BRPI0504199B1

BRPI0504199B1 - Composições farmacêuticas baseadas em lopap e usos das ditas composições

Info

Publication number: BRPI0504199B1
Application number: BRPI0504199-6A
Authority: BR
Inventors: Marisa Chudzinski-Tavassi Ana; Falci Márcio; Augusto Maria Durvanei; Valença Reis Cleyson
Original assignee: Fundação de Amparo à Pesquisa da Estado de São Paulo- FAPESP
Priority date: 2005-09-08
Filing date: 2005-09-08
Publication date: 2018-02-06
Also published as: AU2006289678A1; BRPI0504199A; DK1937292T3; JP2009507046A; WO2007028223A1; US20090170182A1; JP5762670B2; BRPI0504199B8; AU2006289678B2; CA2621482C; CN101365472B; EP1937292B1; EP1937292A4; US8673840B2; CA2621482A1; EP1937292A1; CN101365472A

Abstract

composições farmacêuticas baseadas em lopap e usos das ditas composições a invenção se refere a composições farmacêuticas compreendendo: (a) uma quantidade profilática ou terapeuticamente eficaz de pelo menos um polipeptídeo substancialmente idêntico ao lopap (uma lipocalina com atividade de protease ativadora de protrombina), incluindo a forma recombinante, e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável. a invenção também se refere a composições cosméticas baseadas em lopap, incluindo a forma recombinante, a invenção se relaciona, em especial, aos usos das ditas composições como moduladores de morte celular programada (anti-apoptótico), vasodilatores por elevação de óxido nítrico e como agentes antienvelhecimento.

Description

(54) Título: COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS BASEADAS EM LOPAP E USOS DAS DITAS COMPOSIÇÕES (51) Int.CI.: A61K 38/48; A61P 17/00; A61K 8/64 (73) Titular(es): FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DA ESTADO DE SÃO PAULO-FAPESP. ANA MARISA CHUDZINSKI-TAVASSI. BIOLAB SANUS FARMACÊUTICA LTDA.

(72) Inventor(es): ANA MARISA CHUDZINSKI-TAVASSI; MÁRCIO FALCI; DURVANEI AUGUSTO MARIA; CLEYSON VALENÇA REIS

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COMPOSIÇÃO

COSMÉTICA E SEUS USOS

Campo da Invenção [0001] A presente invenção refere-se a composições farmacêuticas baseadas em uma protease ativadora de protrombina (Lopap), incluindo sua forma recombinante, e ao seu uso como modulador de morte celular programada (antiapoptótico), vasodilator por elevação de óxido nítrico e como agente antienvelhecimento.

Fundamentos da Invenção [0002] O gênero Lonomia é conhecido por provocar um quadro de envenenamento sistêmico decorrente da inoculação de seu veneno através da pele, com consequentes manifestações hemorrágicas de intensidade variável, acarretando risco de vida em alguns casos (Lorini, LM. A taturana: aspectos biológicos e morfológicos da Lonomia obliqua. Passo Fundo: EDIUPF, 1999, páginas 25-35) . A espécie Lonomia obliqua Walker (Lemaire C. Revision du genre Lonomia Walker (Lep Attacidae). Ann Soc Entomol Fr 1972:8:767-861) provoca desde 1989, em dimensões epidêmicas, acidentes em áreas restritas no sul do Brasil (Rio Grande do Sul, Santa Catarina e Paraná) (Brasil. Ministério da Saúde. Fundação Nacional de Saúde, Acidentes por lepdópteros. In: Manual de diagnóstico e tratamento de acidentes por animais peçonhentos, Brasília, 1998, página 131).

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2/46 [0003] Os pacientes acidentados, entre outros sintomas, apresentam, principalmente após um período que pode variar entre 1 e 48 horas, um quadro de discrasia sanguínea (alteração na proporção dos elementos do sangue), acompanhada ou não de manifestações hemorrágicas que podem inclusive levar ao óbito (Kelen, EMA e outros Hemorrhagic syndrome induced by contact with caterpillars of the genus Lonomia (Saturniidae, Hemoleucinae). J. Toxicol-Toxin Rev., 1995; 14:283-308; Brasil, 1998).

[0004] Zannin e colaboradores (Zannin M e outros. Blood coagulation and fibrinolitic factors in 105 patients with hemorrhagic syndrome caused by accidental contact with Lonomia obliqua caterpillar in Santa Catarina, southern Brazil. Thromb Haemost, 89:355-364, 2003) determinaram os parâmetros de coagulação e fibrinólise no plasma de 105 pacientes e verificaram, corroborando alguns dados já existentes, que o acidente afeta os mecanismos de coagulação e fibrinólise. Estes resultados indicaram uma intensa coagulopatia de consumo que pode ser atribuída a componentes do veneno presentes nas cerdas das lagartas Lonomia obliqua, e que possuem potente ação procoagulante, ocasionando ativação secundária da fibrinólise (Zannin, M. e outros, 2003).

[0005] O veneno da taturana Lonomia obliqua possui alguns componentes que interferem no sistema de coagulação. No extrato de cerdas de L. obliqua já foi descrita a presença de ativadores de protrombina e de Fator X (Donato JL e outros. Lonomia obliqua Caterpillar Spicules Trigger Human Blood Coagulation via Activation of Factor X and

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Prothrombin. Thromb. Haemost 1998; 79: 539-42; Kelen e outros, 1995).

[0006] Os autores da presente invenção, anteriormente, isolaram e caracterizaram uma protease ativadora de protrombina de 69 kDa, denominada Lopap (Lonomia obliqua prothrombin activator protease), com características de serinoproteases e atividade procoagulante em ratos, exaurindo o sangue de fibrinogênio e alterando em apenas 30% o número de plaquetas, porém inibindo completamente a função de agregabilidade das plaquetas induzida por colágeno por elevação dos níveis de PGI2.

[0007] No documento BR PI 0200269 é descrita a atividade dessa protease ativadora de protrombina.

[0008] Quando injetado em ratos via intraperitoneal em altas concentrações (> 100 gg/kg), a Lopap desenvolve trombos em vênulas e arteríolas e a migração de polimorfonucleares para pulmões e rins (Reis CV e outros. A Ca⁺⁺ activated serine protease (Lopap) could be responsible for the haemorragic syndrome caused by the caterpillar Lonomia obliqua. Lancet 1999, 353: 1942; Reis CV e outros.

In vivo Characterization of Lopap, a Prothrombin Activator Serine Protease from the Lonomia obliqua Caterpillar Venom. Thromb. Res 2001. 102: 437-43; Reis CV e outros. A prothrombin activator serine protease from the Lonomia obliqua caterpillar venom (Lopap): biochemical characterization. Thromb Res, 2001, 102:427-436).

[0009] Verificou-se também que, em concentração de 2,5 gg/ml, a Lopap atua em células endoteliais (HUVECs), agindo

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4/46 como um indutor da expressão das moléculas de adesão como ICAM-1 e E-selectina, porém sem expressar VCAM, e induzindo também o aumento de IL-8 e de PGI₂. A não expressão de VCAM sugere que a ação do Lopap não se compara à do TNF-α ou da trombina sobre células endoteliais. O PGI₂, em alta concentração, pode também atuar como antiagregante plaquetário. Adicionalmente, deve ser mencionado que a Lopap não tem a capacidade de modular a expressão de mediadores envolvidos nos sistemas de coagulação e fibrinólise como o fator tissular (TF), fator de von Willebrand (vWF) e ativador de plasminogênio tecidual (tPA).

[0010] Foi verificado também que a trombina produzida pelo Lopap é funcional e é inibida por Antitrombina III (AT), sendo capaz de agregar plaquetas, coagular plasma e fibrinogênio, o que sugere que essa protease é semelhante à α-trombina (Chudzinski-Tavassi AM e outros. Effects of Lopap on Human Endothelial Cells and Platelets. Haemostasis 2001; 31:257-265).

[0011] O extrato de cerdas de L. obliqua é efetivo na prevenção experimental de trombose venosa em ratos (Prezoto BC e outros. Antithrombotic effect of Lonomia obliqua caterpillar bristle extract on experimental venous thrombosis. Braz J Med Biol Res 2002; 35(6): 703-12), justificando os estudos que utilizam frações purificadas do veneno para elucidar os mecanismos deste efeito.

[0012] É ainda conhecida a forma recombinante da protease ativadora de protrombina de Lonomia obliqua. No

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5/46 documento BR PI 0403882-7 é descrita a obtenção dessa protease.

[0013] Avaliando-se a estrutura da Lopap obtida na forma recombinante, verificou-se que ela apresenta, em média, 35% de identidade com proteínas da família das lipocalinas.

[0014] As lipocalinas constituem uma família de proteínas que têm a função de armazenar e transportar compostos orgânicos hidrofóbicos e/ou quimicamente sensíveis. Essas proteínas têm a capacidade de se ligarem a moléculas, por exemplo, presentes na fisiologia humana (principalmente hidrofóbicas como o retinol) por possuírem uma região hidrofóbica do tipo β-barrel (oito fitas antiparalelas), composta de uma cavidade interna e de loops externos (em número de quatro) contendo sítios de ligação a diferentes ligantes (ver, por exemplo, US 20040084867 e US 20050069877). A diversidade dessas cavidades e loops dão a cada proteína a capacidade de acomodar ligantes de diferentes tamanhos, formas e características químicas (Flower, DR e outros. The lipocalin protein family: structural and sequence overview. Biochim Biophys Acta 1482: 9-24, 2000).

[0015] A potencialidade proporcionada por essa classe de proteínas ofereceu a oportunidade de alcançar um objetivo tão buscado, historicamente, pelo homem que é o prolongamento da vida média das células.

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Sumário da Invenção [0016] O objeto da presente invenção é prover meios de modulação da morte celular programada (apoptose) ou a causada por agentes externos, tal como infecções.

[0017] Em uma primeira concretização é provida uma composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender:

(a) uma quantidade profilática ou terapeuticamente eficaz de pelo menos um polipeptídeo substancialmente idêntico ao Lopap e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0018] Em outra concretização da presente invenção, é provida uma composição farmacêutica compreendendo:

(a) uma quantidade profilática ou terapeuticamente eficaz de pelo menos um polipeptídeo substancialmente idêntico ao rLopap; e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0019] A presente invenção também provê o uso de pelo menos um polipeptídeo substancialmente idêntico ao Lopap como agente antiapóptico em processos biotecnológicos.

[0020] Preferencialmente, a presente invenção provê o uso de um polipeptídeo substancialmente idêntico à sequência do rLopap, representado na SEQ ID NO:1, como agente antiapóptico em processos biotecnológicos.

[0021] Em outra concretização, a presente invenção também provê o uso de pelo menos um polipeptídeo substancialmente idêntico ao Lopap como agente prolongador

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7/46 da vida-média de células animais ou vegetais ou de células envolvidas em processos biotecnológicos ou bioenergéticos.

[0022] Em uma outra concretização, a presente invenção provê o uso de um polipeptídeo substancialmente idêntico à sequência do rLopap, representada pela SEQ ID NO:1, como agente prolongador da vida-média de células animais ou vegetais ou células envolvidas em processos biotecnológicos ou bioenergéticos.

[0023] Adicionalmente, a presente invenção provê uma composição cosmética caracterizada pelo fato de compreender:

(a) uma quantidade cosmeticamente eficiente de pelo menos um polipeptídeo substancialmente idêntico ao Lopap ou ao rLopap e (b) um veículo cosmeticamente aceitável.

[0024] Os detalhes de uma ou mais concretizações das invenções são apresentadas na descrição a seguir. Outros aspectos, objetos e vantagens das concretizações ficarão evidentes a partir da descrição a seguir e reivindicações anexas.

Breve Descrição das Figuras [0025] A Figura 1 mostra o perfil da proteína Lopap, purificada por um processo compreendendo uma etapa de cromatografia por gel-filtração e duas etapas de cromatografia de fase reversa, apresentando uma única banda de peso molecular de 69 kDa, determinado por análise SDSPetição 870160026000, de 06/06/2016, pág. 20/91

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PAGE. O dito perfil corresponde à Figura 1D do documento de patente PI 0200269-8.

[0026] A Figura 2 ilustra a atividade da proteína Lopap no substrato Abz-YQTFFNPRTFGSQ-EDDnp (deduzido a partir da molécula de protrombina), substrato esse que foi hidrolizado em dois sítios Phe-Phe(10%) e Arg-Thr(90%). O perfil ora apresentado corresponde ao da Figura 3 do documento de patente PI 0200269-8.

[0027] A Figura 3 ilustra o efeito do rLopap em cultura de HUVECs. As HUVECs foram incubadas durante 48 h em meio RPMI contendo 1% de SFB com: A) Controle sem a indução da apoptose B) Controle com 1% de SFB C) rLopap 5pg/ml D) Lopap nativo 5pg/ml.

[0028] A Figura 4 mostra a viabilidade celular. As HUVECs (1x10⁴) foram incubadas com meio RPMI suplementado com FBS 1% sem controle ou com Lopap. Um ensaio de MTT foi realizado após 48 h. A porcentagem de células viáveis foi expressa como a proporção de células não tratadas.

[0029] A Figura 5 mostra a liberação de Prostaglandina I2. As HUVECs foram incubadas durante 1h em meio de cultura RPMI 1640 na ausência (controle negativo) ou presença das metaloproteases. A concentração de PGI2 foi determinada no sobrenadante pelo acúmulo do metabólito 6-keto-PGF_1a no meio de cultura medida por ensaio imunoenzimático competitivo. *p<0,05 vs controle. Os valores indicam a X ± ES de 3 experimentos independentes.

[0030] A Figura 6 ilustra a liberação de Óxido Nítrico. As HUVECs foram incubadas durante 1h em meio de cultura HAM

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F12 na ausência (controle negativo) ou presença de Lopap ou r-Lopap. A concentração de NO foi determinada no sobrenadante após a redução de nitrato e nitrito a NO, detectado por quimioluminecência em fase gasosa após reação com ozônio. *p<0,05 vs controle. Os valores indicam a X ± ES de 5 experimentos independentes.

[0031] A Figura 7 mostra um gel de agarose 1% com o perfil eletroforético do RNA das HUVECs estimuladas em meio RPMI (10% SFB), 1- RNA de células controle, não estimuladas, 2- RNA de células estimuladas com 5U/ml de Trombina, 3- RNA de células estimuladas com TNFa 5ng/ml, 4RNA de células estimuladas com LPS 5pg/ml, 5- RNA de células estimuladas com Lopap 10pg/ml e 6- RNA de células estimuladas com rLopap 10 pg/ml.

[0032] A Figura 8 apresenta a expressão de GAPDH por RTPCR em HUVECs (10% SFB), 1 Controle, células não estimuladas, 2- Células estimuladas com Trombina 5U/ml, 3Células estimuladas com TNFa 5ng/ml, 4 - Células estimuladas com LPS 5pg/ml, 5- Células estimuladas com Lopap 10pg/ml e 6- Células estimuladas com rLopap 10 pg/ml.

[0033] A Figura 9 apresenta a expressão de Bcl-2 por RTPCR em HUVECs em meio RPMI (10% SFB) A) Gel de agarose 2%, 1- Controle, células não estimuladas, 2- Células estimuladas com Trombina 5U/ml, 3- Células estimuladas com TNFa 5ng/ml, 4 - Células estimuladas comLPS 5pg/ml, 5Células estimuladas com Lopap 10pg/ml e 6- Células estimuladas com rLopap 10 pg/ml. B) Expressão do gene alvo Bcl-2, versus o gene controle GAPDH, frente aos diferentes estímulos.

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10/46 [0034] A Figura 10 apresenta a expressão de Bax em HUVECs com meio RPMI (10% SFB) A) Gel de agarose 2%,1Controle, células não estimuladas, 2- Células estimuladas com Trombina 5U/ml, 3- Células estimuladas com TNFa 5ng/ml, 4 - Células estimuladas com LPS 5qg/ml, 5- Células estimuladas com Lopap 10qg/ml e 6- Células estimuladas com rLopap 10 qg/ml. B) Expressão do gene alvo Bax, versus o gene controle GAPDH, frente aos diferentes estímulos.

[0035] A Figura 11 mostra a fração de área (%) de fibronectina expressa pelos fibroblastos tratados com rLopap (1 e 5 qg) e comparado ao grupo controle.

[0036] A Figura 12 apresenta a fração de área (%) de tenascina expressa pelos fibroblastos tratados com rLopap (1 e 5 qg) e comparado ao grupo controle.

[0037] A Figura 13 ilustra a imunofluorescência indireta para Fibronectina em: A) fibroblastos humanos normais (grupo controle); B) fibroblastos humanos normais cultivados na presença de 1qg de rLopap, C) fibroblastos humanos normais cultivados na presença de 5qg de rLopap.

[0038] A Figura 14 ilustra a imunofluorescência indireta para tenascina em: A) fibroblastos humanos normais (grupo controle); B) fibroblastos humanos normais cultivados na presença de 1qg de rLopap, C) fibroblastos humanos normais cultivados na presença de 5qg de rLopap.

[0039] A Figura 15 mostra: (A) pele tratada. (B) pele controle. Observar a presença de quantidade semelhante de núcleos de fibroblastos na derme tratada e controle. HE

120X.

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11/46 [0040] A Figura 16 mostra: (A) pele tratada. (B) pele controle. Observar a presença de quantidade semelhante de núcleos de fibroblastos na derme tratada e controle. Na pele controle há a presença de algumas células.

[0041] A Figura 17 apresenta a fotomicrografia da epiderme dos animais tratados com rLopap, (A) pele tratada. (B) pele controle. Observa-se presença de quantidade semelhante de núcleos de fibroblastos na derme.

[0042]	A Figura 18	mostra	a
Tipo III ·	- Grupo 1.
[0043]	A Figura 19	mostra	a
Tipo III	- Grupo 2.
[0044]	A Figura 20	mostra	a
Tipo III	- Grupo 3.
[0045]	A Figura 21	mostra	a
Tipo III	- Grupo 4.
[0046]	A Figura 22	apresenta
dos animais tratados	com rLopap
colágenas	densas (setas).

fração da área de colágeno fração da área de colágeno fração da área de colágeno fração da área de colágeno fotomicrografias da derme (340X). Observa-se fibras [0047] A Figura 23 ilustra a análise da imunogenicidade do LOPAP - Placas de poliestireno foram sensibilizadas com 100 μl de rLopap (10 μg/ml) e incubadas com diluições crescentes dos soros-teste (soros de coelhos normal e antiLOPAP). A reação foi desenvolvida com o conjugado específico, marcado com peroxidase (1:3000), seguida da adição de OPD e H2O2. As densidades óticas foram determinadas a 492 nm.

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Descrição Detalhada da Invenção [0048] Primeiramente, são fornecidas algumas definições que visam a delimitar o escopo da presente invenção e facilitar a compreensão das mesmas como detalhadamente descritas e reivindicadas.

[0049] “Sub stancialmente idêntico, no contexto de dois ou mais peptídeos, se refere a duas ou mais sequências ou sub-sequências que possuem pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, 95% ou maior identidade de resíduos de aminoácidos, quando comparados ou alinhados para correspondência máxima, como medido através do uso de um algoritmo de comparação de sequência, como, por exemplo, o algoritmo BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)), o algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), o algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), por busca de similaridade pelo método de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), por implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Pacote de Software da Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.).

[0050] “Lopap significa a protease ativadora de protrombina de Lonomia obliqua, de ocorrência natural, apresentando o perfil da Figura 1, após purificação por um processo compreendendo uma etapa de cromatografia por gelfiltração e duas etapas de cromatografia de fase reversa;

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13/46 mostrando uma única banda de peso molecular de 69 kDa, determinado por análise SDS-PAGE; tendo uma atividade correspondente ao perfil da Figura 2, obtido por análise da proteína Lopap no substrato Abz-YQTFFNPRTFGSQ-EDDnp (deduzido a partir da molécula de protrombina), substrato esse que foi hidrolizado em dois sítios Phe-Phe(10%) e ArgThr(90%).

[0051] rLopap significa a protease ativadora de protrombina recombinante, na forma monomérica, definida no documento PI 0403882-7, representada pela SEQ ID NO:1.

[0052] Veículo farmaceuticamente aceitável” se refere a um material selecionado do grupo consistindo de: espessantes não-tóxicos sólidos, semi-sólidos ou líquidos; diluentes, material de encapsulamento ou auxiliar de formulação de qualquer tipo.

[0053] Veículo e/ou excipiente cosmeticamente aceitável” se refere a um material selecionado do grupo consistindo de: espessantes não-tóxicos sólidos, semisólidso ou líquidos, diluentes, substância com propriedades de filtro de radiação UV, perfumes, bases cosméticas ou auxiliar de formulação de qualquer tipo de produto cosmético.

[0054] Como mencionado anteriormente, no documento PI 0200269-8 é descrita, pela primeira vez, a atividade ativadora de protrombina da proteína Lopap e o potencial desfibrinogenante que a mesma possui sem haver alteração do número de plaquetas.

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14/46 [0055] Em linhas gerais, o documento PI 0200269-8, descreve um processo de purificação de proteínas solúveis das cerdas da Lonomia obliqua, com atividade ativadora de protrombina, bem como o processo para a determinação parcial da sequência de aminoácidos do referido ativador de protrombina e processo de determinação dessa atividade ativadora de protrombina da fração II e do ativador de protrombina e o uso de dito ativador como agente desfibrinogenante e como agente reativo na determinação de protrombina no plasma de pacientes em estado hemorrágico.

[0056] No documento PI 0200269-8 foram determinadas as características físico-químicas e biológicas do Lopap. A Figura 1 mostra o perfil da proteína Lopap, purificada por um processo compreendendo uma etapa de cromatografia por gel-filtração e duas etapas de cromatografia de fase reversa, apresentando uma única banda de peso molecular de 69 kDa, determinado por análise SDS-PAGE. O dito perfil corresponde à Figura 1D do documento de patente PI 02002698. Adicionalmente, a Figura 2 ilustra a atividade da proteína Lopap no substrato Abz-YQTFFNPRTFGSQ-EDDnp (deduzido a partir da molécula de protrombina), substrato esse que foi hidrolizado em dois sítios Phe-Phe(10%) e ArgThr(90%). O perfil ora apresentado corresponde ao da Figura 3 do documento de patente PI 0200269-8.

[0057] No documento PI 02000269-8 também foi demonstrado que o Lopap pode ser caracterizado como uma serinoprotease ativada por íons Ca²⁺, sendo, no entanto, estruturalmente diferente de outros ativadores de protrombina que estão descritos na literatura. A porção N-terminal do Lopap

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15/46 apresentou 45,6% de identidade em comparação com a porção N-terminal da insecticianina da hemolinfa de Manduca sexta, e os Fragmentos I, II, III e IV mostraram uma identidade de 36,4%, 37,5%, 42,9% e 55,5%, respectivamente, com os correspondentes fragmentos internos da mesma proteína (insecticianina da hemolinfa de Manduca sexta).

[0058] O documento PI 02000269-8 se detém na atividade ativadora de protrombina do Lopap e sua importância no controle da coagulação do sangue, na medida que a redução da concentração de fibrinogênio permite aumentar a duração do tempo de coagulação e, ao mesmo tempo, evitar o risco de séria trombose vascular.

[0059] Adici onalmente, no documento PI0403882-7 é descrito um processo de obtenção da protease recombinante ativadora de protrombina (rLopap) na forma monomérica e sua sequência de aminoácidos, bem como sua utilização como agente desfibrinogenante e como um componente de um kit diagnóstico para desprotrombinemias.

[0060] Com base na constatação de que o Lopap hidrolisa a protrombina, produzindo a pretrombina-2 como intermediário, e de que este tipo de fragmentação promove a formação de trombina mais lentamente, o que facilita seu controle e impedimento da sua ação, foi agora verificado que o Lopap também promove respostas celulares a nível endotelial, tais como a expressão de NO e de PGI2.

[0061] Foi também confirmado que o Lopap é diferente de outros ativadores conhecidos de protrombina obtidos a partir de venenos, pois, além de modular respostas de agregação plaquetária, possui características que o

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16/46 capacitam a interferir na duração da vida celular. Desse modo, o Lopap torna-se especialmente vantajoso por apresentar propriedades importantes para usos terapêuticos e profiláticos e, além disso, a sua forma recombinante é de fácil obtenção.

[0062] Por se tratar de uma molécula com domínios estruturais conservados de lipocalina, o Lopap foi analisado sobre cultura de células (HUVECs, fibroblastos).

[0063] Os efeitos do rLopap na proliferação, apoptose, liberação de NO e PGI₂ em HUVECs foram analisados com vistas a se determinar o nível de influência dessa proteína na modulação da morte celular programada ou causada por agentes externos. Foi verificado que surpreendentemente o rLopap preveniu da apoptose nas células testadas e inclusive aumentou a proliferação das mesmas. Em HUVECs, além de prevenir da apoptose ele induz aumento de concentrações de NO e PGI2. De acordo com estes dados podese inferir que o Lopap desempenha uma função importante na sobrevida celular, podendo prolongar a vida de diferentes células.

[0064] Esse resultado é reforçado pelo conhecimento de que algumas lipocalinas específicas têm sido utilizadas em diagnóstico de diferentes doenças e alguns estudos têm sido desenvolvidos com as mesmas. Tendo em vista que proteínas da família das lipocalinas são carreadores de lipídeos bem como do retinol, elas podem ser associadas a mecanismos dependentes de transdução de sinal.

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17/46 [0065] Desta forma, os resultados de antiapoptose e de proliferação induzidos pelo rLopap sobre células endoteliais parecem estar envolvidos com a modulação que esta proteína, também um membro das lipocalinas, deve estar realizando a nível nuclear.

[0066] Estes resultados sugerem que o rLopap pode se constituir em um complemento importante para ser usado em processos biotecnológicos que envolvam culturas celulares, podendo prolongar a vida e também proteger as células de efeitos citotóxicos, aumentando o rendimento de processos produtivos.

[0067] Foi encontrada na literatura uma referência que mostra que a suplementação de meios de cultura com hemolinfa da Lonomia oblíqua promove o aumento do crescimento e da longevidade de células Sf-9 (Souza AP e outros. Purification and characterization of an antiapoptotic protein isolated from Lonomia obliqua hemolymph. Biotechnol Prog.; 21:99-105, 2005). Os mesmos autores comentam que na hemolinfa da L. obliqua encontraram frações com potencial antiapoptótico e hidrólise de sacarose. No entanto, não há qualquer referência aos agentes reativos envolvidos nesse resultado.

[0068] Dessa maneira, a presente invenção baseia-se na demonstração de que o Lopap e a sua forma recombinante desempenham um papel importante no controle da morte celular programada, ou seja, possuem atividade antiapóptica, tendo em vista que muitos componentes da hemolinfa são comuns ao extrato de cerdas de Lonomia oblíqua.

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18/46 [0069] Adicionalmente, relacionando as lipocalinas com o efeito antiapoptótico molécula foi analisada sobre cultura humanos.

propriedades das do Lopap, esta de fibroblastos [0070] Para facilitar a compreensão dos testes apresentados mais adiante, é importante apresentar a seguir, de forma resumida, alguns aspectos das células e tecidos humanos.

[0071] A derme humana normal forrada por fibroblastos é composta de uma matriz extracelular do tecido conjuntivo. Três componentes principais têm sido reconhecidos como contribuintes para as propriedades fisiológicas da pele, as fibras de colágeno, uma proteína de matriz abundante que contribui com 80% do peso seco da pele, e um agente responsável pela força tensil da derme e também pela proteção com relação aos traumatismos externos.

[0072] As fibras elásticas, que contribuem com 2%-4% de matriz extracelular (em peles protegidas do sol), provêem elasticidade à pele (Uitto J. Biochemistry of the elastic fibers in normal connective tissues and its alterations in disease. J Invest Dermatol 72:1-10, 1979); os glicosaminoglicanos, geralmente em quantidade pequena tal como 0,1% a 0,3% do peso seco do tecido, desempenham um papel importante na hidratação da pele em razão da grande capacidade de retenção de água do ácido hialurônico (Davidson EA. Polysaccharide structure and metabolism. In: Montagna W(ed). Aging: Biology of skin. Oxford. Pergamon Press, 1965, pp 255-270). Assim, os processos que alteram esta proporção relativa destes componentes, ou processos

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19/46 degradativos que tornem estas moléculas não funcionais, podem resultar em manifestações clínicas importantes para o tecido cutâneo como, por exemplo, a atrofia e perda de elasticidade.

[0073] O componente elástico do tecido conjuntivo está organizado numa rede tridimensional de fibras responsáveis pela elasticidade de vários tecidos. A quantidade, distribuição e organização estrutural das fibras elásticas variam em diferentes órgãos, sendo numerosas em tecidos que sofrem estiramento como a aorta, o pulmão, a pele e os ligamentos elásticos. As fibras colágenas se agrupam em um arranjo paralelo, como feixes de fibras colágenas.

[0074] As fibras colágenas são acidófilas corando-se de róseo pela técnica da hematoxilina-eosina, de azul pelo tricrômio de Mallory e de verde pelo reagente de Masson. Elas são constituídas por uma escleroproteína, o colágeno, que é composto por aminoácidos, sendo que a glicina aparece na proporção de 33,5%, a prolina na proporção de 12% e a hidroxiprolina em 10%.

[0075] As fibras elásticas são constituídas estruturalmente por dois componentes distintos que são a elastina e as microfibrilas. A fibrinogênese normal é controlada pela síntese e interação balanceada desses componentes. As microfibrilas são lançadas ao meio extracelular por fibroblastos, células mesenquimais e outras que com a sua agregação subsequente, formam uma estrutura de sustentação da fibra elástica, onde é depositada a elastina. Essa estrutura básica é que indica a forma e a direção da futura fibra elástica; Ross R. The

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20/46 elastic fiber. A review

p.199-208, 1973; Ross R elastic fibers. Adv. Exp.

J. Histochem. Cytochem., v.21, e outros. The morphogenesis of

Med. Biol., v.79, p.7-17, 1977).

[0076] Como mencionado anteriormente, a presente invenção baseia-se na constatação de que o Lopap e a sua forma recombinante permitem a modulação da morte celular programada.

[0077] Em uma das concretizações da presente invenção, as composições farmacêuticas compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um polipeptídeo que é, de preferência, pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, ainda mais preferencialmente pelo menos 95% idêntico ao Lopap caracterizado por apresentar o perfil da Figura 1, após purificação por um processo compreendendo uma etapa de cromatografia por gel-filtração e duas etapas de cromatografia de fase reversa, mostrando uma única banda de peso molecular de 69 kDa, determinado por análise SDS-PAGE; e ter uma atividade correspondente ao perfil da Figura 2, obtido por análise da proteína Lopap no substrato AbzYQTFFNPRTFGSQ-EDDnp (deduzido a partir da molécula de protrombina), substrato esse que foi hidrolizado em dois sítios Phe-Phe(10%) e Arg-Thr(90%).

[0078] Em uma outra concretização da presente invenção, as composições farmacêuticas compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um polipeptídeo que é, de preferência, pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, ainda

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21/46 mais preferencialmente pelo menos 95% idêntico ao rLopap representado pela SEQ ID NO:1.

[0079] As composições da presente invenção são formuladas, de maneira consistente com a boa prática médica, levando em consideração a condição clínica do paciente (especialmente os efeitos colaterais do tratamento com o(s) peptídeo(s) ou polipeptídeo da invenção), o local de liberação, o método de administração, o esquema de administração e outros fatores conhecidos dos especialistas no assunto. Assim, para as finalidades da presente invenção, a “quantidade eficaz” é determinada de acordo com tais considerações.

[0080] As composições da presente invenção podem ser administradas de várias maneiras, tais como a oral, parenteral, tópica, spray nasal, dentre outras.

[0081] Em geral, a quantidade total farmaceuticamente eficaz do(s) polipeptídeo, de acordo com a invenção, administrado(s) parenteralmente, por dose, pode estar na faixa de 1pg/kg/dia até 100mg/kg/dia com referência ao peso corporal do paciente.

[0082] Outros esquemas de administração parenteral são possíveis, como, por exemplo, infusão subcutânea contínua ou semi-contínua, dependendo do tratamento a ser seguido e/ou das respostas ao mesmo ou dos efeitos desejados. O termo “parenteral” é aqui usado para modos de administração que incluem injeção intravenosa, intramuscular, intradérmica, subcutânea e intra-articular e a infusão.

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22/46 [0083] Mais preferencialmente, as composições da presente invenção são de uso tópico, na forma de pós, pomadas, géis, cremes, adesivos e outros.

[0084] As composições da presente invenção podem ser de uso tópico, na forma de pós, pomadas, géis, cremes, adesivos e outros.

[0085] A composição cosmética da invenção pode conter: umectantes, tal como glicerol; glicóis, tal como etileno glicol, propileno glicol; emulsificantes tais como álcoois C₁-C₅, opcionalmente álcoois poliídricos parcialmente esterificados com ácidos graxos de cadeia longa C12-C24, tal como o monoestearato de glicerol, miristato de isopropila, éster de ácido graxo de álcoois de açúcar, tal como o monoester de ácido graxo de sorbitana, derivados polioxialquilados de tais compostos, éster de ácido graxo de polietoxietileno, colesterol, estearil álcool de cetila, álcoois de cera de algodão e tensoativos sintéticos com baixo valo de HLB; modificadores de reologia tal como carbopol ou outros polímeros sintéticos ou naturais, parafinas de baixa viscosidade, ésteres de álcoois emolientes, triglicerídeos, substâncias lipofílicas, tal como miristato de isopropila; reguladores de pH, tal como TEA, carbonatos ou fosfatos; agentes quelantes, tal como EDTA e seus sais, assim como conservantes. Adicionalmente, a composição cosmética pode conter, ainda, substâncias com propriedades de filtro UV, pigmentos ou corantes, vitaminas, essências e outros adjuvantes normalmente usados em composições de aplicação tópica.

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23/46 [0086] A composição da presente invenção pode, ainda, ser do tipo “sistemas de liberação controlada”, os quais incluem matrizes de polímeros semipermeáveis, na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. A matriz de polímero inclui polilactídeos (ver US 3773919 e EP 58481), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-Lglutamato (ver, por exemplo, EP 133,988).

[0087] A escolha do material de matriz é feita com base na biocompatibilidade, biodegradabilidade, propriedades mecânicas, aparência estética e propriedades de interface. A aplicação particular das composições da presente invenção vai definir a formulação apropriada. Em algumas aplicações, pode ser útil a adição de um agente sequestrante, tal como a carboximetil celulose para evitar a dissociação das composições do(s) polipeptídeo(s) da matriz.

[0088] De forma apropriada, o veículo pode conter quantidades menores de aditivos tais como substâncias que melhoram a isotonicidade e a estabilidade química. Tais materiais incluem tampões como fosfato, succinato, citrato, ácido acético bem como outras substâncias orgânicas ou seus sais; antioxidantes tais como ácido ascórbico; peptídeos (com menos de dez resíduos de aminoácidos) como poliarginina ou tripeptídeos; proteínas tais como soroalbumina, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, ácido glutâmico, ácido aspártico, arginina; monossacarídeos, dissacarídeos ou outros carboidratos incluindo celulose e seus derivados, glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA;

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24/46 álcoois de açúcar tal como manitol ou sorbitol; contra-íons tal como o sódio e/ou tensoativos tais como poli-sorbatos, poloxâmeros ou polietilenoglicóis.

[0089] A quantidade do(s) polipeptídeo(s) presente nas composições farmacêuticas ou cosméticas da presente invenção dependerá da natureza e gravidade da condição que está sendo tratada ou da natureza dos pré-tratamentos a que o paciente tem de ser submetido ou ainda do tratamento cosmético recomendado de forma individual. De uma forma geral, é previsto que as composições farmacêuticas ou cosméticas da presente invenção contenham o ingrediente ativo (polipeptídeo(s)) em uma quantidade na faixa de 0,1 μg até 100 mg (preferencialmente de cerca de 0,1 μg até 10 mg e mais preferencialmente de 0,1 μg até 1 mg) do(s) polipeptídeo(s) por kg de peso corporal.

[0090] Os efeitos do Lopap e sua forma recombinante na proliferação, apoptose, liberação de NO e PGI₂ em HUVECs mostraram-se valiosos na utilização dessa proteína na modulação da morte celular programada ou causada por agentes externos, podendo prolongar a vida de diferentes células.

[0091] Desta forma, os resultados de antiapoptose e de proliferação induzidos pelo Lopap e rLopap sobre os vários tipos de células permitem afirmar que essas proteínas se constituem em um complemento importante para ser usado em processos biotecnológicos que envolvam culturas celulares, podendo prolongar a vida e também proteger as células de efeitos citotóxicos, aumentando o rendimento de processos produtivos. Esta é a base da proposição do uso de

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25/46 polipeptídeos incluindo a antiapóptico envolvidas em substancialmente idênticos ao Lopap, sua forma recombinante, como agente e/ou prolongador da vida-média de células processos biotecnológicos ou bioenergéticos.

[0092] A presente invenção é ainda ilustrada por meio dos exemplos a seguir, os quais são providos meramente a título exemplificativo da invenção e não com a intenção de limitar o escopo da invenção.

EXEMPLO 1

Efeito antiapoptótico do rLopap

Cultivo de células endoteliais [0093] As HUVECs foram obtidas por digestão com colagenase, segundo o método de Jaffe e colaboradores (Jaffe EA e outros. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest, 1973; 52: 27452756). Foram utilizadas células de 1-3 passagens em monocamada confluente e sub-confluente conforme o tipo de experimento realizado. Inicialmente as células foram cultivadas em garrafas de 25 ou 75 cm2 com meio completo (RPMI contendo 10% soro fetal bovino (SFB), heparina (45 pg/ml), piruvato de sódio (1mM), L-glutamina (2mM), penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100pg/ml), 2mercaptoetanol (50 pM), fator de crescimento endotelial (ECGF) (25 pg/ml) e extrato do cérebro de camundongo (0.75%), em estufa a 37°C em atmosfera com 5% de CO2). Quando confluentes, a monocamada foi desgrudada com

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26/46 tripsina/EDTA e as células foram semeadas em placas de 24 poços, conforme o requisito do experimento.

Efeito antiapoptótico [0094] Para avaliar a atividade antiapoptótica do rLopap e do Lopap nativo (5 e 25 pg/ml), a morte celular programada foi induzida pela incubação das HUVECs durante 48 h em meio RPMI contendo 1% do SFB sem (controle) ou na presença de rLopap ou Lopap nativo.

[0095] Mudanças morfológicas e a viabilidade celular foram analisadas por coloração das HUVECs com uma mistura dos corantes fluorescentes que se ligam ao DNA, laranja de acridina (100 pg/ml) para determinar a porcentagem de células que sofreram apoptose, e brometo de etídio para diferenciar entre células viáveis e não viáveis.

[0096] A presença de células apoptóticas foi avaliada por microscopia de fluorescência, usando as células não aderentes e as aderentes desgrudadas com tripsina/EDTA. Pelo menos 200 células foram analisadas no experimento.

[0097] O rLopap (5 pg/ml e 25 pg/ml) mostrou-se capaz de inibir a apoptose de células endoteliais derivadas de cordão umbilical humano (HUVECs) (Tabela 1 e Figura 3) quando a apoptose foi induzida por privação de soro fetal bovino (1%). Maiores concentrações são capazes de produzir efeito mais efetivo na atividade antiapoptótica.

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Tabela 1. Ação antiapóptica do Lopap e rLopap em HUVECs. A apoptose foi induzida por privação de SFB (1% SFB)

% DE CÉLULAS APOPTÓTICAS
Controle	Lopap 5 qg/ml	Lopap 25 qg/ml	rLopap 5 qg/ml	rLopap 25 qg/ml
5 2 ± 2	3 6 ± 4	2 4 ± 2	3 9 ± 3	3 2 ± 2

EXEMPLO 2

Viabilidade [0098] A análise de viabilidade foi realizada utilizando o método MTT. A redução do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol2-metil)-2,5-difeniltetrazolium (MTT) pelas células intactas foi avaliado em microplacas de 96 poços. As HUVECs foram cultivadas em meio RPMI suplementado com 1% de soro fetal bovino e após 48 h de incubação com Lopap (0,15 a 20 qg/ml) a cultura foi lavada com tampão salina-fosfato (PBS). Adicionou-se 10 ql/poço de MTT 2,5 mg/ml e as células foram incubadas por mais 3 horas a 37°C. A reação foi interrompida pela adição de 150 ql de duodecil sulfato.

Os valores de absorbância a 540 nm foram determinados usando-se um leitor automático de microplacas.

[0099] O Lopap aumentou significativamente a viabilidade celular de maneira concentração dependente (Figura 4).

EXEMPLO 3

Produção de prostaciclina [0100] A produção de prostaciclina (PGI₂) foi medida pelo acúmulo de 6-keto-PGF_1a (um metabólito da hidrólise de PGI₂) no meio de cultura RPMI 1640 através do método de ELISA após o tratamento de HUVECs com rLopap e Lopap

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28/46 nativo. O sobrenadante foi centrifugado a 400xg por 10 minutos a 4 C. O tratamento das HUVECs com Lopap nativo por 1 h (5 e 25 gg/ml final) produziu um aumento estatisticamente significativo na liberação de PGI2 comparado ao controle, porém o aumento na concentração de Lopap para 25 gg/ml, não induziu um aumento na liberação de PGI₂ de forma proporcional. O rLopap (5 gg/ml) não estimulou a liberação de PGI₂, porém com 25 gg/ml, o aumento na liberação foi significativo, semelhante ao induzido por LPS (2gg/mL) (Figura 5).

EXEMPLO 4

Produção de óxido nítrico [0101] A produção de óxido nítrico (NO) foi medida pela combinação do acúmulo de nitrito e nitrato no meio de cultura HAM-F12. Após o tratamento das HUVECs com rLopap ou Lopap nativo (5 e 25 gg/ml final), o sobrenadante foi centrifugado a 400xg por 10 minutos a 4 °C. A concentração de óxido nítrico (NO) no sobrenadante foi determinada por quimioluminescência em fase gasosa, utilizando um analisador de óxido nítrico (NO) através da reação do NO com ozônio, após a redução do nitrato e do nitrito com solução saturada de VCl₃ em HCl 1M a 90°C. A concentração de nitrato foi calculada a partir de uma curva padrão de nitrato de sódio. Os estímulos com Lopap nativo e rLopap (25 gg/ml) produziram um aumento estatisticamente significativo na liberação de NO comparado ao controle, sendo este aumento semelhante ao induzido por Trombina (5UI/mL) (Figura 6).

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EXEMPLO 5

Extração, purificação e análise do RNA

Tratamento do material usado para extração do RNA [0102] O RNA é uma molécula facilmente degradada pela ação de RNAses, que são enzimas altamente estáveis e com grande atividade. Estas enzimas encontram-se amplamente distribuídas pelo meio ambiente e mantêm-se ativas mesmo sob condições adversas. Todos os tipos de trabalhos que envolvam RNA devem ser executados sob rigorosas condições de assepsia, evitando a contaminação por RNAses.

[0103] O Dietil-Pirocarbonato (DEPC), um potente inibidor de RNAses foi usado para eliminar possíveis contaminações com estas enzimas em materiais e soluções. Após eliminar as RNAses do meio, o excesso deste composto foi eliminado por autoclavagem do material tratado, por um período prolongado. As cubetas de quartzo, de 0,5 ml, foram tratadas com uma solução, (1:1=V/V) de ácido clorídrico e metanol, por 2h. OS materiais utilizadoS nas eletroforeses (cubas, cubetas, pentes, etc.) foram lavados com água tratada com DEPC e, em seguida, tratados com DEPC 0,01% por 12 horas sendo secos à temperatura ambiente. Todo o material descartável como (tubos, falcons, ponteiras, etc) estavam livres de DNAse e RNAse, sempre novos e autoclavados antes do uso. O material usado para o manuseio do RNA foi reservado somente para estes procedimentos, sendo armazenado em local protegido. O local de trabalho como bancadas foi limpo com etanol 70% e cuidados pessoais,

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30/46 como o uso de avental e o uso indispensável de luvas foram executados.

Extração e análise do RNA [0104] Para a extração do RNA total, foi utilizada a metodologia do Trizol (Invitrogen), seguindo-se o protocolo do fabricante. Trata-se de uma modificação do método descrito por Chomczynski e Sacchi, 1987. Este reagente é uma solução monofásica de iso-tiocianato de guanidina e fenol, acrescidos de um corante avermelhado. O isotiocianato de guanidina é um potente inibidor enzimático e é usado para eliminar a atividade das RNAses presentes nas células.

[0105] O Trizol dispensa algumas soluções originalmente usadas e permite que através de uma extração fenol/clorofórmio, seguida de precipitação alcoólica com isopropanol, o RNA total seja obtido com alto grau de integridade.

[0106] Todo o meio de cultura das placas foi desprezado e as células foram incubadas por 3 minutos a temperatura ambiente (15°C a 30°C) com 1ml de Trizol para aproximadamente 500.000 ou 5 x 10 células. As células com o Trizol foram então colocadas em microtubos de 1,5 ml, onde foram adicionados 0,2 ml de clorofórmio para cada 1 ml de Trizol, vigorosamente agitados no vortex por 15 segundos e incubados à temperatura ambiente por 3 minutos. A seguir foi feita uma centrifugação a 12000 x g por 15 minutos a

4°C. Nesta fase obtêm-se uma fase inferior vermelha

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31/46 correspondente ao fenol-clorofórmio, uma interface branca, e uma fase superior aquosa, incolor, que contém o RNA.

[0107] Em seguida foi feita uma precipitação com 0,5 ml de isopropanol para cada 1 ml de Trizol, transferindo-se a fase aquosa para novos tubos, que foram incubados a temperatura ambiente por 10 minutos e, em seguida, centrifugados a 12.000 x g por 10 minutos a 4°C. O sobrenadante foi descartado e o RNA lavado com etanol 75%, adicionando-se 1 ml de etanol para cada 1 ml de Trizol usado na extração. Os tubos foram centrifugados a 7500 x g por 5 minutos a 4°C, o sobrenadante foi removido e o precipitado de RNA seco em fluxo, ressuspenso em 40ql de H₂O tratada com DEPC e congelados a -70°C.

Quantificação do RNA [0108] Para um volume final de 400 ql foram adicionados ql de RNA concentrado em 398 ql de H₂O deionizada, tratada com DEPC. As leituras de densidade óptica foram feitas em 260 e 280 nm em cubetas de quartzo de 500 ql, onde 1U (unidade de absorbância a 260 nm) equivale a 40 qg de RNA total. A concentração do RNA foi calculada a partir da fórmula:

[RNA] = A260 X D X 40 (qg/ ml) onde D corresponde ao fator de diluição

Análise do RNA

[0109]	A	integridade	do RNA	foi	avaliada	através	de
eletroforese	em gel de	agarose	2%,	contendo	brometo	de

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32/46 etídio, onde foi verificada a presença das frações 18S e 28S, correspondentes às bandas do RNA total.

[0110] As amostras para corrida foram preparadas colocando-se 5 ql do RNA estocado diluído em mais 8 ql de H₂O DEPC e 7 ql de ficoll. As corridas foram realizadas sob 80 V durante 2 horas, utilizando-se como tampão de corrida o TBE 1X (52).

RT-PCR

Síntese da Primeira Fita [0111] Para a síntese do cDNA, em tubos de 200 ql, 2 qg de RNA total foram diluídos para um volume final de 10 ql de H2O DEPC. Adicionou-se 1 ql de oligo (dT) 15 Primer (Promega), aquecendo a 70°C por 5 minutos e esfriando rapidamente no gelo. Os seguintes componentes foram adicionados:

ql de 5x Buffer M-MLV - RT (Promega) ql de 10 mM DNTP Mix (Promega)

0,5 ql	de	40 U/ ql	RNasin Inhibitor (Promega)
3,5 ql	de	H2O-DEPC	(Promega)
[0112]		Após	misturar cuidadosamente	em	vórtex,

adicionou-se 1ql (200 U) da enzima M-MLV-RT para um volume final de 25 ql, a transcrição reversa se fez a 42°C por 60 minutos, e a reação foi terminada em gelo.

Síntese da Segunda Fita [0113] Do volume de 25 ql do cDNA, foi utilizado 5 ql para a síntese da segunda fita, com a adição dos seguintes reagentes:

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33/46 μΐ de 25 mM - MgCl₂ μΐ de 10 X Buffer-Thermophilic DNA Poly μl de 10 mM DNTP Mix

33,5 μl de H₂O DEPC μl do Primer Sense específico para cada gene μl do Primer Anti-Sense específico para cada gene

0,5 μl de Taq DNA polimerase [0114] As reações foram incubadas em termociclador, o qual executou uma programação de desnaturação inicial a

94°C	por	2 min, 35	ciclos	de desnaturação	(94°C	por	30
segundos),	anelamento	(50°C	para GAPDH, 42^°C	para	Bcl2	e
55^°C	para	BAX por 1	minuto)	, extensão (72°C	por 1	min)	e

uma extensão final a 72°C por 3 minutos.

Quantificação dos produtos do PCR [0115] Os produtos foram analisados em eletroforese de agarose 2% corado com brometo de etídio, onde 50μl do produto, adicionados de 7μ1 de tampão “Buffer Type II” foram aplicados. Os géis foram foto-documentados.

[0116] O GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase) foi utilizado como controle por tratar-se de um gene constitutivo. A densitometria foi realizada, utilizando um software de análise de imagem, e o nível de cada expressão está sendo representado pela razão das densidades do gene alvo versus a banda correspondente ao GAPDH. Os experimentos para cada gene foram realizados em triplicata.

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PRIME RS [0117] Os primers foram desenhados baseados em sequência de genes humanos (já publicados), para amplificação das proteínas de interesse (Tabela 2).

Tabela 2. Sequência dos primers e tamanho dos produtos de

PCR

PRIME R	S en s e	Anti s en s e
BCL-2 (279 p b )	5'GAGGAAGTAGACTGAT AT TA3 '	5'CCTTCCCAGAG GAAAAG CAA3 '
BAX (542 p b )	5'GATGGACGGGTCCGGA GA3 '	5'CTCAGCCCATC TTCTTCCAG3'
GAPDH (996 p b )	5'GGTGAAGGTCGGAGTC AAC G 3 '	5 ' TCCTTGGAGGC CAT G TGGGCCCT3'

EXEMPLO 6

Preparação do RNA (HUVECs) [0118] Cult ivos confluentes de HUVECs (500.000 células/poço) em placas de 6 poços foram incubados durante 8 horas em meio RPMI, contendo 10% SFB na ausência (controle), na presença das proteínas na concentração de 10pg/ml e de (Trombina 5pg/ml, TNF-α 5pg/ml, LPS 5pg/ml).

[0119] At ravés da metodologia do Trizol, foram obtidos em média aproximadamente 18pg de RNA total em cada cultura de células estimulada com rLopap. Os RNAs obtidos apresentaram boa qualidade (relação 260/280 = 1,7) e a análise em gel de agarose 2%, revelou a presença das bandas 18S e 28S, confirmando a integridade do RNA obtido (Figura 7).

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Expressão de genes em células endoteliais ( HUVE C s ) [0120] A expressão dos diferentes genes alvos foi medida por RT-PCR, a partir de cultivos confluentes (500.000células/poço) em placas com 6 poços, onde as HUVECs foram incubadas durante 8 horas em meio RPMI, contendo 10% SFB na ausência (controle), na presença das proteínas na concentração de 10qg /ml e de (Trombina 5U/ml, TNF-a 5qg/ml, LPS 5qg/ml), para avaliação da ação direta da mesma.

Expressão do gene constitutivo das células

GAPDH (Controle) [0121] At ravés da expressão por RT-PCR do gene controle constitutivo, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), foram feitas as análises densitométricas dos demais genes estudados neste trabalho. Em HUVECs o gene GAPDH apresentou perfil homogêneo para todos os estímulos realizados. A migração eletroforética do fragmento aplicado foi de 996pb, conforme esperado (Figura 8).

Expressão do gene Bcl-2 (Antiapoptótico) [0122] A migração eletroforética em gel de agarose 2%, da reação de PCR com primer para Bcl-2 demonstrou a geração de fragmentos de 27 9 pb como esperado. As HUVECs estimuladas com Lopap e r-Lopap apresentaram um evidente aumento na expressão do gene Bcl-2 em relação ao controle negativo, e aos demais estímulos realizados (Figura 9).

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Expressão do gene Bax (Pró-apoptótico) [0123] A migração eletroforética em gel de agarose 2%, da reação de PCR com primer para Bax demonstrou a geração de fragmentos de 542pb como esperado. As HUVECs estimuladas com Lopap e r-Lopap apresentaram uma discreta diminuição na

expressão	do gene Bax; principalmente	as	células
estimuladas	com o Lopap nativo, em relação	ao	controle
negativo e	aos demais estímulos (Figura 10).
	EXEMPLO 7
A ç ã o d o	rLopap sobre fibroblastos	c u	tâneos
humanos.	Avaliação de componentes	d a	matriz
extracelular: fibronectina e tenasc	i n a

[0124] Fibroblastos humanos cutâneos cultivados foram plaqueados em lamínulas acondicionadas em placa de 24 poços e incubados com rLopap em diferentes concentrações por 7 dias para avaliar a ação desta proteína na produção de componentes da matriz extracelular (fibronectina e tenascina).

Sistema de teste

Cultura de células

Material Biológico [0125] O sistema de teste compreendeu fibroblastos humanos cutâneos cultivados, obtidos de fragmento de pele normal do lóbulo da orelha de 5 indivíduos de raça negra, do sexo feminino, com idade entre 15 e 40 anos.

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Coleta do material biológico [0126] Os pacientes foram submetidos à biópsia excisional, após consentimento informado, em sala cirúrgica com critérios de assepsia e antissepsia habituais. Foi coletado um fragmento de pele normal medindo 0,5cm x 0,5cm que foi imediatamente imerso em meio de cultura estéril Ham-F-12 acrescido de 15% SFB (soro fetal bovino) e antibióticos (ampicilina 20mg/ml; estreptomicina 20 mg/ml; gentamicina 40 mg/ml).

Cultura dos fibroblastos [0127] Os fragmentos de pele foram submetidos à retirada de restos sanguíneos, resíduos de gordura e de tecidos celulares degenerados pelo ato cirúrgico, sendo este processo de limpeza realizado com PBS estéril (0,15 M NaCl, fosfato de sódio 0,04 M, pH 7,4) com antibióticos, em fluxo laminar. Cada fragmento foi então subdividido em pequenas porções de cerca de 0,1cm x 0,1cm. Cada dez destas pequenas amostras foram acomodadas em placa de Petri de 35 mm contendo meio de cultura Ham-F-12 acrescidos de 15% soro fetal bovino e antibióticos (ampicilina 2660 mg/ml; estreptomicina 20 mg/ml; gentamicina 40 mg/ml). As placas foram então incubadas em estufa à 37^oC com 5% CO2. Durante a primeira semana de cultivo, foram adicionados 500pl de meio de cultura Ham-F-12 com SFB, em dias alternados. Após este período, o meio de cultura foi trocado três vezes por semana. Após 10 a 15 dias, deu-se o início da liberação das células das amostras de tecido para o meio e após 30 dias os fragmentos de tecido foram retirados das placas.

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38/46 [0128] Subculturas foram preparadas para aumentar o volume de material a ser analisado. A placa foi lavada com o PBS estéril por 3 X. Adicionou-se tripsina-EDTA 1:250 permitindo a liberação das células que estavam aderidas ao fundo da placa. O produto foi então inativado com a adição de meio de cultura com SFB 10%. A suspensão celular foi retirada e submetida à centrifugação por 5 minutos a 1.800 rpm. Após desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento com 1ml de meio de cultura com SFB 10%, o número de células viáveis foi determinado.

[0129] A determinação de viabilidade celular foi realizada pelo teste de exclusão celular utilizando corante Azul Tripan. 1 x 10⁶ fibroblastos foram incubados com solução de Azul Tripan 0,5%, diluída em PBS 9:1. Após a homogeneização, uma amostra de suspensão celular foi analisada sob microscópio de luz com objetiva de 20X. A contagem das células foi realizada em câmara de Newbauer e somente as amostras de fibroblastos que continham acima de 90% de células viáveis foram subcultivadas. Algumas amostras destas células foram congeladas em nitrogênio líquido para posterior utilização.

Plano de teste: Grupos Controle e Teste [0130] O grupo controle foi constituído por fibroblastos cultivados em meio de cultura Ham-F-12 suplementado com 10% de SFB.

[0131] Foram delineados 2 grupos testes:

1) fibroblastos cultivados em meio de cultura adicionado com 1pg de rLopap diluído em meio de cultura Ham-F-12;

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2) fibroblastos cultivados em meio de cultura adicionado com 5gg de rLopap diluído em meio de cultura

Ham-F-12.

Preparação da placa [0132] Todas as amostras de fibroblastos utilizadas no experimento consistiam do 6° subcultivo. Foram utilizadas placas de cultura estéreis com 24 poços. Os fibroblastos foram cultivados em lamínulas estéreis redondas de 13mm de diâmetro e sobre cada lamínula foram plaqueados 1 x 10 fibroblastos em 1ml de meio de cultura acrescidos de SFB e antibióticos. Após 24 horas para adesão das células, o meio foi trocado por um meio de cultura novo acrescidos de SFB, antibióticos e rLopap, no volume final de 300gl/poço.

[0133] O rLopap utilizado foi armazenado à temperatura ambiente, filtrado em membrana de 0,22gm nas concentrações de 1gg/gl e 5gg/gl.

[0134] As placas foram mantidas a 37°C em estufa de CO₂por 7 dias e observadas ao microscópio invertido. O meio de cultivo não foi trocado ou acrescentado.

Fixação das lamínulas [0135] As lamínulas foram lavadas cuidadosamente 1X com ml de PBS com antibióticos. As lamínulas foram fixadas por 15 minutos com 400gl do fixador composto por 3% de paraformaldeido e 0,2% de glutaraldeido em tampão fosfato 0,1M pH 7,4 e lavadas cuidadosamente 1X com 1ml de PBS.

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Imunofluorescência Indireta [0136] As lamínulas foram incubadas por 45 minutos com 50μ1 de anticorpo primário monoclonal anti-fibronectina celular e monoclonal anti-tenascina humana, na diluição de

1:100 em PBS.

[0137] Em seguida, as lamínulas foram incubadas por 45 minutos com 50μ1 do anticorpo secundário Alexa Fluor 488, diluído 1:100 em PBS. As lamínulas foram montadas em lâmina de microscopia com uma gota do meio de montagem Vectashield com DAPI (Vector Laboratories-USA).

Avaliação da produção de fibronectina e tenascina pelos fibroblastos através de análise histomorfométrica [0138] As lâminas, submetidas à imunofluorescência foram analisadas sob microscópio de luz e fluorescência (Zeiss) com objetiva de 20X e ocular de 10X e a avaliação quantitativa foi realizada com auxílio de um Sistema Analisador de Imagem.

[0139] As imagens obtidas em 10 campos microscópicos foram digitalizadas com auxílio do software, proporcionando a possibilidade de compartilhamento de dados com o processador de textos (Microsoft Word ) e planilha eletrônica (Microsoft Excel ). Para avaliação quantitativa da produção de Fibronectina e Tenascina, foram marcadas as estruturas fluorescentes, estruturas positivas, de forma a se diferenciar do restante das outras estruturas devido ao contraste de cor. A área de Fibronectina e Tenascina foi obtida por densitometria digital, que foi transformada em micrometros quadrados (μ™. ). Os resultados obtidos em cada

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41/46 campo correspondem à área percentual de estruturas positivas, ou seja, fração de área.

Análise Estatística [0140] Os dados de fração de área das amostras estudadas foram submetidos a estatística descritiva e a comparação entre os grupos foi realizada através de teste não paramétrico Kruskal-Wallis ou pelo teste paramétrico de ANOVA. Considerou-se significante p<0,05.

[0141] Os valores obtidos da fração de área de Fibronectina e Tenascina das 05 amostras de fibroblastos cultivados sob ação do rLopap (1gg e 5μg) e grupo controle (Ham-F-12). Estes valores foram submetidos a análise estatística descritiva, cujos resultados estão especificados na Tabela 3.

Tabela 3. Média e desvio padrão da expressão (%) fibronectina e tenascina em culturas de fibroblastos humanos normais tratados com 1 e 5 μg de rLopap e grupo controle

Tratamento	n	Média	Desvio Padrão	Max	Min
%fibronectina rLopap (1ug)	50	46,1	15,1	72,8	16,8
%fibronectina rLopap (5ug)	50	24,2	18,4	61,4	0,1
%fibronectina controle	50	19,2	7,4	38,4	5,1
%tenascina rLopap (1ug)	50	2,3	1,5	5,8	0,4
%tenascina rLopap (5ug)	50	1,7	1,1	4,8	0,4
%tenascina controle	50	0,8	0,4	2,1	0,1

[0142] A comparação dos valores de fração de área de fibronectina produzida por fibroblastos cultivados com

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42/46 proteína nas concentrações de 1pg e 5pg com o grupo controle revelou diferença estatisticamente significante (p<0,001), mostrando maior produção de fibronectina dos fibroblastos cultivados com rLopap em relação ao grupo controle (Figura 11).

[0143] A comparação dos valores de fração de área de tenascina produzida por fibroblastos cultivados com proteína (1pg e 5pg) e grupo controle revelou diferença estatisticamente significante (p<0,001), mostrando maior produção de tenascina pelos fibroblastos cultivados com rLopap em relação ao grupo controle (Figura 12).

[0144] A Figura 13 mostra a distribuição de fibronectina nos fibroblastos humanos cutâneos cultivados: grupo controle (A), rLopap 1pg (B) e 5 pg (C).

[0145] A Figura 14 mostra a distribuição de tenascina nos fibroblastos humanos cutâneos cultivados: grupo controle (A), rLopap 1pg (B) e 5 pg (C).

EXEMPLO 8 [0146] A região dorsal dos camundongos foi depilada e submetida a tratamento tópico com rLopap juntamente com adjuvantes do lado direito (experimental) e apenas com adjuvantes do lado esquerdo (controle).

[0147] Os grupos experimentais foram divididos em:

Grupo 1: rLopap (0,33 mg) adicionado a pomada de papaína (proporção final 5%), administração tópica 1 vez por semana por 3 vezes.

Grupo 2: rLopap (0,33 mg) diluído em NaCl 0,03M, administração tópica 1 vez por semana por 3 vezes.

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Grupo 3: rLopap (0,33 mg) diluído em NaCl 0,03M, administração intradérmica em uma única dose.

Grupo 4: Pomada comercial Vitanol-A, gel 0, 025 tretinoína, administração tópica 1 vez por semana por 3 vezes.

Estudo histopatológico [0148] A região tratada foi retirada após o sacrifício dos animais e fixada em solução de formalina 10% tamponada com tampão fosfato. As amostras de pele foram então submetidas a secções transversais e submetidas à rotina histológica. As amostras foram desidratadas em série crescente de álcoois, desengorduradas em xilol e embebidas em parafina. As amostras foram então inseridas em parafina e submetidas a cortes de 3 pm de espessura, em micrótomo histológico, que foram recolhidos em lâminas de vidro. Estas lâminas foram submetidas à coloração de HematoxilinaEosina, para análise das características histológicas e à coloração de Picrosirius (Junqueira, LCV e outros. A simple and sensitive method for quantitative estimation of collagen. Anal. Biochem 94: 9609-13, 1979), para avaliação quantitativa do colágeno. As lâminas foram examinadas sob microscopia de luz, em microscópio acoplado a Sistema Analisador de Imagem.

Características histológicas [0149] A pele dos animais de todos os grupos experimentais estudados mostrou arquitetura preservada com epiderme, derme.

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Epiderme [0150] A epiderme apresentou-se como um epitélio escamoso estratificado queratinizado, com espessura fina e homogênea em todos os animais examinados. A membrana basal não foi evidente, não mostrando espessamento ou áreas de degenerações. Na epiderme não foi observado edema intra ou intercelular. Não foram observadas alterações na queratinização. Não foram observados descolamentos dermoepidérmicos ou formação de bolhas. Comparando-se a epiderme nos diversos animais examinados e também entre a pele tratada com rLopap e com o controle, não foi observada nenhuma diferença histológica (Figura 15).

Derme [0151]

As características histológicas da derme não variaram, nos diferentes grupos experimentais. Foi observada a presença semelhante de núcleos celulares na derme constituídos por fibroblastos. Entretanto, não foram observadas células inflamatórias mononucleares, em áreas focais (Figura 16A e 16B).

Quantificação do colágeno III [0152] O colágeno da derme foi quantificado através de auxílio de Analisador de Imagens Kontron 300, em cortes da pele corados pelo Picrosirius. Foram avaliados 05 campos microscópicos com objetiva de 20X e ocular de 10X. Os campos foram escolhidos aleatoriamente nos diversos fragmentos de pele representados na lâmina de cada animal.

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45/46 [0153] Obs ervou-se que a pele tratada com rLopap dos diferentes grupos experimentais difere significativamente (p<0,001) quanto à capacidade de sintetizar colágeno, comparado à pele não tratada (controle) (Figuras 17 a 21).

EXEMPLO 9

Potencial imunogênico do rLopap [0154] Um coelho foi imunizado pela via intradérmica com doses de 10 μg de rLopap, diluídos em 200 μl de solução Al (OH)₃ 10% (p/v), quinzenalmente, por um período de 3 meses.

A sangria total do animal para a obtenção do soro antirLopap foi realizada 10 dias após a ultima imunização. O sangue foi colhido por punção venosa, incubado a 37°C por 30 minutos, com posterior resfriamento a 4°C por 2 h, centrifugado a 1500 rpm por 10 min a 4°C e o soro obtido congelado a -20°C. Soro normal de coelho foi obtido de animais não imunizados, como descrito acima, e utilizado como controle para os ensaios de ELISA.

Titulação de anticorpos dos soros - ELISA [0155] Os títulos de anticorpos dos soros de coelho normal e anti-rLopap frente ao Lopap recombinante foram determinados através do método de ELISA. Para tanto, microplacas de poliestireno foram sensibilizadas pela adição de 10 μg/ml de Lopap recombinante (100 μl/orifício) em tampão PBS. Após incubação por 18 h a 4°C, as placas foram lavadas 3 vezes com PBS e bloqueadas pela adição de 200 μl/orifício do tampão PBS/BSA 5% por 2 h a 37°C. Em seguida, as placas foram lavadas 3 vezes com tampão PBS.

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Para determinação dos títulos, foram adicionados 100 μΐ/orifício dos soros normal (controle) e hiperimune, diluídos de maneira seriada em tampão PBS/BSA 1%. Após incubação por 1 h a temperatura ambiente, as placas foram submetidas a novo ciclo de três lavagens com tampão PBS/Tween-20 0,1% e adicionados 100 pl/orifício de soro anti-coelho conjugado com peroxidade, diluído 1:3.000 em tampão PBS-BSA 0,1%, e incubadas por 1 h a 37°C. Após ciclo de três lavagens com tampão PBS/Tween-20 0,1%, as reações foram reveladas pela adição de 50 pl/orifício do substrato orto-fenileno-diamina (OPD) e H₂O₂. As placas foram incubadas à temperatura ambiente por 20 minutos e a reação interrompida pela adição de 50 pl/orifício de H₂SO₄ 4N. A absorbância foi determinada a 492 nm em leitor de placas. A Figura 23 ilustra a análise de imunogenicidade do Lopap.

Imunogenicida de do rLopap [0156]

A imunogenicidade do rLopap foi determinada através de ensaios imunoenzimáticos (ELISA), sendo mensurados os títulos de anticorpos dos soros de coelho normal e hiperimunizado com o rLopap. A reatividade das diferentes diluições desses soros está representada na Figura 22. O rLopap demonstrou ser pouco imunogênico, induzindo baixos níveis de anticorpos específicos, após hiperimunização do coelho, como evidenciado pelos valores reduzidos de DO (em torno de 0,5, mesmo na diluição do soro de 1:250) e título de anticorpo inferior a 1:4000. O soro normal de coelho apresentou baixa ou nenhuma reatividade contra o rLopap.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição cosmética caracterizada por compreender:

(a) uma quantidade cosmeticamente eficiente de um polipeptídeo idêntico ao rLopap, o qual é representado pela SEQ ID No: 1;

(b) veículo e/ou excipiente cosmeticamente aceitável; e (c) opcionalmente, adjuvantes cosmeticamente aceitáveis, em que a dita composição cosmética apresenta-se sob a forma de pó, pomada, gel, creme ou adesivo.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o dito veículo e/ou excipientes ser selecionado do grupo de umectantes, emulsificantes, modificadores de reologia, reguladores do pH, agentes quelantes ou conservantes.
3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o dito adjuvante ser selecionado do

grupo de sub stâncias com propriedades de filtro de UV, vitaminas, pigmentos e/ou corantes e essências. 4. Uso co smét ico da composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser para tratamento anti-envelhecimento. 5. Uso co smét ico da composição de acordo com a

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2 / 2 reivindicação 1, caracterizado por ser síntese de fibras colágenas.

6. Uso cosmético da composição de reivindicação 1, caracterizado por ser síntese de fibras de sustentação extracelular.

7. Uso cosmético da composição de reivindicação 1, caracterizado por ser síntese de tenascina.

8. Uso cosmético da composição de reivindicação 1, caracterizado por ser síntese de fibronectina.

na indução da acordo com a na indução da da matriz acordo com a na indução da acordo com a na indução da

9. Uso cosmético da composição reivindicação 1, caracterizado tratamento de rejuvenescimento.

de acordo com a por ser para

10. Uso não terapêutico de um polipeptídeo idêntico à sequência do rLopap como representado na SEQ ID No: 1 caracterizado por o dito polipeptídeo ser um agente antiapóptico em processos biotecnológicos.

11. Uso não terapêutico de um polipeptídeo idêntico ao rLopap representado na SEQ ID No: 1 caracterizado por o dito polipeptídeo ser um agente prolongador da vida-média de células envolvidas em processos biotecnológicos ou bioenergéticos.

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1/14

A214nm A214 nm

FIGURA 1

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2/14

FIGURA 3

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3/14

Viabilidade %

Lopap (pg/mL)

FIGURA 4 □ 5 ug/mL □ 25 pg/mL

FIGURA 5

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4/14

PGI2 (pg/mL)

2μ9/ιηΙ_

Trombina
5U/niL

FIGURA 6

1 2 3 4 5 6

2<3S «Μ ΜΗ ΜΗ *Η

18S

FIGURA 7

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5/14

FIGURA 8

Λ) 12 3 4 5 ί.

JkJ-2

FIGURA 9

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6/14

Λ)

β) r-Lopap

1Dug/ml

FIGURA 10

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7/14

FIGURA 11

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8/14 lenascina

FIGURA 12

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9/14

FIGURA 13

FIGURA 14

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10/14

FIGURA 17

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11/14 ** ρ= 0,0217

Tratada Controle

FIGURA 18

FIGURA 19

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12/14

FIGURA 20

FIGURA 21

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13/14

FIGURA 22

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14/14

DO 492nm

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