BRPI0209172B1 - método de detecção de doenças induzidas por glúten em uma amostra sanguínea de um indivíduo, e kit teste para uso no método - Google Patents

Abstract

"método de detecção de doenças induzidas por glúten em uma amostra sanguínea de um indivíduo, e kit teste para uso no método". a invenção é direcionada a um método de detectar doenças induzidas por glúten, tais como, doença celíaca e dermatite herpetiforme. referidas doenças são indicadas pela presença de auto-anticorpos contra transglutaminase t<39>tg do tecido no sangue. o teste é realizado em uma amostra de sangue total (retirado de um doador) usando t<39>tg liberado das células do glóbulo vermelho (hemácia) da amostra sanguínea como um auto-antígeno. os auto-antígenos liberados reagem com os auto-anticorpos na amostra e formam complexos antígeno-anticorpo, os quais são detectados. a presença de tais complexos indica a doença. a invenção também é direcionada ao uso do auto-antígeno em um teste e em um kit de teste.

Description

“MÉTODO DE DETECÇÃO DE DOENÇAS INDUZIDAS POR GLÚTEN EM UMA AMOSTRA SANGUÍNEA DE UM INDIVÍDUO, E KIT TESTE PARA USO NO MÉTODO”.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao diagnóstico, triagem e acompanhamento de doenças relacionadas à intolerância ao glúten, tal como doença celíaca e outras entidades de doenças sensíveis ao glúten. Mais precisamente, a invenção refere-se ao método de detectar doenças induzidas por glúten em uma amostra sanguínea de um paciente. A invenção refere-se adicionalmente ao uso de um auto-antígeno em um método de detecção e um kit de teste útil no método.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA ANTERIOR

Enteropatia sensível ao glúten é uma intolerância determinada geneticamente ao glúten dietético, as prolaminas nocivas do trigo, centeio, cevada. Os alelos HLA DQA1*0501 e DQB 1*0201 codificando o heterodímero HLA DQ2 conferem a susceptibilidade genética tanto para doença celíaca (também celíaco espelta) quanto para dermatite herpetiforme, as formas mais comuns de doença diagnosticada pertencendo a este grupo. Um ou mais genes até agora desconhecidos nos locos não ligados ao HLA mais provavelmente também predisposto à doença celíaca, onde a ingestão de glúten leva a atrofia vilosa no intestino delgado. A enteropatia é o resultado de processos auto-imunes deflagrados por glúten e é de autoperpetuação na presença da consumação de glúten. A resposta imunológica é reduzida e uma cicatrização da mucosa é vista quando o glúten é excluído da dieta. A manifestação clínica típica da doença celíaca é uma má absorção evidente em crianças menores ou uma doença com perda severa em adultos. Durante as últimas décadas, tomou-se evidente que a doença celíaca é sub-diagnosticada, as características clínicas da doença têm sido modificadas para formas mais moderadas, e o diagnóstico é frequentemente feito em uma idade mais elevada. Também em pacientes adultos, existe uma mudança com respeito a sintomas mais moderados. A verdadeira prevalência da doença celíaca em diferentes populações pode ser mais alta que um em 100. O halotipo DR3-DQ2 é típico para muitos distúrbios auto-imunes e é encontrado em aproximadamente 25% da população européia. Associações comuns de doença celíaca são diabetes melito dependente de insulina, Síndrome de Sjõgren, tireoidite auto-imune, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico e vitiligo. Adicionalmente, a prevalência de distúrbios auto-imunes em doença celíaca está relacionada à duração da exposição ao glúten. Os pacientes com doença celíaca não tratada também ficam sujeito a um aumento de risco para malignidades e linfoma no intestino delgado. Manifestações deflagradas por glúten extra-intestinal são dermatites herpetiforme, defeitos do esmalte do dente permanente, osteopenia, revestimento do fígado, cardiomiopatia, infertilidade, ataxia, e epilepsia com calcifícações cerebrais.

Biopsia do intestino delgado é o alicerce para diagnóstico de doença celíaca. Em adição a atrofia vilosa subtotal e hiperplasia cripta, uma característica típica para a lesão da mucosa do intestino induzida por glúten é uma densidade elevada de linfócitos γδ+Τ intraepitelial. Entretanto, a biopsia é uma ferramenta de diagnóstico evasiva e não é adequada para propósitos de triagem. Certos auto-anticorpos do soro, isto é reticulina e anticorpos do endomísio, são induzidos por glúten, direto contra a matriz extracelular do próprio tecido do paciente, e eles são amplamente específicos à doença celíaca. Tipicamente, estes anticorpos são encontrados na classe IgA, porém pacientes celíacos com deficiência IgA seletiva produzem anticorpos similares na classe IgG (Collin P et al. Scand J Gastroenterol 1992; 27:367-71). Recentemente, a enzima transglutaminase celular ou tipo do tecido (tTG, EC 2.3.2.13, referida no seguinte como transglutaminase) foi identificada como o auto-antígeno alvo tanto do auto-anticorpos da reticulina quanto do endomísio. Teste sorológico baseado na detecção destes anticorpos pode ser usado para identificar pacientes com sintomas moderados ou atípicos e entre indivíduos sofrendo de doenças associadas, e até mesmo na população. Casos encontrados por triagem tomou-se a chave em diagnosticar enteropatia por glúten em anos recentes e alguns países começaram então a triagem em massa da população em idade escolar. Existe uma evidência acumulada, que o espectro de doenças sensíveis ao glúten é mais amplo que a enteropatia clássica por glúten e pode representar um assunto de cuidado médico geral. O desempenho de confiança e reproduzível destes testes de anticorpo tem sido apenas realizado em laboratórios especializados com os métodos atuais. Os ensaios de anticorpo do endomísio e da reticulina requerem substratos de tecido congelado, equipamentos imuno-fluorescentes e um pessoal altamente treinado para avaliar visualmente os resultados de ligação de anticorpo. Importante, os testes ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay - ensaio imunoabsorvente ligado à enzima) baseados em transglutaminase renderam resultados quantitativos e não dependentes do observador. Entretanto, seu componente crucial é o antígeno da transglutaminase, o qual deveria ser preferencialmente tão semelhante ao auto-antígeno humano natural quanto possível. A conformação ativa induzida cataliticamente induzida por Ca parece ser o antígeno preferido reconhecido pela maioria dos auto-anticorpos dos pacientes, porém a especificidade do epítopo de pacientes individuais pode diferir. E difícil manter a duplicação correta da enzima durante a purificação de tecidos animais ou alcançá-la quando da produção das proteínas de transglutaminase recombinantes. Em adição, a transglutaminase é muito sensível ao armazenamento a - 40°C e, portanto a necessidade contínua para porções novas de antígeno e apropriadas pode fazer o teste de anticorpo de transglutaminase muito caro. Comercialmente, apenas transglutaminase purificada no tecido a partir do fígado do porquinho-da-índia (Sigma) está disponível, porém esta transglutaminase do roedor foi descoberta ser menos sensível em detectar anticorpos celíacos que a enzima humana natural preparada a partir de células humanas do glóbulo vermelho (hemácia) (Hansson et al. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2000; 30 : 379-384).

Existe uma necessidade para um teste de triagem sorológico simples para doença celíaca e entidades relacionadas da doença sensível ao glúten. Semelhante teste podería preferencialmente ser realizado quando a primeira suspeita para a condição celíaca ou outras entidades de doença sensível ao glúten surgisse, desse modo no caso primário ou como uma triagem de massa. Também poderia ser aplicável ao acompanhamento de pacientes já diagnosticados. A presente invenção agora proporciona um método exato, barato e rápido de diagnosticar doenças induzidas por glúten.

CAMPO DA INVENÇÃO

Atualmente, tem sido surpreendentemente descoberto que o antígeno tTG da transglutaminase do tecido humano é encontrado em amostras de sangue total (retirado de um doador) dentro das células humanas do glóbulo vermelho (hemácias - RBC) em uma quantidade suficiente para servir como antígeno em um ensaio para auto-anticorpos contra tTG. Desse modo, não existe necessidade de adicionar transglutaminase externa para a medição de auto-anticorpos da transglutaminase circulantes. O antígeno apenas tem sido liberado das RBCs por hemólise, a qual permite a transglutaminase e os anticorpos específicos da transglutaminase reagirem na fase líquida da própria amostra para formarem complexos auto-antígeno - auto-anticorpo. Outra vantagem alcançada por usar auto-antígenos no ensaio é que o teste não é sensível a variações individuais nos antígenos tTG entre diferentes pessoas. O método de detectar doenças induzidas por glúten de acordo com a presente invenção é caracterizado pelo fato de que uma amostra sanguínea contendo células do glóbulo vermelho (hemácias - RBC) é hemolisada para liberar transglutaminase (tTG) a partir de RBCs na amostra, o tTG é deixada para reagir com auto-anticorpo anti-tTG possível na amostra para formar um complexo antígeno-anticorpo, e referido complexo é analisado, por meio da qual a presença de referido complexo indica uma doença induzida por glúten. O método da presente invenção pode também ser caracterizado em que uma amostra sanguínea hemolisada de referido paciente é reagida com uma proteína de captação de tTG após a qual qualquer complexo de antígeno-anticorpo capturado é analisado, por meio da qual a presença de referido complexo indica uma doença induzida por glúten. A invenção adicionalmente inclui o uso de transglutaminase (tTG) do tecido liberada das células do glóbulo vermelho (hemácias - RBCs) de uma amostra sanguínea em um ensaio para detectar auto-anticorpos anti-f TG em referida amostra, por meio da qual a presença de referidos auto-anticorpos indica uma doença induzida por glúten.

Ainda outro objetivo da invenção é um kit de teste útil no método descrito. O kit de teste caracterizado pelo fato de que compreende dispositivo para analisar um complexo de antígeno-anticorpo formado entre transglutaminase liberada (tTG) do tecido e auto-anticorpos anti-tTG em uma amostra sanguínea.

Configurações vantajosas da presente invenção estão descritas nas reivindicações dependentes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra IgA do paciente específica para transglutaminase medida por teste sanguíneo total (retirado de um doador), usando amostras sanguíneas hemolisadas e anticorpos de captura anti-tTG da classe IgG imobilizados na placa ELISA. A ligação IgA foi medida com anti-IgA conjugada com peroxidase. Os resultados são fornecidos em unidades arbitrárias (AU), como porcentagem de densidade ótica medida com uma amostra com referência positiva e unidade experimental (amostragem) para pacientes com doença (CD) celíaca latente, tratada ou não tratada assim como para controles. A Figura 2 mostra resultados obtidos com as amostras de sangue total de pacientes celíacos (CD) e controles usando anticorpos de captura de anti-fibronectina do coelho. Os resultados são fornecidos como densidades óticas. A Figura 3 mostra as quantidades de transglutaminase capturada pela placa ELISA a partir das amostras de teste sanguíneo total por anticorpos IgG anti-tTG celíaco. Transglutaminase foi medida com anticorpos CUB 7402 monoclonais. Os resultados são fornecidos como densidades óticas. A Figura 4 mostra verificação do sistema de captura para a especificidade para transglutaminase. Anticorpos de captura irrelevante e específicos a transglutaminase (IgG humano ou IgG monoclonal de camundongo) foram aplicados e uma incubação tipo sanduíche com antígeno de transglutaminase na célula do glóbulo vermelho (hemácia) normal e amostras do soro do paciente (15 pacientes de dermatite herpetiforme e 15 controles) foram feitas. A tabela indica quais componentes foram incluídos nas diferentes configurações de captura e as barras superpostas mostram os valores de densidade ótica obtidos em cada configuração. A Figura 5 mostra a correlação de valores de densidade ótica obtidos com o uso de amostras sanguíneas total (plasma citratado + próprio RBC reconstituído citratado) e a aplicação tipo sanduíche do antígeno da transglutaminase da célula do glóbulo vermelho (hemácia) seguida pela incubação com amostras do plasma do paciente. Em uma configuração, plasma dos pacientes e célula do glóbulo vermelho (hemácia) lisada foram reconstituídas e adicionadas juntamente aos anticorpos de captura de anti-tTG celíaco. Nas outras configurações, célula do glóbulo vermelho (hemácia) normal lisada ou a célula do glóbulo vermelho (hemácia) lisada do próprio paciente foi adicionada às placas revestidas com o mesmo tipo de anticorpos de captura. Para propósito de controle, as amostras do plasma também foram adicionadas sem células do glóbulo vermelho (hemácias). Os resultados são mostrados como densidades óticas. A Figura 6 mostra os resultados de testes capilares com heparina (1-2), laminina (3-4), colágeno (5-6) e gelatina (7-8) como compostos de captura, e as densidades óticas obtidas com as amostras sanguíneas totais provenientes hemolisadas de pacientes celíacos (n=10, colunas 1, 3, 5, 7) e controles (n=12, colunas 2, 4, 6,8) quando heparina (12), laminina (3-4), colágeno I (5-6) ou gelatina (7-8) foram imobilizados pelas placas ELISA e usadas como compostos de captura. A ligação IgA foi medida com anti-IgA conjugada com peroxidase. Os mesmos símbolos representam a mesmas amostras nos diferentes testes.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO “Doença induzida por glúten” como usado aqui refere-se a qualquer entidade de doença ou distúrbio induzido por glúten, o qual está associado a auto-anticorpos contra tTG transglutaminase do tecido. Doenças induzidas por glúten freqüentemente causam enteropatia e as doenças induzidas por glúten mais conhecidas são as doenças celíacas e dermatite herpetiforme. Entretanto, atualmente nós sabemos que existem também doenças induzidas por glúten sem sintomas de enteropatia. Portanto, um melhor indicador de uma doença induzida por glúten é a ocorrência de auto-anticorpos tTG. A “proteína de captação tTG” como mencionada aqui significa qualquer proteína capaz de ligar-se ao complexo tTG-anti-tTG, ou a um composto associado ao referido complexo, tal como fibronectina. Preferencialmente, a proteína de captação de tTG é um anticorpo contra tTG, ou fibronectina, a qual é conhecida por ligar-se a tTG. Pode até mesmo ser um anticorpo de fibronectina, a qual é capaz de capturar o complexo tTG-anti-tTG, por que referido complexo também liga-se a fibronectina presente na amostra. Desse modo, o anticorpo de fibronectina liga-se a fibronectina do complexo fibronectina-tTG-anti-tTG formado. Referido complexo pode também ser capturado por gelatina. Bons resultados são obtidos usando IgG anti-tTG humana obtida de pacientes deficientes em IgA como proteína de captação de tTG. Preferencialmente, uma mistura de pelo menos dois semelhantes anticorpos IgG com diferente especificidade de epítopo são usados. O “significado para analisar” o complexo antígeno-anticorpo inclui quaisquer reagentes necessários para indicar o complexo formado. Referido dispositivo pode consistir essencialmente de dispositivos para capturar o complexo e dispositivos para detectar o complexo capturado. Os dispositivos para detectar o complexo são preferencialmente reagentes necessários para um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA). Em uma configuração da invenção, os dispositivos de captação compreendem anticorpos anti-tTG ligados a um suporte sólido e os dispositivos de detecção compreendem anti-IgA marcado e reagentes necessários para a detecção da marca.

Uma amostra sanguínea é tomada a partir de um indivíduo suspeito de ser intolerante ao glúten. A amostra sanguínea para ser testada deveria conter células do glóbulo vermelho (hemácias), as quais são hemolisadas. A hemólise pode ser realizada de qualquer maneira convencional, a qual rompa as células do glóbulo vermelho (hemácias) de modo que tTG seja liberada. Congelamento e descongelamento estão em possibilidade e o uso de uma solução hipotônica, por exemplo, água é outra. A invenção proporciona um ensaio de ligação de anticorpo para o diagnóstico, diagnóstico diferencial, triagem e acompanhamento de intolerância ao glúten genético, incluindo doença celíaca, dermatite herpetiforme, indivíduos sensíveis ao glúten em doenças associadas e o traço (ou uma característica) celíaco caracterizado pela produção de anticorpos contra transglutaminase. O antígeno intacto de transglutaminase humana é encontrado em amostras sanguíneas totais de paciente dentro de células do glóbulo vermelho (hemácias - RBC) e não existe necessidade de adicionar transglutaminase externa para a medição de auto-anticorpos de transglutaminase circulante. O antígeno apenas deve ser liberado das RBCs por hemólise, a qual permite que a transglutaminase e os anticorpos de transglutaminase específicos reajam na fase líquida da própria amostra. Então os complexos antígeno-anticorpo são capturados para uma superfície sólida para químicos, proteínas (por exemplo, fibronectina) ou anticorpos de captura adequada marcando o antígeno de transglutaminase do tecido. Após a lavagem dos componentes não ligados, os parceiros de ligação podem ser medidos com métodos imuno-químicos.

Em outra configuração da invenção, o conteúdo de transglutaminase da célula do glóbulo vermelho (hemácia) do paciente ou um de outros compostos associados a transglutaminase, tal como fibronectina são medidos baseados no mesmo princípio. O ensaio de ligação da proteína é preferencialmente um imunoensaio selecionado de radioimunoensaio (RIA), ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), fluoroimunoensaio (FiA), ensaioimunoradiométrico (IRMA), ensaio imunoenzimométrico (IEMA), ensaio de imunoluminescência e ensaio de imunofluorescência (Madersbacher S, Berger P. Antibodies and immunoassays. Methods 2000; 21:41-50). O método de acordo com a presente invenção pode ser aplicado também para sistemas simples de detecção de cor (por exemplo, Nunc-Immuno Stick) os quais podem funcionar na cabeceira ou nos consultórios dos médicos. Requer apenas 10-50 microlitros de sangue total (retirado de um doador), portanto pode ser realizado também através do sangue capilar por bastão digital e não é necessário obter sangue venoso ou soro.

Exemplo 1 Materiais e Métodos Pacientes Amostras de paciente foram coletadas no Heim Pal Children’s Hospital, Budapeste, a partir da biopsia jejunal assistindo aos pacientes de suspeita de doença celíaca (CD) ou dermatite herpetiforme (DH) também a partir de pacientes tratados diagnosticados anteriormente com estas doenças. CD foi diagnosticada de acordo com o critério atual da European Society of Paediatric Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition, compreendendo a demonstração de atrofia vilosa Jejunal em histologia e um claro desempenho clinico em uma dieta livre de glúten assim como a exclusão de outras enteropatias. DH foi diagnosticado com o estudo imunofluorescente direcionado a biopsia da pele pela presença de depósitos de IgA granulares nas papilas dérmicas da pele não envolvidas adjacentes as lesões visíveis da pele. Nas primeiras amostras do experimento dos 84 pacientes sensíveis ao glúten (51 não tratados, incluindo 5 DH não tratados; 6 latentes, 27 em uma dieta livre de glúten) com uma idade média de 4,7 anos (faixa: 1-31), e de 10 controles de doença não celíaca com estrutura vilosa jejunal normal foram testados. Para propósitos de controle, amostras aleatórias do hospital submetidas para verificação a gás do sangue foram usadas (n=38). A faixa de idade dos controles foi de 0,4-1,3 ano.

Experimentos adicionais foram conduzidos com amostras de 15 pacientes de CD adicionais, 15 DH e 42 controles.

Manuseio da Amostra Amostras de sangue total (retirado de um doador) foram coletadas em tubos capilares contendo heparina (Clinitubes Radiometer A/S, Copenhagen, Denmark), misturadas com um bastão magnético e seladas com coberturas em ambas as laterais. Então as amostras foram hemolisadas por congelamento e armazenadas até verificação a - 20°C ou abaixo. Para verificação inicial tanto do sangue venoso quanto do sangue capilar obtido por bastão digital foram preenchidos nos tubos capilares. Verificações de controle foram realizadas com sangue venoso coletado em tubos (Vacutainer, Becton Dickinson, Meylan, Fance) com EDTA ou citrato de sódio. Eles também foram congelados ou como eles foram coletados ou no plasma e as células do glóbulo vermelho (hemácias) foram congeladas separadamente após centrifugação por 5 minutos com 4000 rpm.

Captura de Anticorpo Celíaco e Verificação por ELISA

Na hora da verificação, as amostras de sangue total congeladas foram descongeladas, misturadas novamente, deixadas a temperatura ambiente por 15 minutos e diluídas com 0,15M de solução salina tamponada com 0,05M de Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethane - tris(hidroximetil)aminometano) com 10 mM de EDTA e Tween 20 a 0,1%, pH 7,4 (TTBS). Os experimentos foram conduzidos com outras soluções para diluição, incluindo água destilada, solução salina tamponada com Tris com 2,5 ou 5 mM de CaCl2 e soluções contendo albumina ou soro normal das espécies (coelho), nas quais os anticorpos secundários foram produzidos.

Placas de microtitulação (Nunc Immuno-Plate Maxisorp, Nunc A/S Roskilde, Denmark) foram revestidas com uma mistura de dois anticorpos celíacos da classe IgG com diferente especificidade de epítopo obtida de pacientes celíacos deficientes em IgA com doença ativa e endomisial com classe IgG altamente positiva e anticorpos transglutaminase. As diluições respectivas das amostras de soro de captura celíaca foram 1:1000 e 1:2000 em tampão de 0,03 M de bicarbonato, pH 9,6, e elas foram coletadas por uma hora a temperatura ambiente. Portanto, as placas foram lavadas três vezes em TTBS. Bloqueio adicional das placas com albumina de soro bovino não foi usado. As placas foram incubadas por uma hora com as amostras sanguíneas totais diluídas a temperatura ambiente. Após lavagens extensíveis em TTBS, os anticorpos do paciente da classe de ligação IgA foram medidos com anticorpos de coelhos marcados com peroxidase contra IgA humano (DAKO A/S, Glostrup, Denmark) diluído com 1:2000 em TTBS. A cor foi desenvolvida com lmg/ml de dicloridrato de orto-fenilenodiamina (DAKO) com H2O2 a 0,06% em 0,1 M de citrato de sódio, pH 4,2 e foi lido espectrofotometricamente em 450 nm.

Em alguns experimentos, a reação de ELISA foi interrompida com 2,5M de H2SO4 e a absorvência foi medida também a 492 nm. As amostras foram testadas em duas réplicas. Uma amostra positiva conhecida e em branco foram incluídas em cada operação. A concentração de anticorpo foi fornecida tanto em densidades óticas quanto em unidades arbitrárias calculadas como a porcentagem da amostra de referência positiva.

Em experimentos adicionais também outros anticorpos de captura foram testados, incluindo anticorpos policlonais de cabra contra transglutaminase do tecido (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) e diferentes anticorpos monoclonais de camundongo contra transglutaminase do tecido (CUB7402 e TG100 de Neomarkers, Fremont, CA) assim como outros anticorpos de pacientes da classe IgG. Para a imobilização dos anticorpos monoclonais, um anticorpo policlonal de coelho contra IgGl do camundongo (ICN Biomedicals Inc. Aurora, OH) diluído em 1:500 em tampão de bicarbonato foi revestido primeiro pela placa e os monoclonais foram adicionados em TTBS.

Transglutaminase possui um sítio de ligação de fíbronectina na sua parte N-terminal e podería então ser purificada a partir de RBCs pelo uso de fíbronectina (Radek et al. Proc Natl Acad Sei USA 1993; 90:3152-6). Portanto, placas ELISA revestidas com fíbronectina humana (de Sigma F 2006, diluída com 1:1000 em tampão de bicarbonato, pH 9,6) também foram testadas para captura. Como plasma humano já contém alguma fíbronectina, anticorpos de coelho contra fíbronectina humana (de DAKO, diluída com 1:2000 em tampão de bicarbonato, pH 9,6) foram usados assim como anticorpos de captura. O uso de anticorpos de captura, exceto de IgG humano, foi introduzido para fazer possível a verificação de anticorpos de transglutaminase da classe IgG com o mesmo princípio por usar anticorpos secundários contra IgG humano em vez de IgA humano.

Verificação para a presença e quantidade de transglutaminase capturada pelas placas ELISA A quantidade de transglutaminase da célula do glóbulo vermelho (hemácia) ligada à placa foi checada em cavidades separadas revestidas com os anticorpos de captura e incubadas com as diluições sanguíneas totais hemolisadas. A ligação de transglutaminase foi medida com anticorpos policlonais e monoclonais de camundongo CUB7402, TG-100 contra transglutaminase do tecido seguida por anticorpos de coelho conjugados com peroxidase contra imunoglobulinas de camundongo (DAKO). A cor foi desenvolvida similarmente pela detecção de ligação de IgA.

Verificação para a especificidade do anticorpo de captura / antígeno Ensaios de controle pelo ensaio de célula sanguínea total foram realizados com amostras do plasma ou soro (diluídas com concentrações finais similares) dos mesmos pacientes sem ou com adição de célula do glóbulo vermelho normal lisada e diluída 1:20.

Para verificação adicional da especificidade da captura, uma célula do glóbulo vermelho bruta lisada a partir de células do glóbulo vermelho normal lisadas do doador sanguíneo e diluídas de 1:20-1:40 foi usada como o antígeno e as amostras do soro do paciente foram adicionadas de uma maneira ELISA do tipo sanduíche, após lavagem da célula do glóbulo vermelho (hemácia) não ligada lisada. A detecção da ligação IgA foi realizada como no ELISA sanguíneo total. Este ELISA do soro do tipo sanduíche foi descrito no presente resumo no 8th International Symposium on Celiac Disease in Naples, 1999. A especificidade do sistema ELISA do tipo sanduíche para medições de transglutaminase foi adicionalmente testada com amostras de 15 DH e 15 controles. Como anticorpos de captura foram usados, IgG celíaco, IgG não celíaco de um indivíduo deficiente em IgA, anti-transglutaminase monoclonal de camundongo e anticorpos monoclonais de camundongos de classe IgG irrelevantes (DAKO). O paciente celíaco IgG também foi seletivamente revestido pela placa pelo uso de anticorpos monoclonais de camundongos contra IgG humano (solução de enzima-anti-IgG por Pharmacia Glúten IgA EIA kit, Pharmacia Diagnostics AB; Uppsala, Sweden). Para a imobilização dos anticorpos monoclonais, um anticorpo policlonal de coelho contra IgGl (ICN) de camundongo diluído de 1:500 em tampão de bicarbonato foi revestido primeiro à placa e os monoclonais foram adicionados em TTBS.

Verificação de anticorpo de transglutaminase no soro com antígeno de roedor Detecção de anticorpo de transglutaminase do soro pelo uso de antígeno de transglutaminase em roedores (Sigma) foi realizada de acordo com Sulkanen et al., Gastroenterology 1998; 115:1322-1328.

Verificação EMA

Anticorpos de endomísio no soro foram medidos por um ensaio imunofluorescente indireto usando seções congeladas de espessura não fixa de 5-7 micrometros de esôfago do macaco (Korponay-Szabo et al. J Pediatric Gastroenterol Nutr 1997; 25:56-63). As amostras de soro foram inicialmente testadas em diluições 1:2,5 e 1:10 em solução salina tamponada por fosfato (PBS) e se positivo, titulada adicionalmente em diluições de 1:20, 40, 80, 160, 320, 640, 1280, 2560. As seções foram incubadas com as diluições do soro e após lavagens em PBS, os anticorpos de paciente com ligação IgA foram detectados com anticorpos de coelhos marcados com isotiocianato de fluoresceína específicos para IgA humano (DAKO). A positividade foi assegurada por um observador treinado na base da presença de ligação de IgA nas estruturas do endomísio e fibras de tecido conectivo sub-epidermal.

Resultados Desempenho do teste celíaco no sangue total O teste foi realizado em diluições de amostra sanguíneas totais de paciente de 1:10-1:50. A diluição 1:25 foi escolhida para os estudos adicionais. Os valores de absorvência para o IgA de paciente ligado a placa foram signiflcantemente maiores para pacientes com CD não tratado (densidade ótica em 450 nm 0,417 ± 0,245) que com os controles (0,094 ± 0,045), p<0,001. Pacientes tratados e pacientes na fase latente da doença tiveram valores médios levemente elevados, (0,145 ± 0,060 e 0,141 ± 0,043), respectivamente. Estes não foram signiflcantemente diferentes dos controles. Conhecido que várias operações foram realizadas, para estabelecer a positividade do nível de corte, os resultados foram expressos em unidades arbitrárias (AU) calculados para amostra de referência positiva. O nível de corte, o qual detecta todos os pacientes CD não tratados foi 23 AU. Apenas um paciente de controle teve valores AU excedendo esse corte. Desse modo, a especificidade do teste foi 97,9% e pacientes claramente distinguidos com doença ativa dos controles (Fig. 1). AU médio para os pacientes não tratados foi 66,3 AU (intervalos de confidência a 95%, Cl: 55,1-77,4), e para os pacientes tratados 15,6 AU (Cl: 11,9-19,3), para pacientes em fase latente 17,9 AU (Cl: 11,8-23,8). A média dos controles foi 7,2 AU (Cl: 4,8-9,7).

Estudos pilotos com 12 pacientes mostraram que anticorpos de anti-fíbronectina em coelhos são capazes de capturar eficientemente os anticorpos de transglutaminase em paciente presumivelmente através do antígeno transglutaminase e da fíbronectina na amostra (Fig. 2). Um indivíduo de controle (sem biopsia) mostrou D.O.m elevada e será adicionalmente investigado para possível CD. Placas revestidas por fíbronectina também deram positivas, porém os valores de absorvência foram menores e menos específicos.

Verificação para a quantidade de transglutaminase ligada a placa O anticorpo monoclonal CUB 7402 detectou quantidades comparáveis de transglutaminase nas cavidades incubadas com amostras celíacas ou controle (Fig.3). O valor P foi de 0,16, não significante.

Verificação para a especificidade do antígeno e captura do anticorpo Amostras do soro e do plasma adicionados aos anticorpos de captura sem as células dos glóbulos vermelhos (hemácia) não forneceram positividade específica. Quando eritrócito lisado foi adicionado às placas revestidas com anticorpos de captura e as amostras de soro e plasma foram apenas adicionadas após os componentes de célula do glóbulo vermelho (hemácia) não ligados terem sido lavados (ELISA do tipo sanduíche), uma positividade específica foi observada com as amostras de pacientes com enteropatia ao glúten. O sistema ELISA tipo sanduíche foi adicionalmente explorado com 15 amostras de dermatite herpetiforme e 15 controles. Nenhum dos valores específicos de absorvência foram vistos, se ou os anticorpos específicos de captura de transglutaminase ou o eritrócito lisado foram omitidos assim como substituídos com anticorpos monoclonais irrelevantes ou com um soro humano deficiente em IgA não celíaco (fig.4). Revestimento seletivo da fração IgG do soro celíaco deficiente em IgA para a placa através dos anticorpos monoclonais contra IgG humanos resultou em positividade similar (densidade ótica: 0,538 ± 0,233) como o revestimento do soro celíaco total altamente diluído (0,735 ± 0,304, não significante, p=0,07).

Comparação do teste sanguíneo total com resultados do teste tipo sanduíche Em uma configuração, plasma citrado separadamente congelado e células do glóbulo vermelho (hemácias) do paciente (n=15) foram reconstituídos em razões similares como as razões hematócrito (60:40) e adicionados junto com as placas revestidas com os anticorpos celíacos IgG. Em outras configurações, primeiro RBC normal ou RBCs de pacientes foram adicionados à placa e amostras de plasma foram incubadas após lavar os RBCs não ligados (verificação do tipo sanduíche). Os resultados nos dois tipos de configurações correlacionaram-se bem (Fig.5).

Comparação dos resultados de testes celíacos do sangue total com resultados de teste de anticorpo convencional Os resultados do teste do sangue total para positividade fortemente correlata com os resultados tanto de EMA quanto resultados de teste de transglutaminase de roedores obtidos nos mesmos pacientes celíacos não tratados e controles. Um paciente celíaco tinha EMA equivocada e resultados limites ELISA transglutaminase de roedores. Esse paciente foi claramente positivo no teste de sangue total usando seu próprio antígeno.

Positivo para EMA soro Positivo para anticorpos do Positivo com o teste soro reagindo com sanguíneo total transglutaminase de roedor CD ou DH 50/51 51/51 51/51 não tratado CD tratado_____________0/27_______________________3/27______________________5/27_________ CD latente______________5/6________________________4/6_______________________2/6_________ Controles _____________0/26*______________________1/26*_____________________1/48_________ *Apenas os controles com amostras de soro disponíveis foram testados Exemplo 2 Uso de proteínas de captura alternativas Foi testado se outras proteínas conhecidas que são capazes de ligar-se a fibronectina do plasma poderíam ser adequadas para capturarem complexos auto-anticorpos de paciente celíaco-transglutaminase-fibronectina encontrados nas amostras de pacientes hemolisados.

Portanto, em experimentos adicionais, placas ELISA foram revestidas com ou heparina (Noparin 5000 lU/ml, Novo Nordisk A/S, Denmark, diluído 1:500), laminina (Upstate, Lake Placid, NY, diluído 1:120, 12,5 ug/ml), colágeno I (preparado de tendões da cauda do camundongo de acordo com Halttunen et al. Gastroenterology 1996: 11:1252-1262, diluído 1:20, 80 ug/ml) ou com gelatina a 0,025-0,05% (Rousselot, Paris, France) dissolvida em 0,03 M de tampão de bicarbonato, pH 9,6. As etapas adicionais dos testes foram realizadas assim no teste sanguíneo total com anticorpos de captura IgG antitransglutaminase humana como descrito no Exemplo 1.

Os resultados estão de acordo com a Figura 6. Placas revestidas de heparina não forneceram positividade específica com as amostras de paciente celíaco. A laminina e o colágeno I deram a impressão de capturar complexos de anticorpo celíacos, porém a discriminação entre os resultados com amostras celíacas e controles não foi satisfatória. Gelatina foi descoberta capturar eficientemente os complexos antígeno-auto-anticorpo celíacos com elevada densidade ótica e especificidade. As densidades óticas foram consistentemente mais elevadas que aquelas observadas com o teste de sangue total usando anticorpos de captura IgG humano de pacientes celíacos com deficiência de IgA. Investigando as placas após a captura com o anticorpo tTG monoclonal CUB7402, foi descoberto que quantidades mais elevadas de transglutaminase foram capturadas das mesmas amostras de sangue total pelas placas por gelatina que pelos anticorpos IgG de transglutaminase humano (densidade ótica média 1,485+/-0,727 versus 0,729+/-0,343). Portanto, uma diluição maior da amostra podería ser aplicada de modo que aumentasse adicionalmente a discriminação entre amostras de paciente celíaco e controles.

Em verificações adicionais com amostras de sangue total de 21 pacientes celíacos competente a IgA e 62 controles usando diluições de amostra 1:80, as densidades óticas para as amostras celíacas foram 0,908 ± 0,561 e aquelas para os controles foram 0,061 ± 0,0480 quando o IgA humano ligado a placa foi medido em 492 nm. Celíacos tratados (n=21) mostraram um valor médio de 0,198+0,248. No corte onde esse teste detectou todos celíacos não tratados, 93,5% de especificidade foi observada.

ExempIo3 Detecção de pacientes celíacos com deficiência em IgA O uso de gelatina como um composto de captura também permite a medição de complexos antígeno-auto-anticorpo capturado a partir de amostras de sangue total de pacientes celíacos com deficiência em IgA, devido a esta proteína de captura não interferir com a detecção de complexos transglutaminase-auto-anticorpo que podem conter apenas IgG e põem não conter IgA.

Portanto, o teste de sangue total com captura de gelatina também foi realizado com uma reação final que detecta anticorpos humanos de classe IgG ligados a placa usando anticorpos monoclonais contra IgG humano (de Pharmacia’s Glúten EIA kit) e anticorpos de coelhos conjugados com peroxidase anti-camundongo (DAKO). Com esta configuração, as amostras de sangue obtidas de pacientes com deficiência em IgA com doença celíaca ativa (n=8) testados altamente positivos (densidade ótica média 0,824±0,284) enquanto a densidade ótica mediados controles na detecção IgG foi 0,118+0,053.

Exemplo 4 Correlação com valores hematocríticos do sangue Com a finalidade de assegurar se o desempenho do teste de sangue total é influenciado pela presença de anemia, a qual poderia diminuir as quantidades de auto-antígeno celíaco nas amostras de sangue total, valores hematocríticos de pacientes respectivos foram medidos no tempo de amostragem de sangue com a finalidade de testes clínicos. As densidades óticas obtidas com o teste de sangue total não mostraram correlação com os valores hematocríticos, nem em pacientes celíacos (R=0,076) nem no material total (11=0,068). Até os valores hematocríticos tão baixos quanto os resultados positivos 0,277 (anemia severa) foram obtidos com as amostras de pacientes celíacos.

REIVINDICAÇÕES

Claims (14)

1. Método de detecção de doenças induzidas por glúten em uma amostra de sangue de um indivíduo, CARACTERIZADO pelo fato de que uma amostra sanguínea contendo células do glóbulo vermelho (hemácias - RBC) é hemolisada para liberar transglutaminase do tecido (tTG) a partir de RBCs na amostra, o tTG liberado é deixado para reagir com auto-anticorpos anti-tTG possíveis na amostra para formarem um complexo antígeno-anticorpo, e referido complexo é analisado, por meio da qual a presença de referido complexo indica uma doença induzida por glúten.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença a ser detectada é doença celíaca (CD) ou dermatite herpetiforme (DH).

3. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o complexo antígeno-anticorpo é capturado para um suporte de sólido por uma proteína de captação de tTG e o complexo capturado é detectado por um imunoensaio.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de captação tTG é um anticorpo anti-tTG.

5. Método de acordo com as reivindicações de 1 até 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o complexo antígeno-anticorpo é capturado por IgG anti-tTG humano.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo de captação é uma mistura de pelo menos dois anticorpos IgG humanos com diferente especificidade de epítopo e obtido de pacientes celíacos com deficiência em IgA.

7. Método de acordo com as reivindicações de 1 até 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o complexo antígeno-anticorpo é capturado por fibronectina, anticorpo fibronectina ou gelatina.

8. Método de acordo com as reivindicações de 3 até 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o imunoensaio é um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA).

9. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que: i) uma amostra de sangue total é hemolisada por congelamento e descongelamento, ii) a amostra é deixada parada por um tempo suficiente para os complexos antígeno-anticorpo serem formados, iii) a amostra está em contato com IgG anti tTG em um suporte sólido, e iv) os complexos antígeno-anticorpo capturados pelo IgG anti-tTG no suporte sólido são detectados por ELISA usando anti-anticorpos contra IgA humano.

10. Uso de transglutaminase de tecido (tTG) liberada das células do glóbulo vermelho (RBCs) de uma amostra sanguínea em um ensaio para detectar auto-anticorpos anti-tTG em referida amostra, pela qual a presença de referidos auto-anticorpos indica uma doença induzida por glúten.

11. Kit teste, CARACTERIZADO pelo fato que compreende dispositivo para analisar um complexo antígeno-anticorpo formado entre a transglutaminase de tecido liberada (tTG) e auto-anticorpos anti-tTG em uma amostra sanguínea, e dispositivos de captura para capturar o complexo antígeno-anticorpo.

12. Kit teste, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato que compreende dispositivos para detectar o complexo antígeno-anticorpo capturado.

13. Kit teste, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato que os dispositivos de captação compreendem anticorpos anti-tTG ligados a um suporte sólido e os dispositivos de detecção compreendem anti-IgA marcados e reagentes necessários para a detecção da marca.

14. Método de detecção de doenças induzidas por glúten em uma amostra sanguínea de um indivíduo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra sanguínea hemolisada do referido indivíduo é reagida com uma proteína de captação de tTG após a qual qualquer complexo antígeno-anticorpo capturado é analisado, por meio da qual a presença de referido complexo indica uma doença induzida por glúten.