BR112021021683B1

BR112021021683B1 - Compostos multivalentes de ligação a pd-l1 para tratar câncer, composição farmacêutica e uso relacionados

Info

Publication number: BR112021021683B1
Application number: BR112021021683-9A
Authority: BR
Inventors: Michael A. Barry
Original assignee: Mayo Foundation For Medical Education And Research
Priority date: 2019-04-29
Filing date: 2020-04-28
Publication date: 2024-05-28

Abstract

COMPOSTOS MULTIVALENTES DE LIGAÇÃO A PD-L1 PARA TRATAR CÂNCER. Esta invenção provê métodos e materiais para tratar câncer. A invenção engloba métodos e materiais para direcionar compostos de ligação ao ligante 1 de morte programada (PD-L1) e/ou composições contendo um ou mais compostos monovalentes ou multivalentes de ligação ao ligante 1 de morte programada (PD-L1) que são administrados a um mamífero tendo câncer para tratar o mamífero. Em alguns casos, um composto multivalente de ligação a PD-L1 pode incluir dois ou mais polipeptídeos de proteína 1 de morte celular programada (PD-1) (e/ou fragmentos dos mesmos tendo a capacidade de se ligar a PD-L1). Esta invenção também provê métodos e materiais para produzir compostos multivalentes de ligação a PD-L1 e métodos e materiais para produzir moléculas de ácido nucleico que codificam compostos de ligação a PD-L1.

Description

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO Campo Técnico

[001]Esta invenção refere-se a métodos e materiais para tratamento de câncer. A invenção provê métodos e materiais para produzir compostos multivalentes de ligação a PD-L1. Esta invenção também provê métodos e materiais para expressar polipeptídeos PD-1 em células de um mamífero tendo câncer. Em particular, a invenção refere-se a composições compreendendo polipeptídeos PD-1, os polipeptídeos PD-1 podem estar na forma de um ou mais compostos multivalentes de ligação ao ligante 1 de morte programada (PD-L1). Em alguns casos, um composto multivalente de ligação a PD-L1 pode incluir dois ou mais polipeptídeos de proteína 1 de morte celular programada (PD-1) (e/ou fragmentos dos mesmos tendo a capacidade de se ligar a PD-L1). As composições compreendendo compostos de ligação a PD-L1 são administradas a um mamífero tendo câncer em uma quantidade eficaz para tratar o câncer e, opcionalmente, são administrados em combinação com uma ou mais terapias de câncer.

[002]PD-L1, também chamada B7-H1, é uma proteína de ponto de controle imune que regula o sistema imune através de sua ligação do receptor de PD-1. No microambiente tumoral, superexpressão de PD-L1 em células de tumor ajuda a suprimir a imunidade antitumor (Dong ET AL., NAT MED. 8:793-800, (2002); Hamanishi ET AL., INT. J. CLIN. ONCOL. 21:462-473 (2016); Dong ET AL., NAT. MED. 5:1365-1369 (1999); Chen ET AL., J. CLIN. INVEST. 125:3384-3391 (2015); He et al., Sci. Rep. 5:13110 (2015); Chen et al., Clin. Cancer Res.. 18:6580-6587 (2012); Ohaegbulam et al., Trends Mol. Med. 21:24-33 (2015); e Postow et al., J. Clin. Oncol. 33:1974-1982 (2015)).

[003]Células de apresentação ao antígeno (APC) captam os antígenos liberados pelas células de câncer e os apresentam às células T. As células de câncer também podem apresentar antígenos para células T ativadas no contexto do complexo principal de histocompatibilidade. Após a ativação de células T, os receptores PD-1 são expressos nas células T e inibem as respostas imunes pelo envolvimento de ligantes PD-L1 e PD-L2 em APC e PD-L1 em células de câncer. Portanto, o bloqueio específico mediado pelo anticorpo monoclonal (mAb) da via PD-1/PD-L1/PD-L2 pode intensificar a imunidade antitumor. Além de células T e APC, PD-1 e PD- L1 podem ser induzidas em outras células imunes.

[004]No estado de doença de câncer, a interação de PD- L1 que está presente em uma célula de câncer positiva para PD-L1 com PD-1 que está presente em uma célula T, pode reduzir os sinais de função das células T para evitar que o sistema imune ataque a célula de câncer positiva para o PD- L1. PD-1 solúvel (sPD-1) pode atuar como um chamariz por ligação a PD-L1 presente em células de câncer positivas para PD-L1. Por exemplo, quando sPD-1 está ligada a PD-L1 presente em uma célula de câncer positiva para PD-L1, a PD- L1 não está livre para interagir com uma PD-1 presente em uma célula T, permitindo assim que a célula T funcione atacando a célula de câncer positiva para PD-L1.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005]Esta invenção provê métodos e materiais para produzir um ou mais compostos multivalentes de ligação a PD-L1. Esta invenção provê composições compreendendo compostos de ligação a PD-L1 compreendendo polipeptídeos PD-1, os polipeptídeos PD-1 podem estar na forma de um ou mais compostos multivalentes de ligação a PD-L1. Os compostos de ligação a PD-L1 podem atuar como um chamariz por ligação a PD-L1 presente em células de câncer positivas para PD-L1.

[006]Esta invenção provê métodos e materiais compreendendo polipeptídeos PD-1, os polipeptídeos PD-1 podem estar na forma de um ou mais compostos multivalentes de ligação a PD-L1 que são administrados a um mamífero tendo câncer para tratar o mamífero. Em alguns casos, um composto multivalente de ligação a PD-L1 inclui dois ou mais segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-L1 (por exemplo, polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos dos mesmos). Um composto multivalente de ligação a PD-L1 inclui dois ou mais polipeptídeos PD-1 (ou fragmentos dos mesmos tendo a capacidade de se ligar a PD-L1) de modo que o composto pode se ligar a dois ou mais polipeptídeos PD-L1. Esta invenção também provê métodos de produzir compostos de ligação a PD-L1 e composições compreendendo Ads recombinantes compreendendo pelo menos um segmento de aminoácido compreendendo um polipeptídeo PD-1 que forma um composto de ligação a PD-L1 ou um composto multivalente de ligação a PD-L1 descrito aqui.

[007]Em uma modalidade, polipeptídeos PD-1 de camundongo e/ou polipeptídeos PD-1 humanos fusionados a um polipeptídeo de arcabouço podem formar um conjugado de polipeptídeo (por exemplo, um conjugado de polipeptídeo incluindo uma pluralidade de (por exemplo, duas ou mais) cadeias de aminoácido associadas) de modo que quando o polipeptídeo de arcabouço fusionado a um ou mais polipeptídeos PD-1 está em um conjugado de polipeptídeo, o conjugado de polipeptídeo pode formar um composto multivalente de ligação a PD-L1 que inclui dois ou mais polipeptídeos PD-1.

[008]Em uma modalidade, um conjugado de polipeptídeo pode incluir três cadeias de aminoácido, em que o polipeptídeo de arcabouço pode ser um polipeptídeo sigma-1 derivado de Mammalian orthoreovirus 3, e em que o conjugado de polipeptídeo pode incluir três polipeptídeos PD-1.

[009]Em uma modalidade, um conjugado de polipeptídeo pode incluir quatro cadeias de aminoácido, em que o polipeptídeo de arcabouço pode ser um polipeptídeo estreptavidina, e em que o conjugado de polipeptídeo pode incluir quatro polipeptídeos PD-1.

[0010]Esta invenção também provê composições compreendendo Ads recombinantes compreendendo ácidos nucleicos codificando polipeptídeos PD-1 que se ligam a PD- L1. Em uma modalidade, um polipeptídeo PD-1 de camundongo e/ou um polipeptídeo PD-1 humano é(são) fusionado(s) a um domínio gama-carboxiglutâmico dependente de vitamina K de um polipeptídeo de anticorpo de cadeia simples fator X (um domínio GLA ou GLA-EGF de um polipeptídeo FX) e está presente em polipeptídeos hexon adenovirais de modo que quando o polipeptídeo está presente em dois ou mais polipeptídeos hexon virais presentes no capsídeo de uma partícula viral, a partícula viral pode formar um composto multivalente de ligação a PD-L1 que inclui de cerca de 240 a cerca de 720 polipeptídeos PD-1.

[0011]Esta invenção provê métodos e materiais para tratamento de câncer por administração de um ou mais adenovírus recombinantes (Ads) expressando uma proteína PD- 1 e/ou segmentos de aminoácido que se ligam a PD-L1 (por exemplo, polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos dos mesmos). Os Ads recombinantes expressando PD-1 podem ser administrados em combinação com uma imunoterapia para câncer de acordo com um regime de tratamento terapêutico.

[0012]Usando compostos multivalentes de ligação a PD-L1 (por exemplo, como comparado com polipeptídeos PD-1 monoméricos) pode aumentar a eficácia de PD-1 para neutralizar PD-L1 presente em células de câncer positivas para PD-L1, pode prevenir que células de câncer positivas para PD-L1 escapem do sistema imune, e/ou pode permitir que os agentes anticâncer (por exemplo, imunoterapias contra câncer) direcionem mais eficazmente as células de câncer positivas para PD-L1. Em alguns casos, a apresentação de adenovírus de polipeptídeos PD-1 pode ser usada para redirecionar Ads terapêuticos para PD-L1 em uma célula para entrega de ácido nucleico ou para matar células expressando PD-L1 por morte de células oncolíticas.

[0013]Em uma modalidade, um composto de ligação a PD-L1 também pode incluir uma molécula de direcionamento. Uma molécula de direcionamento e fusão celular pode ser um polipeptídeo viral como um polipeptídeo de hemaglutinina (H) de vírus do sarampo (MV), um polipeptídeo de fusão de MV (F), ou um polipeptídeo de glicoproteína (G) de vírus de estomatite vesicular (VSV).

[0014]O composto de ligação a PD-L1 também pode incluir um ou mais polipeptídeos terapêuticos. O polipeptídeo terapêutico é selecionado dentre um polipeptídeo de ligante 4-1BB (4-1BBL), um polipeptídeo de ligante OX40 (OX40L), um polipeptídeo de ligante CD40 (CD40L), ou um polipeptídeo de fator estimulador de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF). O polipeptídeo terapêutico também pode ser um polipeptídeo que ativa sinalização da proteína relacionada ao receptor do fator de necrose tumoral induzida por glicocorticoides (TNFR) (GITR).

[0015]O composto de ligação a PD-L1 também pode incluir um polipeptídeo detectável. O polipeptídeo detectável pode ser uma proteína fluorescente verde (GFP) ou um polipeptídeo luciferase.

[0016]A invenção engloba vetores recombinantes para a expressão de compostos de ligação a PD-L1 compreendendo ácidos nucleicos codificando polipeptídeos PD-1, os polipeptídeos PD-1 podem ser expressos com um ou mais polipeptídeos de direcionamento, e/ou um ou mais polipeptídeos terapêuticos, e/ou proteínas (por exemplo, colágeno, elastina, laminina e fibrinogênio). Os polipeptídeos PD-1 podem ser expressos como proteínas de fusão com polipeptídeos heterólogos. Os ácidos nucleicos codificando polipeptídeos PD-1, assim como os ácidos nucleicos codificando polipeptídeos de direcionamento, polipeptídeos terapêuticos e proteínas, podem estar compreendidos em vetores de expressão, opcionalmente compreendendo cassetes de expressão, que permitem a expressão dos polipeptídeos em células procarióticas ou eucarióticas. O vetor pode ser um vetor viral. O vetor viral pode ser um Ad, vírus adenoassociado (AAV), ou um lentivírus. O vetor viral pode ser um Ad selecionado dentre Ad657, Ad6/57/6, e variantes dos mesmos. O Ad pode ser um Ad replicante condicionalmente (CRAd). O vetor viral pode ser um vetor viral oncolítico.

[0017]Em outro aspecto, a invenção engloba vetores virais para a expressão de compostos de ligação a PD-L1 compreendendo ácidos nucleicos codificando uma cadeia de aminoácido incluindo um polipeptídeo PD-1 e um polipeptídeo de arcabouço como descritos aqui (por exemplo, um conjugado de polipeptídeo que pode incluir uma pluralidade de cadeias de aminoácido, onde cada cadeia de aminoácido inclui um polipeptídeo PD-1 e um polipeptídeo de arcabouço; e onde a pluralidade de cadeias de aminoácido pode formar o conjugado de polipeptídeo).

[0018]Em outro aspecto, a invenção engloba métodos para tratar um mamífero tendo câncer. Os métodos podem incluir, ou consistir essencialmente em, administrar uma composição compreendendo um composto de ligação a PD-L1 a um mamífero tendo câncer.

[0019]O método da invenção compreende administrar uma quantidade eficaz de composições compreendendo compostos de ligação a PD-L1 descritos aqui. Em uma modalidade, os compostos de ligação a PD-L1 são administrados em combinação com uma ou mais terapêuticas para câncer para o mamífero, pelo qual o número de células de câncer presentes no mamífero é reduzido. A uma ou mais terapêuticas para câncer pode incluir uma imunoterapia que direciona PD-1 ou PD-L1. A imunoterapia pode ser selecionada dentre nivolumabe, pembrolizumabe, atezolizumabe, avelumabe, cemiplimabe e durvalumabe.

[0020]Em outro aspecto, a invenção refere-se a métodos para tratar um mamífero tendo câncer compreendendo, ou consistindo essencialmente em, administrar uma composição compreendendo um composto multivalente de ligação a PD-L1 a um mamífero tendo câncer. O composto multivalente de ligação a PD-L1 pode compreender um conjugado de polipeptídeo descrito aqui (por exemplo, um conjugado de polipeptídeo incluindo uma pluralidade de cadeias de aminoácido, em que cada cadeia de aminoácido inclui um polipeptídeo PD-1 e um polipeptídeo de arcabouço). O câncer pode ser um câncer de próstata, câncer de mama, câncer ovariano, câncer de pulmão (por exemplo, um câncer de pulmão de células não pequenas), carcinoma hepatocelular, câncer pancreático, câncer de rim, melanoma, câncer de cérebro, câncer de cólon, linfoma, mieloma, leucemia linfocítica, ou leucemia mieloide. A administração pode incluir administração sistêmica ou local (por exemplo, administração intravenosa, intratumoral, intramuscular, intraórgão, de nódulo intralinfático).

[0021]Um aspecto da invenção refere-se a compostos de ligação ao ligante de proteína 1 de morte celular programada multivalente (PD-1) compreendendo uma pluralidade de cadeias de aminoácido, em que cada cadeia de aminoácido compreende pelo menos um polipeptídeo de proteína 1 de morte celular programada (PD-1).

[0022]Um aspecto adicional da invenção refere-se a um tal composto multivalente de ligação a PD-L1, em que o composto multivalente de ligação a PD-L1 é um conjugado de polipeptídeo compreendendo um polipeptídeo de arcabouço selecionado dentre polipeptídeos Ig, polipeptídeos sigma-1 e polipeptídeos estreptavidina.

[0023]Um aspecto adicional da invenção refere-se a um tal composto multivalente de ligação a PD-L1, em que o composto multivalente de ligação a PD-L1 é um conjugado de polipeptídeo compreendendo mais do que um polipeptídeo de arcabouço.

[0024]Um aspecto adicional da invenção refere-se a um tal composto multivalente de ligação a PD-L1, em que o polipeptídeo PD-1 é uma PD-1 humano ou uma PD-1 murino.

[0025]Um aspecto adicional da invenção refere-se a um tal composto multivalente de ligação a PD-L1, em que a pluralidade de cadeias de aminoácido compreende um polipeptídeo terapêutico, um polipeptídeo de direcionamento ou um polipeptídeo antigênico.

[0026]Um aspecto adicional da invenção refere-se a um tal composto multivalente de ligação a PD-L1, em que o polipeptídeo de direcionamento é selecionado dentre um polipeptídeo de hemaglutinina do vírus do sarampo (MVH), um polipeptídeo de fusão de vírus do sarampo (MVF), e um polipeptídeo de glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSVG).

[0027]Um aspecto adicional da invenção refere-se a um tal composto multivalente de ligação a PD-L1, em que o polipeptídeo terapêutico é selecionado dentre um polipeptídeo de ligante 4-1BB (4-1BBL), um polipeptídeo de ligante OX40 (OX40L), um polipeptídeo de ligante CD40 (CD40L), um polipeptídeo de fator estimulador de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) e um agonista de GITR.

[0028]Um aspecto adicional da invenção refere-se a um tal composto multivalente de ligação a PD-L1 em que cada cadeia de aminoácido compreendendo pelo menos um polipeptídeo de proteína 1 de morte celular programada (PD- 1) é associado com um adenovírus recombinante (Ad) e a pluralidade de cadeias de aminoácido está presente em um polipeptídeo de revestimento do Ad recombinante.

[0029]Um aspecto adicional da invenção refere-se a um tal composto multivalente de ligação a PD-L1, em que o Ad recombinante compreende polipeptídeos hexon capsídeo de uma cepa de Ad Ad6 e pelo menos um polipeptídeo hexon capsídeo de região hipervariável (HVR) de cepa de Ad Ad57.

[0030]Um aspecto adicional da invenção refere-se a um tal composto multivalente de ligação a PD-L1, em que os polipeptídeos hexon capsídeos de uma cepa de Ad Ad6 compreendem polipeptídeos HVR 1-7 de cepa de Ad Ad57.

[0031]Um aspecto adicional da invenção refere-se a um tal composto multivalente de ligação a PD-L1, em que os polipeptídeos hexon capsídeos de uma cepa de Ad Ad6 compreendem polipeptídeos HVR 2-6 de cepa de Ad Ad57.

[0032]Um aspecto adicional da invenção refere-se a um tal composto multivalente de ligação a PD-L1, em que o polipeptídeo de proteína 1 de morte celular programada (PD- 1) é PD-1 humano.

[0033]Um aspecto adicional da invenção refere-se a um tal composto multivalente de ligação a PD-L1, em que o polipeptídeo PD-1 é fusionado a um domínio gama- carboxiglutâmico dependente de vitamina K de um polipeptídeo de anticorpo de cadeia simples fator X (um domínio GLA de um polipeptídeo FX).

[0034]Um aspecto adicional da invenção refere-se a um tal composto multivalente de ligação a PD-L1, em que cada cadeia de aminoácido compreende uma molécula de direcionamento selecionado dentre um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus do sarampo (MVH), um polipeptídeo de fusão do vírus do sarampo (MVF), e um polipeptídeo de glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSVG).

[0035]Um aspecto adicional da invenção refere-se a um tal composto multivalente de ligação a PD-L1, em que cada cadeia de aminoácido compreende um ou mais polipeptídeos terapêuticos selecionados dentre um polipeptídeo de ligante 4-1BB (4-1BBL), um polipeptídeo de ligante OX40 (OX40L), um polipeptídeo de ligante CD40 (CD40L), e um polipeptídeo de fator estimulador de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF).

[0036]Um aspecto adicional da invenção refere-se a uma tal composição farmacêutica compreendendo o composto multivalente de ligação a PD-L1 e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0037]Um aspecto adicional da invenção refere-se a um método de tratar câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo administrar o composto multivalente de ligação a PD-L1.

[0038]Um aspecto adicional da invenção refere-se a um tal método compreendendo adicionalmente administrar uma ou mais terapêuticas para câncer ao mamífero.

[0039]Um aspecto adicional da invenção refere-se a um tal método em que a terapêutica para câncer é uma imunoterapia que direciona PD-1.

[0040]Um aspecto adicional da invenção refere-se a um tal método em que a imunoterapia é selecionada dentre o grupo consistindo em nivolumabe, pembrolizumabe, atezolizumabe, avelumabe, cemiplimabe e durvalumabe.

[0041]Salvo se definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém versado na técnica à qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui possam ser usados para praticar a invenção, métodos e materiais apropriados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência em sua totalidade. Em caso de conflito, o presente relatório, incluindo definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitantes.

[0042]Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são apresentados nos desenhos em anexo e na descrição abaixo. Outras características, objetos e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição e dos desenhos e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0043]Figura 1A mostra esquema de compostos multivalentes de ligação a PD-L1 modificados exemplares. Um composto multivalente de ligação a PD-L1 compreendendo um polipeptídeo PD-1 fusionado a um polipeptídeo Ig que é um conjugado dimérico de polipeptídeo que inclui duas cadeias de aminoácido que incluem, cada, um polipeptídeo PD-1. Um composto multivalente de ligação a PD-L1 que é um conjugado de polipeptídeo trimérico compreendendo três cadeias de aminoácido que incluem, cada, um polipeptídeo PD-1 fusionado a um polipeptídeo sigma. Um composto multivalente de ligação a PD-L1 que é um conjugado de polipeptídeo tetramérico compreende quatro cadeias de aminoácido que incluem, cada, um polipeptídeo PD-1 fusionado a um polipeptídeo estreptavidina.

[0044]Uma cadeia de aminoácido incluindo um polipeptídeo PD-1 fusionado a um domínio GLA de um polipeptídeo FX. As proteínas de fusão podem ser construídas com uma das entidades no N-término ou no C- término. A proteína de fusão que é ligada à superfície de uma partícula adenoviral gera um composto multivalente de ligação a PD-L1.

[0045]Figura 1B mostra compostos de ligação a PD-L1 modificados por introdução de motivos PD-1 em biopolímeros naturais como colágeno, laminina, fibronectina ou elastina. Fusão de PD-1 a monômeros de proteína e expressão em células permitirão sua montagem em polímeros multivalentes exibindo muitos motivos de ligação a PD-L1.

[0046]Figura 2A mostra vetores de ácido nucleico que podem codificar cadeias de aminoácido que podem ser usadas para gerar compostos multivalentes de ligação a PD-L1. Figura 2A mostra esquema de um vetor de ácido nucleico que pode codificar uma cadeia de aminoácido que inclui um polipeptídeo PD-1 murino (mPD-1) fusionado ao polipeptídeo IgG (topo à esquerda), um vetor de ácido nucleico que pode codificar uma cadeia de aminoácido que inclui um polipeptídeo PD-1 humano (hPD-1) fusionado a um polipeptídeo IgG (topo à direita), e uma estratégia de clonagem exemplar (fundo) para substituir ácido nucleico codificando o IgG com ácido nucleico codificando um domínio GLA de um polipeptídeo FX para gerar um vetor de ácido nucleico que pode codificar uma cadeia de aminoácido que inclui um polipeptídeo PD-1 fusionado a um domínio GLA de um polipeptídeo FX, ou para substituir ácido nucleico codificando o IgG com ácido nucleico codificando um polipeptídeo sigma-1 para gerar um vetor de ácido nucleico que pode codificar uma cadeia de aminoácido que inclui um polipeptídeo PD-1 fusionado a um polipeptídeo sigma-1.

[0047]Figura 2B contém imagens de géis mostrando expressão de uma cadeia de aminoácido compreendendo um polipeptídeo PD-1. Trilha 1: marcador de peso molecular (pares de base; bp); Trilha 2: um polipeptídeo PD-1 fusionado a um domínio GLA de um polipeptídeo FX; Trilha 3: marcador de peso molecular (bp); Trilha 4: uma cadeia de aminoácido incluindo um polipeptídeo PD-1 fusionado a um polipeptídeo sigma-1.

[0048]Figura 3 mostra esquema de um vetor de ácido nucleico que pode codificar uma cadeia de aminoácido que inclui um polipeptídeo hPD-1 fusionado a um domínio GLA de um polipeptídeo FX (topo à esquerda), um vetor de ácido nucleico que pode codificar uma cadeia de aminoácido que inclui um polipeptídeo hPD-1 fusionado a um polipeptídeo sigma-1 (topo à direita), e uma estratégia de clonagem exemplar (fundo) para substituir o ácido nucleico codificando o polipeptídeo hPD-1 com ácido nucleico codificando um polipeptídeo mPD-1.

[0049]Figura 4 mostra esquema de vetores de ácido nucleico exemplares que podem codificar cadeias de aminoácido que podem ser usadas para gerar compostos multivalentes de ligação a PD-L1.

[0050]Figura 5 mostra esquema de vetores adenovirais (Ad) exemplares que podem codificar cadeias de aminoácido que podem ser usadas para gerar compostos multivalentes de ligação a PD-L1.

[0051]Figura 6 mostra um esquema de um genoma de um Ad tendo ácido nucleico codificando um polipeptídeo de ponto de controle imune que pode ativar células T (4-1BBL), ácido nucleico codificando um ou mais polipeptídeos PD-1 (PD-1-X, onde X é um arcabouço de ligação dimérico, trimérico, tetramérico ou polimérico), e ácido nucleico codificando um antígeno como um antígeno de câncer ou um antígeno de doença infecciosa (epítopo de HPV). Também é mostrado um mapa do sítio de restrição do genoma Ad.

[0052]Figura 7 mostra um alinhamento de Ad5, 6, e 57 mostrando variação em regiões hexon e E3. (A) Um alinhamento de DNA de Pustell dos genomas de Ad6 e Ad57. Caixas indicam as regiões hexon e E3 onde a variação é maior entre os dois vírus. (B) Alinhamento de aminoácidos ClustalW da região hipervariável em proteínas hexon de Ad5, Ad6 e Ad57.

[0053]Figura 8 mostra a construção de Ad657 por substituição as HVRs de Ad6 com HVRs de Ad57. Abreviatura: HVRs, regiões hipervariáveis.

[0054]Figura 9 é um esquema de um Ad competente para replicação (RC-Ad), em que expressão de E1 é controlada pelo promotor E1 nativo; uma variante CRAd-Probasina-E1A (Ad-PB), em que a expressão de E1 é controlada por promotor de probasina específico da próstata; CRAd-dl1101, em que a ligação da via p300 ablacionada, susceptível à via IFN em células normais; CRAd-dl1107, em que a ligação de pRB ablacionada permite ao vírus matar as células de câncer com rupturas da via RB, mas é reprimido em células normais RB+; CRAd-dl1101/07, em que ligação da via p300 ablacionada, susceptível à ligação pRB da via IFN ablacionada permite ao vírus matar as células de câncer com rupturas da via RB, mas é reprimida em células normais RB+.

[0055]Figura 10 mostra sequências de aminoácido da porção N-terminal do polipeptídeo E1A de tipo selvagem e o N-término de E1A das variantes CRAd, dl1101, dl1107 e dl1101/1107.

[0056]Figura 11 mostra um esquema de diferentes genes de evasão imune E3 em espécie C de Ad exemplar Ad6 e espécie D de Ad exemplar Ad26. Ambos Ads expressam variantes de tamanho e sequência de genes E3 12,5K, 6,7K, 19K, 10,4K (RIDα), 14,5K (RIDβ), e 14,7K, assim como uma representação das funções destas proteínas codificadas E3.

[0057]Figura 12 mostra sítios em HVRs de Ad que podem ser modificados, por exemplo, por PEGuilação ou "BAPilação" com peptídeos aceitadores de biotina (BAPs).

[0058]Figura 13 é um esquema mostrando ciclos terapêutico de Ad. A) Um esquema de troca de serotipo com Ads. B) Um esquema de um ciclo terapêutico exemplar onde Ad6 e Ad657 podem ser usados para ciclos múltiplos de tratamento por troca de serotipo em combinação com conjugação de polímero covalente.

[0059]Figura 14 mostra conjugação de polietileno glicol (PEG) a Ad657-HVR1-C. A) SDS-PAGE de proteínas de Ad com e sem PEGuilação. Setas mostram aumentos de tamanho devido à fixação química de PEG ao hexon. B) Efeitos da PEGuilação direcionada por maleimida-PEG e não direcionamento de NHS- PEG em infecção viral.

[0060]Figura 15 mostra construtos de HVR quiméricos que combinam HVRs diferentes de serotipos de Ad diferentes para modular as interações naturais com células e fatores sanguíneos melhoram farmacologia combinada com inserção de peptídeos de ligação de células e des-direcionamento de células em HVRs diferentes para alterar a entrada na célula e a evasão de células. Neste exemplo, um único aminoácido cisteína é inserido em HVR1 e HVR5 de Ad657 para modular a farmacologia e permitir a conjugação direcionada de polímeros como polietileno glicol ou outras porções como agentes de imagem como fluoróforos.

[0061]Figura 16 mostra mapas de plasmídeo para combinações representativas de CRAds e peptídeo. São mostrados hexons assim como inserções de peptídeos de direcionamento a células em HVRs individuais.

[0062]Figura 17 mostra mapas de plasmídeo para combinações representativas de CRAds e peptídeo. São mostrados hexons assim como inserções de peptídeos de direcionamento a células em HVRs individuais.

[0063] Figura 18 mostra mapas de plasmídeo para combinações representativas de CRAds e peptídeo. São mostrados hexons assim como inserções de peptídeos de direcionamento a células em HVRs individuais.

[0064]Figura 19. Ensaio de bloqueio de PD-1 PD-L1 - Proteína de fusão foi purificada a partir de células infectadas com pAd6/57/6-dl1107-DE3-RSV-hPD-1-HA-Ig-I em uma coluna de proteína A. Esta proteína foi titulada junto com anticorpo monoclonal anti-PD-1 de controle positivo lateral, de Promega (Madison, WI, USA).

[0065]Figura 20. Avaliação de crescimento de tumor - Células de melanoma B16-CAR foram injetadas subcutaneamente em camundongos C57BL/6 e tumores foram injetados com partículas virais 3e11 dos vetores indicados. Chamariz CRAd+PD-Ll é pAd6/57/6-dl1107-ΔE3-RSV-hPD-1-HA-Ig-I. Chamariz CRAd+PD-L1 + estimulador imune representa tumores que foram coinjetados com pAd6/57/6-dl1107-ΔE3-RSV-hPD-1- HA-Ig-I e um segundo adenovírus expressando 4-1BBL.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0066]Esta invenção provê métodos e composições para tratar câncer compreendendo polipeptídeos PD-1. Os polipeptídeos PD-1 podem estar na forma de compostos multivalentes de ligação a PD-L1.

[0067]Em alguns casos, um composto multivalente de ligação a PD-L1 compreende dois ou mais segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-L1 (por exemplo, polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos dos mesmos). Por exemplo, um composto multivalente de ligação a PD-L1 que inclui dois ou mais polipeptídeos PD-1 (e/ou fragmentos dos mesmos tendo a capacidade de se ligar a PD-L1) podem se ligar a dois ou mais polipeptídeos PD-L1. Em alguns casos, um composto multivalente de ligação a PD-L1 pode incluir uma cadeia simples de aminoácido que inclui dois ou mais segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-L1.

[0068]Em alguns casos, um composto multivalente de ligação a PD-L1 pode incluir um conjugado de polipeptídeo incluindo uma pluralidade de (por exemplo, duas ou mais) cadeias de aminoácido que incluem, cada, um ou mais segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-L1. Por exemplo, uma cadeia de aminoácido que inclui um ou mais segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-L1 pode ser um polipeptídeo de fusão que inclui um ou mais polipeptídeos PD-1 fusionados a um polipeptídeo de arcabouço que pode formar um conjugado de polipeptídeo com um ou mais outros polipeptídeos que incluem um ou mais segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-L1 (por exemplo, um conjugado de polipeptídeo incluindo uma pluralidade de cadeias de aminoácido associadas). Quando o polipeptídeo de arcabouço fusionado a um ou mais polipeptídeos PD-1 está em um conjugado de polipeptídeo, o conjugado de polipeptídeo pode incluir dois ou mais polipeptídeos PD-1.

[0069]Em uma modalidade, uma partícula viral compreendendo um polipeptídeo PD-1 pode estar na forma de um composto multivalente de ligação a PD-L1 em que dois ou mais polipeptídeos de revestimento viral são modificados para incluir uma ou mais cadeias de aminoácido que incluem um ou mais segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD- L1.

[0070]Em uma modalidade, um composto de ligação a PD-L1 compreende um vírus recombinante que é geneticamente modificado para expressar o polipeptídeo PD-1, em que o polipeptídeo PD-1 é exibido no revestimento do vírus. Em uma modalidade adicional, o vírus recombinante é geneticamente modificado para expressar o polipeptídeo PD-1 em combinação com um ou mais polipeptídeos que são heterólogos para a cadeia principal do vírus recombinante, por exemplo, polipeptídeos terapêuticos, moléculas de direcionamento/polipeptídeos e polipeptídeo antigênicos.

[0071]Em uma modalidade, um composto de ligação a PD-L1 compreende um Ad recombinante (isto é, Ad657, Ad6/57/6 e variantes dos mesmos) que é modificado em uma ou mais regiões hipervariáveis de hexon (HVRs) da proteína de capsídeo viral e compreende pelo menos um polipeptídeo PD- 1. Em uma modalidade, o Ad recombinante é modificado adicionalmente para compreender polipeptídeos heterólogos como polipeptídeos de direcionamento, polipeptídeos terapêuticos e/ou antígenos. Os polipeptídeos PD-1, assim como os polipeptídeos heterólogos, são expressos quando da replicação viral. Quando da montagem do vírus, os polipeptídeos expressos podem ser exibidos na superfície do vírus como um componente da estrutura do capsídeo do vírus.

[0072]Em uma modalidade adicional, um composto de ligação a PD-L1 compreende um Ad recombinante que é geneticamente modificado para expressar o polipeptídeo PD-1 como uma proteína de fusão com um ou mais polipeptídeos heterólogos, em que a proteína de fusão é exibida no capsídeo da partícula viral. Os polipeptídeos heterólogos podem incluir um domínio GLA de um polipeptídeo FX, polipeptídeos CAR, polipeptídeos CD46, polipeptídeos desmogleína, polipeptídeos integrina, polipeptídeos anticorpo de cadeia única, polipeptídeos anticorpo de camelídeo, polipeptídeos de capsídeo, e polipeptídeos de ligação do envelope.

[0073]Em alguns casos, uma cadeia de aminoácido, que inclui um ou mais polipeptídeos PD-1 e um polipeptídeo que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral, pode ser um polipeptídeo de fusão incluindo um ou mais polipeptídeos PD-1 e um polipeptídeo que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral. Em uma modalidade, a proteína de fusão de PD-1 e um polipeptídeo heterólogo podem ser expressos em uma célula hospedeira, purificados e misturados com um Ad de modo que a proteína de fusão é ligada à superfície do Ad por meio de fixação covalente do polipeptídeo heterólogo ao Ad. Quando um primeiro polipeptídeo de fusão incluindo um ou mais polipeptídeos PD-1 fusionados a um polipeptídeo que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral é ligado a um primeiro polipeptídeo de revestimento viral em uma partícula viral e um segundo polipeptídeo de fusão incluindo um ou mais polipeptídeos PD-1 fusionados a um polipeptídeo que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral é ligado a um segundo polipeptídeo de revestimento viral nesta partícula viral, a partícula viral irá incluir dois ou mais polipeptídeos PD-1.

[0074]Em alguns casos, um composto de ligação a PD-L1 pode incluir uma partícula viral onde um ou mais polipeptídeos de revestimento viral são modificados para incluir uma ou mais cadeias de aminoácido que incluem um ou mais segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-L1 (por exemplo, polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos dos mesmos). Os polipeptídeos PD-1 podem ser expressos durante replicação viral e montagem e exibidos no revestimento do vírus. Em uma modalidade, o Ad (isto é, Ad657, Ad6/57/6 e variantes dos mesmos) é modificado em uma região de HVR para expressar o polipeptídeo PD-1 em combinação com um ou mais polipeptídeos heterólogos selecionados dentre polipeptídeos terapêuticos, polipeptídeos de direcionamento e polipeptídeos antigênicos. O polipeptídeo PD-1 pode ser expresso como uma proteína de fusão com um ou mais polipeptídeos heterólogos. Por exemplo, uma partícula viral é geneticamente modificada para expressar duas ou mais cadeias de aminoácido que incluem cada pelo menos um polipeptídeo PD-1 e um polipeptídeo heterólogo, em que as cadeias de aminoácido são exibidas na superfície da partícula viral como um componente do capsídeo de vírus, assim formando um composto multivalente de ligação a PD-L1. Em alguns casos, uma partícula viral é geneticamente modificada para expressar duas ou mais cadeias de aminoácido que incluem cada um polipeptídeo PD-1 e é modificada para expressar uma ou mais cadeias de aminoácido que compreendem um polipeptídeo heterólogo, em que as cadeias de aminoácido são exibidas na superfície da partícula viral como um componente do capsídeo de vírus, assim formando um composto multivalente de ligação a PD-L1. Em alguns casos, uma cadeia de aminoácido inclui dois ou mais polipeptídeos PD-1 e um polipeptídeo heterólogo que são exibidos sobre a superfície da partícula viral.

[0075]Em uma modalidade, uma cadeia de aminoácido que compreende um ou mais polipeptídeos PD-1 pode ser uma proteína de fusão que compreende um ou mais polipeptídeos PD-1 fusionados a um polipeptídeo heterólogo. O polipeptídeo heterólogo pode se ligar à superfície de um Ad para revestir a partícula viral. Em uma modalidade, as proteínas de fusão são expressas em uma célula hospedeira, purificadas e misturas com um Ad de modo que a proteína de fusão reveste a superfície da partícula de Ad viral assim formando um composto multivalente de ligação a PD-L1.

[0076]Em alguns casos, um composto multivalente de ligação a PD-L1 descrito aqui pode ter afinidade aumentada para PD-L1 (por exemplo, como comparado a um polipeptídeo PD-1 monomérico). Em alguns casos, um composto multivalente de ligação a PD-L1 descrito aqui pode ter avidez aumentada para PD-L1 (por exemplo, como comparado a um polipeptídeo monomérico de PD-1).

[0077]Esta invenção provê métodos e materiais para produzir composições compreendendo polipeptídeos PD-1 e compostos multivalentes de ligação a PD-L1, assim como métodos e materiais para produzir vírus recombinantes compreendendo moléculas de ácido nucleico que codificam uma cadeia de aminoácido que pode ser usada para gerar compostos multivalentes de ligação a PD-L1 descritos aqui.

[0078]Compostos multivalentes de ligação a PD-L1 descritos aqui (por exemplo, um polipeptídeo de fusão que inclui um ou dois ou mais polipeptídeos PD-1, ou um conjugado de polipeptídeo que inclui duas ou mais cadeias de aminoácido que incluem, cada, um ou mais polipeptídeos PD-1, ou uma partícula viral onde proteínas de revestimento viral compreendem uma ou mais cadeias de aminoácido que incluem um ou mais polipeptídeos PD-1, ou uma partícula viral em que um ou mais polipeptídeos PD-1 são ligados à superfície da partícula viral) podem incluir qualquer número apropriado de segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-L1 (por exemplo, polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos dos mesmos que podem se ligar a PD-L1).

[0079]Em alguns casos, um composto multivalente de ligação a PD-L1 descrito aqui pode incluir dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 240, 720, ou mais) segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-L1. Em alguns casos, um composto multivalente de ligação a PD-L1 descrito aqui pode incluir de cerca de dois a cerca de 720 segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-L1. Por exemplo, quando um composto multivalente de ligação a PD-L1 descrito aqui é uma cadeia simples de aminoácido que inclui dois ou mais segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-L1, o composto multivalente de ligação a PD-L1 pode incluir cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 polipeptídeos PD-1 (ou fragmentos dos mesmos que se ligam a PD-L1). Por exemplo, quando um composto multivalente de ligação a PD-L1 descrito aqui é um conjugado de polipeptídeo incluindo uma pluralidade de cadeias de aminoácido que incluem, cada, um ou mais segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-L1, o composto multivalente de ligação a PD-L1 pode incluir cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 polipeptídeos PD-1 (ou fragmentos dos mesmos que se ligam a PD-L1).

[0080]Por exemplo, quando um composto multivalente de ligação a PD-L1 descrito aqui é uma partícula viral onde dois ou mais polipeptídeos de revestimento viral (por exemplo polipeptídeos capsídeos) são modificados para incluir uma ou mais cadeias de aminoácido que incluem um ou mais segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-L1, o composto multivalente de ligação a PD-L1 pode incluir de cerca de 240 polipeptídeos PD-1 a cerca de 720 polipeptídeos PD-1 (ou fragmentos dos mesmos que se ligam a PD-L1). Em casos em que um composto multivalente de ligação a PD-L1 descrito aqui inclui dois segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-L1 (ou uma partícula viral onde um ou mais polipeptídeos de revestimento viral são modificados para incluir uma ou mais cadeias de aminoácido que incluem dois ou mais segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-L1), o composto multivalente de ligação a PD-L1 pode ser referido como um composto de ligação dimérico ou divalente a PD-L1. Em casos em que um composto multivalente de ligação a PD-L1 descrito aqui inclui três segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-L1, o composto multivalente de ligação a PD-L1 pode ser referido como um composto de ligação a PD-L1trimérico ou trivalente. Em casos em que um composto multivalente de ligação a PD-L1 descrito aqui inclui quatro segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-L1, o composto multivalente de ligação a PD-L1 pode ser referido como um composto de ligação a PD- L1 tetramérico ou tetravalente.

[0081]Compostos multivalentes de ligação a PD-L1 descritos aqui podem incluir qualquer segmento(s) de aminoácido apropriado(s) que pode(m) se ligar a PD-L1.

[0082]Em uma modalidade, um segmento de aminoácido que pode se ligar a PD-L1 pode incluir um polipeptídeo PD-1. Em alguns casos, um segmento de aminoácido que pode se ligar a PD-L1 pode incluir qualquer fragmento de um polipeptídeo PD-1 desde que o fragmento retenha a capacidade de se ligar a PD-L1. Em alguns casos, um polipeptídeo PD-1 pode ser um polipeptídeo PD-1. Um polipeptídeo PD-1 pode ser de qualquer animal apropriado. Em alguns casos, um polipeptídeo PD-1 pode ser de um mamífero. Por exemplo, um polipeptídeo PD-1 pode ser um polipeptídeo de hPD-1. Por exemplo, um polipeptídeo PD-1 pode ser um polipeptídeo de mPD-1. Um polipeptídeo PD-1 pode incluir qualquer sequência apropriada de polipeptídeo PD-1. Em alguns casos, um polipeptídeo PD-1 pode ser modificado (por exemplo, para interações de maior afinidade com PD-L1). As sequências de polipeptídeos PD-1 exemplificativas (e os ácidos nucleicos codificando tais polipeptídeos) pode ser como especificadas nas bases de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI) em, por exemplo, Número de Acesso AI928135 (Versão AI928135.1), Número de Acesso AY238517 (Versão AY238517.1), e Número de Acesso CR988122 (Versão CR988122.1), Número de Acesso U64863 (Versão U64863.1), Número de Acesso NM_008798 (Versão NM_008798.2), e Número de Acesso NP_032824 (Versão NP_032824.1). Em alguns casos, um polipeptídeo PD-1 compreende a sequência de aminoácido especificada em SEQ ID NO:5. Em alguns casos, um polipeptídeo PD-1 compreende a sequência de aminoácido especificada em SEQ ID NO:6.

[0083]Em alguns casos, um segmento de aminoácido que pode se ligar a PD-L1 (por exemplo, polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos dos mesmos) pode ter uma sequência que se desvia de uma sequência de polipeptídeo PD-1 tipo selvagem (por exemplo, um polipeptídeo PD-1 tipo selvagem tendo a sequência de aminoácido especificada em SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:6), às vezes referida como uma sequência variante. Por exemplo, uma sequência de polipeptídeo PD-1 (e/ou um fragmento da mesma tendo a capacidade de se ligar a PD-L1) pode ter pelo menos 80% identidade de sequência para SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:6. Em algumas modalidades, um segmento de aminoácido que pode se ligar a PD-L1 pode ter pelo menos 85% identidade de sequência, 90% identidade de sequência, 95% identidade de sequência, ou pelo menos 99% identidade de sequência para SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:6. A identidade de sequência percentual é calculada por determinação do número de posições correspondidas em sequências de polipeptídeos alinhadas, dividindo o número de posições correspondidas pelo número total de aminoácidos alinhados, respectivamente, e multiplicando por 100. Uma posição correspondida refere-se a uma posição em que aminoácidos idênticos ocorrem na mesma posição em sequências alinhadas. O número total de aminoácidos alinhados refere-se ao número mínimo de aminoácidos em um polipeptídeo PD-1 que são necessários para alinhar a segunda sequência e não inclui alinhamento (por exemplo, alinhamento forçado) com sequências não de PD-1, tais como aquelas fundidas a um polipeptídeo PD-1 (por exemplo, aminoácidos de um polipeptídeo IgG, um polipeptídeo estreptavidina, sigma-1 ou um domínio GLA de um polipeptídeo FX que é fundido a um polipeptídeo PD-1). O número total de aminoácidos alinhados pode corresponder a toda a sequência de PD-1 ou pode corresponder a fragmentos da sequência de PD-1 de comprimento completo. Sequências podem ser alinhadas usando o algoritmo descrito por Altschul et al. (Ácidos nucleicos Res., 25: 3389-3402 (1997)) como incorporado em programas BLAST (ferramenta de pesquisa de alinhamento local básico), disponível em ncbi.nlm.nih.gov na rede mundial de computadores de computadores. Pesquisas ou alinhamentos BLAST podem ser realizados para determinar a identidade de sequência percentual entre um polipeptídeo PD-1 e qualquer outra sequência ou porção da mesma usando o algoritmo de Altschul et al. BLASTN é o programa usado para alinhar e comparar a identidade entre sequências de ácido nucleico, enquanto BLASTP é o programa usado para alinhar e comparar a identidade entre sequências de aminoácidos. Quando utilizando programas BLAST para calcular a identidade percentual entre uma sequência de PD-1 e outra sequência, os parâmetros de default padrão dos respectivos programas são usados.

[0084]Em alguns casos, um composto multivalente de ligação a PD-L1 pode incluir um conjugado de polipeptídeo incluindo uma pluralidade de cadeias de aminoácido que incluem, cada, um ou mais segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-L1 (por exemplo, polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos dos mesmos). Como usado aqui, uma pluralidade de cadeias de aminoácido que incluem, cada, um ou mais segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-L1 refere- se a duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou mais) cadeias de aminoácido que incluem, cada, um ou mais segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-L1. Por exemplo, uma cadeia de aminoácido que inclui um ou mais polipeptídeos PD-1 pode ser um polipeptídeo de fusão que inclui um ou mais polipeptídeos PD-1 fusionados a um polipeptídeo de arcabouço que pode formar um conjugado de polipeptídeo com um ou mais de outros polipeptídeos que incluem um ou mais segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-L1 (por exemplo, um conjugado de polipeptídeo incluindo uma pluralidade de cadeias de aminoácido associadas). Quando o polipeptídeo de arcabouço fusionado a um ou mais polipeptídeos PD-1 está em um conjugado de polipeptídeo, o conjugado de polipeptídeo pode incluir dois ou mais polipeptídeos PD-1. Em alguns casos, um conjugado de polipeptídeo incluindo uma pluralidade de cadeias de aminoácido que incluem, cada, um ou mais polipeptídeos PD-1 pode ser um polipeptídeo PD-1 homomérico (por exemplo, pode incluir duas ou mais das mesmas cadeias de aminoácido que incluem, cada, um ou mais polipeptídeos PD-1). Em alguns casos, um conjugado de polipeptídeo incluindo uma pluralidade de cadeias de aminoácido que incluem, cada, um ou mais polipeptídeos PD-1 pode ser um polipeptídeo PD-1 heteromérico (por exemplo, pode incluir duas ou mais cadeias de aminoácido diferentes que incluem, cada, um ou mais polipeptídeos PD-1).

[0085]Uma cadeia de aminoácido incluindo um ou mais segmentos de aminoácido, que pode se ligar a PD-L1 (por exemplo, polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos dos mesmos), presente em um conjugado de polipeptídeo descrito aqui (por exemplo, um conjugado de polipeptídeo incluindo uma pluralidade de cadeias de aminoácido que incluem, cada, um ou mais polipeptídeos PD-1) pode incluir um ou mais segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-L1 fusionado a qualquer polipeptídeo de arcabouço apropriado. Por exemplo, uma cadeia de aminoácido incluindo um ou mais polipeptídeos PD-1 presentes em um conjugado de polipeptídeo descrito aqui pode ser um polipeptídeo de fusão que inclui um ou mais polipeptídeos PD-1 fusionados a qualquer polipeptídeo de arcabouço apropriado. Em alguns casos, um polipeptídeo de arcabouço pode ter a capacidade de formar um conjugado de polipeptídeo (por exemplo, um conjugado de polipeptídeo incluindo uma pluralidade de cadeias de aminoácido associadas). Por exemplo, duas ou mais cadeias de aminoácido incluindo um ou mais polipeptídeos PD-1 fusionados a um polipeptídeo de arcabouço podem formar um conjugado de polipeptídeo que inclui dois ou mais polipeptídeos PD-1. Quando duas ou mais cadeias de aminoácido incluindo um ou mais polipeptídeos PD-1 fusionados a um polipeptídeo de arcabouço formam um conjugado de polipeptídeo, as duas ou mais cadeias de aminoácido podem ser ligadas (por exemplo, por uma ligação covalente ou uma ligação iônica). Um polipeptídeo de arcabouço pode ser qualquer polipeptídeo apropriado que pode formar um conjugado de polipeptídeo com outro polipeptídeo. Um polipeptídeo de arcabouço pode formar naturalmente um conjugado de polipeptídeo ou pode ser modificado para formar um conjugado de polipeptídeo. Exemplos de polipeptídeos de arcabouço que podem formar um conjugado de polipeptídeo podem incluir, sem limitação, polipeptídeos Ig (por exemplo, polipeptídeos IgG como polipeptídeos IgG2), polipeptídeos sigma-1, e polipeptídeos estreptavidina.

[0086]Uma cadeia de aminoácido incluindo um ou mais segmentos de aminoácido, que pode se ligar a PD-L1 (por exemplo, polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos dos mesmos), que pode estar presente em um conjugado de polipeptídeo descrito aqui (por exemplo, um conjugado de polipeptídeo incluindo uma pluralidade de cadeias de aminoácido que incluem, cada, um ou mais polipeptídeos PD-1), pode incluir qualquer sequência de aminoácido apropriada. Por exemplo, uma cadeia de aminoácido incluindo um ou mais polipeptídeos PD-1 fusionados a um polipeptídeo de arcabouço pode incluir qualquer sequência de aminoácido apropriada. As sequências de aminoácido apropriadas de cadeias de aminoácido incluindo um ou mais polipeptídeos PD-1 e um polipeptídeo de arcabouço incluem, sem limitação, as sequências de aminoácido especificadas em SEQ ID NO: 7, 10, 11, 12, 13, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 25, 26, ou 27. Em alguns casos, a sequência de aminoácido de uma cadeia de aminoácido incluindo um ou mais polipeptídeos PD-1 e um polipeptídeo de arcabouço pode ter uma sequência que se desvia de uma das sequências de aminoácido especificadas em SEQ ID NO: 7, 10, 11, 12, 13, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 25, 26, ou 27, às vezes referida como uma sequência variante. Por exemplo, uma sequência de aminoácido de um polipeptídeo de fusão contendo um ou mais polipeptídeos PD-1 e um polipeptídeo de arcabouço pode ter pelo menos 80% identidade de sequência para qualquer uma das sequências de aminoácido especificadas em SEQ ID NO: 7, 10, 11, 12, 13, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 25, 26, ou 27. Em algumas modalidades, uma sequência de aminoácido de um polipeptídeo de fusão contendo um ou mais polipeptídeos PD-1 e um polipeptídeo de arcabouço pode ter pelo menos 85% identidade de sequência, 90% identidade de sequência, 95% identidade de sequência, ou pelo menos 99% identidade de sequência para qualquer uma das sequências de aminoácido especificadas em SEQ ID NO: 7, 10, 11, 12, 13, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 25, 26, ou 27. Identidade de sequência percentual é calculada por determinação do número de posições correspondidas em sequências de polipeptídeos alinhadas, dividindo o número de posições correspondidas pelo número total de aminoácidos alinhados, respectivamente, e multiplicando por 100. Uma posição correspondida refere-se a uma posição em que aminoácidos idênticos ocorrem na mesma posição em sequências alinhadas. Sequências podem ser alinhadas usando o algoritmo descrito por Altschul et al. (Ácidos nucleicos Res., 25: 3389 3402 (1997)) como incorporado em programas BLAST (ferramenta de pesquisa de alinhamento local básico), disponível em ncbi.nlm.nih.gov na rede mundial de computadores. Pesquisas ou alinhamentos BLAST podem ser realizados para determinar a identidade de sequência percentual entre um polipeptídeo e qualquer outra sequência ou porção da mesma usando o algoritmo de Altschul et al. BLASTN é o programa usado para alinhar e comparar a identidade entre sequências de ácido nucleico, enquanto BLASTP é o programa usado para alinhar e comparar a identidade entre sequências de aminoácidos. Quando utilizando programas BLAST para calcular a identidade percentual entre uma sequência de polipeptídeo e outra sequência, são usados os parâmetros padrão dos respectivos programas. Em alguns casos, uma cadeia de aminoácido incluindo um ou mais polipeptídeos PD-1 que podem estar presentes em um conjugado de polipeptídeos aqui descrito (por exemplo, um conjugado de polipeptídeo incluindo uma pluralidade de cadeias de aminoácido cada incluindo um ou mais polipeptídeos PD-1) pode ser como especificada no Exemplo 7.

[0087]Em alguns casos, uma cadeia de aminoácido incluindo um ou mais segmentos de aminoácido, que pode se ligar a PD-L1 (por exemplo, polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos dos mesmos), pode ser fusionada a um polipeptídeo de arcabouço que pode formar um conjugado de polipeptídeo incluindo duas cadeias de aminoácido associadas (por exemplo, um polipeptídeo IgG como um polipeptídeo IgG2). Por exemplo, duas cadeias de aminoácido, cada incluindo um polipeptídeo PD-1 fusionado a um polipeptídeo IgG2, podem formar um conjugado de polipeptídeo que inclui dois polipeptídeos PD-1. As sequências de aminoácido de cadeias de aminoácido exemplares, incluindo um polipeptídeo PD-1 fusionado a um polipeptídeo IgG2, incluem, sem limitação, as sequências de aminoácido especificadas em SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:13, ou SEQ ID NO:21.

[0088]Em alguns casos, uma cadeia de aminoácido incluindo um ou mais segmentos de aminoácido, que pode se ligar a PD-L1 (por exemplo, polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos dos mesmos), pode ser fusionada a um polipeptídeo de arcabouço que pode formar um conjugado de polipeptídeo incluindo três cadeias de aminoácido associadas (por exemplo, um polipeptídeo sigma-1). Por exemplo, três cadeias de aminoácido cada incluindo um polipeptídeo PD-1 fusionado a um polipeptídeo sigma-1 pode formar um conjugado de polipeptídeo que inclui três polipeptídeos PD-1. As sequências de aminoácido exemplares de cadeias de aminoácido incluindo um polipeptídeo PD-1 fusionado a um polipeptídeo sigma-1 incluem, sem limitação, as sequências de aminoácido especificadas em SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:16, ou SEQ ID NO:24.

[0089]Em alguns casos, uma cadeia de aminoácido incluindo um ou mais segmentos de aminoácido, que pode se ligar a PD-L1 (por exemplo, polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos dos mesmos), pode ser fusionada a um polipeptídeo de arcabouço que pode formar um conjugado de polipeptídeo incluindo quatro cadeias de aminoácido associadas (por exemplo, um polipeptídeo estreptavidina). Por exemplo, quatro cadeias de aminoácido, cada incluindo um polipeptídeo PD-1 fusionado a um polipeptídeo estreptavidina, podem formar um conjugado de polipeptídeo que inclui quatro polipeptídeos PD-1. As sequências de aminoácido exemplares de cadeias de aminoácido incluindo um polipeptídeo PD-1 fusionado a um polipeptídeo estreptavidina incluem, sem limitação, as sequências de aminoácido especificadas em SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:17.

[0090]Em alguns casos, um composto multivalente de ligação a PD-L1 pode incluir uma partícula viral onde dois ou mais polipeptídeos de revestimento viral são modificados para incluir uma ou mais cadeias de aminoácido que incluem um ou mais segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD- L1 (por exemplo, polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos dos mesmos). Por exemplo, uma partícula viral pode ser modificada por revestimento da partícula viral com duas ou mais cadeias de aminoácido que incluem, cada, um ou mais polipeptídeos PD-1 e um polipeptídeo que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral. Uma cadeia de aminoácido incluindo um ou mais segmentos de aminoácido, que pode se ligar a PD-L1 (por exemplo, polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos dos mesmos), que pode ser usada para revestir uma partícula viral para gerar um composto multivalente de ligação a PD-L1 (por exemplo, uma partícula viral onde dois ou mais polipeptídeos de revestimento viral são modificados para incluir uma ou mais cadeias de aminoácido que incluem um ou mais polipeptídeos PD-1), pode incluir um ou mais segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-L1 fusionado a qualquer polipeptídeo apropriado que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral. Em alguns casos, um polipeptídeo que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral, pode se ligar covalentemente a um ou mais polipeptídeos de revestimento viral. Em alguns casos, um polipeptídeo que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral com elevada afinidade (por exemplo, de cerca de 0,25 μM a cerca de 100 μM) . Um polipeptídeo que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral pode se ligar naturalmente a um polipeptídeo de revestimento viral ou é modificado para se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral. Um polipeptídeo que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral pode se ligar a qualquer polipeptídeo apropriado de revestimento viral.

[0091]Exemplos de polipeptídeos de revestimento viral incluem, sem limitação, polipeptídeos capsídeos (por exemplo, polipeptídeos hexon, polipeptídeos fibra, polipeptídeos penton), e polipeptídeos adenovírus IX. Um polipeptídeo que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral presente em qualquer tipo apropriado de partícula viral. Uma partícula viral pode ser uma partícula viral competente em replicação (RC) (por exemplo, partículas virais dependentes de auxiliar (HD) e partículas virais de ciclo único (SC)), uma partícula viral pode ser uma partícula viral defeituosa em replicação (RD), ou um vírus pode ser uma partícula viral condicionalmente replicante (CRAd). Em alguns casos, uma partícula viral pode ser uma partícula viral oncolítica.

[0092]Em alguns casos, uma partícula viral pode ser um vetor viral. Exemplos de partículas virais que pode ser revestida com uma ou mais cadeias de aminoácido que incluem um ou mais polipeptídeos PD-1 e um polipeptídeo que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral incluem, sem limitação, Ads, vírus adeno-associados (AAVs), lentivírus, enterovírus, reovírus, poxvírus, vírus do sarampo, e herpes vírus.

[0093]Exemplos de polipeptídeos que podem estar presentes em um polipeptídeo de revestimento viral incluem, sem limitação, um polipeptídeo de domínio GLA (por exemplo, um domínio GLA de um polipeptídeo FX), polipeptídeos CAR, polipeptídeos CD46, polipeptídeos desmogleína, polipeptídeos integrina, polipeptídeos de anticorpo de cadeia única, polipeptídeos de anticorpo camelídeo, polipeptídeos capsídeos e polipeptídeos de ligação de envelope.

[0094]Uma cadeia de aminoácido incluindo um ou mais segmentos de aminoácido, que pode se ligar a PD-L1 (por exemplo, polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos dos mesmos), que pode ser usada para revestir uma partícula viral para gerar um composto multivalente de ligação a PD-L1 (por exemplo, uma partícula viral onde um ou dois ou mais polipeptídeos de revestimento viral são modificados para incluir uma ou mais cadeias de aminoácido que incluem um ou mais polipeptídeos PD-1), pode incluir qualquer sequência de aminoácido apropriada. Por exemplo, uma partícula viral pode ser colocada em contato com uma composição compreendendo duas ou mais cadeias de aminoácido que incluem, cada, um ou mais polipeptídeos PD-1 e um polipeptídeo que pode se ligar covalentemente a um polipeptídeo de revestimento viral de modo que as cadeias de aminoácido revestem a partícula viral. Em alguns casos, uma cadeia de aminoácido, que inclui um ou mais polipeptídeos PD-1 e um polipeptídeo que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral, pode ser um polipeptídeo de fusão incluindo um ou mais polipeptídeos PD-1 e um polipeptídeo que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral. Uma cadeia de aminoácido, que inclui um ou mais polipeptídeos PD-1, e um polipeptídeo, que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral, pode incluir qualquer sequência de aminoácido apropriada. As sequências de aminoácido exemplares de cadeias de aminoácido incluindo um ou mais polipeptídeos PD-1 e um polipeptídeo, que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral, incluem, sem limitação, as sequências de aminoácido especificadas em SEQ ID NO: 8, 9, 14, 15, 22, ou 23. Em alguns casos, a sequência de aminoácido de uma cadeia de aminoácido incluindo um ou mais polipeptídeos PD- 1 e um polipeptídeo, que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral, pode ter uma sequência que se desvia de uma das sequências de aminoácido especificadas em SEQ ID NO: 8, 9, 14, 15, 22, ou 23, às vezes referida como uma sequência variante. Por exemplo, uma sequência de aminoácido de um polipeptídeo de fusão contendo um ou mais polipeptídeos PD-1 e um polipeptídeo, que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral, pode ter pelo menos 80% identidade de sequência a qualquer uma das sequências de aminoácido especificadas em SEQ ID NO: 8, 9, 14, 15, 22, ou 23. Em algumas modalidades, uma sequência de aminoácido de um polipeptídeo de fusão contendo um ou mais polipeptídeos PD-1 e um polipeptídeo, que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral, pode ter pelo menos 85% identidade de sequência, 90% identidade de sequência, 95% identidade de sequência, ou pelo menos 99% identidade de sequência a qualquer uma das sequências de aminoácido especificadas em SEQ ID NO: 8, 9, 14, 15, 22, ou 23. Identidade de sequência percentual é calculada por determinação do número de posições correspondidas em sequências de polipeptídeo alinhadas, dividindo o número de posições correspondidas pelo número total de aminoácidos alinhados, respectivamente, e multiplicando por 100. Uma posição correspondida refere-se a uma posição em que aminoácidos idênticos ocorrem na mesma posição em sequências alinhadas. Sequências podem ser alinhadas usando o algoritmo descrito por Altschul et al. (Nucleic Acid Res., 25:3389-3402 (1997)) como incorporado em programas BLAST (ferramenta básica de pesquisa de alinhamento local). Em alguns casos, uma cadeia de aminoácido incluindo um ou mais polipeptídeos PD-1 e um polipeptídeo, que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral, pode ser como especificada nos Exemplos.

[0095]Em alguns casos, uma cadeia de aminoácido, incluindo um ou mais segmentos de aminoácido, que pode se ligar a PD-L1 (por exemplo, polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos dos mesmos), fusionada a um polipeptídeo que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral (por exemplo, um domínio GLA de um polipeptídeo FX), pode ser usada para revestir (por exemplo, para modificar um ou mais polipeptídeos de revestimento viral) uma partícula viral para formar uma partícula viral revestida tendo duas ou mais cadeias de aminoácido incluindo um ou mais segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-L1 que é ligado a um ou mais polipeptídeos de revestimento viral presentes sobre a superfície do partícula viral.

[0096]Por exemplo, uma ou mais cadeias de aminoácido, cada incluindo um polipeptídeo PD-1 fusionado a um domínio GLA de um polipeptídeo FX, podem ser ligadas a dois ou mais polipeptídeos hexon virais e/ou outras proteínas de revestimento viral para revestir uma partícula viral com duas ou mais cadeias de aminoácido, cada incluindo um polipeptídeo PD-1 fusionado a um domínio GLA de um polipeptídeo FX. Quando uma partícula viral é um Ad, 240 homo-trímeros de polipeptídeo hexon (por exemplo, conjugados de polipeptídeo incluindo três polipeptídeos hexon) podem estar presentes na partícula viral (ver, por exemplo, Chen et al., Human gene therapy, 21:739-749 (2010)). Em alguns casos, um polipeptídeo de fusão, incluindo um polipeptídeo PD-1 e um domínio GLA de um polipeptídeo FX, pode ser usado para revestir uma partícula de Ad para gerar um composto multivalente de ligação a PD- L1 que inclui cerca de 240 polipeptídeos PD-1. Por exemplo, quando um polipeptídeo de fusão, incluindo um polipeptídeo PD-1 fusionado a um domínio GLA de um polipeptídeo FX, é ligado a cada trímero de polipeptídeo hexon em uma partícula viral de Ad, a partícula viral incluirá 240 polipeptídeos PD-1. Em alguns casos, um polipeptídeo de fusão, incluindo um polipeptídeo PD-1 e um domínio GLA de um polipeptídeo FX, pode ser usado para revestir uma partícula de Ad para gerar um composto multivalente de ligação a PD-L1 que pode incluir entre cerca de 240 polipeptídeos PD-1 e cerca de 720 polipeptídeos PD-1. Por exemplo, quando um polipeptídeo de fusão, incluindo um polipeptídeo PD-1 fusionado a um domínio GLA de um polipeptídeo FX, é ligado a cada polipeptídeo hexon em uma partícula viral de Ad, a partícula viral incluirá 720 polipeptídeos PD-1.

[0097]Em alguns casos, compostos multivalentes de ligação a PD-L1 descritos aqui (por exemplo, um polipeptídeo de fusão que inclui dois ou mais polipeptídeos PD-1, ou um conjugado de polipeptídeo que inclui uma ou duas ou mais cadeias de aminoácido que incluem, cada, um ou mais polipeptídeos PD-1, ou uma partícula viral onde dois ou mais polipeptídeos de revestimento viral incluem uma ou mais cadeias de aminoácido que incluem um ou mais polipeptídeos PD-1, ou uma partícula viral onde um ou mais polipeptídeos de revestimento viral incluem uma ou mais cadeias de aminoácido que incluem dois ou mais polipeptídeos PD-1), também podem incluir uma ou mais moléculas adicionais/polipeptídeos.

[0098]Exemplos de moléculas, que podem ser incluídas em um composto multivalente de ligação a PD-L1 descrito aqui, incluem, sem limitação, moléculas de direcionamento (por exemplo, polipeptídeos de direcionamento e sequências de ácido nucleico de direcionamento), antígenos, moléculas terapêuticas e polipeptídeos detectáveis. Em alguns casos, quando um composto multivalente de ligação a PD-L1 é um conjugado de polipeptídeo incluindo uma pluralidade de cadeias de aminoácido que incluem, cada, um ou mais polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos de polipeptídeo PD-1 tendo a capacidade de se ligar a PD-L1, e o conjugado de polipeptídeo inclui uma ou mais moléculas adicionais, a uma ou mais moléculas adicionais pode ser incluída em pelo menos uma (por exemplo, 1, 2, 3, 4, ou mais) cadeia de aminoácido incluindo um ou mais polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos de polipeptídeo PD-1 tendo a capacidade de se ligar a PD-L1 que está presente no conjugado de polipeptídeo. Por exemplo, quando um composto multivalente de ligação a PD-L1 é um conjugado de polipeptídeo incluindo uma pluralidade de cadeias de aminoácido que incluem, cada, um ou mais polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos de polipeptídeo PD-1 tendo a capacidade de se ligar a PD-L1, e o conjugado de polipeptídeo inclui uma ou mais moléculas adicionais, a uma ou mais moléculas adicionais pode ser incluída em cada cadeia de aminoácido incluindo um ou mais polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos de polipeptídeo PD-1 tendo a capacidade de se ligar a PD-L1 que está presente no conjugado de polipeptídeo. Em alguns casos, quando um composto multivalente de ligação a PD-L1 é uma partícula viral onde dois ou mais polipeptídeos de revestimento viral são modificados para incluir uma ou mais cadeias de aminoácido que incluem um ou mais polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos de polipeptídeo PD-1 tendo a capacidade de se ligar a PD-L1 (ou uma partícula viral onde um ou mais polipeptídeos de revestimento viral são incluídos em uma ou mais cadeias de aminoácido que incluem dois ou mais segmentos de aminoácido que incluem um ou mais polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos de polipeptídeos PD-1 tendo a capacidade de se ligar a PD-L1), a uma ou mais moléculas adicionais pode ser incluída em pelo menos uma (por exemplo, 1, 2, 3, 4, ou mais) cadeia de aminoácido incluindo um ou mais polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos de polipeptídeo PD-1 usados para modificar um polipeptídeo de revestimento viral em uma partícula viral. Por exemplo, quando um composto multivalente de ligação a PD-L1 é uma partícula viral onde dois ou mais polipeptídeos de revestimento viral são modificados para incluir uma ou mais cadeias de aminoácido que incluem um ou mais polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos de polipeptídeo PD-1 tendo a capacidade de se ligar a PD-L1 (ou uma partícula viral onde um ou mais polipeptídeos de revestimento viral são modificados para incluir uma ou mais cadeias de aminoácido que incluem dois ou mais segmentos de aminoácido que incluem um ou mais polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos de polipeptídeos PD-1 tendo a capacidade de se ligar a PD-L1), a uma ou mais moléculas adicionais pode ser incluída em cada cadeia de aminoácido incluindo um ou mais polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos de polipeptídeo PD-1 usada para modificar um polipeptídeo de revestimento viral em uma partícula viral.

[0099]Quando compostos de ligação a PD-L1 descritos aqui também incluem uma ou mais moléculas de direcionamento (por exemplo, polipeptídeos de direcionamento e sequências de ácido nucleico de direcionamento), uma molécula de direcionamento pode ser qualquer molécula de direcionamento apropriada. Em alguns casos, uma molécula de direcionamento pode ser um polipeptídeo (por exemplo, um polipeptídeo de direcionamento). Em alguns casos, uma molécula de direcionamento pode ser sequência de ácido nucleico (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico de direcionamento). Em alguns casos, uma molécula de direcionamento pode atrair uma célula T para uma célula positiva para PD-L1 (por exemplo, uma célula de câncer positiva para PD-L1). Por exemplo, quando um composto multivalente de ligação a PD-L1, que inclui uma molécula de direcionamento, é ligado a PD-L1 em uma célula positiva para PD-L1, a molécula de direcionamento no composto multivalente de ligação a PD-L1 pode atrair células T para a célula positiva para PD-L1. Por exemplo, quando um composto multivalente de ligação a PD-L1 inclui uma molécula de direcionamento, a molécula de direcionamento no composto multivalente de ligação a PD-L1 pode dirigir o composto multivalente de ligação a PD-L1 a um local alvo (por exemplo, um tecido alvo) dentro de um mamífero. Exemplos de moléculas de direcionamento, que podem ser incluídas em um composto multivalente de ligação a PD-L1 descrito aqui, incluem polipeptídeos virais, antígenos (por exemplo, antígenos peptídeos), sequências de direcionamento miRNA (por exemplo, sequências de direcionamento miRNA específicas de tecido), anticorpos, fatores de crescimento e carboidratos. Quando um polipeptídeo de direcionamento é um polipeptídeo viral, o polipeptídeo viral pode ser derivado de qualquer vírus apropriado (por exemplo, vírus do sarampo (MV), vírus da cinomose canina (CDV), vírus de estomatite vesicular (VSV), vírus da leucemia do macaco gibão (GALV), vírus Zika, vírus da imunodeficiência humana (HIV), e retrovírus humano endógeno (HERV)). Quando um polipeptídeo de direcionamento é um polipeptídeo viral, o polipeptídeo viral pode ser qualquer polipeptídeo viral apropriado (por exemplo, um polipeptídeo hemaglutinina (H) como um polipeptídeo H des-direcionado, um polipeptídeo de fusão (F), um polipeptídeo viral glicoproteína (G), envelope (env; por exemplo, HERV env), sincitina-1, e sincitina-2. Em alguns casos, um polipeptídeo viral pode ser um polipeptídeo MV H. Em alguns casos, um polipeptídeo viral pode ser um polipeptídeo MV F. Em alguns casos, um polipeptídeo viral pode ser um polipeptídeo VSV G.

[00100]Quando os compostos de ligação a PD-L1 descritos aqui também incluem uma ou mais moléculas terapêuticas, uma molécula terapêutica pode ser qualquer molécula terapêutica apropriada. Em alguns casos, uma molécula terapêutica pode ser um polipeptídeo terapêutico. Em alguns casos, uma molécula terapêutica pode reduzir ou eliminar a inativação de PD-L1 de uma ou mais células T. Em alguns casos, uma molécula terapêutica pode ativar e/ou acumular um ou mais agentes farmacêuticos (por exemplo, fármacos anticâncer). Exemplos de moléculas terapêuticas que podem ser incluídas em um composto multivalente de ligação a PD-L1 descrito aqui incluem um polipeptídeo de ligante 4-1BB (4-1BBL), um polipeptídeo de ligante OX40 (OX40L), um polipeptídeo de fator estimulador de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), anticorpos anti-PD-1, ácido nucleico codificando anticorpos anti-PD-1, timina quinase, citosina desaminase, e simportador de iodeto. Em alguns casos, uma molécula terapêutica pode ser um anticorpo terapêutico. O anticorpo terapêutico pode ser um anticorpo agonista que direciona GITR. A sinalização através de GITR intensifica a proliferação de células T e funções efetoras e protege as células T da morte de células induzida por ativação, que, por sua vez, aumenta a frequência de células T de memória. Combinando agonistas de GITR com os compostos de ligação a PD-L1 da invenção pode demonstrar uma forte sinergia.

[00101]Quando compostos de ligação a PD-L1 descritos aqui também incluem um ou mais polipeptídeos detectáveis, um polipeptídeo detectável pode ser qualquer polipeptídeo detectável apropriado. Em alguns casos, um polipeptídeo detectável pode ser detectado (por exemplo, por um médico clínico) para determinar a localização de um ou mais compostos de ligação a PD-L1 descritos aqui. Em alguns casos, um polipeptídeo detectável pode ser detectado (por exemplo, por um médico clínico) para monitorar a persistência de um ou mais compostos multivalentes de ligação a PD-L1 descritos aqui. Exemplos de polipeptídeos detectáveis que podem ser incluídos em um composto de ligação a PD-L1 descrito aqui são selecionados dentre polipeptídeos fluorescentes (por exemplo, proteína fluorescente verde (GFP), polipeptídeos luciferase, marcadores de peptídeo, e simportador de iodeto de sódio.

[00102]Este documento também apresenta ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de ácido nucleico) que podem codificar cadeias de aminoácido descritas aqui (por exemplo, uma cadeia de aminoácido que inclui um ou mais polipeptídeos PD-1 fusionados a um polipeptídeo de arcabouço, ou uma cadeia de aminoácido que inclui um ou mais polipeptídeos PD-1 fusionados a um polipeptídeo que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral) que pode ser usada para gerar compostos multivalentes de ligação a PD-L1 descritos aqui (por exemplo, um polipeptídeo de fusão que inclui dois ou mais polipeptídeos PD-1, ou um conjugado de polipeptídeo que inclui duas ou mais cadeias de aminoácido que incluem, cada, um ou mais polipeptídeos PD-1, ou uma partícula viral onde um ou dois ou mais polipeptídeos de revestimento viral são modificados para incluir uma ou mais cadeias de aminoácido que incluem um ou mais polipeptídeos PD-1, ou uma partícula viral onde um ou mais polipeptídeos de revestimento viral são modificados para incluir uma ou mais cadeias de aminoácido que incluem dois ou mais polipeptídeos PD-1). Em alguns casos, ácido nucleico pode codificar uma cadeia de aminoácido que pode ser usada para gerar um conjugado de polipeptídeo incluindo duas ou mais cadeias de aminoácido que incluem, cada, um ou mais polipeptídeos PD-1. Por exemplo, ácido nucleico pode codificar uma cadeia amino incluindo um ou mais polipeptídeos PD-1 e um polipeptídeo de arcabouço. Em alguns casos, ácido nucleico pode codificar uma cadeia de aminoácido que pode ser usada para gerar uma partícula viral onde um ou mais polipeptídeos de revestimento viral compreendem uma ou mais cadeias de aminoácido que incluem um ou mais polipeptídeos PD-1. Por exemplo, ácido nucleico pode codificar uma cadeia amino incluindo um ou mais polipeptídeos PD-1 e um polipeptídeo que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral.

[00103]Ácido nucleico (por exemplo, vetores de ácido nucleico) codificando cadeias de aminoácido descritas aqui (por exemplo, uma cadeia de aminoácido que inclui um ou mais polipeptídeos PD-1 fusionados a um polipeptídeo de arcabouço, ou uma cadeia de aminoácido que inclui um ou mais polipeptídeos PD-1 fusionados a um polipeptídeo que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral), que pode ser usada para gerar compostos multivalentes de ligação a PD-L1 descritos aqui, pode ser um ácido nucleico selecionado dentre DNA (por exemplo, um construto de DNA), RNA (por exemplo, mRNA), ou uma combinação dos mesmos. Em alguns casos, ácido nucleico codificando uma cadeia de aminoácido descrita aqui pode ser um vetor (por exemplo, um vetor de expressão ou um vetor viral). Um vetor pode ser um vetor RC (por exemplo, vetores HD e vetores SC) ou um vetor pode ser um vetor RD. Quando um vetor é um vetor viral, o vetor viral pode ser derivado de qualquer tipo apropriado de vírus. Em alguns casos, um vetor viral pode ser derivado de vírus oncolítico. Exemplos de vírus dos quais os vetores virais podem ser derivados incluem, sem limitação, Ads, vírus adeno-associados (AAVs), lentivírus, enterovírus, reovírus, poxvírus, vírus do sarampo, e herpes vírus.

[00104]Em alguns casos, ácido nucleico codificando uma cadeia de aminoácido descrita aqui também pode incluir um ou mais elementos regulatórios (por exemplo, para regular a expressão da cadeia de aminoácido). Exemplos de elementos regulatórios que podem ser incluídos em ácido nucleico codificando uma cadeia de aminoácido descrita aqui incluem, sem limitação, promotores (por exemplo, promotores constitutivos, promotores específicos de tecido/célula, e promotores indutíveis, como promotores ativados quimicamente e promotores ativados por luz), intensificadores, sequências de ácido nucleico (por exemplo, genes suicidas) cuja expressão pode induzir apoptose, necrose, e outras formas de morte celular.

[00105]Em alguns casos, ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de ácido nucleico) codificando cadeias de aminoácido descritas aqui (por exemplo, uma cadeia de aminoácido que inclui um ou mais polipeptídeos PD-1 fusionados a um polipeptídeo de arcabouço, ou uma cadeia de aminoácido que inclui um ou mais polipeptídeos PD-1 fusionados a um polipeptídeo que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral), que podem ser usados para gerar compostos multivalentes de ligação a PD-L1 descritos aqui (por exemplo, um polipeptídeo de fusão que inclui dois ou mais polipeptídeos PD-1, ou um conjugado de polipeptídeo que inclui duas ou mais cadeias de aminoácido que incluem, cada, um ou mais polipeptídeos PD-1, ou uma partícula viral onde dois ou mais polipeptídeos de revestimento viral são modificados para incluir uma ou mais cadeias de aminoácido que incluem um ou mais polipeptídeos PD-1, ou uma partícula viral, onde um ou mais polipeptídeos de revestimento viral são modificados para incluir uma ou mais cadeias de aminoácido que incluem dois ou mais polipeptídeos PD-1), podem produzir duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais) cadeias de aminoácido descritas aqui.

[00106]Em alguns casos, ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de ácido nucleico) codificando cadeias de aminoácido descritas aqui (por exemplo, uma cadeia de aminoácido que inclui um ou mais polipeptídeos PD-1 fusionados a um polipeptídeo de arcabouço, ou uma cadeia de aminoácido que inclui um ou mais polipeptídeos PD-1 fusionados a um polipeptídeo que podem se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral), que podem ser usados para gerar compostos multivalentes de ligação a PD-L1 descritos aqui (por exemplo, um polipeptídeo de fusão que inclui dois ou mais polipeptídeos PD-1, ou um conjugado de polipeptídeo que inclui duas ou mais cadeias de aminoácido que incluem, cada, um ou mais polipeptídeos PD-1, ou uma partícula viral onde dois ou mais polipeptídeos de revestimento viral são modificados para incluir uma ou mais cadeias de aminoácido que incluem um ou mais polipeptídeos PD-1, ou uma partícula viral, onde um ou mais polipeptídeos de revestimento viral são modificados para incluir uma ou mais cadeias de aminoácido que incluem dois ou mais polipeptídeos PD-1) podem produzir continuamente uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais) cadeias de aminoácido descritas aqui.

[00107]Em alguns casos, ácidos nucleicos (por exemplo, vetores de ácido nucleico) codificando cadeias de aminoácido descritas aqui (por exemplo, uma cadeia de aminoácido que inclui um ou mais polipeptídeos PD-1 fusionados a um polipeptídeo de arcabouço, ou uma cadeia de aminoácido que inclui um ou mais polipeptídeos PD-1 fusionados a um polipeptídeo que podem se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral), que podem ser usados para gerar compostos multivalentes de ligação a PD-L1 descritos aqui (por exemplo, um polipeptídeo de fusão que inclui dois ou mais polipeptídeos PD-1, ou um conjugado de polipeptídeo que inclui duas ou mais cadeias de aminoácido que incluem, cada, um ou mais polipeptídeos PD-1, ou uma partícula viral onde dois ou mais polipeptídeos de revestimento viral são modificados para incluir uma ou mais cadeias de aminoácido, que incluem um ou mais polipeptídeos PD-1, ou uma partícula viral onde um ou mais polipeptídeos de revestimento viral são modificados para incluir uma ou mais cadeias de aminoácido que incluem dois ou mais polipeptídeos PD-1), podem produzir uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais) cadeias de aminoácido descritas aqui pela duração da persistência do ácido nucleico (por exemplo, até o ácido nucleico ser degradado).

[00108]Em alguns casos, cadeias de aminoácido codificadas por ácido nucleico descrito aqui podem ser usadas para gerar compostos multivalentes de ligação a PD- L1 descritos aqui. Por exemplo, duas ou mais cadeias de aminoácido, incluindo um ou mais polipeptídeos PD-1 fusionados a um polipeptídeo de arcabouço, podem ser montadas (por exemplo, ser automontadas) em um conjugado de polipeptídeo incluindo duas ou mais cadeias de aminoácido que incluem, cada, um ou mais polipeptídeos PD-1 para gerar um conjugado de polipeptídeo descrito aqui. Quando duas ou mais cadeias de aminoácido, incluindo um ou mais polipeptídeos PD-1 fusionados a um polipeptídeo de arcabouço, se montam em um conjugado de polipeptídeo incluindo duas ou mais cadeias de aminoácido que incluem, cada, um ou mais polipeptídeos PD-1 para gerar um conjugado de polipeptídeo, as cadeias de aminoácido podem se montar in vivo ou in vitro. Por exemplo, uma ou mais cadeias de aminoácido, incluindo um ou mais polipeptídeos PD-1 fusionados a um polipeptídeo, que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral, podem se ligar a dois ou mais polipeptídeos de revestimento viral presentes na superfície de uma partícula viral a revestir, de modo a gerar uma partícula viral revestida descrita aqui. Quando uma ou mais cadeias de aminoácido, incluindo um ou mais polipeptídeos PD-1 fusionados a um polipeptídeo, podem se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral da partícula de virus de revestimento de modo a gerar uma partícula viral revestida, a partícula viral pode ser revestida in vivo ou in vitro.

[00109]Em alguns casos, compostos multivalentes de ligação a PD-L1 descritos aqui podem ser purificados. Um polipeptídeo, proteína ou ácido nucleico “purificado” refere-se a um polipeptídeo ou ácido nucleico que constitui o componente principal em uma mistura de componentes, por exemplo, 30% ou mais, 40% ou mais, 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, 80% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais, ou 99% ou mais em peso. Por exemplo, um composto multivalente de ligação a PD-L1 purificado pode constituir cerca de 30% ou mais em peso de uma composição contendo um ou mais compostos multivalentes de ligação a PD-L1. Polipeptídeos podem ser purificados por métodos incluindo, mas não limitados a, cromatografia de afinidade e coluna de afinidade imunossorvente. Por exemplo, um ácido nucleico purificado codificando uma cadeia de aminoácido, que pode ser usada para gerar um composto multivalente de ligação a PD-L1 descrito aqui, pode constituir cerca de 30% ou mais em peso de uma composição contendo uma ou mais cadeias de aminoácido que podem ser usadas para gerar um composto multivalente de ligação a PD-L1 descrito aqui. Ácido nucleico pode ser purificado por métodos incluindo, mas não limitados a, extração de fenol-clorofórmio e purificação em coluna (por exemplo, purificação em mini-coluna).

[00110]Alternativamente, a invenção também provê compostos multivalentes de ligação a PD-1 que incluem dois ou mais segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-1 (por exemplo, polipeptídeos PD-L1 e/ou fragmentos dos mesmos) assim como métodos para produzir e usar compostos multivalentes de ligação a PD-1 que incluem dois ou mais segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-1 (por exemplo, polipeptídeos PD-L1 e/ou fragmentos dos mesmos). Em alguns casos, um composto multivalente de ligação a PD-1 pode incluir dois ou mais segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-1 (por exemplo, polipeptídeos PD-L1 e/ou fragmentos dos mesmos). Por exemplo, um composto multivalente de ligação a PD-1 que inclui dois ou mais polipeptídeos PD-L1 (e/ou fragmentos dos mesmos tendo a capacidade de se ligar a PD-1) pode se ligar dois ou mais polipeptídeos PD-1. Em alguns casos, um composto multivalente de ligação a PD-1 pode incluir uma cadeia simples de aminoácido que inclui dois ou mais segmentos de aminoácido que podem se ligar a PD-1.

[00111]São também providos aqui métodos e materiais para tratamento de câncer, por exemplo, administrando uma composição contendo um ou mais compostos multivalentes de ligação a PD-L1 descritos aqui. O um ou mais compostos multivalentes de ligação a PD-L1 podem ser administrados a um indivíduo em combinação com polipeptídeos terapêuticos. Em uma modalidade um composto multivalente de ligação a PD- L1 compreende um polipeptídeo terapêutico que é administrado a um indivíduo para tratar câncer. Em outra modalidade, um composto multivalente de ligação a PD-L1 é coadministrado com um Ad expressando um polipeptídeo terapêutico a um indivíduo para tratar câncer.

[00112]A invenção engloba partículas virais em que dois ou mais polipeptídeos de revestimento viral compreendem uma ou mais cadeias de aminoácido que incluem um ou mais polipeptídeos PD-1. A partícula viral pode ser uma partícula viral recombinante compreendendo polipeptídeos PD-1, incluindo proteínas de fusão PD-1, na proteína capsídeo da partícula viral. A partícula viral pode ser uma partícula viral que foi revestida com polipeptídeos PD-1, por exemplo, proteínas de fusão PD-1.

[00113]Em uma modalidade, onde o composto de ligação a PD-L1 compreende um vírus recombinante, o vírus é um Ad recombinante, por exemplo, cepa de Ad Ad657 ou cepa de Ad Ad6/57/6, e variantes dos mesmos. O Ad recombinante pode ser modificado para ser um Ad condicionalmente replicante (CRAd). Tais Ads recombinantes são descritos no pedido US número de série 16/690.733, cuja descrição é aqui incorporada em sua totalidade por referência como se totalmente especificada aqui.

[00114]Em uma modalidade, a invenção engloba uma partícula viral de Ad recombinante condicionalmente replicante que compreende uma ou mais cadeias de aminoácido que incluem, cada, um ou dois ou mais polipeptídeos PD-1, ou ácido nucleico codificando cadeias de aminoácido que podem ser usadas para gerar compostos multivalentes de ligação a PD-L1.

[00115]Em alguns casos, um Ad recombinante descrito aqui (por exemplo, um Ad recombinante tendo atividade anticâncer oncolítica como um Ad recombinante 657) pode incluir um genoma de Ad contendo uma ou mais deleções de ácido nucleico. Uma deleção de ácido nucleico pode ser uma deleção completa (por exemplo, deleção de um ácido nucleico codificando um polipeptídeo) ou uma deleção parcial (por exemplo, deleção de um ou mais nucleotídeos dentro de um ácido nucleico codificando um polipeptídeo). Uma deleção de ácido nucleico pode reduzir ou eliminar a transcrição e tradução de um polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico deletado. Em alguns casos, um ácido nucleico codificando um polipeptídeo associado com produção de progênie infecciosa pode ser deletado. Exemplos de ácidos nucleicos que podem ser deletados e/ou modificados em um Ad recombinante descrito aqui podem codificar E1 (por exemplo, E1A e E1B), E2, E3, E4, pIIIA, fibra, E1B, e incluem intensificadores e promotores virais. Por exemplo, um Ad recombinante descrito aqui (por exemplo, um Ad recombinante tendo atividade anticâncer oncolítica como um Ad recombinante 657) pode incluir um genoma de Ad contendo uma deleção de um ou mais nucleotídeos dentro de um ácido nucleico codificando um polipeptídeo E1. Em alguns casos, um Ad recombinante descrito aqui pode incluir uma ou mais substituições em um ácido nucleico codificando um polipeptídeo E1.

[00116]Em modalidades particulares, um Ad recombinante descrito aqui é modificado para compreender um promotor de probasina compreendendo, por exemplo, um ácido nucleico de SEQ ID NO:41, é modificados para compreender uma deleção dl1101 em um ácido nucleico codificando um polipeptídeo E1; um Ad recombinante descrito aqui é modificado para compreender uma deleção dl1107 em um ácido nucleico codificando um polipeptídeo E1; um Ad recombinante descrito aqui é modificado para compreender uma deleção dl1101 e uma deleção dl1107. A modificação de dl1101 para E1a evita a ligação para p300 e para tornar o vírus susceptível a repressões de Interferon (INF). A mutação dl1107 em E1a evita sua ligação a pRB para bloquear a replicação do vírus em células com vias de pRB intactas. Ver Figura 10 para sequências N-terminais de aminoácido do polipeptídeo E1A, por exemplo, Ad E1A tipo selvagem, e variantes CRAd-657- dl1101, CRAd-657-dl1107 e CRAd-657-dl1101/1107.

[00117]Esquema de mutações em Ad6, Ad657 e variantes dos mesmos envolvendo mutações na proteína E1 para converter o vírus para um Ad condicionalmente replicante (CRAd) é mostrado em Figura 9 e Figura 10. Estes incluem dl1101 e/ou o dl1107 que bloqueiam a ligação a p300 e pRB, respectivamente.

[00118]Figura 10 mostra as sequências de aminoácido N- terminais de E1A em um Ad tipo selvagem, assim como variantes de Ad E1A dl1101, E1A dl1107 e E1A dl1101/1107.

[00119]Também mostrado é a substituição do promotor E1 de Ad com a sequência de DNA do promotor específico de próstata probasina-E1 (SEQ ID NO:41) para gerar o CRAd, Ad- PB (Figura 9). O promotor de probasina é dependente de andrógeno, assim funcionará em tumores sensíveis a andrógenos como LNCaP, mas não em tumores resistentes a andrógenos como DU145.

[00120]Os Ads competentes em replicação, assim como os CRAds, da invenção são geneticamente modificados por métodos conhecidos dos versados na técnica para expressar um ou mais polipeptídeos terapêuticos. Os polipeptídeos terapêuticos podem ser polipeptídeos estimulatórios imunes, por exemplo, CD40L, 4-1BBL, OX40, GM-CSF, e combinações dos mesmos.

[00121]Além disso, em uma modalidade, os Ads competentes em replicação, assim como os CRAds, da invenção são geneticamente modificados por métodos conhecidos dos versados na técnica para expressar ambos os polipeptídeos PD-1 e um ou mais polipeptídeos terapêuticos como proteínas de fusão.

[00122]Os Ads competentes em replicação, assim como os CRAds, da invenção podem ser geneticamente modificados por métodos conhecidos dos versados na técnica para compreender modificados proteínas capsídeos fibra/botão. A proteína de Ad fibra é um complexo de três subunidades aparentemente idênticas que medeiam a etapa de fixação inicial. A proteína de Ad6 fibra nativa (SEQ ID NO:35) se liga a CAR.

[00123]Em um aspecto adicional da invenção, Ads recombinantes modificados por fibra tendo diferentes proteínas fibra ou modificações nas proteínas fibra/botão, que não são nativas do Ad parental, foram gerados. Ads recombinantes, incluindo CRAds, compreendendo proteínas capsídeos de diferentes cepas de Ad e proteínas heterólogas fibra/botão foram gerados, por exemplo, Ads recombinantes compreendendo um polipeptídeo fibra Ad35 heterólogo ou polipeptídeo fibra chimpanzé C68, +/- um peptídeo K7.

[00124]Um Ad quimérico, quimera fibra AdF35, tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:36 e é mais curto do que as proteínas fibra de Ad5 e Ad6 e redireciona o vírus para CD46.

[00125]Um Ad recombinante modificado com fibra, compreendendo Fibra K7 tendo a sequência de SEQ ID NO:37, direciona vírus para proteoglicanos de sulfato de heparina e cargas negativas em células.

[00126]Um Ad quimérico e recombinante, Fibra 6/FC68 compreendendo a sequência de SEQ ID NO:38, é um Ad quimérico tendo uma proteína fibra de adenovírus C68 chimpanzé. A proteína fibra é mais curta do que proteínas fibra Ad5 ou Ad6 e se liga a CAR.

[00127]Um Ad quimérico e recombinante, Fibra 6/FC68-K7 compreendendo a sequência de SEQ ID NO:39, é um Ad quimérico tendo uma proteína fibra de adenovírus C68 chimpanzé. A proteína fibra é mais curta do que as proteínas fibra Ad5 ou Ad6. A Fibra 6/FC68-K7 se liga a CAR e é redirecionada a sulfato de heparina e cargas negativas.

[00128]Um Ad quimérico e recombinante, Fibra 6/FC68-HI- K7 compreendendo a sequência de SEQ ID NO:40, é um Ad quimérico tendo uma proteína fibra de adenovírus C68 chimpanzé. A proteína fibra é mais curta do que proteínas fibra de Ad5 ou Ad6. A Fibra 6/FC68-HI-K7 se liga a CAR e é redirecionada para sulfato de heparina e cargas negativas.

[00129]Em alguns casos, um Ad recombinante descrito aqui (por exemplo, um Ad recombinante tendo atividade anticâncer oncolítico como um Ad recombinante 657) pode incluir um genoma de Ad contendo um ou mais inserções de ácido nucleico. Por exemplo, uma inserção de ácido nucleico pode incluir um ácido nucleico codificando um polipeptídeo, por exemplo um polipeptídeo terapêutico. Um ácido nucleico pode ser inserido em qualquer localização apropriada dentro de um genoma de um Ad recombinante descrito aqui. Em alguns casos, um ácido nucleico codificando um polipeptídeo pode ser inserido em uma HVR (por exemplo, HVR 5 laços) de um genoma de um Ad recombinante descrito aqui. Por exemplo, quando um ácido nucleico codificando um polipeptídeo é inserido em uma HVR de um genoma de um Ad recombinante descrito aqui, o ácido nucleico codificando um polipeptídeo pode expressar um ou mais polipeptídeos, e o(s) polipeptídeo(s) expresso(s) pode ser incorporado no capsídeo do Ad recombinante. Em casos em que um ácido nucleico codificando um polipeptídeo é inserido em uma região HVR de um genoma de um Ad recombinante descrito aqui, o Ad recombinante o apresentar de cerca de 1 a cerca de 720 polipeptídeos codificados pelo ácido nucleico inserido em sua superfície. Uma inserção de ácido nucleico pode ser ácido nucleico codificando qualquer polipeptídeo apropriado. Em alguns casos, uma inserção de ácido nucleico pode codificar um polipeptídeo terapêutico, um polipeptídeo antígeno ou uma citocina.

[00130]Em geral, Ads podem ser modificados para incluir modificações de CRAd descritas aqui.

[00131]Em uma modalidade, um Ad recombinante é um Ad condicionalmente replicante com uma modificação dl1101 para E1a, que evita ligação a p300 e torna o vírus susceptível a repressão IFN, e uma mutação dl1107 em E1a para evitar sua ligação a pRB para bloquear replicação do vírus em células com vias pRB intactas, e uma deleção E3A. O CRAd expressa PD-1 humano fusionado a imunoglobulina humana.

[00132]Em uma modalidade, um Ad recombinante (por exemplo Ad657) é um Ad condicionalmente replicante com uma modificação dl1101 para E1a, que evita a ligação a p300 e torna o vírus susceptível a repressão IFN, e uma deleção E3A. O CRAd expressa PD-1 humano fusionado a Fator X humano (GLA) sobre a superfície da partícula viral, em que o CRAd é redirecionado a células expressando PD-L1 sobre a superfície da célula.

[00133]Em uma modalidade, um Ad recombinante é um Ad condicionalmente replicante (por exemplo Ad657) com uma modificação dl1101 a E1a, que evita a ligação a p300 e torna o vírus susceptível a repressão IFN, e uma mutação dl1107 em E1a para evitar sua ligação a pRB para bloquear replicação do vírus em células com vias pRB intactas e uma deleção E3A. O CRAd expressa PD-1 humano fusionado a Fator X humano (GLA) sobre a superfície da partícula viral, em que o CRAd é redirecionado a células expressando PD-L1 sobre a superfície da célula.

[00134]As partículas virais tendo polipeptídeos PD-1 ligados à superfície da partícula viral podem ser usadas para tratar um mamífero tendo câncer (por exemplo, um câncer incluindo uma ou mais células de câncer positivas para PD-L1). As partículas virais podem ser administradas a um indivíduo em uma quantidade eficaz para o tratamento de câncer e, opcionalmente, podem ser administradas em combinação com terapias para câncer, incluindo imunoterapias e agentes quimioterapêuticos.

[00135]Em um aspecto da invenção, uma composição contendo um ou mais compostos multivalentes de ligação a PD-L1 ou ácido nucleico codificando uma cadeia de aminoácido que pode ser usada para gerar compostos multivalentes de ligação a PD-L1 descritos aqui e, opcionalmente, uma ou mais terapias de câncer, pode ser administrada a um mamífero tendo câncer para tratar o mamífero. Um composto multivalente de ligação a PD-L1 descrito aqui pode se ligar a PD-L1 em células de câncer positivas para PD-L1. A ligação de um polipeptídeo PD-1 pode neutralizar a função de PD-L1 e, assim, evitar que as células positivas para PD-L1 (por exemplo, células de câncer positivas para PD-L1) escapem do sistema imune e/ou pode permitir que os agentes anticâncer (por exemplo, imunoterapias para câncer) se direcionem de modo mais efetivo para as células positivas para PD-L1. Em casos em que ácido nucleico codificando um composto multivalente de ligação a PD-L1 descrito aqui é um vetor de Ad oncolítico codificando um composto multivalente de ligação a PD-L1 descrito aqui, o Ad oncolítico pode infectar a célula e pode dirigir as respostas de células para a célula infectada. Um Ad oncolítico pode infectar qualquer tipo apropriado de célula. Em alguns casos, um Ad oncolítico pode infectar uma célula positiva para PD-L1 (por exemplo, uma célula de câncer positiva para PD-L1). Em alguns casos, um Ad oncolítico pode infectar células não se dividindo (por exemplo, células de rim).

[00136]Em alguns casos, uma composição compreendendo ou consistindo essencialmente em um ou mais compostos de ligação a PD-L1 descritos aqui pode ser usada para tratar um mamífero tendo câncer (por exemplo, um câncer incluindo uma ou mais células de câncer positivas para PD-L1). Por exemplo, uma composição contendo um ou mais compostos multivalentes de ligação a PD-L1 e, opcionalmente, uma ou mais terapêuticas para câncer, pode ser administrada a um mamífero tendo câncer para tratar o mamífero.

[00137]Alternativamente, os métodos e materiais descritos aqui podem ser usados no tratamento de outras doenças ou distúrbios associados com células positivas para PD-L1. Em alguns casos, uma composição contendo um ou mais compostos de ligação a PD-L1 descritos aqui pode ser usada para tratar um mamífero tendo uma doença infecciosa (por exemplo, uma doença infecciosa incluindo um ou mais macrófagos positivos para PD-L1 como macrófagos infiltrando o câncer). Exemplos de doenças infecciosas que podem incluir uma ou mais células positivas para PD-L1 incluem, sem limitação, HIV, hepatite e malária. Em alguns casos, uma composição contendo um ou mais compostos de ligação a PD-L1 descritos aqui pode ser usada para tratar um mamífero tendo uma doença autoimune (por exemplo, uma doença autoimune incluindo um ou mais macrófagos positivos para PD-L1 como macrófagos infiltrando o câncer).

[00138]Qualquer mamífero apropriado tendo câncer pode ser tratado como descrito aqui. Por exemplo, humanos e outros primatas como macacos tendo câncer podem ser tratados com uma composição contendo um ou mais compostos de ligação a PD-L1 descritos aqui e, opcionalmente, podem ser tratados em combinação com um ou mais tratamentos de câncer para reduzir a gravidade do câncer, reduzir um sintoma do câncer, e/ou reduzir o número de células de câncer presentes no mamífero como humano ou de outro primata. Em alguns casos, cães, gatos, cavalos, vacas, porcos, ovelhas, camundongos, e ratos tendo câncer podem ser tratados com uma composição contendo um ou mais compostos multivalentes de ligação a PD-L1 descritos aqui, vírus compreendendo compostos de ligação a PD-L1, ou ácido nucleico codificando uma cadeia de aminoácido que pode ser usada para gerar compostos multivalentes de ligação a PD-L1 descritos aqui, e, opcionalmente, podem ser tratados com um ou mais tratamentos de câncer como descritos aqui.

[00139]Quando tratando um mamífero (por exemplo, um humano) tendo um câncer como descrito aqui, o câncer pode ser qualquer câncer apropriado. Um câncer pode incluir uma ou mais células de câncer positivas para PD-L1. Um câncer pode incluir um ou mais tumores sólidos. Um câncer pode ser um câncer de sangue. Exemplos de cânceres que podem ser tratados como descritos aqui incluem, sem limitação, câncer de mama, câncer colorretal, câncer de rim, câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células não pequenas), câncer ovariano, melanoma, câncer do cérebro, sarcoma, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer de cabeça e pescoço, câncer de fígado, retinoblastoma, linfoma e leucemia.

[00140]Em alguns casos, um mamífero pode ser identificado como tendo um câncer (por exemplo, um câncer incluindo uma ou mais células de câncer positivas para PD- L1). Qualquer método apropriado pode ser usado para identificar um mamífero tendo câncer. Por exemplo, técnicas de geração de imagem e técnicas de biópsia podem ser usadas para identificar mamíferos (por exemplo, humanos) tendo câncer.

[00141]Uma vez identificado como tendo um câncer, um mamífero pode ser administrado com uma composição contendo um ou mais compostos de ligação a PD-L1 descritos aqui, e, opcionalmente, pode ser tratado com uma ou mais terapêuticas para câncer e/ou tratamentos de câncer. A uma ou mais terapêuticas para câncer pode incluir quaisquer tratamentos de câncer apropriados. Em alguns casos, um tratamento de câncer pode incluir cirurgia. Em alguns casos, um tratamento de câncer pode incluir terapia de radiação. Em alguns casos, um tratamento de câncer pode incluir administração de uma farmacoterapia como quimioterapia, terapia hormonal, terapia direcionada, e/ou terapia citotóxica. Exemplos de tratamentos de câncer incluem, sem limitação, administração de um ou mais inibidores do receptor de tirosina quinase (por exemplo, erlotinibe), administração de um ou mais inibidores de PD1/PD-L1 (por exemplo, nivolumabe, pembrolizumabe, atezolizumabe, avelumabe, cemiplimabe, e durvalumabe), administração de uma ou mais imunoterapias como imunoterapias que podem direcionar PD1/PD-L1 (por exemplo, nivolumabe, pembrolizumabe, atezolizumabe, avelumabe, cemiplimabe, durvalumabe, alemtuzumabe, ipilimumabe, ofatumumabe, e rituximabe), administração de um ou mais anticorpos que direcionam GITR, administração de um ou mais compostos de platina (por exemplo, uma cisplatina ou carboplatina), administração de um ou mais taxanos (por exemplo, paclitaxel, docetaxel, ou um paclitaxel ligado a albumina como nab-paclitaxel), administração de altretamina, administração de capecitabina, administração de ciclofosfamida, administração de etoposida (vp-16), administração de gencitabina, administração de ifosfamida, administração de irinotecano (cpt-11), administração de doxorubicina lipossomal, administração de melfalan, administração de pemetrexed, administração de topotecano, administração de vinorelbina, administração de um ou mais agonistas do hormônio liberando hormônio luteinizante (LHRH) (como goserelina e leuprolida), administração de uma ou mais terapias antiestrogênio (como tamoxifeno), administração de um ou mais inibidores de aromatase (como letrozol, anastrozol, e exemestano), administração de um ou mais inibidores de angiogenese (como bevacizumabe), administração de um ou mais inibidores de poli(ADP)-ribose polimerase (PARP) (como olaparibe, rucaparibe, e niraparibe), administração de radioterapia por feixe externo, administração de braquiterapia, administração de fósforo radioativo, e administração de quaisquer combinações dos mesmos. Em casos em que um mamífero tendo câncer é tratado com uma composição contendo um ou mais compostos multivalentes de ligação a PD-L1 ou ácido nucleico codificando uma cadeia de aminoácido que pode ser usada para gerar compostos multivalentes de ligação a PD-L1 descritos aqui, e é tratado com um ou mais tratamentos de câncer, a composição contendo um ou mais tratamentos de câncer pode ser administrada ao mesmo tempo ou independentemente. Por exemplo, a composição contendo um ou mais compostos multivalentes de ligação a PD-L1 ou ácido nucleico codificando uma cadeia de aminoácido que pode ser usada para gerar compostos multivalentes de ligação a PD-L1 descritos aqui pode ser administrada primeira, e o um ou mais tratamentos de câncer administrados em segundo lugar, ou vice-versa.

[00142]Em alguns casos, uma composição compreendendo um ou mais compostos de ligação a PD-L1 descritos aqui pode ser formulada em uma composição farmaceuticamente aceitável para administração a um mamífero tendo câncer. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais compostos multivalentes de ligação a PD-L1 ou ácido nucleico codificando uma cadeia de aminoácido que pode ser usada para gerar compostos multivalentes de ligação a PD-L1 descritos aqui pode ser formulada junto com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis (aditivos) e/ou diluentes. A composição farmacêutica pode compreender adicionalmente um polipeptídeo terapêutico e/ou um vírus recombinante que é geneticamente modificado para expressar um polipeptídeo terapêutico. Uma composição farmacêutica compreendendo, ou consistindo essencialmente em um composto multivalente de ligação a PD-L1 e, opcionalmente, um polipeptídeo terapêutico, pode ser formulada para administração em forma sólida ou líquida incluindo, sem limitação, soluções estéreis, suspensões, formulações de liberação sustentada, comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, nanopartículas e grânulos. Carreadores, cargas e veículos farmaceuticamente aceitáveis que podem ser usados em uma composição farmacêutica descrita aqui incluem, sem limitação, trocadores de íons, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas de soro, como albumina de soro humano, substâncias tampão como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas de glicerídeos parciais de ácidos graxos vegetais saturados, água, sais ou eletrólitos, como sulfato de protamina, hidrogenofosfato dissódico, hidrogenofosfato de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinilpirrolidona, substâncias à base de celulose, polietilenoglicol, carboximetilcelulose de sódio, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloco de polietileno- polioxipropileno, polietilenoglicol e gordura de lã.

[00143]A composição farmacêutica compreendendo ou consistindo essencialmente de um ou mais compostos multivalentes de ligação a PD-L1 como descritos aqui e, opcionalmente, um polipeptídeo terapêutico, são formulados para administração oral ou parenteral (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa, intratumoral e intradérmica).

[00144]Quando sendo administrada oralmente, uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais compostos de ligação a PD-L1 ou ácido nucleico codificando uma cadeia de aminoácido que pode ser usada para gerar compostos multivalentes de ligação a PD-L1 descritos aqui pode estar na forma de uma pílula, comprimido ou cápsula.

[00145]Composições apropriadas para a administração parenteral incluem soluções de injeção estéril aquosa e não aquosa que podem conter antioxidantes, tampões, agentes bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor pretendido; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de colocação em suspensão e espessantes. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou múltiplas doses, por exemplo, ampolas e frasquinhos vedados, e podem ser armazenadas em uma condição seca por congelamento (liofilizada) exigindo apenas a adição do carreador líquido estéril, por exemplo, água para injeções, imediatamente antes do uso. As soluções e suspensões de injeção extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis. Essas soluções de injeção podem estar na forma, por exemplo, de uma suspensão aquosa ou oleaginosa injetável estéril. Esta suspensão pode ser formulada usando, por exemplo, agentes dispersantes ou umectantes adequados (como, por exemplo, Tween 80) e agentes de colocação em suspensão. A preparação injetável estéril pode ser uma solução ou suspensão injetável estéril em um diluente ou solvente não tóxico e parenteralmente aceitável, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol. Exemplos de veículos e solventes aceitáveis que podem ser usados incluem, sem limitação, manitol, água, solução de Ringer e solução isotônica de cloreto de sódio. Além disso, óleos fixos estéreis podem ser usados como solvente ou meio de colocação em suspensão. Em alguns casos, um óleo fixo suave pode ser usado, como mono- ou di-glicerídeos sintéticos. Ácidos graxos, como ácido oleico e seus derivados de glicerídeos podem ser usados na preparação de injetáveis, assim como óleos naturais farmaceuticamente aceitáveis, como azeite ou óleo de rícino, incluindo aqueles em suas versões polioxietiladas. Em alguns casos, essas soluções ou suspensões de óleo podem conter um diluente ou dispersante de álcool de cadeia longa.

[00146]Modalidades específicas descritas aqui podem ser limitadas adicionalmente nas reivindicações usando a expressão "consistindo em" ou "consistindo essencialmente em". Quando usado nas reivindicações, seja como depositado ou adicionado por modificação, o termo de transição "consistindo em" exclui qualquer elemento, etapa ou ingrediente não especificado nas reivindicações. O termo de transição "consistindo essencialmente em" limita o escopo de uma reivindicação aos materiais ou etapas especificados e àqueles que não afetam materialmente a(s) característica(s) básica(s) e nova(s).

[00147]Em alguns casos, uma composição farmaceuticamente aceitável compreendendo um ou mais compostos de ligação a PD-L1 descritos aqui pode ser administrada localmente ou sistemicamente. Por exemplo, uma composição contendo um composto que inibe a função de um domínio PD-L1 intracelular pode ser administrada localmente por injeção em ou próximo de um câncer (por exemplo, um tumor) em um mamífero (por exemplo, um humano). Por exemplo, uma composição contendo um composto que inibe a função de um domínio PD-L1 intracelular pode ser administrada sistemicamente por administração oral ou por injeção (por exemplo, injeção subcutânea, intramuscular, intravenosa, intratumoral e intradérmica) a um mamífero (por exemplo, um humano).

[00148]As doses eficazes podem variar dependendo da gravidade do câncer, a via de administração, a idade e o estado geral de saúde do indivíduo, o uso de excipiente, a possibilidade de uso conjunto com outros tratamentos terapêuticos como o uso de outros agentes, e o julgamento do médico assistente.

[00149]Uma quantidade eficaz de uma composição contendo um ou mais compostos de ligação a PD-L1 descritos aqui pode ser qualquer quantidade que possa reduzir a gravidade do câncer, para reduzir um sintoma do câncer, e/ou para reduzir o número de células de câncer presente dentro do mamífero sem produzir toxicidade significativa para o mamífero. A quantidade eficaz pode permanecer constante ou pode ser ajustada como uma escala deslizante ou dose variável dependendo da resposta do mamífero ao tratamento. Vários fatores podem influenciar a quantidade efetiva real usada para uma aplicação particular. Por exemplo, a frequência de administração, duração de tratamento, uso de vários agentes de tratamento, via de administração e gravidade da condição (por exemplo, câncer) pode exigir um aumento ou diminuição da quantidade administrada eficaz real.

[00150]A frequência de administração pode ser qualquer frequência que sensibiliza as células de câncer no mamífero para um ou mais tratamentos de câncer (por exemplo, uma ou mais imunoterapias de câncer) sem produzir toxicidade significativa para o mamífero. Por exemplo, a frequência de administração pode ser de cerca de uma vez por semana a cerca de três vezes por dia, ou de cerca de duas vezes por mês a cerca de seis vezes por dia, ou de cerca de duas vezes por semana a cerca de uma vez por dia. A frequência de administração pode permanecer constante ou pode ser variável durante a duração de tratamento. Um curso de tratamento com uma composição contendo um ou mais compostos de ligação a PD-L1 descritos aqui pode incluir períodos de descanso. Por exemplo, uma composição contendo um ou mais compostos multivalentes de ligação a PD-L1 ou ácido nucleico codificando uma cadeia de aminoácido que pode ser usada para gerar compostos multivalentes de ligação a PD-L1 descritos aqui pode ser administrada diariamente durante um período de duas semanas seguido por um período de descanso de duas semanas, e tal regime pode ser repetido várias vezes. Como com a quantidade eficaz, vários fatores podem influenciar a frequência real de administração usada para uma aplicação particular. Por exemplo, a quantidade eficaz, duração de tratamento, uso de vários agentes de tratamento, via de administração e gravidade da condição (por exemplo, câncer) podem requerer um aumento ou diminuição em frequência de administração.

[00151]Uma duração efetiva para administrar uma composição contendo um ou mais compostos de ligação a PD-L1 descritos aqui pode ser qualquer duração que possa reduzir a gravidade do câncer, reduzir um sintoma do câncer, e/ou reduzir o número de células de câncer presentes no mamífero sem produzir toxicidade significativa para o mamífero. Assim, a duração pode variar de vários dias a várias semanas, meses ou anos. Em geral, a duração efetiva para o tratamento de câncer pode estar na faixa de uma duração de seis meses a um ano. Vários fatores podem influenciar a duração efetiva real usada para um tratamento particular. Por exemplo, uma duração efetiva pode variar com a frequência de administração, quantidade eficaz, uso de vários agentes de tratamento, via de administração e gravidade da condição sendo tratada.

[00152]Em certos casos, um curso de tratamento e a gravidade de um ou mais sintomas relacionados com a condição sendo tratada (por exemplo, câncer) podem ser monitorados. Qualquer método apropriado pode ser usado para determinar se ou não a sensibilidade de células de câncer no mamífero a um ou mais tratamentos de câncer (por exemplo, uma ou mais imunoterapias de câncer) é aumentada. Por exemplo, a capacidade de resposta de câncer (por exemplo, com base no tamanho e/ou número de tumores) pode ser avaliada usando técnicas de imagem de consultório em diferentes momentos.

[00153]A invenção será ainda descrita nos exemplos seguintes, que não limitam o âmbito da invenção descrita nas reivindicações.

EXEMPLOS Exemplo 1. Construção de Adenovírus Recombinantes: Inserção de HVRs individuais de Diferentes Serotipos de Ad com a Inserção de Peptídeos de Direcionamento/Des- direcionamento à Célula ou Novos Aminoácidos.

[00154]Adenovírus recombinantes foram construídos por tecnologia de DNA recombinante utilizando métodos conhecidos dos versados na técnica. Um Ad recombinante (Ad657) é derivado de uma primeira cepa de Ad Ad6 (por exemplo, pode incluir um genoma de uma primeira cepa de Ad) e pode incluir HVRs de hexon capsídeo de uma segunda cepa de Ad, Ad57, ver Figura 8. Estas modalidades têm sido aplicadas geralmente no contexto de Ads que combinam diferentes HVRs de hexon capsídeo de diferentes Ads (isto é, embaralhamento de HVRs). Figura 7 mostra um alinhamento de Ad5, Ad6, e Ad57 mostrando variação em regiões de hexon. Por exemplo, HVR1 de cepa de Ad Ad6 com HVRs 2-7 de cepa de Ad Ad57 ou HVR1 e 7 de cepa de Ad Ad6 com HVRs 2-6 de cepa de Ad Ad57. Em uma modalidade adicional, um vírus Ad6/56/6 tem HVRs 1 e 7 de cepa de Ad Ad6 e HVRs 2-6 de cepa de Ad Ad657.

[00155]Em um aspecto da invenção, Ad quiméricos foram gerados que têm um HVR1 de Ad6 e HVRs 2-7 de Ad57, a quimera, referida como quimera de HVR Ad6/57, compreende o hexon tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:28.

[00156]Em ainda outro aspecto da invenção, Ad quiméricos foram gerados que têm HVR1 de Ad6 e 7 e HVRs 2-6 de Ad57, a quimera, referida como quimera de HVR de Ad6/57/6, compreende o hexon tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:29.

[00157]Para obter a cepa Ad recombinante Ad657, um ácido nucleico codificando HVRs 1-7 de Ad57 foi sintetizado e inserido no hexon de Ad6 em um plasmídeo com um cassete FRT-Zeocin®-FRT entre pVI e hexon. Esta foi recombinada em vários plasmídeos pAd6 para gerar Ad657 e variantes dos mesmos. A sequência de aminoácido do hexon de Ad657 é especificada em SEQ ID NO:30.

[00158] Com relação a variantes de Ad657, a sequência de HVR de Ad57 foi sintetizada com HVR1 modificada com uma cisteína, aminoácidos de flexibilidade, e sítios de restrição para permitir inserções de outros peptídeos. Esta foi inserida no hexon de Ad6 em um plasmídeo com um cassete FRT-Zeocin®-FRT entre pVI e hexon. Esta foi recombinada em vários plasmídeos pAd6 para gerar variantes de Ad657 com cisteína em HVR1, a variante referida como Ad657-HVR1-XXA compreende o hexon tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:42.

[00159]Com relação a variantes de Ad657, a sequência de HVR de Ad57 foi sintetizada com HVR5 modificado com uma cisteína, aminoácidos de flexibilidade, e sítios de restrição para permitir inserções de outros peptídeos. Esta foi inserida no hexon de Ad6 em um plasmídeo com um cassete FRT-Zeocin®-FRT entre pVI e hexon. Esta foi recombinada em vários plasmídeos pAd6 para gerar variantes de Ad657 com cisteína em HVR5, a variante referida como Ad657-HVR5-XXA compreende o hexon tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:43.

[00160]Com relação a variantes de Ad657, a sequência de HVR de Ad57 foi sintetizada com HVR1 modificada com uma cisteína, aminoácidos de flexibilidade, e sítios de restrição para permitir inserções de outros peptídeos. Esta foi inserida no hexon de Ad6 em um plasmídeo com um cassete FRT-Zeocin®-FRT entre pVI e hexon. Esta foi recombinada em vários plasmídeos de pAd6 para gerar variantes de Ad657 sem cisteína em HVR1, mas com sítios de restrição permitindo as inserções de peptídeo em HVR1, a variante referida como Ad657-HVR1-XA compreende o hexon tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:44.

[00161]Com relação a variantes de Ad657, a sequência de HVR de Ad57 foi sintetizada com HVR5 modificada com uma cisteína, aminoácidos de flexibilidade, e sítios de restrição para permitir inserções de outros peptídeos. Esta foi inserida no hexon de Ad6 em um plasmídeo com um cassete FRT-Zeocin®-FRT entre pVI e hexon. Esta foi recombinada em vários plasmídeos de pAd6 para gerar variantes de Ad657 sem cisteína em HVR5, mas com sítios de restrição permitindo as inserções de peptídeo em HVR5, a variante referida como Ad657-HVR5-XA compreende o hexon tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:45.

[00162]Com relação a variantes de Ad657, a sequência HVR1-XA de Ad657 foi modificada por inserção de um peptídeo aceitador de biotina em HVR1. Esta foi recombinada em vários plasmídeos pAd6 para gerar variantes de Ad657, um BAP em HVR1, a variante referida como Ad657-HVR1-PSTCD compreende o hexon tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:46.

[00163]A inserção de um peptídeo aceitador de biotina des-direciona as variantes de vírus do fígado, permite ao vírus ser redirecionado com avidina ou estreptavidina e ligantes biotinilados, e permite ao vírus ser purificado em colunas de avidina ou estreptavidina monoméricas.

[00164]Com relação a variantes de Ad657, a sequência HVR1-XA de Ad657 foi modificada por inserção de um peptídeo aceitador de biotina (BAP) em HVR1. Esta foi recombinada em vários plasmídeos pAd6 para gerar variantes de Ad657, um BAP em HVR1, a variante referida como Ad657-HVR5-PSTCD compreende o hexon tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:47.

[00165]Com relação a variantes de Ad657, a sequência HVR5-XA de Ad657 foi modificada por inserção de um laço V1/V2 sintético de envelope do HIV em HVR5, a variante referida como Ad657-HVR5-V1/V2 compreende o hexon tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:48.

[00166]A inserção de um laço de V1/V2 sintético de envelope do HIV permite a exibição deste antígeno para servir como uma vacina, bem como o redirecionamento por ligação a proteínas que interagem com o envelope do HIV.

[00167]Com relação a variantes de Ad657, a sequência HVR5-XA de Ad657 foi modificada por inserção de peptídeos sintéticos a partir do vírus papilloma humano (HPV) em HVR5, a variante referida como Ad657-HVR5-HPV compreende o hexon tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:49.

[00168]A inserção de peptídeos sintéticos do vírus papilloma humano permite a exibição dos peptídeos de HPV como antígenos para fins de vacina, assim como para redirecionamento por ligação a proteínas que interagem com peptídeos de HPV.

[00169]Em outro aspecto da invenção, Ad quiméricos foram gerados que têm uma HVR1 de Ad6 e HVRs 2-7 de Ad57, a quimera, referida como quimera de HVR de Ad6/57, compreende o hexon tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:50.

[00170]Em ainda outro aspecto da invenção, Ads quiméricos foram gerados que têm HVR1 de Ad6 e 7 e HVRs 2-6 de Ad57, a quimera, referida como quimera de HVR de Ad6/57/6, compreende o hexon tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:51.

[00171]Os mapas de plasmídeo de Figuras 16-18 mostram a combinação da inserção de HVRs individuais de diferentes serotipos de Ad com a inserção de peptídeos de direcionamento/des-direcionamento a células, polipeptídeos terapêuticos, ou novos aminoácidos como cisteína no hexon para modificação química direcionada e blindagem.

[00172]Em certas modalidades, peptídeos de ligação à célula são inseridos em HVR 1 ou HVR 5, cujas modalidades servem como exemplos de inserção destes e de outros peptídeos em qualquer uma das HVRs de um Ad.

Exemplo 2. Conjugação Química Direcionada de Ad657- HVR5C Modificado por Hexon Modificado por Cisteína.

[00173]Figura 13 é uma representação de variantes de Ad mostrando a combinação de inserção de HVRs individuais de diferentes serotipos de Ad com a inserção de novos aminoácidos como cisteína no hexon para modificação química direcionada e blindagem.

[00174]Este exemplo demonstra a capacidade para direcionar polímero e outras modificações químicas para cisteínas inseridas em um hexon de Ad (Figura 15). O PEG não direcionado inativa a infecção viral, enquanto a PEGuilação direcionada à cisteína retém as funções do vírus.

[00175]Em um aspecto da invenção, o uso de polímeros ou peptídeos/proteínas inseridas para des-direcionar, redirecionar e abrigar anticorpos, proteínas, células é contemplado. Figuras 12 e 14 mostram sítios de HVRs Ad que podem ser modificados, por exemplo, por PEGuilação ou "BAPilação". Outro exemplo mostra inserção de um peptídeo aceitador de biotina (BAP) que é inserido nestas HVRs permitindo o redirecionamento do vetor com avidina ou estreptavidina e ligantes biotinilados ou com proteínas de fusão avidina ou estreptavidina. A inserção de BAP também permite que os vírus sejam purificados em colunas de avidina ou estreptavidina monoméricas para a produção do vetor. Do mesmo modo, Ad57-HVR1-XXA e XA mostram o exemplo de inserir uma cisteína neste sítio para permitir modificação química direcionada com maleimida ou outros agentes reativos a cisteína.

[00176]Em uma modalidade, os diferentes serotipos de Ad e/ou variantes compreendem blindagem do polímero para permitir a múltipla dosagem de variantes de Ad6 e Ad657. Um ciclo terapêutico exemplar, onde Ad6 e Ad657 podem ser usados para ciclos múltiplos de tratamento por troca de serotipo em combinação com conjugação de polímero covalente, é mostrado (Figura 13).

[00177]Ad657-HVR1C expressando GFPLuciferase foi produzido a partir de células e purificado em gradientes de CsCl. O vírus foi covalentemente modificado com 5 kDa polietileno glicol (PEG). O vírus foi tratado com ou NHS- PEG que reage aleatoriamente com aminas/lisinas em proteínas virais ou com maleimida PEG que reage especificamente com cisteína que foi inserida em HVR1 usando o plasmídeo shuttle XXA. Estes vírus não modificados ou modificados foram então purificados por um giro CsCl final seguido por dessalinização. Os vírus indicados foram separados em géis SDS-PAGE, coloridos com SyproRuby e visualizados por imagem (Figura 14). Isso mostra que NHS- PEGuilação modifica aleatoriamente muitas proteínas virais como demonstrado por aumentos na massa aparente das proteínas (indicado por setas). Em contraste, a reação de PEG de maleimida direcionada com a cisteína em HVR1 modifica apenas o hexon e não danifica outras proteínas do capsômero viral. Os efeitos da PEGuilação na função do vírus são avaliados.

Exemplo 3. Ads replicantes condicionalmente (CRAds).

[00178]Esquema de mutações em Ad6, Ad657 e variantes dos mesmos envolvendo mutações na proteína E1 para converter o vírus em um Ad (CRAd) condicionalmente replicante é mostrado em Figura 9, Figura 10 e Figura 11. Estes incluem dl1101 e/ou dl1107 que bloqueiam a ligação a p300 e pRB, respectivamente.

[00179]Figura 10 mostra as sequências de aminoácido N- terminal de E1A em um Ad de tipo selvagem, assim como variantes de Ad E1A dl1101, E1A dl1107 e E1A dl1101/1107.

[00180]Também é mostrada a substituição do promotor E1 de Ad com o promotor específico de próstata probasina e a sequência de DNA de E1 de SEQ ID NO:31 para gerar o CRAd, Ad-PB (Figura 9). O promotor de probasina é dependente de andrógeno, assim funcionará em tumores sensíveis a andrógenos como LNCaP, mas não em tumores resistentes a andrógenos como DU145.

[00181]Em uma modalidade, um vírus Ad657 condicionalmente replicativo tendo uma modificação dl1101 para E1, e uma mutação dl1107 em E1a, e uma deleção E3A, é construído para expressar PD-1 humano fusionado a imunoglobulina humana como uma proteína chamariz de PD-L1. O vírus também expressa GFPLuciferase de um promotor CMV. Tal variante de vírus Ad657 condicionalmente replicativa é referida como CrAd6d1101/1107DE3ADP-hPD-1-Ig-GL.

Exemplo 4. Adenovírus Recombinante Redirecionado e Des- direcionado.

[00182]In vitro, Ads se ligam e entram nas células por meio das interações combinadas de suas proteínas de base de fibra e penton com receptores de superfície celular. A fibra trimérica se liga ao receptor de adenovírus-coxsackie (CAR), e as células que carecem de CAR são relativamente resistentes à infecção, a menos que também expressem integrinas αv que podem ser ligadas por um motivo RGD na base penton.

[00183]A proteína fibra de Ad é um complexo de três subunidades aparentemente idênticas que medeiam a etapa de fixação inicial. A proteína fibra de Ad6 nativo compreende a sequência de aminoácido especificada em SEQ ID NO:35 e se liga a CAR.

[00184]Em um aspecto adicional da invenção, Ads recombinantes modificados por fibra tendo diferentes proteínas fibras que não são nativas para o Ad parental foram gerados. Ads recombinantes, incluindo CRAds, compreendendo proteínas capsídeos de diferentes cepas de Ad foram gerados, por exemplo, Ads recombinantes compreendendo um polipeptídeo fibra Ad35 heterólogo ou polipeptídeo fibra C68 chimpanzé, +/- um peptídeo K7.

[00185]Um Ad quimérico, quimera fibra de AdF3, tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:36 e é mais curto do que proteínas fibra de Ad5 e Ad6 e redireciona vírus para CD4 6 .

[00186]Um Ad recombinante modificado com fibra, compreendendo K7 Fibra tendo a sequência de SEQ ID NO:37, direciona o vírus para proteoglicanos de sulfato de heparina e cargas negativas em células.

[00187]Um Ad quimérico e recombinante, 6/FC68 Fibra compreendendo a sequência de SEQ ID NO:38, é um Ad quimérico tendo uma proteína fibra de adenovírus C68 chimpanzé. A proteína fibra é mais curta do que proteínas fibra de Ad5 ou Ad6 e se liga a CAR.

[00188]Um Ad quimérico e recombinante, 6/FC68-K7 Fibra compreendendo a sequência de SEQ ID NO:39, é um Ad quimérico tendo uma proteína fibra de adenovírus C68 chimpanzé. A proteína fibra é mais curta do que proteínas fibra de Ad5 ou Ad6. 6/FC68-K7 Fibra se liga a CAR e é redirecionado para sulfato de heparina e cargas negativas.

[00189]Um Ad quimérico e recombinante, 6/FC68-HI-K7 Fibra compreendendo a sequência de SEQ ID NO:40, é um Ad quimérico tendo uma proteína fibra de adenovírus C68 chimpanzé. A proteína fibra é mais curta do que proteínas fibra de Ad5 ou Ad6. 6/FC68-HI-K7 Fibra se liga a CAR e é redirecionado para sulfato de heparina e cargas negativas.

[00190]Fator sanguíneo X (FX) se liga com afinidade nanomolar aos hexons de adenovírus espécie C e, consequentemente, permite que o adenovírus espécie C transduza de forma eficiente os hepatócitos do fígado após injeção IV.

[00191]Os seguintes vírus CRAd são construídos que expressam Fator X humano (GLA) fusionado com PD-1 humano. Os domínios PD-1 de tipo selvagem e camundongo e humano de alta afinidade foram fusionados aos terminais N ou C do domínio FX GLA-EGF humano e sua expressão foi conduzida pelo promotor RSV ou CMV. Em alguns casos, esses cassetes de expressão de proteína de fusão foram inseridos no domínio E3 dos vírus indicados. Em outros, eles foram inseridos entre os genes fibra e E4 dos vírus.

[00192]Ad657 condicionalmente replicativo com uma modificação dl1101 para E1a evita sua ligação a p300 e se torna susceptível a IFN, uma deleção E3A, com um cassete de expressão de RSV inserido na deleção E3. Este vírus expressa Fator X humano (GLA) fusionado a PD-1 humano e uma proteína de redirecionamento de adenovírus para células PD- L1+ (isto é, CrAd657d1101DE3ADP*hPD1-GLA-GL-L).

[00193]Ad657 condicionalmente replicativo com uma modificação dl1101 para E1a evita sua ligação a p300 e para tornar o vírus susceptível a repressão por IFN e uma mutação dl1107 em E1a para evitar sua ligação a pRB para bloquear replicação do vírus em células com vias pRB intactas, com E3 deletado e compreende um cassete de expressão de RSV inserido na deleção E3. Este vírus expressa Fator X humano (GLA) fusionado a PD-1 humano (isto é, CrAd657*1101/1107DE3BSTRSVhPD1-GLA*IgIZI). Durante a replicação viral, o PD-1 será expresso em uma célula como um monômero que é capaz de se ligar a PD-L1 quando liberado da célula. O PD-1 também pode ser ligado à superfície de um Ad para redirecionar o Ad para células expressando PD-L1.

[00194]Ad6/57/6 condicionalmente replicativo com uma mutação dl1107 em E1a, e uma deleção E3A com um cassete de expressão de RSV inserido na deleção E3, é construído para expressar PD-1 humano fusionado a imunoglobulina humana como uma proteína chamariz de PD-L1 (isto é, pAd/57/6- dl1107-ΔE3-RSV-hPD-1-HA-Ig-I). Ver Figura 16.

[00195]A proteína de fusão foi purificada a partir de células infectadas com pAd6/57/6-dl1107-DE3-RSV-hPD-1-HA- Ig-I em uma coluna de proteína A. Esta proteína foi titulada junto com anticorpo monoclonal anti-PD-1 de controle positivo lateral no ensaio de bloqueio PD-1/PD-L1 de Promega (Madison, WI, USA). A proteína de fusão hPD-1- HA-Ig humana de alta afinidade inibe PD-L1. Ver Figura 19.

Exemplo 5. Construção de Ads recombinantes para expressão de compostos de ligação a PD-L1 em combinação com polipeptídeos heterólogos.

[00196]Um vírus Ad condicionalmente replicativo Ad vírus (CRAd657 ou CRAd 6/57/6) é modificado para expressar polipeptídeos PD-1 em combinação com um ou mais polipeptídeos heterólogos (por exemplo, polipeptídeos terapêuticos e/ou polipeptídeos de direcionamento). Em uma modalidade, o cassete de fusão RSV-PD- é inserido em uma deleção E3 do vírus e os transgenes terapêuticos são inseridos como cassetes de expressão CMV ou MCMV ou RSV entre os genes fibra e E4 de acordo com os métodos conhecidos dos versados na técnica. Ver Figura 17 e Figura 18.

Exemplo 6. Avaliação de Crescimento de Tumor de CRAd Expressando Proteína de Fusão hPD-1-HA-Ig Humana de Alta Afinidade ou em Combinação com Cargas Úteis de Imunoterapia.

[00197]Células de melanoma B16-CAR são injetadas subcutaneamente em camundongos C57BL/6 e os tumores resultantes são injetados com partículas virais 3e11 dos compostos multivalentes de ligação a PD-L1 da invenção. Chamariz CRAd+PD-L1 é pAd6/57/6-dl1107-ΔE3-RSV-hPD-1-HA-Ig- I. Chamariz CRAd+PD-L1 + estimulador imune são coinjetados em tumores usando pAd6/57/6-dl1107-ΔE3-RSV-hPD-1-HA-Ig-I e um segundo adenovírus expressando 4-1BBL. CRAd expressando proteína de fusão hPD-1-HA-Ig humano de alta afinidade retarda o crescimento do tumor sozinho ou em combinação com cargas úteis de imunoterapia. Ver Figura 20.

[00198]Em uma modalidade, o CRAd657 ou CRAd6/57/6 é modificado para expressar polipeptídeos PD-1 em combinação com um ou mais polipeptídeos terapêuticos. Os polipeptídeos terapêuticos podem ser selecionados dentre GM-CSF, 4-1BBL, CD40L e OX40, e combinações dos mesmos. Em um aspecto, o polipeptídeo PD-1 é expresso com o polipeptídeo terapêutico como uma proteína de fusão. Em um aspecto adicional, um cassete de fusão RSV-PD-1 é inserido em uma deleção E3 do vírus e os transgenes terapêuticos são inseridos como CMV ou MCMV ou cassetes de expressão de RSV entre os genes E4 e vírus fibra. Ver Figuras 17 e 18.

Exemplo 7. Construção de Compostos Multivalentes de Ligação a PD-L1.

[00199]As proteínas de fusão incluindo um polipeptídeo PD-1 e ou um polipeptídeo de arcabouço ou um domínio GLA de um polipeptídeo FX são gerados a partir de genes que são clonados por PCR com mutações e junções de fusão de genes de tipo selvagem, mutantes, ou sintéticos, de acordo com métodos conhecidos dos versados na técnica. As proteínas de fusão são montadas por clonagem em vetores de expressão, cultivadas sob condições que permitem a expressão e montagem de proteínas e, opcionalmente, purificando as proteínas a partir do meio celular.

[00200]As proteínas de fusão podem ser produzidas por transfecção ou infecção por plasmídeo de células com vetores expressando polipeptídeos PD-1 e/ou fragmentos dos mesmos fusionados a um polipeptídeo que pode se ligar a um polipeptídeo de revestimento viral, seguido por purificação com PD-1 ou um parceiro de fusão em colunas de anticorpo ou em colunas de PD-L1 ou em colunas de biotina.

[00201]Em uma modalidade, Ads podem ser colocados em contato com as proteínas de fusão PD-1 purificadas sob condições que permitem o revestimento da superfície do Ad com a proteína de fusão. Por exemplo, o domínio GLA de um polipeptídeo FX se liga à superfície do Ad de modo que PD-1 é exposto sobre a superfície do Ad para se ligar a PD-L1 sobre a superfície de uma célula. Um adenovírus em que o parceiro de fusão é ligado à superfície do Ad e PD-1 é livre para se ligar a PD-L1 em uma célula, fornece um composto de ligação a PD-L1 multimérico.

[00202]Em uma modalidade, ácidos nucleicos codificando as proteínas de fusão são inseridos em plasmídeos ou vetores virais ou são inseridos em vetores de produção de mRNA e estes são transfectados ou infectados in vitro em culturas celulares ou infectados in vivo em animais. Amostras são testadas para a expressão de proteína com anticorpos contra PD-1 e/ou parceiros da proteína de fusão.

[00203]Ácido nucleico (por exemplo, DNA, mRNA, e vetores virais) codificando as proteínas de fusão são entregues em animais normais ou portadores de câncer e alterações em células de sangue periférico, células de linfonodos, células de baço e populações de células tumorais são avaliadas por coloração com CD3, CD4, CD8, PD- 1, PD-L1, e marcadores de ativação de células T.

[00204]Ácido nucleico (por exemplo, DNA, mRNA) ou vetores virais codificando as proteínas de fusão são entregues em animais portadores de câncer e efeitos sobre o tamanho do tumor, metástases, disseminação e sobrevivência foram avaliados.

Outras Modalidades.

[00205]Deve ser entendido que embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com a descrição detalhada da mesma, a descrição acima é destinada a ilustrar e não limitar o escopo da invenção, que é definido pelo escopo das reivindicações em anexo. Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do escopo das seguintes reivindicações.

Claims

1. Composto multivalente de ligação ao ligante de proteína 1 de morte celular programada (PD-L1), caracterizado pelo fato de que compreende uma pluralidade de cadeias de aminoácido, em que cada cadeia de aminoácido compreende pelo menos um polipeptídeo de proteína 1 de morte celular programada (PD-1), em que cada cadeia de aminoácido compreendendo pelo menos um polipeptídeo de proteína 1 de morte celular programada (PD-1) é associada com um adenovírus recombinante (Ad) e a pluralidade de cadeias de aminoácido está presente em polipeptídeo de revestimento do Ad recombinante, e em que o Ad recombinante compreende polipeptídeos hexon de capsídeo de uma cepa de Ad Ad6 e pelo menos um polipeptídeo hexon de capsídeo de região hipervariável (HVR) de cepa de Ad Ad57

2. Composto multivalente de ligação ao ligante de proteína 1 de morte celular programada (PD-L1), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os polipeptídeos hexon de capsídeo de uma cepa de Ad Ad6 compreendem polipeptídeos 1-7 HVR de cepa de Ad Ad57.

3. Composto multivalente de ligação ao ligante de proteína 1 de morte celular programada (PD-L1), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os polipeptídeos hexon de capsídeo de uma cepa de Ad Ad6 compreendem polipeptídeos 2-6 HVR de cepa de Ad Ad57.

4. Composto multivalente de ligação ao ligante de proteína 1 de morte celular programada (PD-L1), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de proteína 1 de morte celular programada (PD- 1) é uma PD-1 de humano ou uma PD-1 de murino.

5. Composto multivalente de ligação ao ligante de proteína 1 de morte celular programada (PD-L1), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Ad recombinante é ainda modificado para compreender polipeptídeos heterólogos selecionados de polipeptídeos de direcionamento, polipeptídeos terapêuticos e antígenos.

6. Composto multivalente de ligação ao ligante de proteína 1 de morte celular programada (PD-L1), de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de direcionamento é selecionado dentre um polipeptídeo de hemaglutinina do vírus do sarampo (MVH), um polipeptídeo de fusão do vírus do sarampo (MVF), e um polipeptídeo de glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSVG).

7. Composto multivalente de ligação ao ligante de proteína 1 de morte celular programada (PD-L1), de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo terapêutico é selecionado dentre um polipeptídeo de ligante 4-1BB (4-1BBL), um polipeptídeo de ligante OX40 (OX40L), um polipeptídeo de ligante CD40 (CD40L), e um polipeptídeo de fator estimulador de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF).

8. Composto multivalente de ligação ao ligante de proteína 1 de morte celular programada (PD-L1), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo PD-1 é fusionado a um domínio gama- carboxiglutâmico dependente de vitamina K de um polipeptídeo de anticorpo de cadeia simples fator X (um domínio GLA de um polipeptídeo FX).

9. Composto multivalente de ligação ao ligante de proteína 1 de morte celular programada (PD-L1), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada cadeia de aminoácido compreende uma molécula de direcionamento selecionada dentre um polipeptídeo de hemaglutinina do vírus do sarampo(MVH), polipeptídeo de fusão do vírus do sarampo (MVF), e um polipeptídeo de glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSVG).

10. Composto multivalente de ligação ao ligante de proteína 1 de morte celular programada (PD-L1), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada cadeia de aminoácido compreende um ou mais polipeptídeos terapêuticos selecionados dentre um polipeptídeo de ligante 4-1BB (4-1BBL), um polipeptídeo de ligante OX40 (OX40L), um polipeptídeo de ligante CD40 (CD40L), e um polipeptídeo de fator estimulador de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF).

11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o composto multivalente de ligação ao ligante de proteína 1 de morte celular programada (PD-L1), conforme definido na reivindicação 1, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

12. Uso de uma composição conforme definida na reivindicação 11, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para uso no tratamento de câncer em um sujeito em necessidade do mesmo.