BRPI0611368A2 - formulacões do ligante apo-2/trail - Google Patents

formulacões do ligante apo-2/trail Download PDF

Info

Publication number
BRPI0611368A2
BRPI0611368A2 BRPI0611368-0A BRPI0611368A BRPI0611368A2 BR PI0611368 A2 BRPI0611368 A2 BR PI0611368A2 BR PI0611368 A BRPI0611368 A BR PI0611368A BR PI0611368 A2 BRPI0611368 A2 BR PI0611368A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
trail
apo2l
crystallization
column
cell
Prior art date
Application number
BRPI0611368-0A
Other languages
English (en)
Inventor
Heather Flores
Tanya P Lin
Timothy C Matthews
Roger Pai
Zahra Shahrokh
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of BRPI0611368A2 publication Critical patent/BRPI0611368A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/30—Zinc; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

FORMULAcõES DO LIGANTE APO-2/TRAIL.A presente invencao refere-se geralmente à purificacao de Apo2L/TRAIL, envolvendo cristalizacao.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FORMULAÇÕES DO LIGANTE AP0-2/TRAIL".
Campo Técnico da Invenção
A presente invenção refere-se geralmente à purificação deApo2L/TRAIL, que envolve cristalização.
Antecedentes da Invenção
Várias moléculas, tais como o fator alfa de necrose tumoral("TNF-alfa"), o fator beta de necrose tumoral ("TNF-beta" ou "linfotoxina-alfa") linfotoxima-beta ("LT-beta"), Iigante CD30, Iigante CD27, Iigante CD40,ligante OX-40, Iigante 4-1 BB, Iigante Apo-1 (também referido como IiganteFAS ou Iigante CD95), Iigante Apo-2 (também referido como Apo-2L ouTRAIL, Iigante Apo-3 (também referido como TWEAK), APRIL, Iigante OPG(também referido como Iigante RANK, ODF ou TRANCE), e TALL-1 (tam-bém referido como BIyS1 BAFF, ou THANK) foram identificadas como mem-bros da família de fatores de necrose tumoral ("TNF') de citocinas (vide, porexemplo, Gruss e Dower, Blood 85:3378-3404 (1995); Schmid et ai, Proc.Nati Acad. Sei. USA 83:1881 (1986); Dealtry et ai, Eur. J. Immunoi 17:689(1987); Pitti et ai, J. Bioi Chem. 271:12687-12690 (1996); Wiley et al., Im-munity 3:673-682 (1995); Browning et ai, Cell 72:847-856 (1993); Armitageet ai, Nature 357:80-82 (1992); documento n2 WO 97/01633, publicado em16 de janeiro de 1997; documento n2 WO 97/25428, publicado em 17 de ju-lho de 1997; Marsters et ai, Curr. Bioi 8:525-528 (1998); Chicheportiche etal., Bioi Chem. 272:32401-32410 (1997); Hahne et ai, J. Exp. Med.188:1185-1190 (1998); documento n2 WO 98/28426, publicado em 2 de julhode 1998; documento n2 WO 98/46751, publicado em 22 de outubro de 1998;documento n2 WO 98/18921, publicado em 7 de maio de 1998; Moore et ai,Science 285:260-263 (1999); Shu et ai, J. Leukocyte Bioi 65:680 (1999);Schneider et ai, J. Exp. Med. 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et ai,J. Bioi Chem. 274:15978-15981 (1999)). Dentre estas moléculas, TNF-alfa,TNF-beta, Iigante CD30, Ligante 4-1 BB, Iigante Apo-1, Iigante Apo-2(Apo2üTRAIL) e Iigante Apo-3 (TEAK) foram relatados como estando envol-vidas na morte celular apoptótica.Apo2UTRAIL foi identificado há vários anos como um membroda famíla dos TNFs de citocinas (vide, por exemplo, Wiley et ai, Immunity3:673-682 (1995); Pitti et ai, J. Biol. Chem. 271:12687-12690 (1996)). O po-lipeptídeo Apo2L/TRAIL humano de comprimento inteiro é uma proteínatransmembrana Tipo Il que tem um comprimento de 281 aminoácidos. Al-gumas células podem produzir uma forma solúvel natural do polipeptídeo,através da clivagem enzimática da região extracelular do polipeptídeo (Mari-ani et ai, J. Cell Biol. 137:221-229 (1997)). Estudos cristalográficos de for-mas solúveis de Apo2L/TRAIL revelam uma estrutura homotrimérica similaràs estruturas de TNF e outras proteínas correlatas (Hymowitz et ai, Molec.Cell 4:563-571 (1999); Hymowitz et ai, Biochemistry 39:633:644 (2000)).Apo2L/TRAIL, diferentemente de outros membros da família de TNFs, entre-tanto, demonstrou ter uma característica estrutural singular pelo fato de quetrês resíduos de cisteína (na posição 230 de cada subunidade no homotrí-mero), em conjunto, coordenam um átomo de zinco, e que a ligação de zincoé importante para a estabilidade do trímero e para a atividade biológica (Hy-mowitz etal., supra; Bodmer et ai, J. Biol. Chem. 275:20632-20637 (2000)).
Foi relatado na literatura que Apo2L/TRAIL pode desempenharum papel na modulação do sistema imunológico, incluindo doenças auto-imunes, tais como artrite reumatóide, e no tratamento de HIV (vide, por e-xemplo, Thomas et ai, J. Immunol. 161:2195-2200 (1998); Johnsen et ai,Cytokine 11:664-672 (1999); Griffith et ai, J. Exp. Med. 189:1343-1353(1999); Song etal., J. Exp. Med. 191:1095-1103 (2000); Jeremias et ai, Eur.J. Immunol. 28:143-152 (1998); Katsikis et ai, J. Exp. Med. 186:1365-1372(1997); Miura etal., J. Exp. Med. 193:651-660 (2001)).
As formas solúveis de Apo2L/TRAIL foram relatadas tambémcomo indutoras da apoptose em uma série de células cancerosas in vitro,incluindo tumores no cólon, pulmão, mama, próstata, bexiga, rim, ovário ecérebro, bem como melanoma, leucemia e mieloma múltiplo (vide, por e-xemplo, Wiley et ai, supra; Pitti et ai, supra; Rieger et ai, FEBS Lett.427:124-128 (1998); Ashkenazi etal., J. Clin. Invest. 104:155-162 (1999);Walczak et ai, Nature Med. 5:157-163 (1999); Keane et ai, Câncer Res.59:734-741 (1999); Mizutani et aí., Clin. Câncer Res. 5:2605-2612 (1999);Gazitt, Leukemia 13:1817-1824 (1999); Yu et ai, Câncer Res. 60:2384-2389(2000); Chinnaiyan et aí., Proc. Natl. Acad. Sei. 97:1754-1759 (2000)). Estu-dos in vivo em modelos de tumores murinos sugerem ainda que A-po2/TRAIL, isoladamente ou em combinação com quimioterapia ou terapiade radiação, pode exercer substanciais efeitos antitumorais (vide Ashkenaziet ai., supra; Walzcak et ai., supra; Gliniak et ai, Câncer Res. 59:6153-6158(1999); Chinnaiyan et ai, supra; Roth et ai, Biochem. Biophys. Res. Comm.265:1999 (1999)). Em contraste com muitos tipos de células cancerosas, amaioria dos tipos de células normais parecem ser resistentes à indução deapoptose por certas formas recombinantes de Apo2LTTRAIL (Ashkenazi etai, supra; Walczak et ai., supra). Jo et ai., relataram que uma forma solúvelde Apo2L/TRAIL marcada com poliistidina induziu apoptose in vitro em hepa-tócitos humanos isolados normais, porém não em não-humanos (Jo et ai,Nature Med. 6:564-567 (2000); vide também Nagata, Nature Med. 6:502-503(200)). Acredita-se que certas preparações de Apo2/TRAIL recombinantepodem variar em termos de propriedades bioquímicas e atividades biológi-cas sobre células doentes versus normais, dependendo, por exemplo, dapresença ou ausência de uma molécula marcadora, teor de zinco, e teorpercentual de trímero (vide Lawrence et ai, Nature Med. Lett. to the Editor7:383-385 (2001); Qin et ai, Nature Med. Lett. to the Editor 7:385-386(2001)).
Acredita-se que a indução de várias respostas celulares media-das por essas citocinas da família de TNFs seja iniciada por sua ligação areceptores de células específicos. Anteriormente, dois receptores de TNFdistintos de aproximadamente 55 kDa (TNFR1) e 75 kDa (TNFR2) foramidentificados (Hohman et ai, J. Bioi Chem. 264:14927-14934 (1989); Broc-khaus et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA 87:3127-3131 (1990); documento n2EP 417.563, publicado em 20 de março de 1991; Loetscher et ai, 61:351(1990); Schall et ai, Ceii 61:361 (1990); Smith et al., Science 248:1019-1023(1990); Lewis et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:2830-2834 (1991); Good-win et ai, Mol. CeiiBioi 11:3020-3026 (1991)). Esses TNFRs demonstraramcompartilhar a estrutura típica de receptores da superfície celular, incluindoas regiões transmembrana extracelular e intracelular. As partes extracelula-res de ambos receptores demonstraram ser também naturalmente proteínasde ligação a TNF (Nophar, Y. et ai, Embo J. 9:3269 (1990); Kohno, T. et al.,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:8331 (1990); Hale et al., J. Cell Biochem.Supplement 15F, 1991, página 113 (P24)).
A parte extracelular dos TNFRs tipo 1 e tipo 2 (TNFR1 e TNFR2)contém um padrão de seqüências de aminoácidos repetido de quatro domí-nio ricos em cisteína (CRDs) designados 1 a 4, partindo do terminal NH2 (S-chall et al., supra; Loetscher et al., supra; Smith et al., supra; Nophar et al.,supra; Kohno et al., supra; Banner et al., Cell 73:431 -435 (1993)). Existe umpadrão repetitivo similar de CRDs em várias outras proteínas da superfíciecelular, incluindo o receptor do fator do crescimento nervoso p75 (NGFR)(Johnson et al., Cell 47:545 (1986); Radeke et al., Nature 325:593 (1987)), oantígeno de células B CD40 (Stamenkovic et al., EMBO J. 8:1403 (1989)), oantígeno de células T 0X40 (Mallet et al., EMBO J. 9:1063 (1990)), e o antí-geno Fas (Yonehara et al., supra; e Itoh et al., Cell 66:233-243 (1991)). AsCDRs são encotradas também nas proteínas T2 semelhantes a TNFR solú-vel (sTNFR) dos poxvírus de Shope e mixoma (Upton et ai, Virology 160:20-29 (1987); Smith et al., Biochem. Biophys. fíes. Commun. 176:335 (1991);Upton et ai, Virology 184:370 (1991)). O alinhamento ótimo destas seqüên-cias indica que as posições dos resíduos de cisteína são bem conservadas.Estes receptores são algumas vezes referidos como membros da superfamí-Iia de receptores de TNF/NGF.
Os ligantes da família de TNF identificados até agora, com a ex-ceção da linfotoxina-beta, são tipicamente proteínas trasmembrana do tipo II,cujo terminal C é extracelular. Em contraste, a maioria dos receptores nafamília de receptores de TNF (TNFR) identificada até agora são tipicamenteproteínas transmembrana do tipo I. Em ambas famílias de Iigantes e recepto-res de TNF, entretanto, a homologia identificada entre membros das famíliasfoi encontrada principalmente no domínio extracelular ("ECD"). Várias dascitocinas da família de TNF, incluindo TNF-alfa, Iigante Apo-1 e IiganteCD40, são clivadas de forma proteolítica na superfície celular; a proteínaresultante em cada caso forma tipicamente uma molécula homotrimérica quefunciona como uma citocina solúvel. As proteínas das famílias de receptoresde TNF também são usualmente clivadas de forma proteolítica para liberardomínios extracelulares (ECDs) de receptores solúveis que podem funcionarcom inibidores das citocinas cognatas.
Pan et a/.descreveram outro membro das famílias de receptoresde TNF referido como "DR4" (Pan et ai, Science 276:111-113 (1997); videtambém documento n2 WO 98/32856, publicado em 30 de julho de 1998)).DR4 foi relatado como contendo um domínio de morte citoplasmática capazde engatar no aparelho de suicídeo de células. Pan et ai descrevem queDR4 supostamente é um receptor do Iigante conhecido como Apo2L/TRAIL.
Em Sheridan et ai, Science 277:818-821 (1997) e Pan et ai.,Science 277:815-818 (1997), está descrita outra molécula que supostamenteé um receptor para Apo2L/TRAIL (vide também documentos n— WO98/51793, publicado em 19 de novembro de 1998, e WO 98/41629, publica-do em 24 de setembro de 1998). Esta molécula é referido como DR5 (ela foitambém referida alternativamente como Apo-2; TRAIL-R, TR6, Tango-63,hAP08, TRICK2 ou KILLER (Screaton et ai, Curr. BioL 7:693-696 (1997);Walczak et ai, EMBO J. 16:5386-5387 (1997); Wu et ai, Nature Genetics17:141-143 (1997); documentos n- WO 98/35986, publicado em 20 de a-gosto de 1998; EP 870.827, publicado em 14 de outubro de 1998; WO98/46643, pulicado em 22 de outubro de 1998; WO 99/02653, publicado em21 de janeiro de 1999; WO 99/09165, publicado em 25 de fevereiro de 1999;WO 99/11791, publicado em 11 de março de 1999). Similarmente a DR4,relata-se que DR5 contém um domínio de morte citoplasmática e é capaz desinalizar a apoptose. A estrutura cristalina do complexo formado entre A-po2LVTRAIL e DR5 está descrita em Hymovitz et ai, Molecular Cell 4:563-571 (1999).
Um outro grupo de receptores recém-identificados é referidocomo "receptores-chamarizes" que supostamente funcionam como inibidoresao invés de transdutores de sinalização. Este grupo inclui DCR1 (referidotambém como TRIDj LIT ou TRAIL-R3) (Pan et ai, Science 276:111-113(1999); Sheridan et ai, Science 277:818-821 (1997); McFarIane et ai., J. Bi-oi Chem. 272:25417-25420 (1997); Schneider et ai, FEBS Letters 416:329-334 (1999); Degli-Esposti et ai, J. Exp. Med. 186:1165-1170 (1997); eMongkolsapaya et ai, J. Immunol. 160:3-6 (1998)); e DCR2 (denominadotambém TRUNDD ou TRAIL-R4) (Marsters et ai, Current Bioi 7:1003-1006(1997); Pan et ai, FEBS Letters 424:41 -45 (1998); Degli-Esposti et ai, Im-munity 7:813-820 (1997)), sendo ambas moléculas da superfície celular,bem como OPG (Simonet et ai, supra; Emery et ai, infra) e DCR3 (Pitti etai, Nature 396:699-703 (1998)), sendo que ambas são proteínas solúveissecretadas. Relatou-se que Apo2UTRAIL se liga a receptores referidos co-mo DcR1, DcR2 e OPG.
Acredita-se que Apo2LVTRAIL atue através dos "receptores demorte" da superfície celular, DR4 e DR5, para ativar caspases, ou enzimasque conduzem o programa de morte celular. Depois da ligação do ligante,DR4 e DR5 conseguem disparar a apoptose independentemente recrutandoe ativando o iniciador da apoptose, caspase-8, através da molécula adapta-dora que contém o domínio da morte, referida como FADD/Mort1 (Kischkelet al., Immunity 12:611-620 (2000); Sprick et ai, Immunity 12:599-609(2000); Bodmer et ai, Nature Cell Biol. 2:241 -243 (2000)). Em contraste comDR4 e DR5, os receptores DcR 1 e DcR2 não sinalizam a apoptose.
Para obter uma revisão sobre a família TNF de citocinas e seusreceptores, vide Ashkenazi e Dixit, Science 281:1305-1308 (1998); Ashke-nazi e Dixit, Curr. Opin. Cell Biol. 11:255-260 (2000); Glostein, Curr. Biol.7:750-753 (1997); Gruss e Dower, supra; Nagata, Cell 88:355-365 (1997); eLocksley et ai, Cell 104:487-501 (2001).
Sumário da Invenção
Certas proteínas, tais como Apo2L/TRAIL, e outros membros dafamília TNF de citocinas, apresentam atividade biológica quando a proteínaé um trímero ou está na forma trimérica. Assim sendo, com os propósitos deuso terapêutico ou mesmo diagnóstico, são desejada formulações dessasproteínas nas quais a proteína é estável e permanece biologicamente ativa,particularmente estável em uma forma trimérica.
A requerente descobriu surpreendentemente que a estrutura mo-lecular singular de Apo2L/TRAIL, sob certas condições, permite que ela cris-talize espontaneamente. Esta propriedade permitiu o desenvolvimento deum processo de recuperação/purificação eficiente e passível de aumento dovolume de produção para Apo2LVTRAIL, que utiliza cristalização como umaetapa de purificação. Além disso, a experiência obtida com Apo2L/TRAILpermitiu o desenvolvimento de um processo de um processo de recuperaçãoe purificação, que envolve cristalização, e que pode ser usado para proteí-nas capazes de cristalização em geral.
Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método pa-ra recuperar Apo2L/TRAIL a partir de uma mistura que compreende
(a) carregar a mistura em uma coluna de troca catiônica;
(b) lavar a coluna de troca catiônica com um tampão de equilí-brio, com o que os componentes não-ligantes presentes na mistura são re-movidos;
(c) eluir Apo2UTRAIL. ligado à coluna de troca catiônica com umtampão de eluição;
(d) resfriar gradualmente o eluído até uma temperatura de cercade 2 e 4°C, com o que Apo2LVTRAILé precipitada espontaneamente em umaforma cristalina, para produzir uma mistura de licor-mãe e cristais deApo2L/TRAIL; e
(e) recuperar Apo2L/TRAIL a partir da mistura da etapa (d) comuma pureza de pelo menos cerca de 99%.
Em uma modalidade específica, a mistura carregada na colunade troca catiônica é um meio de cultura ou Iisado celular de células produto-ras de Apo2L/TRAIL.
Em outra modalidade, a mistura é o Iisado celular de célulashospedeiras de E. coli produtoras de Apo2L/TRAIL.
Em ainda outra modalidade, o Iisado é clarificado antes de car-regar na coluna de troca catiônica.
Em outra modalidade, o eluído obtido na etapa (c) é submetido àetapa de cristalização (d) sem purificação adicional.
A coluna de troca catiônica pode ser, por exemplo, uma colunaSP-Sepharose.
Em ainda outra modalidade, o pH da mistura carregada na colu-na de troca catiônica (por exemplo, SP-Sepharose) é ou é ajustado paracerca de 7,5. A eluição de Apo2L/TRAIL pode ser realizada, por exemplo,em um tampão de eluição que compreende NaCI 100-200 mM ou Na2SC>4100-150 mM, em um tampão que ajusta o pH para 7,5-7,8.
Em outras modalidades, na etapa (d), o eluído é resfriado deuma temperatura de cerca de 15 a 30°C para uma temperatura de cerca de2 a 8°C em cerca de uma a 60 horas, ou até uma temperatura de cerca de 2a 8°C em cerca de uma a 8 horas, ou até uma temperatura de cerca de 2 a8°C em cerca de uma hora, ou até uma temperatura de cerca de 4°C emcerca de uma hora.
Em ainda outra modalidade, o pH do eluído é ou é ajustado parapH 7,0-8,0, tal como pH 7,3, antes da cristalização.
Em outra modalidade, o pH do eluído é ou é ajustado para pH7,5-8,0, depois da cristalização.
Em uma modalidade adicional, na etapa (d), a temperatura decerca de 2 a 4°C é mantida até que seja atingida ou quase atingida a solubi-Iidade em equilíbrio de Apo2L/TRAIL.
No curso da realização do método da invenção, na etapa (d), asolubilidade de Apo2L/TRAIL pode ser diminuída pela adição de um anti-solvente, tal como, por exemplo, polietilenoglicol (PEG), MPD, etanol, iso-propanol e/ou dioxano.
Assim sendo, por exemplo, PEG com um peso molecular entrecerca de 400 e cerca de 10.000 dáltons é usado como um anti-solvente. Emoutras modalidades representativas, o peso molecular do PEG é 400, 3.350ou 10.000 dáltons.
Em outra modalidade, na etapa (e), Apo2L/TRAIL é recuperadona forma de cristais separados do licor-mãe por filtração ou centrifugação ouuma combinações destes procedimentos. O pH do licor-mãe pode ser ajus-tado para cerca de 8,0 antes da filtração para diminuir a solubilidade.
Em outro aspecto, o método de recuperação/purificação da pre-sente invenção compreende ainda as etapas de dissolver os cristais de A-po2L/TRAIL obtidos na etapa (d) do método descrito acima, e submeter asolução obtida a uma segunda etapa de purificação cromatográfica.
Em uma modalidade, a segunda etapa de purificação cromato-gráfica é cromatografia por interação hidrofóbica, que pode ser realizada, porexemplo, em uma coluna Phenyl-Sepharose.
Em outra modalidade, a segunda etapa de purificação cromato-gráfica é uma cromatografia de troca iônica realizada, por exemplo, em umacoluna CM-Sepharose ou SP-Sepharose.
Em outra modalidade, Apo2L/TRAIL é recuperado e formuladodepois da segunda etapa de purificação cromatográfica por ultrafiltração-diafiltração
Em modalidades adicionais, a pureza da proteína purificada é depelo menos cerca de 99,5% ou pelo menos 99,9%.
Breve Descrição dos Desenhos
A Figura 1 ilustra a seqüência de nucleotídeos do DNAc deApo2LVTRAIL humano (SEQ ID N9: 2) e sua seqüência de aminoácidos deri-vada (SEQ ID N9: 1). O "N" na posição do nucleotídeo 447 (em SEQ ID NO2) é usado para indicar que a base de nucleotídeos pode ser um "T" ou "G".
A Figura 2 ilustra um gel de coloração prata de SDS-PAGE, ilus-trando a pureza das preparações de Apo2L/TRAIL descritas.
A Figura 3 ilustra os efeitos de vários sais sobre a cristalizaçãode Apo2L/TRAIL.
A Figura 4 ilustra as distribuições dos tamanhos dos cristais emequilíbrio para rampas de temperatura entre 22°C e 2°G durante períodos deresfriamento de 1, 4, 8 e 24 horas.
A Figura 5 ilustra o efeito da adição de PEG sobre a solubilidadede Apo2L/TRAIL: 5 dias de agitação a 2-8°C.Descrição Detalhada da Invenção
A. Definições
O termo "membro da família de TNF" é utilizado em um sentidoamplo para se referir a vários polipeptídeos que compartilham alguma simila-ridade com o fator de necrose tumoral (TNF), com relação à estrutura oufunção. Certas características estruturais e funcionais associadas com a fa-mília TNF de polipeptídeos são conhecidas nessas técnicas e estão descri-tas, por exemplo, na seção "Antecedentes da Invenção" acima. Tais polipep-tídeos incluem, porém sem limitações, aqueles polipeptídeos referidos nes-sas técnicas como TNF-alfa, TNF-beta, Iigante CD30, Iigante CD27, IiganteCD40, Iigante OX-40, Iigante 4-1 BB, Iigante Apo-1 (também referido comoIigante Fas ou Iigante CD95), Iigante Apo-2 (também referido como Apo-2L/TRAIL (ou referido também como TRAIL), Iigante Apo-3 (também referidocomo TWEAK), APRIL, Iigante OPG (também referido como Iigante RANK,ODF ou TRANCE), e TALL-1 (também referido como BIyS, BAFF, ouTHANK) (vide, por exemplo, Gruss é Dower, Blood 85:3378-3404 (1995);Pitti et ai, J. Bio/. Chem. 271:12687-12690 (1996); Wiley et al., Immunity3:673-682 (1995); Browning et ai, Cell 72:847-856 (1993); Armitage et ai,Nature 357:80-82 (1992); publicações PCT n25 WO 97/01633 e WO97/25428; Marsters et ai, Curr. Biol. 8:525-528 (1998); Chicheportiche et ai,Bioi Chem. 272:32401-32410 (1997); Hahne et ai, J. Exp. Med. 188:1185-1190 (1998); publicações PCT n25 WO 98/28426, WO 98/46751, e WO98/18921; Moore et ai, Science 285:260-263 (1999); Shu et ai, J. LeukocyteBiol. 65:680 (1999); Schneider et ai, J. Exp. Med. 189:1747-1756 (1999);Mukhopadhyay et ai, J. Biol. Chem. 274:15978-15981 (1999)).
Os termos "Apo2L/TRAIL", "Apo2L", "ligante Apo-2", e "TRAIL"são aqui utilizados para se referir a uma seqüência de polipeptídeo que incluios resíduos de aminoácidos 114-281, inclusive, 95-281, inclusive, os resí-duos 91-281, inclusive, os resíduo 41-281, inclusive, os resíduos 15-281,inclusive, ou os resíduos 1-281, inclusive, da seqüência de aminoácidos ilus-trada na Figura 1 (SEQ ID NQ: 1), bem como os fragmentos biologicamenteativos, variantes conseqüentes de deleções, inserções ou substituições dasseqüências acima. Em uma modalidade, a seqüência do polipeptídeo com-preende os resíduos 114-281 da Figura 1 (SEQ ID NQ: 1), e opcionalmente,consiste nos resíduos 114-281 da Figura 1 (SEQ ID NQ: 1). Opcionalmente, aseqüência do polipeptídeo compreende os resíduos 92-281 ou os resíduos91-281 da Figura 1 (SEQ ID NQ: 1). Os polipeptídeos Apo-2L podem ser co-dificados pela seqüência de nucleotídeos nativa ilustrada na Figura 1 (SEQID N5: 2). Opcionalmente, o códon que codifica o resíduo Prol 19 (Figura 1;SEQ ID NQ: 2) pode ser "CCT" ou "CCG". Em outras modalidades, os frag-mentos ou variantes são biologicamente ativos e têm pelo menos 80% deidentidade da seqüência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos90% de identidade de seqüência, e ainda mais preferivelmente, pelo menos95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência com qualqueruma das seqüências de Apo2L/TRAIL enunciadas acima. Opcionalmente, opolipeptídeo Apo2L/TRAIL é codificado por uma seqüência de nucleotídeosque hibridiza sob condições severas com a seqüência codificadora do poli-peptídeo fornecida na Figura 1 (SEQ ID N9: 2). A definição engloba variantesconseqüentes de substituições de Apo2L/TRAIL, nas quais pelo menos umdos seus aminoácidos nativos é substituído por um resíduo de alanina. Asvariantes conseqüentes de substituições específicas de Apo2L/TRAIL inclu-em aquelas nas quais pelo menos um aminoácido é substituído por um resí-duo de alanina. Estas variantes conseqüentes de substituições incluem a-quelas identificadas, por exemplo, como "D203A", "D218A" e "D269A". Estanomenclatura é utilizada para identificar variantes de Apo2L/TRAIT nasquais os resíduos de ácido aspártico nas posições 203, 218 e/ou 269 (usan-do a numeração indicada na Figura 1 (SEQ ID Ne: 1)) são substituídos porresíduos de alanina. Opcionalmente, as variantes de Apo2L7TRAIT podemcompreender uma ou mais das substituições de alanina que estão enuncia-das na Tabela I do pedido de patente PCT publicado n2 WO 01/00832. Asvariantes conseqüentes de substituições incluem uma ou mais das substitui-ções de resíduos identificadas na Tabela I do pedido de patente PCT publi-cado ns WO 01/00832, publicado em 4 de janeiro de 2001. A definição en-globa também uma seqüência nativa de Apo2L/TRIAL isolada a partir deuma fonte de Apo2L/TRIAL ou preparada por métodos recombinantes ousintéticos. O Apo2L/TRAIL da invenção inclui os polipeptídeos referidos co-mo Apo2L/TRAIL ou TRAIL descritos nas publicações PCT n- WO 97/01633e WO 97/25428. Os termos "Apo2L/TRAIL" ou "Apo2L" são usados para sereferir geralmente às formas de Apo2LVTRAIL que incluem as formas mono-méricas, diméricas ou triméricas do polipeptídeo. Toda numeração de resí-duos de aminoácidos referida na seqüência de Apo2L usa a numeração deacordo com a Figura 1 (SEQ ID Ne: 1), a menos que especificamente indica-do de outra forma. Por exemplo, "D203" ou "Asp203" refere-se ao resíduo deácido aspártico na posição 203 da seqüência fornecida na Figura 1 (SEQ ID Ne: 1).
O termo "domínio extracelular de Apo2L/TRAIL" ou "ECD deApo2UTRAIL" refere-se a uma forma de Apo2L/TRAIL que é essencialmenteisenta de domínios transmembrana e citoplasmáticos. Normalmente, o do-mínio extracelular (ECD) deve ter menos do que 1% desses domíniostransmembrana e citoplasmáticos, e de preferência, deve ter menos do que0,5% desses domínios. Deve-se entender que qualquer domínio transmem-brana identificado para os polipeptídeos da presente invenção são identifica-dos segundo critérios empregados rotineiramente as técnicas para identificaresse tipo de domínio hidrofóbico. Os limites exatos de um domínio trans-membrana podem variar, porém mais possivelmente em não mais do quecerca de 5 aminoácidos em cada extremidade do domínio como identificadoinicialmente. Em modalidades preferidas, o ECD deve consistir em uma se-qüência do domínio extracelular solúvel do polipeptídeo, que é isenta dosdomínios intracelulares transmembrana e citoplasmáticos (e não é ligado àmembrana). As seqüências dos domínios extracelulares específicas deApo2LVTRAIL estão descritas nas publicações PCT n- WO 97/01633 e WO97/25428.
O termo "monômero de Apo2L/TRAIL" ou "monômero de Apo2L"refere-se a uma cadeia covalente de uma seqüência de domínio extracelularde Apo2L.
O termo "dímero de Apo2L/TRAIL" ou "dímero de Apo2L" refere-se a dois monômeros de Apo2L unidos em uma ligação covalente por inter-médio de uma ligação dissulfeto. O termo, como aqui utilizado, inclui díme-ros de Apo2L autônomos e dímeros de Apo2L que estão dentro de formastriméricas de Apo2L (isto é, associados com outro, um terceiro, monômerode Apo2L).
O termo "trímero de Apo2UTRAIL" ou "trímero de Apo2L" refere-se a três monômeros de Apo2L que estão associados de forma não-covalente.
O termo "agregado de Apo2L/TRAIL" é utilizado para se referir aformas oligoméricas superiores auto-associadas de Apo2L/TRAIL, tais comotrímeros de Apos2L/TRAIL que formam, por exemplo, formas hexaméricas enanoméricas de Apo2LVTRAIL.
A determinação da presença e da quantidade de monômero,dímero ou trímero (ou outros agregados) de Apo2LVTRAIL pode ser feitausando métodos e ensaios conhecidos nessas técnicas (e usando materiaisdisponíveis no mercado), tais como HPLC por exclusão de tamanho nati-vo("SEC"), exclusão de tamanho desnaturador, usando dodecil-sulfato desódio ("SDS-SEC"), HPLC em fase reversa, eletroforese capilar, e incluindoos métodos descritos mais detalhadamente nos exemplos abaixo.
O termo "marcado", quando aqui utilizado, refere-se a um poli-peptídeo quimérico que compreende Apo2L/TRAIL ou uma parte dele, fundi-do a um "polipeptídeo-marcador". O polipeptídeo-marcador tem resíduossuficientes para proporcionar um epítopo contra o qual um anticorpo podeser produzido ou para proporcionar alguma outra função, tal como quelaçãode íons metálicos, mas ainda assim é curto o suficiente de tal modo que elegeralmente não interfira com a atividade da citocina da família do TNF.O polipeptídeo marcador, de preferência, é também razoavelmente singular,de tal modo que um anticorpo específico do marcador não sofra substanci-almente reações cruzadas com outros epítopos. Os polipeptídeos marcado-res apropriados têm geralmente pelo menos seis resíduos de aminoácidos eusualmente entre cerca de 8 e cerca de 50 resíduos de aminoácidos (de pre-ferência, entre cerca de 10 e cerca de 2 resíduos).O termo "íon de metal bivalente" refere-se a um metal que temduas cargas positivas. Os exemplos de íons de metais bivalentes incluem,porém sem limitações, zinco, cobaltò, níquel, cádmio, magnésio e manga-nês. As formas específicas desses metais, que podem ser empregadas, in-cluem as formas de sais (por exemplo, formas de sais farmaceutícamenteaceitáveis), tais como as formas de cloreto, acetato, carbonato, citrato e sul-fato dos íons de metais bivalentes mencionados. Opcionalmente, um íon demetal bivalente para uso na presente invenção é zinco, e de preferência, aforma de sal sulfato de zinco ou cloreto de zinco.
O termo "isolado", quando usado para descrever as várias prote-ínas aqui descritas, significa uma proteína que foi identificada e separadae/ou recuperada a partir de um componente seu ambiente natural. Os com-ponentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que tipica-mente interfeririam com usos diagnósticos ou terapêuticos da proteína, epodem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não-proteináceos. Em modalidades preferidas, a proteína deve ser purificada (1)até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos do terminal N ouuma seqüência de aminoácidos internos pelo uso de um seqüenciador decopo centrifugante, ou (2) até a homogeneidade por SDS-PAGE sob condi-ções não-redutoras ou redutoras, usando coloração com azul de Coomassie,ou, de preferência, prata, ou (3) até a homogeneidade por técnicas espec-troscópicas de massas para mapeamento de peptídeos. A proteína isoladainclui proteína in situ dentro de células recombinantes, pois pelo menos umcomponente do ambiente natural de Apo2L/TRAIL não estará presente.Normalmente, entretanto, a proteína isolada deve ser preparada por pelomenos uma etapa de purificação.
Uma molécula de ácido nucléico de Apo2L/TRAIL "isolada" éuma molécula de ácido nucléico que é identificada e separada a partir depelo menos uma molécula de ácido nucléico contaminante com a qual elaestá normalmente associada na fonte natural do ácido nucléico deApo2UTRAIL. Uma molécula de ácido nucléico de Apo2L/TRAIL isolada édiferente na forma ou ambiente no qual ela é encontrada na natureza. Asmoléculas de ácidos nucléicos de Apo2L/TRAIL isoladas são, portanto, dis-tinguidas da molécula de ácido nucléico de Apo2L/TRAIL como ela existe emcélulas naturais. Entretanto, uma molécula de ácido nucléico deApo2L/TRAIL isolada inclui moléculas de ácidos nucléicos de Apo2üTRAILcontidas em células que normalmente expressam Apo2L/TRAIL, onde, porexemplo, a molécula de ácido nucléico está em um local cromossômico dife-rente daquele de células naturais.
O termo "Porcentagem (5) de identidade de seqüências de ami-noácidos", com relação às seqüências aqui identificadas, é definida como aporcentagem de resíduos de aminoácidos em uma seqüência-candidata, quesão idênticos aos resíduos de aminoácidos na seqüência de Apo2L/TRAIL,depois de alinhar as seqüências e introduzir lacunas, caso necessário, paraatingir a máxima identidade percentual de seqüências, e não considerandoquaisquer substituições conservativas como parte da identidade de seqüên-cias. O alinhamento com o propósito de determinar a máxima identidadepercentual pode ser realizado de várias maneiras que estão dentro do co-nhecimento dos versados nessas técnicas que podem determinar os parâ-metros apropriados para medir o alinhamento, incluindo designar os algorit-mos necessários para atingir o máximo alinhamento em todas as seqüênciasde comprimento inteiro que estão sendo comparadas. Para os presentespropósitos, os valores da identidade percentual de aminoácidos podem serobtidos usando o programa de computador para comparação de seqüências,ALIGN-2, que foi desenvolvido pela Genentech1 Inc., e o código de fontesque foi depositado com a documentação do usuário no Copyright Office,Washington, DC, 20559, registrado sob o número TXU510087 do US Cop-yright Registration. O programa ALIGN-2 está disponível para o público atra-vés da Genentech, Inc., South San Francisco, CA. Todos os parâmetros dacomparação de seqüências são estabelecidos pelo programa ALIGN-2 e nãovariam.
A "severidade" das reações de hibridização é determinada facil-mente pelos versados nessas técnicas, e é geralmente um cálculo empíricodependente do comprimento da sonda, temperatura de lavagem, e concen-tração de sais. Geralmente, sondas mais longas requerem temperaturasmas altas para o anelamento apropriado, enquanto que sondas mais curtasnecessitam temperaturas mais baixas. A hibridização depende geralmenteda capacidade de o DNA desnaturado voltar a anelar quando filamentoscomplementares estão presentes em um ambiente abaixo da sua temperatu-ra de fusão. Quanto mais alto o grau da identidade desejada entre a sonda ea seqüência hibridizável, mais alta a temperatura relativa que pode ser usa-da. Como resultado, segue-se que temperaturas relativas mais altas tenderi-am a tornar as condições da reação mais severas, enquanto que temperatu-ras mais baixas menos assim. Para obter mais detalhes e explicações sobrea severidade das reações de hibridização, vide Ausubel et al., "Current Pro-tocols in Molecular Biology", Wiley Interscience Publishers (1995).
As "condições de alta severidade", como aqui definidas, sãoidentificadas por aquelas que: (1) empregam baixa intensidade iônica e altatemperatura de lavagem; cloreto de sódio 0,015 M/citrato de sódio 0,0015M/0,1% de dodecil-sulfato de sódio a 50°C; (2) empregam, durante a hibridi-zação, um agente desnaturador; formamida a 50% em volume com 0,1% dealbumina de soro bovino/0,1% de Ficoll/0,1% de poli(vinil-pirrolidona)/tampãode fosfato de sódio 50 mM em pH 6,5 com coreto de sódio 750 mM, citratode sódio 75 mM a 42°C; ou (3) empregam formamida a 50%, 5 χ SSC (NaCI0,75 M, citrato de sódio 0,075 M), fosfato de sódio 50 nM (pH 6,8), 0,1% depirofosfato de sódio, 5 χ solução de Dernhardt, DNA do esperma de salmãopassado por ultra-som (50 μg/mL), ,1% de SDS, e 10% de sulfato de dextra-no a 42°C, com lavagens a 42°C em 0,2 SSC (cloreto de sódio/citrato desódio) e formamida a 50% a 55°C, e em seguida, uma lavagem de alta seve-ridade que consiste em 0,1 χ SSC contendo EDTA a 55°C.
As "condições moderadamente severas" podem ser identificadascomo descrito por Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manu-al", New York: Cold Spring Harobor Press, 1989, e incluem incubação de umdia para o outro a 37 0C em uma solução que compreende: formamida a20%, 5 χ SSC (NaCI 150 mM, citrato trissódico 15 mM, fosfato de sódio 50mM (pH 7,6), 5 χ solução de Dernhardt, 10% de sulfato de dextrano, e 20mg/mL de DNA do esperma de salmão desnaturado cisalhado, e em segui-da, lavagem dos filtros em 1 χ SSC a cerca de 37-50°C. Os versados nessastécnicas devem reconhecer como ajustar a temperatura, intensidade iônica,etc., conforme necessário para se adaptar a fatores tais como comprimentoda sonda, e similares.
O termo "seqüências de controle" refere-se a seqüências deDNA necessárias para a expressão de uma seqüência codificadora ligadaoperacionalmente em um organismo hospedeiro específico. As seqüênciasde controle que são apropriadas para procariontes incluem, por exemplo, umpromotor, opcionalmente uma seqüência operadora, e um sítio de ligação deribossomas. As células eucarióticas reconhecidamente utilizam promotores,sinais de poliadenilação, e intensificadores.
Um ácido nucléico está ligado operacionalmente quando estácolocado em uma relação funcional com outra seqüência de ácidos nucléi-cos. Por exemplo, o DNA para uma pré-seqüência ou líder secretária estáligado operacionalmente ao DNA para um polipeptídeo se ele está expres-sado como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; umpromotor ou intensificador está ligado operacionalmente a uma seqüênciacodificadora se ele afeta a transcrição da seqüência; ou um sítio de ligaçãode ribossomas está ligado operacionalmente a uma seqüência codificadorase ele está posicionado de modo a facilitar a tradução. Geralmente, o termo"ligado operacionalmente" significa que as seqüências de DNA que estãosendo ligadas são contíguas, e, no caso de líder secretora, contíguas e emfase de leitura. Entretanto, os intensificadores não precisam ser contíguos.A ligação é realizada pela ligação em sítios de restrição convenientes. Casotais sítios não existam, são usados adaptadores ou encadeadores de oligo-nucleotídeos sintéticos, de acordo com a prática convencional.
O termo "estável na estocagem" e utilizado para descrever umaformulação que tem um prazo de validade aceitável para um produto na ca-deia distribuidora comercial, por exemplo, pelo menos 12 meses em umadada temperatura, e de preferência, pelo menos 24 meses em uma dadatemperatura. Opcionalmente, esta formulação estável durante a estocagemcontém não mais do que 5% de agregados, não mais do que 10% de díme-ros e/ou mudanças mínimas na heterogeneidade de carga ou atividade bio-lógica. As vias de degradação das proteínas podem envolver instabilidadequímica (isto é, qualquer processo que envolve modificação da proteína porformação de ligações ou clivagem, resultando em uma nova identidade quí-mica), ou instabilidade física (isto é, mudanças na estrutura de ordem supe-rior da proteína). A instabilidade química pode resultar de, por exemplo, de-samidação, racemização, hidrólise, oxidação, eliminação beta ou troca dedissulfetos. A instabilidade física pode resultar de, por exemplo, desnatura-ção, agregação, precipitação ou adsorção. As três vias de degradação deproteínas mais comuns são agregação, desamidação e oxidação de proteí-nas (Cleland et ai, Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems10(4):307-377 (1993)).
Como aqui utilizado, o termo "solúvel" refere-se a polipeptídeosque, quando em soluções aquosas, são completamente dissolvidos, resul-tando em uma solução límpida a ligeiramente opalescente com nenhum par-ticulado visível, avaliado por inspeção visual. Um outro ensaio da turbidez dasolução (ou solubilidade da proteína) pode ser feito medindo as absorvân-cias UV a 340 nm e 360 nm com uma célula de comprimento de trajetória de1 cm, onde a turbidez a 20 mg/mL é menor do que 0,05 unidade de absor-vância.
Um "osmólito" refere-se a um modificador de tonicidade ou ajus-tador osmótico que confere osmolaridade a uma solução. A osmolaridaderefere-se à atividade osmótica total contribuída por íons e moléculas não-ionizadas para uma solução. Os exemplos incluem sais inorgânicos, taiscomo cloreto de sódio, polietilenoglicóis PEGs), polipropilenoglicol, açúcarestais como sacarose e treaiose, glicerina, aminácidos e álcoois de açúcarestais como manitol, conhecidos nessas técnicas e que são considerados ge-ralmente como seguros (GRAS).
Os "conservantes" podem atuar para impedir que bactérias, víruse fungos proliferem na formulação, e antioxidantes ou outros compostos po-dem funcionar de várias maneiras para conservar a estabilidade da formula-ção. Os exemplos incluem cloreto de octadecil-dimetil-benzil-amônio, cloretode hexametônio, cloreto de benzalcônio (uma mistura de cloretos de alquil-benzil-dimetil-amônio, na qual os grupos alquila são compostos de cadeialonga), e coleto de benzetônio. Outros tipos de compostos incluem álcooisaromáticos tais como fenol, e álcool benzílico, alquil-parabenos tais comometil- ou propil-parabeno, e m-cresol. Opcionalmente, tal composto é fenolou álcool benzílico. O conservante ou outro composto deve ser incluído op-cionalmente em uma forma líquida ou aquosa da formulação deApo2L7TRAIL, mas não usualmente em uma forma Iiofilizada da formulação.Neste último caso, o conservante ou outro composto deve estar presentetipicamente na água para injeção (WFI) ou água bacteriostática para injeção(BWFI) usada para reconstituição.
Um "tensoativo" pode atuar para diminuir a turbidez ou a desna-turação de uma proteína em uma formulação. Os exemplos de tensoativosincluem tensoativos não-iônicos tais como Polissorbato, por exemplo, Polis-sorbatos 20, 60 ou 80, um Poloxâmero, como por exemplo, Poloxâmero 184ou 188, polióis Pluronic, copolímeros em bloco de etileno/propileno ou outrosconhecidos nessas técncas e que são GRAS. Opcionalmente, o tensoativo éum Polissorbato ou um Poloxâmero.
O termo "tampão", como aqui utilizado, é qualquer tampão apro-priado que é GRAS e confere geralmente um pH entre cerca de 6 e cerca de9, opcionalmente entre cerca de 6,5 e cerca de 8,5, e opcionalmente, cercade 7 a cerca de 7,5, caso o polipeptídeo seja Apo2L/TRAIL. Os exemplosincluem Tris, Hepes, trietanol-amina, histidina, ou quaisquer outros conheci-dos nessas técnicas como tendo o efeito desejado.
O termo "citocina" é um termo genérico para proteínas liberadaspor uma população de células que atuam sobre outra célula como mediado-res intercelulares. Os exemplos de tais citocinas são linfocinas, monocinas, epolipeptídeos hormonais tradicionais. Estão incluídos entre as citocinas oshormônios do crescimento tais como o hormônio do crescimento humano, ohormônio do crescimento humano N-metionila, e hormônio do crescimentobovino; hormônio paratireóide; tiroxina; insulina; pró-insulina; relaxina; pró-relaxina; hormônios glicoprotéicos tais como hormônio fIicuoestimulante(FSH)1 hormônio estimulante da tireóide (TSH), e hormônio Iuteinizante (LH);fator do crescimento hepático; fato decrescimento de fibroblastos; prolactina;lactogênio placentário; fator de necrose tumoral-alfa e -beta; substância ini-bidora mülleriana; peptídeo associado à gonadotropina do camundongo; ini-biria; activina; fator do crescimento endotelial vascular; integrina; trombo-poietina (TPO); fatores do crescimento nervoso; fator do crescimento de pla-quetas; fatores de transformação do crescimento (TGFs), tais como TGF-alfae TGF-beta; fator I e Il de crescimento semelhante à insulina; eritropoietina(EPO); fatores osteoindutivos; interferons alfa e gama; fatores estimulantesde colônias, tais como fator estimulante de colônias de macrófagos (M-CSF);fator estimulante de granulócitos e macrófagos (GM-CSF); e fator estimulan-te de colônias de granulócitos (G-CSF); interleucinas (Ls) tais como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; e outros fatores polipep-tídicos incluindo LIF e Iigante kit (KL). Como aqui utilizado, o termo "citocina"inclui proteínas de origens naturais ou e culturas de células recombinantes eequivalentes biologicamente ativos das citocinas com seqüências nativas.
O termo "agente citotóxico", como aqui utilizado, refere-se a umasubstância que inibe ou impede o funcionamento de células e/ou causa des-truição de células. O termo pretende incluir isótopos radioativos (por exem-plo, 131I, 125I, 90Y e 186Re), agentes quimioterápicos, e toxinas tais como toxi-nas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou ani-mal, ou fragmentos delas.
Um "agente quimioterápico" é um composto químico útil no tra-tamento de câncer. Os exemplos de agentes quimioterápicos incluem agen-tes alquilantes tais como tiotepa e ciclofosfamida (CYTOXAN®); sulfonatosde alquilas tais como bussulfan, improssulfan e pipossulfan; aziridinas taiscomo bezodopa, meturedopa e uredopa; etilenoiminas e metil-amelaminas,incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietileno-tiofosforamida e trimetilol-melamina; acetogeninas (especialmente bulatacinae bulatacinona); uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topoteca-no); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos a-dozelesina, carzelesina e bizelesina; criptoficinas (particularmente criptofici-na 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sinté-ticos, KW-2189 e CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictiina;espongistatina; mostardas nitrogenadas tais como clorambucil, clornafazina,colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de oxidode mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina,trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosuréias tais como carmustina, cloro-zotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos taiscomo os antibióticos de enediina (por exemplo, caliqueamicina, especial-mente caliqueamicina gama 11 e caliqueamicina phiM, vide, por exemplo,Agnew, Chem. Intl. Ed. Erigi. 33:183-186 (19994); dinemicina, incluindo di-nemicina A; bis-fosfonatos, tal como clodronato; uma esperamicina; bemcomo o cromóforo neocarzinostatina e cromóforos antibióticos de enediinade cromoproteínas correlatos), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina,azasserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofi-lina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (Adryamicin®) (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e de-soxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina,mitomicinas tal como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivo-micinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina,estreptonigrina.estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubici-na; antimetabólitos tais como metotrexato e 5-fluorouracila (5-FU); análogosdo ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, peteropterína, trimetrexa-to; análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina,tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina,floxridina; androgênios tais como calusterona, propionato de dromostanolo-na, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais tais como amino-glutetimida, mitotano, trilostano; repositores de ácido fólico, tal como ácidofrolínico; aceglatona; glicosídeo aldofosfamida; ácido aminolevulínico; enilu-racila; ansacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecol-cina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucid;nitrato de gálio; hidroxiuréia; lentinan; lonidamina; maitansinóides tais comomaitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitra-crina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico;2-etil-hidrazida; procarbazina PSK®; razoxano; rizoxina; sizofirano; espiro-germânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"-tricloro-trietil-amina; trico-tecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina);uretan; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipo-bromano; gacitosina; arabinosídeo ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxói-des, como por exemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology1Princeton, NJ) e docetaxel (TAXOTERE®, Rhône-Poulenc Rorer, Antony1França); clorambucil; gencitabina (Gemzar®); 6-tioguanina; mercaptopurina;metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblas-tina; platina; etoposida (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinor-relbina (Navlebine®); novantrona; teniposida; edatrexato; daunomicina; ami-nopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerases RFS2000; diflúor-metil-ornitina (DMFO); retinóides, tal como ácido retinóico; ca-pecitabina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis dequalquer um dos acima. Estão incluídos também nesta definição os agentesanti-hormonais que atuam para regular ou inibir a ação hormonal sobre tu-mores, tais como anti-estrogênios e moduladores de receptores seletivos deestrogênios (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo Noval-dex®), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno,LY117018, onapristona, e toremifeno (Fareston®); inibidores de aromataseque inibem a enzima aromatase, que regula a produção na glândula supra-renal (adrenal), tais como, por exemplo, 4(5)-imidazóis, aminoglutetimida,acetato de megestrol (Megace®), exemestano, formestano, fadrozol, vorozol(Rivisor®), Ietrosol (Femara®), e anastrozol (Arimidex®); e anti-androgêniostais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, Ieuprolida e goserrelina; e ossais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dosacima.
O termo "agente inibidor de crescimento", quando aqui utilizado,refere-se a um composto ou composição que inibe o crescimento de umacélula, especialmente uma célula cancerosa que expressa qualquer um dosgenes aqui identificados, seja in vitro ou in vivo. Assim sendo, o agente inibi-dor do crescimento é um que reduz significativamente a porcentagem decélulas que superexpressam tais genes na fase S. Os exemplos de agentesinibidores de crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão dociclo celular (em um ponto diferente da fase S), tais como os agentes queinduzem a detenção da fase Gl e a detenção da fase M. Os bloqueadoresda fase M clássicos incluem as vincas (vincristina e vinblastina), taxol, e ini-bidores de topo Il tais como doxorrubicina, epirrubicina, duanorrubicina, eto-posida e bleomicina. Os agentes que detêm G1 também se espraiam sobrea detenção da fase S, como por exemplo, agentes alquilantes de DNA, taiscomo tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, meto-trexato, 5-fluorouracila, e ara-C. Outras informações podem ser encontradasem "The Molecular Basis of Câncer", Mendelsohn e Israel, editores, Capítulo1, intitulado "Cell Cycle Regulation, Oncogenes, and Antineoplasic Drugs",por Murakami et AL. (W.B. Saunders, Filadélfia, 1995), especialmente pági-na 13.
O termo "biologicamente ativo" ou "atividade biológica", para ospropósitos deste relatório descritivo, significa (a) ter a capacidade de induzirou estimular a apoptose em pelo menos um tipo de célula cancerosa demamífero ou célula infectada por vírus in vivo ou ex vivo, seja isoladamentecomo um único agente ou em combinação com um agente quimioterápico;(b) a capacidade de criar um anticorpo, isto é, imunogênico; (c) a capacidadede se ligar e/ou estimular um receptor para Apo2L/TRAIL (tais receptorespodem incluir o receptor DR4, o receptor DR5, OPG, o receptor DcR1, e oreceptor DcR2); ou (d) reter a atividade de um polipeptídeo Apo2L/TRAIL deocorrência natural. Os ensaios para determinar a atividade biológica deApo2LVTRAIL podem ser conduzidos usando métodos conhecidos nessastécnicas, tais como fragmentação de DNA (vide, por exemplo, Marsters etai, Biology 6:1669 (1996), inativação de caspases, ligação de DR4, ligaçãode DR5 (vide, por exemplo, documento n2 WO 98/51793, publicado em 19de novembro de 1998), ligação de DcR1 (vide, por exemplo, documento n2WO 98/58062, publicado em 23 de dezembro de 1998), ligação de DcR2(vide, por exemplo, documento n- WO 99/10484, publicado em 4 de marçode 1999), bem como os ensaios descritos nas publicações PCT n— WO97/01633, WO 97/25428, WO 01/00832 e WO 01/22987.
Os termos "apoptose" e "atividade apoptótica" são utilizados emum sentido amplo e referem-se à forma ordenada ou controlada de mortecelular em mamíferos, que é tipicamente acompanhada de uma ou maismudanças de células características, incluindo condensação do citoplasma,perda de microvilosidades da membrana plasmática, segmentação do nú-cleo, degradação do DNA cromossômico ou perda de função mitocondrial.
Esta atividade pode ser determinada e medida, por exemplo, por ensaios deviabilidade celular (tais como ensaios com azul de Alamar ou ensaios comMTT), análise FACS, ativação de caspases, fragmentação de DNA (vide, porexemplo, Nicoletti et al., J. Immunol. Methods 139:271-279 (1991), e poli-ADP polimerase, "PARP", ensaios de clivagem conhecidos nessas técnicas.
Como aqui utilizado, o termo "distúrbio" em geral refere-se aqualquer condição que se beneficiaria do tratamento com as composiçõesaqui descritas, incluindo qualquer doença ou distúrbio que pode ser tratadopor quantidades eficazes de polipeptídeos, tal como Apo2L/TRAIL. Isto incluidistúrbios crônicos e agudos, bem como aquelas condições patológicas quepredispõem o mamífero ao distúrbio em questão. Os exemplos não-Iimitativos distúrbios a serem tratados neste caso incluem cânceres benignose malignos; distúrbios inflamatórios, angiogênicos e imunogênicos; distúrbiosauto-imunes, artrite (incluindo artrite reumatóide), esclerose múltipla, eHI V/Al DS.
Os termos "câncer", "canceroso" ou "maligno" referem-se oudescrevem a condição fisiológica em mamíferos, que é caracterizada tipica-mente por crescimento celular desregulado. Os exemplos de cânceres inclu-em, porém sem limitações, carcinoma, linfoma, leucemia, blastoma e sarco-ma. Os exemplos mais específicos de tais cânceres incluem carcinoma decélulas escamosas, mieloma, câncer pulmonar de células pequenas, câncerpulmonar de células não-pequenas, glioma, câncer gastrointestinal, câncerrenal, câncer ovariano, câncer hepático, leucemia linfoblástica, leucemia Iin-focítica, câncer colorretal, câncer endométrico, câncer renal, câncer renal,câncer prostático, câncer tireóideo, neuroblastoma, câncer pancreático, glio-blastoma multiforme, câncer cervical, câncer estomacal, câncer da bexiga,hepatoma, câncer mamário, carcinoma colônico, e câncer de cabeça e pes-coço. Opcionalmente, as células cancerosas expressam os receptores DR4e/ou DR5.
Os termos "tratar", "tratamento" e "terapia", como aqui utilizados,referem-se à terapia curativa, terapia profilática e terapia preventiva. O tra-tamento ou administração consecutiva refere-se ao tratamento em uma basepelo menos diária sem interrupção no tratamento por um ou mais dias. Otratamento ou administração intermitente, ou tratamento ou administração deuma maneira intermitente, refere-se ao tratamento que não é consecutivo, eao invés disso, de natureza cíclica.
O termo "mamífero", como aqui utilizado, refere-se a qualquermamífero classificado como um mamífero, incluindo seres humanos, boví-deos, eqüinos, caninos e felinos. Em uma modalidade preferida da invenção,o mamífero é um ser humano.
O termo "poliol", quando aqui utilizado, refere-se amplamente acompostos de álcoois poliidroxilados. Os polióis podem ser qualquer políme-ro de poli(óxido de alquileno) solúvel em água, por exemplo, e podem teruma cadeia linear ou ramificada. Os polióis preferidos incluem aqueles subs-tituídos em uma ou mais posições de hidroxilas por um grupo químico, talcomo um grupo alquila que tem entre um e quatro carbonos. Tipicamente, opoliol é um polialquilenoglicol, de preferência polietilenoglicol (PEG). Entre-tanto, os versados nessas técnicas devem reconhecer que outros polióis,tais como, por exemplo, polipropilenoglicol e copolímeros de polietile-no/polipropileno glicol, podem ser empregados para conjugação a proteínase outras biomoléculas. Os polióis incluem aqueles conhecidos nessas técni-cas e aqueles francamente disponíveis, tais como aqueles disponíveis emfornecedores comerciais.Β. Métodos e Materiais Exemplificativos para Conduzir a Invenção
A presente invenção fornece métodos para a recuperação e puri-ficação de Apo2L/rRAIL. Particularmente, a invenção fornece métodos queenvolvem cristalização para recuperar e purificar Apo2L/TRAIL a partir demisturas nas quais ele está acompanhado de outros contaminantes, tais co-mo proteínas contaminantes e outras impurezas. Em uma modalidade espe-cífica, a invenção fornece métodos para recuperar e purificar Apo2L/TRAIL apartir de culturas de hospedeiros ou Iisados de células recombinantes decélulas hospedeiras recombinantes de E coli produtoras de Apo2L/TRAIL.
A base destes métodos de purificação é a descoberta surpreen-dente que Apo2L7TRAIL cristaliza fácil e espontaneamente em certos siste-mas de tampões. Esta descoberta permite usar a cristalização como umaetapa eficiente da purificação no esquema de purificação de Apo2L7TRAIL.
Particularmente, o trabalho experimental subjacente à presente invençãodemonstrou que a cristalização pode ser implementada como uma etapanoprocesso de purificação de Apo2LVTRAIL e outras proteínas que apresentamuma tendência similar de cristalização espontânea. A incorporação de umaetapa de cristalização no esquema de purificação permite a redução das e-tapas do processo de purificação, e ao mesmo tempo, mantendo rendimen-tos comparáveis a esquemas de purificação tradicionais que usam múltiplasetapas cromatográficas de purificação, sem cristalização. Conseqüentemen-te, ao implementar a cristalização no processo de purificação pode resultarem economias de tempo e custo acentuadas, sem comprometer a eficiência,os volumes do produto ou a qualidade do produto.
B.1 Produção de Apo2L/TRAI L
A descrição abaixo refere-se a métodos para produzirApo2L/TRAIL cultivando células hospedeiras transformadas ou transfectadascom um vetor que contém um ácido nucléico que codifica Apos2L/TRAIL erecuperar o polipeptídeo a partir da cultura de células.
O DNA que codifica Apo2LVTRAIL pode ser obtido a partir dequalquer biblioteca de DNAc preparada a partir do tecido que se acreditapossuir o RNAm de Apos2L/TRAIL e expressá-lo em um nível detectável.Conseqüentemente, o DNA de Apo2L/TRAIL humano pode ser obtido con-venientemente a partir de uma biblioteca de DNAc preparada a partir de te-cidos humanos, tal como uma biblioteca de bacteriófagos do DNAc placentá-rio humano, como descrito na publicação PCT ns WO 97/25428. O gene quecodifica Apo2L/TRAIL também pode ser obtido a partir de uma bibliotecagenômica ou por síntese de oligonucleotídeos.
As bibliotecas podem ser tríadas com sondas (tais como anticor-pos para Apo2L/TRAIL ou nucleotídeos com pelo menos cerca de 20-80 ba-ses) desenhadas para identificar o gene de interesse da proteína codificadapor ele. A triagem da biblioteca de DNAc ou genômica com a sonda selecio-nada pode ser conduzida usando procedimentos usuais (Sambrook et ai,"Molecular Cloning: A Laboratory Manual"; New York; Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989). Um meio alternativo para isolar o gene que codificaApo2L/TRAIL é usar a metodologia de PCR (Sambrook et ai, supra; Dief-fenbach etal., "PCR Primer: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Labo-ratory Press, 1995).
Os fragmentos ou variantes da seqüência de aminoácidos deApo2L/TRAIL podem ser preparados introduzindo mudanças de nucleotí-deos apropriadas no DNA de Apo2L/TRAIL, ou por síntese do polipeptídeoApo2LVTRAIL desejado. Tais fragmentos ou variantes representam inser-ções, substituições e/ou deleções de resíduos dentro de uma ou ambas ex-tremidades da região intracelular, da região transmembrana, ou da regiãoextracelular, ou da seqüência de aminoácidos ilustrada para Apo2L/TRAILde comprimento inteiro na Figura 1 (SEQ ID NQ: 1). Qualquer combinação deinserção, substituição e/ou deleção pode ser feita para chegar à construçãofinal, desde que a construção final possua, por exemplo, uma atividade bio-lógica ou atividade apoptótica desejada, como aqui definido. Em uma moda-lidade preferida, os fragmentos ou variantes têm pelo menos 80% de identi-dade de seqüências de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cercade 90% de identidade de seqüências, e ainda mais preferivelmente, pelomenos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de seqüências com, porexemplo, as seqüências aqui identificadas para os domínios intracelulares,transmembrana ou extracelulares de Apo2L/TRAIL, ou a seqüência de com-primento inteiro para Apo2L7TRAIL. As mudanças de aminoácidos podemalterar também processos pós-translacionais de Apo2L/TRAIL, tal como amudança do número ou posição de sítios de glicosilação ou alteração dascaracterísticas de ancoragem da membrana.
As variações na seqüência de Apo2L/TRAIL, descritas acima,podem ser feitas usando qualquer uma das técnicas e orientações para mu-tações conservativas e não-conservativas enunciadas na patente n- US5.364.934. Elas incluem mutagênese mediada por oligonucleotídeos (dire-cionada a sítios), varredura de alanina, e mutagênese por PCR.
A análise de aminoácidos por varredura pode ser empregadapara identificar um ou mais aminoácidos ao longo de uma seqüência contí-gua. Dentre os aminoácidos de varredura preferidos estão aminoácidos neu-tros relativamente pequenos. Tais aminoácidos incluem alanina, glicina, se-rina e cisteína. A alanina é tipicamente um aminoácido de varredura preferi-do entre este grupo porque ela elimina a cadeia lateral para além do carbonobeta e é menos possível que altere a conformação da cadeia lateral da vari-ante (Conningham et ai, Science 244:1081 (1989)). A alanina é também tipi-camente preferida porque ela é o aminoácido mais comum. Além disso, ela éencontrada freqüentemente em posições enterradas e expostas (Creighton,"The Proteins", W.H. Freeman & Co., NY; Clothia, J. Moi BioL 150:1 (1976)).
As variantes específicas de Apo2LVTRAIL da presente invençãoincluem aqueles polipeptídeos Apo2L/TRAIL que incluem uma ou mais dassubstituições de alanina enunciadas, indicadas na Tabela I do pedido de pa-tente PCT publicado n- WO 01/00832. Tais variantes de Apo2L/TRAIL com-preendem tipicamente uma seqüência de aminoácidos de ocorrência não-natural que difere de uma seqüência de aminoácidos nativa de Apo2UTRAIL(tal como aquela fornecida na Figura 1; SEQ ID NQ: 1, para uma forma decomprimento inteiro ou madura de Apo2L/TRAIL ou uma seqüência do do-mínio extracelular) em pelo menos um ou mais aminoácidos. Opcionalmente,um ou mais aminoácidos que diferem na variante de Apo2L/TRAIL em com-paração com um Apo2UTRAIL nativo devem compreender uma ou maissubstituições de aminoácidos tais como aquelas indicadas na Tabela I dodocumento n2 WO 01/00832. As variantes de Apo2L/TRAIL da invenção in-cluem variantes solúveis de Apo2L/TRAIL que compreendem os resíduos91-281, 92-281, 95-281 ou 92-281, 95-281 ou 114-281 da Figura 2 (SEQ IDNe: 1) e tendo uma ou mais substituições de aminoácidos que intensificam aatividade biológica, tal como a ligação ao receptor. Uma variante particular-mente preferida compreende os resíduos 114-281 da Figura 1 (SEQ ID Ns:1). Em uma modalidade específica, Apo2L/TRAIL consiste nos resíduos 114-281 da Figura 1 (SEQ ID Ns: 1).
Como descrito no documento n2 WO 01/00832, publicado em 4de janeiro de 2001, a estrutura dos cristais em raios X do domínio extracelu-Iar de Apo2L/TRAIL, identificada, e a mutagênese de escaneamento de ala-nina foi realizada para produzir o mapeamento das suas regiões de contatocom receptores. A estrutura obtida para Apo2L/TRAIL revelou uma proteínahomotrimérica que contém um sítio de ligação de íon metálico bivalente (zin-co) que coordena a interação das três subunidades da molécula trimérica deApo2UTRAIL. Similarmente a outros membros da família de TNF,Apo2L/TRAIL parece compreender um trímero compacto formado por trêsmonômeros em rolo gelificado que transmitem aproximadamente 5.100angstrom2 (1.700 angstrom2 por monômero) para formar o trímero globular.A posição dos filamentos beta do núcleo foi bem-conservada em compara-ção com os outros membros estruturalmente caracterizados da família deTNF, TNF-alfa, TNF-beta e CD40L, em comparação com os filamentos donúcleo de TNF-alfa ou TNF-beta.
As variações na seqüência de Apo2L/TRAIL incluídas tambémdentro do escopo da invenção referem-se a derivados ou formas modifica-das do terminal amino. Tais seqüências de Apo2L/TRAIL podem incluir ospolipeptídeos Apo2L/TRAIL aqui descritos, que têm uma metionina ou meti-onina modificada (tal como formil-metionina ou outra espécie de metionilabloqueada) no terminal N da seqüência do polipeptídeo.
O ácido nucléico (por exemplo, DNAc ou DNA genômico) quecodifica Apo2L/TRAIL nativo ou variante pode ser inserido em um vetor re-plicável para clonagem adicional (ampliação do DNA) ou para expressão.Vários vetores estão disponíveis para o público. Os componentes do vetorincluem geralmente, porém sem limitações, um ou mais dos seguintes: umaseqüência de sinais, uma origem de replicação, um ou mais genes marcado-res, um elemento intensificador, um promotor, e uma seqüência da termina-ção da transcrição, cada um dos quais estando descrito abaixo. As seqüên-cias de sinais, origens de replicação, genes marcadores, elementos intensifi-cadores e seqüências terminadoras da transcrição, opcionais, que podemser empregados, são conhecidos nessas técnicas e estão descritos maisdetalhadamente na publicação PCT n2 WO 97/25428.
Os vetores de expressão e clonagem contêm usualmente umpromotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e está ligado opera-cionalmente à seqüência de ácidos nucléicos de Apo2L/TRAIL. Os promoto-res são seqüências não-traduzidas localizadas a montante (5') do códon departida de um gene estrutural (geralmente dentro de cerca de 10O a 1.000pares de bases) que controlam a transcrição e a tradução de uma seqüênciade ácidos nucléicos específica, tal como a seqüência de ácidos nucléicos deApo2LyTRAIL, à qual eles estão ligados operacionalmente. Tais promotores,tipicamente, caem dentro de duas classes, induzíveis e constitutivos. Ospromotores induzíveis são promotores que iniciam maiores níveis de trans-crição a partir do DNA sob seu controle em resposta a alguma mudança nascondições de cultura, como por exemplo, a presença ou ausência de um nu-triente, ou uma mudança na temperatura. Atualmente, um grande número depromotores reconhecidos por uma série de células hospedeiras potenciais ébem conhecido. Estes promotores são ligados operacionalmente ao DNAque codifica Apo2L/TRAIL removendo o promotor do DNA fonte por digestãocom enzima de restrição e inserindo a seqüência do promotor isolada novetor. A seqüência do promotor de Apo2L/TRAIL nativa e muitos promotoresheterólogos podem ser usados para direcionar a ampliação e/ou a expres-são do DNA de Apo2L/TRAIL.
Os promotores apropriados para uso com hospedeiras procarió-ticas e eucarióticas são conhecidos nessas técnicas, e estão descritos maisdetalhadamente na publicação PCT n2 WO 97/25428.
Os métodos preferidos para a produção de Apo2LVTRAIL solúvelem E. coli empregam um promotor induzível para a regulação da expressãodo produto. O uso de um promotor induzível controlável permite o cresci-mento da cultura até a densidade celular desejável antes da indução da ex-pressão do produto e acumulação de quantidades significativas do produto,que podem não ser bem toleradas pelo hospedeiro.
Vários sistemas de promotores induzíveis (incluindo T7 polime-rase, trp e fosfatase alcalina (AP)) foram avaliados pela requerente para aexpressão de Apo2L/TRAIL (aminoácidos 114-281). O uso de cada um entreos promotores T7 polimerase, trp e fosfatase alcalina resultou em quantida-des significativas do trímero de Apo2L7TRAIL solúvel biologicamente ativo,recuperado a partir de uma pasta de células colhidas. Outro promotor opcio-nal é um sistema promotor glicerina-fosfato.
A construção de vetores apropriados que contêm um ou maisdos componentes listados acima emprega técnicas de ligação usuais. Ospiasmídeos ou fragmentos de DNA isolados são clivados, individualizados, ereligados na forma desejada para gerar os piasmídeos requeridos.
Para a análise a fim de confirmar as seqüências corretas nospiasmídeos construídos, podem ser usadas misturas de ligação para trans-formar a cepa 294 de E. coli K12 (ATCC 31.446) e os transformantes exito-sos são selecionados por resistência à ampicilina ou tetraciclina quando a-propriado. Os piasmídeos dos transformantes são preparados, analisadospor digestão com endonuclease de restrição e/ou seqüenciados usando téc-nicas convencionais conhecidas nessa área (vide, por exemplo, Messing etal., Nucleic Acids Res. 9:309 (1981); Maxam et ai, Methods in Enzynology,65:499(1980)).
Podem ser empregados vetores de expressão que proporcionama expressão transiente em células de mamíferos do DNA que codificaApo2L/TRAIL. Em geral, a expressão transiente envolve o uso de um vetorde expressão que é capaz de replicar eficientemente em uma célula hospe-deira, de tal modo que a célula hospedeira acumule muitas cópias do vetorde expressão e, por sua vez, sintetize altos níveis de um polipeptídeo dese-jado codificado pelo vetor de expressão (Sambrook et al., supra). Os siste-mas de expressão transiente, que compreendem um vetor de expressão a-propriado e uma célula hospedeira apropriada, permitem a identificação po-sitiva conveniente de polipeptídeos codificados por DNAs clonados, bemcomo a triagem rápida de tais polipeptídeos quanto às propriedades biológi-cas ou fisiológicas desejadas. Assim sendo, os sistemas de expressão tran-siente são particularmente úteis na invenção com o propósito de identificaranálogos e variantes e Apo2L/TRAIL que são Apo2L/TRAIL biologicamenteativos.
Outros métodos, vetores e células hospedeiras apropriadas paraadaptação para a síntese de Apo2L/TRAIL em cultura de células recombi-nantes de vertebrados estão descritas em Gething et al., Nature 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature 281:40-46 (1979); documentos n25 EP117.060 e EP 117.058.
As células hospedeiras apropriadas para clonar ou expressar oDNA nos vetores neste caso incluem células de procariontes, leveduras, oueucariontes superiores. Os procariontes apropriados para este propósito in-cluem, porém sem limitações, eubactérias, tais como organismos gram-negativos ou gram-positivos, como por exemplo, Enterobacteriaceae taiscomo Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, KlebsiellalProteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella Typhimurium, Serratia, porexemplo, Serratia marcescans e Shigella, bem como Bacilli tais como B.subtilis e B. Iicheniformis (por exemplo, B. Iicheniformis 41P descrito no do-cumento n2 DD 266.710, publicado em 12 de abril de 1989), Pseudomonastal como P. aeruginosa, e Streptomyces. De preferência, a célula hospedeiradeve secretar quantidades mínimas de enzimas proteolíticas.
E. coli é a célula hospedeira apropriada para uso na presenteinvenção. E. coli é particularmente bem apropriada para a expressão deApo2L/TRAIL (compreendendo os aminoácidos 114-281 da Figura 1), umpolipeptídeo com um tamanho menor do que 20 kD com nenhuma necessi-dade de glicosilação. Com uma hospedeira produtora, E. coli pode ser culti-vada até uma densidade celular relativamente alta e é capaz de produzirníveis relativamente altos de proteínas heterólogas.
Além de procariontes, micróbios eucarióticos, tais como fungosfilamentosos ou leveduras são hospedeiros apropriados de clonagem ou ex-pressão para vetores que codificam Apo2L/TRAIL. As células hospedeirasapropriadas para a expressão de Apo2L/TRAIL glicosilado são derivadas deorganismos multicelulares. Os exemplos de tais células hospedeiras, incluin-do células CHO, estão descritos adicionalmente na publicação PCT n2 WO97/25428.
As células hospedeiras são transfectadas, e de preferência,transformadas com os vetores de expressão ou clonagem descritos acimapara a produção de Apo2UTRAIL, e cultivadas em meios nutrientes modifi-cados conforme apropriado para induzir promotores, selecionar transforman-tes, ou ampliar os genes que codificam as seqüências desejadas.
O termo "transfecção" refere-se à captação de um vetor de ex-pressão por uma célula hospedeira, estejam ou não quaisquer seqüênciascodificadoras de fato expressadas. Vários métodos de transfecção são co-nhecidos pelos versados nessas técnicas, como por exemplo, CaP04 e ele-troporação. A transfecção exitosa é reconhecida geralmente quando qual-quer indicação da operação deste vetor ocorre dentro da célula hospedeira.
O termo "transformação" significa introduzir um DNA em umorganismo de tal modo que o DNA seja replicável, seja como um elementoextracromossômico ou como um integrante cromossômico. Dependendo dacélula hospedeira usada, a transformação é feita usando técnicas usuaisapropriadas para essas células. O tratamento com cálcio, empregando clore-to de cálcio, como descrito em Sambrook et ai, supra, ou eletroporação, éusado geralmente para procariontes ou outras células que contêm barreirasde paredes celulares substanciais. A infecção com Agrobacterium tumefaci-ens é usada para a transformaçã de certas células vegetais, como descrito(Shaw et ai, Gene 23:315 (1983); e publicação PCT n- WO 89/05859). Alémdisso, plantas podem ser transfectadas usando tratamento com ultra-som,publicação PCT n2 WO 91/00358, publicado em 10 de janeiro de 1991.Para células de mamíferos sem tais paredes celulares, o métodode precipitação com fosfato de cálcio (Graham e Van der Eb1 Virology52:456-457 (1978)) pode ser empregado. Os aspectos genéricos de trans-formações com sistemas hospedeiros de células de mamíferos foram descri-tos na patente n- 4.399.216. As transformações em levedura são conduzidastipicamente de acordo com o método de Van Solingen et ai, J. Bact.130:946 (1977); e Hsiao et ai, Proc. Nati Acad. Sei. 76:3829 (1979). Entre-tanto, outros métodos para introduzir DNA em células também podem serusados, tais como microinjeção nuclear, eletroporação, fusão de protoplas-tos bacterianos com células intactas, policátions, por exemplo, polibreno,poliornitina. Para obter informações sobre várias técnicas para transformarcélulas de mamíferos, vide Keown et ai, Methods in Enzymology 185:527-537 (1990); e Mansour et ai, Nature 336:348-352 (1988).
As células procarióticas usadas para poduzir Apo2L/TRAIL po-dem ser cultivadas em meios de cultura apropriados, como descrito geral-mente em Sambrook et ai, supra. As formas específicas de meios de culturaque podem ser empregados para cultivar E. coli estão descritas adicional-mente no pedido de patente PCT ns WO 01/00832. Em um processo particu-larmente preferido, Apo2L/TRAIL (compreendendo os aminoácidos 114-281da Figura 1) produzido em E. coli é fermentado usando uma fonte de zinco eglicerofosfato. As titulações da fermentação ficam, de preferência na faixaentre cerca de 4 e cerca de 6 g/L.
As células hospedeiras de mamíferos usadas para produzirApo2L/TRAIL podem ser cultivadas em uma série de meios de cultura.
Os exemplos de meios de cultura disponíveis no mercado incluemmeio de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo ("MEM", Sigma), RPMI-1640(Sigma), e Meio de Eagle Modificado de Dulbecco ("DMEM", Sigma). Qual-quer um desses meios pode ser suplementado conforme necessário comhormônios e/ou outros fatores de crescimento (Tais como insulina, transferri-na, e fosfato), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato),tampões (tal como HEPES), nucleosídeos (tais como adenosina e timidina),antibióticos (tal como o fármaco Gentamycin®), micronutrientes (definidos co-mo compostos inorgânicos usualmente presentes em concentrações finais nafaixa micromoiar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisqueroutros suplementos necessários também podem ser inclusos em concentra-ções apropriadas, e eles são conhecidos pelos versados nessas técnicas. Ascondições da cultura, tais como temperatura, pH, e similares, são aquelasusadas anteriormente com a célula hospedeira selecionada para expressão, edevem ficar evidentes para os versados nessas técnicas.
Geralmente, os princípios, protocolos e técnicas práticas paramaximizar a produtividade de culturas de células de mamíferos podem serencontradas em "Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Aprroach",M. Butler, editor (IRL Press, 1991).
A expressão de Apo2L/TRAIL pode ser medida em uma amostradiretamente, por exemplo, por Southern blotting convencional, Northern blot-ting convencional, para quantificar a transcrição do RNAm (Thomas, Proc.Natl. Acad. Sei. USA 77:5201-5205 (1980)), dot blotting (análise de DNA), ouhibridização in situ, usando uma sonda marcada adequadamente, baseadonas seqüências aqui fornecidas. Vários marcadores podem ser empregados,mais comumente radioisótopos, e particularmente 32P. Entretanto, outrastécnicas também podem ser empregadas, tais como usando nucleotídeosmodificados com biotina para introdução em um polinucleotídeo. A biotinaserve, então, como o sítio para ligação à avidina ou anticorpos, que podemser marcados com uma ampla série de marcadores, tais como radionucleotí-deos, fluorescentes ou enzimas. Alternativamente, podem ser empregadosanticorpos que podem reconhecer dúplices específicos, incluindo dúplices deDNA, dúplices de RNA, e dúplices híbridos de DNA-RNA ou dúplices deDNA-proteína. Os anticorpos, por sua vez, podem ser marcados e o ensaiopode ser conduzido onde o dúplex está ligado a uma superfície, de tal modoque, depois da formação do dúplex sobre a superfície, a presença de anti-corpo ligado ao dúplex possa ser detectada.
A expressão de genes, alternativamente, pode ser medida pormétodos imunológicos, tais como coloração imunoistoquímica de células ouseções de tecido, e ensaio de cultura de células ou fluidos corporais, paraquantificar diretamente a expressão do produto gênico. Com as técnicas decoloração imunoistoquímica, uma amostra de célula é preparada, tipicamen-te por desidratação e fixação, e em seguida, reação com anticorpos marca-dos específicos para o produto gênico acoplado, onde os marcadores sãousualmente detectados visualmente, tais como marcadores enzimáticos,marcadores fluorescentes, marcadores luminescentes, e similares.
Os anticorpos úteis para coloração imunoistoquímica e/ou en-saio de amostras de fluidos podem ser monoclonais ou policlonais, e podemser preparados em qualquer mamífero. Convenientemente, os anticorpospodem ser preparados contra um polipeptídeo Apo2l_/TRAlL nativo ou contraum peptídeo sintético baseado nas seqüências de DNA aqui fornecidas oucontra uma seqüência exógena fundida ao DNA de Apo2L/TRAIL e codifi-cando um epítopo de anticorpo específico.
O polipeptídeo Apo2L/TRAIL pode ser anexado de forma cova-Iente (aqui doravante denominado "conjugado") a um ou mais grupos quími-cos. Os grupos químicos apropriados para uso em um conjugado de Apo-2Lsão, de preferência, não significativamente tóxicos ou imunogênicos. Váriosgrupos químicos exemplificativos, que podem ser conjugados a polipeptí-deos, são conhecidos nessas técnicas e incluem, por exemplo, carboidratos,tais com aqueles carboidratos que ocorrem naturalmente em glicoproteínas,poliglutamato, e polímeros não-proteináceos, tais como polióis (vide, porexemplo, patente n- US 6.245.901.
Um poliol, por exemplo, pode ser conjugado aos polipeptídeos,tal como Apo-2L, em um ou mais resíduos de aminoácidos, incluindo resí-duos de lisina, como descrito no documento n2 WO 93/00109, supra. O poliolempregado pode ser qualquer polímero de poli(óxido de alquileno) solúvelem água e pode ter uma cadeia linear ou ramificada. Os polióis apropriadosincluem aqueles substituídos em uma ou mais posições de hidroxilas comum grupo químico, tal como um grupo alquila que tem entre um e quatro á-tomos de carbono. Tipicamente, o poliol é um poli(alquilenoglicol), tal comopolietilenoglicol (PEG), e o processo de conjugar o poliol a um polipeptídeo édenominado "peguilação". Entretanto, os versados nessas técnicas devemreconhecer que outros polióis, tais como, por exemplo, polipropilenoglicol ecopolímeros de polietilentoglicol/polipropilenoglicol, podem ser empregadosusando as técnicas para conjugação aqui descritas para PEG.
O peso molecular médio do PEG empregado na peguilação doApo-2L pode variar, e tipicamente pode ficar na faixa entre cerca de 500 ecerca de 30.000 dáltons (D). De preferência, o peso molecular médio doPEG é entre cerca de 1.000 e cerca de 25.000 D, e mais preferivelmente,entre cerca de 1.000 e cerca de 5.000 D. Em uma modalidade, a peguilaçãoé conduzida com um PEG que tem um peso molecular médio de cerca de1.000 D. Opcionalmente, o homopolímero de PEG é não-substituído, masele pode ser também substituído em uma extremidade com um grupo alqui-la. De preferência, o grupo alquila é um grupo alquila de C1-C4, e mais prefe-rivelmente, um grupo metila. As preparações de PEGs estão disponíveiscomercialmente, e tipicamente essas preparações de PEG apropriadas parauso na presente invenção são preparações não-homogêneas comercializa-das de acordo com o peso molecular médio. Opcionalmente, um trímero deApo-2Ldeve ser peguilado de uma maneira tal que uma molécula de PEGfique ligada ou conjugada a um, dois, ou cada um dos três monômeros queformam o Apo-2L trimérico. Nessa modalidade, prefere-se que o PEG em-pregado tenha um peso molecular médio de cerca de 1.000 a cerca de 5.000D. Contempla-se também que os trímeros de Apo-2L possam ser "parcial-mente" peguilados, isto é, apenas um ou dois dos três monômeros que for-mam o trímero são ligados ou conjugados a PEG.
Vários métodos para peguilar proteínas são conhecidos nessastécnicas. Os métodos específicos para produzir proteínas conjugadas a PEGincluem os métodos descritos nas patentes n— US 4.179.337, 4.935.465 e5.849.535. Tipicamente, a proteína é ligada de forma covalente por intermé-dio de um ou mais resíduos de aminoácidos da proteína a um grupo terminalreativo no polímero, dependendo principalmente das condições da reação,do peso molecular do polímero, etc. O polímero com o(s) grupo(s) reativos(s)é aqui designado como polímero ativado. O grupo reativo reage seletivamen-te com os grupos livres ou outros grupos reativos na proteína. O polímeroPEG pode ser acoplado ao grupo amino ou outro grupo reativo na proteínade uma maneira aleatória ou específica de sítio.B.2 Cristalização de Apo2L/TRAIL
A cristalização é amplamente utilizada para a purificação de mo-léculas pequenas. Entretanto, geralmente, as técnicas de cristalização nãotêm sido amplamente aplicadas para proteínas, pois vários parâmetros po-dem afetar a cristalização das proteínas, incluindo, por exemplo, a solubili-dade, nucleação e velocidade de crescimento, e a distribuição do tamanhodos cristais (cada uma sendo função de outros parâmetros, tais como solubi-lidade, temperatura, pH, tampão, impurezas, e similares). Como as proteínassão geralmente mais difíceis de cristalizar do que moléculas pequenas, arecuperação e a purificação de proteínas terapêuticas até agora raramenteenvolveu uma etapa ou etapas de cristalização.
A requerente descobriu surpreendentemente que o estado sólidoda proteína Apo2L/TRAIL a 5°C é cristalino em condições de intensidadeiônica moderada a baixa, diferentemente de muitas outras proteínas conhe-cidas nessas técnicas que são solúveis ou formam precipitados amorfos sobcondições similares. Além disso, descobriu-se que o estado sólido dos cris-tais de Apo2L/TRAIL solubiliza de forma reversível quando levado para atemperatura ambiente, sem uma perda na atividade biológica da proteína ouum efeito adverso sobre as propriedades bioquímicas da proteína. Estaobservação foi bastante diferente da desnaturação ou precipitação irreversí-vel observada com outras proteínas conhecidas nessas técnicas.
Opcionalmente, os cristais de Apo2L/TRAIL são preparados res-friando uma solução supersaturada da proteína Apo2L/TRAIL de cerca de 20a cerca de 30°C até abaixo de cerca de 15°C, de preferência cerca de 2 a8°C, mais preferivelmente abaixo de cerca de 2-8°C, ainda mais preferivel-mente abaixo de cerca de 4°C, e com a maior preferência, até cerca de 2 a4°C. opcionalmente, a cncentração de Apo2UTRAIL pode ser acima de 3g/L, para iniciar a cristalização espontânea. Anti-solventes podem ser usa-dos para iniciar a cristalização espontânea em concentrações mais baixasda proteína. A cristalização pode ser conduzida em modo de batelada ousemibatelada em uma faixa grande de escala de produção, desde algunsmililitros até centenas de litros de solução. A velocidade da cristalização po-de ser controlada por resfriamento e agitação programadas. Os equipamen-tos podem incluir, porém sem limitações, tanques agitados ou estáticos comcontrole da temperatura superficial e/ou interna. Chicanas internas e tubosde aspiração também podem ser usados para intensificar a misturação emtanques agitados. A nucleação dos cristais também pode ser controlada porsemeadura (Moore, "AIChE Practical Engineering Perspectives, Distillationand Other Industrial Separations", páginas 239-245). O grau de supersatura-ção, a composição de sais, a velocidade do resfriamento, a velocidade daagitação, e a semeadura, dentre outros parâmetros, podem afetar a veloci-dade de formação dos cristais, a distribuição do tamanho dos cristais, e orendimento dos cristais.
Opcionalmente, para preparar os cristais, a solução da proteínaApo2L/TRAIL contém sulfato de sódio ou cloreto de sódio. Opcionalmente, aconcentração de sais é cerca de 100 mM a cerca de 200 mM, e opcional-mente, o pH é cerca de 6 a cerca de 9 (de preferência, pH de cerca de 6,6 acerca de 8,5).
B.3 Uso de Cristalização na Recuperação e Purificação de Apo2L/TRAIL
Nos métodos da presente invenção, a cristalização é uma etapana recuperação e purificação de Apo2L/TRAIL, e opcionalmente, é uma eta-pa em um esquema com uma coluna ou duas colunas para a recuperação epurificação de Apo2L/TRAIL.
Em uma modalidade específica, Apo2L/TRAIL é purificada a par-tir de uma cultura ou Iisado de células hospedeiras recombinantes, ou Iisadocelular clarificado, usando um processo de purificação que inclui uma etapade cristalização. Caso Apo2L7TRAIL seja produzida em E. coli, tipicamente ocaldo celular integral é colhido e homogeneizado para abrir as células de E.coli e liberar Apo2L/TRAIL solúvel dentro do citoplasma. Depois de removeros resíduos sólidos, por exemplo, por centrifugação, a mistura é carregada euma resina cromatográfica de troca catiônica, tal como, por exemplo, SP-Sepharose Fast Flow ou CM-Separose Fast Flow (Amersham Pharmacia,Suécia). Os protocolos típicos para purificar Apo2L/TRAIL a partir do caldocelular obtido por fermentação de E. colisão fornecidos nos Exemplos 2 e 3.
Em um protocolo típico, o pH do caldo celular integral obtido porfermentação as células de E. colié ajustado para cerca de 7,5, por exemplo,pela adição de HEPES sódico ou qualquer outro tampão apropriado. De pre-ferência, um agente redutor, tal como 1,4-ditio-treitol (DTT) ou β-mercaptoetanol é adicionado, para impedir a formação de ligações dissulfetoentre monômeros ligados de forma não-covalente de Apo2LVTRAIL. As célu-las são abertas por uma ou mais passagens em um homogeneizador de altapressão disponível no mercado, os resíduos celulares são removidos, e oIisado celular é clarificado. Os parâmetros específicos do tratamento, taiscomo seleção e concentração de reagentes, dependem da composição docaldo celular integral de partida, tal como, por exemplo, a densidade das células.
A mistura que contém Apo2LVTRAIL, tal como um Iisado de célu-las clarificado, é então carreada em uma primeira coluna cromatográfica,usando uma resina de troca catiônica. A cromatografia de troca catiônicaretém biomoléculas pela interação de grupos carregados que são de nature-za ácida sobre a superfície da resina com histidina, Iisina e arginina. As resi-nas de troca catiônica estão disponíveis comercialmente como linhas deproduto de vários fabricantes, tal como, por exemplo, Sigma Aldrich. As resi-na trocadoras de cátions incluem resinas portadoras, por exemplo, de gru-pos funcionais carbóxi-metila (trocador catiônico fraco, tal como CM celuloseSephadex) ou grupos funcionais de ácido sulfônico (trocador catiônico forte,tal como SP Sephadex). Na primeira etapa de purificação cromatográficados métodos da presente invenção, são preferidas colunas de troca catiôni-ca forte, por exemplo, SP-Sepharose®, trocadoras catiônicas fortes Spec-tra/Gel®, etc. As trocadoras catiônicas fortes TSKgel, etc., são preferidas. Nocaso de uma coluna com SP-Sepharose®, a matriz de agarose reticuladacom grupos funcionais negativamente carregados se liga a Apo2L/TRAIL, eao mesmo tempo, permite que a maioria das impurezas e as variantes deApo2L/TRAIL atravessem a coluna. A eluição pode ser realizada usandoeluição com gradiente de sais, ou uma eluição em etapas, sendo preferida aeluição em etapas, pois ela proporciona melhores condições para a etapa decristalização subseqüente, sem comprometer os rendimentos. O tampão deeluição contém usualmente cloreto de sódio ou sulfato de sódio, e a concen-tração de sal é selecionada para atender às demandas da coluna de trocacatiônica e da etapa de cristalização subseqüente. A coluna de SP-Sepharose® precisa uma concentração de sal razoavelmente alta para re-mover a proteína Apo2UTRAIL ligada, enquanto que para a etapa de crista-lização subseqüente são preferidas concentrações de sal relativamente bai-xas, para baixa a solubilidade da proteína. Tipicamente, são usadas concen-trações de Na2SO4 cerca de 100-150 mM e 100-200 mM de NaCI. Um tam-pão de eluição típico consiste em NaCI 200 mM, HEPES 50 mM, 0,5% deTriton X-100, DTT 1 mM, pH 7,5.
A concentração de Apo2L/TRAIL na troca catiônica, por exem-plo, no pool de eluição de SP-Sepharose®, influencia o rendimento teóricopara a etapa de cristalização seguinte. A concentração deve ser alta o sufi-ciente para maximizar as diferenças de solubilidade em temperaturas maisbaixas, mas não alta demais para disparar a cristalização espontânea natemperatura ambiente ou ao redor dela.
Em um protocolo representativo, duas etapas de lavagem sãoempregadas entre o carregamento e a eluição da proteína Apo2L/TRAIL. Aprimeira lavagem usa tampão de equilíbrio, e a segunda é uma lavagem comsal, usando um tampão idêntico ao tampão de eluição subseqüente, excetoque se usa uma concentração mais baixa do sal (por exemplo, NaC1100 mMem vez de NaCI 200 mM).
A etapa de eluição de SP, que inclui duas etapas de lavagem,produz tipicamente concentrações de Apo2LVTRAIL ao redor de 3-6 g/L, talcomo 5 g/L com rendimentos ao redor de 80-90%. A etapa de lavagem comsal resulta em perda da proteína ativa; portanto, removendo esta etapa, orendimento pode ser aumentado até acima de 95%. Entretanto, a eliminaçãodesta etapa diminui também a capacidade de a coluna remover endotoxinase proteínas extracelulares, baixando desta forma a pureza.O pool de eluição que deixa a coluna de troca catiônica é sub-metido à cristalização diretamente sem qualquer etapa de purificação adicio-nal, mas opcionalmente, inclui filtração estéril. A cristalização é realizadatipicamente diminuindo gradualmente a temperatura de cerca de 15-30°Cpara cerca de 2 a 8°C em um período de tempo que pode se estender até 60horas, mas é tipicamente mais curto, tal como, por exemplo, cerca de uma a8 horas.
Em um processo de cristalização típico, o pool de eluição quedeixa a coluna de troca catiônica é transferido para dentro de um tanquecom temperatura controlada sob agitação adequada. É importante assegurarque o vaso e a solução de proteína estejam isentos de quaisquer particula-dos sólidos, para evitar a nucleação baseada nesses particulados sólidos,que influenciaria a cinética da cristalização. Para aplicações em pequenaescala, pode ser usado, por exemplo, um vaso de reação Applikon® de 1 ou2 litros. No vaso de 1 L, a temperatura é controlada por intermédio de ser-pentinas de refrigeração imersas no vaso. O vaso de reação de 2 litros con-tém uma camisa de troca térmica. Uma rampa de temperatura pode ser pro-duzida em ambos vasos usando um banho de troca de calor programável(por exemplo, um Circulador de Temperatura Programável PoIyScience Mo-delo 1157). O vaso é usualmente equipado com um agitador para misturarintensamente a solução, e deixar em suspensão os cristais depois de forma-dos. A velocidade da agitação é tipicamente ao redor de 250 rpm para umaescala de 0,4 L e é ajustada para pools maiores mantendo uma razão cons-tante de potência para volume, proporcional a N3/V (agitador com diâmetroconstante).
Descobriu-se que a solubilidade de Apo2L/TRAIL aumenta coma concentração crescente de sal, e Apo2L/TRAIL é igualmente solúvel emsulfato de sódio e cloreto de sódio. Os cristais formados em cloreto de sódiotêm uma espessura mais exagerada em comparação com os cristais forma-dos em sulfato de sódio, que têm uma aparência mais achatada. Como resul-tado, os cristais produzidos em cloreto de sódio são mais fáceis de separarpor filtração, o que torna o cloreto de sódio o sal preferido. Como tampões defundo, HEPES e TRIS fornecem tipicamente resultados comparáveis.
A solubilidade de Apo2UTRAIL diminui com o aumento do pHdentro de uma faixa de cerca de pH 7,0 a 8,0. Um pH mais alto tende a au-mentar os rendimentos, mas pode produzir cristais com uma aparência maisamorfa. Além disso, os cristais são maiores em pH mais alto, mas tambémmais frágeis. Tendo em vista estas considerações, um pH preferido, queproduz a morfologia desejada dos cristais, é 7,3 ± 0,1.
A rampa de temperatura usada durante a cristalização (tipica-mente entre aproximadamente a temperatura ambiente e cerca de 2°C) nãoteve qualquer efeito significativo sobre o tamanho dos cristais ou a distribui-ção do tamanho dos cristais entre cerca de uma e 24 horas. A rampa detemperatura pode ser linear, mas uma taxa de resfriamento não-lineár tam-bém pode ser usada para melhorar ainda mais o perfil do tamanho dos cris-tais mantendo um nível constante de supersaturação à medida que a crista-lização progride. Como Apo2L/TRAIL não cristaliza espontaneamente nossistemas de tampões da presente invenção até que a temperatura estejaabaixo de cerca de 8°C, de preferência abaixo de cerca de 5°C, é possívelbaixar rapidamente a temperatura até cerca de 10°C, e depois resfriar len-tamente o pool para permitir a cristalização.
O tamanho dos cristais é influenciado pela velocidade de agita-ção. Ao testar três velocidades diferentes da agitação (100 rpm, 175 rpm e250 rpm), a cristalização demonstrou ser mais rápida com a velocidade deagitação maiores, mas a distribuição do tamanho dos cristais e a aparênciados cristais foram muito similares para as velocidades de agitação de 175rpm e 250 rpm. Em velocidades mais baixas, os cristais ao ficam completa-mente em suspensão, o pode ocorrer a agregação de cristais. Em velocida-des de agitação mais altas, deve-se tomar cuidado para não danificar a pro-teína solúvel pela exposição a efeitos de cisalhamento na interfacear/líquido.
A eficiência da cristalização pode ser melhorada baixando a so-lubilidade de Apo2UTRAIL. Assim sendo, o rendimento global da etapa decristalização é controlado em parte pela solubilidade de Apo2L/TRAIL nopool gelado da primeira coluna de cromatografia por troca catiônica. Os doisfatores que afetam o rendimento são a concentração inicial de Apo2L/TRAILno pool de eluição coletado a partir da primeira coluna (por exemplo, SP) decromatografia de troca catiônica, e a concentração de Apo2L/TRAIL solúvelna lama de cristais (isto é, a quantidade de Apo2UTRAIL que não cristaliza).Apo2L/TRAIL que ainda está em solução depois da cristalização será perdi-da durante a filtração. A adição de anti-solventes pode mudar a química dasolução para baixar a solubilidade no equilíbrio.
Rendimento percentual teórico = [Apo2L]22c~ [Apo2Uc/[Apo2L]22cχ 100, onde os números subscritos indicam valores de temperatura
Reduzindo Apo2L/TRAIL em solução, menos proteína é removi-da quando o licor-mãe é removido por filtração. O anti-solventes, conhecidostambém como agentes precipitantes, são bem-conhecidos nessas técnicas epodem funcionar de uma série de maneiras. Alguns anti-solventes desidra-tam a solução absorvendo água. Isto essencialmente reduz a atividade daágua disponível para dissolver a proteína (vide McPherson, A., 1998, "Cys-tallization of Biological Macromolecules", Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Plainview, NY).
Um anti-solvente amplamente utilizado é o polietilenoglicol(PEG), um polímero disponível em uma ampla série de pesos moleculares.Como ilustrado nos exemplos, nos métodos da presente invenção, um PEGcom peso molecular mais alto (3.350 e 10.000) produziu resultados melho-res. Outros polímeros que podem ser usados como anti-solventes incluem,por exemplo, Eudragit RS, etil-celulose, álcool isopropílico, etanol, dioxano e2-metil-2,4-pentanodiol (MPD).
Quando a cristalização está completada, os cristais deApo2L/TRAIL são removidos, por exemplo, por filtração. Os cristais podemser mantidos em suspensão durante a etapa de filtração inteira, usando umagitador embutido, ou podem ser depositados em um leito compactado.É importante evitar a formação de uma torta comprimida de cristais, o quepoderia tornar difícil atingir a vazão desejada. Portanto, pressões diferenciaisatravés do leito compactado devem ser minimizadas. As vazões podem vari-ar, e são tipicamente entre cerca de 200 cm/h e cerca de 100 cm/h. A vazãopode depender do equipamento usado, e do diferencial de pressão aplicadodurante a filtração. A filtração pode ser realizada em batelada ou continua-mente. Uma purificação adicional pode ser conseguida, por exemplo, lavan-do o leito de cristais depositado com uma solução que não dissolve substan-cialmente os cristais de Apo2L/TRAIL, tal como uma solução gelada (2-8°C)de TRIS de baixa molaridade em pH de cerca de 7,5.
Depois da cristalização e separação, os cristais de Apo2L/TRAILpodem ser dissolvidos e estocados ou convertidos em uma formulação a-propriada para o uso pretendido.
Alternativamente, uma outra etapa de purificação cromatográficapode ser adicionada para melhorar ainda mais a pureza removendo os resí-duos do anti-solvente (PEG) e os componentes do tampão, e reduzir os ní-veis de proteínas extracelulares residuais, endotoxinas, dímeros e agrega-dos. A segunda coluna cromatográfica, usada depois da cristalização, podeser uma coluna de troca catiônica, ou uma coluna de interação hidrofóbica.Como o pool de cristalização é muito puro, não é tipicamente necessáriousar um modo de separação "ligar e elui f (tal como usado tipicamente comSP-Sepharose ou CM-Sepharose), uma coluna "flow-through", tal como aresina de HIC Phenyl-Sepharose, tipicamente demonstrará um bom desem-penho. O uso de ambos tipos de resinas, troca catiônica em um modo de"ligar e eluir" e HIC em modo "flow-through", foi testado e os resultados estãodiscutidos nos exemplos. Descobriu-se que, enquanto que uma etapa deligação e de cromatografia com eluição em etapas proporciona uma ferra-menta muito potente para a purificação inicial, na segunda etapa de purifica-ção cromatográfica, a cromatografia por interação hidrofóbica em Phenyl-Sepharose é suficiente para produzir a pureza e os rendimentos desejados.Como esta é uma etapa "flow-through", ela produz rendimentos excelentes ereduz o número de soluções necessário para completar a operação emcomparação com a cromatografia de ligar e eluir.
B.4 Uso de Apo2L/TRAIL
Os métodos da presente invenção proporcionam uma alternativaeficaz, eficiente e econômica a, por exemplo, protocolos de purificação querequerem múltiplas purificações em colunas. Como discutido acima, em umamodalidade, o esquema de purificação da presente invenção envolve o usode uma única coluna de troca catiônica, e em seguida, cristalização. Os cris-tais de Apo2L/TRAIL obtidos pelo método da presente invenção podem sersecos para estocagem. A secagem do material cristalino pode reduzir tam-bém substancialmente o volume de estocagem, e proporcionar uma maneiraeficaz para estocagem a granel que evita congelamento do material purifica-do em baixa concentração na solução da formulação. A lama de cristais emconcentração muito alta da proteína pode ser congelada em recipientes comvolumes menores.
Em outra modalidade, os cristais de Apo2L/TRAIL são coletadose lavados com tampão (ou água) (de preferência, um tampão gelado emuma temperatura de cerca de 2 a 8°C). Os cristais lavados podem ser reco-locados em suspensão ou redissolvidos à temperatura ambiente.Apo2L/TRAIL solubilizada novamente pode ser purificada adicionalmente porcromatografia de interação hidrofóbica ou uma segunda cromatografia detroca catiônica, como descrito acima, lavada e estocada como um materialcristalino úmido a granel. Alternativamente, a etapa de cromatografia porinteração hidrofóbica ou outra etapa de cromatografia pode ser omitida emfavor de simplesmente recristalizar.
O material cristalino úmido a granel pode ser estocado a -20°Cou secado para estocagem à temperatura ambiente ou a 2-8°C. De prefe-rência, o material cristalino secado é solubilizado novamente em uma formu-lação que contém succinato de arginina. Opcionalmente, esta formulaçãopode ser filtrada de forma estéril e/ou envasilhada em frascos de dosagensindividuais, e Iiofilizada para reconstituição ou suspensão posterior. Opcio-nalmente, a formulação cristalina seca pode ser envasilhada como um póem frascos e transformada em uma solução ou suspensão. Pode ser dese-jável atingir um teor de água de cerca de 5% a cerca de 10% nos cristais deApo2L/TRAIL secos.
As formulações de Apo2L/TRAIL podem ser empregadas emuma série de aplicações terapêuticas e não-terapêuticas. Dentre estas apli-cações estão métodos para tratar distúrbios tais como câncer, condiçõesrelacionadas ao sistema imunológico, ou condições virais. Estas aplicaçõesterapêuticas e não-terapêuticas estão descritas adicionalmente, por exem-plo, nos documentos n22 WO 97/25428, WO 97/01633 e WO 01/22987.
Nos métodos da invenção para tratar um distúrbio usando umaformulação aqui descrita, a formulação de Apo2L/TRAIL pode ser adminis-trada diretamente ao mamífero por qualquer técnica apropriada, incluindoinfusão ou injeção. A via de administração específica dependerá, por exem-plo, do histórico médico do paciente, incluindo quaisquer efeitos colateraispercebidos ou previstos, usando Apo2L/TRAIL, e do distúrbio a ser corrigido.Os exemplos de administração parenteral incluem administração subcutâ-nea, intramuscular, intravenosa, intra-arterial e intraperitoneal da composi-ção. As formulações são administradas, de preferência, como injeções ouinfusões intravenosas (iv), subcutâneas (sc), intramusculares (im) repetidas,infusões intracranianas ou como formulações de aerossóis apropriadas paradistribuição intranasal ou intrapulmonar (para distribuição intrapulmonar, vi-de, por exemplo, documento n2 EP 257.956).
Assinala-se que a pressão osmótica de injeções pode ser impor-tante em injeção subcutânea e intramuscular. As soluções para injeção,quando hipotônicas ou hipertônicas, podem causar dor a um paciente depoisda infusão. Usualmente, para as formulações terapêuticas injetáveis nestecaso, refere-se que a osmolaridade relativa da solução injetável seja de cer-ca de 300 mosm a cerca de 600 mosm.
Apo2L/TRAIL pode ser administrada também na forma de prepa-rações com liberação prolongada. Os exemplos apropriados de preparaçõescom liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímerossólidos hidrofóbicos que contêm a proteína, matrizes estas que estão naforma de artigos modelados, como por exemplo, filmes ou microcápsulas. Osexemplos de matrizes com liberação controlada incluem derivados de celu-lose (por exemplo, carbóxi-metil-celulose), isobutirato de acetato de sacaro-se (SABER®) em meios não-aquosos, poliésteres, hidrogéis (por exemplo,poli(metacrilato de 2-hidróxi-etila) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res.15:167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982), ou poli(álcoolvinílico)), polilactideos (patente n- US 3.773.919, documento n2 EP 58.481),copolímeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de gama-etila (Sidman etal., Biopolymers 22:547-556 (1983)), copolímero de etileno e acetato de vini-la não-degradável (Langer et al., supra), copolímeros de ácido lático e ácidoglicólico degradáveis, tal como o Depósito Lupron (microsferas injetáveisconstituídas de ácido lático e ácido glicólico, e acetato de leuprolida), e po-li(ácido D-(-)-3-hidróxi-butírico) (documento η2 EP 133.988). Um métodoopcional para a distribuição de fármacos com atuação sistêmica envolve aadministração por infusão contínua (usando, por exemplo, dispositivos comliberação lenta ou minibombas tais como bombas osmóticas ou emplastroscutâneos), ou por injeção (usando, por exemplo, meios intravenosos ou sub-cutâneos, incluindo administração maciça única).
A composição a ser usada na terapia deve ser formulada e do-sada de uma maneira consistente com a boa prática médica, levando emconta a condição clínica do paciente individual, o local de distribuição dacomposição, o método de administração, a cronologia da administração, eoutros fatores conhecidos pelos profissionais. As "quantidades eficazes" decada componente para os presentes propósitos são, assim, determinadaspor essas considerações e são quantidades que resultam em biodisponibili-dade de Apo2L/TRAIL ou outros fármacos para o mamífero.
Como proposição genérica, a quantidade farmaceuticamenteeficaz total dos polipeptídeos Apo2L/TRAIL, administrada, deve ficar na faixaentre cerca de 1 mg/kg/dia e cerca de 20 mg/kg/dia, baseado no peso corpo-ral em quilogramas do paciente, embora, como assinalado acima, isto deveestar sujeito ao critério terapêutico.
Embora a injeção seja preferida, um dispositivo de infusão tam-bém pode ser empregado para infusões contínuas. Uma solução intravenosaem bolsa também pode ser empregada.
Contempla-se que mais terapias adicionais possam ser empre-gadas nos métodos. Uma ou mais terapias adicionais podem incluir, porémsem imitações, administração de terapia de radiação, citocinas, agentes ini-bidores do crescimento, agentes quimioterápicos, agentes citotóxicos, inibi-dores de tirosina cinase, inibidores de ras farnesil transferase, inibidores deangiogênese, e inibidores de cinases dependentes de ciclinas que são co-nhecidos nessas técnicas e definidos adicionalmente com particularidade naSeção I acima. Além disso, terapias baseadas em anticorpos terapêuticosque assestam antígenos de tumores-alvo tais como Rituxan® ou Herceptin®,bem como anticorpos anti-angiogênicos tais como anti-VEGF, ou anticorposque assestam receptores de Apo2L, tais como DR5 ou DR4.
A preparação e os cronogramas de dosagem para agentes qui-mioterápicos podem ser usados de acordo com as instruções dos fabrican-tes ou como determinado empiricamente pelos versados nessas técnicas.A preparação e os cronogramas de dosagem para tais quimioterapias estãodescritos também em "Chemotherapy Service", Editor M.C. Perry, Williams &Wilkins, Baltimore, MD (1992).
Pode ser desejável também administrar anticorpos contra outrosantígenos tais como anticorpos que se ligam a CD20, CD11a, CD18, CD40,ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, fator do crescimento endotelial vascular(VEGF), ou outros membros da família de TNFR (tais como DR4, DR5,OPG, TNFR1, TNFR2). Alternativamente, ou adicionalmente, dois ou maisanticorpos que se ligam aos mesmos antígenos ou dois ou mais antígenosdiferentes aqui descritos podem ser co-administrados ao paciente. Em umamodalidade, as formulações de Apo2L são co-administradas com um agenteinibidor de crescimento.
A formulação de Apo2L/TRAIL pode ser administrada concomi-tantemente ou seqüencialmente com esses outros agentes. Por exemplo, aformulação de Apo2L/TRAIL ou um agente quimioterápico pode ser adminis-trado como um pré-tratamento (antes da administração de qualquer um des-ses agentes), tal como um pré-tratamento de células cancerosas que pode-riam de outra forma ficar resistentes aos efeitos apoptóticos deApo2L/TRAIL.
A invenção fornece também kits que incluem uma formulaçãoaqui descrita. Um kit típico deve compreender um recipiente, de preferênciaum frasco, para Apo217TRAIL em um ou mais excipientes descritos acima; einstruções, tal como uma bula ou rótulo, orientando o usuário de como em-pregar a formulação de Apo2LVTRAIL. Ele deveria de preferência forneceruma formulação farmacêutica. De preferência, a formulação farmacêutica épara tratar câncer ou uma condição relacionada ao sistema imunológico. Osrecipientes apropriados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas etubos de ensaio. Os recipientes podem ser produzidos a partir de vários ma-teriais, tais como vidro ou plástico. O recipiente deve conter uma formulaçãode Apo2L/TRAIL que é eficaz para diagnosticar ou tratar o distúrbio e podeter um orifício de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bol-sa de solução intravenosa ou um frasco com uma tampa perfurável por umaagulha de injeção hipodérmica). O rótulo sobre o recipiente ou associadocom ele indica que a formulação é usada para diagnosticar ou tratar o dis-túrbio de escolha. O artigo manufaturado pode compreender ainda um se-gundo recipiente que compreende água para injeção, uma solução farma-ceuticamente aceitável, solução salina, solução de Ringer, ou solução dedextrose. Ele pode incluir ainda outros materiais desejáveis de um ponto devista comercial ou do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros,agulhas, seringas, e bulas com instruções para uso.
Todas patentes, pedidos de patente, publicações, descrições deprodutos, e protocolos são citados neste pedido de patente inteiro, cujos teo-res são aqui incorporados como referência em sua totalidade.
Exemplos
Os exemplos que se seguem são oferecidos com propósito me-ramente ilustrativo, e não devem ser entendidos de forma alguma como Iimi-tativos do escopo da presente invenção. Os reagentes disponíveis no mer-cado citados nos exemplos foram usados de acordo com as instruções dofabricante, a menos que diferentemente indicado. O fornecedor das célulasidentificadas nos exemplos que se seguem, e neste relatório descritivo intei-ro, pelos números de acesso da ATCC, é a American Type Culture Collecti-on, Manassas, Virgínia.Exemplo 1
Produção de Apo2L/TRAIL em E coli e Purificação por Múltiplas EtapasCromatográficas (sem cristalização)
A. A proteína Apo2L/TRAIL, consistindo nos aminoácidos 114-281 (vide Figura 1), foi expressada em E coli sob o controle do promotor AP(preparação e expressão descritas no Exemplo 8 (Seção A) do documenton2 WO 01/00832, publicado em 4 de janeiro de 2001), e purificada a partirdos Iisados de células de E coli por três etapas cromatográficas que consis-tem em cromatografia de troca catiônica, com hidroxiapatita e de interaçãohidrofóbica (documento n2 WO 01/00832, Exemplo 8, Seção C). Na terceiraseparação cromatográfica, a proteína Apo2L/TRAIL foi eluída em sulfato desódio 600 mM ou sulfato de amônio 400 mM, Tris 50 mM, pH 7,5.
B. Outro método para purificação de Apo2UTRAIL consistiu emquatro etapas de cromatografia de duas etapas de ultrafiltração/diafiltração(UFDF). O caldo celular integral obtido a partir do processo de produção deE coli foi homogeneizado para abrir as células de E coli e liberarApo2L/TRAIL solúvel mantida dentro do citoplasma. Os detritos celularessólidos foram então removidos por centrifugação.
O isolamento primário foi realizado por ligação e gradiente deeluição em uma coluna de troca catiônica (CEX) (coluna de SP-SepharoseFast Flow). O eluído foi então transferido para uma coluna de cromatografiacom hidroxiapatita (HA), e em seguida, cromatografia por interação hidrofó-bica (Phenyl-Sepharose). Depois de uma etapa de ultrafiltração/diafiltração(UFDF), a mistura foi carregada em ma coluna de CM-Sepharose1 e a prote-ína eluída foi concentrada por uma etapa final de UFDF.
Exemplo 2
Cristalização de Apo2L/TRAIL como um Método de Recuperação e Purifica-ção Depois de Purificação em Uma Coluna
A propensão de cristalização de Apo2L/TRAIL em soluções desulfato de sódio foi usada como um meio para purificar a proteínaApo2L/TRAIL a partir de extratos de E coli. O protocolo que se segue foiempregado para a recuperação e purificação de Apos2L/TRAIL recombinan-te sem efeito adverso sobre a qualidade da proteína.
O caldo celular integral colhido, derivado de E. coli (descrito noExemplo 1) teve seu pH ajustado para pH 7,5 com HEPES 1,5 M (ou Tris 1,5M) e depois homogeneizado em um homogeneizador (Gaulin Corporation,Everett, MA) a 44,82 MPa (6.500 psi). O homogeneizado foi diluído até 1com DTT 5 mM em água purificada. Depois que a solução atinge a tempera-tura ambiente, 5% de polietilenoimina (PEI) são adicionados para dar umaconcentração final de 0,1%, e a solução foi floculada por 1-2 horas. O mate-rial floculado foi centrifugado com uma centrífuga com alimentação contínuaBTPX20 (Alfa Lavai Separation AB, Suécia) e clarificado por filtração profun-da. O Iisado (extrato) celular clarificado foi condicionado com Triton X-100até uma concentração final de 0,05%. O Iisado celular clarificado condicio-nado foi então carregado em uma coluna de troca catiônica (resina de trocacatiônica SP-Sepharose FF, Amersham Pharmacia, Suécia) equilibrada emHepes 50 mM (ou Tris 50 mM)/0,05% de Triton X-100/DTT 1 mM, pH 7,5.A Apo2L/TRAIL se ligou à coluna, enquanto que as proteínas não ligadasescoaram através da coluna e foram removidas lavando com tampão de e-quilíbrio até que a absorvância a 280 nm atingisse o referencial. A coluna foientão lavada com 3 volumes da coluna de NaCI 0,1 M em tampão de equilí-brio. A Apo2L/TRAIL foi eluída em etapas usando NaCI 0,1 M (ou Na2SO40,1 M) em Hepes, TRis e trietanol-amina, todos 50 mM, 0,05% de tampão deTriton X-100 e DTT 1 mM, pH 7,8.
O pool de Apo2L/TRAIL à temperatura ambiente coletado dacoluna SP foi colocado em um tanque de aço inoxidável com uma camisaisolada para aquecimento e resfriamento. O tanque foi equipado com umfundo cônico e uma válvula de descarga no fundo para recuperação máximada proteína cristalizada. O pool foi agitado usando uma hélice do tipo navalsob condições de misturação leves. Usou-se um controle para descender atemperatura de aproximadamente 25°C até aproximadamente 4°C durante ocurso de uma hora. A cristalização espontânea foi observada dentro de mi-nutos depois que o pool atingiu 4°C. Depois de mais de 12 horas sob estascondições, a cristalização se completou à medida que a solubilidade em e-quilíbrio estivesse quase estabelecida. Os cristais foram então capturadosem um conjunto de filtração contendo de uma frita de polipropileno de 20μηι. Depois da deposição dos cristais sobre a superfície do filtro, os cristaisforam lavados com Tris 20-50 mM gelado em pH 7,5. Um volume igual dotampão de lavagem em comparação com o volume do pool de Apo2L/TRAILSP foi então usado para remover o licor-mãe (sobrenadante) residual doscristais depositados. Depois da lavagem, os cristais foram dissolvidos emsulfato de sódio 100 mM/Tris 20 mM em pH 7,5 recirculando o tampão dedissolução através do leito de cristais a aproximadamente 30°C. A dissolu-ção dos cristais foi observada dentro de aproximadamente 4 horas.Apo2L/TRAIL purificada dissolvida foi então filtrada de forma estéril paradentro de um recipiente e estocada congelada a -70°C.
A pureza das preparações de Apo2L/TRAIL foi determinada pe-los ensaios ELISA de proteína total (ECP) em E. coli, ensaio de Lisado doAmebócito Límulo (LAL), e coloração prata SDS-PAGE. ECP ELISA foi reali-zado imobilizando anticorpos anti-ECP integral caprino purificado por afini-dade sobre poços de placas de microtitulação, incubando as amostras e de-pois com ECPs conjugados com peroxidase de rábano. A atividade enzimá-tica da peroxidase foi então quantificada com o-fenilenodiamina lenda a ab-sorvância a 490 nm em uma leitora de placas de microtitulação. O nível deendotoxinas foi determinado usando o ensaio de Iise de coágulo do amebó-cito límulo. A coloração prata com SDS-PAGE foi realizada em um gel depoliacrilamida com gradiente de 10 a 20% (Daiichi Pure Chemicals) em tam-pão de Tris-glicina, contendo 0,1% de SDS. A eletroforese foi conduzida emuma corrente constante de 50 mA até que o corante atingisse a proximidadedo fundo do gel. Os géis foram fixados e corados por métodos com Azul Bri-lhante de Coomassie ou coloração prata de Merrill.
A qualidade da proteína foi avaliada por SEC, SDS-SEC, IEX, ea bioatividade, de acordo com os métodos descritos no Exemplo 1.
A pureza e a qualidade de Apo2L/TRAIL recuperada usando ométodo de cristalização acima em uma escala de fermentação de 60 L estãoindicadas na Tabela 1. Para comparação, um padrão referencial purificadopor um método de três etapas cromatográficas, como descrito no Exemplo 1,também está indicado.
Tabela 1
<table>table see original document page 55</column></row><table>
Como indicado na Tabela 1, a preparação de Apo2L/TRAIL emuma escala de fabricação teve um alto grau de pureza apropriado para usoterapêutico. Os dados indicam que a proteína Apo2UTRAIL purificada naetapa de "uma coluna" é suscetível à cristalização e tem uma pureza compa-rável ou melhor do que a proteína Apo2/TRAIL purificada pelo método depurificação em três colunas, descrito no Exemplo 1. A Figura 3 ilustra o efei-to do tipo de sal sobre a cristalização de uma Apo2L/TRAIL purificada naetapa de uma coluna. O "envenenamento" da cristalização por cátions biva-lentes foi observado no caso de Apo2L/TRAIL parcialmente purificada (Figura 3).
As propriedades bioquímicas de Apo2L/TRAIL também não fo-ram afetadas adversamente pela cristalização de Apo2L/TRAIL parcialmentepurificada (vide Tabela 1). Os dados sugerem que a cristalização deApo2L/TRAIL expressada recombinante, quando em um estado parcialmen-te purificado, pode ser um meio eficaz, eficiente e econômico para sua purifi-cação. Opcionalmente, tais cristais podem ser então usados para a prepara-ção de granel seco para estocagem ou formulações com liberação controlada.Exemplo 3
Método para Recuperação e Purificação de Apo2L/TRAIL Usando Cristaliza-ção que Inclui uma Segunda Etapa Cromatográfica depois da Cristalização(Purificação em Duas Colunas)
O caldo celular integral colhido a partir de E. coli (descrito noExemplo 1) teve seu pH ajustado para pH 7,5 com Hepes 1,5 M (ou Tris 1,5M). Adicionou-se DTT até 5 mM para impedir a formação de ligações dissul-feto entre os monômeros não ligados de forma covalente. Duas passagensem um homogeneizador (Gaulin Corporation, Everett, MA) a 44,82 MPa(6.500 psi) romperam as células de E. coli. O Iisado foi então diluído até 1com DTT 5 mM em água purificada. Depois que a solução atingiu a tempera-tura ambiente, 5% de PEI foram adicionados para dar uma concentraçãofinal de 0,2% de PEI. A PEI causou a floculação dos sólidos celulares, e omaterial foi misturado por pelo menos 30 min antes de centrifugar, para per-mitir a floculação completa. Depois da centrifugação, o Iisado clarificado foifiltrado usando um filtro profundo Cuno Maximizer 30/60SP (Cuno Incorpora-ted, Meriden, CT). Antes de carregar o Iisado clarificado em uma coluna deSP Sepharose, o pH foi ajustado para 7,5 usando Hepes Na 1 M, e a condu-tividade foi ajustada para abaixo de 9,5 mS/cm usando DTT 5 mM em água.
Da mesma forma que no método de purificação do Exemplo 2, aresina SP-Sepharose, uma resina de troca catiônica forte, foi escolhida paraa etapa de captura primária. A matriz de agarose reticulada com grupo nega-tivamente carregados se ligou a Apo2L/TRAIL, enquanto que a maior partedas impurezas e variantes de Apo2L/TRAIL atravessaram a coluna. As se-guintes condições do tampão foram usadas: NaCI 200 mM, HEPES 50 mM,0,05% de Triton X-100, DTT 1 mM, pH 7,5.
A cristalização do pool de eluição de SP foi conseguida comuma rampa de temperatura controlada de 22°C até 4°C durante um intervalode 4 horas. O pool de eluição de SP foi filtrado de forma estéril e transferidopara um tanque com temperatura controlada sob boa agitação. Foi importan-te assegurar que o tanque e a solução de proteína estivessem isentos dequaisquer particulados antes da cristalização. Quando o pool de eluição SPresfriou, os cristais se formaram espontaneamente com um comprimentomédio da corda de 44 μηη, determinado pela tecnologia de Medição de Re-fletância com Feixe Focalizado de Lasantec. A morfologia dos cristais era defaces hexagonais com metade da profundidade do maior comprimento dacorda. Depois de reter o pool por aproximadamente uma a duas horas a 4°C,para permitir que a taxa de crescimento dos cristais desacelere, 50% dePEG 3350 foram adicionados para dar uma concentração final de 5% dePEG 3350. A adição de PEG 3350 (um anti-solvente) baixou a solubilidadede Apo2L7TRAIL, e promoveu mais crescimento dos cristais.
Os cristais formados foram então removidos por filtração, embatelada ou continuamente. Em ambos os casos, o licor-mãe foi removido, eos cristais foram lavados para remover as impurezas e o solvente residual.A filtração foi realizada a 2-8°C. A lama de cristais foi transferida para umfiltro do tipo Büchner ou Nutsche, contendo um filtro com malha de aço sinte-rizado, polipropileno sinterizado ou aço de 5-20 μιη sifonando ou pressuri-zando o tanque que contém a lama de cristais. Os cristais foram então ras-pados manualmente do filtro, ou dissolvidos em um sistema de tampão paraa próxima etapa de purificação.
Antes de carregar em uma coluna de CM-Sepharose, os cristaisforam dissolvidos em succinato de arginina 0,5 M/TRIS 20 mM, pH 7,2. An-tes de carregar em uma coluna de Phenyl-Sepharose, os cristais foram dis-solvidos em Na2SO4 0,6 mM/TRIS 50 mM, pH 7,5.
A etapa de cromatografia depois da cristalização serviu para re-mover o PEG e os componentes do tampão do pool de proteína cristalina, epara proporcionar uma remoção pelo menos moderada de ECPs, endotoxi-nas, dímeros e agregados.
Em um conjunto de experimentos, uma coluna de CM-Sepharose para ligar e eluir foi usada nesta etapa. Antes de carregar estacoluna, os cristais de Apo2L/TRAIL foram dissolvidos na formulação do tam-pão, succinato de arginina 0,5 M/TRIS 20 mM, pH 7,2, e o pool dissolvido foidiluído 5 vezes com TRIS 20 mM. O pool de cristais dissolvidos foi carrega-do na coluna e eluído com NaCI 125 mM/TRIS 50 mM/DTT 1 mM, pH 7,5. Aoperação da coluna foi repetida várias vezes para apresentar recuperação(85-95%) e pureza consistentes.
Em outro conjunto de experimentos, foi usada uma coluna "flow-througfi', Phenyl-Sepharose HIC. Neste caso, os cristais foram dissolvidosem Na2SO4 0,6 M/TRIS 50 mM/DTT 1 mM, pH 7,5. A solubilidade deApo2L/TRAIL era muito alta nesta solução por causa da alta concentraçãode sais. Três corridas tiveram consistentemente rendimentos de 98% e oscromatogramas foram quase idênticos. O nível de pureza foi alto, como ob-servado usando a coluna de CM-Sepharose para ligar e eluir.
Exemplo 4
Seleção das Condições de Cristalização
O pool de eluição em SP-Sepharose da primeira etapa de purifi-cação cromatográfica, descrito no Exemplo 3, foi resfriado para produzir cris-tais e depois aquecido para dissolver os cristais múltiplas vezes.
Um analisador de tamanho em tempo real (Medição de Refle-tância com Feixe focalizado Lasentec - FBRM) foi usado para monitorar ocomprimento da corda dos cristais e a distribuição durante o processo decristalização inteiro. No método de FBRM, um laser é girado rapidamente emum trajeto circular. À medida que o laser passa sobre o cristal, o feixe de luzé refletido por uma certa duração que é multiplicada pela velocidade do laserrotativo para dar um "comprimento de corda".
Efeito da Taxa de Resfriamento da Temperatura
O FBRM foi usado para monitorar o perfil do crescimento doscristais em função da taxa de resfriamento da temperatura. A taxa de resfri-amento afeta o tempo necessário para a cristalização e a distribuição final dotamanho. Uma taxa de resfriamento lenta supersatura a solução lentamentee a nucleação e o crescimento dos cristais desaceleram. Um resfriamentorápido induz alta supersaturação, e se formam muitos cristais pequenos.
Uma declínio de temperatura linear de 22°C até 2°C durante vá-rios períodos de tempo foi investigado. Os resultados das distribuições doscristais no equilíbrio durante períodos de resfriamento de 1, 4, 8 e 24 horasestão ilustrados na Figura 1 e indicados na Tabela 2.Tabela 2
<table>table see original document page 59</column></row><table>
Uma taxa de resfriamento de 4 horas proporcionou resultadosaceitáveis.
Efeito da Agitação sobre o Tamanho dos Cristais
Aproximadamente 0,4 L do tampão de eluição SP foi cristalizadoem três velocidades de agitação. Os estudos com três velocidades foram omínimo necessário para colocar em suspensão a maioria dos cristais (100rpm), a velocidade máxima de agitação antes de arrastes de bolhas de ar(250 rmp), e uma velocidade de agitação no meio (175 rpm). Descobriu-seque a cristalização era mais rápida com a velocidade de agitação mais alta(250 rpm). A distribuição dos tamanhos dos cristais era muito similar nosexperimento operados a 175 rpm e 250 rpm, e não houve diferença percep-tível nas imagens microscópicas. 100 rpm não proporcionaram agitação sufi-ciente para colocar completamente em suspensão todas as partículas. Alémdisso, alguma agregação dos cristais foi observada. Em todos os casos, ahélice ficou perto da superfície do ar, e foi fácil arrastar ar para dentro. Emaplicações em grande escala, esta geometria poderia mudar, e velocidadesde agitação mais altas podem ser usadas sem danificar a proteína pela ex-posição à interface ar/líquido.
Estudos com Anti-solventes
Os anti-solventes usados no processo de cristalização melhorama eficiência da cristalização por baixar a solubilidade da proteína. Comoqualquer proteína remanescente na solução é perdida durante a filtração, éimportante levar a solubilidade para um valor tão baixo quanto possível du-rante a reação de cristalização.
Os anti-solventes foram triados enchendo seringas de 5 mL comcristais de Apo2L/TRAIL ou pool de eluição SP, e depois adicionando umaquantidade apropriado do anti-solvente. As amostras foram agitadas lenta-mente durante um período de duas semanas à temperatura ambiente e a 2-8°C. Amostras de 1 mL foram então passadas através de um filtro de 0,22μηι para remover todos os cristais da proteína e depois operadas em umaHPLC IEX para determinar a concentração de Apo2L/TRAIL na solução.
Polietilenoglicol (PEG) com pesos moleculares de 400, 3.350 e10.000 Da (PEG 440, PEG 3350 e PEG 10000, respectivamente) foi testadocomo anti-solvente. Os cristais de Apo2LVTRAIL foram dissolvidos no tam-pão de eluição SP (NaCI 200 mM. HEPES 50 mM, 0,05% de Triton X-100,DTT 1 mM, pH 7,5) e adicionou-se o PEG. As misturas foram agitadas por 5dias em uma temperatura de 2-8°C. Os resultados ilustrados na Figura 5indicam que PEG 3350 e PEG 10000 são melhores do que PEG 400, e qua-se idênticos em termos de melhora do rendimento. A adição de 5% de PEG3350 melhorou o rendimento teórico de cerca de 85% para cerca de 96% emrelação à cristalização sem a adição de PEG ou qualquer outro anti-solvente.
A seguir, o efeito de etanol e álcool isopropílico sobre a solubili-dade de Apo2L/TRAIL foi examinado. Ambos demonstraram proporcionaraumentos significativos do rendimento com concentrações entre 5% e 10%.A solubilidade de Apo2L/TRAIL no equilíbrio ao usar esses solventes foi a-proximadamente equivalente àquela com PEG.
Outros anti-solventes orgânicos usados comumente, a saber, 2-metil-2,4-pentanodiol (MPD), etilenoglicol, e dioxano, também foram testa-dos, mas proporcionaram pouco ou nenhum benefício em termos de reduçãoda solubilidade de Apo2L/TRAIL.
Baseado nestes estudos, determinou-se que bons resultados decristalização e rendimentos podem ser atingidos resfriando o pool de eluiçãoSP com um declínio linear da temperatura entre 22°C e 4°C, usando um pe-ríodo de resfriamento de 4 horas, e PEG 3350 como anti-solvente.Exemplo 5
Processo de Purificação em Duas Colunas Usando Anti-solvente na Etapade Cristalização
Apo2L/TRAIL foi purificada essencialmente como descrito noExemplo 3, mas adicionando 5% de PEG 3350 durante a cristalização.Depois da cristalização, o material foi dividido em 6 coleções (pools). Trêspools foram operados em uma coluna de CM-Sepharose, e 3 pools foramoperados em uma coluna de Phenyl-Sepharose. Os resultados de rendimen-to e pureza estão indicados na Tabela 4 abaixo.
Tabela 4
<table>table see original document page 61</column></row><table>
A presente invenção não está limitada em escopo pelas modali-dades específicas aqui descritas. Na realidade, várias modificações da in-venção além daquelas aqui descritas ficarão evidentes para os versadosnessas técnicas a partir da descrição precedente e das figuras que a acom-panham. Pretende-se que tais modificações caiam dentro do escopo dasreivindicações apensadas.Listagem de Seqüência
<110> GENENTECH, INC.FLORES, HEATHERLINt TANYA P.MArrHEWS1 TIMOTHY C.PAI, ROGERSHAHROKH, ZAHRA
<120> Formulações do Ligante AP0-2/TRAIL
<130> 39766-0174P2 PCT
<140;· ?CT/US2 006/018137<141> 2006-05-10
<150> US 11/136,842<151> 2005-05-24
<160> 2
<170> FastSEQ para Windows versão 4.0
<210> l<211> 281<212> ?RT<213> Homo Sapiens
<400> 1
Met Ala Met Met Glu vai Gln Gly Gly Pro ser Leu Gly Gln Thr Cys
1 5 10 15
vai Leu lie vai Ile Phe Thr vai Leu Leu Gln Ser Leu Cys vai Ala
20 25 30
vai Thr Tyr vai Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys
35 40 45
Tyr Ser Lys ser Gly lie Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr
50 55 60
Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn ser Pro Cys Trp Gln Val65 70 75 80
Lys Trp Gln Leu Aro Gln Leu Val Arq Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser
85 90 95
Glu Glu Thr Ile Ser Thr vai Gln Glu Lys Gln Gln Asn lie Ser Pro
100 105 110
Leu vai Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg vai Ala Ala His Ile Thr Gly
115 120 12 5
Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser pro Asn ser Lys Asn Glu
130 135 140
Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly145 150 155 160
His Ser Phe Leu ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu vai Ile
165 170 175
His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr lie Iyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe
180 185 190
Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln
195 200 205
Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys
210 215 220
ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp ser Lys aso Ala Glj Tyr Gly Leu Tyr225 230 235 240
Ser Ile Tvr Gln Glv Gly Tle Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile
245 250 255
Phe vai ser vai Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His GIj Ala260 265 270
Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu vai Gly275 280
<210> 2<211> 1042<212> DNA<213> Homo Sapiens
<220>
<221> característica misc<222? 447<223> η = TouG
<400> 2
tttcctcact gactataaaa gaatagagaa ggaagggctt cagtgaccgg ctgcctggct 60
gacttacagc agtcagactc tgacaggatc atggctatga tggaggtcca ggggggaccc 120
agcctgggac agacctgcgt gctgatcgtg atcttcacag tgctcctgca gtctctctgt 180
gtggctgtaa cttacgtgta ctttaccãac gagctgaagc agatgcagga caagtactcc 240
aaaagtggca ttgcttgttt cttaaaagaa gatgacagtt attgggaccc caatgacgaa 300
gagagtatga acagcccctg ctggcaagtc aagtggcaac tccgtcagct cgttagaaag 360
atgattttga gaacctctga ggaaaccatt tctacagttc aagaaaàgca acaaaatatt 420
tctcccctag tgagagaaag aggtccncag agagtagcag ctcacataac tgggaccaga 480
ggaagaagca acacattgtc ttctccaaac tccaagaatg aaaaggctct gggccgcaaa 540
ataaactcct gggaatcatc aaggagtggg cattcattcc tgagcaactt gcacttgagg 600
aatggtgaac tggtcatcca tgaaaãaggg ttttactaca tctattccca aacatacttt 660
cgatttcagg aggaaataaa agaaaacaca aagaacgaca aacaaatggt ccaatatatt 720
racaaataca caagttatcc tgaccctata ttgttgatga aaagtgctag aaatagttgt 780
tggtctaaag atgcagaata tggactctat tccatctatc aagggggaat atttgagctt 840
aaggaaaatg acagaatttt tgtttctgta acaaatgagc acttgataga catggaccat 900
gaagccagtt ttttcggggc ctttttagtt ggctaactga cctggaaaga aaaagcaata 960
acctcaaagt gactattcag ttttcaggat gatacactat gaagatgttt caaaaaatct 1020gaccaaaaca aacaaacaga aa 1042

Claims (30)

1. Método para recuperar Apo2L/TRAIL a partir de uma mistura,compreendendo(a) carregar a mistura em uma coluna de troca catiônica;(b) lavar a coluna de troca catiônica com um tampão equilibra-dor, com o que os componentes não-ligados presentes na mistura são re-movidos;(c) eluir Apo2L/TRAIL ligada à coluna de troca catiônica com umtampão de eluição;(d) gradualmente, resfriar o eluído até uma temperatura de cercade 2 a 4°C, como o que a Apo2LVTRAIL é precipitada espontaneamente emuma forma cristalina, para produzir uma mistura de licor-mãe e cristais deApo2L/TRAIL, e(e) recuperar Apo2L/TRAIL a partir da mistura obtida na etapa(d) com uma pureza de pelo menos cerca de 99%.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a misturacarregada na coluna de troca catiônica é um meio de cultura ou Iisado celu-lar de células produtoras de Apo2L7TRAIL.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, em que a dita mis-tura é o Iisado celular de células hospedeiras de E. coli produtoras deApo2L/TRAIL.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, em que o dito Iisadoé clarificado antes de carregar na coluna de troca catiônica.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o eluídoobtido na etapa (c) é submetido à etapa de cristalização (d) sem purificaçãoadicional.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a coluna detroca catiônica é uma coluna de SP-Sepharose.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que o pH damistura carregada na dita coluna é 7,5 ou é ajustado para cerca de 7,5.
8. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que a eluiçãode Apo2L/TRAIL é realizada em um tampão de eluição que compreendeNaCI 100-200 mM ou Na2SO4 em um tampão, ajustando o pH para 7,5-7,8.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que, na etapa(d), o eluído é resfriado de uma temperatura de cerca de 15 a 30°C até umatemperatura de cerca de 2 a 8°C em cerca de uma a 60 horas.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, em que, na etapa(d), o eluído é resfriado até uma temperatura de cerca de 2 a 8°C em cercade uma a 8 horas.
11. Método, de acordo com a reivindicação 9, em que, na etapa(d), o eluído é resfriado até uma temperatura de cerca de 2 a 8°C em cercade uma hora.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que, na etapa(d), o eluído é resfriado até uma temperatura de cerca de 4°C em cerca deuma hora.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o pH doeluído é 7,0-8,0 ou é ajustado para 7,0-8,0 antes da cristalização.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, em que o pH doeluído é 7,3 ou é ajustado para 7,3 antes da cristalização.
15. Método, de acordo com a reivindicação 13, em que o pH doeluído é 7,5-8,0 ou é ajustado para 7,5-8,0 antes da cristalização.
16. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que, na etapa(d), a temperatura de cerca de 2 a 4°C é mantida até que a solubilização emequilíbrio seja atingida ou quase atingida.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, em que, na etapa(d), a solubilidade de Apo2L/TRAIL é diminuída pela adição de um anti-solvente.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, em que o ditoanti-solvente é selecionado no grupo que consiste em um polietilenoglicol(PEG), MPD, etanol, isopropanol, e dioxano.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, em que o pesomolecular do PEG é entre cerca de 400 e cerca de 10.000 dáltons.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, em que o pesomolecular do PEG é 400, 3.350 ou 10.000 dáltons.
21. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que, na etapa(e), Apo2L/TRAIL é recuperada na forma de cristais separados do licor-mãepor filtração ou centrifugação ou uma combinação delas.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, em que o pH dolicor-mãe é ajustado para cerca de 8,0 antes da filtração, para diminuir a so-lubilidade.
23. Método, de acordo com a reivindicação 1, compreendendoainda as etapas de dissolver os cristais de Apo2L/TRAIL obtidos na etapa (d)e submeter a solução obtida a uma segunda etapa de purificação cromato-gráfica.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, em que a ditasegunda etapa de purificação cromatográfica é um cromatografia de intera-ção hidrofóbica.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, em que a croma-tografia de interação hidrofóbica é realizada em uma coluna de Fenil-Sepharose.
26. Método, de acordo com a reivindicação 23, em que a ditasegunda etapa de purificação cromatográfica é uma cromatografia de trocacatiônica.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, em que a ditacromatografia de troca catiônica é realizada em uma coluna de de CM-Sepharose o SP-Sepharose.
28. Método, de acordo com a reivindicação 23, em queApo2L/TRAIL é recuperada e formulada depois da dita segunda etapa depurificação cromatográfica por ultrafiltração/diafiltração.
29. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a dita pu-reza é de pelo menos cerca de 99,5%.
30. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a dita pu-reza é de pelo menos cerca de 99,9%.
BRPI0611368-0A 2005-05-24 2006-05-10 formulacões do ligante apo-2/trail BRPI0611368A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/136,842 US7741285B2 (en) 2001-11-13 2005-05-24 APO-2 ligand/trail formulations
US11/136,842 2005-05-24
PCT/US2006/018137 WO2006127284A2 (en) 2005-05-24 2006-05-10 Method of purifying apo-2 ligand/trail using crystallisation in the cold

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BRPI0611368A2 true BRPI0611368A2 (pt) 2010-08-31

Family

ID=37150024

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0611368-0A BRPI0611368A2 (pt) 2005-05-24 2006-05-10 formulacões do ligante apo-2/trail

Country Status (16)

Country Link
US (2) US7741285B2 (pt)
EP (1) EP1888624B1 (pt)
JP (2) JP2008542269A (pt)
KR (1) KR101283802B1 (pt)
CN (1) CN101228183B (pt)
AT (1) ATE513850T1 (pt)
AU (1) AU2006249494B2 (pt)
BR (1) BRPI0611368A2 (pt)
CA (1) CA2609188C (pt)
ES (1) ES2368445T3 (pt)
IL (1) IL187396A (pt)
MX (1) MX2007014728A (pt)
NZ (1) NZ563518A (pt)
RU (1) RU2435781C2 (pt)
WO (1) WO2006127284A2 (pt)
ZA (1) ZA200710325B (pt)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60237841D1 (de) * 2001-11-13 2010-11-11 Genentech Inc Zusammensetzungen basierend auf APO2-Ligand/ TRAIL und ihre Verwendung
SG181496A1 (en) 2009-12-18 2012-07-30 Csl Ltd Method of purifying polypeptides
MX2021001096A (es) 2015-01-30 2023-01-17 Oncoceutics Inc 7-bencil-4-(2-metilbencilo)-2,4,6,7,8,9-hexahidroimidazo [1,2-a]pirido[3,4-e]pirimidin-5(1h)-ona, analogos y sales del mismo y su uso en terapia.
JP6699085B2 (ja) * 2015-03-25 2020-05-27 東ソー株式会社 Ｆｃ結合性タンパク質の精製方法

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0417563B1 (de) * 1989-09-12 2000-07-05 F. Hoffmann-La Roche Ag TNF-bindende Proteine
US6284236B1 (en) * 1995-06-29 2001-09-04 Immunex Corporation Cytokine that induces apoptosis
EP1666591B1 (en) * 1995-06-29 2011-03-23 Immunex Corporation Cytokine that induces apoptosis
US6030945A (en) * 1996-01-09 2000-02-29 Genentech, Inc. Apo-2 ligand
TW518219B (en) * 1996-04-26 2003-01-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Erythropoietin solution preparation
CA2665133A1 (en) 1996-10-25 1998-05-07 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine .alpha.
ES2144386T5 (es) 1996-12-23 2012-12-07 Immunex Corporation Ligando para el activador del receptor de NF-kappa b, el ligando es miembro de la superfamilia de TNF
AU6250098A (en) 1997-01-28 1998-08-18 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 4 (dr4: death receptor 4), member of the tnf-receptor superfamily and binding to trail (ap02-l)
US6072047A (en) 1997-02-13 2000-06-06 Immunex Corporation Receptor that binds trail
US20010010924A1 (en) 1997-03-14 2001-08-02 Keith Charles Deen Tumor necrosis factor related receptor, tr6 polynecleotides
NZ508381A (en) 1997-03-17 2002-09-27 Human Genome Sciences Inc Antibodies, antagonists and agonists of the death domain containing receptor 5 (DR5)
WO1998046643A1 (en) 1997-04-16 1998-10-22 Millennium Biotherapeutics, Inc. TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTOR RELATED PROTEINS TANGO-63d AND TANGO-63e
ATE363533T1 (de) 1997-04-16 2007-06-15 Amgen Inc Osteoprotegerin bindende proteine und rezeptoren
JP2001511653A (ja) 1997-05-15 2001-08-14 ジェネンテク，インコーポレイテッド Ａｐｏ−２レセプター
AU8400398A (en) 1997-07-11 1999-02-08 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Nucleic acid encoding a novel chemotherapy-induced protein, and methods of use
AU8784498A (en) 1997-08-15 1999-03-08 Idun Pharmaceuticals, Inc. Trail receptors, nucleic acids encoding the same, and methods of use thereof
WO1999011791A2 (en) 1997-09-05 1999-03-11 University Of Washington Tumor necrosis factor family receptors and ligands, encoding nucleic acids and related binding agents
US6541606B2 (en) * 1997-12-31 2003-04-01 Altus Biologics Inc. Stabilized protein crystals formulations containing them and methods of making them
WO1999036535A1 (en) 1998-01-15 1999-07-22 Genentech, Inc. Apo-2 ligand
DE69938923D1 (de) 1998-03-27 2008-07-31 Genentech Inc Synergie zwischen apo-2 ligand und antikörper gegen her-2
ATE330972T1 (de) 1999-06-09 2006-07-15 Genentech Inc Apo-2l rezeptor-agonist und cpt-11 synergie- effekt
JP5118796B2 (ja) * 1999-06-28 2013-01-16 ジェネンテック， インコーポレイテッド 二価の金属イオンを利用したＡｐｏ−２リガンドの製造方法
ATE415978T1 (de) 2000-07-27 2008-12-15 Genentech Inc Sequentielle verabreichung von cpt-11 und apo-2l polypeptid
DE60237841D1 (de) * 2001-11-13 2010-11-11 Genentech Inc Zusammensetzungen basierend auf APO2-Ligand/ TRAIL und ihre Verwendung
US7229617B2 (en) * 2002-11-27 2007-06-12 Irm Llc Methods and compositions for inducing apoptosis in cancer cells
CN1473843A (zh) * 2003-07-24 2004-02-11 华东理工大学 重组 trail 包含体蛋白的工业化提取、复性和纯化方法

Also Published As

Publication number Publication date
ES2368445T3 (es) 2011-11-17
HK1113382A1 (en) 2008-10-03
NZ563518A (en) 2009-12-24
CN101228183B (zh) 2012-06-06
WO2006127284A3 (en) 2007-03-15
RU2435781C2 (ru) 2011-12-10
AU2006249494A1 (en) 2006-11-30
KR101283802B1 (ko) 2013-07-08
CN101228183A (zh) 2008-07-23
KR20080040637A (ko) 2008-05-08
CA2609188C (en) 2014-05-27
US20110054153A1 (en) 2011-03-03
EP1888624A2 (en) 2008-02-20
AU2006249494B2 (en) 2011-09-15
US7741285B2 (en) 2010-06-22
ZA200710325B (en) 2009-08-26
US20060009387A1 (en) 2006-01-12
IL187396A (en) 2012-08-30
MX2007014728A (es) 2008-02-15
JP2008542269A (ja) 2008-11-27
IL187396A0 (en) 2008-02-09
ATE513850T1 (de) 2011-07-15
CA2609188A1 (en) 2006-11-30
RU2007148007A (ru) 2009-06-27
JP2013060471A (ja) 2013-04-04
WO2006127284A2 (en) 2006-11-30
EP1888624B1 (en) 2011-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8470969B2 (en) Apo-2 ligand/trail formulations
US20090137476A1 (en) Apo-2 ligand variants and uses thereof
JP2013060471A (ja) 低温での結晶化を使用して、Ａｐｏ２リガンド／ＴＲＡＩＬを精製するための方法
AU2010201713B2 (en) APO2 ligand/trail formulations
US7842668B1 (en) Apo-2 ligand/trail formulations
HK1113382B (en) Method of purifying apo-2 ligand/trail using crystallisation in the cold
AU2002346376A1 (en) Apo2 ligand/trail formulations

Legal Events

Date Code Title Description
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]

Free format text: NOTIFICACAO DE ANUENCIA RELACIONADA COM O ART 229 DA LPI

B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09B Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette]
B09B Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette]

Free format text: MANTIDO O INDEFERIMENTO UMA VEZ QUE NAO FOI APRESENTADO RECURSO DENTRO DO PRAZO LEGAL