por exemplo, dióxido de titânio, mica, óxidos de ferro (por exemplo,Fe2O3, Fe3O4, FeO(OH)) e/ou óxido de estanho. Pigmentos /corantes vanta-josos incluem por exemplo, carmine, azul Berlin, óxido de cromo verde, azulultramarinho e/ou violeta manganês. Em algumas modalidades preferidas,os pigmentos/corantes incluem, mas não são limitados aos na seguinte tabe-la. Números do Colour Index (CIN) são conhecidos na técnica (vide, Societyof Dyers and Colourists, Rowe Colour Index. 3a. ed. Bradford, England,[1971]).

NOME QUÍMICO OU SIMILAR__CIN COR

<table>table see original document page 54</column></row><table><table>table see original document page 55</column></row><table><table>table see original document page 56</column></row><table><table>table see original document page 57</column></row><table><table>table see original document page 58</column></row><table><table>table see original document page 59</column></row><table><table>table see original document page 60</column></row><table>

Em ainda outras modalidades, composições da presente inven-ção ainda compreendem uma mais substâncias dentre o seguinte grupo:

2.4-dihidroxiazobenzeno, 1 -(2'-cloro-4'-nitro-1 '-fenilazo)-2-hidroxinaftaleno,Ceres Vermelho, ácido 2-(4-sulfo-1-naftilazo)-1-naftol-4-sulfônico, sal de cál-cio de ácido 2 -hidróxi-1,2'-azonaftaleno-1'-sulfônico, sais de cálcio e báriode ácido 1-(2-sulfo-4-metil-1-fenilazo)-2-naftilcarboxílico, sal de cálcio de á-cido 1-(2-sulfo-1-naftilazo)-2-hidroxinaftaleno-3-carboxílico, sal de alumíniode ácido 1-(4-sulfo-1-fenilazo)-2-naftol-6-sulfônico, sal de alumínio de ácido1 -(4-sulfo-1 -naftilazo)-2-naftol-3,6-dissulfônico, ácido 1 -(4-sulfo-1 -naftilazo)-2-naftol-6,8-dissulfônico, sal de alumínio de ácido 4-(4-sulfo-1-fenilazo)-1-(4-sulfofenil)-5-hidroxipirazolona-3- carboxílico, sais de alumínio e zircônio de4.5-dibromofluoresceína, sais de alumínio e zircônio de 2,4,5,7-tetrabromo-fIuoresceína, 3\4',5',6'-tetracloro-2,4,5,7-tetrabromofIuoresceína e seu sal dealumínio, sal de alumínio de 2,4,5,7-tetraiodofluoresceína, sal de alumínio deácido quinoftalona dissulfônico, sal de alumínio de ácido índigo dissulfônico,óxido de ferro vermelho e preto (CIN: 77 491 (vermelho) e 77 499 (preto)),hidrato de óxido de ferro (CIN: 77 492), difosfato de manganês amônio e di-óxido de titânio.

Em ainda outras modalidades, corantes naturais solúveis emóleo, como, por exemplo, extratos de páprica, β-caroteno ou cochinilha en-contram uso na presente invenção.

Em outras modalidades adicionais, composições de gel cremeda presente invenção compreendem pigmentos perolescentes. Em algumasmodalidades preferidas, várias pigmentos perolescentes encontram uso napresente invenção, incluindo mas não limitadas a "pigmentos naturais pero-lescentes" (por exemplo, "essência de pérolas" [cristais mistos de guani-na/hipoxantina de escamas de peixes], "mãe da pérola" [conchas de molus-cos trituradas]), e "pigmentos perolescentes monocristalinos" (por exemplo,oxicloreto de bismuto [BiOCI]); e "pigmentos em substratos em camadas"(por exemplo mica/ oxido de metal).

Bases para pigmentos perolescentes incluem, mas não são limi-tadas a pigmentos pulverulentos, dispersões de óleo de rícino de oxicloretode bismuto e/ou dióxido de titânio, oxicloreto de bismuto e/ou dióxido de titâ-nio em mica. O pigmento Iustroso listado sob CIN 77163, por exemplo, é par-ticularmente vantajoso.

Um grupo adicional de pigmentos perolescentes baseados emmica/ óxido de metal que encontra uso particular na presente invenção éprovido abaixo.

<table>table see original document page 61</column></row><table><table>table see original document page 62</column></row><table>

Em algumas modalidades preferidas, os pigmentos perolescen-tes disponíveis de Merck sob os nomes comerciais Timiron, Colorona ou Di-chrona encontram uso na presente invenção. No entanto, não se pretendeque a presente invenção seja limitado a pigmentos específicos listados aqui.

De fato, pigmentos perolescentes que encontram uso na presente invençãosão obteníveis de numerosas fontes. Por exemplo, outros substratos alémde mica podem ser revestidos com ainda óxidos de metal, como, por exem-plo, sílica e outros. Partículas de SiO2 revestidas com, por exemplo, TiO2 eFe2O3 ("ronaesferas"), que são vendidas por Merck e são particularmenteapropriados para a redução óptica de linhas finas encontram uso na presen-te invenção.

Em modalidades alternativas, o substrato (por exemplo, mica)não é incluído. Em algumas modalidades preferidas, preferência particular édada a pigmentos perolescentes preparados usando SiO2. Estes pigmentos,que também podem ter adicionalmente efeitos goniocromáticos, são dispo-níveis, por exemplo, sob nome comercial Sicopearl Fantastico, disponíveisde BASF.Em modalidades adicionais, pigmentos obtidos de Engelhard /Mearl com base em borossilicato de cálcio sódio que foram revestidos comdióxido de titânio também encontram uso. Estes são disponíveis sob o nomeReflecks. Além da cor, como um resultado de seu tamanho de partícula de40 nm a 180 mm, eles tem um efeito de brilho resplandecente.

Em ainda outras modalidades, pigmentos de efeito que são dis-poníveis sob o nome comercial Metasomes Standard/Glitter em várias cores(amarelo, vermelho, verde, azul) de Flora Tech encontram uso nas composi-ções da presente invenção. As partículas de brilho estão presentes aqui nasmisturas com vários auxiliares e corantes (como, por exemplo, os corantescom os números do Colour Index (Cl) 19140, 77007, 77289, 77491).

Em algumas modalidades, os corantes e pigmentos estão pre-sentes ou individualmente ou em uma mistura. Em modalidades alternativas,eles são mutuamente revestidos um com o outro, espessuras de revestimen-to diferentes geralmente dando lugar a diferentes efeitos coloridos. Em al-gumas modalidades, a quantidade total de corantes e pigmentos conferindocor é escolhido dentre uma faixa de concentrações (por exemplo, de cercade 0,1% em peso a cerca de 30% em peso; preferivelmente de cerca de 0,5a cerca de 15% em peso; e o mais preferivelmente de cerca de 1,0 a cercade 10% em peso, em cada caso com base no peso total das preparações).

Em ainda outras modalidades, a presente invenção provê méto-dos para a preparação das composições da presente invenção. Em algumasmodalidades, estes métodos incluem combinar e aquecer os constituintes dafase óleo e/ou a fase água separadamente, e então combinar os mesmosjuntos com agitação. Em algumas modalidades preferidas, as fases são ho-mogeneizadas. Em algumas modalidades particularmente preferidas, ascomposições são agitadas com consumo de energia moderado a elevado,com vantagem usando uma máquina de dispersão com aro de engrenagema um número de rotações de no máximo 10000 rpm (preferivelmente na fai-xa de cerca de 2500 a cerca de 7700 rpm).

Formulações cosméticas compreendendo a presente invenção

Contempla-se que a presente invenção irá encontrar uso emnumerosas composições de cuidado pessoal. Não se pretende que a pre-sente invenção seja limitada a qualquer formiato particular ou tipo de com-posição. A seguinte descrição proporciona composições exemplares, nãolimitativas, compreendendo a seguinte invenção.

Emulsões compreendem um grupo de cosméticos usuais, co-mumente usados. O termo "emulsão" é geralmente usado em referência aum sistema heterogêneo de dois líquidos que são imiscíveis ou miscíveissomente em uma extensão limitada um com o outro, que são geralmentereferidas como "fases." Uma fase está tipicamente na forma de gotículas(isto é, fase "dispersa", "descontínua" ou "interna"), enquanto o outro líquidoforma uma fase contínua (isto é, "coerente" ou "externa"). As formas menoscomuns de aplicação incluem emulsões múltiplas (isto é, as em que as gotí-culas da fase dispersa [ou descontínua], compreendem, por sua parte, gotí-culas de uma outra fase dispersa, como emulsões água /óleo /água [A/O/A]e emulsões óleo/água/óleo [O/A/O]).

Se a fase óleo for finamente distribuída nas fase água, entãoesta é uma emulsão óleo-em-água (emulsão O/A; por exemplo leite). O cará-ter básico de uma emulsão O/A é determinado pela água. Estas emulsõessão geralmente menos gordurosas sobre a pele, são ao contrário foscas, eabsorvem mais rapidamente na pele do que as emulsões A/O (água-em-óleo).

Os versados na técnica são familiarizados com um grande nú-mero de opções de formulação de preparações A/O estáveis para uso cos-mético e/ou dermatológico, incluindo tais formulações como cremes e un-güentos, que são espalháveis nas faixas de temperatura ambiente à tempe-ratura da pele, assim como loções e leites, que são mais escoáveis nestafaixa de temperatura.

A estabilidade de emulsões é dependente de sua viscosidade,em particular da viscosidade da fase externa. Uma emulsão se torna instávelquando as partículas finamente dispersas coletam juntas para formar agre-gados relativamente grandes, e as gotículas que estão em contato coales-cem. Este processo é referido como "coalescência." Quanto mais viscosa afase externa da emulsão, mais lento será o processo de coalescência. Emul-sões de consistência "líquida" (= escoável) são usadas em vários cosméti-cos (por exemplo, loções de cuidado da pele, loções de limpeza, loções paraa face, loções para as mãos, etc.). Estas composições geralmente tem umaviscosidade de cerca de 2000 mPa-s a cerca de 10.000 mPa-s. A estabilida-de de emulsões escoável este precisando de uma atenção particular porquemobilidade consideravelmente maior das partículas promove uma coales-cência mais rápida.

Sabe-se que as emulsões líquidas típica e atualmente em usogeralmente compreendem espessantes e não são estáveis em concentra-ções de eletrólitos relativamente elevadas. Isto é manifestado em separaçãode fase das composições. No entanto, em algumas modalidades, é desejá-vel usar alguns eletrólitos (por exemplo, filtros UV solúveis em água), a fimde ser capaz de usar as suas outras propriedades físicas, químicas ou fisio-lógicas. Apesar em muitos casos a escolha apropriada do sistema emulsifi-cante pode proporcionar algum remédio em alguma extensão, outras des-vantagens podem então surgir com freqüência.

Por exemplo, algumas desvantagens resultam devido ao fato deque emulsificantes, como finalmente qualquer substância química, pode dis-parar reações alérgicas ou reações com base em supersensibilidade (isto é,hipersensibilidade) do usuário. O uso de emulsificantes cosméticos comunsé geralmente completamente sem risco, apesar de para alguns indivíduos,as composições "hipoalergênicas" serem necessárias e/ou preferidas. Defato, em alguns indivíduos particularmente sensíveis, algumas dermatosessão disparadas por exposição a alguns emulsificantes e exposição à luz so-lar simultânea. Assim, como conhecido do versado, em algumas composi-ções, emulsificantes particulares são menos preferidos e/ou são evitados.

É possível preparar preparações isentas de emulsificante. Porexemplo, algumas preparações tem uma fase oleosa que contém gotículasde água dispersas (isto é, é similar a uma emulsão A/O). Estes sistemas sãoàs vezes chamados "hidrodispersões" ou "oleodispersões", dependendo doque é a fase dispersa e o que é a fase contínua.Para tecnologia cosmética, não é, no entanto, nem necessárionem possível prescindir de emulsificantes de modo geral, especialmenteporque se tem uma escolha pequena de emulsificantes particularmente sua-ves. No entanto, os emulsificantes em uso corrente falta uma faixa satisfato-riamente ampla de escolhas. Assim, o espectro de aplicação de preparaçõescosméticas correspondentemente suaves que são toleradas pela pele é limitado.

Além dos efeitos deletérios de alguns emulsificantes, exposiçãoa outros fatores é conhecida como prejudicando a pele e o cabelo. Por e-xemplo, o efeito prejudicial da porção ultravioleta de radiação solar sobre apele é geralmente conhecida. Apesar dos raios tendo um comprimento deonda menor do que 290 nm (isto é, a região UVC) serem absorvidos pelacamada de ozônio na atmosfera da terra, os raios na faixa entre 290 nm e320 nm (isto é, região UVB), causa eritema, queimadura solar simples ououtras queimaduras de severidade variada. O máximo de atividade de eritemade luz solar é dada como a região relativamente estreita em torno de 308 nm.

Numerosos compostos são conhecidos para prover proteçãocontra radiação UVB prejudicial. O mais comumente, estes compostos sãoderivados de 3-benzilidenocânfora, de ácido 4-aminobenzóico, de ácido ci-nâmico, de ácido salicílico, e benzofenona, e de 2-fenil-benzimidazol.

Também é importante ter substâncias de filtro disponíveis para afaixa entre cerca de 320 nm e cerca de 400 nm, a região de UVA, porqueseus raios também podem provocar dano. Durante um longo tempo, foi con-siderado de modo incorreto que a radiação UV-A de onda longa, tendo umcomprimento de onda de entre 320 nm e 400 nm tinha somente um açãobiológica negligenciável e que, conseqüentemente, os raios UV-B eram res-ponsáveis pelo maior fotodano à pele humana. No entanto, numerosos estu-dos recentes têm mostrado que a radiação UV-A é bem mais prejudicial doque a radiação UV-B com relação a disparar reações fotodinâmicas, especi-ficamente fototóxicas e mudanças crônicas na pele. Além disso, os efeitosprejudiciais de radiação UV-B pode ser ainda intensificados por exposição aradiação UV-A.Foi demonstrado que radiação UV-A sozinha e sob condições dodia-a-dia muito normais, é suficiente para danificar as fibras de elastina ecolágeno, que são de importância essencial para a estrutura e firmeza dapele, em um curto período. Isto leva a mudanças induzidas pela luz crônicasna pele, de modo que a pele "envelhece" prematuramente. A aparência clí-nica de pele envelhecida pela luz tipicamente inclui aumentadas linhas e ru-gas, e um relevo irregular com sulcos. Além disso, as áreas da pele afetadaspelo envelhecimento da pele induzido pela luz com freqüência mostram pig-mentação irregular. Em alguns casos, porções marrons, ceratoses, carcino-mas ou melanomas malignos surgem. A pele prematuramente envelhecidacomo um resultado da exposição diária a UV é também caracterizada comotendo uma atividade diminuída de células Langerhans e uma inflamaçãocrônica, leve.

Aproximadamente 90% da radiação ultravioleta que alcança aTerra consiste em raios UV-A. Apesar da quantidade de radiação UV-B al-cançando a Terra variar amplamente dependendo de numerosos fatores (porexemplo, época do ano e dia e/ou grau de latitude), os níveis de radiaçãoUV-A que alcançam a Terra permanecem relativamente constantes em umabase diária, sem levar em conta a época do ano ou fatores geográficos. Adi-cionalmente, a maior parte da radiação UV-A penetra na epiderme viva, en-quanto cerca de 70% dos raios UV-B são retidos pela camada córnea. A pro-teção preventiva contra os raios UV-A, por exemplo por aplicação de subs-tâncias de filtro de proteção à luz na forma de uma formulação cosmética oudermatológica à pele, é assim de fundamental importância.

Em geral, o comportamento de absorção de luz das substânciasde filtro de proteção à luz é muito bem-conhecido e documentado, principal-mente devido ao fato de que os países mais industrializados tem listas posi-tivas para o uso destas substâncias, que impõe padrões muito estritos sobrea documentação que acompanha cada produto que incorpora estas subs-tâncias. Para a concentração das substâncias nas formulações acabadas, osvalores de absorbância provêem um guia, porque a interação com substân-cias dentro da pele ou na própria superfície da pele com freqüência apresen-ta variáveis que podem impactar tão bem o comportamento das composi-ções em cada indivíduo. No entanto, é geralmente difícil estimar de ante-mão, quão uniforme e espessamente a substância de filtro é distribuída em esobre a camada córnea da pele.

Para testar o desempenho de proteção UV-A, uso é geralmentefeito do método IPD (escurecimento pigmento imediato IPD 5) conhecido dosversados. Este método é similar à determinação do fator de proteção solar, eprovê um método que indica quanto mais tempo a pele protegida com acomposição de proteção à luz pode ser irradiada com radiação UV-A antesda pigmentação que ocorre ser igual que a produzido para pele não protegida.

Outro método de teste que foi estabelecido em toda a Europa éo Padrão Australiano AS/NZS 2604:1997. Neste método, a absorção da pre-paração na região UV-A é medida. A fim de atender ao padrão, a preparaçãodeve absorver pelo menos 90% da radiação UV-A na região 320-360 nm.

É de preocupação na formulação de composições de filtro solarque a concentração de uso de substâncias de filtro de proteção à luz conhe-cidas que também demonstram uma ação de filtro elevada na região UV-A écom freqüência limitada pelo fato de que elas são combinadas com outrassubstâncias que estão em forma de sólidos. Assim, existem algumas dificul-dades de formulação associadas com a obtenção de um fator relativamenteelevado de proteção solar e desempenho de proteção a UV-A. No entanto,os versados na técnica são geralmente conscientes de meios para superare/ou compensar estas dificuldades.

Como as substâncias de filtro de proteção à luz são geralmentedispendiosas e algumas substâncias de filtro de proteção à luz são adicio-nalmente difíceis de incorporar em preparações cosméticas e/ou dermatoló-gicas em concentrações relativamente elevadas, algumas modalidades dapresente invenção foram projetadas para prover preparações simples e decusto-eficaz que, apesar de terem concentrações incomumente baixas desubstâncias de filtro de proteção à luz UV-A convencionais, mesmo assimelas alcançam desempenho de proteção a UV-A aceitável ou ainda elevado.No entanto, como conhecido na técnica, radiação UV tambémpode levar a reações fotoquímicas que produzem produtos que interferemcom o metabolismo da pele. Estes produtos de reação fotoquímica são pre-dominantemente compostos de radical livre (por exemplo, radicais hidroxila).

Fotoprodutos de radical livre não definidos que se formam na própria peletambém podem demonstrar reações secundárias descontroladas como umresultado de sua reatividade elevada. No entanto, singleto oxigênio, um es-tado excitado não de radical livre da molécula de oxigênio, também podesurgir durante a irradiação UV, como podem epóxidos de vida curta e muitosoutros. O singleto oxigênio, por exemplo, diferente de tripleto oxigênio nor-mal (estado base de radical livre) devido à sua aumentada reatividade. Noentanto, estados tripletos de "radical livre" reativos, excitados, da moléculade oxigênio também podem existir. Assim, a fim de evitar estas reações, an-tioxidantes e/ou removedores de radical livre, encontram uso em formula-ções cosméticas e/ou dermatológico.

Os compostos que são comumente usados como agentes deproteção à luz em formulações de proteção à luz cosméticas e/ou dermato-lógicas são geralmente caracterizadas como provendo uma boa proteção àluz. No entanto, existem desvantagens em que elas são às vezes difíceis deincorporar nas desejadas formulações em um modo satisfatório.

Como indicado acima, o fator de proteção solar (FPS) indicaquanto mais tempo a pele protegida com a composição de proteção à luzpode ser irradiada antes da reação de eritema que ocorre é igual que a pelenão protegida (isto é, dez vezes mais tempo comparado com a pele não pro-tegida para um FPS = 10). Consumidores conhecem bem o significado de"FPS" e escolhem produtos de cuidado da pele e/ou do cabelo com basenos valores FPS indicados em produtos. Consumidores esperam receberuma informação confiável dos fabricantes com relação ao fator de proteçãosolar, principalmente devido a um aumentado conhecimento público sobre aassociação exposição solar em excesso e câncer de pele, assim como enve-lhecimento prematuro. Além disso, em algumas parte do mundo, a degrada-ção da camada de ozônio é uma grande preocupação. Dependendo do tipode pele e da exposição solar esperada, os consumidores escolhem produtoscom FPS maior ou menor. No entanto, parece que se nota uma tendênciados consumidores selecionarem fatores de FPS relativamente elevados, par-ticularmente para produtos a serem aplicados às crianças e os com pele uni-forme. Em algumas modalidades, a presente invenção provê composiçõescom concentrações relativamente baixas de substâncias de filtro de proteçãoà luz convencionais, ainda assim com valores FPS que são aceitáveis paraos consumidores.

Em algumas modalidades preferidas, os constituintes básicosdas preparações de filtro solar providas pela presente invenção incluem: á-gua ou soluções aquosas, soluções etanólicas aquosas, óleos naturais e/ouquimicamente modificados e/ou óleos sintéticos; gorduras, ceras e substân-cias graxas naturais e sintéticas, preferivelmente ésteres de ácidos graxoscom álcoois de baixo número de carbono (por exemplo, com isopropanol,propileno glicol ou glicerol), ou ésteres de álcool graxo com ácidos alcanói-cos de índice carbono baixo ou com ácidos graxos; álcoois, dióis ou polióisde índice carbono baixo, e seus éteres, preferivelmente etanol, isopropanol,propileno glicol, glicerol, etileno glicol, éter monoetílico ou monobutílico deetilerio glicol, monometílico de propileno glicol, éter monoetílico ou monobutí-lico, éter monometílico ou monoetílico de dietileno glicol e produtos análo-gos. Em modalidades alternativamente preferidas, misturas de dois ou maisdestes constituintes encontram uso na presente invenção.

O termo "lipídeo" é com freqüência usado como um termo gené-rico para se referir a gorduras, óleos, ceras e similares. Além disso, os ter-mos "fase óleo" e "fase lipídeo" são também usados como sinônimo. No en-tanto, óleos e gorduras diferem uns dos outros em sua polaridade, o que édifícil de definir. Foi proposto adotar a tensão interfacial para água comouma medida do índice de polaridade index de um óleo o fase oleosa. Assim,contempla-se que a tensão interfacial pode ser considerada como uma me-dida apropriada de polaridade de um dado componente de óleo. A "tensãointerfacial" é a força que atua em uma linha imaginária de um metro emcomprimento nas interface entre duas fases. Neste medida, quanto menor atensão interfacial entre a fase óleo e água, maior a polaridade da fase oleosasendo analisada. A unidade física para esta tensão interfacial é convencio-nalmente calculada de relação força/ comprimento e é geralmente expressa-da em mN/m (millinewtons dividido por metros). Ela tem um sinal positivocaso se empenhe em reduzir a interface. No caso inverso, tem um sinal ne-gativo. Como usado aqui, lipídeos são considerados como "polares" se suatensão interfacial para água for água menor do que 30 mN/m.

"Óleos polares" incluem os do grupo de Iecitinas e de triglicerí-deos de ácido graxo, ou seja os ésteres triglicerol de ácidos alcanos carboxí-Iico saturados e/ou insaturados, ramificados e/ou não ramificados tendo umcomprimento de cadeia de 8 a 24, em particular 12 a 18, átomos de carbono.Em algumas modalidades, os triglicerídeos de ácido graxo são escolhidosdentre o grupo consistindo em óleos sintéticos, semi-sintéticos e naturais(por exemplo, azeite de oliva, óleo de girassol, óleo de soja, óleo de nozestrituradas, óleo de colza, óleo de amêndoas, óleo de palma, óleo de coco,óleo de rícino, óleo de germe de trigo, óleo de semente de uva, óleo de cra-vo, óleo de prímula da primavera, óleo de noz de macadame e outros). Noentanto, não se pretende que a presente invenção seja limitada a composi-ções que contem óleos polares particulares. Exemplos adicionais de óleospolares que encontram uso na presente invenção incluem o grupo de éste-res de ácidos alcano carboxílicos saturados e/ou insaturados, ramificadose/ou não ramificados tendo um comprimento de cadeia de 3 a 30 átomos decarbono e saturado e/ou insaturado, ramificados e/ou não ramificados álco-ois tendo um comprimento de cadeia de 3 a 30 átomos de carbono, e dogrupo de ésteres de ácidos carboxílicos aromáticos e saturados e/ou álcooisinsaturados, ramificados e/ou não ramificados tendo um comprimento decadeia de 3 a 30 átomos de carbono. Em algumas modalidades, estes óleosde éster são de miristato de isopropila, palmitato de isopropila, estearato deisopropila, oleato de isopropila, estearato de n-butila, Iaurato de n-hexila,oleato de n-decila, estearato de isooctila, estearato de isononila, isonona-noato de isononila, palmitato de 2-etilhexila, Iaurato de 2-etilhexila, estearatode 2-hexildecila, palmitato de 2-octildodecila, oleato de oleíla, erucato deoleíla, oleato de erucila, erucato de erucila e misturas sintéticas, semi-sintéticas e naturais destes ésteres (por exemplo, óleo de jojoba).

Além disso, em algumas modalidades, a fase oleosa é escolhidadentre o grupo consistindo em éteres de dialquila, assim como álcoois satu-rados ou insaturados, e ramificados ou não ramificados. Em algumas moda-lidades particularmente preferidas, a fase oleosa das composições das mo-dalidades preferidas também contém benzoato de C12-i5-alquila, enquantoem modalidades alternativas, as modalidades preferidas contém somente oúltimo. Em outras modalidades adicionais, a fase óleo é escolhida dentre ogrupo de álcoois Guerbet (isto é, o grupo de álcoois denominados por MareeiGuerbet que primeiro descreveu sua preparação). Estes álcoois são forma-dos de acordo com a equação:

<formula>formula see original document page 72</formula>

por oxidação de um álcool em um aldeído, por condensação aldol do aldeí-do, eliminação de água do aldol e hidrogenação do alil aldeído. ÁlcooisGuerbet são líquidos ainda em baixas temperaturas e resultam em virtual-mente nenhuma irritação da pele. Assim, eles encontram uso como constitu-intes de lubrificação, superlubrificação e também relubrificação em composi-ções de cuidado da pele e de cuidado do cabelo. De fato, o uso de álcooisGuerbet é conhecido na técnica da cosmética. Nestas aplicações, as espé-cies são geralmente caracterizadas como tendo a seguinte estrutura:

<formula>formula see original document page 72</formula>

Nesta estrutura, R1 e R2 são geralmente radicais alquila não ra-mificados. Em algumas modalidades preferidas da presente invenção, osseguintes álcoois Guerbet em que

R1 é propila, butila, pentila, hexila, heptila ou octila e/ou R2éhexi-Ia, heptila, octila, nonila, decila, undecila, dodecila, tridecila ou tetradecilaencontram uso na presente invenção. Em modalidades adicionais, álcoois

Guerbet preferidos incluem 2-butil octanol com a seguinte estrutura química:

<formula>formula see original document page 73</formula>

que é comercialmente disponível, por exemplo, sob nome comercial ISO-FOL® 12 (Condea Chemie GmbH), e 2-hexildecanol com a seguinte estrutura química:

<formula>formula see original document page 73</formula>

que é comercialmente disponível, por exemplo, sob nome comercial ISO-FOL® 16 (Condea Chemie GmbH).

Em modalidades adicionais, misturas de álcoois Guerbet encon-tram uso em composições da presente invenção. Por exemplo, misturas de2-butil octanol e 2-hexildecanol encontram uso em algumas modalidades. Aquantidade total de álcoois Guerbet nas preparações cosméticas ou derma-tológicas acabadas é selecionada dentre a faixa de até cerca de 25,0% empeso, preferivelmente cerca de 0,5 a cerca de 15,0% em peso, com base nopeso total da preparações. No entanto, não se pretende que a presente in-venção seja limitada a qualquer concentração particular nem faixa de con-centrações, como os versados na técnica sabem como para preparar ascomposições tendo concentrações apropriadas para as desejadas composi-ções e seus uso(s). Além disso, contempla-se que qualquer mistura de com-ponentes de óleo e/ou cera irá encontrar uso na presente invenção. Por e-xemplo, em algumas modalidades, ceras (por exemplo, palmitato de cetila)encontra uso como o único componente lipídeo da fase óleo. Em modalida-des adicionais, óleos não polares (por exemplo, os que são escolhidos den-tre o grupo de hidrocarbonetos ramificados e não ramificados e ceras de hi-drocarbonetos, em particular VASELINE® [isto é, petrolato], parafina, óleode esqualano e esqualeno, poliolefinas e poliisobutenos hidrogenados en-contram uso na presente invenção. Em algumas modalidades contendo poli-olefinas, polidecenos são as substâncias preferidas.

Componentes graxos e/ou ceras que encontram uso em modali-dades da presente invenção incluem mas não são limitados a ceras vege-tais, ceras animais, ceras minerais e ceras petroquímicas. Exemplos de ce-ras particularmente preferidas incluem cera candelila, cera de carnaúba, ce-ra japan, cera de gramínea esparto, cera de cortiça, cera guaruma, cera deóleo de germe de arroz, cera de cana de açúcar, cera de bagos, cera de ou-ricuri, cera montana, cera de jojoba, cera de manteiga de carité, cera de abe-lha, cera shellac, cachalote, Ianolina (cera de lã, gordura uropigial, ceresina,ozokerita (cera de terra), ceras de parafina e ceras microcristalinas.

Adicionais componentes graxos e/ou ceras que encontram usona presente invenção incluem ceras e/ou ceras sintéticas quimicamente mo-dificadas (por exemplo, as comercialmente disponíveis sob nomes comerci-ais SYNCROWAX® HRC [tribeenato de glicerila] e SYNSCROWAX® AW 1C[C18-C36 ácido graxo], que são disponíveis de CRODA GmbH), e ceras deéster montana, ceras Sasol, ceras jojoba hidrogenadas, ceras de abelha sin-téticas ou modificadas (por exemplo, cera de abelha dimeticona copoliol e/oucera de abelha C30-50 alquila), ceras de polialquileno, ceras de polietileno gli-col, assim como gorduras quimicamente modificadas (por exemplo, óleosvegetais hidrogenados, como óleo de rícino hidrogenado e/ou glicerídeosgraxos de coco hidrogenado), triglicerídeos (por exemplo, trihidroxistearina,ácidos graxos, ésteres de ácido graxo, e ésteres de glicol, como, estearatode C2O-C4Cralquila, estearato de C2o-C4o-alquilhidroxistearoíla e/ou glicol mon-tanato). Em outras modalidades, a presente invenção compreende algunscompostos de organossilicone, que tem propriedades físicas similares paraos componentes graxos e/ou ceras especificados (por exemplo, estearoxi-trimetilsilano). Em modalidades adicionais, os componentes graxos e/ou ce-ras são providos individualmente, enquanto em ainda outras modalidadeseles são providos como uma mistura. De fato, pretende-se que qualquer mis-tura desejada destes componentes de óleo e/ou cera encontrem uso em vá-rias modalidades da presente invenção.

Em algumas modalidades, a fase oleosa é selecionada dentre ogrupo consistindo em isostearato de 2-etilhexila, octildodecanol, isononanoa-to de isotridecila, isoeicosano, cocoato de 2-etilhexila, benzoato de Ci2-Ci5-alquila, triglicerídeo caprílico/caprico, e éter dicaprílico. Em modalidades al-ternativas, misturas de f várias fases oleosas são providas, incluindo masnão limitadas a misturas compreendendo um ou mais dentre octildodecanol,triglicerídeo caprílico/caprico, éter dicaprilílico, benzoato de Ci2-Ci5-alquila,isostearato de 2-etilhexila, isononanoato de isotridecila. A seguinte tabelaapresenta uma lista de lipídeos que encontram uso sozinhos ou em combi-nação com outros lipídeos em várias modalidades da presente invenção. Astensões interfaciais correspondentes para água são dadas na última coluna.No entanto, não se pretende que a presente invenção seja limitada a estescomponentes específicos, como outros componentes encontram uso em vá-rias modalidades da presente invenção, incluindo misturas de componentesmais ou menos polares e similares.

<table>table see original document page 75</column></row><table><table>table see original document page 76</column></row><table>

Em algumas modalidades, alguma parte ou toda a fase óleo daspreparações é selecionada dentre o grupo consistindo em silicones cíclicoe/ou linear que são também com freqüência referidos como "óleos de silico-ne." Em algumas modalidades, estes silicones ou óleos de silicone estãopresentes como monômeros que são geralmente caracterizados por elemen-tos estruturais como a seguir:<formula>formula see original document page 77</formula>

Silicones tendo duas ou mais unidades siloxila que encontramuso em algumas modalidades da presente invenção são geralmente caracte-rizados por elementos estruturais como a seguir:

<formula>formula see original document page 77</formula>

em que os átomos de silício podem ser substituídos por radicais alquila e/ouradicais arila idênticos ou diferentes, que são representados em termos ge-rais pelo radicais Ri a R4, onde vários diferentes radicais não são necessari-amente limitados a 4 e podem assumir valores de 2 a 200.000.

Silicones cíclicos a serem usados com vantagem de acordo coma invenção são geralmente caracterizados pelo elementos estruturais comoa seguir

<formula>formula see original document page 77</formula>

em que os átomos de silício podem ser substituídos por radicais alquila e/ouradicais arila idênticos ou diferentes, que são representados em termos ge-rais pelo radicais R1 a R4, onde vários diferentes radicais não são necessari-amente limitados a 4, η pode assumir valores de 3/2 a 20. Valores fracionaispara "n" levam em consideração que números impares de grupos siloxilapodem estar presentes no ciclo.

Em algumas modalidades, feniltrimeticona é selecionada comoum óleo de silicone. Outros óleos de silicone apropriados para uso em váriasmodalidades da presente invenção incluem, mas não são limitados a dimeti-cona, fenildimeticona, ciclometicona (octametilciclotetrassiloxano), hexame-tilciclotrissiloxano, polidimetilsiloxano, poli(metilfenilsiloxano), cetildimeticona,e beenoxidimeticona. Em modalidades alternativas, misturas destes compos-tos encontram uso na presente invenção, incluindo mas não limitadas a mis-turas de ciclometicona e isononanoato de isotridecila, e misturas de ciclome-ticona e isoestearato de 2-etilhexila. Em ainda modalidades adicionais, óleosde silicone de similar constituição, como os compostos referidos aos acimacujas cadeias de ácido orgânico foram derivatizadas (por exemplo, polietoxi-Iadas e/ou polipropoxiladas) encontram uso na presente invenção. Estesincluem, mas não são limitados tais compostos como copolímeros polissilo-xano-polialquil-poliéter como cetildimeticona copoliol (isto é, cetildimeticonacopoliol (e) poligliceril-4 isoestearato (e) Iaurato de hexila). De fato, não sepretende que a presente invenção seja limitada a qualquer óleo de siliconeespecífico nem mistura de óleos de silicone, como vários óleos encontramuso em várias modalidades da presente invenção.

Em modalidades adicionais, emulsões água em óleo (A/O) en-contram uso na presente invenção. Em algumas modalidades, emulsifican-tes A/O são usados com ou sem co-emulsificantes adicionais. Em ainda ou-tras modalidades, emulsões A/O da presente ainda compreendem um oumais emulsificantes, incluindo, mas não limitados a um ou mais dos seguin-tes compostos: lecitina, Ianolina cera microcristalina (Cera microcristalina)em mistura com óleo de parafina (parafina líquida), ozokerita, óleo de rícinohidrogenado, poligliceril-3 oleato, misturas de cera de lã ácido, misturas decera de lã álcool, isostearato de pentaeritritial, poligliceril-3 diisostearato, ce-ra de abelha (Cera alba) e ácido esteárico, dihidroxicetilfosfato de sódio emum mistura com éter hidroxicetílico de isopropila, dioleato de metilglicose,dioleato de metilglicose em uma mistura com hidroxiestearato e cera de abe-lha, óleo mineral em uma mistura com petrolato e ozokerita e oleato de glice-rila e álcool lanolínico, petrolato em uma mistura com ozokerita e óleo derícino hidrogenado e isoestearato de glicerila e oleato de poligliceril-3, PEG-7óleo de rícino hidrogenado, ozokerita e óleo de rícino hidrogenado, isostea-rato de poligliceril-4, isoestearato de poligliceril-4 em uma mistura com cetil-dimeticona copoliol e Iaurato de hexila, Iaurilmeticona copoliol, cetildimetico-na copoliol, polímero reticulado acrilato/ acrilato de Cio-C3o-alquila, Poloxâ-mero 101, dipolihidróxi estearato de poligliceril-2, diisoestearato de poliglice-ril-3, dipolihidroxiestearato de poligliceril-4, dipolihidroxiestearato PEG-30,poligliceril-3 diisoestearato de diisostearoíla, dipolihidróxi estearato de poli-gliceril-2, dipolihidróxi estearato de poligliceril-3, dipolihidróxi estearato depoligliceril-4, dioleato de poligliceril-3.

Em outras modalidades adicionais da presente invenção, emul-sões A/O da presente invenção compreendem um ou mais coemulsificantes,incluindo, mas não limitado aos seguintes: estearato de glicerila em umamistura com ceteareth-20, ceteareth-25, ceteareth-6 em uma mistura comálcool estearílico, álcool cetilstearílico em uma mistura com óleo de rícinoPEG-40 e cetilstearila sulfato de sódio, fosfato triceteareth-4, cetilstearil sul-fato de sódio, trilaureth-4 fosfato de lecitina, fosfato laureth-4, ácido esteári-co, estearato de propileno glicol SE, óleo de rícino hidrogenado PEG-25,óleo de rícino hidrogenado PEG-54, glicerídeos caprílico/caprico PEG-6, o-Ieato de glicerila em uma mistura com propileno glicol, ceteth-2, ceteth-20,polissorbato 60, estearato de glicerila em uma mistura com estearato PEG-100, laureth-4, ceteareth-3, éter de isostearil glicerila, álcool cetilestearílicoem uma mistura com sódio cetilestearílico sulfato, laureth-23, steareth-2,glicerila estearato em uma mistura com estearato PEG-30, estearato PEG-40, distearato glicol, copolímero PEG-22 dodecil glicol, estearato de poligli-ceril-2 PEG-4, ceteareth-20, sesquiestearato de metilglicose, steareth- 10,estearato de PEG-20, steareth-2 em uma mistura com distearato PEG-8,steareth-21, steareth-20, isosteareth-20, copolímero PEG-45/dodecil glicol,copolímero metóxi-PEG-22/dodecil glicol, estearato de glicerila PEG-20, cerade abelha PEG-8, Iaurato de poligliceril-2, succinato de isostearil diglicerila,fosfato de cloreto de estearamidopropil PG dimônio, estearato de glicerilaSE, ceteth-20, citrato de trietila, sesquistearato de metilglicose PEG-20, ce-teareth-12, citrato estearato de glicerila, fosfato de cetila, fosfato triceteareth-4, fosfato trilaureth-4, distearato de poliglicerila metilglicose, cetil fosfato depotássio, isosteareth-10, sesquiisoestearato de poligliceril-2, ceteth-10, oleth-20, isoceteth-20, estearato de glicerila em uma mistura com ceteareth-20,ceteareth-12, álcool cetilestearílico e palmitato de cetila, álcool cetilestearíli-co em uma mistura com estearato PEG-20, estearato PEG-30, estearatoPEG-40, e estearato PEG-100.

Em outras modalidades adicionais em que a fase óleo das pre-parações consiste pelo menos parcialmente em óleos de silicone, emulsifi-cantes de silicone encontram uso. Em algumas modalidades, os emulsifican-tes de silicone são selecionados dentre o grupo de substâncias ativas nainterface, alquilmeticona copolióis, e/ou alquil dimeticona copolióis, particu-larmente do grupo de compostos caracterizado pela seguinte estrutura química:

<formula>formula see original document page 80</formula>

em que X e Y1 independentemente um do outro, são escolhidos dentre ogrupo H e os grupos alquila ramificados e não ramificados, grupos acila egrupos alcóxi tendo 1 a 24 átomos de carbono, ρ é um número de O a 200, qé um número de 1 a 40, e r é um número de 1 a 100. Alguns exemplos deemulsificantes de silicone que encontram uso na presente invenção incluem,mas não são limitados a dimeticona copolióis (por exemplo, ABIL® B 8842,ABIL® B 8843, ABIL® B 8847, ABIL® B 8851, ABIL® B 8852, ABIL® B 8863,ABIL® B 8873, e ABIL® B 88183, todos sendo comercialmente disponíveis deTh. Goldschmidt AG). Um exemplo adicional de substâncias ativas nas inter-face que encontra uso na presente invenção inclui cetildimeticona copoliol(ABIL® EM 90), assim como ciclometiconadimeticona copoliol (ABIL® EM97), ambos sendo comercialmente disponíveis de Th. Goldschmidt AG. Umemulsificante adicional que tem demonstrado ser utilizável em várias compo-sições que encontra uso em modalidades da presente invenção é Iaurilmeti-cona copoliol (auxiliar de formulação Dow Corning® 5200), que é comercial-mente disponível de Dow Corning Ltd.

Em modalidades preferidas da presente invenção, a quantidadetotal de emulsificantes usados nas composições de cuidado pessoal (porexemplo, preparações cosméticas ou de cuidado da pele) estão presentesnas faixa de cerca de 0,1 a cerca de 10,0% em peso, preferivelmente cercade 0,5 a cerca de 5,0% em peso, com base no peso total da preparações.

No entanto, não se pretende que a presente invenção seja limitada a qual-quer concentração específica de emulsificante e/ou co-emulsificante, as vá-rias modalidades da presente invenção tendo concentrações e/ou faixas deconcentração diferentes preferidas.

Em algumas modalidades, a presente invenção provê emulsõesem várias formas, incluindo cremes de proteção da pele, loções para a pele,leites cosméticos, cremes de filtro solar, e leites de proteção solar. Em algu-mas modalidades preferidas, estas composições compreendem gorduras,óleos, ceras, e/ou outras substâncias graxas, assim como água, e um oumais emulsificantes como são comumente usados este tipo de formulação.

Além das emulsões líquidas e um pouco mais sólidas das loçõescosméticas de limpeza e/ou cremes de limpeza da presente invenção, a pre-sente invenção também provê preparações de limpeza pulverizáveis ("pulve-rizações de limpeza"), que são usadas, por exemplo, para remover a maqui-agem ou como loção de limpeza suave. Além disso, estas pulverizações delimpeza encontram uso em aplicações para o tratamento de pele com sinais.

Estas preparações de limpeza também encontram uso como "preparaçõesde enxágüe" (isto é, produtos que são enxaguados da pele após a aplicação).

Além dos constituintes acima, várias modalidades da presenteinvenção incluem componentes adicionais, como auxiliares e aditivos, inclu-indo mas não limitados a agentes avolumadores, cargas, perfume, corantes,emulsificantes, ingredientes ativos adicionais (por exemplo, vitaminas e pro-teínas), agentes de proteção à luz, estabilizadores, repelentes de insetos,álcool, substâncias de auto-bronzeamento, água, sais, antimicrobianos, pro-teases, e/ou ceratinase, etc. De fato, não se pretende que a presente inven-ção seja limitada a qualquer componente particular, desde que o componen-te ativo compreendendo um esqueletoe um peptídeo seja incluído. Ainda écontemplado que a presente invenção irá encontrar uso em numerosas evariadas preparações medicinais.

Em algumas modalidades preferidas, a presente invenção provêpreparações tópicas cosméticas e/ou dermatológicas apropriados para usocomo cremes de proteção da pele, leites de limpeza, loções de filtro solar,cremes nutritivos, cremes diurnos, cremes noturnos etc. Em algumas moda-lidades, a presente invenção encontra uso em componentes de composiçõesfarmacêuticas (isto é, fármacos). Em modalidades adicionais, a presenteinvenção encontra uso em cosméticos decorativos (por exemplo, formula-ções de maquiagem).

Em algumas modalidades particularmente preferidas, a presenteinvenção provê filtros solares utilizáveis em preparações cosméticas e/ou decuidado da pele. Além do ingrediente ativo usado de acordo com as modali-dades da presente invenção, em algumas modalidades, estas preparaçõespreferivelmente adicionalmente compreendem pelo menos um filtro de ban-da larga, e/ou pelo menos uma substância de filtro UVA e/ou pelo menosuma substância de filtro UVB e/ou pelo menos um pigmento inorgânico.

Em ainda outras modalidades, a presente invenção provê com-posições de cuidado pessoal que tem componentes de proteção UV, masque não são primariamente filtros solares. Por exemplo, em algumas moda-lidades, substâncias de filtro UV-A e/ou UV-B incorporadas em cremes diur-nos e/ou composições de cuidado do cabelo.

Em modalidades adicionais, as composições de cuidado pessoalda presente invenção compreendem ingredientes cosmeticamente ativos,auxiliares e/ou aditivos, como são comumente usados em tais preparações(por exemplo, antioxidantes, conservantes, bacteriocidas, perfumes, anties-pumas, corantes, pigmentos que tem uma ação de coloração, espessantes,substâncias tensoativas, emulsificantes, emolientes, umectantes e/ou ume-decedores, gorduras, óleos, ceras ou outros constituintes comuns de umaformulação cosmética ou dermatológica, como álcoois, polióis, polímeros,estabilizadores de espuma, eletrólitos, solventes orgânicos ou derivados desilicone). De fato, contempla-se que várias compostos irão encontrar uso nasvárias modalidades da presente invenção, como apropriado para o produto eo usuário.

Em ainda outras modalidades, conservantes, como os usadosem aplicações em alimentos e rações encontram uso em várias composi-ções da presente invenção. A seguinte tabela apresenta uma lista de taiscompostos, assim como o número E para cada composto. No entanto, nãose pretende que a presente invenção seja limitada a estes conservantes es-pecíficos, como Contempla-se que conservantes adicionais irão encontraruso em várias modalidades da presente invenção.

<table>table see original document page 83</column></row><table><table>table see original document page 84</column></row><table>

Conservantes adicionais que encontram uso em várias modali-dades incluem mas não são limitados adibromodicianobutano (2-bromo-2-bro-mometilglutarodinitrila), 3-iodo-2-propinilbutil carbamato, 2-bromo-2-nitropro-pano-1,3-diol, imidazolidiniluréia, 5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona, 2-cloroa-cetamida, cloreto de benzalcônio, álcool benzílico, e doadores de formal-deído. Outros conservantes que encontram uso em várias modalidades dapresente invenção incluem éteres de fenil hidroxialquila, em particular oscompostos conhecidos como "fenoxietanol", devido a seus efeitos bacterici-das e fungicidas sobre vários microorganismos.

Ainda outros agentes antimicrobianos são do mesmo modo a-propriados para uso em várias modalidades da presente invenção, incluindomas não limitadas a éter 2,4,4'-tricloro-2,-hidroxidifenila (isto é, IRGASAN®),1,6-di(4-clorofenilbiguanido)hexano (isto é, CHLORHEXIDIN), 3,4,4'-tricloro-carbanilida, compostos de amônio quaternário, óleo de cravo, hortelã, óleode timo, óleo de citrato de trietila, FARNESOL® (3,7,11 -trimetil-2,6,10-dode-catrien-1-ol) e os ingredientes e/ou combinações de ingredientes ativos des-critos em DE-37 40 186, DE-39 38 140, DE-42 04 321, DE-42 29 707, DE-4309 372, DE-44 11 664, DE-195 41 967, DE-195 43 695, DE-195 43 696, DE-195 47 160, DE-196 02 108, DE-196 02 110, DE-196 02 111, DE-196 31003, DE-196 31 004, DE-196 34 019, DE-42 29 737, DE-42 37 081, DE-4324 219, DE-44 29 467, DE-44 23 410, e DE-195 16 705, todos sendo aquiincorporados por referência. Em ainda outras modalidades, hidrogenocarbo-nato de sódio é também incluído em algumas composições da presente in-venção. No entanto, não se pretende que a presente invenção seja limitadaa qualquer antimicrobiano particular nem combinação de antimicrobianos,como vários compostos tendo estes efeitos irão encontrar uso em váriasmodalidades da presente invenção.

Em modalidades adicionais das composições de cuidado pesso-al da presente invenção, compostos como ativos antiirritantes e/ou antiinfla-matórios são incluídos. Em algumas modalidades, álcool batílico (éter de a-octadecila glicerila), álcool selaquílico (éter de a-9-octadecenil glicerila), ál-cool quimílico (éter de a-hexadecila glicerila), bisabolol, e/ou pantenol sãoincluídos. No entanto, não se pretende que a presente invenção seja limitadoa incorporação de quaisquer antiirritante(s) e/ou antiinflamatório (s) específi-ca, como vários compostos apropriados para estas aplicações encontramuso na presente invenção.

Em ainda outras modalidades da presente invenção, antioxidan-tes são incorporados nas composições de cuidado pessoal. Contempla-seque quaisquer antioxidantes apropriados irão encontrar uso nas composi-ções de cuidado pessoal da presente invenção. Antioxidantes apropriadosincluem, mas não são limitados a aminoácidos (por exemplo, glicina, histidi-na, tirosina, e triptofano) e seus derivados, imidazóis (por exemplo ácido u-rocânico) e seus derivados, peptídeos (por exemplo, D,L-carnosina, D-carnosina, e L-carnosina) e seus derivados (por exemplo, anserina), carote-nóides, carotenos (por exemplo, a-caroteno, β-caroteno, e γ-licopeno) e seusderivados, ácido clorogênico e seus derivados, aurotioglicose, propiltiouracilae outros tióis (por exemplo, tioredoxina, glutationa, cisteína, cistina, cistami-na e os ésteres de glicosila, N-acetila, metila, etila, propila, amila, butila elaurila, palmitoíla, oleíla, g-linoleíla, colesterila e glicerila dos mesmos) eseus sais, tiodipropionato de dilaurila, tiodipropionato de distearila, ácido tio-dipropiônico e seus derivados (por exemplo, ésteres, éteres, peptídeos, lipí-deos, nucleotídeos, nucleosídeos e sais), e compostos sulfoximina (por e-xemplo butionina sulfoximinas, homocisteína sulfoximina, butionina sulfonas,penta-, hexa-, e heptationina sulfoximina) em doses toleradas muito peque-nas, (por exemplo, tipicamente pmol a mmol/kg), agentes quelantes (por e-xemplo, ácidos graxos α-hidróxi, ácido palmítico, ácido fítico, e lactoferrina),ácidos α-hidróxi (por exemplo ácido cítrico, ácido láctico, e ácido málico),ácido úmico, ácido de bile, extratos de bile, bilirrubina, biliverdina, EDTA,EGTA e seus derivados, ácidos graxos insaturados e seus derivados (porexemplo, ácidos linolênicos, ácido linoléico, ácido oléico), ácido fólico e seusderivados, furfurilidenosorbitol e seus derivados, ubiquinona e ubiquinol eseus derivados, vitamina C e seus derivados (por exemplo, ascorbil fosfatode sódio, palmitato de ascorbila, fosfato de Mg ascorbila, e acetato de as-corbila), tocoferóis e derivados (por exemplo, acetato de vitamina E), benzo-ato de coniferila de resina benzoina, ácido ferúlico, furfurilidenoglucitol, car-nosina, hidroxitolueno de butila, hidroxianisol de butila, ácido nordihidroguai-acico, ácido nordihidroguaiaretico, trihidróxi butirofenona, ácido úrico e seusderivados, mannose e seus derivados, zinco e seus derivados (por exemplo,ZnO, ZnS04), selênio e seus derivados (por exemplo, selenometionina), es-tilbenos e seus derivados (por exemplo, oxido de estilbeno, oxido de trans-estilbeno) e seus derivados (por exemplo, sais, ésteres, éteres, açúcares,nucleotídeos, nucleosídeos, peptídeos e lipídeos) de referidos ingredientesativos que são apropriados para o uso pretendido da forma particular de rea-lização(s) da presente invenção.

Em algumas modalidades, a concentração de um ou mais antio-xidantes nas composições da presente invenção é preferivelmente de cercade 0,001 a cerca de 30% em peso, particularmente preferivelmente de cercade 0,05 a cerca de 20% em peso, e mais preferivelmente de cerca de 1 acerca de 10% em peso, com base no peso total da preparação. Em modali-dades adicionais, em que vitamina E e/ou seus derivados são utilizados co-mo antioxidante (s), a faixa preferida é de cerca de 0,001 a cerca de 10% empeso, com base no peso total da formulação. No entanto, não se pretendeque a presente invenção seja limitada a qualquer concentração(ões) de anti-oxidante específica(s), como várias concentrações irão encontrar uso nasvárias modalidades da presente invenção.

Em outras modalidades adicionais, a presente invenção provêpreparações apropriados para uso como desodorantes e/ou antiperspirantes.Contempla-se que qualquer um dos ingredientes ativo que comumente en-contram uso em tais preparações irão também encontrar uso em várias mo-dalidades da presente invenção. Componentes adicionais que são comu-mente usados em tais preparações também encontram uso em várias moda-lidades da presente invenção. Exemplos de tais compostos ativos e inativosincluem, mas não são limitados a mascaradores de odor (por exemplo, per-fumes), absorvedores de odor (por exemplo, filossilicatos descritos em DE-P40 09 347); assim como montmorilonita, caolinita, ilita, beidellita, nontronita,saponita, hectorita, bentonita, esmectita, e sais de zinco de ácido ricinoléico.Em algumas modalidades da presente invenção, a faixa de ingredientes ati-vos (isto é, um ou mais compostos) em tais preparações é preferivelmentede cerca de 0,001 a cerca de 30% em peso; mais preferivelmente de cercade 0,05 a cerca de 20% em peso; e o mais particularmente na faixa de cercade 1 a cerca de 10% em peso, com base no peso total da preparação.

Em algumas modalidades da presente invenção, a fase águatem um caráter de gel que, além de um teor eficaz de compostos e solvente(como apropriado) preferivelmente compreende água, ainda espessantesorgânicos e/ou inorgânicos, e/ou hidrocolóides.

Em algumas modalidades, espessantes inorgânicos são selecio-nados dentre o grupo consistindo em filossilicatos modificados, não modifi-cados, naturalmente ocorrendo, e sintéticos. Apesar de ser geralmente pre-ferível usar componentes puros, em algumas modalidades, misturas de dife-rentes filossilicatos modificados e/ou não modificados encontram uso emvárias composições da presente invenção. Como geralmente conhecido natécnica, filossilicatos são silicatos e alumossilicatos em que as unidades desilicato ou aluminato são unidas juntas via três ligações Si-O- ou Al-O- eformam uma estrutura de folha ondulada ou de camada. A quarta valênciaSi-O- ou Al-O- é saturada por cátions. Interações eletrostáticas relativamentefracas (por exemplo ligações de ponte hidrogênio) existem entre as camadasindividuais. A estrutura de camada é muito definida por ligações covalentes,fortes. A estequiometria dos silicatos em folha é (Si2O52") para estruturas desilicato puras e (AlmSi2"m05(2+m)') para alumossilicatos, em que "m" é um nú-mero maior que zero e menor que 2. Em algumas modalidades em que alu-mossilicatos estão presentes na ausência de silicatos puros, cada grupo Si4+substituído por Al3+ requer outro cátion carregado sozinho para neutralizar acarga. O balanço de carga é preferivelmente nivelado por H+, íons de metalalcalino ou íons de metal alcalino-terroso. Em modalidades alternativas, a-lumínio é usado como um contraíon. Em contraste com os alumossilicatos,estes compostos são referidos como "silicatos de alumínio." "Alumossilicatosde alumínio", em que alumínio está presente tanto a rede de silicato, e tam-bém como contraíon, também encontram uso em algumas modalidades dapresente invenção.

Filossilicatos são bem-conhecidos na técnica (Ver por exemplo,Hollemann et ai, Lehrbuch der Anoraanischen Chemie [Textbook of InorganicChemistry], 91st-100th Ed., Walter de Gruyter - Verlag [1985]; Remy, Lehrbuchder Anorqanischen Chemie. 12* Ed., Akademische Verlagsgesellschaft, Leipzig[1965]). A estrutura de camada de montmorilonita é também conhecida (vi-de, Rõmpps Chemie-Lexikon, Franckh'sche Verlagshandlung, W. Keller &Co., Stuttgart, 8th Ed., [1985], p. 2668 f). Exemplos de filossilicatos incluemos seguintes (montmorilonita é o mineral principal compreendendo as bento-nitas ocorrendo naturalmente);

<table>table see original document page 88</column></row><table>saPonita (Ca,Na)o,33((Mg,Fe)3(OH)2(Alo,33SÍ3,670io))

Hectorita Na0l33((MgtLi)3(OH1F)2(Si4C)Io))

Em algumas modalidades preferidas, formadores de gel inorgâ-nico incluindo mas não limitados a silicatos de alumínio, como as montmori-lonitas (bentonitas, hectoritas e seus derivados, como quaternium-18 bento-nita, quaternium-18 hectoritas, estearalcônio bentonitas e estearalcônio hec-toritas), e também silicatos de magnésio-alumínio (tipos VEEGUM®), e silica-tos de sódio-magnésio (tipos LAPONITE®) encontram uso na presente in-venção.

Montmorilonitas representam minerais de argila que são um tipode esmectitas dioctaédricas, e são massas que intumescem em água, masnão se tornam plásticas. Os pacotes de camadas nas estruturas de três ca-madas das montmorilonitas podem intumescer como um resultado de incor-poração de água reversível (em uma quantidade de duas a 7 vezes) e outrassubstâncias, como, por exemplo, álcoois, glicóis, piridina, picolina, compos-tos de amônio, ions hidróxi-aluminossilicato etc. A fórmula química dada a-cima proporciona apenas uma aproximação da fórmula, como montmoriloni-tas tem uma grande capacidade para troca iônica. Por exemplo, Al pode sersubstituído por Mg, Fe2+, Fe3+, Zn, Pb (por exemplo, de substâncias prejudi-ciais em águas usadas), Cr, Cu e outros elementos. A resultante carga nega-tiva das camadas octaédricas é compensada pela presença de cátions, emparticular Na+ (isto é, montmorilonita de sódio) e Ca2+ (isto é, montmorilonitade cálcio, um composto que é somente intumescível em uma extensão muitopequena) em posições intercamadas.

Em modalidades alternativas, silicatos de magnésio e/ou bento-nitas sintéticos encontram uso na presente invenção, incluindo mas não limi-tadas a tais compostos comercialmente disponíveis como OPTIGEL® (Süd-Chemie). Como indicado acima, em algumas modalidades, silicatos de alu-mínio como os comercialmente disponíveis VEEGUM® (R.T. Vanderbilt Comp.,Inc), encontram uso na presente invenção. Vários tipos de VEEGUM® que en-contram uso em várias modalidades da presente invenção são providos a-baixo.<table>table see original document page 90</column></row><table>

Os produtos acima intumescem em água para formar géis visco-sos, que tem uma reação alcalina. A organofilização de montmorilonita oubentonitas (troca dos cátions intercamadas para íons alquilamônio quaterná-rio) produz produtos (bentonas) que são preferivelmente usados para dis-persão em solventes orgânicos e óleos, gorduras, ungüentos, tintas, reves-timentos de superfície e em detergentes.

BENTONE® é um nome comercial para vários agentes gelifican-tes neutros e quimicamente inertes que são construídos de sais de amônioorgânicos de cadeia longa, e tipos específicos de montmorilonita. Os agen-tes gelificantes BENTONE® intumescem em meios orgânicos, que levam osmeios a também intumescer. Os géis são resistentes a ácidos diluídos e ál-calis, apesar de perderem parcialmente suas propriedades gelificantesquando de contato prolongado com ácidos e álcalis fortes. Devido ao seucaráter organofílico, os agentes gelificantes BENTONE® são somente umec-táveis por água com dificuldade. Existem vários tipos de agentes gelificantesBENTONE® comercialmente disponíveis, incluindo os vendidos por KronosTitan: BENTONE® 27, montmorilonita organicamente modificada; BENTO-NE® 34 (bentonita de dimetildioctilamônio; preparada de acordo com a Pa-tente US Nss 2,531,427, incorporada aqui por referência, que, devido a seusgrupos lipofílicos, intumesce mais prontamente em meio lipofílico do que emágua); BENTONE® 38, montmorilonita organicamente modificada, disponívelcomo uma pó colorido de creme a branco; BENTONE® LT, um mineral deargila purificado; BENTONE® Gel MIO, montmorilonita organicamente modi-ficada que é fornecida como uma suspensão muito fina em óleo mineral(SUS-71) (10% bentonita, 86,7% óleo mineral e 3,3% agente umectante);BENTONE® Gel IPM, bentonita organicamente modificada que é colocadaem suspensão em miristato de isopropila (10% bentonita, 86,7% isopropilmi-ristato, 3,3% agente umectante); BENTONE® Gel CAO, montmorilonita or-ganicamente modificada que é tomada em óleo de rícino (10% bentonita,86,7% óleo de rícino e 3,3% agente umectante); BENTONEC Gel Lantrol,montmorilonita organicamente modificada que, em forma de pasta, se desti-na a posterior processamento, em particular para a preparação, de composi-ções cosméticas; 10% bentonita, 64,9 LANTROL® (óleo de cera de lã), 22,0de miristato de isopropila, 3,0 agente umectante e 0,1 p-hidroxibenzoato depropila; BENTONE® Gel Lan I, uma pasta de BENTONE® 27 10% de po-tência em uma mistura de cera de lã USP e palmitato de isopropila; BEN-TONE® Gel Lan II, uma pasta de bentonita em líquido de cera de lã pura;BENTONE® Gel NV, uma pasta de BENTONE® 27 a 15% potência pastaem ftalato de dibutila; BENTONE® Gel OMS, uma pasta de bentonita emShellsol T.; BENTONE® Gel OMS 25, uma pasta de bentonita em hidrocar-bonetos isoparafínicos (IDOPAR® H); e BENTONE® Gel IPP, uma pasta debentonita em palmitato de isopropila.

"Hidrocolóide" é a abreviatura tecnológica para o nome mais cor-reto de "colóide hidrofílico." Hidrocolóides são macromoléculas que tem umaestrutura grandemente linear e forças intermoleculares de interação quepermitem ligações de valência primária e secundária entre as moléculas in-dividuais para formar uma estrutura reticular. Alguns hidrocolóides são polí-meros solúveis em água naturais ou sintéticos que, em sistemas aquosos,formam géis ou soluções viscosas. Estes compostos aumentam a viscosida-de de água por ou ligação das moléculas de água (hidratação), ou por ab-sorção e encapsulação da água em suas macromoléculas intertecidas, en-quanto limitando a mobilidade de água. Estes polímeros solúveis em águarepresentam um grande grupo de polímeros naturais e sintéticos que sãoquimicamente muito diferentes, mas que compartilham um aspecto comumem sua solubilidade em água ou meio aquoso. Um pré-requisito para isto éque estes polímeros tenham vários grupos hidrofílicos suficientes para solu-bilidade em água e não sejam muito reticulados. Estes grupos hidrofílicospodem ser de natureza não iônica, aniônica ou catiônica, por exemplo comoa seguir:

<formula>formula see original document page 92</formula>

Em algumas modalidades preferidas, o grupo dos hidrocolóidescosmeticamente e dermatologicamente relevantes são divididos nos seguin-tes grupos:, compostos naturais orgânicos (por exemplo, agar-agar, carra-geenano, tragacanto, goma arábica, alginatos, pectinas, polioses, farinha deguar, farinha de feijão alfarroba, amido, dextrina, gelatinas, e caseina); subs-tâncias orgânicas, modificadas naturais (por exemplo, carboximetilcelulose eoutros éteres de celulose, hidroxietilcelulose e hidroxipropilcelulose e celulo-se microcristalina); compostos orgânicos completamente sintéticos (por e-xemplo, compostos poliacrílicos e polimetacrílicos, polímeros de vinila, áci-dos policarboxílicos, poliéteres, poliiminas, poliamidas, e poliuretanos); ecompostos inorgânicos (por exemplo, ácidos polissilícicos, minerais de argi-la, como montmorilonitas, zeolitas, e sílicas).Em modalidades alternativas, etilceluloses encontram uso emcomposições da presente invenção como estabilizadores. Etilceluloses sãocaracterizadas pelo seguinte estrutura. Nesta estrutura, os Rs são ou gruposetila ou átomos de hidrogênio.

Em algumas modalidades preferidas, o grau de etilação na etil-celulose é de cerca de 2,0 a cerca de 3,0, correspondendo a cerca de 40 acerca de 55%, e mais preferivelmente cerca de 48,0 a cerca de 49,5% deetilação. A massa molecular média é preferivelmente escolhida de modo quea viscosidade de uma solução de aproximadamente 5% de potência em umamistura de 80 partes de tolueno e 20 partes de etanol a 25°C é 3 a 110mPas, e mais preferivelmente 9 a 11 mPas. Em algumas modalidades parti-cularmente preferidas, a massa molar média é de cerca de 100.000 a cercade 400.000 g/mol. Em algumas modalidades preferidas, a concentração deetilcelulose em composições da presente invenção está na faixa de cerca de0,1 a cerca de 10% em peso, com base no peso total da preparações. Váriasetilceluloses encontram uso na presente invenção, incluindo mas não limita-das às que são comercialmente disponível (por exemplo, ETHOCEL® Stan-dard 10 Premium; Dow Chemicals).

Em outras modalidades adicionais, celulose microcristalina en-contra usó como hidrocolóide em composições da presente invenção. Váriaspreparações de celulose microcristalina encontram uso na presente inven-ção, incluindo mas não limitadas às que são comercialmente disponíveis(por exemplo, AVICEL®, como AVICEL® RC-591, assim como AVICEL®RC/CL; AVICEL® CE-15; e AVICEL® 500; FMC Corporation Food andPharmaceutical Products). Em algumas modalidades particularmente prefe-ridas, AVICEL® RC-591 (uma celulose microcristalina modificada que é feitade 89% celulose microcristalina e 11% carboximetilcelulose de sódio) encon-tra uso na presente invenção.

Hidrocolóides adicionais que encontram uso na presente inven-ção incluem metilceluloses (isto é, ésteres de metil celulose). Estes compos-tos são caracterizados pela seguinte formula estrutural

<formula>formula see original document page 94</formula>

em que R pode ser a hidrogênio ou um grupo metila.

Ésteres de celulose mistos (geralmente referidos como metilce-luloses, que contém, além de um teor predominante de grupos metila, tam-bém grupos 2-hidroxietila, 2-hidroxipropila ou 2-hidroxibutila) também encon-tram uso em algumas modalidades da presente invenção. Em algumas mo-dalidades preferidas, hidroxipropil)metil- celuloses (por exemplo, METHO-CEL® E4M; Dow Química Co.) encontram uso na presente invenção.

Em ainda outras modalidades, carboximetilcelulose de sódio (is-to é, sal sódio do éter glicólico de celulose, para o qual R nas fórmulas estru-turais acima pode ser hidrogênio e/ou CH2-COONa) encontra uso na pre-sente invenção. Em algumas modalidades preferidas, carboximetilcelulosede sódio, também às vezes referido como "goma de celulose" (por exemplo,NATROSOL® Plus 330 CS; Aqualon) encontra uso na presente invenção.

Em modalidades adicionais, xantano (CAS N- 11138-66-2), (istoé, goma de xantano), um heteropolissacarídeo geralmente formado por fer-mentação de açúcar de milho e isolado como sal de potássio encontra usona presente invenção. Ele é produzido por Xanthomonas campestris e algu-mas outras espécies sob condições aeróbicas e tem um peso molecular de2x106 a 24x106. Xantano é formado a partir de uma cadeia tendo celulosecom cadeias laterais. A estrutura dos subgrupos consiste em glicose, man-nose, ácido glucurônico, acetato e piruvato. O número de unidades de piru-vato determina a viscosidade do xantano.

Em ainda outras modalidades, carrageeno é usado como umformador de gel em composições da presente invenção. Este composto éum extrato de algas vermelhas do Atlântico Norte (Florideae; Chondrus cris-pus e Gigartina stellata) que tem uma estrutura similar à de agar. O termo"carrageeno" é freqüentemente usado em referência a um produto de algaem pó e "carrageeno" é usado em referência ao seu extrato. O carrageenoprecipitado de um extrato de água quente de algas é um pó incolor a colori-do como areia, com um peso molecular na faixa de cerca de 100.000 a cercade 800.000 e um teor de sulfato de cerca de 25%. Carrageenano1 que é mui-to prontamente solúvel em água quente, forma um gel tixotrópico quando doresfriamento, mesmo se o teor de água for de 95-98%. A rigidez do gel éafetada pela estrutura de hélice dupla do carrageeno.

No caso de carrageenano, três constituintes principais são dife-renciados. A "fração κ" formadora de gel consiste em D-galactose 4-sulfato e3,6-anidro-a-D-galactose, que tem ligações alternadas de glicosídeos naposição 1,3- e 1,4 (em contraste, agar contém 3,6-anidro-a -L-galactose). A"fração λ" não gelificante é composta de radicais D-galactose 2-sulfato 1,3-glicosidicamente ligada e 1,4-ligado D-galactose-2,6-dissulfato, e é pronta-mente solúvel em água fria. Finalmente, "ι-carrageenano", composto de D-galactose 4-sulfato em ligação 1,3 e 3,6-anhidro- α-D-galactose 2-sulfato emligação 1,4, são ambos solúveis em água e também formadores de gel. Anatureza de quaisquer cátions que estão presentes (K+, NH4+, Na+, Mg2+,Ca2+) também influencia a solubilidade do carrageenos.

Em outras modalidades adicionais, quitosano (isto é, quitina par-cialmente desacilada) encontra uso em várias composições da presente in-venção. Quitosano tem propriedades formadoras de película e é caracteriza-do como tendo um tato sedoso na pele. Uma desvantagem de alguns uso ésua aderência severa sobre a pele que ocorre temporariamente (geralmente)durante aplicação. Devido a esta aderência, algumas preparações não sãoaceitáveis pelos consumidores. No entanto, quitosano encontra uso em al-gumas preparações, incluindo composições de cuidado do cabelo, como émelhor do que quitina em espessamento e/ou estabilização, assim comomelhora a adesão e resistência à água de películas poliméricas. O uso dequitosano é bem-conhecido do versado na técnica de cuidado pessoal (Verpor exemplo, Fiedler, Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie. Kosmetik undanqrenzende Gebiete. [Lexikon of auxiliares for pharmacy, cosmetics andrelated fields], 3aed„ Edition Cantor, Aulendorf, [1989], p. 293). Quitosano écaracterizado pela seguinte fórmula estrutural:

<formula>formula see original document page 96</formula>

Onde n assume valores de ate cerca de 10 000, e X e ou o radical acetila ouhidrogênio. Quitosano forma por desacetilação e despolimerização parcial(hidrólise) de quitina, que é caracterizada pelo formula estrutural

<formula>formula see original document page 96</formula>

Quitina e um constituinte essencial do ectoesqueleto do artropode (por e-xemplo insetos, caranguejos, e aranhas), e é também encontrado nos teci-dos conectivos e/ou de suporte de outros organismos (por exemplo molus-cos, algas, e fungos). Na região de cerca de pH <6, quitosano é positiva-mente carregado e nesta faixa é também solúvel em sistemas aquosos. Eleé incompatível com matérias-primas aniônicas. Por esta razão, a fim de pre-parar emulsões óleo-em-água contendo quitosano, o uso de emulsificantesnão iônicos é apropriado (Ver por exemplo, EP 776 657). Em algumas moda-lidades preferidas, as composições da presente invenção contém pelo me-nos um quitosano com um grau de desacetilação de pelo menos cerca de > 25%, e mais preferivelmente, a faixa de mais do que cerca de 55 a cerca de99% (como determinado por meio de 1H-RMN). Em algumas modalidades,quitosanos de peso moleculares entre cerca de 10.000 e cerca de1.000.000, em particular os com peso molecular entre 100.000 e 1.000.000(determinado por meio de cromatografia de permeação de gel) encontramuso na presente invenção.

Em ainda outras modalidades, poliacrilatos encontram uso comoagentes gelificantes em algumas composições da presente invenção. Polia-crilatos apropriados incluem mas não são limitados a copolímeros acrilato-acrilato de alquila, em particular os escolhidos dentre o grupo de carbômerosou copolímeros CARBOPOL® (B. F. Goodrich Co.). Em particular, os copo-límeros acrilato- acrilato de alquila que encontram uso em algumas modali-dades da presente invenção tem a seguinte estrutura:

<formula>formula see original document page 97</formula>

onde R' é um radical alquila de cadeia longa, e χ e y representam númerosque simbolizam a respectiva proporção estequiométrica de cada um doscomonômeros.

Em algumas modalidades, copolímeros de acrilato e/ou copolí-meros de acrilato- acrilato de alquila, incluem mas não são limitados aos quesão comercialmente disponíveis (por exemplo, CARBOPOL® 1382, CAR-BOPOL® 981, e CARBOPOL® 5984; B. F. Goodrich Co., e em particular,poliacrilatos do grupo de CARBOPOL tipos 980, 981, 1382, 2984, 5984 eCarbomer 2001). Em modalidades adicionais, copolímeros de acrilatos deCio-30-alquila e um ou mais monômeros de ácido acrílico, de ácido metacríli-co ou seus ésteres que são reticulados com um éter alílico de sacarose ouum éter alílico de pentaeritritol encontram uso em algumas modalidades dapresente invenção.

Compostos que transportam o nome INCI para "polímeros cru-zados de acrilatos/Cio-3o alquil acrilato" também encontram uso em algumasmodalidades da presente invenção. Em algumas modalidades, polímeroscomercialmente disponíveis (por exemplo, PEMULEN® TR1 e PEMULEN®TR2; B. F. Goodrich Co.) encontram uso em algumas modalidades da pre-sente invenção, apesar não se pretender que a presente invenção seja limi-tada a qualquer composição contendo acrilato específica.

Em outras modalidades adicionais, compostos que transportamo nome INCI para "copolímeros acriloildimetiltauratos de amônio / vinil pirro-lidona" encontram uso na presente invenção. Estes copolímeros acriloildime-tiltauratos de amônio / vinil pirrolidona tem a fórmula empírica [C7Hi6N2SO4],![C6H9NO]m, que corresponde à seguinte estrutura:

<formula>formula see original document page 98</formula>

As espécies preferidas deste composto são listadas ChemicalAbstracts sob números de registro 58374-69-9, 13162-05-5 e 88-12-0, e sãocomercialmente disponíveis (por exemplo, ARISTOFLEX®; Clariant GmbH).

No entanto, não se pretende que a presente invenção seja limitada a qual-quer espécie particular. Em outras modalidades adicionais da presente in-venção, copolímeros/polímeros cruzados compreendendo acriloildimetil tau-rato (por exemplo, SIMUGEL® EG e SIMUGEL® EG; Seppic S.A.) encon-tram uso em algumas composições da presente invenção.

Hidrocolóides completamente sintéticos adicionais, que encon-tram uso na presente invenção, incluem, mas não são limitados a poliureta-nos aniônicos que são solúveis ou dispersíveis em água e que são com van-tagem obteníveis de:

Aa) pelo menos um composto que contém dois ou mais átomosde hidrogênio ativos por molécula,Ab) pelo menos um diol contendo grupos ácido ou sal, e

Ac) pelo menos um diisocianato.

Em algumas modalidades preferidas, o componente Aa) é, emparticular, um diol, aminoálcool, diamina, poliesterol, polieterol com a pesomolecular médio numérico de, em cada caso, até 3000, ou suas misturas,onde até 3 mol% de referidos compostos podem ser substituídos por trióisou triaminas. Preferência é dada a dióis e poliesterdióis. Em particular, ocomponente Aa) compreende pelo menos 50% em peso, com base no pesototal da componente Aa), de um poliesterdiol. Poliesterdióis apropriados sãotodos os que são comumente usados para a preparação de poliuretanos, emparticular os produtos de reação of ácido itálico e dietileno glicol, ácido isof-tálico e 1,4-butanodiol, ácido isoftálico / ácido adipico e 1,6-hexanodiol, eácido adipico e etileno glicol ou 5-NaS03- ácido isoftálico, ácido ftálico, ácidoadipico e 1,6-hexanodiol.

Exemplos de dióis que encontram uso em algumas modalidadesda presente invenção incluem, mas não são limitados a etileno glicol, propi-Ieno glicol, butileno glicol, neopentil glicol, polieteróis (por exemplo, polietile-no glicóis tendo pesos moleculares de até 3000), copolímeros em bloco deóxido de etileno e óxido de propileno com pesos moleculares médios numé-ricos de até 3000, e copolímeros em bloco de óxido de etileno, óxido de pro-pileno e óxido de butileno que contém as unidades de óxido de alquilenocopolimerizadas em modo aleatoriamente distribuído ou na forma de blocos.Preferência é dada a etileno glicol, neopentil glicol, di-, tri-, tetra-, penta- ouhexaetileno glicol. Outros dióis que encontram uso incluem poli(ácido a-hidroxicarboxílico) dióis.

Aminoálcoois apropriados que encontram uso em algumas mo-dalidades da presente invenção incluem mas não são limitados a 2-amino-etanol, 2-(N-metilamino)etanol, 3-aminopropanol, e 4-aminobutanol.

Em algumas modalidades, diaminas como etilenodiamina, propi-lenodiamina, 1,4-diaminobutano, 1,6-diaminohexano, e α,ω-diaminas quepodem ser preparadas por aminação de óxidos de polialquileno com amôniaencontram uso em algumas composições da presente invenção.Componente Ab) é, em particular, ácido dimetilolpropanóico ouum composto com a fórmula:

<formula>formula see original document page 100</formula>

onde RR é em cada caso um grupo C2-Ci8-alquileno e Me é Na ou K.

Componente Ac) é, em particular, hexametileno de diisocianato,diisocianato de isoforona, isocianato de metildifenila (MDI), e/ou diisocianatode tolileno.

Em algumas modalidades, os poliuretanos são obtidos por rea-ção dos compostos de grupos Aa) e Ab) sob atmosfera de gás inerte em umsolvente inerte em temperaturas de 70 a 130°C com o composto de grupoAc). Esta reação pode ser realizada, onde apropriado, na presença de ex-tensores de cadeia a fim de preparar poliuretanos com pesos molecularesrelativamente elevados. Como é comum na preparação de poliuretanos, oscomponentes [(Aa)+(Ab)]:Ac são com vantagem usados na relação molar de0,8 a 1,1 : 1. O número ácido do poliuretanos é determinado pela composi-ção e a concentração dos compostos de componente (Ab) na mistura decomponentes (Aa) e (Ab).

Em algumas modalidades, os poliuretanos têm valores K de a-cordo com H. Fikentscher (determinado em soluções a 0,1% em peso depotência em N-metilpirrolidona a 25°C e pH 7) de cerca de 15 a cerca de100, e preferivelmente cerca de 25 a cerca de 50. O valor K (isto é, "viscosi-dade intrínseca"), é um parâmetro que é fácil de determinar por meio de vis-cosidades medidas de soluções de polímero e é assim usado com freqüên-cia no setor industrial para a caracterização de polímeros. Poliuretanos con-tendo grupos ácido que encontram uso em algumas modalidades da presen-te invenção incluem, mas não são limitados a poliuretanos que são solúveisem água ou dispersíveis sem a ajuda de emulsificantes após neutralizaçãoparcial ou completa. Os sais dos poliuretanos geralmente tem melhor solubi-Iidade ou dispersibilidade em água do que os poliuretanos não neutralizados.

Bases que encontram uso para a neutralização dos poliuretanos incluembases de metal alcalino (por exemplo, solução de hidróxido de sódio,, solu-ção de hidróxido de potássio, soda, hidrogenocarbonato de sódio, potássiocarbonato ou hidrogeno-carbonato de potássio) e bases de metal alcalino-terroso (por exemplo, hidróxido de cálcio, óxido de cálcio, hidróxido de mag-nésio ou carbonato de magnésio, e amônia e aminas). Em algumas modali-dades, 2-amino-2-metilpropanol, dietilaminopropilamina e triisoproanolaminaencontram uso particular na neutralização dos grupos ácidos contendo poliu-retanos. Em outras modalidades adicionais, a neutralização dos poliuretanoscontendo grupos ácidos é realizada usando misturas de duas ou mais bases(por exemplo misturas de solução de hidróxido de sódio e triisopropanolami-na). Dependendo do uso pretendido, a neutralização é parcial (por exemplocerca de 20 a cerca de 40%) ou completa (isto é, 100%). Estes polímeros esua preparação são descritos em maiores detalhes em DE-A-42 25 045, in-corporado aqui por referência.

B. Poliuretanos e poliuréias catiônicos solúveis ou dispersíveisem água:

Ba) pelo menos um diisocianato, que já pode ter sido reagidoantes com um ou mais compostos que contém dois ou mais átomos de hi-drogênio ativo por molécula, e

Bb) pelo menos um diol, amino álcool primário ou secundário,diamina primária ou secundária ou triamina primária ou secundária com umou mais átomos de amino nitrogênio terciários, quaternários ou protonadosterciários.

Preferidos diisocianatos são os dada acima sob A). Compostoscom dois ou mais átomos de hidrogênio ativos são dióis, aminoálcoois, dia-minas, poliesteróis, poliamidadiaminas e polieteróis. Compostos apropriadosdeste tipo são os dados acima sob A).

Os poliuretanos são preparados como descrito acima sob A).Grupos catiônicos carregados pode ser produzidos nas poliuréias a partirdos átomos de amino nitrogênio terciários presentes ou por protonação, (porexemplo, com ácidos carboxílicos como ácido láctico), ou por quaternização(por exemplo com agentes alquilantes como halogenetos de Ci a C4-alquila)ou sulfatos. Exemplos destes agentes alquilantes incluem, mas não são limi-tados a cloreto de etila, brometo de etila, cloreto de metila, brometo de meti-la, sulfato de dimetila e sulfato de dietila. Estes polímeros e sua preparaçãosão descritos em maiores detalhes em DE-A-42 41 118, que é incorporadoaqui por referência.

C. Poliuretanos lineares com grupos carboxilato deCa) um ácido 2,2-hidroximetil-substituído carboxílico da fórmula

<formula>formula see original document page 102</formula>

em que RR' é um átomo de hidrogênio ou um grupo CrC2o-alquila, que éusado em uma quantidade que é suficiente para cerca de 0,35 a cerca de2,25 miliequivalentes de grupos carboxila para estar presente nos poliureta-nos por g de poliuretano,

Cb) cerca de 10 a cerca de 90% em peso, com base no pesodo poliuretano, de um ou mais compostos orgânicos com não mais do quedois átomos de hidrogênio ativos e

Cc) um ou mais diisocianatos orgânicos.

Em algumas modalidades preferidas, os grupos carboxila pre-sentes no poliuretano são, finalmente, pelo menos parcialmente neutraliza-dos com uma base apropriada. Estes polímeros e sua preparação são des-critos em EP-A-619 111, incorporado aqui por referência.

D. Produtos de policondensação contendo carboxila de anidri-dos de ácidos tri- ou tetracarboxílicos e dióis, diaminas ou aminoálcoois (po-liésteres, poliamidas ou poliéster amidas). Estes polímeros e sua preparaçãosão descritos em maiores detalhes em DE-A-42 24 761, incorporado aquipor referência.Ε. Poliacrilatos e polimetacrilatos, como são descritos em maio-res detalhes em DE-A-43 14 305, 36 27 970 e 29 17 504, todos sendo incor-porados aqui por referência.

Os polímeros usados em algumas modalidades da presente in-venção tem um valor K de cerca de 15 a cerca de 100, e mais preferivelmen-te de cerca de 25 a cerca de 50. Os polímeros estão geralmente presentesna composição em uma quantidade na faixa de cerca de 0,2 a cerca de 20%em peso, com base no peso total das composições. O sal é usado em umaquantidade efetiva para melhorar a capacidade de troca dos polímeros. O salé geralmente usado em uma quantidade de cerca de 0,02 a cerca de 10%em peso, e mais preferivelmente de cerca de 0,05 a cerca de 5% em peso, eem particular, de cerca de 0,1 a cerca de 3% em peso, com base no pesototal da composição.

A quantidade total de um ou mais hidrocolóides em algumasmodalidades das composições de cuidado pessoal da presente invenção émenor do que cerca de 5% em peso, preferivelmente entre cerca de 0,05 ecerca de 3,0% em peso, e mais preferivelmente entre cerca de 0,1 e cercade 1,0% em peso, com base no peso total da preparações.

Em algumas modalidades adicionais, agentes interface- e/outensoativos são incluídos em algumas composições de cuidado pessoal dapresente invenção, incluindo mas não limitadas a emulsificantes catiônicos(por exemplo, tensoativos quaternário).

Tensoativos quaternários que contém pelo menos um átomo Nque é covalentemente ligado a 4 grupos alquila ou arila. Isto leva, em levarem conta o pH, a uma carga positiva. Alquilbetaína, alquilamidopropilbetaínae alquilamidopropilhidroxissultaína são exemplos de tensoativos quaterná-rios que encontram uso em algumas modalidades da presente invenção.

Os tensoativos catiônicos providos em algumas modalidades dapresente invenção também incluem, mas não são limitados a compostos deamônio quaternário, em particular cloretos ou brometos de benziltrialquila-mônio (por exemplo, cloreto de benzildimetilestearil amônio), sais de alquil-trialquilamônio (por exemplo, cloreto ou brometo de cetiltrimetilamônio), cio-retos ou brometos de alquildimetilhidroxietilamônio, cloretos ou brometos dedialquildimetilamônio, sulfatos de éter de alquilamidoetiltrimetilamônio, saisde alquil piridínio (por exemplo, cloreto de Iauril- ou cetilpirimidínio), deriva-dos de imidazolina, e compostos com um caráter catiônico, como óxidos deamina (por exemplo, óxidos de alquildimetilamina ou óxidos de alquilaminoe-tildimetilamina). Em algumas modalidades preferidas, sais de cetiltrimetila-mônio encontram uso em algumas composições de cuidado pessoal da pre-sente invenção.

Em outras modalidades adicionais, polímeros catiônicos (porexemplo, JAGUAR® C 162 [cloreto de hidroxipropil guar hidroxipropiltrimô-nio]), silicatos de alumínio magnésio modificados (por exemplo, quaternium-18-hectorita, que é comercialmente disponível (por exemplo, BENTONE®38; Rheox), e/ou hectorita de estearalcônio, que é comercialmente disponí-vel (por exemplo, gel SOFTISAN®; Hüls AG) encontram uso em algumascomposições de cuidado pessoal da presente invenção. No entanto, não sepretende que a presente invenção seja limitada a qualquer particular políme-ro catiônico.

Em ainda outras modalidades, algumas composições da presen-te invenção compreendem espessantes de óleo a fim de melhor as proprie-dades táteis de emulsões. Espessantes de óleos preferidos incluem, masnão são limitados a outros sólidos (por exemplo, óxidos de silício hidrofóbi-cos do tipo AEROSIL®, que são disponíveis de Degussa AG). Exemplos detipos de óxidos AEROSIL® vantajosos incluem AEROSIL® 0X50, AERO-SIL® 130, AEROSIL® 150, AEROSIL® 200, AEROSIL® 300, AEROSIL®380, AEROSIL® MOX 80, AEROSIL® MOX 170, AEROSIL® COK 84, AE-ROSIL® R 202, AEROSIL® R 805, AEROSIL® R 812, AEROSIL® R 972,AEROSIL® D R 974 e AEROSIL® R976.

Em algumas modalidades adicionais, algumas composições decuidado pessoal da presente invenção compreendem pelo menos um "sabãode metal" (isto é um sal de um ácido graxo superior, com a exceção do salde metal alcalino), que funcionam como espessantes de óleos. Exemplosdestes sabões de metal incluem, mas não são limitados a estearato de alu-mínio, estearato de zinco e/ou estearato de magnésio.

Em algumas outras modalidades, algumas composições de cui-dado pessoal compreendem pelo menos um tensoativo anfotérico e/ou zwi-teriônico (por exemplo, cocamidopropilbetaína) e/ou umectante (por exemplobetaína). Exemplos de tensoativos anfotéricos que encontram uso em taismodalidades da presente invenção incluem mas não são limitados a a-cil/dialquiletilenodiamina (por exemplo, acilanfoacetato de sódio), acilanfodi-propionato de dissódio, alquilanfodiacetato de dissódio, acilanfohidroxipropil-sulfonato de sódio, acilanfodiacetato de dissódio, acilanfopropionato de só-dio, N-alquilaminoácidos, por exemplo aminopropilalquilglutamida, ácido al-quilaminopropiônico, alquilimidodipropionato de sódio, e Iauroanfocarboxigli-cinato.

Em algumas modalidades, a quantidade substâncias de interfa-ce ou tensoativas (um ou mais compostos) nas preparações está preferivel-mente entre cerca de 0,001 e cerca de 30% em peso, e mais preferivelmenteentre cerca de 0,05 e cerca de 20% em peso, o mais preferivelmente entrecerca de 1 e cerca de 10% em peso, com base no peso total da preparação.

Em algumas outras modalidades adicionais, os ingredientes ati-vos (um ou mais compostos) compreendem pelo menos um ingrediente ativolipofílico. Em algumas modalidades, estes ingredientes ativos lipofílicos sãoselecionados dentre o grupo consistindo em ácido acetil salicílico, atropina,azuleno, hidrocortisona e seus derivados (por exemplo, hidrocortisona-17-valerato), B vitaminas, vitaminas D, vitamina B1, vitamina B12, vitamina D1,retinóide, bisabolol, ácidos graxos insaturados (por exemplo ácidos graxosessenciais, com freqüência também referido como "vitamina F"), ácido γ-linolênico, ácido oléico, ácido eicosapentenóico, ácido docosahexenóico eseus derivados, cloranfenicol, cafeína, prostaglandinas, timol, cânfora, extra-tos ou outros produtos de uma origem vegetal e animal (por exemplo óleo deprímula da primavera, óleo de boragem ou semente de passa de corinto,óleos de peixe e óleo de fígado de bacalhau), e ceramidas e compostos si-milares a ceramida, etc. Em algumas modalidades, os ingrediente(s) ativo(s)são substâncias sobre-engordurantes (por exemplo, óleo de purcelina, EU-CERIT® e/ou NEROCERIT®).

Em ainda algumas outras modalidades, o(s) ingrediente(s) ati-vo(s) compreendem inibidores de NO sintesase. Estas modalidades encon-tram uso particular em tratamento e/ou profilaxia dos sinais e sintomas asso-ciados com o envelhecimento da pele intrínseco e/ou extrínseco, assim co-mo para o tratamento e/ou profilaxia associados com os efeitos nocivos deradiação ultravioleta sobre a pele. Em algumas modalidades preferidas, oinibidor de NO sintase é nitroarginina.

Em ainda algumas modalidades adicionais, o(s) ingrediente(s)ativo (s) é/são catequinas, ésteres de biles de catequinas, e/ou extratos a-quosos ou orgânicos de plantas ou seções de plantas que tem um teor decetequinas ou ésteres de bile de catequinas (por exemplo, as folhas da famí-lia da planta Theaceae, em particular da espécies Camellia sinensis [cháverde]). Seus ingredientes típicos (por exemplo, polifenóis ou catequinas,cafeína, vitaminas, açúcares, minerais, aminoácidos, lipídeos) encontramuso particular em algumas modalidades da presente invenção.

Em algumas modalidades, catequinas encontram uso na pre-sente invenção. Catequinas são um grupo de compostos que são considera-dos como flavonas hidrogenadas ou antocianidinas, e são derivadas de "ca-tequina" (catecol, 3,3',4',5,7-flavanpentol, 2-(3,4-dihidroxifenil)croman-3,5,7-triol). Epicatequina ((2R,3R)-3,3\4*,5,7-flavanpentol) é também um ingredien-te ativo que encontra uso em algumas modalidades da presente invenção.

Em outras modalidades adicionais, extratos de plantas com umteor de catequina, em particular extratos de chá verde (por exemplo, extratosde folhas da planta do gênero Camellia, em particular os usados para chácomo C. sinenis, C. assamica, C. taliensis. e C. irrawadiensis e híbridos des-tas espécies com outras espécies, como C. japonica) encontram uso em al-gumas composições de cuidado pessoal da presente invenção.

Em ainda outras modalidades, ingredientes ativos preferidosincluem polifenóis e catequinas do grupo (-)-catequina, (+)-catequina, gaiatode (-)-catequina, gaiato de (-)-galocatequina, (+)-epicatequina, (-)-epicatequina,gaiato de (-)-epicatequina, (-)-epigalocatequina, e gaiato de (-)-epigaloca-tequina.

Em algumas modalidades adicionais das composições da pre-sente invenção flavona e seus derivados (também com freqüência coletiva-mente chamados "flavonas") encontram uso. Estes compostos tem a seguin-te estrutura básica (posições de substituição são mostradas):

Algumas das flavonas mais importantes que encontram uso emalgumas composições de cuidado pessoal da presente invenção são provi-das abaixo. No entanto, não se pretende que a presente invenção seja limi-tada a qualquer flavona particular.

<table>table see original document page 107</column></row><table>

Na natureza, flavonas estão geralmente presentes em formaglicosilada.

Em ainda outras modalidades, as composições de cuidado pes-soal da presente invenção compreendem pelo menos um flavonóide tendofórmula estrutural genérica:

<formula>formula see original document page 108</formula>

onde Z1 a Z7, independentemente um do outro, são escolhidos dentre o gru-po consistindo em Η, OH, alcóxi e hidroxialcóxi, onde os grupos alcóxi e hi-droxialcóxi podem ser ramificados ou não ramificados e tem 1 a 18 átomosde carbono, e onde Gly é escolhido dentre o grupo de radicais mono- e oli-goglicosídeos.

Em algumas modalidades alternativas, as composições de cui-dado pessoal da presente invenção compreendem pelo menos um flavonódetendo a fórmula estrutural genérica:

<formula>formula see original document page 108</formula>

onde Z1 a Z6, independentemente um do outro, são escolhidos dentre o gru-po consistindo em Η, OH, alcóxi e hidroxialcóxi, onde os grupos alcóxi e hi-droxialcóxi podem ser ramificados ou não ramificados e tem 1 a 18 átomosde carbono, onde Gly é escolhido dentre o grupo de radicais mono e oligo-glicosídeos.

Em algumas modalidades preferidas, a composição tem a fór-mula estrutural genérica<formula>formula see original document page 109</formula>

onde Glyi, Gly2 e Gly3, independentemente um do outro, são radicais mono-glicosídeos. Gly2 e Gly3 também podem, individualmente ou juntos, repre-sentar saturações por átomos de hidrogênio. Em algumas modalidades pre-feridas, Glyi, Gly2 e Gly3, independentemente um do outro, são selecionadosdentre o grupo de radicais hexosila, em particular os radicais rhamnosila eradicais glucosila. No entanto, radicais hexosila, por exemplo alosila, altrosi-la, galactosila, gulosila, idosila, mannosila e talosila, também encontram usoem algumas modalidades da presente invenção. Em outras modalidadesadicionais, radicais pentosila encontram uso em algumas composições decuidado pessoal da presente invenção.

Em algumas modalidades, Zi a Z5 são, independentemente umdo outro, escolhidos com vantagem dentre o grupo consistindo em Η, OH,metóxi, etóxi e 2-hidroxietóxi, e os glicosídeos de flavona tem a estrutura:

Em algumas modalidades, os glicosídeos de flavona providosem algumas das composições de cuidado pessoal da presente invenção tema seguinte estrutura:<formula>formula see original document page 110</formula>

onde Glyi, Gly2 e Gly3, independentemente um do outro, são radicais mono-glicosídeos. Gly2 e Gly3 também podem, individualmente ou juntos, represen-tar saturações por átomos de hidrogênio. Em modalidades alternativas, Glyi,Gly2 e Gly3, independentemente um do outro, são selecionados dentre ogrupo de radicais hexosila, em particular de radicais rhamnosila e radicaisglucosila. No entanto, outros radicais hexosila, por exemplo alosila, altrosila,galactosila, gulosila, idosila, mannosila e talosila, encontram uso em algu-mas modalidades da presente invenção. Além disso, em algumas modalida-des, radicais pentosila encontram uso na presente invenção. Em algumasmodalidades preferidas, as composições de cuidado pessoal da presenteinvenção compreendem um ou mais glucosídeos de flavona selecionadosdentre o grupo consistindo em a-glucosilrutina, a-glucosilmiricetina, a-glucosilisoquercitrina, a-glucosilisoquercetina e a-glucosilquercitrina. Em al-gumas modalidades particularmente preferidas, o glucosídeo de flavona é a-glucosilrutina.

Em ainda algumas modalidades adicionais, as composições decuidado pessoal da presente invenção compreendem pelo menos uma na-ringina (por exemplo, aurantina, naringenin-7-rhamno-glucosídeo), hesperi-din 3',5,7-trihidróxi-4'-metoxiflavanona-7-rutinosídeo, hesperidosídeo, hespe-retin-7-O-rutinosídeo), rutina (3,3',4',5,7-pentahidroxiflavona-3-rutinosídeo,quercetina-3-rutinosídeo, soforina, birutana, rutabion, taurutina, fitomelina,melina), troxerutina (3,5-dihidróxi-3',4',7-tris(2-hidroxietóxi)flavona-3-(6-0-(6-deóxi-a-L-mannopiranosil)-b-D-glucopiranosídeo)), monoxerutina (3,3',4',5-tetrahidróxi-7-(2-hidroxietóxi)flavona-3-(6-0-(6-deóxi-a-L-mannopiranosil)-b-D-glucopiranosídeo)), dihidrorobinetina (3,3',4',5',7-pentahidroxiflavanona),taxifolina (3,3',4',5,7-pentahidroxiflavanona), eriodictiol-7-glucosídeo (3',4',5,7-tetrahidroxiflavanona-7 glucosídeo), flavanomareína (3',4',7,8-tetrahidro-xiflavanona-7 glucosídeo), e/ou isoquercetina (3,3',4',5,7-pentahidroxiflava-nona-3-(b-D-glucopiranosídeo). Em ainda algumas outras modalidades, oingrediente ativo é selecionado dentre o grupo consistindo em ubiquinonas eplastoquinonas. Ubiquinonas são caracterizadas pela fórmula estrutural:

<formula>formula see original document page 111</formula>

Ubiquinonas são as bioquinonas mais difundidas e as mais in-vestigadas. Ubiquinonas são referidas como, dependendo do número deunidades de isopreno ligadas nas cadeias laterais, como Q-1, Q-2, Q-3 etc.,ou de acordo com o número de átomos de carbono, como U-5, U-10, U-15etc. Elas preferivelmente surgem com alguns comprimentos de cadeia (porexemplo em alguns microorganismos e leveduras onde n=6). Na maior partedos mamíferos, incluindo seres humanos, Q10 predomina. Coenzima Q10encontra uso particular em algumas modalidades da presente invenção. Suafórmula estrutural é:

<formula>formula see original document page 111</formula>

Plastoquinonas tem a fórmula estrutural geral:

<formula>formula see original document page 111</formula>Plastoquinonas diferem nos números η de radicais isoprenos esão referidas assim (por exemplo PQ-9 [n=9]). Além disso, outras plastoqui-nonas com variados substituintes no anel quinona existem em algumas mo-dalidades.

Em ainda algumas outras modalidades, a presente invençãocompreende pelo menos uma creatina e/ou derivado de creatina. Creatinatem a seguinte estrutura:

<formula>formula see original document page 112</formula>

Em algumas modalidades preferidas das composições de cui-dado pessoal da presente invenção, fosfato de creatina, sulfato de creatina,acetato de creatina, ascorbato de creatina, e/ou derivados esterificados aogrupo carboxila com álcoois mono- ou polifuncionais encontram uso.

Em algumas formas adicionais de realização, as composiçõesde cuidado pessoal da presente invenção contém L-carnitina [3-hidróxi-4-(trimetilamônio)butirobetaína e]. Acilcarnitinas tem a seguinte estrutura geral:

<formula>formula see original document page 112</formula>

onde R é escolhido dentre o grupo de radicais alquila ramificados e não ra-mificados tendo até 10 átomos de carbono, e encontram uso em algumasmodalidades da presente invenção. Em algumas modalidades preferidas,propionilcarnitina e/ou acetilcarnitina encontram uso. Ambos os enantiôme-ros (forma D e L), assim como misturas e racematos das formas D- e L- en-contram uso em algumas composições de cuidado pessoal da presente in-venção.

Em algumas outras modalidades, os ingredientes ativos da pre-sente invenção incluem, mas não são limitados asericosídeo, piridoxol, vita-mina K, biotina, e substâncias aromáticas. Além disso, não se pretende queos ingredientes ativos presentes nas composições de cuidado pessoal dapresente invenção sejam limitados a qualquer constituinte e/ou mistura(s) deativos em particular. De fato, pretende-se que várias ativos e misturas deativos encontrem uso em várias modalidades da presente invenção. Tam-bém não se pretende que a(s) concentração(s) de tais ativos seja(m) Iimita-da(s) a qualquer nível em particular. Em algumas modalidades, a concentra-ção vai de cerca de 0,001 a cerca de 30% em peso, enquanto em outrasmodalidades, é de cerca de 0,05 a cerca de 20% em peso, e ainda em ou-tras modalidades, de cerca de 0,1 a cerca de 10% em peso, com base nopeso total da preparação. É ainda contemplado que os versados na técnicairão formular composições de cuidado pessoal da presente invenção comconcentração (ões) ativa(s) que é (são) apropriada(s) para o uso pretendidodas composições.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção provê peptídeos e peptídeos suportadospara tratar várias doenças e condições. Em modalidades particularmentepreferidas, a presente invenção provê composições e métodos de cuidadopessoal. Em algumas modalidades, a presente invenção provê composiçõespara uso em cuidado da pele e/ou do cabelo, assim como composiçõescosméticas. Em modalidades particularmente preferidas alternativas, a pre-sente invenção provê peptídeos e peptídeos suportados para tratar doençasda pele, como rosácea. Em algumas modalidades particularmente preferi-das, os peptídeos suportados da presente invenção são peptídeos anti-VEGF. Em modalidades particularmente preferidas alternativas, os peptí-deos anti-VEGF são expressados em uma proteína do esqueleto. Em algu-mas modalidades mais preferidas, a proteína do esqueletocompreende BBI.

Em algumas modalidades preferidas, a presente invenção provêcompostos cosméticos e/ou farmacêuticos apropriados para melhorar a apa-rência da pele. A presente invenção ainda provê peptídeos que bloqueiam aligação de uma proteína. Em algumas modalidades preferidas, a proteína éVEGF. Em algumas modalidades particularmente preferidas, o peptídeo éexpressado em um esqueletoresistente a protease. Em algumas modalida-des especialmente preferidas, o esqueletoé um inibidor de protease (por e-xemplo, BBI, STI, ou inibidor de quimotripsina Elgin). Em algumas modalida-des mais preferidas, o inibidor de protease é um BBI que foi funcionalmentee/ou estruturalmente modificado.

Como indicado acima, dois inibidores de proteína protease fo-ram isolados de soja, o inibidor de tripsina de tipo Kunitz (inibidor de tripsinade soja, STI) e o inibidor de protease Bowman-Birk (BBI) (Ver por exemplo,Birk, Int. J. Pept. Protein Res., 25:113-131 [1985]; e Kennedy, Am. J. Clin.Neutr., 68:1406S-1412S [1998]). Estes inibidores servem como um esquele-tode começo para as seqüências variantes como aqui provido para produziro inibidor de protease em combinação com pelo menos uma seqüência depeptídeos que foi modificada e/ou substituída em uma seqüência (por exem-plo, BBI-AV ou STI-AV). Além das alterações nos suportes "scaffold" com-preendendo as seqüências variantes, outras proteínas desejadas, como u-sado aqui, incluem a adição de seis resíduos de histidina ao C-término (vide,Figuras 1 e 2).

Inibidor de tripsina de soja (STI)

STI inibe a atividade proteolítica de tripsina pela formação de umcomplexo estequiométrico estável (Ver por exemplo, Liu, Chemistry and Nu-tritional Value of Soybean Components, em: Sovbeans. Chemistrv, Techno-logy and Utilization. pp. 32-35, Aspen Publishers, Inc., Gaithersburg, Md.,[1999]). STI consiste em 181 resíduos de aminoácidos com duas pontes dis-sulfeto, tendo uma forma grosseiramente esférica (Ver por exemplo, Song etal., J. Mol. Biol., 275:347-63 [1998]). O laço inibidor de tripsina se encontradentro da primeira ponte dissulfeto. O inibidor de tripsina de soja de tipo Ku-nitz (STI) desempenhou um papel chave nos estudos anteriores de proteina-ses, tendo sido usado como o substrato principal no trabalho bioquímico ecinético que leve à definição do mecanismo padrão de ação de inibidores deproteinase.

Inibidorde Bowman-Birk (BBh

Proteínas inibidoras de Bowman-Birk são uma família cinetica-mente e estruturalmente bem caracterizada de proteínas pequenas (60-90resíduos) isoladas de sementes de leguminosas, assim como outras plantas,incluindo várias gramíneas. Elas tipicamente têm uma estrutura simétrica dedois domínios tricíclicos cada contendo um laço de ligação independente,apesar de algumas terem um domínio e algumas tem mais do que dois do-mínios. O inibidor de Bowman-Birk principal de ~ 8 kDa isolado de soja (BBI)tem dois laços de sítios reativos separados, laço I inibe proteases tendo es-pecificidade similar a tripsina e laço Il inibe proteases com especificidadesimilar a quimotripsina (Ver por exemplo, Chen et ai, J. Biol. Chem.,267:1990-1994 [1992]; Werner e Wemmer, Biochem., 31:999-1010 [1992];Lin et ai, Eur. J. Biochem., 212:549-555 [1993]; Voss et ai, Eur. J. Bio-chem., 242:122-131 [1996]; e Billings et ai, Proc. Natl. Acad. Sci., 89:3120-3124 [1992]). Estas regiões de ligação contém, cada, uma estrutura de "laçocanônico", que é um motivo encontrado em vários inibidores de serina pro-teinase (Bode e Huber, Eur. J. Biochem., 204:433-451 [1992]). STI e BBI sãoencontrados somente na semente de soja, e não em qualquer outra parte daplanta (vide, por exemplo, Birk, Int. J. Pept. Protein Res., 25:113-131 [1985]).

Apesar de numerosas isoformas de BBI terem sido caracteriza-das, SEQ ID NO:47 mostra uma seqüência de aminoácidos da estrutura dor-sal de BBI usada em alguns experimentos, como aqui descrito, compreen-dendo aproximadamente 71 resíduos de aminoácidos (Ver Exemplo 16).

Em soja, BBI é produzido como uma pró-proteína com um pro-peptídeo N-terminal que tem 19 aminoácidos de comprimento. Assim, emalgumas modalidades, BBI é produzido com todas ou pelo menos uma por-ção do propeptídeo. Em algumas modalidades, BBI é truncado, com o núme-ro de 10 resíduos de aminoácidos sendo removidos do N- ou do C- terminal.

Por exemplo, quando da dessecação da semente, algumas moléculas deBBI tem os 9 ou 10 resíduos de aminoácidos C-terminais removidos. Assim,proteólise é geralmente altamente tolerada antes do dissulfeto inicial e logoapós a ligação de dissulfeto terminal, cujas conseqüências geralmente nãosão prejudiciais para a ligação à proteína-alvo. No entanto, será notado quequalquer uma das isoformas ou formas truncadas encontram uso em váriasmodalidades da presente invenção.Variantes do inibidor de protease

Como indicados acima, os inibidores STI e BBI de protease temlaços de ligação que inibem as proteases. A presente invenção provê varian-tes de inibidor de protease com alterações em um ou mais sítios reativos(por exemplo, Laço I e/ou Laço Il de BBI). Em algumas modalidades preferi-das, os laços são substituídos com seqüências que interagem com a proteí-na alvo.

Por exemplo, em algumas modalidades, os laços são substituí-dos com seqüências derivadas de proteínas de ligação de VEGF, inibidoresda via complementar como inibidores C2, C3, C4 ou C5, Compstatin, citoci-nas, outras proteínas de interesse, etc. De fato, não se pretende que a pre-sente invenção seja limitada a qualquer seqüência particular substituída emqualquer um destes laços, pois qualquer seqüência apropriada encontra usona presente invenção.

Em algumas modalidades, seqüências variantes são seleciona-das por vários métodos conhecidos na técnica, incluindo mas não limitadas aapresentação na superfície de fagos outros métodos de triagem apropriado.Por exemplo, uma bibliotecas de genes de peptídeos aleatória é fundida como gene de fago Plll de modo que a biblioteca do peptídeo será apresentadana superfície do fago. Subseqüentemente, a biblioteca de apresentação nasuperfície de fagos é exposta à proteína alvo e lavada com tampão para re-mover a ligação não específica (este processo é às vezes referido como "ba-teia"). Finalmente, o fago de ligação e PCR da seqüência de DNA para opeptídeo codificado são isolados.

Na maior parte das modalidades, um dos laços é substituídocom a seqüência variante (isto é, peptídeos; com freqüência 3 a 14 aminoá-cidos em comprimento, com 5 a 10 aminoácidos sendo preferidos). Seqüên-cias mais longas encontram uso na presente invenção, desde que propor-cionem a ligação e/ou inibição desejada. Além disso, peptídeos apropriadospara uso como substituições de um laço(s) de ligação preferivelmente ado-tam uma conformação funcional quando contidos dentro de um laço confina-do (isto é, um laço formado pela presença de uma ligação de dissulfeto entredois resíduos de cisteína). Em algumas modalidades específicas, os peptí-deos tem entre 7 e 9 aminoácidos de comprimento. Estas seqüências desubstituição também proporcionam inibição de protease ou ligação às prote-ínas marcadas. Em algumas modalidades, obtém-se vantagens na alteraçãode um único aminoácido.

Proteínas de Fusão

Em modalidades preferidas, cada inibidor de protease ou suavariante é expressado como uma proteína de fusão pela célula hospedeirabacteriana. Apesar da clivagem do polipeptídeo de fusão para liberar a pro-teína desejada ser utilizável com freqüência, ela não é necessária. Os inibi-dores de protease e suas variantes expressados e secretados como proteí-nas de fusão retém, de modo surpreendente, sua função.

As seqüências de DNA acima definidas codificando as seqüên-cias de aminoácidos correspondentes são combinadas para formar uma"seqüência de DNA de fusão." Estas seqüências de DNA de fusão são mon-tadas em matriz de leitura aberta apropriada a partir do 5' término a 3' térmi-no na ordem de primeira, segunda, terceira e quarta seqüências de DNA.Como assim montada, a seqüência de DNA codifica um "polipeptídeo defusão" codificando a partir do seu amino-término um peptídeo de sinal fun-cional como uma seqüência secretória em espécies bacterianas, um polipep-tídeo secretado ou porção do mesmo, normalmente secretados de uma es-pécie bacteriana, um peptídeo Iigante clivável e um polipeptídeo desejado(por exemplo, um inibidor de protease e suas variantes). Vários métodos sãoconhecidos dos versados para o produção de proteínas de fusão (Ver porexemplo, Patentes US 5.411.873, 5.429.950, e 5.679.543, todas sendo in-corporadas aqui por referência). Assim, pretende-se que quaisquer métodosapropriados irão encontrar uso na presente invenção.

Expressão de Inibidores de Protease Recombinantes

Na extensão que a presente invenção depende da produção deproteínas de fusão, ela se baseia em técnicas de rotina no campo de genéti-ca recombinante. Os textos básicos descrevendo os métodos gerais de usonesta invenção incluem Sambrook et ai, Molecular Cloning, A LaboratoryManual ((2nd ed.) [1989]); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Labo-ratory Manual (1990); e Ausubel et ai, (eds.), Current Protocols in MolecularBiology (1994).

A presente invenção provê células hospedeiras bacterianas queforam transduzidas, transformadas ou transfectadas com um vetor de ex-pressão compreendendo uma seqüência de ácido nucléico codificando inibi-dor de protease. As condições de cultura, como temperatura, pH e outros,são as previamente usadas para a célula hospedeira parental antes datransdução, transformação ou transfeção que são evidentes para os versa-dos na técnica.

Basicamente, a seqüência nucleotídica codificando uma proteí-na de fusão é ligada operativamente a uma seqüência de promotor funcionalna célula hospedeira. Esta unidade de promotor-gene é então tipicamenteclonada em vetores intermediários antes da transformação nas células hos-pedeiras por replicação e/ou expressão. Estes vetores intermediários sãotipicamente vetores procarióticos (por exemplo, plasmídeos, ou vetores shut-tle). No entanto, não se pretende que a presente invenção seja limitada aouso de vetores intermediários, como esta etapa é omitida em algumas moda-lidades preferidas.

Em uma abordagem, uma cultura bacteriana é transformadacom um vetor de expressão tendo um promotor ou fragmento de promotorbiologicamente ativo ou um ou mais (por exemplo, uma séries) de melhora-dores que funcionam na célula hospedeira, ligada operativamente a umaseqüência de ácido nucléico codificando um inibidor de protease, de modoque a protease é expressada na célula. Em algumas modalidades preferi-das, as seqüências de DNA codificam um inibidor de protease ou suas vari-antes. Em outra modalidade preferida, o promotor é um regulável.Constructos de Ácido nucléico /Vetores de expressão.

Fragmentos de polinucleotídeos naturais ou sintéticos codifican-do um inibidor de protease (isto é, "seqüências de ácido nucléico codificandoPl ") podem ser incorporados em constructos de ácido nucléico heterólogasou vetores, capazes de introdução, e replicação em uma célula bacteriana.Os vetores e métodos descritos aqui são apropriados para uso em váriascélulas hospedeiras para a expressão de inibidores de protease e suas vari-antes. Qualquer vetor pode ser usado desde que ele seja replicável e viávelnas células em que ele é introduzido. Números elevados de vetores e pro-motores apropriados são conhecidos do versado e são comercialmente dis-poníveis. Vetores de clonagem e de expressão apropriados são tambémdescritos em várias referências conhecidas dos versados (Ver por exemplo,Sambrook et ai, supra e Ausubel et al., supra, expressamente incorporadospor referência aqui). A seqüência de DNA apropriada é inserida em umplasmídeo ou vetor (coletivamente referido aqui como "vetores") por qual-quer método apropriado. Geralmente, a seqüência de DNA é inserida emsítio(s) de endonuclease de restrição por procedimentos padrões conhecidosdos versados.

Vetores apropriados são tipicamente equipados com uma se-qüência de ácido nucléico codificando um marcador selecionável, sítios deinserção, e elementos de controle apropriados, como seqüências de termi-nação. Em algumas modalidades, os vetores compreendem seqüências re-gulatórias, incluindo, por exemplo, elementos de controle (isto é, elementosde promotor e terminador ou regiões não traduzidas 5' e/ou 3'), eficazes paraa expressão da seqüência de codificação em células hospedeiras (e/ou emum meio de vetor ou célula hospedeira em que uma seqüência de codifica-ção de proteína solúvel modificada não é normalmente expressada), ligadasoperativamente à seqüência de codificação. Números elevados de vetores epromotores apropriados são conhecidos do versado, muitos destes sendocomercialmente disponíveis e conhecidos dos versados.

Promotores exemplares incluem tanto promotores constitutivoscomo promotores indutíveis. Estes promotores são bem-conhecidos dos ver-sados na técnica. Os versados na técnica também sabem que um promotornatural pode ser modificado por troca, substituição, adição ou eliminação deum ou mais nucleotídeos sem mudar sua função. A prática da presente in-venção engloba mas não é limitada por estas alterações para o promotor. Aescolha do promotor usado na constructo genética está dentro do escopo doconhecimento de um versado na técnica.

A escolha do marcador selecionável apropriado irá depender dacélula hospedeira. Marcadores apropriados para diferentes hospedeiros bac-terianos são bem-conhecidos na técnica. Os genes de marcador selecioná-vel típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ououtras toxinas (por exemplo, ampicilina, metotrexato, tetraciclina, neomicina,ácido micofenólico, puromicina, zeomicina, ou higromicina; ou (b) comple-mentam uma mutação auxotrófica ou uma deficiência nutricional naturalmen-te ocorrendo na cepa hospedeira.

Em algumas modalidades, uma seqüência codificando Pl sele-cionada é inserida em um vetor apropriado de acordo com técnicas recombi-nantes bem-conhecidas e usadas para transformar uma linhagem de célulascapaz de expressão de PI. Devido à degenerescência interna do código ge-nético, outras seqüências de ácido nucléico que codificam substancialmentea mesma ou uma seqüência funcionalmente equivalente de aminoácidospodem ser usadas para clonar e expressar um inibidor de protease específi-co, como ainda detalhado acima. Assim, é notado que estas substituições naregião de codificação se encontra dentro das variantes de seqüência cober-tas pela presente invenção. Qualquer uma e todas estas variantes de se-qüência podem ser utilizadas do mesmo modo como aqui descrito para umaseqüência de ácido nucléico codificando Pl parental. Os versados na técnicareconhecem que diferentes Pls serão codificados por seqüências de ácidonucléico diferentes.

Em algumas modalidades, uma vez que se obtém a forma dese-jada de uma seqüência de ácido nucléico de inibidor de protease, homólogo,variante ou seu fragmento, ela é modificada por qualquer um de vários mo-dos. Onde a seqüência envolve regiões de flanco de não codificação, as re-giões de flanco podem ser submetidas a ressecção, mutagenese etc. Assim,transições, transversões, deleções, e inserções podem ser realizadas naseqüência ocorrendo naturalmente.

Em algumas modalidades preferidas, constructos heterólogas deácido nucléico incluem a seqüência codificando para pelo menos um inibidorde protease, ou suas variante(s), fragmento(s) ou variante(s) de emenda: (i)em isolamento; (ii) em combinação com seqüências de codificação adicio-nais; como seqüências de codificação de proteína de fusão ou peptídeo desinal, onde a seqüência de codificação de Pl é a seqüência de codificaçãodominante; (iii) em combinação com seqüências de não codificação, comoelementos de controle, como elementos de promotor e terminador ou regiõesnão traduzidas 5' e/ou 3', efetivas para a expressão da seqüência de codifi-cação em um hospedeiro apropriado; e/ou (iv) em um vetor ou meio hospe-deiro em que a seqüência de codificação de Pl é um gene heterólogo.

Em algumas modalidades, ácido nucléico heterólogo contendo aseqüência de codificação de ácido nucléico apropriada, junto com as se-qüências apropriadas de promotor e controle, é empregado para introduzirem células hospedeiras bacterianas para permitir que as células expressempelo menos um inibidor de protease ou suas variantes.

Em algumas modalidades da presente invenção, uma constructode ácido nucléico heteróloga é empregada para transferir uma seqüência deácido nucléico codificando Pl em uma célula in vitro. Em algumas modalida-des preferidas, as céiuias hospedeiras integram estavelmente as seqüênciasde ácido nucléico da presente invenção. Assim, qualquer método apropriadopara gerar de modo eficaz transformantes estáveis encontra uso na presenteinvenção.

Em modalidades adicionais da presente invenção, o primeiro e osegundo cassetes de expressão estão presentes em um vetor único, en-quanto em outras modalidades estes cassetes estão presentes em vetoresseparados.

Em algumas modalidades preferidas, além da seqüência depromotor, o cassete de expressão também contém uma região de termina-ção de transcrição a jusante do gene estrutural para prover uma terminaçãoeficiente. Em alguma modalidades, a região de terminação é obtida domesmo gene como a seqüência de promotor, enquanto em outras modalida-des ela é obtida a partir de outro gene. A seleção de sinais de terminação detranscrição apropriados é bem-conhecida dos versados na técnica.Além disso, contempla-se que qualquer vetor de expressão a-propriado irá encontrar uso na presente invenção. De fato, contempla-se quevários vetores convencionais usados para expressão em células eucarióticasou procarióticas serão apropriados e encontram uso com a presente inven-ção. Os vetores de expressão bacterianos padrões incluem bacteriófagos λ eM13, assim como plasmídeos como plasmídeos à base de pBR322, pSKF,pET23D, e sistemas de expressão de fusão, como MBP, GST, e LacZ. Emoutras modalidades, etiquetas de epítopos são adicionadas a proteínas re-combinantes, a fim de prover métodos convenientes de isolamento (por e-xemplo, c-myc).

Elementos adicionais tipicamente incluídos em vetores de ex-pressão são replicons, um gene codificando resistência a antibiótico parapermitir a seleção de bactérias que abrigam plasmídeos recombinantes, esítios de restrição singulares em regiões do plasmídeo não essenciais parapermitir a inserção de seqüências heterólogas. O gene de resistência a anti-biótico particular escolhido não é crítico, sendo qualquer um dos muitos ge-nes de resistência conhecidos na técnica apropriado.Introdução de uma seqüência de ácido nucléico codificando inibidor de pro-tease em células hospedeiras.

Em algumas modalidades preferidas, os métodos da presenteinvenção fornecem células hospedeiras que contém uma seqüência de inte-resse estavelmente integrada (isto é ácido nucléico codificando PI). No en-tanto, em modalidades alternativas, os métodos da presente invenção pro-vêem a manutenção de um vetor de transformação extra-cromossômico,auto-replicante.

A invenção ainda provê células e composições de células queforam geneticamente modificadas para compreender uma seqüência de áci-do nucléico codificando Pl provida exogenamente. Em algumas modalida-des, uma célula hospedeira parental é geneticamente modificada por umvetor de expressão. Em algumas modalidades, o vetor é um plasmídeo, en-quanto em outras modalidades o vetor é uma partícula viral, fago, DNA des-protegido, etc. Assim, não se pretende que ta forma do vetor seja limitada aqualquer tipo de vetor em particular, os vários vetores irão encontrar uso napresente invenção.

Várias métodos podem ser empregados for liberar um vetor deexpressão nas células em vitro. Métodos de introdução de ácidos nucléicosem células para a expressão de seqüências de ácido nucléico heterólogassão também conhecidos do versado na técnica comum, incluindo, mas nãolimitados a eletroporação, fusão de protoplastos com células intactas; trans-dução; bombardeio em alta velocidade com microprojéteis revestidos comDNA; infecção com ácidos nucléicos virais modificados (por exemplo, fago);transformação quimicamente mediada, competência, etc. Além disso, emalgumas modalidades, constructos de ácido nucléico heterólogas compreen-dendo uma de seqüência ácido nucléico Pl são transcritas in vitro, e o RNAresultante introduzido na célula hospedeira por qualquer um dos métodosapropriados conhecidos na técnica.

Após a introdução de uma constructo de ácido nucléico heteró-Ioga compreendendo a seqüência de codificação para um inibidor de protea-se, as células geneticamente modificadas são cultivadas em meio nutrienteconvencional modificado como apropriado para ativar promotores, selecionartransformantes, e/ ou amplificar a expressão de uma seqüência de ácidonucléico codificando PI. As condições de cultura, como temperatura, pH eoutros, são as previamente usadas para a célula hospedeira selecionadapara expressão, e são evidentes para os versados na técnica.

A progênie de células em que tais constructos de ácido nucléicoheterólogas foram introduzidas é geralmente considerada para compreendera seqüência de ácido nucléico codificando Pl encontrada na constructo deácido nucléico heteróloga.

Hospedeiros Bacterianos e Expressão

Células hospedeiras apropriadas incluem qualquer espécie bac-teriana apropriada. Em algumas modalidades, os hospedeiros bacterianosservem tanto como hospedeiros de expressão como a fonte dos primeiro esegundo ácidos nucléicos. Usando os presentes métodos e células hospe-deiras inventivos, níveis surpreendentes de expressão foram obtidos. O sis-tema utilizado aqui alcançou níveis de expressão e secreção acima de 0,5g/l de inibidor de protease.

Após o vetor de expressão ser introduzido nas células hospedei-ras, as células hospedeiras transfectadas são cultivadas sob condições favo-recendo a expressão do gene codificando a proteína desejada. Grandes lo-tes de células transformadas podem ser cultivados como descrito acima.Finalmente, o produto é recuperado da cultura usando técnicas conhecidasna técnica.

As proteínas acessórias, como tiol-dissulfeto oxidoreductases ou"chaperones" encontram uso em algumas modalidades, como elas podembenéficas para ajudar a duplicar a proteína secretória em sua conformaçãoativa. Tiol-dissulfeto oxidoreductases e proteína dissulfeto isomerases catali-sam a formação das ligações dissulfeto corretas na proteína. A superexpres-são do operon bdbDC em B. subtilis foi demonstrada como benéfica para aprodução de uma proteína com ligações dissulfeto (Ver por exemplo, Meimaet ai, J. Biol. Chem., 277:6994-7001, [2002]). "Chaperones" ajudam as pro-teínas secretórias a duplicar por ligação às regiões hidrofóbicas expostasnos estados não duplicados e prevenir interações desfavoráveis e prolil-peptidil cis-trans isomerases ajudam na formação da conformação apropria-da da cadeia de peptídeo adjacente a resíduos prolina.

Em algumas modalidades da presente invenção, as células hos-pedeiras são transformadas com um vetor de expressão codificando pelomenos um tiol-dissulfeto oxidoreductase ou chaperone. Não se pretende quea presente invenção seja limitada a qualquer particular tiol-dissulfeto oxido-reductase ou chaperone, como qualquer tiol-dissulfeto oxidoreductase ouchaperone apropriado conhecido dos versados na técnica irão encontrar usona presente invenção.

Em algumas modalidades da presente invenção, a fração deproteína secretória apropriadamente duplicada é aumentada pela adição deprodutos químicos ao meio de crescimento que reduz/oxida ligações dissul-feto, e/ou alteram o potencial redox geral, e/ou produtos químicos que alte-ram as propriedades de solvente, assim afetando a conformação e agrega-ção de proteína. Em modalidades particularmente preferidas, um reagenteque reduz ligações dissulfeto, como 2-mercaptoetanol, é preferido para au-mentar a fração proteína corretamente duplicada. No entanto, em outrasmodalidades e dependendo do meio usado, outros redutores de dissulfetoou agentes oxidantes (por exemplo, DTT, TCEP, glutationa reduzida e oxi-dada, cisteína, cistina, cisteamina, tioglicolato, S2O32", S2O42", S2O52", SO32",S2O72", Cu+, etc.), ou usados sozinhos ou em combinação, encontram usona presente invenção. Contempla-se que outros adjuvantes que alteram aspropriedades de solventes, (por exemplo, uréia, DMSO, TWEEN®-80, etc.),ou adicionados ao meio de crescimento sozinhos ou preferivelmente emcombinação com agentes redutores/oxidantes de dissulfeto, como βΜΕ,também irão aumentar a fração de proteína secretória corretamente duplica-da e encontram uso em várias modalidades da presente invenção. Em al-gumas modalidades preferidas, o βΜΕ é usado a concentrações na faixa de0,5 a 4 mM, enquanto em outras modalidades, a faixa de concentrações de0,1 mM a 10 mM. De fato, os versados na técnica sabem como selecionar omelhor meio de crescimento e as condições de crescimento para otimizar osefeitos dos agentes redutores/oxidantes de tiol adicionados e/ou outros adju-vantes, assim como a concentração dos agentes redutores/oxidantes de tiole/ou outros adjuvantes a usar. Não se pretende que a presente invençãoseja limitada a qualquer agentes redutores/oxidantes de dissulfeto ou adju-vantes particulares, como quaisquer reagentes apropriados conhecidos dosversados na técnica encontram uso na presente invenção.

Parâmetros de fermentação

A presente invenção baseia-se em procedimentos de fermenta-ção para cultivar as espécies bacterianas. Os procedimentos de fermentaçãopara a produção de proteínas heterólogas por espécies bacterianas sãobem-conhecidos na técnica. O cultivo é alcançado em um meio de cresci-mento compreendendo um meio de sal mineral aquoso, fatores de cresci-mento orgânicos, o carbono e material de fonte de energia, oxigênio molecu-lar (para bactérias aeróbicas e facultativas), e, como evidente, um inóculo departida de uma ou mais espécies de microorganismos em particular a seremempregadas.

Além da fonte de energia e carbono, oxigênio, nitrogênio assimi-lável e um inóculo do microorganismo, é necessário suprir quantidades a-propriadas de nutrientes minerais para assegurar o crescimento apropriadodo microorganismo, assimilar a assimilação do carbono e fonte de energiapelas células no processo de conversão microbiano, e obter rendimentoscelulares máximos com densidade de células máxima no meio de fermentação.

Vários meios de cultura encontram uso na presente invenção,como conhecido dos versados na técnica. No entanto, meios de culturasbacterianas padrões encontram uso na presente invenção. Em algumas for-mulações de meios preferidos, os meios incluem além de nitrogênio, quanti-dades apropriadas de fósforo, magnésio, cálcio, potássio, enxofre, e sódio,em formas apropriadas iônicas assimiláveis solúveis e combinadas, e tam-bém presentes preferivelmente devem estar alguns elementos de traço co-mo cobre, manganês, molibdênio, zinco, ferro, boro, e iodo, e outros, nova-mente em forma assimilável solúvel apropriada, como as conhecidas na técnica.

Em algumas modalidades, a reação de fermentação envolve umprocesso aeróbico em que o oxigênio molecular necessário é fornecido porum gás contendo oxigênio molecular como ar, ar enriquecido com oxigênio,ou ainda oxigênio molecular substancialmente puro, provido para manter osconteúdos do vaso de fermentação com uma pressão parcial de oxigênioapropriada, efetiva para auxiliar a espécie de microorganismo a crescer emum modo próspero. Com efeito, por uso de um substrato oxigenado de hi-drocarboneto, a exigência de oxigênio para o crescimento do microorganis-mo é reduzida. Mesmo assim, oxigênio molecular deve ser fornecido para ocrescimento de organismos aeróbicos e, em uma menor extensão, facultativos.

Apesar da taxa de aeração poder variar em uma faixa conside-rável, aeração geralmente é conduzida a uma taxa que está na faixa de cer-ca de 0,5 a 10, preferivelmente cerca de 0,5 a 7, volumes (na pressão em-pregada e a 25°C.) de gás contendo oxigênio por volume de líquido no fer-mentador por minuto. Esta quantidade é baseada em ar de teor de oxigênionormal sendo fornecido o reator, e em termos de oxigênio puro, as faixasrespectivas devem ser de cerca de 0,1 a 1,7 ou preferivelmente cerca de 0,1a 1,3, volumes (na pressão empregada e a 25°C.) de oxigênio por volume delíquido no fermentador por minuto.

A pressão empregada para o processo de conversão microbianopode variar amplamente. As pressões geralmente estão na faixa de cerca de0 a 3,5 kg/cm2 manométricos, atualmente preferivelmente cerca de 0 a 2,1kg/cm2 manométricos, mais preferivelmente pelo menos pelo menos leve-mente acima da pressão atmosférica, como um equilíbrio de equipamento ecusto de operação versus a solubilidade em oxigênio obtida. Pressões maio-res do que a atmosférica são vantajosas em que estas pressões tendem aaumentar a concentração de oxigênio dissolvido no fermento aquoso, quepode sua vez pode ajudar a aumentar as taxas de crescimento celular. Aomesmo tempo, isto é equilibrado pelo fato de que pressões atmosféricas defato aumentam os custos de equipamento e operação.

A temperatura de fermentação pode variar um pouco, mas paraa maior parte das espécies bacterianas usadas na presente invenção, a tem-peratura geralmente estará na faixa de cerca de 20°C a 40°C, geralmentepreferivelmente a faixa de cerca de 28°C a 37°C, dependendo da cepa domicroorganismo escolhido, como conhecido dos versados na técnica.

Os microorganismos também requerem uma fonte of nitrogênioassimilável. A fonte of nitrogênio assimilável pode ser qualquer compostocontendo nitrogênio ou compostos capazes de liberar nitrogênio em umaforma apropriada para a utilização metabólica pelo microorganismo. Apesarde vários compostos orgânicos de fonte de nitrogênio, como hidrolisados deproteína, poderem ser empregados, geralmente compostos contendo nitro-gênio baratos - como amônia, hidróxido de amônio, uréia, e vários sais deamônio como fosfato de amônio, sulfato de amônio, pirofosfato de amônio,cloreto de amônio, ou vários compostos de amônio podem ser utilizados. Opróprio gás amônia é conveniente para operações em larga escala, e podeser empregado por borbulhamento do fermento aquoso (meio de fermenta-ção) em quantidades apropriadas. Ao mesmo tempo, esta amônia tambémpode ser empregada para auxiliar no controle de pH.

A faixa de pH no fermento microbiano aquoso (mistura de fer-mentação) deve estar na faixa exemplar de 2,0 a 8,0. No entanto, os ótimosde faixa de pH para alguns microorganismos são dependentes dos meiosempregados em alguma extensão, assim como do microorganismo particu-lar, e assim mudam um pouco com mudança em meios como conhecido dosversados na técnica.

Apesar do tempo de retenção médio da mistura de fermentaçãono fermentador poder variar consideravelmente, dependendo em parte datemperatura de fermentação e da cultura empregada, como é conhecido natécnica.

Em algumas modalidades, a fermentação é preferivelmente con-duzida em tal modo que o substrato contendo carbono pode ser controladocomo um fator de limitação, assim provendo uma boa conversão do substra-to contendo carbono nas células e evitando a contaminação das células comuma quantidade substancial de substrato não convertido. O último não é umproblema com substratos solúveis em água, porque quaisquer traços restan-tes são prontamente removidos. Isto pode ser um problema, no entanto, noscasos de substratos não solúveis em água, e requer etapas de tratamentode produto adicionais como etapas de lavagem apropriadas. O tempo ne-cessário para alcançar este nível de substrato Iimitante não é crítico e podevariar com o microorganismo e processo de fermentação em particular sen-do conduzido. No entanto, é bem-conhecida na técnica a determinação daconcentração de fonte de carbono no meio de fermentação e se ou não onível desejado de fonte de carbono foi obtido.

Apesar em algumas modalidades, a fermentação ser conduzidacomo uma operação em batelada ou contínua, a operação em batelada ali-mentada é geralmente preferida para facilidade de controle, produção dequantidades uniformes de produtos, e os usos mais econômicos de todo oequipamento.Se desejado, parte ou todo o material de fonte de energia e car-bono e/ou parte da fonte assimilável de nitrogênio como amônia pode seradicionado ao meio mineral aquoso antes da alimentação ao meio aquosomineral no fermentador. De fato, cada uma das correntes introduzida no rea-tor preferivelmente é controlada a uma relação predeterminada, ou em res-posta a uma necessidade determinável por monitoração como concentraçãodo substrato de energia e carbono, pH, oxigênio dissolvido, oxigênio ou dió-xido de carbono nos gases residuais do fermentador, densidade de célulasmensurável por transmitância de luz ou similares. As taxas e alimentaçãodos vários materiais podem ser variadas de modo a obter uma taxa de cres-cimento de células tão rápida como possível, consistente com utilização efi-ciente da fonte de energia e carbono, para obter um rendimento tão elevadode células de microorganismos relativo à carga do substrato com possível,mas, mais importante, para obter a maior produção da desejada proteína porvolume unitário.

Em uma operação em batelada, ou na preferida batelada ali-mentada, todo o equipamento, reator, ou meios de fermentação, vaso ourecipiente, tubulações, dispositivos de resfriamento ou circulação anexos, eoutros, são inicialmente esterilizados, geralmente por emprego de vapor co-mo a cerca de 1210C durante pelo menos cerca de 15 minutos. O reator es-terilizado então é inoculado com uma cultura do microorganismo selecionadona presença de todos os requeridos nutrientes, incluindo oxigênio, e o subs-trato contendo carbono. O tipo de fermentador empregado não é crítico, a-pesar de em algumas modalidades, o 15L Biolafitte (Saint-Germain-en-Laye,France) ser preferido.

Separações de proteínas

Em algumas modalidades particularmente preferidas, uma vezque a desejada proteína é expressada, a proteína secretada é recuperada. Apresente invenção provê métodos de separação de uma proteína desejadade seu análogo de fusão. É especificamente contemplado que os métodoscomo aqui descritos irão encontrar uso na separação de inibidor de proteina-se e variantes do análogo de fusão.A coleta e purificação da proteína desejada do caldo de fermen-tação também pode ser obtida usando procedimentos como conhecidos dosversados na técnica. O caldo de fermentação irá geralmente conter resíduoscelulares, incluindo células, várias sólidos em suspensão e outros contami-nantes de biomassa, assim como os produtos de proteína desejada, que sãopreferivelmente removidos do caldo de fermentação por meios conhecidosna técnica. Os processos apropriados para esta remoção incluem separa-ções técnicas sólido-líquido convencionais (por exemplo, centrifugação, fil-tração, diálise, microfiltração, filtração com vácuo giratório, ou outros proces-sos conhecidos), para produzir um filtrado isento de células. Em algumasmodalidades, é preferível ainda concentrar o caldo de fermentação ou o fil-trado isento de células antes do processo de purificação e/ou cristalizaçãousando técnicas como ultrafiltração, evaporação e/ou precipitação.

Precipitação dos componentes proteináceos do sobrenadanteou filtrado pode ser obtida por meio de um sal (por exemplo, sulfato de amô-nio) ou pH baixo (tipicamente menor do que 3), seguido por purificação poruma variedade de procedimentos cromatográficos (por exemplo, cromato-grafia de troca tônica, cromatografia de afinidade, cromatografia de interaçãohidrofóbica, cromatografia por indução de carga hidrofóbica etc.) ou proce-dimentos reconhecidos na técnica similares. Não se pretende que a presenteinvenção seja limitada a qualquer método de separação particular, pois con-templa-se que qualquer método irá encontrar uso na presente invenção.

Em algumas modalidades preferidas, quando o polipeptídeo ex-pressado desejado é secretado das células bacterianas, o polipeptídeo épurificado a partir do meio de crescimento. Em modalidades preferidas, ascélulas hospedeiras de expressão são removidas dos meios antes da purifi-cação do polipeptídeo (por exemplo por centrifugação).

Quando o polipeptídeo recombinante expressado desejado nãoé secretado da célula hospedeira, a célula hospedeira é preferivelmenterompida e o polipeptídeo liberado em um "extrato aquoso" que é o primeiroestágio de purificação. Preferivelmente, as células hospedeiras de expres-são são coletadas dos meios antes da ruptura da célula (por exemplo porcentrifugação). A ruptura das células pode ser realizada por uso de quais-quer meios apropriados bem-conhecidos na técnica, como por digestão debeta-glucanase ou Iisozima ou forçando as células através de pressão ele-vada (vide, por exemplo, Scobes1 Protein Purification. 2a. Ed., Springer-Verlag).

Em algumas modalidades, a adição de seis resíduos de histidina(isto é, uma "His Tag") para o C-término é usada como um auxiliar na purifi-cação da proteína desejada e seu análogo de fusão. O uso de etiquetas "Histags" como um auxiliar de purificação é bem-conhecido na técnica (Ver porexemplo, Hengen, TIBS 20:285-286 [1995]). As proteínas etiquetadas 6x hissão facilmente purificadas usando Cromatografia de afinidade de íon metalimobilizado (IMAC), como conhecido dos versados na técnica.

Pureza

Para algumas aplicações, é de grande importância que os inibi-dores de protease produzidos usando a presente invenção sejam altamentepuros (por exemplo, tendo uma pureza maior do que 99%). Isto é particular-mente verdadeiro sempre que a desejada proteína deve ser usada como umagente terapêutico, mas é também necessário para outras aplicações. Osmétodos são como aqui descritos para prover um modo de produzir subs-tancialmente as proteínas puras desejadas. As proteínas desejadas comoaqui descrito são utilizáveis em composições farmacêuticas e de cuidadopessoal. No entanto, contempla-se que proteínas de variados níveis de pu-reza serão produzidas usando os métodos da presente invenção e não sepretende que as proteínas produzidas usando a presente invenção sejamlimitadas a qualquer nível particular de pureza.

Ativação de BBI durante a purificação

Em algumas modalidades da presente invenção, após o cresci-mento durante o processo de purificação, a atividade de uma proteína é au-mentada pela adição de produtos químicos que reduzem/oxidam ligaçõesdissulfeto e/ou alteram o potencial redox geral, e/ou produtos químicos quealteram as propriedades de solventes, assim afetando a conformação e a-gregação de proteínas. Em algumas modalidades particularmente preferidas,adição de um reagente que reduz ligações dissulfeto, como 2-mercaptoetanol, é usada para aumentar atividade da proteína. No entanto,como os versados na técnica sabem, dependendo da pureza e composiçãodo tampão, outros agentes redutores ou oxidantes de dissulfeto (por exem-pio, DTT, TCEP1 glutationa reduzida e oxidada, cisteína, cistina, cisteamina,tioglicolato, S2O32', S2O42", S2O52", SO32", S2O72", Cu+, proteína dissulfeto i-somerases, proteína tiol-dissulfeto oxidorreductases, etc.), ou usados sozi-nhos ou em combinação, encontram uso na presente invenção. Outros adju-vantes que alteram as propriedades de solventes, (por exemplo etanolamina,DMSO, TWEEN®-80, arginina, uréia, etc.), ou adicionados sozinhos ou pre-ferivelmente em combinação com agentes redutores/oxidantes de dissulfeto,como βΜΕ, durante o processo de purificação também encontram uso napresente invenção por aumento da atividade da proteína. Em algumas mo-dalidades preferidas, proteína parcialmente purificada é diluída em tampão(em algumas modalidades particularmente preferidas, um tampão zwiteriôni-co com TWEEN®-80 em pH básico) e ativado com βΜΕ e um agente oxi-dante de dissulfeto (em modalidades preferidas alternativas, glutationa oxi-dada ou um sulfito de sódio).

Além disso, contempla-se que condições serão tríadas a fim dedeterminar a ativação ótima da proteína, se desejado. Por exemplo, váriasconcentrações de βΜΕ (Om1 - 10 mM), concentrações de agentes oxidantes(O a 1/20 a 20 vezes a concentração de βΜΕ) pH (7,5 - 9,5), temperaturas(15 - 40°C), diluições (1 - 20 vezes), tempos de incubação (12-72 h), ae-ração (incubações sob gás inerte para uma misturação vigorosa sob gasescontendo oxigênio), tipos de tampão (Tris, CHES, CAPS, Tricine1TAPS, ou-tros tampões zwiteriônicos, etc.), concentrações de tampão (0,1 - 1 M), e aadição de várias adjuvantes conhecidos como alterando as propriedades desolvente, assim afetando a conformação e agregação de proteínas (por e-xemplo, etanolamina, DMSO, TWEEN®-80, arginina, uréia, etc.) são testa-dos a fim de determinar as condições ótimas para o sistema de expressãousado. Não se pretende que a presente invenção seja limitada a quaisqueragentes redutores/oxidantes de dissulfeto particulares, diluição, temperatura,pH, tipo de tampão ou composição, ou adjuvante, como quaisquer reagentesapropriados conhecidos dos versados na técnica encontram uso na presenteinvenção.

Composições de cuidado pessoal

Em modalidades particularmente preferidas, a presente inven-ção provê compostos cosméticos e/ou farmacêuticos para melhorar a apa-rência da pele compreendendo pelo menos um polipeptídeo ou um peptídeo.Em algumas modalidades preferidas, o polipeptídeo ou peptídeo liga oVEGF. Em modalidades alternativas, a ligação do polipeptídeo ou peptídeo aVEGF bloqueia a atividade a jusante do VEGF. Em algumas modalidades,os compostos compreendem pelo menos um peptídeo, enquanto em outrasmodalidades, os compostos compreendem pelo menos um polipeptídeo. Emalgumas modalidades preferidas, o peptídeo compreende uma seqüência deaminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOS: 1-7,16, e 17. Em modalidades preferidas adicionais, o peptídeo tem uma se-qüência de ligação conservada, a seqüência sendo XXLWPXWC (SEQ IDNO: 15). Em algumas modalidades preferidas, o peptídeo compreende umaseqüência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQID NOS:22-24. Em modalidades preferidas alternativas, os compostos têmuma seqüência, a seqüência sendo pelo menos 70%, preferivelmente 80%,mais preferivelmente 90%, e o mais preferivelmente 95% homóloga com asseqüências especificadas aqui. Em algumas modalidades preferidas, o poli-peptídeo tem um peso molecular que está preferivelmente entre 500 Dáltonse 30.000 Dáltons, mais preferivelmente entre 1000 Dáltons e 10.000 Dáltons,e o mais preferivelmente de 1500 Dáltons a 8.000 Dáltons.

Em algumas modalidades preferidas, os compostos encontramuso na melhora da pele em um organismo (isto é, indivíduo) tendo um dis-túrbio de pele. Em algumas modalidades preferidas, o distúrbio de pele é umdistúrbio angiogênico de pele. Em modalidades preferidas adicionais, o dis-túrbio de pele é pelo menos um selecionado dentre o grupo consistindo empsoríase, úlceras venosas, acne, rosácea, verrugas, eczema, hemangiomase linfangiogênese, etc. Em algumas modalidades particularmente preferidas,o distúrbio de pele é rosácea.

Não se pretende que a presente invenção seja limitada a qual-quer tratamento ou condição de pele particular. Por exemplo, cor da peletem sido um aspecto de preocupação para seres humanos há muitos anos.

Em particular, se nota um desejo de remover a hiperpigmentação associadacom manchas de idade, sardas, e outras áreas de escurecimento da peledevido a idade ou outros fatores. Uma complexão uniformemente colorida(isto é, sem áreas de vermelhidão, escuras ou brancas) é preferida por mui-tos indivíduos. Além disso, em algumas áreas, branqueamento da pele é umefeito desejado, enquanto em outros a pele bronzeada é preferida. Várioscompostos foram usados para obter uma despigmentação, incluindo ácidokojic, hidroxiquinona, e retinóides. Várias pesquisas foram devotadas à pro-dução de uma pele bronzeada sem o uso de radiação a fim de evitar fotoda-no. Os compostos que têm encontrado uso no bronzeamento da pele semexposição solar incluem dihidroxiacetona e produtos químicos similares. Noentanto, os resultados obtidos com estes produtos geralmente não são óti-mos, como uma aplicação precisa e uniforme é requerida a fim de obter oresultado desejado. Além disso, muitos destes compostos são irritantes napele.

A base química e enzimática da melanogenese é bem-conhecida.

Os melanócitos migram da cresta neural embrional neural dentro da pelepara produzir os grânulos secretórios conhecidos como melanossomas, queproduzem melanina via melanogenese. A melanina produzida por estas célu-las é então distribuída aos queratinócitos pelos dendritos de melanócito. Aenzima chave em melanogenese é tirosinase, que inicia uma cascata de re-ações que convertem tirosina em melanina, que é um polímero. Duas proteí-nas relacionadas com tirosinase (TRP's) são conhecidas, que compartilhamcerca de 40% de homologia com tirosinase. Estas proteínas (TRP-1 e TRP-2) têm atividades catalíticas assim como papéis regulatórios em melanoge-nese. TRP-1 é relatado como sendo a glicoproteína mais abundante em me-lanócitos.

Apesar da base química e enzimática de melanogenese ser bemdocumentada, sua regulação ao nível celular é somente parcialmente enten-dida. Tirosinase e os TRP1S compartilham propriedades estruturais e biológi-cas com a família dos genes da proteína de membrana associada Iisossomal(LAMP). Assim, foi contemplado que sua marcação para a membrana mela-nossomal pode induzir sua ativação. É também contemplado que a reaçãode fosforilação/desfosforilação ocorrendo nas caudas citoplásmicas destasproteínas pode estar envolvida na regulação de melanogenese. A isoformabeta da família de proteína quinase C (PKC) foi demonstrada como regulan-do a melanogenese humana através da ativação de tirosinase. A expressãode genes de tirosinase, TRP-1 e TRP-2 é coordenada. Além disso, todas astrês enzimas são expressadas na epiderme humana.

O receptor ativado por 2- protease- (PAR-2) é um receptor copu-lado a proteína G de sete transmembranas, que está relacionado com, masé distinto dos receptores de trombina (TR também nomeado PAR-1, e PAR-3) em sua seqüência. Ambos os receptores são ativados proteoliticamentepor uma clivagem de arginina-serina ao domínio extracelular. Os N-términosrecentemente criados então ativam estes receptores como Iigandos amarra-dos. Ambos os receptores podem ser ativados por tripsina, mas somente osTRs são ativados por trombina. Além disso, somente PAR-2 é ativado portriptase de células- tronco. Ambos os receptores também podem ser ativa-dos pelo peptídeos que correspondem a seus novos N-términos, indepen-dentes de clivagem do receptor. Além disso, um peptídeo com a seqüênciaSLIGRL (SEQ ID NO:32), conhecido como sendo um peptídeo ativador dePAR-2 de camundongo, é eqüipotente na ativação do receptor humano. A-pesar das funções de TR serem bem documentadas, a biologia do sistemaPAR-2 ainda não foi completamente identificada. No entanto, um papel paraa ativação de PAR-2 na inibição de crescimento e diferenciação de querati-nócitos foi recentemente descrito (Derian etal., Cell Growth Different., 8:743-749 [1997]).

Em outras modalidades preferidas, a presente invenção provêcompostos cosméticos e/ou farmacêuticos para melhorar a aparência dapele. Nestas modalidades preferidas, os compostos compreendem pelo me-nos um peptídeo ou polipeptídeo dentro de pelo menos um suporte de es-queleto, o peptídeo ou polipeptídeo sendo expressado no suporte de esque-leto. Em algumas modalidades particularmente preferidas, o pelo menos umpeptídeo ou polipeptídeo é um laço. Em outras modalidades particularmentepreferidas, o laço é fechado por uma ligação dissulfeto. Em algumas modali-dades preferidas, o polipeptídeo ou peptídeo liga a VEGF. Em modalidadesalternativas, a ligação do polipeptídeo ou peptídeo a VEGF bloqueia a ativi-dade a jusante do VEGF. Em algumas modalidades particularmente preferi-das, o peptídeo é expressado em um esqueletoresistente a protease. Emalgumas modalidades especialmente preferidas, o esqueletocompreende uminibidor de protease (por exemplo, inibidor de BBI, STI, ou quimotripsina El-gin). Em algumas modalidades mais preferidas, o inibidor de protease é BBI.

Em algumas modalidades preferidas, os compostos ainda com-preendem pelo menos um peptídeo. Preferivelmente, o peptídeo compreen-de uma seqüência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindoem SEQ ID NOS: 1-7, 16, e 17. Em determinada alternativa, peptídeo com-preende uma seqüência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consis-tindo em SEQ ID NOS: 14). Em algumas modalidades, os compostos com-preendem uma seqüência de aminoácidos selecionada dentre o grupo con-sistindo em SEQ ID NOS:22-24. O mais preferivelmente, os compostoscompreendem SEQ ID NO:22. Em algumas modalidades preferidas, o peptí-deo tem uma seqüência de ligação conservada, a seqüência sendo X-XLWPXWC (SEQ ID NO: 15). Em algumas modalidades preferidas, os com-postos têm uma seqüência, a seqüência sendo pelo menos 70%, preferivel-mente 80%, mais preferivelmente 90%, e o mais preferivelmente 95% idênti-ca às seqüências especificadas aqui. O peso molecular do peptídeo estápreferivelmente entre 500 Dáltons e 45.000 Dáltons, mais preferivelmenteentre 1000 Dáltons e 12.000 Dáltons, e o mais preferivelmente de 1500 Dál-tons a 10.000 Dáltons. Em algumas modalidades preferidas, os compostoscompreendem pelo menos um polipeptídeo.

Em algumas modalidades preferidas, os compostos são usadospara a melhora da pele em um organismo (isto é, um indivíduo) tendo umdistúrbio de pele. Em modalidades preferidas adicionais, o distúrbio de peleé pelo menos um selecionado dentre o grupo consistindo em psoríase, úlce-ras venosas, acne, rosácea, verrugas, eczema, hemangiomas e linfangiogê-nese, etc. Em algumas modalidades particularmente preferidas, o distúrbiode pele é rosácea.

Em ainda outras modalidades, a presente invenção provê com-posições cosméticas e/ou farmacêuticas compreendendo pelo menos umpolipeptídeo ou peptídeo, como especificado aqui, e um veículo ou excipien-te fisiologicamente aceitável. Preferivelmente, o composto está presente emuma quantidade de cerca de 0,0001% a cerca de 5% em peso com base nopeso total da composição. Também preferivelmente, o composto está pre-sente em uma quantidade de cerca de 0,001% a cerca de 0,5% em pesocom base no peso total da composição. Composição pode estar na forma deum veículo emulsificado, como um creme ou loção nutriente, um gel estabili-zado ou sistema de dispersão, um soro de tratamento, um sistema de distri-buição lipossomal, uma máscara ou porção tópica, um sistema de limpeza àbase de tensoativos como um xampu ou líquido de limpeza corporal, umadispersão ou emulsão aerossolizada ou pulverizada, um condicionador paraa pele ou cabelo, auxiliar de penteado, ou um produto pigmentado comomaquiagem, assim como outras preparações de maquiagem e cosméticasapropriadas. Em algumas modalidades, o veículo é preferivelmente pelomenos um selecionado dentre o grupo consistindo em água, propileno glicol,etanol, propanol, glicerol, butileno glicol e polietileno glicol.

Em modalidades adicionais, a presente invenção provê compos-tos cosméticos e/ou farmacêuticos compreendendo pelo menos um polipep-tídeo ou um peptídeo apropriado para modular o crescimento de cabelo. Emalgumas modalidades preferidas, os compostos compreendem pelo menosum polipeptídeo.

Em algumas modalidades preferidas, a modulação compreendeo tratamento de pelo menos um doença ou condição que envolve perda decabelo. Em algumas modalidades preferidas, a doença ou condição é pelomenos uma selecionada dentre o grupo consistindo em alopecias inflamató-rias, pseudopelada, escleroderma, mordidas de carrapatos, Iichen planus,psoríase, lupus, dermatite seborrêica, síndrome da perda de cabelo, hemo-cromatose, alopecia androgênica, alopecia areata, câncer, condições queafetam a produção defeituosa de fibras do cabelo, e fatores ambientais queafetam a produção do cabelo. Em algumas modalidades preferidas, a doen-ça é alopecia androgênica ou alopecia areata.

Em algumas modalidades preferidas, a modulação compreendea inibição do crescimento de cabelo e/ou remoção do cabelo para tratamentode pelo menos um doença ou condição para a qual é desejável um cresci-mento diminuído de cabelo. Em algumas modalidades preferidas, a inibiçãoe/ou a remoção compreende depilação.

Em algumas modalidades preferidas, a invenção provê compos-tos cosméticos e/ou farmacêuticos para modular o crescimento de cabelocompreendendo pelo menos um peptídeo ou polipeptídeo e pelo menos umsuporte de esqueleto, o peptídeo ou polipeptídeo estando contido dentro dosuporte de esqueleto, preferivelmente o peptídeo ou polipeptídeo sendo umlaço, e o mais preferivelmente, o laço sendo fechado por uma ligação dissul-feto. Em algumas modalidades preferidas, o esqueletocompreende STI, E-glin ou BBI. Em modalidades particularmente preferidas, o esqueletocom-preende BBI. Em modalidades ainda preferidas, o peptídeo ou polipeptídeocompreende um polipeptídeo.

Em ainda outras modalidades, a presente invenção provê meiospara diminuir a atividade e/ou níveis de VEGF. Em algumas modalidadespreferidas, a atividade e/ou níveis de VEGF são diminuídos na epiderme. Emalgumas modalidades, o método compreendendo aplicar uma quantidadeefetiva de pelo menos um dos compostos como aqui descritos a um orga-nismo em necessidade do mesmo.

Em modalidades adicionais, a presente invenção provê aplica-ções para tratamento do cabelo e/ou da pele, assim como aplicações na ci-catrização de feridas, tratamento de doenças proliferativas, etc. Assim, apresente invenção provê composições e métodos apropriados para a aplica-ção em/sobre os seres humanos e outros animais.Em modalidades preferidas adicionais, a presente invenção édirigida a pelo menos um esqueletoresistente a protease compreendendo,pelo menos, um peptídeo ou polipeptídeo e, pelo menos, um laço. Os laçosnativos flexíveis são encontrados sobre a superfície da maior parte dos mó-dulos de proteína e existem como extensões curtas de aminoácidos que co-nectam regiões de estrutura secundária definida. Apesar dos estudos crista-lográfico e de RMN (ressonância magnética nuclear) demonstrarem que oslaços nativos são geralmente menos bem definidos do que as alfa-hélices ebeta- folhas, sua liberdade conformacional é normalmente limitada substan-cialmente comparada com os peptídeos livres. Conseqüentemente, as ativi-dades de ligação dos laços nativos em proteínas geralmente diferem signifi-cativamente das da seqüência linear correspondente de aminoácidos. Noentanto, não se pretende que a presente invenção seja limitada a qualquermecanismo específico.

Os laços providos pela presente invenção ligam proteínas comoVEGF (por exemplo, VEGF-A). A ligação do laço à proteína evita que a pro-teína se ligue à sua marcação. Assim, pensa-se que as interações de liga-ção devem ser rompidas por ligação ao laço da proteína. Como um resulta-do, bioatividade pode ser alterada, como desejado. No entanto, não se pre-tende que a presente invenção seja limitada a qualquer mecanismo em par-ticular.

A presente invenção ainda provê inibidores de protease paraestabilizar os laços. STI, BBI e Eglin C tem laços nativos que ligam a e ini-bem proteases. Em algumas modalidades, laços nativos de STI e BBI sãosubstituídos com os polipeptídeos e/ou peptídeos da invenção. Em algumasmodalidades, estas seqüências são substituídas com inibidores ou melhora-dores de qualquer VEFG, enquanto que, em outras modalidades, as se-qüências são substituídas com inibidores ou melhoradores de VEGF-A. Emmodalidades alternativas, as seqüências são substituídas com inibidores deFGF-5, TGFB-1 e TGFB-2, assim como inibidores da via complementar, co-mo inibidores de C2, C3, C4 ou C5 e Compstatina, etc. Em modalidades adi-cionais, laços nativos de STI e BBI são substituídos com seqüências queforam isoladas usando várias técnicas conhecidas na técnica (por exemplo,apresentação na superfície de fagos), como as proteínas de ligação a VEGF1como aqui descrito.

Em algumas modalidades, um laço nativo é substituído com umlaço que tem 3 a 20 aminoácidos de comprimento, preferivelmente 5 a 15aminoácidos de comprimento, e mais preferivelmente 5 a 10 aminoácidos decomprimento. Em modalidades alternativas, seqüências mais longas encon-tram uso, desde que elas proporcionem ligação e/ou inibição. Além disso,peptídeos apropriados para uso como substituições do(s) laço(s) nativo(s)podem formar laços limitados (isto é, um laço formado pela presença a umaligação dissulfeto entre dois resíduos de cisteína). Em algumas modalidadesparticularmente preferidas, os peptídeos tem entre 7 e 9 aminoácidos decomprimento.

Existem várias vantagem em usar suportes "scaffold" para esta-bilizar as seqüências de peptídeos. Em algumas modalidades preferidas, aatividade biológica de um peptídeo é maior e/ou eficazmente modula a fun-ção biológica como um resultado de limitar a flexibilidade do peptídeo e re-duz o custo entrópico de fixação da seqüência de polipeptídeos na confor-mação bioativa. Além disso, informação estrutural obtida por cristalografia deraios X encontra uso em guiar a maturação por afinidade. Além disso, emalgumas modalidades, a seqüência apresentada em um esqueletoestruturalé mais resistente à degradação proteolítica em aplicações biológicas diferen-tes. Em ainda outras modalidades, a constructo quimérica é obtida em quan-tidade grande em sistemas de expressão biológicos de baixo custo para a-plicações industriais.

BBI representa uma classe de suportes "scaffold" de proteínacuja ligação a proteases é mediada por um laço nativo exposto que é fixadoem uma conformação canônica característica canonical e que se ajusta nosítio ativo em um modo similar, como pensa, ao de um substrato (Laskowskie Kato, Ann. Rev. Biochem., 49:593-626 [1980]; e Bode & Huber, supra). Olaço nativo é freqüentemente limitado pela presença de pontes dissulfetoe/ou redes de ligação a hidrogênio extensivas que atuam para tratar a estru-tura na estrutura canônica correta. A seqüência deste laço determina a es-pecificidade da inibição, que espelha a especificidade de proteases paraseus substratos. Por exemplo, a maior parte dos inibidores de tripsina temArg ou Lys como seu resíduo P1. Inibidores da família de BBI tem uma redede pontes dissulfeto conservadas que ajudam a formar uma estrutura simé-trica de dois domínios tricíclicos (Chen et ai, supra] Werner e Wemmer, su-pra, e Liu et ai, supra), cada contendo um sítio de ligação de serina protea-se independente. O laço nativo de ligação está contido dentro de uma regiãounida por pontes dissulfeto formadas entre resíduos de cisteína. A identida-de do resíduo de aminoácidos no sítio P1 em cada domínio é o determinanteprincipal da serina protease inibida. Os domínios nativos possuem Iisina ouarginina para tripsina, Ieucina ou tirosina para quimotripsina e alanina paraelastase (Tsunogae et ai, J. Biochem. (Tokyo) 100:243-246 [1986]). Alémdisso, serina é altamente conservada na posição ΡΊ e prolina na posiçãoP'3. As regiões de laço nativo individuais de BBI são bem apropriadas para oenxerto de laço de proteína de peptídeos limitados por cisteína previamenteidentificados, que ligam a marcações seletivamente, como aqui descrito.

Numerosas isoformas de BBI foram caracterizadas. Por exemplo,a seqüência

DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCICALSYPAQCFCVDITDFCYE PCKPSEDDKEN (SEQ ID NO:25) proporciona a seqüênciade aminoácidos de uma estrutura dorsal de BBI, como aqui descrito. Alémdisso, em algumas modalidades, BBI é truncado com tantos como 10 resí-duos de aminoácidos sendo removidos do N- ou C- terminal. Qualquer umadas isoformas, como aqui descrito, assim como as adicionais conhecidas natécnica, encontra uso como suportes "scaffold" na presente invenção.

A presente invenção provê várias vantagens sobre a criação de,por exemplo, proteínas quiméricas. Transferência de uma proteína completapode ser difícil quando, por exemplo, o domínio da proteína de interessetransporta mais do que uma atividade biológica importante. Manter uma ati-vidade (por exemplo interações domínio-domínio funcionalmente significan-tes) enquanto alterando outra (por exemplo, ligação de alta afinidade paraum co-fator ou receptor) pode ser problemático. A presente invenção, comoindicado aqui, supera esta limitação, como em modalidades preferidas oslaços são transferidos, em vez dos domínios completos.

Além disso, em algumas modalidades, os compostos da presen-te invenção compreendem pelo menos uma mutação além da especificadaacima. Outras mutações, como deleções, inserções, substituições, transver-sões, transições e inversões, em um ou mais de outros locais, também en-contram uso na presente invenção.

Em algumas modalidades, os compostos da presente invençãotambém compreendem uma substituição conservativa que pode ocorrer co-mo uma substituição similar-a-similar (por exemplo, básica para básica, áci-da para ácida, polar para polar etc.). Em modalidades adicionais, substitui-ções não conservativas são providas (isto é, de uma classe de resíduo paraoutra ou alternativamente envolvendo a inclusão de aminoácidos não natu-rais, como ornitina, ornitina de ácido diaminobutírico, ornitina de norleucina,piriilalanina, tienilalanina, naftilalanina e fenilglicina).

Em algumas modalidades, as seqüências também tem dele-ções, inserções e/ou substituições de resíduos de aminoácidos que produ-zem uma mudança silente e resultam em uma substância funcionalmenteequivalente.

Em algumas modalidades, substituições de aminoácidos delibe-radas são feitas com base na similaridade das propriedades de aminoácidos(por exemplo, polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade,e/ou a natureza antipática dos resíduos) e são assim utilizáveis para agruparos aminoácidos juntos em grupos funcionais. Aminoácidos podem ser agru-pados juntos com base nas propriedades de sua cadeia lateral sozinha. Noentanto, é mais utilizável incluir também os dados de mutação. Os conjuntosde aminoácidos assim derivados são provavelmente conservados por razõesestruturais. Estes conjuntos podem ser descritos na forma de um diagramaVenn (Ver por exemplo, Livingstone e Barton, Comput. Appl. Biosci.., 9:745-756 [1993]; e (Taylor, J. Theor. Biol., 119:205-218 [1986]). Em algumas mo-dalidades, substituições conservativas são feitas, por exemplo de acordocom a tabela abaixo que descreve um agrupamento de aminoácidos de dia-grama de Venn geralmente aceito.

<table>table see original document page 143</column></row><table>

Em algumas modalidades, seqüências variantes de aminoácidosda presente invenção também incluem grupos espaçadores apropriados in-seridos entre quaisquer dois resíduos de aminoácidos de uma seqüênciaincluindo grupos alquila como grupos metila, etila ou propila, além dos espa-çadores de aminoácidos como resíduos de glicina ou β-alanina. Uma outraforma de variação envolve a presença de um ou mais resíduos de aminoáci-dos em forma peptóide.

Em algumas modalidades, comparações de homologia encon-tram uso na identificação de seqüências homólogas que encontram uso napresente invenção. As comparações de homologia pode ser conduzidas aolho nú, ou mais geralmente, com a ajuda de programas de comparação deseqüências prontamente disponíveis. Os programas de computador disponí-veis podem calcular a homologia percentual entre duas ou mais seqüências.Adicionalmente, a homologia percentual pode ser calculada sobre seqüên-cias contíguas (isto é, uma seqüência é alinhada com a outra seqüência ecada aminoácído em uma seqüência é diretamente comparado com o ami-noácido correspondente na outra seqüência, um resíduo de cada vez). Isto échamado como um alinhamento "não espaçado". Tipicamente, estes alinha-mentos não espaçados são realizados somente sobre um número relativa-mente curto de resíduos.

Apesar deste ser um método consistente e muito simples, eledeixa de levar em consideração que, por exemplo, em um par de seqüênciasde outra forma idêntico, uma inserção ou deleção irá levar os seguintes resí-duos de aminoácidos a serem colocados fora de alinhamento, assim poten-cialmente resultando em uma grande redução em % homologia quando umalinhamento global é realizado. Conseqüentemente, a maior parte dos méto-dos de comparação de seqüência são projetados para produzir alinhamentosótimos que levam em consideração possíveis inserções e deleções sem pe-nalizar indevidamente o escore de homologia global. Isto é obtido por inser-ção de "espaços " em um alinhamento de seqüência de modo a tentar ma-ximizar a homologia local.

No entanto, estes métodos mais complexos designam "penali-dades de espaço" a cada espaço que ocorre nos alinhamentos, de modoque para o mesmo número de aminoácidos idênticos, o alinhamento de se-qüência com o menor número de espaços possível (isto é, refletindo ummaior relação entre as duas seqüências comparadas) irá obter um maiorescore do que uma com muitos espaços. "Custos de espaços relacionadospor afinidade" são tipicamente usados os quais carregam um custo relativa-mente elevado para a existência de um espaço e uma menor penalidadepara cada resíduo subseqüente no espaço. Este é um dos sistemas de clas-sificação de espaços mais comumente usado. As penalidades de espaçoselevadas irão produzir, como evidente, alinhamentos otimizados com menosespaços. A maior parte dos programas de alimentação permitem que as pe-nalidades de espaços sejam modificadas. No entanto, prefere-se usar osvalores de "default" quando usando este software para as comparações deseqüências. Quando usando o pacote GCG Wisconsin Bestfit, a penalidadede espaço de default para seqüências de aminoácidos é -12 e para um es-paço e -4 para cada extensão.

Cálculo de % homologia máxima, assim primeiro requer a pro-dução de um alinhamento ótimo, levando em consideração penalidades deespaço. Um programa de computador apropriado para realizar este alinha-mento é o pacote GCG Wisconsin Bestfit (Ver por exemplo, Devereux et ai,Nuc. Acids Res., 12:387 [1984]). Exemplos de outros pacotes de softwareque podem realizar as comparações de seqüências incluem, mas não sãolimitados ao pacote BLAST FASTA, e a suite GENEWORKS de ferramentasde comparações, todos sendo bem-conhecidos dos versados. AmbosBLAST e FASTA são disponíveis para busca offline e online. No entanto,para algumas aplicações, prefere-se usar o programa GCG Bestfit. O pacoteBLAST 2 Sequence é também disponível para comparação de seqüênciasde proteínas e nucleotídicas.

Apesar da homologia percentual final poder ser medida em ter-mos de identidade, o próprio processo de alinhamento tipicamente não ébaseado em uma comparação de pares "tudo ou nada". Ao contrário, umamatriz de escore de similaridade em escala é geralmente usada que defineescores para cada comparação à feição de pares com base em similaridadequímica ou distância evolucionária. Um exemplo desta matriz comumenteusada é a matriz BLOSUM62 - a matriz de default para a suite de progra-mas BLAST. Os programas GCG Wisconsin geralmente usam ou valores dedefault públicos ou uma tabela de comparação de símbolos de praxe, se for-necida. Para algumas aplicações, prefere-se usar os valores de default pú-blicos para o pacote GCG, ou no caso de outro software, a matriz de default,como BLOSUM62.

Alternativamente, homologias percentuais podem ser calculadasusando o aspecto de alinhamento múltiplo em DNASI5® (Hitachi Software),com base em um algoritmo, análogo a CLUSTAL (Ver por exemplo, Higginse Sharp, Gene 73:237-244 [1988]).

Uma vez que o software produziu um alinhamento ótimo, é pos-sível calcular a porcentagem de homologia, e mais preferivelmente, o por-centagem de identidade de seqüência. O software tipicamente realiza istocomo parte de uma comparação de seqüência e gera um resultado numérico.

Em algumas modalidades, a presente invenção provê ácidosnucléicos codificando qualquer um dos compostos como aqui descritos, as-sim como seus complementos. Em modalidades preferidas adicionais, a in-venção provê vetores compreendendo um composto, como descrito aqui,células compreendendo o composto e métodos de expressar o composto.

Os versados na técnica apreciam a relação entre as seqüênciasde ácido nucléico e seqüências de polipeptídeos, em particular como rela-cionadas com o código genético e a degenerescência deste código, e serãocapazes de construir estes ácidos nucléicos sem dificuldade. Por exemplo,um versados na técnica sabe que, para cada substituição de aminoácido emuma seqüência, pode-se ter um ou mais códons que codificam o aminoácidosubstituto. Assim, é evidente que, dependendo da degenerescência do códi-go genético com relação ao resíduo de aminoácidos particular, uma ou maisseqüências de ácido nucléico pode ser gerada correspondendo à seqüênciade polipeptídeos.

Mutações em seqüência de aminoácidos e em seqüência deácido nucléico podem ser feitas por qualquer uma de várias técnicas, comoconhecido na técnica. Em modalidades particularmente preferidas, as muta-ções são introduzidas em seqüências parentais por meio de PCR (reação decadeia polimerase) usando iniciadores apropriados. Em algumas modalida-des, as enzimas parentais são modificadas ao nível de aminoácidos, en-quanto em outras modalidades, as enzimas são modificados ao nível de áci-do nucléico, a fim de gerar as seqüências como aqui descrito. Em algumasmodalidades preferidas, a presente invenção provê a geração de compostospor introdução de uma ou mais mudanças de códons correspondentes naseqüência nucleotídica codificando um composto. Será notado que as mu-danças de códon irão encontrar uso em várias seqüências de ácido nucléicoda presente invenção. Por exemplo, em algumas modalidades, mudanças deseqüências são feitas em qualquer uma das seqüências homólogas, comoaqui descrito.

Como indicados acima, em algumas modalidades, o "composto"compreende a proteína "completa", (isto é, em seu comprimento completo,como ocorre em natureza (ou como mudado)), enquanto em outras modali-dades, ele compreende uma forma truncada de uma proteína. Assim, oscompostos da presente invenção são ou truncados ou de "comprimentocompleto". Além disso, em algumas modalidades, a truncagem está locali-zada na extremidade N-terminal, enquanto em outras modalidades, a trun-cagem está localizada na extremidade C-terminal da proteína. Em outrasmodalidades, o composto falta uma ou mais porções (por exemplo, subse-qüências, seqüências de sinal, domínios ou porções), ou ativo ou não.

Em ainda outras modalidades alternativas, as seqüências nucle-otídicas codificando os compostos são preparadas sinteticamente por méto-dos padrões estabelecidos (por exemplo, o método fosforoamidito descritopor Beucage et ai, Tetrahedr. Lett., 22:1859-1869 [1981]; ou o método des-crito por Matthes et ai, EMBO J., 3:801-805 [1984]). No método fosforoami-dito, oligonucleotídeos são sintetizados (por exemplo, em um sintetizador deDNA automático), purificado, anelado, ligado e clonado em vetores apropriados.

Em algumas modalidades da presente invenção, as seqüênciasnucleotídicas são ou de origem genômica mista ou sintética, origem de cD-NA e sintética mista e origem de cDNA e genômico mista, preparadas porligação de fragmentos de origem de cDNA ou genômico, sintético, de acordocom técnicas padrões. Cada fragmento ligado corresponde a várias partesda seqüência nucleotídica completa. Em algumas modalidades, a seqüênciade DNA é preparada por reação de cadeia polimerase (PCR) usando inicia-dores específicos, como conhecido na técnica.

Em algumas modalidades, as seqüências nucleotídicas, descri-tas aqui, e apropriadas para uso nos métodos e composições descritos aqui,incluem em si mesmas nucleotídeos sintéticos ou modificados. Vários tiposdiferentes de modificação para oligonucleotídeos são conhecidos na técnica.Estes incluem, mas não são limitados a, estruturas dorsais de metilfosfonatoe fosforotioato e/ou a adição de cadeias acridina ou polilisina nas extremida-des 3' e/ou 5' da molécula. No entanto, não se pretende que a presente in-venção seja limitada a qualquer método particular, como quaisquer métodosapropriados conhecidos dos versados para modificar as seqüências núcleo-tídicas encontram uso na presente invenção. Em algumas modalidades, es-tas modificações são realizadas a fim de melhorar a atividade e/ou extensãode vida in vivo das seqüências nucleotídicas.

Em algumas modalidades preferidas, a presente invenção provêseqüências nucleotídicas e métodos para usar seqüências nucleotídicas quesão complementares às seqüências apresentadas aqui, assim como deriva-dos e/ou fragmentos destas seqüências.

Em algumas modalidades, os polinucleotídeos da presente in-venção encontram uso na produção de iniciadores e/ou sondas. Assim, emalgumas modalidades, as seqüências polinucleotídicas são usadas paraproduzir iniciadores de PCR, iniciadores para outros métodos de amplifica-ção, como conhecido na técnica, sondas rotuladas, e/ou para métodos declonagem. Em modalidades preferidas, estes iniciadores, sondas e outrosfragmentos tem pelo menos 15, preferivelmente pelo menos 20, e em algu-mas modalidades mais preferíveis, pelo menos 25, 30 ou 40 nucleotídeos.

Além disso, estes iniciadores, sondas e fragmentos são englobados pelotermo "polinucleotídeo".

Em algumas modalidades, polinucleotídeos como polinucleotí-deos DNA e sondas são produzidos recombinantemente, enquanto em ou-tras modalidades, eles são produzidos sinteticamente. Em modalidades adi-cionais, estas seqüências são clonadas usando métodos padrões. Em geral,iniciadores são produzidos por meios sintéticos, envolvendo uma fabricaçãoem etapas da seqüência de ácido nucléico desejada, um nucleotídeo de ca-da vez. Técnicas para alcançar isto, usando técnicas automatizadas sãoprontamente disponíveis na técnica. No entanto, não se pretende que a pre-sente invenção seja limitada à produção de polinucleotídeos usando qual-quer método particular, como qualquer método apropriado conhecido dosversados encontra uso na presente invenção.

Em algumas modalidades, polinucleotídeos mais longos sãogeralmente produzidos usando meios recombinantes, por exemplo usandotécnicas de clonagem PCR, como conhecidos na técnica. Em tais modalida-des, os iniciadores são tipicamente projetados para conter sítios de reconhe-cimento de o enzima de restrição apropriados, de modo que o DNA amplifi-cado pode ser prontamente clonado em um vetor de clonagem apropriado.Preferivelmente, as seqüências variantes são pelo menos tão biologicamen-te ativas como as seqüências apresentadas aqui.

Em algumas modalidades preferidas, seqüências que são provi-das que são complementares ao composto ou seqüências que são capazesde hibridizar para as seqüências nucleotídicas dos compostos (incluindo se-qüências complementares das aqui apresentadas), assim como seqüênciasnucleotídicas que são complementares a seqüências que podem hibridizarem seqüências nucleotídicas dos compostos (incluindo seqüências comple-mentares das aqui apresentadas). Em algumas modalidades preferidas, asseqüências polinucleotídicas que são capazes de hibridizar para as seqüên-cias nucleotídicas apresentadas aqui sob condições de estringência inter-mediário a máxima são providas.

Em algumas modalidades preferidas, seqüências nucleotídicasque podem hibridizar na seqüência nucleotídica de um composto de ácidonucléico, ou o seu complemento, sob condições estringentes (por exemplo,50°C e 0,2xSSC) são providas. Mais preferivelmente, as seqüências nucleo-tídicas podem hibridizar na seqüência nucleotídica do composto, ou o seucomplemento, sob condições mais altamente estringentes (por exemplo65°C e 0,1xSSC).

Em algumas modalidades, é desejável mudar a seqüência a fimde para preparar um composto. Assim, em algumas modalidades, mutantessão preparados a partir dos compostos aqui providos. Em algumas modali-dades, mutações são introduzidas usando oligonucleotídeos sintéticos. Es-tes oligonucleotídeos contém seqüências nucleotídicas flanqueando os sítiosde mutação desejados. Várias métodos conhecidos na técnica encontramuso nesta modalidade (Ver por exemplo, Morinaga et al., Biotechnol., 2:646-649 [1984]; Nelson e Long, Anal. Biochem., 180:147-151 [1989]; e Sarkar eSommer, Biotechn., 8:404-407 [1990]). No entanto, métodos adicionais en-contram uso na presente invenção e não se pretende que a presente inven-ção seja limitada a qualquer método particular.Em algumas modalidades preferidas, as seqüências usadas nosmétodos e composições como aqui descrito incluem uma seqüência recom-binante (isto é, a seqüência que foi preparada usando técnicas de DNA re-combinante produzido usando qualquer método apropriado conhecido natécnica.

Em modalidades adicionais, a presente invenção provê vetorescompreendendo o composto, células compreendendo o composto, e méto-dos de expressar o composto. Em algumas modalidades, as seqüências nu-cleotídicas usadas nos métodos e composições como aqui descritos sãoincorporadas em um vetor replicável recombinante. Em algumas modalida-des, o vetor é usado para replicar e expressar a seqüência nucleotídica, emforma de enzima, em e/ou a partir de uma célula hospedeira compatível. Emalgumas modalidades, expressão é controlada usando seqüências de con-trole (por exemplo, seqüências regulatórias). Em algumas modalidades, pro-teínas produzidas pela célula hospedeira por expressão da seqüência nucle-otídica são secretadas (isto é, dentro do meio de crescimento), enquanto emoutras modalidades, as proteínas estão contidas intracelularmente dentro dacélula hospedeira. Em algumas modalidades, as seqüências de codificaçãosão projetadas para incluir seqüências de sinal que dirigem a seção das se-qüências codificando substâncias através de uma membrana de células pro-carióticas e eucarióticas particular. Em outras modalidades, polinucleotídeossão incorporados em um vetor replicável recombinante. Em modalidadesadicionais, o vetor é usado para replicar o ácido nucléico em uma célulahospedeira compatível. Em modalidades preferidas, o vetor compreendendoa seqüência polinucleotídica é transformado em uma célula hospedeira a-propriada. Apesar de qualquer hospedeiro apropriado encontrar uso na pre-sente invenção, em algumas modalidades preferidas, os hospedeiros sãoselecionados dentre o grupo consistindo em células bacterianas, leveduras,de insetos, de fungos e de mamíferos.

Em algumas modalidades, compostos e seus polinucleotídeossão expressados por introdução de um polinucleotídeo em um vetor replicá-vel, introduzindo o vetor em uma célula hospedeira compatível, e cultivandoa célula hospedeira sob condições que ocasionam a replicação do vetor. Emalgumas modalidades, o vetor é recuperado da célula hospedeira.

Em modalidades adicionais, o composto ácido nucléico é ligadooperativamente a elementos regulatórios transcripcionais e translacionaisativos na célula hospedeira. Em algumas modalidades, o composto ácidonucléico também codifica uma proteína de fusão compreendendo pelo me-nos uma seqüência de sinal (por exemplo, as derivadas do gene glucoamila-se de Schwanniomyces occidentalis, de um gene de tipo trançado de fator αde Saccharomyces cerevisiae e a TAKA-amilase de Aspergillus oryzaé). Emoutras modalidades alternativas, o composto ácido nucléico codifica umaproteína de fusão compreendendo um domínio de ligação de membrana.

Em algumas modalidades preferidas, o composto é expressadonos níveis desejados em um organismo hospedeiro usando um vetor de ex-pressão. Contempla-se que qualquer vetor de expressão compreendendoum composto ácido nucléico que é capaz de expressar o gene codificando ocomposto ácido nucléico no organismo hospedeiro selecionado irá encontraruso na presente invenção. A escolha de vetor depende da célula hospedeiraem que ele deve ser introduzido. Assim, em algumas modalidades, o vetor éum vetor replicando autonomamente (isto é, um vetor que existe como umaentidade epissomal, cuja replicação é independente de replicação cromos-sômica, como, por exemplo, um plasmídeo, um bacteriófago ou um elementoepissomal, um minicromossomo ou um cromossomo artificial). Alternativa-mente, em algumas modalidades, o vetor integra no genoma da célula hos-pedeira e replica junto com o cromossomo.

Em algumas modalidades preferidas, o vetor de expressão incluios componentes de um vetor de clonagem, incluindo mas não limitados atais componentes como um elemento que permite a replicação autônoma dovetor no organismo hospedeiro selecionado e um ou mais marcadores feno-tipicamente detectáveis para fins de seleção. Em modalidades preferidas, ovetor de expressão ainda compreende seqüências nucleotídicas de controlecodificando um promotor, operador, sítio de ligação de ribossomas, sinal deiniciação de tradução, e opcionalmente, um gene repressor ou um ou maisgenes ativadores. Adicionalmente, em algumas modalidades, o vetor de ex-pressão compreende uma seqüência codificando para uma seqüência deaminoácidos capazes de marcar o composto em uma organela da célulahospedeira como um peroxissoma ou em um compartimento de célula hos-pedeira particular. Esta seqüência de marcação inclui mas é não limitada auma seqüência SKL. Para expressão sob a direção de seqüências de con-trole, a seqüência de ácido nucléico codificando o composto é ligada opera-tivamente às seqüências de controle em um modo apropriado com relação àexpressão.

Em algumas modalidades preferidas, o polinucleotídeo em umvetor é ligado operativamente a uma seqüência de controle que é capaz deprover a expressão da seqüência de codificação pela célula hospedeira (istoé, o vetor é um vetor de expressão). Em algumas modalidades, as seqüên-cias de controle são modificadas (por exemplo, pela adição de outros ele-mentos regulatórios transcripcionais) a fim de tornar o nível de transcriçãodirigido pelas seqüências de controle mais respondentes aos moduladorestranscripcionais. Em algumas modalidades preferidas, as seqüências decontrole compreendem promotores.

Em algumas modalidades preferidas dos vetores, a seqüênciade ácido nucléico codificando para o composto é combinada operativamentecom uma seqüência de promotor apropriada. O promotor pode ser qualquerseqüência de DNA tendo atividade de transcrição no organismo hospedeirode escolha e pode ser derivado de genes que são homólogos ou heterólogosao organismo hospedeiro. Exemplos de promotores apropriados para dirigira transcrição da seqüência nucleotídica modificada, como compostos ácidosnucléicos, em um hospedeiro bacteriano incluem, mas não são limitados aopromotor do operon Iac de E. coli, os promotores dagA do gene agarase deStreptomyces coelicolor, os promotores do gene α-amilase de Bacillus Iiche-niformis (amyL), o promotor aprE de Bacillus subtilis, os promotores do geneamilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), os promotoresdo gene α-amilase de Bacillus amyloliquefaeiens (amyQ), os promotores dosgenes xylA e xylB de Bacillus subtilis e um promotor derivado de um promo-tor derivado de Lactococcus sp. incluindo o promotor PI70. Quando o genecodificando o composto é expressado em uma espécie bacteriana como E.coli, um promotor apropriado pode ser selecionado, por exemplo, de umpromotor de bacteriófago incluindo um promotor T7 e um promotor de fagolambda. Para transcrição em uma espécie de fungos, exemplos de promoto-res utilizáveis são os derivados dos genes codificando a TAKA amilase deAspergillus oryzae, proteinase aspártica de Rhizomueor miehei, a-amilaseneutral de A. niger, α-amilase estável em ácido de A. niger, glucoamilase deA. niger, Iipase de Rhizomueor miehei, protease alcalina de A. oryzae, triosefosfato isomerase de A. oryzae, e acetamidase de A. nidulans. Exemplos depromotores apropriados para a expressão em uma espécie de levedurasincluem mas não são limitados aos promotores Gal 1 e Gal 10 de Saeeha-romyees eerevisiae e aos promotores de Piehia pastoris AOX1 ou AOX2.

Exemplos de organismos hospedeiros bacterianos apropriadossão espécies Gram positivas, incluindo, mas não limitadas a membros dasespécies de Baeillaeeae, (por exemplo, B. subtiiis, B. iieheniformis, B. ientus,B. brevis, B. stearothermophilus, B. aicaiophilus, B. amyioliquefaeiens, B.eoaguians, B. iautus, B. megaterium e B. thuringiensis), espécies de Strep-tomyees (por exemplo, S. murinus e S. lividans), bactérias de láctico ácido(por exemplo, Laetococeus spp. como Lactococcus lactis] Lactobacillus spp.incluindo Lactobacillus reuterr, Leueonostoe spp.; Pedioeoceus spp.; e Strep-toeoeeus spp. Alternativamente, cepas de espécies Gram-negativas perten-cendo aos membros de Enterobaeteriaeeae (por exemplo, E. coli) ou dePseudomonadaeeae encontram uso na presente invenção.

Em algumas modalidades, um organismo hospedeiro de levedu-ra apropriado é selecionado dentre várias espécies de leveduras biotecnolo-gicamente utilizáveis, incluindo mas não limitadas a Piehia sp., Hansenula spou Kluyveromyees, Yarrowinia, Saccharomyees (por exemplo, Saeeharomy-ees eerevisiae), Schizosaceharomyee (por exemplo, S. pombe). Em algumasmodalidades, cepas das espécies de leveduras metilotróficas Piehia pastorissão usadas com o organismo hospedeiro, enquanto em outras modalidades,o organismo hospedeiro é uma espécie Hansenula. Os organismos hospe-deiros apropriados dentre os fungos filamentosos incluem espécies de As-pergillus (por exemplo, A. niger, A. oryzae, A. tubigensis, A. awamori e As-pergillus nidulans). Alternativamente, cepas de Fusarium espécies (por e-xemplo F. oxisporum) e Rhizomucor (por exemplo, Rhizomucor miehei) en-contram uso como organismo hospedeiro. As cepas adicionais apropriadasincluem, mas não são limitadas a espécies de Thermomycese Mucor.

Em algumas modalidades preferidas, células hospedeiras com-preendendo polinucleotídeos são usados para expressar polipeptídeos, co-mo os compostos descritos aqui, fragmentos, homólogos, variantes ou seusderivados. Células hospedeiras são cultivadas sob condições apropriadasque permitem a expressão das proteínas. Em algumas modalidades, ex-pressão dos polipeptídeos é constitutiva (isto é, os peptídeos são continua-mente produzidos), enquanto em outras modalidades, expressão é indutível.Nos casos de expressão indutível, a produção de proteínas é iniciada quan-do requerido por adição de uma substância indutora ao meio de cultura (porexemplo, dexametasona ou IPTG). Polipeptídeos podem ser extraídos decélulas hospedeiras por uma variedade de técnicas conhecidos na técnica,incluindo enzimática, química e/ou Iise osmótica e ruptura física. De fato, nãose pretende que a presente invenção seja limitada a qualquer meio particularde coleta de polipeptídeos expressados.

Em modalidades alternativas, polipeptídeos são produzidos re-combinantemente em qualquer sistema isento de células in vitro apropriado(incluindo comercialmente disponível), como o sistema de reticulócito decoelhos TnT® (Promega).

Em modalidades preferidas adicionais, a presente invenção pro-vê composições cosméticas e/ou farmacêuticas compreendendo pelo menosum polipeptídeo ou peptídeo, como especificado aqui, e um veículo ou exci-piente fisiologicamente aceitável. Preferivelmente, o composto está presenteem uma quantidade de cerca de 0,0001% a cerca de 5% em peso, com baseno peso total da composição. Também preferivelmente, o composto estápresente em uma quantidade de cerca de 0,001% a cerca de 0,5% em pesocom base no peso total da composição. Composição pode estar na forma deum veículo emulsificado, como um creme ou loção nutriente, um gel estabili-zado ou sistema de dispersão, um soro de tratamento, um sistema de distri-buição lipossomal, uma máscara ou porção tópica, um sistema de limpeza àbase de tensoativos como um xampu ou líquido de limpeza corporal, umadispersão ou emulsão aerossolizada ou pulverizada, um condicionador dapele ou cabelo, auxiliar de penteado, ou um produto pigmentado como ma-quiagem. Preferivelmente, o veículo é pelo menos um composto selecionadodentre o grupo consistindo em água, propileno glicol, etanol, propanol, glice-rol, butileno glicol e polietileno glicol.

Em algumas modalidades lipossomais, os Iipossomas compre-endem água e um ou mais ingredientes capazes de formar vesículas de bi-camadas de lipídeos que podem manter um ou mais ingredientes ativos oufuncionais. Exemplos não Iimitativos de ingredientes capazes de formar ve-sículas de bi-camadas de lipídeos incluem: fosfolipídeos, fosfatidilcolina hi-drogenada, lecitina, colesterol e esfingolipídeos. Os Iipossomas preferidosincluem, sem limitação : a) Iipossoma lipóide 0003 (composto de água e leci-tina e glicerina); b) Iipossoma lipóide 0300 (composto de água e fosfatidilco-lina); c) Iipossoma lipóide 0111 (composto de água, extrato de folha deGinkgo biloba, álcool desnaturado, lecitina hidrogenada e colesterol); d) Ii-possomas antiirritantes (composto de água, extrato de semente de cola a-cuminata, bisabolol e fosfolipídeos); e) Iipossomas de vitamina CeE (com-postos de água, fosfolipídeos, acetato tocoferila e palmitato de ascorbila); f)Iipossomas firmadores (compostos de água, butileno glicol, extrato de frutapyrus malus (maçã), fosfolipídeos, acetato de tocoferila e carbomero); e g)Iipossomas umectantes (compostos de água, sódio PCA, acetato de tocoferi-la, goma de xantano, arginina, lisina, glicina e prolina).

Em outras modalidades, a composição de cuidado pessoal dapresente invenção ainda compreende pelo menos um ingrediente ativo alémdos suportes "scaffold" aqui providos. Existem numerosos ingredientes ati-vos como conhecido dos versados na técnica que encontram uso nas com-posições de cuidado pessoal da presente invenção. De fato, contempla-seque qualquer ingrediente ativo apropriado ou combinação de ingredientesativos apropriados irá encontrar uso na presente invenção (Ver por exemplo,McCutcheon's Functional Materials, Edições Norte-Americana e Internacio-nal, publicado por MC Publishing Co. [2003]). Por exemplo, em algumas mo-dalidades, as composições de cuidado pessoal aqui compreendem um in-grediente ativo de cuidado da pele a um nível de cerca de 0,0001% a cercade 20%, em peso da composição. Em outra modalidade, as composições decuidado pessoal compreendem um ingrediente ativo de cuidado da pele decerca de 0,001% a cerca de 5%, em peso da composição. Em ainda outramodalidade, as composições de cuidado pessoal compreendem um ingredi-ente ativo de cuidado da pele de cerca de 0,01% a cerca de 2%, em peso dacomposição.

Exemplos não Iimitativos de ingredientes ativos ou funcionaisque pode ser liberados via Iipossomas incluem: vitaminas e seus derivados,antioxidantes, proteínas e peptídeos, agentes queratolíticos, bioflavinóides,terpenóides, fitoquímicos, e extratos de plantas, de origem marinha ou fer-mentada. Em uma modalidade preferida, a composição ainda compreendeum ativo para o cuidado da pele ou cuidado do cabelo. Ingredientes ativospodem incluir qualquer um dentre uma ampla variedade de ingredientes co-mo são conhecidos na técnica. (Ver por exemplo, McCutcheon's FunctionalMaterials. Edições Norte-Americana e Internacional, (2003), publicado porMC Publishing Co.). Preferivelmente, estes ativos incluem mas não são limi-tados a antioxidantes, como derivados de tocoferila e ascorbila, bioflavinói-des, terpenóides, sintéticos e e outros, vitaminas e derivados de vitamina,ácidos hidroxil- e polihidróxi e seus derivados, como AHAs e BHAs e seusprodutos de reação, peptídeos e polipeptídeos e seus derivados, como gli-copeptídeos e peptídeos liofilizados, proteínas de choque térmico e citoci-nas, enzimas e inibidores de enzimas e seus derivados, como proteases,inibidores de MMP, catalases, glicose oxidase e superóxido dismutase, ami-noácidos e seus derivados, produtos de fermentação de levedura, bactériase fungos e seus derivados, incluindo cogumelos, algas e algas marinhas eseus derivados, fitoesteróis e extratos de plantas e de partes de plantas eseus derivados e fosfolipídeos e seus derivados, agentes anticaspa comopiritiona de zinco e sistemas de distribuição contendo os mesmos, como aquiprovido e/ou conhecido na técnica.

Em algumas modalidades preferidas, o ativo para o cuidado dapele é selecionado dentre o grupo consistindo em um componente de Vita-mina B3, pantenol, vitamina E, acetato de vitamina E, retinol, propionato deretinila, palmitato de retinila, ácido retinóico, vitamina C, teobromo, alfa-hidróxiácido, farnesol, fitrantriol, ácido salicílico, palmitil peptapeptídeo-3 e suasmisturas. Em algumas modalidades preferidas, o componente de vitaminaB3 é niacinamida. Em algumas modalidades, as composições providas aquicompreendem um ativo para o cuidado da pele a um nível de cerca de0,0001% a cerca de 20%, preferivelmente de cerca de 0,001% a cerca de5%, mais preferivelmente de cerca de 0,01% a cerca de 2%, em peso.

Derivados exemplares dos compostos de vitamina B3 acimaincluem ésteres de ácido nicotínico, incluindo ésteres não vasodilatadores deácido nicotínico, aminoácidos de nicotinila, ésteres de álcool nicotinílico deácidos carboxílicos, N-óxido de ácido nicotínico e N-óxido de niacinamida.

Os ésteres de ácido nicotínico apropriados incluem ésteres de ácido nicotíni-co de álcoois C1-C22. preferivelmente C-|-C-|6. mais preferivelmente C-|-C6.

Nestas modalidades, os álcoois são de modo apropriado de cadeia reta oucadeia ramificada, cíclicos ou acíclicos, saturados ou insaturados (incluindoaromáticos), e substituídos ou não substituídos. Os ésteres são preferivel-mente não vasodilatadores.

Os ésteres de ácido nicotínico não vasodilatadores incluem nico-tinato de tocoferol e hexanicotinato de inositol; nicotinatos de tocoferol sãopreferidos. A descrição mais completa de compostos de vitamina B3 é provi-da em WO 98/22085. Os de compostos vitamina B3 preferidos incluem nia-cinamida e nicotinato de tocoferol.

Em modalidades adicionais, o ativo de cuidado da pele compre-ende pelo menos um retinóide. O retinóide é preferivelmente retinol, ésteresde retinol (por exemplo, ésteres de C2 - C22 alquila retinol, incluindo palmita-to de retinila, acetato de retinila, proprionato de retinila), retinal, e/ou ácidoretinóico (incluindo ácido retinóico todo-trans e/ou ácido 13-cis- retinóico),mais preferivelmente retinóides diferentes de ácido retinóico. Estes compos-tos são bem-conhecidos na técnica e são comercialmente disponíveis devárias fontes (por exemplo, Sigma e Boehringer Mannheim). Retinóides pre-feridos incluem retinol, palmitato de retinila, acetato de retinila, proprionatode retinila, retinal, ácido retinóico e suas combinações. Mais preferidos sãoretinol, propionato retinóico, ácido retinóico e palmitato de retinila. Em algu-mas modalidades, o retinóide é incluído como um material substancialmentepuro, enquanto em outras modalidades, ele é provido como um extrato obti-do por isolamento físico e/ou químico apropriado de fontes naturais (por e-xemplo, plantas). Quando um retinóide é incluído nas composições aqui, elepreferivelmente compreende de cerca de 0,005% a cerca de 2%, preferivel-mente de cerca de 0,01% a cerca de 1% retinóide. Retinol é preferivelmenteusado em uma quantidade de cerca de 0,01% a cerca de 0,15%; ésteres deretinol são preferivelmente usados em uma quantidade de cerca de 0,01% acerca de 2% (por exemplo, cerca de 1%).

Em algumas modalidades, as composições da presente inven-ção compreendem quantidades efetivas e seguras de um veículo dermatolo-gicamente aceitável que é apropriado para aplicação tópica à pele ou cabelocom os materiais essenciais e outros materiais opcionais são incorporadospara permitir que os materiais essenciais e componentes opcionais sejamliberados na pele ou cabelo em uma concentração apropriada. Assim, emalgumas modalidades, o veículo atua como um diluente, dispersante, solven-te ou e outros para os componentes essenciais, assegurando que estescomponentes podem ser aplicados e distribuídos uniformemente sobre oalvo selecionado em uma concentração apropriada.

Em outras modalidades, uma quantidade efetiva de um ou maiscompostos como aqui descrito também deve ser incluída em composições aserem aplicadas a materiais queratinosos, como unhas e cabelo, incluindomas não limitadas aos utilizáveis como composições de pulverização no ca-belo, composições para modelar o penteado do cabelo, composições de la-vagem com xampu e/ou condicionamento do cabelo, composições aplicadascom o fim de regular o crescimento de cabelo e composições aplicadas aocabelo e couro cabeludo com o fim de tratar seborréia, dermatite e/ou caspa.

Em outras modalidades adicionais, uma quantidade efetiva deum ou mais compostos como aqui descritos é incluída em composições a-propriadas para aplicação tópica à pele ou cabelo. Estas composições sãoprovidas em qualquer forma apropriada, incluindo mas não limitadas a cre-mes, loções, géis, suspensões dispersões, microemulsões, nanodispersões,microesferas, hidrogéis, emulsões (por exemplo, óleo-em-água e água -em-óleo, assim como emulsões múltiplas), e géis multilaminares e outros (Verpor exemplo, Schlossman et ai, The Chemistrv and Manufacture of Cosme-tics. [1998], incorporado por referência, aqui). Em algumas modalidades, ascomposições são formuladas como composições aquosas de silicone, en-quanto em outras modalidades elas são formuladas como emulsões de umaou mais fases de óleo em uma fase contínua aquosa(ou uma fase aquosaem uma fase de óleo).

O tipo de veículo utilizado na-presente-invenção depende do tipode forma de produto desejada para a composição. O veículo pode ser sólido,semi-sólido ou líquido. Os veículos apropriados incluem líquidos, semi-sólidos (por exemplo, cremes, loções, géis, bastões, ungüentos, e pastas),pulverizações e espumas. Preferivelmente o veículo está na forma de umaloção, creme ou um gel, mais preferivelmente um que tem a espessura sufi-ciente ou ponto de conformação para evitar que as partículas sedimentem.Em algumas modalidades, o veículo é inerte, enquanto em outras modalida-des, ele proporciona benefícios dermatológicos. Em algumas modalidades, oveículo é aplicado diretamente à pele e/ou cabelo, enquanto em outras mo-dalidades, ele é aplicado via um pano ou tecido ou não tecido. Em ainda ou-tras modalidades, ele está na forma de um curativo, máscara ou envoltório.Em ainda outras modalidades, ele é aerossolizado ou de outra forma pulve-rizado ou bombeado na pele e/ou cabelo. O veículo escolhido é fisicamentee quimicamente compatível com os componentes essenciais, como aquidescrito, e não deve prejudicar indevidamente a estabilidade, eficácia ououtros benefícios de uso associados com as composições da presente in-venção.Os veículos preferidos contém um diluente hidrofílico dermatolo-gicamente aceitável. Os diluentes hidrofílicos apropriados incluem água, di-Iuentes hidrofílicos orgânicos como álcoois monoídricos C2 - C10, preferivel-mente C2 - C6, preferivelmente, C3 - C6 e glicóis e polióis de baixo peso mo-lecular, incluindo propileno glicol, polietileno glicol, polipropileno glicol, glice-rol, butileno glicol, 1,2,4-butanotriol, ésteres de sorbitol, 1,2,6-hexametriol,pentileno glicol, hexileno glicol, ésteres de sorbitol, éteres etoxilados, éterespropoxilados, e suas combinações. O diluente é preferivelmente líquido. Á-gua é um diluente preferido. Composição preferivelmente compreende pelomenos cerca de 20% do diluente hidrofílico.

Em algumas modalidades, veículos apropriados também com-preendem uma emulsão compreendendo uma fase hidrofílica, especialmenteuma fase aquosa, e uma fase hidrofóbica (por exemplo, um lipídeo, óleo oumaterial oleoso). Como bem-conhecido dos versados na técnica, a fase hi-drofílica é dispersa na fase hidrofóbica, ou vice versa, para formar respecti-vamente fases dispersas ou contínuas hidrofílicas ou hidrofóbicas, depen-dendo da composição de ingredientes. O termo "fase dispersa" é um termobem-conhecido de um versados na técnica de tecnologia de emulsão, usadoem referência à fase que existe como partículas pequenas ou gotículas quesão colocadas em suspensão em e circundadas por uma fase contínua. Afase dispersa é também conhecida como a fase interna ou descontínua. Aemulsão pode ser ou compreender (por exemplo, em emulsão de fase triplaou outra múltipla) uma emulsão óleo-em-água ou uma emulsão água -em-óleo, como uma emulsão água -em-silicone. As emulsões óleo-em-água tipi-camente compreendem de cerca de 1% a cerca de 60% (preferivelmentecerca de 1% a cerca de 30%) da fase hidrofóbica dispersa e de cerca de 1%a cerca de 99% (preferivelmente de cerca de 10% a cerca de 90%) da fasehidrofílica contínua, enquanto emulsões água -em-óleo tipicamente compre-endem de cerca de 1% a cerca de 98% (preferivelmente de cerca de 40% acerca de 90%) da fase hidrofílica dispersa e de cerca de 1% a cerca de 50%(preferivelmente cerca de 1% a cerca de 30%) da fase hidrofóbica contínua.

Em outras modalidades, o veículo também inclui um ou maiscomponentes que facilitam a penetração através da barreira do estrato cór-neo superior aos níveis inferiores da pele. Exemplos de melhoradores dapenetração incluem, mas não são limitados a, propileno glicol, azona, etoxi-diglicol, dimetil isosorbídeo, uréia, etanol e sulfóxido de dimetila, assim comomicroemulsões, Iipossomas e nanoemulsões.

Em algumas formas adicionais de realização, as composiçõesda presente invenção compreendem umectantes, que estão preferivelmentepresentes em um nível de cerca de 0,01% a cerca de 20%, preferivelmentede cerca de 0,1% a cerca de 15% e preferivelmente de cerca de 0,5% a cer-ca de 10%. Os umectantes preferidos incluem, mas não são limitados a,compostos selecionados dentre álcoois poliídricos, sorbitol, glicerol, uréia,betaína e, D-pantenol, DL-pantenol, pantotenato de cálcio, geléia real, pante-tina, pantoteína, pantenil etil éter, ácido pangamico, piridoxina, complexopantoil lactose Vitamina B, ácido carboxílico pirrolidona sódica, hexano - 1,2, 6, triol, guanidina ou seus derivados, e suas misturas.

Os álcoois poliídricos apropriados para uso aqui incluem, masnão são limitados a polialquileno glicóis e preferivelmente alquileno polióis eseus derivados, incluindo propileno glicol, dipropileno glicol, polipropilenoglicol, polietileno glicol e seus derivados, sorbitol, hidroxipropil sorbitol, eritri-tol, treitol, pentaeritritol, xilitol, glucitol, mannitol, pentileno glicol, hexilenoglicol, butileno glicol (por exemplo, 1,3-butileno glicol), hexano triol (por e-xemplo, 1,2,6-hexanotriol), trimetilol propano, neopentil glicol, glicerina, glice-rina etoxilada, propano-1,3 diol, glicerina propoxilada e suas misturas. Osderivados alcoxilados de qualquer um dos acima álcoois poliídricos são tam-bém apropriados para uso aqui. Os álcoois poliídricos preferidos da presenteinvenção são selecionado dentre glicerina, butileno glicol, propileno glicol,pentileno glicol, hexileno glicol, dipropileno glicol, polietileno glicol, hexanotriol, glicerina etoxilada e glicerina propoxilada e suas misturas.

Os umectantes apropriados utilizáveis aqui são 2-pirrolidona-5-carboxilato de sódio (NaPCA), guanidina; ácido glicólico e sais glicolato (porexemplo, alquila de amônio e amônio quaternário); ácido láctico e sais Iacta-to (por exemplo, alquila de amônio e amônio quaternário); aloe vera (babo-sa) em qualquer uma de suas várias formas (por exemplo, gel de aloe vera);ácido hialurônico e seus derivados (por exemplo, derivados de sal como hia-luronato de sódio); Iactamida monoetanolamina; acetamida monoetanolami-na; uréia; betaína e, pantenol e seus derivados; e suas misturas.

Em algumas modalidades, pelo menos parte (até cerca de 5%em peso de composição) de um umectante são incorporados nas composi-ções da presente invenção na forma de uma mistura com um copolímeroacrilato ou metacrilato reticulado, hidrofóbico, particulado, ele mesmo prefe-rivelmente presente em uma quantidade de cerca de 0,1% a cerca de 10%,que pode ser adicionada ou na fase aquosa ou dispersa. Este copolímero éparticularmente valiosos para reduzir o brilho e controlar o óleo enquantoajudando a prover benefícios de umectação eficazes e é descrito em maio-res detalhes em W096/03964, incorporado aqui por referência.

Em algumas modalidades, as composições óleo-em-água e á-gua -em-óleo da presente invenção compreendem de cerca de 0,05% a cer-ca de 20%, preferivelmente de cerca de 1% a cerca de 15%, preferivelmentede cerca de 2% a cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 2% a cerca de5% de um emoliente dermatologicamente aceitável. Emolientes tendem alubrificar a pele, aumentar a suavidade e flexibilidade da pele, evitar ou alivi-ar a secura da pele e/ou proteger a pele. Emolientes são tipicamente materi-ais imiscíveis água, óleos ou ceras e emolientes podem conferir proprieda-des estéticas a uma composição tópica. Uma ampla variedade de emolien-tes apropriados é conhecida (Ver por exemplo, Sagarin, Cosmetics. Scienceand Technology. 2a. Ed., Vol. 1, pp. 32-43 [1972]; e WO 00/24372), e encon-tram uso aqui, contém numerosos exemplos de materiais apropriados comoemolientes. Emolientes adicionais incluem, mas não são limitados aos se-guintes:

i) hidrocarbonetos de cadeia reta e ramificados tendo de cercade 7 a cerca de 40 átomos de carbono, como óleos minerais, dodecano, es-qualano, colesterol, poliisobutileno hidrogenado, isohexadecano, isoeicosa-no, isooctahexacontano, isohexapentacontahectano, e as C7-C40 isoparafi-nas, que são hidrocarbonetos C7-C40 ramificados. Os hidrocarbonetos decadeia ramificada apropriados para uso aqui são selecionados dentre iso-pentacontaoctactano, petrolato e suas misturas;

ii) ésteres de ácido graxo C1-C30 de C1-C30 ácidos carboxíli-cos, C12-15 benzoatos de alquila e de C2-C30 ácidos dicarboxílicos, por e-xemplo isononanoato de isononila, neopentanoato de isoestearila, octanoatode isodecila, isononanoato de isodecila, isononanoato de tridecila, octanoatode miristila,, pelargonato de octila, isononanoato de octila, miristila de miris-tato, neopentanoato de miristila, octanoato de miristila, miristato de isopropi-la, propionato de miristila, estearato de isopropila, isostearato de isopropila,isostearato de metila, beenato de beenila, maleato de dioctila, adipato dediisopropila, e dilinoleato de diisopropila e suas misturas também encontramuso na presente invenção;

iii) C1-C30 mono- e poli- ésteres de açúcares e materiais rela-cionados. Estes ésteres são derivado de um açúcar ou porção poliol e umaou mais porções de ácido carboxílico. Dependendo do ácido e açúcar consti-tuintes, estes ésteres podem estar em forma líquida ou sólida em temperatu-ra ambiente. Exemplos incluem: tetraoleato de glicose, os galactose tetraés-teres de ácido oléico, o sorbitol tetraoleato, tetraoleato de sacarose, pentao-Ieato de sacarose, hexaoleato de sacarose, heptaoleato de sacarose, octao-Ieato de sacarose, sorbitol hexaéster. Outros materiais incluem ésteres deácido graxo de óleo de soja ou óleo de semente de algodão de sacarose.Outros exemplos de tais materiais são descritos em WO 96/16636, incorpo-rado por referência aqui;

iv) Óleos vegetais e óleos vegetais hidrogenados. Exemplos deóleos vegetais e óleos vegetais hidrogenados incluem óleo de cártamo, óleode semente de uva, óleo de coco, óleo de semente de algodão, óleo de me-nhaden, óleo de caroço de palma, óleo de palma, óleo de amendoim, óleode soja, óleo de semente de colza, óleo de linhaça, óleo de farelo de arroz,óleo de pinheiro, óleo de nozes, óleo de sésamo, óleo de semente de giras-sol, óleo de óleos parcialmente e completamente hidrogenados das fontesacima e suas misturas;

v) Agentes umectantes solúveis ou coloidalmente solúveis. E-xemplos incluem ácido hialurônico e sulfato de condroitina.

Em algumas modalidades, as composições da presente inven-ção contém um emulsificante e/ou tensoativo, geralmente para ajudar a dis-persar e colocar em suspensão a fase dispersa dentro da fase aquosa contí-nua. Um tensoativo também pode ser utilizável se o produto se destinar paralimpeza da pele ou cabelo. Por conveniência aqui abaixo, "emulsificantes"são englobados pelo termo "tensoativos." Assim, como usado aqui, o termo"tensoativo(s)" refere-se a agentes ativos na superfície, ou usados comoemulsificantes ou para outros fins tensoativos como limpeza da pele. Tenso-ativos conhecidos, incluindo os convencionais, encontram uso na presenteinvenção, desde que o agente selecionado seja químicamente e fisicamentecompatível com componentes essenciais da composição e prover as carac-terísticas desejadas (Ver por exemplo, WO 00/24372). Tensoativos apropri-ados incluem materiais derivados não silicone, materiais derivados de silico-ne, e suas misturas.

Em outras modalidades, as composições da presente invençãocompreendem preferivelmente de cerca de 0,05% a cerca de 30%, mais pre-ferivelmente de cerca de 0,5% a 15%, e o mais preferivelmente de cerca de1% a 10% de um tensoativo ou mistura de tensoativos. O tensoativo ou mis-tura de tensoativos exatos escolhidos depende do pH dá composição, ououtros componentes presentes e a estética do produto final desejada.

Dentre os tensoativos não iônicos que são utilizáveis aqui estãoos que podem ser amplamente definidos como produtos de condensação deálcoois de cadeia longa (por exemplo, Cg-30 álcoois), com polímeros de a-mido ou açúcar (por exemplo, glicosídeos). Outros tensoativos não iônicosutilizáveis incluem os produtos de condensação de óxidos de alquileno comácidos graxos (isto é, ésteres de oxido de alquileno de ácidos graxos). Estesmateriais tem a fórmula geral RCO(X)nOH em que R é um grupo Ciq-30alquila, X é -OCH2CH2- (isto é, derivado de etileno glicol ou óxido) ou-OCH2CHCH3- (isto é, derivado de propileno glicol ou óxido) e η é um inteirode cerca de 6 a cerca de 200. Outros tensoativos não iônicos são os produ-tos de condensação de óxidos de alquileno com 2 moles de ácidos graxos(isto é, diésteres de oxido de aiquileno de ácidos graxos). Estes materiaistem a fórmula geral RCO(X)nOOCR em que R é um grupo C-io-30 alquila, Xé -OCH2CH2-(isto é, derivado de etileno glicol ou oxido) ou -OCH2CHCH3-(isto é, derivado de propileno glicol ou óxido) e η é um inteiro de cerca de 6 acerca de 100. Em algumas modalidades, um emulsificante para uso aqui épreferivelmente uma mistura de éster de ácido com base em uma mistura deéster de ácido graxo sorbitano e éster de ácido graxo de sacarose, especi-almente uma mistura de estearato de sorbitano e cocoato de sacarose. Ou-tros exemplos apropriados incluem uma mistura de álcoois cetearílicos eglucosídeos de cetearila. No entanto, não se pretende que a presente inven-ção seja limitada a qualquer emulsificante particular, como vários emulsifi-cantes apropriados são conhecidos na técnica.

Em modalidades adicionais, os tensoativos hidrofílicos utilizáveisaqui alternativamente ou adicionalmente incluem qualquer uma dentre umaampla variedade de tensoativos catiônicos, aniônicos, zwiteriônicos, e anfo-téricos, como são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, McCutcheon's.Emulsifiers and Deteraents. Edições Norte-Americana e Internacional, MCPublishing Co. [2003]; patente US N2 5.011.681 patente US N2 4.421.769; epatente US N2 3.755.560).

Vários tensoativos aniônicos são também utilizáveis aqui (Verpor exemplo, patente US N2 3.929.678). tensoativos aniônicos exemplaresincluem, mas não são limitados a isetionatos de alcoíla (por exemplo, C12 -C30). alquila e éter sulfatos de alquila e seus sais, alquila e fosfatos de alquiléter e seus sais, tauratos de alquil metila (por exemplo, C12 - C30), e sa-bões (por exemplo, sais de alquilamina e de metal alcalino substituídos, porexemplo, sais de sódio ou potássio) de ácidos graxos.

Tensoativos anfotéricos e zwiteriônicos são também utilizáveisaqui. Exemplos de tensoativos anfotéricos e zwiteriônicos preferido que en-contram uso nas composições da presente invenção são os que são ampla-mente descritos como derivados de aminas alifáticas secundárias e terciá-rias em que o radical alifático pode ser de cadeia reta ou ramificada e emque um dos substituintes alifáticos contém de cerca de 8 a cerca de 22 áto-mos de carbono (preferivelmente Cg - C-je) e um contém um grupo aniônicosolubilizante em água (por exemplo, carbóxi, sulfonato, sulfato, fosfato, oufosfonato). Exemplos, incluem mas não são limitados a acetatos de alquilimino e iminodialcanoatos e aminoalcanoatos, imidazolínio e derivados deamônio. Outros tensoativos anfotéricos e zwiteriônicos apropriados são osselecionados dentre o grupo consistindo em betaínas, sultainas, hidroxissul-tainas, e sarcosinatos de alcanoíla ramificados e não ramificados, e suasmisturas.

Em outras modalidades, algumas emulsões da presente inven-ção incluem um emulsificante contendo silicone ou tensoativo. Uma amplavariedade de emulsificantes de silicone encontram uso aqui. Estes emulsifi-cantes de silicone são organopolissiloxanos tipicamente organicamente mo-dificados, também conhecidos dos versados na técnica como tensoativos desilicone. Os emulsificantes de silicone utilizáveis incluem, mas não são limi-tados a dimeticona copolióis. Estes materiais são polidimetil siloxanos queforam modificados para incluir cadeias laterais de poliéter, como cadeias deóxido de polietileno, cadeias de óxido de polipropileno, misturas destas ca-deias e cadeias de poliéter contendo porções derivadas de tanto óxido deetileno como óxido de propileno. Outros exemplos incluem dimeticona copo-lióis modificados por alquila (isto é, compostos que contém C2-C30 cadeiaslaterais pendentes. Ainda outros dimeticona copolióis utilizáveis incluem ma-teriais tendo várias porções pendentes catiônicas, aniônicas, anfotéricas, ezwiteriônicas.

Em algumas modalidades, as composições da presente inven-ção compreendem pelo menos um agente espessante polimérico. Os agen-tes espessantes poliméricos utilizáveis aqui preferivelmente têm um pesomolecular médio numérico maior do que cerca de 20.000, mais preferivel-mente maior do que cerca de 50.000, e o mais preferivelmente maior do quecerca de 100.000. Em algumas modalidades, as composições da presenteinvenção compreendem de cerca de 0,01% a cerca de 10%, preferivelmentede cerca de 0,1% a cerca de 8% e mais preferivelmente de cerca de 0,2% acerca de 5% em peso da composição do agente espessante polimérico ousuas misturas.

Os agentes espessantes poliméricos preferidos para uso aquiincluem, mas não são limitados a mais do que agentes não tônicos e agen-tes espessantes aniônicos ou suas misturas. Os agentes espessantes nãotônicos apropriados incluem, mas não são limitados a polímeros poliacrilami-da, poli(N-vinil pirrolidonas) reticuladas, polissacarídeos, gomas naturais ousintéticas, polivinil pirrolidona e álcool polivinílico. Os agentes espessantesaniônicos apropriados incluem, mas não são limitados a copolímeros de áci-do acrílico/acrilato de etila, polímeros e copolímeros reticulados de carboxi-vinila de éteres de alquil vinila e anidrido maleico. Espessantes comercial-mente disponíveis (por exemplo, Carbopol; Noveon) encontram uso em al-gumas modalidades da presente invenção. As resinas apropriadas Carbopolpode ser hidrofobicamente modificadas, e outras resinas apropriadas sãodescritas em W098/22085, ou suas misturas.

Em algumas modalidades, as presentes composições compre-endem pelo menos uma fase de óleo silicone. As fases de óleo(s) siliconegeralmente compreendem de cerca de 0,1% a cerca de 20%, preferivelmen-te de cerca de 0,5% a cerca de 10%, e mais preferivelmente de cerca de0,5% a cerca de 5%, da composição. A fase óleo de silicone preferivelmentecompreende um ou mais componentes de silicone.

Em algumas modalidades, componentes de silicones são flui-dos, incluindo silicones de cadeia reta, ramificados e cíclicos. Os fluidos desilicone apropriados utilizáveis aqui incluem silicones inclusive fluidos de po-Iialquil siloxano, fluidos de poliaril siloxano, polialquilsiloxanos cíclicos e line-ares, silicones polialcoxilados, silicones modificados de amino e amônio qua-ternário, polialquilaril siloxanos ou um copolímero poliéter siloxano e suasmisturas. Fluidos de silicone voláteis, assim como não voláteis encontramuso aqui. Fluidos de silicone geralmente têm um peso molecular médio demenos do que cerca de 200.000. Em modalidades preferidas, fluidos de sili-cone apropriados tem um peso molecular de cerca de 100.000 ou menos,preferivelmente cerca de 50.000 ou menos, e mais preferivelmente cerca de10.000 ou menos. Preferivelmente o fluido de silicone é selecionado dentrefluidos de silicone tendo um peso molecular médio ponderai na faixa de cer-ca de 100 a cerca de 50.000 e preferivelmente de cerca de 200 a cerca de40.000. Tipicamente, fluidos de silicone tem uma viscosidade na faixa decerca de 0,65 a cerca de 600.000 mm2s"1, preferivelmente de cerca de 0,65a cerca de 10.000 mm2.s"1 a 25°C. A viscosidade pode ser medida por meiode um viscosímetro capilar de vidro, como especificado em método de testeda Dow Corning Corporate CTM0004, 29 de julho de 1970. Polidimetil silo-xanos apropriados que podem ser usados aqui incluem compostos comerci-almente disponíveis (por exemplo, da General Electric Company e Dow Cor-ning). Também são utilizáveis polialquilarilsiloxanos essencialmente não vo-láteis, por exemplo, polimetilfenilsiloxanos, tendo viscosidades de cerca de0,65 a 30.000 mm2s·1 a 25°C (General Electric Company ou de Dow Cor-ning). Polidimetilsiloxanos cíclicos apropriados para uso aqui são os tendouma estrutura de anel incorporando de cerca de 3 a cerca de 7 porções(CH3)2SiO, preferivelmente cerca de 5 ou mais.

Em modalidades adicionais, gomas de silicone encontram usoaqui. Em algumas modalidades preferidas, uma fase óleo de silicone com-preende uma goma de silicone ou a mistura de silicones incluindo a goma desilicone. Tipicamente, gomas de silicone têm uma viscosidade a 25°C emexcesso de cerca de 1.000.000 ITini2S'1. As gomas de silicone incluem di-meticonas, como conhecidos na técnica (Ver por exemplo, Patente US N24.152.416; e Noll, Chemistrv and Technoloav of Silicones. Academic Press,New York [1968]). Gomas de silicone como as descritas em General ElectricSilicone Rubber Produts Data Sheets SE 30, SE 33, SE 54 e SE 76, tambémencontram uso na presente invenção. Exemplos específicos de gomas desilicone incluem polidimetilsiloxano, copolímero (polidimetilsiloxano) (metilvi-nil siloxano), copolímero poli(dimetilsiloxano)(difenil)(metilvinil siloxano) esuas misturas. Preferidas gomas de silicone para uso aqui são gomas desilicone tendo um peso molecular de cerca de 200.000 a cerca de 4,000.000selecionadas dentre dimeticonol, dimeticona copoliol, dimeticona e suas misturas.

Em algumas modalidades, uma fase de silicone aqui preferível-mente compreende uma goma de silicone incorporada na composição comoparte de uma mistura goma de silicone-fluido. Quando a goma de silicone éincorporada como parte de uma goma de mistura silicone-fluido, a goma desilicone preferivelmente constitui de cerca de 5% a cerca de 40%, especial-mente de cerca de 10% a 20% em peso da mistura de goma de silicone-fluido. As misturas apropriadas de goma de silicone-fluido aqui são misturasconsistindo essencialmente de:

(i) um silicone tendo um peso molecular de cerca de 200.000 acerca de 4,000.000 selecionado dentre dimeticonol, fluorossiliconè e dimeti-cona e suas misturas; e

(ii) um veículo que é um fluido de silicone, o veículo tendo umaviscosidade de cerca de 0,65 mm^s"1 a cerca de 100 mm2s~1,em que a relação de i) a ii) é de cerca de 10:90 a cerca de 20:80e em que referido componente à base de goma de silicone tem uma viscosi-dade final de cerca de 100 mm2s"1 a cerca de 100.000 mm2s"1, preferivel-mente de 500 (Tim2S"1 a cerca de 10.000 Iiim2S"1.

Outros componentes de silicone apropriados para uso em umafase de óleo de silicone aqui incluem polímeros poliorganossiloxano reticula-dos, opcionalmente dispersos em um veículo fluido. Em geral, quando pre-sentes, os polímeros poliorganossiloxano reticulados, juntos com seu veículo(se presentes) compreendem de cerca de 0,1% a cerca de 20%, preferivel-mente de cerca de 0,5% a cerca de 10%, e mais preferivelmente de cerca de0,5% a cerca de 5% da composição. Estes polímeros compreendem políme-ros poliorganossiloxano reticulados por um agente de reticulação (Ver porexemplo, W098/22085). Exemplos de polímeros poliorganossiloxano apro-priados para uso aqui incluem, mas não são limitados a metil vinil dimetico-na, metil vinil difenil dimeticona e metil vinil fenil metil difenil dimeticona.

Outra classe de componentes de silicone apropriados para usoem uma fase de óleo silicone fase inclui copolímeros polidiorganossiloxano-polioxialquileno contendo pelo menos um segmento polidiorganossiloxano epelo menos um segmento polioxialquileno (Ver por exemplo, W098/22085).

Copolímeros polidiorganossiloxano-polialquileno apropriados são disponíveiscomercialmente sob os nomes comerciais BELSIL® de Wacker-ChemieGmbH. Uma mistura de fluido de copolímero particularmente preferida parauso aqui inclui Dow Corning DC3225C que tem a designação CTFA Dimeti-cona/Dimeticona copoliol.

Em outras modalidades, composições da presente invençãocompreendem um filtro solar orgânico. Em algumas modalidades, filtros sola-res apropriados têm propriedades de absorção de UVA, enquanto outros têmpropriedades absorventes de UVB, e ainda outros compreendem uma mistu-ra dos mesmos. A quantidade exata do ativo do filtro solar varia, dependen-do do fator de proteção solar desejado (isto é, abreviado "FPS") da composi-ção, assim como o nível desejado de proteção de UV. FPS é uma medidacomumente usada de fotoproteção de um filtro solar contra eritema. O FPS édefinido como uma relação da energia de ultravioleta requerida para produzireritema mínimo sobre a pele protegida à requerida para produzir o mesmoeritema mínima em uma pele não protegida no mesmo indivíduo. Quantida-des do filtro solar usados são preferivelmente de cerca de 2% a cerca de20%, e mais preferivelmente de cerca de 4% a cerca de 14%. Filtros solaresapropriados incluem, mas não são limitados aos aprovados para uso nosEstados Unidos, Japão, Europa e Austrália. As composições da presenteinvenção preferivelmente compreendem um FPS of cerca de 2 a cerca de30, preferivelmente cerca de 4 cerca de 30, e mais preferivelmente cerca de4 a cerca de 15.

Em algumas modalidades, as composições da presente inven-ção compreendem um ou mais ativos de filtro solar absorvedores de UVAque absorvem radiação UV tendo um comprimento de onda de cerca de320nm a cerca de 400nm. Os apropriados ativos de filtro solar absorvedoresde UVA incluem, mas não são limitados a derivados de dibenzoilmetano (Verpor exemplo, Lowe e Shaath (eds.), Sunsceens: Development. Evaluationand Requlatorv Aspects. Mareei Dekker, Inc.) derivados antranilato comometilantranilato e homometila, 1-N-acetilantranilato, e suas misturas. O ativode filtro solar absorvedor de UVA está preferivelmente presente em umaquantidade suficiente para prover proteção UVA de espectro amplo ou inde-pendentemente, ou em combinação com outros ativos protetores de UV quepode estar presentes na composição.

Os ativos de filtro solar Uva apropriados incluem ativos de filtrosolar dibenzoilmetano e seus derivados. Eles incluem, mas não são limitadosaos selecionados dentre 2-metildibenzoilmetano, 4-metildibenzoilmetano,4-isopropildibenzoilmetano, 4-terc-butildibenzoilmetano, 2, 4-dimetildibenzoil-metano, 2, 5-dimetildibenzoilmetano, 4, 4'-diisopropilbenzoilmetano, 4-(1,1-di-metiletil)-4'-metoxidibenzoilmetano, 2-metil-5-isopropil-4'-metoxidibenzoilme-tano, 2-metil-5-terc-butil-4'-metóxi-dibenzoilmetano, 2, 4-dimetil-4'-metoxidi-benzoilmetano, 2, 6-dimetil-4'-terc-butil-4'metoxidibenzoilmetano, e suas mis-turas. Os ativos de filtro solar de dibenzoil preferidos incluem os seleciona-dos dentre 4-(1, 1-dimetiletil)-4'-metoxidibenzoilmetano, 4-isopropildiben-zoilmetano, e suas misturas. Um ativo de filtro solar preferido é 4-(1, 1-dime-tiletil)-4'-metoxidibenzoilmetano.

O ativo de filtro solar 4-(1, 1-dimetiletil)-4'-metoxidibenzoilmetano,que é também conhecido como metoxidibenzoilmetano de butila ou "avo-benzona", é comercialmente disponível sob os nomes de Parsol® 1789 deGivaudan Roure (International) S. A., e Eusolex® 9020 de Merck & Co., Inc.O filtro solar 4-isopropildibenzoil metano, que é também conhecido comoisopropildibenzoil metano, é comercialmente disponível de Merck sob o no-me de Eusolex® 8020.

Em algumas modalidades, as composições da presente inven-ção ainda incluem um ou mais ativos de filtro solar UVB que absorve (m)radiação UV tendo um comprimento de onda de cerca de 290 nm a cerca de320 nm. As composições compreendem uma quantidade do ativo de filtrosolar UVB que é segura e efetiva em prover proteção contra UVB ou inde-pendentemente, ou em combinação com outros ativos protetores de UV quepodem estar presentes nas composições. As composições compreendem decerca de 0,1% a cerca de 20%, preferivelmente de cerca de 0,1% a cerca de12%, e mais preferivelmente de cerca de 0,5% a cerca de 8% em peso, decada filtro solar orgânico absorvendo UVB, ou como regulado pelas autori-dades relevantes.Vários ativos de filtro solar UVB são apropriados para uso aqui(Ver por exemplo, Pat U.S. N2 5,087,372; Pat. U.S. N2 5,073,371; PatenteUS N2 5,073,372; Patente US N2 4,937,370; e Patente US N2 4,999,186).Ativos de filtro solar UVB preferidos são selecionados dentre 2-etilhexil-2-ciano-3, 2-etilhexil Ν,Ν-dimetil-p-aminobenzoato, ácido p-aminobenzóico,oxibenzona, salicilato de homomentila, salicilato de octila, 4,4'-metóxi-t-butildibenzoil metano, 4-isopropil dibenzoil metano, 3-benzilideno cânfora, 3-(4-metilbenzilideno) cânfora, 3-difenilacrilato, ácido 2-fenil-benzimidazol-5-sulfô-nico (PBSA), ésteres de cinamato e seus derivados como 2-etilhexil-p-meto-xicinamato, ésteres de salicilato e seus derivados como salicilato de trieta-nolamina, salicilato de etilhexila, ácido octildimetil para-aminobenzóico, deri-vados de cânfora e seus derivados, e suas misturas. Ativos de filtro solarorgânicos preferidos incluem 2-etilhexil-2-ciano-3, 3-difenilacrilato, ácido2-fenil-benzimidazol-5-sulfônico (PBSA), octil-p-metoxicinamato, e suas mis-turas. As formas de sal e ácido neutralizadas dos filtros solares ácidos sãotambém utilizáveis aqui.

Em algumas modalidades, pelo menos um agente é adicionadoa qualquer uma das composições utilizáveis na presente invenção para es-tabilizar o filtro solar UVA para evitar que ele fotodegrade em exposição aradiação UV e assim mantenha sua eficácia de proteção UVA. Uma amplafaixa de compostos são relatados como tendo estas propriedades estabili-zantes e devem ser escolhidos para complementar tanto o filtro solar UVAcomo a composição como um todo (Ver por exemplo, Patentes US Nos5.972.316; 5.968.485; 5.935.556; 5.827.508; e WO 00/06110). Preferidosexemplos de agentes estabilizantes para uso na presente invenção incluem2-etilhexil-2-ciano-3, 3-difenilacrilato, etil-2-ciano-3, 3-difenilacrilato, 2-etilhe-xil-3, 3-difenilacrilato, etil-3, 3-bis(4-metoxifenil)acrilato, dietilhexil 2,6 naftala-to e suas misturas (Symrise Chemical Company).

Em algumas modalidades, pelo menos um agente é adicionadoa qualquer uma das composições utilizáveis na presente invenção para me-lhor a substantividade da pele destas composições, particularmente paramelhorar sua resistência a ser removida por lavagem com água ou esfrega-da. Exemplos incluem, mas não são limitados a, copolímeros acrilato/Ci2-22alquilmetacrilato, copolímero acrilato/acrilato, dimeticona, dimeticonol, enxer-to-copoli (dimetilsiloxano/ metacrilato de i-butila), Iauril dimeticona, copolíme-ro PVP/exadecano, copolímero PVP/eicoseno, tricontanil PVP e trimetoxisi-loxisilicato.

Além dos filtros solares orgânicos, em algumas modalidades, ascomposições da presente invenção adicionalmente compreendem bloquea-dores solares físicos inorgânicos (Ver por exemplo, TFA International Cos-metic Ingredient Dictionary, 6a Ed., pp. 1026-28 e 1103 [1995]; Sayre et ai,J. Soe. Cosmet. Chem., 41:103-109 [1990]; e Lowe etal., supra). Os bloque-adores solares físicos inorgânicos preferidos incluem oxido de zinco e dióxi-do de titânio e suas misturas.

Quando usados em modalidades preferidas, os bloqueadoressolares físicos estão presentes em uma quantidade tal que as presentescomposições são transparentes sobre a pele (isto é, não branqueamento),preferivelmente de cerca de 0,5% a cerca de 20%, preferivelmente de cercade 0,5% a cerca de 10%, e mais preferivelmente de cerca de 0,5% a 5% empeso. Quando dióxido de titânio é usado, ele pode ter uma estrutura anata-se, rutila ou amorfa. Os fabricantes de dióxido de titânio e oxido de zinco detipo micronizado para uso em filtro solar incluem, mas não são limitados aTayca Corporation, Uniqema, Shinetsu Chemical Corporation, Kerr-McGee,Nanofase, Nanofonte, Sachtleben, Elementis, e BASF Corporation, assimcomo seus agentes de distribuição e as empresas que ainda processam omaterial para uso em filtro solar. As partículas de bloqueador solar físicas(por exemplo, dióxido de titânio e óxido de zinco) podem ser não revestidasou revestidas com vários materiais incluindo mas não limitadas a aminoáci-dos, compostos de alumínio como alumina, estearato de alumínio, Iaurato dealumínio, e similares; ácidos carboxílicos e seus sais (por exemplo, ácidoesteárico e seus sais); fosfolipídeos, como lecitina; compostos de siliconeorgânicos; compostos de silicone inorgânicos, como sílica e silicatos e mistu-ras dos mesmos. Em algumas modalidades preferidas, as composições dapresente invenção compreendem de cerca de 0,1% a cerca de 15%, preferi-velmente de cerca de 0,1% a cerca de 7%, e mais preferivelmente de cercade 0,5% a cerca de 5%, em peso, de filtro solar inorgânico.

Em algumas modalidades preferidas, a composição da presenteinvenção também inclui conservantes. Estes conservantes incluem, mas nãosão limitados a pentileno glicol, tetraacetato de etileno diamina (EDTA) eseus sais, clorhexidina (e seus derivados diacetato, di-cloridrato, diglucona-to), 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol, paracloro metaxilenol, cloridrato de poli-hexametilenobiguanida, ácido desidroacético, diazolidinil uréia, álcool 2,4-dicloro benzílico, 4,4-dimetil-1,3-oxazolidina, formaldeído (por exemplo, solu-ção aquosa a 37%, com 10-15% metanol para evitar polimerização), gluta-raldeído, dimetilidantoína, imidazolidinil uréia, 5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona, orto-fenilfenol, ésteres de ácido 4-hidroxibenzóico (por exemplo, "para-beno") e seus ésteres de metila, etila, propila, isopropila, butila, e isobutila,triclosano, 2-fenoxietanol, acetato fenil mercuríco, borato, nitrato, quaternio-15, salicilato, ácido salicílico e seus sais, cálcio, sorbato de cálcio, ácido sór-bico e seus sais, iodopropanil butil carbamato zinco piritiona, álcool benzíli-co, 5-bromo-5nitro-1,3-dioxano, 2-bromo-2-nitropropano-1,3-diol, ácido ben-zóico e seus sais, sulfitos, bissulfitos, fenoxietanol, cloroxilenol, diazolidiniluréia, metilparabenos, propilparabenos, isopropilparabenos, isobutil parabe-nos, butil parabenos, etilparabeno, fenoxietanol PG, e cloreto de benzalcônio.

Vários ingredients opcionais como agentes neutralizantes, per-fumes e agentes solubilizantes de perfume, e agentes colorantes, tambémencontram uso em algumas das composições aqui. Prefere-se que quais-quer ingredientes adicionais melhorem os benefícios de flexibilidade/suavidade do produto. Além disso, prefere-se que qualquer tal ingredientenão impacte de modo negativo as propriedades estéticas do produto.

Outros materiais opcionais incluem agentes ceratolíticos, assimcomo conservantes solúveis em água e/ou solubilizáveis preferivelmente aum nível de cerca de 0,1% a cerca de 5% (por exemplo, Germall 115, éste-res de metila, etila, propila e butila de ácido hidroxibenzóico, álcool benzílico,DMDM hidantoína iodopropanil butil carbanato, disponíveis sob o nome co-mercial Glydant Plus de Lonza; EDTA1 EUXYL® K400, Bromopol (2-bromo-2-nitropropano-1,3-diol) e fenoxipropanol); antibacterianos (por exemplo, IR-GASAN®) e fenoxietanol (preferivelmente em níveis de cerca de 0,1% a cercade 5%); assim como agentes umectantes solúveis ou coloidalmente solúveis,como ácido hialurônico, sulfato de condroitina, e poliacrilatos de sódio enxer-tados com amido (por exemplo, SANWET® IM-1000, IM-1500 e IM-2500,disponíveis de Celanese Superabsorbent Materials, Portsmith, VA, Vide porexemplo, Patente US N2 4,076,663; vitaminas como vitamina A, vitamina C,vitamina E e seus derivados e seus blocos de constructo, como fitantriol, evitamina K e seus, como o álcool graxo dodecatrienol; alfa e beta hidroxiáci-dos; aloe vera; esfingosinas e fitoesfingosinas, colesterol; agentes de bran-queamento da pele; N-acetil cisteína; agentes colorantes; agentes antibacte-rianos, como TCC/TCS, também conhecidos como triclosano e triclorocar-bono; perfumes e solubilizanes de perfume. Exemplos de ácidos alfa hidróxiincluem ácido glicólico, ácido láctico, ácido málico, ácido cítrico, ácido glicóli-co em conjunto com glicolato de amônio, ácido alfa-hidróxi etanóico, ácidoalfa-hidroxioctanóico, ácido alfa- hidroxicaprílico, ácido hidroxicaprílico, ácidode frutas mistas, ácidos trialfa hidróxi de frutas, ácidos triplos de frutas, ex-trato de cana de açúcar, alfa hidróxi e plantas medicinais, ácido l-alfa hidróxie glicômero em ácidos graxos reticulados (por exemplo, alfa nutrium). Exem-plos preferidos de ácidos alfa hidróxi são ácido glicólico e ácido láctico. Pre-fere-se que ácidos alfa hidróxi sejam usados em níveis de até cerca de 10%.Não se pretende que a presente invenção seja limitada a qualquer compostoparticular derivado de qualquer fonte particular, como qualquer compostoaditivo apropriado, ou obtidos de fontes naturais ou através de síntese noslaboratórios encontram uso na presente invenção.

Outros materiais opcionais incluem conservantes solúveis emágua ou solubilizáveis, preferivelmente a um nível de cerca de 0,1% a cercade 5% cada, como Germall 115, ésteres de metila, etila, propila e butila deácido hidroxibenzóico, álcool benzílico, DMDM hidantoína iodopropanil butilcarbanato disponíveis sob o nome comercial Glydant Plus de Lonza, EDTA,Euxyl (RTM) K400, Bromopol (2-bromo-2-nitropropano-1,3-diol), pentilenoglicol e fenoxipropanol; antibacterianos como Irgasan (RTM) e fenoxietanol(preferivelmente em níveis de 0,1% a cerca de 5%). Agentes antibacterianoscomo TCC/TCS, também conhecidos como triclosano e triclorocarbono sãotambém utilizáveis em composições da presente invenção.

Agentes neutralizantes apropriados para uso em neutralizaçãode grupos ácidos contendo agentes gelificantes hidrofílicos aqui incluem hi-dróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amônio, monoetanola-mina, dietanolamina, amino metil propanol, tampão tris e trietanolamina.

Outros materiais opcionais que encontram uso na presente in-venção incluem qualquer um dentre os numerosos ingredientes ativos e/oufuncionais conhecidos dos versados na técnica (Vide por exemplo, McCut-cheon's Functional Materials. Edições Norte-Americana e Internacional, MCPublishing Co. [2003]) Como indicado acima, exemplos não Iimitativos inclu-em agentes queratolíticos; agentes umectantes solúveis ou coloidalmentesolúveis, como ácido hialurônico e sulfato de condroitina; vitaminas comovitamina A, vitamina C, vitamina E, vitamina K e seus derivados e seus blo-cos de constructo; fitantriol; álcoois graxos como dodecatrienol; alfa e betahidroxiácidos; aloe vera; esfingosinas e fitoesfingosinas, colesterol; agentesde branqueamento da pele; N-acetil cisteíná; agentes de coloração. Exem-plos de ácidos alfa hidróxi incluem ácido glicólico, ácido láctico, ácido málico,e ácido cítrico (ou derivados sinteticamente ou de fontes naturais ou usadossozinhos ou em combinação) e seus ésteres ou combinações tamponadasrelevantes. Outros exemplos de ácidos alfa-hidróxi incluem: ácido alfa-hidróxi etanóico, ácido alfa-hidroxioctanóico, ácido alfa-hidroxicaprílico, eácido hidroxicaprílico. Preferidos exemplos de ácidos alfa hidróxi incluemácido glicólico e ácido láctico. Prefere-se que os ácidos alfa hidróxi sejamusados em níveis de até cerca de 10%.

Materiais opcionais incluem pigmentos que, quando insolúveisem água, contribuem para e são incluídos no nível total de ingredientes deóleo de fase. Pigmentos apropriados para uso nas composições da presenteinvenção podem ser orgânicos e/ou inorgânicos. Também estão incluídosdentro do termo "pigmento" os materiais tendo uma tonalidade de cor ou Ius-tro fraco, como agentes de acabamento fosco, agentes de difusão de luz, eauxiliares de formulação como micas, seracitas, e sais de carbonato. Outrosexemplos de pigmentos apropriados incluem dióxido de titânio, óxidos deferro, óxidos de glutamato de ferro, óxido de zinco, oxicloreto de bismuto,azul ultramarinho (todos estes podendo ser ou pré-dispersos e/ou pre-revestidos ou não) corantes e Iacas D&C, cores FD&C, aditivos de cor natu-ral como carmine, e suas misturas. Dependendo do tipo de composição, amistura de pigmentos é geralmente usada em modalidades preferidas dapresente invenção. Pigmentos preferidos para uso aqui do ponto de vista deumectação, tato da pele, aparência da pele e compatibilidade da emulsãosão pigmentos tratados. Em algumas modalidades, os pigmentos são trata-dos com compostos, incluindo mas não limitados a aminoácidos, silicones,Iecitina e óleos de éster.

Em modalidades preferidas, o pH das composições aqui está nafaixa de cerca de 3,5 a cerca de 10, preferivelmente de cerca de 4 a cercade 8, e mais preferivelmente de cerca de 5 a cerca de 7, em que o pH dacomposição final é ajustado por adição de sais de tampão ácido, ou básico,como necessário, dependendo da composição das formas e as exigênciasde pH dos compostos.

As composições da presente invenção são preparadas por téc-nicas padrões bem-conhecidas dos versados na técnica. Em geral, a faseaquosa e/ou a fase óleo são preparadas separadamente, com materiais dedivisão de fase similares sendo adicionados em qualquer ordem. Se o produ-to final for uma emulsão, as duas fases são então combinadas com agitaçãovigorosa e/ou homogeneização, como necessário, para reduzir o tamanhodas gotículas de fase interna. Quaisquer ingredientes na formulação comvolatilidade elevada, ou que são susceptíveis à hidrólise ou decomposiçãoem temperaturas elevadas, são adicionados com agitação suave em direçãoao final do processo, pós-emulsificação se aplicável. A freqüência de dosa-gem irá depender dos critérios de desempenho desejados.

Em algumas modalidades da presente invenção, métodos dediminuir a atividade de VEGF são providos. Nestas modalidades, os méto-dos compreendem aplicar a um organismo em necessidade do mesmo umaquantidade efetiva de qualquer um dos compostos aqui especificados. Emmodalidades preferidas adicionais, a presente invenção provê compostospara o tratamento de um organismo em necessidade do mesmo, incluindohumanos e outros animais.

Experimental

Os seguintes exemplos servem para ilustrar certas modalidadespreferidas e aspectos da presente invenção e não devem ser construídoscomo limitando o escopo dos mesmos.

Na descrição experimental que segue, as seguintes abreviaçõesaplicam-se: Pl (inibidor de proteinase), BBI (inibidor de Bowman-Birk), STI(inibidor de tripsina de óleo de soja); ppm (partes por milhão); VEGF e VegF(fator de crescimento endotelial vascular); M (molar); mM (milimolar); μΜ(micromolar); nM (nanomolar); mol (moles); mmol (milimoles); μιηοΙ (micro-mols); nmol (nanomoles); g (gramas); mg (miligramas); pg (microgramas); pg(picogramas); L (litros); ml e mL (mililitros); μΙ e μΙ_ (microlitros); cm (centíme-tros); mm (milímetros); μηι (micrometros); nm (nanômetros); U (unidades); V(volts); PM (peso molecular); s (segundos); min(s) (minuto/minutos); h(s) (ho-ra/horas); 0C (graus centígrados); QS (quantidade suficiente); ND (não feito);SA (vide capaz (não aplicável); rpm (revoluções por minuto); H2O (água);dH20 (água deionizada); (HCI (ácido clorídrico); aa (aminoácido); bp (par debases); kb (par de quilobase); kD (kilodáltons); cDNA (DNA complementarou cópia); DNA (ácido dessoxirribonucléico); ssDNA (DNA filamento único);dsDNA (DNA filamento duplo); dNTP (trifosfato dessoxirribonucleotídeo);RNA (ácido ribonucléico); MgCI2 (cloreto de magnésio); NaCI (cloreto de só-dio); p/v (peso para volume); v/v (volume para volume); g (densidade); OD(densidade óptica); A405 (absorbância a 405 nm); Vmax (a velocidade inicialmáxima de uma reação catalisada por enzima); FGFrI(IIIc) (receptor FGF-5);solução tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS); SOC (2% de bacto-triptona, 0,5% de extrato de levedura bacto, 10 mM de NaCI, 2,5 mM de K-Cl); Terrific Broth (TB; 12 g/l de bacto triptona, 24 g/l de glicerol, 2,31 g/l deKH2PO4, e 12,54 g/l de K2HPO4); OD280 (densidade óptica a 280 nm); OD600(densidade óptica a 600 nm); PAGE (eletroforese de poliacrilamida gel); PBS(solução salina tamponada de fosfato [150 mM de NaCI1 10 mM de tampãode fosfato de sódio, pH 7,2]); PBST (PBS+0,25% Tween® 20); PEG (polieti-leno glicol); PCR (reação de cadeia polimerase); RT-PCR (PCR de transcri-ção inversa); SDS (dodecil sulfato de sódio); bME, BME e βΜΕ (beta-mercaptoetanol ou 2-mercaptoetanol); Tris-HCI (cloridrato de tris [hidroxime-til] aminometano); tricina (N-[tris-(hidroximetil)-metil]-glicina); CHES (ácido 2-(N-ciclo-hexilamino) etano-sulfônico); TAPS (ácido 3-{[tris-(hidroximetil)-metil]-amino}-propanossulfônico); ácido CAPS (3-(ciclohexilamino)-propano-sulfônico; DMSO (sulfóxido de dimetila); DTT (1,4-ditio-DL-treitol); Glut e GSH(glutationa reduzida); GSSG (glutationa oxidada); TCEP (tris[2-carboxietil]fosfina); tris(tris(hidroximetil) aminometano); HEPES (ácido N-[2-hidroxietil]piperazina-N-[2-etanossulfônico]); HBS (solução salina tamponada de HE-PES); SDS (dodecilsulfato de sódio); Tris-HCI (cloridrato de tris[hidroximetil]aminometano); Ci (curies) mCi (milicuries); pCi (microcuries); TLC (cromato-grafia de camada fina) O/W (óleo em emulsão de água); A/O (emulsão águaem óleo); W/S (emulsão água em silício); emulsão selecionada (emulsãoestabilizada com um composto sólido); hidrodispersão (formulações isentasde emulsificante); PIT (tecnologia de temperatura de inversão de fase usadapara fabricar emulsões especiais); bastões (qualquer produto que é providoem um formiato de bastão, incluindo mas não limitado a batons, antiperspi-rantes, desodorizantes); Ts (tosila); Bn (benzila); Ph (fenila); Ms (mesila); Et(etila), Me (metila); Klenow (fragmento grande de DNA I polimerase (Kle-now)); rpm (revoluções por minuto); EGTA (etileno glicol-bis(éter β-amino-etílico) ácido Ν, N, N', Ν'-tetraacético); EDTA (ácido etilenodiaminatetracéti-co); bla (β-lactamase ou gene de resistência ampicilina); PDS (soro bovinoderivado de plasma que foi dialisada para remover fatores de crescimento;diálise de plasma bovino desfibrinado é realizado contra DMEM durante cer-ca de 6 horas a 4°C, com agitação, o meio é mudado e a diálise é continua-da durante a noite; o PDS dialisado é coletado após 24 horas, e estéril filtra-do duas vezes através de um filtro de 0,2 μιτι); FCS e FBS (soro de bezerrofetal); GE Healthcare (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, United Kingdom);DNA2.0 (DNA2.0, Menlo Park1 CA); OXOID (Oxoid, Basingstoke1 Hampshire1UK); Megazyme (Megazyme International Ireland Ltd., Bray Business Park1Bray1 Co., Wicklow1 Ireland); Corning (Corning Life Sciences, Corning, NY);(NEN (NEN Life Science Products, Boston, MA); Pharma AS (Pharma AS,Oslo, Norway); Dynal (Dynal, Oslo, Norway); Bio-Synthesis (Bio-Synthesis,Lewisville, TX); ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD);Gibco/BRL (Gibco/BRL, Grand lsland, NY); Sigma (Sigma Chemical Co., St.Louis, MO); Pharmacia (Pharmacia Biotech, Pisacataway, NJ); NCBI (Natio-nal Center for Biotechnology Information); Applied Biosystems (Applied Bi-osystems, Foster City, CA); Clontech (CLONTECH Laboratories, Palo Alto,CA); Difco (Difco Laboratories, Detroit1 Ml); Oxoid (Oxoid Inc., Ogdensburg,NY); GIBCO BRL ou Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD);Millipore (Millipore, Billerica, MA); Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA); Invitro-gen (Invitrogen Corp., San Diego, CA); NEB (New England Biolabs, Beverly,MA); Cambrex (Cambrex Bioproducts, East Rutherford, NJ); Sigma (SigmaChemical Co., St. Louis, MO); Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford1 IL);Takara (Takara Bio Inc. Otsu1 Japan); Roche (Hoffmann-La Roche1 Basel1Switzerland); EM Science (EM Science, Gibbstown1 NJ); Qiagen (Qiagen1Inc., Valencia, CA); Biodesign (Biodesign Intl., Saco, Maine); Biosource (Bio-source, Intl., Camarillo1 CA); Aptagen (Aptagen1 Inc., Herndon, VA); Molecu-lar Devices (Molecular Devices, Corp., Sunnyvale1 CA); R&D Systems (R&DSystems, Minneapolis1 MN); Stratagene (Stratagene Cloning Systems1 LaJolla1 CA); Marsh (Marsh Biosciences1 Rochester1 NY); Bio-Tek (Bio-Tek Ins-truments, Winooski, VT); (Biacore (Biacore, Inc., Piscataway1 NJ); PeproTe-ch (PeproTech1 Rocky Hill1 NJ); SynPep (SynPep1 Dublin, CA); Chemicon(CHEMICON, Temecula, CA); Clinicai Research Laboratories, (Clinicai Re-search Laboratories, Inc., Piscataway, NJ); e Microsoft (Microsoft, Inc., Red-mond, WA).

Exemplo 1

Composições de cuidado pessoal

Neste exemplo, várias composições de cuidado pessoal com-preendendo qualquer um dos compostos da presente invenção são providascomo a seguir. Nestas formulações, as quantidades são dadas como per-centagens da composição total, salvo indicado em contrário. Também, salvoindicado em contrário nas seguintes formulações, a concentração de BBI-AV(referido como "composto" abaixo) nas faixas de cerca de 0,01% a cerca de1,0%. Em algumas formulações, a concentração preferida está na faixa decerca de 0,1% a cerca de 0,2%, enquanto em outras formulações, a concen-tração preferida está na faixa de cerca de 0,05% a cerca de 0,1% (por e-xemplo, para algumas modalidades de inibição de crescimento de cabelo);de cerca de 0,02 a 0,1% (por exemplo, para algumas modalidades clarea-mento da pele); de cerca de 0,5% a cerca de 1,0% (por exemplo, para algu-mas modalidades de clareamento pele); ou em concentrações maiores quecerca de 0,1% (por exemplo, para algumas modalidades de tratamento derosácea). Os versados na técnica sabem como determinar a constructo a-propriada (isto é ótima) de BBI-AV para cada produto.

Lavagem Corporal Umectante (pH 7)

<table>table see original document page 181</column></row><table><table>table see original document page 56</column></row><table>LOÇÃO CORPORAL_ pH 7 pH 7 pH 7,5 pH 7

<table>table see original document page 183</column></row><table>

EMULSÃO DE PODER UMECTANTE pH 7 pH 7

ULTRA-ELEVADO

<table>table see original document page 183</column></row><table><table>table see original document page 184</column></row><table><table>table see original document page 185</column></row><table><table>table see original document page 186</column></row><table><table>table see original document page 187</column></row><table><table>table see original document page 188</column></row><table><table>table see original document page 189</column></row><table><table>table see original document page 190</column></row><table><table>table see original document page 191</column></row><table><table>table see original document page 192</column></row><table><table>table see original document page 193</column></row><table><table>table see original document page 194</column></row><table><table>table see original document page 195</column></row><table><table>table see original document page 196</column></row><table><table>table see original document page 197</column></row><table><table>table see original document page 198</column></row><table><table>table see original document page 199</column></row><table><table>table see original document page 200</column></row><table><table>table see original document page 201</column></row><table><table>table see original document page 202</column></row><table><table>table see original document page 203</column></row><table>CONDICIONADOR /TRATAMENTO NUTRIENTE DE CABELO (pH 6)

<table>table see original document page 204</column></row><table>XAMPU TRANSPARENTE Formulações

<table>table see original document page 205</column></row><table>

(Quantidades)

<table>table see original document page 205</column></row><table>XAMPU CONDICIONADO FormulaçõesTRANSPARENTE__(Quantidades)

<table>table see original document page 206</column></row><table>

EMULSÃO O/A- ESPUMA Formulações (Quantidades) MATÉRIA-PRIMA (Designação INCI) 1 2 <table>table see original document page 206</column></row><table><table>table see original document page 207</column></row><table>XAMPU CONDICIONADOR FormulaçõesCOM PEROLESCENTE__(Quantidades)

<table>table see original document page 208</column></row><table>

XAMPU CONDICIONADOR FormulaçõesTRANSPARENTE__(Quantidades)

<table>table see original document page 208</column></row><table>

Ph ajustado a 6,0<table>table see original document page 209</column></row><table>XAMPU CONDICIONADOR FormulaçõesTRANSPARENTE__(Quantidades)

<table>table see original document page 210</column></row><table>

pH ajustado a 6,0

<table>table see original document page 210</column></row><table>

pH ajustado a 6,0<table>table see original document page 2011</column></row><table>CREME EM GEL Formulações (Quantidades)

<table>table see original document page 212</column></row><table>

pH ajustado a 6,0 CREME EM GEL Formulações (Quantidades)

<table>table see original document page 212</column></row><table><table>table see original document page 213</column></row><table><table>table see original document page 214</column></row><table>FORMULAÇÃO O/A DE FormulaçãoFILTRO SOLAR__(Quantidades)

<table>table see original document page 215</column></row><table><table>table see original document page 216</column></row><table>HIDRODISPERSÃO Formulações

<table>table see original document page 217</column></row><table><table>table see original document page 218</column></row><table>EMULSÃO A/O DE FILTRO SOLAR Formulações

<table>table see original document page 219</column></row><table><table>table see original document page 220</column></row><table><table>table see original document page 221</column></row><table>BASTÕES Formulações

<table>table see original document page 222</column></row><table>

EMULSÃO PIT__Formulações (Quantidades)

<table>table see original document page 222</column></row><table><table>table see original document page 223</column></row><table>EMULSÃO PIT__Formulações (Quantidades)

<table>table see original document page 224</column></row><table>

CREME EM GEL Formulações

<table>table see original document page 224</column></row><table><table>table see original document page 225</column></row><table><table>table see original document page 226</column></row><table><table>table see original document page 227</column></row><table><table>table see original document page 228</column></row><table><table>table see original document page 229</column></row><table><table>table see original document page 230</column></row><table><table>table see original document page 231</column></row><table><table>table see original document page 232</column></row><table><table>table see original document page 233</column></row><table><table>table see original document page 234</column></row><table><table>table see original document page 235</column></row><table><table>table see original document page 236</column></row><table><table>table see original document page 237</column></row><table>

Em ainda outras modalidades, a presente invenção compreendepelo menos um pigmento inorgânico. Em algumas modalidades preferidas,estes pigmentos inorgânicos são com base em óxidos de metal e/ou outroscompostos de metal solúveis ou levemente insolúveis em água, incluindomas não limitados a compostos como óxidos de zinco (ZnO), titânio (TiO2),ferro (por exemplo, Fe2O3), zircônio (ZrO2), sílica (SiO2), manganês (por e-xemplo, MnO), alumínio (AI2O3), cerio (por exemplo, Ce2O3), e óxidos mistu-rados destes óxidos, assim como misturas dos mesmos. Em algumas moda-lidades, os óxidos de metal são de tipo microfino, enquanto em outras moda-lidades, os óxidos de metal são de tipo de pigmento. Em outras modalida-des, os óxidos de metal são uma mistura de tipos microfinos e pigmentos.

Em modalidades adicionais, os pigmentos inorgânicos são re-vestidos (isto é, eles são tratados na superfície). Em algumas modalidadesparticularmente preferidas, a superfície é revestido com uma película hidro-fóbica fina. Em algumas outras modalidades particularmente preferidas, asuperfície é revestida com um película hidrofílica fina. Em ainda modalidadesadicionais, a presente invenção provê composições compreendendo váriosconstituintes de maquiagem e maquiagens. Por exemplo, em algumas mo-dalidades, a presente invenção provê vários corantes e/ou pigmentos. Emalgumas modalidades, pigmentos utilizáveis incluem, mas não são limitadosa dióxido de titânio, mica, óxidos de ferro (por exemplo. Fe2O3, Fe3O4, FeO(OH), etc.) e/ou oxido estanoso. A presente invenção ainda provê corantes,incluindo mas não limitados a carmine, azul, oxido de cromo, ultramarinhoe/ou magnésio púrpura. Os corantes e pigmentos de algumas modalidadesmais preferidas são conhecidos dos versados na técnica e previamente pro-vidos (vide, por exemplo, Colour Index Nummern (CIN)1 Rowe Colour Index,terceira edição, Society of Dyers and Colourists, Bradford, England [1971]).

Em modalidades adicionais, pigmentos perolescentes com baseem mica/óxido de metal encontram uso, como descrito acima. No entanto,não se pretende que a presente invenção seja limitada a estes pigmentosparticulares, como pigmentos perolescentes adicionais encontram uso emvárias modalidades da presente invenção.

A seguintes formulações apresentam exemplos adicionais deuso da presente invenção.

<table>table see original document page 238</column></row><table><table>table see original document page 239</column></row><table><table>table see original document page 240</column></row><table><table>table see original document page 241</column></row><table><table>table see original document page 242</column></row><table><table>table see original document page 243</column></row><table><table>table see original document page 244</column></row><table>

A seguinte fórmula provê um exemplo de um produto após bar-ba compreendendo o BBI-AV da presente invenção.

<table>table see original document page 244</column></row><table><table>table see original document page 245</column></row><table>

Produção: Pesar os componentes de fase A e misturar os mesmos. Dissol-ver a fase B, agitar na fase A e homogeneizar bem.

Valores de medida:

Viscosidade: 18 500mPa s Brookfield RVD Il+Valor pH: 5,8

A seguinte fórmula provê um exemplo de um produto após bar-ba compreendendo o BBI-AV da presente invenção.

<table>table see original document page 245</column></row><table>

Produção: Pesar os componentes de fase A e dissolver os mesmos clara-mente.

A fórmula para pós-barba e pré-barba apresentada acima con-tém BBI-AV suficiente (composto) para prover o(s) efeito (s) desejado(s). Emalgumas modalidades, a concentração de BBI-AV está na faixa de cerca de1.000 ppm a cerca de 10.000 ppm. Nas seguintes formulações, as concen-trações típicas de BBI-AV usadas na faixa de cerca de 100 ppm a cerca de1.000 ppm ou de cerca de 1.000 ppm a cerca de 10.000 ppm. No entanto,não se pretende que a presente invenção seja limitada a esta faixa de con-centração específica, como outras concentrações encontram uso em outrasmodalidades da presente invenção.

A seguinte fórmula provê um exemplo de um produto pós-solcompreendendo o BBI-AV da presente invenção.

<table>table see original document page 246</column></row><table>

Produção: Misturar os componentes de fase A. Dissolver a fase B e agitar nafase A enquanto homogeneizando. Neutralizar com a fase C e homogeneizaroutra vez.

Valores de medida:

<table>table see original document page 246</column></row><table>

A seguinte fórmula provê um exemplo de um produto limpadorfacial compreendendo o BBI-AV da presente invenção.

Limpador Facial

<table>table see original document page 246</column></row><table><table>table see original document page 247</column></row><table>

Produção: Dissolver a fase A, então agitar na fase B. Duplicar fase C. Dis-solver a fase D, agitar as mesmas nas fases A+B+C combinadas, homoge-neizar e agitar outra vez durante 15 min.Valores de medida:

Viscosidade: 7 200mPa s Brookfield RVT

Valor pH: 5,8

A seguinte fórmula provê um exemplo de um produto de pulveri-zação do corpo de cuidado diário com SPF 8 compreendendo o BBI-AV dapresente invenção.

PULVERIZAÇÃO DO CORPO DE CUIDADO DIÁRIO - SPF 8

<table>table see original document page 247</column></row><table><table>table see original document page 248</column></row><table>

Produção: Pesar os componentes de fase A e dissolver os mesmos clara-mente.

Valores de medida:

SPF: 8 Colipa Task Force "Medida de Proteção Solar"

A seguinte fórmula provê um exemplo de um produto de loçãode cuidado pessoal solar de uso diário com SPF 27 compreendendo o BBl-AV da presente invenção.

LOÇÃO CUIDADO SOLAR - SPF 27

<table>table see original document page 248</column></row><table><table>table see original document page 249</column></row><table>

Produção: Aquecer as fases AeB separadamente a cerca de 80°C. Agitara fase B na fase A enquanto homogeneizando. Aquecer a fase C a cerca de80°C e agitar as mesmas às fases A+B combinadas enquanto homogenei-zando. Resfriar a cerca de 40°C adicionar fase D e homogeneizar outra vez.

Valores de medida:

Viscosidade: 3 200mPa s Brookfield RVD Il+Valor pH: 6,0

SPF: 27 Colipa Task Force "Medida de Proteção Solar"

LOÇÃO DE CUIDADO SOLAR - SPF 24

<table>table see original document page 249</column></row><table><table>table see original document page 250</column></row><table>

Produção: Aquecer a fase A a 80°C, adicionar a fase B e homogeneizar du-rante 3 min. Aquecer a fase C a cerca de 80°C, e agitar as mesmas nas fa-ses A+B combinadas enquanto homogeneizando. Resfriar a cerca de 40°C,adicionar a fase D, e homogeneizar.Valores de medida:

Viscosidade: 5 OOOmPa s Brookfield RVD Il+Valor pH: 7,5

SPF: 24 Colipa Task Force "Medida de Proteção Solar"

A seguinte fórmula provê um exemplo de um produto de emul-são filtro solar com SPF 28 compreendendo o BBI-AV da presente invenção.

EMULSÂO FILTRO SOLAR - SPF 28

% Ingrediente INCI

A 3,5 Cremophor A 6 Ceteareth-6, álcool estearílico

1,5 Cremophor A 25 Ceteareth-25<table>table see original document page 251</column></row><table>

Produção: Aquecer fase A a 80°C, adicionar a fase B e homogeneizar duran-te 3 min. Aquecer a fase C a cerca de 80°C, e agitar as mesmas às fasesA+B combinadas enquanto homogeneizando. Resfriar a cerca de 40°C, adi-cionar a fase D e homogeneizar.

Valores de medida:

<table>table see original document page 251</column></row><table>

A seguinte fórmula provê um exemplo de um produto de bálsa-mo para os pés compreendendo o BBI-AV da presente invenção.balsamo para os pés

<table>table see original document page 252</column></row><table>

Produção: Aquecer as fases AeBa cerca de 80°C separadamente. Agitar afase B na fase A enquanto homogeneizando. Resfriar a cerca de 40°C, adi-cionar a fases CeDe homogeneizar outra vez. Resfriar em temperaturaambiente.

Valores de medida:

Viscosidade: 20 500mPa s Brookfield RVD Il+Valor pH: 6,0

A seguinte fórmula provê um exemplo de um produto em gelrefrescante dos pés compreendendo o BBI-AV da presente invenção.

GEL REFRESCANTE PARA OS PÉS

<table>table see original document page 252</column></row><table><table>table see original document page 253</column></row><table>

Produção: Fase A: Interdispersar o carbopol e deixar o mesmo assentar nofundo do béquer. Dissolver a fase B e agitar na fase A.

Valores de medida:

Viscosidade: 14 500mPa s Brookfield RVD Il+Valor pH: 7,5

A seguinte fórmula prove um exemplo de um produto em gelcondicionador para a pele compreendendo o BBI-AV da presente invenção.

GEL CONDICIONADOR PARA A PELE

<table>table see original document page 253</column></row><table>

Produção: Dissolver a fase A claramente. Permitir fase B para intumescer eneutralizar com a fase C. Agitar a fase A as mesmas a fase B neutralizada ehomogeneizar.Valores de medida:

<table>table see original document page 254</column></row><table>

A seguinte fórmula provê um exemplo de uma emulsão A/Ocompreendendo o BBI-AV da presente invenção.

EMULSÃO A/O

<table>table see original document page 254</column></row><table>

Produção: Aquecer as fases AeB separadamente a cerca de 85°C. Agitar afase B na fase A e homogeneizar. Resfriar a cerca de 40°C enquanto agita-ção, adicionar a fase C e homogeneizar outra vez. Resfriar em temperaturaambiente.

Valores de medida:

Viscosidade: 37 500mPa s Brookfield RVD Il+

A seguinte fórmula provê um exemplo de um produto de emul-são O/A compreendendo o BBI-AV da presente invenção.EMULSÃO O/A

<table>table see original document page 255</column></row><table>

SA Composto

Produção: Aquecer fase AeB separadamente a cerca de 80°C. Agitar a fa-se B na fase A e homogeneizar. Agitar a fase C nas fases A+B combinadase homogeneizar. Resfriar a cerca de 40°C, adicionar a fase D, então ajudar ovalor pH com a fase E a 6,5. Adicionar a fase F e homogeneizar. Resfriar emtemperatura ambiente.Valores de medida:

<table>table see original document page 256</column></row><table>

A seguinte fórmula provê um exemplo de um produto em cremeprotetor para o dia compreendendo o BBI-AV da presente invenção.

CREME PROTETOR PARA O DIA

<table>table see original document page 256</column></row><table>

Produção: Aquecer fase AeB separadamente a cerca de 80°C. Agitar a fa-se B na fase A e homogeneizar. Agitar a fase C nas fases A+B combinadase homogeneizar. Resfriar a cerca de 40°C, adicionar a fase D, então ajudar ovalor pH com a fase E a 6,5 e homogeneizar. Resfriar em temperatura ambi-ente.

Valores de medida:

<table>table see original document page 257</column></row><table>

As seguintes fórmulas provêem exemplos de produtos de cuida-do do cabelo compreendendo o BBI-AV da presente invenção.

CONDICIONADORES DE CABELO

<table>table see original document page 257</column></row><table>

Produção: Adicionar todos os compostos à fase A e agitar para homogenei-zar. Encher um recipiente apropriado e carregar com a fase B.

CONDICIONADORES ESPUMANTES

<table>table see original document page 257</column></row><table><table>table see original document page 258</column></row><table>

Produção: Adicionar todos os compostos à fase A e agitar para homogenei-zar. Encher um recipiente apropriado e carregar com a fase B.

CONDICIONADORES ESPUMANTES

<table>table see original document page 258</column></row><table>B 6,0 Propano/butano

Produção: Adicionar todos os compostos à fase A e agitar para homogenei-zar. Encher um recipiente apropriado e carregar com a fase B.

ESPUMAS MODELADORAS DO PENTEADO

% Ingredientes (INCI) A 0,5 Laureth-4 QS Perfume B 77,3 Aqua dem. 10,0 Poliquaternio-28 Composto 0,5 Copoliol dimeticona 0,2 Ceteareth-25 0,2 Pantenol 0,1 PEG-25 PABA 0,2 Hidroxietilcelulose C 10,0 HFC 152 A % Ingredientes (INCI) A 0,5 Laureth-4 QS Perfume B 73,3 Aqua dem. 10,0 Poliquaternio-28 SA Composto 0,5 Copoliol dimeticona 0,2 Ceteareth-25 0,2 Pantenol 0,1 PEG-25 PABA 0,2 Hidroxietilcelulose C 10,0 HFC 152 A

Produção: Pesar os compostos de fase A e misturar os mesmos. Dissolver afase B1 agitar na fase A e homogeneizar. Encher um recipiente apropriado ecarregar com a fase C.

% Ingredientes (INCI)A 2,0 Metossulfato de cocotrimônio QS Perfume B 78,5 Aqua dem. 6,7 Copolímero de acrilatos 0,6 AMP SA Composto 0,5 Copoliol dimeticona 0,2 Ceteareth-25 0,2 Pantenol 0,1 PEG-25 PABA 0,2 Hidroxietilcelulose C 10,0 HFC 152 A % Ingredientes (INCI) A 2,0 Metossulfato de cocotrimônio QS Perfume B 74,5 Aqua dem. 6,7 Copolímero de acrilatos 0,6 AMP SA Composto 0,5 Copoliol dimeticona 0,2 Ceteareth-25 0,2 Pantenol 0,1 PEG-25 PABA 0,2 Hidroxietilcelulose C 10,0 HFC 152 A

Produção: Pesar os compostos de fase A e misturar os mesmos. Dissolver afase B1 agitar na fase A e homogeneizar. Encher um recipiente apropriado ecarregar com a fase C.

ESPUMA MODELADORA DO PENTEADO

% Ingredientes (INCI)

A 2,0 Metossulfato de cocotrimônio

QS Perfume<table>table see original document page 261</column></row><table>

Produção: Pesar os compostos de fase A e misturar os mesmos. Dissolver afase B, agitar na fase A e homogeneizar. Ajustar o pH a 6 -7. Encher umrecipiente apropriado e carregar com a fase C.

ESPUMA MODELADORA DO PENTEADO

<table>table see original document page 261</column></row><table><table>table see original document page 262</column></row><table>

Produção: Pesar os compostos de fase A e misturar os mesmos. Dissolver afase B, agitar na fase A e homogeneizar. Adicionar a fase C e homogeneizaroutra vez. Ajustar o pH a 6-7. Encher um recipiente apropriado e carregarcom fase D.

ESPUMAS MODELADORAS DO PENTEADO

<table>table see original document page 262</column></row><table><table>table see original document page 263</column></row><table>

Produção: Pesar os compostos de fase A e misturar os mesmos. Dissolver afase B, agitar na fase A e homogeneizar. Adicionar a fase C e homogeneizaroutra vez. Ajustar o pH a 6-7. Encher um recipiente apropriado e carregarcom fase D.

ESPUMAS MODELADORAS DO PENTEADO

% Ingredientes (INCI) A QS PEG-40 óleo de rícino hidrogenado QS Perfume 85,5 Aqua dem. B 7,0 Poliestireno sulfonato de sódio SA Composto 0,5 Brometo de cetrimônio QS Conservante C 6,0 Propano/butano % Ingredientes (INCI) A QS PEG-40 óleo de rícino hidrogenado QS Perfume 81,5 Aqua dem. B 7,0 Poliestireno sulfonato de sódio SA Composto 0,5 Brometo de cetrimônio QS Conservante C 6,0 Propano/butano

Produção: Pesar os compostos de fase A e misturar os mesmos. Dissolver afase B, agitar na fase A e homogeneizar. Ajustar o pH a 6-7. Encher um re-cipiente apropriado e carregar com a fase C.ESPUMAS MODELADORAS DO PENTEADO

% Ingredientes (INCI)A QS PEG-40 óleo de rícino hidrogenado QS Perfume 92,0 Aqua dem.B 0,5 Poliquaternio-10 1,0 Composto 0,5 Brometo de cetrimônio QS ConservanteC 6,0 Propano/butano % Ingredientes (INCI)A QS PEG-40 óleo de rícino hidrogenado QS Perfume 88,0 Aqua dem.B 0,5 Poliquaternio-10 5,0 Composto 0,5 Brometo de cetrimônio QS ConservanteC 6,0 Propano/butano

Produção: Pesar os compostos de fase A e misturar os mesmos. Dissolver afase B, agitar na fase A e homogeneizar. Ajustar o pH a 6-7. Encher um re-cipiente apropriado e carregar com a fase C.

% Ingredientes (INCI)A QS PEG-40 óleo de rícino hidrogenado QS Perfume 82,5 Aqua dem.B 10,0 Poliquaternio-16 SA Composto 0,5 Fosfato de hidroxietil cetildimônio QS ConservanteC 6,0 Propano/butano% Ingredientes (INCI)A QS PEG-40 óleo de rícino hidrogenado QS Perfume 78,5 Aqua dem.B 100 Poliquaternio-16 SA Composto 0,5 Fosfato de hidroxietil cetildimônio QS ConservanteC 6,0 Propano/butano

Produção: Pesar os compostos de fase A e misturar os mesmos. Dissolver afase B, agitar na fase A e homogeneizar. Ajustar o pH a 6-7. Encher um re-cipiente apropriado e carregar com a fase C.

ESPUMAS MODELADORAS DO PENTEADO

% Ingredientes (INCI) A 2,0 Metossulfato de cocotrimônio QS Perfume B 84,0 Aqua dem. 2,0 Quitosana SA Composto 0,5 Copoliol dimeticona 0,2 Ceteareth-25 0,2 Pantenol 0,1 PEG-25 PABA C 10,0 HFC 152 A % Ingredientes (INCI) A 2,0 Metossulfato de cocotrimônio QS Perfume B 80,0 Aqua dem. 2,0 Quitosana SA Composto 0,5 Copoliol dimeticona 0,2 Ceteareth-25<table>table see original document page 266</column></row><table>

Produção: Pesar os compostos de fase A e misturar os mesmos. Dissolver afase B, agitar na fase A e homogeneizar. Ajustar o pH a 6-7. Encher um re-cipiente apropriado e carregar com a fase C.

XAMPUS

<table>table see original document page 266</column></row><table><table>table see original document page 267</column></row><table>

Produção: Pesar os compostos de fase A e misturar os mesmos. Ajustar opH a 6-7 com ácido cítrico.

GÉIS PARA CHUVEIRO

<table>table see original document page 267</column></row><table>

Produção: Pesar os compostos de fase A e misturar os mesmos. Ajustar opH a 6-7 com ácido cítrico.XAMPUS

<table>table see original document page 268</column></row><table>

Produção: Pesar os compostos de fase A e misturar os mesmos. Ajustar opH a 6-7 com ácido cítrico.

XAMPUS

<table>table see original document page 268</column></row><table><table>table see original document page 269</column></row><table>

Produção: Pesar os compostos de fase A e misturar os mesmos. Ajustar opH a 6-7. Adicionar a fase B e aquecer até o máximo de 40°C.

LOÇÕES CORPORAIS

<table>table see original document page 269</column></row><table><table>table see original document page 270</column></row><table>Produção: Aquecer as fases AeB separadamente a aproximadamente40°C. Adicionar fase B à fase A e homogeneizar por agitação. Adicionar afase C na fase AeB combinada e homogeneizar outra vez. Ajustar o pHcom fase D a 6 - 7. Homogeneizar por agitação e resfriar em temperaturaambiente.

LOÇÕES CORPORAIS

<table>table see original document page 271</column></row><table><table>table see original document page 272</column></row><table>

Produção: Aquecer as fases AeB separadamente a aproximadamente80°C. Adicionar fase B à fase A e homogeneizar por agitação. Resfriar a40°C e adicionar fase C. Homogeneizar outra vez e resfriar em temperaturaambiente.

CONDICIONADORES DE CABELO

% Ingredientes (INCI) A 10,0 Copolímero de PVP/VA 0,2 Fosfato de hidroxietil cetildimônio 0,2 Ceteareth-25 0,5 Copoliol dimeticona QS Perfume 10,0 Álcool SA Composto 68,1 Aqua dem. B 10,0 Propano/butano % Ingredientes (INCI) A 10,0 Copolímero de PVP/VA 0,2 Fosfato de hidroxietil cetildimônio 0,2 Ceteareth-25 0,5 Copoliol dimeticona QS Perfume 10,0 Álcool SA Composto 64,1 Aqua dem. B 10,0 Propano/butanoProdução: Adicionar todos os compostos à fase A e agitar para homogenei-zar. Encher um recipiente apropriado e carregar com a fase B.

CONDICIONADORES ESPUMANTES

<table>table see original document page 273</column></row><table><table>table see original document page 274</column></row><table>

Produção: Adicionar todos os compostos à fase A e agitar para homogenei-zar. Encher um recipiente apropriado e carregar com a fase B.

ESPUMAS MODELADORAS DO PENTEADO

<table>table see original document page 274</column></row><table>C 10,0 HFC 152 A

Produção: Pesar os compostos de fase A e misturar os mesmos. Dissolver afase B, agitar na fase A e homogeneizar. Encher um recipiente apropriado ecarregar com a fase C.

ESPUMAS MODELADORAS DO PENTEADO

% Ingredientes (INCI) A 2,0 Metossulfato de cocotrimônio QS Perfume B 78,5 Aqua dem. 6,7 Copolímero acrilatos 0,6 AMP SA Composto 0,5 Copoliol dimeticona 0,2 Ceteareth-25 0,2 Pantenol 0,1 PEG-25 PABA 0,2 Hidroxietilcelulose C 10,0 HFC 152A % Ingredientes (INCI) A 2,0 Metossulfato de cocotrimônio QS Perfume B 74,5 Aqua dem. 6,7 Copolímero de acrilatos 0,6 AMP SA Composto 0,5 Copoliol dimeticona 0,2 Ceteareth-25 0,2 Pantenol 0,1 PEG-25 PABA 0,2 Hidroxietilcelulose C 10,0 HFC 152AProdução: Pesar os compostos de fase A e misturar os mesmos. Dissolver afase B, agitar na fase A e homogeneizar. Encher um recipiente apropriado ecarregar com a fase C.

ESPUMAS MODELADORAS DO PENTEADO

<table>table see original document page 276</column></row><table>

Produção: Pesar os compostos de fase A e misturar os mesmos. Dissolver afase B, agitar na fase A e homogeneizar. Ajustar o pH a 6 -7. Encher umrecipiente apropriado e carregar com a fase C.

ESPUMAS MODELADORAS DO PENTEADO

<table>table see original document page 276</column></row><table><table>table see original document page 277</column></row><table>

Produção: Pesar os compostos de fase A e misturar os mesmos. Dissolver afase B, agitar na fase A e homogeneizar. Adicionar a fase C e homogeneizaroutra vez. Ajustar o pH a 6-7. Encher um recipiente apropriado e carregarcom fase D.

ESPUMAS MODELADORAS DO PENTEADO

<table>table see original document page 277</column></row><table><table>table see original document page 278</column></row><table>

Produção: Pesar os compostos de fase A e misturar os mesmos. Dissolver afase B, agitar na fase A e homogeneizar. Adicionar a fase C e homogeneizaroutra vez. Ajustar o pH a 6-7. Encher um recipiente apropriado e carregarcom fase D.

ESPUMAS MODELADORAS DO PENTEADO

<table>table see original document page 278</column></row><table><table>table see original document page 279</column></row><table>

Produção: Pesar os compostos de fase A e misturar os mesmos. Dissolver afase B, agitar na fase A e homogeneizar. Ajustar o pH a 6-7. Encher um re-cipiente apropriado e carregar com a fase C.

ESPUMAS MODELADORAS DO PENTEADO

<table>table see original document page 279</column></row><table>Produção: Pesar os compostos de fase A e misturar os mes-mos. Dissolver a fase B1 agitar na fase A e homogeneizar. Ajustar o pH a 6-7. Encher um recipiente apropriado e carregar com a fase C.

ESPUMAS MODELADORAS DO PENTEADO

<table>table see original document page 280</column></row><table>

Produção: Pesar os compostos de fase A e misturar os mesmos.Dissolver a fase B, agitar na fase A e homogeneizar. Ajustar o pH a 6-7. En-cher um recipiente apropriado e carregar com a fase C.

ESPUMAS MODELADORAS DO PENTEADO

<table>table see original document page 280</column></row><table><table>table see original document page 281</column></row><table>

Produção: Pesar os compostos de fase A e misturar os mesmos. Dissolver afase B, agitar na fase A e homogeneizar. Ajustar o pH a 6-7. Encher um re-cipiente apropriado e carregar com a fase C.

XAMPUS

<table>table see original document page 281</column></row><table><table>table see original document page 282</column></row><table>

Produção: Pesar os compostos de fase A e misturar os mesmos. Ajustar opH a 6-7 com ácido cítrico.

GÉIS PARA CHUVEIRO

<table>table see original document page 282</column></row><table><table>table see original document page 283</column></row><table>

Produção: Pesar os compostos de fase A e misturar os mesmos. Ajustar opH a 6-7 com ácido cítrico.

XAMPUS

<table>table see original document page 283</column></row><table><table>table see original document page 284</column></row><table>

Produção: Pesar os compostos de fase A e misturar os mesmos. Ajustar opH a 6-7 com ácido cítrico.

XAMPUS

<table>table see original document page 284</column></row><table><table>table see original document page 285</column></row><table>

Produção: Pesar os compostos de fase A e misturar os mesmos. Ajustar opH a 6-7. Adicionar a fase B e aquecer até o máximo de 40°C.

LOÇÕES CORPORAIS

<table>table see original document page 285</column></row><table><table>table see original document page 286</column></row><table>

Produção: Aquecer as fases AeB separadamente a aproximadamente40°C. Adicionar fase B à fase A e homogeneizar por agitação. Adicionar afase C na fase AeB combinada e homogeneizar outra vez. Ajustar o pHcom fase D a 6 - 7. Homogeneizar por agitação e resfriar em temperaturaambiente.

LOÇÕES CORPORAIS

<table>table see original document page 286</column></row><table><table>table see original document page 287</column></row><table>

Produção: Aquecer as fases AeB separadamente a aproximadamente80°C. Adicionar fase B à fase A e homogeneizar por agitação. Resfriar a40°C e adicionar fase C. Homogeneizar outra vez e resfriar em temperaturaambiente.

CUIDADO DA PELE DIÁRIO O/A

<table>table see original document page 287</column></row><table>QS Conservante

67,8 Aqua dem.

C 4,0 Triglicerídeo caprílico/cáprico, copolímero acrilatos de sódio

D 0,2 Fosfato de ascorbila de sódio

1,0 Acetato de tocoferila

0,2 Bisabolol

1,0 Triglicerídeo caprílico/cáprico, ascorbato de sódio, toco-ferol, retinol

SA Composto

E QS Hidróxido de sódio

% Ingredientes (INCI)

A 1,7 Ceteareth-6, álcool estearílico

0,7 Ceteareth-25

2,0 Benzoato de dietilamino hidroxibenzoil hexila

2,0 PEG-14 Dimeticona

3,6 Álcool cetearílico

6,0 Metoxicinamato de etilhexila

2,0 Adipato de dibutila

B 5,0 Glicerina

0,2 EDTA dissódico

1,0 Pantenol

QS Conservante

63,8 Aqua dem.

C 4,0 Triglicerídeo caprílico/cáprico, copolímero acrilatos de sódio

25 D 0,2 Fosfato de ascorbila de sódio

1,0 Acetato de tocoferila

0,2 Bisabolol

1,0 Triglicerídeo caprílico/cáprico, ascorbato de sódio, toco-ferol, retinol

SA Composto

E QS Hidróxido de sódioProdução: Aquecer fase AeB separadamente a aproximadamente 80°C.

Adicionar fase B à fase A e homogeneizar por agitação. Adicionar a fase Cna fase AeB combinada e homogeneizar outra vez. Resfriar a aproximada-mente 40°C e adicionar à fase D. Ajustar o pH com fase E a aproximada-mente 6,5. Homogeneizar por agitação e resfriar em temperatura ambiente.

CREME O/A PROTETOR DA PELE PARA O DIA

% Ingredientes (INCI) A 1,7 Ceteareth-6, álcool estearílico 0,7 Ceteareth-25 2,0 Benzoato de dietilamino hidroxibenzoil hexila 2,0 PEG-14 Dimeticona 3,6 Álcool cetearílico 6,0 Metoxicinamato de etilhexila 2,0 Adipato de dibutila B 5,0 Glicerina 0,2 EDTA dissódico 1,0 Pantenol QS Conservante 68,6 Aqua dem. C 4,0 Triglicerídeo caprílico/cáprico, copolímero acrilatos de sódio D 1,0 Fosfato de ascorbila de sódio 1,0 Acetato de tocoferila 0,2 Bisabolol SA Composto E QS Hidróxido de sódio % Ingredientes (INCI) A 1,7 Ceteareth-6, álcool estearílico 0,7 Ceteareth-25 2,0 Benzoato de dietilamino hidroxibenzoil hexila 2,0 PEG-14 dimeticona 3,6 Álcool cetearílico 6,0 Metoxicinamato de etilhexila<table>table see original document page 290</column></row><table>

Produção:: Aquecer a fase AeB separadamente a aproximadamente 80°C.Adicionar fase B à fase A e homogeneizar por agitação. Adicionar a fase Cna fase AeB combinada e homogeneizar outra vez. Resfriar a aproximada-mente 40°C e adicionar à fase D. Ajustar o pH com fase E a aproximada-mente 6,5. Homogeneizar por agitação e resfriar em temperatura ambiente.

LIMPADOR FACIAL Q/A

<table>table see original document page 290</column></row><table><table>table see original document page 291</column></row><table>

Produção: Dissolver a fase A e adicionar fase B à fase A e homogeneizarpor agitação. Adicionar a fase C na fase AeB combinada e homogeneizaroutra vez. Adicionar a fase D na fase A, B e C combinada e homogeneizaroutra vez. Dissolver a fase D e adicionar à fase A, B, e C e homogeneizaroutra vez. Agitar durante 15 minutos.PULVERIZAÇÃO CORPORAL DE CUIDADO DIÁRIO

<table>table see original document page 292</column></row><table>55,2 Álcool

Produção: Pesar todos os ingredientes da fase A e dissolver completamentepor agitação.

GEL DE CUIDADO DA PELE

<table>table see original document page 293</column></row><table>

Produção: Dissolver a fase A. Intumescer a fase B e neutralizar com a faseC. Adicionar fase A à fase BeCe homogeneizar por agitação.

LOÇÕES PÓS-BARBA

<table>table see original document page 293</column></row><table><table>table see original document page 294</column></row><table><table>table see original document page 295</column></row><table>

Produção: Dissolver a fase A. Dissolver a fase B e adicionar à fase A. Ho-mogeneizar por agitação. Neutralizar a fase A e B por adicionar a fase C ehomogeneizar outra vez.

LOÇÕES DE FILTRO SOLAR

<table>table see original document page 295</column></row><table><table>table see original document page 296</column></row><table>

Produção: Aquecer fase AeB separadamente a aproximadamente 80°C.

Adicionar fase B à fase A e homogeneizar por agitação. Aquecer a fase C a80°C e adicionar na fase AeB combinada e homogeneizar outra vez. Res-friar a aproximadamente 40°C e adicionar à fase D. Homogeneizar outra vez.LOÇÕES DE FILTRO SOLAR O/A

<table>table see original document page 297</column></row><table><table>table see original document page 298</column></row><table>

Produção: Aquecer fase AeB separadamente a aproximadamente 80°C.Adicionar fase B à fase A e homogeneizar por agitação. Aquecer a fase C a80°C e adicionar na fase AeB combinada e homogeneizar outra vez. Res-friar a aproximadamente 40°C e adicionar à fase D. Homogeneizar outra vez.

LOÇÕES DE FILTRO SOLAR O/A

<table>table see original document page 298</column></row><table><table>table see original document page 299</column></row><table>

Produção: Aquecei fase AeB separadamente a aproximadamente 80°C

Adicionar fase B à fase A e homogeneizar por agitação. Aquecer a fase C a80°C e adicionar na fase AeB combinada e homogeneizar outra vez. Res-friar a aproximadamente 40°C e adicionar à fase D. Homogeneizar outra vez.

BÁLSAMO PARA OS PÉS

<table>table see original document page 300</column></row><table>5,0 Extrato de hamamélia

Produção: Aquecer fase AeB separadamente a aproximadamente 80°C.Adicionar fase B à fase A e homogeneizar por agitação. Resfriar a aproxi-madamente 40°C e adicionar fase CeD. Homogeneizar por agitação e res-friar em temperatura ambiente.

<table>table see original document page 301</column></row><table>0,5 Acetato de tocoferila

Produção: Aquecer fase AeB separadamente a aproximadamente 85°C.

Adicionar fase B à fase A e homogeneizar por agitação. Resfriar a aproxi-madamente 40°C e adicionar fase C. Homogeneizar por agitação e resfriarem temperatura ambiente.

MAQUIAGEM LÍQUIDA - TIPO O/A

<table>table see original document page 302</column></row><table><table>table see original document page 303</column></row><table>

Produção: Aquecer fase AeB separadamente a aproximadamente 80°C.Adicionar fase B à fase A e homogeneizar por agitação. Resfriar a 40°C eadicionar à fase CeD. Homogeneizar outra vez e resfriar em temperaturaambiente.

BASE

<table>table see original document page 303</column></row><table>

Os pigmentos (AS 5811, 5131, 5146, 5126, e 50230; Color Te-chniques) e propilparabeno são dispersos em Silcare 31 M50 SV (Clariant),agitando até ficarem úmidos. A mistura é então passada sobre um moinhode três rolos em ajuste apertado até o tamanho de partícula ser <10 μιτι. En-tão, DC 9011 Elastomer Blend (Dow Corning) e DC 245 Fluid são combina-dos em um vaso de acabamento, agitando até ficarem homogêneos. O tritu-rado de cor é adicionado com agitação lenta do homogeneizador. A água épesada em um vaso separado e o composto é gradualmente adicionado comagitação do propulsor, agitando até dissolver. Metilparabeno e ácido benzói-co são adicionados a butileno glicol. A mistura é aquecida levemente, e agi-tada até dissolver. A mistura é resfriada a 30 0C e adicionada na soluçãocontendo composto. A fase em água é adicionada lentamente na fase emóleo com agitação rápida. Quando a adição está completa, a preparação éhomogeneizada durante cinco minutos. Esta preparação é utilizável comouma base de maquiagem para aplicação na pele.

FORMULAÇÃO DE RÍMEL

Os ingredientes de ambos um controle de preparação como deum rimei contendo 2% são como a seguir:

<table>table see original document page 304</column></row><table><table>table see original document page 305</column></row><table>

Para produzir a formulação de rimei, a fase de cera 8 é combi-nada e aquecida a 85-90 0C com misturação de propulsor. A solução decomposto a 10% é preparada por adição de composto A a água enquantomisturando com propulsor. A água da fase 1 é adicionada a um béquer comtara de aço inoxidável (aproximadamente 50 g de excesso são adicionadospara compensar perdas). O metilparabeno de fase 2 é adicionado a butilenoglicol e agitado enquanto aquecendo no topo de um banho de vapor até dis-solver, então adicionado a água com agitação de homomisturador lento. En-tão, a fase 4 de oxido de ferro preto é adicionada, enquanto mantendo a agi-tação. Então, Natrosol é aspergido, enquanto mantendo a agitação. O KOHa 10% é adicionado e o aquecimento começa a 85 0C, com o béquer cobertotão firmemente quanto possível. Quando o Natrosol está dissolvido, o ácidocítrico a 10% é adicionado em gotas, mantendo temperatura e agitação. En-tão o Arlacel 165 é adicionado lentamente e misturado durante pelo menos 5min para assegurar dissolução. A 85-90 0C, a fase cera é lentamente adicio-nada à fase de água enquanto homomisturando. A temperatura e agitaçãosão mantidas durante 10 min. A batelada é removida do banho de vapor edeixada resfriar enquanto homo-misturando com raspagem manual ocasio-nal das paredes do béquer. A 55 0C, a batelada é pesada para verificar aperda de peso. A misturação é iniciada e a água e adicionada, se necessá-rio. A 45 0C1 as fases 9 e 10 são adicionadas. O resfriamento é continuadousando água fria a 30 0C. Neste ponto, a raspagem manual contínua dasparedes do béquer é necessária.

Nesta preparação, a quantidade pequena de KOH (na fase 5) éusada para elevar o pH para dispersar o Natrosol que é revestido com glio-xal para retardar a umectação, e evitar aglomeração. Na fase 7, o ácido cítri-co é adicionado lentamente para ajustar o pH a -5,5, abaixo do ponto isoelé-tricô dos óxidos de ferro. Nas fases 7 e 8, o Arlacel 165 é dividido entre asfases óleo e água, como a emulsificação é mais fácil de obter com o tensoa-tivo em ambas as fases. Na fase 9, a água deionizada é adicionada à bate-lada de controle em vez de composto. A solução de composto é preparadaenquanto a emulsão está sendo processado, de modo a ser absolutamentefresca. Esta preparação provê uma formulação apropriada para uso comoum rimei.

EXEMPLO 2

Estudos de clareamento da pele

Neste exemplo, as experiências conduzidas para avaliar as ca-pacidade de clareamento da pele de BBI-AV são descritas. Treze indivíduos,com idades de 18-65, com tipos de pele Fitzpatrick Ill ou IV participaramdeste estudo de 22 dias. A classificação de pele de Fitzpatrick é baseada naresposta não protegida da pele aos primeiros 30 a 45 minutos de exposiçãoao sol após uma estação no inverno sem exposição ao sol. As categorias detipos de pele são:

I - sempre queima facilmente; nunca se bronzeia

II - sempre queima facilmente; bronzeia minimamente

III - queima moderadamente; bronzeia gradualmente

IV - queima minimamente; sempre bronzeia bem

V - raramente queima; bronzeia profusamente

Vl - nunca queima; profundamente pigmentado

Cinco sítios de teste de cor uniforme foram marcados no dorsoinferior de cada indivíduo. O classificador clínico avaliou o grau de bronzea-do em cada sítio usando uma escala 0 -10 (0 = bronzeado muito leve e 10 =bronzeado muito profundo). Cada indivíduo foi pré-tratado com uma concen-tração de molécula A, duas concentrações de molécula B, tampão de contro-le de veículo, e um sítio não tratado durante 11 dias consecutivos. Aproxi-madamente 150 uL de materiais de teste (0,1% e 0,9% de BBI-AV) e contro-le de veículo foram dosados no dorso inferior usando adesivos oclusivos. Osadesivos oclusivos consistiam em um chumaço Webril® (pano não tecido)mantido na pele com uma fita porosa, hipoalergênica (por exemplo, SCAN-PORE® ou MICROPORE®). Uma tira de fita BLENDERM® igual na largurado chumaço de algodão cobriu o lado de fora da fita de modo a prover umadesivo oclusivo. Os adesivos permaneceram no local até o clinico removerno dia seguinte. Este procedimento foi repetido durante 11 dias.

No dia 12, o clínico removeu os adesivos que foram aplicadosno dia anterior e o sítio foi suavemente limpo para remover o material de tes-te residual. O classificador clínico avaliou o grau de bronzeado em cada sítiousando uma escala de 0-11 (0 = sem bronzeado e 11 = bronzeado muitoprofundo). Os resultados são dados na tabela abaixo. Como indicado, nãose tem uma maior mudança na classificação de bronzeado com o BBI-AV doque o controle de veículo.

<table>table see original document page 307</column></row><table>

EXEMPLO 3

Redução em piamentacão de pele

Neste exemplo, as experiências conduzidas para testar a capa-cidade de BBI-AV de reduzir a pigmentação da pele induzida por exposiçãoa Uva são descritas. Este estudo foi conduzido com 13 indivíduos de tipo depele Ill e IV com base na classificação de pele de Fitzpatrick.

No dia um, cada dose de escurecimento com pigmento persis-tente mínima do indivíduo (MPPD) foi determinada no dorso inferior de cadaindivíduo, em uma área que é igual em cor à área que recebeu a aplicaçãode material de teste. Os indivíduos receberam cinco a sete exposições deUVA, com cada exposição representando um aumento de cerca de 25% so-bre a exposição anterior. Os indivíduos retornaram à clínica 3 - 4 horas apósas exposições de MPPD estarem completas. Os sítios de teste foram classi-ficados para escurecimento por pigmento usando a seguinte escala:

- sem escurecimento de pigmento visível

? resposta questionável, indistinto

+ leve escurecimento sobre essencialmente o campo de irradia-ção completo

++ escurecimento definido sobre o campo de irradiação completo

O sítio tratado com a dose menor de Uva produzindo um escorede "+" representou este MPPD do indivíduo.

No dia dois, sítios de cor uniforme foram marcados no dorsoinferior. O classificador clínico avaliou o grau de bronzeado em cada sítiousando uma escala O -10 (O = bronzeado muito leve e 10 = bronzeado muitoprofundo). Então o material de teste (0,1% e 0,9% de BBI-AV) e o controlede veículo aplicados sob oclusão. Um volume de 150 μΙ foi dosado sobrecada adesivo. Os adesivos oclusivos usados nestas experiências foram i-guais que descritos no exemplo 2. Como descrito no exemplo 2, os curativospermaneceram no local até o próximo dia, quando um clínico os removeu. Oprocedimento foi repetido durante 11 dias. Nos dias 12 - 14, o clínico remo-veu os adesivos que foram aplicados no dia anterior e o sitio foi suavementelimpo para remover material de teste residual. O classificador clínico avaliouo grau de bronzeado em cada sítio usando uma escala de 0-11 (0 - sembronzeado e 11 - bronzeado muito profundo). Após completar a classifica-ção, cada sítio foi exposto a 1,0 MPPD de UVA, como descrito para dia 1.Novos curativos foram aplicados após as exposições estarem completas. Nodia 15, os curativos foram removidos e o grau de bronzeado de cada sítio foiavaliado usando uma escala 0-10 (0 = sem bronzeado e 10 = bronzeadomuito profundo). Os resultados são dados abaixo.<table>table see original document page 309</column></row><table>

Os resultados mostraram que a pigmentação induzida por UVAé diminuída no caso de sítios expostos a BBI-AV. Isto é ainda evidentequando o aumento no grau de bronzeamento é tabulado na tabela abaixo.Na tabela, os resultados do grau de bronzeamento são mostrados como osresultados obtidos para dia 12 subtraído dos graus dos dias 13, 14 e 15.

<table>table see original document page 309</column></row><table>

EXEMPLO 4

Inibição do crescimento de cabelo

Neste Exemplo, experimentos para determinar a capacidade dascomposições da presente invenção de inibir o crescimento de pêlo são des-critos. Em particular, estes experimentos são conduzidos a fim de avaliar acapacidade das composições da presente invenção de diminuir o crescimen-to de pêlo após a depilação por barbear ou uso de cremes ou ceras.

Experiências com pêlos faciais

Nestas experiências, um grupo (por exemplo, 5) indivíduos dosexo masculino com classificação de pele Fitzpatrick Il foram testados. Osindivíduos são solicitados a não usar tratamento facial tópico antes do co-meço das experiências. No dia 1, o crescimento do pêlo facial é visualmenteavaliado e fotografado. Após esta avaliação e fotografia, a(s) composição(ões) a serem testadas, assim como o controle de veículo são aplicadosna(s) concentração(ões) desejada(s). Começando no dia 2, os indivíduosaplicam a(s) composição (ões) imediatamente após barbear. Nenhum outrotratamento pré- ou pós-barbear é usado durante as experiências. Na maioriados casos, a experiência continua durante um período de tempo de 30 a 45dias. O crescimento do pêlo facial é visualmente avaliado e fotografado acada três dias durante as experiências. O número de pêlos, assim como aextensão do eixo do pêlo e que são medidos usando análise de imagemcomputadorizada. Em modalidades preferidas , se nota uma diminuição nonúmero de pêlos, espessura do pêlo e/ou comprimento do pêlo devido à a-plicação do(s) composto(s) de teste).

Experiências com pêlos nas pernas

Nestas experiências, um grupo (por exemplo 5) de indivíduos dosexo feminino com classificação de pele Fitzpatrick Il foram testados. Osindivíduos são solicitados a não usar tratamento tópico nas pernas antes docomeço das experiências. No dia 1, as áreas em ambas as pernas de cadaindivíduo são marcadas e o crescimento dos pêlos é visualmente avaliado efotografado. Após esta avaliação e fotografia, a(s) composição (ões) a seremtestadas são aplicadas na(s) concentração(ões) desejada(s). Após esta ava-liação e fotografia, a (s) composição (ões) a serem testadas (isto é, os com-postos de teste contendo uma concentração desejada de BBI-AV), assimcomo um controle de veículo, são aplicados na(s) concentração(ões) dese-jada(s). Em alguns métodos, cada indivíduo é provido com dois tubos, umdos quais contém o BBI-AV e o outro contendo o controle de veículo. Estestubos são marcados "esquerdo" e "direito". Cada dia durante as experiên-cias, o indivíduo aplica as composições nos dois tubos nas pernas respecti-vas. Após 7 dias de aplicação, os indivíduos são visualmente avaliados efotografados. Ambas as pernas são então raspadas ou expostas a um depi-latório e os indivíduos de teste continuam a aplicar as composições comoantes. O crescimento de pêlos é então avaliado visualmente e por fotografiade áreas apropriadas nas pernas a cada 2 dias. Após 10 dias, as pernas sãonovamente raspadas e os indivíduos de teste continuam a aplicar as compo-sições como antes. Em alguns métodos, as experiências são conduzidasdurante 3 ciclos e o crescimento de pêlos é visualmente avaliado e as foto-grafias tomadas. As experiências são então continuadas por mais 8 dias. Emmodalidades preferidas, se nota uma diminuição no número de pêlos, es-pessura do pêlo e/ou comprimento do pêlo devido à aplicação do(s) compos-to^) de teste) na(s) área(s) marcada(s).

Começando no dia 2, os indivíduos aplicam a(s) composição(ões) imediatamente após raspar. Não é usado nenhum outro tratamentopré- ou pós-raspagem durante as experiências. Na maioria dos casos, a ex-periência continua durante um tempo de 30 a 45 dias. O crescimento de pê-los é visualmente avaliado e fotografado a cada três dias durante as experi-ências. O número de pêlos, assim como a extensão do eixo do pêlo e quesão medidos usando análise de imagem computadorizada. Em modalidadespreferidas, se nota uma diminuição no número de pêlos, espessura do pêloe/ou comprimento do pêlo devido à aplicação do(s) composto(s) de teste).

EXEMPLO 5

"Panninq", de uma biblioteca de peptídeos com apresentação na superfíciede faqos

Neste Exemplo, foram descritos experimentos conduzidos paratriar uma biblioteca com apresentação de fagos. Uma biblioteca de peptí-deos com apresentação de fagos comercialmente disponível PhD C7C(NEB) foi triada contra hVEGF165 (R&D systems) por 3 ciclos de acordo comas instruções dos fabricantes. Este procedimento forneceu os perfis de se-qüência resumidos na figura 1. Os clones individuais foram confirmados u-sando ELISA de fagos de acordo com as instruções dos fabricantes (vide,figura 2).

EXEMPLO 6

Análise de ligação de BlAcore® de peptídeos de ligação VEGF

Neste Exemplo, experimentos conduzidos para avaliar as afini-dades dos peptídeos para VEGF são descritos. As afinidades dos peptídeospara VEGF foram medidos usando um sistema de ressonância de plasmonde superfície BlAcore® 3000 (Biacore). Um chip sensor A CM5 foi condicio-nado com 50 mM NaOH, 0,1% HCI, 0,1% SDS, e 0,08% H3PO4, e ativadospara copulação covalente de VEGF usando cloridrato de N-etil -/V-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e A/-hidroxissuccinimida (NHS) de acordocom as instruções dos fabricantes (Biacore). VEGFi6S humano (Biosource)foi diluído a 5 pg/ml em 20 mM acetato de sódio , pH 4,8 e injetado a umataxa de fluxo de 2 μΙ/min para obter aproximadamente 1000 a 6000 unidadesde resposta (RU) de proteína copulada. TNF-alfa (TNF-alfa humano, Bio-source, Int., Camarillo, CA) foi similarmente copulado no chip sensor CM5em aproximadamente 850 a 3500 RU na trilha de referência. Uma soluçãode 1 M etanolamina foi injetada como um agente de bloqueio. Em algumasexperiências, uma solução adicional de EDC e NHS foi injetada para melho-rar a estabilidade da linha de base e uma solução de 1 M etanolamina inje-tada como um agente de bloqueio. A trilha de referência foi ativada comEDC e NHS e bloqueada com etanolamina.

Os peptídeos foram sintetizados usando química FMO padrão,purificados por HPLC de fase reversa a > 95% de pureza (SynPep)1 e arma-zenados a 10 mg/mL em DMSO. Para medidas cinéticas, peptídeos diluídosem série de duas vezes em tampão HBS-EP5 0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 MNaCI, 3 mM EDTA, 0,005% Surfactant P20 (Biacore), foram injetados a 25°Ca uma taxa de fluxo de 20 pL/min. Amostras de DMSO diluídas em série deduas vezes e amostras de tampão foram também injetadas para subtraçãode fundo. Os parâmetros cinéticos foram calculados usando software BIAe-valuation 3,1. Resultado destes experimentos são apresentados na Figura 3.

EXEMPLO 7

Constructo de suportes "scaffold" de peptídeo-BLA

Neste Exemplo, são descritos métodos usados na constructo deconstructos anti-VEGF-BBI. Plasmídeo pCM01 (5,1 kb) codifica uma se-qüência de peptídeo de 15 aminoácidos CK37281 fundida no N-término deβ-lactamase de Enterobacter cloaceae (BLA) com uma seqüência de sinalplll e etiqueta C-terminal 6XHis, (vide, Figura 4). O plasmídeo tambémtransporta um gene de resistência a cloranfenicol (CAT) como um marcadorselecionável e expressão é dirigida por um promotor Iac (Plac). PlasmídeopCM01 foi construído usando um vetor Bbs1, pME30 construído a partir depCB04. pCB04 foi digerido com Dralll e Spe I (NEB), resultando em frag-mentos de 2,8 kb e 2,1 kb. Para fazer os insertos, os pares oligo NtermStf2-Fe NtermStf2-R (5 μΜ) foram combinados em um volume total de 50 μΙ emágua, a mistura foi aquecida a 95C em bloco de calor durante 5 minutos, e obloco foi deixado resfriar em temperatura ambiente.

Oligos: NtermStf2-F e NtermStf2-R para inserto de vetor "stuffer"NtermStf2-F

5'[Phos]

CTAGTGTCTTCGATCAAGTCGACAACAGCCTGTCTGCAGATCCTGAAGACTGGCGGAGGTGGTCGCGAATACGATTACCCCGCTGATGAAAGCACAGA 3' (SEQ ID NO:26)NtermStf2-R5'[Phos]

GTGCTTTCATCAGCGGGGTAATCGTATTCGCGACCACCTCCGCCAGTCTTCAGGATCTGCAGACAGGCTGTTGTCGACTTGATCGAAGACA 3' (SEQID NO:27)

O fragmento de 2,8kb, o fragmento de 2,1 kb, e inserto stuffer(100bp) foram ligados durante a noite a 16°C em uma relação molar de 1:1:5respectivamente, usando 10 μΙ de DNA mix e 10 μΙ de solução Takara I liga-se. Ligações foram purificadas usando kit DNA "clean" de Zymo Research eeluídas em 2x 8 μΙ de água. Então, 5 μΙ de mistura de ligação foram trans-formados em 50 μΙ células electrocompetentes Top 10 (Invitrogen), 250 μΙSOC foram adicionados e as células cultivadas durante 1 hora a 37°C. Amistura de transformação foi diluída 1/10 e colocada em placas em ambasas placas LA + 5 ppm CMP e LA + 5 ppm CMP + 0,1 ppm CTX, seguido porincubação durante a noite a 37°C. 12 colônias foram retiradas das placasCMP, cultivadas em LB + 5 ppm CMP, DNA foi isolado e digerido com enzi-ma Bbs\ (2 sítios em plasmídeo sfu/feí). pCB04 (WT) foi também digeridocomo controle. Um clone tinha a seqüência correta e foi designado pME22.

O plasmídeo de expressão peptídeo VEGF -BLA pCM01 foiconstruído a partir de pME22 usando os seguintes iniciadores para o insertoBBsI (vide, Figura 5); Oligos VegF-F, VegF-5R, VegF-3RP para inserto depeptídeo.VeqF-F

5'ACTAGTCGTTCCTTTCTATTCTCACTCTGCTTGTACCCTGTGGCCGACCTTCTGGTGCGGTGGAGGTTCGACGCCAGTGTCAGAAAAACAGCTG 3'(SEQ ID NO:28)

VeaF-5R

5' AGCAGAGTGAGAATAGAAAGGAACGAC 3' (SEQ ID NO:29)VegF-3RP

5' [Phos]CCGCCAGCTGTTTTTCTGACACTGG 3' (SEQ ID N0:30)

As proteínas de fusão BLA-peptídeo pCM01 e pCB04 (WT) euma biblioteca de tendências pCM04 foram expressados em E. coli (TOPIO;Invitrogen) em frascos de agitação de 1-L na presença de 5 ppm CMP e 0,1ppm antibiótico cefotoxima a 25SC durante 40 horas. As pastas de célulasforam coletadas das culturas de células de 200 ml por centrifugação a3,000xg durante 10 min. As pastas foram então tratadas com 25 ml de rea-gente B-PER (Pierce) durante 40 min com mistura lenta. O extrato foi sepa-rado por centrifugação a 20,OOOxgf durante 20 min. A-atividade BLA atividadede todas as frações líquidas foi testada usando nitrocefina e a concentraçãode proteínas de fusão em cada fração foi calculada considerando a mesmaatividade específica como a enzima WT. As proteínas de fusão foram purifi-cadas por cromatografia IMAC. As frações ativas BLA eluídas com imidazolforam reunidas e a pureza foi verificada como sendo melhor do que 95%como verificado por SDS-PAGE (vide, Figura 6).

EXEMPLO 8

Triagem de uma bibliotecas de esoueletode Peptídeo-BLA

Neste Exemplo, são descritos experimentos para triar uma bibli-oteca de esqueletopeptídeo-BLA. As placas COSTAR (96 cavidades) foramrevestidas com 0,5 pg (100 μί de 5 Mg/mL) hVEGF165 (Preprotech) com agi-tação suave a 4 2C durante a noite, seguido por bloqueio com tampão debloqueio Superbloek (Pierce) durante várias horas a temperatura ambiente.

As amostras purificadas com His-tag de pCM01 e pCM04 foram diluídas se-rialmente em tampão de teste BLA e porções de 100 μΙ foram transferidaspara cavidades revestidas com VEGF. Após uma hora, as placas foram Ia-vadas seis vezes com PBS1 0,05% TWEEN®-20 e 200 μΙ_ de tampão de tes-te de nitrocefina contendo 0,1 mg/ml nitrocefina (Oxoid) foram adicionadospara medir a atividade de beta-lactamase residual ligada a Abs490Zmin. Ascavidades de controle continham pCB04 beta-lactamase como um controle(vide, Figura 7).

EXEMPLO 9

Inibicão de Proliferação de Células HUVE por peptídeos aVEGF.

Neste Exemplo, são descritos experimentos conduzidos paradeterminar os efeitos de peptídeos aVEGF em células HUVE. As célulasHUVE (células de veia umbilical humana; Cambrex) foram passadas 1-5 ve-zes e mantidas de acordo com as instruções dos fabricantes. O crescimentode células HUVE foi estimulado por 0,03 a 20 ng/ml VEGF com a prolifera-ção maior a 10 ng/ml VEGF16S- Esta concentração foi também usada emsubseqüentes experimentos. Uma série de peptídeos a VEGF de 0,5 nM a25 μΜ (e um controle de anticorpo monoclonal anti-VEGF (R&D Systems))foram misturados com 10 ng/mL VEGF antes da adição a células HUVE se-meadas em triplicata em placas de 96 cavidades. A proliferação de célulasfoi medida por incorporação de 3H-timidina (vide, Figura 8). Significante inibi-ção foi observada a 0,4 μΜ anti-VEGF.

EXEMPLO 10

Inibicão de formação de tubos de vasos sangüíneos por conjugados VEGFPeptídeo

Neste Exemplo, são descritos experimentos conduzidos paraavaliar a formação de tubos de vasos sangüíneos. Este teste de angiogêne-se in vitro foi obtido como um kit de Chemicon e usado de acordo com asinstruções dos fabricantes.

Este teste provê um modelo simples de angiogênese em que aindução ou inibição da formulação de tubos por sinais exógenos pode sermonitorada. Uma suspensão de células endoteliais de células HUVE de bai-xa passagem foi misturada com concentrações diferentes do inibidor na pre-sença de 10 ng/mL VEGF, antes da adição das células a "ECMatrix" (isto é,uma solução que é polimerizada in situ e provê um gel sólido de proteínasde base preparadas de modo que células endoteliais se alinham e formamestruturas similares a tubos ocos). A formação de tubos é um processo demúltiplas etapas envolvendo adesão, migração diferenciação e crescimentode células. A formação de tubos resultante foi medida sob um microscópiode luz invertida a uma ampliação de 20X-100X. A inibição significante deformação de túbulos foi observada em concentrações acima de 1 μΜ peptídeo.

EXEMPLO 11

Constructo de bibliotecas de peptídeos com tendências de VEGF apresenta-da na superfície com faaos

Neste Exemplo, são descritos experimentos conduzidos parabibliotecas de apresentação na superfície de fagos construídas. As bibliote-cas de maturação por afinidade usados para a triagem de VEGF foram cons-truídas usando o sistema de apresentação na superfície de fagos de gene IllC7C bem-conhecido na técnica (vide, Noren e Noren [2001]). Oligonucleotí-deos foram sintetizados e fosforilados como bem-conhecido na técnica. Osoligonucleotídeos usados para construir as bibliotecas empregam códonsNNK (onde N = G, A, T, C e K= G ou Τ). O esquema de clonagem NNK eli-mina o potencial para dois códons de parada e ainda codifica todos os vinteaminoácidos. A biblioteca de peptídeo aleatória apresentou 9 aminoácidosaleatórios com duas cisteínas fixadas em posições 2 e 9 (XC(X)7CGGGS;SEQ ID N0:31; X representa qualquer aminoácido). Sete bibliotecas de pep-tídeos com tendência CK37282 foram criadas usando os mesmos métodos'como para a biblioteca aleatória.

EXEMPLO 12

Constructo de um inibidor de aVEGF Bowman Birk (BBIvegf)

Neste Exemplo, é descrita constructo de uma constructo anti-VEGF BBI (BBI-AV). Um gene sintético codificando para inibidor de BowmanBirk (vide, Figura 9) com sítios de restrição apropriados para a introdução deseqüências de codificação de peptídeos pequenos no laço de tripsina (Sacl-EcoRI) e/ou laço de quimotripsina (EcoRI-Sa/1) foi clonado em pET-22b(Novagen) usando sítios de clonagem NdeUXhoI de acordo com os proce-dimentos padrões bem-conhecidos na técnica. O vetor resultante, pET BBI,foi usado como um gabarito para inserir as seqüências CK37281, CK37282em laços BBI como cassetes de oligonucleotídeos de filamento duplo (Ope-ron). Constructos foram transformadas em BL-21(DE3) E coli, e colocadasem meio contendo 50 pg/mL ampicilina. DNA Plasmídeo de clones individu-ais foi isolado usando métodos bem-conhecidos na técnica (Qiagen) e osinsertos corretos confirmados por seqüenciamento de DNA. Os peptídeos deinteresse adicionais incluem PS-AV1 (1KSAIC-KYYLYWW-CF1V; SEQ IDN0:16) e PS-AV2 (1KSAIC-TLWKSYW-CF1V; SEQ ID N0:17).

Proteínas de fusão e BBI de tipo foram expressados em fermen-tadores de 14-L. As pastas de células foram coletadas e as proteínas isola-das dos corpos de inclusão usando uma modificação do procedimento detriagem Foldlt (Hampton) (vide, Figura 10).

EXEMPLO 13

Análise de ligação BlAcore® de BBI-VEGF

Neste Exemplo, são descritos experimentos conduzidos paradeterminar a afinidade de ligação de constructos produzidas como indicadono exemplo 9. As afinidades de constructos BBI-VEGF para VEGF forammedidas usando um sistema de ressonância de plasmon de superfície BIA-core® 3000 (Biacore). Um chip sensor A CM5 foi condicionado com 50 mMNaOH, e ativado para copulação covalente de VEGF usando cloridrato de N-etil -A^(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e A/-hidroxissuccinimida(NHS) de acordo com as instruções dos fabricantes (Biacore). VEGF(VEGF-I65 humano Biosource) foi diluído a 5 pg/ml em 20 mM acetato de só-dio , pH 4,8 e injetado a uma taxa de fluxo de 2 μΙ/min para obter aproxima-damente 1000 a 6000 unidades de resposta (RU) de proteína copulada.

Tripsina e quimotripsina foram similarmente copuladas para o chip sensorCM5 em aproximadamente 850 a 3500 RU em trilhas restantes. Uma solu-ção de 1M etanolamina foi injetada como um agente de bloqueio. A afinidadede ligação seletiva para VEGF de BBI-VEGF reduplicado é mostrada emFigura 11.EXEMPLO 14

Teste de Proliferação de células In vitro para testar a atividade de peptídeosinibidores de hVEGF

Neste Exemplo, são descritos experimentos conduzidos paradeterminar a atividade antiproliferativa de peptídeos anti-VEG. A atividadeantiproliferativa de peptídeos inibidores de VEGF foi determinada usandocélulas endoteliais de veia umbilical humanas (HUVEC) como a seguir. Umapassagem anterior (menor que seis) de HUVEC foi semeada em placas de96 cavidades de 5000 células por cavidade e deixadas sem nutrientes du-rante 18 horas em 200 μΙ de meio EBM (Cambrex) sem fatores de cresci-mento e suplementados com 0,5% FBS, a 37 0C com 5% CO2. O meio foisubstituído com 180 μΙ de meio de crescimento contendo meio EBM com 5%soro bovino fetal e 1% DMSO. Então, 20 μΙ de VEGF preincubado duranteuma hora com concentrações variadas de peptídeos (a concentração final deDMSO de todas as cavidades foi 1%) foram adicionados às cavidades parauma concentração final de VEGF de 10 ng/ml. Anticorpo VEGF humano (R &D Systems) foi usado como um controle positivo. As células com concentra-ções de 0,31 a 20 ng/ml de VEGF sozinho no meio de crescimento foramusadas para construir uma curva de crescimento padrão. As células foramainda incubadas durante 48 horas e a proliferação de células foi medida u-sando um arranjo MTS (kit de teste de proliferação celular de uma soluçãoaquosa CeIITiter 96; Promega). Então, 40 μΙ da solução de tetrazólio MTSforam adicionados a cada cavidade e após 3 e 4 horas de incubação, as pla-cas foram lidas a 490 nM. A absorção do meio sozinho foi subtraída de todosos pontos de dados. Os resultados indicaram que os peptídeos inibidores deVEGF CK37281 e CK37283 tem IC50 na faixa micromolar.

EXEMPLO 15

Teste de curativos para ferimentos de repetição (RIPT) de um peptídeo anti-VEGF em pele humana

Neste Exemplo, são descritos experimentos conduzidos paradeterminar os resultados de teste de curativos para peptídeos anti VEGF. Asamostras do peptídeo aVEGF CK37281 dosadas a 0,5% (p/v) foram formu-ladas na formulação de base contendo água deionizada /butileno glicol. A-proximadamente 0,2 mL da formulação foi aplicado a 200 voluntários huma-nos em um teste de curativos para ferimentos repetidos de acordo com osprocedimentos designados por Clinicai Research Laboratories, Inc. (Pisca-taway, NJ). Os resultados indicaram que não se nota irritação dérmica ousensibilização sobre a pele dos voluntários.

Tendo descrito as modalidades preferidas da presente invenção,será evidente para os versados na técnica que várias modificações podemser feitas nas modalidades descritas, e que estas modificações se destinama estar no escopo da presente invenção.

EXEMPLO 16

Produção de proteínas de fusão BCE103-BBI em B. subtilis

Neste Exemplo, experimentos conduzidos para produzir proteí-nas de fusão BCE103-BBI em B. subtilis são descritos. A seqüência de DNAdo gene sintético (Operon Technologies) codificando para a proteína pro-BBIcom uma etiqueta de hexa-histidina C-terminal usada nestes experimentosé:

A ACCTG CGTCTGTCTAAG CTTG G CCTGCTTATG AA ATC AG ACCATC AGCACAGCAATGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTACGAAATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTTCCGATATGCGTCTGAATAGCTGTCATAGTGCATGCAAAAGCTGTATCTGCGCCCTGAGTTATCCAGCTCAATGTTTTTGCGTCGACATCACGGACTTCTGCTATGAGCCATGTAAACCAAGCGAGGACGATAAAGAGAACCATCATCACCATCACCAT (SEQ IDNO:44)

A seqüência de proteína de pro-BBI C-terminal hexa-histidinaetiquetada codificada para o gene sintético acima é:NLRLSKLGLLMKSDHQHSNDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCICALSYPAQCFCVDITDFCYEPCKPSEDDKENHHHHHH (SEQID NO:45)

A porção da seqüência de DNA do gene sintético que codificapara a forma madura principal de BBI é

GACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTACGAAATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTTCCGATATGCGTCTGAATAGCTGTCATAGTGCATGCAAAAGCTGTATCTGCGCCCTGAGTTATCCAGCTCAATGTTTTTGCGTCGACATCACGGACTTCTGCTATGAGCCATGTAAACCAAGCGAGGACGATAAAGAGAAC (SEQ ID NO:46)

A seqüência de proteína da forma madura principal de BBI codi-ficado pelo gene sintético acima é:

DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCICALSYPAQCFCVDITDFCYEPCKPSEDDKEN (SEQ ID NO:47)

Os iniciadores PCR usados para amplificar o gene BBI para fu-são no cassete de expressão de BCE103 no vetor pJ103 foram:

BBIfusion _FW: 5' CAGCACGGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCC 3'(SEQ ID NO:48)

BBIHindIILRV: 5' CTGCAGAAGCTTAAAAATAAAAAAACGGATTTCCTTCAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTTTTAGTTCTCTTTATCGTCCTCGC 3'(SEQ ID NO:49)

BBIHIS-HindIILRV: 5' CTGCAGAAGCTTAAAAATAAAAAAACGGATTTCCTTCAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTTTTAATGGTGATGGTGATGATGGTTCTC 3' (SEQ ID N0:50)

A seqüência do cassete de expressão aprE-BCE103-BBI-HisTag(EcoR\-Hinó\\\) que foi clonado no vetor de integração pJM103 é apresenta-da na Figura 14. Um mapa esquemático do plasmídeo do vetor de expres-são pJM103BBIHis é apresentado na Figura 15.

O gene de celulase alcalina (BCE103) (vide, van Soligen, Paten-te US N2 6,063,611, incorporada aqui por referência) fundido na seqüênciade sinal e promotor aprE de B. subtilis foi clonado a partir de pUCAPR103(Shaw et al., J. Mol. Biol., 320:303-309 [2002]) como um fragmento EcoRI-SamHI (isto é, um fragmento que transporta a seqüência de codificação dedomínio catalítico BCE103 e primeiro Iigante do domínio de ligação de celu-lose apenas) em pJM103 (Perego, "Integrational vectors for genetic manipu-lation in Bacillus subtilis" In, Bacillus subtilis and Other Gram-positive Bacté-ria: Biochemistrv, Phvsioloav. and Molecular Genetics. Sonenshein, Hoch, eLosick (eds), American Society for Microbiology, Washington D.C., pp. 615-624 [1993]). Um gene codificando o inibidor de protease Bowman-Birk desoja (BBI) (Swiss-Prot Acesso η2 P01055; Vide, Odani e Ikenaka, J. Bio-chem., 71: 839-848 [1972]) com uma etiqueta hexa-histidina C-terminal (His-Tag) foi sintetizado por Operon Technologies (vide, seqüência de DNA aci-ma). O gene BBI foi amplificado por PCR com iniciadores (todos os iniciado-res foram sintetizados por MWG Biotech, Oligos Etc., ou Operon Technolo-gies) que geraram um sítio 5' BamYW na matriz de leitura correta com o geneBCE103, e na extremidade 3' introduzida em um terminador transcripcionalforte (LAT, do gene α-amilase de Bacillus Iicheniformis) após a extremidadedo gene BBI com um sítio 3' H/ndlll para clonagem no vetor pJM103.

Os fragmentos com ou sem uma His-Tag C-terminal foram ge-rados com os iniciadores BBIfusion_FW (SEQ ID NO:48) e BBIHISHindII-l_RV (SEQ ID N0:50), ou BBIfusion_FW (SEQ ID NO:48) e BBI-Hindlll_RV(SEQ ID NO:49), respectivamente, usando o gene BBI sintéticocomo um gabarito. Salvo especificado em contrário, as reações PCR foramtipicamente realizadas em um termociclador por 30 ciclos com polimeraseTaq High Fidelity Platinum (Invitrogen) de acordo com as instruções dos fa-bricantes (com uma temperatura de anelamento de 55°C). Os fragmentos dePCR foram clonados como fragmentos BamH\-Hind\\\ em pJM103 transpor-tando o cassete de expressão aprE-BCE103. A seqüência de genes corretafoi verificada por seqüenciamento de DNA.

Assim, como mostrado na Figura 14, o N-término da região decodificação madura do gene BBI (com ou sem His-Tag) foi fundido em arma-ção com a região de codificação C-terminal da primeira seqüência de IiganteCBD (domínio de ligação de celulose) codificado pelo gene BCE103 celula-se. Assim, os dois CBD's de BCE103 (Shaw et ai, supra) são substituídospor BBI nos vetores de expressão finais, pJM103BBI ou pJM103BBIhis (vide,Figura 15). O promotor aprE controla a expressão das fusões de genesBCE103-BBI (vide, Ferrari et ai, J. Bact., 170:289-295 [1988]; e Henner etai, J. Bact., 170: 296-300 [1988]).

As células competentes de Bacillus subtiiis, BG3934comK, fo-ram transformadas com os plasmídeos de expressão, pJM103BBI oupJM103BBIhis. As bactérias foram tornadas competentes pela indução dogene comK sob o controle de um promotor indutível por xilose (Hahn et ai,Mol. Microbiol., 21:763-775 [1996]). Os transformantes foram selecionadosem placas de ágar de caldo Luria (LA) contendo 5 pg/ml cloranfenicol. Paraaumentar a expressão por amplificação dos genes, as colônias foram risca-das e cultivadas várias vezes em placas LA com 25 pg/ml de cloranfenicolaté a taxa de crescimento com o antibiótico ser similar à taxa de crescimentona ausência de cloranfenicol. A proteína de fusão BCE103-BBI foi produzidapor crescimento em frascos de agitação a 37 0C em meio TSB (caldo Tryp-tone Soya de OXOID1 30 g/L) ou em meio MBD, um meio definido à base deMOPS. O meio MBD foi feito essencialmente como descrito (Neidhardt et ai,J. Bacteriol., 119: 736-747 [1974]), exceto NH4CI2, FeSO4l e CaCI2 foramdeixados do meio de base, 3 mM K2HPO4 foi usado e o meio de base foi su-plementado com 60 mM uréia, 75 g/L glicose, e 1 % soytone. Também, osmicronutrientes foram completados como uma carga de 100 X contendo, emum litro, 400 mg FeSO4 TH2O, 100 mg MnSO4 H2O, 100 mg ZnS047H20,50 mg CuCI2'2H20, 100 mg CoCI26H20, 100 mg NaMo042H20, 100 mgNa2B4O7 IOH2O, 10 ml de 1M CaCI2 , e 10 ml de 0,5 M citrato de sódio

A proteína de fusão BCE103-BBI pode ser facilmente visualiza-da em amostras de sobrenadantes isentos de células (após 24 h de cresci-mento em meio TSB ou 48 h em meio MBD) como a banda de proteína prin-cipal em géis SDS-PAGE (10 % NuPAGE em tampão MES, ciclado comodescrito de acordo com as instruções dos fabricantes, Invitrogen) fluindo a ~44 kDa por uso de colorações de proteína padrões (por exemplo, GeICodeBlue Stain Reagent; Pierce). A identidade de proteína de fusão BCE103-BBIfoi verificada por imunoblots de géis SDS-PAGE usando os protocolos deacordo com as instruções dos fabricantes (Kit BM Chromogenic WesternBlotting; Roche Applied Science usando um anticorpo anti-HisTag ou umanticorpo policlonal de celulase anti-BCE103 para detecção).

Para determinar a atividade de BCE103, degradação de celula-se foi avaliada qualitativamente em placas de indicador de celulase LA (com1 % carboximetil celulose colorido com 0,2 % vermelho Congo, ou com 0,5 %azo-CM-celulose, Megazyme), ou quantitativamente por um teste direto emtampão de teste (100 mM Tris pH 8,6, 0,005 % Tween-80) no caldo de cultu-ra usando um substrato sintético, 4-nitrofenil β-D-celobiosídeo (Sigma), u-sando métodos bem-conhecidos na técnica (ver por exemplo, van Tilbeurghetal., Meth. Enzymol., 160:45-59 [1988]).

Os testes inibidores de tripsina foram realizados em tampão deteste para determinar a atividade de BBI. Especificamente, uma curva pa-drão foi gerada para fazer onze diluições em série 1:1 (100 μΙ_ BBI + 100 μ!_tampão de teste) de uma solução de BBI padrão de 2 pg/mL O BBI padrãofoi purificado de 1 mg/ml de solução de inibidor de tripsina -quimotripsina(Sigma Cat. η2 T-9777) em 20 mM MES pH 6,0 usando uma coluna de inte-ração hidrofóbica (POROS HP2, coluna de fenila, Applied Biosystems). Acoluna foi equilibrada com 20mM MES pH 6,0, carregada com 5 mg do inibi-dor, lavada com o tampão de equilíbrio e então o BBI foi eluído com água.As amostras de BBI desconhecidas a serem testadas no teste inibidor foramdiluídas como necessário, de modo que dois ou mais pontos de dados esti-vessem dentro da curva padrão (geralmente diluições de amostra de 1:10,1:100, 1:200, 1:1000, 1:2000 foram testadas e então as diluições niveladasse necessário). Cada padrão ou amostra de BBI diluído, 20 μ!_, foi adiciona-do a 80 μL de 50 ng/ml de tripsina pancreática bovina (Worthington) (feitapor diluição de uma carga de solução de 1 mg/mL de tripsina em um tampãode teste). Por conveniência, os padrões e amostras foram dispostos em pla-cas de microtitulação de 96 cavidades. As reações foram misturadas e incu-badas 15 min a 25 °C. Após a incubação, 100 μΙ_ do substrato de tripsina a0,5 mg/ml (diluído em tampão de teste de uma solução 100 mg/ml de DM-SO), Suc-AAPR-pNA (succinil-Ala-Ala-Pro-Arg-para-nitroanilídeo, Bachem),foram adicionados, misturados e o OD (A4os) foi monitorado durante 15 min,com 1 ponto no tempo registrado a cada 12 segundos usando Spectra Max250 (Molecular Devices). Os pontos de dados foram usados para determinaro Vmax para cada reação. A curva padrão foi gerada traçando em gráficoVmax versus concentração de BBI e foi configurado em uma curva de quatroparâmetros. Toda a configuração de dados foi feita usando software forneci-do pelo fabricante (Molecular Devices). A concentração de BBI das amostrasdesconhecidas foi calculada da curva padrão. Alternativamente, a atividadede BBI foi medida usando o mesmo protocolo mas por determinação da ini-bição de quimotripsina pancreática bovina (Worthington) (quimotripsina foiusada na mesma concentração como a atividade de tripsina e quimotripsinafoi medida por adição de 100 μΙ_ de um substrato de 0,4 mg/ml de quimotrip-sina , succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-para-nitroanilídeo, Bachem).

Títulos de ciclos de frascos agitados (500 ml meio MBD em fras-cos com anteparos de 2,8 L Fernbach 6, 37°C, 225 rpm, coletados 60 h apóso crescimento) tipicamente na faixa de 0,4 - 0,9 mg/ml atividade BCE e 40 -150 pg/ml atividade inibidora de BBI tripsina. No entanto, é contemplado queos títulos provavelmente podem ser melhorados ainda por otimização dacepa bacteriana, meio de cultura e condições de crescimento (aeração, tem-peratura, tempo de coleta, etc).

Além da fusão de BCE103 a BBI tipo selvagem, proteínas defusão a variantes BBI e proteínas de fusão com vários Iigantes entreBCE103 e BBI foram produzidos usando os métodos descritos acima, comodescrito nos seguintes Exemplos. Além disso, proteínas de fusão foram tam-bém produzidas quando o BBI foi fundido no segundo Iigante de CBD (BCE-cbdD-BBI; vide, Exemplo 19) tornando possível usar o primeiro CBD paraauxiliar no processo de purificação.

EXEMPLO 17

Produção de peptídeos substituídos nos Iacos do sítio reativo de BBI comoproteínas de fusão BCE103-BBI

Neste Exemplo, são descritos experimentos conduzidos paraproduzir peptídeos substituídos nos laços de sítio reativo de BBI como prote-ína de fusão BCE103-BBI. Os iniciadores, assim com outras seqüências u-sadas nas várias etapas destes experimentos são apresentados abaixo. Aseqüência de 12BBIck81 do sítio de fusão BCE103 (no sítio SamHI) para aextremidade do gene é apresentada na Figura 16. Peptídeos contendo aseqüência CK37281 (ACYNLYGWTC (SEQ ID NO:43) foram inseridos emambos os laços inibidores de tripsina e quimotripsina.Os iniciadores usados para introduzir um sítio EcoRI no geneBBI usando mutagênese sítio-dirigida QuikChange® (Stratagene) foram:BowBeco-F

5'-GATATGCGTCTGAATTCCTGTCATAGTGCAT (SEQ ID N0:51)BowBeco-R

5'-ATGCACTATGACAGGAATTCAGACGCATATC (SEQ ID NO:52)

As seqüências dos oligonucleotídeos de DNA que foram anela-das e clonadas no gene BBI (SacI-EcoRI) para substituir o laço inibidor detripsina com o peptídeo de ligação de VegF CK37281 foram:1BBck81 +

5'-CTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTTATAATTTGTATGGGTGGACTTGTCGCTGCAGCGATATGCGTCTG (SEQ ID NO:53)1BBck81-

5'- AATTCAGACGCATATCGCTGCAGCGACAAGTCCACCCATACAAATTATAACATGCGCATTGATCGCAACAGGGTTTAGAGCT (SEQ ID NO:54)

As seqüências dos oligonucleotídeos de DNA que foram anela-das e clonadas no gene BBI (Eco\-Sal\) para substituir o laço inibidor dequimotripsina com o peptídeo de ligação de VegF CK37281 foram2BBck81 +

5'-

AATTCCTGTCATAGTGCCTGCAAAAGCTGCGCATGTTATAACCTGTACG

GGTGGACCTGTTTTTGCG (SEQ ID NO:55)

2BBck81-

5'-

TCGACGCAAAAACAGGTCCACCCGTACAGGTTATAACATGCGCAGCTTTTGCAGGCACTATGACAGG (SEQ ID NO:56)

As seqüências de DNA dos pares de oligonucleotídeos usadospara fazer cassetes para introduzir peptídeos nos laços de sítio reativo detripsina (sítios de restrição Sacl e EcoRI) ou quimotripsina (sítios de restriçãoEcoRI e Sa/l) do gene BBI sintético são dadas abaixo. Estas seqüências decodificação de peptídeos foram então movimentadas para o vetor de expres-são de p2JM103BBI como fragmentos Sacl-Sa/I.Comstatina (12 laço)

CTAAACCCTGTTG CG ATC AATGCGC ATGTGTTGTTC AG G ACTG GG GTC ACCACCGTTGTCGCTGCAGCGATATGCGTCTG (SEQ ID NO:57)e

AATTCAGACGCATATCGCTGCAGCGACAACGGTGGTGACCCCAGTCCTGAACAACACATGCGCATTGATCGCAACAGGGTTTAGAGCT (SEQ IDNO:58)

Comstatina (2- laço)

CAAAAGCTGTATCTGCGTTGTTCAGGACTGGGGTCACCACCGTTGTTTTTGCG (SEQ ID NO:59)e

TCGACGCAAAAACAACGGTGGTGACCCCAGTCCTGAACAACGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQ ID N0:60)C2c (12 laço)

CTAAACCCTGTTGCGATCAATGCAGCTGTGGTCGTAAAATCCCGATCCAGTGTCGCTGCAGCGATATGCGTCTG (SEQ ID N0:61)e

AATTCAGACGCATATCGCTGCAGCGACACTGGATCGGGATTTTACGACCACAGCTGCATTGATCGCAACAGGGTTTAGAGCT (SEQ ID NO:62)C3c (12 laço)

CTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGGTTGTGCTCGTTCTAACCTGGACGAATGTCGCTGCAGCGATATGCGTCTG (SEQ ID NO:63)e

AATTCAGACGCATATCGCTGCAGCGACATTCGTCCAGGTTAGAACGAGCACAACCGCATTGATCGCAACAGGGTTTAGAGCT (SEQ ID NO:64)C4c (12 laço)

CTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGGTTGTCAGCGTGCTCTGCCGATCCTGTGTCGCTGCAGCGATATGCGTCTG (SEQ ID NO:65)e

AATTCAGACGCATATCGCTGCAGCGACACAGGATCGGCAGAGCACGCTGACAACCGCATTGATCGCAACAGGGTTTAGAGCT (SEQ ID NO:66)C5c (12 laço)CTAAACCCTGTTGCGATCAATGCCAGTGTGGTCGTCTGCACATGAAAACCTGTCGCTGCAGCGATATGCGTCTG (SEQ ID NO:67)e

AATTCAGACGCATATCGCTGCAGCGACAGGTTTTCATGTGCAGACGACCACACTGGCATTGATCGCAACAGGGTTTAGAGCT (SEQ ID NO:68)Xa 1 (2S laço)

AATTCCTGTCATAGTGCCTGCAAAAGCTGTATCTGCGCCCGTAGTTTGCCAGCTCAATG Illll GCG (SEQ ID NO:69)e

TCGACGCAAAAACATTGAGCTGGCAAACTACGGGCGCAGATACAGCTTTTGCAGGCACTATGACAGG (SEQ ID N0:70)hSCC1 (1-laço)

CTAAACCCTGTTGCGATCAATGCAACTGTACGTACTCAACCCCTCCACAGTGTCGCTGCAGCGATATGCGTCTG (SEQ ID NO:71)e

AATTCAGACGCATATCGCTGCAGCGACACTGTGGAGGGGTTGAGTACGTACAGTTGCATTGATCGCAACAGGGTTTAGAGCT (SEQ ID NO:72)

As seqüências de DNA de pares de iniciadores de oligonucleotí-deos usados para introduzir seqüências de peptídeos nos laços de sítio rea-tivo de tripsina ou quimotripsina usando um kit de mutagênese sítio-dirigidaQuikChange® Il XL (Stratagene) são dados abaixo. As reações foram reali-zadas de acordo com as instruções dos fabricantes e descritas no exemplo.Vinte ciclos foram realizados com extensões de 6 minutos a 68 0C1 desnatu-rações de 50 s a 95 0C, e anelamentos a 55 0C durante 50 s. Após os ciclos,uma extensão final foi realizada a 68 0C durante 20 minutos.1A (2- laço)

CTGTATCTGCAAACGCTCAAAATCTCGTGGCTGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQ ID NO:73)e

CGCAAAAACAGCCACGAGATTTTGAGCGTTTGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQ ID NO:74)2B (2â laço)CTGTATCTGCTGGTATAATCAAATGACAACATG Illll GCGTCGACATCAC (SEQ ID NO:75)e

CGCAAAAACATGTTGTCATTTGATTATACCAGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQ ID NO:76)4A (2S laço)

CTGTATCTGCCATCAACTTGGCCCGAATTCATG Illll GCGTCGACATCAC (SEQ ID NO:77)e

CGCAAAAACATGAATTCGGGCCAAGTTGATGGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQ ID NO:78)5A (2S laço)

CTGTATCTGCCATCCGTGGGCACCGTATTCTTGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQ ID NO:79)e

CGCAAAAACAAGAATACGGTGCCCACGGATGGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQ ID N0:80)6-1A (2- laço)

CTGTATCTGCAATCTTCATTATCTTCAACAGTG Illll GCGTCGACATCAC (SEQ ID NO:81)e

CGCAAAAACACTGTTGAAGATAATGAAGATTGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQ ID NO:82)7A (22 laço)

CTGTATCTGCACACCGTCTCTTTATCGCCCGTG Illll GCGTCGACATCAC (SEQ ID NO:83)e

CGCAAAAACACGGGCGATAAAGAGACGGTGTGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQ ID NO:84)8B (2- laço)

CTGTATCTGCCTTACAGATCAATCTAAACCGTGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQ ID NO:85)e

CGCAAAAACACGGTTTAGATTGATCTGTAAGGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQ ID NO:86)9A (2- laço)

CTGTATCTG CGTTAC AAC ATC AATG G GCATGTGTTTTTG CGTCG AC ATC AC (SEQ ID NO:87)e

CGCAAAAACACATGCCCATTGATGTTGTAACGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQ ID NO:88)10B (22 laço)

CTGTATCTGCCGCGCATCACCGTATGATTGGTGTTTTTGCGTCGACATC

AC (SEQ ID NO:89)e

CGCAAAAACACCAATCATACGGTGATGCGCGGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQ ID N0:90)11-1A (2S laço)

CTGTATCTGCTCAACACAAAAAATTCCGCAATGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQ ID NO:91)e

CGCAAAAACATTGCGGAATTTTTTGTGTTGAGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQ ID NO:92)12B (2- laço)

CTGTATCTGCACACAATTTCGCTCTGCAACATGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQ ID NO:93)e

CGCAAAAACATGTTGCAGAGCGAAATTGTGTGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQ ID NO:94)13A (22 laço)

CTGTATCTGCCCGGATCATGTTCCGCATCTTTGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQ ID NO:95)e

CGCAAAAACAAAGATGCGGAACATGATCCGGGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQ ID NO:96)-1A (2- laço)

CTGTATCTGCTCAGGCTTTCCGCTTTCTACATG Illll GCGTCGACATCAC (SEQ ID NO:97)e

CGCAAAAACATGTAGAAAGCGGAAAGCCTGAGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQ ID NO:98)1A6 (12 laço)

TCAATGCGCATGTGAAGAGATCTGGACTATGCTTTGCCGGTGTTCCGATATGCGTC (SEQ ID NO:99)e

CGGAACACCGGCAAAGCATAGTCCAGATCTCTTCACATGCGCATTGATCGCAACAGG (SEQ ID N0:100)1A6 (2- laço)

CAAAAG CTGTG CTTGTG A AG AG ATCTG G ACTATG CTTTGCTTTTG CGTCGACATCACGG (SEQ ID N0:101)e

ACGCAAAAGCAAAGCATAGTCCAGATCTCTTCACAAGCACAGCTTTTGCATGCACTATG (SEQ ID NO: 102)1C2 (1s laço)

TCAATGCGCATGTTGGGCCCTTACTGTCAAAACATGCCGGTGTTCCGATATGCGTC (SEQ ID NO:103)e

CGGAACACCGGCATGTTTTGACAGTAAGGGCCCAACATGCGCATTGATCGCAACAGG (SEQ ID NO: 104)1C2 (2- laço)

CAAAAGCTGTGCTTGTTGGGCCCTTACTGTCAAAACATGCTTTTGCGTCGACATCACGG (SEQ ID NO: 105)e

ACGCAAAAGCATGTTTTGACAGTAAGGGCCCAACAAGCACAGCTTTTGCATGCACTATG (SEQ ID NO: 106)2E2 (12 laço)TCAATGCGCATGTCTTACAGTACTGTGGACTACATGCCGGTGTTCCGATATGCGTC (SEQ ID NO: 107)e

CGGAACACCGGCATGTAGTCCACAGTACTGTAAGACATGCGCATTGATCGCAACAGG (SEQ ID NO:108)2E2 (22 laço)

CAAAAGCTGTGCTTGTCTTACAGTACTGTGGACTACATGCTTTTGCGTCGACATCACGG (SEQ ID NO: 109)e

ACGCAAAAGCATGTAGTCCACAGTACTGTAAGACAAGCACAGCTTTTGCATGCACTATG (SEQ ID NO: 110)2E5 (12 laço)

TCAATGCGCATGTACTCTTTGGAACAGATCTCCTTGCCGGTGTTCCGATATGCGTC (SEQ ID NO:111)

e

CG G AAC ACCG G C AAG GAG ATCTGTTCC AAAG AGTAC ATGCG CATTG ATCGCAACAGG (SEQ ID NO:112)2E5 (22 laço)

CAAAAGCTGTGCTTGTACTCTTTGGAATCGATCTCCTTGCTTTTGCGTCGACATCACGG (SEQ ID NO:113)e

ACGCAAAAGCAAGGAGATCGATTCCAAAGAGTACAAGCACAGCTTTTGCATGCACTATG (SEQ ID NO:114)FGFns (12 laço)

TCAATGCGCATGTACAAACATCGATTCTACTCCTTGCCGGTGTTCCGATATGCGTC (SEQ ID NO:115)e

CGGAACACCGGCAAGGAGTAGAATCGATGTTTGTACATGCGCATTGATCGCAACAGG (SEQ ID NO:116)

FGFns (22 laço)

CAAAAGCTGTGCTTGCACAAACATCGATTCTACTCCTTGTTTTTGCGTCGACATCACGG (SEQ ID NO:117)e

ACGCAAAAACAAGGAGTAGAATCGATGTTTGTGCAAGCACAGCTTTTGCATGCACTATG (SEQ ID N0:118)FGFkr (12 laço)

TCAATGCGCATGTACAAAAATCGATCGTACTCCTTGCCGGTGTTCCGATATGCGTC (SEQ ID NO:119)e

CGGAACACCGGCAAGGAGTACGATCGATTTTTGTACATGCGCATTGATCGCAACAGG (SEQ ID N0:120)

FGFkr (22 laço)

CAAAAGCTGTGCTTGCACAAAAATCGATCGTACTCCTTGTTTTTGCGTCGACATCACGG (SEQ ID ΝΟ.Ί21)e

ACGCAAAAACAAGGAGTACGATCGATTTTTGTGCAAGCACAGCTTTTGCATGCACTATG (SEQ ID NO: 122)FGFhI (12 laço)

TCAATGCGCATGTCACCTGCAGACAACTGAAACATGCCGGTGTTCCGATATGCGTC (SEQ ID NO: 123)e

CGGAACACCGGCATGTTTCAGTTGTCTGCAGGTGACATGCGCATTGATCGCAACAGG (SEQ ID NO: 124)FGFhI (22 laço)

CAAAAGCTGTGCTTGCCACCTGCAGACAACTGAAACATGTTTTTGCGTCGACATCACGG (SEQ ID NO:125)e

ACGCAAAAACATGTTTCAGTTGTCTGCAGGTGGCAAGCACAGCTTTTGCATGCACTATG (SEQ ID NO: 126)FGFgy (12 laço)

TCAATGCGCATGTGGCTACTTCATCCCATCGATTTGCCGGTGTTCCGATATGCGTC (SEQ ID NO: 127)e

CGGAACACCGGCAAATCGATGGGATGAAGTAGCCACATGCGCATTGATCGCAACAGG (SEQ ID NO: 128)FGFgy (22 laço)

CAAAAG CTGTG CTTG CG G CTACTTC ATCCC ATCG ATTTGTTTTTGCGTCGACATCACGG (SEQ ID NO: 129)e

ACGCAAAAACAAATCGATGGGATGAAGTAGCCGCAAGCACAGCTTTTGCATGCACTATG (SEQ ID NO: 130)MM005 (12 laço)

TCAATGCGCATGTTTACGTATCCTTGCTAACAAATGCCGGTGTTCCGATATGCGTC (SEQ ID NO:131)e

CGGAACACCGGCATTTGTTAGCAAGGATACGTAAACATGCGCATTGATCGCAACAGG (SEQ ID NO:132)MM005 (22 laço)

C A A AAG CTGTG CTTG CTTACGTATCCTTGCTAAC AA ATGTTTTTG CGTCGACATCACGG (SEQ ID NO: 133)e

ACGCAAAAACATTTGTTAGCAAGGATACGTAAGCAAGCACAGCTTTTGC

ATGCACTATG (SEQ ID NO: 134)MM007 (12 laço)

GCGATCAATGCGCCTGCAGAACTCAACCATATCCTTTATGTCGGTGTTCCGATATGCGTC (SEQ ID NO: 135)e

GGAACACCGACATAAAGGATATGGTTGAGTTCTGCAGGCGCATTGATCG

CAACAGGGTTT (SEQ ID NO: 136)MM007 (22 laço)

CAAAAGCTGTGCCTGCAGAACACAACCTTACCCACTTTGTTTTTGCGTCGACATCACGG (SEQ ID NO: 137)e

ACGCAAAAACAAAGTGGGTAAGGTTGTGTTCTGCAGGCACAGCTTTTGC

ATGCACTATG (SEQ ID NO: 138)MM009 (22 laço)CAAAAGCTGTGCCTGCCTGTTAACACCTACTCTTAACTGTTTTTGCGTCGACATCACGG (SEQ ID NO: 139)e

ACGCAAAAACAGTTAAGAGTAGGTGTTAACAGGCAGGCACAGCTTTTGCATGCACTATG (SEQ ID NO: 140)MM010 (12 laço)

TCAATGCGCATGCGCTCTTCCAACTCATTCTAACTGTCGGTGTTCCGATATGCGTCT (SEQ ID NO:141)e

CGGAACACCGACAGTTAGAATGAGTTGGAAGAGCGCATGCGCATTGATCGCAACAGG (SEQ ID NO: 142)MM010 (22 laço)

CAAAAGCTGTGCCTGCGCGCTTCCTACACACTCTAACTGTTTTTGCGTCGACATCACGG (SEQ ID NO:143)e

ACGCAAAAACAGTTAGAGTGTGTAGGAAGCGCGCAGGCACAGCTTTTGCATGCACTATG (SEQ ID NO: 144)MM017 {2- laço)

CAAAAGCTGTGCCTGCCCTTTAGGCCTTTGCCCACCTTGTTTTTGCGTCGACATCACGG (SEQ ID NO: 145)e

ACGCAAAAACAAGGTGGGCAAAGGCCTAAAGGGCAGGCACAGCTTTTGCATGCACTATG (SEQ ID NO: 146)FGFpsI (2° laço)

AAGCTGTATCTGCTGGAACATCGATTCTACACCTTGTTTTTGCGTCGACATCACGG (SEQ ID NO: 147)e

ACGCAAAAACAAGGTGTAGAATCGATGTTCCAGCAGATACAGCTTTTGCATGCACT (SEQ ID NO: 148)FGFps2 (12 laço)

GCGATCAATGCATCTGTACTTGGATTGACAGTACTCCTTGTCGGTGTTCCGATATGCGTC (SEQ ID NO:149)e

GGAACACCGACAAGGAGTACTGTCAATCCAAGTACAGATGCATTGATCGCAACAGGGTTT (SEQ ID NO: 150)FGFps2 (22 laço)

AAGCTGTATCTGCACATGGATCGATAGTACTCCTTG Illll GCGTCGACATCACGG (SEQ ID NO:151)e

ACGCAAAAACAAGGTGTAGAATCGATCCATGTGCAGATACAGCTTTTGCATGCACT (SEQ ID NO:152)

FGFpsB (2- laço)

AAGCTGTATCTGTACATGGATCGATTGGACACCTTGTTTTTGCGTCGACATCACGG (SEQ ID NO:153)e

ACGCAAAAACAAGGTGTCCAATCGATCCATGTACAGATACAGCTTTTGCATGCACT (SEQ ID NO: 154)1A8 (22 laço)

CAAAAGCTGCGCATGTGTTACTACAGATTGGATCGAATG Illll GCGTCGACATCACGG (SEQ ID NO:155)e

ACGCAAAAACATTCGATCCAATCTGTAGTAACACATGCGCAGCTTTTGCATGCACTATG (SEQ ID NO:156)1A12 (22 laço)

CAAAAGCTGTGCCTGCCCAACACTTTGGACTCATATGTG Illll GCGTCGACATCACGGAC (SEQ ID NO:157)e

ACGCAAAAACACATATGAGTCCAAAGTGTTGGGCAGGCACAGCTTTTGCATGCACTATGAC (SEQ ID NO: 158)1E11 (22 laço)

CAAAAGCTGCGCATGTTACTACTCTCAATTCCACCAATGTTTTTGCGTCGACATCACGG (SEQ ID NO:159)e

ACGCAAAAACATTGGTGGAATTGAGAGTAGTAACATGCGCAGCTTTTGCATGCACTATG (SEQ ID NO: 160)TGFpsI (2e laço)

CAAAAG CTGTCTTTGTCCG G A AAACG ATAACGTTTCTCCTTGTAATTG CGTCGACATCACGGACTTCTG (SEQ ID NO: 161)e

TGTCGACGCAATTACAAGGAGAAACGTTATCGTTTTCCGGACAAAGACAGCTTTTGCATGCACTATGAC (SEQ ID NO:162)

As seqüências de DNA dos pares de oligonucleotídeos usados para fazercassetes para introduzir seqüências de peptídeos em laços de sítios reativosa quimotripsina do vetor de expressão p2JM103-lnk2-BBI são providos abai-xo. Os cassetes foram ligados nos sítios de restrição Sph\ e Sal\ no vetor.MM021 (22 laço)

CAAAAGCTGTGCTTGTAAACACAACGTACGTCTTTTATGTTTTTGCG(SEQ ID NO: 163) e

TCGACGCAAAAACATAAAAGACGTACGTTGTGTTTACAAGCACAGCTTTTGCATG (SEQ ID NO: 164)VegT (2e laço)

CAAATCTTGCGCGTGCACACTTTGGAAATCTTACTGGTGTTTTTGCG(SEQ ID NO:165)e

TCGACGCAAAAACACCAGTAAGATTTCCAAAGTGTGCACGCGCAAGATTTGCATG (SEQ ID NO:166)VegK (2- laço)

CAAATCTTGCGCATGTAAATATTACCTTTACTGGTGGTGTTTTTGCG(SEQ ID NO:167)e

TCGACGCAAAAACACCACCAGTAAAGGTAATATTTACATGCGCAAGATTTGCATG (SEQ ID NO: 168)VegKD (22 laço)

C AAATCTTG C ATCTGTAAATATG ATCTTTACTG GTG GTGTTTTTG CG(SEQ ID NO:169)e

TCGACGCAAAAACACCACCAGTAAAGATCATATTTACAGATGCAAGATTTGCATG (SEQ ID NO: 170)VegDK (22 laço)

CAAATCTTGCATCTGTGATTATAAACTTTACTGGTGGTGTTTTTGCG(SEQ ID NO:171)e

TCGACGCAAAAACACCACCAGTAAAGTTTATAATCACAGATGCAAGATTTGCATG (SEQ ID NO: 172)

As bibliotecas feitas de peptídeos limitados em cisteína são rea-gentes populares (por exemplo o kit de bibliotecas de peptídeo de apresen-tação na superfície de fagos PhD-C7C comercialmente disponível, NEB) pa-ra seleção de peptídeos que ligam a substratos de interesse. BBI tem doislaços de sítio reativo limitado em cisteína que são estruturalmente similaresaos laços de peptídeos apresentados em vários métodos usados para sele-cionar Iigantes de peptídeos. Assim, uma vez que um peptídeo de ligaçãolimitado em cisteína foi selecionado, BBI é apropriado para uso como umsuporte "scafold" para apresentar o peptídeo em uma reação de ligação.

O peptídeo de ligação CK37281 (ver por exemplo, pedido depatente US co-pendente, número de série 10/984,270, depositado em 8 deNovembro, 2004, incorporado aqui por referência) foi enxertado em BBI porsubstituição de tripsina , quimotripsina , ou ambos os laços de sítio reativo,com a seqüência de peptídeo (ACYNLYGWTC)(SEQ ID NO:43) usando oscassetes de oligonucleotídeos DNA. Para facilitar a constructo, um sítio E-coRI foi introduzido na região de codificação do gene BBI gene (sintetizadopor encomenda por Operon Technologies; ver, Exemplo 16) entre os laçosde sítio reativos de tripsina e quimotripsina por mutagênese sítio-dirigidaQuikChange®, usando métodos descritos pelo fabricante (Stratagene) usan-do os iniciadores BowBeco-F e BowBeco-R, mostrados acima (0,5 pmol decada iniciador foi usado na reação QuikChange®; após uma etapa de des-naturação inicial de 97°C durante 3 minutos, 18 ciclos PCR de 68°C durante12 minutos, 95°C durante 30 segundos e 55°C durante um minuto, seguidopor uma reação de extensão final durante 15 minutos a 68°C).

Para substituir o laço do peptídeo inibidor de tripsina, dois oligo-nucleotídeos DNA (IBBCK81+ e 1BBCk81-) foram anelados e ligados emsítios de restrição Sacl e EcoRI. Do mesmo modo, para substituir o laço dopeptídeo inibidor de quimotripsina, sítios EcoRI e Sa/I foram usados parainserção de um cassete de DNA feito por anelamento dos oligonucleotídeos(2BBck81+ an 2BBck81-). O peptídeo (ACYNLYGWTC)(SEQ ID NO:43) foienxertado em ambos os laços por inserção do peptídeo no laço de quimo-tripsina (usando os oligonucleotídeos (2BBck81+ an 2BBck81-) após o laçode tripsina ser primeiro substituído pelo peptídeo. BBI com o peptídeo enxer-tado no laço de tripsina (1BBIck81) foi movimentado no vetor de expressãopJM103BBI como um fragmento Sac\-Sph\. BBI com o peptídeo enxertadono laço de quimotripsina (2BBIck81), ou ambos os laços (12BBIck81), foimovimentado em pJM103BBI como os fragmentos Sacl-Sall. As seqüênciascorretas foram verificadas por seqüenciamento de DNA (a seqüência de ge-ne 12BBIck81 é mostrada na Figura 16). Os vetores resultantes, pJM103-1BBIck81, pJM103-2BBIck81, ou pJM103-12BBIck81, foram usados paratransformar BG3934comK de B. subtilis, e a produção das proteínas de fu-são BCE foi determinada como no exemplo 16, acima.

A proteína de fusão fluindo a ~ 44 kDa foi detectada por SDS-PAGE como sendo a proteína principal presente no caldo isento de células.Apesar de que em alguns casos, se tem uma degradação significante (até50 %) da porção BBI (especialmente após > 48 h de crescimento em meioMBD), como observado pela presença de uma proteína proeminente fluindoa ~ 34 kDa correspondendo ao núcleo catalítico BCE103. Nestes casos, ostítulos de BCE103 celulase foram similares aos medidos com fusões para oBBI tipo selvagem (Exemplo 16), mas a atividade de BBI (inibição de tripsinacom 2BBIck81, ou inibição de quimotripsina com 1BBIck81) foi geralmentecerca de duas vezes menor.

Para reduzir a degradação proteolítica de variantes de BBI du-rante o crescimento (isto é, diminuição da quantidade do número de BCE103celulase presente em géis de SDS-PAGE em comparação com a proteína defusão), uma cepa de Bacillus subtilis com nove genes de protease deletados,BG6006 {deg!fy32, oppA, AspollE3501, AaprE1 AnprE, Aepr, AispA, Abpr,AvprAwprA, Ampr-ybjF, AnprB, amyE::xylRPxylAcomK-ermC), foi usada co-mo um hospedeiro de expressão, e a temperatura de crescimento (35 0C) eaeração (200 rpm) foram reduzidas. Com estas mudanças, uma banda deproteína de fusão principal (~ 44 kDa) foi observada em géis SDS-PAGEcom uma banda insignificante presente no peso molecular esperado para aproteína de núcleo catalítico BCE (-34 kDa).

Além do peptídeo acima, vários outros peptídeos limitados emcisteína foram produzidos quando substituídos nos laços do sítio reativo atripsina e/ou quimotripsina de BBI fundido ao C-término de BCE103 celulase.Os exemplos específicos incluíam:

(1) peptídeos projetados ou selecionados como antagonistascomplementos, constatina introduzida nos 12 ou 2- laços de sítio reativo (vi-de, Sahu et al., J. Immunol., 157: 884-891, [1996]), C2c (1s laço), C3c (1-laço), C4c (1S laço) e C5c (1- laço); ou peptídeos selecionados em uma rea-ção de ligação de Fator B 1B, 2B, 4A, 5A, 6-1 A, 7A, 8B, 9A, 10B, 11-1 A,12B, 13A, e 15-1A (todos no 22 laço);

(2) peptídeos projetados para ligar ao Fator Xa de proteases ouquimotripsina de estrato córneo, Xa1 (22 laço) ou hSCC1 (1s laço), respecti-vamente;

(3) peptídeos selecionados em reações de ligação de FGF5 1A6(12 ou 2- laço), 1C2 (12 ou 22 laço), 2E2 (12 ou 22 laço), 2E5 (12, 2S ou ambosos laços), FGFns (12 ou 22 laço), FGFkr (12 ou 22 laço), FGFhI (12 ou 2S Ia-ço), FGFgy (12 ou 22 laço), MM005 (12 ou 22 laço), MM007 (12, 22 ou ambosos laços), MM009 (22 laço), MM010 (12, 22 ou ambos os laços), MM017 (22laço), FGFpsI (22 laço), FGFps2 (12, 22 ou ambos os laços), e FGFpsB (22laço); e

(4) peptídeos selecionados em reações de ligação de TGF3-11A8 (22 laço), 1A12 (22 laço), 1E11 (22 laço), TGFpsI (22 laço), e MM021 (22 laço)

(5) peptídeos selecionados em reações de ligação de VEGFVegK (2e laço), VegT (22 laço), VegKD (22 laço), e VegDK (2â laço),

Os oligonucleotídeos usados para introduzir estes peptídeos emlaços de sítio reativo de tripsina (12 laço) ou quimotripsina (2- laço) e méto-dos usados para enxertar estes peptídeos em BBI, são providos abaixo. Emtodos os casos, as proteínas de fusão foram produzidas como determinadopor géis SDS-PAGE. No entanto, com alguns peptídeos substituídos, aquantidade de proteína de fusão intacta foi aumentada por redução da de-gradação proteolítica como descrito acima para o peptídeo enxertado(ACYNLYGWTC) (SEQ ID NO:43).

EXEMPLO 18

Ativação de BBI por agentes redutores/oxidantes de tiol

Após crescimento, a atividade de BBI (por inibição de tripsina ouquimotripsina) é tipicamente algumas 5-20 vezes menor do que a que seriaesperada da atividade da BCE103 celulase medida nos sobrenadantes isen-tos de células (as duas moléculas devem estar presentes em uma relaçãomolar 1:1 na proteína de fusão). Um aumento na atividade de BBI (medidapor inibição de tripsina ou de quimotripsina) na proteína de fusão BCE103-BBI pode ser obtido por rotina por adição de BME, tipicamente concentra-ções de 1-4 mM adicionadas ao meio de crescimento de MBD cerca de 14 hapós a inoculação. A atividade de inibição de tripsina ou quimotripsina deBBI na proteína de fusão é também menor do que esperado quando peptí-deos de ligação (por exemplo peptídeo de ligação VegF CK37281) substituio laço do sítio reativo tripsina ou quimotripsina, respectivamente. Como como BBI de tipo selvagem, a atividade inibidora pode ser aumentada por trata-mento com BME. Inesperadamente, outros agentes redutores de tiol (porexemplo cisteína, glutationa reduzida, DL-ditiotreitol e Tris[2-carboxietil ] fos-fina) tem poucos ou negligenciáveis efeitos sobre a ativação de BBI duranteo crescimento nestas experiências. Também, adições de antioxidantes (porexemplo, ácido ascórbico ou acetato de DL-a-tocoferol) ou outros adjuvantesao meio de crescimento (por exemplo, isoleucina, óleo de soja, Tween-80),ou crescimento a 30°C não aumentam de modo significante a relação deatividade de BCE103:BBI.Especificamente, para determinar a ativação de BBI durante ocrescimento, culturas de B. subtilis BG6006 transformadas com 2JM103-E3-2BBIck81 (vide, Exemplo 19, abaixo) foram cultivadas em 40 ml de meioMBD frascos de agitação de 250 ml a 37°C durante 13 h. Então, os agentesredutores de tiol, indicados no gráfico na figura 17, foram adicionados e ossobrenadantes de células coletadas após 62 h de crescimento. Os reagentes2-mercaptoetanol (BME), cisteína (Cys), glutationa reduzida (Glut), e DL-ditiotreitol (DTT) foram adicionados ao meio de crescimento nas concentra-ções finais indicadas no gráfico apresentado na Figura 17. Concentraçõesde 5 mM βΜΕ podem resultar em melhores relações de atividade deBCE103:BBI, mas tipicamente resultam em uma diminuição global em am-bos os títulos de BCE103 e BBI (vide, Figura 17), pelo menos parcialmentedevido à redução em crescimento bacteriano causado pelo reagente adicio-nado. Títulos de BCE103 e 2BBIck81 foram determinados usando os testesdescritos em exemplo 16.

A ativação de BBI foi também obtida após purificação parcialdas proteínas de fusão (por exemplo BCE-lnk2-2BBIck81; Ver, Exemplo 19,abaixo) por cromatografia de troca iônica Q-Sepharose.

A proteína de fusão foi purificada a partir de caldo sem célulasobtido dos frascos de agitação ou ciclos do fermentador. O caldo foi filtrado,diluído cinco a dez vezes em água e o pH ajustado a pH 7,5 - 8,0. A amos-tra diluída foi carregada em uma coluna compactada com resina Q-Sepharose (GE Healthcare). A coluna foi lavada com 50 mM Tris pH 7,5 eentão lavada novamente com o mesmo tampão contendo 300 mM NaCI. Aproteína de fusão foi eluída no mesmo tampão com 700 mM NaCI.

Para ativar o BBI, as frações de proteína de fusão reunidas fo-ram diluídas dez vezes em tampão de teste, então tratadas com 2 mM βΜΕe 0,2 mM glutationa oxidada (GSSG) com mistura constante em uma placade agitação ou plataforma oscilante durante cerca de 24 h à temperaturaambiente. O BBI pode ser geralmente ativado a cerca de 70- 100 % da ati-vidade inibidora de tripsina esperada com base na concentração medida daBCE103 celulase. Apesar do método de ativação descrito acima geralmentedar os melhores resultados, em alguns casos, a fim de maximizar a ativaçãode uma dada amostra, triagens foram realizadas em placas de 96 cavidadespara determinar as condições ótimas. Inicialmente, as condições típicas tría-das da diluição em tampão de teste (por exemplo, séries de diluição de 2-50vezes), a concentração de βΜΕ (por exemplo, séries entre 0,5-5 mM) econcentração de glutationa oxidada (por exemplo 0 mM, então uma série de1/20 a 1/2 a concentração de βΜΕ).

A ativação da proteína de fusão BCE-lnk2-2BBIck81 é mostradana Figura 18. Neste exemplo específico, a proteína de fusão de uma purifi-cação Q-Sepharose foi diluída em 1:10 em PBS de Dulbecco (Mediatech)com 0,005 % TWEEN®-80. Beta-mercaptoetanol foi adicionado a uma con-centração final de 3 mM e incubado durante a noite em temperatura ambien-te em um girador. A amostra foi ainda incubada à temperatura ambiente du-rante cerca de 60 h com agitação vigorosa em uma placa de agitação mag-nética. Os títulos de BCE103 e 2BBIck81 (antes e após tratamento comβΜΕ) foram determinados por testes de celulase e testes inibidores de trip-sina, respectivamente.

Em algumas modalidades, como para ativação de BBI ou deseus variantes em caldo isento de células de fermentações de volume gran-de, é desejável reduzir a diluição e concentração de βΜΕ na reação de ati-vação. Isto pode ser obtido usando concentrações maiores de tampão (500mM Tris pH 8,6), ou mudando para tampões zwitteriônicos, como CHES(também CAPS, Tricine, TAPS, e outros tampões zwitteriônicos apropria-dos). For exemplo, o caldo isento de células (ou frações de proteína de fu-são purificadas por cromatografia de troca tônica) foi diluído 1:1 em 375 mMCHES pH 8,6 com 0,005 % TWEEN®-80, então ativado com 1 mM βΜΕ e10 mM Na2SO3 e incubado com agitação em temperatura ambiente durantecerca de 24 h. BBI ou seus variantes, como proteínas de fusão BCE103 ce-lulase, foram ativados por rotina por este método a 70 - 100 % do valor es-perado (com base em atividades de BCE103 celulase).

Em algumas outras modalidades, é desejável ativar BBI ou seusvariantes no caldo de fermentação completo com as células presentes. Porexemplo, em alguns experimentos, caldo total foi diluído 1:1 em 250 mM gli-cina pH 9,0 com 0,05 % TWEEN®-80, e então ativado com 2 mM βΜΕ e 10mM Na2SO3 (ou com 10 mM Na2S2O4 sozinho) e incubado com agitação emtemperatura ambiente durante cerca de 24 h. BBI ou seus variantes, comoproteínas de fusão BCE103 celulase, foram ativados por rotina por este mé-todo a 30 - 100 % do valor esperado (com base em atividades de BCE103celulase).

EXEMPLO 19

Liberação de BBI livre/variantes por clivaqem das proteínas de fusãoBCE103-BBI

Este Exemplo descreve experimentos desenvolvidos para liberarBBI livre ou seus variantes por clivagem das proteínas de fusão BCE103-BBI.

As seqüências dos pares de DNA oligonucleotídeos que foramanelados e ligados em sítios BamHI e Sacl de pJM103-BBI para gerar sítiosde clivagem em potencial durante o crescimento de culturas entre o domíniocatalítico BCE103 e BBI são providos abaixo.

BCEsubBBI (uma seqüência de peptídeos sensível a tipo subtilisina)GATCCAGGTGGAGCTGCTTTAGTTGACGATGAGAGCT (SEQ ID NO: 173)e

CTCATCGTCAACTAAAGCAGCTCCACCTG (SEQ ID NO:174)BCEcbdLBBI (a porção do 12 CBD)

GATCCAGGTGAACCTGACCCAACTCCTCCATCTGATCCTGGAGAATACCCAGCTTGGGACGATGAGAGCT (SEQ ID NO: 175)e

CTCATCGTCCCAAGCTGGGTATTCTCCAGGATCAGATGGAGGAGTTGGGTCAGGTTCACCTG (SEQ ID NO:176)BCEproBBI (o pró-peptídeo completo de BBI)

GATCCGGCGAACCTGCGTCTGTCTAAGCTTGGCCTGCTTATGAAATCAGACCATCAGCACAGCAATGACGATGAGAGCT (SEQ ID NO: 177)e

CTC ATCGTC ATTG CTGTGCTG ATG GTCTG ATTTC ATAAG C AG GCC AAGCTTAGACAGACGCAGGTTCGCCG (SEQ ID NO: 178)BCEshortproBBI (uma porção C-terminal do pró-peptídeo de BBI)GATCCAAAATCAGACCATCAGCACAGCAATGACGATGAGAGCT (SEQ IDNO: 179)

e

CTCATCGTCATTGCTGTGCTGATGGTCTGATTTTG (SEQ ID NO: 180)As seqüências do par de DNA oligonucleotídeo que foi anelado e ligado nossítios BamVW e Sacl de p2JM103-BBI para fundir BBI no 2Ô Iigante CBD deBCE103 celulase são dadas abaixo.

BCEcbdDBBI

GATCCAGGAGAACCGGACCCAACGCCCCCAAGTGATCCAGGAGAGTATCC AG C ATG G G ATTC AA ATC AA ATTTACAC A AATG AAATTGTGTATC ATAACGGTCAGTTATGGCAAGCGAAATGGTGGACACAAAATCAAGAGCCAGGTGACCCATACGGTCCGTGGGAACCACTCAAATCTGACCCAGATTCAGACGATGAGAGCT (SEQ ID NO:181)e

CTCATCGTCTGAATCTGGGTCAGATTTGAGTGGTTCCCACGGACCGTATGGGTCACCTGGCTCTTGATTTTGTGTCCACCATTTCGCTTGCCATAACTGACCGTTATGATACACAATTTCATTTGTGTAAATTTGATTTGAATCCCATGCTG G ATACTCTCCTG G ATC ACTTG G G G GCGTTG G GTCCGGTTCTCCTG(SEQ ID NO:182)

As seqüências de peptídeo susceptíveis à clivagem de ácidoentre resíduos de ácido aspártico e prolina são dadas abaixo.Liaante 1 - WGDPHY (SEQ ID NO:183)(Lidell et ai, J. Biol. Chem.278:13944-51 [2003])

Liqante 2 - DNNDPI (SEQ ID NO:184)(Segalas et ai, FEBS Lett., 371:171-175 [1995])

Ligante 3 - VVADPN (SEQ ID NO:185)(Kemperman et ai, Appl. Env. Micro-biol., 69:1589-1597 [2003])

Os iniciadores de oligonucleotídeos usados para introduzir umsítio SssHII em pJM103BBI por mutagênese sítio-dirigida QuikChange® sãodados abaixo.BCEbss-F

5'-TGGCGTTCAGCAACATGAGCGCGCAGGCTGATGATTA (SEQ ID NO:186)BCEbss-R

5'-TAATCATCAGCCTGCGCGCTCATGTTGCTGAACGCCA (SEQ ID NO:187)

Seqüências dos DNA oligonucleotídeos que foram aneladoscomo um cassete (Sal\-Hind\\\) para introduzir sítios H/ndlll e Xho\ após ocódon de laço de BBI1 para introduzir um sítio Pacl após o LAT, e remover osítio Hind\\\ original são dadas abaixo.

BCEterm+

5'-GACATCACGGACTTCTGCTATGAGCCATGTAAACCAAG

CGAGGACGATAAAGAGAACTAAAAGCTTAACTCGAGGTTAACAGAGGACGGATTTCCTGAAGGAAATCCG I I I I I I I Al I I I IAAHAAG (SEQ ID NO:188)BCEterm-

5'-AGCTCTTAATTAAAAATAAAAAAACGGATTTCCTTCAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACCTCGAGTTAAGCTTTTAGTTCTCTTTATCGTCCTCGCTTGGTTTACATGGCTCATAGCAGAAGTCCGTGATG (SEQ ID NO: 189)

Iniciadores PCR usados para gerar os Iigantes lábeis em ácidoaqui providos acima (isto é, Ligante 1, Ligante 2, e Ligante 3) inseridos entreo domínio catalítico BCE103 e BBI são dados abaixo.BCE103coreBssHII_FW

5'-CAGCAACATGAGCGCGCAGGCTG (SEQ ID N0:190)IinkerWG DPH Y_R V

5'-ATCGTCTGGATCCGGATAGTGGGGGTCTCCCCAAGATGCTGATTCTCTTA Illlll CCC (SEQ ID NO:191)IinkerDNNDPLRV

5' -ATCGTCTG G ATCCG GTATG G G ATC ATTGTTGTC AG ATGCTGATTCTCTTATTTTTTCCC (SEQ ID NO:192)linkerVVADPN_RV

5'-ATCGTCTGGATCCGGGTTGGGATCTGCAACTACAGATGCTGATTCTCTTA Illlll CCC (SEQ ID NO: 193)

Os iniciadores PCR usados para gerar os Iigantes lábeis em á-cido providos acima, (isto é, Ligante 1, Ligante 2, e Ligante 3) inseridos no 12ligante CBD.

BCE103corePstl_FW

GCATAAGGAT GAGTCATCTG CAGCG (SEQ ID NO: 194)LplusWGDPHY_RV

5'-ATCGTCTGGATCCGGATAGTGGGGGTCTCCCCACGGTTCTCCTGGATCAGATGGCGG (SEQ ID NO: 195)LplusDNNDPLRV

5'-ATCGTCTGGATCCGGTATGGGATCATTGTTGTCCGGTTCTCCTGGATCAGATGGCGG (SEQ ID NO: 196)LplusVVADPN_RV

5'-ATCGTCTGGATCCGGGTTGGGATCTGCAACTACCGGTTCTCCTGGATCAGATGGCGG (SEQ ID NO: 197)

A seqüência de proteína dos Iigantes lábeis em ácido inseridosentre o domínio catalítico BCE103 e BBI é apresentada abaixo. Os Iiganteslábeis em ácido são mostrados em tipo em negrito e as seqüências do pri-meiro domínio CBD são sublinhadas.

Liqante 1

BCE-WGDPHY-PDP-BBI (SEQ ID NO: 198)

Liqante 2

BCE-DNNDPI-PDP-BBI (SEQ ID NO:199)

Liqante 3

BCE-VVADPN-PDP-BBI (SEQ ID N0:200)LinkerPIus 1

BCE-IPPSDPTPPSDPGEP-WGDPHY-PDP-BBI (SEQ ID N0:201)LinkerPIus 2

BCE-IPPSDPTPPSDPGEP-DNNDPI-PDP-BBI (SEQ ID N0:202)LinkerPIus 3

BCE-IPPSDPTPPSDPGEP-VVADPN-PDP-BBI (SEQ ID N0:203)

As seqüências dos pares de DNA oligonucleotídeos que foramaneladas e ligadas nos sítios SamHI e Sacl de pJM103-BBI para gerar sítiosde clivagem potenciais entre o domínio catalítico de BCE103 e BBI durante oprocesso de purificação são dadas abaixo.BCEentBBI (sítio de clivagem de Enteropeptidase)GATCCAGGTGGAGACGACGATGACAAAGACGATGAGAGCT (SEQ IDN0:204)e

CTCATCGTCTTTGTCATCGTCGTCTCCACCTG (SEQ ID N0:205)BCEgenenIBBI (sítio de clivagem de Genenase I)GATCCAGGTGCTGCTCATTACGACGATGAGAGCT (SEQ ID N0:206)e

CTCATCGTCGTAATGAGCAGCACCTG (SEQ ID N0:207)

As seqüências dos pares de DNA oligonucleotídeos que foramaneladas e ligadas nos sítios BamHI e Sacl de pJM103-lnk2-1BBIck81 paragerar sítios de clivagem em potencial entre o domínio catalítico BCE103 eBBI durante o processo de purificação são dadas abaixo.

BCEfurinBBI (sítio de clivagem de Furin/Blisterase)GATCCACGTGCTAAAAGAGACGATGAGAGCT (SEQ ID N0:208)e

CTCATCGTCTCTTTTAGCACGTG (SEQ ID N0:209)BCEgenen2BBI (sítio de clivagem de Genenase I)GATCCAGGCGCTGCACACTACAACGACGATGAGAGCT (SEQ ID NO:210)

e

CTCATCGTCGTTGTAGTGTGCAGCGCCTG (SEQ ID NO:211)BCEfIeBBI (sítio de clivagem de Mpr)GATCCATTCCTTGAAGACGATGAGAGCT (SEQ ID NO:212)e

CTCATCGTCTTCAAGGAATG (SEQ ID NO:213)

Seqüências dos pares de iniciadores de oligonucleotídeos usa-dos para introduzir os Iigantes E e E3 em Ligante 2 por mutagênese sítio-dirigida QuikChange (Stratagene) são dadas abaixo.BCE-EInk-BBI (sítio de clivagem Mpr)

CCCATACCGGAGCCAGACGATGAGAGCTC (SEQ ID NO:214)eCATCGTCTGGCTCCGGTATGGGATCATTGTTG (SEQ ID NO:215)

A seqüência de proteína do Iigante E3 entre o domínio catalíticode BCE103 e BBI foi DNNDPIPEPDDESFNMPIPEP (SEQ ID NO:216). Nes-ta seqüência, o Ligante E é sublinhado e a seqüência gerada pela recombi-nação imperfeita em E. coli é mostrada em tipo negrito. A clivagem por Mpr(ou protease V8) pode ocorrer após qualquer um dos três ácidos glutâmicospresentes no Ligante E3. Assim, a estrutura foi BCE-(SEC) ID NO:216)-BBI.

As seqüências do pares de DNA oligonucleotídeos que foramaneladas e ligadas nos sítios BamHl e Sad de p2JM103-lnk2-2BBIck81 paragerar sítios de clivagem em potencial de Genenase I entre o domínio catalíti-co de BCE103 e BBI são dadas abaixo.BCEgenen3BBI

GATCCAGGCGCTGCACACTACAAATCAGACCATCAGCACAGCAATGACGATGAGAGCT (SEQ ID NO:217)

e

CTCATCGTCATTGCTGTGCTGATGGTCTGATTTGTAGTGTGCAGCGCCTG (SEQ ID NO:218)

BCEgenen4BBI

GATCCAGGCGCTGCACACTACGTAGAATTTCAAGACGATGAGAGCT(SEQ ID NO:219)e

CTCATCGTCTTGAAATTCTACGTAGTGTGCAGCGCCTG (SEQ ID N0:220)

A seqüência de proteína de um sítio de clivagem sensível a Ge-nenase I (também sensível a ácido e Mpr) inserida entre o domínio catalíticoBCEl03 e BBI foi DNNDPIPDPGAAHYVEFQ (SEQ ID NO:221). O sítio deGenenase I (Ligante Gen4) está em negrito (a clivagem ocorre entre tirosinae valina) (NEB) e Ligante 2 é sublinhado. A clivagem por Mpr também podeocorrer após o ácido glutâmico que se a valina no ligante de Gen4. A se-qüência usada aqui foi BCE-SEQ ID NO:221)-BBI.

Os sítios de clivagem na proteína de fusão BCE103-lnk2-2BBIck81 são indicados abaixo. Os sete aminoácidos C-terminais do domí-nio catalítico de BCE103 (sublinhado), seqüência de ligante 2 (tipo negrito),e seqüências 2BBIck81 são mostrados. As ligações Asp-Pro lábeis em áci-do/calor são indicadas com setas de ponta sólida e as ligações sensíveis a

Mpr após os ácidos glutâmicos são indicadas com setas de ponta de linha.

ψ i + \|/...KKESASDNNDPIPDPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCFCVDITDFCYEPCKPSEDDKEN (SEQ ID NO:222)ou suas variantes, a metade BBI necessita ser clivada da proteína de fusãoBCE103BBI.

Em algumas modalidades, isto é, obtido durante o crescimento,por proteases intrinsecamente produzidas por B. subtilis. Em algumas moda-lidades alternativas, esta clivagem ocorre após o crescimento, durante oprocesso de purificação (por exemplo por ácido /calor ou clivagem proteolíti-ca). Os Iigantes potencialmente susceptíveis à clivagem durante o cresci-mento foram projetados (vide, acima, sub, cbdL, pro, shortpro, e cbdD) eclonados em vetores de expressão pJM103BBI ou p2JM103BBI como oscassetes SamHI-SacI. A produção de proteína de fusão versus domínio ca-talítico BCE103 foi analisada em géis SDS-PAGE como descrito em exemplo 16.

Uma pequena clivagem da proteína de fusão foi observada paratodos os ligantes, exceto para o pró-ligante, que foi quase completamenteclivado de modo que uma proteína de fusão intacta, muito pequena, foi ob-servada em géis, apesar de se ter uma grande correspondendo ao núcleocatalítico BCE103. Infelizmente, esta clivagem durante o crescimento resul-tou em atividade negligenciável de BBI medida em sobrenadantes isentos decélulas e nenhum BBI pode ser identificado em géis SDS-PAGE. Apesar nãose pretender que a presente invenção seja limitada a um mecanismo ou teo-ria em particular, é possível que o BBI seja particularmente sensível à de-gradação proteolítica em sua forma inativa. Assim, clivagem durante o pro-cesso de purificação após ativação é geralmente preferido.

Em algumas modalidades, as ligações entre os resíduos de áci-do aspártico e prolina são clivados por tratamento térmico em um pH ácido,como é bem-conhecido na técnica (ver por exemplo, Landon, Meth. Enzy-mol., 47:145-149 [1977]). O 12 Iigante de CBD em BCE103 celulase tem trêsseqüências Asp-Pro dipeptídeo (vide, Figura 14) com o potencial a ser cliva-do por tratamento ácido/ calor. No entanto, a clivagem por tratamento ácido/calor nestes sítios foi verificada como sendo ineficaz. As seqüências de pro-teína que são especialmente lábeis para ácido/ calor foram descritas na lite-ratura, três destas seqüências são WGDPHY (SEQ ID NO:183), DNNDPI(SEQ ID NO:184), e VVADPN (SEQ ID NO:185)(isto é, Ligantes 1, 2 e 3).

Antes destes Iigantes lábeis em ácido serem introduzidos novetor de expressão BCE103-BBI, pJM103BBI, um sítio BssHII foi introduzidopor mutagênese QuikChange® XL (Stratagene) (usando os métodos do fa-bricante; e descritos no exemplo 17 acima, exceto etapas de extensão de 8minutos e desnaturação de 1 minuto foram usadas), na região de codificaçãode seqüência de sinal aprE usando os iniciadores de oligonucleotídeosBCEbss-F e BCEbss-R (providos acima). Então, sítios H/ndlll e Xho\ foraminseridos em frente do terminador LAT (após o códon de parada BBI) e umsítio Pacl foi adicionado após o terminador (o sítio H/ndlll original após oterminador LAT foi removido) por inserção de um cassete de oligonucleotí-deo (BCEterm+ e BCEterm-; provido acima) nos sítios Sa/I e Hinó\\\ original.Este novo vetor é chamado "p2JM103BBI."

Os fragmentos de Iigante lábil em ácido foram gerados por PCR1usando iniciador dianteiro BCE103coreBssHII_FW com cada um dos inicia-dores reversos, Iigante WGDPHY_RV (SEQ ID NO: 191), Iigante DNND-PI_RV (SEQ ID NO:192), ou Iigante VVADPN_RV (SEQ ID NO: 193) ep2JM103BBI como o gabarito (vide, Exemplo 16, para o protocolo PCR). Osfragmentos PCR de 970 bp foram digeridos com BamHi e Psfl, os fragmen-tos 154 bp codificando os fragmentos do Iigante de ácido foram isolados deum gel agarose após eletroforese, e ligados no vetor p2JM103 digeridos comSamHI e Ps/l que também foram purificados de um gel. As seqüências deIigante nos vetores de expressão finais, p2JM103lnk1-BBI, p2JM103lnk2-BBIe p2JM103lnk3-BBI, foram verificadas por seqüenciamento de DNA.

B. subtilis competente, cepas BG3934comK ou BG6006 foramtransformados com os plasmídeos, colônias selecionada em placas de 5pg/ml cloranfenicol LA e amplificados a 25Mg/ml cloranfenicol como descritono exemplo 16.

Similarmente, os ligados lábeis em ácido foram inseridos noprimeiro Iigante de CBD. Especificamente, os fragmentos de PCR foram ge-rados usando o iniciador dianteiro BCE103corePstl_FW (SEQ ID NO: 194)com os iniciadores reversos LplusWGDPHY_RV (SEQ ID NO:195), L-plusDNNDPLRV (SEQ ID NO:196), ou LplusVVADPN_RV (SEQ ID NO:197)com p2JM103BBI como um gabarito. Os fragmentos de PCR de cerca de150 bp foram digeridos com BamH\ e Psfl, purificados e ligados no vetorp2JM103BBI digerido com SamHI e PstI. As seqüências corretas foram veri-ficadas por seqüenciamento de DNA e os plasmídeos p2JM103pllnk1-BBI,p2JM103pllnk2-BBI e p2JM103pllnk3-BBI foram usados para transformar ascepas de B. subtilis como descrito acima.

Após crescimento em meio MBD, as proteínas de fusão forampurificadas por cromatografia de troca iônica essencialmente como descritoacima (vide, Exemplo 17). A proteína de fusão foi clivada por tratamento a55°C durante 16 h em 10% ácido fórmico. O domínio catalítico BCE103 pre-cipitado durante o tratamento com ácido foi removido por centrifugação. OBBI livre no sobrenadante foi secado durante a noite em um SpeedVac. Aamostra foi colocada em suspensão em 50 mM Tris pH 8 antes de carregarno gel SDS-PAGE. Por análise dos géis SDS-PAGE coloridos com proteína,observou-se que a clivagem com ácido foi bem mais eficiente nas proteínasde fusão onde o Ligante 2 foi inserido entre o domínio catalítico BCE103 eBBI (BCE-DNNDPI-PDP-BBI; SEQ ID NO:199). Este Iigante foi verificadocomo sendo clivado em um par de horas a 75°C em 20 mM glicina pH 2.

Em modalidades alternativas, a proteína de fusão foi clivada portratamento com uma protease durante o processo de purificação. Ligantesforam projetados com sítios de clivagem para ácido glutâmico, proteasesespecíficas (por exemplo, Mpr ou V8 protease), furina/blisterase, genenase I,e enteropeptidase (enteroquinase). Estes Iigantes foram introduzidos comocassetes de oligonucleotídeos (vide acima, para as seqüências) entre o nú-cleo catalítico BCE103 e BBI no vetor de expressão usando os sítios BamHIe Sacl (vide, Figura 14). Na região de codificação do vetor de expressão ori-ginal (pJM103BBI), se tem um resíduo de ácido glutâmico no 1- domínio deCBD e um terceiro resíduo em BBI (vide, Figura 14), que é contemplado pa-ra ser susceptível à clivagem por proteases específicas para ácido glutâmicocomo B. subtilis Mpr (BsMpr) ou V8 protease. No entanto, nem BsMpr nemV8 proteases foram verificadas como clivando a proteína de fusão BCE-BBIde modo muito eficaz nestes sítios. Assim, foi necessário projetar outros Ii-gantes que foram susceptíveis à clivagem por estas proteases.

Os seis Iigantes lábeis em ácido descritos acima foram testadospara clivagem por BsMpr. Estas proteínas de fusão foram clivadas por tra-tamento durante 16 h com 16 pg de BsMpr à temperatura ambiente. Apósclivagem, o domínio catalítico BCE103 foi precipitado pela adição de ácidofórmico a 10 % e removido por centrifugação. O BBI livre no sobrenadantefoi secado durante a noite em um SpeedVac. A amostra foi colocada emsuspensão em 50 mM Tris pH 8, antes de carga no SDS-PAGE. Similar àclivagem de ácido, a proteína de fusão BCE-DNNDPI-PDP-BBI (Ligante 2;SEQ ID NO:199) foi clivada de modo bem mais eficiente para BsMpr do quepara qualquer um dos outros ligantes. Assim, BBI e seus variantes foramverificados como sendo eficazmente liberados da proteína de fusão BCE-DNNDPI-PDP-BBI (SEQ ID NO:199) ou por tratamento ácido/ calor ou diges-tão proteolítica com uma protease específica para ácido glutâmico, comoBsMpr. Vários outros ligantes projetados para clivagem por Mpr (por exem-plo, E, ligante E3, e fie, providos acima) foram testados, mas nenhum dosmesmos tinha quaisquer vantagens sobre Ligante 2 (o ligante E3 foi geradopor uma recombinação defeituosa em E. coli após transformação com a rea-ção de mutagênese sítio-dirigida QuikChange® projetada para construir oligante E). Como mostrado acima, existem dois sítios de clivagem lábeis áci-do/calor no Ligante 2 e três sítios sensíveis à clivagem por Mpr.

Os ligantes projetados para clivagem por furina ou blisterase(NEB) (BCEfurinBBI), ou enteropeptidase (enteroquinase, NEB) (BCEentB-Bl) foram testados, mas nenhuma destas seqüências foi clivada de modoeficaz para a protease apropriada. Quatro ligantes foram também projetados(BCEgenenIBBI, BCEgenen2BBI, BCEgenen3BBI, e BCEgenen4BBI) e tes-tados para clivagem por genenase I (NEB). Clivagem efetiva da proteína defusão foi observada somente com o Iigante de Gen4 (BCEgenen4BBI). BsM-pr foi também verificado para clivar de modo eficaz o Iigante Gen4.

Após ativação da proteína de fusão BCE-lnk2-2BBIck81 purifi-cada, a clivagem por BsMpr não chega até completar, como julgado por géisSDS-PAGE. No entanto, foi descoberto que a clivagem completa após ativa-ção de proteínas de fusão BCE-BBI com Ligante 2 (ou o Iigante Gen4) podeser obtida por uso de Mpr protease isolada de Bacillus Iicheniformis (BIMpr).Apesar de não se pretender que a presente invenção seja limitada a qual-quer mecanismo em particular, a clivagem após o terceiro aminoácido emBBI maduro, parece ser mais sensível a BIMpr enquanto a clivagem após osexto aminoácido do C-térmico de BBI é mais sensível à clivagem de BsMpr.

Em algumas modalidades, após a clivagem, o BBI é purificadodo domínio catalítico BCE103 por precipitação de ácido seletiva (pH 3 oumenor) do domínio catalítico BCE103, como descrito acima, cromatografiade troca iônica (vide, Exemplo 20), ou por ligação seletiva de BBI em umacoluna de anidrotripsina -agarose (Sigma) carregada em 50 mM Tris pH 8,0,lavada com 50 mM Tris pH 8,0 com 150 mM NaCI, então eluindo BBI ligadocom 50 mM glicina pH 2,2 com 300 mM NaCI).

EXEMPLO 20

Ligação de BBIck81 em VeaF

Neste Exemplo, experimentos conduzidos para avaliar a ligaçãode BBIck81 em VegF são descritos. A proteína de fusão BCE103-lnk2-2BBIck81 foi produzida em B. subtilis como descrito em exemplo 17. A prote-ína de fusão foi purificada, e a atividade inibidora de tripsina BBI foi aumen-tada por tratamento com βΜΕ e glutationa oxidada, como descrito em exem-plo 18. A proteína de fusão foi clivada por BsMpr protease (vide, Exemplo19) e o 2BBIck81 livre foi purificado do domínio catalítico BCE103 por cro-matografia de troca iônica usando uma coluna Q-Sepharose.

Brevemente, após clivagem, o pH da amostra clivada foi ajusta-do a 5,5, a amostra foi então carregada sobre a coluna (equilibrada com 25mM MES pH 5,5). O 2BBIck81 livre foi lavado através da coluna usando 25mM acetato de sódio pH 5,0, enquanto o núcleo catalítico de BCE103 per-maneceu ligado à resina. A fração de 2BBIck81 foi concentrada por ultrafil-tração e analisada usando um teste de ligação à base de eletroquimiolumi-nescência (ECL) (BioVeris). Os anticorpos anti-VegF (Santa Cruz) e VegF(PeproTech) foram rotulados com o corante de eletroquimioluminescência ebiotina, respectivamente, como descrito pelo fabricante (BioVeris). Todos osmateriais eram PBS de Dulbecco (Mediatech) suplementados com 0,1 %TWEEN®-80. Uma série de diluição inicial de anticorpo anti-VegF (125, 250e 500 ng/ml) e VegF (100, 150, 200 e 250 ng/ml) foi testada no teste de liga-ção para determinar as concentrações de cada que iriam dar um sinal ECLrobusto.

Para testar a ligação de 2BBIck81, 50 pL de 500 ng/ml anticorpoanti-VegF rotulado com ECL, 50 pL de 250 ng/ml VegF biotinilado e 100 pL2BBIck81 (série de 12,5, 15, 31,25, 62,5, 125, 250 ou 500 ng/ml) foram incu-bados em temperatura ambiente durante 2 h com agitação. Então, 50 pL de0,2 mg/ml de contas revestidas com estreptavidina foram adicionadas e areação foi incubada a temperatura ambiente durante 30 minutos. O sinal deECL foi medido usando um analisador BioVeris M8/384 como descrito pelofabricante (BioVeris). Como mostrado em Figura 19, o sinal ECL diminuiucomo as concentrações crescentes de 2BBIck81 deslocaram mais do anti-corpo anti-VegF rotulado ligado a VegF fixado nas contas magnéticas.

Assim, o peptídeo CK37281 quando enxertado sobre o laço ini-bidor de quimotripsina de BBI (2BBIck81) competiu com o anticorpo anti-VegF para ligação a VegF em concentrações micromolares. De fato,2BBIck81 competiu para a ligação de VegF bem melhor do que o própriopeptídeo CK37281 sintetizado (vide, Figura 19). O peptídeo CK37281 inseri-do no laço inibidor de tripsina, 1BBIck81, também competiu com o anticorpoanti-VegF no teste BioVeris. Assim, BBI foi verificado como sendo utilizávelcomo parte de um esqueletopara apresentar peptídeos de ligação ativos se-lecionados por vários métodos de triagem.EXEMPLO 21

Uso de Parceiros de Fusão Alternativos para a Produção de 2BBIck81

Neste Exemplo, experimentos conduzidos para avaliar parceirosde fusão alternativos são descritos. A seqüência de DNA dos iniciadores deoligonucleotídeos usados para amplificar o gene dsbC (E. coli) de pET-40b(+) é dada abaixo. Estes iniciadores geram um sítio SssHII na extremi-dade 5' e um SamHI na extremidade 3' para clonagem em p2JM103-Gen4-2BBIck81.

DsbCBBI-F

AACATGAGCGCGCAGGCTGATGACGCGGCAATTCAACAAACGTTAG(SEQ ID NO:223)DsbCBBI-R

TCGTCTGGATCCGGTATGGGATCATTGTTGTCACCAGAACCACTAGTTGATCCTTTACCGCTGGTCATTTTTTGGTG (SEQ ID NO:224)

As seqüências de DNA dos oligonucleotídeos que foram anela-dos juntos para fazer um cassete (Alw44\-BamH\) para fusão do gene cuti-nase de P. mendocina em BBI com Ligante 2, são dadas abaixo.

CutinaseBBI+

TGCACTTCTCTGCTTTGGTCTGTTGAACGCAGAGGTCTTGACAACAATGATCCTATTCCG (SEQ ID NO:225)

CutinaseBBI-

GATCCGGAATAGGATCATTGTTGTCAAGACCTCTGCGTTCAACAGACCAAAGCAGAGAAG (SEQ ID NO:226)

Devido à porção de BBI ter sete ligações dissulfeto, contempla-se que títulos maiores de BBI ativo seriam obtidos usando proteínas de fu-são diferentes das do domínio catalítico de BCE103 celulase. For exemplo,em algumas modalidades, composições como tiol-dissulfeto oxidoreductasese/ou proteína dissulfeto isomerases encontram uso como proteínas de fusãopara ajudar a produzir porções de BBI corretamente duplicadas. Nesta mo·dalidade, não é necessária nenhuma etapa de ativação adicionado sob amaior parte das circunstâncias. Em modalidades adicionais, outras proteínasproduzidas em títulos elevados em S. subtilis também encontra uso comoparceiros de fusão. Por exemplo, a proteína termoestável dissulfeto isome-rase do fungo Humicola insolens (hiPDI) foi usada como um parceiro de fu-são para produzir a cadeia leve de imunoglobulina G (2 dissulfetos) em Ba-cillus brevis (vide, Kajino et ai, Appl. Env. Microbiol., 66:638-642 [2000]).

Para determinar se hiPDI pode ser um melhor parceiro de fusãodo que BCE103 para a produção de BBI, este gene hiPDI foi sintetizado(DNA2,0) e clonado no vetor de expressão, p2JM103-lnk2-2BBIck81 (vide,Exemplo 19) como um fragmento SssHII- Saci. Ao projetar o gene sintético,códons ocorrendo com elevada freqüência em genes de B. subtilis altamenteexpressados foram selecionados exceto em casos onde os sítios de restri-ção foram introduzidos ou deletados. Na constructo final, o N-término do ge-ne hiPDI maduro foi fundido na seqüência de sinal AprE e o C-término foifundido a um Iigante com um sítio de clivagem de Enteropeptidase (Kajino etai, Appl. Env. Microbiol., 66:638-642 [2000]), que, por sua vez, foi fundido a2BBIck81 (vide, Figura 20). Este vetor de expressão, p2JM-PDI-EK-2BBIck81, foi usado para transformar B. subtilis BG6006 e a produção daproteína de fusão foi determinada em meio MBD (como descrito no exemplo16) com ou sem 2 mM βΜΕ adicionado 14 h após inoculação.

Como determinado por géis SDS-PAGE, a produção da proteínade fusão PDI-2BBIck81 foi tipicamente um pouco menor do que a de BCE-2BBck81 cultivada sob condições idênticas. Os títulos de BBI (ínibição detripsina) medidos dos sobrenadantes isentos de células PDI-2BBIck81 foramtambém tipicamente menores do que a fusão BCE-2BBIck81. Como com asfusões a BCE103, as atividades medidas de BBI quando fundido a PDI fo-ram maiores quando cultivado em 2 mM βΜΕ e a atividade de BBI foi au-mentada pela adição de βΜΕ aos sobrenadantes isentos de células após ocrescimento quando cultivados em meio isento de βΜΕ (como descrito emexemplo 18). Assim, a atividade de tiol-dissulfeto oxidoreductase de PDI nãoparece aumentar significativamente os títulos de 2BBIck81 ativo na proteínade fusão ou eliminar a necessidade para a ativação da molécula de BBI.

A fim de aumentar a redução em potencial da proteína de fusão,que foi contemplada para melhorar os títulos de BBI durante o crescimento,DsbC de Escherichia coli foi usado como um parceiro de fusão para2BBIck81. O gene dsbC foi amplificado por PCR usando Herculase Enhan-ced DNA polymerase como descrito pelo fabricante (Stratagene) usandoDsbCBBI-F e DsbCBBI-R como iniciadores (seqüências mostradas acima) epET-40b(+) (Novagen) como um gabarito. O fragmento de PCR isolado foiclonado no vetor p2JM103-Gen4-2BBIck81 (vide, Exemplo 19) como umfragmento SssHIl-fíamHI. A seqüência correta do gene de fusão foi verifica-da por seqüenciamento de DNA. Neste caso, os títulos da proteína de fusãoDsbC-2BBIck81 foram significantemente menores do que da proteína defusão BCE-2BBIck81 como julgado em géis SDS-PAGE e os títulos do2BBIck81 ativo medidos por inibição de tripsina foram também bem menores.

Outras proteínas que são produzidas em títulos elevados em B.subtilis encontram uso como parceiros de fusão para a produção de BBI.

Uma tal proteína é a cutinase de Pseudomonas mendocina, que foi expres-sada em títulos elevados utilizando o promotor aprE de B. subtilis (ver porexemplo, Pat. U.S. N2 5.429.950, incorporado aqui por referência). A fusãodo gene aprE-cutinase como um fragmento EcoR\-Alw44\ (de pAK-15) foiligada com cassete de oligonucleotídeo de Iigante Alw44\-BamH\ (vide, se-qüência acima) no p2JM103-lnk2-2BBIck81 (vide, Exemplo 19) que foi cor-tado com EcoRI e BarriHl Este vetor de expressão cutinase-ligante 2-2BBIck81 (vide, Figura 21 para a seqüência EcoRI-BamHI aprE-cutinase-ligante 2) foi usado para transformar as células de B. subtilis BG6006 e aproteína de fusão foi produzida em meio MBD como descrito previamentepara as outras proteínas de fusão (vide, Exemplo 16). Neste caso, a proteínade fusão cutinase-ligante 2-2BBIck81 não foi a banda principal observadaem géis SDS-PAGE e os títulos de lípase medidos (como medidos usandoos métodos providos em patente US 5 429 950) e os títulos de BBI forambem menores (cerca de 20 vezes) do que o encontrado com a proteína defusão BCE-2BBIck81. Também os títulos de BBI na proteína de fusão cuti-nase não foram melhorados de modo significante quando 3 mM βΜΕ foi adi-cionado ao meio de crescimento. Assim, os maiores títulos de 2BBIck81 ati-vo foram consistentemente obtidos por ativação da proteína de fusão BCE-2BBIck81. Mesmo assim, é contemplado que vários parceiros de fusão irãoencontrar uso na presente invenção.

Os versados na técnica irão prontamente notar que a presenteinvenção é bem adaptada para realizar os objetos e obter as finalidades evantagens mencionadas, assim como as inerentes aqui. Os complexos mo-leculares e os métodos, procedimentos, tratamentos, moléculas, compostosespecíficos descritos aqui são atualmente representativos de modalidadespreferidas, são exemplares, e não são destinados a serem uma limitação noescopo da invenção. Será prontamente evidente para os versados na técni-ca que substituições e modificações variadas podem ser feitas na invençãodescrita aqui sem sair do escopo e espírito da invenção.

Todas as patentes e publicações mencionados no relatório sãoindicativas dos níveis dos versados na técnica à qual a invenção pertence.Todas as patentes e publicações são aqui incorporadas por referência namesma extensão como se cada publicação individual fosse especificamentee individualmente iniciada a ser incorporada por referência.

A invenção aqui descrita de modo ilustrativo pode ser praticadade modo apropriado na ausência de qualquer elemento ou elementos, Iimita-ção ou limitações que não são especificamente aqui descritas. Os termos eexpressões que foram empregados são usados como termos de descrição enão limitação, e não se tem intenção que no uso destes termos e expres-sões excluir quaisquer equivalentes dos aspectos mostrados e descritos ousuas porções, mas é reconhecido que várias modificações são possíveisdentro do escopo da invenção. Assim, deve-se entender que apesar da pre-sente invenção ter sido especificamente descrita pelas modalidades preferi-das e aspectos opcionais, modificação e variação dos conceitos aqui descri-tos podem ser obtidas pelo versado na técnica, e que estas modificações evariações são consideradas como dentro o escopo da invenção, como aquidefinido.

A invenção foi descrita amplamente e genericamente aqui. Cadauma das espécies e agrupamentos subgenéricos mais limitados, dentro dadescrição genérica, também formam parte da invenção. Isto inclui a descri-ção genérica da invenção com uma condição ou limitação negativa remo-vendo qualquer assunto do gênero, sem levar em conta se ou não o materialretirado é especificamente aqui descrito.

Claims (47)

1. Composição de cuidado pessoal compreendendo um suportede esqueleto, em que o referido esqueletocompreende um inibidor de prote-ase e pelo menos um peptídeo selecionado dentre o grupo consistindo emSEQ ID NOS:1-17.

2. Composição de cuidado pessoal de acordo com a reivindica-ção 1, em que o referido inibidor de protease é selecionado dentre o grupoconsistindo em inibidor de Bowman-Birk, inibidor de tripsina de soja, e inibi-dor de quimotripsina Elgin.

3. Composição de cuidado pessoal de acordo com a reivindica-ção 2, em que o referido inibidor de Bowman-Birk é um inibidor modificadode Bowman-Birk.

4. Composição de cuidado pessoal de acordo com a reivindica-ção 1, em que o referido suporte de esqueletocompreende de cerca de- 0,001 por cento em peso, a cerca de 5 por cento em peso da referida com-posição de cuidado pessoal.

5. Composição de cuidado pessoal de acordo com a reivindica-ção 4, em que o referido suporte de esqueletocompreende de cerca de 0,01por cento em peso, a cerca de 2,0 por cento em peso da referida composi-ção de cuidado pessoal.

6. Composição de cuidado pessoal de acordo com a reivindica-ção 5, em que o referido suporte de esqueletocompreende de cerca de 0,01por cento em peso a cerca de 1 por cento em peso da referida composiçãode cuidado pessoal.

7. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a refe-rida composição de cuidado pessoal é uma composição de cuidado da peleselecionada dentre o grupo consistindo em cremes, loções, pulverizações,emulsões, suspensões coloidais, espumas, aerossóis, líquidos, géis, soros,e sólidos para a pele.

8.Composição de acordo com a reivindicação 7, em que a refe-rida composição de cuidado pessoal é uma composição de cuidado da peleselecionada dentre líquidos umectantes de limpeza corporal, líquidos de Iim-peza corporal, limpadores antimicrobianos, cremes protetores da pele, lo-ções corporais, cremes faciais, cremes umectantes, emulsões de limpezafacial, géis faciais, soros faciais, limpadores faciais à base de tensoativos,géis esfoliantes faciais, tratamentos antiacne, tonalizantes faciais, cremesesfoliantes, máscaras faciais, bálsamos pós-barba, bálsamos pré-barba,composições de bronzeamento, composições de clareamento da pele, com-posições redutoras de vermelhidão da pele, filtros solares, depilatórios, inibi-dores do crescimento de cabelo, e radioprotetores.

9. Composição de acordo com a reivindicação 7, em que a refe-rida composição de cuidado da pele compreende composições aplicadastopicamente, de venda direta, tratamentos antifungos, tratamentos antiacne,protetores da pele, filtros solares, desodorantes, e antiperspirantes.

10. Composição de acordo com a reivindicação 7, em que refe-rida composição é capaz de clarear a tonalidade da pele.

11. Composição de acordo com a reivindicação 7, em que a re-ferida composição é capaz de reduzir a vermelhidão na tonalidade da pele.

12. Composição de acordo com a reivindicação 7, em que a re-ferida composição é capaz de evitar o escurecimento da tonalidade da pele.

13. Composição de acordo com a reivindicação 7, em que a re-ferida composição é capaz de evitar o desenvolvimento da cor da pele.

14. Composição de acordo com a reivindicação 7, em que refe-rida composição de cuidado da pele é um radioprotetor.

15. Composição de acordo com a reivindicação 14, em que oreferido radioprotetor é um filtro solar selecionado dentre filtros solares nãoresistentes à água, filtros solares muito resistentes à água, e filtros solareságua-em-silicone.

16. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a re-ferida composição de cuidado pessoal é capaz de evitar o crescimento decabelo.

17. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a re-ferida composição de cuidado pessoal é uma composição de cuidado docabelo.

18. Composição de cuidado do cabelo de acordo com a reivindi-cação 17, em que a referida composição de cuidado do cabelo é seleciona-da dentre o grupo consistindo em xampus, condicionadores, composiçõespara pentear o cabelo, colorantes para cabelo, formulações de ondas per-manentes, cremes, géis, espumas, pulverizações, emulsões, suspensõescoloidais, líquidos, espumas, e sólidos.

19. Composição de cuidado do cabelo de acordo com a reivindi-cação 18, em que a referida composição de cuidado do cabelo ainda com-preende um radioprotetor.

20. Composição de acordo com a reivindicação 19, em que oreferido radioprotetor é um filtro solar selecionado dentre filtros solares nãoresistentes à água, filtros solares muito resistentes à água, e filtros solareságua-em-silicone.

21. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a re-ferida composição de cuidado pessoal é uma composição de cuidado oral.

22. Composição de acordo com a reivindicação 21, em que areferida composição de cuidado oral é selecionada dentre o grupo consistin-do em pastas de dentes, géis de dentes, colutórios, líquidos para limpezaoral, composições anticáries, composições de branqueamento dos dentes,gomas de mascar, adesivos para dentaduras, e refrescantes bucais.

23. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a re-ferida composição de cuidado pessoal é uma composição cosmética.

24. Composição de acordo com a reivindicação 23, em que areferida composição cosmética é selecionada dentre géis para os olhos,sombras para os olhos, batons de ponto de derretimento elevado, batons,brilhos para os lábios, bálsamos para os lábios, rimei, lápis para os olhos,formulações de pó compacto, e bases.

25. Composição de acordo com a reivindicação 24, em que areferida composição de maquiagem compreende pelo menos um pigmento.

26. Composição de acordo com a reivindicação 25, em que areferida composição de maquiagem compreendendo pelo menos um pig-mento é um rimei selecionada dentre rimei não à prova d'água, rimei à provad'água, rimei avolumador, rimei extensor, rimei enrolador, rimei anidro àprova d'água, rimei à base d'água, e tratamentos dos cílios e sobrancelhas.

27. Composição de acordo com a reivindicação 25, em que areferida composição de maquiagem é uma formulação de pó compacto sele-cionada dentre pós soltos, blushes, sombras para os olhos, e pós de bron-zeamento.

28. Composição de acordo com a reivindicação 25, em que areferida composição de maquiagem é uma base selecionada dentre baseágua-em-óleo, base água-em-silicone, bases óleo-em-água, bastões anidrospara maquiagem, e bases creme-a-pó.

29. Composição de cuidado pessoal de acordo com a reivindi-cação 1, em que o referido suporte de esqueletocompreende a seqüência deaminoácidos especificada em SEQ ID NO: 19.

30. Composição de cuidado pessoal de acordo com a reivindi-cação 1, em que o referido esqueletoainda compreende pelo menos umaseqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NOS:20 e 21.

31. Composição de cuidado pessoal de acordo com a reivindi-cação 30, em que pelo menos uma das referidas seqüências de aminoáci-dos especificada em SEQ ID NOS: 20 e 21 é substituída por pelo menos umpeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos selecionada dentre o grupoconsistindo em SEQ ID NOS:1-17.

32. Composição de cuidado pessoal de acordo com a reivindi-cação 1, em que o referido suporte de esqueletocompreende uma seqüênciade aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOS:22-25.

33. Método para fabricar a composição de cuidado pessoal co-mo definida na reivindicação 1, compreendendo combinar uma quantidadeefetiva do referido esqueletoe pelo menos um veículo ou excipiente fisiologi-camente aceitável.

34. Método para modificar a tonalidade da pele de um indivíduo,compreendendo as etapas de:i) prover uma composição compreendendo a composi-ção de cuidado pessoal como definida na reivindicação 1;ii) prover um indivíduo a ser tratado; eii) aplicar a referida composição ao referido indivíduo emuma área em que modificações na tonalidade da pele do referido indivíduosão desejadas.

35. Método de acordo com a reivindicação 34, em que a referidamodificação de tonalidade da pele compreende o clareamento da tonalidadeda pele do referido indivíduo.

36. Método de acordo com a reivindicação 34, em que a referidamodificação de tonalidade da pele compreende redutores de vermelhidão natonalidade da pele do referido indivíduo.

37. Método de acordo com a reivindicação 34, em que a referidacomposição de cuidado pessoal compreende a seqüência de aminoácidosespecificada em SEQ ID NO: 19.

38. Método de acordo com a reivindicação 34, em que a referidacomposição de cuidado pessoal compreende pelo menos uma seqüência deaminoácidos especificada em SEQ ID NOS:20 e 21.

39. Método de acordo com a reivindicação 34, em que pelo me-nos uma das referidas seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ IDNOS:20 e 21 é substituída por pelo menos um peptídeo tendo uma seqüên-cia de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ IDNOS:1-17.

40. Método de acordo com a reivindicação 34, em que referidacomposição de cuidado pessoal é codificada por uma seqüência de aminoá-cidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOS:22-25.

41. Método para modificar o crescimento de cabelo de um indi-víduo, compreendendo as etapas de:i) prover a composição de cuidado pessoal de acordocom a reivindicação 1;ii) prover um indivíduo a ser tratado; eii) aplicar a referida composição ao referido indivíduo emuma área em que as modificações ao referido crescimento de cabelo do in-divíduo são desejadas.

42. Método de acordo com a reivindicação 41, em que a referidamodificação de crescimento de cabelo compreende inibir o crescimento docabelo do referido indivíduo.

43. Método de acordo com a reivindicação 41, em que a referidamodificação de crescimento de cabelo compreende inibir o crescimento docabelo do referido indivíduo, em que referido cabelo a ser inibido é selecio-nado dentre o grupo consistindo em cabelo facial, pêlos das axilas, pêlosdas pernas, pêlos do torso, e pêlos do braço, e cabelo da cabeça.

44. Método de acordo com a reivindicação 41, em que a referidacomposição de cuidado pessoal compreende uma seqüência de aminoáci-dos especificada em SEQ ID NO:19.

45. Método de acordo com a reivindicação 41, em que a referidacomposição de cuidado pessoal compreende pelo menos uma seqüência deaminoácidos especificada em SEQ ID NOS:20 e 21.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, em que pelo me-nos uma das referidas seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ IDNOS:20 e 21 é substituída por pelo menos um peptídeo tendo uma seqüên-cia de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ IDNOS:1-17.

47. Método de acordo com a reivindicação 38, em que a referidacomposição de cuidado pessoal é codificada por uma seqüência de aminoá-cidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOS:22-25.