JP5001180B2

JP5001180B2 - 自己免疫障害後の中枢神経系の神経再生に用いるｅｇｆ／ｇｈｒｐ−６の組合せ

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Publication number: JP5001180B2
Application number: JP2007557312A
Authority: JP
Inventors: デルバルコヘレラ、ディアナガルシア; ニエト、ヘラルド、エンリケギレン; アコスタ、ホルヘアマドルベルランガ; アルメイダ、フレヤ、デロスミラグロスフレイレ; ベラ、ダナイシブリアン; アリアス、エドゥアルドペントン
Original assignee: セントロデインジエニエリアジエネテイカイバイオテクノロジア
Priority date: 2005-03-02
Filing date: 2006-02-24
Publication date: 2012-08-15
Anticipated expiration: 2026-02-24
Also published as: MY142494A; KR20070107790A; CU23529A1; KR101255200B1; ZA200707020B; AU2006220154B2; CN101180044A; EP1870106B1; WO2006092106A2; CA2600628A1; CA2600628C; MX2007010717A; BRPI0607844B8; PT1870106E; ATE431743T1; DE602006006903D1; BRPI0607844A2; ES2327562T3; EP1870106A2; RU2007136280A

Description

（発明の分野）
本発明は、医薬、さらに特に神経学に関連する医薬に関する。さらに自己免疫障害後、特に多発性硬化症及び視神経脊髄炎被患患者における処置及び再発の防止のために、上皮成長因子（ＥｐｉｄｅｒｍａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ）及び成長ホルモン放出性ペプチド−６（ＧｒｏｗｔｈＨｏｒｍｏｍｅＲｅｌｅａｓｉｎｇＰｅｐｔｉｄｅ−６）を含有する組成物を投与することによって中枢神経系神経再生を刺激することに関する。

（発明の背景）
多発性硬化症（ＭｕｌｔｉｐｌｅＳｃｌｅｒｏｓｉｓ）（ＭＳ）及び視神経脊髄炎（ＯｐｔｉｃＮｅｕｒｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）（ＯＮ）は若年の人々、本質的に女性が被患する自己免疫性脱髄病であり、好ましくない時点で発生する無力及び虚脱をもたらす。ＭＳ発生数は先進国における工業化及び発展の進行パラメータに強力に相関する。

中枢神経系（ＣｅｎｔｒａｌＮｅｒｖｏｕｓＳｙｓｔｅｍ）は自己免疫反応がまれに見出される特権が与えられている免疫学的部位である。この自己免疫反応は、未確定の原因によって細胞及び体液調節メカニズムが不全になった場合に生じる。賦活されたリンパ球として末梢発生するミエリン抗原に対する自動反応性細胞が血液脳関門（ＢｌｏｏｄＢｒａｉｎＢａｒｒｉｅｒ）（ＢＢＢ）を通過し、それらの標的を中枢神経系実質内に見出す（これはしばしば、事実である）。脱髄、反応性星状膠細胞増加、ならびにニューロン及び希突起神経膠細胞の死に発展する多くのカスケード様事象が続いて起こる。

中枢神経系内の自己免疫反応はミエリン抗原を指向し、これによって第一の場合、その損傷は主要ニューロンの軸を包んでいるミエリンシートに、ミエリン産生に応答する希突起神経膠細胞に、また自己免疫反応の発現により非特異的に損傷される別群のニューロンに制限される。

壊死又はアポトーシスのいずれかの結果として続いて生じる脱髄及びニューロンの死はヒト身体内の種々の構造体に無作為に影響を及ぼす運動性及び感受性の消失を導く。ＭＳ及びＯＮにおける再髄鞘形成プロセスは一般に、制限され、また一時的である。しかしながら、この再髄鞘形成プロセスは、自動反応性星状膠細胞と希突起神経膠細胞との間の均衡に依存する可能性が存在する（ＪｏｈｎＧ．Ｒ．，ＳｈａｎｋａｒＳ．Ｌ．，Ｓｈａｆｉｔ−ＺａｇａｒｄｏＢ．，ＭａｓｓｉｍｉＡ．，ＬｅｅＳ．Ｃ．，ＲａｉｎｅＣ．Ｓ．等（２００２）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ｒｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｐａｔｈｗａｙｔｈａｔｒｅｓｔｒｉｃｔｓｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎ［多発性硬化症：希突起神経膠細胞成熟を制限する発達経路の再発現］、ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ８（１０）：１１１５−１１２１）。

神経再生戦略の中で、成長因子、例えば上皮成長因子（ＥｐｉｄｅｒｍａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ）（ＥＧＦ）及びウシ−繊維芽細胞成長因子（ｂｏｖｉｎｅ−ＦｉｂｒｏｂｌａｓｔＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ）（ｂＦＧＦ）による処置は、脳皮質から単離された多能未分化細胞直系がこれらの成長因子に応答してタイプＩ及びＩＩ星状膠細胞、髄鞘形成性希突起神経膠細胞、及び種々のニューロン系統に向かって分化することを示す非常に有望な提案であった（ＭｅｈｌｅｒＭ．Ｆ．，ＧｏｋｈａｎＳ．（１９９９）Ｐｏｓｔｎａｔａｌｃｅｒｅｂｒａｌｃｏｒｔｉｃａｌｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ：ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｍｅｃｈａｎｉｓｍｓａｎｄｐｏｔｅｎｔｉａｌｒｏｌｅｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｎｏｖｅｌｎｅｕｒａｌｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ［生後大脳皮質多能プロゲニター：新規神経再生戦略の開発における調節メカニズム及び可能な役割］、ＢｒａｉｎＰａｔｈｏｌ．；９（３）：５１５−５２６）。

成長ホルモン放出性ペプチド−６（ＧＨＲＰ−６）は、中枢神経系におけるインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）発現を増加させる（ＦｒａｇｏＬ．Ｍ．，ＰａｎｅｄａＣ．，ＤｉｃｋｓｏｎＳ．Ｌ．，ＨｅｗｓｏｎＡ．Ｋ．，ＡｒｇｅｎｔｅＪ．，ＣｈｏｗｅｎＪ．Ａ．（２００２）、Ｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅ（ＧＨ）ａｎｄＧＨ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅ−６ｉｎｃｒｅａｓｅｂｒａｉｎｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄａｃｔｉｖａｔｅｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ［成長ホルモン（ＧＨ）及びＧＨ放出性ペプチド−６は脳インスリン様成長因子−１発現を増加し、及び神経防護に含まれる細胞内信号発信経路を活性化する］、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１４３（１０）：４１１３−４１２２）。

ＩＧＦ−１は、プロセス様希突起神経膠細胞成熟に含まれ（ＷｉｌｓｏｎＨ．Ｃ．，ＯｎｉｓｃｈｋｅＣ．，ＲａｉｎｅＣ．Ｓ．（２００３）Ｈｕｍａｎｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｐｒｅｃｕｒｓｏｒｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏ：ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓ［インビトロヒト希突起神経膠細胞先駆体：表現型分析及び成長因子に対する差別的応答］、Ｇｌｉａ４４（２）：１５３−１６５）、ＴＮＦ−アルファ活性化に依存するアポトーシス経路を停止させ、他方でＭＳ及びＯＮにおけるこの因子により誘発される損傷を防止する（ＹｅＰ．Ｄ’ＥｒｃｏｌｅＡ．Ｊ．（１９９９）Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ１ｐｒｏｔｅｃｔｓｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓｆｒｏｍｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄｉｎｊｕｒｙ［インスリン様成長因子１は腫瘍壊死因子−アルファ−誘発損傷から希突起神経膠細胞を防護する］、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１４０（７）：３０６３−３０７２９）。

ＩＧＦ−１はまた、ＭＨＣクラス１関連分子の発現を下方調節する（ＩｔｏＴ，ＩｔｏＮ，ＢｅｔｔｅｒｍａｎｎＡ，ＴｏｋｕｒａＹ，ＴａｋｉｇａｗａＭ，ＰａｕｓＲ．（２００４）ＣｏｌｌａｐｓｅａｎｄｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎｏｆＭＨＣｃｌａｓｓ−１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｉｍｍｕｎｅｐｒｉｖｉｌｅｇｅ：ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇｔｈｅｈｕｍａｎｈａｉｒｆｏｌｌｉｃｌｅａｓａｍｏｄｅｌ［ＭＨＣクラス−１−依存免疫特権の崩壊及び修復：モデルとしてヒト毛嚢を活用する］、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６４（２）：６２３−６３４）。ＥＡＥの動物モデルにおいて、ＩＧＦ−１はＢＢＢの血管内皮病変、硬変プラークの数及び大きさ、ＭＳの特徴的病変を減少させる（ＬｉＷ，ＱｕｉｇｌｅｙＬ，ＹａｏＤ．Ｌ，ＨｕｄｓｏｎＬ．Ｄ，ＢｒｅｎｎｅｒＭ，ＺｈａｎｇＢ．Ｊ．等（１９９８）Ｃｈｒｏｎｉｃｒｅｌａｐｓｉｎｇｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｏｎｙｅｌｉｔｉｓ：ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−１ｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｎｃｌｉｎｉｃａｌｄｅｆｉｃｉｔｓ，ｌｅｓｉｏｎｓｅｖｅｒｉｔｙ，ｇｌｉａｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，ａｎｄｂｌｏｏｄｂｒａｉｎｂａｒｒｉｅｒｄｅｆｅｃｔｓ［慢性再発実験的自己免疫脳脊髄炎：臨床的欠損、病変重篤度、神経膠細胞応答、及び血液脳関門欠損に対するインスリン様成長因子−１処置の効果］、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ，５７（５）：４２６−４３８）。

全身的に投与された場合、ＧＨＲＰ−６は、内因副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）レベルを増加する（ＭａｒｔｉｎｓＭ．Ｒ，ＰｉｎｔｏＡ．Ｃ，ＢｒｕｎｎｅｒＥ，ＳｉｌｖａＭ．Ｒ，ＬｅｎｇｙｅｌＡ．Ｍ．（２００３）ＧＨ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇｐｅｐｔｉｄ（ＧＨＲＰ−６）−ｉｎｄｕｃｅｄＡＣＴＨｒｅｌｅａｓｅｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈａｄｄｉｓｏｎ’ｓｄｅｓｅａｓｅ：ｅｆｆｅｃｔｏｆｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｗｉｔｈｄｒａｗａｌ［アジソン病の患者におけるＧＨ−放出性ペプチド（ＧＨＲＰ−６）−誘発ＡＣＴＨ放出：グルココルチコイドの作用は取り消される］、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．（２６（２）：１４３−１４７）。内因ステロイド放出性因子としてのＡＣＴＨは自動反応性障害を中和する有益な効果を有し、長い間、ＭＳに対する伝統的治療法であった（ＯｉｓｈｉＣ，ＳａｋｕｔａＭ．（２００３）Ｓｔｅｒｏｉｄｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｍｕｌｔｉｐｌｅｓｃｌｅｒｏｓｉｓ［多発性硬化症のステロイド治療］、ＮｉｐｐｏｎＲｉｎｓｈｏ６１（８）：１３６１−１３６６）。

ＥＧＦは中枢神経系（ＣＮＳ）において小神経膠細胞、血液由来マクロファージによって、及びまた或る種のニューロンによって局所的に合成される。ＢＢＢ及び脳室床膜（ｖｅｎｔｉｃｌｅｌｙｉｎｇｍｅｍｂｒａｎｅｓ）を通過することから、ＥＧＦはまた、ＣＮＳを流動することができる。ＥＧＦは、ＣＮＳ発現、ＣＮＳ実質細胞の維持及び分化、神経再生プロセスに非常にかなり関連する動作、及び攻撃に際し惹起される生き残りメカニズムなどの或る数の生理学的機能に関与するものと考えられてきた（Ｐｌａｔａ−ＳａｌａｍａｎＣ．Ｒ．（１９９１）Ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒａｎｄｔｈｅｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍ［上皮成長因子及び神経系］、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ１２（３）：６５３−６６３）。

ＥＧＦは細胞増殖を刺激し、ＣＮＳ内で生き残る（ＴｈｏｒｎｅＲ．Ｇ，ＨｒａｂｅｔｏｖａＳ，ＮｉｃｈｏｌｓｏｎＣ．（２００４）ＤｉｆｆｕｓｉｏｎｏｆＥｐｉｄｅｒｍａｌＧｌｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｉｎＲａｔＢｒａｉｎＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＳｐａｃｅＭｅａｓｕｒｅｄｂｙＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅＯｐｔｉｃａｌＩｍａｇｉｎｇ［集積光学造影により測定されたラット脳細胞外空間における上皮成長因子の拡散］、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９２（６）：３４７１−３４８１）。

ＥＧＦ−刺激された希突起神経膠細胞は増強された再髄鞘形成能力を獲得する。ＥＧＦは希突起神経膠細胞増殖プロセスに関与し、これにより細胞分裂、及びさらに成熟希突起神経膠細胞、星状膠細胞及びシュワン（Ｓｃｈｗａｎｎ）細胞などの特定化された細胞への分化が促進される。ＥＧＦは新しいニューロンの発生により付与される神経発生などの事象を促進する（ＣｒａｎｇＡ．Ｊ．，ＧｉｌｓｏｎＪ．Ｍ．，ＬｉＷ．Ｗ．，ＢｌａｋｅｍｏｒｅＷ．Ｆ．（２００４）ＴｈｅｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇｐｏｔｅｎｔｉａｌａｎｄｉｎｖｉｔｒｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＭＯＧ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅａｄｕｌｔｒａｔＣＮＳ［成熟ラットＣＮＳから単離されたＭＯＧ−発現性希突起神経膠細胞先駆体の再髄鞘形成能力及びインビトロ分化］、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０（６）：１４４５−１４６０；ＲａｉｎｅｔｅａｕＯ．，ＲｉｅｔｓｃｈｉｎＬ．，ＧｒａｄｗｏｈｌＧ．，ＧｕｉｌｌｅｍｏｔＦ．，ＧａｈｗｉｌｅｒＢ．Ｈ．（２００４）Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｓｌｉｃｅｃｕｌｔｕｒｅｓ［海馬切片培地における神経発生］、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＮｅｕｒｏｓｃｉ．２６（２）：２４１−２５０）。

これらの事象はまた、希突起神経膠細胞が損傷を経験した後にもまた見出され、このことは再生プロセスに対するＥＧＦ−媒介作用がＥＧＦと損傷された希突起神経膠細胞で特異的に賦活されるシグナル変換系との間の相互反応の結果であることを示唆している。これはまた、このシグナル変換系の変調が再髄鞘形成に向かうメカニズムを増幅させることができることを示唆している（ＷａｎｇＫ．，ＷａｎｇＪ．Ｊ．，ＷａｎｇＹ．，ＨｅＱ．Ｈ．，ＷａｎｇＸ．，ＷａｎｇＸ．Ｍ．（２００４）Ｉｎｆｕｓｉｏｎｏｆｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒａｎｄｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｉｎｔｏｔｈｅｓｔｒｉａｔｕｍｏｆｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎｒａｔｓｌｅａｄｓｔｏｉｎｖｉｔｒｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｉｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆａｄｕｌｔｎｅｕｒａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ［上皮成長因子及び塩基性繊維芽細胞増殖因子のパーキンソン病ラットの線状体への注入は成熟神経プロゲニター細胞のインビトロ増殖及び分化を導く］、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．３６４（３）：１５４−１５８；ＫｎａｐｐＰ．Ｅ．，ＡｄａｍｓＭ．Ｈ．（２００４）Ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｐｒｏｍｏｔｅｓｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｐｒｏｃｅｓｓｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｒｅｇｒｏｗｔｈａｆｔｅｒｉｎｊｕｒｙ［上皮増殖因子は損傷後の希突起神経膠細胞プロセス形成及び再増殖を導く］、Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．２９６（２）：１３５−１４４）。

過去数年間の間、余分であるとは言えない、強化された治療手段のである組合せ治療及び／又は系統的治療として複雑な治療的介入手段が提供されており、これにより関連疾病に関係する節目又はキイポイントにおける複雑な病理生理学的問題への接近が可能にされた。種々の成長因子又はそれらの中の１種とＣＮＳに対し正の栄養価値を有する別の分子との組合わせを用いる組合わせ治療法はいまだに欠落している。

理想的治療法は初期発作が伴う病状の程度を抑制し、再発頻度を最低に減少させることに焦点が合わせられる。従って、種々の臨床形態のＭＳ及びＯＮにおける再発防止などの処置に使用されるさらに有効な方法の開発にかかわる関心が支持されている。
治療有効濃度のＥＧＦ及び分泌促進性ＧＨＲＰ−６を必要とする組合わせの投与は、動脈血液供給欠乏による組織損傷の予防及び処置に従来から示唆されてきた（ＷＯ０２／０５３１６７）。

（発明の要旨）
本発明は、ＣＮＳの自己免疫障害に対しＥＧＦ及びＧＨＲＰ−６の共同投与を必要とする方法及び改善された処置に基づいている。この組合わせは、ＣＮＳの慢性的病状、特に多発性硬化症及び視神経脊髄炎における自己免疫付随障害を防止し、また回復させる。

各成分単独に比較して、当該組合わせはさらに長い持続的効力及び再発の実質的減少をもたらす、換言すれば、さらに効果的な方法で再生事象を誘発させる。本明細書で使用されているものとして、「さらに長い持続的効力」の用語は、活性成分がさらに長期間にわたる改善を導き、再発場面を回避する防護を授与さえすることを意味する。これは自己免疫によってもたらされるアポトーシス／壊死による脱髄及びニューロン損失の結果として生じた神経学的損失の回復を確実にする。他方、当該医薬組成物の活性成分は天然の調節細胞刺激能力により賦与される自己タンパク質及びペプチドであり、従ってこれらは内因ペプチド投与後の増殖を刺激する。

調節Ｔ細胞の役割は免疫寛容を構造的に仲裁することにあることから、この方法は自己免疫応答を中和することができる（ＪｏｒｎＧ．，ＢｅｎｅｄｉｋｔＢ．，ＢｒｕｎｏＫ．（２００４）ＭｅｄｕｌｌａｒｙＥｐｉｔｈｅｌｉａｌＣｅｌｌｓｏｆｔｈｅＨｕｍａｎＴｈｙｍｕｓＥｘｐｒｅｓｓａＨｉｇｈｌｙＤｉｖｅｒｓｅＳｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆＴｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＧｅｎｅｓＣｏｌｏｃａｌｉｚｅｄｉｎＣｈｒｏｍｏｓｏｍａｌＣｌｕｓｔｅｒｓ［ヒト胸腺の髄上皮細胞は染色体クラスターに局限化される組織特異性遺伝子の高度に多様な選択を示す］、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９（２）：１５５−１６６）；（ＤａｙｎｅＭ．，ＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅＢ．（２００４）ＢａｃｋｔｏＣｅｎｔｒａｌＴｏｌｅｒａｎｃｅ［中枢寛容への逆行］、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２０：５０９−５１６）；（ＭａｒｋＳ．Ａ．，ＥｍｉｌｙＳ．Ｖ．，ＬｕｄｇｅｒＫ．，ＺｈｉｂｉｎＣ．，ＳｔｕａｒｔＰ．Ｂ．，ＳｈａｎｎｏｎＪ．Ｔ．等（２００２）ＰｒｏｊｅｃｔｉｏｎｏｆａｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＳｅｌｆＳｈａｄｏｗＷｉｔｈｉｎｔｈｅＴｈｙｍｕｓｂｙｔｈｅＡｉｒｅＰｒｏｔｅｉｎ［エアタンパク質による胸腺内における免疫学的自己陰影の投影］、Ｓｃｉｅｎｃｅ２９８：１３９５−１４００）；（ＳｈｍｏｎＳ．（２００４）ＮａｔｕｒａｌｌｙａｒｉｓｉｎｇＣＤ４^＋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙＴｃｅｌｌｓｆｏｒｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃｓｅｌｆ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆｉｍｍｕｎｅｒｅａｐｏｎｓｅｓ［免疫学的自己寛容及び免疫応答の負の制御にかかわる天然産生ＣＤ４^＋調節Ｔ細胞］、ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２２：５３１−５６２）。

神経−栄養付与及び神経−再生事象に関連するＥＧＦとＧＨＲＰ−６との間の協働作用によって、この組合わせは神経再生プロセスの促進に有用であり、自己免疫が引き起こす障害によって失われた神経学的機能の再獲得を助長する。ＥＧＦとＧＨＲＰ−６との組合わせはいずれかの酸化防止剤治療と共に使用することができる。神経再生及び神経防護に対する当該組合わせの治療的投与は反復投与計画を要する。本発明で開示されているように、ＥＧＦで表されている活性成分は、ヒツジ、ウシ、ブタ及びヒトを包含するいずれかの動物種からその天然配列又はその変異体の形態で誘導することができ、また合成、天然又は組換えなどのいずれかの供給源から誘導することができる。この場合の好適形態は、天然配列を有するヒトＥＧＦ、及び全部のヒト組換えＥＧＦの大部分である。成長ホルモン放出性ペプチド（ＧＨＲＰ）の用語で表わされている活性成分は化学合成により得られる下記配列を有するヘキサペプチドである：Ｈｉｓ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨｓｕｂ２。

特定の設定において、ＭＳ及びＯＮ発症期間中に投与される治療用量は、２０〜３０日間でＥＧＦについて５〜２００μｇ／ｋｇ／日及びＧＨＲＰ−６について０．５〜３５０μｇ／ｋｇ／日の範囲である。
本発明のもうひとつの設定において、多発性硬化症の再発を防止するために発症間段階期間内に投与される用量は、１３０日までの期間で各成分について０．５〜５０μｇ／ｋｇ／日の範囲である。当該組合わせは一団として投与されなければならない。投与経路は非経口、末梢血管、筋肉内又は腹腔内である。投与に含まれるベヒクルは、正常塩類溶液、ラクテートリンゲル溶液、ヒト血漿、ヒトアルブミン溶液、デキストロース５％、ゼラチン溶液又はその混合物を包含する。

再発の軽減又は二次進行臨床形態にある多発性硬化症に対し最高の治療効果を期待する場合、一次投与は疾病の前兆徴（個人的に相違する）と一致してなされなければならない。寛解期において、再発防止にかかわり上記した用量を用いる持続的治療計画が薦められる。
その他の多発性硬化症臨床形態において、治療的用量を用いる持続処置計画が薦められる。

本発明のその他の設定に従い、ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６組合わせは、養子転移（ａｄｏｐｔｉｖｅｔｒａｎｓｆｅｒ）実験において、重篤な臨床形態のＥＡＥの発症を防止する天然及び適応調節（ａｄａｐｔｉｖｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）Ｔ細胞の増殖を誘発させる。
ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６組合わせは、単独の医薬組成物内に入れて、又は使用の直前に各成分を混合することによって使用することができる。当該活性成分組合わせは、徐放性用具の手段を用いることができる。製剤が凍結乾燥されている場合、これは使用直前に希釈しなければならない。

（特定の態様／例の詳細な説明）
例１：実験的自己免疫性脳炎（ＥＡＥ）バイオモデルにおけるＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６医薬組合わせの治療効果
ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６医薬組合わせの治療効果を評価するために、ＥＡＥ動物モデルを用意した。このモデルは多発性硬化症ヒト疾病の動物等価体であった。
雌ルイスラット（ＬｅｗｉｓＲａｔｓ）（１３０ｇ）を、ＰＢＳ（５０％）及び完全フロイントアジュバント（５０％）中のモルモット脊髄ホモジネート（５ｍｇ）により０〜６日間、皮下免疫化した。最初の免疫化後の１０日、ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６組合わせ（２００μｇ／ｋｇ／日−７４０μｇ／ｋｇ／日）、個別活性成分ＥＧＦ（２００μｇ／ｋｇ／日）、ＧＨＲＰ−６（７４０μｇ／ｋｇ／日）及びプラセボ（ＰＢＳ）を用いて治療計画を開始した。

この治療計画は、腹腔内投与を用いて１０日間行った。臨床評価値は下記等級に基づいていた：０；無症状、１；尾の麻痺、２；後肢のいずれかの麻痺、３；後肢の完全な麻痺、４；前肢及び後肢の完全な麻痺、５；瀕死又は死亡。体重損失及び膀胱及び直腸括約筋の機能不全（これはまた当該疾病の臨床的症状である）は、上記臨床指数に０．５を加算することによって評価する。最初の免疫化後の４０日目に動物に麻酔をかけ、次いで安楽死させ、その脳及び脊髄を組織病理学的分析用に処理した（１０％ｄｅホルマリン、Ｈ＆ＥｙＬｕｘｏｌＢｌｕｅ染色）。この組織病理学的分析では、下記パラメータを考慮した：脈管周囲炎症性湿潤（ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｉｎｆｉｌｔｔｒａｔｅｓ）の数及び大きさ、脱髄化病巣の数、アポトーシスニューロンの数、ならびに神経膠細胞及び星状膠細胞の反応性。顕微鏡検査はブラインドとして行った。

表１に示されているように、ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６組合わせはＥＡＥを発現するように実験的に誘導された動物を防護する。これらの動物の５０％のみは極僅かな形態で当該疾病を発現し、他方、残りの動物は未変化のままである。これに対し、残りの群（独立した活性成分で処置された群及びプラセボで処置された群）は１００％の発生数を有する。ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６組合わせで処置された動物における平均臨床指数は０．３７±０．４７であった。各独立成分処置群の場合、平均臨床指数は、ＥＧＦの場合に１．３７±１．７であり、またＧＨＲＰ−６の場合に１．５±１．６であり、またプラセボ処置群は平均臨床指数１．７±１．４を示した。各群について８匹のラットを割り当てた。これらの群間の統計学的比較はｐ＜０．００１であった。ニューマンケウルス（ＮｅｗｍａｎＫｅｕｌｓ）多重比較試験を使用した。

表１．ＥＡＥを発現するように誘導されたラットの治療効果の臨床要旨

表２に示されているように、相違する群に含まれる動物の脳及び脊髄の病理学的試験分析の結果は反応性星状膠細胞が同一状態で存在していても、ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６処置動物の血管カフ（ｖａｓｃｕｌａｒｃｕｆｆ）の数（ｐ＝０．０２８非対称Ｔ試験）及び大きさがプラセボ処置群に比較して減少していることを示している。

表２．動物の脳及び脊髄における脈管周囲炎症性湿潤

この実験は、ＥＧＦ／ＧＨＲＰ医薬組合わせが重篤な臨床形態にある疾病の発現から動物を防護することを示した。この防護効果の基礎となるメカニズムは、希突起神経膠細胞によるミエリンの増大した産生及び引き続く被患した神経構造体の再髄鞘形成にある。もうひとつのメカニズムは自動反応性細胞の脳実質への通行を回避することにかかわるＢＢＢの完全性に関連する。

例２．ＥＡＥ動物モデル予防計画におけるＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６医薬組合わせの防護効果
ＭＳヒト疾病を代表するＥＡＥ動物モデルにおけるＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６組合わせの予防効果を評価するために、雌ルイスラット（１３０ｇ）を、ＰＢＳ（５０％）及び完全フロイントアジュバント（５０％）中のモルモット脊髄ホモジネート（５ｍｇ）により０日目及び６日目に、皮下免疫化した。最初の免疫化前の１０日の時点で、ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６組合わせ（２００μｇ／ｋｇ／日−７４０μｇ／ｋｇ／日）及び個別活性成分ＥＧＦ（２００μｇ／ｋｇ／日）、ＧＨＲＰ−６（７４０μｇ／ｋｇ／日）及びプラセボ（ＰＢＳ）を用いる予防計画を開始した。

この予防計画は、腹腔内投与経路を用いて１０日間行った（最初の免疫化前の−１０〜−１日）。臨床評価値は下記等級に基づいていた：０；無症状、１；尾の麻痺、２；後肢のいずれかの麻痺、３；後肢の完全な麻痺、４；前肢及び後肢の完全な麻痺、５；瀕死又は死亡。体重損失及び膀胱及び直腸括約筋の機能不全（これはまた当該疾病の臨床的症状である）は、上記臨床指数に０．５を加算することによって評価する。最初の免疫化後の４０日目に動物に麻酔をかけ、次いで安楽死させ、その脳及び脊髄を組織病理学的分析用に処理した（１０％ｄｅホルマリン、Ｈ＆ＥｙＬｕｘｏｌＢｌｕｅ染色）。この組織病理学的分析では、下記パラメータを考慮した：脈管周囲炎症性湿潤の数及び大きさ、脱髄化病巣の数、アポトーシスニューロンの数、ならびに神経膠細胞及び星状膠細胞の反応性。顕微鏡検査はブラインドとして行った。

表３に示されているように、この予防計画に用いられたＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６医薬組合わせはＥＡＥを発現するように誘導された動物を防護した。ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６処置動物の１００％が当該疾病を軽度の形態（０．５〜１臨床評価値）で発現した。これに対し、単独成分で処置された動物の場合、７５％が重篤な臨床形態（３〜４臨床評価値）でＥＡＥを発現した。ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６医薬組合わせで処置された動物に見出された平均臨床指数は０．６８±０．２５であった。単独成分処置群の場合、平均臨床指数は、ＥＧＦの場合に２．８±０．９９であり、またＧＨＲＰ−６の場合に２．７±１．０３であり（ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６処置動物と比較し、Ｐ＝０．０００３）、またプラセボ処置群は３±１．４の平均臨床指数を示した（ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６処置動物と比較し、Ｐ＝０．００１１）。各群について８匹のラットを使用した。統計学的比較にはマンホワイトニイ（ＭａｎｎＷｈｉｔｎｅｙ）Ｔ試験を使用し、当該組合わせで処置された群とプラセボ群とを比較することによってｐ＝０．００１１の数値を得た。各独立活性成分で処置された群の場合、当該医薬組合わせで処置された群との比較によってｐ＝０．０００３の数値を得た。

表３．ＥＡＥを発現するように誘導されたラットにおける予防効果の臨床的要旨

表４に見出されるように、実験群における脳及び脊髄の病理学的分析は反応性星状膠細胞が同一の場合でさえも、ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６により予防的に処置された動物の脈管周囲カフ数（ｐ＝０．０２５非対称Ｔ試験）及び大きさがプラセボ処置群よりも少なく、また小さいことを示す。

表４．予防的に処置された動物の脳及び脊髄における脈管周囲炎症性湿潤

この実験は、ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６医薬組合わせがその最も重篤な臨床形態にあるＥＡＥの発現から動物を防護することを示している。さらにまた、この実験は臨床評価値と組織学的発見との間の強力な相関関係を証明している。この防護効果を説明するメカニズムは、前状態と見なされ、またミエリン産生において活性である希突起神経膠細胞へのニューロン先駆体の分化の誘発と関連している。ＢＢＢの完全性の保持は脳実質への自動反応性細胞の通行を防止する。このことは予防に用いられるＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６医薬組合わせの防護役割を説明するもうひとつの事象である。

例３．用量試験、相乗効果−医薬組合わせの活性成分間の相乗作用
当該医薬組合わせが治療効果にかかわり有効である用量範囲を探求するために、前記ＥＡＥモデル、雌ルイスラット（１３０ｇ）を使用し、０日〜６日間、ＰＢＳ（５０％）及び完全フロイントアジュバント（５０％）中のモルモット脊髄ホモジネート（５ｍｇ）を用いて皮下免疫化した。最初の免疫化後の１０日目に、相違する濃度で組合わされているＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６組合わせを使用し、治療計画を開始した：
ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６（４００μｇ／ｋｇ／日−１４８０μｇ／ｋｇ／日）、
ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６（２００μｇ／ｋｇ／日−７４０μｇ／ｋｇ／日）、
ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６（１００μｇ／ｋｇ／日−３４０μｇ／ｋｇ／日）、
ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６（５０μｇ／ｋｇ／日−１７０μｇ／ｋｇ／日）、
ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６（２５μｇ／ｋｇ／日−８５μｇ／ｋｇ／日）、
ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６（１２μｇ／ｋｇ／日−４０μｇ／ｋｇ／日）。

この治療計画は、腹腔内投与を使用して１０日間にわたり行った。臨床評価値は下記等級に基づいていた：０；無症状、１；尾の麻痺、２；後肢のいずれかの麻痺、３；後肢の完全な麻痺、４；前肢及び後肢の完全な麻痺、５；瀕死又は死亡。体重損失及び膀胱及び直腸括約筋の機能不全（これはまた当該疾病の臨床的症状である）は、上記臨床指数に０．５を加算することによって評価する。最初の免疫化後の４０日目に動物に麻酔をかけ、次いで安楽死させ、その脳及び脊髄を組織病理学的分析用に処理した（１０％ｄｅホルマリン、Ｈ＆ＥｙＬｕｘｏｌＢｌｕｅ染色）。この組織病理学的分析では、下記パラメータを考慮した：脈管周囲炎症性湿潤の数及び大きさ、脱髄化病巣の数、アポトーシスニューロンの数、ならびに神経膠細胞及び星状膠細胞の反応性。顕微鏡検査はブラインドとして行った。

ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６（４００μｇ／ｋｇ／日−１４８０μｇ／ｋｇ／日）処置群において、動物の２５％は未変化のままであり、動物の７５％は当該疾病を軽度の形態（０．５〜１）で示した。平均臨床指数は０．６２±０．４４であった。ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６（２００μｇ／ｋｇ／日−７４０μｇ／ｋｇ／日）処置群において、動物の２５％は未変化のままであり、動物の７５％は当該疾病を軽度の形態（０．５〜１）で示した。平均臨床指数は０．５±０．３７であった。

ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６（１００μｇ／ｋｇ／日−３４０μｇ／ｋｇ／日）処置群において、動物の１２．５％は未変化のままであり、動物の８７．５％は当該疾病を軽度の形態（０．５〜１）で示した。平均臨床指数は０．６２±０．３５であった。
ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６（５０μｇ／ｋｇ／日−１７０μｇ／ｋｇ／日）処置群において、動物の１００％がＥＡＥを発現し、１２．５％が中間的臨床形態（２）を示し、そして残りは軽度の形態（０．５〜１）で当該疾病を示した。平均臨床指数は０．９３±０．４９であった。

ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６（２５μｇ／ｋｇ／日−８５μｇ／ｋｇ／日）処置群において、動物の１００％がＥＡＥを発現し、３７．５％が中間的臨床形態（２）を示し、そして残りは軽度の形態（０．５〜１）で当該疾病を示した。平均臨床指数は１．２５±０．６５であった。
ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６（１２μｇ／ｋｇ／日−４０μｇ／ｋｇ／日）処置群において、動物の１００％がＥＡＥを発現し、１２．５％が最も重篤な臨床形態（３）を示し、３７．５％が中間的臨床形態（２）を示し、そして残りは軽度の状態（０．５〜１）で当該疾病を示した。平均臨床指数は１．３７±０．８７であった。

表５及び６は臨床及び組織病理学的結果を示している。この組織病理学的分析はＥＡＥ−誘発され、ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６（４００μｇ／ｋｇ−１４８０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ−７４０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ−３４０μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ−１７０μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ−８５μｇ／ｋｇ）で処置された群におけるリンパ球脈管周囲浸潤の数に統計学的差違がなかったことを示した。ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６医薬組合わせ（１２μｇ／ｋｇ−４０μｇ／ｋｇ）で処置された群の場合、脈管周囲湿潤の数はより多い傾向を示したが（ｐ＝０．０４０）、この差は統計学的に有意ではなかった。これらの結果はＥＧＦについて５０〜４００μｇ／ｋｇ／日及びＧＨＲＰ−６について１７０μｇ／ｋｇ／日〜１．４ｍｇ／ｋｇ／日の用量範囲がＥＡＥ発現に対する防護にかかわるその有用性を維持できることを証明している（表５）。

表５．用量応答及び相乗効果の臨床要旨−ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６組合わせの個別成分間の相乗作用

表６．各実験群の脳及び脊髄における脈管周囲炎症性湿潤

例４．天然調節性Ｔ細胞応答の発生におけるＥＧＦ−ＧＨＲＰ−６医薬組合わせの効果の評価
２０匹の雌ルイスラット（１３０ｇ）を、ＰＢＳ（５０％）及び完全フロイントアジュバント（５０％）中のモルモット脊髄ホモジネート（５ｍｇ）により０日目に及び６日目に皮下免疫化した。最初の免疫化後の１０日目に、ＥＧＦ／ＧＨＲＰ−６組合わせ（２００μｇ／ｋｇ／日−７４０μｇ／ｋｇ／日）を用いて治療計画を開始し、次いでこれらの免疫化したラットの中の１０匹（グループＡ）に次の１０日間、その腹腔内投与を行った。別の１０匹のラットはプラセボとしてＰＢＳ処置した（グループＢ）。最後の投与後の１週間、両群からの動物を麻酔して採血し、これにより末梢血液単核リンパ球を得た。グループＡ及びグループＢから得られたリンパ球を処理し、ＣＤ４^＋細胞を分離した。
ＣＤ^４＋ＣＤ２５^＋細胞のＦＡＣＳによる分析はグループＡで１４．６７％及びＰＢＳ処置群（グループＢ）で３．８％であった。

別の雌ルイスラット（１３０ｇ）を、ＰＢＳ（５０％）及び完全フロイントアジュバント（５０％）中のモルモット脊髄ホモジネート（５ｍｇ）により０日目及び６日目に皮下免疫化した。最初の免疫化後の１０日目、従属群（ｎ＝８）をグループＡからの５０００００ＣＤ^４＋細胞を用いて血管経由により養子転移処置した。もう一方の従属群（ｎ＝８）はグループＢからの５０００００ＣＤ^４＋細胞を用いて血管経由により養子転移処置した。

臨床評価値は下記等級に基づいていた：０；無症状、１；尾の麻痺、２；後肢のいずれかの麻痺、３；後肢の完全な麻痺、４；前肢及び後肢の完全な麻痺、５；瀕死又は死亡。体重損失及び膀胱及び直腸括約筋の機能不全（これはまた当該疾病の臨床的症状である）は、上記臨床指数に０．５を加算することによって評価する。最初の免疫化後の４０日目に動物に麻酔をかけ、次いで安楽死させ、その脳及び脊髄を組織病理学的試験用に処理した（１０％ｄｅホルマリン、Ｈ＆ＥｙＬｕｘｏｌＢｌｕｅ染色）。この組織病理学的分析では、下記パラメータを考慮した：脈管周囲炎症性湿潤の数及び大きさ、脱髄化病巣の数、アポトーシスニューロンの数、ならびに神経膠細胞及び星状膠細胞の反応性。顕微鏡検査はブラインドとして行った。

表７に示されているように、ＥＡＥ誘発動物におけるＣＤ^４＋細胞の転移処置及び当該医薬組合わせによる処置は、ホストをＥＡＥ発現から防護する。グループＡから誘導されたＣＤ^４＋細胞を転移された動物の５０％のみが軽度の形態（臨床評価値０．５〜１）のＥＡＥを発現し、残りの５０％は未変化のままであった。これに対して、グループＢから誘導されたＣＤ^４＋細胞により養子転移処置された動物は、１００％がＥＡＥを発現し、６２．５％は重篤な臨床形態（臨床評価値２〜４）で、また３７．５％が軽度の臨床形態（臨床評価値０．５〜１）でＥＡＥを発現した。グループＡから誘導されたＣＤ^４＋細胞により養子転移処置された従属群における平均臨床指数は、０．３１±０．０．３４であった。グループＢから誘導されたＣＤ^４＋細胞により養子転移処置された従属群における平均臨床指数は、２．１±０．９９であった（Ｐ＝０．０００３）。統計学的比較にはマンホワイトニイＴ試験を使用した。

表７．養子細胞転移の防護効果

表８に示されているように、実験群における脳及び脊髄の組織学的分析は反応性星状膠細胞が同一状態で存在する場合でさえも、ＣＤ^４＋がグループＡに由来するものであるホストラットにおける脈管カフの数（ｐ＝０．０００１）及び大きさがグループＢから誘導されたＣＤ^４＋細胞により養子転移処置されたラットに比較し小さいことを示した。

表８．各実験群の脳及び脊髄における脈管周囲炎症性湿潤

これらの結果は、当該医薬組合わせによる処置が天然調節Ｔ細胞の増殖を誘発させることができ、この処置は養子転移実験における重篤な臨床形態のＥＡＥの発現を防止することを証明している。

Claims

自己免疫を原因とするアポトーシス又は壊死による脱髄、ニューロン変性及びニューロン細胞死に関連する症状又は合併症に被患している患者における多発性硬化症の処置及び改善のためのＥＧＦ及び成長ホルモン放出性ペプチド−６（ＧＨＲＰ−６）を含む医薬。
前記ＥＧＦがヒトＥＧＦである、請求項１に記載の医薬。
前記ヒトＥＧＦは、合成、天然又は組換えによって得られるものである、請求項２に記載の医薬。
ＥＧＦ−ＧＨＲＰ−６組合わせは静脈内、筋肉内又は腹腔内投与されるものであるか、又は制御放出性用具を用いて投与されるものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬。
前記医薬は、患者の体重キログラム１日当たりにおける各成分を独立して５〜１０μｇの用量範囲で２０〜３０日間にわたる治療計画で非経口投与されるものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬。
前記医薬は、寛解期間中、患者の体重キログラム１日当たりで各独立成分を１〜５μｇの用量範囲で１３０日までの期間にわたり非経口投与されるものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬。
前記医薬が天然調節Ｔ細胞の増殖を誘発するものである、請求項１に記載の医薬。