BRPI0611378A2 - uso de lactoferrina bovina e formulacão para lactente - Google Patents

Abstract

A presente invencao refere-se a um novo método para inibir o crescimento de bactérias, em um paciente, de um patogeno bacteriano que expressa um sistema de secrecao tipo III, bem como E. coli enteroagregadora e/ou prevenir ou tratar infeccao causada pelo mesmo. O método compreende administrar ao paciente uma quantidade eficaz de lactoferrina bovina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSPARA INIBIR O CRESCIMENTO DE BACTÉRIAS".

Antecedentes da Invenção

Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provi-sório US 60/677.969 depositado em 5 de maio de 2005, que é incorporado atítulo de referência, em sua totalidade.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se, em geral, a métodos para inibir ocrescimento de bactérias.

Descrição de Técnica Relacionada

O trato gastrointestinal (GI) de um Iactente é colonizado por bac-térias dentro de horas após o nascimento. A bactéria pode ser ingerida atra-vés de alimentos ou água ou pode ser obtida diretamente de indivíduos queseguram o lactente. Uma família bacteriana que freqüentemente reside den-tro do trato Gl humano é a Enterobacteriaceae, que consiste em bastonetesGram-negativos facultativamente anaeróbicos. Vários gêneros dentro dessafamília podem ser considerados como patógenos intestinais humanos, inclu-indo Escherichia, Salmonellal Shigella, e Yersinia.

Escherichia coli(E. coli) é uma das principais espécies de bacté-rias que reside no intestino inferior dos animais de sangue quente. Comoparte da flora normal do trato intestinal, E coli desempenha um papel crucialna digestão de alimentos por produção de vitamina K a partir de material nãodigerido no intestino grosso. Uma vez estabelecida, a cepa de E. coli podepersistir no trato Gl por meses ou mesmo anos. Contanto que essas bacté-rias não adquiram elementos genéticos que codifique fatores de virulência,elas permanecem comensais benignos.

Contudo, existem vários subtipos de E. coli que podem causarinfecções e doenças de gravidade variável. Por exemplo, as classes deE. coli conhecidas como E. coli uropatogênicas (UPEC) podem causar infec-ções no trato urinário, a mais comum infecção por E coli extra-intestinal.E. coli causa cerca de 80% de todas as infecções do trato urinário, não com-plicadas, que respondem por mais de 7.000.000 idas ao consultório médico,por ano, nos E.U.A. Similarmente, E. coli (MNEC) associada à meningite é opatógeno mais comum responsável pela meningite, particularmente duranteo período neonatal. Meningite neonatal pode afetar um em cada dois a qua-tro mil lactentes.

As cepas E coli podem causar também outras doenças. Porexemplo, se a E. coli é translocada para a cavidade peritoneal através deuma perfuração ou rasgo no intestino, ela pode causar peritonite, uma infec-ção potencialmente fatal. E coli pode também causar sepse, uma infecçãoque resulta de bactérias que entram na corrente sangüínea. As bactérias sãousualmente introduzidas na corrente sangüínea a partir de algum sítio deinfecção distai, tal como rim, pele, ou pulmão. Existem aproximadamente500.000 casos de septicemia por ano nos E.U.A. e a taxa de mortalidadepermanece entre 20 e 50% apesar do substancial esforço de pesquisa notratamento desta condição. Aproximadamente 45% de casos de septicemiasão devidos às bactérias Gram-negativas, tal como E. coli.

Certas cepas virulentas de E coli podem também causar váriasdoenças diarréicas. A gravidade da doença diarréica varia consideravelmen-te e pode ser fatal. Mesmo quando não fatal, a doença diarréica é um dosprimeiros problemas de saúde pública para lactentes e crianças em paísesem desenvolvimento, apesar dos avanços recentes no entendimento dascausas subjacentes e administração da doença.

Diarréia é uma doença particularmente perigosa para crianças elactentes. Ela é a causa principal de morte em crianças com menos de 5 a-nos de idade, sendo responsável por de 3 a 4 milhões de mortes, a cadaano, no mundo inteiro. Episódios múltiplos de diarréia aguda ou diarréia per-sistente podem afetar seriamente o crescimento, o estado nutricional e acognição. Steiner, T.S., et al. Enteroaggregative Escherichia Coli ProduceIntestinal Inflammation and Growth Impairment and Cause lnterleukin-8 Re-Iease from Intestinal Epithelial Cells, J. Infect. Dis. 177:88-96 (1998).

Cepas de E. coli diarreiogênica foram divididas em pelo menosseis categorias principais com base em suas características epidemiológicase clínicas, determinantes de virulência específicas, e associação a certossorotipos: Ε. coli enterotoxigênica (ETEC)1 Ε. coli enteroinvasiva (EIEC),Ε. coli difusamente aderente (DAEC), E. coli enteropatogênica (EPEC)1E. colienteroemorrágica(EHEC), e E coli enteroagregadora (EAEC). Nataro,J., et ai, Diarrheagenic Escherichia coli, Clin. Microbio. Rev. 11:142-201 (ja-neiro de 1998); Trung Vu Nguyen, et al., Detection and Characterization ofDiarrheagenie Escherichia coli from Young Chiidren in Hanoi, Vietnan,J. Clin. Microbio. 43:755-760, 755 (fevereiro de 2005).

ETEC refere-se a cepas específicas de enterotoxinas produtorasde E coli. Algumas enterotoxinas são citotóxicas, danificando as células mu-cosas do trato gastrointestinal, enquanto outras são meramente citotônicas,induzido a secreção de água e eletrólitos. ETEC é reconhecida como a cau-sa primária da diarréia do viajante. Em contraste, EIEC refere-se a cepasque produzem fatores de invasão e causam a destruição do tecido colônicoe inflamação. EIEC se assemelha bastante à Shigella e causa uma formadisentérica de diarréia em humanos. Cepas de DAEC são identificadas deacordo com sua capacidade de aderir difusamente à superfície de uma célu-la. EPEC é a categoria mais antiga de E. coli diarreiogênica e causa freqüen-temente uma doença diarréica com água em profusão. EPEC é a causaprincipal da diarréia infantil em países em desenvolvimento. Diferentementede ETEC ou ElEC, EPEC não produz toxinas reconhecíveis ou fatores deinvasão. Um outro grupo de cepas de E. coli são EHEC, também conhecidascomo E. coli produtora da toxina Shiga (STEC). EHEC excreta verotoxinaspotentes ou toxinas Shiga1 causando, freqüentemente, colite hemorrágica oudiarréia sangüínea. Por último, EAEC, que é conhecida por sua capacidadede se ligar às células de cultura de tecido em um modo agregador, tem sidotambém associada à diarréia persistente, especialmente em países em de-senvolvimento.

O gênero Shigella, também um membro da família Enterobacte-riaceae, está estreitamente relacionado à Escheriehia, mas é anaerogênico eincapaz de fermentar lactose. Assim, este é usualmente discernível de Ecoli. Existem quatro espécies do gênero: S. dysenteriae, S. flexnerí, S. boydi-i, e S. sonnei. Muitas cepas, incluindo M90T, E22383 e E23507, existemdentro da espécie S. flexneri.

A infecção por Shigella flexneri, comumente conhecida comodisenteria shigelose ou bacilar, é a causa primeira da mortalidade infantil empaíses em desenvolvimento. Esses são aproximadamente 165 milhões deepisódios de shigelose a cada ano, resultante em um milhão e meio de mor-tes. Shigelose é caracterizada por diarréia, febre, vômitos e cãimbras esto-macais. Em casos raros, crianças novas com a doença podem sofrer ata-ques. Shigelose é particularmente comum e pode causar problemas recor-rentes em estabelecimentos onde a higiene é deficiente. A transmissão dadoença ocorre principalmente por consumo de água contaminada com fezesde indivíduos infectados. A infecção é bastante eficiente, pois a ingestão demenos que 10 células bacterianas é o bastante para causar uma infecção.

Crianças, especialmente crianças que estão começando a andar, de 2 a 4anos de idade, são as que têm maior probabilidade de contrair shigelose.EPEC, EHEC e Shigella usam, cada uma, um mecanismo similarpara invadir e infectar células eucarióticas e causar diarréia. Esse mecanis-mo é conhecido como o sistema de secreção tipo Ill (TTSS). Patógenos queusam esse mecanismo induzem uma lesão histopatológica característica,denominada lesão (A/E) de adesão/destruição, definida por adesão das bac-térias à superfície epitelial e a subseqüente destruição da célula hospedeiracom microvilosidades. Sekiya, K., et al., Supermolecular Structure ofthe En-teropathogenic Escherichia eoli Type Ill Secretion System and its Direet Inte-raetion with the EspA-Sheath-Iike Strueture, PNAS, 98:11,638-11,643 (2001).

O TTSS permite que os patógenos injetem proteínas virulentas no citoplas-ma das células hospedeiras eucarióticas que eles infectam. Yip, Calvin, etal., Struetural Charaeterization of a Type-Ill Seeretion System Filament Pro-tein in Complex with its Chaperone, Nat. Structural & Mol. Biol. 12:75-81 (2005).

O aparelho de TTSS consiste em duas partes distintas: (1) umaestrutura extracelular, oca, alongada, freqüentemente denominada de agu-lha, e (2) uma base cilíndrica, similar ao corpo basal flagelar que cruza asduas membranas bacterianas e assegura a estabilização da estrutura totalmediante o envelope celular. Acredita-se que a agulha esteja fisicamenteligada ao corpo basal. Tampakaki, A., et ai, Conserved Features of Type IllSecretion, Cell. Microbio. 6:805-816 (2004).

O mecanismo do TTSS é disparado quando o patógeno entraem contato íntimo com uma célula hospedeira. Embora o mecanismo descri-to abaixo corresponda especificamente à EPEC, acredita-se que exista ummecanismo similar para todos os patógenos que expressam TTSS. Sekiya,PNAS 98:11,638; Ebel, F., et ai, Temperature- and Medium-Dependent Se-cretion of Proteins by Shiga Toxin-Producing Escherichia coli, lnfect. Imm.64:4472-4479 (novembro de 1996).

Acredita-se que o TTSS seja um mecanismo de etapas múltiplasresultando em infecção eventual. Primeiramente, um par de estruturas simi-lares a anel localizado nas membranas internas e externas é montado. Asbactérias então produzem uma porta de injeção composta do componentede secreção F de E. coli (EscF)1 que é ancorada à membrana bacterianainterna ou externa. Múltiplos de proteína A secretada pela E. coli (EspA) ten-dem então a se ligar na ponta do EscF. EspA subseqüentemente inicia apolimerização da ponta do EscF e monta uma estrutura similar a bainha, co-nhecida como a agulha. A agulha é expansível, e seu alongamento é contro-lado pela quantidade de EspA secretada. A agulha constrói uma ponte físicaentre a bactéria e a membrana de célula hospedeira.

Na extremidade da agulha, duas proteínas BeD secretadas pe-la E. coli (EspB) e (EspD), hetero-oligomerizam em complexos que formamporos na célula eucariótica alvo. Esses poros permitem que as proteínassejam injetadas no compartimento citoplásmico das células epiteliais. EspB eEspD, bem como o receptor de intimina translocado (Tir), são então translo-cados para as células hospedeiras. Sabe-se que a função própria da EspB écrítica para o uso com sucesso do sistema de secreção tipo Ill pelas bacté-rias patogênicas. Ao introduzirem as proteínas bacterianas na célula hospe-deira, a bactéria força a célula a cooperar com sua própria infecção. Adicio-nalmente, na medida em que o Tir é translocado, ele é projetado para alémda superfície da célula intestinal e se liga diretamente à molécula de adesãode bactérias, intimina. A ligação intimina-Tir desencadeia a polimerização daactina e de outros componentes citoesqueletais no sítio de ligação, que en-tão rompe as microvilosidades de enterócitos, formando o pedestal distintivo.

Essa alteração é, freqüentemente, referida como a lesão A/E. Depois demuitas bactérias serem aderidas ao revestimento celular intestinal dessamaneira, os sintomas da infecção, tal como diarréia, começa. Vide a Figura16 para um diagrama de um TTSS típico.

Em contraste com EPEC, EHEC e Shigella, EAEC é uma classi-ficação de E. coli que não expressa os sistemas de secreção tipo III. Em vezdisso, a característica que distingue as cepas de EAEC é sua capacidade dese ligar às células de cultura de tecido de um modo agregador. As bactériasse alinham, elas próprias, em fileiras paralelas às células de tecido. Essaagregação foi descrita como "similar a tijolos empilhados".

A patogênese de EAEC tem três estágios: (1) aderência à mu-cosa intestinal por fímbrias de aderência agregadora (AAF) ou outros fatoresaderentes; (2) produção aumentada de muco pelas bactérias e célula hos-pedeira, que é depositado como um biofilme de muco sobre a superfície doenterócitos; e (3) uma resposta inflamatória com liberação de citocina, toxi-dez mucosa e secreção intestinal. Huang, D.B., et ai., EnteroaggregaiiveEscherichia coli: An Emerging Enteric Pathogen, Am. J. Gastroenterol.99(2):383-389 (2004). EAEC incluem muitas cepas de E. coli, inclusive E.coli 042, 04, 0:H10 e 044.Ή18.

Cepas de EAEC, associadas à diarréia persistente em criançasnovas, são responsáveis por cerca de 10% dos casos de diarréia em crian-ças. Em países em desenvolvimento, cepas de EAEC estão associadas a de8% a 32% de todos os casos de diarréias pediátricas agudas e de 20% a30% de toda a diarréia persistente. As cepas têm sido também associadas àdiarréia do viajante e à diarréia associada à síndrome de imunodeficiênciaadquirida (AIDS). A duração dos casos de diarréias associadas à EAEC emcrianças com menos de 3 anos de idade pode ser em média de 17 dias, queé mais longa que aquela associada à qualquer outro patógeno.

Como meio de proteger crianças com menos de 5 anos de idadecontra várias doenças diarréicas, o aleitamento materno tem sido identifica-do como a mais eficaz intervenção. Múltiplos estudos têm mostrado que oaleitamento materno exclusivo, e em uma menos extensão, o aleitamentomaterno parcial, podem proteger de diarréia aguda e persistente. Victoria,C.G., et al., Risk Factors for Deaths Due to Respiratory Infections AmongBraziiian Infants, Int. J. Epidemiol. 18: 918-25 (1989). A eficácia do aleita-mento materno como intervenção protetora pode ser atribuída aos múltiplosfatores antiinfecciosos, antiinflamatórios e imunorreguladores transmitidosatravés do leite humano. Newburg, D.S. Human Milk Glycoconjugaes thatInhibit Pathogens, Curr. Med. Chem. 6: 117-127 (1999).

Lactoferrina, uma glicoproteína que se liga ao ferro, é um dosprincipais agentes multifuncionais presentes no leite humano. Ela é tambémencontrada em secreções exócrinas, tais como lágrima, saliva e aquelas detipos específicos de células, tais como neutrófilos. Foi reportado que Iactofer-rina humana protege de bactérias Gram-negativas em uma variedade de modos.

Embora não se deseje estar ligado a isso ou a qualquer teoria,acredita-se que a lactoferrina humana exerça atividade bacteriostática porprivar o microrganismo do ferro que é necessário para o seu crescimento.

Assim, ao seqüestrar o ferro ambiental que é essencial para o crescimentode microorganismos patogênicos, a lactoferrina humana inibe eficazmente ocrescimento desses microrganismos.

Acredita-se que a lactoferrina humana possa também exerceratividade bactericida devido à sua direta ligação à membrana microbiana.Lactoferrina humana se liga à porção de lipídio A do lipopolissacarídeo (LPS)na superfície celular bacteriana, que rompe a membrana celular bacteriana ealtera a sua permeabilidade. Especula-se que a ligação de lactoferrina hu-mana ao LPS pode interferir com o maquinário de secreção tipo III, fazendocom que as proteínas secretadas sejam liberadas e então digeridas. Ochoa,T.J., et al., Laetoferrin Impairs Type Ill Seeretory System Funetion in Entero-pathogenie Eseheriehia eoli, Infect. Immun. 71:5149-5155 (2003).

Vários estudos têm examinado o efeito da lactoferrina humanaem várias espécies bacterianas. Por exemplo, um estudo de 2003 investigouo efeito da Iactoferrina humana recombinante no TTSS. Lactoferrina humanarecombinante é conhecida como sendo bastante similar em seqüência deaminoácidos à Iactoferrina humana, mas tem sido descrita como tendo umdiferente padrão de glicosilação. O estudo demonstrou que a Iactoferrinahumana recombinante pode comprometer a função do sistema de secreçãotipo Ill em E. coli enteropatogênica. Id. Contudo, o estudo constatou tambémque a Iactoferrina humana não comprometeu o crescimento de EPEC. Id.

Um estudo de 2001 demonstrou que a Iactoferrina humana podeinibir a adesão da EPEC às células HeLa. Nascimento de Araújo, A., et al.,Lactoferrin and Free Secretory Component of Human Milk Inhibit the Adhesi-on of Enteropathogenic Escherichia coli to HeLa Cells, BMC Microbiol. 1:25(2001). Esse estudo não focou a capacidade da Iactoferrina humana de inibiro crescimento de microrganismos.

Embora a Iactoferrina humana pareça ter efeito positivo sobre ossintomas de doenças diarréicas, algumas mulheres não desejam ou são in-capazes de aleitamento materno. Como tal, seria útil proporcionar uma alter-nativa para o leite humano que seria eficaz para prevenir ou eliminar infec-ções diarréicas. Tal alternativa deve ser também eficaz na inibição do cres-cimento dos patógenos bacterianos que causam infecções diarréicas.Sumário da Invenção

Portanto, em resumo, a presente invenção é direcionada a umnovo método para inibir o crescimento de enterobacteriaceae, em um paci-ente e/ou prevenir ou tratar uma infecção causada por enterobacteriaceae, ométodo compreendendo administrar a um indivíduo uma quantidade eficazde Iactoferrina bovina.

A presente invenção refere-se também a um novo método parainibir o crescimento de patógenos bacterianos que expressam um sistemade secreção tipo Ill em um paciente e/ou prevenir ou tratar uma infecçãocausada por patógenos bacterianos que expressam um sistema de secreçãotipo III. O método compreende administrar a um indivíduo uma quantidadeeficaz de Iactoferrina bovina. Em certas modalidades, esses patógenos po-dem ser selecionados do grupo que consiste em Salmonella, Shigella, Yersi-nia, Pseudomonas, e Escherichia.

Além disso, a presente invenção é direcionada a um novo méto-do para inibir a aderência de patógenos bacterianos que expressam um sis-tema de secreção tipo Ill às células intestinais humanas o método compre-endendo contactar os patógenos com uma quantidade eficaz de Iactoferrinabovina.

A presente invenção é adicionalmente direcionada a um novométodo para provocar a liberação prematura de EspB em uma patógenobacteriano que expressa um sistema de secreção tipo III, bem como um mé-todo para provocar a degradação de EspB em um patógeno bacteriano queexpressa um sistema de secreção tipo Ill o método compreendendo contac-tar os patógenos com uma quantidade eficaz de Iactoferrina bovina.

Ainda, a presente invenção é direcionada a um novo métodopara inibir o crescimento de E. coli enteroagregadora em um paciente, bemcomo prevenir ou tratar uma infecção causada por E. coli enteroagregadorao método compreendendo contactar os patógenos com uma quantidade efi-caz de Iactoferrina bovina..

A presente invenção é também direcionada a um novo métodopara inibir a aderência da E. coli enteroagregadora a células intestinais ométodo compreendendo contactar os patógenos com uma quantidade eficazde Iactoferrina bovina..

Além disso, a presente invenção é direcionada a uma nova for-mulação enteral nova ou fórmula para Iactentes ("Infant Formula") que com-preende Iactoferrina bovina que foi isolada de leite integral e tem uma conta-gem de células somáticas baixa. Em certas modalidades, a formulação ente-ral contém ainda glicomacropeptídeo de caseína.

Dentre as vantagens da presente invenção existe aquela de for-necer um remédio não farmacêutico para muitas doenças e infecções medi-adas por bactérias. O bLF pode ser facilmente suplementada em uma com-posição enteral ou fórmula para Iactente para prevenir o início de ou tratartais doenças. Alternativamente, o bLF da presente invenção pode ser admi-nistrado na superfície de produtos alimentícios ou intermisturados com osprodutos alimentícios para inibir o crescimento de patógenos bacterianos.Breve Descrição dos Desenhos

Para um entendimento mais completo da presente invenção, éagora feita referência às seguintes descrições tomadas em conjunto com osdesenhos acompanhantes.

A Figura 1 ilustra o efeito bacteriostático de bLF no crescimentode EPEC.

A Figura 2 ilustra o efeito bacteriostático de bLF no crescimentode EAEC.

A Figura 3 ilustra o efeito bacteriostático no crescimento de Shi-gella.

A Figura 4 ilustra o efeito de várias concentrações variadas debLF na inibição do crescimento de EPEC.

A Figura 5 ilustra o efeito de concentrações variadas de bLF nainibição do crescimento de EAEC.

A Figura 6 ilustra o efeito de concentrações variadas de bLF nainibição do crescimento de Shigella.

A Figura 7 ilustra o efeito de concentrações saturadoras na ca-pacidade de bLF de inibir o crescimento de EPEC.

A Figura 8 ilustra o efeitos de concentrações saturadoras de fer-ro na capacidade de bLF de inibir o crescimento de EAEC.

A Figura 9 ilustra o efeito de concentrações saturadoras na ca-pacidade de bLF de inibir o crescimento de Shigella.

A Figura 10 ilustra o efeito de várias preparações de bLF na ini-bição de crescimento de EPEC.

A Figura 11 ilustra o efeito de várias preparações de bLF na ini-bição de crescimento de EAEC.

A Figura 12 ilustra o efeito de várias preparações de bLF na ini-bição de crescimento de Shigella.

A Figura 13 ilustra a aderência de EAEC às células HEp-2 emausência de bLF.A Figura 14 ilustra o efeito de bLF na aderência de EAEC às cé-lulas HEp-2.

A Figura 15 ilustra o efeito de concentrações saturadoras de fer-ro na capacidade de bLF de inibir a aderência de EAEC às células HEp-2.

A Figura 16 é um diagrama do sistema de secreção tipo III.

A Figura 17 é um Western blot de STEC HW1 e STEC 306-7, asós e em presença de Iactoferrina bovina e humana.

A Figura 18 é um Western blot de STEC TWO 8023 e C600, asós e em presença de Iactoferrina bovina e humana.

Descrição Detalhada das Modalidades Preferidas

Será agora feita referência, em detalhes, às modalidades da in-venção, um ou mais exemplos das quais são dados abaixo. Cada exemplo éproporcionado a título de explicação da invenção, sem limitar a invenção. Narealidade, tornar-se-á aparente para aqueles versados na técnica que muitasmodificações e variações podem ser feitas na presente invenção sem sedesviar do escopo e espírito da invenção. Por exemplo, as característicasilustradas ou descritas como parte de uma modalidade, podem ser usadasem uma outra modalidade para realizar ainda uma subseqüente modalidade.

Assim, pretende-se que a presente invenção englobe tais modi-ficações e variações como estando dentro do escopo das reivindicações a-pensas e equivalentes destas. Outros objetivos, características e aspectosda presente invenção são mostrados em ou são óbvios da seguinte descri-ção detalhada. É para ser entendido por aquele com conhecimento ordinárioda técnica que a presente discussão é uma descrição de modalidades e-xemplares somente, e não se destina a limitar os aspectos mais amplos dapresente invenção.

O termo "probiótico" significa um microrganismo que exerce efei-tos benéficos na saúde do hospedeiro.

O termo "prebiótico", como usado aqui, significa um ingredientealimentício não digerível que estimula o crescimento e/atividade dos probióticos.

O termo "paciente" significa qualquer mamífero, preferivelmenteum humano. Em certas modalidades, o paciente necessita de prevenção outratamento de uma infecção causada por Enterobacteriaceae ou patógenosbacterianos que expressam um TTSS. Em outras modalidades, o pacientenecessita de inibição do crescimento de patógenos bacterianos que expres-sam TTSS. Em modalidades particulares, o paciente necessita de inibiçãodo crescimento de EAEC ou necessita de prevenção e tratamento de umainfecção causada por EAEC. Em certas modalidades, o paciente é uma cri-ança ou lactente. Em algumas modalidades, o paciente é um Iactente quenão recebe aleitamento materno humano.

O termo "inibir" significa diminuir, limitar ou bloquear o cresci-mento ou ação de um ou mais ingredientes.

Como usado aqui, o termo "tratar" significa atenuar, melhorar ouremediar uma doença, distúrbio, ou sintoma de uma doença ou condição.

O termo "prevenir" significa deter ou impedir uma doença, dis-túrbio, ou sintoma de uma doença ou condição através de alguma ação.

O termo "quantidade eficaz" significa uma quantidade que resul-ta em inibição do crescimento de um organismo patogênico ou melhorar deou remediar uma doença, distúrbio, ou sintoma de uma doença ou condiçãocausada pelo organismo.

O termo "infecção" significa invasão por e multiplicação de mi-crorganismos patogênicos no corpo de um paciente, que podem produzirlesão tecidual subseqüente e progresso à doença manifesta através de umavariedade de mecanismos celulares ou tóxicos.

A expressão "contagem célula somática" significa medir a conta-gem de leucócitos no leite.

A expressão "formulação enteral" significa uma composição paraadministração enteral a um paciente, preferivelmente através de ingestão.

Como usada aqui, a expressão "fórmula para lactente" significauma composição que satisfaz as exigências nutricionais de um lactente porser um substituto para o leite humano. Nos E.U.A., o conteúdo de uma fór-mula para lactente é ditado pelas regulamentações federais estabelecidasem 21 C.F.R. Seções 100, 106, e 107. Essas regulamentações definem osníveis de macronutriente, vitamina, mineral, e de outros ingredientes, em umesforço para estimular as propriedades nutricionais e outras propriedades doleite materno humano.

De acordo com a presente invenção, foi constatado um novométodo para inibir o crescimento de Enterobacteriaceae em um paciente.

O método compreende administrar ao paciente uma quantidade eficaz deIactoferrina bovina (bLF). A Iactoferrina bovina é uma glicoproteína que per-tence ao transportador de ferro ou à família de transferrina. Ela é isolada doleite bovino, onde é encontrada como um componente do trigo.

É sabido que existem diferenças significantes entre a seqüênciade aminoácidos, padrões de glicolisação e capacidade de ligação ao ferroem Iactoferrina humana ou bovina. Adicionalmente, existem etapas múltiplase seqüenciais de processamento envolvidas no isolamento de Iactoferrinabovina do leite de vaca, que são esperadas resultar em propriedades fisio-químicas da preparação de Iactoferrina bovina resultante. É também relatadoque a Iactoferrina humana e a bovina têm diferenças em suas capacidadesde se ligarem ao receptor de Iactoferrina encontrado no intestino humano.

Especificamente, a Iactoferrina humana é conhecida como tendo fraca capa-cidade de se ligar ao receptor de Iactoferrina do intestino humano. Devido aofato da Iactoferrina humana e bovina serem tão diferentes a esse respeito,os resultados obtidos na presente invenção, usando Iactoferrina bovina, fo-ram inesperados e surpreendentes.

Como discutido acima, acredita-se que o mecanismo principalpor trás do efeito bacteriostático da Iactoferrina humana e presumivelmentebovina era o seqüestro de ferro dos patógenos. Em contraste, a presenteinvenção mostrou que o efeito bacteriostático bovino é independente de sa-turação de ferro. Assim, acredita-se que o efeito bacteriostático da Iactoferri-na bovina ocorra através de um mecanismo diferente daqueles da Iactoferri-na humana.

Existem vários estudos que lidam com os efeitos bacteriostáticosda bLF. Por exemplo, um estudo constatou que a bLF tem efeito bacteriostá-tico na proliferação de várias espécies de Clostridium em camundongos. Te-raguchi, S., et al., Bacteriostatic Effect of Oraliy Administered Bovine Lacto-ferrin on Proliferation of Clostridium Speeies in the Gut of Miee Fed BovineMilk, Appl. Environ. Microbiol. 61:501-506 (1995). Foi também demonstradoque bLF tem efeito bacteriostático em Enterobaeteriaeeae intestinais em ca-mundongos. Teraguchi, S., et ai, The Bacteriostatic Effeet of Orally Adminis-tered Bovine Laetoferrin on Intestinal Enterobaeteriaeeae of SPF Miee FedBovine Milk, Biosci. Biotech. Biochem. 58:482-487 (1994). Embora a espéciepredominante de Enterobaeteriaeeae que foi isolada no estudo fosse E. eoli,o estudo não fornece evidência do efeito inibidor de crescimento de bLF nospatógenos bacterianos tendo sistemas de secreção tipo Ill ou classificaçõesde E. eoli específica, tal como EAEC.

Contudo, em contraste com os estudos acima, um estudo simi-larmente conduzido constatou que bLF não apresentou efeito inibidor decrescimento na E. eoli enterotoxigênica. Sarelli, L., et ai, Laetoferrin to Pre-vent Experimental Eseherichia eoli Diarrhea in Weaned Pigs, Intl. J. Appl.Res., disponível em http://vvww.iarvm.com/articles/Vol1lss4/Heinonen.htm. Oestudo não demonstrou redução significante na ocorrência de diarréia expe-rimentalmente reduzida ou contagens de E. eoli hemolítica em fezes. Id.

Várias patentes também relatam os efeitos da bLF em váriasbactérias e/ou doenças. Por exemplo, o Pedido de Patente US 20030203839de Kruzel et al. refere-se ao uso de bLF para tratar a progressão de síndro-me da resposta inflamatória sistêmica (SIRS) na sepsia, sepsia grave, cho-que séptico e falência múltipla dos órgãos.

Os Pedidos de Patente US 20040043922 de Naidu e US2003022901111 de Braun referem-se a um método para reduzir a contami-nação microbiana em produtos alimentícios. O método envolve tratar umproduto alimentício com Iactoferrina imobilizada. Embora a invenção seja útilno tratamento de EPEC e Shigella spp., ela requer que a Iactoferrina sejaimobilizada para ser eficaz.

O Pedido de Patente US 20040152624 de Varadhachary et al.refere-se a um método para tratar bacteriemia por administração de umaquantidade eficaz de bLF a um paciente. De acordo com a referência, o mé-todo também causa a redução dos níveis de bactérias circulantes. Contudo,nenhuma dessas referências descreve os benefícios da bLF nos patógenosbacterianos tendo sistemas de secreção tipo III. Similarmente, nenhuma dasreferências descreve os benefícios da bLF na EAEC. Assim, a presente in-venção proporciona benefícios surpreendentes sobre as referências discuti-das acima.

Em modalidades particulares da presente invenção, as Entero-bacteriaceae podem compreender E coli e Shigella. Em uma outra modali-dade da invenção, as Enterobacteriaceae podem compreender E. coli ante-ropatogênica, E. coli enteroagregadora e Shigella. Em ainda uma outra mo-dalidade da invenção, as Enterobacteriaceae podem compreender E coliE2348/69, E. coli 042 e Shigella flexneri M90T. As cepas de E. coliE2348/69, E. coli 042 e Shigella flexneri M90T são pediologicamente impor-tantes, pois estas provocam muitas infecções deletérias em Iactentes e crianças.

Em outras modalidades da invenção, o crescimento de patóge-nos bacterianos que expressam um sistema de secreção tipo Ill é inibido poruma quantidade eficaz de bLF. Em certas modalidades, os patógenos bacte-rianos que expressam um sistema de secreção tipo Ill podem compreenderSalmonellal Shigella, Yersinia, Pseudomonas e Escherichia. Em uma moda-lidade, o patógeno de Escherichia pode compreender E. coli enteropatogêni-ca ou E coli. enteroemorrágica. EPEC inclui muitas cepas de E coli, incluin-do E. coli E2348/69, 026, 055, 0157, 0111, 0114:H2, 0119:H6, 0126,0127:H6, 0128:H2 e 0142:H6. Similarmente, a EHEC pode compreender ascepas STEC TWO 8023, STEC HW1, STEC 306-7, 0157:H7, 0111:H8,0104:H21, 0111, 026 ou 026:H11.

Em uma modalidade separada da presente invenção, a invençãoprevine ou trata uma infecção causada por Enterobacteriaceae em um paci-ente. Isso inclui quaisquer infecções conhecidas na técnica a serem causa-das por Enterobacteriaceae. Mais especificamente, isso inclui quaisquer in-fecções conhecidas na técnica a serem causadas por E. coli enteropatogêni-ca, E. coli ente roag regado ra ou Shigela flexneri. Também inclui todas as in-fecções conhecidas na técnica a serem causadas por patógeno bacterianoque expressa um sistema de secreção tipo III. Em uma modalidade da pre-sente invenção, a infecção pode incluir infecção do trato urinário, meningiteneonatal, peritonite, shigelose, ou qualquer infecção ou doença gastrointestinal.

Em uma outra modalidade da invenção, o crescimento de bacté-rias patogênicas é inibido sem aumento correspondente dos níveis de toxi-nas produzidas pelas bactérias. É sabido que inibição de crescimento é umdesencadeador para a indução de bacteriófagos que portam genes Stx. Sãoconhecidos muitos antibióticos que aumentam a produção de toxinas via deciclo fagolítico. A presente invenção foi surpreendente porque ela não indu-ziu um nível aumentado de produção de toxinas durante a inibição de cres-cimento simultâneo. Assim, a presente invenção pode inibir o crescimento debactérias patogênicas sem aumentar simultaneamente a produção de toxi-nas. Esse benefício inesperado é discutido ainda no Exemplo 4.

Em certas modalidades da invenção, a bLF foi isolada de leiteintegral. Em certas outras modalidades, a bLF tem uma contagem de célulassomáticas baixa. Em algumas modalidades, a bFL foi isolada de leite inte-gral, bem como bem tem uma contagem de células somáticas baixa.

Embora não se deseje estar ligado a isso ou qualquer teoria,acredita-se que bLF tenha sido isolada de leite integral tenha menos Iipopo-lissacarídeos (LPS) inicialmente ligados que a bLF que foi isolada de leiteem pó. Adicionalmente, acredita-se que bLF com contagem de células so-máticas baixa tem menos LPS inicialmente ligado. Porque essa forma debLF tem menos LPS inicialmente ligado, mais sítios de ligação estão dispo-níveis em sua superfície. Acredita-se que isso auxilie a bLF a ligar-se ao lo-cal apropriado e interromper o processo de infecção.

A bLF que é usada em certas modalidades da presente invençãopode ser qualquer bLF isolada do leite integral e/ou tendo uma contagem decélulas somáticas baixa. A título de exemplo, bLF adequada é disponível daTatua Co-operative Dairy Co., Ltd., em Morrinsville, Nova Zelândia.

Em uma modalidade da presente invenção, o efeito inibidor decrescimento da bLF é dependente de dose. Conforme a dose de bLF é au-mentada, o efeito inibidor de crescimento da bLF é também aumentada.

Em uma outra modalidade da presente invenção, o efeito inibidorde crescimento da bLF é dependente da concentração de ferro presente nointestino do paciente. A bLF da presente invenção perde suas capacidadesbacteriostáticas depois de ser saturada com ferro.

Na presente invenção, bLF tem efeito inibidor de crescimento empatógenos bacterianos que têm sistemas de secreção tipo III, bem comoEAEC, um patógeno que carece de sistema de secreção tipo III. A presenteinvenção ilustra que embora a bLF seja eficaz em patógenos bacterianosque expressam um sistema de secreção tipo III, ela não é necessariamenteespecífica para o sistema de secreção tipo III. bLF é também eficaz em inibiro crescimento de patógenos não-TTSS. Embora não se deseje estar ligado aisso ou a qualquer teoria, acredita-se que as proteínas de virulência ancora-das em membrana de EAEC, que são importantes para aderência, podemser rompidas por interação de bLF com a superfície bacteriana. Existem vá-rias proteínas de aderência que poderiam ser responsáveis pelo efeito dabLF na aderência de EAEC, incluindo AAF/I e AAF/II. Assim, bLF pode pro-teger Iactentes de infecção gastrointestinal por impedir a ligação de EAECaos epitélios intestinais e assim proteger da colonização por patógenos.

Em uma modalidade particular da invenção, bLF pode inibir aaderência de EAEC às células intestinais. Nessa modalidade, o efeito antia-derência não é afetado pela concentração de ferro presente no intestino dopaciente.

Uma quantidade eficaz de bLF para uso na presente invençãopode estar entre cerca de 0,001 mg e cerca de 100 g por dia. Em uma mo-dalidade, uma quantidade eficaz de bLF para uso na presente invenção po-de estar entre cerca de 0,1 mg e 10 g por dia. Em uma outra modalidade,uma quantidade eficaz de bLF pode estar entre cerca de 10 mg e 1.500 mgpor dia. Em uma modalidade particular da invenção, a bLF pode ser adminis-trada em três doses diárias.

Em várias modalidades, a bLF pode ser administrada via solu-ção, cápsula, comprimido, ou pequena cápsula. Veículos para bLF podemter uma concentração de bLF de entre cerca de 0,01% e cerca de 100%.

A presente invenção também engloba uso de Iactoferrina bovinana fabricação de um medicamento para inibir o crescimento de EPEC, EAECou Shigella em um produto alimentício. Nessa modalidade, a bLF pode seraspergida sobre a superfície do alimento ou pode ser intermisturado com osingredientes do produto alimentício.

Em uma outra modalidade da presente invenção, a invenção éuma formulação enteral que compreende glicomacropeptídeo de proteína eIactoferrina bovina que foi isolada de leite integral e tem uma contagem decélulas somáticas baixa.

Em uma modalidade, a formulação enteral inclui também umácido graxo, poliinsaturado, de cadeia longa (LCPUFA). LCPUFAs adequa-dos podem incluir, mas sem limitação, ácido α-linoléico, ácido γ-linoléico,ácido linoléico, ácido linolênico, ácido eicosapentanóico (EPA), ácido araqui-dônico (ARA) e ácido docosaexanóico (DHA). Em um método da presenteinvenção, uma quantidade eficaz de LCPUFA pode corresponder a entrecerca de 3 mg por kg de peso corporal e cerca de 150 mg por kg de pesocorporal por dia. Em uma modalidade da invenção, a quantidade é de cercade 6 mg por kg de peso corporal a cerca de 100 mg por kg de peso corporalpor dia. Em uma outra modalidade, a quantidade é de cerca de 10 mg por kgde peso corporal por dia a cerca de 60 mg por kg de peso corporal por dia.

A formulação enteral pode conter também um probiótico. Qual-quer probiótico conhecido na técnica será aceitável nessa modalidade. Emuma modalidade particular, o probiótico é selecionado do grupo que consisteem Lactobacillus e Bifidobacterium. Nessa modalidade, o probiótico pode serLactobaccilus rhamnosus GG (LGG) ou Bifidobacterium Iaetis (Bb-12).

Em ainda outra modalidade da invenção, a formulação enteralpode conter um prebiótico. Qualquer prebiótico conhecido da técnica seráaceitável nessa modalidade. Prebióticos podem incluir lactulose, galactooli-gossacarídeo, fruto-oligossacarídeo, isomalto-oligossacarídeo, oligossacarí-deos de soja, lactossacarose, xilo-oligossacarídeo, e gentio-oligossacarídeos.

Em uma outra modalidade, a invenção é uma fórmula para Iac-tente que compreende bLF que foi isolada de leite integral e tem uma conta-gem de células somáticas baixa. A fórmula para Iactente pode conter glico-macropeptídeo de caseína. A fórmula para Iactente pode conter também pe-lo menos LCPUFA. Em ainda uma outra modalidade, a fórmula para Iactentepode conter pelo menos um probiótico e/ou um prebiótico. Em uma modali-dade particular, a fórmula para Iactente contém bLF que foi isolada de leiteintegral e tem uma contagem de células somáticas baixa, glicomacropeptí-deo de caseína, pelo menos um LCPUFA, pelo menos um probiótico, e pelomenos um prebiótico.

A fórmula para Iactente para uso na presente invenção é nutriti-vamente completa e contém tipos e quantidades adequadas de lipídio, car-boidrato, proteína, vitaminas e minerais. A quantidade de lipídio ou de gordu-ra pode variar tipicamente de cerca de 3 a cerca de 7 g/100 kcal. A quanti-dade de proteína pode variar tipicamente de cerca de 1 a cerca de 5 g/100kcal. A quantidade de carboidrato pode variar tipicamente de cerca de 8 acerca de 12 g/100 kcal. Fontes de proteína podem ser qualquer uma usadana técnica, por exemplo, leite sem gordura, proteína do trigo, caseína, prote-ína da soja, proteína hidrolisada, aminoácidos, e similares. Fontes de car-boidrato podem ser qualquer uma usada na técnica, por exemplo, lactose,glicose, sólidos de xarope de milho, maltodextrinas, sacarose, amido, sólidosde xarope de arroz, e similares. Fontes de lipídíos podem ser qualquer umausada na técnica, por exemplo, óleos vegetais tais como óleo de palma, óleode soja, palmoleína, óleo de coco, óleo de triglicerídeo de cadeia média, óleode girassol com alto teor oléico, óleo de açafrão com alto teor oléico, e similares.

Convenientemente, fórmula para Iactente comercialmente dispo-nível pode ser usada. Por exemplo, Enfamil®, Fórmula Prematura Enfamil®,Enfamil® com Ferro, Lactofree®, Nutramigen®, Pregestimil®, and ProSobee®(disponível da Johnson & Company, Evansville, IN, E.U.A.) podem ser su-plementadas com níveis adequados de bLF, glicomacropeptídeo de caseína,LCPUFA(s), probiótico(s), e/ou prebiótico(s) e usados na prática do métododa invenção.

Os seguintes exemplos descrevem várias modalidades da pre-sente invenção. Outras modalidades dentro do escopo das reivindicaçõesaqui tornar-se-ão aparentes para aqueles versados na técnica a partir deconsideração do relatório descritivo ou da prática da invenção descrita aqui.

É pretendido que o relatório descritivo, juntamente com os exemplos, sejaconsiderado como apenas exemplificativo, com o escopo e espírito da in-venção sendo indicados pelas reivindicações que seguem os exemplos. Nosexemplos, todas as percentagens são dadas em uma base em peso a me-nos que de outro modo indicado.

Exemplo 1

Esse exemplo descreve os materiais e métodos necessários pa-ra mostrar o efeito de Iactoferrina bovina em patógenos bacterianos tendosistema de secreção tipo III. Três cepas de bactérias foram utilizadas napresente invenção. As cepas incluíram STEC HW1, STEC 306-7 e STECTWO 8023. Cada uma dessas cepas é um organismo diferente que utiliza umTTSS para infectar células. A cepa bacteriana C600, um patógeno que nãoutiliza um TTSS, foi usada como controle negativo no teste.

As bactérias de crescimento durante a noite em Caldo de Luriaforam inoculados em diluição 1:50 em meio de EAGLE modificado por Dul-becco (DMEM) com HEPES 25mM, pH 7,4, e incubadas a 37°C em uma in-cubadora com CO2 a 5%, sem agitação. Uma alíquota de 5 mL foi medidaem tubos rotulados e o crescimento bacteriano foi monitorado espectrofoto-metricamente em OD6oo de hora em hora por sete horas. Unidades formado-ras de colônia (cfu) foram avaliadas durante a fase de crescimento logarítmi-co (4 horas) em todas as amostras de controle sem bLF.

De modo a eliminar a possibilidade de que a atividade anti-TTSSobservada para Iactoferrina bovina fosse devida ao seqüestro de ferro, a Iac-toferrina usada neste experimento foi saturada com ferro através da incuba-ção da Iactoferrina com 5 vezes o ferro necessário para saturar todos os sí-tios de ligação de ferro na preparação de lactoferrina.De hora em hora durante os experimentos, a amostra era centri-fugada a 13.200 rpm por 10 a 15 minutos para separar células associadasdos componentes liberados. Os sobrenadantes, representando o materialassociado não celular (que foi liberado das bactérias), foram retidos e colo-cados em 0,1 mL de tampão de amostra de SDS e aquecidos a 100°C, por 5minutos. Os péletes dessa etapa de centrifugação foram lavados em soluçãosalina de tampão de fosfato e ressuspensos em 0,1 mL de tampão de amos-tra de SDS e aquecidos a 100°C, por 5 minutos. Os sobrenadantes e precipi-tados, ambos no tampão de amostra, foram então resolvidos por eletroforeseem gel de poliacrilamida com SDS usando métodos costumeiros. O gel re-sultante foi então transferido para uma membrana, tal como polivinilpirrolido-na ou nitrocelulose, usando métodos comuns. A presença de EspB nos so-brenadantes (proteínas liberadas) e precipitados (proteínas associadas acélulas) foi então detectada por Western blotting usando anticorpos específi-cos para EspB.

Nesse exemplo, a bIF foi adquirida da Tatua Co-operative DairyCo., Ltd, Morrinsville, Nova Zelândia. A menos que de outro modo indicado,todos os experimentos foram conduzidos usando-se uma concentração de10 mg/mL (0,125 mM) ou 1 mg/mL de bLF, que refere-se aproximadamenteà concentração presente no colostro humano e no leite maduro, respectivamente.

Os dados são expressos como o desvio padrão ± média (SD) amenos que de outro modo indicado. Para análise do efeito inibidor de cres-cimento da lactoferrina, duas linhas de regressão foram calculadas e a dife-rença entre as duas inclinações de regressão foram então testadas usandoestatística t (Armitage P, 1980). Dados em par foram então analisados peloteste de soma das ordens Wilcoxon para diferenças nas médias. Para análi-se do teor de ferro de várias preparações de lactoferrina e seu efeito inibidorde crescimento, uma regressão linear foi calculada e expressa como R-quadrado para cada bactéria.

Exemplo 2

Esse exemplo ilustra o efeito de lactoferrina bovina na ligação depatógenos bacterianos às células eucarióticas. Especificamente, esseexemplo ilustra o efeito de Iactoferrina bovina na proteína EspB no sistemade secreção tipo III.

O Western blot mostrado na Figura 17 ilustra o efeito da Iactofer-rina bovina e humana em STEC HW1 e STEC 306-7. A faixa L1 representa osmarcadores de peso molecular. A faixa L2 representa EspB purificada paraindicar a posição apropriada desta proteína no Western blot. A faixa L3 emcada uma das fotografias do gel representa a quantidade de EspB no sobre-nadante (liberado) depois de 2, 3, 4 ou 5 horas de cultura de crescimento dacepa HW1. A faixa L4 representa EspB no sobrenadante de uma cultura de 2,3, 4, ou 5 horas da cepa HW1 que estava crescendo em 1 mg/L de Iactoferri-na recombinante humana. A faixa L5 representa EspB em um sobrenadantede cultura de 2, 3, 4, ou 5 horas da cepa HW1, que estava crescendo em 1mg/mL de Iactoferrina bovina. A faixa L6 representa o sobrenadante de EspBde um cultura de 2, 3, 4, ou 5 horas da cepa 306-7. A faixa L6 representa osobrenadante de uma cultura de 2, 3, 4 ou 5 horas da cepa 306-7, que estavacrescendo em 1 mg/mL de Iactoferrina recombinante humana. A faixa L6 re-presenta o sobrenadante de EspB de uma cultura de 2, 3, 4 ou 5 horas dacepa 306-7, que estava crescendo em 1 mg/mL de Iactoferrina bovina.

O Western blot mostrado na Figura 17 ilustra que em ausênciade bLF (faixas L3 e L6), EspB não é observada no sobrenadante (não libe-rado das bactérias) até depois de 4 horas de crescimento. Isso ilustra o cur-so normal de produção e liberação dos componentes de TTSS durante ocrescimento não interrompido das bactérias. Em contraste, em presença debLF, EspB é detectada no sobrenadante anterior (3 horas, faixas L5 e L8),que em ausência de bLF, indicando liberação prematura de EspB. Esse a-chado é importante porque EspB é um componente essencial requerido parauso com sucesso do TTSS, e liberação prematura limitaria a eficácia doTTSS para infecção. O mesmo efeito não é visto com uma preparação deIactoferrina humana (faixas L4 e L7). Além da liberação prematura de EspB,esse experimento proporciona também evidência de que bLF está agindocomo uma protease para degradar EspB (e, portanto, não permite que estaseja reusada para formação do complexo de agulha de secreção). Isso éindicado pelas numerosas bandas identificadas como EspB (porque ela éreconhecida como o anticorpo anti-EspB) imediatamente sob a posição daproteína de EspB intacta no gel (indicando a geração de peptídeos de EspBmenores). Esse fenômeno é observado para todas as cepas que expressamos peptídeos de EspB). Esse fenômeno é observado para todas as cepasque expressam o TTSS1 mas não para o C660, um patógeno negativo deTTSS. É sabido que patógenos diferentes utilizando o TTSS expressam va-riantes de EspB, proporcionando uma explanação para a degradação variá-vel desta proteína de cada patógeno por bLF.

O Western blot mostrado na Figura 18 é organizado do mesmomodo que aquele da Figura 17 exceto que as cepas testadas são STECTWO 8023 e C600, um controle negativo. Os resultados do Western blotmostrado na Figura 18 são também similares àqueles mostrados na Figura17. EspB está presente nos meios em 3 horas de crescimento em Iactoferri-na enquanto ela não aparece no controle até 4 horas. Em ambos os pontosde tempo de 4 e 5 horas, Iactoferrina bovina fez com que a EspB se degra-dasse. Além disso, com três cepas STEC avaliadas no ponto de tempo de 3horas, a Iactoferrina bovina fez com que a EspB fosse liberada no meio maisrapidamente que foi a Iactoferrina humana recombinante. Além do mais, es-sa figura proporciona evidência adicional da degradação de EspB por bLF,conforme discutido na figura anterior.

Portanto, acredita-se que a presença de Iactoferrina bovina pro-voca tanto uma liberação prematura como uma degradação da EspB.

A EspB é requerida para alterações na corrente em curto circuito através dascélulas epiteliais intestinais polarizadas e para despolarização das membra-nas em células Caco-2. EspB é também requerida para indução da ativaçãode NF-κΒ, para secreção de interleucina-8, para migração transepitelial deneutrófilos, e para diminuição da resistência elétrica transepitelial, todos osquais podem contribuir para doença diarréica. Assim, uma liberação prema-tura e/ou degradação de EspB podem reduzir ou eliminar os sintomas dadoença diarréica.Exemplo 3

É crítico para a validade desse experimento que a bLF usadaneste experimento seja ferro saturado, e, portanto, não agindo bacteriostati-camente para inibir o crescimento das cepas bacterianas. Isso alteraria aquantidade de EspB em cada faixa, confundindo potencialmente a interpre-tação dos dados.

Este exemplo ilustra a taxa de crescimento equivalente das bac-térias em presença ou ausência de Iactoferrina bovina quando saturada comferro. Devido ao fato de que o crescimento de cada cultura neste experimen-to é similar tanto em presença como em ausência de bLF, os efeitos obser-vados na EspB são devidos a uma nova atividade de bLF e não à inibição decrescimento ou ao seqüestro de ferro.

Exemplo 4

Este exemplo ilustra o efeito da Iactoferrina bovina na super-regulação da produção da toxina Shiga (Stx) durante a inibição de crescimen-to de STEC. Além do sistema de secreção tipo III, as cepas EHEC têm fatoresde virulência adicionais que contribuem para suas personalidades patogêni-cas. Um dos principais fatores de virulência é a produção de Stx1 uma toxinaque inibe a síntese de proteína. Existem duas formas de Stx: Stx1, que é qua-se idêntica à toxina da Shigella dysenteriae tipo 1, e Stx2, que compartilhasomente 50 a 60% de homologia de aminoácido com Stxl. Tanto Stxl comoStx2 têm sido associadas à doença bastante séria. Acredita-se que Stx, que éliberada por bactérias que residem no lúmen intestinal, é responsável peladoença diarréica, colite hemorrágica, e síndrome hemolítico-urêmica. A toxinaatravessa a barreira epitelial intestinal, entra na corrente sangüínea, e danificaas células vasculares do cólon, rins e do sistema nervoso central.

É sabido que a inibição do crescimento é um desencadeador paraa indução de bacteriófagos que transportam os genes de Stx. Por exemplo,antibióticos múltiplos, incluindo ciproflaxina, norfloxacina, trimetoprinsulfame-toxazol, ampicilina, fosfomicina, furazolidona, mitomicina, cefepima, e tetraci-clina, são conhecidos por aumentarem a produção via indução de um ciclofagolítico. Modelos animais e dados clínicos em seres humanos sugerem quetal indução de toxina é central para a patogênese da doença humana.

Portanto, esse estudo avaliou o efeito da Iactoferrina bovina naprodução de toxina. Vinte cepas de STEC foram estudadas. A quantidade detoxina produzida sob condições inibidoras de crescimento de Iactoferrina foideterminada e comparada à ciprofloxacina, um indutor conhecido da produ-ção de toxina. Na ausência de Iactoferrina ou ciprofloxacina, a quantidade datoxina Stx produzida por STEC foi de 35±14 ng/cavidade. Na presença deciprofloxacina, a quantidade de toxina Stx produzida foi de 6821193ng/cavidade, um aumento de quase vinte vezes. Contudo, na presença daIactoferrina bovina, a quantidade da toxina Stx produzida foi de somente35±14 ng/cavidade. Assim, a Iactoferrina bovina, diferentemente de muitosoutros agentes que comprometem o crescimento bacteriano, o faz sem indu-ção da produção da toxina Stx. A Iactoferrina bovina não aumenta a produ-ção de toxinas por patógenos bacterianos quando crescidos sob as mesmascondições que os patógenos não tendo Iactoferrina bovina. Igualmente, emensaios de indução de fago, nenhuma cepa STEC poderia ser induzida paraentrar em um ciclo lítico quando crescida com uma ampla variedade de con-centrações de Iactoferrina bovina.

Exemplo 5

Esse exemplo ilustra o efeito da Iactoferrina bovina no cresci-mento de Enterobacteriaceae.

Três cepas de bactérias foram utilizadas na presente invenção.

As cepas incluíram EPEC E2348/69, EAEC 042, e Shingella flexneri M90T.

As bactérias do crescimento durante a noite em caldo de Luria foram inocu-Iadas em uma diluição de 1:50 em meio de Eagle modificado por Dulbecco(DMEM) com HEPES 25 mM, pH 7,4, e incubadas a 37°C, em uma incuba-dora com CO2 a 5%, sem agitação. O crescimento bacteriano foi monitoradoespectrofotometricamente em OD6oo, de hora em hora, por sete horas. Uni-dades formadoras de colônia (cfu) foram avaliadas durante o crescimento defase logarítmico (4 horas) em todas as amostras de controle sem bLF.

Neste exemplo, a bLF foi adquirida da Tatua Co-operative DairyCo., Ltd., em Morrinsville, Nova Zelândia. A menos que de outro modo notado,todos os experimentos foram conduzidos usando uma concentração de 10mg/mL (0,125mM) ou 1 mg/mL de bLF, que são aproximadamente as concen-trações presentes no colostro humano e no leite maduro, respectivamente.

Os dados são expressos como média ± desvio padrão (SD) amenos que de outro modo indicado. Para análise do efeito inibidor de cres-cimento da lactoferrina, foram calculadas duas linhas de regressão e a dife-rença entre as duas inclinações de regressão foram então testadas usandoestatística t (Armitage P, 1980). Dados em pares foram então analisadospelo teste de soma das ordens Wilcoxon para diferenças nas médias. Paraanálise do teor de ferro das várias preparações de lactoferrina e seu efeitoinibidor de crescimento, foi calculada uma regressão linear e expressa comoR-quadrado para cada bactéria.

As bactérias tratadas com bLF (EPEC E2348/69, EAEC 042 eShigella flexneri M90T) tinham inicialmente significante inibição de cresci-mento (OD6oo 0,149 vs. 0,831, lactoferrina vs. controle, respectivamente).

Depois da remoção da bLF dos meios, as bactérias apresentaram cresci-mento normal (OD6oo 0,911 vs. 0,828, lactoferrina vs. controle, respectiva-mente). Esse resultado indica que bLF tem efeito inibidor no crescimento deEPEC, EAEC e Shigella. Esse resultado indica também que a bLF tem efeitobacteriostático, e não bactericida, em EPEC, EAEC e Shigella, conforme asbactérias retornaram ao crescimento normal depois da remoção de bLF dosmeios. Esses resultados são mostrados nas Figuras 1 a 3.

Exemplo 6

Esse exemplo ilustra o efeito da concentração e tempo no efeitoinibidor de crescimento de bLF com respeito à EPEC, EAEC e Shigella.Nesse exemplo, a bLF foi adquirida da Tatua Co-operative Dairy Co., Ltd.,em Morrinsville, Nova Zelândia. As bactérias foram incubadas em meios decultura DMEM em presença de preparações de bLF, em 1 mg/mL, 0,1mg/mL e 0,01 mg/mL. As Figuras 4-6 mostram que bLF inibiu o crescimentode EPEC, EAEC e Shigella em um modo dependente de dose. Conforme aconcentração de bLF aumentava, seu efeito inibidor de crescimento tambémaumentava.Exemplo 7

Isso ilustra o efeito da saturação de ferro no efeito inibidor decrescimento da bLF. Para comparar a saturação de ferro de cada prepara-ção de lactoferrina, amostras (10 mg/mL) foram diluídas em Tris 0,1 M, pH8,5 e colocada em uma rotisseria por duas horas. A saturação de ferro foiestimada por determinação do teor de ferro por absorbância em 465 nm(Mazurier e Spik, 1980). O teor de proteína foi estimado por absorbância em280 nm. As razões de ferro/proteína para as várias preparações de lactofer-rina estavam relacionadas a crescimento. Nesse exemplo, uma quantidadede saturação de ferro inverteu o efeito inibidor de crescimento da bLF nabactéria (Figuras 7-9).

Exemplo 8

Esse exemplo ilustra a eficácia de bLF que foi isolada de leiteintegral e tem uma contagem de células somáticas baixa versus as prepara-ções de bLF que foram isoladas de leite em pó e não têm uma contagem decélulas somáticas baixa. Estudos comparativos foram conduzidos usandopreparações de lactoferrina comercialmente disponíveis, mostradas na Tabela 1.

Tabela 1.

<table>table see original document page 28</column></row><table>

Essas preparações de lactoferrina estavam saturadas com apro-ximadamente 10-20% de ferro. As preparações foram diluídas em tampão deamostra (2-mercaptoetanol, dodecil sulfato de sódio e azul de bromofenol a0,1%) em uma concentração final de 1 mg/mL. As amostras foram então re-solvidas em eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de só-dio (SDS-PAGE) e coloridas com azul de coomassie ou coloração com prata.

As várias de preparações de Iactoferrina diferiram em seu efeitoinibidor sobre o crescimento de EPEC, EAEC e Shigella (Figuras 10-12).Cada uma das preparações de bLF foi eficaz em inibir o crescimento deEPEC, EAEC e Shigella. Contudo, em cada experimento, LF-tatua apresen-tou o mais alto efeito inibidor de crescimento sobre EPEC, EAEC e Shigella.LF-Tatua foi isolada de leite bovino integral e tinha uma contagem de célulassomáticas baixa.

Essa variabilidade poderia ser possivelmente explicada pelasdiferenças em seus teores de ferro. O teor de ferro de 5 preparações de Iac-toferrina foi avaliado: bLF-BR20, bLF-BF-10, bLF-Tatua, e bLF-NZMP. Paracada preparação de lactoferrina, o teor de ferro por mg de proteína foi esti-mando por medição de seu OD em 280 (para teor de proteína) e 465 (parateor de ferro). A razão de ferro/proteína para cada preparação foi comparadaao seu efeito no crescimento de EAEC, EPEC e Shigella, em 6 horas. Comoesperado, a preparação com a maior inibição de crescimento (OD diminuído)tinha o menor teor de ferro. A análise de regressão linear indica um R-quadrado de 0,58 para EAEC, 0,55 para EPEC, e 0,81 para Shigella.

Exemplo 9

Esse exemplo ilustra o efeito de bLF na ligação de EAEC. A ca-pacidade da bLF de bloquear a ligação de EAEC foi avaliada em um sistemade ensaio de células HEp-2. Uma camada subcofluente de células HEp-2(aproximadamente 5x104 células/cavidade, em uma placa de 24 cavidades)foi infectada com EAEC em razão de bactérias para alvo de aproximada-mente 100:1. As bactérias provenientes da cultura de noite foram crescidasem bLF por 4 horas, centrifugadas, lavadas, e ressuspensas em meios deadesão (DMEM, HEPES 100mM, pH 7, com 1% de D-manose). Essa sus-pensão bacteriana, com e sem bLF (10, 1, 0,1, 0,01 mg/mL), foi incubadacom as células HEp-2 a 37°C em CO2 a 5%, por 4 horas. A monocamada foientão lavada vigorosamente para remover bactérias não aderentes. A ade-rência de EAEC foi avaliada por microscopia e cfu. Para microscopia, as cé-lulas foram fixadas com metanol a 100% e coloridas com violeta cristal. Paraavaliação de cfu, as células HEp-2 foram tratadas com Triton X-100, diluídasem série em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e cultivadas emplacas de MacConkey.

Um observador cego avaliou qualitativamente o número de bac-térias/célula HEp-2 (0-3+) por microscopia e o padrão agregador caracterís-tico "tijolos empilhados". Na ausência de bLF, havia bactérias 3+/célulasHEp-s com o padrão agregado ou característico (Figura 13). Na presença debLF em 10 mg/mL (Figura 14) e 1 mg/mL, não havia bactérias no campo. Napresença de bLF em 0,1 e 0,01 mg/mL, algumas bactérias aderiram difusa-mente às células HEp-2,mas sem o padrão agregador típico. De modo a ca-racterizar quantitativamente esse efeito, foi medida a quantidade de bacté-rias ligadas às células HEp-2 por cfus. bLF diminuiu a aderência às célulasHEp-2 em 82% e 73% para 10 e 1 mg/mL sem saturação de ferro (p < 0,05para ambos).

Exemplo 10

Esse exemplo ilustra o efeito de saturação de ferro sobre a ade-rência de EAEC às células HEp-2. Em 10 mg/mL de bLF, a aderência deEAEC foi quase que completamente inibida. A inclusão de quantidades satu-radoras de ferro não afetaram o efeito antiaderência. Em 1 mg/mL, o mesmoresultado foi observado.

bLF saturada com aderência diminuída de ferro às células HEp-2em 71% e 60% para 10 e 1 mg/mL, respectivamente (p < 0,05 para ambos)(Figura 15). As cfu em preparações de bLF com ou sem saturação de ferronão foram significantemente diferentes: 7,1 ± 5,8 χ 104 cfu/mL (bLF 10mg/mL com ferro) vs. 4,0 ± 5,1 χ 104 cfu/mL (bLF 10 mg/mL sem ferro) (p =0,386); e 9,8 ± 5,9 χ 104 cfu/mL (bLF 1 mg/mL com ferro) vs. 6,3 ± 5,1 χ 104cfu/mL (bLF 1 mg/mL sem ferro) (p = 0,386). Assim, bLF diminui a aderênciade EAEC às células de cultura sob condições não bacteriostáticas e esteefeito não é dependente de ferro.

Todas as referências citadas neste relatório descritivo, incluindo,sem limitação, todos os artigos, publicações, patentes, pedidos de patente,apresentações, textos, relatórios, manuscritos,, brochuras, livros, postagensna internet, artigos de jornal, periódicos, e similares, são aqui incorporados atítulo de referência neste relatório descritivo, em sua totalidade. A discussãodas referências aqui tem a intenção de meramente resumir as asserçõesfeitas pelos seus autores e não se faz admissão a que qualquer referênciaconstitua anterioridade. As requerentes se reservam o direito de contestar aacuidade e pertinência das referências citadas.

Essas e outras modificações e variações da presente invençãopodem ser praticadas por aqueles versados na técnica, sem se desviar doespírito e escopo da presente invenção, que é mais particularmente estabe-Iecido nas reivindicações apensas. Além disso, deve ser entendido que osaspectos das várias modalidades podem ser intercambiáveis no todo ou emparte. Além disso, aqueles versados na técnica apreciarão que a descriçãoacima é dada apenas a título de exemplo, e não pretende limitar a invençãoainda posteriormente descrita em tais reivindicações apensas. Portanto, oespírito e escopo das reivindicações apensas não devem ser limitados àdescrição das versões preferidas aí contidas.

Claims (63)

1. Método para inibir o crescimento, em um paciente, de um pa-tógeno bacteriano que expressa um sistema de secreção tipo III, o métodocompreendendo administrar ao paciente uma quantidade eficaz de Iactoferrina bovina.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o patógenobacteriano que expressa um sistema de secreção tipo Ill é selecionado dogrupo que consiste em Salmonella, Shigella, Yersinia, Pseudomonas e Es-cherichia.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o patógenobacteriano que expressa um sistema de secreção tipo Ill é selecionado dogrupo que consiste em E. colienteropatogênica e E. colienteroemorrágica.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, em que a E. colienteropatogênica é E. coli E2348/69.

5. Método, de acordo com a reivindicação 3, em que a E. colienteroemorrágica é selecionada do grupo que consiste em STEC TWO-8023, STEC HW1 e STEC 306-7.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o patógenobacteriano que expressa o sistema de secreção tipo Ill é Shigella flexneri.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que a Shigellaflexneri é Shigella flexneri M90T.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a quantida-de eficaz diária está na faixa de cerca de 0,001 mg a cerca de 100 g.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a quantida-de eficaz diária está na faixa de cerca de 0,1 mg a cerca de 10 g.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a quanti-dade eficaz diária está na faixa de cerca de 10 mg a cerca de 1.500 mg.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a bLF éproporcionada em três doses diárias.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a Iactofer-rina bovina foi isolada de leite integral.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a Iactofer-rina bovina tem uma contagem de células somáticas baixa.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a produ-ção de toxina pelos patógenos bacterianos não é aumentada.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a adminis-tração compreende aspersão de Iactoferrina bovina sobre a superfície de umproduto alimentício.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a adminis-tração compreende intermisturar Iactoferrina bovina com os ingredientes deum produto alimentício.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o pacientenecessita de inibição de crescimento de um patógeno bacteriano que ex-pressa um sistema de secreção tipo III.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o pacienteé uma criança ou lactente.

19. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o pacienteé um lactente que não é alimentado com leite materno humano.

20. Método para prevenir ou tratar, em um paciente, uma infec-ção que é causada por um patógeno bacteriano que expressa um sistemade secreção tipo Ill o método compreendendo administrar ao paciente umaquantidade eficaz de Iactoferrina bovina.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, em que a infec-ção é selecionada do grupo que consiste em infecção do trato urinário, me-ningite neonatal, peritonite, shigelose e infecções gastrointestinais.

22. Método, de acordo com a reivindicação 20, em que o pató-geno bacteriano que expressa um sistema de secreção tipo Ill é selecionadodo grupo que consiste em Salmonella, Shigella, Yersinia, e Escherichia

23. Método, de acordo com a reivindicação 20, em que o pató-geno bacteriano que expressa um sistema de secreção tipo Ill é selecionadodo grupo que consiste em E. coli enteropatogênica e E. coli enteroemorrágica.

24. Método, de acordo com a reivindicação 20, em que o pacien-te necessita de prevenção ou tratamento de uma infecção causada por pa-tógeno bacteriano que expressa um sistema de secreção tipo III.

25. Método, de acordo com a reivindicação 20, em que o pacien-te é uma criança ou um lactente.

26. Método, de acordo com a reivindicação 20, em que o pacien-te é um lactente que não é alimentado com leite humano.

27. Método para inibir a aderência de patógenos bacterianos queexpressam um sistema de secreção tipo Ill à parede intestinal de um pacien-te o método compreendendo administrar ao paciente uma quantidade eficazde Iactoferrina bovina.

28. Método, de acordo a reivindicação 27, em que o patógenobacteriano que expressa um sistema de secreção tipo Ill é selecionado dogrupo que consiste em Salmonella, Shigella, Yersinia, e Escherichia.

29. Método, de acordo com a reivindicação 27, em que o pató-geno que expressa um sistema de secreção tipo Ill é selecionado do grupoque consiste em E. colienteropatogênica e E. colienteroemorrágica.

30. Método para causar a liberação prematura de EspB em umpatógeno bacteriano que expressa um sistema de secreção tipo Ill o métodocompreendendo contactar o patógeno bacteriano com uma quantidade efi-caz de Iactoferrina bovina.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, em que o pató-geno bacteriano que expressa um sistema de secreção tipo Ill é selecionadodo grupo que consiste em Salmonella, Shigella, Yersinia, e Escherichia.

32. Método, de acordo com a reivindicação 30, em que o pató-geno bacteriano que expressa um sistema de secreção tipo Ill é selecionadodo grupo que consiste em E. coli enteropatogênica e E. coli enteroemorrágica.

33. Método para causar a degradação de EspB em um patógenobacteriano que expressa um sistema de secreção tipo Ill o método compre-endendo contactar o patógeno bacteriano com uma quantidade eficaz deIactoferrina bovina

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, em que o pató-geno bacteriano que expressa um sistema de secreção tipo Ill é selecionadodo grupo que consiste em Salmonella, Shigella, Yersiniai e Escherichia.

35. Método, de acordo com a reivindicação 33, em que o pató-geno bacteriano que expressa um sistema de secreção tipo Ill é selecionadodo grupo que consiste em E. coli enteropatogênica e E. coli enteroemorrágica.

36. Método para inibir o crescimento de E. colienteroagregadoraem um paciente o método compreendendo administrar ao paciente umaquantidade eficaz de Iactoferrina bovina.

37. Método, de acordo com a reivindicação 36, em que a Iacto-ferrina bovina foi isolada de leite integral.

38. Método, de acordo com a reivindicação 36, em que a Iacto-ferrina bovina tem uma contagem de células somáticas baixa.

39. Método, de acordo com a reivindicação 36, em que a E. colienteroagregadora é E. coli 042.

40. Método, de acordo com a reivindicação 36, em que o pacien-te necessita de inibição de crescimento de E. coli enteroagregadora.

41. Método, de acordo com a reivindicação 36, em que o pacien-te é uma criança ou Iactente.

42. Método, de acordo com a reivindicação 36, em que o pacien-te é um Iactente que não é alimentado com leite humano.

43. Método para prevenir ou tratar uma infecção causada porE coli enteroagregadora em um paciente o método compreendendo admi-nistrar ao paciente uma quantidade eficaz de Iactoferrina bovina.

44. Método, de acordo com a reivindicação 43, em que a Iacto-ferrina bovina foi isolada de leite integral.

45. Método, de acordo com a reivindicação 43, em que a lactò-ferrina bovina tem uma contagem de células somáticas baixa.

46. Método, de acordo com a reivindicação 43, em que a infec-ção é selecionada do grupo que consiste em infecção do trato urinário, me-ningite neonatal, peritonite, shigelose e infecções gastrointestinais.

47. Método, de acordo com a reivindicação 43, em que a E colienteroagregadora é E coli 042.

48. Método, de acordo com a reivindicação 43, em que o pacien-te necessita de prevenção ou tratamento de uma infecção causada por E.coli enteroagregadora.

49. Método, de acordo com a reivindicação 43, em que o pacien-te é uma criança ou lactente.

50. Método, de acordo com a reivindicação 43, em que o pacien-te é um lactente que não é alimentado por leite humano.

51. Método para inibir a aderência de E. coli enteroagregadoraàs células intestinais, o método compreendendo contactar a E. coli enteroa-gregadora com Iactoferrina bovina.

52. Método, de acordo com a reivindicação 51, em que a Iacto-ferrina bovina foi isolada de leite integral.

53. Método, de acordo com a reivindicação 51, em que a Iacto-ferrina bovina tem uma contagem de células somáticas baixa.

54. Método, de acordo com a reivindicação 51, em que a E. colienteroagregadora é E. coli 042.

55. Formulação enteral que compreende Iactoferrina bovina, quefoi isolada de leite integral e tem uma contagem de células somáticas baixa.

56. Formulação, de acordo com a reivindicação 55, que compre-ende, adicionalmente, glicomacropeptídeo de caseína.

57. Formulação, de acordo com a reivindicação 55, que compre-ende, adicionalmente, um ácido graxo poliinsaturado de cadeia longa.

58. Formulação, de acordo com a reivindicação 57, em que oácido graxo poliinsaturado de cadeia longa é selecionado do grupo que con-siste em DHA, ARA e combinações dos mesmos.

59. Formulação, de acordo com a reivindicação 55, que compre-ende, adicionalmente, pelo menos um probiótico.

60. Formulação, de acordo com a reivindicação 59, em que oprobiótico é selecionado do grupo que consiste em LGG, Bb-12 e combina-ções dos mesmos.

61. Formulação, de acordo com a reivindicação 55, que compre-ende, adicionalmente, pelo menos um prebiótico.

62. Formulação, de acordo com a reivindicação 61, em que oprebiótico é selecionado do grupo que consiste em lactulose, galacto-oligossacarídeo, fruto-oligossacarídeo, isomalto-oligossacarídeo, oligossace-rídeos de soja, lactossacarose, xilo-oligossacarídeo e gentio-oligossacarídeo.

63. Formulação, de acordo com a reivindicação 55, em que aformulação enteral é uma fórmula para lactente.