BRPI0103922B1 - Composição inoculante de base aquosa para sementes, sementes revestidas e método para armazenagem da composição - Google Patents

Description

" COMPOSIÇÃO INOCULANTE DE BASE AQUOSA PARA

SEMENTES, SEMENTES REVESTIDAS E MÉTODO PARA ARMAZENAGEM DA COMPOSIÇÃO " Campo da Invenção A presente invenção se refere a uma composição inocu- lante de base aquosa para sementes, particularmente legumi- nosas, contendo pelo menos uma espécie de microrganismos fixadores de nitrogênio em plantas, mais particularmente bactérias do gênero Rhizobivm ou Bradyrhizobivun, que pro- porcionam as plantas com capacidade de nodulação aumentada, e permanecem estáveis à temperatura ambiente, sem decrésci- mo do número de bactérias viáveis durante períodos de tempo estendidos.

Panorama da Invenção A relação simbiótica entre plantas leguminosas e bac- térias do gênero Rbxzobivm é muito bem conhecida. Plantas leguminosas formam· um grande grupo de plantas ao qual vege- tais de importância econômica como feijão soja, alfalfa, amendoim, ervilhas, etc., pertencem. As bactérias do gênero Khizobium são capazes de infectar as raízes das plantas, desde que elas permeiam (penetram) dentro dos cabelos radi- culares e colonizam a raiz, produzindo aqueles caracterís- ticos "nódulos". Como um resultado desta relação simbióti- ca, plantas podem transformar nitrogênio gasoso em compos- tos orgânicos de nitrogênio, por intermédio do processo descrito como fixação de nitrogênio.

Quando sementes de leguminosas são semeadas em uma área que não tenha sido previamente cultivada, ou que tenha permanecido não cultivada durante algum tempo, microrganis- mos Rhizobiwn irão ser provavelmente escassos no solo. Em tais casos, é uma prática freqüente que as sementes sejam inoculadas antes da semeadura, para assegurar a desejada nodulação. Plantas leguminosas são consideravelmente bene- ficiadas como formas de nódulos fixadores de nitrogênio at- mosférico, obtendo resultados aperfeiçoados e conteúdo de proteína mais elevado. Paralelamente, em solos deficientes em nitrogênio, benefícios são obtidos desde que seus conte- údos originais não estejam exauridos.

Existem muitas espécies e cepas diferentes das bacté- rias Rhizobivm. Assim, cepas específicas podem ser identi- ficadas para cada colheita, que não irão necessariamente fazer uma nodulação efetiva em uma colheita diferente. Em- bora a maioria dos solos contenham uma população rhizobiana (de Rhizobivaa) natural, estas cepas selvagens são freqüen- temente ineficientes para uma fixação de nitrogênio deseja- da. Conseqüentemente, o melhor caminho para assegurar uma simbiose apropriada com uma determinada colheita é inocular tanto a semente ou quanto o solo, no momento da semeadura, com bactérias de uma cepa rhizobiana selecionada.

As bem conhecidas composições inoculantes de Rhizobivaa contém a cepa microbiana juntamente com um meio carreador (de suporte) apropriado.

Inicialmente, composições inoculantes foram utilizadas em culturas agarizadas (com ágar) e elas não foram muito populares naquela época de maneira que sua utilização prá- tica foi muito limitada. Então, formulações com turfa como meio carreador foram utilizadas, que estão ainda sendo uti- lizadas no presente (atualmente).

Sementes revestidas com um filme inoculante é o mais preferido método de inoculação. 0 inoculante é colocado em contato intimo com as sementes de maneira a assegurar uma formação rápida de nódulos em plantas após germinação. Isto pode ser conseguido por intermédio da aplicação de uma com- posição pulverizada de bactérias em estado adormecido (ina- tivo, latente), em uma mistura com um carreador pulveriza- do, tal como kaolim (caulim), turfa, etc. Embora um produto estável seja obtido, o pulverizado não está completamente aderido sobre e nas sementes, assim resultando na perda de pulverizado e conseqüentemente no decréscimo de concentra- ção bacteriana no revestimento, paralelamente aos problemas nas máquinas de semeadura, tais como bloqueio de tubulações e outros condutos que transportam as sementes em direção ao solo.

Adicionalmente ainda, inoculantes à base de óleo apa- receram, que trouxeram importantes vantagens práticas para sua aplicação, quando comparados às formulações pulveriza- das, paralelamente possibilitando a preparação de formula- ções misturadas de inoculante e fungicidas. Entretanto, e desvantajosamente, de maneira a garantir uma boa sobrevi- vência das bactérias neste tipo de formulações, é necessá- rio armazená-las a cerca de 0o C, o que aumenta os custos, desde que isto necessita haver equipamentos de resfriamen- to, e manutenção de cadeia de resfriamento até o momento que elas sejam eventualmente (efetivamente) utilizadas.

Recentemente, inoculantes de base aquosa foram desen- volvidos, que possuem a mesma utilização prática como os inoculantes à base de óleo, uma importante vantagem sobre estes sendo a de que os inoculantes de base aquosa podem ser armazenados à temperatura ambiente durante longos perí- odos de tempo, sem decréscimo do número de bactérias viá- veis . É conhecido que o processo de fixação de nitrogênio é ativado por uma enzima nitrogenase que contém molibdênio (Mo). Se molibdênio pudesse ser espalhado (borrifado) sobre a superfície da semente no momento de germinação, bactérias inoculantes poderíam conseguir uma nodulaçâo rápida e, bem como uma imediata fixação de nitrogênio do ar.

Um importante fator adicional para levar em considera- ção é a liberação de compostos tóxicos, usualmente chamados exudatos, pelas sementes. Estes exudatos possuem um efeito de inibição sobre bactérias, fungos, leveduras, etc. Estes efeitos podem também ser verificados nas sementes de legu- minosas. Os mais importantes agentes para resposta tóxica foram identificados como taninos condensados em trifólio (trevo) branco {Txifolium Repens L.) para Rhlzoblum (Young & Paterson, 1.980); para quatro cepas de Rhizobivm txifolii (T. Stibterraneum L., T. Visiculosum Savi e T. Pratense L.) é provavelmente envolvida uma reação entre o ácido tânico da semente e o ferro do meio (The Zamik & Wright, 1.987); D' Arcy-Lameta A. {Study of Soybean and lentil root exuda- tes; Identification of some polyphenolic compounds; Relati- on with planlet physiology. Plant and Soil, 92, 113-123, 1.986) identificou alguns compostos polifenólicos em difu- satos de sementes de lentilha (Lens culinaris) e de semen- tes de feijão de soja {Glycine max L. ) . Outros exudatos identificados foram Miricetina (3, 5, 3', 4', 5' - hexahi- droflavona), desoxi-5-flavonas, isoflavonóides (Ali, F. S. and You Loymnachan, Inhibition of Bradyrhizobium japonicum by Diffusates from soybean seeds. Soil Biol. Biochem, 22 (7) , 973-976, 1.990) .

No momento de inoculação, as sementes inoculadas de leguminosas começam interagindo com as bactérias sobre sua superfície (Rhizobium e Bradyrhizobium) , assim produzindo uma morte progressiva dos referidos microrganismos (Bowden, G. D., The toxicity of legume seeds diffusate towards Rhi- zóbia and other bactéria. Plant and Soil, 15 (2), 155-165, 1.961) .

De maneira a evitar estes inconvenientes, estes exuda- tos, tais como os taninos, podem ser, em alguma extensão, neutralizados por um outro composto possuindo funções bási- cas, que é inerte para as bactérias benéficas e para a se- mente/planta.

Resumo da Invenção Foi descoberto que a nova combinação de um composto de molibdênio e um composto que neutraliza exudatos tóxicos da semente em uma base aquosa proporciona uma composição ino- culante que produz uma formação imediata de nódulos na co- roa da raiz das plantas germinadas, e consequentemente fi- xação de nitrogênio, com o que uma planta forte com uma performance de proteína elevada é obtida a partir do iní- cio. A nova combinação de um composto neutralizador destes exudatos tóxicos com um composto de molibdênio sobre a su- perfície da semente, proporciona a raiz da planta germinada com uma elevada concentração de bactérias rhizobianas viá- veis e uma disponibilidade de molibdênio independentemente das características do solo. Esta nova combinação proporci- ona resultados de performance de plantas inoculadas com esta composição, que são vantajosamente diferidas daquelas inoculadas com as formulações tradicionais.

Esta invenção proporciona uma composição inoculante em uma base aquosa para sementes que compreende pelo menos uma espécie de microrganismo que possui um efeito benéfico so- bre plantas, um composto de molibdênio e um polímero sele- cionado daqueles que possuem uma metade amida, amina ou imina e excipientes apropriados.

Plantas são leguminosas, com os microrganismos seleci- onados preferíveis sendo aqueles do gênero Rhizobivcm. ou Bradyxhlzobivm.

Um polímero preferido a ser empregado nesta invenção é polivinil pirrolidona (FVP), preferivelmente em uma concen- tração de cerca de 0,2 % peso/peso até 5 % peso/peso da composição.

Compostos de molibdênio preferidos são sais inorgâni- cos, preferivelmente sais de metais alcalinos, tais como molibdato de sódio e molibdato de potássio. Um sal mais preferido é molibdato de potássio, em uma concentração se situando entre 0,01 % em peso e 2,00 % em peso da composi- ção. Mais preferivelmente, o composto de molibdênio está presente em uma concentração de 0,20 % em peso da composi- ção.

Adicionalmente, a invenção proporciona uma semente possuindo um revestimento que compreende pelo menos uma das espécies de microrganismo possuindo um efeito benéfico so- bre plantas, um composto de molibdênio e um polímero sele- cionado entre aqueles apresentando uma metade amida, amina ou imina. A invenção proporciona, também, um método para produ- ção da imediata formação de nódulos na raiz de plantas le- guminosas que compreende revestir as sementes de legumino- sas com a composição acima descrita. É um objetivo adicional da invenção proporcionar uma composição líquida inoculante em uma base aquosa, tal como aquela aqui anteriormente descrita, que pode ser armazenada à temperatura ambiente durante um longo período de tempo, enquanto mantendo a concentração de bactérias viáveis ne- cessárias durante cerca de dois anos.

Descrição Detalhada da Invenção A invenção é realizada utilizando bactérias do gênero Rhizobium e Bradyrhizobium, que são capazes de formação de nódulos nas raízes de uma ou mais espécies de plantas legu- minosas. Cepas preferidas incluem Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium meliloti, Rhizobium leguminosarum biovar trifo- lii, Rhizobium leguminosarum biovar viceae e Rhizobium le- guminosarum biovar phaseoli. A seleção de cepas de Rhizobium e Bradyrhizobium efi- cientes para fixação de nitrogênio é uma primeira etapa ne- cessária para produção de um inoculante de semente legumi- nosa de elevada qualidade. Especificidade de efetividade é expressada como diferenças na ação entre espécies e dife- renças entre as espécies. Fatores ecológicos deveríam tam- bém ser levados em consideração, tal como capacidade compe- titiva para crescimento no solo e na rhizosfera, habilidade competitiva para formação de nódulos e sobrevivência, tanto na presença e quanto na ausência da planta. Outros fatores a serem levados em consideração para seleção de uma cultura microbiana são tolerância aos meios carreadores, tolerância ao substrato onde ela é aplicada e características de solo.

Após a desejada cepa de rhizobiana ser selecionada, ela é cultivada em um meio de crescimento no interior de um fermentador convencional. Um meio de crescimento adequando pode ser, por exemplo, um meio aquoso possuindo sacarose, levedura autolisada, fosfato de potássio, fosfato de magné- sio heptahidratado, cloreto de cálcio e cloreto férrico. A fermentação é conduzida preferivelmente sob agitação a cer- ca de 30° C, até que uma elevada concentração de bactérias seja conseguida.

Para viabilizar a composição inoculante inventiva, lâ- minas da cultura bacteriana fresca possuindo células viá- veis são misturadas com lâminas equivalentes de uma suspen- são esterilizada contendo um composto de molibdênio e um polímero do tipo apresentando uma metade amida, amina ou imina, tal como polivinil pirrolidona. Concentração de cé- lulas viáveis utilizada é aquela necessária para obtenção de uma concentração na composição final da invenção de cer- ca de 5,0 x 109 bactérias/ml.

Polímeros possuindo um nitrogênio amídico podem ser aqueles do tipo possuindo sub-unidades carregando um anel de 2-pirrolidona, tal como polivinil pirrolidona (FVP), po- límeros de vinil pirrolidona alquilados, vinil pirroli- dona/vinil acetato, estireno e copolímeros derivados subs- tituídos .

Preferivelmente, PVK K-60 é utilizado, tal como Lu- viskol K-60 da BASF. Também polímeros de vinil pirrolidona alquilados podem ser utilizados (Agrimer AL, fornecido pela International Speciality Products).

Uma faixa adequada para concentração de FVP e os asse- melhados na composição inoculante pode ser de cerca de 0,2 % peso/peso e 5 % peso/peso. Preferivelmente, uma concen- tração de 3 % peso/peso é utilizada. A suspensão também contém adjuvantes adequados que são proporcionados para estabilidade na composição final. Como tais adjuvantes, estabilizadores podem ser utilizados tais como carboxi metil celulose, goma arábica, alginato de só- dio e os assemelhados. Preferivelmente, alginato de sódio é utilizado em concentração se situando na faixa a partir de 0,1 % em peso até 1 % em peso, mais preferivelmente cerca de 5 % em peso.

Preferivelmente, também carboxi metil celulose é uti- lizada em uma concentração de cerca de 0,5 % em peso e 2 % em peso, mais preferivelmente a cerca de 1 % em peso.

Adicionalmente, a composição pode conter nutrientes ou fatores de crescimento, tais como açúcares, aminoácidos, proteínas, sais, e os assemelhados. Adicionalmente, a com- posição pode conter agentes osmoreguladores, tampões, etc. A composição inoculante da invenção pode ser armazena- da à temperatura ambiente por cerca de dois anos, a sobre- vivência de bactérias sendo garantida. A composição aquosa inventiva pode ser armazenada em bolsas plásticas de 250 ml, que são esterilizadas antes de enchimento e vedadas após o enchimento. 0 revestimento de sementes pode ser realizado pelo es- pargimento ou simplesmente misturando a composição aquosa com as sementes em um funil de enchimento ou receptáculo adequado até um revestimento de semente uniforme ser conse- guido. A proporção inoculante/semente pode ser de cerca de 150 cm3 da composição inoculante por 50 kg de sementes. A invenção foi genericamente descrita, e irá ser me- lhor compreendida quando tomada com referência a determina- dos exemplos não limitantes, que estão incluídos somente para propósitos ilustrativos.

Exemplo 1 Preparação de composição Uma colônia única de Bzadyrbizobivm japonlcum foi se- meada em 100 ml de um meio de cultura (1 % de sacarose, 0,05 % de levedura autolisada, 0,022 % de K2HP04, 0,01 % de MgS04.7H20, 0,004 % de CaCl2 e 0,002 % de FeCl3 em água) .

Ela foi incubada por 7 dias a 30° C em um agitador rotativo a 120 rpm. 0 processo foi repetido trazendo os 100 ml a 1 litro de meio fresco, e fermentando novamente. 1.000 ml da cultura obtida foram misturados com 1.000 ml de uma solução resfriada esterilizada, preparada a par- tir da dissolução em água de 0,5 % de alginato de sódio, 1 % de carboxi metil celulose, 3 % de polivinil pirrolidona e 0,2 % de K2Mo04. A mistura foi empacotada sob condições esterilizadas em bolsas plásticas de 250 cm3 previamente esterilizadas.

Exemplo 2 Viabilidade de Bradyxhlzobxxaa japonlcum na compo- sição inoculante Amostras da composição preparada em concordância com o Exemplo 1 foram armazenadas durante 720 dias. Periodicamen- te, uma amostra foi extraída e viabilidade foi determinada, e contagem de células executada, a concentração de composi- ção inicial (tempo 0) sendo de 5,0 x 109 unidades de forma- ção de colônia/ml (cfu/ml). Os resultados estão mostrados na Figura 1. Análise da curva obtida mostra que a composi- ção inoculante aquosa mantém viabilidade de Bradyrhizobiwxi japonicwn acima de 10® cfu/ml durante o 720° dia e é acima de 109 cfu/ml durante os primeiros 300 dias.

Exemplo 3 Viabilidade de Bra.dyxhxzdbi.um japonicvm sobre se- mentes Dois quilogramas de sementes de feijão de soja foram inoculadas com a composição obtida em concordância com a descrição no Exemplo 1. A inoculação foi feita pela mistura da composição inoculante com as sementes em uma bolsa ou canhamaço à prova de água até que um revestimento uniformi- zado sobre as sementes foi conseguido. Uma proporção de inoculante/semente similar àquela determinada para uma se- meadura de campo foi utilizada, isto é, cerca de 150 cm3 de inoculante/50 kg de sementes. Um processo similar foi uti- lizado para um lote de controle, com um inoculante sem PVP/Mo.

Periodicamente, 50 sementes a partir de cada formula- ção foram tomadas de cada vez, e elas foram colocadas em um béquer (beaker) onde e ao qual 100 ml de solução fisiológi- ca foram adicionados. Através de agitação, bactérias inici- almente aderidas à cutícula de semente passaram pela e na solução. Semeadura foi feita e contagem de bactérias foi executada, e número de bactérias por sementes (ou unidades de formação de colônia/semente, cfu/semente) foi calculado.

Este processo foi repetido à 8, 24, 48, 168 e 336 horas. A temperatura de ensaio foi 30° C. Os resultados estão mos- trados na Tabela 1 abaixo.

Resultados desta experiência mostram que adição de PVP à composição inoculante proporciona um número mais elevado de bactérias viáveis presentes no revestimento de semente, que permaneceu acima de 104, mesmo quando o grupo de con- trole não duradouramente proporcionou bactérias viáveis (336 horas).

Exemplo 4 Viabilidade de Br a dyrhi z ohi um japonicvm sobre se- mentes Um ensaio foi conduzido seguindo o processo geral ex- plicado no Exemplo 3, mas a partir de inóculos com diferen- tes concentrações de bactérias. Os resultados seguem na Ta- bela 2 e Figura 2. A partir da representação de dados da Figura 2, é per- feitamente observado que a adição de FVP à composição ino- culante proporciona uma duradoura persistência às bactérias sobre o revestimento de semente. De fato, a diminuição na contagem é somente por duas ordens de magnitude após 336 horas terem decorrido, enquanto utilizando um inoculante sem PVP, persistência de bactérias é seriamente afetada, contagem diminuída por cinco ordens de magnitude, exatamen- te por 1 ufc/semente após 336 horas.

Exemplo 5 Ensaios de nodulação Dois quilogramas de sementes de feijão de soja foram inoculadas com a composição obtida em concordância com a descrição no Exemplo 1. A inoculação foi feita pela mistura da composição inoculante com as sementes em uma bolsa ou canhamaço à prova de água até que um revestimento uniformi- zado sobre as sementes foi conseguido. Uma proporção de inoculante/semente similar àquela determinada para uma se- meadura de campo foi utilizada, isto é, cerca de 150 cm3 de inoculante/50 kg de sementes. Um processo similar foi uti- lizado para um lote de controle, com um inoculante similar, mas sem FVP/Mo. 150 béqueres (beakers) com vermiculita esterilizada foram preparados. Semeadura foi como se segue: 50 béqueres com uma semente livre de inoculante (referência negativa) cada; 50 béqueres com uma semente inoculada com uma compo- sição aquosa (inoculante de controle), sem PVP/Mo; e 50 bé- queres com uma semente cada, inoculados com a composição com PVP/Mo; preparados em concordância com a descrição do Exemplo 1.

Os béqueres foram colocados em uma estufa para plantas sob as seguintes condições: Luz: fotoperiodo 16/8; fonte de luz: teto coberto com tubos de luz diurna (daylight) e Gro-Lux em uma taxa de 2 : 1, colocados a cerca de 40 cm de altura a partir das bordas dos béqueres. Intensidade sobre a borda do béquer foi cerca de 4.600 lux.

Temperatura máxima: 30° C; temperatura mínima diurna: 25° C; temperatura mínima noturna: 20° C.

Umidade relativa mínima: 65 %.

Os béqueres foram irrigados com uma solução de Jensen (2 ml de K2HP04 a 10 %, 5 ml de MgS04.7H20 a 4 %, 10 ml de NaCl a 2 %, 0,1 ml de FeCl3 a 10 %, 1 g de CaHP04 em 1 li- tro de água destilada esterilizada, com um pH final de 6,9), diluída a 25 %. Após uma semana, algumas observações foram feitas, pequenos nódulos foram detectados nas raízes das plantas tratadas com o inoculante de PVP/Mo, enquanto nas plantas de referência negativa e nas plantas de contro- le nenhum nódulo foi detectado.

Uma semana mais tarde, toda a semeadura foi removida. O número de plantas foi anotado bem como o número de nódu- los por planta. Os resultados estão mostrados na Tabela 3 abaixo.

Menção deve ser feita que 100 % das plantas tratadas com o inoculante inventivo alcançaram uma média de 10,03 nódulos de bom tamanho por planta na coroa de raiz. Que 81,25 % das plantas tratadas com o inoculante de controle alcançaram uma média de 5,64 nódulos, mas de menor tamanho, por planta. Plantas sem revestimento inoculante (referência negativa) não desenvolveram nenhum nódulo de qualquer modo.

Após a natureza da invenção ter sido descrita e espe- c;'-ficada, bem como a forma de colocar a invenção em práti- ca, é reivindicado como proteção pelo requerente o contido nas reivindicações anexas.

Claims (8)

1. Uma composição inocuiante de base aquosa para sementes de leguminosas, caracterizada pelo fato de que a composição compreende pelo menos um microrganismo fixador de nitrogênio viável selecionado do gênero Rhizohium ou Bradyrhizobium possuindo um efeito benéfico sobre as plantas que irão crescer a partir das sementes, um composto de molibdênio e um polímero· selecionado a partir do grupo que apresenta uma metade amida, amina ou imina e excipientes adequados, em que o inocuiante mantém a viabilidade do microrganismo nele contido por até dois anos quando armazenado à temperatura ambiente.

2. Uma composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os mícrorganismos são uma cepa selecionada a partir do grupo formado por Bradtyrbi zobi um japoaicvaa, Shizobium melilotl, Rhizobium 7 pgiimí no«a rena biovai trifolíí, Bhizobium leguminosarum Jbxovar viceaô e Rhlzobium 1 cgumlnosazvtm biovar phaseoli.

3. Uma composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido composto de molibdênio é selecionado a partir de molibdatos de metal alcalino em uma concentração se situando entre 0,01 a 2,0% peso/peso da composição.

4. Uma composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o referido composto de molibdênio é um moíibdato de potássio.

5. Uma composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o polímero é selecionado a partir de polivinil pirrolídona, polímeros de vinil pirrolídona alquilados, copolímeros de acetato· de vinil e vinil pirrolídona, e copolímeros de estireno e vinil pirrolídona, em uma concentração de 0,2 a 5,01 peso/peso da composição.

6. Uma composição inoculante de base aquosa de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma cepa de Bradyxhí zobium japonicum em uma quantidade eficaz para promover a fixação de nitrogênio em plantas que Irão crescer a partir de sementes de feijão de soja, de 0,01 a 2,01 peso/peso de molibdato de potássio, de 0,2 a 5,0% peso/peso de polívirtil pirrolidona e excipientes adequados.

7. Uma semente revestida com uma composição inoculante, caracterizada pelo fato de que a composição compreende uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6,

8. Um método para o armazenamento à temperatura ambiente de uma composição inoculante de microrganismos viáveis de acordo com a reivindicação 1, caracterizado polo fato de compreender os seguintes estágios: • seleção de uma cultura de células viáveis do gênero Rhizobium ou. Bradyrhizobium, • misturaçâo da referida cultura com uma solução aquosa de 0,01 a 2,0 % peso/peso de um composto de molibdênio, de 0,2 a 5,01 peso/peso de um polímero selecionado dentre aqueles que apresentam uma metade de amida, amína ou imina e excipientes apropriados, e • armazenagem da composição à temperatura ambiente, pronta para uso.