BR9910703B1 - “CEPA delta THY A DO VIBRIO CHOLERAE, E, VACINA” - Google Patents

Description

"CEPA Δ THY A DO VIBRIO CHOLERAE, E, VACINA" A presente invenção diz respeito a um processo de produzir cepas thy A’ do Vibrio cholerae, a tais cepas e ao seu uso. A invenção particularmente diz respeito a uma cepa do Vibrio cholerae que tenha sido destituído do seu gene thy A no cromossoma, isto é, uma cepa Δ thy A que carece da funcionalidade do gene thy A. Esta cepa pode compreender um ou vários elementos de DNA epissomais de replicação autônoma, tal como plasmídeos que tenham um gene thy A funcional, opcionalmente estranho, por exemplo, E. coli que permita que a cepa se desenvolva na ausência de timina no meio de desenvolvimento e opcionalmente tenha um gene estrutural que codifique uma proteína homóloga ou heteróloga. A invenção ainda diz respeito a seqüências de nucleotídeos de %Aea proteínas por elas codificadas e a uma vacina que compreenda como um componente imunizante uma cepa Δ thy A do Vibrio cholerae da invenção ou uma cepa thy K do V. cholerae produzida pelo processo da invenção.

FUNDAMENTOS A expressão de genes recombinantes em hospedeiros bacterianos é mais freqüentemente obtida pela introdução de elementos epissômicos auto replicadores (por exemplo, plasmídeos) que codificam o gene estrutural da proteína de interesse sob o controle de um promotor apropriado na bactéria hospedeira. Tais plasmídeos são mais comumente mantidos pela inclusão de genes marcadores seletivos que codificam proteínas que conferem resistência a antibióticos específicos (tais como ampicilina, cloranfenicol, canamicina, tetraciclina, etc.). Estes são depois mantidos no hospedeiro pela adição do antibiótico apropriado ao meio de cultura. A manutenção estável de plasmídeos em cepas hospedeiras ffeqüentemente requer a adição da seleção de antibiótico apropriada sem que estes possam segregar aumentando para números significantes de célula em qualquer cultura que sejam destituídas do plasmídeo e que portanto não podem expressar o produto desejado.

Entretanto, o uso de antibióticos na produção de proteínas recombinantes é indesejável por várias razões. Além do aumento óbvio nos custos que surge da necessidade de adicioná-los como um suplemento ao meio de cultura, o uso de antibióticos é considerado um problema na produção de qualquer proteína recombinante pretendida para o uso humano ou veterinário. Isto é primariamente por três razões. Primeiramente, os antibióticos residuais podem causar, em indivíduos sensíveis, graves reações alérgicas. Em segundo lugar, existe a possibilidade de seleção de bactéria resistente ao antibiótico na flora bacteriana natural daqueles que usam o produto e finalmente, o DNA que codifica a resistência ao antibiótico também pode ser transferido para bactérias sensíveis nos indivíduos que usam o produto, deste modo disseminando também resistência não desejada ao antibiótico em um co-hospedeiro. Já existem invenções que lidam com este problema, um dos tais é o gene par que matará eficazmente todas as células que não retiverem uma cópia do plasmídeo depois de cada divisão celular [1].

Um outro pedido de patente [2], que diz respeito sobre a invenção aqui descrita, foi fundamentado sobre o conhecimento da seqüência do DNA do thy A no E. coli. Os autores introduziram o gene thy A em um plasmídeo, porém usaram cepas hospedeiras que foram mutantes espontâneos do thy A' selecionados com base na resistência ao trimetroprim. Tais mutantes não são bem definidos (carregam mutações de ponto ou pequenas supressões) e podem reverter para o tipo selvagem (isto é, thy A+) em freqüências inaceitavelmente altas. Isto pode levar ao fato de que a bactéria hospedeira possa eliminar o plasmídeo e em conseqüência perder, ou não dar a produção compatível e confiável do produto recombinante desejado. Um problema adicional com a seleção por trimetoprim é a possibilidade de que a dependência à timina resultante possa surgir devido a uma mutação no gene da diidrofoliato reductase (folA) e portento não ser complementada por um gene thy A originário de plasmídeo [3], Este pedido de patente foi interrompido, pelo menos na Europa. O uso do V. cholerae para a expressão dos genes recombinantes mostrou ser vantajoso em relação a outros sistemas procarióticos de expressão em uso comum em que produtos recombinantes específicos podem ser produzidos em grandes quantidades e secretados no meio de cultura, facilitando deste modo os procedimentos de purificação a jusante. Isto está em contraste ao E. coli, onde o produto freqüentemente se agrupa no espaço periplásmico [4].

Um fator importante que dota ο V. cholerae com esta propriedade são os genes eps no V. cholerae [5]. A timidilato sintetase codificada pelo gene thy A do Escherichia coli e outras bactérias catalisa a metilação do desoxiuridilato (dUMP) para desoxitimidilato (dTMP) e é uma enzima essencial na biossíntese do trifosfato de desoxirribotimidina (dTTP) para a incorporação no DNA. Na ausência desta enzima a bactéria toma-se dependente de uma fonte externa de timina que é incorporada no dTTP por um caminho de recuperação codificado pelos genes deo [6].

Os mutantes expontâneos que são thy A' podem ser facilmente isolados com base na resistência ao trimetoprim. Este antibiótico inibe a regeneração do diidrofoliato produzida pela síntese de dTMP catalisada pela timidilato sintetase. Desta maneira se as células são thy A' tomam-se dependentes da timina, porém não mais esgota o lago de tetraidrofoliato na presença do trimetoprim.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção está, em seus diferentes aspectos, fundamentada na nova seqüência de nucleotídeo do gene thy A no Vibrio cholerae. Uma aplicação útil do gene thy A é, por exemplo, na manutenção de plasmídeos recombinantes utilizados na superprodução de proteínas recombinantes no V. cholerae e no uso da seqüência para a inserção de genes estranhos de uma maneira selecionável e específica por sítio no cromossoma do V. cholerae.

Um aspecto da invenção está direcionado a um processo para produzir uma cepa thy A do Vibrio cholerae que compreende a etapa de mutagênese direcionada por sítio no cromossoma do V. cholerae para a supressão e/ou inserção de nucleotídeos de gene no local do gene thy A tendo essencialmente a seqüência de nucleotídeo SEQ ID NO: 1 da Figura 1. A expressão “tendo essencialmente a seqüência de nucleotídeo” neste relatório descritivo e reivindicações é intencionada compreender seqüências de nucleotídeo que tenham algumas extensões, mutilações, supressões ou adições de nucleotídeo, naturais ou não naturais que não interfiram com a função natural da seqüência de nucleotídeo em questão.

Um outro aspecto da invenção está direcionado a uma cepa thy A do Vibrio cholerae que é uma cepa Δ thy A que carece da funcionalidade do gene thy A.

Em uma modalidade deste aspecto da invenção a cepa Δ thy A do V. cholerae compreende um ou vários elementos de DNA epissomais de replicação autônoma tendo uma funcionalidade de gene thy A que permite que a cepa desenvolva na ausência de ti mi na no meio de desenvolvimento.

Em uma modalidade preferida o elemento de DNA epissomal de replicação autônoma é um plasmídeo.

Em uma outra modalidade preferida a cepa Δ thy A de acordo com a invenção compreende em um elemento de DNA epissomal de replicação autônoma, especialmente um plasmídeo, um gene thy A estranho, tal como um gene do E. coli.

Em uma modalidade particularmente preferida deste aspecto da invenção a cepa Δ thy A de acordo com a invenção compreende em um ou vários elementos de DNA epissomal de replicação autônoma, especialmente plasmídeos, além de um gene thy A estranho, tal como um gene E. coli, também um gene estrutural que codifica uma proteína homóloga ou heteróloga, tal como a subunidade B da enterotoxina instável ao calor do Escherichia coli (LTB) ou da proteína de 26 kD da glutationa S-transferase (GST 26 kD) do Schistosoma japonicum.

Um terceiro aspecto da invenção está direcionado a uma seqüência de nucleotídeo de uma região de flanque 5’ de um gene thy A estrutural do Vibrio cholerae tendo essencialmente a seqüência de nucleotídeo SEQID NO: 2 da Figura 2.

Um quarto aspecto da invenção está direcionado a uma seqüência de nucleotídeo de uma região de flanque 3’ de um gene thy A estrutural do Vibrio cholerae tendo essencialmente a seqüência de nucleotídeo SEQ ID NO: 3 da Figura 3. A seqüência de nucleotídeo SEQ ID NO: 1 é útil para a inserção de genes estranhos de uma maneira selecionável e específica por sítio no cromossoma do V. cholerae e para a mutagênese direcionada por sítio na produção de cepas thy A" do Vibrio cholerae.

Um quinto aspecto da invenção está direcionado a uma proteína codificada por uma seqüência de nucleotídeo de um gene thy A do Vibrio cholerae de acordo com a invenção, tal como uma proteína tendo a seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 4 da Figura 4.

Um sexto aspecto da invenção está direcionado a uma proteína codificada por uma seqüência de nucleotídeo de uma região de flanque 5’ de um gene thy A estrutural do Vibrio cholerae de acordo com a invenção, tal como a proteína tendo a seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 5 da Figura 5.

As proteínas de acordo com o quinto e com o sexto aspectos da invenção são cada uma utilizáveis para propósitos de pesquisa e alvos potenciais para a terapia antimicrobiana.

Um sétimo aspecto da invenção está direcionado a uma vacina que compreenda como um componente imunizante uma cepa Δ thy A do Vibrio cholerae de acordo com a invenção ou uma cepa thy A' do Vibrio cholerae produzida pelo processo da invenção. A vacina será usada para o tratamento profílático e terapêutico da cólera e opcionalmente de outras doenças infecciosas, especialmente em casos onde a cepa usada foi engendrada para expressar proteínas estranhas. A vacina compreenderá além do(s) componente(s) imunizador(es), um veículo, tal como solução salina fisiológica e outros componentes freqüentemente usados em vacinas tais como tampões e adjuvantes. Os veículos, tampões, adjuvantes e outros componentes utilizáveis são divulgados, por exemplo, nas Farmacopéias Européia e US.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra a seqüência de nucleotídeo SEQ ID NO: 1 do gene thy A do Vibrio cholerae. A Figura 2 mostra a seqüência de nucleotídeo SEQ ID NO: 2 da região de flanque 5’ do gene thy A estrutural do Vibrio cholerae. A Figura 3 mostra a seqüência de nucleotídeo SEQ ID NO: 3 da região de flanque 3’ do gene thy A estrutural do Vibrio cholerae. A Figura 4 mostra a seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 4 da proteína codificada pelo gene thy A estrutural do Vibrio cholerae. A Figura 5 mostra a seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 5 da proteína codificada pela região de flanque 5’ do gene thy A estrutural do Vibrio cholerae. A Figura 6 mostra a clonagem de um fragmento EcoKUHindíll contendo o gene thy A do V. cholerae no pUC19. A Figura 7 mostra uma comparação dos produtos do gene thy A do E. coli [16], V cholerae e H. influenzae [17] que apresentam o grau alto de homologia entre ο V. cholerae e o El. influenzae comparado com o E. coli. A Figura 8 mostra a inserção de um bloco de gene de resistência ao Kan® no sítio Pstl do gene thy A do V. cholerae no pUC19. A Figura 9 mostra a PCR para gerar um fragmento thy A-Kan com extremidades Xbal. A Figura 10 mostra a ligação do fragmento thy A-Kan com extremidades Xbal em plasmídeo pNQ705. A Figura 11 mostra a supressão parcial do gene thy A e o início do gene Kan no pNEB193. A Figura 12 mostra a divagem Xbal para extirpar o gene Athy A AKan do pNEB 193, ligação no pDM4 restrito ao Xbal. A Figura 13 mostra um esboço de uma estratégia para suprimir completamente o gene thy A do V. cholerae. A Figura 14 mostra a inserção da região 5’ a montante do thy A no pMT-SUICIDE 1; geração de pMT com 5 prim.

A Figura 15 mostra a inserção da região 3’ a jusante do thy A no pMT com 5 prim; geração de pMT Athy A do V. cholerae, A Figura 16 mostra o vetor de expressão pMT-eltB {thy A) usado para a expressão de LTB no V cholerae JS1569 Athy A. A Figura 17 mostra o vetor de expressão pMT-GST {thy A) usado para a expressão de GST no V. cholerae JS1569 Athy A.

DESCRIÇÃO DOS EXPERIMENTOS

Estratégia utilizada De modo a produzir mutantes thy A definidos do V. cholerae que possam ser usados como cepas adequadas de produção para proteínas recombinantes codificadas nos plasmídeos mantidos pela complementação thy A, foi primeiro necessário clonar e caracterizar o gene do tipo selvagem e as suas regiões de flanque 5, e 3’. Nossa estratégia foi primeiro clonar o gene thy A do V. cholerae em um plasmídeo, nas bases de complementação da auxotrofia do thy A em uma cepa do E. coli Kl2. A análise de restrição e os experimentos de subclonagem foram feitos de modo a localizar o gene estrutural thy A no fragmento grande de DNA inicialmente obtido. A região apropriada contendo o gene thy A e as suas regiões de flanque 5’ e 3’ do gene foram depois seqüenciadas.

Para verificar que um dos genes seqüenciados foi de fato o gene thy A do V. cholerae, comparações de homologia foram feitas com seqüências thy A de outros organismos. O gene clonado também pode complementar o fenotipo thy A de uma cepa mutante do V. cholerae que foi selecionada com base na resistência ao trimetoprim. A análise de seqüência deste mutante mostrou que este na verdade não tem uma única mudança de base no gene que identificamos como thy A, que resultou em um códon de parada que dá um produto de gene truncado não funcional. O conhecimento da seqüência thy A e da região que a circunda permitiu o uso de vetores suicidas adequados para mutagênese direcionada por sítio. As estratégias consideradas foram (a) inativação insercional, (b) uma combinação de inativação insercional e supressão de gene e (c) remoção do gene inteiro: (a) A inativação insercional do gene thy A foi obtida pela inserção de um bloco de gene Kan® (com o vetor suicida pNQ705) [14]. (b) Uma supressão de aproximadamente 400 pares de base foi realizada na cepa que carrega o bloco de gene Kan® que removeu 200 pares de base de cada um do gene thy A a montante do sítio de inserção e do gene de resistência à canamicina que foram deste modo inativados. Obtivemos assim um gene thy A suprimido onde a supressão foi na parte central do gene e seguida por uma inserção de uma região não codificadora do DNA. Esta construção foi inserida no cromossoma do V. cholerae usando-se o vetor suicida pDM4 e resultou em uma cepa chamada de JS1569 AthyAAKan. (c) A remoção completa do gene thy A foi feita ligando-se junto das regiões de flanque o gene estrutural, tomando-se o cuidado de não romper outras matrizes de leitura aberta (o rompimento do gene Igt adjacente também é letal). O DNA que carrega a supressão foi clonado em um novo vetor suicida (PMT-SUICIDE-1) usado para a inserção da seqüência no cromossoma do V. cholerae. A cepa resultante é chamada de JS1569 AthyA.

Para a expressão de genes recombinantes nestas cepas AthyA do V. cholerae, dois vetores de expressão foram construídos. Cada um consistiu do gene thy A do E. coli, da origem de replicação do vetor de alto número de cópia de propósito geral pUC19, do promotor tac e do terminador de transcrição thy A independente de rho. Em um dos dois vetores o gene laclq foi inserido de modo a regular a expressão do promotor tac que também continha a seqüência do operador lac.

Os dois genes foram clonados nestes plasmídeos e expressados na cepa suprimida do thy A recentemente gerada do V. cholerae; a JS1569A%A. O primeiro codificou a subunidade B da enterotoxina humana instável ao calor do E. coli (LTB) (Figura 16), o segundo foi o sj26 glutationa-S-transferase (GST) do Schistosoma japonicum (Figura 17). O LTB é similar na estrutura à subunidade B da toxina da cólera naturalmente produzida pela cepa hospedeira e foi secretado no meio de desenvolvimento. A outra proteína é eucariótica na origem, vindo da Asian Liver Fluke. O sj26 GST é conhecido por se expressar em níveis altos no E. coli e se acumula no citoplasma. A expressão das duas proteínas recombinantes foi avaliada com base no GM1 ELISA do sobrenadante de cultura no caso do LTB e um ensaio comercialmente disponível no caso do GST. Ambas as proteínas também foram analisadas com base no SDS-PAGE e nas Western Blot.

Origem do gene thy A

O gene thy A foi clonado a partir da cepa JS1569 do V cholerae. Esta cepa origina da cepa 569B do V. cholerae Inaba do biótipo clássico (ATCC N° 25870). A cepa tem uma supressão no gene ctxA [7] e foi tomada resistente à rifampicina [8].

Clonagem de um fragmento HindHHEcoRl DE 1,4 kB que abrange o gene thy A do V. Cholerae. O DNA cromossômico preparado pelo processo CTAB [9] foi digerido até a finalização com a enzima de restrição Hindlll. O DNA digerido foi ligado no plasmídeo de vetor de propósito geral pBR322 (New England Biolabs Inc. Beverly, MA USA) que foi digerido com Hindlll e tratado com alcalino fosfatase. A mistura de ligação foi submetida a eletroporação [10] em uma cepa E. coli HB101 que foi fenotipicamente ThyA' (selecionada com base na resistência ao trimetoprim) e a cultura disseminada sobre placas de ágar Syncase modificado (MS) [11] suplementadas com 50 μg/ml de ampicilina, porém não contendo nenhuma timina. Desta maneira, os transformantes foram selecionados tanto com base na aquisição de plasmídeo quanto na presença de um gene thy A funcional.

As colônias que desenvolveram foram separadas por linhas em colônias únicas sobre o mesmo tipo de placas de ágar e foram cultivadas em caldo MS suplementado com ampicilina. O DNA plasmídico foi preparado por “Wizard miniprepps” (ProMega Corp. Madison Wis.) e digerido com Hindlll. Um fragmento de aproximadamente 10 a 12 kB foi isolado, este clone foi chamado de ThyA B2.

Para reduzir o tamanho do fragmento, o plasmídeo foi cortado com EcoRl e religado usando-se T4 ligase. O DNA ligado foi novamente submetido a eletroporação na cepa E. coli descrita acima usando-se as mesmas condições seletivas para o desenvolvimento de transformantes.

As colônias que resultam deste experimento foram isoladas como descrito acima e DNA plasmídico purificado e analisado pela digestão dupla com EcoRl e Hindlll. Um fragmento de DNA de aproximadamente 1,4. kb restou, o qual reteve a capacidade para complementar a mutação thy A na cepa hospedeira de E. coli. Este fragmento foi clonado no plasmídeo pUC19 (New England Biolabs) que foi digerido com as mesmas duas enzimas e tratado com alcalino fosfatase. Seguindo-se a eletroporação, os transformantes do experimento foram isolados e caracterizados como descrito acima. Este clone foi chamado ThyA 1:2 (Figura 6).

Verificação de que o fragmento HindllllEcoJetl DE 1,4 kB contém o gene thy A.

Análise Southern blot. Para verificar que o fragmento clonado realmente originário do cromossoma do V. cholerae, o DNA da cepa JS1569 foi digerido até o final com Hindlll e Hindlll e EcoRI. Os fragmentos de DNA foram resolvidos por eletroforese em agarose junto com o clone digerido por Hindlll ThyA B2 e o clone digerido por Hindlll e AcoRI ThyA 1:2.

Depois da eletroforese o DNA foi transferido para uma membrana de náilon, imobilizado por irradiação de UV e hibridizado (sob condições severas) com o fragmento de 1,5 kB extirpado do clone ThyA 1:2 que foi rotulado com 32P dCTP usando-se o conjunto Amershams Multiprime.

Resultados. Em ambos DNAs cromossômicos digeridos por Hindlll e no clone ThyA B2 digerido por Hindlll, uma faixa de aproximadamente 10 kB foi evidente. Do mesmo modo no DNA cromossômico digerido por Hindlll/EcoRl e o clone do DNA plasmídico ThyA 1:2 uma faixa de 1,4 kB foi evidente (dados não mostrados). Estes dados demonstraram que o fragmento clonado foi derivado do DNA JS1569 do V. cholerae.

Transformação do JS1569 ThyA' com o ThyA 1:2 plasmídico Para verificar se o fragmento Hindlll/EcoRI clonado de 1,4 B podería suportar o desenvolvimento de V. cholerae fenotipicamente ThyA', um mutante dependente de timina do JS1569 (V. cholerae JS1569 4.4) foi submetido a eletroporação com o ThyA 1:2 plasmídico. A eletroporação e o meio seletivo foram como descrito acima. O JS1569 4.4 não desenvolveu no meio MS sem a adição de timina.

Resultados. As colônias do JS1569 4.4 que desenvolveram na ausência de timina foram isoladas. Todas mostraram abrigar o plasmídeo ThyA 1:2, sustentando deste modo a suposição de que o fragmento clonado continha o gene thy A do V. cholerae.

Seqüenciamento de DNA do ThyA 1:2 plasmídico. o DNA plasmídico foi seqüenciado pelo processo da terminação de cadeia dideóxi [12] usando-se o conjunto sequenciador de ciclo terminador ABI PRISM® Dye (Perkin Elmer). Tanto os iniciadores comercialmente disponíveis bem como os fabricados sob encomenda foram usados. As seqüências de DNA foram analisadas em um sequenciador automático ABI PRISM 373 (Perkin Elmer). Os dados foram analisados usando-se o pacote AutoAssembler Software (Perkin Elmer). As procuras por homologia com a seqüência de DNA encontrada foram feitas com o programa GCG [13].

Resultados. As melhores homologias foram com timidilato sintetases de várias espécies. Observe que a homologia com E. coli timidilato sintetase é um pouco fraca (Figura 7).

Estratégia para a supressão do gene thy A no V. cholerae JS1569.

Duas estratégias diferentes foram usadas para se obter os mutantes thy A definidos do V. cholerae JS1569, a primeira envolveu a inativação do gene thy A pela inserção de um bloco de gene Kan® seguido por uma supressão parcial do gene thy A e do bloco de gene Kan®. A segunda estratégia foi direcionada à supressão completa do gene thy A do cromossoma por meio de um novo vetor suicida pMT

SUICIDE-1. Este vetor contém as regiões de flanque 5’ e 3’ do gene thy A bem como a origem R6K de replicação e os genes RP4 mob.

Para substituir o gene thy A da cepa JS1569 decidimos usar o JS1569 4.4 dependente de timina anterior visto que os experimentos preliminares indicaram que existe uma forte desvantagem seletiva para ir do tipo selvagem para a dependência á timina mesmo na presença de altos níveis de timina exógena.

Inativação do gene thy A pela inserção de um bloco de gene KANR A nossa estratégia envolveu a inativação do gene thy A pela inserção de um gene de resistência à canamicina em um sítio Pstl único no gene thy A, na forma de um bloco de gene Kan® (Pharmacia) (Figura 8). Esta construção foi amplificada por PCR (sistema Expand®High Fidelity PCR, Boehringer Mannheim) com iniciadores que incorporam as extremidades Xbal de modo que a mesma possa ser transferida para o plasmídeo suicida pNQ 705 [14] que carrega um sítio Xbal único e o gene de resistência ao cloranfenicol.

Os seguintes iniciadores foram usados para a amplificação por PCR do gene insercionalmente inativado: ---------^ O plasmídeo resultante foi depois transferido para o E. coli S- 17 que foi usado nos experimentos de conjugação.

Visto que a cepa receptora JS1569 4.4 é resistente à rifampicina e sensível ao cloranfenicol e a cepa doadora E. coli S-17 é resistente tanto ao cloranfenicol quanto à canamicina, os transconjugantes foram selecionados pela seleção tanto da resistência à rifampicina quanto à canamicina. As cepas resultantes do V. cholerae entretanto também pode ser resistente ao cloranfenicol visto que o plasmídeo inteiro pode ser inicialmente inserido no cromossoma.

Os exconjugantes que foram incorporados ao gene thy A inativado que carrega o bloco de gene Kan® no cromossoma e perdeu o plasmídeo pNQ 705 podem ser então selecionados entre aqueles que foram sensíveis ao cloranfenicol, porém permaneceram resistentes à canamicina.

Para verificar a inserção do gene de resistência à canamicina no gene thy A o gene thy A inteiro foi amplificado por PCR com os iniciadores thy A-10 e thy A-11 e o tamanho do fragmento resultante comparado àquele do gene thy A natural. O fragmento thy A esperado de 2,6 kb comparado àquele do gene thy A natural de 1,4 kb foi encontrado.

Resultados. Os exconjugantes mostraram ser resistentes à canamicina, sensíveis ao cloranfenicol e quando amplificados por PCR mostraram ter incorporado o bloco de gene resistente à canamicina no cromossoma. O seqüenciamento do fragmento amplificado mostrou que o único defeito no gene foi devido à inserção do gene da canamicina. Isto indicou que o evento de recombinação que incorporou o gene insercionalmente inativado no cromossoma também eliminou a mutação de ponto que tomou a cepa receptora (JS1569 4.4) dependente da timina. O desenvolvimento da cepa resultante foi observada apenas se o meio de cultura foi suplementado com timina (200 pg/ml).

Supressão parcial do gene thy A e do bloco do gene KANR

Para garantir ainda uma mutação thy A não reversível o thy A insercionalmente inativado foi subclonado como um fragmento Xbal no pNEB 193 (New England Biolabs). Os iniciadores de PCR foram planejados de modo que suprimiu-se 209 pares de base do gene thy A e removeu-se 261 pares de base do bloco de gene Kan®.

Desta maneira, o gene thy A foi ainda rompido e aquele gene de resistência à canamicina também foi inativado (pela remoção do início da região codificadora). O resultado global deste procedimento foi uma cepa que carrega um gene thy A suprimido que também conteve uma inserção de DNA não codificadora.

Depois da amplificação por PCR um fragmento de DNA foi obtido abrangendo o plasmídeo inteiro com exceção da região suprimida. O DNA amplificado foi digerido com Xhol, auto ligado e transformado no E. coli HB101. As colônias foram selecionadas sobre placas contendo ampicilina. As colônias individuais foram selecionadas e novamente separadas por linha. As preparações de plasmídeo em pequena escala a partir das colônias individuais produziam os padrões esperados de restrição quando analisadas com enzimas de restrição Xbal, Xhol, Hindlll e Rsal. O gene thy A incompleto que carrega um gene inativado de resistência à canamicina foi cortado do vetor pela digestão com Xbal, purificado e ligado no pDM4 [15] (Figura 12). O PDM4 é um vetor suicida derivado do pNQ 705 contendo o gene óúcBR do Bacillus subtilis e um sítio de clonagem múltipla modificado.

Depois da transferência do plasmídeo pDM4 (Af/zyAAKan) para a cepa S-17 do E. coli, um experimento de transconjugação foi realizado. Nesta ocasião, a cepa JS1569 thyAKan do V. cholerae obtida acima foi usada como cepa receptora. O entrelaçamento foi feito como descrito acima com a seleção para rifampicina e cloranfenicol. Após o desenvolvimento neste meio as colônias foram selecionadas no meio contendo 10 % de sacarose na ausência de cloranfenicol. A sacarose induz o gene sacBR que codifica a levansucrase que converte a sacarose para levanina. Este composto é tóxico para muitos organismos Gram negativos. Deste modo, os clones que ainda carregam o plasmídeo suicida foram mortos deixando os exconjugantes que perderam o plasmídeo.

Resultados. Uma colônia foi selecionada sendo sensível ao cloranfenicol e à canamicina. A amplificação por PCR da região thy A com os iniciadores ThyA-10 e ThyA-11 confirmou que o fragmento thy AKan (2,6 kb) no cromossoma foi substituído com o fragmento Aí/ryAAKan (2,1 kb). O cultivo da cepa resultante foi apenas observado se o meio de cultivo foi suplementado com timina (200 pg/ml). Esta cepa foi denominada JS1569 AthyAAKan do V. cholerae.

Supressão direta do gene thy A no V cholerae Para este processo as seqüências de flanque 5’ e 3’ do gene thy A foram usadas. O novo vetor suicida foi construído, o pMT SUICIDE-1 (Figura 14), que contém a origem R6K de replicação, os genes mob do RP4, um gene de resistência ao cloranfenicol e um sítio de clonagem múltipla do Litmus 28 (New England Biolabs). Eficazmente, um fragmento modificado foi construído em que a região codificadora thy A foi substituída por um sítio de clonagem múltipla (derivado do Litmus 28) deixando apenas a região 5’ e 3’ do local thy A do V. cholerae. O plasmídeo resultante foi usado para gerar uma cepa do V. cholerae em que o gene thy A inteiro foi suprimido.

Como material de partida para esta construção, o plasmídeo pMT SUICIDE-1 foi usado (M. Lebens, não publicado). A partir das regiões 5’ e 3’ do local thy A os seguintes iniciadores de PCR foram planejados: Como padrão para as reações de PCR, uma preparação de DNA cromossômico do V. cholerae JS1569 foi usado (Figura 13).

Os DNAs amplificados foram digeridos com as enzimas de restrição apropriadas e clonadas no vetor pMT-SUICIDE 1 (Figuras 14 e 15) produzindo o plasmídeo ρΜΤΔί/zyA V. cholerae que contém aproximadamente 700 pares de base da região 5’ à montante do gene thy A e o mesmo número de pares de base da região 3’ à jusante do gene thy A.

Este plasmídeo foi transferido para o E. coli SI7-1 e usado em experimentos de conjugação como descrito acima. Como receptor, a cepa JS1569 4.4 do V. cholerae foi usada. Entrelaçamentos foram feitos sobre ágar LB suplementado com rifampicina, cloranfenicol e timina. Os exconjugantes que perderam o plasmídeo suicida do cromossoma foram selecionados com base na sensibilidade ao cloranfenicol.

Resultados. Uma colônia sensível ao cloranfenicol e resistente à rifampicina foi selecionada. A amplificação por PCR com os iniciadores ThyA-10 e ThyA-11 da região thy A resultou em um fragmento de 1,4 kb do gene thy A natural e um fragmento de 0,6 kb do gene AthyA.

Isto confirmou que o gene estrutural thy A no cromossoma foi suprimido.

Além disso a bactéria pode se desenvolver apenas no meio complementado com timina. Esta cepa é denominada V. cholerae JS1569 AthyA, Expressão da subunidade B da enterotoxina instável ao calor do E. coli (LTB) e a glutationa-s-transferase sj26 (GST) do Schistosoma japonicum no V. cholerae JS1569 AthyA.

Dois vetores de expressão foram construídos cada um consistiu do gene thy A do E. coli, da origem de replicação do vetor de alto número de cópia pUC19, do promotor tac e do terminador de transcrição trpA independente de rho. Em um dos dois vetores, o gene laclq foi inserido de modo a regular a expressão do promotor tac que também conteve a seqüência operadora lac (Figuras 16 e 17).

Expressão da proteína LTB na cepa V. cholerae JS1569 AthyA. O vetor de expressão apresentado na Figura 16 foi submetido à eletroporação na V. cholerae JS1569 AthyA, Os transformantes foram selecionados em MS-agar. As colônias individuais foram cultivadas para produzir mini-preps plasmídicos que foram checados pela análise de enzima de restrição. Para a expressão, um transformante foi cultivado em meio MS a 37°C em uma cultura sob agitação. O meio de cultura foi colhido e ensaiado quanto a LTB pelo GM1-ELISA.

Resultados. A cultura foi verificada produzir aproximadamente 300 pg/rnl da LTB como ensaiado pelo GM1 ELISA. O SDS-PAGE e a Western Blot usado um anticorpo monoclonal específico da LTB verificou ainda que a proteína secretada foi a LTB.

Expressão da proteína GST nas cepa V. cholerae JS1569 hihyA. A sj26 glutationa-S-transferase (GST) do Schistosoma japonicum foi clonada no vetor de expressão apresentado na Figura 17. Este vetor é idêntico ao primeiro, exceto para a seqüência do gene laclq. O laclq permite a expressão controlada das proteínas recombinantes. O vetor foi submetido à eletroporação na V. cholerae JS1569 AthyA. Os transformantes foram selecionados em MS-agar. As colônias individuais foram cultivadas para produzir mini-preps plasmídicos que foram checados pela análise de enzima de restrição. Para a expressão, um transformante foi cultivado em meio MS a 37°C em uma cultura sob agitação, com a adição de IPTG.

Resultados. A proteína recombinante foi verificada no citoplasma da bactéria V. cholerae, O SDS-PAGE e a Western Blot com um anticorpo monoclonal específico do GST (Pharmacia BioTech, Uppsala) confirmou que a GST foi expressada. O nível de expressão da GST foi mais difícil de determinar do que para a LTB visto que a proteína foi expressada intracelularmente, porém foi julgada estar na mesma faixa como a LTB.

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LISTAGEM DA SEQUÊNCIA

<110> SBL Vaccin AB <120> Processo para produzir cepas thy A- de Vibrio cholerae, tais cepas e seu uso. <130> 29772 <140> <141> <150> SE 9801852-6 <151> 26.05.1998 <160> 5 <170> PatentInVer.2.1 <210> 1 <211> 2909 <212> DNA <213> Vibrio cholerae <400> 1 Τ' gagaaggttt gttatgcctc agggttatct gcagtttccc aatattgacc ccgtattgtt 60 ttcgatcggc cctctagcgg tgcgctggta tggcttgatg tatttggtgg gtttcctttt 120 tgctatgtgg ttggccaatc gccgagcgga tcgcgcgggc agtggttgga cgcgtgagca 180 agtctctgac ttgttattcg ccggcttttt aggtgtagtg atcggtggcc gagttggtta 240 tgtgatcttc tacaattttg atctgttcct tgctgaccct ctttatttat tcaaagtgtg 300 gactggcggc atgtccttcc acggcggctt attgggtgtg atcaccgcca tgttctggta 360 tgcgcgtaaa aaccaacgca ccttctttgg tgtggccgat tttgttgccc ctttagtgcc 420 attcggtttg gggatgggac gtatcggtaa ctttatgaat agtgaacttt ggggacgagt 480 aacggatgtg ccttgggctt ttgtattccc taatggtggc ccactgccgc gccatccttc 540 acagctttat gaattcgcct tagaaggcgt ggttctgttc tttattctta attggtttat 600 tggtaaacct cgtccgctag gcagcgtatc cggactgttt 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ccgttgccac taaaccaatc atcaatcctg caattgggtg ggaagcaaat 1080 tcaaatagaa ctttggcttg atcgccggtt gcccatttaa aaccgctgcc gaccatcgcg 1140 actgcaagaa gtagtaaata cagcatgaaa gccaagtttg cccaacgtag gcctttcgtg 1200 gtcagcgaaa tcggcgctgc ag 1222 [<210> 4 <21> 283 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 4 Vai Lys Gin Tyr Leu Asp Leu Cys Gin Arg Ile Val Asp Gin Gly Vai 5 IS

Trp Val Glu Asn Glu Arg Thr Gly Lys Arg Cys Leu Thr Val Ile Asn 2° 25 30 Ala Asp Leu Thr Tyr Asp Val Gly Asn Asn Gin Phe Pro Leu Val Thr 35 40 45 Thr Arg Lys Ser Phe Trp Lys Ala Ala Val Ala Glu Leu Leu Gly Tyr 50 55 50 Ile Arg Gly Tyr Asp Asn Ala Ala Asp Phe Arg Gin Leu Gly Thr Lys 65 70 75 Y80 Thr Trp Asp Ala Asn Ala Asn Leu Asn Gin Ala Trp Leu Asn Asn Pro 85 90 95 Tyr Arg Lys Gly Glu Asp Asp Met Gly Arg Val Tyr Gly Val Gin Gly 100 105 110 Arg Ala Trp Ala Lys Pro Asp Gly Gly His ile Asp Gin Leu Lys Lys 5 120 125 Ile Val Asp Asp Leu Ser Arg Gly Val Asp Asp Arg Gly Glu Ile Leu 135 140 Asn Phe Tyr Aen Pm Gly Glu Phe Hie «et Gly Cys Leu Arg Pm Cys 150 !55 160 Met Tyr Ser His His Phe Ser Leu Leu Gly Asp Thr Leu Tyr Leu Asn 165 170 175 Ser Thr Gin Arg Ser Cys Asp Val Pro Leu Gly Leu Asn Phe Asn Met 185 190 Val· Gin Val Tyr" Val Phe Leu Ala Leu Met Ala Gin Ile Thr Gly Lys 200 205 Lys Pro Gly Leu Ala Tyr His Lys He Val Asn Ala His Ile Tyr Gin 215 22o Asp Gin Leu Glu Leu Met Arg Asp Val Gin Leu Lys Arg Glu Pro Phe 230 235 240 Pro Ala Pro Gin Phe His Ile Asn Pro Lys lXe Lys Thr Leu Gin Asp 245 250 25S

Claims (7)

1. Cepa Δ thyA do Vibrio cholerae, caracterizada pelo fato de que carece da funcionalidade do seu gene thyA que apresenta a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 localizada no cromossoma de dita cepa.

2. Cepa Δ thyA do Vibrio cholerae de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender um ou vários elementos de DNA epissomal de replicação autônoma tendo uma funcionalidade de gene thyA que permite que a cepa se desenvolva na ausência de timina no meio de cultivo e o um ou vários elementos de DNA epissomal de replicação autônoma ainda compreende um gene estrutural que codifica uma proteína.

3. Cepa Δ thyA do Vibrio cholerae de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o elemento de DNA epissomal de replicação autônoma é um plasmídeo.

4. Cepa Δ thyA do Vibrio cholerae de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o elemento de DNA epissomal de replicação autônoma apresenta um gene thyA estranho.

5. Cepa Δ thyA do Vibrio cholerae de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o gene thyA estranho é um gene de E. coli.

6. Cepa Δ thyA do Vibrio cholerae de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a proteína codificada é selecionada da subunidade B da enterotoxina instável ao calor do Escherichia coli (LTB) e da proteína glutationa-S-transferase de 26 kD do Schistosoma japonicum (GST 26 kD).

7. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende como um componente imunizador uma cepa Δ tlvy A do Vibrio cholerae, como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6.