ES2327562T3

ES2327562T3 - Combinacion de egf/ghrp-6 para la neurorregeneracion del sistema nervioso central.

Info

Publication number: ES2327562T3
Application number: ES06705745T
Authority: ES
Inventors: Diana Garcia Del Barco Herrera; Gerardo Enrique Guillen Nieto; Jorge A. Berlanga Acosta; Freya Freyre Almeida; Danay Cibrian Vera; Eduardo Penton Arias
Original assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Current assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Priority date: 2005-03-02
Filing date: 2006-02-24
Publication date: 2009-10-30
Anticipated expiration: 2026-02-24
Also published as: MY142494A; KR20070107790A; CU23529A1; KR101255200B1; ZA200707020B; AU2006220154B2; CN101180044A; EP1870106B1; WO2006092106A2; CA2600628A1; CA2600628C; MX2007010717A; BRPI0607844B8; PT1870106E; ATE431743T1; DE602006006903D1; BRPI0607844A2; JP5001180B2; EP1870106A2; RU2007136280A

Abstract

La presente invención es dirigida a estimular la neuroregeneracin del sistema nervioso central debido al daño autoinmune. En paricular la combinación farmacéutica que comprende concentracionesterapéuticamente efectivas del Factor de Crecimiento Epidérmico del Hexapéptido Secretagogo de la Hormona de Crecimiento Humanaes administrada a un sujeto que sufre de los síntomas de Esclerois Múltiple y Neuromielitis Óptica y corrige la desmielinizacióncausada por células autoreactivas en el Sistema Nervioso Central

Description

Combinación de EGF/GHRP-6 para la neurorregeneración del sistema nervioso central.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a medicina, y más específicamente a neurología, y se dirige a estimular la neurorregeneración del sistema nervioso central después de un daño autoinmunitario, particularmente para el tratamiento y la prevención de recaídas en pacientes con esclerosis múltiple y neuromielitis óptica, mediante la administración de composiciones que contienen factor de crecimiento epidérmico y péptido liberador de hormona del crecimiento 6.

Técnica anterior

La esclerosis múltiple (EM) y la neuromielitis óptica (NO) son enfermedades desmielinizantes autoinmunitarias que afectan a gente joven, fundamentalmente mujeres, que dan como resultado incapacitación e invalidez que progresa con el tiempo. La incidencia de EM está fuertemente correlacionada con parámetros avanzados de industrialización y desarrollo en países del primer mundo.

El sistema nervioso central (SNC) es un sitio inmunológico en el que las reacciones autoinmunitarias se encuentran de modo infrecuente. Esto sucede cuando, por causas no determinadas, falla el mecanismo regulador humoral y celular, lo que determina que las células autorreactivas contra antígenos de mielina que se generan periféricamente (lo que a menudo es el caso), crucen a través de la barrera hematoencefálica (BBB) en forma de linfocitos activados y encuentren una diana en el parénquima del sistema nervioso central. A partir de entonces tiene lugar una serie de eventos en forma de cascada que dan como resultado desmielinización, astrocitosis reactiva y muerte celular de neuronas y oligodendrocitos.

La reacción autoinmunitaria dentro del sistema nervioso central se dirige contra antígenos de mielina de modo que, en primera instancia, el daño se limita a láminas de mielina que cubren los axones de las neuronas principales, al oligodendrocito que es responsable de la producción de mielina y a otro grupo de neuronas que sufren una lesión de un modo no específico debido a la expansión de la reacción autoinmunitaria.

La desmielinización y la muerte neuronal resultantes por necrosis y/o apoptosis dan como resultado pérdida de sentido y/o función motora que afectan aleatoriamente a regiones específicas del cuerpo humano.

El proceso de remielinización en EM y NO es, en general, limitado y transitorio. Este proceso de remielinización, aunque posible, depende del equilibrio entre astrocitos autorreactivos y los oligodendrocitos (John G.R., Shankar S.L., Shafit-Zagardo B., Massimi A., Lee S.C., Raine C.S. y col. (2002) Multiple sclerosis: re-expression of a developmental pathway that restricts oligodendrocyte maturation Nature Medicine 8(10):1115-1121).

Entre las estrategias de regeneración neural, el tratamiento con factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y el factor de crecimiento de fibroblastos bovino (bFGF) han sido propuestas muy prometedoras, demostrando que linajes celulares multipotentes no diferenciados aislados a partir de la corteza cerebral son responsables de estos factores de crecimiento, diferenciando hacia linajes celulares diferentes tales como astrocitos de tipo I y II, oligodendrocitos mielinizantes y tipos neuronales diferentes (Mehler M.F., Gokhan S. (1999) Postnatal cerebral cortical multipotent progenitors: regulatory mechanisms and potential role in the development of novel neural regenerative strategies. Brain Pathol; 9(3):515-526).

El péptido liberador de hormona del crecimiento 6 (GHRP-6) aumenta la expresión del factor de crecimiento similar a insulina 1 (IGF-1) en el sistema nervioso central (Frago L.M., Paneda C., Dickson S.L., Hewson A.K., Argente J., Chowen J.A. (2002) La hormona del crecimiento (HC) y el péptido liberador de HC 6 aumentan la expresión del factor de crecimiento similar a insulina I en el cerebro y activan las rutas de señalización intracelular implicadas en la neuroprotección. Endocrinology 143(10):4113-4122).

El IGF-1 está implicado en procesos como la maduración de oligodendrocitos (Wilson H.C., Onischke C., Raine C.S. (2003) Human oligodendrocyte precursor cells in vitro: phenotypic analysis and differential response to growth factors. Glia 44 (2):153-165), bloqueando las rutas de apoptosis dependiente del factor de necrosis tumoral (TNF-\alpha), protegiendo así la EM y la NO del daño inducido por TNF-\alpha (Ye P, D'Ercole A.J. (1999) Insulin-like growth factor 1 protects oligodendrocytes from tumor necrosis factor-alpha-induced injury. Endocrinology 140(7):3063-3072) y reduce además la expresión de moléculas del complejo de histocompatibilidad principal de clase I (MHC-I) (Ito T, Ito N, Bettermann A, Tokura Y, Takigawa M, Paus R. (2004) Collapse and restoration of MHC class-I-dependent immune privilege: exploiting the human hair follicle as a model. Am. J. Pathol 164(2):623-634). En modelos experimentales de encefalitis autoinmunitaria (encefatilis autoinmunitaria experimental o EAE), el IGF-1 disminuye la lesión del endotelio vascular de la BBB, el número y el tamaño de placas de esclerosis, lesiones patognomónicas de esclerosis múltiple. (Li W, Quigley L, Yao D.L, Hudson L.D, Brenner M, Zhang B.J y col. (1998) Chronic relapsing experimental autoimmune encephalonyelitis: effects of insulin-like growth factor-1 treatment on clinical deficits, lesion severity, glial responses, and blood brain barrier defects. J Neuropathol Exp Neurol 57(5):426-438).

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Cuando se administra sistémicamente, el GHRP-6 aumenta los valores de hormona adrecorticotrofina endógena (ACTH) (Martins M.R, Pinto A.C, Brunner E, Silva M.R, Lengyel A.M. (2003) GH-releasing peptide (GHRP-6)-induced ACTH release in patients with addison's disease: effect of glucocorticoid withdrawal. J Endocrinol Invest. 26(2):143-147). La ACTH, como factor liberador de esteroides endógenos, tiene un efecto beneficioso contrarrestando los trastornos autorreactivos y ha sido, durante largo tiempo, la terapia tradicional para EM (Oishi C, Sakuta M. (2003) Steroid therapy for multiple sclerosis. Nippon Rinsho 61(8):1361-1366).

El EGF se sintetiza localmente en el sistema nervioso central (SNC) por microglias, macrófagos derivados de sangre y también por algunas neuronas. Al pasar a través de la BBB y las membranas que se apoyan en el ventrículo, el EGF es capaz de fluir al SNC. Se ha atribuido al EGF un número determinado de funciones fisiológicas, como desarrollo del SNC, mantenimiento y diferenciación de células parenquimales del SNC, actuaciones que están mucho más relacionadas con procesos de regeneración neural y con mecanismos de supervivencia activados por agresiones (Plata-Salaman C.R. (1991) Epidermal growth factor and the nervous system. Peptides 12(3):653-663).

El EGF estimula la proliferación y la supervivencia celular dentro del SNC (Thorne R.G, Hrabetova S, Nicholson C. (2004) Diffusion of Epidermal Growth Factor in Rat Brain Extracellular Space Measured by Integrative Optical Imaging. J Neurophysiol 92(6):3471-3481).

Los oligodendrocitos estimulados por EGF obtienen un potencial de remielinización mejorado. El EGF contribuye al proceso de proliferación de oligodendrocitos facilitando así el comienzo de la división celular y, además, la diferenciación en células especializadas como células de Schwann, astrocitos y oligodendrocitos maduros. El EGF promueve eventos tales como neurogénesis dada por la generación de neuronas nuevas (Crang A.J., Gilson J.M., Li W.W., Blakemore W.F. (2004) The remyelinating potential and in vitro differentiation of MOG-expressing oligodendrocyte precursors isolated from the adult rat CNS. Eur J Neurosci 20(6):1445-1460; Raineteau O., Rietschin L., Gradwohl G., Guillemot F., Gahwiler B.H. (2004) Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Mol Cell Neurosci 26(2):241-250). Estos eventos se observan probablemente con más frecuencia después de que los oligodendrocitos hayan experimentado el daño, sugiriendo que los efectos mediados por EGF sobre los procesos regenerativos son consecuencia de interacciones entre el EGF y un sistema de transducción de señal que se activa específicamente en oligodendrocitos dañados. Esto sugiere también que la modulación de este sistema de transducción de señal puede amplificar mecanismos hacia la remielinización (Wang K., Wang J. J, Wang Y., He Q.H., Wang X., Wang X.M. (2004) Infusion of epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor into the striatum of parkinsonian rats leads to in vitro proliferation and differentiation of adult neural progenitor cells. Neurosci Lett 364(3):154-158; Knapp P.E., Adams M.H. (2004) Epidermal growth factor promotes oligodendrocyte process formation and regrowth after injury. Exp Cell Res 296(2):135-144).

Durante estos últimos años se han propuesto intervenciones terapéuticas complejas como terapias de combinación y/o terapias sistemáticas que están lejos de ser redundantes y que fortalecen el enfoque terapéutico, permitiendo así el acceso a problemas patofisiológicos complejos en los puntos centrales o claves de la enfermedad de referencia. Hasta ahora se carece de una terapia combinada con varios factores de crecimiento o la combinación de uno de ellos con moléculas alternativas que tienen trofismo positivo por el SNC.

En todos los casos, una terapia ideal reduciría los síntomas asociados con los brotes iniciales y reduciría a un mínimo la frecuencia de recaídas. Existe, por lo tanto, la necesidad de desarrollar un procedimiento más eficaz para usar en el tratamiento y la prevención de recurrencia de diferentes formas clínicas de esclerosis múltiple y neuromielitis óptica.

Se ha sugerido previamente la administración de la combinación que comprende concentraciones terapéuticamente eficaces de EGF y el secretagogo GHRP-6 para la profilaxis y el tratamiento de tejidos dañados debido a déficit de suministro de sangre arterial (documento WO 02/053167).

Sumario de la invención

La presente invención se basa en un procedimiento en el que se representa la coadministración de EGF y GHRP-6 y un tratamiento mejorado para trastornos autoinmunitarios del SCN. Esta combinación protege de, y revierte, los daños asociados a autoinmunidad en procesos crónicos del SNC, particularmente en esclerosis múltiple y neuromeilitis óptica.

En comparación con cada ingrediente por separado, la combinación produce una eficacia de más duración y una reducción sustancial de recaídas; en otras palabras, activa eventos regenerativos de un modo más eficaz. Tal como se usa en el presente documento, "eficacia de más duración" significa que los ingredientes activos conducen a una mejora de los síntomas asociados a la EM o la NO durante un periodo de tiempo más largo, confiriendo incluso protección para evitar episodios de recaída. Esto asegurará la restauración de las funciones neurológicas afectadas como consecuencia de desmielización y perdidas neuronales por apoptosis/necrosis provocadas por el daño autoinmunitario. Por otra parte, los ingredientes activos de la combinación farmacéutica son proteínas y péptidos autólogos dotados de capacidades estimulantes de células reguladoras naturales, de modo que se estimularían para proliferarse después de la administración del péptido exógeno. De este modo, la respuesta autoinmunitaria puede contrarrestarse, ya que el papel regulatorio de los linfocitos T es para mediar constitutivamente la tolerancia inmunológica (Jörn G., Benedikt B., Bruno K. (2004) Medullary Epithelial Cells of the Human Thymus Express a Highly Diverse Selection of Tissue-specific Genes Colocalized in Chromosomal Clusters. J Exp Med 199(2):155-166.); (Dayne M., Christophe B. (2004) Back to Central Tolerance. Immunity 20:509-516); (Mark S.A., Emily S.V., Ludger K., Zhibin C., Stuart P.B., Shannon J.T. y col. (2002) Projection of an Immunological Self Shadow Within the Thymus by the Aire Protein. Science 298:1395-1400) (Shimon S. (2004) Naturally arising CD4+ regulatory T cells for immunologic self-tolerance and negative control of immune responses. Annual Review of Immunology 22:531-562).

Debido al efecto sinérgico entre el EGF y el GHRP-6 en relación con eventos neurotróficos/neurorregenerativos, esta combinación es útil en la aceleración de procesos neurogenerativos, ayudando en las funciones de recuperación de nervios motores y sensores perdidas por la lesión o el daño generado de modo autoinmunatario. La combinación del EGF y el GHRP-6 podría estar asociada con alguna terapia antioxidante.

La administración terapéutica de la combinación para la neurorregeneración y neuroprotección requiere unos esquemas de administración repetidos. Como se describe en la presente invención, el ingrediente activo denominado como EGF puede originarse en algunas especies animales, incluyendo la ovina, bovina, porcina y seres humanos, en su secuencia nativa o sus variantes y a partir de alguna fuente tal como sintética, natural o recombinante. La forma preferente en este caso es el EGF humano en su secuencia nativa, y la más preferente de todas es el EGF recombinante humano. El ingrediente activo denominado como péptido liberador de hormona del crecimiento (GHRP) es el hexapéptido que tiene la siguiente secuencia: His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2}, obtenido por síntesis química.

En un marco particular, las dosis terapéuticas que se administran durante las crisis de EM y la NO están en el intervalo de entre 5 y 200 \mug/kg/día para EGF y entre 0,5 y 350 \mug/kg/día para el GHRP-6 durante 20 a 30 días.

En otro marco de la presente invención, las dosis que se administran en las fases intercrisis para prevenir recaídas en esclerosis múltiple están en el intervalo entre 0,5 y 50 \mug/kg/día para cada uno de los ingredientes durante un periodo de hasta 130 días. La combinación debe administrarse como bolo. Las vías de administración serán parenterales, en venas periféricas, intramusculares o intraperitoneales. Los vehículos implicados en la administración incluyen solución salina normal, solución Ringer Lactato, plasma humano, solución de albúmina humana, dextrosa al 5%, solución de gelatina o las mezclas de los mismos.

Con la expectación de lograr la máxima eficacia terapéutica para esclerosis múltiple, en formas clínicas de remisión-recaída o progresiva secundaria, la primera administración debe realizarse coincidiendo con la etapa prodrómica de la enfermedad (de forma personalizada). En las fases de remisión, los esquemas terapéuticos sostenidos se proponen con las dosis citadas anteriormente como preventivas de las recaídas.

En otras formas clínicas de esclerosis múltiple se proponen esquemas de tratamiento sostenido que implican dosis terapéuticas.

En línea con otro marco de la presente invención, la combinación de EGF/GHRP-6 induce la proliferación de linfocitos T reguladores naturales y adaptativos que previenen la aparición de formas clínicas graves de EAE en experimentos de transferencia adoptiva.

La combinación de EGF/GHRP 6 puede usarse en una composición farmacéutica única o mezclando los ingredientes independientes justo antes de su uso. La combinación de ingredientes activos puede usarse mediante dispositivos de liberación lenta. Si la formulación se descongela, debe diluirse justo antes de su uso.

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Descripción detallada de realizaciones particulares/Ejemplos Ejemplo 1 Efecto terapéutico de la combinación farmacéutica de EGF/GHRP-6 en un modelo biológico de encefalitis autoinmunitaria experimental (EAE)

Para determinar la eficacia terapéutica de la combinación farmacéutica de EGF/GHRP-6 se estableció un modelo animal de EAE que representa la contrapartida de la enfermedad de la esclerosis múltiple en seres humanos.

Se inmunizaron ratas de Lewis hembra (130g) subcutáneamente con homogeneizado de médula espinal de cobaya (5mg) en PBS (50%) y coadyuvante de Freund completo (50%), durante los días 0 y 6. Diez días después de la primera inmunización, se inició el esquema terapéutico usando la combinación de EGF/GHRP-6 (200 \mug/kg/día - 740 \mug/kg/día), los ingredientes activos independientes EGF (200 \mug/kg/día), GHRP 6 (740 \mug/kg/día) y placebo (PBS). Este esquema terapéutico se siguió durante 10 días, usando administración intraperitoneal. Los registros clínicos se basaron en la siguiente escala: 0; sin síntomas, 1; parálisis del rabo, 2; parálisis de alguna de las extremidades posteriores, 3; parálisis completa de las extremidades posteriores, 4; parálisis completa de las extremidades posteriores y anteriores, 5; agonía o muerte. La pérdida de peso y la incontinencia en los esfínteres vesical y rectal, que son signos clínicos de la enfermedad, se registran añadiendo 0,5 al índice clínico descrito anteriormente. Cuarenta días después de la primera inmunización se anestesió y se eutanizó a los animales; el encéfalo y la médula espinal se procesaron para estudios histopatológicos (formalina al 10%, tinción con H y E y azul luxol). Para el análisis histopatológico se consideraron los siguientes parámetros: número y tamaño de infiltrados inflamatorios perivasculares, número de lesiones de desmielinación, número de neuronas apoptóticas y reactividad de células glial y astrocitos. El estudio microscópico se realizó de forma ciega.

Como se muestra en la tabla 1, la combinación de EGF/GHRP-6 protege a los animales inducidos experimentalmente a desarrollar EAE; sólo el 50% de estos animales desarrolló la forma más suave de la enfermedad, mientras que el resto permaneció inalterado. Por el contrario, en el resto de grupos la enfermedad tuvo un 100% de incidencia (grupos tratados con los ingredientes activos independientes y el placebo). El índice clínico medio en los animales tratados con la combinación de EGF/GHRP-6 fue de 0,37 \pm 0,47. Para los grupos tratados con ingredientes independientes el índice clínico medio fue 1,37 \pm 1,7 para el EGF y 1,5 \pm 1,6 para el GHRP-6, y el grupo tratado con placebo mostró un índice clínico medio de 1,7 \pm 1,4. Por cada grupo se asignaron ocho ratas. La comparación estadística entre los grupos fue p<0,001. Se usó el ensayo de comparación múltiple de Newman Keuls.

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TABLA 1 Resumen clínico del efecto terapéutico de ratas inducidas a desarrollar EAE

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Tal como se muestra en la tabla 2, los resultados del análisis de estudio patológico del encéfalo y la médula espinal de los animales incluidos en los diferentes grupos muestran que incluso existiendo la misma situación referente a astrocitos reactivos, el número (prueba t independiente, p=0,028) y tamaño del manguito vascular en animales tratados con EGF/GHRP-6 es inferior que en el grupo tratado con placebo.

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TABLA 2 Infiltrados inflamatorios perivasculares en el cerebro y la médula espinal de los animales

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Los experimentos demostraron que la combinación farmacéutica de EGF/GHRP protege a los animales de desarrollar formas clínicas graves de la enfermedad. Los mecanismos que subyacen a este efecto protector son la producción aumentada de mielina por oligodendrocitos y la subsiguiente remielinización de las estructuras nerviosas afectadas. Otro mecanismo está relacionado con la integridad de la BBB, para evitar el paso de células autorreactivas al parénquima cerebral.

Ejemplo 2 Efecto protector de la combinación farmacéutica de EGF/GHRP-6 en un esquema profiláctico de modelo animal de EAE

Para determinar el efecto profiláctico de la combinación de EGF/GHRP-6 en un modelo animal de EAE, que representa la enfermedad humana de esclerosis múltiple, se inmunizaron subcutáneamente ratas de Lewis hembra (130g) con homogeneizado de médula espinal de cobaya (5mg) en PBS (50%) y un coadyuvante de Freund completo (50%), los días 0 y 6. Diez días después de la primera inmunización se inició el esquema profiláctico usando la combinación de EGF/GHRP-6 (200 \mug/kg/día - 740 \mug/kg/día), los ingredientes activos independientes EGF (200 \mug/kg/día), GHRP-6 (740 \mug/kg/día) y placebo (PBS). Este esquema profiláctico se siguió durante 10 días (-10 a -1 día antes de la primera inmunización), usando la vía de administración intraperitoneal. Los registros clínicos se basaron en la siguiente escala: 0; sin síntomas, 1; parálisis del rabo, 2; parálisis de alguna de las extremidades posteriores, 3; parálisis completa de las extremidades posteriores, 4; parálisis completa de las extremidades posteriores y anteriores 5; agonía o muerte. La pérdida de peso y la incontinencia en los esfínteres vesical y rectal, que son signos clínicos de la enfermedad, se registran añadiendo 0,5 al índice clínico descrito anteriormente. Cuarenta días después de la primera inmunización se anestesió y se eutanizó a los animales; el encéfalo y la médula espinal se procesaron para estudios histopatológicos (formalina al 10%, tinción con H y E y azul luxol). Para el análisis histopatológico se consideraron los siguientes parámetros: número y tamaño de infiltrados inflamatorios perivasculares, número de lesiones de desmielinación, número de neuronas apoptóticas y reactividad de células glial y astrocitos. El estudio microscópico se realizó de forma
ciega.

Tal como se muestra en la tabla 3, la combinación farmacéutica de EGF/GHRP-6 que se usa en el esquema profiláctico protegió a los animales inducidos a desarrollar EAE. El cien por cien de los animales tratados con EGF/GHRP-6 desarrollaron una forma suave de la enfermedad (0,5-1 de registro clínico). Por contra, para los grupos tratados con los ingredientes únicos, el 75% desarrollo una forma clínica grave de EAE (3-4 de registro clínico). El índice clínico medio que se encontró para los animales tratados con la combinación farmacéutica de EGF/GHRP-6 fue
0,68 \pm 0,25. Para los grupos tratados con ingredientes únicos, los índices clínicos medios fueron 2,8 \pm 0,99 para el EGF y 2,7 \pm 1,03 para el GHRP-6 (P=0,0003 en comparación con los animales tratados con EGF/GHRP-6) y el grupo tratado con placebo mostró un índice clínico medio de 3 \pm 1,4 (p=0,0011 en comparación con los animales tratados con EGF/GHRP-6) Por cada grupo se usaron ocho ratas. Para la comparación estadística se usó la prueba T de Mann Whitney; comparando el grupo tratado con la combinación y el grupo de placebo se obtuvo un valor de p=0,0011 y para los grupos tratados con ingredientes activos independientes se obtuvieron valores de p=0,0003, en comparación con el grupo tratado con la combinación farmacéutica.

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TABLA 3 Resumen clínico del efecto terapéutico en ratas inducidas a desarrollar EAE

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Tal como se observa en la tabla 4, el análisis patológico del encéfalo y la médula espinal en los grupos experimentales muestra que incluso en el mismo caso de astrocitos reactivos, el número (prueba T independiente, p=0,025) y tamaño del manguito perivascular en animales tratados profilácticamente con EGF/GHRP-6 era menor e inferior que el grupo tratado con placebo.

TABLA 4 Infiltrados inflamatorios perivasculares en el cerebro y la médula espinal de los animales tratados profilácticamente

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Este experimento demostró que la combinación farmacéutica de EGF/GHRP-6 que se usa protege profilácticamente los animales de desarrollar EAE en su forma clínica más grave. Además, demostró una fuerte correlación entre la evolución clínica y los hallazgos histológicos. Los mecanismos que explican este efecto protector están relacionados con la inducción de diferenciación de células precursoras neuronales hacia oligodendrocitos que serán precondicionados y activos en la producción de mielina. La conservación de la integridad de la BBB prevendrá el paso de células autorreactivas hacia el parénquima cerebral; esto es otro evento que explica el papel protector de la combinación farmacéutica de EGF/GHRP-6 que se usa de modo preventivo.

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Ejemplo 3 Estudio de la dosis, sinergismo: potenciación entre los principios activos de la combinación farmacéutica

Buscando un intervalo de dosificación para la combinación farmacéutica que fuera eficaz para los efectos terapéuticos, ésta se usó en las ratas Lewis hembra (130g) del modelo de EAE mencionado anteriormente, que se inmunizaron subcutáneamente con homogeneizado de médula espinal de cobaya (5mg) en PBS (50%) y coadyuvante de Freund completo (50%), durante los días 0 y 6. Diez días después de la primera inmunización, se inició el esquema terapéutico usando la combinación de EGF/GHRP-6 en diferentes concentraciones

EGF/GHRP-6 (400 \mug/kg/día-1480 \mug/kg/día).

EGF/GHRP-6 (200 \mug/kg/día-740 \mug/kg/día).

EGF/GHRP-6 (100 \mug/kg/día-340 \mug/kg/día).

EGF/GHRP-6 (50 \mug/kg/día-170 \mug/kg/día).

EGF/GHRP-6 (25 \mug/kg/día-85 \mug/kg/día).

EGF/GHRP-6 (12 \mug/kg/día-40 \mug/kg/día).

Este esquema terapéutico se siguió durante 10 días, usando administración intraperitoneal. Los registros clínicos se basaron en la siguiente escala: 0; sin síntomas, 1; parálisis del rabo, 2; parálisis de alguna de las extremidades posteriores, 3; parálisis completa de las extremidades posteriores, 4; parálisis completa de las extremidades posteriores y anteriores 5; agonía o muerte. La pérdida de peso y la incontinencia en los esfínteres vesical y rectal, que son signos clínicos de la enfermedad, se registran añadiendo 0,5 al índice clínico descrito anteriormente. Cuarenta días después de la primera inmunización se anestesió y se eutanizó a los animales; el encéfalo y la médula espinal se procesaron para estudios histopatológicos (formalina al 10%, tinción con H y E y azul luxol). Para el análisis histopatológico se consideraron los siguientes parámetros: número y tamaño de infiltrados inflamatorios perivasculares, número de lesiones de desmielinación, número de neuronas apoptóticas y reactividad de células glial y astrocitos. El estudio microscópico se realizó de forma ciega.

En el grupo tratado con EGF/GHRP-6 (400 \mug/kg/día-1480 \mug/kg/día), el 25% de los animales permaneció inalterado y el 75% de los animales mostró una forma suave de la enfermedad (0,5-1). El índice clínico medio fue
0,62 \pm 0,44. En el grupo tratado con EGF/GHRP-6 (200 \mug/kg/día-740 \mug/kg/día), el 25% de los animales permaneció inalterado y el 75% de los animales mostró una forma suave de la enfermedad (0,5-1). El índice clínico medio fue
0,5 \pm 0,37.

En el grupo tratado con EGF/GHRP-6 (100 \mug/kg/día-340 \mug/kg/día), el 12,5% de los animales permaneció inalterado y el 87,5% de los animales mostró una forma suave de la enfermedad (0,5-1). El índice clínico medio fue
0,62 \pm 0,35.

En el grupo tratado con EGF/GHRP-6 (50 \mug/kg/día-170 \mug/kg/día), el 100% de los animales desarrollaron EAE, el 12,5% con una forma clínica intermedia (2) y el resto mostró una forma suave de la enfermedad (0,5-1). El índice clínico medio fue 0,93 \pm 0,49.

En el grupo tratado con EGF/GHRP-6 (25 \mug/kg/día-85 \mug/kg/día), el 100% de los animales desarrollaron EAE, el 37,5% con una forma clínica intermedia (2) y el resto mostró una forma suave de la enfermedad (0,5-1). El índice clínico medio fue 1,25 \pm 0,65.

En el grupo tratado con EGF/GHRP-6 (12 \mug/kg/día-40 \mug/kg/día), el 100% de los animales desarrollaron EAE, el 12,5% con la forma más grave (3), el 37,5% con una forma clínica intermedia (2) y el resto mostró una forma suave de la enfermedad (0,5-1). El índice clínico medio fue 1,37 \pm 0,87.

Las tablas 5 y 6 muestran los resultados clínicos y los histopatológicos. El análisis histopatológico mostró que no había diferencias estadísticas en el número de los infiltrados perivasculares linfocíticos en los grupos inducidos EAE tratados con EGF/GHRP-6 (400 \mug/kg-1480 \mug/kg, 200 \mug/kg-740 \mug/kg, 100 \mug/kg-340 \mug/kg, 50 \mug/kg-170 \mug/kg y 25 \mug/kg-85 \mug/kg). En el caso del grupo tratado con la combinación farmacéutica de EGF/GHRP-6 (12 \mug/kg-40 \mug/kg), el número de infiltrados perivasculares mostró una tendencia a ser superior (p=0,040), pero esta diferencia no fue estadísticamente significativa. Estos resultados demostraron que hay un intervalo de 50-400 \mug/kg/día para el EGF y de 170 \mug/kg/día- 1,4 mg/kg/día para el GHRP-6, que permite a la formulación de la combinación mantener su utilidad para la protección contra la inducción de EAE (Tabla 5).

TABLA 5 Resumen clínico de la respuesta a la dosificación y sinergismo: potenciación entre los ingredientes separados de la combinación de EGF/GHRP-6

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TABLA 6 Infiltrados inflamatorios perivasculares en el cerebro y la médula espinal de cada grupo experimental

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Ejemplo 4 Evaluación del efecto de la combinación farmacéutica de EGF-GHRP-6 en la generación de una respuesta de linfocitos T reguladores naturales

Se inmunizaron subcutáneamente veinte ratas Lewis hembra (130g) con homogeneizado de médula espinal de cobaya (5mg) en PBS (50%) y el coadyuvante de Freund completo (50%), los días 0 y 6. Diez días después de la primera inmunización, el esquema terapéutico se inició usando la combinación de EGF/GHRP-6 (200 \mug/kg/día-740 \mug/kg/día) y se siguió durante otros 10 días mediante su administración intraperitoneal en diez de las ratas inmunizadas (Grupo A). Las otras 10 ratas se trataron con placebo PBS (Grupo B). Una semana después de la última administración, los animales de ambos grupos se anestesiaron para el sangrado y de este modo se obtuvieron linfocitos mononucleares de sangre periférica. Los linfocitos procedentes de los grupos A y B se trataron para el segregado de linfocitos CD4+.

El análisis mediante FACS de los linfocitos CD4+CD25+ fue 14,67% en el grupo A y 3,8% en el grupo tratado con PBS (grupo B).

Otras ratas de Lewis hembra (130g) se inmunizaron subcutáneamente con homogeneizado de médula espinal de cobaya (5mg) en PBS (50%) y el coadyuvante de Lewis completo (50%), los días 0 y 6. Diez días después de la primera inmunización se transfirió de modo intravenoso adoptivamente un subgrupo (n=8) con 500.000 linfocitos CD4+ procedentes del grupo A. Otro subgrupo (n=8) se transfirió de modo intravenoso adoptivamente con 500.000 linfocitos CD4+ procedentes del grupo B.

Los registros clínicos se basaron en la siguiente escala: 0; sin síntomas, 1; parálisis del rabo, 2; parálisis de alguna de las extremidades posteriores, 3; parálisis completa de las extremidades posteriores, 4; parálisis completa de las extremidades posteriores y anteriores 5; agonía o muerte. La pérdida de peso y la incontinencia en los esfínteres vesical y rectal, que son signos clínicos de la enfermedad, se registran añadiendo 0,5 al índice clínico descrito anteriormente. Cuarenta días después de la primera inmunización se anestesió y se eutanizó a los animales; el encéfalo y la médula espinal se procesaron para estudios histopatológicos (formalina al 10%, tinción con H y E y azul luxol). Para el análisis histopatológico se consideraron los siguientes parámetros: número y tamaño de infiltrados inflamatorios perivasculares, número de lesiones de desmielinación, número de neuronas apoptóticas y reactividad de células glial y astrocitos. El estudio microscópico se realizó de forma ciega.

Tal como se muestra en la tabla 7, la transferencia de linfocitos CD4+ en animales inducidos a EAE y tratados con la combinación farmacéutica, protege al hospedador de desarrollar EAE. Solo el 50% de los animales transferidos con linfocitos CD4+ procedentes del grupo A desarrollaron una forma suave de EAE (0,5-1 de registro clínico), el restante 50% permaneció inalterado. Por el contrario, el 100% de los animales transferidos adoptivamente con linfocitos CD4+ procedentes del grupo B desarrollaron EAE, el 62,5% con la forma clínica grave (2-4 de registro clínico) y el 37,5% con una forma clínica suave (0,5-1 de registro clínico). El índice clínico medio fue 0,31 \pm 0,34 en el subgrupo transferido adoptivamente con CD4+ procedente del grupo A. El índice clínico medio fue 2,1 \pm 0,99 en el subgrupo transferido adoptivamente con CD4+ procedente del grupo B (P =0,0003). Se usó la prueba de Mann Whitney para el análisis estadístico.

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TABLA 7 Efecto protector de la transferencia de células adoptivas

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Como se muestra en la tabla 8, los análisis histológicos del encéfalo y la médula espinal en los grupos experimentales mostraron que incluso existiendo la misma situación en relación con astrocitos reactivos, el número (p=0,0001) y tamaño de los manguitos vasculares en las ratas hospedadoras para los CD4+ procedentes del grupo A son inferiores que en las ratas a las que se transfirió adoptivamente linfocitos CD4+ procedentes del grupo B.

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TABLA 8 Infiltrados inflamatorios perivasculares en el cerebro y la médula espinal de cada grupo experimental

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Estos resultados demostraron que el tratamiento con la combinación farmacéutica es capaz de inducir la proliferación de linfocitos T reguladores naturales que protegen del desarrollo de formas clínicas graves de EAE en experimentos de transferencia adoptivos.

Claims

1. Uso del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y del péptido liberador de hormona del crecimiento 6 (GHRP-6) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y mejora de trastornos del sistema nervioso central en un paciente que padece de un síntoma o complicación relacionada con desmielinización, degeneración neuronal y muerte celular neuronal por apoptosis o necrosis, en el que las enfermedades antes mencionadas tienen una etiología autoinmunitaria.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el EGF es EGF humano.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el EGF humano se obtiene a partir de una fuente natural, mediante tecnología recombinante o síntesis química.

4. Uso de acuerdo con una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 3, en el que el trastorno del sistema nervioso central es:

a. Esclerosis múltiple;

b. Neuromielitis óptica.

5. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la combinación de EGF-2GHRP-6 se administra intravenosa, intramuscular o intraperitonealmente o mediante el uso de un dispositivo de liberación controlada.

6. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el medicamento se administra parenteralmente en un esquema terapéutico durante un periodo de 20 a 30 días, en un intervalo de dosificación de entre 5 y 10 \mug de cada ingrediente independiente, por kilogramo de peso del cuerpo del paciente por día.

7. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el medicamento se administra parenteralmente durante las remisiones, durante un periodo de hasta 130 días, en un intervalo de dosificación de entre 1 y 5 \mug de cada ingrediente independiente, por kilogramo de peso del cuerpo del paciente por día.

8. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el medicamento induce la proliferación de linfocitos T reguladores naturales y adaptativos.