BRPI0607844B1

BRPI0607844B1 - uso do egf e ghrp-6

Info

Publication number: BRPI0607844B1
Application number: BRPI0607844A
Authority: BR
Inventors: Cibrian Vera Danay; Garcia Del Barco Herrera Diana; Penton Arias Eduardo; De Los Milagros Freyre Almeida Freya; Enrique Guillén Nieto Gerardo; Amador Berlanga Acosta Jorge
Original assignee: Ct Ingenieria Genetica Biotecnologia
Priority date: 2005-03-02
Filing date: 2006-02-24
Publication date: 2018-08-28
Also published as: JP2008531607A; ES2327562T3; ATE431743T1; CU23529A1; DE602006006903D1; AU2006220154A1; CA2600628C; KR20070107790A; RU2007136280A; RU2403913C2; EP1870106B1; ZA200707020B; CN101180044B; BRPI0607844A2; AU2006220154B2; CA2600628A1; US20100093616A1; MY142494A; CN101180044A; WO2006092106A2

Abstract

uso do egf e ghrp-6. a presente invenção é dirigida a estimular a neuroregeneração do sistema nervoso central em função do dano autoimune. mm particular a combinação farmacêutica que compreende concentrações terapeuticamente efetivas do fator de crescimento epidérmico e do hexapeptídio secretagogo do hormônio de crescimento humano é administrada em um sujeito que sofre dos sintomas de esclerose múltipla e neuromielite óptica e corrige a desmielização causada por células autoreativas no sistema nervoso central.

Description

(54) Título: USO DO EGF E GHRP-6 (51) Int.CI.: A61K 38/18; A61K 38/08; A61K 38/25; A61P 25/28 (30) Prioridade Unionista: 02/03/2005 CU 2005-0043 (73) Titular(es): CENTRO DE INGENIERÍA GENÉTICA Y BIOTECNOLOGIA (72) Inventor(es): DIANA GARCIA DEL BARCO HERRERA; GERARDO ENRIQUE GUILLÉN NIETO; JORGE AMADOR BERLANGA ACOSTA; DANAY CIBRIAN VERA; EDUARDO PENTON ARIAS; FREYA DE LOS MILAGROS FREYRE ALMEIDA (85) Data do Início da Fase Nacional: 31/08/2007

“USO DO EGF E GHRP-6”

Campo da técnica.

A presente invenção se relaciona com a medicina e mais especificamente com a neurologia e é dirigida a estimular a neuroregeneração do sistema nervoso central devido ao dano autoimune, particularmente a tratar e prevenir as recaídas em pacientes com Esclerose Múltipla e Neuromielite Óptica administrando composições que contêm Fator de Crescimento Epidérmico e um Hexapeptídio Secretagogo do Hormônio de Crescimento Humano.

Estado da técnica Anterior

A Esclerose Múltipla (EM) e a Neuromielite Óptica (NO) são doenças autoimunes e desmielinizantes que afetam adultos jovens, fundamentalmente do sexo feminino, produzindo incapacidade e invalidez que progridem no tempo. A incidência da mesma corresponde com parâmetros avançados de industrialização-desenvolvimento em países de primeiro mundo.

O sistema nervoso central (SNC) é um lugar imunologicamente privilegiado no qual é pouco freqüente a ocorrência de reações de natureza autoimune. Isto ocorre quando por determinadas causas, falham mecanismos regulatórios celulares e/ou humorais, o qual determina que as células autoreativas contra antígenos da mielina, geradas em periferia (se for um fato frequente), em sua condição de linfócitos ativados, atravessem a barreira hematoencefálica (BHE) e encontrem seus alvos no parênquima do SNC. A seguir sucedem uma série de eventos em cascata, os quais produzem desmielinização, astrócitose reativa, e morte celular de neurônios e oligodendrócitos.

A reação autoimune no parênquima do SNC está dirigida contra os antígenos da mielina, porque o dano se circunscreve às bainhas de mielina que recobrem os axônios dos neurônios principais, ao oligodendrócito cuja função é a de produzir a mielina e a outro grupo de neurônios que são afetam de maneira inespecífica pelo alcance da resposta autoimune.

A desmielinização e a morte neuronal por necrose e/ou apoptose resultantes produzem perda de funções motoras e/ou sensitivas que afetam de maneira aleatória determinadas zonas do corpo humano.

O processo de remielinização em EM e NO é geralmente limitado e transitório. O processo de remielinização ainda que possível, depende do equilíbrio que se estabelece entre os astrócitos autorreativos e os oligodendrócitos (John G. R., Shankar S. L., Shafit-Zagardo B., Massimi A.,

Lee S.C., Raine CS. et al. (2002) Multiple sclerosis: re-expression of a developmental pathway that restricts oligodendrocyte maturation Nature Medicine 8(10): 1115-1121).

Entre as estratégias de regeneração neuraí, o tratamento com fatores de crescimento como o Fator de Crescimento Epidérmico (em inglês “Epidermal Growth Fator” abreviado EGF) e o fator de crescimento de fibroblastos bovino (em inglês “basic Fibroblast Growth Fator”, abreviado bFGF) foram propostas muito promissoras ao demonstrar que estirpes celulares indiferenciada mas multipotentes, isoladas da crosta cerebral respondem a ditos fatores de crescimento diferenciando-se para diferentes tipos celulares como astrócitos I e II, oligodendrócitos mielinizantes e diferentes tipos de neurônios (Mehler M. F., Gokhan S. (1999) Postnatal cerebral cortical multipotent progenitors: regulatory mechanisms and potential role in the development of novato neural regenerative strategies. Brain Pathol; 9(3):515-526).

O Hexapeptídio Secretagogo do Hormônio de Crescimento

Humano (em inglês “Growth Hormone Releasing Peptide-6” abreviado GHRP-6) incrementa a expressão do fator de crescimento similar à insulina 1 (em inglês “Insulin-like Growth factor 1”, abreviado IGF-1) no SNC (Frago L.M., Paneda C, Dickson S.L, Hewson A.K., Argente J., Chowen J.A. (2002)

Growth hormone (GH) and GH-releasing peptide-6 increase brain insulin-like growth factor-1 expression and activate intracellular signaling pathways involved in neuroprotection. Endocrinology 143(10):4113-4122). O IGF-1 intervém em determinados processos como é incrementar os eventos relacionados com maturação dos oligodendrócitos (Wilson H. C, Onischke C, Raine CS. (2003) Human oligodendrocyte precursor cells in vitro: phenotypic analysis and differential response to growth factors. Glia 44(2):153-165), bloquear as vias de apoptose dependentes do Fator de necrose tumoral (em inglês “Tumor Necrose Fator”, abreviado TNF-α) pelo qual protege do dano que induz o TNF-α em EM e NO (Ye P, D’Ercole A.J. (1999) Insulin-like growth factor I protects oligodendrocytes from tumor necrosis factor-alphainduced injury. Endocrinology 140(7):3063-3072), e além disso reduz a expressão da molécula de classe I do complexo principal de histocompatibilidade (em inglês “Major Histocompatibility complex-1”, abreviado MHC-I) (Ito T, Ito N, Bettermann A, Tokura E, Takigawa M, Paus R. (2004) Collapse and restoration of MHC class-I-dependent immune privilege: exploiting the human hair follicle as a model. Am. J Pathol 164(2):623- 634). Em modelo experimental de encefalite autoimune o IGF-1 reduz a lesão do endotélio vascular da BHE, o número e o tamanho das placas de escleroses, lesão patognomônica de Esclerose Múltipla (Li W, Quigley L, Yao D.L, Hudson LD, Brenner Ml Zhang B. J et al. (1998) Chronic relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis: effects of insulin-like growth factor-1 treatment on clinicai deficits, lesion severity, glial responses, and blood brain barrier defects. J Neuropathol Exp Neurol 57(5):426-438).

De maneira sistêmica o GHRP-6 incrementa os níveis endógenos do hormônio adrenocorticotropina (ACTH) (Martins M. R, Pinto A.C, Brunner E, Silva M.R^ Lengyel A.m. (2003) GH-releasing. pepti.de (GHRP-ó)-induced ACTH release in patients with addison’s disease: effect of glucocorticoid withdrawal. J Endocrinol Invest 26(2):143-147). A ACTH

como fator liberador de esteróides endógenos, têm um efeito benéfico em contrarrestar as desordens autorreativas e por muito tempo foi a terapia tradicional para EM (Oishi C, Sakuta M. (2003) Steroid therapy for multiple sclerosis. Nippon Rinsho 61(8):1361-1366).

O EGF é sintetizado localmente no SNC por microglias, macrófagos derivados de sangue e também por alguns neurônios, além disso chega através da corrente sanguínea por ser permeável à BHE e às membranas que recobrem os ventrículos. De modo que esta molécula tem uma série de funções fisiológicas como influir sobre o desenvolvimento do SNC, diferenciação e manutenção das células do parênquima nervoso, ações estas muito relacionadas com os processos de regeneração neural e os mecanismos de sobrevivência que segue a uma variedade de insultos (Plata-Salaman CR. (1991) Epidermal growth factor and the nervous system. Peptides 12(3):653663).

O EGF estimula proliferação e sobrevivência celular no SNC (Thome R. G, Hrabetova S, Nicholson C. (2004) Diffusion of Epidermal Growth factor in Rat Brain Extracellular Space Measured by Integrative Optical Imaging. J Neurophysiol 92(6):3471-3481). Os oligodendrócitos estimulados com EGF ganham quanto a potencial remielinizante. O EGF contribui aos processos de proliferação dos oligodendrócitos, facilitando o começo da divisão celular e a posterior diferenciação em célula especializadas como oligodendrócitos maduros, astrócitos e células de Schwann.

O EGF promove eventos de nova geração de neurônios ou neurogênese (Crang AJ. , Gilson J. M., Li W.W., Blakemore W.F. (2004) The remyelinating potential and in vitro differentiation of MOG-expressing oligodendrocyte precursors isolated from the adult rat CNS. Eur J Neurosci 20(6): 1445-1460; Raineteau Ou., Rietschin L., Gradwohl G., Guillemot F., Gahwiler Β. H. (2004) Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Mol Cell Neurosci 26(2):241-250). Estes eventos são mais evidentes depois que os

oligodendrócitos tiverem experimentado algum dano ou lesão, sugerindo que os efeitos do EGF sobre os processos de regeneração são consequências das interações entre o EGF e um sistema de transducção de sinais, que se ativa especificamente nos oligodendrócitos lesados, sugerem além disso que a modulação deste sistema de transducção de sinais pudesse prover mecanismos que por sua vez promovam a remielinização (Wang K., Wang J. J1 Wang E., Tenho Q.H., Wang X., Wang X.M. (2004) Infusion of epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor into the striatum of parkinsonian rats leads to in vitro proliferation and differentiation of adult neural progenitor cells. Neurosci Lett 364(3): 154-158; Knapp Ρ. E., Adams M.H. (2004) Epidermal growth factor promotes oligodendrocyte process formation and regrowth after injury. Exp Cell Res 296(2):135-144).

Nos últimos anos se propôs a realização de intervenções terapêuticas complexas como Terapia Combinada ou Terapia de Sistema que longe de parecer redundantes conferem uma fortaleza e integridade à aproximação terapêutica, permitindo a abordagem de problemas fisiopatológicos complexos nos nódulos ou pontos chaves que decidem o curso da doença em questão. Uma terapia combinada entre vários fatores de crescimentos, ou a combinação de um destes com outras moléculas com tropismo positivo para o SNC não existe até o momento. Em todos os casos, uma terapia ideal reduziría os sintomas associados com o ataque inicial e reduziría ao mínimo a freqüência de repetições posteriores. Por tanto, daí o interesse em desenvolver um método, mais eficaz para ser usado no tratamento e a prevenção das recaídas em diferentes formas clínicas de z

Esclerose Múltipla e a Neuromielite Óptica.

A administração da combinação que compreende concentrações terapeuticamente efetivas do Fator de Crescimento Epidérmico e do Hexapeptídio Secretagogo do Hormônio de Crescimento Humano foi sugerida com anterioridade para a profilaxia e o tratamento do dano tissular

devido a falta de irrigação sanguínea arterial (No. de Solicitação Internacional WO 02/053167).

Explicação da Invenção

A presente invenção está baseada em um método em que a co5 administração de EGF e GHRP-6 representa um tratamento melhorado para desordens autoimunes do Sistema Nervoso Central. Esta combinação protege e reverte o dano ocasionado pela resposta autoimune em lesões crônicas do SNC, particularmente em Esclerose Múltipla e Neuromielite Óptica. Comparado à administração de um ou do outro princípio ativo sozinho, a combinação produz a eficácia mais duradoura e uma redução substancial das recaídas, isto é, produz eventos neuro-regenerativos, de uma maneira mais eficiente. Como é usado aqui, o termo “a eficácia mais duradoura” quer dizer do que os princípios ativos produzem o alívio de sintomas associados com EM e NO durante um período de tempo mais longo, inclusive confere proteção para evitar episódios de recaídas. Isto garantirá a restauração das funções neurológicas afetadas em conseqüência da desmielinização e da perda neuronal por eventos de apoptose/necrose derivados do dano autoimune. Por outra lado, os princípios ativos contidos na combinação farmacêutica são proteínas e peptídio de natureza autóloga, para os quais existem células T

Regulatórias naturais, que serão estimuladas a proliferar posterior à administração exógena destes peptídios e poderão contrarrestar a resposta autoimune, pois o papel destas células T regulatórias é o de mediar fenômenos de tolerância imunológica, de forma constitutiva (Jõm G., Benedikt B., Bruno K. (2004) Medullary epithelial cells of the human thymus express a highly di verse selection of tissue-specific genes colocalized in chromosomal clusters. J. Exp. Med. 199(2): 155-166; Diane M., Christophe B. (2004) Back to central tolerance. Immunity 20:509-516; Mark S.A., Emily

S.V., Ludger K., Zhibin C, Stuart P. B., et al. (2002) Projection of an immunological self shadow within the thymus by the ar protein. Science

298:1395-1400; Shimon S. (2004) Naturally arising CD4+ regulatory T cells for immunologic self-tolerance and negative control of immune responses. Animal Review of Immunology 22:531-562).

Em função do efeito sinérgico entre EGF e GHRP-6 com relação a eventos neuro-tróficos/ neuro-regenerativos, esta combinação é útil em acelerar os processos de neurogênese, o qual facilita a recuperação de funções nervosas motoras e sensoriais perdidas em conseqüência de dano ou lesão de natureza autoimune. A combinação dos produtos EGF/GHRP-6, os quais exercem uma marcada ação neuro-regeneradora e neuro-protetora pela estimulação de diferentes mecanismos que são desencadeados depois da administração de doses terapêuticas. A combinação poderá ser associada com qualquer terapia antioxidante.

A administração terapêutica da combinação orientada a neuroregeneração e/ou neuro-proteção requer de administrações repetidas. De acordo com descrito na presente invenção, o princípio ativo referido como EGF prove de qualquer espécie, incluindo bovino, ovino, suíno e humano, em sua seqüência nativa ou variantes desta e de qualquer fonte que seja natural, sintético ou recombinante. O preferido neste caso é o EGF de seqüência nativa humana e mas preferencialmente o EGF humano recombinante. O princípio ativo referido como o peptídio secretagogo do hormônio de Crescimento Humano é o hexapeptídio que tem a seguinte seqüência de aminoácidos: His-D-Trp-Asa-Trp-D-Phe-Lys- NH.sub.2 e obtido por síntese química.

Em uma realização particular as doses terapêuticas administradas durante as crises de EM e NO compreendem uma classe entre 5-200 pg/kg/dia para o EGF e entre 0.5- 350 pg/kg/dia para o peptídio GHRP6 por espaço de 20 até 30 dias.

Em outra realização da invenção as doses administradas nos estados intercrises, para prevenir as recaídas ou exacerbações em Esclerose

Múltipla, compreendem uma classe entre 0.5-50 pg/kg/dia para cada um dos componentes em um espaço de até 130 dias.

A combinação deverá ser administrada como “bolus. As vias de administração serão parenterais em veia superficial, intramuscular ou intraperitonal. Os veículos usados na administração incluem: solução salina normal, solução de Ringer lactato, plasma humano, solução de albumina humana, dextrose 5%, solução de gelatina, ou mistura de algumas delas.

Com o propósito de garantir a maior eficácia terapêutica em Esclerose Múltipla, nas formas clínicas exacerbação-remessão ou secundária progressiva, a primeira administração deverá realizar-se coincidindo com os pródromos da doença (personalizados). Nas fases de remessão se propõem esquemas terapêuticos sustentados com a dose anteriormente referida como preventivas das recaídas. Em outras formas clínicas de Esclerose Múltipla se propõem esquemas sustentados de tratamento mas com doses terapêuticas.

De acordo com a outra materialização da presente invenção, a combinação EGF/GHRP-6 induz proliferação de células T regulatórias naturais e adaptativas que protegem do desenvolvimento de formas clínicas severas de EAE em experimentos de transferência adotiva.

A combinação EGF/GHRP-6 pode ser empregada dentro de uma mesma composição farmacêutica ou misturada a partir dos componentes independentes no momento de ser usada. A combinação dos princípios ativos pode ser administrada usando aditamentos que garantam libertação lenta. Se a forma de apresentação da combinação é liofilizada, a mesma deverá ser ressuspensa imediatamente antes de usar.

Exposição detalhada de modos de realização/ Exemplos

Exemplo 1. Efeito terapêutico da combinação farmacêutica EGF/GHRP-6 em um biomodelo de Encefalite Autoimune Experimental (EAE).

Para avaliar o efeito terapêutico da combinação farmacêutica EGF/GHRP-6 testou-se em um biomodelo de Encefalite Autoimune

Experimental (EAE), o qual é o modelo animal da doença Esclerose Múltipla.

Ratas Lewis fêmeas, 130g de peso corporal médio, foram imunizadas por via subcutânea com 5mg de homogeneizado de medula espinhal de curiel em PBS (50%) e adjuvante completo de Freund (50%), nos dias 0 e 6. Dez dias posteriores à primeira imunização começou o esquema terapêutico com a combinação EGF/GHRP-6 (200pg/kg/dia-740pg/kg/dia), os princípios ativos independentes EGF (200pg/kg/dia) e GHRP-6 (740pg/kg/dia) e placebo (PBS). Este esquema terapêutico seguiu por espaço de 10 dias, usando a via de administração intraperitoneal. As medições da clínica da doença se fizeram baseando-se no seguinte índice clínico: 0; não alterações, 1; paralisia completa da fila, 2; paralisia de um dos membros inferiores, 3; paralisia completa do trem posterior, 4; paralisia completa do trem posterior e paralisia do trem anterior, 5; morte. A perda de peso e a incontinência vesical ou do esfmcter retal, que também são signos clínicos da doença no animal foram valorados adicionando 0.5 ao índice clínico mencionado anteriormente. Aos 40 dias posteriores à primeira imunização os animais foram anestesiados e sacrificados, o encéfalo e a medula espinhal de cada animal foi processado (fixação em 10% de formalina, tingimento com H & E e Luxol Blue) para a análise histopatológico. Os critérios histopatológicos considerados foram, o número e o tamanho de infiltrados inflamatórios perivasculares, lesões desmielinizantes, apoptose de neurônios ou células da glia e reatividade dos astrócitos. Todo o estudo microscópico foi realizado às cegas.

Como se mostra na Tabela 1, a combinação EGF/GHRP-6 protege os animais experimentalmente induzidos a desenvolver EAE, só 50% destes animais desenvolve a forma mais leve da doença, o resto não adoece. Não ocorre assim no resto dos grupos onde a incidência da doença é de 100% (grupos tratados com os princípios ativos independentes e placebo). O índice clínico medio do grupo tratado com a combinação EGF/GHRP-6 é de 0.37 ±

0.47, o dos grupos tratados com os princípios ativos independente é 1.37 ± 1.7 para o EGF e 1.5 ± 1.6 para o GHRP-6 e o do grupo tratado com o placebo é 1.7 ± 1.4. Usaram-se um total de 8 ratas por grupo. A comparação estatística entre os grupos foi p<0.001. Usou-se o “teste” de comparação múltipla de

Newman Keuls.

Tabela 1. Resumo Clínico do efeito terapêutico em ratas induzidas a desenvolver EAE.

Grupos	Incidência (%)	Dias de Começo (Média ± DP)	índice clinico
Média + DP	máximo	mínimo	Dias de Doença
Controle	0	0	0	0	0	0
EGF	100	12,5 + 0,57	1,37 ± 1.7	5	1	12,7 ±4,1
GHRP-6	100	13,7 + 2,3	1,5 ±1,6	4	0.5	15,5 ±6,7
EGF/GHRP-6	50	12 ±0	0,37 + 0.47	1	0	9 ±1,4
Placebo	100	12,2 ±0,5	1,7 ±1.4	4	0,5	13,2 ±8,1

Como se mostra na tabela 2, os resultados do estudo por anatomia patológica dos encéfalos e medulas dos animais dos diferentes 10 grupos demonstra que embora existindo a mesma situação em termos de astrócitos reativos, o número (p=0.028 T teste não pareado) e tamanho das infiltrados inflamatórias perivasculares é menor no grupo tratado terapeuticamente com a combinação farmacêutica do que no que recebe placebo.

Tabela 2. Infiltrados inflamatórios perivasculares em cérebro e medula dos animais

Grupos	N° de infiltrados inflamatórios perivasculares(Média ± DP)
Controle	0
EGF	4,5 ±1,9
GHRP-6	2,25 ± 1,25
EGF/GHRP-6	2 ±0,8
Placebo	5± 2.1

Este experimento demonstra que a combinação farmacêutica EGF/GHRP-6 protege os animais de desenvolver a doença em sua forma clínica mais severa. Os mecanismos que explicam este efeito protetor são o aumento na produção de mielina por oligodendrócitos e a conseqüente remielinização das terminações nervosas afetadas, outros mecanismos estão relacionados com a manutenção da integridade da Barreira Hematoencefálica (BHE) impedindo o passo de células autoreativas para o parênquima cerebral.

Exemplo 2. Efeito protetor da combinação farmacêutica EGF/GHRP-6 numa modalidade preventiva no biomodelo de Encefalite Autoimune Experimental (EAE)

Para avaliar o efeito protetor da combinação farmacêutica EGF/GHRP-6 em uma modalidade preventiva, testou-se no biomodelo de Encefalite Autoimune Experimental (EAE), modelo animal da doença Esclerose Múltipla.

Ratas Lewis fêmeas, 130g de peso corporal médio, foram tratadas com o esquema profilático do EGF/GHRP-6 dez dias antes da primeira imunização com homogenado de medula de curiel. A imunização foi praticada por via subcutânea com 5mg de homogenado de medula espinhal de curiel em PBS (50%) e adjuvante completo de Freund (50%), nos dias 0 e 6. Os grupos de tratamento profíláctico foram:

$

EGF/GHRP-6 (100qg/kg/dia-370pg/kg/dia).

EGF (100pg/kg/dia)

GHRP-6 (370pg/kg/dia) Placebo PBS.

O tratamento com o esquema profilático seguiu por um espaço de 10 dias (-10 até -1), usando a via de administração intraperitonal.

As medições da clínica forma feitas se baseando no seguinte índice clínico: 0; nenhuma alteração, 1; paralisia completa do rabo, 2; paralisia de um dos membros inferiores, 3; paralisia completa do trem posterior, 4; paralisia completa do trem posterior e paralisia do trem anterior, 5; morte. A perda de peso e a incontinência vesical ou do esfíncter retal, que também são signos clínicos da doença no animal foram valoradas adicionando 0.5 ao índice clínico mencionado anteriormente. Aos 40 dias posteriores à primeira imunização, os animais foram anestesiados e sacrificados. O encéfalo e a medula espinhal de cada foi processado (fixação em 10% de formalina, fingimento com Η & E e Luxol Blue) para a análise histopatológica. Os critérios histopatológicos considerados foram, número e o tamanho de infiltrados inflamatórios perivasculares, lesões desmielinizantes, apoptose de neurônios ou células da glia e reatividade dos astrócitos. Todo o estudo microscópico foi realizado a cega.

Como se mostra na Tabela 3, a combinação farmacêutica, EGF/GHRP-6 protege de maneira preventiva os animais experimentalmente induzidos a desenvolver EAE. 100% destes animais tratados com a combinação farmacêutica desenvolve a forma mais leve da doença (0.5-1 índice clínico). Não ocorre assim no resto dos grupos onde 75% dos animais tratados preventivamente com cada um dos princípios ativos independente desenvolve formas severas da doença (3-4 do índice clínico). O índice clínico médio do grupo tratado com a combinação farmacêutica EGF/GHRP-6 é 0.68 ± 0.25, o dos grupos tratados com os princípios ativos independente é 2.8 ± 0.99 para o grupo tratado com o EGF e 2.7 ± 1.03 para o grupo tratado com o

GHRP-6. O do grupo tratado com o placebo é 3 i 1.4. Usaram-se um total de 8 ratas por grupo. Para a comparação estatística entre os grupos usando o Ensaio ou “Teste” de Mann Whitney para a comparação entre o grupo tratado com a combinação farmacêutica e o placebo se obteve um valor de P^O.OOl 1, e os grupos tratados com os princípios ativos independentes obtiveram valores de P=0.0003 entre a comparação da combinação farmacêutica e GHRP-6 e combinação farmacêutica e EGF indistintamente.

Tabela 3. Resumo Clínico do efeito profilático em ratas induzidas a desenvolver EAE.

Grupos	Incidência (%)	Dias do Começo (Média ± DP)	índice clínico
Média ± DP	máximo	mínimo
Controlw	0	0	0	0	0
EGF	100	11,5 ±0,57	2,8 ± 0,99	4	1
GHRP-6	100	11,7 ±2,3	2,7 ±1,03	4	1
EGF/GHRP- 6	100	10 ± 0	0,68 ± 0,75	1	0,5
Placebo	100	12,2 ± 0,5	3 + 1,4	5	1

Como se mostra na tabela 4, os resultados do estudo por anatomia patológica dos encéfalos e medulas dos animais dos grupos demonstra que embora existindo a mesma situação em termos de astrócitos reativos, o número (p=0.025 T teste não pareado) e tamanho dos infiltrados inflamatórios perivasculares é menor no grupo tratado preventivamente com a combinação farmacêutica do que no que recebe placebo.

Tabela 4. Infiltrados inflamatórios perivasculares em cérebro e medula dos animais tratados de maneira preventiva.

Grupos	N° de infiltrados inflamatórios perivasculares(Média ± DP)
Controle	0
EGF	4+1,6
GHRP-6	2,7 ± 1,925
EGF/GHRP-6	1,5 ±1
Placebo	5± 2,1

Este experimento demonstra que a combinação farmacêutica EGF/GHRP-6 usada de modo preventivo protege os animais de desenvolver a doença em sua forma clínica mais severa, existindo uma correlação entre a clínica e os achados histopatológicos. Os mecanismos que explicam o efeito protetor estão relacionados com a indução à diferenciação de precursores neuronais em oligodendrócitos os quais estarão pré-condicionados e ativos para a produção de mielina. Também a manutenção da integridade da Barreira Hemato Encefálica a qual vai impedir o passo de células autoreativas para o parênquima cerebral, é outro dos eventos que explica o papel protetor da combinação farmacêutica usada de maneira preventiva.

Exemplo 3. Estudo de dose, sinergismo-potenciação entre os princípios ativos da combinação farmacêutica.

Na busca de uma classe de dose entre os princípios ativos da combinação farmacêutica, que resultasse eficiente aos efeitos terapêuticos, testou-se no biomodelo de EAE anteriormente referido.

Ratas Lewis fêmeas, 130g de peso corporal médio, foram imunizadas por via subcutânea com 5mg de homogenado de medula espinhal de curiel em PBS (50%) e adjuvante completo de Freund (50%), nos dias 0 e

6. Dez dias depois da primeira imunização começou o esquema terapêutico

com o EGF/GHRP-6 com diferentes doses. Este esquema terapêutico seguiu por espaço de 10 dias, usando a via de administração intraperitonal. As medições da clínica da doença foram feitas baseando-se no seguinte índice clínico: 0; nenhuma alteração, 1 ; paralisia completa do rabo, 2; paralisia de um dos membros inferiores, 3; paralisia completa do trem posterior, 4; paralisia completa do trem posterior e paralisia do trem anterior, 5; morte. A perda de importância e a incontinência vesical ou do esfíncter retal, que também são signos clínicos da doença no animal são valorados adicionando 0.5 ao índice clínico mencionado anteriormente. Aos 40 dias posteriores à primeira imunização, os animais foram anestesiados e sacrificados, o encéfalo e a medula espinhal de cada foi processado (fixação em 10% de formalina, fingimento com Η & E e Luxol Blue) para a análise histopatológica. Os critérios histopatológicos considerados foram, número e o tamanho de infiltrados inflamatórios perivasculares, lesões desmielinizantes, apoptose de neurônios ou células da glia e reatividade dos astrócitos. Todo o estudo microscópico foi realizado às cegas.

Os grupos de animais tratados com as diferentes doses da combinação farmacêutica foram:

EGF/GHRP-6 (400 pg/kg/dia-1480 pg/kg/dia).

EGF/GHRP-6 (200 pg/kg/dfa-740 pg/kg/dia).

EGF/GHRP-6 (100 pg/kg/dia-340 pg/kg/dia)

EGF/GHRP-6 (50 pg/kg/dia-170 pg/kg/dia)

EGF/GHRP-6 (25 pg/kg/dia-85 pg/kg/dia)

EGF/GHRP-6 (12 pg/kg/dia-40 pg/kg/dia)

No grupo tratado com a combinação farmacêutica

EGF/GHRP-6 com doses de (400 pg/kg/dia-1480 pg/kg/dia), 25% dos animais não adoeceram, 75% que adoeceu foi com formas clínicas mais leves da doença (0.5-1). O índice clínico médio deste grupo foi de 0.62 ± 0.44.

No grupo tratado com a combinação farmacêutica

EGF/GHRP-6 com doses de (200 pg/kg/dia-740 pg/kg/dia), 25% dos animais não adoeceram, 75% que adoeceu foi com as formas clínicas mais leves da doença (0.5-1). O índice clínico médio deste grupo foi de 0.5 ± 0.37.

No grupo tratado com a combinação farmacêutica 5 EGF/GHRP-6 com doses de (100 pg/kg/dia-340 pg/kg/dia), 12.5% dos animais não adoeceram, 87.5% que adoeceu foi com as formas clínicas mais leves da doença (0.5-1). O índice clínico médio deste grupo foi de 0.62 ±

0.35.

No grupo tratado com a combinação farmacêutica 10 EGF/GHRP-6 com doses de (50 pg/kg/dia-170 pg/kg/dia), 100% dos animais adoeceram, 12.5% com a forma intermediária da doença (2) e o resto com as formas clínicas mais leves da doença (0.5-1). O índice clínico médio deste grupo foi de 0.93 ± 0.49.

No grupo tratado com a combinação farmacêutica 15 EGF/GHRP-6 com doses de (25 pg/kg/dia-6 85 pg/kg/dia), 100% dos animais adoeceram, 37.5% com a forma intermediária da doença (2) e o restante com as formas clínicas leves da doença (0.5-1). O índice clínico médio deste grupo foi de 1.25 ± 0.65.

No grupo tratado com a combinação farmacêutica 20 EGF/GHRP-6 com doses de (12 pg/kg/dia-40 pg/kg/dia), 100% dos animais adoeceram, 12.5% com as formas severa da doença (3), 37.5% com a forma intermediária da doença (2) e o restante com as formas clínicas leves da doença (0.5-1). O índice clínico médio deste grupo foi de 1.37 + 0.87.

As tabelas 5 e 6 demonstram os resultados da clínica e do 25 estudo histopatológico. No caso deste último não se apreciam diferenças estatisticamente significativas quanto ao número de infiltrados linfocitários perivasculares aos grupos tratados com a combinação farmacêutica EGF/GHRP- 6 com doses de (400 pg/kg-1480 pg/kg, 200 pg/kg-740 pg/kg, 100 pg/kg-340 pg/kg, 50 pg/kg-170 pg/kg e 25 pig/kg-85 pg/kg). No caso do grupo tratado com a combinação farmacêutica EGF/GHRP-6 com doses de 12 pg/kg-40 pg/kg o número de infiltrados peri vasculares mostra uma tendência a ser superior (p=0.040), mas esta diferença não é estatisticamente significativa. Estes resultados demonstram que existe uma classe de dose entre 50-400 pg/kg/dia para o EGF e entre 170 pg/kg/dia-1.4 mg/kg/dia para o GHRP-6, com o qual se pode formular a combinação farmacêutica e esta ser útil na proteção contra a indução de EAE. Tudo mencionado anteriormente se resume na seguinte tabela.

Tabela 5. Resumo Clínico do estudo de dose, sinergismo e potenciação entre os princípios ativos da combinação farmacêutica.

Groups EGF/GHRP-6	Incidência (%)	índice clínico
Média ±DP	máximo	mínimo
EGF/GHRP-6(400gg/kg-1480pg/kg)	75	0,62 ± 0,44	0	1
EGF/GHRP-6 (200pg/kg- 740pg/kg)	75	0,5 ±0,37	0	1
EGF/GHRP-6 (100jng/kg- 340pg/kg)	87,5	0,65 ±0,35	0	1
EGF/GHRP-6 (50pg/kg-170pg/kg)	100	0,93 ± 0,49	0,5	2
EGF/GHRP-6 (25pg/kg-85pg/kg)	100	1,25 ±0,65	0,5	2
EGF/GHRP-6 (12pg/kg-40 μg/kg)	100	1,3 ±0,87	0,5	3

Tabela 6. Infiltrados inflamatórios peri vasculares em cérebro e medula dos animais tratados com a combinação farmacêutica com diferentes doses.

Grupos EGF/GHRP-6
N° de Infiltrados Inflamatórios 1 Perivasculares (Média ± DP)
EGF/GHRP-6 (400pg/kg-1480pg/kg)	2,7± 0,95
EGF/GHRP-6 (200gg/kg-740gg/kg)	2,7 ± 0,5
EGF/GHRP-6 (100pg/kg-340pg/kg)	2,2 ± 1,2
EGF/GHRP-6 (50pg/kg-170pg/kg)	3 ±1,4
EGF/GHRP-6 (25pg/kg-85pg/kg)	3,2 ± 0,95
EGF/GHRP-6 (12pg/kg-40 pg/kg)	4 ±0,8

Exemplo 4 Avaliação do efeito da combinação farmacêutica na geração de resposta de células T regulatórias naturais.

Vinte Ratas Lewis fêmeas, 130g de peso corporal médio, foram imunizadas por via subcutânea com 5mg de Homogenado de medula espinhal de curiel em PBS (50%) e adjuvante completo de Freund (50%), nos dias 0 e 6. Dez dias depois da primeira imunização e no espaço de 10 dias, começou-se o esquema terapêutico com o EGF/GHRP-6 (200pg/kg/dia740pg/kg/dia) em 10 das ratas imunizadas (grupo A). Ao restante das ratas foi fornecido PBS como placebo (grupo B). Uma semana depois da última dose terapêutica fornecida, os animais de ambos grupos foram anestesiados para extrair o máximo volume de sangue e purificar por gradiente de ficoll o anel de linfócitos. Os linfócitos provenientes dos animais dos grupos A e B foram submetidos respectivamente à separação da população celular CD4. A análise por FACS da subpopulação CD4+ CD25+ foi 14.67% para os CD4 do Grupo

A e 3,8% para o caso do grupo B.

Ratas Lewis fêmeas, 130g de peso corporal médio, foram

imunizadas por via subcutânea com 5mg de Homogenado de medula espinhal de curiel em PBS (50%) e adjuvante completo de Freund (50%), nos dias 0 e

6. Dez dias depois da primeira imunização um subgrupo (n=8) foi transferido com um total de 500 000 células CD4+ proveniente do grupo A e outro subgrupo (n=8) foi transferido com 500 000 células CD4+ proveniente do Grupo B. As medições da clínica da doença foram feitas baseando-se no seguinte índice clínico: 0; nenhuma alteração, 1 ; paralisia completa do rabo, 2; paralisia de um dos membros inferiores, 3; paralisia completa do trem posterior, 4; paralisia completa do trem posterior e paralisia do trem anterior,

5; morte. A perda de importância e a incontinência vesical ou do esfíncter retal, que também sao signos clínicos da doença no animal foram valorados adicionando 0.5 ao índice clínico mencionado anteriormente. Aos 40 dias depois da primeira imunização, os animais foram anestesiados e sacrificados, o encéfalo e a medula espinhal de cada foi processado (fixação em 10% de formalina, fingimento com Η & E e Luxol Blue) para a análise histopatológica. Os critérios histopatológicos considerados foram, o número e o tamanho de infiltrados inflamatórios perivasculares, lesões desmielinizantes, apoptose de neurônios ou células da glia e reatividade dos astrócitos. Todo o estudo microscópico foi realizado às cegas.

Como se mostra na Tabela 7, a transferência de células CD4+ dos animais induzidos a desenvolver EAE e tratados com a combinação farmacêutica protege os animais experimentalmente induzidos a desenvolver EAE. Só 50% destes animais que receberam por transferência adotiva as células CD4+ do grupo A desenvolve a formas mais leve da doença (0.5-1 índice clínico), o outro 50% não adoece. Pelo contrário, 100% dos animais que recebem por transferência adotiva as células CD4+ do grupo B, desenvolve a doença em suas formas clínicas severas um 62.5% (2-4 do índice clínico) e em formas clínicas leves (0.5-1 do índice clínico) o 37.5%. O índice clínico médio do grupo receptor das CD4+- grupo A foi 0.31 + 0.34, o do grupo receptor das CD4+-grupo B foi 2.1 ± 0.99. A comparação estatística de ambos grupos foi realizada pelo “teste” de Mann Whitney e se obteve um valor de P =0.0003.

Tabela 7. Efeito protetor da transferência adotiva.

Grupos	Incidência (%)	Dias de Começo (Média ± DP)	índice clínico
Média ± DP	máximo	mínimo
Grupo A	50	10 ±0	0,31 ±0,34	1	0
Grupo B	100	11,5 + 0,57	2,1 ±0,99	4	1

A análise histológica dos encéfalos e medulas dos animais dos grupos receptores de células CD4+-grupo A e células CD4+-grupo B, demonstra que embora existindo a mesma situação em termos de astrócitos reativos, o número (p=0.0001) e tamanho dos infiltrados inflamatórios perivasculares é significativamente menor nos receptores das células CD4+ grupo A. Como se vê na tabela 8.

Tabela 8. Infiltrados inflamatórios perivasculares em cérebro e medula dos animais posterior à transferência adotiva.

Grupos	N° de infiltrados Inflamtórios Perivasculares (Média ± DP)
Receptor CD4 grupo A	2,1 ±0,8
Receptor CD4 grupo B	6,5 ± 1,7

Estes resultados demonstram que o tratamento com a combinação farmacêutica é capaz de induzir a proliferação de células T regulatórias naturais e que estas protegem do desenvolvimento de formas clínicas severas de EAE em experimentos de transferência adotiva.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uso do EGF e GHRP-6 caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para tratar ou aliviar transtornos do sistema nervoso central em um paciente que sofre de sintomas ou complicações

5 associadas à desmielização, degeneração neuronal e morte celular por apoptose ou necrose de natureza autoimune.
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o EGF é humano.
3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo 10 fato de que o EGF humano é obtido de fonte natural, por via recombinante ou síntese química.
4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o transtorno do sistema nervoso central é:

15 a esclerose múltipla;

b. neuromielite óptica.
5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que combinação de EGF e o GHRP-6 é administrada de forma intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou por

20 aditamentos que garantam liberação lenta.
6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o medicamento é administrado parenteralmente de forma terapêutica no espaço de 20 até 30 dias, em uma classe de doses entre 5-10 pg de cada componente ativo por quilograma de

25 peso corporal do paciente por dia.
7. Uso de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o medicamento é administrado parenteralmente nos estágios intercrises no espaço de até 130 dias, em uma classe de doses de entre 1-5 pg de cada componente ativo por quilograma de /Λ peso corporal do paciente por dia.
8. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o medicamento induz à proliferação de células T regulatórias naturais e adaptativas.