BR112021010983A2 - Variante de interleucina-2 humana ou seu derivado - Google Patents

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Hu Ge
Yuan Lin
Hongwei Wang
Yangchao Ou
Xianglin Kong
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Abstract

variante de interleucina-2 humana ou seu derivado. a presente invenção refere-se a uma variante da interleucina-2 humana (il-2) que possui uma ou mais mutações de aminoácidos ou um derivado dessa. a variante de il-2 ou seu derivado tem estabilidade aumentada comparada com il-2 de tipo selvagem e propriedades aperfeiçoadas como um agente imunoterapêutico. também são descritos um imunoconjugado e uma composição farmacêutica que compreendem variante de il-2 ou seu derivado, uma molécula de polinucleotídeo que compreende os mesmos, um vetor, célula hospedeira e um método de preparação dos mesmos, assim como o uso farmacêutico da variante de il-2 ou seu derivado, o imunoconjugado ou composição farmacêutica que compreendem a variante de il-2 ou seu derivado.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VARIANTE DE INTERLEUCINA-2 HUMANA OU SEU DERIVADO".
CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a uma variante de interleucina-2 (IL-2) humana ou seu derivado que possui uma ou mais mutações de aminoácidos. Especificamente, a variante de IL-2 humana ou seu derivado têm estabilidade aumentada e propriedades aperfeiçoadas como um agente imunoterapêutico. A presente descrição também se refere a um imunoconjugado que compreende a variante de IL-2 humana ou seu derivado, moléculas de polinucleotídeo que codificam os mesmos, vetores, células hospedeiras e seus métodos de preparação, assim como se refere à uma composição farmacêutica que compreende a variante de IL-2 ou seu derivado ou imunoconjugados, e também se refere ao método de tratamento e seu uso farmacêutico.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] A interleucina-2 humana (IL-2), também conhecida como fator de crescimento de célula T (TCGF), consiste em 133 aminoácidos, com um peso molecular de aproximadamente 15kD e o gene está localizado no cromossomo 4 (4q27), incluindo uma sequência total de 7kb. Em 1976 e 1977, Doris Morgan, Francis Ruscetti, Robert Gallo, Steven Gillis, Kendal Smith, et al., respectivamente, descobriram que o meio de cultura de célula T ativada pode promover a proliferação de célula T. Posteriormente, o fator estimulante compreendido no meio de cultura foi purificado e identificado como uma única proteína, denominada IL-2.
[003] Experimentos precedentes com células in vitro mostraram que células T podem secretar IL-2 e expressar o receptor de IL-2 (IL- 2R) na superfície celular, após serem ativadas por TCR e CD28. A ligação de IL-2 e seu receptor pode desencadear a proliferação de células T e fazer com que as células T tenham funções. Este modelo torna a IL-2 uma molécula que desempenha um papel central na resposta imune da célula T. No entanto, foi descoberto em experimentos subsequentes in vivo que animais poderiam desenvolver autoimunidade quando IL-2 ou seu receptor são eliminados. Experimentos subsequentes mostraram que a IL-2 pode não apenas ativar células efetoras (tais como células T e células NK), mas também ativar células T regulatórias (Treg), suprimindo assim a autoimunidade excessiva.
[004] IL-2 atua por meio de IL-2R. IL-2R compreende três subunidades, IL-2Rα (isto é, CD25), IL-2Rβ (isto é, CD122) e IL-2Rγ (isto é, CD132). As três subunidades podem formar três formas de receptor: o receptor com alta afinidade de ligação que compreende todas as três subunidades IL-2Rα/β/γ, o receptor de média afinidade de ligação que compreende IL-2Rβ/γ e o receptor de baixa afinidade de ligação que é IL-2Rα. Entre eles, IL-2Rβ e IL-2Rγ são necessários para IL-2 ativar as vias de sinalização a jusante. Quando IL-2 se liga a IL-2Rβ e IL-2Rγ ao mesmo tempo, as duas subunidades do receptor formam um heterodímero, que por sua vez fosforila STAT5 intracelular e entra no núcleo para causar a transcrição e expressão do gene correspondente. IL-2Rα não é necessário para a transdução de sinal, mas pode promover a ligação de IL-2 a IL-2Rβ e IL-2Rγ. IL-2Rγ é expresso em todas as células imunes; IL-2Rβ é expresso em células T CD8+, células NK e Tregs, e o nível de expressão de IL-2Rβ aumentará após as células T serem ativadas; IL-2Rα é altamente expresso em Tregs constantemente e transitoriamente em células T CD8+ ativadas e, em seguida, o nível de expressão será regulado negativamente.
[005] IL-2 é sintetizada principalmente por células T ativadas, especialmente células T auxiliares CD4+. IL-2 estimula a proliferação e diferenciação das células T, induz a geração de linfócitos T citotóxicos
(CTL) e a diferenciação de linfócitos do sangue periférico em células citotóxicas e células killer ativadas pela linfocina (LAK), promove a expressão de citocinas e moléculas de citólise pelas células T, promove a proliferação e diferenciação de células B e a síntese de imunoglobulinas através das células B, assim como estimula a produção, proliferação e ativação de células natural killer (NK).
[006] A capacidade da IL-2 de expandir a população de linfócitos in vivo e melhorar as funções efetoras dessas células, confere a IL-2 efeitos antitumorais. A imunoterapia com IL-2 se tornou uma opção terapêutica para certos pacientes com câncer metastático. Presentemente, a IL-2 em alta dose foi aprovada para o tratamento de carcinoma de célula renal metastático e melanoma maligno.
[007] Os estudos existentes de variantes de IL-2 demonstraram que as variantes de IL-2 com mutações em pelo menos quatro posições de 38, 42, 45, 62 e 68 possuem um efeito estimulante reduzido sobre Tregs (WO2012062228); as variantes de IL-2 com mutações nas posições 72, 42 e 45 reduziram ou eliminaram a afinidade de ligação ao receptor de IL-2 com alta afinidade ligação, mas ainda retêm a afinidade de ligação aos receptores de IL-2 com afinidade de ligação média (CN201280017730.1); as mutações nas posições 91 e 126 permitem que IL-2 se ligue a CD25 (IL2Rα), mas não ativa IL-2R em Tregs (US8906356); as IL-2Rs que possuem pelo menos uma mutação de E15, H16, Q22, D84, N88 ou E95 são usadas para tratar doença enxerto contra hospedeiro em indivíduos (US9732134); as variantes de IL-2 que compreendem pelo menos R38W podem reduzir a permeabilidade vascular e podem ser usadas para tratar tumores sólidos (US7371371; US7514073; US8124066; US7803361); a proteína de fusão formada pela variante de IL-2 que se funde a Fc é usada para tratar doenças, a IL-2 tem mutação N88R (WO2016014428); hIL-2-N88R pode ativar seletivamente células T em vez de células natural killer e pode reduzir a formação de metástases no pulmão (WO 99/60128); IL-2 que possui mutações nas posições 20, 88 ou 126 pode ser usada para preparar um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de doenças autoimunes (WO2009135615); um polipeptídeo quimérico, que compreende uma citocina ligada a um ligante que atinge uma proteína sobre à superfície da célula imune, em que a citocina pode ser uma variante de IL-2 (WO2017136818) e etc.
[008] Entretanto, ainda há uma necessidade nesse campo por variantes de IL-2 com maior estabilidade. O fornecimento de tais variantes de IL-2 e seus derivados para aumentar a eficácia terapêutica de IL-2 é um problema urgente neste campo.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[009] A presente descrição fornece uma variante de IL-2 ou seu derivado que possui uma ou mais mutações de aminoácidos e um conjugado da variante de IL-2 ou seu derivado, um polipeptídeo e uma molécula de ácido nucleico codificadores, um vetor, célula hospedeira e composição farmacêutica, uso farmacêutico e método de tratamento.
[0010] No primeiro aspecto, a presente descrição fornece uma variante de IL-2 ou seu derivado, que têm uma ou mais mutações de aminoácidos nas posições 11, 26, 27º, 29, 30, 31, 32, 33, 3º, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 70, 71, 72, 78, 82, 88 132. Na presente descrição, a mutação representada em uma forma abc, em que a é o tipo de aminoácido antes da mutação, b é a posição da mutação e c é o tipo de aminoácido depois a mutação. Por exemplo, N26S se refere a uma mutação de asparagina (N) para serina (S) na posição 26; N26 se refere a qual asparagina (N) na posição 26 é mutada; 26S se refere a qual aminoácido na posição 26 é mutado para serina (S).
[0011] Especificamente, a variante de IL-2 ou seu derivado fornecido na presente descrição compreendem uma ou mais mutações de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas nas seguintes posições: 26, 29, 30, 71, 11, 132, 70, 82, 27 e 78. Em algumas modalidades, o aminoácido antes da mutação (por exemplo, na IL-2 humana de tipo selvagem) são: asparagina (N) na posição 26, asparagina (N) na posição 29 e asparagina (N) na posição 30, asparagina (N) na posição 71, glutamina (Q) na posição 11, leucina (L) na posição 132, leucina (L) na posição 70, prolina (P) na posição 82, glicina (G) na posição 27 e fenilalanina (F) na posição 78. Em algumas modalidades, a(s) mutação/mutações de aminoácido da variante de IL- 2 ou seu derivado inclui/incluem qualquer um ou qualquer combinação selecionada das seguintes mutações: mutação para Gln (Q) na posição 26, mutação para serina (S) na posição 29, mutação para serina (S) na posição 30, mutação para Gln (Q) na posição 71, a mutação para Cys (C) na posição 11, 132, 70, 82, 27 e 78.
[0012] Em algumas modalidades específicas, a variante de IL-2 ou seu derivado compreendem um primeiro tipo de mutação e o primeiro tipo de mutação é qualquer um selecionado do grupo que consiste em (1) - (7) ou qualquer combinação destes: (1) N26Q, (2) N29S, (3) N30S, (4) N71Q, (5) Q11C e L132C, (6) L70C e P82C, e (7) G27C e F78C.
[0013] Em algumas modalidades específicas, a variante de IL-2 ou seu derivado acima mencionados tem estabilidade aumentada, por exemplo, estabilidade de desaminação aumentada e/ou estabilidade térmica; especificamente, o primeiro tipo de mutação fornecido pela presente descrição confere estabilidade aumentada à variante de IL-2 ou seu derivado quando comparada com IL-2 do tipo selvagem; a estabilidade compreende, mas não está limitada a estabilidade de desaminação aumentada e/ou térmica estabilidade.
[0014] Por outro lado, a variante de IL-2 ou seu derivado fornecido na presente descrição também compreendem uma ou mais mutações de aminoácidos nas seguintes posições ou qualquer combinação das mesmas: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 72. Em algumas modalidades, os aminoácidos antes da mutação (como por exemplo na IL-2 humana do tipo selvagem) são: asparagina (N) na posição 29, asparagina (N) na posição 30, tirosina (Y) na posição 31, lisina (K) na posição 32, asparagina (N) na posição 33, prolina (P) na posição 34, lisina (K) na posição 35, leucina (L) na posição 36, treonina (T) na posição 37, arginina (R) na posição 38, metionina (M) na posição 39, leucina (L) na posição 40, treonina (T) na posição 41, fenilalanina (F) na posição 42, lisina (K) na posição 43, fenilalanina (F) na posição 44, tirosina (Y) na posição 45, leucina (L) na posição 72.
[0015] Em algumas modalidades específicas, a variante de IL-2 ou seu derivado compreendem ainda um segundo tipo de mutação e o segundo tipo de mutação é qualquer uma selecionada do grupo que consiste em (8) a (11) ou (8) ou qualquer combinação de (8) a (10): (8) F42A, (9) Y45A, (10) L72G e 11) NNYKNPKLTRMLTFK nas posições 29-44 mutados para QSMHIDATL.
[0016] Em algumas modalidades, o segundo tipo de mutação pode eliminar ou reduzir a afinidade de IL-2 pelos receptores de alta afinidade (IL-2Rα/β/γ) e reter a afinidadeIL-2 pelo receptor de média afinidade (IL- 2Rβ/γ) afinidade; o segundo tipo de mutação pode reter o efeito de IL-2 sobre a indução da proliferação e ativação de células efetoras (tal como células NK e T), mas reduzir o efeito de IL-2 sobre a indução da proliferação e ativação de células Treg.
[0017] No terceiro aspecto, a variante de IL-2 ou seu derivado fornecidos pela presente descrição compreendem uma ou mais mutações de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas nas seguintes posições: 20, 88 e 126. Em algumas modalidades, os aminoácidos antes da mutação (por exemplo, na IL-2 humana de tipo selvagem) são: ácido aspártico (D) na posição 20, asparagina (N) na posição 88 e glutamina na posição 126 (Q). Em algumas modalidades, a variante de IL-2 ou seu derivado compreendem qualquer aminoácido a seguir ou qualquer combinação desses depois da mutação: alanina (A) ou histidina (H) ou iso Leucina (I) ou metionina (M) ou ácido glutâmico (E) ou serina (S) ou valina (V) ou triptofano (W) na posição 20, alanina (A) ou arginina (R) ou ácido glutâmico (E) ou leucina (L) ou fenilalanina (F) ou glicina (G) ou isoleucina (I) ou metionina (M) ou serina (S) ou Y ou valina (V), asparagina (N) ou leucina (L) ou P ou fenilalanina (F) ou glicina (G) ou isoleucina (I) ou metionina (M) ou arginina (R) ou serina (S) ou treonina (T) ou tirosina (Y) ou valina (V) na posição 126.
[0018] Em algumas modalidades específicas, a variante de IL-2 ou seu derivado compreendem ainda um terceiro tipo de mutação, que é qualquer mutação selecionada do grupo que consiste em mutações de (12) a (14) ou qualquer combinação das mesmas: (12) N88 mutado para A, R, E, L, F, G, I, M, S, Y, V ou D, (13) D20 mutado para A, H, I, M, E, S, V, W ou Y, (2) (14) Q126 mutado para N, L, P, F, G, I, M, R, S, T, Y ou V
[0019] Em algumas modalidades, o terceiro tipo de mutação pode reduzir a afinidade de IL-2 para receptores de alta afinidade (IL-2Rα/β/γ) e receptores de afinidade média (IL-2Rβ/γ), mas a afinidade pelo receptor de alta afinidade (IL-2Rβ/γ) está mais reduzida do que a afinidade do receptor de média afinidade; o terceiro tipo de mutação pode reter o efeito de IL-2 sobre a indução da proliferação e ativação de Tregs, mas eliminar ou reduzir o efeito de IL-2 sobre a indução da proliferação e ativação em células efetoras (tal como células NK e T).
[0020] Em algumas modalidades, a variante de IL-2 ou seu derivado compreendem o primeiro tipo de mutação e o segundo tipo de mutação ou compreendem o primeiro tipo de mutação e o terceiro tipo de mutação como descrito acima.
[0021] Em algumas modalidades, o primeiro tipo de mutação na variante de IL-2 ou seu derivado é selecionado entre qualquer um de (15) a (17), ou é qualquer um de (15) a (17) em combinação com qualquer um de (5) a (7) como descrito acima: (15) N26Q e N29S (16) N26Q, N29S e N71Q, e (17) N26Q e N30S.
[0022] O segundo tipo de mutação é selecionado entre qualquer um de (18) a (20) e (11): (18) F42A e Y45A, (19) F42A e L72G e (20) Y45A e L72G;
[0023] O terceiro tipo de mutação é N88R ou N88G ou N88I ou N88D.
[0024] Em algumas modalidades, a variante de IL-2 ou seu derivado compreendem uma mutação como mostrada em qualquer um de (21) a (29): (21) N26Q, N29S, F42A, N71Q e L72G, (22) N26Q, N29S e N88R, (23) N26Q, N29S, F42A e L72G, (24) N26Q, N30S, F42A e L72G, (25) Q11C, N26Q, N30S, F42A, L72G e L132C, (26) N26Q, N30S, F42A, L70C, L72G e P82C,
(27) N26Q, G27C, N30S, F42A, L72G e F78C, (28) N29S, F42A e L72G E (29) Q11C, NNYKNPKLTRMLTFKF nas posições 29-44 são mutados para QSMHIDATL e L132C.
[0025] Em adição a (1) a (29) descritos acima, a presente descrição também fornece as seguintes variantes de IL-2, que compreendem qualquer combinação de posições de mutação e tipos de mutação como mostrado em (1) a (20), compreendendo, mas não se limitando ao seguinte de (30) a (208): (30) N26Q/Q11C/L132C; (31) N26Q/L70C/P82C; (32) N26Q/G27C/F78C; (33) N26Q/NNYKNPKLTRMLTFKF nas posições 29-44 mutados para QSMHIDATL; (34) N26Q/F42A/Y45A; (35) N26Q/F42A/L72G; (36) N26Q/Y45A/L72G; (37) N26Q/F42A/Y45A/L72G; (38) Q11C/N30S/L132C; (39) N30S/L70C/P82C; (40) G27C/N30S/F78C; (41) N30S/F42A/Y45A; (42) N30S/F42A/L72G; (43) N30S/Y45A/L72G; (44) N30S/F42A/Y45A/L72G; (45) N29S/N30S/F42A/L72G; (46) Q11C/F42A/Y45A; (47) Q11C/F42A/L72G/L132C; (48) Q11C/Y45A/L72G/L132C; (49) Q11C/F42A/Y45A/L72G/L132C;
(50) Q11C/N29S/F42A/L72G/L132C; (51) NNYKNPKLTRMLTFKF nas posições 29-44 mutado para QSMHIDATL/L70C/P82C; (52) F42A/Y45A/L70C/P82C; (53) F42A/L70C/L72G/P82C; (54) Y45A/L70C/L72G/P82C; (55) F42A/Y45A/L70C/L72G/P82C; (56) N29S/F42A/L70C/L72G/P82C; (57) G27C/NNYKNPKLTRMLTFKF nas posições 29-44 mutado para QSMHIDATL/F78C; (58) G27C/F42A/Y45A/F78C; (59) G27C/F42A/L72G/F78C; (60) G27C/Y45A/L72G/F78C; (61) G27C/F42A/Y45A/L72G/F78C; (62) G27C/N29S/F42A/L72G/F78C; (63) NNYKNPKLTRMLTFKF nas posições 29-44 mutado para QSMHIDATL/Y45A; (64) NNYKNPKLTRMLTFKF nas posições 29-44 mutado para QSMHIDATL/L72G; (65) NNYKNPKLTRMLTFKF nas posições 29-44 mutado para QSMHIDATL/Y45A/ L72G; (66) N26Q/N30S/Q11C/L132C; (67) N26Q/N30S/L70C/P82C; (68) N26Q/G27C/N30S/F78C; (69) N26Q/N30S/F42A/Y45A; (70) N26Q/N30S/F42A/L72G; (71) N26Q/N30S/Y45A/L72G; (72) N26Q/N30S/F42A/Y45A/L72G; (73) N26Q/N29S/N30S/F42A/L72G; (74) N26Q/N29S/N30S;
(75) N26Q/N29S/Q11C/L132C; (76) N26Q/N29S/L70C/P82C; (77) N26Q/N29S/G27C/F78C; (78) N26Q/N29S/F42A/Y45A; (79) N26Q/N29S/Y45A/L72G; (80) N26Q/N29S/F42A/Y45A/L72G; (81) Q11C/N29S/N30S/L132C; (82) N29S/N30S/L70C/P82C; (83) G27C/N29S/N30S/F78C; (84) N29S/N30S/F42A/Y45A; (85) N29S/N30S/F42A/L72G; (86) N29S/N30S/Y45A/L72G; (87) N29S/N30S/F42A/Y45A/L72G; (88) Q11C/N29S/F42A/Y45A/L132C; (89) Q11C/N29S/F42A/L72G/L132C; (90) Q11C/N29S/Y45A/L72G/L132C; (91) Q11C/N29S/F42A/Y45A/L72G/L132C; (92) N29S/F42A/Y45A/L70C/P82C; (93) N29S/F42A/L70C/L72G/P82C; (94) N29S/Y45A/L70C/L72G/P82C; (95) N29S/F42A/Y45A/L70C/L72G/P82C; (96) G27C/N29S/F78C/F42A/Y45A; (97) G27C/N29S/F78C/F42A/L72G; (98) G27C/N29S/F78C/Y45A/L72G; (99) G27C/N29S/F78C/F42A/Y45A/L72G; (100) N29S/F42A/Y45A; (101) N29S/F42A/L72G; (102) N29S/Y45A/L72G; (103) N29S/F42A/Y45A/L72G; (104) Q11C/N29S/L132C;
(105) N29S/L70C/P82C; (106) G27C/N29S/F78C; (107) N29S/N30S; (108) N26Q/N29S; (109) N26Q/N71Q; (110) N30S/N71Q; (111) Q11C/N71Q/L132C; (112) L70C/N71Q/P82C; (113) G27C/N71Q/F78C; (114) NNYKNPKLTRMLTFKF nas posições 29-44 mutado para QSMHIDATL/N71Q; (115) F42A/Y45A/N71Q; (116) F42A/N71Q/L72G; (117) Y45A/N71Q/L72G; (118) N26Q/N30S/F42A/N71Q/L72G; (119) Q11C/N26Q/N30S/F42A/N71Q/L72G/L132C; (120) N26Q/N30S/F42A/L70C/N71Q/L72G/P82C; (121) N26Q/G27C/N30S/F42A/N71Q/L72G/F78C; (122) N29S/F42A/N71Q/L72G; (123) N26Q/N30S/N71Q; (124) N26Q/Q11C/N71Q/L132C; (125) N26Q/L70C/N71Q/P82C; (126) N26Q/G27C/N71Q/F78C; (127) N26Q/NNYKNPKLTRMLTFKF nas posições 29-44 mutado para QSMHIDATL/N71Q; (128) N26Q/F42A/Y45A/N71Q; (129) N26Q/F42A/N71Q/L72G; (130) N26Q/Y45A/N71Q/L72G; (131) N26Q/F42A/Y45A/N71Q/L72G; (132) Q11C/N30S/N71Q/L132C;
(133) N30S/L70C/N71Q/P82C; (134) G27C/N30S/N71Q/F78C; (135) N30S/F42A/Y45A/N71Q; (136) N30S/F42A/N71Q/L72G; (137) N30S/Y45A/N71Q/L72G; (138) N30S/F42A/Y45A/N71Q/L72G; (139) N29S/N30S/F42A/N71Q/L72G; (140) Q11C/F42A/Y45A/N71Q; (141) Q11C/F42A/N71Q/L72G/L132C; (142) Q11C/Y45A/N71Q/L72G/L132C; (143) Q11C/F42A/Y45A/N71Q/L72G/L132C; (144) Q11C/N29S/F42A/N71Q/L72G/L132C; (145) NNYKNPKLTRMLTFKF nas posições 29-44 mutado para QSMHIDATL/L70C/ N71Q/P82C; (146) F42A/Y45A/L70C/N71Q/P82C; (147) F42A/L70C/N71Q/L72G/P82C; (148) Y45A/L70C/N71Q/L72G/P82C; (149) F42A/Y45A/L70C/N71Q/L72G/P82C; (150) N29S/F42A/L70C/N71Q/L72G/P82C; (151) G27C/NNYKNPKLTRMLTFKF nas posições 29-44 mutado para QSMHIDATL/ N71Q/F78C; (152) G27C/F42A/Y45A/N71Q/F78C; (153) G27C/F42A/N71Q/L72G/F78C; (154) G27C/Y45A/N71Q/L72G/F78C; (155) G27C/F42A/Y45A/N71Q/L72G/F78C; (156) G27C/N29S/F42A/N71Q/L72G/F78C; (157) NNYKNPKLTRMLTFKF nas posições 29-44 mutado para QSMHIDATL/ Y45A/N71Q; (158) NNYKNPKLTRMLTFKF nas posições 29-44 mutado para QSMHIDATL/ N71Q/L72G;
(159) NNYKNPKLTRMLTFKF nas posições 29-44 mutado para QSMHIDATL/Y45A/ N71Q/L72G; (160) N26Q/N30S/Q11C/N71Q/L132C; (161) N26Q/N30S/L70C/N71Q/P82C; (162) N26Q/G27C/N30S/N71Q/F78C; (163) N26Q/N30S/F42A/Y45A/N71Q; (164) N26Q/N30S/F42A/N71Q/L72G; (165) N26Q/N30S/Y45A/N71Q/L72G; (166) N26Q/N30S/F42A/Y45A/N71Q/L72G; (167) N26Q/N29S/N30S/F42A/N71Q/L72G; (168) N26Q/N29S/N30S/N71Q; (169) N26Q/N29S/Q11C/N71Q/L132C; (170) N26Q/N29S/L70C/N71Q/P82C; (171) N26Q/N29S/G27C/N71Q/F78C; (172) N26Q/N29S/F42A/Y45A/N71Q; (173) N26Q/N29S/Y45A/N71Q/L72G; (174) N26Q/N29S/F42A/Y45A/N71Q/L72G; (175) Q11C/N29S/N30S/N71Q/L132C; (176) N29S/N30S/L70C/N71Q/P82C; (177) G27C/N29S/N30S/N71Q/F78C; (178) N29S/N30S/F42A/Y45A/N71Q; (179) N29S/N30S/F42A/N71Q/L72G; (180) N29S/N30S/Y45A/N71Q/L72G; (181) N29S/N30S/F42A/Y45A/N71Q/L72G; (182) Q11C/N29S/F42A/Y45A/N71Q/L132C; (183) Q11C/N29S/F42A/N71Q/L72G/L132C; (184) Q11C/N29S/Y45A/N71Q/L72G/L132C; (185) Q11C/N29S/F42A/Y45A/N71Q/L72G/L132C; (186) N29S/F42A/Y45A/L70C/N71Q/P82C; (187) N29S/F42A/L70C/N71Q/L72G/P82C;
(188) N29S/Y45A/L70C/N71Q/L72G/P82C; (189) N29S/F42A/Y45A/L70C/N71Q/L72G/P82C; (190) G27C/N29S/F78C/F42A/Y45A/N71Q; (191) G27C/N29S/F78C/F42A/N71Q/L72G; (192) G27C/N29S/F78C/Y45A/N71Q/L72G; (193) G27C/N29S/F78C/F42A/Y45A/N71Q/L72G; (194) N29S/F42A/Y45A/N71Q; (195) N29S/F42A/N71Q/L72G; (196) N29S/Y45A/N71Q/L72G; (197) N29S/F42A/Y45A/N71Q/L72G; (198) Q11C/N29S/N71Q/L132C; (199) N29S/L70C/N71Q/P82C; (200) G27C/N29S/N71Q/F78C; (201) N29S/N30S/N71Q; (202) N26Q/N29S/N71Q; (203) N26Q/N88R; (204) N29S/N88R; (205) N30S/N88R; (206) N26Q/N88R/Q11C/L132C; (207) N29S/N88R/L70C/P82C; e (208) N30S/N88R/G27C/F78C; em que "/" se refere a quais mutações estão presentes ao mesmo tempo em uma única variante de IL-2. Em algumas modalidades, as mutações descritas acima estão relacionadas à IL-2 do tipo selvagem e a sequência de aminoácidos de IL-2 do tipo selvagem é mostrada na SEQ ID Nº:2. A numeração da posição da mutação é contada a partir do aminoácido A na segunda posição de acordo com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID Nº:2.
[0026] Em algumas modalidades, a variante de IL-2 ou seu derivado compreendem aminoácidos como mostrados em qualquer uma selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 4, SEQ ID Nº: 6, SEQ ID Nº: 8, SEQ ID Nº: 10, SEQ ID Nº:12, SEQ ID Nº:14, SEQ ID Nº:16, SEQ ID Nº:18, SEQ ID Nº:20, SEQ ID Nº:22, SEQ ID Nº:24, SEQ ID Nº:26, SEQ ID Nº:28, SEQ ID Nº: 30, SEQ ID Nº: 32, SEQ ID Nº: 34, SEQ ID Nº: 36 e SEQ ID Nº: 41 mostradas em qualquer um dos aminoácidos. As sequências de aminoácidos dos polipeptídeos e as sequência de nucleotídeos correspondentes são mostrados na Tabela 1 (o sublinhado representa a mutação de aminoácido): Tabela 1. A sequência de aminoácidos e a sequência de ácido nucleico de variantes de IL-2 As sequências de aminoácidos para o tipo selvagem e SEQ ID Nº: Numeração Posição Mutação variantes de IL-2 humana Correspondente
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKL
TRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLA IL-2-WT tipo selvagem SEQ ID Nº:1
QSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADET ATIVEFLNRWITFCQSIISTLT (SEQ ID Nº:2)
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILQGINNYKNPKL
TRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLA IL-2-01 N26Q SEQ ID Nº:3
QSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADET ATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:4)
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINSYKNPKL
TRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLA IL-2-02 N30S SEQ ID Nº:5
QSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADET ATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:6)
MAPTSSSTKKTCLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKL
TRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLA IL-2-03 Q11C/L132C SEQ ID Nº:7
QSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADET ATIVEFLNRWITFAQSIISTCT (SEQ ID Nº:8)
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKL
TRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVCNLA IL-2-04 L70C/P82C SEQ ID Nº:9
QSKNFHLRCRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADET ATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:10)
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNCINNYKNPKL
TRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLA IL-2-05 G27C/F78C SEQ ID Nº:11
QSKNCHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADET ATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:12)
As sequências de aminoácidos para o tipo selvagem e SEQ ID Nº: Numeração Posição Mutação variantes de IL-2 humana Correspondente
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGIQSMHIDAT NNYKNPKLTRMLTFKF
LYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHL nas posições 29-44 IL-2-06 RPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLN SEQ ID Nº:13 mutado para
RWITFAQSIISTLT
QSMHIDATL (SEQ ID Nº:14)
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKL
TRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLA IL-2-07 F42A/Y45A SEQ ID Nº:15
QSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADET ATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:16)
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKL
TRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNG IL-2-08 F42A/L72G SEQ ID Nº:17
AQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADE TATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:18)
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKL
TRMLTFKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGA IL-2-09 Y45A/L72G SEQ ID Nº:19
QSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADET ATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:20)
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILQGINSYKNPKL N26Q/N30S/ TRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNG IL-2-10 SEQ ID Nº:21 F42A/L72G AQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADE TATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:22)
MAPTSSSTKKTCLQLEHLLLDLQMILQGINSYKNPKL Q11C/N26Q/N30S/F42A
TRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNG IL-2-11 / SEQ ID Nº:23
AQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADE L72G/L132C TATIVEFLNRWITFAQSIISTCT (SEQ ID Nº:24) N26Q/N30S/ MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILQGINSYKNPKL
TRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVCNG IL-2-12 F42A/L70C/ SEQ ID Nº:25
AQSKNFHLRCRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADE L72G/P82C TATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:26)
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILQCINSYKNPKL N26Q/G27C/N30S/F42A
TRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNG IL-2-13 / SEQ ID Nº:27
AQSKNCHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYAD L72G/F78C ETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:28)
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNYKNPKL N29S/F42A TRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNG IL-2-14 SEQ ID Nº:29 /L72G AQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADE TATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:30)
As sequências de aminoácidos para o tipo selvagem e SEQ ID Nº: Numeração Posição Mutação variantes de IL-2 humana Correspondente
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILQGISNYKNPKL
TRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNG IL-2-21 N26Q/N29S/F42A/L72G SEQ ID Nº:31
AQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADE TATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:32)
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILQGISNYKNPKL N26Q/N29S/F42A/N71Q TRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLQG IL-2-22 SEQ ID Nº:33 /L72G AQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADE TATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:34)
NNYKNPKLTRMLTFKF MAPTSSSTKKTCLQLEHLLLDLQMILNGIQSMHIDATL na posição Q11C/29-44 YMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLR IL-2-23 SEQ ID Nº:35 mutado para PRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNR QSMHIDATL/L132C WITFAQSIISTCT (SEQ ID Nº:36)
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILQGISNYKNPKL
TRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLA IL-2-24 N26Q/N29S/N88R SEQ ID Nº:40
QSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSETTFMCEYADET ATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:41) (Nota: A numeração para as posições de mutação mencionada acima está de acordo com a proteína humana IL-2 madura mostrado na SEQ ID Nº: 2. A proteína humana IL-2 madura não compreende o aminoácido M na primeira posição, de modo que a numeração começa a partir do aminoácido A na segunda posição. Entre esses, "/" se refere a quais mutações estão presentes ao mesmo tempo em uma única variante de IL-2. Cada variante pode ou não compreender C125A; em que a presença de C125A é para evitar a formação de dímero).
[0027] Em algumas modalidades, o derivado da variante de IL-2 inclui a proteína de extensão completa ou parcial da variante de IL-2 da presente descrição; ou inclui as proteínas mutadas, derivados funcionais, fragmentos funcionais, peptídeos biologicamente ativos, proteínas de fusão, isoformas ou seus sais obtidos pela mutação posterior com base na variante de IL-2 da presente descrição. Por exemplo, uma proteína de fusão que compreende a variante de IL-2, um monômero ou dímero ou trímero ou polímero da variante de IL-2, várias formas modificadas da variante de IL-2 (tais como PEGuilação, peguilação, glicosilação, conjugação ou fusão com albumina, fusão ou conjugação com Fc, hidroxietilação, ausência de O-glicosilação, etc.) e homólogos das variantes de IL-2 em várias espécies. A modificação da IL-2 não causa efeito adverso na imunogenicidade relacionada ao tratamento.
[0028] Em algumas modalidades, a variante ou derivado de IL-2 é PEGuilado (que pode ser expresso como PEG-IL-2), por exemplo, uma variante ou derivado de IL-2 mono ou di-PEGuilado. A variante ou derivado de PEG-IL-2 compreende um grupo de ligação SC-PEG. Em outras modalidades, a variante ou derivado de PEG-IL-2 compreende um grupo de ligação metoxi-PEG-aldeído (mPEG-ALD). Em certas modalidades, o peso molecular médio da porção de PEG varia entre cerca de 5KD a cerca de 50KD, em particular 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 KD; ou cerca de 5KD a cerca de 40KD, ou cerca de 10KD a cerca de 30KD, ou cerca de 10KD a cerca de 30KD, ou cerca de15KD a cerca de 20KD. Em algumas modalidades, o grupo aldeído em mPEG-ALD pode ser acetaldeído, propionaldeído, butiraldeído ou semelhantes. Em uma modalidade, a variante de IL-2 ou seu derivado têm uma meia-vida sérica prolongada quando comparados àquela de IL-2 do tipo selvagem ou seu derivado.
[0029] Quando a variante de IL-2 ou seu derivado contêm o segundo tipo de mutação, em algumas modalidades, a variante de IL-2 ou seu derivado podem desencadear uma ou mais respostas celulares selecionadas do grupo que consiste em: proliferação de linfócitos T ativados, diferenciação de linfócitos T ativados, atividade de células T citotóxicas (CTLs), proliferação de células B ativadas, diferenciação em células B ativadas, proliferação em células natural killer (NK), diferenciação de células NK, secreção de citocinas pelas células T ou células NK ativadas e citotoxicidade antitumoral das células killer ativadas (LAK) pelo linfócito/NK. Em algumas modalidades, a variante de IL-2 ou seu derivado têm uma capacidade reduzida de induzir a sinalização de IL-2 em células T reguladoras quando comparada com aquela do polipeptídeo de IL-2 de tipo selvagem. Em uma modalidade, a variantes de IL-2 ou seu derivado induzem menos morte celular induzida por ativação (AICD) em células T do que IL-2 do tipo selvagem ou seu derivado. Em algumas modalidades específicas, a variantes de IL-2 ou seu derivado têm toxicidade in vivo reduzida em comparação com IL-2 de tipo selvagem ou seu derivado.
[0030] Quando a variante de IL-2 ou seu derivado contêm o terceiro tipo de mutação, em algumas modalidades, a variante de IL-2 ou seu derivado podem reduzir a afinidade de IL-2 a ambos os receptores de alta afinidade (IL-2Rα/β/γ) e ao receptor de média afinidade (IL-2Rβ/γ), entretanto a redução da afinidade pelo receptor de alta afinidade é maior do que aquela pelo receptor de média afinidade. Em algumas modalidades, a variante de IL-2 ou seu derivado podem reter o efeito de IL-2 sobre a indução da proliferação e ativação de Tregs, mas eliminar ou reduzir o efeito de IL-2 sobre a indução da proliferação e ativação de células efetoras (tais como células NK e T).
[0031] Em outro aspecto, a presente descrição fornece um conjugado no qual uma variante de IL-2 ou seu derivado estão diretamente conectados ou indiretamente conectados a um módulo não IL-2 por meio de um ligante. Em algumas modalidades, o conjugado é um imunoconjugado, em que a módulo não IL-2 é um módulo de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o módulo de ligação ao antígeno tem como alvo os antígenos presentes nas células tumorais ou no ambiente das células tumorais.
[0032] Em algumas modalidades, a variante de IL-2 está ligada a pelo menos um módulo não IL-2. Em algumas modalidades, a variante IL-2 e o módulo não IL-2 formam uma proteína de fusão, o que significa que a variante IL-2 compartilha uma ligação peptídica com o módulo não IL-2. Em algumas modalidades, a variante de IL-2 está ligada a pelo menos um módulo não IL-2, tal como o primeiro módulo não IL-2 e um segundo módulo não IL-2. Em algumas modalidades, o módulo não IL- 2 é um módulo de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, a variante de IL-2 compartilha uma ligação peptídica com o primeiro módulo de ligação ao antígeno na terminação amino ou carboxila e o segundo módulo de ligação ao antígeno compartilha uma ligação peptídica na terminação amino ou carboxila com o seguinte: i) variante de IL-2 ou ii) o primeiro módulo de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades específicas, a variante de IL-2 compartilha uma ligação peptídica com o primeiro módulo não IL-2 na terminação carboxila e compartilha uma ligação peptídica amino-terminal com o segundo módulo não IL-2 na terminação amino. Em algumas modalidades, o módulo não IL-2 é um módulo de ligação ao antígeno.
[0033] O módulo de ligação ao antígeno pode ser um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno, compreendendo, mas não se limitando a moléculas de imunoglobulina (por exemplo, moléculas de IgG semelhantes a imunoglobulinas (por exemplo, IgG1)), anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno.
[0034] Em algumas modalidades específicas, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é selecionado a partir de: um complexo de polipeptídeo que compreende uma região variável da cadeia pesada de um anticorpo e uma região variável da cadeia leve de um anticorpo, Fab, Fv, sFv, F(ab')2, anticorpo linear, anticorpo de cadeia única, scFv, sdAb, sdFv, nanocorpo, anticorpo peptídico pepticorpo, anticorpo de domínio e anticorpo multiespecífico (anticorpo biespecífico, diacorpo, triacorpo e tetracorpo, dois scFv em tandem, três scFv em tandem). No caso em que a variante de IL-2 está conectada a mais de um módulo de ligação ao antígeno (tal como o primeiro e o segundo módulos de ligação ao antígeno), cada módulo de ligação ao antígeno pode ser selecionado independentemente a partir de várias formas de anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno, por exemplo, o primeiro módulo de ligação ao antígeno pode ser uma molécula de Fab e o segundo módulo de ligação ao antígeno pode ser uma molécula de scFv, ou cada um dos primeiro e segundo módulos de ligação ao antígeno é uma molécula scFv, ou cada um dos primeiro e segundo módulos de ligação ao antígeno é uma molécula de Fab. Em algumas modalidades, no caso em que a variante de IL-2 está conectada a mais do que um módulo de ligação ao antígeno (tal como o primeiro e o segundo módulos de ligação ao antígeno), o antígeno direcionado por cada módulo de ligação ao antígeno pode ser selecionado independentemente, por exemplo, o primeiro e segundo módulos de ligação ao antígeno direcionados contra diferentes antígenos ou direcionados contra o mesmo antígeno.
[0035] Em algumas modalidades, o antígeno ligado pelo módulo de ligação ao antígeno pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em: domínio A1 Tenascina C (TNC A1), domínio A2 de Tenascina C (TNC A2), extra-domínio de Fibronectina (Extra-Domínio B) (EDB), antígeno carcinoembrionário (CEA) e proteoglicano de sulfato de condroitina associao ao melanoma (MCSP). Em algumas modalidades, os antígenos tumorais compreendem, mas não estão limitados a MAGE, MART-1/Melan-A, gp100, dipeptidil peptidase IV (DPPIV), proteína de ligação a adenosina desaminase (ADAbp), ciclofilina b, antígeno relacionado ao colón-reto (CRC)-C017-1A/GA733, antígeno carcinoembrionário (CEA) e seus epítopos imunogênicos CAP-1 e CAP- 2, etv6, am11, antígeno específico da próstata (PSA) e seus epítopos imunogênicos PSA-1, PSA -2 e PSA-3, antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), receptor de células T/CD3- cadeia zeta, família MAGE de antígenos tumorais (tal como MAGE-A1, MAGE- A2,
MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE- B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), a família GAGE de antígenos tumorais (por exemplo, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tirosinase, p53, família MUC, HER2/neu, p21ras, RCAS1, α-fetoproteina, E-caderina, α-catenina, β-catenina e γ- catenina, P120ctn, gp100Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, proteína da polipose adenomatosa coli (APC), fodrina, conexina 37, idiotipo de Ig, p15, gp75, gangliosídeos GM2 e GD2, produtos virais (tais como proteína do vírus do papiloma humano), família Smad de antígenos tumorais, 1mp-1, P1A, antígeno nuclear codificado por EBV (EBNA)-1, fosforilase do glicogênio cerebral, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL- 40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 e CT-7 e c-erbB-2. Em algumas modalidades, exemplos não limitantes de antígenos virais envolvem a hemaglutinina do vírus influenza, LMP-1 do vírus de Epstein-Barr, glicoproteína E2 do vírus da hepatite, gp160 de HIV e gp120 de HIV. Em algumas modalidades, exemplos não limitantes de antígenos ECM envolvem sindecan, heparanase, integrina, osteopontina, link, caderina, laminina, laminina tipo RGF, lectina, fibronectina, notsch, tenascina e matrixina.
[0036] Em algumas modalidades, a variante de IL-2 ou seu derivado que compreendem o módulo de ligação ao antígeno descrito acima compreende o segundo tipo de mutação, mas não compreende o terceiro tipo de mutação
[0037] Em algumas modalidades, é fornecido um método para aumentar a estabilidade de IL-2 ou seu derivado ou conjugado, o método compreendendo a introdução de quaisquer mutações de IL-2 ou seu derivado ou conjugado, em que a(s) dita(s) mutação/mutações é qualquer uma ou a combinação de:
1) N26Q, 2) N29S, 3) N30S, 4) N71Q, 5) Q11C e L132C, 6) L70C e P82C, e 7) G27C e F78C.
[0038] Em outro aspecto, a presente descrição fornece uma composição farmacêutica que contém a variante de IL-2 ou seu derivado ou seu imunoconjugado descritos acima, opcionalmente, compreende um diluente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitáveis. A composição farmacêutica pode ser uma preparação liofilizada ou uma solução injetável
[0039] Em algumas modalidades específicas, a composição farmacêutica pode compreender 0,01 a 99% em peso da variante de IL- 2 ou seu derivado ou imunoconjugado, em uma dose unitária; ou a quantidade da composição farmacêutica A quantidade da variante de IL-2 ou seu derivado ou imunoconjugado compreendida na unidade da composição farmacêutica é de 0,1-2000 mg (por exemplo, 1-1000 mg).
[0040] Em outro aspecto, a presente descrição fornece um ácido nucleico que codifica a variante de IL-2 ou seu derivado acima mencionados. O ácido nucleico compreende um polinucleotídeo mostrado em qualquer uma das sequências selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 3, SEQ ID Nº: 5, SEQ ID Nº: 7, SEQ ID Nº: 9, SEQ ID Nº: 11, SEQ ID Nº: 13, SEQ ID Nº: 15, SEQ ID Nº:17, SEQ ID Nº:19, SEQ ID Nº:21, SEQ ID Nº:23, SEQ ID Nº:25, SEQ ID Nº:27, SEQ ID Nº:29, SEQ ID Nº:31, SEQ ID Nº: 33, SEQ ID Nº: 35 e SEQ ID Nº: 40.
[0041] Em algumas modalidades, é fornecido um vetor de expressão que compreende um ácido nucleico que codifica a variante de IL-2 ou seu derivado descritos acima.
[0042] Em outro aspecto, é fornecida uma célula hospedeira que expressa o vetor descrito acima. A célula hospedeira pode ser uma célula procariótica ou eucariótica. Em algumas modalidades específicas, a célula hospedeira é uma bactéria, levedura ou célula de mamífero, especificamente Pichia pastoris ou Saccharomyces cerevisiae.
[0043] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende (por exemplo, que tenha sido transformada ou transfectada) um vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica a sequência de aminoácidos da variante de IL-2 ou seu derivado ou imunoconjugado descritos acima. A célula hospedeira envolve microrganismos procarióticos (tais como Escherichia coli) ou várias células eucarióticas (tais como células de ovário de hamster chinês (CHO), células de rim embrionário humano (HEK) ou linfócitos (tais como células Y0, NS0, Sp20), células de inseto, etc.). Em algumas modalidades, as células hospedeiras que expressam polipeptídeos glicosilados que podem ser usadas, são derivadas de organismos multicelulares (por exemplo, invertebrados e vertebrados), tais como células de plantas e de insetos. As células de vertebrados também podem ser usadas como células hospedeiras, por exemplo, linhagens de células de mamíferos mantidas em suspensão, linhagens CV1 de rim de macaco (COS-7), linhagens de rim embrionário humano (células 293 ou 293T), células de rim de filhote de hamster (BHK), células de sertoli de camundongo (células TM4), células de rim de macaco (CV1), células de rim de macaco verde africano (VERO-76), células de câncer cervical humano (HELA), células renais caninas (MDCK), hepatócitos de rato búfalo (BRL3A), células de pulmão humano (W138), hepatócitos humanos (Hep G2), células de tumor de mama de camundongo (MMT060562), células TRI (por exemplo, aquelas descritas em Mather et al., Annals NYAcad Sci383, 44-68 (1982))), células MRC5 e FS4 células, células de ovário de hamster chinês (CHO), linhagens de células de mieloma, tais como YO,
NS0, P3X63 e Sp2/0 e células contidas em animais transgênicos, plantas transgênicas ou plantas cultivadas ou tecidos de animais.
[0044] Em outro aspecto, a presente descrição fornece o uso da variante de IL-2 ou seu derivado, imunoconjugado ou composição farmacêutica que compreende os mesmos descritos acima para a preparação de um medicamento.
[0045] A variante de IL-2 ou seu derivado serão usados para tratar doenças proliferativas, doenças imunes, para regular a resposta imune mediada por célula T, para estimular o sistema imune do indivíduo e para serem usados para a preparação de um medicamento relacionado, quando ele compreende o segundo tipo de mutação. A doença proliferativa pode ser um tumor ou câncer (por exemplo, tumor ou câncer metastático) e pode ser um tumor sólido (por exemplo, carcinoma de células renais metastático e melanoma maligno). Em algumas modalidades, a variante de IL-2, seu derivado ou imunoconjugado da presente descrição podem ser usados para tratar doenças ou condições que que se beneficiarão da estimulação do sistema imunológico do hospedeiro, especialmente condições em que é desejado aumentar a resposta imune celular; tais condições envolvem uma resposta imune insuficiente ou deficiente do hospedeiro. Em algumas modalidades, as doenças ou condições para as quais a variantes ou de IL-2 ou seu derivado ou imunoconjugado podem ser administrados, se referem a tumores ou infecções em que a resposta imune celular é um mecanismo chave de imunidade específica para aqueles tumores ou infecções, tais como como câncer (por exemplo, carcinoma de célula renal ou melanoma), imunodeficiência (tal como pacientes HIV-positivos, pacientes imunossuprimidos), infecções crônicas, etc. Em algumas modalidades, a resposta imune celular intensificada pode compreender um ou mais dos seguintes: aumento geral da função imune, aumento da função da célula T, aumento da função da célula B, recuperação da função do linfócito, expressão aumentada do receptor de IL-2, resposta aumentada de célula T, atividade aumentada de células natural killer ou atividade aumentada de células natural killer ativadas por linfocina (LAK), etc.
Em algumas modalidades, a doença que é tratada pela variante de IL-2 ou seu derivado ou imunoconjugado da presente descrição é um distúrbio proliferativo, tal como o câncer.
Exemplos não limitativos de cânceres incluem câncer de bexiga, câncer de cérebro, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pâncreas, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer uterino, câncer cervical, câncer endometrial, câncer de esôfago, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer retal, câncer de estômago, câncer de próstata, câncer de sangue, câncer de pele, câncer de células escamosas, câncer ósseo e câncer renal.
Outros distúrbios de proliferação celular que podem ser tratados com variante de IL-2 ou seu derivado da presente descrição compreendem, mas não estão limitados a neoplasias localizadas nos seguintes locais: abdômen, osso, mama, sistema digestivo, fígado, pâncreas, peritônio, glândulas endócrinas (glândulas adrenais, paratireoide, pituitária, testículo, ovário, timo, tireoide), olhos, cabeça e pescoço, sistema nervoso (central e periférico), sistema linfático, pelve, pele, tecidos moles, baço, tórax e aparelho geniturinário.
Os distúrbios compreendem ainda condições ou lesões pré-cancerosas e metástase de câncer.
Em certas modalidades, o câncer é selecionado do grupo que consiste em carcinoma de células renais, câncer de pele, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de cérebro, câncer de cabeça e pescoço.
Similarmente, outros distúrbios da proliferação celular também podem ser tratados com a variante de IL-2 ou o derivado da presente descrição, compreendendo, mas não limitados a: hipergamaglobulinemia, distúrbios linfoproliferativos, paraproteinemias, púrpura, sarcoidose, síndrome de Sezary, macroglobulinemia de Waldenstron, doença de
Gaucher, histiocitose; e quaisquer outras doenças proliferação celular localizadas nos sistemas de órgãos listados acima, diferentes de neoplasia. Em outras modalidades, a doença envolve autoimunidade, rejeição de transplante, resposta imune pós-traumática e doenças infecciosas (por exemplo, HIV).
[0046] A variante da IL-2 ou seu derivado serão usados para tratar uma doença autoimune ou aliviar/tratar/prevenir uma reação autoimune após o transplante de órgãos, quando ela compreende o terceiro tipo de mutação. A doença autoimune pode ser selecionada do grupo que consiste em: diabetes mellitus tipo I, artrite reumatoide, esclerose múltipla gastrite crônica, doença de Crohn, doença de Basedow, doença de Bechterew, psoríase, miastenia gravis, hepatite autoimune, APECED, síndrome de Chrug-Strauss, colite ulcerativa, glomerulonefrite, síndrome de Guillain-Barré, tireoidite de Hashimoto, líquen escleroatrófico, lúpus eritematoso sistêmico, PANDAS, febre reumática, sarcoidose, síndrome de Sjogren, síndrome de Stiff-Man, esclerodermia, granulomatose de Wegener, vitiligo, enteropatia autoimune, síndrome de nefrite por hemorragia pulmonar (síndrome de Goodpasture), dermatomiosite, polimiosite, alergia autoimune, asma. Em algumas modalidades, a variante de IL-2 ou seu derivado podem ser usados em combinação com agentes imunossupressores. Em algumas modalidades, o agente imunossupressor é selecionado do grupo que consiste em: glicocorticoide, incluindo decortina, prednisol; azatioprina; ciclosporina A; micofenolato de mofetila; tacrolimus; globulina anti-linfócito T, anticorpos anti-CD3, incluindo muromonab; anticorpos anti-CD25, incluindo basiliximab e daclizumab; anticorpos anti-TNF-α, incluindo infliximab e adalimumab; azatioprina;
metotrexate; ciclosporina; sirolimus; everolimus; fingolimod; CellCept; solvente entérico de micofenolato de sódio; e ciclofosfamida.
[0047] Em algumas modalidades, a variante de IL-2 ou seu derivado ou imunoconjugado da presente descrição não podem fornecer o benefício de curar uma doença completamente, mas apenas fornecer uma cura parcial. Em algumas modalidades, as alterações fisiológicas que têm algum benefício também são consideradas terapeuticamente benéficas. Assim, em algumas modalidades, a quantidade da variante de IL-2 ou seu derivado ou imunoconjugado que forneça uma alteração fisiológica é considerada uma "quantidade eficaz" ou uma "quantidade terapeuticamente eficaz". O paciente ou indivíduo necessitado de tratamento é geralmente um mamífero e, mais especificamente, um humano.
[0048] Em algumas modalidades, é fornecido um método para administrar a variante de IL-2 ou seu derivado ou imunoconjugado da presente descrição para um indivíduo, em que a variante de IL-2 ou seu derivado ou imunoconjugado é administrado pelo menos duas vezes por dia, pelo menos uma vez por dia, pelo menos uma vez a cada 48 horas, pelo menos uma vez a cada 72 horas, pelo menos uma vez por semana, pelo menos uma vez a cada 2 semanas, pelo menos uma vez por mês, pelo menos uma vez a cada dois meses ou pelo menos uma vez a cada três meses. IL-2 pode ser administrada por qualquer via eficaz, por exemplo, por injeção parenteral, incluindo injeção subcutânea de variante de IL-2 ou seu derivado ou imunoconjugado.
[0049] Em um aspecto adicional, a presente descrição fornece um método para a preparação da variante de IL-2ou derivado ou o imunoconjugados, que compreende a introdução de mutações da variante de IL-2 descritas na IL-2 humana do tipo selvagem, ou usando a sequência de ácido nucleico descrita acima, ou usando o vetor de expressão descrito acima, ou usando a célula hospedeira descrita acima. O método de preparação da variante de IL-2 em WO2012/107417 como um todo está no presente documento incorporado.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0050] As Figuras 1A-1F mostram os resultados experimentais da estabilidade térmica de IL-2 do tipo selvagem (WT) e suas variantes IL- 2-01, IL-2-02, IL-2-03, IL-2-04, IL-2-05, respectivamente.
[0051] A Figura 2 mostra a afinidade de IL-2 do tipo selvagem (WT) e suas variantes IL-2-01, IL-2-02, IL-2-03, IL-2-04, IL-2-05, IL -2-06, IL- 2-07, IL-2-08, IL-2-09, IL-2-13 e IL-2Rα detectadas por ELISA.
[0052] A Figura 3A-3C são resultados de teste que mostram a proliferação de células CTLL2 facilitada por IL-2-10, IL-2-22, IL-2-23 e IL-2-10 PEGuilada, IL-2-22 PEGuilada e IL-2-23 PEGuilada IL-2 detectada por experimentos ELISA.
[0053] As Figuras 4A-4C são resultados de teste que mostram a proliferação células Mo7e facilitada por IL-2-10, IL-2-22, IL-2-23 e IL-2- 10 PEGuilada, IL-2-22 PEGuilada e IL-2-23 PEGuilada IL-2 detectada por experimentos ELISA.
[0054] A Figura 5 mostra os resultados experimentais da fosforilação de STAT5 em células CTLL2 por IL-2-01, IL-2-02, IL-2-07, IL-2-08 e IL-2-09 detectada por citometria de fluxo.
[0055] A Figura 6A-6C mostram os resultados experimentais da fosforilação de STAT5 em células T regulatórias (Tregs Figura 6A) do sangue periférico humano, em células T CD8+ (Figura 6B) e em células NK (Figura 6C) estimuladas por IL-2-10, IL-2-22, IL-2-23 e IL-2-10 PEGuilada, IL-2-22 PEGuilada e IL-2-23 PEGuilada respectivamente.
[0056] As Figuras 7A-7D são resultados experimentais que indicam os efeitos de PEG-IL-2-22 sobre o número de células NK de camundongo (Figura 7A), células T CD8 + (Figura 7B), células T CD4 + (Figura 7C) e células Treg (Figura 7D), respectivamente.
[0057] As Figuras 8A-8C são os resultados experimentais dos efeitos de PEG-IL-2-24 sobre número de células T CD8 + de camundongo (Figura 8A), células T CD4 + (Figura 8B) e células Treg (Figura 8C), respectivamente. Figuras 8D-8Fmostram o percentual correspondente de células T CD8+ para células T CD3+ (Figura 8D), o percentual de células T CD4+ para células T CD3+ (Figura 8E) e o percentual de células Treg para células T CD4+ (Figura 8F), respectivamente.
[0058] A Figura 9 é um gráfico que mostra os resultados do efeito antitumor de PEG-IL-2-22 em um modelo de câncer de cólon CT26 de camundongo.
[0059] A Fig. 10 é um gráfico que mostra o efeito antitumoral de PEG-IL-2-22 no modelo de camundongo NCG com transplante subcutâneo de melanoma A375 humano misturado com PBMC humana.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENCÃO
[0060] Para facilitar a compreensão da presente descrição, certas expressões técnicas e científicas são definidas especificamente abaixo. A menos que especificamente definido, todas expressões técnicas e científicas usadas nesta descrição têm o significado comumente entendidos por aqueles versados na técnica aos quais esta descrição pertence.
[0061] Como usados na descrição, o código de três letras e o código de uma letra para os aminoácidos são como descritos em J. Biol. Chem, 243, p3558 (1968). Terminologia
[0062] A expressão "Interleucina-2" ou "IL-2" se refere a qualquer IL-2 natural de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos tais como primatas (tal como humanos) e roedores (tal como camundongos e ratos). A expressão abrange IL-2 não processada, assim como qualquer forma de IL-2 derivada do processamento na célula. A expressão também abrange variantes de IL-2 de ocorrência natural, tais como variantes de splice ou variantes alélicas. A sequência de aminoácidos de uma IL-2 humana de tipo selvagem exemplificadora é mostrada em SEQ ID Nº:2. A IL-2 humana não processada contém adicionalmente um peptídeo de sinal de 20 aminoácidos na terminação N (como mostrado na SEQ ID Nº:272 em WO2012107417) e o peptídeo de sinal está ausente nas moléculas de IL-2 maduras.
[0063] "Mutação de aminoácido" se refere a substituição, deleção, inserção, modificação de aminoácidos e qualquer combinação desses para obtenção de um construto final de modo que o construto final possua as características desejadas, tais como estabilidade intensificada. A deleção e inserção da sequência de aminoácidos envolvem a deleção e inserção de aminoácidos nas terminações amino e/ou carboxila. Um exemplo de deleção terminal é a deleção de um resíduo de alanina na primeira posição da IL-2 humana de extensão completa. A mutação de aminoácido preferida é a substituição de aminoácidos. Por exemplo, a fim de alterar a afinidade de ligação de polipeptídeos de IL-2, aminoácidos não conservados podem ser substituídos (isto é, um aminoácido pode ser substituído por outro aminoácido que possui estrutura e/ou propriedade química diferentes).
[0064] A substituição de aminoácido preferida envolve a substituição de aminoácidos hidrofílicos por aminoácidos hidrofóbicos. A substituição de aminoácido envolve aminoácidos de ocorrência não natural ou derivados de 20 aminoácidos padronizados de ocorrência natural (por exemplo, 4-hidroxiprolina, 3-metil-histidina, ornitina, homoserina, 5-hidroxilisina). As mutações de aminoácidos podem ser geradas usando métodos genéticos ou químicos conhecidos na técnica, incluindo métodos tais como a mutagênese direcionada ao sítio, PCR, síntese de gene e modificação química.
[0065] "IL-2 de tipo selvagem" é igual a variante do polipeptídeo de IL-2 nos outros aspectos além do fato de ser uma forma de IL-2 com aminoácido de tipo selvagem em cada posição que corresponde àquela do polipeptídeo variante de IL-2. Por exemplo, se a variante de IL-2 for IL-2 de extensão completa (isto é, IL-2 que não é fundida ou conjugada a qualquer outra molécula), então a forma de tipo selvagem desta variante é IL-2 natural de extensão completa. Se a variante de IL-2 é uma fusão de IL-2 e outro polipeptídeo codificador (tal como uma cadeia de anticorpo) a jusante de IL-2, então a forma de tipo selvagem desta variante de IL-2 é uma IL -2 que possui a sequência de aminoácidos de IL-2 do tipo selvagem fundida com o mesmo polipeptídeo a jusante. Além disso, se a variante de IL-2 é uma forma truncada de IL-2 (uma sequência na qual as mutações ou modificações são realizadas dentro da porção não truncada de IL-2), então a forma de tipo selvagem desta variante de IL-2 tem um tipo selvagem, então a forma do tipo selvagem de tal variante de IL-2 é similarmente uma IL-2 truncada que possui a sequência do tipo selvagem. A fim de comparar a afinidade de ligação pelo receptor de IL-2 o a atividade biológica entre várias formas de variantes de IL-2 e as formas correspondentes de IL-2 do tipo selvagem, a expressão (tipo selvagem" abrange IL-2 que ocorre naturalmente, IL- 2 natural, uma forma de IL-2 que contém uma ou mais mutações de aminoácidos que não afetam a ligação ao receptor de IL-2, por exemplo, substituição de alanina por cisteína em uma posição que corresponde ao resíduo 125 de IL-2 humana (C125A). Em algumas modalidades, a IL-2 de tipo selvagem compreende a sequência de aminoácidos como mostrada na SEQ ID Nº: 2.
[0066] "Derivado" deve ser interpretado de forma ampla incluindo quaisquer produtos relacionados a IL-2. Derivado se refere, mas não está limitado a homólogos de IL-2 humana e não humana, fragmentos ou truncamentos, proteínas de fusão (tal como fusão com peptídeo de sinal ou fusão com outros ingredientes ativos ou inativos, ingredientes ativos tais como anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno), suas formas modificadas (tal como PEGuilação, glicosilação, conjugação/fusão com albumina, conjugação e/ou fusão com Fc, hidroxietilação, etc.) e proteínas modificadas de forma conservativa.
[0067] "CD25" ou "subunidade alfa do receptor de IL-2" se refere a qualquer CD25 natural de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos tais como primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), envolve CD25 não processado de "extensão completa" e quaisquer formas processadas de CD25 derivadas de células, também envolve variantes de CD25 de ocorrência natural, tais como variantes de splice ou variantes alélicas. Em algumas modalidades, CD25 é CD25 humano e uma sequência exemplificadora é mostrada na SEQ ID Nº: 37
[0068] "Receptor de IL-2 de alta afinidade" se refere à forma heterotrimérica do receptor de IL-2, que consiste na subunidade γ do receptor (também conhecido como subunidade γ do receptor universal de citocina, γc ou CD132), subunidade β do receptor (também conhecido como CD122 ou p70) e subunidade alfa do receptor (também conhecida como CD25 ou p55). Em contraste, um "receptor de IL-2 de média afinidade" se refere a um receptor de IL-2 que contém apenas as subunidades γ e β sem subunidade alfa (veja, por exemplo, Olejniczak e Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-189 (2008)).
[0069] "Afinidade" se refere à resistência total de todas as interações não covalentes entre um sítio local de ligação de uma molécula (tal como um receptor) e seu parceiro de ligação (tal como um ligante). A menos que indicado de outra forma, "afinidade de ligação" no presente documento se refere à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, um receptor e um ligante).
[0070] A afinidade de uma molécula X por seu parceiro Y geralmente pode ser expressa pela constante de dissociação (KD), que é a proporção entre as constantes de dissociação e a taxa de associação (Kdissociação e Kligação, respectivamente). Deste modo, afinidades serão iguais, desde que a proporção das constantes de taxa permaneça a mesma; entretanto, as taxas constantes podem ser diferentes. A afinidade pode ser medida por métodos convencionais na técnica, incluindo os métodos no presente documento descritos.
[0071] "Célula T reguladora" ou "célula Treguladora" ou "Treg" se refere a um tipo de célula T CD4+ especializada que pode suprimir a resposta de outras células T. As Tregs são caracterizadas pela expressão da subunidade α do receptor de IL-2 (CD25) e o fator de transcrição forkhead box P3 (FOXP3) e por desempenhar um papel importante na indução na manutenção da auto-tolerância periférica a antígenos (incluindo aqueles expressos pelos tumores). IL-2 é necessária para obter a função, desenvolvimento e a indução das características inibitórias de Tregs.
[0072] "Célula efetora" se refere a uma população que medeia os efeitos citotóxicos de IL-2. As células efetoras incluem as células T efetoras, tais como as células T citotóxicas CD8+, células NK, células killer ativadas por linfocina (LAK) e macrófagos/monócitos.
[0073] "Módulo de ligação ao antígeno" se refere a uma molécula de polipeptídeo que se liga especificamente a um determinante antigênico. Em algumas modalidades, a molécula que se liga ao antígeno pode direcionar a porção conjugada (por exemplo, citocina (IL- 2 ou suas variantes) e/ou outro módulo de ligação ao antígeno) ao sítio alvo, tal como a um tipo específico de célula de tumor ou estroma de tumor que possui um determinante antigênico específico. O módulo de ligação ao antígeno envolve um anticorpo e seus fragmentos antigênicos. Um módulo de ligação ao antígeno envolve o domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo, que compreende uma região variável da cadeia pesada do anticorpo ou uma região variável da cadeia leve do anticorpo. O módulo de ligação ao antígeno pode compreender uma região constante do anticorpo. Como conhecido na técnica, a região constante da cadeia pesada disponível se refere a qualquer um dos seguintes cinco isotipos: α, δ, ε, γ, ou μ. A região constante da cadeia leve disponível se refere a qualquer um dos seguintes dois isotipos: κ e λ. IL-2 ou sua variante podem estar ligadas a um ou mais módulos de ligação ao antígeno através de uma ou mais sequências ligantes para formar um "imunoconjugado".
[0074] "Ligação específica" significa que a ligação é seletiva para o antígeno e pode ser distinguida entre interações indesejadas ou não específicas. A capacidade do módulo de ligação ao antígeno para se ligar a determinantes antigênicos específicos pode ser alcançada por ensaio de imunosorvente ligado a enzima (ELISA) ou outras técnicas bem conhecidas por aqueles versados na técnica, tal como medida pela tecnologia de ressonância de plasma de superfície (analisada no instrumento BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J17, 323-329 (2000)), e ensaios de ligação tradicionais (Heeley, Endocr Res28, 217-229 (2002)).
[0075] "Anticorpo" é usado no sentido mais amplo no presente documento e abrange várias estruturas de anticorpos, desde que exibam a atividade de ligação ao antígeno desejada. Os anticorpos se referem, mas não estão limitados a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos bi- específicos) e fragmentos de ligação ao antígeno. Os anticorpos podem incluir anticorpos de murino, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos de camelídeo. Como um exemplo, o anticorpo pode ser uma imunoglobulina, que é uma estrutura de cadeia tetrapeptídica composta por duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas conectadas por ligações de dissulfeto entre as cadeias. A composição de aminoácidos e a sequência da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina são diferentes, levando a antigenicidade diferente. Consequentemente, as imunoglobulinas podem ser divididas em cinco categorias ou isotipos de imunoglobulinas, a saber, IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. As cadeias pesadas correspondentes são cadeia μ, cadeia δ e cadeia γ, cadeia α e cadeia ε. O mesmo tipo de IG pode ser dividido em diferentes sublasses, de acordo com a diferença de composição de aminoácidos na região da dobradiça e de acordo com o número e posição da ligação de dissulfeto da cadeia pesada. Por exemplo, IgG pode ser dividida em IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. A cadeia leve está dividida em cadeia kappa ou cadeia lambda, de acordo com a diferença da região constante. Cada um dos cinco tipos de Ig pode ter uma cadeia kappa ou uma cadeia lambda.
[0076] "Fragmento de ligação ao antígeno" se refere a fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, Fv de cadeia única (isto é, sFv), nanocorpos (isto é, VHH) e domínios VH/VL com atividade de ligação ao antígeno. O fragmento Fv contém a região variável da cadeia pesada do anticorpo e a região variável da cadeia leve, mas não compreende a região constante; o fragmento FV é o menor fragmento de ligação ao antígeno que compreende todos os sítios de ligação ao antígeno. Geralmente, o anticorpo Fv também compreendem um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL e podem formar a estrutura necessária para a ligação ao antígeno. Diferentes ligantes também podem ser usados para conectar as regiões variáveis de dois anticorpos para formar uma cadeia polipeptídica única, que é chamada de anticorpo de cadeia simples ou Fv de cadeia simples (sFv).
[0077] "Modificações conservativas" se aplicam a sequências de aminoácidos e nucleotídeos. Para uma sequência de nucleotídeos específica, a modificação conservativa se refere àqueles ácidos nucleicos que codificam a mesma ou substancialmente as mesmas sequências de aminoácidos, ou no caso em que o nucleotídeo não codifica a sequência de aminoácidos, ela se refere substancialmente a mesma sequência de nucleotídeos. Para a sequência de aminoácidos, "modificação conservativa" se refere à substituição de aminoácidos em proteínas por outros aminoácidos com características semelhantes (tais como carga, tamanho da cadeia lateral, hidrofobicidade/hidrofilicidade, conformação da cadeia principal e rigidez, etc.); alterações frequentes podem ser realizadas sem alterar a atividade biológica da proteína.
[0078] Falando de modo geral, aqueles versados na técnica sabem que uma única substituição de aminoácido em uma região não essencial de um polipeptídeo não altera substancialmente a atividade biológica (veja, por exemplo, Watson et al. (1987) Molecμlar Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., página 224, (4ª edição)).
[0079] "PEGuilação" se refere ao acoplamento de pelo menos uma molécula de PEG a outra molécula (por exemplo, uma proteína terapêutica). Por exemplo, Adagen (uma formulação PEGuilada de adenosina deaminase) é aprovado para o tratamento de imunodeficiência combinada grave. Foi demonstrado que a ligação de polietilenoglicol pode prevenir a proteólise (veja, por exemplo, Sada et al. (1991) J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139). Na forma mais comum, PEG é um poliéter linear ou ramificado acoplado a um grupo hidroxila em uma extremidade e tem a seguinte estrutura geral: HO- (CH2CH2O)n-CH2CH2-OH. A fim de acoplar o PEG a moléculas (polipeptídeos, polissacarídeos, polinucleotídeos e moléculas orgânicas pequenas), PEG pode ser ativado pela preparação de alguns ou dois derivados de PEG com grupos funcionais nas extremidades. A abordagem comum para a conjugação de proteínas com PEG é ativar o PEG com um grupo funcional, o grupo funcional adequado para a reação com lisina e os grupos de aminoácidos N-terminais. Em particular, o grupo reativo comum envolvido na conjugação é o grupo α ou ε amino da lisina. A reação entre o ligante PEGuilado com a proteína pode levar à ligação da porção de PEG principalmente nas seguintes posições: o grupo alfa amino no terminal N da proteína, o grupo épsilon amino na cadeia lateral do resíduo de lisina, ou o Imidazolil na cadeia lateral do resíduo de lisina. Uma vez que a maioria das proteínas recombinantes têm um único grupo α amino e muitos grupos ε amino e grupos imidazol, muitos isômeros posicionais podem ser gerados de acordo com as propriedades químicas do grupo de ligação.
[0080] "Vetor", "vetor de expressão" e "construção de expressão" são sinônimos e se referem a uma molécula de DNA usada para introduzir um gene específico operativamente associado com o DNA e direcionar sua expressão em uma célula alvo, incluindo um vetor que sirva como uma estrutura de ácido nucleico que se replique autonomamente e um vetor introduzido no genoma da célula hospedeira na qual o vetor é introduzido. O vetor de expressão no presente documento compreende um cassete de expressão que permite a transcrição de grandes quantidades de mRNA estável. Uma vez que o vetor de expressão está na célula alvo, a molécula de ácido ribonucleico codificada pelo gene ou proteína é gerada através do sistema de transcrição e/ou tradução celular.
[0081] "Célula hospedeira", "linhagem de célula hospedeira" e "cultura de célula hospedeira" são usados indistintamente e se referem a células nas quais o ácido nucleico exógeno tenha sido introduzido, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras envolvem "transformantes" e "células transformadas", que envolvem células inicialmente transformadas e progênie delas derivada (independentemente do número de passagens).
[0082] A progênie pode não ser exatamente igual à célula parental quanto ao conteúdo de ácido nucleico, mas pode compreender mutações. A progênie mutada obtida pelo rastreamento ou seleção, que possua a mesma função ou atividade biológica que a função ou atividade das células transformadas originais está no presente documento incluída.
[0083] "Administração", "dosagem" e "tratamento" quando aplicados a um animal, humanos, indivíduos experimentais, células, tecidos, órgãos ou fluidos biológicos se referem contatar um agente farmacêutico, terapêutico, de diagnóstico ou composições com um animal, humano, indivíduo, célula, tecido, órgão ou fluido biológico. "Administração", "dosagem" e "tratamento" podem se referir a, por exemplo, tratamento, farmacocinética, diagnóstico, pesquisa e métodos experimentais. O tratamento de uma célula abrange o contato do reagente com a célula, assim como o contato do reagente com o fluido, onde o fluido está em contato com a célula. "Administração", "dosagem" e "tratamento" também significam os tratamentos in vitro ou ex vivo, por exemplo, de uma célula com um reagente, agente de diagnóstico, composições de ligação ou com outra célula. "Administração" e "tratamento" quando aplicados a humanos, indivíduos veterinários ou de pesquisa se referem a tratamento terapêutico, medidas preventivas ou profiláticas, e aplicações de pesquisas e diagnóstico.
[0084] Como usado no presente documento, "tratamento" significa administrar internamente ou eternamente um agente terapêutico, tal como qualquer uma das variantes de IL-2 e seus derivados ou uma composição que compreenda as variantes ou seus derivados da presente descrição, a um indivíduo que tenha sido diagnosticado ter, ser suspeito de ter, ser suscetível a um ou mais sintomas de doença para os quais o agente terapêutico tenha atividade terapêutica conhecida. Tipicamente, o agente terapêutico é administrado ao indivíduo ou na população a ser tratada para a indução da regressão ou inibição da progressão de tais sintomas em qualquer grau clinicamente mensurável.
[0085] A quantidade do agente terapêutico que é eficaz para aliviar qualquer sintoma de doença particular (também referida como "quantidade terapeuticamente eficaz") pode variar dependendo de vários fatores, tais como o estado de doença, idade e peso corporal do indivíduo, e a capacidade do fármaco em desencadear a eficiência desejada Nº:
[0086] Se o sintoma da doença é aliviado, pode ser avaliado por qualquer medida clínica tipicamente usada pelos médicos ou outros profissionais de saúde para avaliar a severidade ou estado da progressão daquele sintoma. Embora uma modalidade da presente descrição (por exemplo, um métodos de tratamento ou artigo de manufatura) possa não ser eficaz no alívio dos sintomas da doença alvo em cada paciente, ela pode aliviar os sintomas da doença alvo em um número estatisticamente significativo de indivíduos como determinado por quaisquer testes estatísticos conhecidos na técnica, tais como teste t de Student, teste do chi-quadrado e teste U de acordo com Mann e Whitney, teste de Kruskal-Wallis (teste H), teste de Jonckheere-Terpstra e teste de Wilcoxon.
[0087] Uma "quantidade eficaz" abrange uma quantidade suficiente para melhorar ou prevenir um sintoma ou sinal da condição médica. Uma quantidade eficaz também significa uma quantidade suficiente para permitir ou facilitar o diagnóstico. A quantidade eficaz para um indivíduo em particular ou indivíduo veterinário pode variar dependendo de fatores tais como a condição a ser tratada, a saúde geral do indivíduo, a via e a dose de administração e a gravidade dos efeitos colaterais. A quantidade eficaz pode ser a dose máxima ou o protocolo de dosagem que evite efeitos colaterais significativos ou efeitos tóxicos.
EXEMPLOS
[0088] Daqui por diante, a presente descrição será adicionalmente descrita com referência aos exemplos a seguir. Entretanto, o escopo da presente descrição não está limitado pelos exemplos.
Exemplo 1: Construção e expressão de IL-2 do tipo selvagem e suas variantes
1. Síntese do gene e construção de vetor de expressão recombinante
[0089] A sequência de ácido nucleico da IL-2 humana do tipo selvagem foi sintetizada, o sítio de restrição Nde I foi introduzido na extremidade 5' e o sítio de restrição BamH I foi introduzido na extremidade 3'. A sequência de ácido nucleico é mostrada em SEQ ID Nº:1 (os sítios de restrição Nde I e BamH I. são mostrados em itálico). A sequência de aminoácidos de IL-2 de tipo selvagem é mostrada na SEQ ID Nº:2. > Sequência de ácido nucleico de IL-2 do tipo selvagem
CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAAC TGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGAACGGCATCAAC AACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCTTCAAATTCTAC ATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCTGGAAGA AGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATCTGGCACAGAGCAAA AACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATATTAACGTTATT GTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGTGTGAATATGC
CGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATCGTTGGATTACCTT TTGTCAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAATGAGGATCC (SEQ ID Nº:1). > Sequência de aminoácidos de IL-2 do tipo selvagem
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMP
KKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLEL KGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT (SEQ ID Nº:2).
[0090] Depois de ser sintetizada, a sequência de ácido nucleico de IL-2 foi ligada do vetor de expressão em E.coli pET-9a (Novagen, Cat.69431-3) através de dois sítios de restrição Nde I e BamH I para obter vetor de expressão de IL-2 de tipo selvagem.
2. Introdução das mutações de aminoácidos descritas na presente descrição em uma sequência de aminoácidos de IL-2 de tipo selvagem.
[0091] Em uma variante, a asparagina na posição 26 é substituída por glutamina, e o códon AAC nas posições 76-78 da sequência de nucleotídeos correspondente foi mutado para CAG para obter a variante IL-2-01, em que a porção em itálico é o sítio de restrição e a porção sublinhada é o sítio de mutação, as sequências a seguir são indicadas de modo similar. > A sequência de ácido nucleico de IL-2-01
CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAA CTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGCAGGGCATC AACAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCTTCAAAT TCTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTC TGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATCTGGCAC AGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATAT TAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATG TGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATC
GTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAATG AGGATCC (SEQ ID Nº:3). > A sequência de aminoácidos de IL-2-01
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILQGINNYKNPKLTRMLTFKFYMP
KKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLEL KGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:4).
[0092] Em uma variante, a asparagina na posição 30 é substituída por serina, e o códon AAC nas posições 88-90 da sequência de nucleotídeos correspondente foi mutado para AGC para obter a variante IL-2-02. > A sequência de ácido nucleico de IL-2-02:
CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAA CTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGAACGGCATCA ACAGCTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCTTCAAATT CTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCT GGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATCTGGCACA GAGCAAAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATATT AACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGT GTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATC
GTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAATG AGGATCC (SEQ ID Nº:5). > A sequência de aminoácidos de IL-2-02
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINSYKNPKLTRMLTFKFYMP
KKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLEL KGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº: 6).
[0093] Em uma variante, a glutamina na posição 11 foi substituída por cisteína; o códon CAG nas posições 31-33 da sequência de nucleotídeos correspondente foi mutado para TGT; a leucina na posição 132 foi substituída por cisteína; o códon CTG nas posições 394-396 da sequência de nucleotídeos correspondente foi mutado para TGT para obter a variante IL-2-03. > A sequência de ácido nucleico de IL-2-03:
CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCTGTCTGCAACT GGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGAACGGCATCAACA ACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCTTCAAATTCTACA TGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCTGGAAGAA GAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATCTGGCACAGAGCAAAA ACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATATTAACGTTATTG TGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGTGTGAATATGCC
GATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATCGTTGGATTACCTTT GCACAGAGCATTATTAGCACCTGTACCTAATGAGGATCC (SEQ ID Nº:7). > A sequência de aminoácidos de IL-2-03
MAPTSSSTKKTCLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMP
KKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLEL KGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTCT (SEQ ID Nº:8).
[0094] Em uma variante, a leucina na posição 70 foi substituída por cisteína; o códon CTG nas posições 208-210 da sequência de nucleotídeos correspondente foi mutado para TGT; a prolina na posição 82 foi substituída por cisteína; o códon CCG nas posições 244-246 da sequência de nucleotídeos correspondente foi mutado para TGT para obter a variante IL-2-04. > A sequência de ácido nucleico de IL-2-04:
CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAA CTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGAACGGCATCA ACAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCTTCAAATT CTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCT GGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTTGTAATCTGGCACA GAGCAAAAACTTTCATCTGCGTTGTCGTGATCTGATTAGCAATATT AACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGT GTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATC
GTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAATG AGGATCC (SEQ ID Nº:9). > A sequência de aminoácidos de IL-2-04:
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMP
KKATELKHLQCLEEELKPLEEVCNLAQSKNFHLRCRDLISNINVIVLEL KGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:10).
[0095] Em uma variante, the glicina na posição 27 foi substituída por cisteína; o códon GGC nas posições 79-81 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para TGT; a fenilalanina posição 78 foi substituída por cisteína; o códon TTT nas posições 232- 234 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para TGT, para obter a variante IL-2-05. > A sequência de ácido nucleico de IL-2-05:
CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAA CTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGAACTGTATCA ACAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCTTCAAATT CTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCT GGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATCTGGCACA GAGCAAAAACTGTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATATT AACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGT GTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATC
GTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAATG AGGATCC (SEQ ID Nº:11). > A sequência de aminoácidos de IL-2-05:
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNCINNYKNPKLTRMLTFKFYMP
KKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNCHLRPRDLISNINVIVLEL KGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:12).
[0096] Em uma variante, o peptídeo nas posições 29-44 foi substituído por QSMHIDATL; o códonAACAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCTTC AAATTC nas posições 85-132 da sequência de nucleotídeos correspondente foi mutado para CAGAGCATGCATATTGATGCAACCCTG para obter a variante IL-2-06. > A sequência de ácido nucleico de IL-2-06:
CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAA CTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGAACGGCATC CAGAGCATGCATATTGATGCAACCCTGTACATGCCGAAAAAAGCA ACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCTGGAAGAAGAACTGAAACCG CTGGAAGAGGTTCTGAATCTGGCACAGAGCAAAAACTTTCATCTG CGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATATTAACGTTATTGTGCTGGAAC TGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGTGTGAATATGCCGATGAAA
CCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATCGTTGGATTACCTTTGCACA GAGCATTATTAGCACCCTGACCTAATGAGGATCC (SEQ ID Nº:13). > A sequência de aminoácidos de IL-2-06:
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGIQSMHIDATLYMPKKATELK
HLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTF MCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:14).
[0097] Em uma variante, a fenilalanina posição 42 foi substituída por alanina; o códonTTC nas posições 124-126 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para GCA; a tirosina na posição 45 foi substituída poralanine; o códonTAC nas posições 133-135 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para GCA, para obter a variante IL-2-07. > A sequência de ácido nucleico de IL-2-07:
CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAA CTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGAACGGCATCA ACAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCGCAAAAT TCGCAATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTC TGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATCTGGCAC AGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATAT TAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATG TGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATC
GTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAATG AGGATCC (SEQ ID Nº:15). > A sequência de aminoácidos de IL-2-07:
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMP
KKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLEL KGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:16).
[0098] Em uma variante, a fenilalanina na posição 42 foi substituída por alanina; o códon TTC nas posições 124-126 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para GCA; a leucina na posição 72 foi substituída por glicina; o códon CTG nas posições 214-216 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para GGC para obter a variante IL-2-08. > A sequência de ácido nucleico de IL-2-08:
CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAA CTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGAACGGCATCA ACAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCGCAAAAT TCTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTC TGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATGGCGCA CAGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATA TTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTAT GTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAAT
CGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAAT GAGGATCC (SEQ ID Nº:17). > A sequência de aminoácidos de IL-2-08:
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFYMP
KKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLEL KGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:18).
[0099] Em uma variante, a tirosina na posição 45 foi substituída por alanina; o códon TAC nas posições 133-135 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para GCA; a leucina na posição 72 foi substituída por glicina; o códon CTG nas posições 214-216 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para GGC para obter a variante IL-2-09. > A sequência de ácido nucleico de IL-2-09:
CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAAC TGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGAACGGCATCAAC AACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCTTCAAATTCGC AATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCTGGAA GAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATGGCGCACAGAGCA AAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATATTAACGTTA TTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGTGTGAATAT
GCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATCGTTGGATTAC CTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAATGAGGATCC (SEQ ID Nº:19).
> A sequência de aminoácidos de IL-2-09:
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFAMP
KKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLEL KGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:20).
[00100] Em uma variante, a asparagina na posição 26 foi substituída por glutamina; o códon AAC nas posições 76-78 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para CAG; a asparagina na posição 30 foi substituída por serina; o códon AAC nas posições 88-90 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para AGC; a fenilalanina posição 42 foi substituída por alanina; o códon TTC nas posições 124-126 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para GCA; a leucina na posição 72 foi substituída por glicina; o códon CTG nas posições 214-216 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para GGC para obter a variante IL-2-10. > A sequência de ácido nucleico de IL-2-10:
CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAA CTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGCAGGGCATC AACAGCTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCGCAAAA TTCTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGT CTGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATGGCGC ACAGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAAT ATTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTA TGTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAA
TCGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAA TGAGGATCC (SEQ ID Nº:21). > A sequência de aminoácidos de IL-2-10:
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILQGINSYKNPKLTRMLTAKFYMP
KKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLEL KGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:22).
[00101] Em uma variante, a glutamina na posição 11 foi substituída por cisteína, e o códon CAG nas posições 31-33 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para TGT; a asparagina na posição 26 foi substituída por glutamina, o códon AAC nas posições 76- 78 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para CAG; a asparagina na posição 30 foi substituída por serina, e o códon AAC nas posições 88-90 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para AGC; a fenilalanina posição 42 foi substituída por alanina, e o códon TTC nas posições 124-126 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para GCA; a leucina na posição 72 foi substituída por glicina; o códon CTG nas posições 214-216 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para GGC; a leucina na posição 132 foi substituída por cisteína, e o códon CTG nas posições 394-396 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para TGT para obter a variante IL-2-11. > A sequência de ácido nucleico de IL-2-11:
CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCTGTCTGCAA CTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGCAGGGCATC AACAGCTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCGCAAAA TTCTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGT CTGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATGGCGC ACAGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAAT ATTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTA TGTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAA
TCGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCTGTACCTAA TGAGGATCC (SEQ ID Nº:23). > A sequência de aminoácidos de IL-2-11:
MAPTSSSTKKTCLQLEHLLLDLQMILQGINSYKNPKLTRMLTAKFYMP
KKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLEL KGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTCT (SEQ ID Nº:24).
[00102] Em uma variante, a asparagina na posição 26 foi substituída por glutamina, e o códon AAC nas posições 76-78 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para CAG; a asparagina na posição 30 foi substituída por serina, o códon AAC nas posições 88-90 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para AGC; a fenilalanina posição 42 foi substituída por alanina, e o códon TTC nas posições 124-126 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para GCA; a leucina na posição 70 foi substituída por cisteína, e o códon CTG nas posições 208-210 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para TGT; a leucina na posição 72 foi substituída por glicina; o códon CTG nas posições 214-216 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para GGC; a prolina na posição 82 foi substituída por cisteína, o códon CCG nas posições 244-246 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para TGT para obter a variante IL-2-12. > A sequência de ácido nucleico de IL-2-12:
CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAA CTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGCAGGGCATC AACAGCTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCGCAAAA TTCTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGT CTGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTTGTAATGGCGCA CAGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTTGTCGTGATCTGATTAGCAATA TTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTAT GTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAAT
CGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAAT GAGGATCC (SEQ ID Nº:25). > A sequência de aminoácidos de IL-2-12:
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILQGINSYKNPKLTRMLTAKFYMP
KKATELKHLQCLEEELKPLEEVCNGAQSKNFHLRCRDLISNINVIVLEL KGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:26).
[00103] Em uma variante, a asparagina na posição 26 foi substituída por glutamina, e o códon AAC nas posições 76-78 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para CAG; the glicina na posição 27 foi substituída por cisteína, o códon GGC nas posições 79- 81 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para TGT; a asparagina na posição 30 foi substituída por serina e o códon AAC nas posições 88-90 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para AGC; a fenilalanina posição 42 foi substituída por alanina, e o códon TTC nas posições 124-126 do nucleosídeo correspondente foi mutado para GCA; a leucina na posição 72 foi substituída por glicina, e o códon CTG nas posições 214-216 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para GGC; a fenilalanina posição 78 foi substituída por cisteína, e o códon TTT nas posições 232-234 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para TGT para obter a variante IL-2-13. > A sequência de ácido nucleico de IL-2-13:
CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAA CTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGCAGTGTATCA ACAGCTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCGCAAAAT TCTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTC TGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATGGCGCA CAGAGCAAAAACTGTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAAT ATTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTA TGTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAA
TCGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAA TGAGGATCC (SEQ ID Nº:27). > A sequência de aminoácidos de IL-2-13:
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILQCINSYKNPKLTRMLTAKFYMP
KKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNCHLRPRDLISNINVIVLEL KGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:28).
[00104] Em uma variante, a asparagina na posição 29 foi substituída por serina, e o códon AAC nas posições 85-87 da sequência de nucleotídeos correspondente foi substituído por AGC; a fenilalanina posição 42 foi substituída por alanina, o códon TTC nas posições 124- 126 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para GCA; a leucina na posição 72 foi substituída por glicina e o códon CTG nas posições 214-216 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para GGC para obter a variante IL-2-14. > A sequência de ácido nucleico de IL-2-14:
CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAA CTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGAACGGCATC AGCAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCGCAAAA TTCTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGT CTGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATGGCGC ACAGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAAT ATTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTA TGTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAA
TCGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAA TGAGGATCC (SEQ ID Nº:29). > A sequência de aminoácidos de IL-2-14:
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNYKNPKLTRMLTAKFYMP
KKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLEL KGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:30).
[00105] Em uma variante, a asparagina na posição 26 foi substituída por glutamina e o códon AAC nas posições 76-78 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para CAG; a asparagina na posição 29 foi substituída por serina, o códon AAC nas posições 85-87 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para AGC; a fenilalanina posição 42 foi substituída por alanina, e o códon TTC nas posições 124-126 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para GCA; a leucina na posição 72 foi substituída por glicina, e o códon CTG nas posições 214-216 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para GGC para obter a variante IL-2-21. > A sequência de ácido nucleico de IL-2-21:
CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAA CTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGCAGGGCATC AGCAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCGCAAAA TTCTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGT CTGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATGGCGC ACAGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAAT ATTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTA TGTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAA
TCGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAA TGAGGATCC (SEQ ID Nº:31). > A sequência de aminoácidos de IL-2-21:
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILQGISNYKNPKLTRMLTAKFYMP
KKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLEL KGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:32).
[00106] Em uma variante, a asparagina na posição 26 foi substituída por glutamina, e o códon AAC nas posições 76-78 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para CAG; a asparagina na posição 29 foi substituída por serina, o códon AAC nas posições 85-87 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para AGC; a fenilalanina posição 42 foi substituída por alanina, e o códon TTC nas posições 124-126 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para GCA; a asparagina na posição 71 foi substituída por glutamina, e o códon AAT nas posições 211-213 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para CAG. A leucina na posição 72 foi substituída por glicina, e o códon CTG nas posições 214- 216 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para GGC para obter a variante IL-2-22.
> A sequência de ácido nucleico de IL-2-22:
CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAA CTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGCAGGGCATC AGCAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCGCAAAA TTCTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGT CTGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGCAGGGCGC ACAGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAAT ATTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTA TGTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAA
TCGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAA TGAGGATCC (SEQ ID Nº:33). > A sequência de aminoácidos de IL-2-22:
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILQGISNYKNPKLTRMLTAKFYMP
KKATELKHLQCLEEELKPLEEVLQGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLEL KGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:34).
[00107] Em uma variante, a glutamina na posição 11 foi substituída por cisteína e o códon CAG nas posições 31-33 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para TGT; o peptídeo nas posições 29-44 foi substituída por QSMHIDATL, o códonAACAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCTTC AAATTC nas posições 85-132 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para CAGAGCATGCATATTGATGCAACCCTG; a leucina na posição 132 foi substituída por cisteína e o códon CTG nas posições 394-396 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para TGT para obter a variante IL-2-23.
[00108] > A sequência de ácido nucleico de IL-2-23:
[00109] CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCTG
TCTGCAACTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGAAC GGCATCCAGAGCATGCATATTGATGCAACCCTGTACATGCCGAA AAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCTGGAAGAAGAACT GAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATCTGGCACAGAGCAAAAACTT TCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATATTAACGTTATTGTG CTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGTGTGAATATGCC
GATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATCGTTGGATTACCT TTGCACAGAGCATTATTAGCACCTGTACCTAATGAGGATCC (SEQ ID Nº:35). > A sequência de aminoácidos de IL-2-23:
MAPTSSSTKKTCLQLEHLLLDLQMILNGIQSMHIDATLYMPKKATELK
HLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTF MCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTCT (SEQ ID Nº:36).
[00110] Em uma variante, a asparagina na posição 26 foi substituída por glutamina, e o códon AAC nas posições 76-78 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para CAG; a asparagina na posição 29 foi substituída por serina, o códon AAC nas posições 85-87 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para AGC; a asparagina na posição 88 foi substituída por arginina e o códon AAT nas posições 262-264 da sequência de aminoácidos correspondente foi mutado para CGT, para obter a variante IL-2-24. > A sequência de ácido nucleico de IL-2-24:
CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAA CTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGCAGGGCATC AGCAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCTTCAAAT TCTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTC TGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATCTGGCAC AGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCCGTA TTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTAT GTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAAT
CGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAAT GAGGATCC (SEQ ID Nº:40).
> A sequência de aminoácidos de IL-2-24:
MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILQGISNYKNPKLTRMLTFKFYMP
KKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLEL KGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID Nº:41).
[00111] Após a síntese, sequência do gene de cada uma das variantes acima foi ligada a pET-9a através dos dois sítios de restrição, Nde I e BamH I de para obter vetores de expressão recombinantes de cada variante de IL-2.
3. Expressão recombinante e preparação de IL-2 de tipo selvagem e suas variantes
[00112] O vetor de expressão recombinante foi transformado na cepa BL21 (DE3) (Novagen, Cat.69450-3) para obter a bactéria recombinante para IL-2 de tipo selvagem e sua variante e as bactérias recombinantes foram plaqueadas em placas LB que compreende resistência Kan para o rastreamento.
[00113] Uma única colônia foi selecionada através do rastreamento com Kan em 10mL de meio LB, cultivada a 37°C e 220rpm até atingir a OD600 de 1,2 ± 0,2, glicerol 50% foi adicionado até uma concentração final de 10% e embalada em tubos de criopreservação (1mL/tubo) e armazenado a -80°C.
[00114] Foi usado um tubo de glicerol congelado, recuperado em banho-maria a 37°C, inoculado em 1L de meio LB, cultivado a 37°C e 220 rpm até que a OD600 atingiu 0,6 ～ 1,0, IPTG foi adicionado para obter a concentração final de 1mM, induzida e cultivada a 37°C, 220 rpm por 4h. Depois que a indução finalizou, a bactéria foi coletada.
[00115] As células bacterianas foram rompidas, os corpos de inclusão foram desnaturados, renaturados e purificados, a proteína alvo (IL-2 do tipo selvagem e suas variantes) foram obtidas pelo teste. Exemplo 2: Preparação de IL-2 PEGuilada e sua variante
[00116] Foi usada uma proteína IL-2 em um sistema de tampão com tampão de ácido acético-acetato de sódio 10mM, pH 5,0, com uma concentração de proteína de 2 mg/ml; mPEG-butiraldeído 20kDa em água, foi adicionado em uma solução de proteína de IL-2, a quantidade da substância de mPEG-butiraldeído era uma-duas vezes maior do que aquela de proteína; uma solução aquosa de cianoboro-hidreto de sódio foi adicionada ao sistema de reação e a quantidade de cianoboro- hidreto de sódio era 50-100 vezes maior do que aquela de proteína; a reação foi realizada a 25°C por cerca de 15 a 20 horas com agitação, uma solução aquosa de glicina foi adicionada para finalizar a reação. A concentração final de glicina era de 30 mM. Depois da reação, a solução de modificação com PEG foi purificada por cromatografia líquida de alto desempenho em fase reversa para separar impurezas (tais como proteína modificada dupla/múltipla e proteína nua) a partir de IL-2 modificado por mono-PEG. O componente alvo foi coletado, o tampão foi trocado e a análise da atividade e a capacidade de ligação foi realizada.
[00117] Através do teste, a IL-2 PEGuilada e sua variante foram obtidas. Exemplo 3: Estudo da estabilidade de IL-2 e sua variante
1. Estabilidade química de IL-2 de tipo selvagem e sua variante
[00118] Uma amostra de IL-2 do tipo selvagem (sistema tampão foi Tris-HCl 10mM, manitol 50mg ml, SDS 0,18mg/ml, pH 8,5), foi incubada a 40ºC por 30 dias para o estudo de estabilidade, a amostra foi usada para a análise da degradação pelo mapeamento de peptídeo baseado em MS líquida.
[00119] Método de detecção: foram usados 0,5mL de amostra e foram adicionados 0,5mL de solução desnaturante (8 mol/L de cloridrato de guanidina, 0,2 mol/L de Tris-HCl, pH 9,0), 8μl de DTT 1mol/L (ditiotreitol), bem misturados e incubados em banho de água a 25°C por 1 hora. Em seguida, 35 μl de IAC 0,5 mol/L foram adicionados e incubados em banho de água a 25°C por uma hora. A amostra foi dissolvida em tampão de digestão (2moL/L de ureia, 50 mmol/L de Tris- HCl, pH 8,3) pela troca do tampão através de uma coluna PD-10. Após a troca do tampão, 12,5 μg de tripsina foram adicionados em 0,5 mL da amostra e incubados em banho de água a 25°C por 18 horas, ácido clorídrico foi adicionado para interromper a reação e a análise de mapeamento de peptídeo baseado em MS líquida foi realizada.
[00120] Os resultados do teste mapeamento de peptídeo baseado em MS líquida são mostrados na Tabela 2. Após serem mantidos por 30 dias, no que diz respeito ao fragmento de restrição 9-32 que compreende N26 e N29 (isto é, um fragmento de peptídeo de aminoácidos nas posições 9-32), três fragmentos com aumento significativo na desaminação (isto é, 9-32A, 9-32B, 9-32C) foram detectados. No processo de estudo das variantes, a estabilidade de duas variantes de IL-2-08 (F42A/L72G) e IL-2-22 (N26Q/N29S/F42A/N71Q/L72G) foi investigada e as amostras foram retiradas para detectar degradação. O método é igual àquele da IL-2 do tipo selvagem. Os resultados são mostrados na Tabela 2.
[00121] Os resultados experimentais mostram que os três fragmentos com aumento significativo na desaminação podem ser detectados no fragmento de peptídeo 9-32 de ambas IL-2-08 e IL-2 do tipo selvagem, com aumento similar na desaminação, indicando que a mutação F42A/L72G não tem efeito na 9-desaminação do fragmento de peptídeo 9-32. Por outro lado, as mutações de N26 e N29 em IL-2-22 e IL-2-24 reduziram a desaminação dos fragmentos nas duas posições. Após 30 dias, foi detectado que o aumento dos fragmentos desaminados foi de <0,5% (não mostrado na tabela), indicando que N26Q e N29S podem aumentar a estabilidade de IL-2
Tabela 2. Resultados da estabilidade das variantes de IL-2 (posições N26 e N29) Fragmentos Aumento da Possível sítio de Nome de restrição desaminação desaminação IL-2 no dia 30 IL-2 9-32 A Q11/Q13/Q22/N26/N29/N30 7,4% 9-32 B Q11/Q13/Q22/N26/N29/N30 1,7% 9-32 C Q11/Q13/Q22/N26/N29/N30 4,4% IL-2-08 (F42A/L72G) 9-32 A Q11/Q13/Q22/N26/N29/N30 6,2% 9-32 B Q11/Q13/Q22/N26/N29/N30 1,2% 9-32 C Q11/Q13/Q22/N26/N29/N30 5,2% IL-2-22 9-32 Q11/Q13/Q22/Q26/N30 / (N26Q/N29S/F42A/N71Q/L72G) IL-2-24 (N26Q/N29S/N88R) 9-32 Q11/Q13/Q22/Q26/N30 /
[00122] Adicionalmente, em IL-2-08 (F42A/L72G), quatro fragmentos com aumento significativo na desaminação (isto é, 55-76A, 55-76B, 55- 76C, 55-76D, 55-76A, 55-76B, 55-76C, 55-76D) foram encontrados na sequência de restrição 55-76. O efeito da mutação de N71 em Q foi investigado, a saber IL-2-22 (N26Q/N29S/F42A/N71Q/L72G) e os resultados de estabilidade são mostrados na Tabela 3. A mutação na posição N71 reduz o número de fragmentos desaminados na sequência de restrição 55-76, reduz o aumento na desaminação, melhora significativamente a desaminação e estabiliza a proteína; dessa maneira, o desenho atende às expectativas.
Tabela 3. Resultados da estabilidade das variantes de IL-2 (posição N71) Fragmentos Possível sítio Aumento da Nome de restrição de desaminação IL-2 desaminação no dia 30 IL-2-08 (F42A/L72G) 55-76 A N71/Q57/Q74 14,2% 55-76 B N71/Q57/Q74 9,8% 55-76 C N71/Q57/Q74 1,2% 55-76 D N71/Q57/Q74 10,2% IL-2-22 55-76 Q71/Q57/Q74 3,1% (N26Q/N29S/F42A/N71Q/L72G)
2. Estabilidade térmica de IL-2 do tipo selvagem e sua variante
[00123] A estabilidade da amostra de 1 mg/mL de IL-2 (sistema tampão era ácido acético 10 mM em tampão de acetato de sódio, pH 4,5, trealose a 10%) foi estudada com o instrumento Uncle (Unchained labs). A temperatura da amostra foi aumentada de 25°C para 95°C em uma taxa de 0,3°C/min. Ao mesmo tempo, o triptofano na amostra foi excitado a 266 nm, e a emissão da amostra em 300-400 nm foi observada. A temperatura de fusão (Tm) foi calculada de acordo com a seguinte fórmula, onde λ é o comprimento de onda (300-400nm), I(λ) é a intensidade de emissão neste comprimento de onda e BCM é a média baricêntrica, que é o comprimento de onda ponderado pela intensidade da luz.
[00124] À medida que a temperatura aumenta, os parâmetros de
BCM da amostra mudam, refletindo a mudança na conformação da proteína. Existem duas temperaturas de fusão para IL-2 do tipo selvagem, indicando que IL-2 experimenta dois estágios antes de ser completamente desdobrada. A energia necessária para o primeiro estágio de desdobramento é menor do que aquele segundo estágio. Embora as mutações N26Q e N30S basicamente não tenham afetado a primeira temperatura de fusão, elas aumentaram significativamente a segunda temperatura de fusão; apesar de IL-2-03, IL-2-04 e IL-2-05 não terem tido a primeira temperatura de fusão. A temperatura de fusão, a segunda temperatura de fusão, a segunda temperatura de fusão também foi significativamente mais alta do que aquela do tipo selvagem.
[00125] Os resultados do teste de estabilidade térmica da variante de IL-2 são mostrados nas Figuras 1A-1F e na Tabela 4. Os resultados experimentais mostram que as mutações N26Q, N30S, Q11C/L132C, L70C/P82C, G27C/F78C melhoram a estabilidade térmica da IL-2. Tabela 4. Temperatura de fusão de IL-2 do tipo selvagem e sua variante Nome Tm1 (°C) Tm2 (°C) IL-2 61,5 77,5 IL-2-01 60,8 90,5 IL-2-02 61,8 89,1 IL-2-03 Ausente 92,1 IL-2-04 Ausente 91,8 IL-2-05 Ausente 92,5 Exemplo 4: Determinação da afinidade de ligação da variante de IL- 2 pelo receptor alfa da interleucina 2 (IL-2Rα)
[00126] ELISA foi usado para detectar as propriedades de ligação de IL-2 e suas variantes a IL-2Rα. A proteína recombinante IL-2Rα com his-
tag foi revestida e IL-2 foi adicionada e então a atividade de ligação do anticorpo ao antígeno foi detectada pela adição do anticorpo policlonal anti-IL-2 conjugado com HRP e o substrato TMB de HRP.
[00127] Uma placa de microtitulação de 96 poços foi revestida com 2μg/mL de proteína recombinante IL-2Rα marcada com his (SinoBiological, Cat # 10165-H08H) e incubada durante a noite a 4°C. A placa foi lavada com solução de lavagem por três vezes, 250 μl por poço. Para cada período de lavagem, a placa era agitada por 10 segundos de cada garantir uma lavagem suficiente. 100μl de IL-2 e sua variante diluídos com solução de diluição foram adicionados a cada poço. A placa foi incubada por uma hora em temperatura ambiente. A placa foi lavada com solução de lavagem por três vezes, 250 μl por poço. 100 μl de anticorpo policlonal anti-IL-2 (SinoBiological, Cat # 11848-T16) marcado com HRP diluído para 0,1 μg/mL com solução de diluição foram adicionados a cada poço. A placa foi incubada por uma hora em temperatura ambiente. A placa foi lavada com solução de lavagem por três vezes, 250 μl por poço. 100μl de TMB foram adicionados a cada poço e a reação foi realizada por 15 minutos no escuro. 50 μl de ácido sulfúrico 0,16 M foram adicionados a cada poço. O leitor de microplaca Thermo MultiSkanFc foi usado para ler o valor OD a 450 nm e o valor de EC50 da ligação de IL-2 e suas variantes a IL-2Rα foi calculado.
[00128] Os dados de ligação ELISA das variantes no Exemplo 4 a IL- 2Rα são mostrados na Figura 2 e Tabela 5. Os resultados mostram que o primeiro tipo de mutação (ou seja, as mutações N26Q, N30S, Q11C/ L132C, L70C/P82C, G27C/F78C e N29S) não afetaram a ligação de IL- 2 a IL-2Rα. O segundo tipo de mutação (ou seja, as mutações F42A/ Y45A, F42A/L72G, Y45A/L72G, mutação em QSMHIDATL nas posições 29-44), reduziram muito a ligação de IL-2 a IL-2Rα; a ligação de IL-2 a IL-2Rα mal pode ser observada sob condições experimentais.
A ligação de IL-2 a IL-2Rα também está reduzida a presença do segundo tipo de mutação, quando os dois tipos de mutação são combinados. > IL-2Rα (His Tag)
ELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCT GNSSHSSWDQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQ PVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRAL
HRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPE GRPESETSCHHHHHH (SEQ ID Nº:37). Tabela 5. Detecção de EC50 para a ligação da variante de IL-2 ao receptor de baixa afinidade IL-R2α por ELISA Nome Posição e tipo de mutação (Aminoácido SEQ ID Nº:) EC50 (nM) IL-2 tipo selvagem (SEQ ID Nº:2) 0,50 IL-2-01 N26Q (SEQ ID Nº:4) 0,50 IL-2-02 N30S (SEQ ID Nº:6) 0,41 IL-2-03 Q11C/L132C (SEQ ID Nº:8) 1,53 IL-2-04 L70C/P82C (SEQ ID Nº:10) 0,87 IL-2-05 G27C/F78C (SEQ ID Nº:12) 0,60 IL-2-06 mutação em QSMHIDATL nas posições 29-44 (SEQ ID Nº:14) N.A.
IL-2-07 F42A/Y45A (SEQ ID Nº:16) N.A.
IL-2-08 F42A/L72G (SEQ ID Nº:18) N.A.
IL-2-09 Y45A/L72G (SEQ ID Nº:20) N.A.
IL-2-13 N26Q/N30S/G27C/F78C/F42A/L72G (SEQ ID Nº:28) N.A.
(Nota: N.A., não detectável, devido à baixa capacidade de ligação dessas variantes a IL-2Rα, EC50 não pode ser obtida pelo ajuste dos dados dentro da faixa de concentração usada no experimento.)
[00129] Octet RED96e (Fortebio) foi usado para detectar a afinidade de IL-2, PEG-IL-2-10, PEG-IL-2-22, PEG-IL-2-23 a IL-2Rα.
[00130] O biossensor HIS1K (Fortebio, 18-5120) foi imerso em 200 μL de tampão (PBS, pH 7,4, tween-20 0,02%, BSA 0,1%) por 10 minutos para o tratamento de umedecimento.
Em seguida, IL-2Rα humana com His tag (SinoBiological, Cat # 10165-H08H) foi dissolvida em PBS, pH 7,4, 0,02% tween-20, 0,1% BSA, e o sensor foi colocado em 200 μL de tal solução.
O sensor foi colocado em 200μL de tampão)PBS, pH 7,4, tween-20 0,02%, BSA 0,1%) para remover o excesso de IL-2Rα.
Em seguida, PEG-IL-2-10, PEG-IL-2-22 e PEG-IL-2-23 foram diluídos para 133,3 nM com tampão (P PBS, pH 7,4, tween-20 0,02%, BSA 0,1%), respectivamente.
O sensor foi colocado em soluções de IL-2 com diferentes concentrações e mantido por 300 segundos para ligação.
Em seguida, o sensor foi colocado em 200 μL de 1X PBS, pH 7,4, 0,02% tween-20, 0,1% BSA por 600 segundos para a dissociação de IL-2. Os resultados experimentais na Tabela 6 mostram que PEG-IL-2-10, PEG- IL-2-22 e PEG-IL-2-23 não se ligam a IL-2Rα.
Tabela 6. Afinidade de ligação da variante de IL-2 ao receptor de IL-R2α de baixa afinidade (Octet)
Posição e tipo de mutação (aminoácidos SEQ ID afinidade Nome Nº:) (nM)
IL-2 tipo selvagem (SEQ ID Nº:2) 7,83
IL-2-24 N26Q/N29S/N88R (SEQ ID Nº:38) 11,8
N.A.
PEG-IL-2-10 N26Q/N30S/F42A/L72G (SEQ ID Nº:22)
N.A.
PEG-IL-2-22 N26Q/N29S/F42A/N71G/L72G (SEQ ID Nº:34)
Q11C/NNYKNPKLTRMLTFKF nas posições 29-44 N.A.
PEG-IL-2-23 mutado para QSMHIDATL/L132C (SEQ ID Nº:36)
(Nota: N.A., não detectável, essas variantes possuem uma baixa capacidade de ligação a IL-2Rα, a afinidade pode ser obtida pelo ajuste dos dados dentro da faixa de concentração usada no experimento.)
Exemplo 5: Determinação da afinidade de ligação de Il-2 e sua variante ao receptor beta/gama de IL-2 (IL-2Rβ/y)
[00131] O experimento Biacore foi usado para detectar a capacidade de ligação de IL-2 e sua variante a IL-2Rβ/γ no Exemplo 1.
[00132] Em primeiro lugar, as subunidades IL-2Rβ e IL-2Rγ foram clonadas e fundidas ao Fc hole e Fc knob (SEQ ID NO 38 e 39), respectivamente, para preparar a ferramenta molecular do heterodímero de IL-2Rβ/γ-Fc. IL-2Rβ-Fc hole e IL-2Rγ-Fc knob foram cotransfectados em células HEK293.O heterodímero foi purificado com Proteína A e depois com a peneira molecular Superdex 200. Após o teste, a proteína IL-2Rβ/γ foi obtida. >IL-2Rβ (Fc hole)
MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARCAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQ DGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDS QKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHV ETHRCNISWEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQ EWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALG KDTGAQDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPS RDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS
DGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K (SEQ ID Nº: 38). >IL-2Rγ (Fc knob)
MLKPSLPFTSLLFLQLPLLGVGLNTTILTPNGNEDTTADFFLTTMPTDS LSVSTLPLPEVQCFVFNVEYMNCTWNSSSEPQPTNLTLHYWYKNSD NDKVQKCSHYLFSEEITSGCQLQKKEIHLYQTFVVQLQDPREPRRQA TQMLKLQNLVIPWAPENLTLHKLSESQLELNWNNRFLNHCLEHLVQY RTDWDHSWTEQSVDYRHKFSLPSVDGQKRYTFRVRSRFNPLCGSA QHWSEWSHPIHWGSNTSKENPFLFALEAGAQDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS
DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID Nº: 39).
[00133] O chip sensor de Proteína A (GE, Cat # 29127556) do instrumento Biacore (Biacore T200, GE) foi usado para capturar IL- 2Rβ/γ-Fc, em que IL-2Rβ/γ-Fc é diluído com 1 × HBS-EP para 1μg/mL, em uma taxa de fluxo de 10μL/min por 30 segundos. Em seguida, uma série de gradientes de concentração de IL-2 e sua variante fluíram através da superfície do chip em uma taxa de fluxo de 30μL/min, a ligação foi mantida por 120 segundos e a dissociação foi mantida por 360 segundos. O instrumento Biacore (Biacore X100, GE) foi usado para detectar a reação em tempo real, para obter as curvas de associação e dissociação. Após cada ciclo de dissociação estar completo, o chip foi lavado e regenerado com Gly-HCl 10 mM pH 1,5. Os dados obtidos no experimento foram ajustados a um modelo de ligação 1:1, e os valores que representam a capacidade de ligação de IL-2 e suas variantes com o receptor de afinidade média IL-2Rβ/γ foram obtidos, como mostrado na Tabela 7.
[00134] Os resultados mostraram que todas as mutações N26Q, N30S, Q11C/L132C, L70C/P82C, G27C/F78C, F42A/Y45A, F42A/L72G, Y45A/L72G, N26Q/ N30S/F42A/ L72G, mutação em QSMHIDATL nas posições 29-44 e suas combinações, têm pouco efeito na ligação de IL-2 e IL-2Rβ/γ.
Tabela 7. Afinidade de IL-2 e sua variante pelo receptor de média afinidade IL-2Rβ/γ Nome Kon (M-1s-1) Koff (s-1) Kd (nM) 5 -4 IL-2 (WT) 9,36×10 2,40×10 0,257 5 -4 IL-2-01 9,02×10 2,20×10 0,244 6 -4 IL-2-02 1,03×10 2,12×10 0,206 5 -4 IL-2-03 5,33×10 1,35×10 0,253 5 -4 IL-2-04 4,98×10 1,50×10 0,302 5 -5 IL-2-05 3,36×10 9,68×10 0,288 5 -4 IL-2-06 8,56×10 4,36×10 0,509 5 -4 IL-2-07 8,22×10 2,15×10 0,261 5 -4 IL-2-08 9,20×10 2,06×10 0,224 5 -4 IL-2-09 6,46×10 2,22×10 0,344 6 -4 IL-2-10 1,62×10 4,30×10 0,266
[00135] Um método similar foi usado para detectar a afinidade de PEG-IL-2-10, PEG-IL-2-22, PEG-IL-2-23 e IL-2Rβ/γ por Biacore. Os resultados são mostrados na Tabela 8. Os resultados mostraram que após a variante de IL-2 ser acoplada ao PEG mostrou ligação reduzida a IL-2Rβ/γ em certa extensão, mas ainda manteve uma forte afinidade. Os resultados experimentais mostram que IL-2-24 raramente se liga a IL-2Rβ, quando comparada com IL-2 do tipo selvagem, indicando que N26Q N29S/N88R reduz a ligação de IL-2 a IL-2Rβ (os resultados não são mostrados no presente documento).
Tabela 8. Afinidade da variante PEG-IL-2 ao receptor de média afinidade IL-2Rβ/γ Nome Kon (M-1s-1) Koff (s-1) Kd (nM) 6 -3 PEG-IL-2-10 1,38×10 1,19×10 0,86 5 -4 PEG-IL-2-22 1,55×10 5,49×10 3,54 5 -4 PEG-IL-2-23 3,50×10 6,49×10 1,86 Exemplo 6: Viabilidade celular mediada pelo receptor de alta afinidade IL-2Rα/β/γ de IL-2 e sua variante
[00136] CTLL2 é uma linha celular derivada de camundongo que coexpressa IL-2Rα, β e γ, que pode ser usada para avaliar a viabilidade celular mediada pelo receptor de alta afinidade IL-2Rα/β/γ de cada variante de IL-2. Sob diferentes concentrações de IL-2 ou sua variante, a taxa de proliferação de CTLL-2 foi detectada para avaliar a atividade biológica de IL-2 ou sua variante.
[00137] Meio de cultura completo: RPMI 1640 + L-glutamina 2mM + piruvato de sódio 1mM + soro fetal bovino + T-STIM 10%, que foi suplementado com concanavalina-A (contendo IL-2); Meio básico: RPMI 1640 + L-glutamina 2 mM + piruvato de sódio 1 mM + soro fetal bovino a 10%.
[00138] Experimento de proliferação de células CTLL-2: as células CTLL-2 foram cultivadas em meio de cultura completo a 37°C e 5% de CO2 até atingir uma densidade de 2,0 × 105 células/mL, as células foram sub-cultivadas e as células CTLL-2 foram coletadas por centrifugação depois de 3 -4 dias. As células foram lavadas 3 vezes com PBS, ressuspensas no meio de cultura básico para preparar uma suspensão de células contendo 2,0 × 105 células por mL e incubadas em uma placa de 96 poços com 90 μL de células por poço. 10 μL da solução de IL-2 concentrada 10x preparada com o meio de cultura básico na concentração correspondente foram adicionados. As células foram incubadas sob uma condição de 37°C e CO2 5%. Após incubar por 24 horas, 100μL de solução de lise CELLTITER-Glo (Promega) foram adicionados a cada poço e misturados com a solução na placa de células. A placa foi colocada em um leitor de microplaca, com 630nm como comprimento de onda de referência e a absorbância foi medida no comprimento de onda de 570nm e os resultados medidos foram registrados.
[00139] Os dados são ajustados usando um programa de computador ou o algoritmo de regressão de quatro parâmetros e o resultado do cálculo é calculado da seguinte forma: Atividade biológica relativa da amostra de teste (%) = EC50 da amostra de referência/EC50 da amostra de teste (EC50: concentração para o efeito máximo).
[00140] Os dados de atividade de IL-2 e sua variante são mostrados na Tabela 9, Tabela 10 e Figuras 3A-3C. Os resultados mostraram que o primeiro tipo de mutação (ou seja, mutações N26Q, N29S, N30S, Q11C/L132C, L70C/P82C, G27C/F78C) não afetou ou mesmo aumentou ligeiramente a atividade promotora de proliferação de IL-2 das células CTLL2; enquanto que o segundo tipo de mutação (ou seja F42A/ Y45A, F42A/L72G, Y45A/L72G, e mutação em QSMHIDATL nas posições 29-44), reduziu a ligação de IL-2 e IL-2Rα, assim como reduziu a atividade de IL- 2 de promover a proliferação de células CTLL2.
Tabela 9. Atividade de variantes de IL-2 sobre a promoção da proliferação das células CTLL2 Nome Posição e tipo de mutação (Aminoácidos SEQ ID Nº:) Atividade biológica relativa
IL-2 tipo selvagem (SEQ ID Nº:2) 100%
IL-2-01 N26Q (SEQ ID Nº:4) 96%
IL-2-02 N30S (SEQ ID Nº:6) 117%
IL-2-03 Q11C/L132C (SEQ ID Nº:8) 162%
IL-2-04 L70C/P82C (SEQ ID Nº:10) 176%
IL-2-05 G27C/F78C (SEQ ID Nº:12) 229%
IL-2-06 mutação em QSMHIDATL nas posições 29-44 (SEQ ID Nº:14) 4%
IL-2-07 F42A/Y45A (SEQ ID Nº:16) 4%
IL-2-08 F42A/L72G (SEQ ID Nº:18) 7%
IL-2-09 Y45A/L72G (SEQ ID Nº:20) 2%
Tabela 10. Atividade de variantes de IL-2 sobre a promoção da proliferação das células CTLL2 Posição e tipo de mutação (Aminoácidos SEQ ID Nº:) EC50 Atividade Nome (nM) biológica relativa
IL-2 tipo selvagem (SEQ ID Nº:2) 0,053 100%
IL-2-10 N26Q/N30S/F42A/L72G (SEQ ID Nº:22) 4,80 1%
IL-2-22 N26Q/N29S/F42A/N71G/L72G (SEQ ID Nº:34) 5,73 0,9%
Q11C/NNYKNPKLTRMLTFKF nas posições 29-44 mutado IL-2-23 22,71 0,2% para QSMHIDATL/L132C (SEQ ID Nº:36)
PEG-IL-2-10 N26Q/N30S/F42A/L72G (SEQ ID Nº:22) 35,29 0,2%
PEG-IL-2-22 N26Q/N29S/F42A/N71G/L72G (SEQ ID Nº:34) 39,25 0,1%
Q11C/NNYKNPKLTRMLTFKF nas posições 29-44 mutado PEG-IL-2-23 N.A, N.A, para QSMHIDATL/L132C (SEQ ID Nº:36)
(Nota: N.A., não detectado, significa que o efeito da variante sobre a proliferação da célula CTLL2 é pequeno e a EC50 não pode ser obtida pelo ajuste dos dados dentro da faixa de concentração usada no experimento).
Exemplo 7: Viabilidade celular mediada pelo receptor de média afinidade IL-2Rβ/γ de IL-2 e sua variante
[00141] Mo7e é uma linhagem celular humana que expressa apenas IL-2Rβ e γ, mas não expressa IL-2Rα. Mo7e pode ser usada para avaliar a atividade celular mediada pelo receptor de afinidade IL-2Rβ/γ de cada variante de IL-2. Sob diferentes concentrações de IL-2 ou sua variante, a taxa de proliferação dependente da linhagem celular de Mo7e foi detectada para avaliar atividade biológica de IL-2 ou sua variante.
[00142] Meio de cultura completo: RPMI 1640 + L-glutamina 2mM + piruvato de sódio 1mM + soro fetal de vitela a 10% + 15ng / mL GM- CSF; meio básico: RPMI 1640 + L-glutamina 2 mM + piruvato de sódio 1 mM + Soro Fetal Bovino a 10%.
[00143] Experimento de proliferação de células Mo7e: as células Mo7e foram cultivadas em meio de cultura completo a 37°C e CO2 5% até atingir uma densidade de 2,0 × 105 células/mL, as células foram sub- cultivadas e as células Mo7e foram coletadas por centrifugação depois de 3 a 4 dias. As células foram lavadas 3 vezes com PBS e ressuspensas no meio de cultura básico para preparar uma suspensão de células contendo 2,0 × 105 células por mL e incubadas em uma placa de 96 poços com 90 μL de células por poço. 10 μL de uma solução concentrada 10x de IL-2 preparada com meio de cultura básico foram adicionados. As células foram incubadas sob uma condição de 37°C e CO2 5%. Após 72 horas de incubação, 100μL de solução de lise CELLTITER-Glo (Promega) foram adicionados a cada poço e misturados com a solução na placa de células. A placa foi colocada em um leitor de microplaca, com 630nm como comprimento de onda de referência, e a absorbância foi medida no comprimento de onda de 570nm e os resultados da medida foram registrados. A atividade biológica relativa foi calculada usando o mesmo método do Exemplo 6.
[00144] Os dados de atividade de proliferação de células Mo7e para
IL-2 e suas variantes são mostrados na Tabela 11 e nas Figuras 4A-4C. Os resultados mostraram que nem primeiro tipo de ou seja, mutações N26Q, N29S, N30S, Q11C/L132C, L70C/P82C, G27C/F78C) nem o segundo tipo de mutação (ou seja F42A/ Y45A, F42A/L72G, Y45A/L72G, e mutação em QSMHIDATL nas posições 29-44) afetam a atividade de proliferação de IL-2 em células Mo7e, indicando que elas não afetam a afinidade de IL-2 a IL-2Rβ/γ.
[00145] Quando IL-2 é acoplada a PEG a atividade de proliferação de IL-2 em células Mo7e será reduzida até certo ponto, mas ainda mantém uma ligação favorável. Tabela 11. Atividade de IL-2 e sua variante em promover a proliferação de Mo7e Posição e tipo de mutação (aminoácidos SEQ EC50 Atividade Nome ID Nº:) (nM) biológica relativa IL-2 tipo selvagem (SEQ ID Nº:2) 2,44 100% IL-2-10 N26Q/N30S/F42A/L72G (SEQ ID Nº:22) 1,78 137% IL-2-22 N26Q/N29S/F42A/N71G/L72G (SEQ ID Nº:34) 2,84 86% Q11C/NNYKNPKLTRMLTFKF nas posições IL-2-23 29-44 mutado para QSMHIDATL/L132C (SEQ 2,22 110% ID Nº:36) PEG-IL-2-10 N26Q/N30S/F42A/L72G (SEQ ID Nº:22) 13,19 19% N26Q/N29S/F42A/N71G/L72G (SEQ ID PEG-IL-2-22 34,81 7% Nº:34) Q11C/NNYKNPKLTRMLTFKF nas posições 10% PEG-IL-2-23 29-44 mutado para QSMHIDATL/L132C (SEQ 23,37 ID Nº:36) Exemplo 8: Determinação da atividade de IL-2 e sua variante na fosforilação de STAT5 em células CTLL2
[00146] A atividade biológica de IL-2 ou sua variante foi detectada com base no nível de fosforilação de STAT5 na cepa CTLL-2 dependente de células em diferentes concentrações de IL-2 ou sua variante.
[00147] Meio de cultura completo: RPMI 1640 + L-glutamina 2mM + piruvato de sódio 1mM + 10% de soro fetal bovino + 10% de cultura T- STIM suplementada com concanavalina-A (contendo IL-2); meio básico: RPMI 1640+ L-glutamina 2 mM + piruvato de sódio 1 mM + soro fetal bovino 10%.
[00148] Experimento de fosforilação de STAT5 em células CTLL-2: as células CTLL-2 foram cultivadas em meio de cultura completo a 37°C e CO2 5% até atingir uma densidade de 2,0 × 105 células por mL, lavadas com PBSA (PBS, pH 7,2, 1%BSA) uma vez, e a densidade foi ajustada para 1,0 × 106 células por mL e as células foram divididas em alíquotas em tubos com 500 μL por tubo. As concentrações correspondentes da solução concentrada de IL-2 preparada com o meio de cultura básico da concentração foram incubadas incube em temperatura ambiente por 20 minutos; paraformaldeído foi adicionado imediatamente em uma concentração final de 1,5%, e misturado por centrifugação e incubado em temperatura ambiente por 10 minutos. 1 mL de PBS foi adicionado e centrifugado a 4°C, 1400 rpm por 5 minutos para remover o paraformaldeído. As células foram resuspensas, 1 mL de metanol 100% foi adicionado pré-resfriado a 4°C, misturado por centrifugação, as células foram incubadas a 4°C por 20 minutos. 3 mL de tampão PBSA foram adicionados e centrifugados a 4°C e 1400 rpm por 5 minutos. As células foram lavadas duas vezes. Anticorpo anti- STAT5-pY694 conjugado com Alexa Fluor 647 (BD, Cat # 612599) foi incubado por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro. As células foram lavadas duas vezes com 3mL de PBSA e detectadas com citômetro de fluxo. A atividade biológica relativa foi calculada usando o mesmo método do Exemplo 6.
[00149] Os dados de atividade de fosforilação de STAT5 de IL-2 e sua variante em células CTLL2 são mostrados na Figura 5 e na Tabela
12. Os resultados mostraram que as mutações N26Q, N29S e N30S não afetaram ou até aumentaram levemente a atividade de fosforilação de STAT5 de IL-2 em células CTLL2, enquanto que F42A/ Y45A, F42A/ L72G e Y45A/L72G reduziram a atividade de IL-2 na fosforilação de STAT5 em células CTLL2. Dessa maneira pode ser provado que N26Q, N29S, N30S não afetam a ligação de IL-2 ao receptor de alta afinidade IL-2Rα/β/γ, enquanto que F42A/Y45A, F42A/L72G e Y45A/L72G reduziram a ligação de IL-2 com o receptor IL-2Rα/ β/γ de alta afinidade. Tabela 12. Atividade de IL-2 do tipo selvagem e sua variante na fosforilação de STAT5 em células CTLL2 Atividade biológica Nome Mutação (aminoácido SEQ ID Nº:) EC50 (nM) relativa IL-2 tipo selvagem (SEQ ID Nº:2) 0,010 100% IL-2-01 N26Q (SEQ ID Nº:4) 0,0084 119% IL-2-02 N30S (SEQ ID Nº:6) 0,0084 119% IL-2-07 F42A/Y45A (SEQ ID Nº:16) 2,45 0,41% IL-2-08 F42A/L72G (SEQ ID Nº:18) 3,93 0,25% IL-2-09 Y45A/L72G (SEQ ID Nº:20) 4,02 0,25% Exemplo 9: Determinação da atividade de IL-2 e sua variante na fosforilação de STAT5 em células do sangue periférico humano (PBMC)
[00150] A atividade biológica de IL-2 foi detectada com base no nível de fosforilação de STAT5 em várias populações de células no sangue periférico humano (incluindo Tregs, células NK, células T CD4+ e células T CD8+) sob diferentes concentrações de IL-2 ou sua variante.
[00151] Meio básico: RPMI 1640 + 10% de soro fetal bovino.
[00152] Mistura de anticorpos: CD3 APC-Cy7 (BD 557832), CD4
BB515 (BD 564419), CD8 BB700 (BD 566452), CD25 BV421 (BD 564033), FOXP3 PE (BD 560852), CD56 BV650 (BD 564057), pSTAT5 AF647 (BD 562076).
[00153] Experimento de fosforilação de STAT5 em PBMC humano: Células PBMC humanas isoladas recentemente foram ajustadas para uma densidade de 6,0 × 106 células por mL com meio basal e 90 μL foram adicionados em uma placa de 96 poços. IL-2 e sua variante e derivados foram diluídos com meio básico para 1000 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 0,1 nM, 0,01 nM; 10 μL dos quais foram adicionados a 90 μL de PBMC e estimulados a 37°C por 15 minutos. Depois, as células foram imediatamente fixadas com tampão BD Cytofix pré-aquecido (BD, Cat Nº. 554655) a 37°C durante 10 minutos. As células foram centrifugadas a 350 g por 7 minutos a 4°C. O sobrenadante foi removido, 200 μL de BD Phosflow Perm Buffer III (BD, Cat Nº. 558050) pré-resfriado a -20°C foram adicionados sobre gelo por 30 minutos para digestão da membrana celular. As células foram centrifugadas a 450 g por 7 minutos 4°C. O sobrenadante foi removido, 200 μL de BD Phosflow Perm Buffer III (BD, Cat Nº. 558050) pré-resfriado a -20°C foram adicionados sobre gelo por 30 minutos para digestão da membrana de célula T. As células foram centrifugadas a 450 g por 7 minutos a 4°C. O sobrenadante foi removido, 200 μL de PBS pH 7,4 foram adicionados para lavar duas vezes. 100 μL de bloqueador de FcR diluídos 1:200 foram adicionados e incubados a 4°C por 20 minutos. A amostra foi centrifugada em 450 g a 4°C por 7 minutos. O sobrenadante foi removido, 100 μL de mistura de anticorpo foram adicionados e as células foram coradas em temperatura ambiente por 40 minutos. A amostra foi centrifugada a 450 g por 7 minutos a 4°C. O sobrenadante foi removido, 200 μL de PBS, pH 7,4 foram adicionados às PBMC resuspensas para detecção com citômetro de fluxo. As células NK são definidas como células CD3-CD56+, as células T CD8+ são definidas como células CD3+CD4-CD8+ e as Treg são definidas como células CD3+CD4+CD25+Foxp3 +.
[00154] Para as três populações de células acima, os valores da fluorescência de pSTAT5 (MFI) sob diferentes concentrações de IL-2 foram resumidos, ajustados pelo uso de um programa de computador ou um algoritmo de regressão de quatro parâmetros e a atividade biológica relativa foi calculada de acordo com o mesmo método no Exemplo 6.
[00155] Os resultados mostraram que F42A/L72G e as mutações em IL-2-10 e IL-2-23 apenas reduziram a ligação de IL-2 a IL-2Rα, mas não afetaram a ligação de IL-2 a IL-2Rβ/γ, a redução da atividade de Treg causada por essas mutações é maior do que nas células T CD8+ e do que nas células NK. Pelo contrário, já que N88R não afeta a ligação de IL-2 e IL-2Rα, mas reduz a ligação de IL-2 e IL-2Rβ, portanto, a redução na atividade de Tregs causada por IL-2 é menor do que aquela nas células T CD8+. O acoplamento de PEG a IL-2 resultará em redução do efeito da ativação de IL-2 em células T CD8 + e células NK, em uma certa extensão.
[00156] Os dados de atividade da variante de IL-2 na fosforilação de STAT5 em células PBMC são mostrados na Tabela 13, Tabela 14, Tabela 15 e Figura 6A-6C. Tabela 13. Atividade de IL-2 e sua variante na fosforilação de STAT5 em células Treg humanas EC50 Atividade Nome Mutação (aminoácidos SEQ ID Nº:) (nM) biológica relativa IL-2 tipo selvagem (SEQ ID Nº:2) 0,00046 100 % PEG-IL-2-10 N26Q/N30S/F42A/L72G (SEQ ID Nº:22) 2,65 0,02 % Q11C/NNYKNPKLTRMLTFKF nas posições 29-44 PEG-IL-2-23 4,24 0,01 % mutado para QSMHIDATL/L132C (SEQ ID Nº:36) IL-2-24 0,209 0,2 % N26Q/N29S/N88R (SEQ ID Nº:38) PEG-IL-2-24 6,02 0,007 %
Tabela 14. Atividade de IL-2 e sua variante na fosforilação em células T CD8+ humanas Nome EC50 (nM) Atividade Relativa IL-2 2,32 100 % PEG-IL-2-10 8,97 26 % PEG-IL-2-23 14,41 16 % IL-2-24 N.A. N.A.
PEG-IL-2-24 N.A. N.A. (Nota: N.A., não detectado indicando que a atividade da variante na fosforilação de STAT5 é menor nas células T CD8+ e a EC50 não pode ser obtida pelo ajuste dos dados dentro da faixa de concentração usada no experimento). Exemplo 10: Determinação do efeito de IL-2 e sua variante sobre as células imunes do sangue periférico de camundongos Balb/c
[00157] Camundongos BALB/c (adquiridos de Shanghai Lingchang Biological Technology Co., Ltd.), fêmeas, 4-8 semanas de idade, pesando 18-20 g, foram deixados se aclimatar durante 5 dias antes do experimento formal. Todos os camundongos BALB/c foram criados em um alojamento animal IVC de grau SPF com um sistema de temperatura e pressão constantes, onde a temperatura era 20-26°C, a umidade era de 40-70% e o ciclo de luz era de 12 horas claro/12 horas escuro. Não havia mais do que 6 camundongos BALB/c em cada gaiola. O tamanho da gaiola é 325 mm × 210 mm × 180 mm. O material do forro na gaiola era espiga de milho, que era renovada duas vezes por semana. Durante todo o experimento, todos os camundongos do laboratório puderam comer e beber livremente, e a comida e a água eram autoclavadas e trocadas duas vezes por semana.
[00158] Todo o pessoal que entrava e saia da sala de criação de animais ou operadores de experimentos usavam roupas esterilizadas de laboratório, máscaras médicas descartáveis e luvas de borracha. Cada gaiola tem uma etiqueta clara e detalhada correspondente. O conteúdo da etiqueta incluiu: número de aprovação IACUC LDIACUC006, número de animais, gênero, cepa, data de inclusão, número do item, grupo, estágio experimental atual e a pessoa responsável pelo experimento, etc. Ao longo do experimento, a operação e a observação de animais experimentais foram realizadas de acordo com os regulamentos de uso e manejo de animais da AAALAC. De acordo com o processo de experimento de rotina, o comportamento, alimentação, ingestão de água, alteração de peso, brilho do pelo e outras condições anormais de todos os animais experimentais foram monitorados e registrados.
[00159] Os camundongos foram agrupados de acordo com o peso corporal e a administração foi iniciada após o agrupamento. O tipo de administração, dosagem e via de administração são mostrados na Tabela 16 e Figuras 7A-7D. O dia de agrupamento do modelo é o dia 0.
[00160] O sangue foi coletado em cada ponto de tempo e o volume de sangue foi medido, o sangue anti-coagulado recentemente coletado foi lisado com lisado de células sanguíneas vermelhas para lisar as células sanguíneas vermelhas e lavado uma vez com PBS.
[00161] A solução de coloração mista com PBS contendo FBS 1%. A solução de coloração mista compreendia CD3 APC-Cy7 (Biolegend 100329), CD8 PE (Biolegend 100708), CD4 PE-Cy7 (eBioscience 25- 0042-82), CD25 PerCP-Cy5.5 (BD 561112) e CD49b-APC (Biolegend 108909)). 100μL de solução de coloração mista foram adicionados a cada amostra e incubados a 4°C por 30 minutos. A amostra foi lavada duas vezes com FBS 1%. True-NuclearTM Transcription Factor Buffer Set (Biolegend 424401) foi usado para fixar as amostras por 60 minutos, para digestão da membrana celular. 100 μL de anticorpo Foxp3 anti- camundongo (Biolegend 126405) foram incubados por 60 minutos em temperatura ambiente. As amostras foram lavadas duas vezes com PBS, solução de lavagem em pH 7,4 e, finalmente, foram resuspensas com 500 μL de PBS, solução de lavagem em pH 7,4 para análise na máquina. As células NK são definidas como células CD3-CD49b+, células T CD8+ são definidas como células CD3+CD4-CD8+ e Treg são definidas como células CD3+CD4+CD25+Foxp3+. De acordo com o volume da amostra de sangue, a densidade celular de cada grupo de células no sangue periférico foi calculada. Tabela 16. Regime de dosagem para o tratamento com PEG-IL-2-22 Administração Ponto de tempo Número de Dose Via de Tempo de Grupo para amostragem animais (mg/kg) administração administração de sangue (d) 1 3 PEG-IL-2-22 i.v. 0, 3, 5, 10 3 2 3 i.v. 2, 4, 6 3 3 s.c. 0, 3, 5, 10 3 administração única 4 3 s.c. 2, 4, 6 desde o início do 5 3 s.c. 3, 5, 10 6 teste 6 3 s.c. 2, 4, 6 7 3 s.c. 3, 5, 10 9 8 3 s.c. 2, 4, 6
[00162] Durante o experimento, PEG-IL-2-22 foi administrado através de injeção da veia da cauda no dia 0, o sangue do camundongo foi coletado e analisado por citometria de fluxo no dia 0, 2, 3, 4, 5, 6 e 10, respectivamente. Os resultados da densidade de cada população de células no sangue mostram que a densidade de células NK CD3- CD49b+ em células do sangue total está significativamente aumentada no dia 3 de uma maneira dependente da dose e reverte basicamente ao nível pré-dosagem no dia 5. A densidade de células T regulatórias (Tregs) está aumentada significativamente no dia 3, a densidade basicamente reverte ao nível pré-dosagem no dia 4.
[00163] Durante o experimento, todos os grupos de camundongos tratados com diferentes doses de PEG-IL-2-22 a serem testados não mostraram perda de peso ou comportamento anormal, indicando que os camundongos tiveram uma tolerância favorável ao medicamento nas doses a serem testadas. Tabela 17. Administração e tratamento por PEG-IL-2-24 Ponto de tempo Número de Dose Via de Tempo de Grupo Tratamento para amostragem animais (mg/kg) administração administração de sangue (d) 1 3 0,2 i.p. 0, 3, 4, 5 administração PEG-IL-2- 2 3 1 i.p. única desde o 0, 3, 4, 5 24 início do teste 3 3 5 i.p. 0, 3, 4, 5 (Nota: i.v. injeção na veia da cauda; s.c. injeção subcutânea; i.p. injeção intraperitoneal)
[00164] Os resultados mostraram que PEG-IL-2-24 pode estimular a proliferação de Treg em doses alta (5mg/kg), média (1mg/kg) e baixa (0,2mg/kg) depois de três dias de administração de uma maneira dependente da dose; os percentuais de células T CD4+ e células T CD8+ em células T CD3+ não se alterou nas três doses, mostrando a ativação preferencial de Treg por PEG-IL-2-24. Os resultados são mostrados nas Figuras 8A-8F. Exemplo 11: Avaliação da eficácia de IL-2 e sua variante em modelos de camundongo de tumor de câncer de cólon derivado de murino
[00165] Células CT26.WT de adenocarcinoma de cólon derivado de murino (do Cell Bank, em Chinese Academy of Sciences (SIBC), Shanghai) foram expandidas depois de descongelar a geração de células P4+1 e cultivadas em meio DMEM contendo soro fetal bovino 10% (FBS). As células CT26.WT em fase de crescimento exponencial foram coletadas, resuspensas em HBSS para atingir 1 x 106/mL, transplantadas por via subcutânea em camundongos BALB/C sob condições assépticas e cada camundongo foi inoculado com 1 x 105 células. Quando o volume do tumor atingiu cerca de 80 a 100 mm3, os animais foram divididos em grupos. A primeira administração começou depois do agrupamento. O método de administração detalhado, dose e via de administração são mostrados na Tabela 18. O dia no qual os camundongos foram agrupados é considerado o dia 0. Tabela 18. Regime de dosagem de PEG-IL-2-22 Número de Dose Via de Frequência de Grupo Tratamento animais (mg/kg) administração administração 1 6 PBS -- s.c. Q5D 2 6 3 s.c. Q5D 3 6 6 s.c. Q5D PEG-IL-2- 4 6 9 s.c. Q5D 22 5 6 3 i.v. Q5D 6 6 6 i.v. Q5D (Nota: i.v. injeção na veia da cauda; s.c. injeção subcutânea. Q5D, administrado uma vez a cada cinco dias. Volume de dosagem: o volume de dosagem foi ajustado de acordo com o peso corporal do camundongo (0,1 mL/10g)).
[00166] Após o início da administração, o peso corporal do camundongo e o volume do tumor foram medidos 3 vezes por semana, e o volume do tumor foi calculado como: volume do tumor (mm3) = 0,5 × (diâmetro longo do tumor × diâmetro curto do tumor2). Taxa de inibição relativa do tumor TGI (%) foi calculada como: TGI% = (1-T/C) × 100%. T/C% é a taxa relativa de crescimento do tumor (isto é, o valor percentual relativo do grupo de tratamento e do grupo de controle em relação ao volume do tumor ou peso do tumor entre o grupo de tratamento e o grupo de controle em um certo ponto de tempo). T e C representam o volume do tumor (TV) ou peso do tumor (TW) do grupo de tratamento e grupo de controle, em um ponto de tempo específico, respectivamente. Os resultados experimentais são mostrados na Tabela 19 e Figura 9.
Tabela 19. Efeito antitumor de PEG-IL-2-22 no modelo de tumor CT26 volume tumor no volume tumor no TGI T/C valor Grupo dia 0 (mm3) dia 12 (mm3) (%) (%) de p 1 72,3±5,31 2577,6±360,91 2 72,2±6,03 1410,5±673,38 47 53 0,1576 3 70,9±5,37 1297,5±263,52 51 49 0,0168 4 71,8±5,33 1168,6±352,3 56 44 0,0190 5 70,1±5,53 2369,4±547,49 8 92 0,7574 6 69,8±5,85 1122,2±418,6 58 42 0,0265
[00167] A eficácia de PEG-IL-2-22 com diferentes doses e diferentes modos de administração foi testada no modelo de aloenxerto CT26 de células de câncer de cólon de camundongo, neste experimento. Os resultados mostram que: no grupo de dose média da administração subcutânea (G3), PEG-IL-2-22 6mg/kg s.c. Q5D*5 mostrou um volume médio do tumor de 1297,5 ± 263,52 mm3 no dia 12 depois da administração, que é significativamente menor do que aquele no grupo de controle no mesmo dia (com um volume do tumor de 2577,6 ± 360,91 mm3, TGI=51%, p=0,0168). No grupo com dose alta da administração subcutânea (G4), PEG-IL-2-22 9 mg/kg s.c. Q5D*5 mostrou um volume médio do tumor de 1168,6 ± 352,3 mm3 no dia 12 depois da administração, que é significativamente menor do que aquele no grupo de controle no mesmo dia (com um volume do tumor de 2577,6 ± 360,91 mm3, TGI=56%, p=0,0190). No grupo com dose média e administração subcutânea (G6), PEG-IL-2-22 6 mg/kg i.v. Q5D*5 mostrou um volume médio do tumor de 1122,2 ± 418,6 mm3 no dia 12 depois da administração, que é significativamente menor do que aquele no grupo de controle no mesmo dia (com um volume do tumor de 2577,6 ± 360,91 mm3, TGI=58%, p=0,0265).
Exemplo 12: Avaliação da eficácia de IL-12 e sua variante em um modelo em camundongo de tumor de melanoma humano
[00168] Camundongos NCG, fêmeas, 4-8 semanas de idade, pesando cerca de 18-22 g, foram adquiridos de Jiangsu GemPharmatech Biotechnology Co., Ltd. Todos os camundongos NCG foram criados em gaiolas IVC para animais grau SPF com sistema de pressão e temperatura constantes.
[00169] As células A375 foram cultivadas em meio DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (FBS). Células A375 na fase de crescimento exponencial foram coletadas, e HBSS foi resuspenso em uma concentração adequada para inoculação subcutânea de tumor em camundongos NCG. As células A375 usadas para cocultivo precisam ser tratadas com Mitomicina C por 2 horas e, em seguida, lavadas com PBS três vezes. O sangue periférico humano normal foi coletado, para separar as PBMCs humanas por centrifugação em gradiente de densidade e as células foram contadas. Depois, PBMCs foram resuspensas em uma concentração de 3 × 106 células/mL com meio RPMI1640 (contendo IL-2 e FBS 10%), e cocultivadas com células A375 tratadas com Mitomicina C. Após 8 dias de cocultura, PBMCs foram coletados e células A375 recentemente digeridas também foram coletadas. Cada camundongo foi inoculado: PBMC 8 × 105, células A375 4 × 106; Volume de inoculação: 0,2ml/camundongo (compreendendo Matrigel 50%); Inoculadas por via subcutânea no flanco direito de camundongos fêmeas NCG, um total de 30 camundongos foram inoculados. Os camundongos foram divididos em grupos aleatoriamente de acordo com seu peso corporal. O método de administração detalhado, dosagem e via de administração são mostrados na Tabela 20. O dia no qual os camundongos foram agrupados para a administração é ajustado como o dia 0.
Tabela 20. Regime de dosagem de PEG-IL-2-22 Grupo Grupo de N Dose (mg/kg) Regime de Via de administração dosagem administração 1 PBS 6 -- Q3D i.v.
2 6 0,03 Q3D i.v.
3 6 0,1 Q3D i.v. PEG-IL-2-22 4 6 0,03 Q3D s.c.
5 6 0,1 Q3D s.c.
(Nota: N: número de animais usados. i.v.: injeção na veia da cauda; s.c. injeção subcutânea. Q3D: administrado uma vez a cada três dias. Volume de dosagem: o volume de dosagem foi ajustado de acordo com o peso dos camundongos que apresentavam tumor (0,1 mL/10g)).
[00170] Uma vez iniciada a administração, o peso e o volume do tumor dos camundongos foram medidos duas vezes por semana. Os resultados experimentais são mostrados na Tabela 21e Figura 10, respectivamente. Tabela 21. Efeito antitumor de PEG-IL-2-22 no modelo em camundongo de tumor A375 humano Volume tumor no dia Volume tumor no dia 27 TGI T/C valor Grupo 0 (mm3) (mm3) (%) (%) de P 1 0±0 1558,55±320,54 2 0±0 175,75±64,16 88,72 11,28 <0,001 3 0±0 55,62±15,18 96,43 3,57 <0,001 4 0±0 95,08±37,27 93,90 6,10 <0,001 5 0±0 232,23±35,68 85,10 14,90 <0,001
[00171] No final do experimento (dia 27 após a administração), o volume do tumor e o peso do tumor no grupo tratado com PEG-IL-2-22 (0,03 mg/kg, injeção na veia da cauda), grupo tratado com PEG-IL-2-22
(0,1 mg/kg, injeção na veia da cauda), grupo tratado com PEG-IL-2-22 (0,03 mg/kg, injeção subcutânea), grupo tratado com PEG-IL-2-22 (0,1 mg/kg, injeção subcutânea) são significativamente diferentes daqueles no grupo com PBS (valor de P menor do que 0,001), indicando um efeito inibitório significativo sobre o crescimento do tumor. Exemplo 13: Análise da imunogenicidade de IL-2 e sua variante
[00172] De acordo com a análise de simulação por computador, o número simulado de epítopo de célula T (TCE) calculado pelo uso de variantes de IL-2 é aproximadamente equivalente a ou menor do que aquele de IL-2 tipo selvagem (veja a Tabela 22). Os resultados mostram que as mutações de aminoácidos em cada variante de IL-2 não causarão efeitos adversos sobre a imunogenicidade de IL-2 para propósitos relacionados a terapêutica. Tabela 22. Epítopos de célula T de variantes de IL-2 Número Número de TCE TCE IL-2 5 LISNINVIV FKFYMPKKA MILNGINNY LTRMLTFKF MLTFKFYMP IL-2-01 4 FKFYMPKKA LISNINVIV LTRMLTFKF MLTFKFYMP IL-2-02 6 MILNGINSY FKFYMPKKA LTRMLTFKF LISNINVIV INSYKNPKL MLTFKFYMP IL-2-03 5 LISNINVIV FKFYMPKKA MILNGINNY LTRMLTFKF MLTFKFYMP IL-2-04 5 LISNINVIV FKFYMPKKA MILNGINNY LTRMLTFKF MLTFKFYMP IL-2-05 5 MILNCINNY FKFYMPKKA LISNINVIV LTRMLTFKF MLTFKFYMP IL-2-06 5 LISNINVIV MHIDATLYM IQSMHIDAT MILNGIQSM LNGIQSMHI IL-2-07 4 TRMLTAKFA LISNINVIV MILNGINNY LTRMLTAKF IL-2-08 3 LISNINVIV MILNGINNY LTRMLTAKF IL-2-09 6 FKFAMPKKA MILNGINNY LTRMLTFKF RMLTFKFAM LISNINVIV MLTFKFAMP IL-2-10 3 LISNINVIV LTRMLTAKF INSYKNPKL IL-2-11 3 LISNINVIV LTRMLTAKF INSYKNPKL IL-2-12 3 LISNINVIV LTRMLTAKF INSYKNPKL IL-2-13 3 LISNINVIV LTRMLTAKF INSYKNPKL IL-2-14 3 LISNINVIV MILNGISNY LTRMLTAKF IL-2-21 2 LISNINVIV LTRMLTAKF IL-2-22 2 LISNINVIV LTRMLTAKF IL-2-23 5 LISNINVIV MHIDATLYM IQSMHIDAT MILNGIQSM LNGIQSMHI

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Variante de IL-2 ou seu derivado, caracterizados pelo fato de compreenderem um primeiro tipo de mutação e o primeiro tipo de mutação é qualquer uma selecionada do grupo que consiste em 1) a 7) ou suas combinações: 1) N26Q, 2) N29S, 3) N30S, 4) N71Q, 5) Q11C e L132C, 6) L70C e P82C, e 7) G27C e F78C.
    2. Variante de IL-2 ou seu derivado de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de compreenderem ainda um segundo tipo de mutação ou um terceiro tipo de mutação, em que: o segundo tipo de mutação pode eliminar ou reduzir a afinidade da variante de IL-2 ou seu derivado pelo o receptor de alta afinidade (IL-2Rα/β/γ), mas reter sua afinidade pelo o receptor de média afinidade (IL-2Rβ/γ); o terceiro tipo de mutação pode reduzir a afinidade da variante de IL-2 ou seu derivado por ambos receptores de alta afinidade (IL-2Rα/β/γ) e receptores de afinidade média (IL-2Rβ/γ), e a afinidade pelo receptor de alta afinidade está mais diminuída do que a afinidade pelo o receptor de média afinidade; preferivelmente, o segundo tipo de mutação é qualquer um selecionado do grupo que consiste em de 8) a 11) ou qualquer combinação de 8) a 10): 8) F42A, 9) Y45A, 10) L72G, e
    11) NNYKNPKLTRMLTFKF nas posições 29-44 mutado para QSMHIDATL; o terceiro tipo de mutação é qualquer um selecionado do grupo que consiste em 12) a 14) ou qualquer combinação desses: 12) N88R ou N88G ou N88I ou N88D, 13) D20H ou D20Y, e 14) Q126L.
    3. Variante de IL-2 ou seu derivado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizados pelo fato de que o primeiro tipo mutação é qualquer um selecionado do grupo que consiste em 15) a 17) ou qualquer um de 15) a 17) em combinação com qualquer um de 5) a 7): 15) N26Q e N29S, 16) N26Q, N29S e N71Q, e 17) N26Q e N30S; o segundo tipo mutação é qualquer um selecionado do grupo que consiste em 18) a 20) e 11): 18) F42A e Y45A, 19) F42A e L72G, e 20) Y45A e L72G; o terceiro tipo mutação é N88R ou N88G ou N88D; preferivelmente a variante de IL-2 ou seu derivado compreendem mutações mostradas em qualquer um de 21) a 29): 21) N26Q, N29S, F42A, N71Q e L72G, 22) N26Q, N29S e N88R, 23) N26Q, N29S, F42A e L72G, 24) N26Q, N30S, F42A e L72G, 25) Q11C, N26Q, N30S, F42A, L72G e L132C, 26) N26Q, N30S, F42A, L70C, L72G e P82C, 27) N26Q, G27C, N30S, F42A, L72G e F78C,
    28) N29S, F42A e L72G, e 29) Q11C, NNYKNPKLTRMLTFKF nas posições 29-44 mutados para QSMHIDATL e L132C.
    4. Variante de IL-2 ou seu derivado, caracterizados pelo fato de que os aminoácidos nas posições 29-44 da variante ou seu derivado são substituídos por QSMHIDATL; preferivelmente, a variante de IL-2 ou seu derivado compreende ainda a mutação mostrada em qualquer um de 1) a 7) ou qualquer combinação das mesmas de acordo com a reivindicação 1
    5. Variante de IL-2 ou seu derivado, caracterizados pelo fato de que a variante de IL-2 ou seu derivado compreendem as mutações N71Q e L72G; preferivelmente a variante de IL-2 ou seu derivado compreendem as mutações mostradas em qualquer um de 1) a 3) e 5) a 9) ou uma combinação dessas: 1) N26Q, 2) N29S, 3) N30S, 5) Q11C e L132C, 6) L70C e P82C, 7) G27C e F78C, 8) F42A, e 9) Y45A.
    6. Variante de IL-2 ou seu derivado de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizadas pelo fato de que a estabilidade está aumentada quando comparadas com IL-2 de tipo selvagem.
    7. Variante de IL-2 ou seu derivado de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizadas pelo fato de compreenderem ainda uma mutação de aminoácido de C125A.
    8. Variante de IL-2 ou seu derivado, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizados pelo fato de que a(s) mutação/mutações é/são relacionada(s) à IL-2 de tipo selvagem, cuja sequência de aminoácidos é mostrada em SEQ ID Nº:2 e a numeração da posição da mutação é contada a partir do aminoácido A na segunda posição 2 de acordo com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID Nº:2.
    9. Variante de IL-2 ou seu derivado de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizados pelo fato de compreenderem aminoácidos como mostrados em qualquer uma selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 4, SEQ ID Nº: 6, SEQ ID Nº: 8, SEQ ID Nº: 10, SEQ ID Nº:12, SEQ ID Nº:14, SEQ ID Nº:16, SEQ ID Nº:18, SEQ ID Nº:20, SEQ ID Nº:22, SEQ ID Nº:24, SEQ ID Nº:26, SEQ ID Nº: 28, SEQ ID Nº: 30, SEQ ID Nº: 32, SEQ ID Nº: 34, SEQ ID Nº: 36 e SEQ ID Nº: 41.
    10. Variante de IL-2 ou seu derivado de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizados pelo fato de serem monoméricas e/ou PEGuiladas e/ou glicosiladas e/ou conjugadas ou fundidas com albumina, e/ou fundidas a Fc e/ou hidroxietiladas e/ou sem O-glicosilação; preferivelmente, PEG está ligado à terminação N da variante de IL-2; mais preferivelmente, o peso molecular de PEG é de 5 KD a 50 KD; o mais preferivelmente, o peso molecular de PEG é de 20 KD.
    11. Conjugado, caracterizado pelo fato de compreender a variante de IL-2 ou seu derivado de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a variante de IL-2 ou seu derivado estão diretamente ligados a um módulo não IL-2 ou indiretamente ligados a um módulo não IL-2 através de um ligante;
    preferivelmente, o módulo não IL-2 é um módulo de ligação ao antígeno; mais preferivelmente, o módulo de ligação ao antígeno é um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno; mais preferivelmente, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno tem como alvo um antígeno presente nas células tumorais ou no ambiente das células tumorais.
    12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender a variante de IL-2 ou seu derivado como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 ou o conjugado como definido na reivindicação 11; preferivelmente a composição farmacêutica compreende diluentes, veículos ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.
    13. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de codificar a variante de IL-2 ou seu derivado, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, preferivelmente a molécula de ácido nucleico compreende um polinucleotídeo como mostrado em qualquer uma das SEQ ID Nº: 3, SEQ ID Nº: 5, SEQ ID Nº: 7, SEQ ID Nº: 9, SEQ ID Nº: 11, SEQ ID Nº: 13, SEQ ID Nº: 15. SEQ ID Nº:17, SEQ ID Nº:19, SEQ ID Nº:21, SEQ ID Nº:23, SEQ ID Nº:25, SEQ ID Nº:27, SEQ ID Nº:29, SEQ ID Nº:31, SEQ ID Nº: 33, SEQ ID Nº: 35 e SEQ ID Nº: 40.
    14. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de compreender a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 13.
    15. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de compreender o vetor como definido na reivindicação 14 ou que expresse a variante de IL-2 ou seu derivado como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, o conjugado como definido na reivindicação 11, preferivelmente, a célula hospedeira é uma célula procariótica ou eucariótica;
    mais preferivelmente, a célula hospedeira é uma bactéria, uma levedura ou uma célula de mamífero; o mais preferivelmente, a célula hospedeira é Saccharomyces cerevisiae ou Escherichia coli.
    16. Uso da variante de IL-2 ou seu derivado como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, o conjugado como definido na reivindicação 11 ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 12, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um fármaco; quando a variante de IL-2 ou seu derivado compreendem o segundo tipo de mutação, o fármaco é usado para tratar uma doença proliferativa ou doença proliferativa metastática ou doenças imunes, para regular respostas imunes mediadas por células T e estimular o sistema imune de um indivíduo; preferivelmente, a doença proliferativa é tumor ou câncer, e a doença imune é diabetes; mais preferivelmente, o tumor ou câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em carcinoma de células epiteliais, carcinoma de células endoteliais, carcinoma de células escamosas, câncer causado pelo vírus do papiloma, adenocarcinoma, carcinoma, melanoma, sarcoma, teratocarcinoma, tumor pulmonar, câncer de pulmão metastático, linfoma e carcinoma de células renais metastático; quando a variante de IL-2 ou seu derivado compreendem o terceiro tipo de mutação, o fármaco é usado para tratar doenças autoimunes ou reações autoimunes após o transplante de órgãos; preferivelmente, a doença autoimune é selecionada do grupo que consiste em diabetes tipo I, artrite reumatoide, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), eczema e asma.
    17. Método para o tratamento de uma doença proliferativa,
    uma doença proliferativa metastática ou uma doença imune ou para regular a resposta imune mediada por célula T, estimular o sistema imunológico de um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreender administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da variante de IL- 2 ou seu derivado como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, o conjugado como definido na reivindicação 11 ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 12 a um indivíduo, em que, a variante de IL-2 ou seu derivado contêm o segundo tipo de mutação; preferivelmente, a doença proliferativa é um tumor ou câncer e a doença imune é diabetes; mais preferivelmente, o tumor ou câncer é selecionado do grupo que consiste em carcinoma de células epiteliais, carcinoma de células endoteliais, carcinoma de células escamosas, câncer causado por vírus do papiloma, adenocarcinoma, carcinoma, melanoma, sarcoma, teratocarcinoma, tumores de pulmão, câncer de pulmão metastático, linfoma e carcinoma de células renais metastático.
    18. Método de tratamento e/ou prevenção de uma doença autoimune ou uma resposta autoimune devidas ao transplante de órgão, caracterizado pelo fato de compreender administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da variante de IL-2 ou seu derivado como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 6 a 10, o conjugado como definido na reivindicação 11 ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 12 a um indivíduo, em que, a variante de IL-2 ou seu derivado compreendem o terceiro tipo de mutação; preferivelmente, a doença autoimune é selecionada de diabetes tipo I, artrite reumatoide, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), eczema e asma.
    19. Método para preparar a variante de IL-2 ou seu derivado,
    como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de compreender: introduzir mutações na IL-2 humana de tipo selvagem, ou realizar a expressão recombinante pelo uso da molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 13, ou o vetor de expressão como definido na reivindicação 14 ou célula hospedeira como definida na reivindicação 15.
    20. Método para aumentar a estabilidade de IL-2 ou seu derivado ou conjugado, caracterizado pelo fato de compreender a introdução das mutações mostradas na IL-2 ou seu derivado ou seu conjugado, em que as ditas mutações são quaisquer uma de 1) a 7) ou suas combinações: 1) N26Q, 2) N29S, 3) N30S, 4) N71Q, 5) Q11C e L132C, 6) L70C e P82C, e 7) G27C e F78C.
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