BR112021015865A2

BR112021015865A2 - Nova diamina oxidase recombinante e seu uso no tratamento de doenças caracterizadas por excesso de histamina

Info

Publication number: BR112021015865A2
Application number: BR112021015865-0A
Authority: BR
Inventors: Thomas Böhm; Bernd Jilma; Nicole Borth; Elisabeth Gludovacz
Original assignee: Universität Für Bodenkultur Wien; Medizinische Universität Wien
Priority date: 2019-02-19
Filing date: 2020-02-18
Publication date: 2021-10-05
Also published as: US20220145269A1; KR20210132650A; SG11202107659SA; EA202192305A1; WO2020169577A1; IL285452A; EP3927817A1; MX2021010050A; CN113785052A; CA3130751A1; JP2022520862A; AU2020225319A1

Abstract

nova diamina oxidase recombinante e seu uso no tratamento de doenças caracterizadas por excesso de histamina. a presente invenção se refere a uma diamina oxidase (dao) recombinante humana com menor afinidade de ligação ao glicosaminoglicano, em que a referida dao compreende pelo menos uma modificação de aminoácido no domínio de ligação do glicosaminoglicano (gag). a presente invenção também se refere ao uso da dao no tratamento de uma condição associada ao excesso de histamina, especificamente no tratamento de doenças alérgicas crônicas, mais especificamente no tratamento de anafilaxia, choque anafilático, urticária crônica, urticária aguda, asma, febre do feno, rinite alérgica, conjuntivite alérgica, intoxicação por histamina, dor de cabeça, dermatite atópica, doenças inflamatórias, mastocitose, síndrome de ativação de mastócitos (mcas), pré-eclâmpsia, hiperêmese gravídica, parto prematuro, úlceras pépticas, refluxo ácido, prurido e sepse.

Description

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NOVA DIAMINA OXIDASE RECOMBINANTE E SEU USO NO TRATAMENTO DE DOENÇAS CARACTERIZADAS POR EXCESSO DE HISTAMINA CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a uma diamina oxidase (DAO) recombinante com menor afinidade de ligação ao glicosaminoglicano, em que a referida DAO compreende pelo menos uma modificação de aminoácido no domínio de ligação do glicosaminoglicano (GAG).

[002] A presente invenção também se refere ao uso da DAO no tratamento de uma condição associada ao excesso de histamina, especificamente no tratamento de doenças alérgicas crônicas e/ou no tratamento de gravidez de alto risco, mais especificamente no tratamento de anafilaxia, choque anafilático, urticária crônica, urticária aguda, asma, febre do feno, rinite alérgica, conjuntivite alérgica, intoxicação por histamina, dor de cabeça, dermatite atópica, doenças inflamatórias, mastocitose, síndrome de ativação de mastócitos (MCAS), pré-eclâmpsia, hiperêmese gravídica, parto prematuro, úlceras pépticas, refluxo ácido, prurido e sepse.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] A histamina (2-(1H-Imidazol-4-il)etanamina) é um composto orgânico nitrogenado envolvido nas reações imunológicas locais, regulando a função fisiológica no intestino e atuando como neurotransmissor para o cérebro, a medula espinhal e o útero. A histamina participa da reação inflamatória e desempenha um papel central como mediadora da coceira. Como parte de uma reação imunológica a patógenos estranhos, a histamina é produzida pelos basófilos e pelos mastócitos encontrados em tecidos conjuntivos próximos. Ela fica armazenada na forma inativa nos grânulos metacromáticos dos mastócitos e leucócitos basofílicos, onde fica disponível para liberação imediata. A histamina também pode ser sintetizada imediatamente por

2 / 75 neutrófilos e macrófagos durante a inflamação. Após sua liberação, a histamina é um potente mediador fisiológico e patológico que se liga a quatro receptores (H 1 - H4) expressos em muitas células diferentes do corpo. A ligação da histamina aos seus receptores é muito específica. Após a ligação, muitas atividades posteriores são induzidas. Reações alérgicas agudas, como febre do feno, coriza, coceira nos olhos ou, em casos mais graves, asma com problemas respiratórios; urticária aguda e crônica e reações de hipersensibilidade, também chamadas de anafilaxia, causada, por exemplo, por medicamentos, especialmente antibióticos ou agentes de contraste radiológico, por alergia a amendoim ou picada de vespa, etc., são mediadas por mastócitos teciduais e basófilos no sangue, liberando vários mediadores, sendo a histamina um dos mais ativos entre eles. Entre os sintomas induzidos pela histamina estão anafilaxia, uma reação de hipersensibilidade com queda da pressão arterial, desmaios e problemas respiratórios, entre outros sintomas; broncoespasmo, rubor (vermelhidão da pele), prurido (coceira), taquicardia (pulsação elevada), síncope (desmaios), hipotensão (pressão arterial baixa), dor epigástrica e abdominal, náuseas, vômitos, diarreia, fadiga, perda de memória, depressão e cefaleia. O excesso de histamina no sangue (>10 ng/mL; os sintomas começam em 1 a 3 ng/mL) é potencialmente fatal. Uma concentração de histamina de aproximadamente 100 ng/mL no sangue pode causar parada cardíaca. Especificamente durante a gravidez, a hiper-histaminemia pode levar a complicações gestacionais específicas, como pré- eclâmpsia, aborto espontâneo, trabalho de parto prematuro e hiperêmese gravídica (Brew O. e Sullivan MHF, J.Reprod.Immunol., 72(2006), 94-107, Maintz L. et al., Human Reproduction Update, 14,5, 2008, 485-495).

[004] Mastócitos e basófilos são células do sistema imunológico que desempenham muitas funções diferentes. No entanto, os mastócitos e a histamina

3 / 75 desempenham um papel importante em muitas doenças como síndromes de ativação de mastócitos, MCAS, ou seja, incapacidade de tolerar a histamina no vinho tinto ou queijo ou em outros alimentos; na literatura, é frequentemente descrita como intolerância à histamina, dermatite atópica (também chamada de neurodermite, uma doença de pele), mastocitose (aumento do número de mastócitos na pele e/ou nos órgãos internos, como a medula óssea, o fígado ou o baço), úlceras pépticas (danos à mucosa do estômago ou no duodeno, causados pelo excesso de histamina, seguido de liberação de ácido), refluxo ácido, dor de cabeça, prurido e, possivelmente, até mesmo sepse, entre outras doenças. A histamina também pode ser sintetizada imediatamente pela histidina descarboxilase induzida, por exemplo, em neutrófilos e macrófagos sob determinadas condições patológicas.

[005] Além disso, a histamina também pode entrar de fora no corpo, por inalação ou por via oral, por exemplo, pela ingestão de alimentos que contenham histamina, como queijo, vinho, peixe enlatado e chucrute. A histamina também pode ser produzida por bactérias do microbioma.

[006] Os anti-histamínicos que se opõem à atividade dos receptores de histamina H1 e H2 estão disponíveis há várias décadas e são considerados eficazes no tratamento de sintomas como coriza e coceira na pele e nos olhos. Os anti- histamínicos são um dos medicamentos mais prescritos em todo o mundo. No entanto, a análise minuciosa dos dados tem demonstrado claramente que a eficácia dos anti- histamínicos é limitada em algumas condições patológicas. Por exemplo, cerca de 25% dos pacientes com urticária crônica são resistentes aos anti-histamínicos e sofrem de baixa qualidade de vida. O tratamento de reações de hipersensibilidade com anti-histamínicos é amplamente praticado, mas faltam dados de eficácia de alta qualidade e, em alguns documentos, é declarada a falta de eficácia. As diretrizes para

4 / 75 anafilaxia não recomendam necessariamente o uso do bloqueador do receptor de histamina H1 para o tratamento porque as evidências de benefício não são claras. O uso de antagonistas dos receptores H2 de histamina na anafilaxia não é incentivado porque pode agravar os sintomas.

[007] Essa eficácia limitada dos anti-histamínicos não surpreende. Alguns estudos demonstraram que os anti-histamínicos só podem bloquear os efeitos do aumento de 2 a 3 vezes nas concentrações de histamina, mas são muito menos eficazes quando as concentrações de histamina aumentam além disso. Durante a anafilaxia ou reações de hipersensibilidade, as concentrações de histamina na circulação podem aumentar mais de 100 vezes em pessoas normais, e ainda mais em pacientes com mastocitose. Pacientes com mastocitose apresentam níveis constantemente aumentados de histamina e seus metabólitos, de 5 a 15 vezes, em condições não anafiláticas de estado estacionário. O corpo não consegue degradar com suficiente velocidade o excesso de histamina, e o desenvolvimento de vários sintomas é uma consequência lógica.

[008] No organismo mamífero, a histamina é degradada por duas enzimas: diamina oxidase (diamina oxidase, DAO, EC 1.4.3.6) e histamina-N-metiltransferase (HNMT ou, abreviando, NMT, EC 2.1.1.8). A NMT catalisa a N-metilação em N-metil- histamina.

[009] A estrutura e a inibição da DAO humana são analisadas em McGrath AP et al. (Biochemistry, 2009, 48(41), 9810-9822). A DAO catalisa a desaminação oxidativa da histamina em acetaldeído de imidazol. A DAO foi originalmente identificada como a enzima que depurava a histamina exógena de amostras picadas de pulmão e fígado e foi, portanto, denominada histaminase (Best CH., J. Physiol., 1929, 67, 256-263). Posteriormente, uma proteína identificada como diamina oxidase

5 / 75 foi denominada “proteína de ligação à amilorida” e foi incorretamente implicada com o canal de Na+ sensível à amilorida. Alguns bancos de dados ainda designam a AOC1 como ABP1. Que a DAO e a ABP1 eram, de fato, a mesma proteína foi posteriormente observado pelos autores originais (Novotny WF et al., J.Biol.Chem., 1994, 269, 9921- 9925), que também relataram a clonagem do gene humano, correspondente a uma proteína com 751 resíduos de aminoácidos. A superexpressão da DAO humana recombinante (hDAO) foi alcançada em células de inseto (Elmore BO. et al., J.Biol.Inorg.Chem., 2002, 7, 565-579). Embora tenha sido posteriormente relatado por Elmore et al. que a DAO contém uma sequência de consenso de ligação à heparina (resíduos 568-575), não poderia ser derivado dessa estrutura que o domínio de ligação à heparina-realmente se liga à heparina. Uma molécula de heparina de 12-meros tem ~5 nm (50 Å) de comprimento, e o diâmetro do domínio circular de ligação à heparina na DAO é de aproximadamente 25 Å. O peso molecular de uma heparina com 12 meros = 284 * 12 = 3408 Da. A LMWH (heparina de baixo peso molecular) não se liga fortemente à DAO, mas tem um peso molecular médio de 5000 Da (18 unidades de açúcar). Apenas a HMWH se liga à DAO com um peso molecular médio de 15000 Da, mas isso corresponde a 15000/284 = 52 unidades de açúcar numa fileira.

[010] A disponibilidade de grandes quantidades de hDAO recombinante possibilitou a identificação in vitro de seus substratos preferenciais, apresentando uma preferência distinta por diaminas. Em particular, duas diaminas atípicas, histamina e 1-metil histamina, são substratos excelentes. Cada um contém um grupo imidazol no lugar de uma das aminas primárias presentes em substratos de diamina típicos, tais como a espermidina, putrescina ou cadaverina. A hDAO é a enzima da linha de frente para a degradação da histamina exógena, e níveis reduzidos de DAO demonstraram

6 / 75 estar diretamente correlacionados com a intolerância à histamina (Maintz L. et al., Am.J.Clin.Nutr., 2007, 85, 1185-1196). Atividades reduzidas de DAO foram encontradas em complicações heterogêneas múltiplas da gravidez, como diabetes, ameaça de aborto e retardo de aborto e distúrbios trofoblásticos (Maintz L., et al., 2008).

[011] No trato gastrointestinal, a DAO degrada a histamina da dieta para evitar e proteger o corpo do aumento das concentrações no sangue. No entanto, exceto durante a gravidez, o antígeno (e, portanto, a atividade) da DAO é baixa ou mesmo ausente no plasma (Boehm T. et al., Clinical Biochemistry 50, 2017, 444-451). Durante a gravidez, a atividade da DAO aumenta mais de 100 vezes.

[012] Na WO 02/43745, divulga-se a utilização sistêmica da DAO de origem vegetal para o tratamento de doenças mediadas pela histamina. A administração de enzimas diretamente isoladas de vegetais, no entanto, é um grande problema devido à ocorrência frequente de alérgenos em plantas, principalmente pelo fato de as leguminosas divulgadas no documento WO 02/43745 apresentarem elevado potencial alergênico.

[013] WO2006/003213A1 descreve formulações de administração específicas de DAO de origem animal ou produzida de forma recombinante.

[014] A expressão e purificação da DAO recombinante humana (rh) de tipo selvagem (wt) em células CHO foi publicada por Gludovacz E. et al. (J Biotechnol.

2016, 227:120-130). No entanto, em ratos, a meia-vida de distribuição alfa da rhDAO wt foi inferior a 10 minutos e compreendeu mais de 80% da quantidade de proteína injetada. A meia-vida de eliminação beta foi de aproximadamente 3 horas. O fator de escala para que produtos biológicos sejam extrapolados de ratos para seres humanos é de aproximadamente 4 a 8 e, portanto, o perfil FC da DAO recombinante wt não é

7 / 75 adequado para desenvolvimento pré-clínico e clínico. Três sítios de glicosilação de DAO passaram por mutação, mas as mutações do glicano não melhoraram o perfil FC. Os efeitos das mutações do glicano na expressão e na atividade da DAO foram publicados por Gludovacz E. et al. (J.Biol.Chem. 2018, 293(3), 1070-1087).

[015] O Banco de Dados UniProt, n.º. de acesso G3QJ02, 2011, XP- 002792064 divulga a sequência de diamina oxidase de Gorilla gorilla.

[016] O Banco de Dados UniProt, n.º. de acesso Q9SXW5, 2000 revela a sequência da diamina oxidase de Pisum sativum.

[017] O WO 2012/028891A1 relata a histaminase de origem vegetal. Como a histamina liberada não pode ser bloqueada ou desativada de maneira eficiente por anti-histamínicos, novas abordagens de tratamento e profilaxia para a desativação rápida da histamina excessiva trariam benefícios significativos para pacientes que sofrem de altas concentrações de histamina circulatória. Muitos pacientes sofrem por horas com o aumento das concentrações de histamina. A meia-vida da histamina até mesmo aumenta durante a anafilaxia e hipotensão devido à redução da filtragem renal e do fluxo sanguíneo.

[018] Portanto, há uma demanda elevada e não atendida por um tratamento aprimorado das condições associadas ao excesso de histamina.

RESUMO DA INVENÇÃO

[019] Em condições patológicas, o excesso de histamina não pode ser antagonizado de maneira eficiente pelos anti-histamínicos disponíveis atualmente. Os níveis elevados de histamina causam sintomas irritantes, graves, debilitantes, com risco de vida e, ocasionalmente, morte.

[020] Um dos objetivos da presente invenção é apresentar um regime

8 / 75 aprimorado de remoção do excesso de histamina e tratamento e prevenção de doenças e condições induzidas por histamina.

[021] O objetivo é contemplado pela presente invenção, com a apresentação de uma DAO recombinante modificada para aumentar a concentração de DAO ativa dentro do corpo de um indivíduo para, assim, auxiliar, ou permitir, respectivamente, a degradação da histamina.

[022] A administração de DAO humana recombinante, conforme aqui descrito, podem degradar o excesso de histamina em condições agudas, subagudas, subcrônicas, crônicas e profiláticas, beneficiando significativamente os pacientes que sofrem ou sofrerão de várias doenças para as quais os anti-histamínicos não são suficientemente eficazes para degradar as concentrações excessivas de histamina.

Isso estabelece uma opção de tratamento totalmente nova para indivíduos que sofrem de excesso de histamina.

[023] De acordo com a invenção, é apresentada uma diamina oxidase (DAO) recombinante humana com menor afinidade de ligação ao glicosaminoglicano (GAG) em comparação com a afinidade de ligação ao GAG da respectiva DAO humana de tipo selvagem, em que a referida DAO compreende pelo menos uma modificação de aminoácido no domínio de ligação ao glicosaminoglicano (GAG); especificamente, o domínio de ligação ao GAG compreende os aminoácidos nas posições 568-575 com referência à numeração de SEQ ID NO:1.

[024] Especificamente, o domínio de ligação ao GAG é um domínio de ligação à heparina/ao sulfato de heparano.

[025] Especificamente, a modificação de aminoácidos causa a diminuição da afinidade de ligação da DAO ao GAG, enquanto sua atividade enzimática em relação à histamina é preservada.

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[026] De acordo com uma incorporação específica, pelo menos uma modificação de aminoácido no domínio de ligação da DAO ao GAG é um(a) substituição, exclusão, inserção ou acoplamento de aminoácido com um fragmento químico.

[027] De acordo com uma incorporação específica da invenção, a DAO recombinante da invenção compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 modificações de aminoácidos no domínio de ligação ao GAG. Especificamente, os referidos resíduos de aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácidos; especificamente, a arginina ou a lisina é substituída por serina ou treonina.

[028] De acordo com outra incorporação, a DAO recombinante compreende um domínio de ligação da sequência de aminoácidos X1FX2X3X4LPX5 ao GAG, em que X1 pode ser por qualquer aminoácido, é especificamente A ou S, mais especificamente é S; X2 pode ser por qualquer aminoácido, é especificamente K; X3 pode ser por qualquer aminoácido, é especificamente A ou T, mais especificamente é T; X4 pode ser por qualquer aminoácido, é especificamente K, e X5 pode ser por qualquer aminoácido, é especificamente K ou T, mais especificamente é T.

[029] Em ainda outra incorporação específica, a DAO recombinante compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SFKAKLPK (SEQ ID NO:33), AFKAKLPT (SEQ ID NO:34), AFKTKLPK (SEQ ID NO:35), SFKTKLPK (SEQ ID NO:36), AFKTKLPT (SEQ ID NO:37), SFKAKLPK (SEQ ID NO:38).

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[030] De acordo com uma incorporação específica, a DAO recombinante, conforme divulgado neste documento, compreende ainda pelo menos uma modificação da cisteína acessível ao solvente na posição de aminoácido 123 (cys123) com referência à numeração de SEQ ID N.º 1, especificamente a modificação da cisteína é uma substituição, exclusão ou conjugação de aminoácido com um fragmento químico.

[031] Numa incorporação preferencial, cys123, de acordo com a numeração de SEQ ID 1 da DAO, é substituída pela alanina (cys123ala, C123A).

[032] A DAO da invenção apresenta especificamente uma depuração reduzida do plasma. A invenção apresenta especificamente uma DAO recombinante que cuja meia-vida plasmática é consideravelmente maior em comparação com a DAO do tipo selvagem; especificamente, a referida meia-vida é aumentada em pelo menos 1,5 vezes, especificamente pelo menos 2 vezes em comparação com a DAO do tipo selvagem.

[033] Numa incorporação alternativa ou adicional, a DAO apresenta uma AUC aumentada em pelo menos 10 vezes em comparação com a DAO de tipo selvagem.

[034] De acordo com uma incorporação aqui apresentada, a internalização da DAO recombinante por células endoteliais é pelo menos 10%, 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, especificamente 90% menor em comparação com a DAO de tipo selvagem.

[035] De acordo com ainda outra incorporação, a afinidade de ligação da DAO ao GAG, como aqui descrita, especificamente a afinidade de ligação à heparina/ao sulfato de heparano, é de pelo menos 10%, 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, especificamente 90% menor em comparação com a DAO de tipo selvagem.

[036] Aqui é apresentada também uma DAO recombinante ou um derivado funcional ou análogo desta, que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ

11 / 75 ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16.

[037] A DAO humana também apresenta vários sítios de N-glicosilação que desempenham um papel na secreção e retenção no retículo endoplasmático.

Especificamente, os glicanos em Asn-168 são predominantemente sialilados com ramificações bi- a tetraantenárias.

[038] De acordo com uma incorporação, a DAO recombinante aqui descrita compreende ainda uma modificação, especificamente uma substituição de aminoácido na posição 168 com referência à SEQ ID NO 1. Especificamente, a modificação é uma modificação única na posição 168. Mais especificamente, Asn é substituído por Gln. Especificamente, a referida modificação aumenta a FC da DAO aqui descrita. Mais especificamente, a DAO compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:106.

[039] Aqui é apresentada também uma DAO recombinante ou um derivado funcional ou análogo da mesma, codificada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32 ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32.

[040] É apresentada aqui também uma sequência de nucleotídeos isolada que codifica a DAO ou um análogo funcional ou derivado desta, conforme aqui descrito, compreendendo especificamente as sequências SEQ ID NOs: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32 ou seus fragmentos.

[041] De acordo com uma incorporação específica da invenção, apresenta-se aqui um polipeptídeo de fusão que compreende a DAO recombinante aqui descrita e

12 / 75 um domínio Fc de IgG humana ou albumina de soro humano (HSA) ou um fragmento da mesma, em que o polipeptídeo de fusão mantém a atividade funcional da DAO recombinante.

[042] Aqui é apresentado também um polipeptídeo de fusão que compreende a DAO recombinante aqui descrita e um domínio Fc de IgG humana que compreende as sequências de qualquer uma das SEQ ID NOs: 56 a 70, ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 56 a 70.

[043] É apresentado aqui também um polipeptídeo de fusão que compreende a DAO recombinante aqui descrita e um domínio Fc de IgG humana ou um derivado funcional ou análogo desta, codificado por qualquer uma das SEQ ID NOs: 72 a 102, ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 72 a 102.

[044] É também apresentado aqui um vetor recombinante que compreende a sequência de nucleotídeos aqui descrita; especificamente, o vetor é um vetor de expressão bacteriana, de levedura, baculoviral, vegetal ou mamífera.

[045] De acordo com uma incorporação, é apresentada aqui um cassete de expressão que compreende a sequência de nucleotídeos, operacionalmente ligada a elementos reguladores.

[046] De acordo com uma incorporação, é apresentada aqui uma célula hospedeira recombinante ou uma linha celular hospedeira de origem bacteriana, de levedura, baculoviral, vegetal ou mamífera, que compreende a DAO recombinante aqui descrita, em que as células hospedeiras são especificamente selecionadas do grupo que consiste em células CHO, células Vero, células MDCK, células de Pichia pastoris e células SF9.

[047] É ainda apresentado aqui um sistema de expressão que compreende o

13 / 75 vetor, ou o cassete de expressão e uma célula hospedeira, ou linha celular hospedeira aqui descrita.

[048] De acordo com uma incorporação, é ainda apresentado aqui um método para produzir a DAO recombinante aqui descrita; o referido método compreende as etapas de i. clonagem de uma sequência de nucleotídeos que codifica a DAO num vetor de expressão, ii. transformar uma célula hospedeira com esse vetor, iii. cultivo da a célula hospedeira transformada sob condições em que a DAO é expressa, iv. isolamento da DAO da cultura de células hospedeiras, com a opção de desintegração das células hospedeiras e, ainda, v. purificação da DAO.

[049] De acordo com uma incorporação, é apresentada uma composição farmacêutica que compreende a DAO recombinante e, como opção, um ou mais excipientes.

[050] Especificamente, a composição farmacêutica pode ser aplicada por via intravenosa, intramuscular e subcutânea ou por outras vias de administração parenteral, como intraperitoneal ou intratecal.

[051] Numa outra incorporação, é apresentado o uso da DAO recombinante na preparação de uma composição farmacêutica.

[052] Especificamente, a DAO recombinante é apresentada para uso no tratamento de uma condição associada ao excesso de histamina, especificamente para o tratamento de doenças alérgicas crônicas ou doenças associadas ao aumento da histamina ou à diminuição da atividade da DAO, mais especificamente para o

14 / 75 tratamento de anafilaxia, choque anafilático, urticária crônica, urticária aguda, asma, febre do feno, rinite alérgica, conjuntivite alérgica, intoxicação por histamina, dor de cabeça, dermatite atópica, doenças inflamatórias, mastocitose, síndrome de ativação de mastócitos (MCAS), pré-eclâmpsia, hiperêmese gravídica, trabalho de parto pré- termo, úlceras pépticas, refluxo ácido, prurido e sepse.

[053] Numa incorporação da invenção, o uso da DAO recombinante é abrangido para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma condição associada ao excesso de histamina, especificamente para o tratamento de doenças alérgicas crônicas ou doenças associadas ao aumento da histamina ou à diminuição da atividade da DAO, mais especificamente para o tratamento de anafilaxia, choque anafilático, urticária crônica, urticária aguda, asma, febre do feno, rinite alérgica, conjuntivite alérgica, intoxicação por histamina, dor de cabeça, dermatite atópica, doenças inflamatórias, mastocitose, síndrome de ativação de mastócitos (MCAS), pré- eclâmpsia, hiperêmese gravídica, trabalho de parto pré-termo, úlceras pépticas, refluxo ácido, prurido e sepse.

[054] Numa outra incorporação, é apresentado aqui um ligante específico de alvo que se liga especificamente ao domínio de ligação da DAO ao GAG, que se liga especificamente a um ou mais dos aminoácidos na posição 568-575 com referência à numeração de SEQ ID No. 1.

[055] Como alternativa, é apresentado aqui um ligante específico de alvo que inibe especificamente a ligação da heparina/do sulfato de heparano ao domínio de ligação da DAO ao GAG, especificamente a um ou mais dos aminoácidos na posição 568-575 com referência à numeração de SEQ ID No. 1.

[056] Especificamente, o ligante é selecionado no grupo que consiste em ácido nucleico, inibidor de molécula pequena ou proteína de ligação ao antígeno.

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[057] Numa outra incorporação, o ligante é uma proteína de ligação ao antígeno, especificamente selecionada no grupo que consiste em - anticorpos ou fragmentos de anticorpos, tais como qualquer um entre Fab, Fd, scFv, diacorpos, triacorpos, tetrâmeros Fv, minicorpos, nanocorpos, anticorpos de domínio único como VH, VHH, IgNARs ou V-NAR; - miméticos de anticorpos, tais como Adnectins™, Affibodies®, Affilins®, Affimers®, Affitins, Alfacorpos, Aptâmeros, Anticalinas, Avímeros, DARPins®, Fynomers®, peptídeos de domínio Kunitz, Monocorpos ou NanoCLAMPS; ou - proteínas de fusão que compreendem um ou mais domínios de dobra de imunoglobulina, domínios de anticorpo ou miméticos de anticorpo.

[058] De acordo com uma incorporação, é apresentado aqui um método para identificar compostos que modulam a ligação de heparina da DAO, que compreende as etapas de (a) construção de um modelo de computador do domínio de ligação do GAG, definido pelas coordenadas da estrutura dos aminoácidos da sequência da DAO de SEQ ID No. 1, (b) seleção de potencial composto modulador por um método selecionado no grupo que consiste em: (i) montagem de fragmentos moleculares no referido composto, (ii) seleção de um composto num banco de dados de moléculas pequenas, e (iii) projeto de novo do ligante do referido composto; (c) uso de meios computacionais para realizar uma operação programática de ajuste entre modelos de computador do referido composto e o domínio de ligação do GAG, a fim de criar uma configuração de baixa energia do referido composto no

16 / 75 domínio de ligação à heparina; e (d) avaliação dos resultados da referida operação de ajuste para quantificar a associação entre o referido composto e o domínio de ligação à heparina/ao sulfato de heparano, avaliando, assim, a capacidade do referido composto de se associar ao referido domínio de ligação à heparina.

FIGURAS

[059] Figura 1: Sequências de aminoácidos e nucleotídeos da DAO de tipo selvagem e da DAO modificada. Com referência às sequências de aminoácidos: As letras em negrito referem-se a substituições em comparação com as sequências de wt; a letra sublinhada refere-se ao sinal de secreção; as letras em negrito e itálico referem-se a Fc; letras em negrito, itálico e sublinhadas referem-se a sequências ligantes da região de dobradiça da IgG1.

[060] Figura 2: Perfis de eluição de heparina-sefarose da DAO humana recombinante de tipo selvagem e mutantes de heparina/sulfato de heparano.

[061] Figura 3: Variantes de Hepmut 1, 4 e 7 são eluidas da heparina-sefarose em concentrações de sal 50% mais baixas em comparação com a DAO_WT.

[062] Figura 4: Western blot de lisados de células SK-Hep1 após incubação com DAO_WT e variantes de HepMut

[063] Figura 5: A variante HepMut4 mostra ligação reduzida a células SK- Hep1 em comparação com a DAO_WT.

[064] Figura 6: Calorimetria de titulação isotérmica da DAO_WT e da HepMut4.

[065] Figura 7: As escalas lineares (a) e log y (b) são apresentadas. A HepMut4 aumenta em mais de 19-vezes a AUC (Área Sob a Curva) em comparação com a proteína da DAO de tipo selvagem após injeção intravenosa de 1 mg/kg de

17 / 75 variantes da DAO.

[066] Figura 8: A HepMut4 aumenta em mais de 16-vezes a AUC em comparação com a proteína da DAO_WT após injeção intraperitoneal.

[067] Figura 9: Médias dos valores medidos usando 1 mg/kg de DAO de tipo selvagem-e diferentes variantes de HepMut.

[068] Figura 10: Depuração lenta de mutantes do domínio de ligação à heparina/ao sulfato-de heparano em comparação com a proteína da DAO de tipo selvagem administrada a 1 mg/kg.

[069] Figura 11: Depuração lenta de mutantes do domínio de ligação à heparina-em comparação com a proteína da DAO de tipo selvagem.

[070] Figura 12: Depuração lenta de mutantes do domínio de ligação à heparina-em comparação com a proteína da DAO de tipo selvagem administrada a 1 mg/kg.

[071] Figura 13: Depuração lenta de mutantes do domínio de ligação à heparina-em comparação com a proteína da DAO de tipo selvagem administrada a 1 mg/kg. Escala linear do eixo y-.

[072] Figura 14: Depuração lenta de mutantes do domínio de ligação à heparina-em comparação com a proteína da DAO de tipo selvagem administrada a 1 mg/kg. Os primeiros 90 minutos são apresentadas; Escala linear do eixo y-.

[073] Figura 15: Depuração rápida de Fc-DAO do tipo selvagem em comparação com Fc-HepMut4 administrada a 1 mg/kg em 6 ou 4 ratos, respectivamente. As médias com os desvios padrão são apresentadas; Escala linear do eixo y-.

[074] Figura 16: Depuração rápida de Fc-DAO do tipo selvagem em comparação com Fc-HepMut4 administrada a 1 mg/kg em 6 ou 4 ratos,

18 / 75 respectivamente. As médias com os desvios padrão são apresentadas; Escala logarítmica do eixo y-.

[075] Figura 17: A Fc-DAO-HepMut4 apresenta um aumento acentuado da AUC após a administração intravenosa a 1 mg/kg; Escala logarítmica do eixo y-.

[076] Figura 18: A Fc-DAO-HepMut4 apresenta um aumento acentuado da AUC após a administração intravenosa a 1 mg/kg; Escala linear do eixo y-.

[077] Figura 19: Western blot de mutantes da DAO.

[078] Figura 20: Nenhuma diferença relevante na atividade de DAO entre a DAO_WT e as mutações cys123.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[079] Salvo indicado ou definido de outra forma, todos os termos aqui empregados têm seu significado usual na técnica, que ficará claro para o especialista.

É feita referência, por exemplo, a manuais padrão, como Sambrook et al, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (2nd Ed.), Vols. 1 -3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, “Genes IV”, Oxford University Press, Nova Iorque, (1990), e Janeway et al, “Immunobiology” (5ª Ed., ou edições mais recentes, Garland Science, Nova Iorque, 2001).

[080] O objeto das reivindicações refere-se especificamente a produtos ou métodos artificiais que empregam ou produzem tais produtos artificiais, que podem ser variantes de produtos originários (de tipo selvagem). Embora possa haver um certo grau de identidade de sequência com a estrutura originária, é bem entendido que os materiais, métodos e usos da invenção, por exemplo, que se refiram especificamente a sequências isoladas de ácido nucléico, sequências de aminoácidos, construtos de fusão, construtos de expressão, células hospedeiras

19 / 75 transformadas e proteínas modificadas são “feitos pelo homem” ou sintéticos e, portanto, não são considerados resultantes das “leis da natureza”.

[081] Os termos “compreende”, “contém”, “tem” e “inclui”, da maneira aqui empregada, podem ser usados como sinônimos e devem ser entendidos como uma definição aberta, permitindo outros membros ou partes ou elementos. “Consistindo” /” que consiste” é considerado uma definição mais próxima, sem outros elementos da característica de definição de “consistir”. Assim, “que compreende” é mais amplo e contém a definição “que consiste”.

[082] O termo “aproximadamente”, da maneira aqui empregada, refere-se ao mesmo valor ou um valor que difere em +/- 5% em relação ao valor dado.

[083] O monômero da DAO humana compreende aproximadamente 751 aminoácidos e forma dímeros que são enzimaticamente ativos. Das 14 cisteínas no dímero da DAO, 10 delas estão envolvidas na formação de SS, e 4 não estão.

Especificamente, as cisteínas 123 e 633 não estão envolvidas na formação da ligação ao dissulfeto.

[084] Da maneira aqui empregada, o termo “aminoácidos” refere-se a vinte aminoácidos de ocorrência natural, codificados por sessenta e quatro códons tripletos.

Esses 20 aminoácidos podem ser divididos naqueles que têm cargas neutras, cargas positivas e cargas negativas:

[085] Os aminoácidos “neutros” são mostrados abaixo junto com seus respectivos códigos de três letras e uma letra e sua polaridade: Alanina: (Ala, A) apolar, neutra; Asparagina: (Asn, N) polar, neutra; Cisteína: (Cys, C) apolar, neutra; Glutamina: (Gln, Q) polar, neutra;

20 / 75 Glicina: (Gly, G) apolar, neutra; Isoleucina: (Ile, I) apolar, neutra; Leucina: (Leu, L) apolar, neutra; Metionina: (Met, M) apolar, neutra; Fenilalanina: (Phe, F) apolar, neutra; Prolina: (Pro, P) apolar, neutra; Serina: (Ser, S) polar, neutra; Treonina: (Thr, T) polar, neutra; Triptofano: (Trp, W) apolar, neutro; Tirosina: (Tyr, Y) polar, neutra; Valina: (Val, V) apolar, neutra; e Histidina: (His, H) polar, positiva (10%) neutra (90%).

Os aminoácidos “positivamente” carregados são: Arginina: (Arg, R) polar, positiva; e Lisina: (Lys, K) polar, positiva.

Os aminoácidos “negativamente” carregados são: Ácido aspártico: (Asp, D) polar, negativo; e Ácido glutâmico: (Glu, E) polar, negativo.

[086] O termo “modificação” da DAO da invenção refere-se a qualquer alteração da sequência de aminoácidos, entre elas substituições, acréscimos, exclusões, mutações e inserções de aminoácidos. As modificações também podem ser modificações quimiosseletivas. Essa modificação pode ser uma conjugação ou um acoplamento com um fragmento químico em que se forma uma ligação covalente estável entre duas moléculas, sendo pelo menos uma delas uma biomolécula. Essa conjugação pode ser formada com um ou mais resíduos de aminoácidos, entre elas a

21 / 75 conjugação com maleimidas, iodoacetamidas, isoacetoamidas, 2-tiopiridina, 3- arilpropiolonitrila, fluoretos de benzoíla, isotiocianatos, isocianatos, sais de diazônio, PTAD, NaIO4 ou PLP.

[087] A cisteína livre raramente ocorre em superfícies de proteínas, e é uma excelente escolha para modificação quimiosseletiva. Especificamente, a Cys nas posições de aminoácido 123 e 633 da DAO modificada, conforme aqui descrito, são acessíveis por solvente. Substituindo-se especificamente a cys123 acessível ao solvente, especificamente trocando a cys123 pela ala123, a DAO assim produzida torna-se incapaz de formar ligações de dissulfeto ou outras interações moleculares que criam agregados de ordem superior. Após a expressão da DAO recombinante em células CHO, algumas porcentagens de moléculas de DAO (~ 20% a 30%) formam não apenas dímeros, mas também tetrâmeros, hexâmeros e até octâmeros. Esses oligômeros de ordem superior foram descritos e podem ser considerados variantes naturais com função desconhecida. Não está claro se eles se formam durante o dobramento e o transporte do RE para o Golgi e a secreção para o ambiente extracelular ou, em geral, apenas no ambiente extracelular. No entanto, esses tetrâmeros e oligômeros maiores complicam a expressão, purificação, caracterização, padronização e seleção da formulação ideal da DAO recombinante aqui descrita. Pela mutação de uma cisteína relativamente acessível a solvente na superfície da DAO, especificamente pela mutação da Cys123, apenas dímeros de DAO são encontrados no sobrenadante das células hospedeiras, especificamente das células CHO.

[088] Além disso, de acordo com ainda outra incorporação específica, a cisteína na posição de aminoácido 633 também pode ser modificada, cf. aqui descrito, para cys123. A Cys633 também não está envolvida na formação de ligações de dissulfeto.

22 / 75

[089] Em condições básicas, os resíduos de cisteína podem ser desprotonados para gerar um nucleófilo tiolato, que reagirá com eletrófilos suaves, tais como maleimidas e iodoacetamidas. O resultado é a formação de uma ligação organossulfurada. Outra modificação de resíduos de cisteína envolve a formação de ligações de dissulfeto. Os resíduos de cisteína reduzidos reagem com dissulfetos exógenos, gerando novas ligações de dissulfetos na proteína. Muitas vezes, um excesso de dissulfetos é usado para conduzir a reação, como 2-tiopiridona e 3- carboxi-4-nitrotiofenol. Foi demonstrado que alcinos deficientes em elétrons reagem seletivamente com resíduos de cisteína de proteínas na presença de outros resíduos de aminoácidos nucleofílicos. Dependendo da substituição do alcino, essas reações podem produzir bioconjugados tanto cliváveis (quando se utilizam derivados de alcinona) como hidroliticamente estáveis (quando são usados 3-arilpropiolonitrilos).

[090] A “modificação” também abrange a substituição de aminoácidos naturais por aminoácidos não naturais. Os aminoácidos não naturais não são codificados pelo Código Genético Universal. Normalmente, eles podem ser encontrados na natureza como produtos metabólicos, especialmente em plantas e bactérias. Esses aminoácidos não naturais podem ser selecionados a partir do seguinte, mas não apenas deles: D-aminoácidos, homoaminoácidos, N-metil aminoácidos, alfametil aminoácidos, beta2 aminoácidos, beta3 aminoácidos, beta3 homoaminoácidos, ACHC, peptóides ou aminoácidos pesados, especificamente substituídos por átomos 13C e/ou 15N, especificamente E-acetil-lisina, alanina (ácido 3-amino-propriônico), ácido 6- aminocapróico, ácido ?-aminobutírico, citrulina, cisteína acetamidometil protegida, dimetil- lisina, hidroxil-prolina, ácido mercaptopropriônico, metil-lisina, 3-notro-tirosina, norleucinas, ácido piroglutâmico, carbobenzoxil.

[091] O termo “domínio de ligação ao GAG”, da maneira aqui utilizada,

23 / 75 refere-se à região com a DAO que está envolvida na ligação ou interação com as quatro classes de glicosaminoglicanos, inclusive heparina/sulfato de heparano, condroitina/sulfato de dermatano, sulfato de queratina e hialuronano. A ligação à heparina/sulfato de heparano é preferencial. A heparina está presente nos mastócitos.

O sulfato de heparano está presente em quase todas as células, como as células endoteliais.

[092] O termo “ligação ao GAG” refere-se à interação/ligação da DAO com um glicosaminoglicano, especificamente com a heparina ou o sulfato de heparano. Os GAGs se ligam a muitas classes diferentes de proteínas, principalmente por meio de interações eletrostáticas entre grupos de sulfato negativamente carregados e ácidos urônicos e aminoácidos positivamente carregados na proteína. A afinidade de ligação à heparina pode ser determinada por qualquer método conhecido por especialistas.

Vários métodos estão disponíveis para analisar as interações GAG-proteína, e alguns permitem a medição direta dos valores de K d. Um método comum envolve o fracionamento de proteínas por afinidade em colunas de sefarose que contêm cadeias de GAG ligadas covalentemente, geralmente heparina. As proteínas ligadas são eluidas com diferentes concentrações de cloreto de sódio, e a concentração necessária para a eluição é geralmente proporcional ao K d. As interações de alta afinidade exigem pelo menos 1 M NaCl para deslocar o ligante ligado, o que se traduz em valores de Kd de 10-7–10-9 M (determinados em concentrações fisiológicas de sal por ligação de equilíbrio). As proteínas com baixa afinidade (10 -4–10-6 M) não se ligam em condições “normais” (0,15 M NaCl) ou precisam apenas de 0,3–0,5 M NaCl para eluir. Este método se fundamenta na suposição de que a interação GAG-proteína é inteiramente iônica e pode criar uma avaliação da afinidade relativa ao comparar diferentes proteínas que se ligam ao GAG. Outros métodos, mas não apenas estes,

24 / 75 podem ser: co-eletroforese de afinidade, ultracentrifugação analítica, dicroísmo circular, ELISA de competição, microscopia de fluorescência, espectrometria de massa de mobilidade iônica, calorimetria de titulação isotérmica, dispersão de luz laser, NMR, ressonância plasmônica de superfície e raios-X e, assim, gerar dados termodinâmicos detalhados (ΔH [mudança de entalpia], ΔS [mudança de entropia], ΔCp [mudança na capacidade térmica molar], etc.), dados cinéticos (velocidades de associação e dissociação) e dados de alta resolução sobre contatos atômicos em interações GAG-proteína (Esko JD. et al., Essentials of Glycobiology, 3ª edição, Capítulo 38, 2017).

[093] Especificamente, os mutantes de DAO, cf. aqui descritos, diminuíram ou apresentam ligação reduzida à heparina e/ou ao sulfato de heparano.

Especificamente, a afinidade de ligação à heparina/ao sulfato de heparano da DAO recombinante é de pelo menos 10%, 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, especificamente 90%, menor em comparação com a DAO do tipo selvagem. De acordo com um método específico, a afinidade de ligação é determinada usando a cromatografia em heparina- sefarose, em que as variantes da DAO são incubadas em baixas concentrações de sal e eluidas com concentrações crescentes de sal. As concentrações de sal com o pico na proteína da DAO (medidas usando absorbância a 280 nm) são usadas como a concentração milimolar (mM) de sal na qual a DAO é eluida.

[094] A DAO da invenção apresenta, ainda, uma menor internalização nas células endoteliais em comparação com a DAO de tipo selvagem que é internalizada.

Especificamente, a internalização por células endoteliais é pelo menos 10%, 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, especificamente 90%, menor em comparação com a DAO de tipo selvagem.

[095] Especificamente, o domínio de ligação ao GAG compreende

25 / 75 aminoácidos nas posições 568-575 com referência à numeração de SEQ ID NO:1.

Dentro do referido domínio, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou todos os aminoácidos podem ser modificados.

[096] Um monômero da DAO contém 24 lisinas e 44 argininas na sequência principal de aminoácidos, estando a maioria delas na superfície da molécula. É provável que outras lisinas e argininas estejam envolvidas na ligação à heparina. Além do domínio de ligação ao GAG que abrange aminoácidos nas posições 568-575, outras lisinas ou argininas na superfície da DAO pode estar envolvidas na ligação à heparina/ao sulfato de heparano.

[097] A modificação de uma ou mais destas lisinas e/ou argininas pode diminuir ainda mais a ligação à heparina/ao sulfato de heparano da DAO recombinante.

[098] O termo “atividade enzimática” da DAO refere-se à capacidade do polipeptídeo de catalisar a desaminação oxidativa de um substrato apropriado, como putrescina ou histamina, em aminobutiraldeído ou acetaldeído de imidazol. A preservação da atividade enzimática significa que a DAO da invenção tem atividade enzimática igual ou semelhante à da respectiva DAO de tipo selvagem. A atividade enzimática, que é de pelo menos 80%, especificamente pelo menos 90%, da atividade do tipo selvagem é interpretada como sendo a atividade enzimática semelhante à de uma DAO de tipo selvagem.

[099] Para determinar a atividade enzimática da DAO, podem ser usados quaisquer métodos conhecidos na técnica. Estes métodos podem ser, entre outros, ensaios usando oxidação de luminol mediada por peroxidase de rábano (HRP) (Bartko J. et al., Alcohol. Ago 2016; 54: 51-9), métodos espectrofotométricos conforme descrito por Holmstedt BO e Tham R. (Acta Physiol. Scand., 1959, 45, 152-163) e

26 / 75 Bardsley W.G. et al., (Biochem.J. 1972, 127, 875-879), espectrometria de massa (Gludovacz E. et al., 2016), contagem de cintilação líquida (Okuyama T. e Kobayashi Y., Archives Biochem. Biophys., 19661, 95, 242-250), métodos de ensaio titulométrico, manométrico, fluorométrico, biológico ou radioativo (Zeller EA., The enzymes, (JB Sumner and K Maybäck, eds.) Vol II, Parte A, p. 536, Academic Press, Nova Iorque, 1951; Shore PA et al., J.Pharmacol., Exptl.Therap. 127, 1959, 182; Ahlark A., Acta Physiol.Scand.Supl., 1944, 28, 9)

[100] O termo “variante funcional” ou “variante funcionalmente ativa” também inclui variantes alélicas de ocorrência natural, bem como mutantes ou quaisquer outras variantes de ocorrência não natural. Como é conhecido na técnica, uma variante alélica é uma forma alternativa de um ácido nucléico ou peptídeo, que é caracterizado como tendo um(a) substituição, exclusão ou acréscimo de um ou mais nucleotídeos ou um ou mais aminoácidos que, essencialmente, não alteram a função biológica do ácido nucléico ou polipeptídeo.

[101] Variantes funcionais podem ser obtidas por alterações de sequência no polipeptídeo ou na sequência de nucleotídeos, por exemplo, por uma ou mais mutações pontuais, em que as alterações de sequência retêm ou melhoram uma função do polipeptídeo inalterado ou da sequência de nucleotídeos, quando usado em combinação com a invenção. Entre essas alterações de sequência podem estar substituições (conservadoras), acréscimos, exclusões, mutações e inserções. As substituições conservadoras são aquelas que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos que são relacionados em suas cadeias laterais e propriedades químicas.

Exemplos dessas famílias são aminoácidos com cadeias laterais básicas, com cadeias laterais ácidas, com cadeias laterais alifáticas apolares, com cadeias laterais aromáticas apolares, com cadeias laterais polares não carregadas, com cadeias

27 / 75 laterais pequenas, com cadeias laterais grandes, etc.

[102] Uma mutação pontual é entendida especialmente como a engenharia de um polinucleotídeo que resulta na expressão de uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de aminoácidos não manipulada na substituição ou troca, exclusão ou inserção de um ou mais aminoácidos únicos (não-consecutivos) ou duplicados para diferentes aminoácidos.

[103] Numa outra incorporação, um domínio de ligação ao GAG pode ser introduzido na DAO em qualquer posição dentro do polipeptídeo por meios recombinantes. O respectivo domínio pode ser constituído pela sequência de aminoácidos X1FX2X3X4LPX5, sendo X1 qualquer aminoácido, sendo especificamente A ou S, sendo mais especificamente S; sendo X2 qualquer aminoácido, especificamente K; sendo X3 qualquer aminoácido, especificamente A ou T, mais especificamente T, sendo X4 qualquer aminoácido, especificamente K; e sendo X5 qualquer aminoácido, especificamente K ou T, mais especificamente T.

Numa incorporação específica, uma ou mais das sequências de aminoácidos SFKAKLPK (SEQ ID NO:33), AFKAKLPT (SEQ ID NO:34), AFKTKLPK (SEQ ID NO:35), SFKTKLPK (SEQ ID NO:36), AFKTKLPT (SEQ ID NO:37), SFKAKLPK (SEQ ID NO:38) são introduzidas no polipeptídeo DAO aqui descrito.

[104] O termo “identidade de sequência”, tal como aqui utilizado, é entendido como o parentesco entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos, e descrito pelo grau de identidade de sequência ou complementaridade de sequência. A identidade de sequência de uma variante, um homólogo ou um ortólogo em comparação com um nucleotídeo parental ou uma sequência de aminoácidos indica o grau de identidade de duas ou mais sequências.

Duas ou mais sequências de aminoácidos podem ter resíduos de aminoácidos iguais

28 / 75 ou conservados numa posição correspondente, até um certo grau, até 100%. Duas ou mais sequências de nucleotídeos podem ter pares de bases iguais ou conservados numa posição correspondente, até um certo grau, até 100%.

[105] A busca por semelhança de sequências é uma estratégia eficaz e confiável para identificar homólogos com identidade de sequência em excesso (por exemplo, ao menos 50%). As ferramentas de pesquisa de semelhança de sequência frequentemente usadas são, por exemplo, BLAST, FASTA e HMMER.

[106] As pesquisas de semelhança de sequência podem identificar essas proteínas homólogas ou polinucleotídeos, detectando o excesso de semelhança e uma semelhança estatisticamente significativa que reflita uma ancestralidade comum.

Os homólogos podem abranger ortólogos, que são aqui entendidos como a mesma proteína em diferentes organismos, por exemplo, variantes dessa proteína em diferentes organismos ou espécies.

[107] Para determinar a % de complementaridade de duas sequências complementares, uma das duas sequências precisam ser convertida em sua sequência complementar antes que a % de complementaridade possa, então, ser calculada como a % de identidade entre a primeira sequência e a segunda sequência convertidas, usando o algoritmo mencionado acima.

[108] “Porcentagem (%) de identidade” em relação a uma sequência de aminoácidos, homólogos e ortólogos aqui descrita é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos numa sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídica específica, após o alinhamento da sequência e a introdução de lacunas, se necessário, para atingir a identidade de sequência máxima percentual, e sem considerar nenhuma substituição conservadora como parte da identidade de sequência. Os versados na técnica podem determinar os

29 / 75 parâmetros apropriados para medir o alinhamento, inclusive quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências que estiverem sendo comparadas.

[109] Para os fins aqui descritos, a identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o programa NCBI BLAST versão

2.2.29 (Jan-06-2014) com blastp configurado com os seguintes parâmetros exemplificativos: Programa: blastp, tamanho de palavra: 6, valor esperado: 10, tamanho da lista de ocorrências: 100, Gapcosts: 11.1, Matriz: BLOSUM62, cadeia de filtros: F, Código Genético: 1, tamanho da janela: 40, Limiar: 21, Estatísticas baseadas em composição: 2.

[110] “Porcentagem (%) de identidade” em relação a uma sequência de nucleotídeos, por exemplo, de uma molécula de ácido nucleico ou uma parte dela, em particular uma sequência de DNA codificadora, é definida como a porcentagem de nucleotídeos numa sequência de DNA candidata que é idêntica aos nucleotídeos na sequência de DNA, após o alinhamento da sequência e a introdução de lacunas, se necessário, para atingir a identidade de sequência máxima percentual, e sem considerar nenhuma substituição conservadora como parte da identidade de sequência. O alinhamento, para fins de determinação da identidade percentual de uma sequência de nucleotídeos, pode ser alcançado de várias maneiras que estejam dentro da competência da técnica, por exemplo, usando software de computador disponível ao público. Os versados na técnica podem determinar os parâmetros apropriados para medir o alinhamento, inclusive quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências que estiverem sendo comparadas.

[111] O alinhamento ideal pode ser determinado com o uso de qualquer

30 / 75 algoritmo adequado para sequências de alinhamento, sendo exemplos não limitativos o algoritmo Smith-Waterman, o algoritmo Needleman-Wunsch, algoritmos baseados na transformada de Burrows-Wheeler (por exemplo, o alinhador Burrows Wheeler), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies; disponível em novocraft.com), ELAND (Illumina, San Diego, CA), SOAP (disponível em soap.genomies.org.cn) e Maq (disponível em maq.sourceforge.net).

[112] A DAO, conforme descrita aqui, pode compreender as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 2 a 16 e quaisquer variantes funcionais das mesmas com 90%, 95%, 99% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 2 a 16.

[113] A DAO recombinante tem uma meia-vida plasmática consideravelmente maior em comparação com a DAO do tipo selvagem; especificamente, a referida meia- vida é aumentada em pelo menos 1,5 vezes, especificamente pelo menos 2 vezes em comparação com a DAO do tipo selvagem.

[114] A duração da ação ou presença física de um fármaco é conhecida como meia-vida. Esse é o período de tempo necessário para que a concentração ou quantidade do fármaco no corpo ou no sangue total ou no plasma seja reduzida pela metade. A meia-vida de um fármaco é geralmente considerada em relação à quantidade do fármaco no plasma ou soro. A meia-vida plasmática ou sérica de um fármaco depende da rapidez com que o fármaco é eliminado do plasma ou soro. A molécula de um fármaco pode ser eliminada do corpo, ou pode ser translocada para outro compartimento de fluido corporal, como o fluido intracelular, ou pode ser destruída no sangue. A remoção de um fármaco do plasma é conhecida como depuração, e a distribuição do fármaco pelos vários tecidos do corpo é conhecida como volume de distribuição.

31 / 75

[115] A área sob a curva de concentração plasmática do fármaco no tempo (AUC) reflete a exposição real do corpo ao fármaco, ou seja, a DAO recombinante aqui descrita, após a administração de uma dose do fármaco, sendo expressa em µg/min/mL. Essa área sob a curva depende da velocidade de depuração do fármaco do corpo e da dose administrada. A quantidade total de fármaco eliminada pelo organismo pode ser avaliada somando-se ou integrando-se as quantidades eliminadas em cada intervalo de tempo, desde o tempo zero (tempo de administração do fármaco) até o tempo infinito. Essa quantidade total corresponde à fração da dose administrada que atinge a circulação sistêmica. A AUC é diretamente proporcional à dose quando o fármaco segue uma cinética linear. A AUC é inversamente proporcional à depuração do fármaco. Ou seja, quanto maior a depuração, menos tempo o fármaco passa na circulação sistêmica e mais rápido será o declínio da concentração plasmática do fármaco. Portanto, nessas situações, a exposição do organismo ao fármaco e a área sob a curva concentração-tempo são menores.

[116] A DAO recombinante, conforme descrita aqui, tem uma AUC pelo menos 2 vezes maior, pelo menos 5 vezes, 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 30 vezes maior em comparação com a DAO de tipo selvagem.

[117] O termo “expressão” é entendido da seguinte forma. As moléculas de ácido nucleico que contêm uma sequência de codificação desejada de um produto de expressão, como, por exemplo, uma proteína de fusão como aqui descrita, podem ser usadas para fins de expressão. Os hospedeiros transformados ou transfectados com essas sequências são capazes de produzir as proteínas codificadas. Para efetuar a transformação, o sistema de expressão pode ser incluído num vetor; no entanto, o respectivo DNA também pode ser integrado ao cromossomo hospedeiro.

32 / 75 Especificamente, o termo refere-se a uma célula hospedeira e um vetor compatível sob condições adequadas, por exemplo, para a expressão de uma proteína codificada por DNA estranho transportado pelo vetor e introduzido na célula hospedeira.

[118] O DNA codificador é uma sequência de DNA que codifica uma sequência específica de aminoácidos para um determinado polipeptídeo ou uma determinada proteína. O DNA promotor é uma sequência de DNA que inicia, regula ou de outra forma medeia ou controla a expressão do DNA codificador. O DNA promotor e o DNA codificador podem ser do mesmo gene ou de genes diferentes, e podem ser do mesmo organismo ou de organismos diferentes. Muitas vezes, os vetores de clonagem recombinantes contêm um ou mais sistemas de replicação para clonagem ou expressão, um ou mais marcadores para seleção no hospedeiro, por exemplo, resistência a antibióticos, um ou mais sinais de localização nuclear (NLS) e um ou mais cassetes de expressão.

[119] O termo “Vetor de expressão”, da maneira aqui empregado, é definido como sequências de DNA que são necessárias para a transcrição de sequências de nucleotídeos recombinantes clonados, ou seja, de genes recombinantes e a conversão de seu mRNA num organismo hospedeiro adequado. Para obter a expressão, uma sequência que codifica um produto de expressão desejado, como a DAO aqui descrita, é normalmente clonada num vetor de expressão que contém um promotor para dirigir a transcrição. Promotores bacterianos e eucarióticos adequados são bem conhecidos na técnica. O promotor usado para dirigir a expressão de um ácido nucléico depende da aplicação particular. Por exemplo, um promotor constitutivo forte é normalmente usados para expressão e purificação de proteínas de fusão. Por outro lado, quando o produto de expressão deve ser administrado in vivo para regulação gênica, pode ser usado um promotor constitutivo ou induzível, dependendo

33 / 75 do uso específico do produto de expressão. Além disso, um promotor preferencial para administração pode ser um promotor fraco. O promotor também pode conter elementos que reajam à transativação, por exemplo, elementos de reação à hipóxia, elementos de reação a Gal4 e elementos de reação do repressor de lac. Os vetores de expressão compreendem o cassete de expressão e, além disso, compreendem em geral uma origem para replicação autônoma nas células hospedeiras ou um sítio de integração do genoma, um ou mais marcadores selecionáveis (por exemplo, um gene de síntese de aminoácidos ou um gene que confere resistência a antibióticos, como a zeocina, a canamicina, o G418 ou a higromicina), uma série de sítios de clivagem com enzimas de restrição, uma sequência promotora adequada e um terminador de transcrição, cujos componentes estão operacionalmente ligados entre si.

[120] Um “cassete de expressão” refere-se a uma sequência de codificação de DNA ou segmento de codificação de DNA para um produto de expressão que pode ser inserido num vetor em sítios de restrição definidos. Os sítios de restrição do cassete são projetados para garantir a inserção do cassete no quadro de leitura adequado. Em geral, o DNA estranho é inserido num ou mais sítios de restrição do DNA do vetor e, em seguida, é transportado pelo vetor até uma célula hospedeira junto com o DNA do vetor transmissível. Um segmento ou uma sequência de DNA com DNA inserido ou adicionado, como um vetor de expressão, também pode ser chamado de “construção de DNA”.

[121] Qualquer célula hospedeira ou linha celular adequada pode ser usada para expressar a DAO recombinante que permite o dobramento adequado, modificações pós-conversão e atividade enzimática. Especificamente, as células hospedeiras recombinantes podem ser selecionadas a partir de células CHO, células COS, células Vero, células MDCK, células de Pichia pastoris, células SF9 e linhas

34 / 75 celulares humanas, tais como HEK e HeLa.

[122] O termo “vetor”, da maneira aqui empregada, abrange sequências de nucleotídeos de replicação autônoma, bem como sequências de nucleotídeos de integração do genoma. Um tipo comum de vetor é um “plasmídeo”, que, em geral, é uma molécula autônoma de DNA de fita dupla que pode aceitar facilmente um DNA extra (estranho) e que pode ser facilmente introduzido numa célula hospedeira adequada. Um vetor de plasmídeo contém, frequentemente, DNA codificador e DNA promotor, e apresenta um ou mais sítios de restrição adequados para inserir um DNA estranho. Especificamente, o termo “vetor” ou “plasmídeo” refere-se a um veículo pelo qual uma sequência de DNA ou RNA (por exemplo, um gene estranho) pode ser introduzida numa célula hospedeira, de modo a transformar o hospedeiro e promover a expressão (por exemplo, transcrição e conversão) da sequência introduzida. Os vetores são transfectados para as células e o DNA podem ser integrados ao genoma por recombinação homóloga no caso de transfecção estável, ou as células podem ser transitoriamente transfectadas. Especificamente, o vetor é um vetor de expressão bacteriano, de levedura, baculoviral, vegetal ou mamífero.

[123] Pode ser usado qualquer um dos procedimentos conhecidos para a introdução de sequências de nucleotídeos estranhas em células hospedeiras. Entre esses procedimentos estão o uso de transfecção de fosfato de cálcio, polibreno, fusão de protoplastos, eletroporação, nucleofecção, lipossomas, microinjeção, DNA nu, vetores de plasmídeo, vetores virais, epissomais e integrativos, e qualquer um dos outros métodos bem conhecidos para a introdução de DNA genômico clonado, cDNA, DNA sintético ou outro material genético estranho numa célula hospedeira (vide, por exemplo, Sambrook et al.).

[124] Exemplos de vetores de expressão mamíferos são os vetores

35 / 75 adenovirais, o pSV e a série pCMV de vetores de plasmídeo, vaccinia e vetores retrovirais, bem como baculovírus. Os promotores para citomegalovírus (CMV) e SV40 são habitualmente usados em vetores de expressão mamíferos para conduzir a expressão de genes. O promotor não viral, como o promotor do fator de alongamento (EF)-1, também é conhecido.

[125] Usando os vetores e as células hospedeiras descritos acima, a presente invenção cria um método para produzir a DAO recombinante, que compreende as etapas sequenciais de clonagem de uma sequência de nucleotídeos que codifica a DAO num vetor de expressão, transformando uma célula hospedeira, especificamente uma célula de mamífero com o referido vetor, cultivando a célula hospedeira transformada sob condições em que a DAO é expressa, isolando a DAO da cultura da célula hospedeira, opcionalmente por desintegração das células hospedeiras ou isolando a DAO do sobrenadante da cultura celular e, opcionalmente, purificando a DAO.

[126] É descrita ainda uma composição farmacêutica que compreende a DAO recombinante aqui apresentada. De acordo com uma incorporação específica, essa composição farmacêutica que compreende a DAO ou suas variantes funcionais, conforme aqui descrito, é usada no tratamento de qualquer condição associada ao excesso de histamina, especificamente de excesso de histamina >1 ng/mL de concentração no plasma, especificamente para o tratamento de doenças alérgicas crônicas, mais especificamente para o tratamento de doenças alérgicas crônicas e/ou no tratamento de gravidez de alto risco, mais especificamente no tratamento de anafilaxia, choque anafilático, urticária crônica, urticária aguda, asma, febre do feno, rinite alérgica, conjuntivite alérgica, intoxicação por histamina, dor de cabeça, coceira, vômito, taquicardia, hipotensão, parada cardíaca, dermatite atópica, doenças

36 / 75 inflamatórias, mastocitose, síndrome de ativação de mastócitos (MCAS), pré- eclâmpsia, hiperêmese gravídica, parto prematuro, úlceras pépticas, refluxo ácido, prurido e sepse.

[127] Especificamente, a composição farmacêutica aqui descrita compreende ainda veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, agentes de formação de volume, quando usados para diagnóstico ou terapia. Essas composições farmacêuticas podem ser administradas, de acordo com a presente invenção, como uma injeção de bolus ou infusão, ou por infusão contínua. Os excipientes farmacêuticos adequados para facilitar esses meios de administração são bem conhecidos na técnica.

[128] Em geral, os excipientes farmaceuticamente aceitáveis são todos e quaisquer solventes adequados, meios de dispersão, revestimentos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção e semelhantes, que sejam fisiologicamente compatíveis com a DAO apresentada pela invenção. Outros exemplos de excipientes farmaceuticamente aceitáveis são água esterilizada, soro fisiológico, soro fisiológico tamponado com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e semelhantes, bem como combinações de qualquer um deles.

[129] Outros veículos farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Remington’s Pharmaceutical Sciences (Gennaro, AR, ed., Mack Publishing Co, 1985). As formulações líquidas podem ser soluções, emulsões ou suspensões, podendo também ser excipientes tais como agentes de suspensão, solubilizantes, surfactantes, conservantes e agentes quelantes.

[130] Entre as formulações exemplares utilizadas para administração parentérica estão aquelas adequadas para injeção subcutânea, intramuscular ou intravenosa como, por exemplo, uma solução, emulsão ou suspensão.

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[131] A DAO aqui descrita é administrada especificamente numa quantidade terapeuticamente eficaz, o que significa uma quantidade ou atividade suficiente para gerar os resultados benéficos ou desejados, inclusive resultados clínicos, quando administrado a um paciente, por exemplo, um paciente que sofra de câncer. Como tal, uma quantidade eficaz ou quantidade sinônima da mesma depende do contexto em que estiver sendo aplicada. Uma quantidade eficaz pretende significar a quantidade de um composto que seja suficiente para tratar, prevenir ou inibir essas doenças ou esses distúrbios.

[132] A quantidade do composto, ou seja, a DAO recombinante aqui descrita, que corresponderá a essa quantidade eficaz variará de acordo com vários fatores, tais como o fármaco ou composto em questão, a formulação farmacêutica, a via de administração, o tipo de doença ou desordem, a identidade do paciente ou hospedeiro a ser tratado e semelhantes, mas pode, no entanto, ser rotineiramente determinada por um especialista na técnica.

[133] De acordo com uma incorporação específica da invenção, é apresentado um polipeptídeo de fusão em que a DAO recombinante é conjugada a um segundo fragmento, que pode ser, entre outros, Fc ou albumina sérica humana (HSA).

[134] De acordo com uma incorporação específica, a DAO conjugada com um Fc compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 70 ou um fragmento funcional do mesmo que tenha pelo menos 80%, especificamente pelo menos 85%, 90%, 95%, 99% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 70.

[135] De acordo com uma incorporação específica, a DAO conjugada com um Fc é codificada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 72 a 102 ou por um fragmento do mesmo que tenha pelo menos 80%, especificamente pelo menos 85%, 90%, 95%, 99% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 72 a 102.

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[136] O termo “polipeptídeo de fusão”, no contexto da presente invenção, refere-se a uma sequência de aminoácidos, predominantemente (mas não necessariamente) conectados uns aos outros por ligações peptídicas. O termo “fundido”, de acordo com o polipeptídeo de fusão da presente invenção, refere-se ao fato de as sequências de aminoácidos de pelo menos duas origens diferentes, a saber, a DAO modificada cf. aqui definido e o segundo fragmento, especificamente o domínio Fc da IgG humana ou albumina, estarem ligadas umas às outras por ligações covalentes, seja diretamente ou por meio de um ligante de aminoácido ou espaçador, unindo (criando uma ponte, conjugando, ligando covalentemente) as sequências de aminoácidos. A fusão pode ser realizada por conjugação química ou por métodos de engenharia genética que são bem conhecidos no estado da técnica.

[137] Em algumas incorporações, o polipeptídeo da DAO, conforme definido aqui, está covalentemente ligado por meio do seu terminal C ao domínio Fc da IgG humana ou a HSA. Especificamente, em algumas incorporações, no sentido do terminal N para o terminal C, o polipeptídeo de fusão compreende, de acordo com a invenção, o polipeptídeo da DAO e o componente do domínio Fc ou HSA.

[138] Em outras incorporações, o polipeptídeo da DAO, conforme definido aqui, está covalentemente ligado por meio do seu terminal N ao domínio Fc da IgG humana ou a HSA. Especificamente, em algumas incorporações, no sentido do terminal N para o terminal C, o polipeptídeo de fusão da invenção compreende o componente do domínio Fc ou HSA e o polipeptídeo da DAO.

[139] O termo “polipeptídeo”, da maneira aqui empregada, refere-se a resíduos de aminoácidos, conectados por ligações peptídicas. Em geral, uma sequência polipeptídica é relatada da extremidade terminal N que contém o grupo amino livre para a extremidade terminal N que contém o grupo carboxila livre. Um

39 / 75 polipeptídeo também pode ser denominado “sequência de aminoácidos”, “peptídeo” ou “proteína”, e pode ser modificado, por exemplo, por manosilação, glicosilação, amidação, carboxilação ou fosforilação.

[140] O termo “covalentemente ligado” ou “ligação covalente”, significa que os domínios indicados estão conectados ou ligados por ligações covalentes.

[141] Especificamente, da maneira aqui empregada, o termo “polipeptídeo de fusão Fc” abrange a DAO da presente divulgação, que compreende um domínio Fc de comprimento total, bem como proteínas que compreendem fragmentos do domínio Fc (por exemplo, um domínio de CH2 completo, um domínio CH3 completo, um fragmento de CH2, um fragmento de CH3, ou combinações dos mesmos). Uma proteína de fusão Fc também pode compreender toda a região de dobradiça ou uma parte dela.

[142] Da maneira aqui empregada, a região de Fc contém os polipeptídeos que compreendem a região constante de um anticorpo, excluído o primeiro domínio de imunoglobulina da região constante e seus fragmentos. Assim, Fc refere-se aos dois últimos domínios de imunoglobulina de região constante da IgA, IgD e IgG, e os últimos três domínios de imunoglobulina de região constante da IgE e IgM e, como opção, a região de dobradiça flexível do terminal N para esses domínios. Para a IgA e a IgM, a região Fc pode conter a cadeia J. Para a IgG, o Fc compreende os domínios de imunoglobulina Cgama2 e Cgama3 (Cɣ2 e Cɣ3) e, como opção, a região de dobradiça entre Cgama1 (Cɣ1) e Cgama2 (Cɣ2). Embora os limites da região Fc possam variar, a região Fc de cadeia pesada da IgG humana é definida, em geral, de forma a compreender os resíduos C226 ou P230 em seu terminal carboxila, em que a numeração segue o índice EU cf. estabelecido em Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed. Serviço de Saúde Pública, Institutos

40 / 75 Nacionais de Saúde, Bethesda, MD (1991)). Fc pode referir-se a essa região isolada ou a essa região no contexto de um anticorpo, fragmento de anticorpo ou proteína de fusão Fc.

[143] A sequência de HSA fundida ao polipeptídeo da DAO aqui descrita pode compreender a sequência de tipo selvagem ou 90%, especificamente pelo menos 95%, mais especificamente pelo menos 99%, mais especificamente pelo menos 99,9% de identidade de sequência com a sequência de tipo selvagem (SEQ ID No 103). Como opção uma sequência ligante está contida entre a DAO e a HSA, que compreende especificamente entre 2 e aproximadamente 10 resíduos de aminoácidos.

[144] De acordo com uma incorporação específica, a ligação da DAO à GAG, especificamente a ligação à heparina/ao sulfato de heparano é inibida, levando, assim, a diminuição da internalização da DAO e ao aumento da quantidade de DAO na circularização do corpo, que pode ser determinada pela AUC. Quando a DAO é modificada conforme descrito aqui, a DAO apresenta, de fato, uma diminuição significativa da ligação heparina/sulfato de heparano.

[145] Outra opção para aumentar a DAO na circularização do corpo é criar um ligante específico do alvo, que se liga especificamente ao domínio de ligação heparina/sulfato de heparano. Especificamente, um anticorpo ou fragmento de anticorpo ou qualquer ligante pode se ligar à DAO perto do domínio de ligação à heparina e, assim, bloquear o acesso ao domínio de ligação à heparina. Como alternativa, é uma proteína de fusão em que partes dela cobrem e bloqueiam a função do domínio de ligação à heparina e, portanto, têm o mesmo efeito que as mutações ou a ligação do anticorpo diretamente ao domínio de ligação à heparina.

[146] Como alternativa, inibe-se a ligação heparina/sulfato de heparano ao

41 / 75 domínio de ligação da DAO ao GAG.

O ligante pode ser uma proteína de ligação ao antígeno, especificamente selecionada do grupo que consiste em anticorpos ou fragmentos de anticorpos, tais como qualquer um entre Fab, Fd, scFv, diacorpos,

triacorpos, tetrâmeros Fv, minicorpos, nanocorpos, anticorpos de domínio único como

VH, VHH, IgNARs ou V-NAR; miméticos de anticorpos, como Adnectins™

(compartilhando com domínios variáveis de anticorpos uma dobra em sanduíche de folha beta com voltas diversificadas, mas diferindo dos anticorpos pela sequência primária e apresentando uma estrutura de domínio único sem ligações de dissulfeto),

Affibodies® (proteínas pequenas e simples compostas por um feixe de três hélices com base no andaime de um dos domínios de ligação de IgG da Proteína A), Affilins®

(estruturalmente derivadas da ubiquitina humana, construídas por modificação de aminoácidos expostos à superfície dessas proteínas e isoladas por técnicas de exibição, como exibição de fago e triagem.

As afilinas se assemelham a anticorpos em sua afinidade e especificidade para antígenos, mas não na estrutura, o que as torna um tipo de mimético de anticorpos); os Affimers® (pequenas proteínas que se ligam a moléculas-alvo com especificidade e afinidade semelhantes às dos anticorpos), as Afitinas (proteínas artificiais com capacidade de se ligar seletivamente a antígenos), os Alfacorpos, os Aptâmeros, as Anticalinas, os Avímeros, as DARPins®

(proteínas miméticas de anticorpos geneticamente modificados, que normalmente exibem ligação alta afinidade e altamente específica à proteína-alvo), Fynomers®

(pequenas proteínas de ligação (7 kDa) derivadas do domínio da SH3 humana da Fyn quinase, que podem ser manipuladas para produzir domínios de ligação específicos e de alta afinidade para ter proteínas específicas como alvo), peptídeos do domínio de Kunitz, monocorpos ou NanoCLAMPS (CLostridal Antibody Mimetic Proteins, ou proteínas miméticas de anticorpos clostridiais); ou proteínas de fusão que

42 / 75 compreendem um ou mais domínios de dobras de imunoglobulina, domínios de anticorpos ou miméticos de anticorpos.

[147] É apresentado ainda um método para identificar compostos que modulam a ligação de heparina da DAO, que compreende as etapas de (a) construção de um modelo de computador do domínio de ligação do GAG, definido pelas coordenadas da estrutura dos aminoácidos da sequência da DAO de SEQ ID No. 1, (b) seleção de potencial composto modulador por um método selecionado no grupo que consiste em: (i) montagem de fragmentos moleculares no referido composto, (ii) seleção de um composto num banco de dados de moléculas pequenas, e (iii) projeto de novo do ligante do referido composto; (c) uso de meios computacionais para realizar uma operação programática de ajuste entre modelos de computador do referido composto e o domínio de ligação do GAG, a fim de criar uma configuração de baixa energia do referido composto no domínio de ligação à heparina; e (d) avaliação dos resultados da referida operação de ajuste para quantificar a associação entre o referido composto e o domínio de ligação à heparina/ao sulfato de heparano, avaliando, assim, a capacidade do referido composto de se associar ao referido domínio de ligação à heparina/ao sulfato de heparano.

[148] O termo “coordenadas de estrutura” refere-se a um conjunto de valores que definem a posição de um ou mais resíduos de aminoácidos com referência a um sistema de eixos. O termo se refere a um conjunto de dados que define a estrutura tridimensional de uma molécula ou de moléculas (por exemplo, coordenadas

43 / 75 cartesianas, fatores de temperatura e ocupações). As coordenadas estruturais podem ser ligeiramente modificadas e, ainda, gerar estruturas tridimensionais quase idênticas. Uma medida de um conjunto exclusivo de coordenadas estruturais é a raiz do desvio quadrático médio da estrutura resultante. Coordenadas estruturais que geram estruturas tridimensionais (em particular, uma estrutura tridimensional de um domínio de ligação à heparina/ao sulfato de heparina) que se desviam uma da outra por um desvio quadrático médio de raiz inferior a 3 Å, 2 Å, 1,5 Å, 1,0 Å, ou 0,5 Å pode ser considerado por um versado na técnica como muito semelhante.

[149] Da maneira aqui empregada, o termo “construir um modelo de computador” inclui a análise quantitativa e qualitativa da estrutura e/ou função molecular com base em informações estruturais atômicas e modelos de interação. O termo “modelagem” inclui modelos convencionais numéricos de minimização de energia e dinâmica molecular, modelos gráficos interativos de computador, modelos de mecânica molecular modificados, geometria de distância e outros modelos de restrição por estrutura.

[150] O termo “operação de programa de ajuste” refere-se a uma operação que utiliza as coordenadas da estrutura de uma entidade química, um centro enzimaticamente ativo, uma bolsa de ligação, uma molécula ou um complexo molecular, ou parte do mesmo, para associar a entidade química ao centro enzimaticamente ativo, à bolsa de ligação, à molécula ou ao complexo molecular, ou a uma parte do mesmo. Isto pode ser conseguido posicionando, girando ou transladando a entidade química no centro enzimaticamente ativo para coincidir com a forma e complementaridade eletrostática do centro enzimaticamente ativo.

Interações covalentes, interações não covalentes, como a ligação de hidrogênio, eletrostática, hidrofóbica, interações de Van der Waals e interações eletrostáticas não

44 / 75 complementares, como interações carga-carga repulsiva, dipolo-dipolo e carga- dipolo, podem ser otimizadas. Também pode-se minimizar a energia de deformação da ligação da entidade química ao centro enzimaticamente ativo.

[151] Os itens a seguir são incorporações específicas da invenção aqui apresentada.

1. Uma diamina oxidase (DAO) recombinante com menor afinidade de ligação ao glicosaminoglicano, em que a referida DAO compreende pelo menos uma modificação de aminoácido no domínio de ligação do glicosaminoglicano (GAG).

2. A DAO recombinante do item 1 compreende ainda pelo menos uma modificação da cisteína acessível ao solvente na posição de aminoácido 123 com referência à numeração de SEQ ID N.º 1, especificamente a modificação da cisteína é uma substituição, uma exclusão ou um acoplamento de aminoácido com um fragmento químico.

3. A DAO recombinante do item 1 ou 2, em que a cisteína na posição 123, de acordo com a numeração da SEQ ID 1, é substituída pela alanina.

4. A DAO recombinante de qualquer um dos itens 1 a 3, em que o domínio de ligação ao GAG é um domínio de ligação à heparina/ao sulfato de heparano.

5. A DAO recombinante de qualquer um dos itens 1 a 4, em que pelo menos uma modificação de aminoácido no domínio de ligação ao GAG é uma substituição, uma exclusão, uma inserção ou um acoplamento de aminoácido com um fragmento químico.

6. A DAO recombinante de qualquer um dos itens de 1 a 5, que compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 substituições de aminoácidos no domínio de ligação ao GAG.

7. A DAO recombinante de qualquer um dos itens de 1 a 6, em que o

45 / 75 domínio de ligação ao GAG compreende os aminoácidos nas posições 568-575 com referência à numeração da SEQ ID NO:1.

8. A DAO recombinante de qualquer um dos itens de 1 a 7, que compreende um domínio de ligação ao GAG da sequência de aminoácidos X1FX2X3X4LPX5, em que X1 pode ser por qualquer aminoácido, é especificamente A ou S, mais especificamente é S; X2 pode ser por qualquer aminoácido, é especificamente K; X3 pode ser por qualquer aminoácido, é especificamente A ou T, mais especificamente é T; X4 pode ser por qualquer aminoácido, é especificamente K, e X5 pode ser por qualquer aminoácido, é especificamente K ou T, mais especificamente é T.

9. A DAO recombinante do item 7 ou 8, que compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SFKAKLPK (SEQ ID NO:33), AFKAKLPT (SEQ ID NO:34), AFKTKLPK (SEQ ID NO:35), SFKTKLPK (SEQ ID NO:36), AFKTKLPT (SEQ ID NO:37), SFKAKLPK (SEQ ID NO:38).

10. A DAO recombinante de qualquer um dos itens de 1 a 9, em que essa DAO apresenta uma meia-vida plasmática consideravelmente maior em comparação com a DAO do tipo selvagem; especificamente, a referida meia-vida é aumentada em pelo menos 1,5 vezes, especificamente pelo menos 2 vezes em comparação com a DAO do tipo selvagem.

11. A DAO recombinante de qualquer um dos itens de 1 a 10, em que a referida DAO apresenta uma AUC pelo menos 10 vezes maior em comparação com a DAO de tipo selvagem.

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12. A DAO recombinante de qualquer um dos itens de 1 a 11, em que a internalização por células endoteliais é pelo menos 10%, 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, especificamente 90%, menor em comparação com a DAO de tipo selvagem.

13. A DAO recombinante de qualquer um dos itens de 1 a 12, em que a afinidade de ligação ao GAG, especificamente a afinidade de ligação à heparina/ao sulfato de heparano é de pelo menos 10%, 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, especificamente 90% menor em comparação com a DAO de tipo selvagem.

14. A DAO recombinante de qualquer um dos itens de 1 a 13, que compreende as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 2 a 16.

15. Um polipeptídeo de fusão que compreende a DAO recombinante de qualquer um dos itens de 1 a 14 e um domínio Fc de IgG humana ou albumina sérica humana (HSA), em que o polipeptídeo de fusão mantém a atividade funcional da DAO recombinante.

16. Uma sequência isolada de nucleotídeos que codifica a DAO de qualquer um dos itens de 1 a 15, que compreende especificamente as sequências SEQ ID NOs: 17 a 32.

17. Um vetor recombinante que compreende a sequência de nucleotídeos do item 16; especificamente, o vetor é um vetor de expressão bacteriana, de levedura, baculoviral, vegetal ou mamífera.

18. Um cassete de expressão que compreende a sequência de nucleotídeos do item 17, operacionalmente ligada a elementos reguladores.

19. Uma célula hospedeira recombinante ou uma linha celular hospedeira que compreende a DAO recombinante de qualquer um dos itens de 1 a 15, em que as células hospedeiras são selecionadas no grupo que consiste em células CHO, células Vero, células MDCK, células de Pichia pastoris, células SF9.

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20. Um sistema de expressão que compreende o vetor do item 17 ou o cassete de expressão do item 18 e uma célula hospedeira ou linha de células hospedeiras do item 19.

21. Um método para produzir a DAO recombinante de acordo com os itens de 1 a 15, compreendendo o referido método as etapas de i. clonagem de uma sequência de nucleotídeos que codifica a DAO de qualquer um dos itens de 1 a 15 num vetor de expressão, ii. transformar uma célula hospedeira com esse vetor, iii. cultivo da a célula hospedeira transformada sob condições em que a DAO é expressa, iv. isolamento da DAO da cultura de células hospedeiras, com a opção de desintegração das células hospedeiras e, ainda, v. purificação da DAO.

22. Composição farmacêutica que compreende a DAO recombinante de qualquer um dos itens de 1 a 15 e, como opção, um ou mais excipientes.

23. Uso da DAO recombinante de qualquer um dos itens de 1 a 15 na preparação de uma composição farmacêutica.

24. A DAO recombinante de qualquer um dos itens de 1 a 15 para uso no tratamento de uma condição associada ao excesso de histamina, especificamente para o tratamento de doenças alérgicas crônicas, mais especificamente para o tratamento de anafilaxia, choque anafilático, urticária crônica, urticária aguda, asma, febre do feno, rinite alérgica, conjuntivite alérgica, intoxicação por histamina, dor de cabeça, dermatite atópica, doenças inflamatórias, mastocitose, síndrome de ativação de mastócitos (MCAS), pré-eclâmpsia, hiperêmese gravídica, parto prematuro, úlceras pépticas, refluxo ácido, prurido e sepse.

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25. O uso da DAO recombinante de qualquer um dos itens de 1 a 15 para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma condição associada ao excesso de histamina, especificamente para o tratamento de doenças alérgicas crônicas, mais especificamente para o tratamento de anafilaxia, choque anafilático, urticária crônica, urticária aguda, asma, febre do feno, rinite alérgica, conjuntivite alérgica, intoxicação por histamina, dor de cabeça, dermatite atópica doenças inflamatórias, mastocitose, úlceras pépticas, refluxo ácido, prurido e sepse.

26. Um ligante específico de alvo que se liga especificamente ao domínio de ligação da DAO ao GAG, que se liga especificamente a um ou mais dos aminoácidos na posição 568-575 com referência à numeração de SEQ ID No. 1.

27. Um ligante específico de alvo que inibe especificamente a ligação da heparina/do sulfato de heparano ao domínio de ligação da DAO ao GAG, especificamente a um ou mais dos aminoácidos na posição 568-575 com referência à numeração de SEQ ID No. 1.

28. O ligante específico do alvo, do item 26 ou 27, em que o referido ligante é selecionado no grupo que consiste em ácido nucléico, inibidor de moléculas pequenas ou proteína de ligação ao antígeno.

29. O ligante específico do alvo do item 28, em que o referido ligante é uma proteína de ligação ao antígeno, especificamente selecionada no grupo que consiste em - anticorpos ou fragmentos de anticorpos, tais como qualquer um entre Fab, Fd, scFv, diacorpos, triacorpos, tetrâmeros Fv, minicorpos, nanocorpos, anticorpos de domínio único como VH, VHH, IgNARs ou V-NAR; - miméticos de anticorpos, tais como Adnectins™, Affibodies®, Affilins®, Affimers®, Affitins, Alfacorpos, Aptâmeros, Anticalinas, Avímeros, DARPins®,

49 / 75 Fynomers®, peptídeos de domínio Kunitz, Monocorpos ou NanoCLAMPS; ou - proteínas de fusão que compreendem um ou mais domínios de dobra de imunoglobulina, domínios de anticorpo ou miméticos de anticorpo.

30. um método para identificar compostos que modulam a ligação de heparina da DAO, que compreende as etapas de (a) construção de um modelo de computador do domínio de ligação do GAG, definido pelas coordenadas da estrutura dos aminoácidos da sequência da DAO de SEQ ID No. 1, (b) seleção de potencial composto modulador por um método selecionado no grupo que consiste em: (i) montagem de fragmentos moleculares no referido composto, (ii) seleção de um composto num banco de dados de moléculas pequenas, e (iii) projeto de novo do ligante do referido composto; (c) uso de meios computacionais para realizar uma operação programática de ajuste entre modelos de computador do referido composto e o domínio de ligação do GAG, a fim de criar uma configuração de baixa energia do referido composto no domínio de ligação à heparina; e (d) avaliação dos resultados da referida operação de ajuste para quantificar a associação entre o referido composto e o domínio de ligação à heparina/ao sulfato de heparano, avaliando, assim, a capacidade do referido composto de se associar ao referido domínio de ligação à heparina.

[152] Os exemplos descritos aqui são ilustrativos da presente invenção e não se destinam a limitá-los. Diferentes incorporações da presente invenção foram descritas de acordo com a presente invenção. Muitas modificações e variações podem

50 / 75 ser feitas nas técnicas aqui descritas e ilustradas, sem se afastar do espírito e do escopo da invenção. Portanto, deve-se entender que os exemplos são apenas ilustrativos e não limitam o escopo da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1 DAO com domínio de ligação ao GAG modificado:

[153] Resumo: Os aminoácidos na ligação da DAO ao GAG (domínio de ligação à heparina/ao sulfato de heparano) foram mutados. Após mutações no domínio de ligação da DAO à heparina-, foram realizados estudos em animais com esses mutantes. A meia-vida alfa curta pode ser quase eliminada e a meia-vida beta, aumentada para 6 horas em ratos. A meia-vida alfa refere-se à taxa de declínio nas concentrações plasmáticas em virtude do processo de redistribuição do fármaco do compartimento central para o periférico; a meia-vida beta refere-se à taxa de declínio causado pelo processo de depuração do fármaco em virtude do metabolismo ou da excreção. A área sob a curva (AUC) aumentou mais de 20 vezes. A meia-vida de 6 horas em ratos é extrapolada para 24 a 48 horas em humanos, e isso certamente basta para o tratamento de condições agudas e subagudas de excesso de histamina.

Por exemplo, eventos de anafilaxia ou MCAS duram de algumas horas a 1 a 2 dias, e a anafilaxia pode ser bifásica em 10-20% dos pacientes, o que significa que um segundo episódio pode ocorrer no prazo de 24 horas. Algumas mutações foram testadas, e um mutante duplo distinto no domínio de ligação à heparina- mostrou as melhorias mais pronunciadas nos parâmetros farmacocinéticos (FC). Como a DAO é um dímero e o domínio de ligação à heparina forma uma estrutura em anel composta de ambos os monômeros, quatro mutações estão localizadas próximas uma da outra.

No entanto, a expressão, estabilidade e atividade da DAO do tipo selvagem e dos

51 / 75 mutantes de DAO são idênticas.

DAO com cisteína modificada

[154] Quando a DAO foi expressa em células CHO, algumas porcentagens de moléculas de DAO (~ 20% a 30%) formaram não apenas dímeros, mas também tetrâmeros, hexâmeros e até octâmeros. Esses oligômeros de ordem superior podem ser considerados variantes naturais com função desconhecida. Não está claro se eles se formam durante o dobramento e o transporte do RE para o Golgi e a secreção para o ambiente extracelular ou, em geral, apenas no ambiente extracelular. No entanto, esses tetrâmeros e oligômeros maiores complicam a expressão, purificação, caracterização, padronização e seleção da formulação ideal da rhDAO. Portanto, uma cisteína relativamente acessível ao solvente na superfície da DAO foi mutada e, nesse mutante, apenas dímeros da DAO são encontrados no sobrenadante das células CHO.

[155] Construções de DAO, tendo 2 mutações pontuais no domínio de ligação à heparina/ao sulfato-de heparano e uma única mutação numa cisteína distinta, são incorporações específicas.

[156] A tabela a seguir apresenta a DAO recombinante. Mutações de treonina e serina foram preferidas em detrimento da alanina e da glicina para trocar a lisina e a arginina com aminoácidos polares. Isso ajudou a manter a confirmação inalterada.

Tabela 1: Mutações da DAO no domínio de ligação ao GAG com troca de arginina e lisina por serina e treonina Aminoácido Variante da DAO 568 570 571 572 575 WT Arginina Lisina Arginina Lisina Lisina HepMut1 Arg_568_Ser Serina Lisina Arginina Lisina Lisina HepMut2 Lys_575_Thr Arginina Lisina Arginina Lisina Treonina HepMut3 Arginina Lisina Treonina Lisina Lisina Arg_568_Ser; HepMut4 Serina Lisina Treonina Lisina Lisina Arg_571_Thr

52 / 75 HepMut5 Arginina Lisina Treonina Lisina Treonina Arg_568_Ser; HepMut7 Serina Lisina Arginina Lisina Treonina Lys_575_Thr

[157] A mutação HepMut4 apresentou a perda mais forte de ligação à heparina. HepMut6 é uma mutação tripla que substitui 570/571/572 por Gly/Gln/Thr, que está presente em roedores. A glutamina na sequência de roedores também pode se ligar ao sulfato negativamente carregado e, às vezes, pode substituir a arginina ou a lisina. Todos os experimentos com animais foram feitos, até o momento, em roedores (camundongos e ratos).

[158] Abaixo são apresentados os dados de experimentos com heparina-sefarose usando KCl e NaCl para eluir a DAO purificada de tipo selvagem e variantes de HepMut da heparina-sefarose. A heparina é irreversivelmente acoplada à sefarose, e a DAO purificada é incubada em baixas concentrações de sal, seguida por um gradiente linear de concentrações crescentes de KCl ou NaCl. As concentrações de sal com o pico na proteína da DAO (medidas usando absorbância a 280 nm) são usadas como a concentração milimolar (mM) de sal na qual a DAO é eluída.

[159] A Figura 2 apresenta os perfis de eluição de heparina--sefarose da DAO humana recombinante de tipo selvagem (WT) e de mutantes de heparina. As variantes de HepMut são eluídas mais cedo em comparação com a DAO_WT, DAO_WT purificada, e variantes de hepMut foram carregadas numa coluna HiTrap de Heparina de HP (Alto Desempenho) de 1 mL, usando um tampão de 50 mM de HEPES, pH 7,4, e uma vazão de 0,2 mL/min. A eluição foi realizada usando um gradiente linear de 0% a 70% de 50 mM de HEPES com 1 M de cloreto de sódio, pH 7,4, com um tempo de gradiente de 60 minutos; rh = humana recombinante.

Para a eluição do KCl, foram carregadas variantes da rhDAO purificada numa

53 / 75 coluna HiTrap de Heparina HP de 1 mL, usando um tampão de 10 mM de fosfato de potássio, pH 7,2 e uma vazão de 0,2 mL/min. A eluição foi realizada usando um gradiente linear de 0% a 100% de 10 mM de fosfato de potássio com 1 M de cloreto de potássio, pH 7,2, com um tempo de gradiente de 60 minutos. Os perfis de eluição não são apresentados, mas as concentrações de sal no pico de eluição são apresentadas abaixo.

[160] A Tabela 2 e a figura 3 mostram os resultados brutos, mas também normalizados com base em dados que usam a proteína de tipo selvagem-da DAO. A média e o desvio padrão (DP) das duas experiências com sal foram calculados e apresentados como um gráfico de barras. Os números acima das barras correspondem aos números da tabela. Para a DAO_WT, eles representam a concentração de sal da eluição. Para as mutações, é apresentada a diferença para a concentração de sal da DAO_WT.

[161] A DAO_WT foi eluída da heparina-sefarose a 372 mM de NaCl ou 310 mM de concentração de sal de KCl. Os HepMuts foram eluídos em concentrações de sal significativamente mais baixas. O coeficiente de correlação R entre os perfis de eluição de NaCl e KCl é de 97%, com um valor “p” de 0,0056. Portanto, pareceu justificável combinar os dois perfis e calcular uma média com DP. Os DPs mais/menos médios são representados pela altura da barra (média) e pelas barras de erro (DP mais/menos).

Tabela 2: Eluição da DAO_WT e das variantes hepMut de heparina-sefarose em diferentes concentrações de NaCl ou KCl Conc. KCl Conc. % KCl ligado % NaCl ligado % % DP [mM] NaCl [mM] com DAO_WT com DAO_WT Média DAO_WT 310 372 100% 100% 100% 0,0% HepMut1 172 186 56% 50% 53% 3,9%

54 / 75 HepMut2 233 317 75% 85% 80% 7,3% HepMut4 138 175 44% 47% 46% 1,8% HepMut7 164 197 53% 53% 53% 0,1% WT = Tipo Selvagem; Conc. = Concentração; DP = Desvio padrão

[162] A figura 3 apresenta as variantes de HepMut 1, 4 e 7 eluídas da heparina-sefarose em concentrações de sal 50% mais baixas em comparação com a DAO_WT. Os dados são da Tabela 2.

[163] A Tabela 3 apresenta o delta da concentração de sal da DAO_WT em relação aos mutantes para NaCl e KCl. Por exemplo, 200 mM significa que foram necessários 200 mM a menos de NaCl para eluir o mutante da heparina-sefarose em comparação com a DAO_WT.

Tabela 3: As variantes HepMut são eluídas em concentrações significativamente mais baixas de NaCl ou KCl em comparação com a proteína DAO de tipo selvagem a partir da heparina-farose Delta de mM de KCl Delta de mM de NaCl da da DAO DAO DAO_WT 0 0 HepMut1 138 186 HepMut2 78 55 HepMut4 172 197 HepMut7 147 175

[164] Com base nesses dados, o HepMut4 pode ser o mutante mais fraco de ligação à heparina-, mas a diferença para o HepMut1 e o HepMut7 não é significativa.

A mutação de um único resíduo de lisina em HepMut2 reduz a afinidade pela heparina-sefarose.

[165] O soro e o plasma contêm aproximadamente 145 a 150 mM de Na + e K+ combinados e íons de 100 mM de Cl–. A eluição das variantes HepMut1, 4 e 7 da

55 / 75 heparina-sefarose está próxima da concentração fisiológica de íons no soro e, portanto, esses mutantes devem ser minimamente ativos in vivo, e este é o caso in vitro, cf. mostrado abaixo, usando células, e in vivo em ratos e camundongos.

[166] Estes dados mostram claramente que a DAO se liga à heparina por meio do domínio de ligação à heparina/ao sulfato de heparano. Para colocar esses resultados num contexto maior, a mutação de 1 a 2 resíduos de arginina/lisina entre 48 lisinas e 88 aminoácidos de arginina na sequência da DAO (e a maioria deles são expostos à superfície) quase abole a ligação à heparina, embora, usando HepMut4 com duas mutações de argininas, apenas 2/88 = 2,3% dos resíduos de arginina tenham sofrido mutação.

[167] A depuração da DAO_WT em camundongos e ratos é significativamente mais rápida em comparação com as variantes HepMut. Foi pressuposto que o domínio de ligação à heparina-está envolvido na redução dos valores da Área Sob a Curva (AUC). Os mutantes com ligação à heparina apresentam eluição da heparina-sefarose em concentrações de sal mais baixas, implicando que a ligação à heparina ou ao sulfato de heparano é reduzida.

[168] No conjunto de experimentos seguinte, foi constatado que a DAO não apenas se liga às células endoteliais, mas também é realmente internalizada e apresenta coloração vesicular dentro das células. As variantes de HepMut não são mais internalizadas pelas células endoteliais. As células endoteliais são as primeiras células (exceto as células do sangue) expostas à DAO após a administração intravenosa. Elas estão em contato direto com o sangue. Elas também ficam expostas à DAO após a administração subcutânea porque a DAO será transportada pelo do sistema linfático até o compartimento do sangue.

[169] Após a incubação com DAO_WT e variantes HepMut, a microscopia

56 / 75 de imunofluorescência de células-SK-Hep1 (uma linha celular imortal semelhante a células endoteliais) de um paciente com câncer de fígado mostrou que a internalização de variantes HepMut foi inibida. As células SK-Hep1 foram incubadas durante 60 minutos com 20 µg/mL da DAO humana recombinante purificada e variantes HepMut (controle negativo = sem adição de rhDAO) foram incubadas a 37 °C, lavadas duas vezes com 150 mM de tampão de glicina com 150 mM de cloreto de sódio, pH 3,0, e uma vez com PBS para eliminar a DAO ligada à membrana. Após a fixação e permeabilização, as células foram incubadas com uma diluição a 1:500 do anticorpo anti-ABP1 (ABP1 = proteína de ligação a amilorida 1, nome alternativo da DAO) produzido em coelhos (Sigma Aldrich). Uma diluição a 1:500 de Alexa Fluor 488 de burro anti-coelho (H+L) (Jackson Research, 711-545-152) foi usada como anticorpo secundário. Foi usado DAPI para contra- coloração dos núcleos. As células foram analisadas por microscopia de fluorescência num microscópio invertido DMI-6000B equipado com uma objetiva de imersão em glicerol HCX PL APO 63x/1,30 e conjuntos de filtros A4 (para DAPI) e L5 (para Alexa Fluor 488) (Leica Microsystems). Resultados análogos foram obtidos usando HUVEC = células endoteliais da veia umbilical humana, as células endoteliais (CE) prototípicas usadas para pesquisa de CE.

[170] As variantes HepMut4 e HepMut7 mostraram retenção acentuadamente reduzida nas células SK-Hep1, enquanto a HepMut1 causou alguma coloração semelhante à coloração de tipo vesicular da DAO_WT. Esses resultados não apenas demonstraram que as variantes HepMut da DAO bloqueiam a retenção nas CEs, mas também, pela primeira vez, que a DAO é internalizada pelas células. Foi demonstrado que DAO se liga à superfície das CEs, e foi localizada DAO dentro das células, mas a incubação de células com DAO e a prova de que a DAO_WT é internalizada implicam

57 / 75 na existência de um receptor de DAO. Foi confirmado que a DAO se liga aos glicosaminoglicanos de sulfato de heparano presentes nas CEs (a heparina está presente apenas em mastócitos no corpo humano) e as variantes HepMut não são mais capazes de se ligar de forma eficiente e, portanto, não são internalizadas. Isso também se reflete nos dados in vivo de ratos e camundongos aqui descritos.

[171] Os dados de imunofluorescência discutidos acima também foram refletidos nos dados de Western blotting. Há uma diferença de mais de 6 vezes no sinal de Western blotting de HepMut4 e HepMut7 em relação à DAO_WT e ao HepMut1. Esses dados estão de acordo com os dados de imunofluorescência.

HepMut4 e HepMut7 não foram internalizados pelas células SK-Hep1.

[172] A figura 4 mostra um Western blot de lisados de células SK-Hep1 após incubação com DAO_WT e variantes de HepMut. Faixa 1: Controle negativo, 2: rhDAO_WT, 3: HepMut1, 4 de rhDAO: HepMut4, 5 de rhDAO: HepMut7 de rhDAO. As células SK-Hep1 foram incubadas a 37 °C durante 60 minutos com 20 µg/mL da das respectivas variantes de DAO purificada (controle negativo = sem adição de rhDAO), lavadas duas vezes com 150 mM de tampão de glicina com 150 mM de cloreto de sódio, pH 3,0, e uma vez com PBS para eliminar a DAO ligada à membrana. As células foram, então, lisadas com tampão RIPA e banho ultra-sônico. Os lisados celulares foram carregados num gel de SDS-PAGE, seguido por blotting numa membrana de PVDF. A membrana foi incubada após bloqueio com uma diluição a 1:1000 de uma fração de IgG sérica de coelhos imunizados com rhDAO purificada. Esta etapa foi seguida por incubação com uma diluição de β-actina mABAC-15 (Invitrogen) a 1:5000. Diluições a 1:5000 de IRDye®800CW de anticorpo secundário de cabra anti-IgG de coelho (H+L) e de IRDye®680RD de cabra anti-IgG de camundongo (H+L) (Li-Cor) foram usadas

58 / 75 como anticorpos secundários. A membrana foi lida a 700 e 800 nm usando o Odyssey Infrared Imaging System (Li-Cor). B. As intensidades das faixas foram determinadas em referência à rhDAO_WT purificada (não mostrada) e usadas para calcular a quantidade de rhDAO internalizada.

[173] A ligação da DAO_WT e das variantes HepMut4 a células SK-Hep1 num ensaio in vitro é aproximadamente 5-vezes menor. A DAO foi marcada com o corante fluorescente Alexa488 nos glicosaminoglicanos e incubada com células SK-HEP1.

Esse ensaio é realizado em placas de microtitulação. O sinal fluorescente é medido após lavagem e lise celular.

[174] Na figura 5, a variante HepMut4 mostra ligação reduzida a células SK-Hep1 em comparação com a DAO_WT.

[175] As células SK-Hep1 foram cultivadas numa placa de 96-cubas e incubadas com 0 a 8 µg/mL de rhDAO_WT e rhDAO-HepMut4 marcadas com Alexa488, por 60 minutos, a 37 °C. As células foram lavadas duas vezes com 150 mM de tampão de glicina com 150 mM de cloreto de sódio, pH 3,0, e uma vez com PBS, para eliminar a DAO ligada à membrana. Após a lise celular usando o tampão RIPA, as intensidades de fluorescência foram determinadas usando um leitor de placas Tecan. As médias de triplicatas com os erros padrão da média (EPM) são mostradas.

[176] Também foi testada a ligação da DAO_WT e da HepMut4 à heparina de alto e baixo peso molecular (HMWH, LMWH) usando Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC), o instrumento de última geração para a determinação de afinidades de ligação sem marcadores.

[177] A Figura 6 apresenta os dados de da DAO_WT e da HepMut4.

[178] 12,5 µM de rhDAO_WT purificada e 12,0 µM de rhDAO-HepMut4

59 / 75 purificada foram submetidos a calorimetria de titulação isotérmica (MicroCal PEAQ-ITC, Malvern) usando injeções de 25 x 1 µL de 160 µM de heparina de alto peso molecular (HMWH, Gilvasan, peso molecular médio = 15 kDa) e heparina de baixo peso molecular (LMWH, Lovenox, peso molecular médio = 4,5 kDa). O tampão usado foi 50 mM de HEPES com 150 mM de KCl, pH 7,3. A ligação foi observada apenas para rhDAO_WT e HMWH com um valor de K D de 423 nM.

[179] Ambos os componentes (a proteína DAO e as duas moléculas de heparina) ficaram inalterados e não foram imobilizados. Isso permitiu a determinação das verdadeiras afinidades de ligação. A heparina-sefarose representa uma matriz multivalente na qual as moléculas deslizam de uma molécula de heparina para outra.

A DAO_WT se ligou à HMWH com um Kd de 423 nM, enquanto a HepMut4 não se ligou à HMWH. A DAO_WT também não se ligou à LMWH.

Injeção intravenosa de DAO_WT e HepMut4 em camundongos C57BL6

[180] A DAO_WT e a proteína HepMut4 foram injetadas a 1 mg/kg na veia da cauda de camundongos C57BL6 com peso corporal de aproximadamente 20 gramas.

As concentrações de proteína e a atividade enzimática das duas variantes de DAO purificadas eram comparáveis. A purificação de proteínas foi realizada conforme publicado recentemente (Gludovacz 2016). As escalas lineares e logarítmicas do eixo “y” são apresentadas.

[181] A figura 7 apresenta as escalas linear (a) e logarítmica “y” (b). A HepMut4 aumenta em mais de 19-vezes a AUC (Área Sob a Curva) em comparação com a proteína da DAO de tipo selvagem-após injeção intravenosa de 1 mg/kg de variantes da DAO. São apresentados os valores medidos (n = 3 a 4 camundongos por ponto no tempo) mais/menos desvios padrão. As concentrações de DAO foram medidas usando nosso ELISA desenvolvido ternamente para DAO humana, que não

60 / 75 reconhece a DAO de camundongo nem de rato (Boehm 2017). Os dados de meia- vida e AUC estão resumidos na tabela a seguir.

Tabela 4: A AUC aumenta 19 vezes em camundongos tratados com HepMut4 versus DAO_WT após administração intravenosa Minutos de meia- AUC µg*min/mL§ vida* DAO_WT 76,1 76 HepMut4 192,1 1468 Proporção de HepMut4 para 2,5 19,4 DAO_WT *Calculada de 60 a 1680 minutos §AUC = Área sob a curva; Calculada de 10 a 1680 minutos

[182] A meia-vida foi calculada de 60 a 1680 minutos para excluir a meia-vida de distribuição alfa rápida usando a DAO_WT, que é de aproximadamente 10 minutos.

Usando a variante HepMut4, essa depuração muito rápida da DAO da circulação é mais ou menos ausente. Há um elevado ajuste de curva usando uma função de decaimento monoexponencial-de 60 a 1680.

Injeção intraperitoneal de DAO_WT e HepMut4 em camundongos C57BL6

[183] A DAO_WT e a proteína HepMut4 foram injetadas intraperitonealmente a 1 mg/kg em camundongos com peso corporal de 21 gramas. Como mostra a Figura 8, a HepMut4 aumenta em mais de 16-vezes a AUC (Área Sob a Curva) em comparação com a proteína da DAO_WT após injeção intraperitoneal. Cada ponto no tempo representa a média de 3 camundongos e, portanto, no total, foram usados 15 camundongos DAO_WT e 15 camundongos HepMut4. As médias com os desvios padrão são apresentadas. As concentrações de DAO foram medidas usando um ELISA para DAO humana, publicado recentemente (Boehm 2017). Os dados da AUC estão resumidos na tabela a seguir. Os dados de meia-vida não estão incluídos porque

61 / 75 precisaríamos pressupor que a absorção da DAO_WT e HepMut4 do espaço intraperitoneal é igual, e isso pode não ser observado na prática.

Tabela 5: A AUC aumenta 16-vezes em camundongos tratados com HepMut4 versus DAO_WT.

AUC µg*min/mL§ DAO_WT 41,2 HepMut4 666,3 Proporção de HepMut4 para 16,2 DAO_WT §AUC = Área sob a curva; Calculada de 0 a 1440 minutos Injeção intravenosa de DAO_WT e HepMut1, 4 e 7 em ratos

[184] A Figura 9 apresenta as médias dos valores medidos mais/menos o desvio padrão (DP) usando 1 mg/kg de DAO tipo selvagem-e diferentes variantes de HepMut. Depuração lenta de mutantes do domínio de ligação à heparina-em comparação com a proteína da DAO de tipo selvagem-administrada a 1 mg/kg.

DAO_WT n = 9; HepMut1 n = 4; HepMut4 n = 5; HepMut7 n = 4; Escala linear do eixo y-. As médias com os DPs são apresentadas.

[185] A figura 10 apresenta a depuração lenta de mutantes do domínio de ligação à heparina-em comparação com a proteína da DAO de tipo selvagem-administrada a 1 mg/kg. DAO_WT n = 9; HepMut1 n = 4; HepMut4 n = 5; HepMut7 n = 4; Escala logarítmica do eixo y-. As médias com os DPs são apresentadas.

[186] A DAO_WT e a HepMut7 apresentam uma meia-vida alfa rápida, e são usadas duas equações para derivar a curva de melhor ajuste. No entanto, a meia-vida alfa da HepMut7 é significativamente mais longa em comparação com a da DAO_WT.

As meias-vidas são apresentadas abaixo. Para HepMut1 e HepMut4, o decaimento

62 / 75 monoexponencial apresenta o melhor ajuste com o R quadrado ajustado mais alto e o valor “p”-mais baixo. Isso também pode ser visto na figura com os dados originais.

[187] A Figura 11 apresenta as curvas que usam as diferentes equações exponenciais derivadas. Essas curvas foram usadas para calcular as AUCs e as meias-vidas apresentadas posteriormente.

[188] Figura 11: Depuração lenta de mutantes do domínio de ligação à heparina-em comparação com a proteína da DAO de tipo selvagem-administrada a 1 mg/kg. DAO_WT n = 9; HepMut1 n = 4; HepMut4 n = 5; HepMut7 n = 4; Escala logarítmica-do eixo y; essas curvas foram geradas usando as equações exponenciais de melhor ajuste.

[189] As Figuras 12, 13 e 14 apresentam os primeiros 90 minutos para ver a depuração rápida com o uso da proteína DAO de tipo selvagem.

[190] A figura 12 apresenta a depuração lenta de mutantes do domínio de ligação à heparina-em comparação com a proteína da DAO de tipo selvagem-administrada a 1 mg/kg. DAO_WT n = 9; HepMut1 n = 4; HepMut4 n = 5; HepMut7 n = 4; Escala logarítmica do eixo y-; apenas os primeiros 90 minutos são apresentados.

[191] Abaixo estão as versões lineares do eixo “y” dessas figuras.

[192] A figura 13 apresenta a depuração lenta de mutantes do domínio de ligação à heparina-em comparação com a proteína da DAO de tipo selvagem-administrada a 1 mg/kg. DAO_WT n = 9; HepMut1 n = 4; HepMut4 n = 5; HepMut7 n = 4. As curvas foram geradas usando as equações exponenciais de melhor ajuste; Escala linear do eixo “y” -.

[193] A figura 14 apresenta a depuração lenta de mutantes do domínio de ligação à heparina-em comparação com a proteína da DAO de tipo

63 / 75 selvagem-administrada a 1 mg/kg. DAO_WT n = 9; HepMut1 n = 4; HepMut4 n = 5; HepMut7 n = 4; Escala linear do eixo y; apenas os primeiros 90 minutos são apresentados; Escala linear do eixo y-.

[194] Por causa da meia-vida alfa rápida em ratos tratados com DAO_WT, calculamos as AUCs a partir de 0, mas também de 5 minutos a 240 e 1440 minutos.

Os pontos de dados em 10 minutos são, provavelmente, bastante variáveis. Os dados estão resumidos nas tabelas a seguir.

Tabela 6: A AUC aumenta nos mutantes de ligação à heparina-versus ratos tratados com DAO_WT DAO tipo HepMut1 HepMut4 HepMut7 selvagem-(n = 9) (n=4) (n=5) (n=4) AUC_0-1440 270 1554 3829 2165 µg/mL/min AUC_0-240 238 797 1550 1010 µg/mL/min AUC_5-1440 116 1531 3788 2113 µg/mL/min AUC_5-240 84 774 1509 958 µg/mL/min

[195] Para as variantes de HepMut, 0 a 1440 ou 5 a 1440 minutos não fazem nenhuma diferença relevante, mas, para a proteína DAO de tipo selvagem-, o começo aos 5 minutos reduziu significativamente a AUC. As concentrações calculadas de DAO, usando as equações exponenciais de melhor ajuste, estão acima das concentrações teóricas de DAO e, portanto, não são possíveis. O aumento acentuado das AUCs também é visto claramente usando-se a janela de tempo de 0 a 1440 minutos.

[196] Também neste conjunto de experimentos, a variante HepMut4 apresenta o efeito mais acentuado. Isso também se reflete nos dados de meia-vida.

Tabela 7: A AUC aumento entre 3 e 33-vezes em mutantes que se ligam a heparina-versus ratos tratados com DAO_WT; o HepMut4 apresenta o maior aumento.

64 / 75 DAO tipo HepMut1 HepMut4 HepMut7 selvagem-(n = 9) (n=4) (n=5) (n=4) AUC_0-1440 1,0 5,8 14,2 8,0 AUC_0-240 1,0 3,4 6,5 4,2 AUC_5-1440 1,0 13,2 32,6 18,2 AUC_5-240 1,0 9,2 17,9 11,4 Tabela 8: Depuração da meia-vida alfa muito rápida na DAO tipo selvagem-e aumento da meia-vida beta em mutantes de ligação à heparina-.

t1/2 alfa minutos t1/2 beta minutos DAO_WT 1,9 162 HepMut1 na 214 HepMut4 na 343 HepMut7 42 297 na = não se aplica

[197] Em conclusão, as mutações no domínio presumido de ligação da DAO à heparina-aumentam acentuadamente a AUC em ratos após injeção intravenosa de 1 mg/kg de peso corporal. O mutante de melhor desempenho é o mutante duplo HepMut4 com 2 argininas retiradas. Isso se ajusta bem aos dados de previsão e eluição da heparina-sefarose.

Exemplo 2 Fc-DAO com domínio de ligação ao GAG modificado:

[198] As variantes de fusão da Fc-DAO também foram testadas com as mutações de ligação à heparina, e os parâmetros de FC melhoraram ainda mais com uma meia-vida beta de 9 horas e AUC maior. Os aminoácidos envolvidos na interação de alta afinidade com o receptor Fc_gamma foram retirados, e os aminoácidos envolvidos na interação com FcRN não foram alterados.

Injeção intravenosa de Fc-DAO_WT e Fc-DAO-HepMut4 em ratos

[199] Abaixo são apresentados os resultados de 6 e 4 ratos após injeção

65 / 75 intravenosa de 1 mg/kg de Fc-DAO de tipo selvagem-e da proteína Fc-HepMut4, usando escalas lineares e logarítmicas. Medimos apenas por 4 horas usando a Fc- DAO de tipo selvagem-. No entanto, a função exponencial derivada pode ser usada para extrapolar para 1680 minutos, como foi medida usando a variante Fc-HepMut4 (veja abaixo). A proteína de fusão Fc-DAO apresenta, de forma semelhante à proteína DAO de tipo selvagem, uma meia-vida de distribuição alfa muito rápida. A maior parte da variante de fusão é retirada do plasma em 20 minutos. Depois disso, a meia-vida é de aproximadamente 120 minutos, calculada usando os valores de pontos no tempo 30, 120 e 240.

[200] A Fc-HepMut4 é muito mais estável no plasma. O mecanismo de depuração da DAO é claramente predominante sobre a parte Fc. A meia-vida das IgGs humanas em ratos é de vários dias, e essa meia-vida é determinada principalmente pela ligação da parte Fc ao receptor FcRN.

[201] A figura 15 apresenta a depuração rápida de Fc-DAO do tipo selvagem em comparação com Fc-HepMut4 administrada a 1 mg/kg em 6 ou 4 ratos, respectivamente. As médias com os desvios padrão são apresentadas; Escala linear do eixo y-.

[202] A figura 16 apresenta a depuração rápida de Fc-DAO do tipo selvagem em comparação com Fc-HepMut4 administrada a 1 mg/kg em 6 ou 4 ratos, respectivamente. As médias com os desvios padrão são apresentadas; Escala logarítmica do eixo y-.

[203] Ambos os conjuntos de dados podem se ajustar melhor a uma função de decaimento monoexponencial com valores “p” menores que 0,001 e valores de R quadrado ajustados > 97%. Para a proteína Fc-DAO de tipo selvagem-, a meia-vida após 30 minutos foi calculada como sendo de 120 minutos, com base nos dados dos

66 / 75 pontos no tempo 30, 120 e 240 minutos. Um ajuste bifatorial de curva exponencial de decaimento não convergiu. As equações de melhor ajuste são usadas para extrapolar os dados de Fc-DAO para 24 horas. As curvas são apresentadas abaixo.

[204] Na figura 17, a Fc-DAO-HepMut4 apresenta um aumento acentuado da AUC após a administração intravenosa a 1 mg/kg; Escala logarítmica do eixo y-.

[205] Na figura 18, a Fc-DAO-HepMut4 apresenta um aumento acentuado da AUC após a administração intravenosa a 1 mg/kg; Escala linear do eixo y-.

[206] As áreas sob as curvas foram calculadas de 0 e 5 minutos a 240 ou 1440 minutos após a injeção intravenosa. O ajuste da curva nos primeiros minutos gerou em valores muito elevados em 0 minutos nos dados de Fc-DAO e, portanto, também calculamos a AUC começando em 5 minutos.

Tabela 9: A AUC é acentuadamente maior em ratos tratados com Fc-HepMut4 versus ratos tratados com Fc-DAO_WT Fc-DAO tipo Fc-HepMut4 selvagem-(n = (n=4) 6) AUC_0-1440 157 2751 µg/mL/min AUC_0-240 142 1057 µg/mL/min AUC_5-1440 69 2723 µg/mL/min AUC_5-240 54 1028 µg/mL/min

[207] As razões das AUCs são apresentadas nas tabelas abaixo, seguidas de uma tabela com as meias-vidas calculadas.

Tabela 10: As AUCs da Fc-HepMut4 versus Fc-DAO_WT são de 7 a 40-vezes maiores Fc-DAO tipo Fc_HepMut4 selvagem-(n=6) (n=4) AUC_0-1440 1,0 17,6 AUC_0-240 1,0 7,4 AUC_5-1440 1,0 39,5

67 / 75 AUC_5-240 1,0 19,0 Tabela 11: A meia-vida alfa rápida da Fc-DAO_WT é eliminada em ratos tratados com Fc-HepMut t1/2 alfa minutos t1/2 beta minutos* Fc_DAO_WT 1,7 120 Fc_HepMut4 na 268 * Começando 30 minutos após a injeção intravenosa

[208] As variantes Fc-HepMut4 são mais estáveis no plasma em comparação com a Fc-DAO. Isso está de acordo com os dados de camundongos e ratos usando variantes de DAO sem-fusão. No entanto, a meia-vida da Fc-HepMut4 ainda é bastante curta em comparação com os anticorpos IgG. A depuração de DAO parece ainda predominante sobre os mecanismos de depuração de Fc mais lentos.

Exemplo 3 DAO com domínio de ligação ao GAG modificado e cys123 modificada:

[209] As cisteínas 123 e 633 não estão envolvidas na formação da ligação ao dissulfeto do dímero DAO.

[210] A área de superfície acessível relativa ou a acessibilidade relativa ao solvente (RSA) de um resíduo de proteína é uma medida da exposição ao solvente do resíduo.

Pode ser calculada pela fórmula: RSA = ASA/MaxASA, onde ASA é a área de superfície acessível ao solvente e MaxASA é a área máxima possível de superfície acessível ao solvente, ou o resíduo. Tanto ASA quanto MaxASA costumam ser medidas em Å².

RSA Cys123 Cys123 = 93,84 Å² acessível de 148 Å2 = 63,4% (monômero B) Cys123 = 90,72 Å² acessível de 148 Å² = 61,3% (monômero A) Média = 62,4% RSA Cys633

68 / 75 Cys633 = 34,62 Å2 acessível de 148 = 23,4% (monômero B) Cys633 = 33,49 acessível de 148 = 22,6% (monômero A) Média = 23%

[211] Cys123 está na superfície, e isso é incomum. O aminoácido cisteína é o mais raro e o “menor e mais alto” aminoácido conservado em proteínas (Marino SM e Gladyshev VN, J Mol Biol. 2010 Dez 17;404(5):902-16), provavelmente porque está disponível para oxidação. A DAO produz peróxido de hidrogênio, que pode causar exatamente essa oxidação da cys123 e, portanto, pode formar uma ligação de dissulfeto que pode perturbar gravemente a função. Ela é altamente conservada em enzimas como aminoácido catalítico e se estiver envolvida na formação de ligações de dissulfeto, como também é o caso na DAO. A Cys633 está mais profundamente inserida na estrutura e menos acessível, e talvez não desempenhe um papel na formação de agregados. Ela pode desempenhar um papel em altas concentrações de DAO.

[212] Como um dímero DAO tem dois aminoácidos Cys123 acessíveis, um dímero pode formar uma ponte de dissulfeto com outro dímero, criando um tetrâmero, mas também pode interagir com dois dímeros, formando um hexâmero, etc. O peso molecular da DAO sem o sinal de secreção, puramente com base nos aminoácidos (732), seria 166872 Da no caso do dímero. O do tetrâmero seria 333744 Da; do hexâmero, 500617 Da; e do octâmero, 667489 Da, mas os glicanos provavelmente aumentarão esse peso em aproximadamente 25% (Elmore, 2002). A altura de um monômero ou dímero DAO é de aproximadamente 65 Å, mas ela aumenta para 130 Å no tetrâmero e 195 Å e 260 Å no hexâmero e octâmero, respectivamente. Não temos dados sobre a estrutura da pilha multimérica da DAO. O agregado pode ser rígido ou flexível. Esses agregados são certamente mais imunogênicos porque neoepítopos

69 / 75 podem ser criados entre dois dímeros e repetidos 2 ou 3 vezes com potenciais e prováveis consequências negativas sobre a consequências eficácia e a segurança (vide abaixo).

Tabela 12: Peso molecular do monômero DAO para o octâmero, usando 25% de peso de glicano 732 732 aa mais Altura da DAO Comprimento aminoácidos glicanos 25% nm da DAO nm (aa) Monômero 83436 104295 6,5 10,0 Dímero 166872 208590 6,5 10,0 Tetrâmero 333744 417180 13,0 10,0 Hexâmero 500616 625770 19,5 10,0 Octâmero 667488 834360 26,0 10,0

[213] Foram descritos agregados de ordem superior da DAO. Paolucci et al (Biochimie. 1971; 53(6): 735-49) publicou que o peso molecular da DAO da placenta humana é composto por 1-4 múltiplos de 125 kDa +/- 5 ou, em outras palavras, 125, 250, 375 e 500 kDa. Tufvesson (Scand J Clin Lab Invest. 1978 Set; 38(5):463-72) publicou uma DAO de peso molecular de 245 e 485 kDa, novamente após a purificação do líquido amniótico humano correspondente ao dímero e ao tetrâmero.

Wilfingseder et al. (Inflamm Res. 2002 Abr;51 Supl 1:S89-90) mostrou uma “formação de complexo” de DAO da placenta humana usando Western blotting.

[214] Diferentes plasmídeos que expressam a DAO-foram transfectados em células ExpiCHO para expressão transiente. O Western blotting foi realizado diretamente nos sobrenadantes após 7 dias de cultura. Os resultados são apresentados na Figura 19.

[215] Figura 1: faixa 1: Padrão HiMark; faixa 2: Controle Negativo (plasmídeo vazio); faixa 3: rhDAO_WT; faixa 4: rhDAOΔ123; faixa 5: rhFc-DAO; faixa 6: rhFc- DAOΔ123; faixa 7: rhDAO-HepMut4; faixa 8: rhDAO-HepMut4Δ123; faixa 9: rhFc-

70 / 75 DAO-HepMut4; faixa 10: rhFc-DAO-HepMut4Δ123. rhFc = proteína de fusão Fc humana recombinante com DAO; foram carregados 15 µL de cada sobrenadante de cultura. O SDS-PAGE foi realizado em condições não redutoras. Anticorpo: Soro de coelho MUV #408, 1:5000.

[216] A mutação da Cys123 para Ala123 evitou completamente a tetramerização e a formação de agregados de ordem superior das variantes DAO humana recombinante de tipo selvagem e HepMut4. Não há efeitos sobre as construções de fusão rhFc-DAO. Isso implica que a formação de agregados nessas variantes de fusão Fc não é causada pela Cys123, mas mais provavelmente pela parte Fc, que também contém cisteínas.

[217] Sob condições redutoras com o uso de mercaptoetanol, as ligações de dissulfeto são abertas e nenhum tetrâmero nem agregados de ordem superior são vistos nem na DAO de tipo selvagem nem em HepMuts ou variantes de fusão. O peso molecular está entre 71 e 117, e seria previsto, com base apenas nos aminoácidos, como sendo 83,436 Da. Esses dados comprovam claramente que a mutação cys123 para ala123 impede completamente a tetramerização e variantes n-méricas de ordem superior da DAO. A Cys633 não está envolvida.

[218] A intensidade do sinal de cada faixa foi determinada usando o software ImageJ para quantificar aproximadamente a porcentagem de variantes n-méricas superiores. Para comparar o WT e as faixas mutantes cys123 correspondentes, foram selecionadas áreas de tamanhos iguais (conforme indicado) e um perfil de sinal foi gerado. Foi calculada a área sob a curva (AUC) de cada faixa.

Tabela 13: Quantificação do efeito da mutação ala123 na formação de agregados em duas réplicas

71 / 75 Réplica 1 Réplica 2 Sinal Porcentagem Sinal Porcentagem rhDAO_WT 77693 100% 68048 100% rhDAO_Ala123 66523 86% 57007 84% rhDAO_HepMut4 76456 100% 67066 100% rhDAO_HepMut4_Ala123 56045 73% 55377 83% rhDAO WT menos Ala123 11170 14% 11041 16% HepMut4 WT menos Ala123 20411 27% 11689 17% Média 19% DP 5,5% rhFc-DAO 70709 100% 64270 100% rhFc-DAO_Ala123 61878 88% 69892 109% rhFc-DAO-HepMut4 56134 100% 66383 100% rhFc-DAO-HepMut4_Ala123 57673 103% 82826 125% rhFc-DAO WT menos Ala123 8831 12% -5622 -9% rhFc-HepMut4 WT menos -1538 -3% -16443 -25% Ala123 Média -6% DP 15,4%

[219] A diferença média (DP) entre a Cys123 e a mutação Ala123 é, em média, os dados combinados das réplicas 1 e 2 de aproximadamente 19% (5,5%) para WT e o mutante HepMut4. Para as variantes da Fc-DAO, a diferença média (DP) é de -6% (15,4%) ou, em outras palavras, a mutação de cys123 para ala123 não é diferente.

[220] Portanto, a mutação da ala123 tem vantagem significativa para a fabricação e o controle de qualidade em geral, mas também para a redução da imunogenicidade e, portanto, essa mutação também é altamente relevante do ponto de vista clínico. É bem conhecido que os agregados são mais imunogênicos e, portanto, usando essa mutação, a imunogenicidade da rhDAO será menor.

[221] Os sobrenadantes foram testados quanto à atividade da DAO, usando um ensaio padrão de atividade de DAO, cf. descrito em Bartko (Alcohol. 2016 Ago;54:51-9.) ou em Gludovacz 2016. Foi confirmado que, neste caso, não há

72 / 75 nenhum efeito da mutação de cys123 para ala123 na atividade da DAO. A Figura 20, apresenta a atividade da DAO. A WT DAO, a HepMut4 ou as variantes Fc são definidas em 100% e comparadas com os mutantes de cys123 para ala123. É demonstrado que nenhuma diferença significativa na atividade de DAO entre a DAO_WT e as mutações cys123.

Exemplo 4 Geração de mutantes de glicosilação Asn168 Mutagênese da Asn-168 dirigida ao sítio

[222] Para substituir a asparagina no sítio de N-glicosilação Asn-168 (AAT) por glutamina (CAG), o respectivo códon no plasmídeo de expressão da DAO (Gludovacz E. et al., 2016, J. Biotechnol., 227, 120-130) passou por mutação, usando mutagênese dirigida ao sítio. Portanto, uma PCR foi conduzida usando os seguintes primers 5- fosforilados: Asn-168, CAGaccacaggcttctcattc (direto, SEQ ID NO:104) e gaggaagaactgatgcag (reverso, SEQ ID NO:105). A polimerase Phusion (Thermo Fisher Scientific) foi usada: temperatura de recozimento: 56,3 °C; tempos de alongamento, 4 min por 30 ciclos. Foram realizadas a ligação (ligase de DNA T4, New England Biolabs) e a amplificação dos plasmídeos finais. A exatidão da sequência foi verificada por sequenciação de DNA (Eurofins MWG Operon). Todas as técnicas de clonagem foram conduzidas de acordo com Green MR e Sambrook, J. (2012), Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; e de acordo com as instruções do fabricante.

Administração intravenosa de rhDAO, proteínas concorrentes e mutantes de glicosilação em ratos e camundongos

[223] Os protocolos experimentais para o tratamento de ratos e camundongos foram aprovados pelo Comitê de Bem-Estar Animal local e pelo Ministério Federal da

73 / 75 Ciência, Pesquisa e Economia (GZ 66.009/0152-WF/V/3b/2014) e conduzidos em total conformidade com as diretrizes ARRIVE (Kilkenny, C et al., Br. J. Pharmacol.

(2010) 160, 1577–1579). Para implantar um acesso vascular na Vena jugularis (acesso vascular para roedores com cateter silástico destacável, Hugo-Sachs Elektronic-Harvard Apparatus), os ratos são anestesiados por injeção intraperitoneal de cetamina (100 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg). Após a intubação, a anestesia é mantida por meio de ventilação contínua com controle de volume (mistura O2-ar + 1,5% de isoflurano). O pelo é depilado na área da cirurgia e posteriormente desinfetado com solução de iodo (Betaisodona, Mundipharma). Metamizol (100 mg/kg) é administrado por via subcutânea para analgesia. É feita uma incisão cutânea de aproximadamente 1 cm no dorso dos animais para colocação do balão do acesso vascular por via subcutânea. O acesso é lavado com solução salina antes que o balão seja fixado com suturas entre as escápulas. Uma segunda incisão na pele é feita no sítio da V. jugularis sinistra para dissecar a V. jugularis para cateterização. Uma pequena incisão é colocada na V. jugularis sinistra exposta, e o cateter é inserido e fixado com fios de seda (7-0). O tecido subcutâneo e a pele são fechados com suturas simples interrompidas (4-0). A cirurgia é realizada de forma asséptica. O tempo médio de cirurgia é de aproximadamente 2 horas. A analgesia pós-operatória é realizada por água potável ad libitum com piritramide e glicose (30 mg de piritramide e 10 mL de glicose a 10% em 250 mL de água potável). Durante os experimentos, o acesso vascular é preenchido com uma solução contendo 10 µg/mL de argatroban (Argatra 100 mg/mL; Mitsubishi Pharma), 0,3 µg/mL de ativador de plasminogênio tecidual (Alteplase, Actilyse, Boehringer Ingelheim) e 0,38% de citrato de sódio em NaCl a 0,9% para prevenir a coagulação.

[224] As retiradas de sangue venoso (0,5 mL) são realizadas em pontos

74 / 75 predefinidos no tempo, sob anestesia curta com isoflurano em tubos contendo citrato de sódio para anticoagulação. O plasma é preparado em 4 horas e armazenado a -32 °C até a análise. A substituição de fluidos (0,5 mL) por soro fisiológico (NaCl a 0,9%) é administrada aos animais. Os animais são sacrificados após o último ponto de coleta de sangue sob anestesia profunda com cetamina-xilazina (35 mg e 5 mg/kg) por meio de uma sobredosagem de pentobarbital (300 mg/kg). Estão incluídos ratos machos (Sprague-Dawley) com aproximadamente 400 gramas e ratos fêmeas (C57BL/6N) com aproximadamente 20 g de peso corporal.

[225] Os ratos Sprague Dawley machos são adquiridos de vendedores comerciais (Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, França e Laboratório da Divisão de Ciência e Genérica Animal da Universidade Médica de Viena, Himberg, Áustria). Os animais são alojados em condições controladas e padronizadas (ciclo L/E artificial 12:12, temperatura ambiente 22 ± 2 °C, umidade 45 ± 10%). Os animais são mantidos em grupos de dois (gaiolas Makrolon 3) e recebem enriquecimento ambiental. Os animais têm acesso ad libitum à água e à alimentação completa para ratos (Alleinfutter für Ratten und Mäuse sniff R/MH; sniff Spezialdiäten GmbH).

[226] Os camundongos fêmeas (C57BL/6N) são obtidos de um vendedor comercial (Charles River Laboratories, Sulzfeld, Alemanha e Laboratório da Divisão de Ciência e Genérica Animal da Universidade Médica de Viena, Himberg, Áustria).

Os animais são alojados em condições controladas e padronizadas (ciclo L/E artificial 12:12, temperatura ambiente 22 ± 2 °C, umidade 45 ± 10%). Os animais são mantidos em grupos de cinco (gaiolas longas de Makrolon 2) e têm acesso ad libitum à água e à alimentação completa para camundongos, conforme descrito acima para ratos.

Depuração plasmática rápida de rhDAO em ratos e camundongos após administração intravenosa

75 / 75

[227] Administra-se por via intravenosa a 1 mg/kg a ratos e camundongos RhDAO purificada, rhDAO de tipo selvagem e rhDAO contendo qualquer uma das mutações HepMut1 a HepMut7 ou qualquer uma entre HepMut1 e HepMut4, compreendendo ainda as mutações Cys123 e/ou Asn168Gln, e amostras de sangue são coletadas nos pontos de tempo indicados. As concentrações de antígeno DAO são medidas usando um ELISA para DAO humana, recém-publicado (Boehm T. et al., 2017, Clin. Biochem., 50, 444-451). As semi-vidas de distribuição (alfa) e depuração (beta) são de aproximadamente 3 e 230 minutos, respectivamente, nos ratos e de aproximadamente 11 e 110 minutos, respectivamente, nos camundongos. Em ratos, mais de 90% da dose injetada é eliminada do pool de plasma em 10 minutos. A depuração rápida em camundongos é um pouco mais lenta.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. UMA DIAMINA OXIDASE (DAO) RECOMBINANTE HUMANA com menor afinidade de ligação ao glicosaminoglicano em comparação com a respectiva DAO humana de tipo selvagem, caracterizada pelo fato de que a referida DAO compreende pelo menos uma modificação de aminoácido de qualquer um dos aminoácidos nas posições 568-575 do domínio de ligação ao glicosaminoglicano (GAG) com referência à numeração de SEQ ID NO:1.

2. A DAO RECOMBINANTE de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda pelo menos uma modificação da cisteína acessível ao solvente na posição de aminoácido 123 (cys123) com referência à numeração de SEQ ID N.º 1, especificamente a modificação da cisteína é uma substituição, uma exclusão ou um acoplamento de aminoácido com um fragmento químico; mais especificamente, a cys123 é substituída pela alanina.

3. A DAO RECOMBINANTE de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação ao GAG é um domínio de ligação à heparina/ao sulfato de heparano.

4. A DAO RECOMBINANTE de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma modificação de aminoácido no domínio de ligação ao GAG é uma substituição, uma exclusão, uma inserção ou um acoplamento de aminoácido com um fragmento químico.

5. A DAO RECOMBINANTE de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 substituições de aminoácidos no domínio de ligação ao GAG.

6. A DAO RECOMBINANTE de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio de ligação ao GAG da sequência de aminoácidos X1FX2X3X4LPX5, em que X1 pode ser por qualquer aminoácido, é especificamente A ou S, mais especificamente é S; X2 pode ser por qualquer aminoácido, é especificamente K; X3 pode ser por qualquer aminoácido, é especificamente A ou T, mais especificamente é T; X4 pode ser por qualquer aminoácido, é especificamente K, e X5 pode ser por qualquer aminoácido, é especificamente K ou T, mais especificamente é T.

7. A DAO RECOMBINANTE de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SFKAKLPK (SEQ ID NO:33), AFKAKLPT (SEQ ID NO:34), AFKTKLPK (SEQ ID NO:35), SFKTKLPK (SEQ ID NO:36), AFKTKLPT (SEQ ID NO:37), SFKAKLPK (SEQ ID NO:38).

8. A DAO RECOMBINANTE, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição 168 com referência à SEQ ID NO 1; especificamente, a Asn é substituída por Gln.

9. A DAO RECOMBINANTE de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de que essa DAO apresenta uma meia-vida plasmática consideravelmente maior em comparação com a DAO do tipo selvagem; especificamente, a referida meia-vida é aumentada em pelo menos 1,5 vezes, especificamente pelo menos 2 vezes em comparação com a DAO do tipo selvagem.

10. A DAO RECOMBINANTE de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a referida DAO apresenta uma AUC pelo menos 10 vezes maior em comparação com a DAO de tipo selvagem.

11. A DAO RECOMBINANTE de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a internalização por células endoteliais é pelo menos 10%, 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, especificamente 90%, menor em comparação com a DAO de tipo selvagem.

12. A DAO RECOMBINANTE de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a afinidade de ligação ao GAG, especificamente a afinidade de ligação à heparina/ao sulfato de heparano é de pelo menos 10%, 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, especificamente 90% menor em comparação com a DAO de tipo selvagem.

13. A DAO RECOMBINANTE de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizada pelo fato de que compreende as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 2 a 16.

14. UM POLIPEPTÍDEO DE FUSÃO que compreende a DAO recombinante conforme qualquer uma das reivindicações de 1 a 12 e um domínio Fc de IgG humana ou albumina sérica humana (HSA), caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de fusão mantém a atividade funcional da DAO recombinante.

15. UMA SEQUÊNCIA ISOLADA DE NUCLEOTÍDEOS que codifica a DAO conforme qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizada pelo fato de que compreende especificamente as sequências SEQ ID NOs: 17 a 32.

16. UM VETOR RECOMBINANTE que compreende a sequência de nucleotídeos da reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o vetor é especificamente um vetor de expressão bacteriana, de levedura, baculoviral, vegetal ou mamífera.

17. UM CASSETE DE EXPRESSÃO caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos da reivindicação 15, operacionalmente ligada a elementos reguladores.

18. UMA CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE ou uma linha celular hospedeira caracterizada pelo fato de que compreende a DAO recombinante de qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, em que as células hospedeiras são selecionadas no grupo que consiste em células CHO, células Vero, células MDCK, células de Pichia pastoris, células SF9.

19. UM SISTEMA DE EXPRESSÃO caracterizado pelo fato de que compreende o vetor da reivindicação 16 ou o cassete de expressão da reivindicação 17 e uma célula hospedeira ou linha de células hospedeiras da reivindicação 18.

20. UM MÉTODO PARA PRODUZIR A DAO RECOMBINANTE conforme as reivindicações de 1 a 12, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de i. clonagem de uma sequência de nucleotídeos que codifica a DAO de qualquer uma das reivindicações de 1 a 13 num vetor de expressão, ii. transformar uma célula hospedeira com esse vetor, iii. cultivo da a célula hospedeira transformada sob condições em que a DAO é expressa, iv. isolamento da DAO da cultura de células hospedeiras, com a opção de desintegração das células hospedeiras e, ainda, v. purificação da DAO.

21. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada pelo fato de que compreende a DAO recombinante conforme qualquer uma das reivindicações de 1 a 13 e, como opção, um ou mais excipientes.

22. A DAO RECOMBINANTE de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizada pelo fato de que serve para uso no tratamento de uma condição associada ao excesso de histamina, especificamente para o tratamento de doenças alérgicas crônicas, mais especificamente para o tratamento de anafilaxia, choque anafilático, urticária crônica, urticária aguda, asma, febre do feno, rinite alérgica, conjuntivite alérgica, intoxicação por histamina, dor de cabeça, dermatite atópica, doenças inflamatórias, mastocitose, síndrome de ativação de mastócitos (MCAS), pré-eclâmpsia, hiperêmese gravídica, parto prematuro, úlceras pépticas, refluxo ácido, prurido e sepse.

23. O USO DA DAO RECOMBINANTE conforme qualquer uma das reivindicações de 1 a 13 caracterizado pelo fato de que serve para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma condição associada ao excesso de histamina, especificamente para o tratamento de doenças alérgicas crônicas, mais especificamente para o tratamento de anafilaxia, choque anafilático, urticária crônica, urticária aguda, asma, febre do feno, rinite alérgica, conjuntivite alérgica, intoxicação por histamina, dor de cabeça, dermatite atópica doenças inflamatórias, mastocitose, úlceras pépticas, refluxo ácido, prurido e sepse.

24. UM LIGANTE ESPECÍFICO DE ALVO caracterizado pelo fato de que se liga especificamente ao domínio de ligação da DAO ao GAG, que se liga especificamente a um ou mais dos aminoácidos na posição 568-575 com referência à numeração de SEQ ID No. 1.

25. UM LIGANTE ESPECÍFICO DE ALVO caracterizado pelo fato de que inibe especificamente a ligação da heparina/do sulfato de heparano ao domínio de ligação da DAO ao GAG, especificamente a um ou mais dos aminoácidos na posição 568-575 com referência à numeração de SEQ ID No. 1.

26. O LIGANTE ESPECÍFICO DO ALVO, de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizado pelo fato de que o referido ligante é selecionado no grupo que consiste em ácido nucléico, inibidor de moléculas pequenas ou proteína de ligação ao antígeno.

27. O LIGANTE ESPECÍFICO DO ALVO de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o referido ligante é uma proteína de ligação ao antígeno, especificamente selecionada no grupo que consiste em - anticorpos ou fragmentos de anticorpos, tais como qualquer um entre Fab, Fd, scFv, diacorpos, triacorpos, tetrâmeros Fv, minicorpos, nanocorpos, anticorpos de domínio único como VH, VHH, IgNARs ou V-NAR; - miméticos de anticorpos, tais como Adnectins™, Affibodies®, Affilins®, Affimers®, Affitins, Alfacorpos, Aptâmeros, Anticalinas, Avímeros, DARPins®, Fynomers®, peptídeos de domínio Kunitz, Monocorpos ou NanoCLAMPS; ou - proteínas de fusão que compreendem um ou mais domínios de dobra de imunoglobulina, domínios de anticorpo ou miméticos de anticorpo.

28. UM MÉTODO para identificar compostos que modulam a ligação de heparina da DAO, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de (a) construção de um modelo de computador do domínio de ligação do GAG, definido pelas coordenadas da estrutura dos aminoácidos da sequência da DAO de SEQ ID No. 1, (b) seleção de potencial composto modulador por um método selecionado no grupo que consiste em: (i) montagem de fragmentos moleculares no referido composto, (ii) seleção de um composto num banco de dados de moléculas pequenas, e

(iii) projeto de novo do ligante do referido composto;

(c) uso de meios computacionais para realizar uma operação programática de ajuste entre modelos de computador do referido composto e o domínio de ligação do

GAG, a fim de criar uma configuração de baixa energia do referido composto no domínio de ligação à heparina; e

(d) avaliação dos resultados da referida operação de ajuste para quantificar a associação entre o referido composto e o domínio de ligação à heparina/ao sulfato de heparano, avaliando, assim, a capacidade do referido composto de se associar ao referido domínio de ligação à heparina.