BR112021012368A2

BR112021012368A2 - Processo para a preparação de um agonista duplo de gip/glp1.

Info

Publication number: BR112021012368A2
Application number: BR112021012368-7A
Authority: BR
Inventors: Michael Oliver Frederick; Michael Eugene Kopach; Neil John Kallman; Kevin Dale Seibert; Sergey Vladimirovich Tsukanov; Stephanie Ruth Coffin; Ankur Jalan
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 2019-01-29
Filing date: 2020-01-28
Publication date: 2021-09-14
Also published as: TW202043260A; US20220135639A1; MA54862A; CA3224820A1; CO2021009662A2; JP2023078130A; KR20210110349A; AU2023203001A1; MX2021008965A; AU2024201004A1; CN113330024A; AU2020216922A1; CA3128023A1; AU2023203001B2; JP7315683B2; TWI799680B; IL284446A; CL2021001905A1; JP2022517834A; EP3917950A1

Abstract

processo para a preparação de um agonista duplo de gip/glp1. a presente invenção refere-se a intermediários e processos úteis na fabricação de tirzepatida ou um sal farmaceu-ticamente aceitável do mesmo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM AGONISTA DUPLO DE GIP/GLP1".

[001] A presente invenção refere-se a processos e intermediários para a preparação de um peptídeo agonista duplo de GIP/GLP1, tirzepatida ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[002] O diabetes mellitus é um transtorno crônico caracterizado por hiperglicemia resultante de defeitos na secreção de insulina, na ação da insulina ou ambos. No diabetes mellitus de tipo 2 ("T2D"), os efeitos combinados da secreção de insulina comprometida e resistência à insulina estão associados a níveis elevados de glicose no sangue. O agonista duplo de GIP/GLP1, tirzepatida, é descrito e reivindicado na patente Norte-Americana 9.474.780 ("Patente 780"). A tirzepatida pode ser útil no tratamento de T2D.

[003] O documento US9474780 descreve, de modo geral, peptídeos e um método para preparar um agonista duplo de GIP/GLP1.

[004] Há uma necessidade de processos e intermediários para permitir uma tecnologia aprimorada para a produção de tirzepatida com uma combinação de vantagens, incluindo a pureza comercialmente desejada. Da mesma forma, há uma necessidade de processos eficientes e ambientalmente "verdes", incluindo intermediários estáveis, para fornecer a tirzepatida com menos etapas de purificação. Uma tecnologia aprimorada também é necessária para fornecer processos de fabricação de tirzepatida que produzam fluxos mínimos de resíduos para segurança aprimorada do operador e do meio ambiente. À preparação de tirzepatida farmaceuticamente aceitável em larga escala apresenta uma série de desafios técnicos que podem afetar o rendimento global e a pureza. Há uma necessidade de processos para evitar o uso de metais de transição e/ou condições de reação adversas que são incompatíveis com a síntese de peptídeos.

[005] A presente invenção procura atender a estas necessidades ao fornecer novos intermediários e processos úteis na fabricação de tirzepatida (SEQ ID NO: 1) ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma. Os processos de fabricação de tirzepatida aprimorados da presente invenção fornecem intermediários e reações de processo que incorporam uma combinação de avanços, incluindo uma via eficiente com menos etapas enquanto, ao mesmo tempo, mantém a alta qualidade e pureza. É importante ressaltar que Os processos e intermediários aprimorados diminuem a intensidade dos recursos e minimizam os fluxos de resíduos.

[006] Os processos aprimorados descritos no presente documento fornecem várias modalidades de intermediários úteis para a produção de tirzepatida.

[007] A presente invenção fornece um composto de SEQ ID NO: 17 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A presente invenção fornece um composto de SEQ ID NO: 11 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A presente invenção fornece um composto de SEQ ID NO: 22 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A presente invenção fornece um composto de SEQ ID NO: 21 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A presente invenção fornece um composto de SEQ ID NO: 20 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A presente invenção fornece um composto de SEQ ID NO: 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A presente invenção fornece um composto de SEQ ID NO: 4 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A presente invenção fornece um composto de SEQ ID NO: 7 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A presente invenção fornece um composto de SEQ ID NO: 14 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A presente invenção fornece um composto de SEQ ID NO: 33 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A presente invenção fornece um composto de SEQ ID NO: 32 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A presente invenção fornece um composto de SEQ ID NO: 34 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A presente invenção fornece um composto de SEQ ID NO: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A presente invenção fornece um composto de SEQ ID NO: 36 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A presente invenção fornece um composto de SEQ ID NO: 38 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A presente invenção fornece um composto de SEQ ID NO: 39 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[008] É fornecido um composto da fórmula: Ido

H

MK - a e A AA o o ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[009] É fornecido um composto da fórmula: asse tda onda o, 70 Comeu "* o ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0010] A presente invenção fornece um processo em que a tirzepatida é preparada usando nanofiltração.

[0011] A presente invenção fornece um processo para preparar tirzepatida que compreende desproteger um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de um composto de SEQ ID NO: 22.

[0012] É fornecido um processo para acilar seletivamente um aminoácido lisina em que o aminoácido lisina e o N-término são protegidos. É fornecido um processo para acilar seletivamente um aminoácido lisina em um peptídeo que compreende acoplar um peptídeo ligado à resina-Lisina-NH2 com ácido t-butil-eicosanodioil-Glu- (O-terc-butil)-(8-amino-3,6-dioxaoctanoico)-(ácido 8-amino-3,6- dioxaoctanoico)-OH. É fornecido um processo para preparar tirzepatida que compreende desproteger um composto de SEQ ID NO: 22 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0013] É fornecido um processo para desproteger a tirzepatida, em que a solução de desproteção compreende ditiotreitol, tri-isopropilsilano e ácido trifluoroacético.

[0014] É fornecido um processo para acilar seletivamente um aminoácido lisina, em que o peptídeo ligado à resina-Lisina-NH2 é um composto da fórmula: IRIA) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0015] É fornecido um processo para converter o isômero do depsi peptídeo ao peptídeo desejado que compreende: ajustar o isômero do depsi peptídeo para um pH entre um pH de cerca de 7 a um pH de cerca de 10; e incubar o isômero do depsi peptídeo em um pH de 7 a um pH de 10 durante pelo menos uma hora.

[0016] É fornecido um processo para converter o isômero do depsi peptídeo, em que o isômero do depsi peptídeo é ajustado para um pH de cerca de 8,5 a um pH de cerca de 9,5.

[0017] É fornecido um processo para converter o isômero do depsi peptídeo, em que o isômero do depsi peptídeo é um composto de SEQ ID NO: 40 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0018] É fornecida uma dessulfuração com base em radical que compreende contatar um peptídeo com um iniciador de radical. Em uma modalidade, a dessulfuração compreende contatar um peptídeo adequado para dessulfuração com um iniciador de radical solúvel em água. Em uma modalidade, o iniciador de radical é um iniciador azo. Em uma modalidade, o iniciador de radical é selecionado a partir do grupo que consiste em dicloridrato de 2,2'-azobis[2-(2-imidazolin-2-il)propano] (VA-O044) e dicloridrato de 2,2'-azobis(2-metilpropionamidina) (VA-O50).

[0019] O método de dessulfuração com base em radical fornecido no presente documento é ambientalmente desejável, isento de metal de transição e condições compatíveis com a síntese de peptídeos.

[0020] Conforme usado no presente documento, as seguintes abreviaturas têm os significados apresentados no presente documento: "SPPS" significa Síntese de Peptídeos de Fase Sólida, "Fmoc" significa cloreto de fluorenilmetiloxicarbonila, "Pip" significa piperidina, "DIC" significa di-isopropilcarbodi-imida, "Oxyma" significa ciano-hidróxi- iminoacetato de etila, "DCM" significa diclorometano, "IPA" significa isopropanol, "MTBE" significa éter metil-terc-butílico, "TFA" significa ácido trifluoroacético, "TIPS" significa tri-isopropilsilano, "DTT" significa ditiotreitol, "UPLC" significa cromatografia de líquido de desempenho ultra alto, "HFIP" significa hexafluoroisopropanol, "CTC" significa clorotritila, "HATU" significa hexafluorofosfato de 3-óxido de (1- [bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridínio, "TFET" significa 2,2,2-trifluoroetanotiol, "DIEA" significa N,N-di- isopropiletilamina, "AEEA" significa ácido 17-amino-10-0x0-3,6,12,15- tetraoxa-9-aza-heptadecanoico, "TCEP" significa tris(2- carboxietil)fosfina, "DCU" significa diciclo-hexilureia, "DCC" significa diciclo-hexilcarbodi-imida, "TMSA" significa trimetilsilalmida, "HOBt" significa hidroxibenzotriazol, "HRMS" significa espectrometria de massa de alta resolução, "LPPS" significa síntese de peptídeo em fase líquida, "MSMPR" significa reator de suspensão mista de produto misto, "MPA" significa fase móvel A, "MPB" significa fase móvel B, "L-GSH" significa solução reduzida de L-glutationa, "TZP" significa tirzepatida, "AP"

significa produto farmacêutico ativo e "API" significa ingrediente farmacêutico — ativo, "PyBOP" significa hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-ilóxi)tripirrolidinofosfônio), "DEA" significa dietilamina, "TBTU" significa tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-i1)-1,1,3,3- tetrametilamínio, "TNTU" significa tetrafluoroborato de 2-(5-norborneno- 2,3-dicarboximido)-1,1,3,3-tetrametilurônio, "PyOxim" significa 1- hexafluorofosfato de ciano-2-etóxi-2-o0xoetilidenoamino-óxi-tris- pirrolidino-fosfônio, "PyClock" significa hexafluorofosfato de 6-cloro- benzotriazol-1-ilóxi-tris-pirrolidinofosfônio. Conforme apresentado no presente documento, as abreviaturas de uma letra de aminoácidos são apresentadas em negrito, enquanto que os átomos são apresentados como texto não em negrito e geralmente em fonte minúscula para distinguir de abreviações de aminoácidos de uma letra. Conforme usado no presente documento, quando uma abreviatura de aminoácido aparece com um número acima do aminoácido, o número refere-se à posição de aminoácido correspondente no produto tirzepatida final. Os números são fornecidos por conveniência e o aparecimento ou ausência de tais números em uma sequência não influencia a sequência de aminoácidos ou o peptídeo indicado em tal sequência. Conforme usado no presente documento, o termo "protegido" significa que um grupo de proteção é ligado na posição indicada. Aqueles versados na técnica reconhecerão que uma variedade de grupos de proteção são bem conhecidos, e grupos de proteção alternativos podem ser adequados para um processo particular.

[0021] Aqueles versados na técnica reconhecerão que há resinas alternativas para construir os peptídeos apresentados no presente documento. Por exemplo, as resinas amida de Sieber e Rink são bem conhecidas por aqueles versados na técnica para a preparação dos peptídeos descritos no presente documento; no entanto, resinas alternativas podem ser selecionadas para a preparação dos peptídeos descritos no presente documento. Por exemplo, porém sem limitações, 2-CTC e resinas relacionadas podem ser usadas para preparar um peptídeo alvo, seguido por uma etapa de amidação do C-término.

[0022] As construções de síntese de peptídeo em fase sólida (SPPS) são realizadas usando técnicas de química peptídica de cloreto de fluorenilmetiloxicarbonila (Fmoc) usando acoplamentos sequenciais com um sintetizador de peptídeos automatizado. A resina é intumescida com DMF e depois desprotegida usando piperidina (Pip) a 20 %/DMF (3 x 30 min). Subsequentes desproteções de Fmoc usam tratamentos de 3 x 30 min com Pip a 20 %/DMF e tratamentos de 4 x 30 min são usados para acoplamentos mais difíceis. Após a desproteção, a resina é lavada com lavagens de 5 x 2 min com 10 volumes de DMF. A pré-ativação de aminoácidos usa soluções de di-isopropilcarbodi-imida (DIC)/ciano- hidróxi-iminoacetato (Oxyma)/DMF em temperatura ambiente durante min. O acoplamento do aminoácido ativado ao peptídeo ligado à resina ocorre durante um tempo especificado para cada aminoácido individual. A lavagem do solvente com 5 x 2 min 10 volumes de DMF é realizada após cada acoplamento. Para o isolamento do produto final, o produto ligado à resina é lavado 5 x 2 min com 10 volumes de DCM para remover a DMF. A resina é lavada com 2 x 2 min 10 volumes de IPA para remover o DCM, lavada 5 x 2 min 10 volumes de éter metil-terc- butílico (MTBE), então, o produto é seco a 40ºC sob vácuo. O produto ligado à resina é armazenado gelado (-20ºC). Para análise, o peptídeo é clivado da resina com um coquetel ácido que consiste em ácido trifluoroacético (TFA)/H2O/TIPS (tri-isopropilsilano)/DTT (ditiotreitol) na seguinte proporção: (0,93v/0,04v/0,03v/0,03v). A resina é intumescida com DCM (4-5 mL, 3 x 30 min) e drenada. O coquetel de clivagem (4-5 mL) é adicionado à resina pré-intumescida e a suspensão é agitada durante 2 horas em temperatura ambiente. A solução é filtrada, em seguida, a resina é lavada com uma pequena quantidade de DCM e combinada com a solução de clivagem. A solução resultante é vertida em 7-10 volumes de éter metil-terc-butílico (MTBE) gelado (0 ºC). À suspensão é envelhecida durante 30 min a O ºC, em seguida, o precipitado resultante é centrifugado e a solução límpida é decantada. O resíduo é suspenso no mesmo volume de MTBE e a suspensão resultante é novamente centrifugada e decantada. Após decantação, a solução límpida de MTBE do peptídeo precipitado é seca sob vácuo a 40 ºC durante a noite. Síntese da Preparação 1: SEQ ID NO: 2

[0023] A síntese usa resina de amida de Sieber-Fmoc com um carregamento de 0,71 mmol/g. O procedimento de SPPS geral é usado com as seguintes modificações: ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, 4h,ta.

ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, 6h, ta.

ciclos de 4 x 30 minutos de De-Fmoc, 6h, ta.

ciclos de 4 x 30 minutos de De-Fmoc, «eso EEE | 6h, ta. é fo ESSE lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, Fmoc-L-Ala-OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta.

ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, Fmoc-Gly-OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta. ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 7 | FmocL-Ser(tBu)-OH | 39 n1/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta. ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, Fmoc-L-Ser(tBu)-OH | 35 4/33 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, Fmoc-L-Pro-OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta ciclos de 4 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, | Fmoc-Giy-OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta.

[0024] Clivagem Suave de Preparação 1: Dez reações de desproteção idênticas são executadas em paralelo, cada uma na escala de — 0,5 mmol da Preparação 1 ligada à resina usando o seguinte protocolo: 1) Para um reator de frita de 40 mL, adicionar 1,55 g (- 0,5 mmol) de Preparação 1 ligada à resina. 2) Intumescer com 3 x 15 mL de DMF (15 min cada), 3) Tratar com 3 x 15 mL (30 min cada) de Pip a %/DMF. 4) Lavar com 4 x 15 mL de DMF, seguido por 4 x 15 mL de DCM. 5) Adicionar 1,5 mL de TFA e 28,5 mL de DCM a cada um dos cinco frascos de reação de 40 mL. 6) Adicionar um quinto da Preparação 1 ligada à resina (2,75 g) a cada um dos frascos de solução de TFA e tampar os frascos e misturar na roda rotativa durante 5 minutos. 7) Filtrar as misturas e lavar com 100 mL de DCM para dar um volume total de filtrado de 500 mL. 8) Combinar os filtrados e transferir para um frasco de fundo redondo que contém 1000 mL de MTBE. 9) Concentrar a suspensão resultante em um óleo amarelo claro, triturar com 200 mL de MTBE e resfriar em banho de gelo durante 30 minutos. 10) Filtrar o sólido, lavar com 50 mL de MTBE gelado e secar em um forno a vácuo a 33 ºC durante a noite para produzir 5,35 g (91 % de rendimento) de um sólido branco. Análise do sólido isolado usando UPLC (98,57 % de área, com 0,99 % de subprodutos de desproteção de t-Bu combinados). Síntese da Preparação 2: SEQ ID NO: 3

[0025] A síntese usa resina Fmoc-Gly-OH2-CTC com um carregamento de 0,61 mmol/g. O procedimento de SPPS geral é usado com as seguintes modificações: ; NA Condições de SPPS Solvente para acoplamentos: DMF ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 1 Fmoc-L-Ala-OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta. ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, ? Fmoc-L-lie-OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta. ciclos de 4 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 3 Fmoc-L-Leu-OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 6h, ta. ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 1 Fmoc-L-Trp(Boc)-OH | 39 na/3,3 DIC/3,0 Oxyma 6h, ta. ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, Fmoc-L-GIn(Trt)-OH | 39 na/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta. ciclos de 4 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, Fmoc-L-Val-OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 6h, ta.

ciclos de 4 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 1 Fmoc-L-Phe- OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 8h, ta. ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, Fmoc-L-Ala-OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta. ciclos de 4 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, Fmoc-Lys(Alloc)-OH | 39 n4/3,3 DIC/3,0 Oxyma 8h, ta. ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, Fmoc-L-GIn(Trt--OH | 39 n4/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta. ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, nv Fmoc-L-Ala-OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta. ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 12 Fmoc-L-lie-OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta. ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 18 Fmoc-L-Lys(Boc)-OH | 35 na/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta. ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 1 Fmoc-L-Asp(tBu)-OH | 35 n4/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta.

[0026] Clivagem Suave de Preparação 2: A um frasco de cintilação de vidro de 40 mL, adicionar a Preparação 2 ligada à resina (3,06 9, 1,12 mmol) e 30 mL de solução de HFIP a 30 %/DCM onde é observada a mudança para a cor vermelho. Agitar o frasco girando em uma roda em temperatura ambiente durante 1 hora. Filtrar a resina e lavar com 3 x 10 mL de DCM. Remover o solvente sob vácuo para formar uma espuma vítrea (banho a 35ºC, 10 torr, 2,34 g) e substituir por uma pequena porção de IPA (24 mL) e, em seguida, adicionar água (24 mL) gota a gota ao longo de 25 min em temperatura ambiente. Agitar a solução resultante durante 30 min e, em seguida, filtrar. Lavar o bolo lavado 3 x 10 mL de H2O0 e em seguida, secar em forno a vácuo a 25 torr e 35ºC durante a noite. Isto produz a Preparação 2 como um sólido branco (1,81 g). Síntese da Preparação 4: SEQ ID NO: 4

[0027] A síntese usa resina Fmoc-Leu-OH 2-CTC com um carregamento de 0,68 mmol/g. O procedimento de SPPS geral é usado com as seguintes modificações: ; A Condições de SPPS Solvente para acoplamentos: DMF Ciclos de 4 x 30 minutos de De-Fmoc, Aib lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 1 Fmoc-Aib -OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 8h,ta. Ciclos de 4 x 30 minutos de De-Fmoc, des lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 2 — |FmocLlle-OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 18h, ta. Ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, do ' lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 3 | FmocL-Ser(tBu)-OH 39 4/33 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta. Ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, Fmoc-L-TyrítBu)-OH — | 39 n4/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta Ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, Fmoc-L-Asp(tBu)-OH — | 39 n4/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta. Ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, Fmoc-L-Ser(tBu)-OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta.

Ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, ds - lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 7 | FmocL-Thr(tBu)-OH 309 n4/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta. Ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, 1 Phes lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, Fmoc-L-Phe-OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta Ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, ds - lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, Fmoc-L-Thr(tBu)-OM — | 239 n14/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta Ciclos de 4 x 30 minutos de De-Fmoc, Gy lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, | Fmoc-Giy-OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 6h, ta. Ciclos de 4 x 30 minutos de De-Fmoc, do ' lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 11 | Fmoc-L-Glu(tBu)OH — | 239 n14/33 DIC/3,0 Oxyma 6h, ta. Ciclos de 4 x 30 minutos de De-Fmoc, Aih lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 12 | Fmoc-Aib-OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 8h,ta. Ciclos de 4 x 30 minutos de De-Fmoc, Jo - lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 13 | BooL-Tyr(tBu)-OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 18h, ta.

[0028] Clivagem Suave de Preparação 4: A um frasco de cintilação de vidro de 20 mL, adicionar a Preparação 4 ligada à resina (2,0 g, 0,62 mmol) e 10 mL de solução de HFIP/DCM a 30%, onde uma mudança de cor é observada. Agitar o frasco girando em uma roda em temperatura ambiente, em seguida, filtrar a resina, lavar com 3 x 2 mL de DCM e remover o solvente sob vácuo para formar uma espuma vítrea e pegajosa. Dissolver a espuma em 5,2 mL de DMSO. Adicionar esta solução a 6 mL de água em vazões iguais (T — 15ºC) ao longo de 45 min com 1 mL de água. Assim que a solução peptídica estiver totalmente adicionada, adicionar mais 6 mL de água ao longo de 45 min.

Sólidos brancos precipitam com a adição. Agitar a suspensão resultante a 15 ºC durante 30 min. Filtrar os sólidos, lavar com 6 mL de água e, em seguida, transferir para o forno a vácuo a 35 “C e 25 torr. Isto origina a Preparação 4 (Boc-1-14-OH, 1,0763 g) como um sólido branco fofo. Síntese da Preparação 3 Através de LPPS: SEQ ID NO: 5

[0029] A um frasco de cintilação de vidro de 20 mL, adicionar a Preparação 2 (500 mg, 0,18 3 mmol), Preparação 1 (179 mg, 0,175 mmol) e DMSO (10 mL). Adicionar DIEA (46 uL, 0,265 mmol) a esta solução, seguido por PyBOP (hexafluorofosfato de (benzotriazol-1- ilóxi)tripirrolidinofosfônio) (123 mg, 0,230 mmol). Agitar a reação durante 2 horas, então, suplementar com dietilamina (DEA) (183 microlitros, 1,77 mmol) e agitar a solução resultante durante 2 horas. Extrair o conteúdo da reação com uma seringa e adicionar a um frasco agitado de 50 mL com adição simultânea gota a gota de água (12 mL) ao longo de 1 hora. Após as adições estarem concluídas, coletar o produto precipitado por meio de filtração e, subsequentemente, lavar com água (2x4 mL). Secar o bolo úmido em vácuo a 35 ºC durante 18 horas para obter a Preparação 3 como um sólido branco (rendimento de 88 % 0,6003 g, HRMS calc. para C184H261N31038 esperado 3512,9444, real 3512,9430). Síntese da Preparação 5 Através de LPPS: SEQ ID NO: 6 mac EEE ão Preparação 4 Fe o Preparação 3

E Preparação &

[0030] A um frasco de cintilação de vidro de 20 mL, adicionar a Preparação 3 (338,8 mg, 0,09 1 mmol), Preparação 4 (192,1 mg, 0,09 1 mmol) e DMSO (10 mL). A esta solução, adicionar PyBOP (63,5 mg, 0,118 mmol), seguido por DIEA (79 microlitros, 0,454 mmol). Agitar a solução de reação durante 2,5 horas. Extrair o conteúdo da reação com uma seringa e adicionar o conteúdo a um frasco agitado de 50 mL com adição simultânea gota a gota de água (12 mL) ao longo de 1 hora. Após as adições estarem concluídas, coletar o produto precipitado por meio de filtração e, subsequentemente, lavar com água (2 x 4 mL). Secar o bolo úmido sob vácuo a 35 ºC durante 18 horas para obter a Preparação como um sólido branco (0,3568 g, rendimento de 70 %, HRMS calc. para C293H435N45064 esperado 5608,2168, real 5608,2066). Síntese de Preparação 6 através do Método 1 (LPPS) H o H o PSU A a nana on 0, Bu o i RARA O Nx. A . ” sh ou, o Di CA aa 3 a A À o 9% Ma O AA “ou Lo igÃo mo mm o os tao r "e seta do “o A Atom entmcnmmmmennorrccnnmerncnnnomasprcnano Cons

[0031] Dissolver ácido — eicosanodioico, “éster —mono(1,1- dimetiletílico) (15,0 kg, reagente limitante) e N-hidróxi-succinimida (1,2 eq.) em acetato de etila a 27 ºC. Adicionar uma solução de DCC (1,25 eq.) em acetato de etila e agitar a reação durante 24 h a 22 ºC. Filtraro subproduto de DCU resultante e, em seguida, extrair a fase orgânica três vezes com solução aq. de NaCl a 5 %. Após extração, concentrar a fase orgânica, coevaporar com isopropanol e, em seguida, cristalizar através da adição de heptano. Após filtração, enxaguar o bolo de filtro com heptano e secar a 25ºC para obter 17,0 kg de INT1 com 87 % de rendimento e 99 % de pureza.

[0032] Dissolver H-Glu-OtBu (7,7 kg, 1,1 eq.) em DCM (54 L) a 20ºC, em seguida, adicionar uma solução de TMSA (11,3 kg) dissolvida em DCM (7 L), em seguida, agitar a mistura de reação durante 1 ha 40ºC. Adicionar solução de INT1 (17,0 kg) em DCM em temperatura ambiente e agitar 8 h. Após a reação estar concluída, DCM é trocado por acetato de etila por meio de destilação. Lavar a fase orgânica três vezes com solução aquosa de KHSO4 a 2 %/NacCl, em seguida, lavar 4 vezes com solução aquosa de NaCl a 2%. Após separação e remoção da fase aquosa, concentrar a fase orgânica, coevaporar com propanol, diluir com isopropanol e depois cristalizar através da adição de água. Após filtração, lavar o bolo de filto com uma mistura de água/isopropanol e, em seguida, secar a 30ºC para produzir 17,3 kg de INT2 com 86 % de com rendimento e pureza de 99%.

[0033] Dissolver o INT2 (17,3 kg) e N-hidróxi-succinimida (4,1 kg, 1,2 eq.) em acetato de etila (336 kg) a 27ºC. Adicionar uma solução de DCC (8,33 kg, 1,25 eq.) em acetato de etila e agitar a reação durante 24 h a 22 ºC. Filtrar o subproduto de DCU resultante. Concentrar a fase orgânica, coevaporar com isopropanol e, em seguida, cristalizar por meio de resfriamento da solução de isopropanol (- 125 L). Depois, enxaguar o bolo de filtro com isopropanol gelado e secar a 25ºC para produzir 16,3 kg de INT3 com 81% de rendimento e 96% de pureza.

[0034] Suspender o ácido 17-amino-10-0x0-3,6,12,15 tetraoxa-9- aza-heptadecanoico (AEEA 2) (8,1 kg, 26,3 mol) em DCM (54 L) a 22ºC, adicionar TMSA (7,68 kg, 59,9 mol) em DCM (6,2 L) e, em seguida, agitar a mistura de reação durante uma hora a 40 ºC. Suspender o INT3 (16 kg) em DCM (31 L) a 35 ºC e adicionar à mistura protegida por TMS (AEEA 2) a 22 ºC. Agitar a reação durante 12 horas e, após conclusão da reação, concentrar a mistura e, em seguida, trocar por acetato de etila. Lavar a fase orgânica três vezes com solução aquosa de KHSOA4/NaCl (- 200 L) e, em seguida, lavar 4 vezes com solução aquosa de NaCl a 2 % (- 200 L) até um pH alvo de 4,5. Concentrar a fase orgânica e trocar por acetonitrila. Esfriar a solução de acetonitrila para - 20ºC e depois envelhecer a suspensão resultante durante 15 horas na temperatura de -20ºC. Filtrar a mistura, lavar o filtro de bolo com acetonitrila gelada e secar a < 0ºC para obter 18,4 kg de Preparação 6 (rendimento de 88 %) com 96 % de pureza. Rendimento global = 53%. Síntese de Preparação 6 através do Método 2 (SPPS)

[0035] Alternativamente, a Preparação 6 pode ser preparada usando a síntese de peptídeos em fase sólida usando um sintetizador de peptídeos.

[0036] São usados procedimentos de acoplamento padrão. Condições de Acoplamento Padrão:

[0037] 2,0 equiv. de HATU a 0,133 M, 5,0 equiv. de DIEA, temperatura ambiente, 3 horas, desproteção durante 3 x 15 min com piperidina a 20 %/DMF. Carregamento de Resina:

[0038] FmocNH -AEEA sobre a resina 2-CTC (0,99 mmol/g): 1,01 g em cada uma das reações paralelas.

[0039] Um programa automático usando um intumescimento em DMF, seguido por Pip/DMF; lavagem com DMF; e aminoácido, DIEA, mistura de HATU; e ciclos de lavagem com DMF seguido de secagem.

[0040] A resina é clivada por meio de agitação dos lotes combinados em HFIP a 30 %/DCM (240 mL) durante 1,5 horas. A resina é filtrada, lavada e o solvente é removido do filtrado sob vácuo. O óleo resultante é dissolvido em acetonitrila e o solvente é removido novamente. Esta operação fornecer 30,47 g (146% do rendimento teórico) de um óleo viscoso amarelo que contém 52,3% de área do produto desejado através de análise UPLC. O produto bruto é purificado por meio de cromatografia rápida (500 gramas de sílica gel, eluído com 85 % de DCM/10 % de metanol/5 % ácido acético, 38 x frações de 100 mL coletadas). O concentrado previamente cromatografado (17,94 9) é cristalizado para proporcionar 13,4 g (rendimento de 74,7 %), com uma pureza por UPLC de 91,65 % de área. Exemplo 1

= E " o Boc-vH. ALeotrTeoysd Lrpxiaga dar QW-LH-A-6-6-P-$-$-G-A-P-P-P-S-N Bi ufa, Es Ba idades q, Bi Bar tm O Tantos eds eu Preparação 5 s | . Ns kh sec-vll Leortetso y sal Arograanhyarvawnta G6-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-Ni, BU ufa Bo Eu BdaMBUBAO: 1/,, Bi Bor fa tribos BuBo eu = Preparação 7 “ Facas A À g x | " MOI NA A A Ag A Ag O Ao, PY fa OE nado Preparação 6 encan Hondpao Y o. PEA A menina aa, . k jo WE T sos *. DK 2UH AE VQWL1-A0:0-P-8-8-67A-D-P-P-S NH, 9 pa fga 65 imo issues (4, mi boo Ro O indor insos e Preparação 8 ” o o sete hora Aran Aa PR o ch Jotrasesed daggaçd ueregvacer aeee Preparação 8 o é res A rama Aa HA x G-T-F-T-S-0-Y-S 1 x No, ão ue o " Exemplo 1 Exemplo de Síntese 1 SEQ ID NO: 1

[0041] A um primeiro frasco de HPLC, adicionar a Preparação 5 (10,5 mg, 0,00187 mmol) e DCM (200 uL, 20 L/kg). A esta solução, adicionar uma solução de fenilsilano (0,81 M em DCM, 22,1 uL, 0,0178 mmol) e tetraquis(trifenilfosfina)-paládio (0) (0,8 M em DCM, 22,1 uL, 0,00064 mmol). Agitar a solução a 24ºC durante uma hora para obter uma solução não isolada da Preparação 7 (SEQ ID NO: 7). A um segundo frasco de HPLC, adicionar DCM (150 uL), seguido pela Preparação 6 (0,118 M em DCM, 16 uL, 0,00189 mmol), PyBOP (0,186 M em DCM, 16 uL, 0,00298 mmol) e DIEA (0,573 M em DCM, 5 equiv.). Adicionar o conteúdo do segundo frasco ao primeiro frasco e agitar a reação durante 1 hora para obter uma solução não isolada da Preparação 8 (SEQ ID NO: 8). Concentrar a solução da Preparação 8 sob vácuo e, ao sólido resultante, adicionar 50 ul de uma solução de ácido trifluoroacético (4,65 mL), tri-isopropilsilano (20 uL) e DTT (20 mg). Agitar a suspensão durante 18 horas e monitorar por HPLC para confirmar a formação do Exemplo 1 (HRMS calc. para C225H348N48068 esperado 4810,5249, real 4810,5257). Síntese da Preparação 9 SEQ ID NO: 9

[0042] Suspender a resina de amida de Sieber (13,42 g, 0,75 mmol/g, 10,1 mmol) em DMF (130 mL, 10 vols.) durante cerca de 20 min e, em seguida, drenar. Lavar a resina resultante com DMF (80 mL, 6 vols.) durante cerca de 5 min. Remover o grupo Fmoc por meio de tratamento da resina de aminoácido Fmoc com 5% em volume de piperidina, 1,25 % em volume de DBU, 1,0% em peso de solução de HOBt/DMF (80 mL, 6 vols.) duas vezes, 10 min e 20 min, respectivamente. lavar duas vezes com DMF (80 mL, 6 vols.), duas vezes com MTBE (80 mL, 6 vols.) e novamente duas vezes com DMF (80 mL, 6 vols.) após drenar a solução de de-Fmoc.

[0043] Usando a química Fmoc padrão, montar a cadeia de aminoácidos. Em geral, 1,5 equiv. de Fmoc-aminoácido e HOBt (2,47 9, % de água úmida, 14,6 mmol, 1,46 equiv.) são dissolvidos em DMF (60 mL, 4,5 vols.), seguido pela adição de DIEA (1,94 mL, 11,1 mmol, 1,11 equiv.). Esfriar a solução resultante para < 5 ºC com um banho de gelo e ativar através da adição de TBTU (4,83 g, 15,0 mmol, 1,5 equiv.).

Deixar repousar durante cerca de 5 minutos a 0ºC - 5ºC. Adicionar DOM (60 mL, 1,5 vols.) à resina, seguido pela adição da solução de Fmoc- aminoácido ativado. Agitar a mistura resultante próximo da temperatura ambiente durante 2 horas. Repetir o procedimento de deFmoc e o acoplamento com o restante dos aminoácidos sequencialmente. Após concluir o último procedimento de deFmoc, lavar a resina com 2- propanol (130 mL, 10 vols.) durante 5 min duas vezes, seguido de lavagem com MTBE (130 mL, 10 vols.) seis vezes. A resina é seca a 35ºC in vacuo, resultando na Preparação 9-Seiber (21,21 g, 0,435 mmol/g teórico, 91,7 % de rendimento com base no aumento de massa).

[0044] Uma parte do complexo de Preparação 9- resina (10,15 9g, 0,435 mmol/g, 4,41 mmol) é tratada com 5% em volume de TFA em solução de DCM (101 mL, 10 vols.) e a etapa de lavagem com DCM. As frações de clivagem e lavagens são neutralizadas com DIEA (26,29 9, 35,5 mL, proporção molar de 1,01:1 para TFA). As frações são combinadas e concentradas sob vácuo para 50% do volume original. Lavar a solução em DCM com uma solução saturada aquosa de NaHCO3 (2 x 94 mL). Secar a solução resultante sobre MgSO4 anidro e concentrar até secagem para produzir um sólido pegajoso. Resuspender este sólido pegajoso em MTBE a < 5ºC (100 mL) para decompor a goma, resultando em um produto de suspensão branca. Filtrar, lavar e secar a suspensão de pó branco, resultando na Preparação 9 (3,84 g, 92,3% de área, 37,8% em peso de DIEA-TFA, 57,4% em peso, 2,29 mmol, 51,9 % de rendimento, HRMS calc. para C46H78N10012 esperado 962,5801, real 962,5806) como um pó branco. Síntese da Preparação 10 SEQ ID NO: 10

[0045] Suspender o complexo de resina Fmoc-Gly-Gly-0-2CTC (18,09 g, 0,57 mmol/g, 10,3 mmol) em DMF (180 mL, 10 vols.) durante min e, em seguida, drenar. Lavar a resina resultante com DMF (108 mL, 6 vols.) durante 5 min. Remover o grupo Fmoc por meio de tratamento da resina de aminoácido-Fmoc com 5 % em volume de piperidina, 1,25 % em volume de DBU, 1,0 % em peso de solução de HOBt/DMF (108 mL, 6 vols.) duas vezes, 10 min e 20 min, respectivamente. Drenar a solução de de-Fmoc e lavar a resina duas vezes com DMF (110 mL, 6 vols.), duas vezes com MTBE (110 mL, 6 vols.) e novamente duas vezes com DMF (110 mL, 6 vols.). A montagem da corrente é conduzida com química de Fmoc padrão.

[0046] Para o acoplamento dos aminoácidos, geralmente 1,5 equiv. de Fmoc-aminoácidos e HOBt (2,54 g, 20 % de água, 15,0 mmol, 1,5 equiv.) foram dissolvidos em DMF (80 mL, 4,4 vols.), seguido pela adição de DIEA (1,94 g, 15,0 mmol, 1,5 equiv.) para permitir o acoplamento dos aminoácidos. Esfriar a solução resultante para 0 - 5 ºC com um banho de gelo e ativar pela adição de tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-i1)-1,1,3,3-tetrametilamínio (TBTU) (4,84 g, 15,1 mmol, 1,5 equiv.). Deixar em repouso durante 5 min a 0 - 5ºC. DCM (35 g, 1,5 vol.) e, em seguida, adicionar à resina, seguido pela adição da solução de Fmoc-aminoácido ativado. A mistura resultante é agitada em temperatura ambiente durante 2 h. A resina peptídica é lavada após conclusão das etapas sintéticas com 2-propanol (180 mL, 10 vols.) durante 5 min duas vezes e, em seguida, MTBE (180 mL, 10 vols. cada, 6 vezes), seguido por secagem a 35 “ºC, resultando no complexo de Preparação 10-resina (25,52 g, 0,216 mmol/g, 53,6 % de rendimento).

[0047] Tratar uma parte do complexo de Preparação 10-resina (10,075 g, 0,216 mmol/g, 2,18 mmol) três vezes com 1 % em volume de TFA em solução de DCM (100 mL, 10 vols.) e lavar com DCM (75 mL, 7,5 vols.). Neutralizar as frações de clivagem e lavar com piridina (3,18 g, proporção molar de 1,01:1 para TFA). Combinar e concentrar as frações sob vácuo até secagem a < 35 ºC. Realizar a reconstituição com etanol (40 mL, 10 % vol. dos filtrados combinados), seguido por concentração até secagem. Finalmente, triturar o peptídeo com agitação em água deionizada (150 mL, 40 % vol. dos filtrados combinados). Coletar o precipitado peptídico bruto sólido por meio de centrifugação e lavar com água deionizada duas vezes (150 ml cada). Lavar o sólido com n-heptano duas vezes (100 ml cada), isolar e secar in vacuo a 40 ºC para originar a Preparação 10 (SEQ ID NO: 10) como um sólido amarelo claro (4,10 g, 72,4 % de área, 3,0 % em peso de piridina-TFA, 70,2 % em peso, 1,85 mmol, 85,1 % de rendimento, HRMS calc. para CB8H103N11015 esperado 1553,7635, real 1553,7656). Síntese de Preparação 11 SEQ ID NO: 11

[0048] Suspender o complexo de resina H-Alanina-O-2CTC (40,39 9, 0,5 mmol/g, 20,20 mmol) em DMF (400 mL, 10 vols.) durante cerca de 20 minutos e, em seguida, drenar. Lavar a resina resultante com DMF (400 mL, 10 vols.) durante 5 min duas vezes. Montar a cadeia de aminoácidos usando a química de Fmoc padrão. Em geral, dissolver 1,5 equiv. de Fmoc-aminoácido e HOBt (5,51 g, 80 % em peso, 32,6 mmol, 1,6 equiv.) em DMF (150 mL, 3,7 vols.), seguido pela adição de DIEA (4,22 g, 32,7 mmol, 1,6 equiv.) Esfriar a solução resultante até cerca de < 5ºC com um banho de gelo e ativar através da adição de TBTU (10,39 g, 32,4 mmol, 1,6 equiv.). Deixar agitar durante cerca de 5 minutos a O - 5ºC. Adicionar DCM (80 mL, 2 vols.) à resina, seguido pela adição da solução de Fmoc-aminoácido ativado. Agitar a mistura resultante próximo da temperatura ambiente durante 2 horas.

[0049] Remover o grupo Fmoc por meio de tratamento da resina de aminoácido-Fmoc com 5 % em volume de piperidina, 1,25 % em volume de DBU, 1,0 % em peso de solução de HOBtI/DMF (240 mL, 6 vols.) duas vezes, 10 min e 20 min, respectivamente. Drenar a solução de de- Fmoc, lavar a resina duas vezes com DMF (240 mL, 6 vols.), duas vezes com MTBE (240 mL, 6 vols.) e novamente duas vezes com DMF (240 mL, 6 vols.). A resina peptídica é cuidadosamente lavada com 2- propanol (400 mL, 10 vols.) duas vezes e MTBE (400 mL, 10 vols. cada, 6 vezes) após conclusão das etapas sintéticas, seguido por secagem in vacuo a 35ºC para produzir resina carregada menos o último aminoácido (74,82 g, 0,159 mmol/g, 11,90 mmol, 58,9 % de rendimento). — Adicionar o último aminoácido, Fmoc-Leu-OH separadamente a uma parte da resina (13,61 g, 0,159 mmol/g, 2,16 mmol). Intumescer esta resina com DMF (130 mL, 10 vols., 3 vezes) durante > 5 min cada, em seguida, desproteger (130 mL de mistura de desproteção preparada a partir de 5,6 g de piperidina, 1,67 g de DBU, 1,3 g de HOBt em 120 mL de DMF, 10 vols. duas vezes) em 10 min e 20 min. Lavar a resina com DMF (80 mL, 6 vols., duas vezes), seguido de MTBE (80 mL, 6 vols., duas vezes) e, em seguida, DMF (80 mL, 6 vols., duas vezes) durante 5 min cada. Dissolver em DMF (50 mL, 3,7 vols.), seguido pela adição de DIEA (0,54 g, 4,2 mmol, 1,9 equiv. para o acoplamento de Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH (1,47 g, 4,16 mmol, 1,9 equiv.) e HOBt (0,704 g, 80 % em peso, 4,17 mmol, 1,9 equiv.)). Esfriar a solução resultante para < 5ºC com um banho de gelo e ativar pela adição de TBTU (1,34 g, 4,17 mmol, 1,9 equiv.) e deixar agitar durante min a 0 - 5ºC. Adicionar DCM (20 mL, 1,5 vols.) à resina, seguido pela adição da solução de Fmoc-aminoácido ativado. Agitar a mistura resultante próximo da temperatura ambiente durante 2 horas. Lavar esta resina com DMF (180 mL, 13 vols., duas vezes), MTBE (180 mL, 13 vols., duas vezes) e DMF (180 mL, 13 vols., duas vezes) durante 5 min cada. Lavar a resina com DCM (130 mL, 10 vols., 6 vezes, 5 minutos cada), antes de secar a resina in vacuo a 35ºC, resultando em uma resina carregada (12,90 g, 0,203 mmol/g, 2,62 mmol, 121 % de rendimento).

[0050] Tratar uma parte da resina (7,09 g, 0,203 mmol/g, 1,44 mmol)

três vezes com 1 % em volume de TFA em solução de DCM (70 mL, 10 vols.) durante 10 minutos cada em torno da temperatura ambiente, seguido por lavagem com DCM (55 mL, 7,5 vols.). Neutralizar as frações de clivagem e lavar com piridina (3,02 g, proporção molar de 1,02:1 para TFA). Combinar e concentrar as frações sob vácuo até secagem a < 35ºC. Realizar a reconstituição com etanol (28 mL, 11 % vol. dos filtrados combinados), seguido por concentração até secagem. Finalmente, agitar o peptídeo em água deionizada (105 mL, 40 % vol. dos filtrados combinados). Coletar o precipitado peptídico bruto sólido por meio de filtração e lavar com água deionizada (4 x 50 mL). Lavar o sólido com n-heptano (3 x 100 mL), isolar e secar in vacuo a 40 ºC, resultando na Preparação 11 como um pó branco (4,54 g, 87,6 % de área, 44,4 % em peso de piridina-TFA, 48,7 % em peso, 0,936 mmol, rendimento de 65,0 %, HRMS calc. para C127H192N14028 esperado 2361,4031, real 2361,4021). O rendimento global para a preparação da Preparação 11 em resina é de 71,3 %. Síntese da Preparação 12 SEQ ID NO: 12

[0051] Suspender o complexo de resina Fmoc-Aib-O-CTC (19,16 g, 0,54 mmol/g, 10,35 mmol) em DMF (190 mL, 10 vols.) durante 20 min e, em seguida, drenar. Lavar a resina resultante com DMF (190 mL, 10 vols.) durante 5 min e depois escorrer. Combinar piperidina (77,82 9), DBU (23,16 g), HOBt (18,09 g, 80 % em peso) e DMF (1800 mL) para fornecer solução de piperidina a 5 %, DBU a 1,25 %, HOBt a 1,0 %/DMF como uma solução de desproteção. Remover o grupo Fmoc por meio de tratamento da resina de aminoácido-Fmoc com solução de desproteção (190 mL, 10 vols.) duas vezes, 10 min e 20 min, respectivamente. Drenar a solução de de-Fmoc e lavar a resina duas vezes com DMF, duas vezes com MTBE e novamente duas vezes com DMF (190 mL, 10 vols. para cada lavagem).

[0052] Adicionar DIEA (2,62 g, 20,3 mmol, 2,0 equiv.) a uma solução de Fmoc-lle-OH (7,11 g, 10,1 mmol, 2,0 equiv.) em DMF (85 mL). Esfriar a solução resultante para O - 5ºC, adicionar hexafluorofosfato de 6-cloro- benzotriazol-1-ilóxi-tris-pirrolidinofosfônio (PyClock) (11,386 g, 20,06 mmol, 2,0 equiv.) e dissolver completamente. Adicionar a solução ativada ao complexo de resina H-Aib-O-CTC pré-intumescida em DCM (30 mL, 1,5 vols.) após permanecer durante 3 a 5 minutos. Deixar a reação aquecer para a temperatura ambiente e agitar durante 2 horas. O material não reagido é cerca de 18%, conforme indicado pela avaliação do ensaio. Lavar com DMF duas vezes, MTBE duas vezes e DMF duas vezes (190 mL, 10 vols. para cada). Adicionar uma solução de Fmoc-lle-OH (10,63 g, 30,08 mmol, 6 equiv.) em DMF (165 mL) à Oxyma (50 mL, 0,6 M em DMF, 30 mmol, 6 equiv.) e DIC (50 mL, 0,66 M em DMF, 33 mmol, 6,6 equiv.). Agitar durante 5 minutos em torno da temperatura ambiente e, em seguida, adicionar à resina e agitar durante 18 horas. Adicionar uma mistura de piridina, anidrido acético e DMF à resina e agitar durante 0,5 horas. Lavar a resina com DMF (5 x 140 mL, 7 vols.), mais DMF (2 x 180 mL, 9 vols.), MTBE (2 x 180 mL, 9 vols.) e, em seguida, DMF (2 x 180 mL, 9 vols.).

[0053] Conduzir o restante da montagem da cadeia com a química de Fmoc padrão sequencialmente para os aminoácidos restantes. Em geral, dissolver o Fmoc-aminoácido (2,0 equiv.), HOBt (3,42 9g, 80 % em peso, 2,0 equiv.) em DMF (85 mL), seguido pela adição de DIEA (2,64 g, 2,0 equiv.). Esfriar a solução resultante para O - 5ºC com um banho de gelo e ativar pela adição de TBTU (6,45 g, 2,0 equiv.) e deixar repousar durante 3-5 min a O - 5ºC. Adicionar DCM (30 mL) à resina seguido pela adição da solução de Fmoc-aminoácido ativado. Agitar a mistura resultante em temperatura ambiente durante 2 horas. Lavar a resina resultante duas vezes com DMF, duas vezes com MTBE e novamente duas vezes com DMF (190 mL, 10 vols. para cada lavagem).

Remover o grupo Fmoc por meio de tratamento da resina de aminoácido-Fmoc com solução de desproteção (190 mL, 10 vols.) duas vezes, 10 min e 20 min, respectivamente. Lavar a resina duas vezes com DMF, duas vezes com MTBE e novamente duas vezes com DMF (190 mL, 10 vols. para cada lavagem) após drenagem da solução de de-Fmoc.

[0054] Ativar o tetrâmero Boc-Y-Aib-E(tBu)G-OH (12,25 g, 2,0 equiv.) em DMF (50 mL) com Oxyma (30 mL de 0,6 M em DMF, 20 mmol, 2 equiv.) e DIC (33 mL de 0,66 M, 22 mmol, 2,1 equiv.) durante 5 min para adicionar os últimos quatro aminoácidos como um tetrâmero. Adicionar esta mistura à resina e acoplar durante 18 horas. Escorrer a mistura ao final de 18 horas e lavar a resina com DMF (190 mL durante min cada durante 5 vezes). Adicionar mais tetrâmero (6,21 g, 1,0 equiv.) em DMF (40 mL), ativar com PyBOP (5,77 g, 1,1 equiv.) e DIEA (3,32 g, 2,6 equiv.) durante 5 min antes de adicionar esta mistura à resina e agitar durante 4 horas. Drenar a mistura ao final de 4 horas, lavar com DMF (190 mL, 5 min cada, 5 vezes). Capear a resina ao adicionar uma mistura de DMF (105 mL), piridina (13,48 g, 17 equiv.) e anidrido acético (14,27 g, 14 equiv.) à resina e agitar durante 1 hr. Lavar a resina peptídica após conclusão da montagem de cadeia, durante 5 min cada, cinco vezes com DMF (190 mL de cada vez), seis vezes com DCM (190 mL de cada vez) e, em seguida, secar sob vácuo a 35ºC, resultando no complexo de Preparação 12-resina (31,03 g, 0,2595 g/mmol teórico, 8,05 mmol, rendimento de 77,8%). Tratar uma parte do complexo de Preparação 12-resina (15,975 g, 0,2595 mmol/g, 4,146 mmol) três vezes com 1 % em volume de TFA em solução de DCM (160 mL, 10 vols.) durante 10 min cada em temperatura ambiente, seguido de lavagem com DCM (120 mL, 7,5 vols.). Neutralizar as frações de clivagem e lavar com piridina (4,74 g, proporção molar de 0,94:1 para TFA). Combinar e concentrar as frações sob vácuo até secagem a <

35ºC. Realizar reconstituição com etanol (30 mL, 5 % vol. dos filtrados combinados), seguido por concentração até secagem. Agitar o peptídeo mecanicamente em água deionizada (242 mL, 40 % vol. dos filtrados combinados) durante 10 minutos. Coletar o peptídeo bruto sólido por meio de filtração e lavar com água deionizada (4 x 100 mL). Lavar o sólido com n-heptano (4 x 100 mL), isolar e secar in vacuo a 35ºC, resultando na Preparação 12 como um pó branco (9,38 g, 82,2 % de área, 0,2% em peso de piridina-TFA, 82,1 % em peso, 3,85 mmol, rendimento de 92,8%, HRMS calc. para C103H165N13026 esperado 2000,1989, real 2000,1968).

Síntese da Preparação 13 SEQ ID NO: 13

[0055] Em um frasco sob N2 é adicionada a Preparação 9 (2,887 9, 70,2 % em peso, 1,30 mmol), Preparação 10 (3,576 g, 57,4 % em peso, 2,13 mmol, 1,63 equiv.), DMSO (18,1 g, 16,4 mL), DMF (15,8 g, 16,7 mL) e DIEA (655 mg, 5,07 mmol, 3,89 equiv.) com agitação até resultar em uma solução dourada. A solução é resfriada em água gelada antes de PyBOP (1,414 g, 2,72 mmol, 2,08 equiv.) ser adicionado. Remover o banho de gelo e deixar a mistura aquecer para a temperatura ambiente. Monitorar a reação durante cerca de 5 horas para assegurar conversão adequada. Uma alíquota de dietilamina (2,116 g, 28,9 mmol, 22,2 equiv.) é adicionada à mistura de reação em temperatura ambiente. À mistura é agitada durante cerca de uma hora para permitir uma conversão de cerca de > 99% da Preparação 13. O produto é precipitado pela adição de uma mistura a < 4ºC que tem NaHCO3 saturado aquoso (50 ml) e água deionizada (50 ml) à mistura de reação. A mistura é agitada sob condições geladas durante pelo menos cerca de 15 minutos. Uma pasta branca lamacenta é filtrada. O bolo úmido é lavado com água deionizada (3 x 50 mL), seguido de MTBE (6 x 50 mL) e secagem a 40 ºC in vacuo com purga de N2 durante cerca de 62 h. O processo resulta na Preparação 13 (4,45 g, 60,4 % de área, 16,4 % de área de dibenzofulveno, 1,18 mmol, 90,5 % de rendimento, HRMS calc. para C119H169N21024 esperado 2276,2649, real 2276,2550) como um sólido amarelo claro. Síntese da Preparação 14 SEQ ID NO: 14

[0056] Uma alíquota da Preparação 11 (3,012 g, 48,7 % em peso, 0,621 mmol, 1,00 equiv.) é adicionada a um frasco sob N2 com a Preparação 13 (3,951 g, 60,4 % em peso, 1,05 mmol, 1,69 equiv.), DMSO (9,8 g, 8,9 mL), DMF (52,0 g, 55,0 mL) e DIEA (372 mg, 2,88 mmol, 4,63 equiv.). A mistura é agitada até que surja uma solução dourada. Esfriar a mistura com água gelada para < 10ºC. Adicionar uma alíquota de PyBOP (742 mg, 1,42 mmol, 2,30 equiv.) à mistura. Remover o banho de gelo e deixar a mistura aquecer até cerca da temperatura ambiente. Monitorar a reação de conversão para a Preparação 14 durante cerca de 22 horas. Isto produz uma conversão de cerca de > 96%. Piperidina (530 mg, 6,22 mmol, 10,0 equiv.) é adicionada à mistura de reação gelada quando a temperatura é < 10ºC. A mistura é agitada em temperatura ambiente durante cerca de 2 horas para fornecer uma conversão de > cerca de 99 % para a Preparação

14. A mistura de reação é adicionada a outro frasco que contém HCl aq. a 0,5 N a < 4ºC (12,72 g, 6,23 mmol, 10,0 equiv.) e água deionizada (16,71 g) para permitir a precipitação da Preparação 14. A suspensão gelada é agitada durante cerca de 15 minutos e a suspensão branca é filtrada. O bolo úmido é lavado com água deionizada (2 x 30 mL), NaHCO3 saturado aquoso (2 x 30 ml), água deionizada (3 x 30 mL) e MTBE (4 x 45 mL) e secar a 40ºC in vacuo com purga de N2 durante cerca de 17 h. O produto, Preparação 14 (5,418 g, 48,9% de área, 0,603 mmol, 97,0% de rendimento, HRMS calc. para C231H349N35049 esperado 4397,5893, real 4397,6057) é obtido como um pó branco.

Síntese da Preparação 15 SEQ ID NO: 15

[0057] Uma alíquota de Preparação 12 (671 mg, 82,1% em peso, 0,275 mmol, 1,23 equiv.), é adicionada a um frasco sob atmosfera de N2. Preparação 14 (2,009 g, 48,9% de área, 10,7% de área de isômeros, 0,223 mmol, 1,00 equiv.), DMSO (11,1 g, 10,0 mL), DMF (19,0 g, 20,1 mL) e DIEA (76 mg, 0,588 mmol, 2,63 equiv.) são adicionados ao frasco com agitação, resultando em uma solução de cor dourada. Adicionar uma alíquota de HOAt a 0,6 M (619 mg, 0,384 mmol, 1,72 equiv.) antes de resfriamento para -5ºC. Adicionar uma amostra de PyClock (220 mg, 0,397 mmol, 1,78 equiv.). Deixar a mistura aquecer para cerca da temperatura ambiente para permitir uma conversão de cerca de 84 % para a Preparação 15. Isolar o produto através da adição da mistura de reação à água deionizada gelada (548 mL) ao longo de min, resultando na precipitação do produto. Enxaguar o frasco de reação com DMF (5 mL) e adicionar à suspensão. A suspensão é agitada durante cerca de 15 minutos, deixada aquecer para cerca da temperatura ambiente e filtrada. O bolo úmido é lavado com água deionizada (3 x 80 mL) e o sólido branco ceroso seco a 35ºC durante 3,5 dias in vacuo, resultando na Preparação 15 (2,506 g, 41,6% de área, 0,168 mmol, 73,1% de rendimento, HRMS calc. para C334H512N480O74 esperado 6379,7777, real 6379,8652) como um pó branco. Exemplo 2 Síntese do Exemplo 2 SEQ ID NO: 1

[0058] Uma amostra de TFA (19,656 g, 13,03 mL) é adicionada a um frasco sob atmosfera de N2 com DCM (815 mg, 0,62 mL), DTT (434 mg), e TIPS (362 mg, 0,47 mL). Esfriar a mistura em água gelada antes de adicionar água (468 mg, 0,47 mL). Uma amostra da Preparação 15

(1016 mg, 39,0 % de área, 0,0620 mmol) é adicionada a esta mistura a 2ºC para fornecer uma solução. Aquecer a mistura para cerca da temperatura ambiente e agitar durante cerca de 2 horas. Adicionar a mistura de reação a MTBE a -15ºC (150 mL) enxaguando o reator com MTBE (3 mL). Centrifugar a suspensão após cerca de 10 min, decantar o sobrenadante. O bolo úmido é ressuspenso em MTBE (3 x 50 mL), centrifugando para cada lavagem e decantando o sobrenadante. O bolo úmido é seco a 35ºC in vácuo, resultando no Exemplo 2 (784 mg, 26,5% de área, 0,0432 mmol, rendimento de 69,7%, HRMS calc. para C225H348N48068 esperado 4810,5249, real 4810,5642) como um sólido branco. Síntese da Preparação 16 SEQ ID NO: 16

[0059] A síntese usa resina de Fmoc-Gly-OH 2-cloro tritila com um carregamento de 0,61 mmol/g. O procedimento de SPPS geral é substancialmente — conforme descrito no presente documento. Preparação 16 resulta de clivagem suave do peptídeo na resina, conforme descrito no presente documento, usando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. A reconstrução do material concentrado é realizada com etanol (5 % vol. dos filtrados combinados) e concentração até secagem. O peptídeo é triturado com agitação em água (40 % vol. dos filtrados combinados). O sólido é isolado e seco sob vácuo a 40ºC até um peso constante para fornecer 5,24 g (99%) da Preparação 16 como um pó branco. Síntese da Preparação 18 SEQ ID NO: 17

[0060] A síntese usa resina de Fmoc-Ala-OH 2-cloro tritila com um carregamento de 0,50 mmol/g. O procedimento de SPPS geral é usado substancialmente conforme descrito no presente documento com as seguintes modificações:

Ciclo Aminoácido Condições de SPPS Comentários Solvente para acoplamentos: DMF 1 Ácido (528)-52-((((9H- Ciclos de De-Fmoc de Preparação 17 fluoren-9- 10 e 20 min com il) metóxi)carbonil)amino)- DBU/HOBt, 25-(terc-butoxicarbonil)- lavagens pós-desprot. 6 2,2-dimetil-4,23,28,37,46- x 2 minutos, pentaoxo-3,32,35,41,44- 1,7 AA/3,0 HOBt/3,0 pentaoxa-24,29,38,47- ' TBTU/3 O DIEA ' tetra-azatripentacontan- 2h, ta. 53-0ico 2 Fmoc-L-GlIn(Trt)-OH Ciclos de De-Fmoc de Capeamento 10 e 20 min, realizado no final lavagens pós-desprot. 6 | usando: mistura x 2 minutos, de Ac20/Pyr em

1. 3,0 AA/3,0 HOBt/3,0 temperatura TBTU/3,0 DIEA, 2h, t.a. ambiente

2. Reacoplar 1,5 AA/1,5 HOBt/1,5 TBTU/1,5 DIEA, 4h, t.a. 3 Fmoc-L-Ala-OH Ciclos de De-Fmoc de 10 e 20 min, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 2,0 AA/2,0 HOBt/2,0 TBTU/2,0 DIEA, 2h, t.a. 4 Fmoc-L-lle-OH Ciclos de De-Fmoc de 10 e 20 min, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 2,0 AA/2,0 HOBt/2,0 TBTU/2,0 DIEA, 2h, t.a. Fmoc-L-Lys(Boc)-OH Ciclos de De-Fmoc de e 20 min, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 2,0 AA/2,0 HOBt/2,0 TBTU/2,0 DIEA, 2h, t.a. Fmoc-L-Asp(tBu)-OH Ciclos de De-Fmoc de 10 e 20 min, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 2,0 AA/2,0 HOBt/2,0 TBTU/2,0 DIEA, 2h, t.a. Clivagem Suave de Preparação 18:

[0061] Uma amostra de 42,13 g de peptídeo no intermediário de resina é colocada em um frasco e tratada 3 vezes com 10 volumes (400 mL) de TFA a 1 %6/DCM durante 10 min cada, seguido por lavagem com DCM. Cada tratamento é extinto através da adição de 4,4 mL de piridina. As soluções resultantes são combinadas e concentradas in vacuo. À reconstituição é realizada com etanol (25 mL), seguido de concentração até secagem para proporcionar 56,6 g de semissólido espumoso. Um volume de 400 mL de água é adicionado 10 vezes para fornecer uma suspensão. A suspensão é filtrada e lavada com água. O sólido é isolado e seco sob vácuo a 40ºC até um peso constante para produzir 23,3 g de Preparação 18 como um pó branco. Síntese da Preparação 17

[0062] Ácido — ((528)-52-((((9H-fluoren-9-il)metóxi)carbonil)amino)- 25-(terc-butoxicarbonil)-2,2-dimetil-4,23,28,37 ,46-pentaoxo- 3,32,35,41 ,44-pentaoxa-24,29,38,47-tetra-azatripentacontan-53-oico)

[0063] Preparação 6 (80 g, 92 mmol), DIEA (17,53 m L, 101 mmol), TSTU (30,3 g, 101 mmol) e acetonitrila (1 L) são carregados em um recipiente e agitados a 23ºC durante 17 h. A solução é concentrada, em seguida, o resíduo de cor laranja resultante é redissolvido em EtOAc (1,6 L), em seguida lavado com HCl a 0,1 M (2x 1L). A camada orgânica é lavada com água (2 X 1 L), em seguida, seca sobre MgSOA4, filtrada e concentrada in vacuo para deixar um óleo de cor laranja (83 g). Um segundo lote é executado na mesma escala e combinado para fornecer 123 g de óleo bruto. O éster intermediário (123 g, 110 g ativo, 113 mmol) é dissolvido em EtOH (700 mL), em seguida, Fmoc-lisina (45,9 g, 125 mmol) e DIEA (21,70 m L, 125 mmol) são adicionados e a reação agitada 17 horas. Após conclusão da reação, o EtOH é removido in vacuo para deixar um óleo laranja (201 g). O resíduo é dissolvido em EtOAc (1,1 L) e lavado com solução de HCI a 0,1 M (3 x 400 mL), em seguida, solução aquosa de NaHCO3 (400 mL). As camadas são separadas e, em seguida, a camada orgânica é lavada com uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio (1 x 400 mL). Os orgânicos são concentrados para produzir um óleo de laranja (- 190 g). Acetona (400 ml) é adicionada, em seguida, a resultante suspensão é filtrada para remover os inorgânicos. A mistura é concentrada, então, purificada por meio de cromatografia de fase normal (1,1 kg de sílica preparada com heptano/acetona a 60/40) e eluida com aumento da polaridade do eluente (coleta de frações de — 3L). Frações de pelo menos 95 % de área de HPLC são combinadas e concentradas para fornecer óleo amarelo espesso (70 g) de Preparação P17. Síntese da Preparação 19A SEQ ID NO: 18

[0064] A síntese usa resina de Fmoc-Leu-OH 2-cloro tritila com um carregamento de 0,65 mmol/g. O procedimento de SPPS geral é usado com as seguintes modificações: ; A: Condições de SPPS Solvente para acoplamentos: DMF ciclos de 4 x 30 minutos de De-Fmoc, Aba lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 1 Fmoc-Aib-OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 8h, ta. ciclos de 4 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 2 Fmoc-L-lle-OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 18h,ta. ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 3 Fmoc-L-Ser(tBu)-OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta. ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 4 Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, S | FmoclAsp(Bu-OH — | 39 n4/33 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta. ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, mm ' lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, Fmoc-L-Ser(tBu)-OH — | 35 n4/33 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta.

ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 7 | FmooL-ThríBu-OH — | 39 n4/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta. ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, 1 .Phe. lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, Fmoc-L-Phe- OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta ciclos de 4 x 30 minutos de De-Fmoc, Fmoc-Gly-Thr (wMe, | lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, MePro)-OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 18h,ta. ciclos de 4 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, | Fmoc-L-Glu(tBu)-OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 8h, ta. ciclos de 4 x 30 minutos de De-Fmoc, Aba lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 11 | Fmoc-Aib-OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 18h,ta. ciclos de 4 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 12 | BocL-Tyr(tBu)-OH 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 18h,ta.

[0065] A Preparação 19A derivada de pseudoprolina pode ser processada no Exemplo 3 de maneira análoga à Preparação 19B, conforme descrito no presente documento. Síntese da Preparação 19B SEQ ID NO: 19

[0066] A síntese usa resina de Fmoc-Leu-OH 2-cloro tritila com um carregamento de 0,65 mmol/g. A Preparação 19B é preparada usando o procedimento de SPPS substancialmente conforme descrito no presente documento. Ciclo | Aminoácido Condições de SPPS Comentários Solvente para acoplamentos: DMF 1 Fmoc-Aib-OH | ciclos de 4 x 30 minutos de De-Fmoc, lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 8h, ta.

2 Fmoc-L-lle- ciclos de 4 x 30 minutos de De-Fmoc, OH lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 18h, ta. 3 Fmoc-L- ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, Ser(tBu)-OH | lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta. 4 Fmoc-L- ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, Tyr(tBu)-OH — | lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta Fmoc-L- ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, Asp(tBu)-OH | lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta. Fmoc-L- ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, Ser(tBu)-OH | lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta. 7 Fmoc-L- ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, Thr(tBu)-OH | lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta. Fmoc-L- Phe- | ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, OH lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta Fmoc-L- ciclos de 3 x 30 minutos de De-Fmoc, Thr(tBu)-OH | lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4h,ta Boc-Tyr(tBu)- | ciclos de 4 x 30 minutos de De-Fmoc, | Capeamento Aib-Glu(tBu)- | lavagens pós-desprot. 6 x 2 minutos, — | realizado no Gly-OH 1.2.0 AA/2.2 DIC/2.0 Oxyma final — usando: 6h, ta. mistura de

2. acoplar, 1,0 AA/1,1 PyBOP/2,5| P20/Pyr DIPEA, 4 h, ta Clivagem Suave de Preparação 19B:

[0067] A preparação 19B é preparada usando clivagem suave de 19B ligada à resina substancialmente conforme descrito no presente documento usando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Consulte, por exemplo, o método da Preparação 18. O sólido resultante é isolado e seco sob vácuo a 30-40ºC até um peso constante para render 2,94 g do produto como um pó amarelo claro. Síntese da Preparação 20 SEQ ID NO: 20

[0068] A uma solução da Preparação 1 (4,25 g, 4,166 mmol) e Preparação 16 (5,00 g, 3,340 mmol) em DMSO/DMF (1:1, 200 mL) é adicionado PyBOP (2,60g, 5,00 mmol) e DIEA (1,75 mL, 10,0 mmol) em temperatura ambiente. A solução é agitada durante 18 horas e depois extinta pela adição de um excesso de dietilamina (10,0 mL). A solução extinta é agitada durante 2 horas e, então, lentamente adicionada a uma solução saturada aquosa de bicarbonato de sódio/água (1:1, 300 mL) a 0ºC. O precipitado resultante é agitado durante 10 minutos e depois coletado por meio de filtração. O filtrado é lavado sucessivamente com água (3 x 150 mL), seguido por éter metil terc-butílico (3 x 150 mL). O sólido é seco sob vácuo a 40ºC para fornecer a Preparação 20 como um sólido branco (5,30 g, rendimento de 69%, HRMS calc. para C119H169N21024 esperado 2276,2649, real 2276,2652). Síntese da Preparação 21 SEQ ID NO: 21

[0069] A uma solução da Preparação 20 (1,00 g, 0,44 mmol) e Preparação 18 (0,90 g, 0,40 mmol) em DMSO/DMF (1:1, 20 ml) é adicionado PyBOP (314 mg, 0,30 mmol) e DIEA (0,21 mL, 1,20 mmol) em temperatura ambiente. A solução é agitada durante 18 horas e depois extinta com piperidina (0,79 mL, 4,00 mmol). A solução extinta é agitada durante 2 horas e, em seguida, esfriada para O ºC e extinta com uma solução diluída de HCI (50 mL). A suspensão resultante é agitada durante 10 minutos e o sólido é coletado por meio de filtração. O filtrado é lavado sucessivamente com solução saturada aquosa de bicarbonato de sódio (2 x 50 mL), água (3 x 50 mL), seguido por éter metil terc- butílico (3 x 50 mL). O sólido é seco sob vácuo a 40 ºC durante 18 horas para proporcionar a Preparação 21 como um sólido branco (1,80 9, 106% de rendimento, HRMS calc. para C225H338N34048 esperado 4284,5053, real 4284,5062). Síntese da Preparação 22 SEQ ID NO: 22

[0070] A uma solução da Preparação 21 (214 mg, 0,05 mmol) e Preparação 19B (116 mg, 0,055 mmol) em DMSO/DMF (1:1, 3 mL) é adicionado PyBOP (57 mg, 0,11 mmol) e DIEA (58 uL, 0,33 mmol) em temperatura ambiente. A solução é agitada durante 18 horas e depois extinta com uma mistura a 1:1 de bicarbonato de sódio aquoso saturado e água (10 mL). A suspensão resultante é agitada durante 10 minutos e o sólido resultante é coletado por meio de filtração. O sólido é lavado com água (3 x 10 mL) e o sólido é seco sob vácuo a 40ºC para proporcionar a Preparação 22 (285 mg, 89% de rendimento, HRMS calc. para C334H512N480O74 esperado 6379,777, real 6379.7730). Exemplo 3 Síntese do Exemplo 3 SEQ ID NO: 1

[0071] Uma solução de TFA (23 mL), água (0,1 mL), tri- isopropilsilano (0,1 mL) e DTT (75 mg) é esfriada para 0ºC, adicionada à solução da Preparação 22 (100 mg, 0,015 mmol) e a mistura de reação é deixada aquecer para a temperatura ambiente e agitada durante 2 horas. A mistura resultante é vertida em uma solução pré-resfriada (- 20ºC) de éter metil terc-butílico (25 mL). O precipitado resultante é mantido durante 15 minutos a —-20ºC e a suspensão é centrifugada e lavada com éter metil terc-butílico (2 x 25 mL). O sólido é seco sob vácuo a 35ºC durante 18 horas para se obter o Exemplo 3 como um sólido branco (71 mg, 93% de rendimento, HRMS calc. para C225H348N46068 esperado 4810,5249, real 4810,5036). Etapa 1

[0072] Etapa 1: Uma solução de corrente da Preparação 25 (1,05 equiv.) é preparada em 5 vols. de DMSO/ACN (90:10 v/v). Uma segunda solução de corrente da Preparação 26 é preparada em 20 vols. de DMSO/ACN (90:10 v/v). Uma terceira solução de corrente é preparada de PyOxim (1,5 equiv.) em 3 vols. de ACN. Uma quarta corrente de DIEA (4 equiv.) em ACN é preparada. As três primeiras correntes são bombeadas para um misturador e, na saída do misturador, o DIEA é combinado e a mistura é bombeada através de outro misturador e através de um reator de fluxo em pistão durante um tempo de residência de 2 h em um banho de temperatura constante de 20ºC. Na saída do reator, ácido acético pode ser adicionado para consumir o restante do PyOxim (hexafluorofosfato de 1-ciano-2-etóxi-2-oxoetilidenoaminoóxi- tris-pirrolidino-fosfônio). Após > 2 h, dietilamina pura (10 equiv.) é adicionada e misturada através de um misturador. Esta corrente progrediu para um segundo reator de fluxo em pistão com um tempo de residência de 1 h em um banho de temperatura constante de 20ºC. À solução do produto da Preparação 27 é coletada e enviada através de nanofiltração com solução de DMSO/ACN a 70/30 para remoção de reagentes para 10-20 diavolumes.

[0073] Uma solução de corrente da Preparação 25, 2,40 kg, 96,7 % em peso, 2,274 mol) é preparada ao dissolver o sólido em DMSO (13,88 kg, 12,62 L) e diluir a solução com ACN (1,09 kg, 1,39 L), criando uma solução da Preparação 25 (114,3 mg/mL, 0,112 M) em DMSO:ACN a 90:10 v/v. Uma segunda solução de corrente da Preparação 26 (SEQ ID NO: 26, 2,79 kg, 98,6% em peso, 1,836 mol) é preparada ao dissolver o sólido em DMSO (54,8 kg, 49,8 L) e diluir com ACN (4,3 kg, 5,47 L), criando uma solução da Preparação 26 (45,5 mg/mL, 0,030 M) em DMSO:ACN a 90:10 v/v. Uma terceira solução de corrente é preparada de PyOxim (4,5 kg, 8,53 mol) em ACN (47,33 kg, 60,22 L) criando uma solução a 0,132 M. DIEA é adicionado como um líquido puro. A solução da Preparação 25 (14,91 L, 1,704 kg, 1,670 mol, 0,95 equiv., 5,9 g/min) e Preparação 26 (58,46 L, 2,660 kg, 1,750 mol, 1,00 equiv., 22,5 g/min) e PyOxim (1,4 equiv., 5,4 gímin) é bombeada para um misturador combinada com DIEA puro (4,0 equiv., 0,446 mL/min) a 20ºC. A mistura é bombeada através de outro misturador e através de um reator de fluxo em pistão durante um tempo de residência de 3 h em um banho com temperatura de 20ºC e coletado ao longo de 42,9 h, resultando em 88,6 kg de solução do produto.

[0074] Nanofiltração é um processo de filtração com base em membrana que é usado para separar espécies químicas com base em suas diferenças de tamanho e peso molecular. A solução produto da Preparação 27 contêm s reagentes (dietilamina, PyOxim, DIEA, etc.) e subprodutos indesejados (por exemplo, dibenzofulveno) que é desejável remover antes de prosseguir para a próxima etapa. À nanofiltração é aplicada para remover espécies indesejadas (peso molecular < 500 Da).

[0075] A solução de produto da Preparação 27 é carregada em um tanque de corrente NF e bombeada em um circuito de recirculação através de um permutador de calor e uma unidade de nanofiltração que contém uma membrana adequada (cerâmica ou polimérica) para causar a separação desejada. As espécies indesejáveis são removidas do permeado e coletadas separadamente ou descartadas. A fim de manter um volume constante no tanque de NF, solvente fresco ou seja, DMSO/ACN a 70:30 v/v, é continuamente bombeado para corresponder à taxa de permeado extraída. A solução do produto da Preparação 27 é purificada por meio de nanofiltração e transportada diretamente para a Etapa 2.

[0076] A solução da Preparação 27 protegida com Fmoc em DMSO/ACN (88,6 kg) e dietilamina (1,34 kg) é adicionada a um reator. A mistura é agitada a 20ºC durante 2 h, resultando na Preparação 27

(87,6 L, 38,45 mg/mL, 3,37 kg, 1,48 mol). A solução de produto da Preparação 27 é carregada para um tanque de corrente de nanofiltração e, em seguida, é bombeada em um circuito de recirculação através de um permutador de calor e uma unidade de nanofiltração que contém uma membrana adequada (cerâmica ou polimérica) para causar a separação desejada. As espécies indesejadas são removidas no lado do permeado e coletadas separadamente ou descartadas. A operação é continuada até que a remoção suficiente de impurezas indesejadas seja obtida. A fim de manter um volume constante no tanque de nanofiltração, DMSO/ACN a 70:30 v/v fresco é continuamente bombeado para coincidir com a taxa de permeado extraída. Isto resulta na Preparação 27 em DMSO/ACN (72,4 L, 40,8 mg/mL, 2,95 kg, 1,30 mol, rendimento de 78,1% através do acoplamento, deFmoc e nanofiltração). Etapa 1 Exemplificação - Resultados analíticos.

[0077] HPLC confirma a conversão da Preparação 25 e Preparação 26 à Preparação 27. O método de análise usa uma coluna de fase estacionária de fenil hexila a 65ºC (2,1 mm id x 150 mm x tamanho de partícula de 1,7 mícrons) com um gradiente de 2-98 % B em TFA a 0,1% em água e acetonitrila ao longo de 12 minutos. Detecção por UV a 214 nm é usada para este material.

[0078] A Tabela A.1 mostra dados de espectrometria de massa de alta resolução coletados para o produto da reação de acoplamento da Etapa 1 (Preparação 27 protegida com Fmoc) e o produto da reação de desproteção da Etapa 1 (Preparação 27). A precisão da massa é a métrica usada para confirmar a correspondência das espécies medidas com as espécies previstas.

Composto Fórmula química Massa lons Estado Massa Preci- Monoisotró | observados de Monoisotró | são de pica m/z carga pica massa Teórica Calculada (ppm) (neutro) (neutra) Prepara- | C134H179N21026 | 2498,333 | 2499,3402 1 2498,3329 | 0,05 ção 27 Protegida com Fmoc Prepara- | C119H169N21024 | 2276,2649 | 2277,2743 1 2276,267 ção 27 Tabela A.1 Confirmação da Preparação 27 e Preparação 27 protegida com Fmoc medida através da precisão de massa calculada usando dados de espectrometria de massa de alta resolução. Etapa 2 SEQ ID NO:28 + —SEQIDNO:27 SEQ ID NO:29 Esquema A.2 Síntese da Preparação 29 (SEQ ID NO: 29) a partir de fragmentos da Preparação 27 (SEQ ID NO: 27) e Preparação 28 (SEQ ID NO: 28). Etapa 2 Química Etapa 2 H-E-V-QWA1A-A-6-G-P-$-5-6-A-P-P-P-S-tot, tribos “BuiBu “su Preparação 27 o o sis go o o dom õ mta das sido da * o " À Preparação 28 mos o H o. NS As of A guadus WAL1-A-G-G-P-S$-$-G-A-P-P-P-S-nn, mid fa tados ae ee Preparação 29

[0079] Etapa 2: Uma solução de corrente da Preparação 28 (1,15 equiv.) é preparada em 10 vols. de DMSO/ACN (90:10 v/v). Uma segunda solução de corrente é preparada de PyOxim (2 equiv.) em 1 vol. de ACN. Uma terceira corrente de DIEA (3 equiv.) em ACN é preparada (solução a 5 % em peso). A solução da Preparação 27 da Etapa 1 e as correntes da Preparação 28 e PyOxim são bombeadas para um misturador e, na saída do misturador, DIEA é combinado e a mistura é bombeada através de outro misturador e através de um reator de fluxo em pistão durante um tempo de residência de 2 h em um banho com temperatura constante de 20ºC. Na saída do reator, ácido acético pode ser adicionado para consumir o PyOxim residual. Após > 2 h, dietilamina pura (10 equiv.) é adicionada e misturada através de um misturador. Esta corrente progride para um segundo reator de fluxo em pistão com um tempo de residência de 1 h em um banho com temperatura constante de 20 ºC. A solução do produto da Preparação 29 é coletada e enviada através de uma nanofiltração com solução DMF como um diafiltrante para remover reagentes para 10-20 diavolumes.

[0080] Uma solução de corrente da Preparação 28 (4,68 kg, 98,9 % em peso, 2,058 mol) é preparada ao dissolver o sólido em DMSO (41,75 kg, 37,95 L) e diluir a solução com ACN (3,3 kg, 4,20 L), criando uma solução da Preparação 28 (94,7 mg/mL, 0,0421 M) em DMSO:ACN a 90:10 v/v. Uma segunda solução de corrente é preparada de PyOxim (3,0 kg, 5,69 mol) em ACN (11,81 kg, 15,03 L) criando uma solução de 0,327 M. DIEA é adicionado como um líquido puro. As correntes da solução da Preparação 27 da Etapa 1 (73,86 L, 41,2 mg/mL, 3,04 kg, 1,336 mol, 0,0181 M, 1,0 equiv., 29,9 gyímin) e Preparação 28 (1,3 equiv., 17,7 g/min) e PyOxim (2,1 equiv., 2,9 g/min) são bombeadas para um misturador e, na saída do misturador, a corrente é ajustada a ºC e combinada com DIEA puro (4,0 equiv., 0,374 mL/min) a 20ºC. A mistura é bombeada através de outro misturador e através de um reator de fluxo em pistão durante um tempo de residência de 3 h em um banho com temperatura de 20ºC e coletado ao longo de 43,2 h,

resultando em 129,35 kg de solução do produto da Preparação 29.

[0081] Um processo de nanofiltração substancialmente conforme descrito no presente documento acima usa a solução resultante da Preparação 29 em vez da solução resultante da Preparação 27.

[0082] Um processo de nanofiltação que usa solução de Preparação 29 protegida por Fmoc em DMSO/ACN é conduzido substancialmente conforme descrito no presente documento. A Preparação 29 protegida com Fmoc (129,35 kg) e dietilamina (2,0 kg) são adicionadas a um reator para nanofiltração. O processo de nanofiltração resulta na Preparação 29 em DMF (98,85 g, 42,24 mg/ml, 4,18 kg, 0,974 mol, rendimento 73,1 % entre o acoplamento, deFmoc e nanofiltração).

[0083] HPLC confirma a síntese da Preparação 29 a partir de Preparação 28 e Preparação 27. O método de análise usa uma coluna de fase estacionária C4 a 65 ºC (2,1 mm id x 150 mm x tamanho de partícula de 1,7 mícrons) com um gradiente de 25-98 % Bem TFA a 0,1% em água e acetonitrila ao longo de 12 minutos. Detecção por UV a 214 nm é usada para este material.

[0084] A Tabela A.3 mostra dados de espectrometria de massa de alta resolução coletados para o produto da reação de acoplamento da Etapa 2 (Preparação 29 protegida com Fmoc) e o produto da reação de desproteção da Etapa 2 (Preparação 29). A precisão da massa confirma o produto da espécie medida. Massa monoisotópica da espécie neutra.

Compos- | Fórmula química Massa Íons Estado Massa Precisão

TT E EEE Teórica mz Calculada (ppm) (neutra) (neutra) Protegi- Emo ção 29

[0085] Tabela A.3 Confirmação da Preparação 29 e Preparação 29 protegida por Fmoc medida através da precisão de massa calculada usando dados de espectrometria de massa de alta resolução. Etapa 3 Esquema A.3 Síntese da Preparação 31 (SEQ ID NO: 31) a partir de fragmentos da Preparação 30 (SEQ ID NO: 30) e Preparação 29 (SEQ ID NO: 29). soc A onda od, neo id pursagacerass aeoefm Preparação 2º mb icone dio | Preparação 30 acusa rena A dr E E EEE a AA perv eia een e soa neem

[0086] Etapa 3. Descrição do Processo Descontínuo: A uma solução nanofiltrada em DMF de Preparação 29 (2,249 g, 46,5 mg/9g, 104,6 BMG, 0,0244 mmol) e Preparação 30 (71,5 mg, 90,6% de área, 0,0306 mmol) em DMF (0,3068 g, 0,325 mL) a - 5ºC é adicionada uma solução de DIEA a 5,0% em peso em DMF (114,0 mg, 5,70 mg DIEA, 0,0441 mmol, 1,8 equivalentes) e uma solução a 10,1% em peso de hexafluorofosfato de3-óxido de (1-[bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3- triazolo[4,5-b]piridínio (HATU) em DMF (154,9 mg, 15,59 mg HATU, 0,0410 mmol, 1,7 equivalentes). A solução é agitada durante 4 horas a -5ºC e, em seguida, extinta com bicarbonato de sódio aquoso a 5% em peso (5,295 g, 4,8 mL) em temperatura ambiente, o qual é adicionado ao longo de 15 minutos. A suspensão resultante é agitada a 0ºC durante minutos e o sólido resultante é coletado por meio de filtração. O sólido é lavado com água (4 x 2 mL) e, em seguida, lavado com MTBE

(4 x 2 mL). O sólido gomoso é seco sob vácuo a 35ºC para gerar a Preparação 31 (219,7 mg, 47,6 % de área, 0,0164 mmol, rendimento de 67,1%).

[0087] Uma solução de corrente da Preparação 30 é preparada em 10 vols. de DMF. Uma segunda solução de corrente é preparada a partir de HATU (1,8 equiv.) com solução de ACN a 10 % em peso. Uma terceira corrente de DIEA (2,5 equiv.) em DMF é preparada (solução a % em peso). A solução da Preparação 29 da Etapa 2 e as correntes da Preparação 30 e DIEA são bombeadas para um misturador e, na saída do misturador, a corrente é resfriada e combinada com solução gelada de HATU. A mistura é bombeada através de outro misturador e através de um reator de fluxo em pistão durante um tempo de residência de 3 h em um banho com temperatura constante de - 5ºC e coletada. Uma solução de salmoura/bicarbonato (solução aquosa, cloreto de sódio aq. a 17% em peso, bicarbonato de sódio aq. a 0,5% em peso) com uma carga de sal de 19% em peso é preparada. A solução resultante da Preparação 31 em DMF é, então, bombeada para um reator de suspensão mista de produtos mistos (MSMPR) juntamente com a solução salina para formar um precipitado. A tau no reator de suspensão mista de produtos mistos é de 1 hora. O segundo MSMPR é executado mais gelado durante uma tau de 1 hora e esta suspensão é carregada para um filtro intermitentemente. A suspensão é lavada com água e seca sob vácuo a 35ºC.

[0088] Uma corrente de solução de Preparação 30 (9,42 kg, 83,6 % em peso, 3,72 mol) é preparada em DMF (54,12 kg), criando uma segunda corrente de solução a 0,0563 M. DIEA é preparada a partir de HATU (1,15 kg, 3,02 mol) em ACN (10,4 kg), criando uma corrente a 0,215 M. DIEA é adicionado como um líquido puro. As correntes de solução da Preparação 29 da Etapa 2 (98,85 L, 42,24 mg/mL, 4,18 kg, 0,975 mol, 0,0099 M, 1,0 equiv., 40,2 g/min) e a Preparação 30 (1,3 equiv., 9,2 gímin) e DIEA (2,1 equiv., 0,152 mL/min) são bombeadas para um misturador.

Na saída do misturador, a corrente é resfriada a 0ºC e combinada com solução de HATU gelada (2,0 equiv., 3,2 g/min) a 0ºC.

A mistura é bombeada através de outro misturador e através de um reator de fluxo em pistão durante um tempo de residência de 4 em um banho com temperatura de 0ºC e coletada ao longo de 42 h, resultando em 131,8 kg de solução de produto.

A solução de produto é precipitada em duas seções.

Uma solução a 17% em peso de NaCl aq./0,5 % em peso de NaHCO3 aq. (29 kg) é combinada com DMF (13,2 kg) em um reator inerte e resfriada para não mais do que 20ºC.

À solução de produto em DMF (66,6 kg) é, então, coadicionada com 17% em peso de NaCl aq./0,5 % em peso de NaHCOS3 ag. (34,4 kg) ao reator ao longo de 1 h, mantendo 20ºC, resultando na precipitação do produto, Preparação 31. A suspensão é esfriada para 5ºC ao longo de 1 h, antes de água (32,2 kg no total) ser adicionada em duas porções.

À suspensão a 5ºC é agitada durante 0,5 h, antes da suspensão ser filtrada.

O bolo úmido é ressuspenso em água (63,9 kg) durante 0,5 h e filtrado.

A segunda seção da solução de produto é precipitada de maneira comparável.

Uma solução de 17 % em peso de NaCl aq./0,5 % em peso de NaHCO3 ag. (29 kg) e DMF (13,55 kg) são combinados em um reator e resfriados para não mais de 20 ºC.

A segunda seção da solução de produto em DMF (65,2 kg) é coadicionada a 17 % em peso de NaCl aq./0,5 % em peso de NaHCO3 aq. (36,8 kg) ao reator ao longo de 1 h, mantendo 20ºC, resultando na precipitação do produto, Preparação 31. A suspensão é esfriada para 5 ºC ao longo de 1,25 h, antes de água (32,1 kg no total) ser adicionada em duas porções.

À suspensão é agitada durante 0,5 h, antes de ser filtrada por cima do primeiro bolo úmido.

O bolo úmido combinado é ressuspenso com água duas vezes (64 kg cada) durante 0,5 h cada e filtrado.

Isto é, seguido por duas lavagens de deslocamento com água (64 kg cada). O bolo úmido lavado combinado é purgado com N2 e, em seguida, seco sob vácuo a 38ºC até a K.F. ser < 4% em peso, resultando na Preparação 31 (10,34 kg, potência assumida de 60%, 0,972 mol, rendimento assumido de 100%). Exemplo 3 Tirzepatida (SEQ ID NO: 1) scg LA nana, AAA o Corn ara, Amo de flotvdado cupia, at do RA RO VA OR RARA sea Mad a a AA Mion aÃ | o E ins opa sm Exemplo 3 Sa drcissarea fuamia er nesriavirÃa me e me

[0089] Uma solução de TFA (23 mL), água (0,1 mL), tri- isopropilsilano (TIPS, 0,1 mL) e Ditiotreitol (DTT, 75 mg) é esfriada para 0ºC. Adicionar à solução da Preparação 31 (100 mg, 0,015 mmol) e a mistura de reação é deixada aquecer para a temperatura ambiente e agitada durante 2 horas. A mistura resultante é vertida para uma solução pré-resfriada (-20ºC) de MTBE (25 mL). O precipitado resultante é mantido durante 15 minutos a - 20ºC e a suspensão é centrifugada e lavada com MTBE (2 x 25 mL). O sólido é seco sob vácuo a 35ºC durante 18 horas para se obter o Exemplo 3 como um sólido branco (71 mg, 93 % de rendimento, HRMS calc. para C225H348N46068 esperado 4810,5249, real 4810,5036).

[0090] A um reator inerte a 15ºC é adicionado DCM (27,3 kg, 20,6 L), água (4,1 kg), Preparação 31 (10,34 kg, potência assumida de 60%, 0,972 mol) e DTT (3,10 kg). Em um reator inerte separado é adicionado TFA (154,1 kg, 103,4 L) e TIPS (3,2 kg, 4,2 L). A solução de TFA/TIPS é adicionada à suspensão da Preparação 31, DCM, água e DTT em

0,25 h, formando uma solução incolor, e aquecida e mantida a 20ºC durante 3 h. Após 3 h a 20ºC, o reator é esfriado para - 10ºC. Em um reator separado, MTBE (382,4 kg, 516,8 L) é adicionado, o qual é esfriado para - 20ºC. Uma parte deste MTBE gelado (91,8 kg, 124,1 L) é adicionada à solução de reação gelada durante 2 h, mantendo a - 5ºC a - 18ºC. O MTBE gelado restante (294.3 kg, 397,7 L) é adicionado ao longo de 1,5 h mantendo a - 5ºC a - 18ºC, resultando na precipitação do Exemplo 3. A suspensão é ajustada para O ºC e mantida durante > 0,5 h antes de ser filtrada em três seções. O bolo úmido combinado é ressuspenso com MTBE (114,7 kg, 155 L) duas vezes e filtrado antes de uma lavagem de deslocamento final com MTBE (114,7 kg, 155L). O bolo úmido é seco a 28ºC até < 4,5 % em peso de MTBE ser medido. Isto resultou no Exemplo 3 (7,77 kg, 46,8 % em peso, 0,755 mol, 77,7% de rendimento). Exemplo 4A (SPPS Linear) Tirzepatida (SEQ ID NO: 1) MD Resina de Sieber

I | O ] Preparação 23 | et

RITA Preparação 24 | '

dna, storogrigiers uracon e oarer Até) | fit fedao cmo gos O “E Depsi Peplídeos Serina TOPS pepticos. nha -mesiradus sestôatrasentos emisúas.es restivas de Serina-e Traonina: | meo Anda menina des Arre Exemplo 44

[0091] Resina Fmoc de Sieber (17 kg, 0,76 mmol/g) é carregada em um reator. A resina é intumescida com DMF, agitada durante 2 horas e, em seguida, o DMF é removido por meio de filtração da resina. A resina é, então, lavada com DMF por um total de duas vezes. A resina protegida com Fmoc é, então, desprotegida usando tratamentos com Pip a 20 %/NMP. Amostragem para verificar a remoção de Fmoc é realizada após o último tratamento com PIP/NMP para confirmar remoção de > 99 % de Fmoc por meio de análise UV (alvo IPC < 1% de Fmoc restante). Após o tratamento final com PIP a 20 % p/p/NMP, o leito de resina é lavado várias vezes com DMF. A cadeia principal do peptídeo é, então, construída usando as seguintes condições gerais para cada acoplamento de aminoácido e desproteção: [pesoto correo | PPSSSRREOS [mec] mms ar fomen esproteção em E E Solução de reação de resina acoplamento — | — Aminodeido | doem | [| oomaPure | | 30equiv |

EFE EEEEELDe Tese | ammmro | o mess acoplamento [ronstncanas | ERES fome fo PES] aro fome pós-ivDde sem a es intumescimento resina

[0092] Desproteção de Fmoc: A resina no reator de peptídeos é tratada com três ou quatro cargas da solução de PIP a 20 % v/v/NMP. Cada tratamento é agitado na resina durante 30 min, seguido por filtração para concluir a remoção do grupo de proteção Fmoc. Após o tratamento final com PIP a 20 % v/v/NMP, o leito de resina é lavado um mínimo de seis vezes com DMF na carga e volume de DMF pré- especificados.

[0093] Ativação de Aminoácidos: Uma solução pré-preparada de Oxyma Pure/NMP a 12 % p/p é carregada em um reator. O aminoácido- Fmoc selecionado é, então, adicionado. A mistura é agitada a 20 + 5ºC até o aminoácido-Fmoc estar completamente dissolvido. As soluções de Fmoc-AA/Oxyma Pure/NMP são, então, resfriadas para 15 + 3ºC antes da ativação para assegurar que a reação de ativação exotérmica secundária seja controlada e a temperatura da solução resultante seja mantida na faixa especificada de 20 + 5ºC. A solução de aminoácidos é, então, ativada pela adição de DIC. A solução de éster ativado é, então, agitada durante 20-30 min antes de transferência da solução para o reator que contém o peptídeo sobre o intermediário de resina.

[0094] Acoplamento: Após conclusão da etapa de pré-ativação, a solução de éster ativado é transferida para o reator que contém o peptídeo desprotegido sobre a resina para iniciar a reação de acoplamento. A reação de acoplamento peptídico é agitada a 20 + 5ºC durante pelo menos 4 horas. Após o tempo de agitação necessário, a suspensão de resina é amostrada para a conclusão do acoplamento

(IPC). A amostragem é repetida em intervalos específicos, conforme necessário, até que um resultado pelo IPC aprovado seja obtido. Operações de reacoplamento são realizadas, se necessário. Quando o acoplamento está concluído, o conteúdo da solução do reator de peptídeos é filtrado, em seguida, o peptídeo sobre o intermediário de resina é lavado várias vezes com DMF para preparar o próximo acoplamento.

[0095] Acoplamento de lle(12) a Aib(13): O acoplamento de Fmoc- Ille(12) a Aib(13) é realizado usando uma abordagem de anidrido simétrico que usa seis equivalentes do Fmoc-AA, três equivalentes de DIC. O tempo de ativação é estendido para 40-60 min para esta sequência para assegurar a formação das espécies de anidrido simétrico ativado. Um tempo de agitação de acoplamento estendido (18 h) é necessário para atingir a conclusão da reação (< 1 % desacoplado) conforme determinado por análise HPLC.

[0096] Desproteção de Lys(20)ivDe (Preparação 23): Uma desproteção seletiva do grupo Lys(20)ivDde dos 39 aminoácidos totalmente protegidos no esqueleto do peptídeo sobre resina de Boc- Tyr(1)-Ser(39) é realizada. A desproteção é conseguida usando hidrato de hidrazina a 8% p/p em solução de DMF com agitação durante 4 h em temperatura ambiente. A reação de desproteção é monitorada por HPLC visando um limite de IPC de < 1% do componente Lys(ivDde) remanescente após desproteção. O fragmento peptídico resultante (Preparação 23) é lavado repetidamente (8x) com DMF para remover completamente a hidrazina residual. O fragmento da Preparação 23 totalmente construído é lavado quatro vezes com IPA e depois seco a < 40ºC até ser alcançado um LOD de < 1%). A Preparação 23 é embalada e armazenada gelada (-20ºC) antes de acoplamento com a Preparação 6.

[0097] Acoplamento da Preparação 6 à Preparação 23: Preparação

6 (1,5 equiv.) e PyBOP (1,5 equiv.) sólidos são carregados em um reator, seguido por DMF e a mistura é agitada até ocorrer dissolução. Colidina é, então, carregada para iniciar a formação das espécies de éster ativo. A solução de éster ativado é agitada durante 60 min antes de ser transferida para o reator que contém o intermediário da Preparação 23. A suspensão de reação é agitada durante 18 h a 25ºC. A suspensão é amostrada para conclusão do acoplamento (IPC) e a amostragem é repetida, se necessário, em intervalos específicos conforme necessário para obter resultados aprovados pelo IPC (< 1% de Preparação 23). Quando o acoplamento é concluído, o conteúdo da solução é filtrado e descartado. O intermediário de Preparação 24 totalmente construído é lavado várias vezes com DMF e, em seguida, IPA. A Preparação 24 é seca a < 40ºC até um LOD < 1% ser alcançado. A Preparação 24 é embalada e armazenada gelada (-20ºC) antes de clivagem da resina.

[0098] Clivagem de Resina e Isolamento do Exemplo 4A Bruto: Um coquetel de clivagem é preparado que consiste em ácido trifluoroacético (TFA), tri-isopropilsilano (TIPS), ditioteritol (DTT), DCM e água. O coquetel de clivagem é resfriado para 15 + 5ºC. Os carregamentos de reagente são mostradas na tabela a seguir: Volume Etapa de Processo Solvente/Reagente (por Resina Ligada Carregada) 7,16 mL/g 0,34 mL/g Coquetel de clivagem TIPS 0,24 mL/g 0,24 9/9 0,75 m/s Carregamento líquido de coquetel — 8,50 mL/g Lavagem de resina consumida 3 mL/g MTBE 14 9 Lavagem de recipiente e bolo MTBE 3 9/9

[0099] A Preparação 24 é carregada a um reator, seguido pelo coquetel de clivagem. A mistura é agitada e mantida a 23 ºC durante 3 h. A mistura é filtrada, em seguida, a resina consumida é lavada com DCM. O filtrado de lavagem de DCM é combinado com a solução de desproteção em massa e o conteúdo é resfriado para < -10 ºC. O MTBE é resfriado para < -13 ºC. Então, MTBE gelado é alimentado ao filtrado gelado em duas porções. A taxa de alimentação de MTBE é controlada para manter a temperatura interna da solução bruta a < 5ºC. O carregamento inicial de MTBE constituía em — 45% da carga total de MTBE. Um precipitado macio se forma próximo ao final da adição de MTBE, mas é prontamente redissolvido na solução. A solução de precipitação é, então, resfriada novamente para uma temperatura interna de -15 + 5ºC. A segunda adição de MTBE é alimentada em uma taxa de aproximadamente 5-10 vezes a taxa de alimentação inicial de MTBE e constituía — 55% do carregamento total de MTBE. A temperatura interna da suspensão de precipitação é mantida a < 0ºC durante a adição. A suspensão resultante é envelhecida a -8 + 3ºC por um mínimo de 6 h, seguida, aquecida para O + 3ºC e envelhecida por mais 2 h antes de isolamento.

[00100] —Asuspensão de peptídeo bruto gelada é filtrada, em seguida, o bolo úmido resultante é lavado com MTBE. O bolo úmido bruto do Exemplo 4A é, então, seco até um valor LOD alvo pelo IPC de < 1%. O produto bruto, Exemplo 4A, é embalado e armazenado. O intermediário bruto é armazenado gelado (-20 ºC) até purificação. Em geral, 45,39 kg do Exemplo 4A bruto são produzidos em 45 % em peso e uma pureza de 64 % da área por HPLC. Rendimento contido com base na resina de Sieber = 47 %. Purificação do Exemplo 4A:

Fases móveis: Fase móvel A (MPA) 90 % de água, TFA a 0,1 % e 10 % de ACN Fase móvel B (MPB) % de água, TFA a 0,1 % e 90 % de ACN

[00101] — Purificação em Fase Reversa 1 (RP1): O Exemplo 4A bruto é dissolvido em 90 % em peso de MPA e 10 % em peso de MPB. À solução é agitada pelo menos 7 h para concluir a descarboxilação do triptofano. A solução do bruto envelhecido é filtrada e carregada sobre uma coluna Kromasil 100-10-C8 pré-equilibrada empacotada. A coluna é lavada com uma mistura de tampões A (90 % água, TFA a 0,1 % e 10 % ACN) e B (10 % água, TFA a 0,1 % e 90 % ACN) resultando em ACN a 30 % para dois volumes de coluna e preparada para eluição aumentando a concentração mista de ACN de 30 % para 35 % em um volume de coluna. A tirezepatida é eluída da coluna usando um aumento de ACN de 1,5 % em volume da coluna até a eluição estar concluída. O eluente é fracionado e testado quanto à pureza usando RP-HPLC. À coluna é regenerada aumentando o ACN de 47 % para 65 % sobre um volume de coluna e continuando a fluir ACN a 65 % para três volumes de coluna. A coluna é reequilibrada usando ACN a 30 % para dois volumes de coluna antes da próxima sequência de injeção.

[00102] Frações que se qualificam para inclusão na corrente principal são agrupadas. As frações que não atendem aos critérios de pureza, mas têm pureza superior a 50 %, podem ser combinadas para injeções de reciclagem depois que todas as injeções primárias forem concluídas. Frações de reciclagem são separadas em frações dianteiras e frações posteriores, as frações diluídas com tampão A e armazenadas geladas. As injeções de reciclagem são processadas e agrupadas usando os critérios de injeção primária; no entanto, apenas as frações de pico principais são avançadas e nenhuma reciclagem adicional é realizada.

Após conclusão do agrupamento principal, o intermediário é testado quanto à concentração e pureza. O material é diluído e o pH ajustado para um pH de 8 antes do processamento RP2. O processamento RP1 rende 37 kg de produto bruto e 14277 g de produto contido com uma pureza média do agrupamento de 90,9%.

[00103] Purificação em Fase Reversa 2: A solução de RP1 do Exemplo 4 é carregada em uma coluna Kromasil 100-10-C8 pré- equilibrada empacotada. A coluna é lavada com uma mistura de Tampão C (90% de NH40Ac aquoso, pH de 8,0, 10% de ACN) e Tampão D (10% de NH40Ac aquoso, pH de 8,0, 90% de ACN) que resulta em uma solução de ACN a 20 % para dois volumes de coluna. A tirzepatida é eluída da coluna usando um aumento de ACN de 3,5% por coluna até a eluição estar concluída. O eluente é fracionado e testado quanto à pureza usando RP-HPLC. Após a eluição, a coluna é regenerada aumentando o ACN para 80 % em um volume de coluna e continuando a fluir ACN a 80 % para três volumes de coluna. A coluna é reequilibrada usando ACN a 20 % para dois volumes de coluna antes da próxima sequência de injeção.

[00104] As frações que se qualificam para inclusão na corrente principal são agrupadas. As frações que não atendem aos critérios de pureza, mas têm pureza superior a 60 %, podem ser combinadas para injeções de reciclagem depois que todas as injeções primárias forem concluídas. Frações de reciclagem são separada em frações dianteiras e frações posteriores, diluídas com tampão C e armazenadas geladas. As injeções de reciclagem são processadas e agrupadas usando os critérios de injeção primária; no entanto, apenas as frações de pico principais serão avançadas e nenhuma reciclagem adicional será realizada. Após conclusão do agrupamento principal, o intermediário é testado quanto à concentração e pureza. O material pode ter o pH ajustado para 8,0 em preparação para a etapa de TFF. O processamento RP2, começando com 14,2 kg, rende 10,9 kg de produto contido com um rendimento de 76,7 %.

[00105] Cromatografia de Troca lônica (IEX): A solução de RP2 do Exemplo 4A é filtrada e carregada em uma coluna Amberchrom CG — 300M. Duas frações são eluídas usando fase móvel E (acetato de amônio aquoso a 10%, IPA a 5%, pH de 8) e fase móvel F (isopropanol). As frações são analisadas quanto ao conteúdo de peptídeo e aquelas < 3 mg/mL são descartadas. As frações agrupadas são concentradas e armazenadas a 20ºC antes de precipitação. O processo IEX começa com 10,9 kg de RP2 para render 14,3 kg do material do Exemplo 4A contido com uma pureza de 97,8 % do agrupamento.

[00106] Precipitação: A solução de IEX do Exemplo 4A (333 kg) é filtrada e, em seguida, isopropanol (850L) é carregado para reduzir o teor de água para < 10 % p/p de água. A solução diluída é resfriada para O + 3 ºC em preparação para carregamento e precipitação de MTBE. MTBE (2304 L, 1708 kg) é resfriado para O + 3ºC. O MTBE gelado é alimentado à solução de IEX em uma taxa de — 0,69 kg/min durante os primeiros — 37% do carregamento de MTBE. A taxa de alimentação é, então, aumentada para uma média de — 2,3 kg/min para completar os — 63% restantes do carregamento de MTBE. A temperatura durante a alimentação é mantida a < 5ºC. A suspensão de precipitação resultante é filtrada gelada (< - 10ºC). Em seguida, o bolo de filtro é lavado com MTBE. O bolo de filtro é seco até um LOD < 2 %.

[00107] Unmidificação de 4A: O Exemplo 4A é umidificado passando nitrogênio úmido através do filtro do secador. A umidade da corrente gasosa que sai da saída do filtro é monitorada a cada 60 min. À umidificação é continuada até que < 0,5 % de MTBE e < 0,2 % de IPA permaneçam no bolo úmido. Após conclusão do processo de umidificação, o fluxo de nitrogênio é trocado para um fluxo de nitrogênio seco através do bolo de produto puro do Exemplo 4A. O material é amostrado quanto à água e solventes residuais contra alvos de IPC específicos e a secagem usando nitrogênio seco é continuada até que o teor de água alvo desejado de 5-7 % p/p seja alcançado. Um total de 12,9 kg de Exemplo 4A é isolado com > 95 % de pureza no conteúdo peptídico. Rendimento global com base no carregamento de resina de Sieber = 31 %. Exemplo 4B (SPPS de linear) Tirzepatida (SEQ ID NO: 1) Meo) Resina de Stever We Bso-V A, À 6-TF-T-SDYSAS ÍLDKA-AO. xevominserssonvens. | a sé ds Jo! ea da A E da não! + oO - Preparação 23 | sz it Arenas AE A, uia! ol edad nei do E ls ele! sl Preparação 24 | CRETA ES, q, JeetETSOISAS À NS A ie fot Jal RE Te le! ro " 4 H À, | ressus " PHS NE a: Exemplo db srt heerel, Local Losso ara ca e eos o araras a Ar uDepsipemlidendeselina =— w "ISPSIFENAMN FAGiNDatnAs, não resinas iemtádaços raitava de sóna a Tistria | rnneação cara remover nes pentívos sara iemois ee ' penar (polar aaa

SABIA ARNS ANIOIUIAINFANANTAAA Exemplo 48

Preparação 23

[00108] O processo para produzir a Preparação 23 é substancialmente conforme fornecido pelo Exemplo 4 A, exceto que NMP é globalmente substituído por DMF para todos os acoplamentos e desproteções. Além disso, a estequiometria de aminoácidos:Oxyma:DIC é reduzida para 2,5:2,5:2,7 equivalentes molares com base na resina de Sieber. A única exceção relacionada ao uso de DMF é o acoplamento de Ile12 a Aib13, em que o NMP é retido. Nesta exemplificação, 17,6 kg de resina de Sieber em processos para 92,2 kg de Preparação 23 de peptídeos sobre o intermediário de resina. Preparação 24

[00109] O processo substancialmente conforme fornecido pelo Exemplo 4A prepara 92,1 kg de Preparação 23; posteriormente processado para 97,3 kg de Preparação 24 de peptídeos sobre intermediário de resina. A Preparação 24 é embalada e armazenada gelada (-20 º C) antes de clivagem da resina.

[00110] —Clivagem de Resina e Isolamento do Exemplo 4B Bruto: Dois lotes são executados na Preparação 24 em escala de 32 kg usando condições substancialmente conforme descrito no Exemplo 4A para distribuir 24,4 kg do Exemplo 4B, 69,5 % de Pureza por HPLC e 52,6 % de rendimento e 21,3 kg de Exemplo 4B, 88,3 % de pureza por HPLC e rendimento de 45,2 %. O intermediário bruto é armazenado gelado (-20 ºC) até purificação.

[00111] Purificação de Exemplo 4B: Dissolução do bruto: A Tirzepatida do Exemplo 4B bruto é carregada em um recipiente de dissolução e dissolvido em uma solução de acetonitrila:água a 1:1 até uma concentração final de 25 g de sólido/L de solução. O pH da solução resultante é ajustado para 8,5-9,5 com hidróxido de amônio para iniciar a conversão dos isômeros do Depsi peptídeo (10-15 %) para a Tirzepatida do Exemplo 4B. A mistura com pH ajustado é agitada durante pelo menos uma hora para permitir que ocorra a Depsi conversão. O pH é, então, ajustado para 1,5-2,5 através da adição de ácido trifluoroacético e diluído para um teor de acetonitrila de 30 % em preparação para cromatografia. No total, a solução bruta é agitada durante pelo menos 7 horas para converter o sal Trp CO2 na Tirzepatida do Exemplo 4B. Conversão de tirzepatida (TZP) em depsipeptídeo: ros Amro K x 4, GF Lá é x > Vl Ea E ho e oa Ação A Ea A-E-V-Q-W-LA-AG-G-P8-8GAPPPS ns | TeP respondida, o o e ret, doe Y ja AA Ain perua fesaod qursaniasasraseaneas ” Depsipeptideo Conversão do depsi peptídeo em API: o o M À + | RN CH CN CH —NHR à à | | OH oM | Ácido trifuoroacético o aessoc ice o | H, entao &s | | Neutralização para pH > 6

OH o o

Y A ro HC — NR de L, | | oH ou

[00112] Purificação em Fase Reversa 1 (RP1): O processo RP1 substancialmente conforme apresentado pelo Exemplo 4 A pode ser usado para converter o depsi peptídeo em API. O processo de purificação de RP1 é substancialmente o mesmo que aquele descrito no Exemplo 4 A; no entanto, a etapa de dissolução do bruto descrita acima aumenta a capacidade da etapa cromatográfica RP1. Isto permite um carregamento de g de resina por L de Tirzepatida e diminui o número de injeções necessárias para purificar a Tirzepatida bruta sob as condições descritas no Exemplo 4. Nesta exemplificação, o teor de 23,7 kg corrigido do Exemplo 4B bruto gera 25,4 kg de Exemplo 4B (107 %) após RP1. Volume total da solução = 2910 L (Q 8,72 g/L e uma vez que todas as frações do agrupamento são coletadas, a mistura é agitada, amostrada e mantida antes de Purificação em Fase Reversa 2 (RP2).

[00113] Purificação em Fase Reversa 2 (RP2): Substancialmente o mesmo processo de purificação conforme descrito no Exemplo 4A, e usando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, é usado para Purificação de Fase Reversa 2 (RP2). Nesta exemplificação, 15,2 kg contidos no Exemplo 4B de RP1 são purificados após RP2 para 13,8 kg de Exemplo 4B em — 98 % de pureza. Volume total da solução = 808 L & 17,0 g/L. A mistura é armazenada antes da filtração em fluxo tangencial.

[00114] Filtração em Fluxo Tangencial (TFF): Membranas de TFF são instaladas e lavadas com água. O tampão de acetato de amônio é preparado usando Água Purificada com Baixo Teor de Endotoxina, ácido acético e hidróxido de amônio. O isopropanol é, então, carregado para fornecer um tampão de NH40Ac a 100 mM, pH de 8,0:IPA a 5:95. A solução RP2 de 17 g/L do Exemplo 4B é concentrada através de TFF para — 125 g/L. A solução de RP2 é recirculada, permitindo que o solvente penetre através da membrana enquanto retém a solução peptídica no lado do retentado da membrana em solução. Após concentração, o tampão de diafiltração é alimentado ao tanque de retenção de retentado enquanto o permeado é continuamente coletado. A troca de tampão é continuada até que a composição de solvente desejada e a concentração de peptídeo sejam atingidas. A solução é esvaziada do sistema e a camada de polarização resultante é enxaguada da membrana e combinada com o concentrado peptídico. Duas seções de solução de RP2 (403,9 L & 17 g/L, 9,87 kg de API) foram processadas através de TFF.

[00115] Precipitação de Co-Alimentação: As seções de TFF são combinadas (138,2 kg, 78,3 g/L) e o KF medido (8,9%) para descobrir < % de água. MTBE (243 kg) é carregado em um recipiente separado e resfriado para O ºC. IPA (48 kg), água (6 kg) e MTBE (100 kg) são adicionados ao recipiente de precipitação e a solução é resfriada para O ºC. As correntes de processo de TFF e MTBE são coalimentadas ao recipiente de precipitação em taxas de 1,6-1,8 e 2,9 -3,1 kg/min, respectivamente. A suspensão resultante é envelhecida durante mais 0,7 horas a O º“C e depois aquecida para 15 ºC. A suspensão é envelhecida a 15 ºC durante 1 h, seguido pela adição de MTBE (118 kg). A suspensão é envelhecida a 15 ºC durante 1 hora e depois esfriada para 2,5 ºC. A suspensão é filtrada gelada e o bolo de filtro lavado com MTBE (573 kg). O bolo de filtro é seco até LOD < 2 %.

[00116] Umidificação: A umidificação substancialmente conforme apresentado no Exemplo 4A, e usando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, é aplicada ao material do Exemplo 4B. Um total de 14,5 kg de Exemplo 4B (SEQ ID NO: 1) é isolado com > 97,7 % de pureza por HPLC e 88,4 % de conteúdo peptídico. Rendimento global com base no carregamento de resina de Sieber = 46 %. Exemplo 5 Síntese Contínua de Preparação 31 Usando Química Convergente em Fluxo

[00117] Asínteseda Preparação 31 a partir de fragmentos peptídicos é realizada usando tanto para abordagens descontínua para a química, bem como a adição sequencial de fragmentos em um reator de fluxo tubular. A abordagem generalizada para a síntese envolve o acoplamento dos dois fragmentos pela mistura de duas soluções, juntamente com o agente de acoplamento em um reator tubular que é, então, seguido por uma adição de base e um tempo de residência adicional em um reator tubular para realizar a remoção do grupo de proteção FMOC. Isto prepara as espécies acopladas para a adição do próximo fragmento. O excesso de reagentes, base e solvente são removidos entre as reações de acoplamento consecutivas usando um nanofiltto com uma membrana que é dimensionada para reter o peptídeo e permear impurezas de baixo peso molecular. Diafiltração é usada para remover totalmente as impurezas de baixo peso molecular antes das etapas de acoplamento subsequentes. Uma descrição e resultados analíticos da exemplificação destas transformações estão incluídos abaixo.

[00118] HPLC é usada para confirmar a síntese da Preparação 31 a partir da Preparação 29 e Preparação 30. O método de análise usa uma coluna de fase estacionária C4 a 65 ºC (2,1 mm id x 150 mm x tamanho de partícula de 1,7 mícrons) com um gradiente de 60-98 de % B em TFA a TFA em água e acetonitrila ao longo de 12 minutos. Detecção por UV a 214 nm é usada para este material.

[00119] A Tabela A.5 mostra dados de espectrometria de massa de alta resolução coletados para o produto da reação de acoplamento da Etapa 3 (Preparação 31) feita em fluxo. A precisão de massa confirma a espécie desejada. posto química monoiso- observa- | de carre- | Monoisotípi | são de tópica dos m/z gamento ca massa teórica Calculada (ppm) (neutra) (neutra) ração 31

[00120] Tabela A.5 Confirmação da Preparação 31 medida por meio da precisão de massa calculada usando dados de espectrometria de massa de alta resolução.

[00121] A ligação química nativa é um processo útil para preparar peptídeos de comprimento total que compreendem uma cisteína ou uma alanina na sequência. O processo emprega uma reação quimiosseletiva de dois segmentos peptídicos desprotegidos para produzir um intermediário transitório ligado a tioéster. O intermediário ligado a tioéster se reorganiza para fornecer um produto de ligação de comprimento total com uma ligação peptídica nativa no local da ligação. Aqueles versados na técnica reconhecerão que a técnica de ligação química nativa pode ser útil na síntese química de peptídeos de comprimento total que contêm cisteína ou alanina. Exemplo 6 Processo de Ligação Química Nativa Tirzepatida (SEQ ID NO: 1)

O O [e (Cd > Fmoc-HN-N Cd Cc Õ cl Õ Resina de cloreto de 2-clorotritila (2-CTC) Preparação 32 Síntese de Resina Fmoc-hidrazina-CTC (Preparação 32)

[00122] Resina 2-CTC (10,7 g, 17,7 mmol) é intumescida em 100 mL de DCM durante 20 min a 0ºC. O carbazato de 9-fluorenilmetila (15,6 g, 61,4 mmol, 3,5 equiv.) é dissolvido em 210 mL de DMF:DCM a 2:1. DIEA (31 mL, 178 mmol, 10,1 equiv.) é adicionado à solução de carbazato de 9-fluorenilmetila. Esta solução é, em seguida, lentamente adicionada à resina, a 0ºC. Ela é agitada a 0ºC durante cerca de uma hora e deixada aquecer para a temperatura ambiente. A mistura de reação é agitada durante 16 horas em temperatura ambiente. Metanol (10 mL) é, então, adicionado para extinguir a resina 2-CTC restante e agitado durante 15 min. A resina é enxaguada com 200 mL de DMF, seguido por DMF (2 x 100 mL), água (3 x 100 mL), DMF (3 x 100 mL), metanol (3 x 100 mL) e, finalmente, com DCM (3 x 100 mL). A resina é seca em um forno a vácuo a 27 ºC durante 16 horas. O carregamento de resina é medido a 0,74 mmol/g através de RMN quantitativa. Síntese de Peptídeo de Hidrazida (17-meros) (Preparação 33) SEQ ID NO: 32 o evil Leetereovenl Iuowxihp" Me Me Me Me Preparação 33

[00123] Resina de hidrazina-CTC (1,01 g, valor de carregamento: 0,65 mmol/g) é tomada em um vaso de reator de 40 mL e intumescida com 3 x 4 mL de DCM (30 s cada), seguido por 2 x 10 mL de DMF (20 min cada) em um sintetizador de peptídeos. Fmoc-lle-OH (0,919 g, 2,60 mmol, 4 equiv.) e HBTU (0,99 g, 2,61 mmol, 4 equiv.) são dissolvidos em 7 mL de DMF. DIPEA (0,91 mL, 5,22 mmol, 8 equiv.) é adicionado à solução de aminoácidos e o volume é completado até 10 mL com DMF. A solução de aminoácidos ativados é adicionada à resina. A suspensão é deixada misturar com nitrogênio durante 8 horas. Após 8 horas, a resina é lavada com 5 x 10 mL de DMF, 5 x 10 mL de DCM e seca durante 12 horas. O carregamento da resina resultante é medido como sendo 0,54 mmol/g através de RMN quantitativa. 0,91 g desta resina são usados para a síntese da Preparação 33 (SEQ ID NO: 32).

[00124] —Desproteção: 4x9 mL de piperidina a 20 % v/v em DMF, 30 minutos cada.

[00125] —Acoplamentos: 3 equivalentes de aminoácido, 3 equivalentes de OXYMA e 3,3 equivalentes de DIC são usados para acoplamento de aminoácidos. A resina é lavada com 5 x 9 mL de DMF com 1 min de mistura de N2 após cada acoplamento e a iteração final de desproteção. No final da síntese da hidrazida do peptídeo, a resina é lavada com DCM com mistura de N2. A resina é seca no sintetizador.

[00126] Desproteção e Clivagem: 25 mL do coquetel de clivagem feito com ditiotreitol a 5% p/v (DTT), água a 2,5 % v/v, tri-isopropilsilano (TIPS) a 2,5 % v/v e ácido trifluoroacético (TFA) a 90 % são adicionados à resina seca (2,37 g) e misturados durante 3 horas em um misturador rotativo. A resina é filtrada e lavada com 2 x 2,5 mL de TFA. O filtrado é vertido em 175 mL de MTBE gelado e o peptídeo imediatamente precipitado. O frasco de filtração é lavado com 2 x 2,0 mL de TFA e vertido em MTBE gelado. Ele é resfriado para -20 ºC durante meia hora e, em seguida, centrifugado. O precipitado peptídico é, então, lavado duas vezes com 150 mL de MTBE e centrifugado. O precipitado peptídico é seco em uma estufa a vácuo a 27 ºC durante 16 horas. 1,25 g de amostra do produto bruto, Preparação 33, são obtidos após secagem [Esperado (massa + 2H+)/2 = 968,4883, observado (massa + 2H+)/2 = 968,4879]. rose, Amei A. Preparação 34 Sad arvenciscerascareda

[00127] Cerca de 0,62 mmol de Preparação 34 são sintetizados em resina de amida de Sieber através de protocolos padrão de SPPS. Fmoc-Lys(ivDde)-OH é usado para desproteção ortogonal e acilação de lisina.

[00128] — Desproteção de ivDde: Hidrazina monoidratada (64 % p/p) (1,98 g, 25,3 mmol) é diluída para 24,4 g com DMF e 20 g são adicionados à resina. A suspensão é deixada agitar com uma corrente de nitrogênio e lavada com 5 x 9 mL de DMF após cerca de duas horas. Isto é repetido mais uma vez.

[00129] Ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(48)-5-terc-butóxi-4-[(20-terc-butóxi-

20-oxo-icosanoil)amino]-5-0x0- pentanoilJamino]JetóxiletóxilacetilJamino]Jetóxiletóxilacético(1094,4 mg, 1,252 mmol, 2 equiv.) é dissolvido em 10 mL de DMF anidro. TNTU (506,9 mg, 1,360 mmol, 2,2 equiv.) e DIEA (0,24 mL, 1,4 mmol, 2,2 equiv.) são adicionados ao mesmo. O volume é completado até 15 mL com DMF anidro. Ele é deixado misturar durante 30 minutos em um misturador rotativo. O éster ativado da Preparação 6 é, então, adicionado à resina e deixado misturar durante 12 horas com uma corrente de nitrogênio. Após 12 horas, a solução é drenada e a resina é lavada com 5 x 10 mL de DMF e 7 x 10 mL de DCM com 1 min de mistura com N2. A resina é seca durante 8 horas no sintetizador.

[00130] Desproteção e Clivagem: 20 mL da mistura de clivagem feita com ditiotreitol (DTT) a 5% p/v, água a 2,5% v/v, tridisopropilsilano (TIPS) a 2,5 % v/v e ácido trifluoroacético (TFA) a 90% são adicionados à resina seca (2,42 g) e misturados durante 3 horas em um misturador rotativo. A resina é filtrada e lavada com 2 x 2,0 mL de TFA. O filtrado é vertido em 200 mL de MTBE gelado e o peptídeo imediatamente precipitado. O frasco de filtração é lavado com 2 x 2 mL de TFA e é vertido em MTBE gelado. Ele é resfriado para -20ºC durante 30 min e, em seguida, centrifugado. O precipitado peptídico é lavado duas vezes com 240 mL de MTBE e centrifugado. O precipitado peptídico é seco em uma estufa a vácuo a 27ºC durante 14 horas. 1,853 g do produto bruto, Preparação 34, são obtidos após secagem. Ela é purificada por meio de RP-HPLC sobre uma coluna Kromasil 100-10-C8 de 10 uM (30 mm x 250 mm) em temperatura ambiente com um gradiente linear de acetonitrila a 30-55 % em água durante 25 min, depois acetonitrila a 15% em água durante os primeiros 5 min e uma constante de TFA a 0,1% ao longo de 30 min. 1,28 g da Preparação 34 purificada (SEQ ID NO: 33) são obtidos [Esperado (massa + 2H+)/2 = 1470,7929, observado (massa + 2H+)/2 = 1470,7885].

Síntese de Tioéster (Conversão de Preparação 33 à Preparação 35

[00131] A hidrazida peptídica bruta (Preparação 33, 2,422 g, 1,251 mmol) é dissolvida em 50 mL do tampão de ligação (cloridrato de guanidina a 6 M e hidrogenofosfato de sódio monobásico a 0,2 M, pH de 3,35) e resfriada para -15ºC em um banho de acetona-gelo. 9,4 mL de solução a 1 M de nitrito de sódio (9,4 mmol, 7,5 equiv.) são adicionados à solução de hidrazida peptídica bruta e deixados agitar durante 20 min a -15ºC. Enquanto isso, 1 mL de 2,2,2-trifluoroetanotiol (TFET) é completado até 10 mL com tampão de ligação (cloridrato de guanidina a 6 M e hidrogenofosfato de sódio monobásico a 0,2 M, pH de 7,0). Após 20 min, 10 mL da mistura TFET são adicionados à solução da hidrazida peptídica para causar tiólise in situ da peptidil azida gerada a partir da Preparação 33. o nv AeeteTSDYstl Aoki Me Me Preparação 33 Me Me uv AeetETSDYSAl Aos o, Me Me Me Me Preparação 35

[00132] O pH da mistura de reação é ajustado para cerca de 6,95 com solução de hidróxido de sódio a 5N. Tiólise da peptidil azida é deixada correr durante 45 min e o volume é levado para 100 ml com o tampão de ligação (pH de 7,0). A mistura de tioéster bruto é purificada por meio de RP-HPLC em uma coluna Waters X-Bridge C18 de 10 uM (10 mm x 250 mm) em temperatura ambiente com um gradiente linear de acetonitrila a 25 - 42% em água durante 25 minutos depois acetonitrila a 10% em água durante os primeiros 2,8 min e uma constante de TFA a 0,1 % durante os 28 min de purificação. Isto fornece

1,03 g do tioéster TFET (Preparação 35 (SEQ ID NO: 34))[Esperado (massa + 2H+)2 = 1010,4650, observado (massa + 2H+)2 = 1010,4620].

[00133] Ligação Química Nativa: Solução aquosa de cloridrato de guanidina a 6 M e hidrogeno fosfato de sódio monobásico a 0,3 M (pH de 7,0) é o tampão de ligação usado na ligação química nativa. Todas as soluções são feitas neste tampão de ligação. Dissolver 350,4 mg (0,174 mmol) do tioéster peptídico, Preparação 35 (SEQ ID NO: 34), em 50 mL do tampão de ligação. Uma porção de 8,0 mL de solução de ácido 4-mercaptofenilacético (MPAA) a 0,5 M é adicionada à solução de tioéster peptídico. O peptídeo que contém cisteína N-terminal (Preparação 34 (SEQ ID NO: 33), 524,6 mg, 0,178 mmol, 1,03 equiv.) é dissolvido em 48 mL do tampão de ligação em um tubo para centrífuga de 50 mL. A solução da Preparação 34 é adicionada à solução de tioéster. O tubo é enxaguado com 2 x 8 mL do tampão de ligação (pH de cerca de 7,0) e adicionado à mistura de reação. O pH da mistura de reação é ajustado para cerca de 7 com solução de NaOH a 5N. Uma porção de 8,0 mL de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP, 0,5 M, pH de 7,0) é adicionada à mistura de reação e o pH é ajustado novamente para 7,0 com 0,2 mL de solução de hidróxido de sódio a SN. A reação é deixada agitar em temperatura ambiente durante 24 horas e, então, armazenada em um congelador. Mais 3 mL de solução de TCEP a 0,5 M são adicionados antes da purificação. A Preparação 36 (SEQ ID NO: 35) é purificada por meio de RP-HPLC em uma coluna Kromasil C18 de 10 UM (10 mm x 250 mm) em temperatura ambiente com um gradiente linear de acetonitrila a 20 - 50% em água (ácido acético a 0,1% e titulado para um pH de 9,0) ao longo de 23 minutos, depois acetonitrila a 10% em água durante os primeiros 4 minutos e durante os 28 minutos de purificação. Cerca de 372 mg (44,3%) do análogo de cisteína, a tirzepatida da Preparação 36, são obtidos após purificação [Esperado

(massa + 3H+)/3 = 1615,17263, observado (massa + 3H+)/3 = 1615,1686]. o nv Recrersovs! Luowrteco, po nad io ir cad rotura a Bs Preparação 34 AE A, nt Leorersoreit Luonrcanhzarvewiiacorasenerrêo, Preparação 36

[00134] —Dessulfuração: Solução aquosa de cloridrato de guanidina a 6 M e hidrogenofosfato de sódio monobásico a 0,3 M (pH de 7,0) é o tampão usado na dessulfuração. Todas as soluções foram feitas neste tampão. dicloridrato de 2,2'-azobis[2-(2-imidazolin-2-il)propano] (Preparação 37, 808,2 mg, 2,5 mmol) é dissolvido em 10 mL do tampão e o pH é ajustado para cerca de 7,0 com NaOH a 5N. O volume é completado até 15 mL com o tampão. O análogo de cisteína, a tirzepatida da Preparação 36 (105,2 mg, 0,022 mmol), é dissolvido em mL do tampão e 6 mL da solução da Preparação 37 são adicionados ao mesmo. Cinco mL de solução reduzida de L-glutationa a 0,3 M (L- GSH, pH de 7,0) e 7,5 mL de solução de TCEP a 0,5 M (pH de 7,0) são adicionados à mesma. A solução é aquecida para 44 ºC durante 4,5 horas, pelo que a reação é considerada concluída através de análise UPLC [Esperado (massa + 3H+)/3 = 1604,5153, observado (massa + 3H+)/3 = 1604,5122]. O rendimento da dessulfuração é calculado por UPLC usando um padrão de referência de tirzepatida (SEQ ID NO: 1).

O rendimento é estimado em 47%.

os A nene Ma, o» a : a iecnensorei Acesse YÁFVO-W-AA-AGOPSSCAPPPSNO Prey jo 36 | - | ER Preparação 37 rss Ai Lança X ol ms ao ir mx AA E nd Lee-rrrsovsil lin nad avania SGRSSCARÁES Ligação Química Nativa (Abordagem 2): Síntese da Preparação de Hidrazida Peptídica 39 SEQ ID NO: 36

[00135] Resina de hidrazina-CTC (2,03 g, 1,82 mmol, valor de carregamento: 0,65 mmol/g) é tomada em um vaso de reator de 40 mL e intumescida com 3 x 10 mL de DCM (30 s cada), seguido por 2 x 10 mL de DMF (20 min cada) em um sintetizador Symphony. HBTU (1,48 g, 3,90 mmol, 3,0 equiv.) é dissolvido em 13,1 mL de ácido (258, 52S)- 52-((((9H-fluoren-9-il) metóxi)carbonil)amino)-25-(terc-butoxicarbonil)- 2,2-dimetil-4,23,28,37 ,46-pentaoxo-3,32,35,41,44-pentaoxa- 24,29,38,47-tetra-azatripentacontan-53-oico — (Preparação 17, 365 mg/mL em DMF) (3,91 mmol, 3,0 equiv.). DIPEA (1,4 mL, 8,04 mmol, 6,1 equiv.) é adicionado à solução acima e o volume é completado até 19 mL com DMF. A solução é deixada misturar em temperatura ambiente em um misturador rotativo durante 30 min. A solução de éster ativado da Preparação 17 é adicionada à resina. A suspensão é deixada misturar com nitrogênio durante 8 horas. Após 8 horas, a resina é lavada com 5 x 10 mL de DMF, 5 x 10 mL de DCM e seca durante 12 horas. O carregamento da resina resultante é medido como sendo 0,26 mmol/g através de RMN quantitativa. 1,82 g desta resina são usados para a síntese da hidrazida peptídica, Preparação 39 (SEQ ID NO: 36).

[00136] Desproteção: 4x9 mL de piperidina a 20 % v/v em DMF, 30 minutos cada.

[00137] —Acoplamentos: 3 equivalentes de aminoácido, 3 equivalentes de OXYMA e 3,3 equivalentes de DIC são usados para o acoplamento de aminoácidos.

[00138] —Aresinaé lavada com 5 x 9 mL de DMF com 1 min de mistura de N2 após cada acoplamento e a iteração final de desproteção. No final da síntese da hidrazida peptídica, a resina é lavada com 7 x 10 mL de DCM com 1 min de mistura de N2. A resina é, então, seca durante cerca de 12 horas no sintetizador.

[00139] Desproteção e Clivagem: 25 mL do coquetel de clivagem feito com ditiotreitol (DTT) a 5% p/v, água a 2,5 % v/v, tri-isopropilsilano (TIPS) a 2,5 % v/v e ácido trifluoroacético (TFA) a 90 % são adicionados ao resina seca e misturados em um misturador rotativo. A resina é filtrada, lavada com TFA (2 x 2,5 mL) e o filtrado é vertido em 175 ml de MTBE gelado. O frasco de filtração é lavado com TFA (2 x2,5mL) e as lavagens são vertidas em MTBE gelado. Ele é resfriado para -20ºC durante 30 min e, em seguida, centrifugado. O precipitado peptídico é, então, lavado duas vezes com 150 mL de MTBE e centrifugado. O precipitado peptídico é seco em uma estufa a vácuo a 27ºC durante 16 horas. 1,70 g da hidrazida peptídica bruta, Preparação 39 (SEQ ID NO: 36), são obtidos após secagem. A hidrazida peptídica bruta, Preparação 39, é purificada por meio de RP-HPLC em uma coluna Waters XSelect CSH C18 de 10 uM (10 mm x 250 mm) em temperatura ambiente com um gradiente linear de acetonitrila a 20 - 55 % em água ao longo de 23 min, depois acetonitrila a 10 % em água durante os primeiros 3 minutos e uma constante de TFA a 0,1 % durante os 28 minutos de purificação. Cerca de 110 mg da hidrazida parcialmente purificada, Preparação 39, são obtidos.

[00140] Desproteção e Clivagem: 25 mL do coquetel de clivagem feito com ditiotreitol (DTT) a 5% p/v, água a 2,5 % v/v, tri-isopropilsilano (TIPS) a 2,5 % v/v e ácido trifluoroacético (TFA) a 90% são adicionados à resina seca (2,92 g) e misturados em um misturador rotativo. A resina é filtrada e lavada com 2 x 2,5 mL de TFA. O filtrado é vertido em 200 mL de MTBE gelado e o peptídeo imediatamente precipitado. O frasco de filtração é, então, lavado com 2 x 2 mL de TFA e as lavagens são vertidas em MTBE gelado. Ele é resfriado para -20ºC durante 30 min e, em seguida, centrifugado. O precipitado peptídico é, então, lavado duas vezes com 240 mL de MTBE e centrifugado. O precipitado peptídico é, então, seco em uma estufa a vácuo a 27ºC durante 16 horas. Cerca de 1,7 g do produto bruto de 19-meros, Preparação 40 (SEQ ID NO: 37), são obtidos.

[00141] Ligação Química Nativa: Solução aquosa de cloridrato de guanidina a 6 M e hidrogeno fosfato de sódio monobásico a 0,3 M (pH de 7,0) é o tampão de ligação usado na ligação química nativa. Todas as soluções são feitas neste tampão de ligação. Hidrazida peptídica parcialmente purificada (Preparação 39, 56 mg, 0,019 mmol) é dissolvida em 5 mL do tampão de ligação (cloridrato de guanidina a GM e hidrogeno fosfato de sódio monobásico a 0,3 M, pH de 3,35) e resfriada para -15ºC em um banho de acetona gelado. 0,25 mL de solução de nitrito de sódio a IM (0,25 mmol, 13,2 equiv.) são adicionados à solução de hidrazida peptídica e deixados em agitação durante 10 min a -15ºC. Após 10 min, 0,8 mL de solução de ácido 4- mercaptofenilacético (MPAA) a 0,5 M são adicionados à solução de hidrazida peptídica para causar tiólise in situ da peptidil azida gerada a partir da Preparação 39. O pH da mistura de reação é ajustado para cerca de 7,0 com solução de hidróxido de sódio a SN. Tiólise da peptidil azida é deixada correr durante 30 min.

H ? H ? EB a o no o A Hey Aec-TeTSDSSA dese ds Me Me Me Me o Preparação 39

CENAS POUPA A o io o Am no HS Ne pi EG TE TD Sl BACIA Qu 1 Ot Preparação 41

[00142] Cerca de 0,62mmo!lda Preparação 40 (SEQ ID NO: 37) são sintetizados em resina de amida de Sieber usando protocolos de SPPS padrão. A Preparação 40 que contém cisteína N-terminal (26,1 mg, 0,014 mmol, 0,74 equiv.) é dissolvida em 1 mL do tampão de ligação. À solução da Preparação 40 é adicionada à solução de tioéster. O frasco que contém a Preparação 40 é enxaguado com 1 mL do tampão de ligação (pH de 7,0) e adicionado à mistura de reação. Após 15 min, 1,0 mL de tris(2-carboxietil)'fosfina (TCEP, 0,5 M, pH de 7,0) é adicionado à mistura de reação e o pH é ajustado para 7,0 com solução de hidróxido de sódio a 5N. A reação é deixada agitar em temperatura ambiente durante uma hora. O análogo de cisteína, a tirzepatida da Preparação 42, é observado na mistura de reação.

o o res a A a renda Aa, nl 3 E-G-T-F-T-S8-D-Y-s-1 A 3 ms oH o o. Ot Preparação 41 | H-C-F-V-Q-W-L-1-A-G6-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S- NH, Preparação 40 resp Lo one da,

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SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1 Tirzepatida YX1IEGTFTSDYSIX2LDKIAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPS em que X1 é Aib; X2 é Aib; K na posição 20 é quimicamente modificado através de conjugação ao grupo épsilon-amino da cadeia lateral de K com (2-[2-(2-Amino-etóxi)-etóxi]-acetil)2-(yGlu)1-CO-(CH2)18-CO2H; e o aminoácido C-terminal é amidado como uma amida primária C- terminal SEQ ID NO: 2 H-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH, Bu fu tBu SEQ ID NO: 3

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composto caracterizado pelo fato de que é de SEQ ID NO: 17 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

2. Composto caracterizado pelo fato de que é de SEQ ID NO: 11 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

3. Composto caracterizado pelo fato de que é de SEQ ID NO: 22 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

4. Composto caracterizado pelo fato de que é de SEQ ID NO: 21 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

5. Composto caracterizado pelo fato de que é de SEQ ID NO: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

6. Composto caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula: o AA o dk NHFmoc o H < INDIA AI AO: o H 3 H ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

7. Composto caracterizado pelo fato de que é de SEQ ID NO: 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

8. Composto caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula: o o sro A A a Aa À, H "o comu " o ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

9. Composto caracterizado pelo fato de que é de SEQ ID NO: 4 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

10. Composto caracterizado pelo fato de que é de SEQ ID NO: 7 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

11. Composto caracterizado pelo fato de que é de SEQ ID NO: 14 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

12. Composto caracterizado pelo fato de que é de SEQ ID NO: 17 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

13. Composto caracterizado pelo fato de que é de SEQ ID NO: 33 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

14. Composto caracterizado pelo fato de que é de SEQ ID NO: 32 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

15. Composto caracterizado pelo fato de que é de SEQ ID NO: 34 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

16. Composto caracterizado pelo fato de que é de SEQ ID NO: 35 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

17. Composto caracterizado pelo fato de que é de SEQ ID NO: 36 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

18. Composto caracterizado pelo fato de que é de SEQ ID NO: 38 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

19. Composto caracterizado pelo fato de que é de SEQ ID NO: 39 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

20. Processo para preparar tirzepatida ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma caracterizado pelo fato de que compreende nanofiltrar um intermediário de tirzepatida.

21. Processo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o intermediário de tirzepatida é SEQ ID NO: 27.

22. Processo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o intermediário de tirzepatida é SEQ ID NO: 29.

23. Processo, de acordo com a reivindicação 20,

caracterizado pelo fato de que o processo de nanofiltração compreende diafiltração.

24. Processo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o processo compreende uma diafiltração com DMF.

25. Processo para preparar tirzepatida ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma, caracterizado pelo fato de que compreende desproteger um composto de SEQ ID NO: 22 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

26. Processo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a solução de desproteção compreende ditiotreitol, tricisopropilsilano e ácido trifluoroacético.

27. Processo para acilar seletivamente um aminoácido lisina em um peptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende acoplar um peptídeo ligado à resina-Lisina-NH2 com ácido t-butil-eicosanodioil- Glu-(O-terc-butil)-(8-amino-3,6-dioxaoctanoico)-(8-amino-3,6- dioxaoctanoico)-OH.

28. Processo, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é uma incretina.

29. Processo, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que o peptídeo ligado à resina-Lisina-NH2 é SEQ ID NO: 24 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

30. Processo para converter um isômero de depsi peptídeo ao peptídeo desejado caracterizado pelo fato de que compreende: a. ajustar o isômero do depsi peptídeo para um pH entre um pH de cerca 7 a um pH de cerca de 10; e b. incubar o isômero do depsi peptídeo em um pH de 7 a um pH de 10 durante pelo menos uma hora.

31. Processo, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o isômero de depsi peptídeo é ajustado para um pH de cerca de 8,5 a um pH de cerca de 9,5.

32. Processo, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é uma incretina.

33. Processo, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o isômero do depsi peptídeo é recuperado a partir de uma corrente de resíduos de processo.

34. Processo, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o isômero de depsi peptídeo é SEQ ID NO: 40 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

35. Processo para dessulfurizar uma incretina ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma, caracterizado pelo fato de que compreende contatar a incretina com um iniciador de radical.

36. Processo, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o iniciador de radical é um iniciador de radical solúvel em água.

37. Processo, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o iniciador de radical é um iniciador azo.

38. Processo, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o iniciador de radical é selecionado a partir do grupo que consiste em dicloridrato de 2,2'-azobis[2-(2- imidazolin-2-il)propano] e dicloridrato de 2,2'-azobis(2- metilpropionamidina).

39. Processo, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a incretina é SEQ ID NO: 35 ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma.

40. Processo, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o processo de dessulfuração fornece um peptídeo de SEQ ID NO: 1.