CN116178572A - 构建嵌合蛋白的嵌合区域、构建方法、嵌合蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种嵌合蛋白，包括细胞因子以及细胞因子受体胞外域；细胞因子嵌入到细胞因子受体胞外域的嵌合区域中，嵌合区域位于细胞因子受体胞外域柔性连接区，或细胞因子受体胞外域嵌入到该细胞因子的嵌合区域中，嵌合区域位于细胞因子柔性连接区。本发明公开了通过在CD25和IL‑2蛋白上选择合适的嵌合区域，将两个蛋白分成不同的肽段，连接形成一条肽链，表达形成嵌合蛋白。其具有消除或降低的对高亲和力IL‑2受体(IL‑2Rαβγ)的亲和力，并保留/增强对中等亲和力IL‑2受体(IL‑2Rβγ)的亲和力。本发明还公开了IL15RA和IL‑15的嵌合蛋白以及IL21R和IL21的嵌合蛋白。本发明还公开了该嵌合蛋白的缀合物、药物组合物、核酸分子、表达载体、宿主细胞、生产方法、试剂盒，以及其用途。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域。具体而言，本发明涉及一种用于构建嵌合蛋白的嵌合区域、构建方法、嵌合蛋白、制备方法以及应用，本发明还涉及该嵌合蛋白的衍生物、缀合物、药物组合、核酸分子、表达载体和宿主细胞。
背景技术
细胞因子(cytokine，CK)是细胞产生的低分子量可溶性蛋白质，按照其功能可分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。细胞因子通过结合细胞表面相应的细胞因子受体，介导细胞内信号转导而发挥多种生物学功能，包括免疫调节、血细胞生成、细胞生长以及损伤组织修复等。因此基于细胞因子的药物是药物开发中的重要领域。然而许多天然的细胞因子并不适合作为药物。因为一种细胞因子通常可结合多种表达在不同细胞表面的多种受体，传递着不同的信号，另外同一种受体也可以结合不同的细胞因子，这导致细胞因子的作用具有多效性、重叠性、拮抗性、协同性等多种生理特性。临床治疗中需要特定激活细胞因子参与的一个特异信号，而不激活不必要的信号，进一步执行预期功能，而达到治疗效果好而毒副作用小的目的。细胞因子受体绝大多数是跨膜蛋白，由胞外域、跨膜区和胞浆区组成。
例如，以白细胞介素2为例，白细胞介素2(Interleukin-2，IL-2)也称作T细胞生长因子(TCGF)，是一种15.5kDa球状糖蛋白，它具有133个氨基酸的长度。IL-2的结构由四个反平行的、两亲性的α螺旋和一些链接序列(loop)组成(Smith，Science240，1169-76(1988)；Bazan，Science257，410-413(1992))。IL-2主要来源于活化的CD4+T细胞、活化的CD8+T细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞和巨噬细胞，可通过与细胞表面的IL-2受体结合来调节其作用。
IL-2受体是由三个亚基组成的复合体，三个亚基分别为IL-2Rα(即CD25)、IL-2Rβ(即CD122)和IL-2Rγ(即CD132)。这三个亚基的表达以及他们与IL-2的亲和力各不相同。其中IL-2Rβ亚基和IL-2Rγ亚基形成的异源二聚IL-2受体主要由细胞毒性CD8+T细胞和NK细胞表达，与IL-2中等亲和力结合，称为中等亲和力IL-2受体(IL-2Rβγ)。由IL-2Rα亚基、IL-2Rβ亚基和IL-2Rγ亚基形成的异源三聚IL-2受体主要表达在调节性T细胞(Treg)(Byman，0.和Sprent.J.Nat.Rev.Immunol.12，180-190(2012))，并与IL-2高亲和性结合(亲和力比二聚体受体高约100倍)，称为高亲和力IL-2受体(IL-2Rαβγ)。另外发现一些内皮细胞表面也有IL-2的受体α(CD25)亚基的表达。IL-2Rβ和IL-2Rγ是IL-2激活下游信号通路所必需的，当IL-2同时结合IL-2Rβ和IL-2Rγ时，两个受体亚基形成异源二聚体，磷酸化细胞内的STAT5，进入细胞核导致相应的基因转录和表达；IL-2Rα并非信号所必需，但可以促进IL-2与IL-2Rβ和IL-2Rγ的结合。IL-2Rγ在所有免疫细胞中均有表达；IL-2Rβ在CD8+T细胞、NK细胞、调节性T细胞中均有表达，而且在T细胞被激活后还会提升表达水平；IL-2Rα在调节性T细胞持续高表达，在被激活的CD8+T细胞中会有短暂表达，随即下调表达水平。由于静息状态的效应T细胞和NK细胞在细胞表面上没有IL-2Rα，故对于IL-2相对不敏感。而Treg细胞在体内一贯表达最高水平的IL-2Rα，因此，正常情况下IL-2会优先剌激Treg细胞增殖。
IL-2在体内具有扩充淋巴细胞群体和提高这些细胞的效应器的功能，尤其是对CD8+T细胞和NK细胞的增殖和活化赋予了IL-2的抗肿瘤能力。IL-2是历史上第一个用于肿瘤免疫治疗的细胞因子，抗肿瘤作用已得到临床证实。高剂量IL-2治疗已经批准用于具有转移性肾细胞癌和恶性黑素瘤的患者。经过多年的临床应用，人们对于IL-2的认识更加深入，IL-2的临床应用也带来了诸多问题。
首先与IL-2免疫疗法有关的一项担忧是由重组人IL-2治疗产生的副作用。接受高剂量IL-2治疗的患者发生血管(或毛细血管)渗漏综合征(VLS)，血管通透性的一种病理性升高，导致多个器官中的流体外渗(引起例如肺和皮肤水肿和肝细胞损伤)和血管内流体消减(引起血压下降和心率补偿性升高)。除了IL-2停药以外，VLS没有治疗。研究发现，发生VLS可能与IL-2与内皮细胞表达的IL-2RA结合有关(Kriegetal.，ProcNatAcadSciUSA107，11906-11(2010))。其次，由于IL-2与高表达在抑制性调节T细胞(Treg)的高亲和力IL-2受体结合，而维持外周Treg细胞的数量和活性(MaloyandPowrie，NatureImmunol6，1171-72(2005))。Treg细胞遏制效应T细胞破坏它们的靶物；或是经由细胞-细胞接触抑制T细胞辅助和激活；或是经由释放免疫遏制性细胞因子，诸如IL-10或TGF-β，消减IL-2诱导的抗肿瘤免疫力(Imaietal.，CancerSci98，416-23(2007))。另外，由于IL-2的分子量较小，其在体内的半衰期短，需要持续给药才能维持体内高浓度的IL-2。
抑制IL-2与高亲和力IL2受体(IL-2Rαβγ)的结合，保留或增强与中等亲和力IL2受体(IL-2Rβγ)的结合，并延长其半衰期是克服IL-2在肿瘤免疫治疗中问题的关键。现在已经有多种方法被开发来克服这些与IL-2免疫疗法有关的问题。例如，通过IL-2突变体来改变IL-2对不同受体的亲和特异性。如Merck公司的突变体(R38W，F42K，WO2008003473A2)，降低与α受体亚基的相互作用，以其达到效应T细胞活化以增强功效；而Roche的IL-2突变体(F42A，Y45A和L72G，US2016/0208017A1)，其与α受体不结合，但可以正常结合β和γ受体亚基复合物，并可以发挥效应，目前正在临床中。还有一些方法通过开发IL-2的抗体封闭IL-2与IL-2Rα的结合，而保留与IL-2Rβγ的结合。但目前这些开发大部分都处于研究阶段，临床上仍需要具有偏向性激活IL-2Rβγ的IL-2或衍生物用于肿瘤免疫治疗。
因此，开发出能够偏向性激活中等亲和力IL2受体(IL-2Rβγ)的长效型细胞因子或蛋白，进而更好地作为临床药物，特别是用于肿瘤免疫治疗，十分必要。
再比如IL-15是IL-2家族的另一具有抗肿瘤活性的成员，其受体由三个受体亚基组成：IL-15受体α(IL15RA或IL-15Rα)、IL-2受体β(IL-2Rβ，也称IL-15Rβ或CD122)和γc(也称CD132)。IL-15与IL-2结构十分相似，同属于螺旋型细胞因子家族。IL-15的异三聚体受体与IL-2受体共用IL-2R/IL-15Rβ(CD122)和共同γc链(CD 132)。
IL-15Rα作为IL-15受体复合物的独特组分，主要在单核细胞和树突状细胞上表达。与其他γc家族细胞因子不同的是，IL-15作为细胞因子首先与IL-15Rα表达细胞结合，然后，IL-15/IL-15Rα复合物递呈给激活的T细胞或NK细胞上的IL-2/15Rβ和γc。这使得IL-15的活性受到限制。IL-15突变体(IL-15N72D)和IL-15RαSu/Fc的二聚体蛋白，已被证明在小鼠模型中具有优异的抗肿瘤活性。但仍然存在清除率高，激活外周免疫细胞而产生毒性等缺点。临床使用中，需要具有可以直接结合IL-15Rβγ受体、并可以直接激活T细胞/NK细胞、同时避免刺激调节性T细胞(Treg)的偏向型IL-15。
IL-21于2000年被首次发现，属于细胞因子受体γ链家族，是一种四α螺旋束I型细胞因子。IL-21主要由活化的CD4+T细胞、NK细胞、TFH细胞、Th17细胞分泌。它通过由IL-21R和普通γ链/IL-2Rγ(也称CD132)组成的受体复合体发出信号。临床中，需要对IL-21R亲和力减弱的IL-21，以更好的避免潜在的毒性问题。
鉴于细胞因子在治疗应用中普遍存在功能多样性和活性受限的问题，亟需发展功能偏向性细胞因子的构建方法，以便于解决临床应用中的问题。本发明提供了一种具有偏向性细胞因子功能的嵌合蛋白及其构建方法，基于此平台可以构建功能偏向型细胞因子以克服细胞因子成药过程中的问题。
发明内容
本发明的目的在于构建一种包括细胞因子和细胞因子受体的嵌合蛋白，从而使该嵌合蛋白可以偏向性结合其他细胞因子受体，进而发挥特异性功能，可以用于临床药物。
第一方面，本发明提供了一种用于构建嵌合蛋白的嵌合区域和构建方法，在一些实施方案中，所述的嵌合区域位于细胞因子受体胞外域的柔性连接区，通过在柔性连接区内直接或间接(通过接头元件)嵌入细胞因子，进而达到构建嵌合蛋白的目的。
在一些实施方案中，嵌合区域位于细胞因子的柔性连接区，通过在柔性连接区内直接或间接(通过接头元件)嵌入细胞因子受体胞外域，进而达到构建嵌合蛋白的目的。
第二方面，基于上述构建嵌合蛋白的嵌合区域，本发明提供了一种嵌合蛋白，该嵌合蛋白包括细胞因子以及细胞因子受体胞外域；该嵌合蛋白充分利用细胞因子受体胞外域是天然存在的可以拮抗细胞因子和其自身相互作用的拮抗剂特性，通过将细胞因子与细胞因子受体胞外域嵌合成嵌合蛋白，从而使嵌合蛋白偏向性结合其他细胞因子受体，进而发挥特异性功能。
在一些具体的实施方案中，细胞因子嵌入到细胞因子受体胞外域的嵌合区域中，所述嵌合区域位于细胞因子受体胞外域柔性连接区，所述的嵌合蛋白从N端到C端具有如下所示的多肽结构式：
C1-I-C2；
式中C1为细胞因子受体胞外域嵌合区域中任一嵌合位点前或后的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物，C2为细胞因子受体胞外域中除C1外的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物；I为细胞因子或者细胞因子的变体、改造体、截断体或衍生物。
其中，所述的C1、C2至少含有三个氨基酸，或者至少含有一个独立的蛋白质二级结构单元，如α螺旋或者β折叠等。
进一步的，在一些实施方式中，所述的C1和C2通过接头元件间接同I连接；所述的嵌合蛋白从N端到C端具有如下所示的多肽结构式：C1-L1-I-L3-C2；上述式中L1，L3为各自独立的接头元件。
在一些实施方式中，多肽结构式C1-L1-I-L3-C2中的I在其嵌合位点前或者后的两部分氨基酸序列I1和I2通过接头元件L2连接，即嵌合蛋白从N端到C端具有如下所示的多肽结构式：C1-L1-I1-L2-I2-L3-C2；式中I1为细胞因子嵌合区域中任一嵌合位点前或后的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物，I2为细胞因子中除I1外的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物。
在一些具体的实施方案中，可以是细胞因子受体胞外域嵌入到该细胞因子的嵌合区域中，所述的嵌合区域位于细胞因子柔性连接区；所述的嵌合蛋白从N端到C端具有如下所示的多肽结构式：
I1-C-I2；
式中I1为细胞因子嵌合区域中任一嵌合位点前或后的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物，I2为细胞因子中除I1外氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物；C为细胞因子受体胞外域或者细胞因子受体胞外域的变体、改造体、截断体或衍生物。
其中，I1、I2至少含有三个氨基酸，或者至少含有一个独立的蛋白质二级结构单元，如α螺旋或者β折叠等。
进一步的，所述的I1和I2通过接头元件间接同C连接，所述的嵌合蛋白从N端到C端具有如下所示的多肽结构式：I1-L1-C-L3-I2；上述式中L1，L3为各自独立的接头元件。
进一步的，所述的多肽结构式I1-L1-C-L3-I2中的C在其嵌合位点前或者后的两部分氨基酸序列C1和C2通过接头元件L2连接，即嵌合蛋白从N端到C端具有如下所示的多肽结构式：I1-L1-C1-L2-C2-L3-I2；式中C1为细胞因子受体胞外域嵌合区域中任一嵌合位点前或后的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物，C2为细胞因子受体胞外域中除C1外的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物。
上述实施例中，接头元件L1、L2、L3可以是相同或不同序列，其可选自序列SEQ IDNO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:18，或其他本领域常用的、具有类似功能的接头元件。
在一些实施方式中，嵌合蛋白还包括免疫球蛋白Fc区，Fc区可以连接在嵌合蛋白的N端也可以放C端，可以直接连接也可以通过接头元件间接连接。免疫球蛋白Fc区可以使所述分子形成二聚体，同时延长所述分子的体内半衰期。可用于本发明的Fc区可以来自不同亚型的免疫球蛋白，例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM。在一些实施方案中，可以在野生型的Fc序列上引入突变用于改变Fc介导的相关活性。所述突变包括但不限于：a).改变Fc介导的CDC活性的突变；b).改变Fc介导的ADCC活性的突变；或c).改变FcRn介导的体内半衰期的突变。此类突变描述于下列文献中：LeonardGPresta，CurrentOpinioninImmunology2008，20:460-470；EsoheE.Idusogieetal.，JImmunol2000，164:4178-4184；RAPHAELA.CLYNESetal.，NatureMedicine，2000，Volume6，Number4:443-446；PaulR.Hintonetal.，JImmunol，2006，176:346-356。
在一些实施方案中，Fc序列上可以引入突变，从而使得突变的Fc更容易形成同二聚体或者异二聚体。如Ridgway，Prestaetal.1996以及Carter2001中提到的利用Fc接触界面氨基酸侧链基团空间作用的knob-hole模型，使得不同Fc突变之间更容易形成异二聚体；再比如如CN102558355或者CN103388013A中，通过改变Fc接触界面氨基酸所带的电荷，进而改变Fc接触界面之间的离子相互作用力，使得不同的Fc突变对之间更容易形成异二聚体(CN102558355A)，亦或是具有相同突变的Fc之间更容易形成同二聚体(CN103388013A)。
在一些具体的实施方案中，免疫球蛋白Fc区优选是人免疫球蛋白Fc区，更优选是人IgG1的Fc区。在一些具体实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列示于SEQ IDNO:20。
在一些具体的实施方案中，还包括该嵌合蛋白的衍生物。
在一些具体的实施方案中，所述的细胞因子受体为CD25，所述的细胞因子为IL-2，IL-2嵌入到CD25胞外域的嵌合区域中嵌合成CD25/IL-2嵌合蛋白。该CD25/IL-2嵌合蛋白或其衍生物具有以下特征中的至少一个：
(a)能够自然形成类似于IL-2与CD25结合的三维构象；
(b)与野生型IL-2相比，很大程度降低与CD25的结合或与CD25不结合；
(c)与野生型IL-2相比，能够保留或增强与CD122的结合；
(d)与野生型IL-2相比，分子量更大，体内半衰期更长；
(e)能够有效激活中等亲和力IL-2受体(IL-2Rβγ)介导的信号；
(f)促进CD8+T细胞和NK细胞的活化；
(g)促进免疫细胞杀伤肿瘤细胞。
在一些具体的实施方案中，所述的细胞因子受体为CD25，所述的细胞因子为IL-2，CD25胞外域嵌入到IL-2的嵌合区域中，嵌合成IL2/CD25嵌合蛋白。该IL2/CD25嵌合蛋白或其衍生物具有以下特征中的至少一个：
(a)能够自然形成类似于IL-2与CD25结合的三维构象；
(b)与野生型IL-2相比，分子量更大，体内半衰期更长。
在一些具体的实施方案中，所述的细胞因子受体为IL15RA，所述的细胞因子为IL-15，嵌合成IL15RA/IL-15嵌合蛋白。该IL15RA/IL-15嵌合蛋白或其衍生物具有以下特征中的至少一个：
(a)能够自然形成类似于IL-15与IL15RA结合的三维构象；
(b)与野生型IL-15相比，分子量更大，体内半衰期更长。
(c)与野生型IL-15相比，很大程度降低与IL15RA的结合；
(d)与野生型IL-15相比，能够保留或增强与IL15Rβ(CD122)的结合；
(e)促进NK细胞的活化。
在一些具体的实施方案中，所述的细胞因子受体为IL-21R，所述的细胞因子为IL-21，嵌合成IL-21RA/IL-21嵌合蛋白。该IL-21RA/IL-21嵌合蛋白或其衍生物具有以下特征中的至少一个：
(a)能够自然形成类似于IL-21与IL21RA结合的三维构象；
(b)与野生型IL-21相比，分子量更大，体内半衰期更长。
第三方面，本发明提供一种缀合物，包括上述的嵌合蛋白或其衍生物，所述嵌合蛋白或其衍生物直接或通过接头元件间接地与其他模块连接。
一些实施例中，所述的其他模块包括抗原结合模块、细胞毒素、放射性同位素、生物活性蛋白质、可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、酶金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、中任一种或其组合。
更优选地，所述抗原结合模块是抗体或抗原结合片段；最优选地，所述抗体或抗原结合片段靶向肿瘤细胞上或肿瘤细胞环境中呈现的抗原。
一些实施方式中，所述抗原结合模块靶向肿瘤细胞上呈现的或肿瘤细胞环境中的抗原。一些实施方式中，所述抗原结合模块靶向功能细胞(例如CD8+T细胞、NK细胞、CIK细胞、TIL细胞、巨噬细胞、DC细胞等)上的抗原。
一些实施方式中，嵌合蛋白连接于至少一个其他模块。一些实施方式中，嵌合蛋白和其他模块形成融合蛋白，即嵌合蛋白与其他模块共享肽键。一些实施方式中，嵌合蛋白连接于至少一个其他模块，例如第一和第二其他模块。一些实施方式中，其他模块为抗原结合模块。一些实施方式中，嵌合蛋白与第一抗原结合模块共享氨基或羧基端肽键，且第二抗原结合模块与以下共享氨基或羧基端肽键：i)嵌合蛋白或ii)第一抗原结合模块。一些具体的实施方式中，嵌合蛋白与所述第一其他模块共享羧基端肽键，而与所述第二其他模块共享氨基末端肽键。一些实施方式中，所述其他模块是抗原结合模块。所述抗原结合模块可以是抗体或抗原结合片段，包括但不限于免疫球蛋白分子(例如IgG(例如IgG1)类免疫球蛋白分子)、抗体或其抗原结合片段。一些具体实施方式中，抗体或抗原结合片段选自包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区的多肽复合物、Fab、Fv、sFv、F(ab’)2、线性抗体、单链抗体、scFv、sdAb、sdFv、纳米抗体、肽抗体peptibody、结构域抗体、多特异性抗体(双特异性抗体、diabody、triabody和tetrabody、串联二-scFv、串联三-scFv)、受体结合区和相互作用蛋白结合区。在嵌合蛋白连接于超过一个抗原结合模块例如第一和第二抗原结合模块的情况下，每个抗原结合模块可以独立地选自各种形式的抗体和抗原结合片段，例如，第一抗原结合模块可以是纳米抗体分子，而第二抗原结合模块可以是scFv分子，或第一和第二抗原结合模块中的每一个都是纳米抗体分子，或第一和第二抗原结合模块中的每一个是Fab分子。一些实施方式中，在嵌合蛋白连接于超过一个抗原结合模块例如第一和第二抗原结合模块的情况下，能独立地选择每个抗原结合模块所针对的抗原，例如，所述第一和所述第二抗原结合模块针对不同的抗原或针对同一抗原。
一些实施方式中，所述抗原结合模块结合的抗原可以选自下组：生腱蛋白C的A1域(TNCA1)、生腱蛋白C的A2域(TNCA2)、纤连蛋白的外域(ExtraDomainB)(EDB)、癌胚抗原(CEA)和黑素瘤有关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)。一些实施方式中，肿瘤抗原包括但不限于MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环素(cyclophilin)b、结肠直肠有关的抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、前列腺特异性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、T细胞受体/CD3-zeta链、肿瘤抗原的MAGE家族(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGEB4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、肿瘤抗原的GAGE家族(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4，GAGE-5，GAGE-6，GAGE-7，GAGE-8，GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-胎蛋白、E-钙粘蛋白、α-连环蛋白(catenin)、β-连环蛋白和γ-连环蛋白、p120ctn、gp100Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤样结肠息肉蛋白(adenomatouspolyposiscoliprotein，APC)、胞衬蛋白(fodrin)、连接蛋白(Connexin)37、Ig独特型、p15、gp75、GM2和GD2神经节苷脂、病毒产物如人乳头状瘤病毒蛋白、肿瘤抗原的Smad家族、lmp-1、P1A、EBV编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7、以及c-erbB-2。一些实施方式中，病毒抗原的非限制性例子包括流感病毒血凝素、Epstein-Barr病毒LMP-1、丙肝病毒E2糖蛋白、HIVgp160和HIVgp120。一些实施方式中，ECM抗原的非限制性例子包括多配体聚糖(syndecan)、类肝素酶(heparanase)、整联蛋白、骨桥蛋白(osteopontin)、link、钙粘蛋白、层粘连蛋白、EGF型层粘连蛋白、凝集素、纤连蛋白、notch、生腱蛋白和matrixin。
第四方面，本发明公开了一种药物组合物，包括上所述的嵌合蛋白或其衍生物或上述的缀合物以及药学上可接受的稀释剂、载体或助剂。所述药物组合物可以为冻干制剂或可注射溶液。
第五方面，本发明提供了一种编码上述嵌合蛋白或其衍生物的核酸分子。本发明的核酸可为RNA、DNA或cDNA。
在一个实施例中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
在另一个实施例中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；
在另一个实施例中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；
第六方面，本发明提供含有上述嵌合蛋白或其衍生物的核酸序列的表达载体。所述载体可以是真核表达载体、原核表达载体、病毒载体。
在一个实施例中，表达载体上的CD25/IL-2嵌合蛋白可以包含N端信号肽序列，如序列SEQ ID NO:19，C端含铰链区的Fc序列，如序列SEQ ID NO:20。
在一些实施方案中，所述的表达载体是病毒载体，可以产生具有生理功能的病毒，如常见的一些溶瘤病毒：单纯疱疹病毒(HSV)、腺病毒、牛痘病毒和呼肠弧病毒等。
第七方面，本发明涉及表达或能够表达一种或多种本发明的嵌合蛋白和/或含有本发明的核酸或载体的宿主细胞。本发明的优选宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
适合的细菌细胞包括但不限于革兰氏阴性细菌菌株(例如大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株、变形杆菌属(Proteus)菌株及假单胞菌属(Pseudomonas)菌株)及革兰氏阳性细菌菌株(例如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株、链霉菌属(Streptomyces)菌株、葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株及乳球菌属(Lactococcus)菌株)的细胞。
适合的真菌细胞包括但不限于木霉属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)及曲菌属(Aspergillus)的物种的细胞；或者包括酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe))、毕赤酵母属(Pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)及嗜甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica))及汉森酵母属(Hansenula)的物种的细胞。
适合的哺乳动物细胞包括但不限于HEK293细胞、CHO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞等。
然而，本发明也可使用两栖类细胞、昆虫细胞、植物细胞及本领域中用于表达异源蛋白的任何其他细胞。
一些实施方案中，所述的宿主细胞是能够表达本发明的嵌合蛋白或其衍生物的功能细胞(如：CAR-T、CAR-NK、CD8+T细胞、NK细胞、CIK细胞、TIL细胞、巨噬细胞、DC细胞等)，所述的功能细胞具有以下任一种或多种生理功能：肿瘤杀伤、病原清除、免疫效应等。
第八方面，本发明提供了本发明所述嵌合蛋白或其衍生物、核酸分子、宿主细胞、免疫缀合物及药物组合物用于制备治疗相关疾病(如增生性疾病、免疫性疾病等)、调节T细胞介导的免疫应答、刺激个体免疫系统的药物中的用途。所述增生性疾病可以是肿瘤或癌(例如转移性肿瘤或癌)，可以是实体瘤(例如转移性肾细胞癌和恶性黑素瘤)。
一些实施方式中，本发明公开的嵌合蛋白或其衍生物、免疫缀合物、药物组合可用于治疗刺激宿主的免疫系统以获益的疾病情形，特别是期望增强细胞免疫应答的状况，可以包括宿主免疫应答不足或缺陷性的疾病情形。一些实施方式中，施嵌合蛋白或其衍生物、免疫缀合物的疾病情形包括细胞免疫应答是特异性免疫的关键机制的肿瘤或感染，例如癌症(例如肾细胞癌或黑素瘤)、免疫缺陷(例如HIV阳性患者中、免疫受抑制的患者)、慢性感染等。一些实施方式中，增强细胞免疫应答可以包括以下任一种或多种：免疫功能的一般升高、T细胞功能升高、B细胞功能升高、淋巴细胞功能的恢复、IL-2受体表达提高、T细胞应答性提高、天然杀伤细胞活性或淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞活性升高等。
一些实施方式中，本发明公开的嵌合蛋白或其衍生物、免疫缀合物、药物组合用于治疗的疾病是增殖性病症，例如癌症。癌症的非限制性例子包括膀胱癌、脑癌、头和颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血液癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌和肾癌。其它可使用本公开的嵌合蛋白或其衍生物治疗的细胞增殖病症包括但不限于位于以下处的新生物：腹部、骨、乳房、消化系统、肝、胰、腹膜、内分泌腺(肾上腺、副甲状腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头和颈、神经系统(中枢和外周)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸部、和泌尿生殖系统。还包括癌症前期状况或损伤以及癌症转移。在某些实施方式中，癌症选自下组：肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、脑癌、头和颈癌。类似地，其它细胞增殖病症也可用本公开的嵌合蛋白或其衍生物治疗，包括但不限于：高丙种球蛋白血症(hypergammaglobulinemia)、淋巴增生性病症、病变蛋白血症(paraproteinemias)、紫癜(purpura)、结节病、塞扎里综合征(SezarySyndrome)、Waldenstron's巨球蛋白血症、高歇氏病(Gaucher'sDisease)、组织细胞增多病(histiocytosis)以及任何其它位于上文所列的器官系统中的瘤形成(neoplasia)外的细胞增殖疾病。在另一些实施方式中，所述疾病涉及自身免疫性、移植排斥、外伤后免疫应答和传染性疾病(例如HIV)。
一些实施方式中，提供其中每日至少2次、每日至少1次、每48小时至少1次、每72小时至少一次、每周至少一次、每2周至少一次、每个月至少一次、每2个月至少一次或每3个月至少一次向受试者施用嵌合蛋白或其衍生物、免疫缀合物的方法。可通过任何有效途径施用嵌合蛋白或其衍生物、免疫缀合物。在一些实施方式中，通过肠胃外注射包括皮下注射施用嵌合蛋白或其衍生物、免疫缀合物。具体实施方式涉及包含药学上可接受的量的嵌合蛋白或其衍生物、免疫缀合物(例如，治疗有效量)(包括上述的那些试剂)连同一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂(例如，等渗注射溶液)的药物组合物。所述药物组合物通常为适于人施用的药物组合物。此外，在一些实施方式中，所述药物组合物包含至少一种另外的预防剂或治疗剂。一些实施方式含有上述药物组合物之一和任选地一种或多种另外的组分的无菌容器。
第九方面，本发明提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包含本发明的嵌合蛋白、其衍生物、缀合物、药物组合物、核酸分子、表达载体或宿主细胞，以及使用说明。试剂盒一般包括表明试剂盒内容物的预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或以其他方式随试剂盒提供的任何书面的或记录的材料。
第十方面，本发明提供了一种嵌合蛋白或其衍生物的构建和生产方法，包括在适于表达所述嵌合蛋白或其衍生物的条件下或使用前述核酸分子，或使用前述表达载体，或使用前述宿主细胞进行表达。
附图说明
图1为CD25与IL-2嵌合蛋白的嵌合区域和位点(CD25胞外域的嵌合区域)。
图2为CD25与IL-2嵌合蛋白的嵌合区域和位点(IL-2的嵌合区域)。
图3为CD25/IL-2chimera1嵌合蛋白的示意图和预测三维构象。
图4为CD25/IL-2chimera2嵌合蛋白的示意图和预测三维构象。
图5为CD25/IL-2chimera3嵌合蛋白的示意图和预测三维构象。
图6为CD25/IL-2嵌合蛋白的表达纯化。
图7为CD25/IL-2嵌合蛋白与CD25的结合情况。
图8为Human IL-2-Fc和CD25的结合情况。
图9为CD25/IL-2嵌合蛋白与CD122的结合情况(柱形图)。
图10为CD25/IL-2嵌合蛋白与CD122的结合情况(曲线图)。
图11为CD25/IL-2嵌合蛋白刺激NK92细胞激活p-STAT5情况。
图12为CD25/IL-2嵌合蛋白刺激CD8+T细胞激活p-STAT5情况。
图13为CD25/IL-2嵌合蛋白促进免疫细胞杀伤肿瘤细胞情况。
图14为IL-2/CD25 chimera嵌合蛋白的示意图和预测三维构象。
图15为IL15RA/IL-15chimera嵌合蛋白的示意图和预测三维构象。
图16为IL15RA/IL-15chimera嵌合蛋白与IL15RA的结合情况。
图17为IL15RA/IL-15chimera嵌合蛋白与IL15Rβ(CD122)的结合情况。
图18为IL15RA/IL-15chimera嵌合蛋白刺激NK92细胞激活p-STAT5情况
图19为IL21R/IL-21chimera嵌合蛋白的示意图和预测三维构象。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本发明中的它处另有明确定义，否则本发明使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义，参考例如标准手册，如Sambrook等人，“MolecularCloning:ALaboratoryManual”(第2版)，第1-3卷，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)；Lewin，“GenesIV”，OxfordUniversityPress，NewYork，(1990)；及Roitt等人，“Immunology”(第2版)，GowerMedicalPublishing，London，NewYork(1989)，以及本文中引用的一般现有技术；此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解，亦参考例如标准手册、上述一般现有技术及其中引用的其他参考文献。
术语
“嵌合蛋白”是指蛋白包括最初来源于两个不同来源(例如细胞因子或细胞因子受体胞外域)的氨基酸序列。举例而言，嵌合蛋白可以包括来自至少两种天然存在的不同人蛋白质的结构域。在一些实例中，嵌合蛋白可包括作为合成序列的结构域和来源于天然存在的蛋白质(例如天然存在的人蛋白质)的结构域。在一些实施例中，嵌合蛋白可以包括至少两个不同的作为合成序列的结构域。本发明所述“嵌合体”，“嵌合蛋白”可以互换使用。
“细胞因子”(cytokine，CK)旨在被广义地解释，是细胞产生的低分子量可溶性蛋白质，按照其功能可分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。细胞因子是一种蛋白多肽，在细胞信号通路中起重要的作用。在本发明中，细胞因子涵盖最广义的范畴，例如蛋白类激素分子也包含在本发明所指的细胞因子范围中。该术语涵盖未加工的细胞因子以及源自细胞中的加工的任何形式的细胞因子。该术语还涵盖天然存在的细胞因子变体，例如剪接变体或等位变体。该术语还涵盖具有类似功能的人工改造的细胞因子变体、改造体、截断体。
“细胞因子受体胞外域”旨在被广义地解释，包括上文术语中所述的细胞因子的受体胞外域。该术语涵盖未加工的细胞因子受体胞外域以及源自细胞中的加工的任何形式的细胞因子受体胞外域。该术语还涵盖天然存在的细胞因子受体胞外域的变体，例如剪接变体或等位变体。该术语还涵盖具有类似功能的人工改造的细胞因子受体胞外域的变体、改造体、截断体。
“柔性连接区”旨在被广义地解释，包括：连接蛋白质二级结构(α螺旋和/或β折叠等)之间的连接序列、连接二级结构折叠成的结构域之间的柔性连接序列等，如：各种类型的环(loop)、转角等。
“白介素-2”或“IL-2”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物如灵长类(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的任何天然的IL-2。该术语涵盖未加工的IL-2以及源自细胞中的加工的任何形式的IL-2。该术语还涵盖天然存在的IL-2变体，例如剪接变体或等位变体。该术语还涵盖具有类似功能的IL-2变体、改造体、截断体。例示性野生型人IL-2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。未加工的人IL-2额外包含N端20个氨基酸的信号肽(参见UniProt条目号：P60568)，所述信号肽在成熟的IL-2分子中是缺乏的。本发明中，“白介素-2”、“白介素2”、“白细胞介素-2”、“白细胞介素2”“IL2”和“IL-2”可以互换使用。
“CD25”或“IL-2受体的α亚基”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物如灵长类(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的任何天然CD25，包括“全长”的未加工的CD25以及源自细胞中的加工的任何形式的CD25，还包括天然存在的CD25变体，例如剪接变体或等位变体。该术语还涵盖具有类似功能的CD25变体、改造体、截断体。在某些实施方案中，CD25是人CD25(参见UniProt条目号：P01589)，其胞外域例示性序列如SEQ ID NO：1所示。本发明所述的“CD25”与“IL-2Rα”以及“IL-2受体的α亚基”可以互换使用。
本发明所述的CD25和IL-2均不包括信号肽序列，除去信号肽后的第一个氨基酸为第1位的氨基酸。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述，是本领域中公知且达成一致的标准。
CD25和IL-2的变体包括其突变体，所述突变体包括CD25或IL-2的氨基酸取代、缺失、插入、修饰及其任意组合。
同源肽段指来自不同物种的同源蛋白质上序列和功能类似的肽段。
“衍生物”旨在被广义地解释，包括任意靶标蛋白相关的产品。包括但不限于人和非人的靶标蛋白同系物、片段或截短体、融合蛋白(如与信号肽融合或其他活性、非活性成份融合，活性成份例如抗体或其抗原结合片段)、修饰形式(如PEG化、糖基化、白蛋白缀合/融合、Fc缀和/融合、羟乙基化等)、和保守修饰的蛋白等。
“免疫缀合物”是一种特定的缀合物，其包含至少一个嵌合蛋白或其衍生物和至少一个抗原结合模块。在某些实施方式中，所述免疫缀合物包含至少一个嵌合蛋白或其衍生物和至少两个抗原结合模块。依照本发明的具体的免疫缀合物基本由通过一种或多种接头序列连接的一个嵌合蛋白或其衍生物和抗原结合模块组成。可以通过多种相互作用并以多种构造将抗原结合模块与嵌合蛋白或其衍生物连接。
“抗体”在本文中以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，只要它们展现出期望的抗原结合活性，所述抗体包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗原结合片段。抗体可以包括鼠源抗体、人抗体、骆驼抗体、鲨鱼抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重链抗体、纳米抗体、单域抗体等。例示性的，抗体可以是免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。
“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，单链Fv(即sFv)，纳米抗体(即VHH)，VH/VL结构域。Fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗原结合片段。一般地，Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体(singlechainantibody)或单链Fv(sFv)。
在比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指与另一序列相比，在参考序列某一位置处指定数目氨基酸残基的插入、缺失或取代。在取代的情况下，所述取代将优选为保守氨基酸取代，所述保守氨基酸是指氨基酸残基被化学结构类似的另一氨基酸残基置换，且其对多肽的功能、活性或其他生物性质影响较小或基本上无影响。所述保守氨基酸取代在本领域中是公知的，例如保守氨基酸取代优选是以下组(i)-(v)内的一个氨基酸被同一组内的另一氨基酸残基所取代：(i)较小脂族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(ii)极性带负电残基及其(不带电)酰胺：Asp、Asn、Glu及Gln；(iii)极性带正电残基：His、Arg及Lys；(iv)较大脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(v)芳族残基：Phe、Tyr及Trp。特别优选的保守氨基酸取代如下：Ala被Gly或Ser取代；Arg被Lys取代；Asn被Gln或His取代；Asp被Glu取代；Cys被Ser取代；Gln被Asn取代；Glu被Asp取代；Gly被Ala或Pro取代；His被Asn或Gln取代；Ile被Leu或Val取代；Leu被Ile或Val取代；Lys被Arg、Gln或Glu取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Phe被Met、Leu或Tyr取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Trp或Phe取代；Val被Ile或Leu取代。
两个多肽序列之间的“序列相同性”指示序列之间相同氨基酸的百分比。“序列相似性”指示相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列相同性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列相同性通常使用序列分析软件来测量。例如，可使用NCBI数据库的BLAST程序来确定相同性。对于序列相同性的确定，可以参见例如：ComputationalMolecularBiology，Lesk，A.M.，ed.，OxfordUniversityPress，NewYork，1988，Biocomputing:Informatics，and，Genome，Projects，Smith，D.W.，ed.，AcademicPress，NewYork，1993；ComputerAnalysisofSequenceData，PartI，Griffin，A.M.，andGriffin，H.G.，eds.，HumanaPress，NewJersey，1994；SequenceAnalysisinMolecularBiology，vonHeinje，G.，AcademicPress，1987和SequenceAnalysisPrimer，Gribskov，M.andDevereux，J.，eds.，MStocktonPress，NewYork，1991。
“载体”是指可以在其中插入多核苷酸的核酸媒介物。当载体允许插入其中的多核苷酸编码的蛋白质的表达时，该载体称为表达载体。该载体可以通过转化、转导或转染入宿主细胞而使携带的遗传物质元件在宿主细胞中表达。载体是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于质粒，噬菌体，粘粒，人工染色体如酵母人工染色体(YAC)，细菌人工染色体(BAC)或P1衍生人工染色体(PAC)，噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体和动物病毒。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)，腺病毒，腺相关病毒，疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)，痘病毒，杆状病毒，乳头瘤病毒，乳多空病毒(如SV40)。载体可以包含用于控制表达的多个元件，包括但不限于启动子序列，转录起始序列，增强子序列，选择元件和报道基因。另外，载体可以包含复制起点。
“宿主细胞”和“宿主细胞系”可交换使用并指已引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括初始转化的细胞和自其衍生的后代(不考虑传代数)。后代在核酸内含物上可能与亲本细胞不完全相同，但可以含有突变。本文中包括具有与原始转化细胞中所筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的突变后代。“宿主细胞”包括但不限于原核细胞如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，真核细胞如酵母细胞或曲霉属(Aspergillus)，昆虫细胞如S2果蝇细胞或Sf9，以及哺乳动物细胞如成纤维细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK293细胞或人细胞。
下面采用细胞因子IL-2及其受体CD25、IL-15及其受体IL-15RA、IL-21及其受体IL-21R等分子对为实施例，对本发明做进一步说明。
实施例1
CD25/IL-2嵌合蛋白的设计及结构预测
1.1嵌合区域的确定
如前所述，在本具体实施方案中，细胞因子受体为CD25，细胞因子为IL-2。根据PDB数据库中IL-2与其高亲和力受体IL-2Rαβγ的晶体结构(PDBID:2B5I)，我们分析得到在CD25与IL-2结合面及其附近有多个柔性连接区(即loop区)，如图1、图2所示。
CD25胞外域的序列号为SEQ ID NO:1，CD25胞外域的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1进行编号；IL-2的序列号为SEQ ID NO:2，IL-2氨基酸位置根据SEQ ID NO:2进行编号，
在一些实施方案中，嵌合区域位于CD25胞外域：所述的嵌合区域位于CD25胞外域与IL-2作用界面(参照结构PD BID:2B5I)的柔性连接序列区：包括嵌合区Q1和嵌合区Q2：
(a)嵌合区1(如图1所示)位于CD25胞外域(SEQ ID NO:1)上的I37-K38-S39-G40-S41-L42(SEQ ID NO:3)肽段或该肽段的同源肽段或具有与该肽段类似结构和功能的衍生肽段，以及该肽段向前向后各延伸10个氨基酸的肽段(SEQ ID NO:5)；
(b)嵌合区2(如图1所示)位于CD25胞外域(SEQ ID NO:1)上的T150-H151-G152-K153-T154(SEQ ID NO:4)肽段或该肽段的同源肽段或具有与该肽段类似结构和功能的衍生肽段，以及该肽段向前向后各延伸10个氨基酸的肽段(SEQ ID NO:6)。
在一些实施方案中，可以选自(a)和(b)所述肽段上的任意一个氨基酸位点作为嵌合点位，在此位点前/后可以嵌入IL-2的部分肽段，IL-2，IL-2突变体，IL-2改造体，IL-2衍生物等。
在一些具体实施方案中，优选地嵌合位点选自(a)所述的CD25胞外域K38位，如SEQID NO：10-11是基于该嵌合位点构建的两个嵌合蛋白。
在一个实施方案中，优选地嵌合位点选自(b)所述的CD25胞外域H151位，如SEQ IDNO：12是基于该嵌合位点构建的一个嵌合蛋白。
在一些其他实施方案中，嵌合区域位于细胞因子IL-2上：嵌合区域选自IL-2两个相邻α螺旋间的柔性连接序列区(loop区)(如图2所示):
(a)嵌合区3(如图2所示)：IL-2(SEQ ID NO:2)的helixA与helixB间的A’B’loop区T41-F42-K43-F44-Y45-M46-P47-K48-K49-A50-T51(SEQ ID NO:7)或具有与该loop区类似结构和功能的衍生肽段；
(b)嵌合区4(如图2所示)：IL-2(SEQ ID NO:2)的helixB与helixC间的B’C’loop区L72-A73-Q74-S75-K76-N77-F78-H79-L80(SEQ ID NO:8)或具有与该loop区类似结构和功能的衍生肽段；
(c)嵌合区5(如图2所示)：IL-2(SEQ ID NO:2)的helixC与helixD间的C’D’loop区F103-M104-C105-E106-Y107-A108-D109-E110-T111-A112序列(SEQ ID NO:9)或具有与该loop区类似结构和功能的衍生肽段。
在一些实施方案中，可以选自(a)、(b)和(c)所述肽段上的任意一个氨基酸位点作为嵌合位点，在此位点前/后可以嵌入CD25胞外域的部分肽段，CD25胞外域、CD25胞外域突变体，CD25胞外域改造体，CD25胞外域衍生物等。
在一些实施方案中，优选地嵌合位点选自IL-2上C’D’loop区的第F103位点。
在一些实施方案中，优选地嵌合位点选自IL-2上A’B’loop区的第Y45位点。
在一些实施方案中，优选地嵌合位点选自IL-2上B’C’loop区的第N77位点。
1.2嵌合蛋白的构建及结构预测
通过在嵌合区Q1、Q2的任一氨基酸位置的前、后作为嵌合点位，即可得到C1的氨基酸序列可以为如下肽段：E1-R36，或E1-I37，或E1-K38，或E1-S39，或E1-G40，或E1-S41，或E1-L42，或E1-M149，或E1-T150，或E1-H151，或E1-G152，或E1-K153，或E1-T154。
C2的氨基酸序列可以为如下肽段：I37-E217，或K38-E217，或S39-E217，或G40-E217，或S41-E217，或L42-E217，或Y43-E217，或H151-E217，或G152-E217，或K153-E217，或T154-E217，或R155-E217。
C1和C2也可以为上述任一肽段在其他(非人源)物种的同源肽段；或者上述任一肽段的氨基酸序列经过一个或多个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有该肽段类似结构和功能的衍生肽段；或者与上述肽段序列具有至少80％序列相同性的氨基酸序列。
通过在嵌合区Q3-Q5的任一氨基酸位置的前、后作为嵌合点位，即可得到I1的氨基酸序列可以为如下肽段：T41-Y133，F42-Y133，或K43-Y133，或F44-Y133，或Y45-Y133，或M46-Y133，或P47-Y133，或K48-Y133，或K49-Y133，或A50-Y133，或T51-Y133，或L72-Y133，或A73-Y133，或Q74-Y133，或S75-Y133，或K76-Y133，或N77-Y133，或F78-Y133，或H79-Y133，或L80-Y133，或F103-Y133，或M104-Y133，或C105-Y133，或E106-Y133，或Y107-Y133，或A108-Y133，或D109-Y133，或E110-Y133，或T111-Y133，或A112-Y133。
I2的氨基酸序列可以为如下肽段：P2-L40，或P2-T41，或P2-F42，或P2-K43，或P2-F44，或P2-Y45，或P2-M46，或P2-P47，或P2-K48，或P2-K49，或P2-A50，或P2-N71，或P2-L72，或P2-A73，或P2-Q74，或P2-S75，或P2-K76，或P2-N77，或P2-F78，或P2-H79，或P2-T102，或P2-F103，或P2-M104，或P2-C105，或P2-E106，或P2-Y107，或P2-A108，或P2-D109，或P2-E110，或P2-T111。
I1和I2也可以为上述任一肽段在其他(非人源)物种的同源肽段；或者上述任一肽段的氨基酸序列经过一个或多个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有该肽段类似结构和功能的衍生肽段；或者与上述肽段序列具有至少80％序列相同性的氨基酸序列。
通过在柔性连接区内，通过合适长度的接头元件将CD25与IL-2的不同肽段按照本发明中的C1-L1-I1-L2-I2-L3-C2结构式进行嵌合连接。当嵌合位点选自CD25胞外域K38位时，如SEQ ID NO：10-11是基于该嵌合位点构建的两个嵌合蛋白，以及当嵌合位点为CD25胞外域H151位，如SEQ ID NO：12是基于该嵌合位点构建的一个嵌合蛋白。
进一步的，我们按照表1中的组合，嵌合后形成一条多肽链的嵌合体：CD25/IL-2chimera1，CD25/IL-2chimera2，CD25/IL-2chimera3。对这些序列使用Alphafold2预测其蛋白结构(Jumper，Jetal.，Nature(2021)；Varadi，Metal.，NucleicAcidsResearch(2021).)，运行过程中使用提供的完整版本数据库BigFantasticDatabase(BDF)，同时将训练参数--db_preset设置为full_dbs，其他参数为默认参数，使用PyMol查看预测后的蛋白结构。结果显示三个肽段均形成类似于CD25和IL-2结合而成的复合体晶体结构(PDBID：2B5I)，如图3～5所示。
由蛋白结构可知，在这些嵌合蛋白中IL-2结构域的CD25表位已经被CD25结构域完全封闭，由此推测这些CD25/IL-2嵌合蛋白具有潜在的偏向性结合/激活中等亲和力IL-2受体(IL-2Rβγ)而减弱(或者不)结合/激活高亲和力IL-2受体(IL-2Rαβγ)的功能。后续的实施例进一步验证了基于结构的功能推测。
表1.3种嵌合蛋白的肽段和接头的序列
将CD25/IL-2chimera1、CD25/IL-2chimera2、CD25/IL-2chimera3分别加入免疫球蛋白Fc区，得到SEQ ID NO:21(CD25/IL-2chimera1-Fc)、SEQ ID NO:22(CD25/IL-2chimera2-Fc)、SEQ ID NO:23(CD25/IL-2chimera3-Fc)。
实施例二
实验材料准备
表2中提供了实施例3-12中使用的相关实验材料的信息。
表2实验材料
实施例3
CD25/IL-2chimera-Fc嵌合体的表达纯化
3.1载体构建
委托通用生物系统(安徽)有限公司合成CD25/IL-2chimera1(SEQ ID NO:10)和CD25/IL-2chimera3(SEQ ID NO:12)序列到厦门柏慈生物公司用于Expi293F细胞表达、带humanIGG1-Fc标签的载体(LV082-AbV-Human-IGG1-Fc-1GS)中，获得表达CD25/IL-2chimera-Fc的2个表达质粒，分别可以用于后续表达CD25/IL-2chimera1-Fc(SEQ ID NO:21)和CD25/IL-2chimera3-Fc(SEQ ID NO:23)蛋白。
3.2Expi293F哺乳动物细胞表达CD25/IL-2chimera-Fc蛋白
将构建好的CD25/IL-2chimera-Fc质粒转染到EXPi293F细胞中，转染流程如下：Expi293F细胞于37℃，8％CO2培养箱中135rpm摇晃培养到4至5×10^6cells/ml，将细胞用新鲜培养液稀释到3×10^6cells/ml的浓度，30ml/瓶。取1.5mlOpti-Medium+30ug质粒预混5分钟(A液)，1.5mlOpti-Medium+60ulPEI(2ug/ul)(B液)预混5分钟，将A液及B液混合并于室温中静置20分钟(每孔剂量)，将上述液体滴入培养瓶中，轻摇混匀，并将细胞放回至37℃，8％CO2培养箱中135rpm继续培养。转染24小时后，补加D-Glucose至终浓度4.5g/L，补加VPA至终浓度3mM。转染5天后，2000rcf，5分钟离心收集细胞上清培养液。
将上清液与ProteinAbeads旋转孵育2h，然后将液体和珠子全部转移至空柱中，用WashingBuffer洗掉杂蛋白，用ElutionBuffer洗脱蛋白质，洗脱后的蛋白在PBS中透析，透析后的蛋白采用0.22uM的滤膜过滤，用BCA的方法测定蛋白浓度，并将蛋白质跑SDS-PAGE胶，经考马斯亮蓝染色后，观察蛋白的表达情况，如图6所示。如图6可知CD25/IL-2chimera1-Fc(SEQ ID NO:21)和CD25/IL-2chimera3-Fc(SEQ ID NO:23)均可正常表达。
实施例4
检测CD25/IL-2嵌合体与CD25结合情况
按400ng/孔的量在ELISA板包被CD25重组蛋白，室温2h，5％脱脂奶粉室温封闭。封闭结束后用washingbuffer清洗3次，之后每孔加入100ul Human IL-2、CD25/IL-2chimera1-Fc或CD25/IL-2chimera3-Fc的梯度稀释系列(0.625nM至1000nM)，室温反应2h，washingbuffer清洗3次。加入AlpacaVHH-FcAnti-IL2抗体室温反应1h，washingbuffer清洗3次。加入Rabbitanti-VHH(HRP)(Genscript，A01861-200)室温孵育1h，孵育结束后，加入TMB显色液(索莱宝，PR1200-500ML)，并通过1MH2SO4终止反应。使用酶标仪(Tecan，SPARK10M)读取460nm处的吸光值。采用GraphPadPrism9进行数据处理和作图分析，获得野生型Human IL-2、CD25/IL-2chimera1-Fc和CD25/IL-2chimera3-Fc与CD25的结合曲线，如图7所示。同时检查了Human IL-2-Fc和CD25的结合情况，如图8所示。
由实验结果发现：
(1)野生型Human IL-2可以很好的和CD25结合。
(2)CD25/IL-2chimera1-Fc(SEQ ID NO:21)和CD25/IL-2chimera3-Fc(SEQ IDNO:23)在使用浓度达到1000nM的情况下和CD25都没有明显结合，提示CD25/IL-2chimera1-Fc(SEQ ID NO:21)和CD25/IL-2chimera3-Fc(SEQ IDNO:23)很可能没办法结合/激活高亲和力IL-2受体。
(3)融合Fc的IL-2蛋白(Human IL-2-Fc)与CD25的结合能力和野生型Human IL-2差不多，说明Fc不会显著影响IL-2和CD25的结合情况，进一步说明CD25/IL-2chimera1-Fc和CD25/IL-2chimera3-Fc与CD25极其显著削弱的结合反应是CD25/IL-2chimera1和CD25/IL-2chimera3特异的效果。
实施例5
检测CD25/IL-2嵌合体与CD122结合情况
5.1Human IL-2和CD25/IL-2嵌合体进行Biotin偶联
将500μg相关蛋白溶解于500μlPBS中，使其终浓度为1mg/ml。加入5μl、10mg/ml的NHS-biotin溶液混合均匀(NHS用DMSO溶解)。室温孵育30min。加入50μl100mM的甘氨酸溶液，室温孵育10min，混合均匀终止反应。采用PBS对偶联后的蛋白进行透析。透析后，采用0.22uM滤膜过滤，采用BCA测量蛋白浓度，冻存于-80度备用。
5.2ELISA检测CD25/IL-2嵌合体与CD122结合情况
按400ng/孔的量在ELISA板中包被CD122重组蛋白，然后分别加入等量偶联Biotin后的Human IL-2、CD25/IL-2chimera1-Fc、CD25/IL-2chimera3-Fc或Fc-Isotype(阴性对照)，采用HRP-Streptavidin检测各蛋白和CD122的结合情况，如图9所示。
由实验结果可知，野生型Human IL-2和CD122有较弱的相互作用。与野生型HumanIL-2相比，CD25/IL-2chimera1-Fc和CD25/IL-2chimera3-Fc与CD122的结合显著增强，很可能是IL-2和CD25的嵌合，增强了其和CD122的亲和力。对照Fc蛋白与CD122不结合，进一步说明CD25/IL-2chimera1-Fc和CD25/IL-2chimera3-Fc与CD122的结合是CD25/IL-2chimera1和CD25/IL-2chimera3特异的反应。
为了进一步确认CD25/IL-2chimera1-Fc和CD25/IL-2chimera3-Fc与CD122的结合能力，进一步通过CD25/IL-2嵌合体的梯度稀释系列(0.625nM至1000nM)结合实验检测两个嵌合体和CD122的结合曲线，如图10所示。从图10中可以看出CD25/IL-2chimera1-Fc(SEQID NO:21)和CD25/IL-2chimera3-Fc(SEQ ID NO:23)可以很好地和CD122结合，提示该嵌合体保留结合/激活中等亲和力IL-2受体的能力。
实施例6
CD25/IL-2嵌合体刺激NK92细胞
NK92细胞(ATCC，CRL-2407)采用天津灏洋生物的TBDNK92KIT培养基进行传代培养。
刺激前，先采用无IL2培养基，培养NK92细胞2-3天。按所需的样本量，将无IL-2培养的NK92细胞接种于24孔板中。采用PBS(阴性对照)、Human IL-2、CD25/IL-2chimera1-Fc(SEQ ID NO:21)、CD25/IL-2chimera3-Fc(SEQ ID NO:23)、CD25-Fc(阴性对照)和Fc-Isotype(阴性对照)分别对上述IL-2饥饿处理的NK92细胞进行处理。处理时间：20min，60min；处理浓度：15.625nM；刺激后1000rcf，5min，收集细胞沉淀。用RIPAlysisbuffer裂解细胞，加入5×Loadingbuffer，westernblot检测P-STAT5和Actin，如图11所示。
由实验结果可知，CD25/IL-2chimera1-Fc(SEQ ID NO:21)和CD25/IL-2chimera3-Fc(SEQ ID NO:23)可以很好地激活NK92细胞中STAT5的磷酸化，提示该嵌合体具有激活NK细胞的功能。CD25-Fc和Fc-Isotype都不能激活STAT5的磷酸化，进一步说明CD25/IL-2chimera1-Fc和CD25/IL-2chimera3-Fc对NK92的激活是CD25/IL-2chimera1和CD25/IL-2chimera3特异激发的反应。
实施例7
CD25/IL-2嵌合体刺激CD8+T细胞
7.1MouseCD8+T细胞分离
CD8+T细胞的分离采用负筛的方法，将获取的小鼠脾脏和淋巴结细胞，除掉CD4+T细胞、B细胞、红细胞等非CD8细胞后获得，具体流程如下：
取小鼠脾脏跟淋巴结于2毫升培养基中。
将70微米滤网置于50毫升管上，在滤网上研磨组织。
用8毫升磁珠分离缓冲液(StreptavidinParticlesPlus–DM，BDBiosciences，557812)冲刷滤网，500g，5min，4℃离心。
用3毫升红细胞裂解液裂解5min。
加入5-10毫升磁珠分离缓冲液终止反应，离心。
细胞计数，稀释到2x10^7每毫升。
按每1×10^8细胞量加400微升的抗体cocktail。
配置抗体(购自BioLegend)混合液在100ul的磁珠分离缓冲液中，具体如下：
4度孵育20分钟，500g，5min，4℃，离心。
用10毫升磁珠分离缓冲液洗一次。
准备两份磁珠：第一份50μL；第二份40ulbeads；采用磁珠分离缓冲液按3倍beads体积稀释。
将细胞与第一份beads重悬孵育5分钟后，转移到置于磁力架上的流式管中吸附一分钟。
将上清转移到第二份beadds中孵育5分钟，转移到置于磁力架上的流式管中吸附一分钟。
再将上清转移到另一个流式管中吸附一分钟。
转移到1.5毫升管离心，洗一遍后用相应的溶液重悬，计数，分析纯度。
根据所需的细胞量，用无IL-2的培养液铺板于24孔板中备用。
7.2CD25/IL-2嵌合体刺激CD8+T细胞
采用PBS(阴性对照)、Human IL-2、CD25/IL-2chimera1-Fc(SEQ ID NO:21)和CD25/IL-2chimera3-Fc(SEQ IDNO:23)分别对7.1中分离的CD8+T细胞进行处理，处理时间：20min，2h；处理浓度：15.625nM；刺激后1000rcf，5min，收集细胞沉淀。用RIPAlysisbuffer裂解细胞，加入5×Loadingbuffer，westernblot检测P-STAT5和Actin，如图12所示。由实验结果可知，CD25/IL-2chimera1-Fc(SEQ ID NO:21)和CD25/IL-2chimera3-Fc(SEQ ID NO:23)可以很好地激活CD8+T细胞中STAT5的磷酸化，提示该嵌合体具有激活CD8+T细胞的功能。
实施例8
CD25/IL-2嵌合蛋白促进免疫细胞杀伤肿瘤细胞
8.1人外周血单个核细胞(PBMC)的提取
将新鲜血液用PBS按照1:1进行稀释轻轻上下吹打。将Ficoll试剂上下颠倒5-10次充分震荡混匀，将Ficoll试剂分装到离心管中待用。将稀释后的血液贴壁加入含Ficoll的离心管中，将离心管转移至离心机中，配平，室温400g离心30min，设置升速1降速0。用1mL移液器轻轻将上层血清吸出。离心结束后分4层，由下到上分别为，红细胞，Ficoll溶液，白膜层，PBS。将枪头插进白膜层中小心吸取白膜层(即淋巴细胞层)转移至新的15ml离心管中。尽量避免吸取到下层或上层的细胞，避免造成污染。加入10mlPBS至上述转移出来的淋巴细胞中，轻轻吹打混匀，100×g，10min离心。弃上清，加入1ml裂红液，3min裂红。加入清洗液终止裂红，300×g，5min离心。加入清洗液补至体积到10ml清洗，100×g，8min离心清洗细胞2次。弃上清，收集细胞沉淀备用。
8.2免疫细胞的扩增和活化
将上述分离的PBMC加入24孔细胞培养皿中，细胞培养皿预先涂有10μg/mL抗CD3(novoprotein，GMP-A018)和抗CD28(novoprotein,GMP-A063)并在4℃下保持过夜，抗CD3和抗CD28抗体可以促进T细胞的活化和增殖。PBMC是在含有10％胎牛血清的RPMI 1640中培养，含1:100青霉素-链霉素。将细胞分成不同份，按终浓度15.625nM的用量分别加入：HumanIL-2、CD25/IL-2chimera1-Fc(SEQ ID NO:21)、CD25/IL-2chimera3-Fc(SEQ IDNO:23)、CD25-Fc(对照)或Fc-Isotype(对照)。细胞隔天半数传代，等量添加新鲜培养基，并添加相应的刺激物：Human IL-2、CD25/IL-2chimera1-Fc、CD25/IL-2chimera3-Fc、CD25-Fc或Fc-Isotype，将增殖和活化好的免疫细胞用于后续的肿瘤杀伤实验。
8.3RTCA esight检测免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力
步骤如下：在E-Plate 96孔培养板中加入50μL1640完全培养基，37度平衡1个小时，检测阻抗基线。接种肿瘤细胞(人肺鳞癌细胞H226)数量5000个/孔，将孔板室温水平放置30分钟，使细胞均匀沉降到孔板底部，通过阻抗检测靶细胞贴壁增殖。阻抗每15分钟采集一次，成像每1个小时采集一次。待肿瘤细胞贴壁12h后，收集8.2中扩增好的效应细胞(主要是T细胞)，按效靶比为5:1，将配制好的效应细胞悬液以每孔50ul加入含靶细胞(肿瘤细胞)的孔中。将加好的孔板放回xCELLigence RTCA eSight(安捷伦)中对应的位置，静置平衡30min。然后开始数据采集，实时监测效应细胞杀伤靶细胞的过程，阻抗15min测一次，图像1小时采集一次。结果如图13所示：与CD25-Fc和Fc-Isotype相比，CD25/IL-2chimera1-Fc与CD25/IL-2chimera3-Fc同HumanIL-2类似都可以显著促进免疫杀伤H226肿瘤细胞，说明CD25/IL-2chimera1-Fc与CD25/IL-2chimera3-Fc可以有效促进免疫细胞杀伤肿瘤，并且这个活性是CD25/IL-2chimera1与CD25/IL-2chimera3特异性的反应。
实施例9
本实施例公开了一种试剂盒，包含容器，所述容器内设有实施例三的CD25/IL-2嵌合蛋白。采用本实施例试剂盒，可促进NK细胞、CD8+T细胞的活化或促进免疫细胞杀伤肿瘤细胞，以促进相关疾病的治疗。
实施例10
IL-2/CD25嵌合蛋白的设计及结构预测
根据1.1确定的嵌合区域，通过在柔性连接区内，通过合适长度的接头元件将CD25与IL-2的不同肽段按照本发明中的I1-L1-C-L3-I2结构式进行嵌合连接。当嵌合位点选自IL-2的S75位时(根据SEQ ID NO:2进行编号)，如SEQ ID NO：27是基于该嵌合位点构建的一个嵌合蛋白，称为IL-2/CD25 Chimera。
进一步的，我们按照表3中的组合，嵌合后形成一条多肽链的嵌合体：IL-2/CD25Chimera。对这些序列使用Alphafold2预测其蛋白结构(Jumper，Jetal.，Nature(2021)；Varadi，Metal.，NucleicAcidsResearch(2021).)，运行过程中使用提供的完整版本数据库BigFantasticDatabase(BDF)，同时将训练参数--db_preset设置为full_dbs，其他参数为默认参数，使用PyMol查看预测后的蛋白结构。结果显示该肽段形成类似于CD25和IL-2结合而成的复合体晶体结构(PDB ID：2B5I)，如图14所示(CD25根据SEQ ID NO：1，IL-2根据SEQID NO:2进行编号。)。
由蛋白结构可知，该嵌合蛋白中IL-2结构域的CD25表位已经被CD25结构域完全封闭，由此推测这些IL-2/CD25嵌合蛋白具有潜在的偏向性结合/激活中等亲和力IL-2受体(IL-2Rβγ)而减弱(或者不)结合/激活高亲和力IL-2受体(IL-2Rαβγ)的功能。
表3.IL-2/CD25 Chimera(SEQ ID NO：27)的肽段和接头的序列
实施例11
IL15RA/IL-15嵌合蛋白的设计及结构预测
如前所述，在本具体实施方案中，细胞因子受体为IL15RA，细胞因子为IL-15。根据PDB数据库中IL-15与IL15RA的晶体结构(PDB ID:2Z3Q)，我们分析得到在IL15RA与IL-15结合面及其附近有多个柔性连接区。优选地，我们选择IL15RA胞外域上的K66-A67-G68-T69-S70-S71柔性连接区(IL15RA的氨基酸位置根据UniProt条目号：Q13261进行编号)作为本实施例构建IL15RA/IL-15嵌合蛋白的嵌合区域。
通过在该柔性连接区内，通过合适长度的接头元件将IL15RA与IL15的不同肽段按照本发明中的C1-L1-I1-L2-I2-L3-C2结构式进行嵌合连接。当嵌合位点选自该嵌合区域的A67位时(IL15RA的氨基酸位置根据UniProt条目号：Q13261进行编号)，如SEQ ID NO：28是基于该嵌合位点构建的一个嵌合蛋白，称为IL15RA/IL-15Chimera。
进一步的，我们按照表4中的组合，嵌合后形成一条多肽链的嵌合体：IL15RA/IL-15Chimera。对这些序列使用Alphafold2预测其蛋白结构(Jumper，Jetal.，Nature(2021)；Varadi，Metal.，NucleicAcidsResearch(2021).)，运行过程中使用提供的完整版本数据库BigFantasticDatabase(BDF)，同时将训练参数--db_preset设置为full_dbs，其他参数为默认参数，使用PyMol查看预测后的蛋白结构。结果显示该肽段形成类似于IL15RA和IL-15结合而成的复合体晶体结构(PDB ID：2Z3Q)，如图15所示(IL15RA根据UniProt ID：Q13261进行编号，IL-15根据UniProt ID：P40933进行编号)。
由蛋白结构可知，该嵌合蛋白中IL-15结构域的IL15RA表位已经被IL15RA结构域完全封闭，由此推测该IL15RA/IL-15嵌合蛋白具有潜在的偏向性结合/激活IL-15βγ(CD122/CD132)受体而减弱(或者不)结合/激活IL15Rα(IL15RA)受体的功能。
表4.IL15RA/IL-15Chimera(SEQ ID NO：28)的肽段和接头的序列
进一步地，类似于实施例3-6，我们构建了IL15RA/IL-15嵌合蛋白的表达载体，制备了IL15RA/IL-15嵌合蛋白，通过ELISA实验检测了IL15RA/IL-15Chimera和IL15RA的结合情况(图16)；通过ELISA实验检测了IL15RA/IL-15Chimera和IL15Rβ(CD122)的结合情况(图17)；以及通过采用IL15RA/IL-15Chimera对NK92刺激，后续westernblot检测STAT5的磷酸化水平，检测了IL15RA/IL-15Chimera对NK细胞的激活情况(图18)。
由结果可知，IL15RA/IL-15Chimera大大降低了与IL15RA的结合，增强了和IL15Rβ(CD122)的结合，并可以直接促进NK92细胞中STAT5的磷酸化，说明IL15RA/IL-15嵌合蛋白具有直接结合IL-15βγ(CD122/CD132)受体而减弱(或者不)结合/激活IL15Rα(IL15RA)受体的功能，进一步的可以直接促进NK细胞的活化。
实施例12
IL21R/IL-21嵌合蛋白的设计及结构预测
如前所述，在本具体实施方案中，细胞因子受体为IL21R，细胞因子为IL-21。根据PDB数据库中IL-21与IL21R的晶体结构(PDB ID:3TGX)，我们分析得到在IL21R与IL-21结合面及其附近有多个柔性连接区。
通过在柔性连接区内，通过合适长度的接头元件将IL21R与IL-21的不同肽段按照本发明中的C1-L1-I-L3-C2结构式进行嵌合连接。当嵌合位点选自IL21R的D91位时(根据UniProt条目号：Q9HBE5进行编号)，如SEQ ID NO：29是基于该嵌合位点构建的一个嵌合蛋白，称为IL21R/IL-21Chimera。
进一步的，我们按照表5中的组合，嵌合后形成一条多肽链的嵌合体：IL21R/IL-21Chimera。对这些序列使用Alphafold2预测其蛋白结构(Jumper，Jetal.，Nature(2021)；Varadi，Metal.，NucleicAcidsResearch(2021).)，运行过程中使用提供的完整版本数据库BigFantasticDatabase(BDF)，同时将训练参数--db_preset设置为full_dbs，其他参数为默认参数，使用PyMol查看预测后的蛋白结构。结果显示该肽段形成类似于IL21R和IL21结合而成的复合体晶体结构(PDB ID：3TGX)，如图19所示(IL21R根据UniProt ID：Q9HBE5进行编号，IL-21根据UniProt ID：Q9HBE4进行编号)。
由蛋白结构可知，该嵌合蛋白中IL-21结构域的IL21R表位已经被IL21R结构域完全封闭，由此推测该IL21R/IL-21嵌合蛋白具有潜在的减弱结合/减弱激活L21R受体的功能。
表5.IL21R/IL-21Chimera(SEQ ID NO：29)的肽段和接头的序列
实施例13
嵌合区域的应用拓展
本发明所描述的细胞因子/细胞因子受体的嵌合区域除了可以嵌合细胞因子受体胞外域或细胞因子外，还可以嵌合单链抗体/单域抗体或者其他功能性蛋白等；这样在相关位置嵌入目标抗体/功能性蛋白后(如靶向T细胞抗原或者NK细胞抗原或者肿瘤相关抗原的抗体等)通过位阻破坏细胞因子与其受体的结合，同时又可以通过嵌入的抗体/功能性蛋白将目标细胞因子靶向特定的位置(如T细胞、NK细胞或者肿瘤细胞)达到特异性调控目标细胞因子在体内有目的性分布的作用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (24)
1.一种嵌合蛋白，其特征在于，包括细胞因子以及细胞因子受体胞外域；
所述的细胞因子嵌入到细胞因子受体胞外域的嵌合区域中，所述嵌合区域位于细胞因子受体胞外域柔性连接区，所述的嵌合蛋白从N端到C端具有如下所示的多肽结构式：C1-I-C2，式中C1为细胞因子受体胞外域嵌合区域中任一嵌合位点前或后的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物，C2为细胞因子受体胞外域中除C1外的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物；I为细胞因子或者细胞因子的变体、改造体、截断体或衍生物；
或所述的细胞因子受体胞外域嵌入到该细胞因子的嵌合区域中，所述的嵌合区域位于细胞因子柔性连接区；所述的嵌合蛋白从N端到C端具有如下所示的多肽结构式：I1-C-I2；式中I1为细胞因子嵌合区域中任一嵌合位点前或后的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物，I2为细胞因子中除I1外的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物；C为细胞因子受体胞外域或者细胞因子受体胞外域的变体、改造体、截断体或衍生物。
2.如权利要求1的嵌合蛋白，其特征在于：所述的C1、C2、I1、I2至少含有三个氨基酸，或者至少含有一个独立的蛋白质二级结构单元。
3.如权利要求1所述的嵌合蛋白，其特征在于：所述的C1和C2通过接头元件间接同I连接；所述的嵌合蛋白从N端到C端具有如下所示的多肽结构式：C1-L1-I-L3-C2；
或所述的I1和I2通过接头元件间接同C连接，所述的嵌合蛋白从N端到C端具有如下所示的多肽结构式：I1-L1-C-L3-I2；
上述式中L1，L3为各自独立的接头元件，L1和L3为相同或不同序列。
4.如权利要求3所述的嵌合蛋白，其特征在于：所述的多肽结构式C1-L1-I-L3-C2中的I在其嵌合位点前或者后的两部分氨基酸序列I1和I2通过接头元件L2连接，即嵌合蛋白从N端到C端具有如下所示的多肽结构式：C1-L1-I1-L2-I2-L3-C2；式中I1为细胞因子嵌合区域中任一嵌合位点前或后的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物，I2为细胞因子中除I1外的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物；
或所述的多肽结构式I1-L1-C-L3-I2中的C在其嵌合位点前或者后的两部分氨基酸序列C1和C2通过接头元件L2连接，即嵌合蛋白从N端到C端具有如下所示的多肽结构式：I1-L1-C1-L2-C2-L3-I2；式中C1为细胞因子受体胞外域嵌合区域中任一嵌合位点前或后的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物，C2为细胞因子受体胞外域中除C1外的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物。
5.如权利要求4所述的嵌合蛋白，其特征在于：还包括免疫球蛋白Fc区。
6.如权利要求1～5任一项所述的嵌合蛋白，其特征在于：所述的细胞因子受体为CD25，所述的细胞因子为IL-2；或所述的细胞因子受体为IL15RA，所述的细胞因子为IL-15；或所述的细胞因子受体为IL21R，所述的细胞因子为IL-21。
7.如权利要求6所述的嵌合蛋白，其特征在于：CD25胞外域的序列号为SEQ ID NO:1，CD25的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1进行编号；
C1包含以下任一氨基酸序列：
(a)、CD25胞外域上的如下肽段:E1-R36，或E1-I37，或E1-K38，或E1-S39，或E1-G40，或E1-S41，或E1-L42，或E1-M149，或E1-T150，或E1-H151，或E1-G152，或E1-K153，或E1-T154；
(b)、(a)中所述肽段在其他(非人源)物种的同源肽段；
(c)、将(a)或者(b)中任一肽段的氨基酸序列经过一个或多个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有该肽段类似结构和功能的衍生肽段；
(d)、与(a)或者(b)限定的肽段序列具有至少80％序列相同性的氨基酸序列；
C2包含以下任一氨基酸序列：
(a)、CD25胞外域上的如下肽段:I37-E217，或K38-E217，或S39-E217，或G40-E217，或S41-E217，或L42-E217，或Y43-E217，或H151-E217，或G152-E217，或K153-E217，或T154-E217，或R155-E217；
(b)、(a)中所述肽段在其他(非人源)物种的同源肽段；
(c)、将(a)或者(b)中任一肽段的氨基酸序列经过一个或多个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有该肽段类似结构和功能的衍生肽段；
(d)、与(a)或者(b)限定的肽段序列具有至少80％序列相同性的氨基酸序列。
8.如权利要求6所述的嵌合蛋白，其特征在于：IL-2的序列号为SEQ ID NO:2，IL-2的氨基酸位置根据SEQ ID NO:2进行编号；
I1包含以下任一氨基酸序列：
(a)、IL-2上的如下肽段：T41-Y133，F42-Y133，或K43-Y133，或F44-Y133，或Y45-Y133，或M46-Y133，或P47-Y133，或K48-Y133，或K49-Y133，或A50-Y133，或T51-Y133，或L72-Y133，或A73-Y133，或Q74-Y133，或S75-Y133，或K76-Y133，或N77-Y133，或F78-Y133，或H79-Y133，或L80-Y133，或F103-Y133，或M104-Y133，或C105-Y133，或E106-Y133，或Y107-Y133，或A108-Y133，或D109-Y133，或E110-Y133，或T111-Y133，或A112-Y133；
(b)、(a)中所述肽段在其他(非人源)物种的同源肽段；
(c)、将(a)或者(b)中任一肽段的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有该肽段类似结构和功能的衍生肽段；
(d)、与(a)或者(b)限定的肽段序列具有至少80％的序列相同性的氨基酸序列；
I2包含以下任一氨基酸序列：
(a)、IL-2上的如下肽段：P2-L40，或P2-T41，或P2-F42，或P2-K43，或P2-F44，或P2-Y45，或P2-M46，或P2-P47，或P2-K48，或P2-K49，或P2-A50，或P2-N71，或P2-L72，或P2-A73，或P2-Q74，或P2-S75，或P2-K76，或P2-N77，或P2-F78，或P2-H79，或P2-T102，或P2-F103，或P2-M104，或P2-C105，或P2-E106，或P2-Y107，或P2-A108，或P2-D109，或P2-E110，或P2-T111；
(b)、(a)中所述肽段在其他(非人源)物种的同源肽段；
(c)、将(a)或者(b)中任一肽段的氨基酸序列经过一个或多个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有该肽段类似结构和功能的衍生肽段；
(d)、与(a)或者(b)限定的肽段序列具有至少80％的序列相同性的氨基酸序列。
9.如权利要求6所述的嵌合蛋白，其特征在于：所述的嵌合蛋白包含SEQ ID NO:10-12，SEQ ID NO:21-23，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28-29中任一多肽序列或具有与SEQ ID NO:10-12，SEQ ID NO:21-23，SEQ IDNO:27，SEQ ID NO:28-29中任一多肽序列至少80％序列相同性的氨基酸序列。
10.用于构建嵌合蛋白的嵌合区域，其特征在于：所述的嵌合区域位于细胞因子受体胞外域的柔性连接区或者细胞因子的柔性连接区。
11.如权利要求10所述的用于构建嵌合蛋白的嵌合区域，其特征在于：所述的细胞因子受体为CD25，CD25胞外域的序列号为SEQ ID NO:1，CD25胞外域的氨基酸位置根据SEQ IDNO:1进行编号，所述的嵌合区域位于CD25胞外域的柔性连接区，包括嵌合区Q1和嵌合区Q2：
a.嵌合区Q1位于CD25胞外域的I37-K38-S39-G40-S41-L42肽段，序列号为SEQ ID NO:3，或该肽段的同源肽段或具有与该肽段类似结构和功能的衍生肽段，或该肽段向前向后各延伸10个氨基酸的肽段，序列号为SEQ ID NO:5；
b.嵌合区Q2位于CD25胞外域的T150-H151-G152-K153-T154肽段，序列号为SEQ ID NO:4，或该肽段的同源肽段或具有与该肽段类似结构和功能的衍生肽段，或该肽段向前向后各延伸10个氨基酸的肽段，序列号为SEQ ID NO:6。
12.如权利要求10所述的用于构建嵌合蛋白的嵌合区域，其特征在于：所述的细胞因子为IL-2，IL-2的序列号为SEQ ID NO:2，IL-2的氨基酸位置根据SEQ ID NO:2进行编号，所述的嵌合区域位于IL-2两个相邻α螺旋间的柔性连接区，包括嵌合区Q3、嵌合区Q4、嵌合区Q5：
a.嵌合区Q3位于IL-2的T41-F42-K43-F44-Y45-M46-P47-K48-K49-A50-T51肽段，序列号为SEQ ID NO:7，或该肽段的同源肽段或具有与该肽段类似结构和功能的衍生肽段；
b.嵌合区Q4位于IL-2的L72-A73-Q74-S75-K76-N77-F78-H79-L80肽段，序列号为SEQID NO:8，或该肽段的同源肽段或具有与该肽段类似结构和功能的衍生肽段；
c.嵌合区Q5位于IL-2的F103-M104-C105-E106-Y107-A108-D109-E110-T111-A112肽段，序列号为SEQ ID NO:9，或该肽段的同源肽段或具有与该肽段类似结构和功能的衍生肽段。
13.如权利要求10所述的用于构建嵌合蛋白的嵌合区域，其特征在于：所述的细胞因子受体为IL15RA，IL15RA的胞外域为第31-205位氨基酸，所述的嵌合区域位于IL15RA胞外域的柔性连接区，包含位于IL15RA胞外域的K66-A67-G68-T69-S70-S71肽段，或该肽段的同源肽段或具有与该肽段类似结构和功能的衍生肽段，或该肽段向前向后各延伸10个氨基酸的肽段。
14.构建嵌合蛋白的方法，其特征在于：在权利要求10-13任一项所述的构建嵌合蛋白的嵌合区域中任一嵌合位点前或后直接或间接嵌入细胞因子或细胞因子受体胞外域。
15.缀合物，其特征在于：包括权利要求1～9任一项所述的嵌合蛋白或其衍生物，所述嵌合蛋白或其衍生物直接或通过接头元件间接地与其他模块连接。
16.如权利要求15所述的缀合物，其特征在于：所述的其他模块包括抗原结合模块、细胞毒素、放射性同位素、生物活性蛋白质、可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、酶金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、中任一种或其组合；更优选地，所述抗原结合模块是抗体或抗原结合片段；最优选地，所述抗体或抗原结合片段靶向肿瘤细胞上或肿瘤细胞环境中呈现的抗原。
17.药物组合物，其特征在于：包括权利要求1～9任一项所述的嵌合蛋白或其衍生物或权利要求15-16任一项所述的缀合物以及药学上可接受的稀释剂、载体或助剂。
18.核酸分子，其特征在于：其编码权利要求1～9任一项所述的嵌合蛋白或权利要求15-16所述的缀合物。
19.表达载体，其特征在于：包含权利要求18所述的核酸分子。
20.宿主细胞，其包含权利要求19所述的表达载体，或权利要求18所述的核酸分子，或表达权利要求1～9任一项所述的嵌合蛋白或其衍生物或权利要求15-16中的缀合物。
21.权利要求1～9任一项所述的嵌合蛋白或其衍生物、权利要求15-16中的缀合物、权利要求17的药物组合物、权利要求18的核酸分子、权利要求19的表达载体或权利要求20的宿主细胞用于制备治疗增生性疾病或免疫性疾病、调节T细胞介导的免疫应答、刺激个体免疫系统的药物中的用途。
22.如权利要求21所述的用途，其特征在于：所述增生性疾病是肿瘤或癌。
23.试剂盒，其特征在于：包含权利要求1～9任一项所述的嵌合蛋白或其衍生物、权利要求15-16中的缀合物、权利要求17的药物组合物、权利要求18的核酸分子、权利要求19的表达载体或权利要求20的宿主细胞。
24.一种制备嵌合蛋白的方法，其特征在于：在适于表达所述的嵌合蛋白的条件下使用权利要求18的核酸分子，或使用权利要求19的表达载体，或使用权利要求20的宿主细胞进行表达。
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