BR112021010240A2 - preparação que compreende uma dispersão de fosfolipídeos e sais de ácidos graxos - Google Patents

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Abstract

PREPARAÇÃO QUE COMPREENDE UMA DISPERSÃO DE FOSFOLIPÍDEOS E SAIS DE ÁCIDOS GRAXO. A invenção se refere a preparações que compreendem uma mistura de pelo menos um fosfolipídeo e pelo menos um sal de ácidos graxos de um cátion com um ânion derivado de um ácido graxo.A invenção também se refere a um método para preparar tais preparações e ao uso de tais reparações para fornecer ácidos graxos poli-insaturados a células, tecidos, órgãos ou organismos, por exemplo, no campo de cultura de células e tecidos, preservação de órgãos, nutrição humana ou animal, ou cosmética.

Description

“PREPARAÇÃO QUE COMPREENDE UMA DISPERSÃO DE FOSFOLIPÍDEOS E SAIS DE ÁCIDOS GRAXOS”
[0001] A invenção descreve composições que contêm fosfolipídeos e sais de ácidos graxos ômega-3, formulações e processos para preparar tais composições na forma lipossomal e suas aplicações.
[0002] Os ácidos graxos ômega-3, especialmente ácido dodeca-hexaenoico (DHA) e ácido eicosapentaenoico (EPA) são conhecidos por ter vários efeitos benéficos na saúde humana, são blocos de construção importantes de vários constituintes celulares e agem como precursores para moléculas de sinalização.
[0003] As principais fontes desses compostos são óleos de algas e peixes, bem como alguns óleos derivados de plantas, nos quais estão presentes na forma de triglicerídeos. Vários óleos, bem como os ésteres de etila derivados de óleos, estão comercialmente disponíveis.
[0004] Visto que o consumo diário dessas fontes de ômega- 3 com os alimentos ou suplementos nutricionais é limitada, é importante garantir a máxima biodisponibilidade desses ácidos graxos. A biodisponibilidade de nutrientes hidrofóbicos no sistema digestivo é frequentemente baixa e representa um desafio especialmente para os suplementos, em virtude de serem frequentemente consumidos independentemente de uma refeição na forma de cápsulas ou pílulas. A secreção de fluidos digestivos (ácidos biliares, fosfolipídeos, lipases) é dificilmente induzida em jejum, ou não é induzida em jejum, o que resulta na hidrólise enzimática incompleta de gorduras e óleos, baixa solubilização e biodisponibilidade.
[0005] Surgem desafios adicionais à biodisponibilidade quando tecnologias de formulação avançadas são usadas para pular partes dos sistemas digestivos a fim de liberar ácidos graxos ômega-3 na parte inferior do sistema digestivo, por exemplo, no intestino delgado ou grosso. Cápsulas ou comprimidos revestidos com os respectivos polímeros de liberação podem ser usados para essa finalidade. Nesses sistemas, os mecanismos de solubilização natural supracitados são menos eficazes, o que reduz a biodisponibilidade e precisa ser compensado por medidas apropriadas.
[0006] O mesmo vale para o fornecimento de ácidos graxos ômega-3 para células e tecidos isolados para cultivo in vitro, por exemplo, como parte de composições de meio de cultura celular livre de soro. Nessas aplicações, a solubilização no trato digestivo é preferencialmente simulada por formulações que estão próximas do sistema natural para maximizar a biocompatibilidade e a biodisponibilidade. Para a adição a meios de cultura celular, também é essencial que os ácidos graxos sejam dispersos no meio de modo que permita a passagem ideal através de filtros estéreis.
[0007] Várias abordagens foram desenvolvidas para resolver o problema da biodisponibilidade, seja por formulação, modificação química de ácidos graxos ômega-3 ou ambas.
[0008] Uma abordagem promissora é a hidrólise e saponificação subsequente de ésteres de ácidos graxos ômega- 3, que simulam parte do processo digestivo natural e, desse modo, aumentam a solubilidade. O documento WO2016102323A1 descreve composições que compreendem sais de ácidos graxos ômega-3 poli-insaturados que podem ser estabilizados contra oxidação.
[0009] Uma formulação também pode aprimorar a biodisponibilidade. Por exemplo, o documento WO2010103402 revela formulações de óleos autoemulsificantes contendo tensoativos que mostraram aumentar a dispersão no estômago e aumentar biodisponibilidade. A desvantagem de tais sistemas é que normalmente requerem tensoativos sintéticos não iônicos que não são fornecidos de forma sustentável e são cada vez menos aceitos pelo consumidor. Outra desvantagem é a grande quantidade de tensoativo e cotensoativo em relação ao óleo ou éster etílico necessário para gerar gotículas finas de óleo após a dispersão em água. Por fim, esses sistemas ainda estão em um estado líquido, o que os torna propensos à oxidação e geralmente requer a adição de antioxidantes e precauções especiais em relação ao processamento e embalagem.
[0010] Os fosfolipídeos, como fosfatidilcolina (lecitina), são anfifílicos naturais e ingredientes alimentares que são altamente biocompatíveis e facilmente digeríveis. Eles foram usados como emulsificantes na indústria alimentícia e como suplementos nutricionais por muitas décadas. Por isso não é surpreendente que os fosfolipídeos tenham sido usados para formular formas de ácidos graxos ômega-3. Por exemplo, Alaarg et al. (International Journal of Nanomedicine 2016:11 5027–5040) e Hadian et al. (Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2014), 13 (2): 393-404) prepararam formulações lipossomais à base de fosfolipídeos a partir de ésteres e ácidos graxos ômega-3 livres.
[0011] No entanto, formulações lipossomais à base de fosfolipídeos de ésteres e ácidos graxos ômega-3 também têm várias desvantagens. Os ésteres etílicos e triglicerídeos ômega-3 têm polaridade tão baixa, que apenas pequenas quantidades podem ser dispersas de modo estável em bicamadas lipossomais. Também é difícil convertê-los em uma forma de pó mais concentrada por secagem sem adição de excipientes adicionais devido ao caráter pegajoso do óleo e alguns dos fosfolipídeos. O uso de ácidos graxos livres requer a neutralização dos ácidos graxos livres, o que complica o processamento e pode resultar em qualidade e estabilidade lipossomais inferiores e também contraíons introduzidos como sódio ou potássio (por meio de NaOH ou KOH), que são indesejáveis nas aplicações nutricionais e outras.
[0012] Constatou-se, surpreendentemente, que as preparações de ômega-3 que superam os problemas supracitados podem ser preparadas a partir de misturas de fosfolipídeos com sais de ácidos graxos ômega-3. Constatou-se que especialmente sais com aminoácidos básicos como contraíons têm propriedades benéficas.
[0013] Portanto, um aspecto da presente invenção é uma preparação que compreende uma dispersão de pelo menos um fosfolipídeo, e pelo menos um sal de ácidos graxos de um cátion com um ânion derivado de um ácido graxo ômega-3 ou ômega-6.
[0014] A dispersão de acordo com a presente invenção é, de acordo com a definição IUPAC, um material que compreende mais de uma fase, em que pelo menos uma das fases consiste em domínios de fase finamente divididas, frequentemente na faixa de tamanho coloidal, disperso ao longo de uma fase contínua. As duas fases podem estar em estados de matéria iguais ou diferentes. Elas são diferentes de soluções, em que as moléculas dissolvidas não formam uma fase separada do soluto. A presente invenção se refere tanto a dispersões de uma fase líquida em um meio líquido como coloide (miniemulsão ou microemulsão) ou como suspensão (emulsão com tamanho de partícula de mais de 1 µm), quanto a dispersões de uma fase sólida em um meio líquido como coloide (sol) ou como suspensão (com tamanho de partícula de mais de 1 µm). Além disso, a invenção também se refere a uma dispersão de uma fase sólida em um meio sólido contínuo, que é chamado de sol sólido.
[0015] Um coloide é uma dispersão com uma fase dispersa entre 1 nm e 1 µm e é definida como uma emulsão quando uma fase líquida é dispersa em um meio líquido contínuo, como um sol quando uma fase sólida é dispersa em um meio líquido contínuo e como um sol sólido quando uma fase sólida é dispersa em meio sólido contínuo.
[0016] O processo de preparação de tais dispersões pode ser aprimorado e simplificado. Constatou-se que as composições têm melhor qualidade e estabilidade. O teor de contraíons orgânicos indesejados como sódio pode ser reduzido. A filtração estéril das formas líquidas foi significativamente facilitada pela composição inventiva em comparação com outras formas de ácidos graxos ômega-3. Constatou-se que os pós secos preparados a partir das composições inventivas têm propriedades melhores, que facilitam o processamento.
[0017] Também foi constatado que tais formulações melhoram muito a biodisponibilidade de ácidos graxos ômega- 3 para células microbianas e animais, incluindo humanas.
[0018] As composições inventivas da invenção consistem em fosfolipídeos que são capazes de formas bicamadas e sais de ácidos graxos ômega-3, preferencialmente sais de aminoácidos de ácidos graxos ômega-3. Os fosfolipídeos podem ser misturas complexas (por exemplo, lecitina sem óleo), estruturas principais definidas com variações na composição de ácidos graxos (por exemplo, fosfatidilcolina, com ácidos graxos insaturados ou hidrogenados) ou compostos purificados e definidos (por exemplo, dioleilfosfatidilcolina, DOPC).
[0019] Em uma configuração preferencial da presente invenção, o ácido graxo é selecionado a partir de ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosa-hexaenoico (DHA), ácido araquidônico (ARA), ácido alfa-linolênico, ácido estearidônico, ácido eicosatetraenoico, ácido docosapentaenoico, ácido linoleico, ácido γ-linolênico e/ou seus derivados, preferencialmente selecionados a partir de EPA e DHA de ácidos graxos ômega-3.
[0020] Em uma outra configuração preferencial, o cátion no sal de ácidos graxos é um cátion orgânico derivado de um dos seguintes: lisina, arginina, ornitina, colina e suas misturas.
[0021] Em uma configuração alternativa da presente invenção, o fosfolipídeo é um fosfolipídeo sem óleo que compreende um teor de fosfatidilcolina de mais de 40 % em peso, preferencialmente 70 % em peso, preferencialmente mais de 90 % em peso e um teor de fosfatidiletanolamina de menos de 5 % em peso, preferencialmente menos de 1 % em peso.
[0022] Em uma modalidade alternativa, o fosfolipídeo é um fosfolipídeo não hidrogenado que tem um teor de ácido oleico e/ou linoleico de mais de 70 % em peso de ácidos graxos totais.
[0023] Em uma outra configuração preferencial da presente invenção, a razão de massa de fosfolipídeo para sal de ácidos graxos é de mais de 0,005, preferencialmente mais de 0,01, mais preferencialmente mais de 0,09, com a máxima preferência mais de 0,39.
[0024] Em uma modalidade alternativa, a preparação está na forma de um pó ou de um líquido que resulta em dispersões coloidais com tamanhos médios de partícula de menos de 1 µm, preferencialmente menos de 500 nm, com a máxima preferência menos de 250 nm, quando misturados com água em um valor de pH entre pH 6,5 e 7,5.
[0025] Em outra modalidade, os componentes são finamente dispersos uns nos outros, de modo que tanto os fosfolipídeos quanto os sais de ácidos graxos estejam presentes e detectáveis em quantidades de 100 µg e menores.
[0026] Uma outra matéria da presente invenção é um meio de cultura, como um meio de cultura celular, que compreende uma preparação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.
[0027] Em uma modalidade preferencial, o meio de cultura está na forma de líquido, na forma de um gel, um pó, um granulado, um pélete ou na forma de um comprimido.
[0028] Em outras modalidades preferenciais, o meio de cultura é um meio líquido na forma concentrada 2 vezes, 3 vezes, 3,33 vezes, 4 vezes, 5 vezes ou 10 vezes (volume/volume), em relação à concentração do dito meio em uso. Isso permite a preparação de um meio de cultura "pronto para uso" por meio de simples diluição do meio concentrado com o respectivo volume de água estéril. Tais formas concentradas do meio da invenção também podem ser usadas por meio da adição do mesmo a uma cultura, por exemplo, em um processo de cultivo em batelada alimentada.
[0029] Outro aspecto da presente invenção se refere a um método para preparar uma preparação de acordo com a presente invenção, que compreende pelo menos as seguintes etapas: a. Dissolver um fosfolipídeo e um sal de ácidos graxos juntos em um solvente miscível em água e adicionar pequenas quantidades de água para dissolver totalmente o sal; b. Adicionar a solução a um sistema aquoso para preparar uma dispersão de lipídeo; c. Reduzir o tamanho de partícula da dispersão de lipídeo a um tamanho médio de partícula de menos de 500 nm, preferencialmente menos de 250 nm, por meio de sonicação ou homogeneização; d. Opcionalmente secar a preparação, preferencialmente por meio de secagem por aspersão ou congelamento.
[0030] Em uma modalidade alternativa, o método de acordo com a presente invenção compreende pelo menos as seguintes etapas: a. Dissolver o fosfolipídeo em um solvente miscível em água; b. Dissolver o sal de ácidos graxos em um sistema aquoso e adicionar a solução de fosfolipídeo para preparar uma dispersão de lipídeo; c. Reduzir o tamanho de partícula da dispersão de lipídeo a um tamanho médio de partícula de menos de 500 nm, preferencialmente menos de 250 nm, por meio de sonicação ou homogeneização; d. Opcionalmente secar a preparação, preferencialmente por meio de secagem por aspersão ou congelamento.
[0031] Em uma modalidade preferencial do método de acordo com a presente invenção, o solvente miscível em água é selecionado a partir de um ou mais dentre os seguintes: etanol, glicerol e propilenoglicol.
[0032] Outro aspecto da presente invenção se refere ao uso de uma preparação de acordo com a presente invenção para fornecer ácidos graxos poli-insaturados a células, tecidos, órgãos ou organismos, preferencialmente no campo de cultura de células e tecidos, preservação de órgãos, nutrição humana ou animal, farmacêutica ou cosmética.
[0033] Uma modalidade específica se refere ao uso de uma preparação de acordo com a presente invenção, para o cultivo e estímulo de expansão de células-tronco mesenquimais.
[0034] Uma modalidade alternativa se refere ao uso de uma preparação de acordo com a presente invenção, as um suplemento de alimento ou ração ou como um produto farmacêutico.
[0035] Uma outra matéria da presente invenção é a uma composição de gêneros alimentícios ou ração que contém uma preparação de acordo com a presente invenção e pelo menos um outro ingrediente de alimento ou ração, preferencialmente selecionado a partir de proteínas, carboidratos, gorduras, probióticos adicionais, prebióticos, enzimas, vitaminas, moduladores imunológicos, substitutos do leite, minerais, aminoácidos, coccidiostáticos, produtos à base de ácido,
medicamentos e suas combinações.
[0036] A composição de gêneros alimentícios ou ração de acordo com a presente invenção também inclui suplementos dietéticos na forma de uma pílula, cápsula, comprimido ou líquido.
[0037] Uma outra matéria da presente invenção é uma composição farmacêutica que contém uma preparação de acordo com a presente invenção e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0038] As preparações de acordo com a presente invenção, quando administradas a animais ou seres humanos, preferencialmente melhoram o estado de saúde, em particular saúde intestinal, saúde cardiovascular, saúde cardiometabólica, saúde pulmonar, saúde articular, saúde ocular, saúde mental, saúde oral ou saúde imunológica de um animal ou um ser humano.
[0039] Uma outra matéria da presente invenção é, portanto, uma composição de acordo com a presente invenção para aprimorar o estado de saúde, em particular saúde intestinal, saúde cardiovascular, saúde cardiometabólica, saúde pulmonar, saúde articular, saúde ocular, saúde mental, saúde oral ou saúde imunológica de um animal ou um ser humano é parte da presente invenção. Exemplos de trabalho
[0040] As preparações de ácidos graxos ômega-3 foram caracterizadas com os seguintes métodos:
1.1 Determinação de tamanho de partícula
[0041] O tamanho de partícula foi determinado por meio de medições de espalhamento de luz dinâmico (DLS) (Zetasizer Nano ZS, Malvern).
1.2 Medição de turbidez
[0042] A turbidez das preparações foi medida após diluição de 100x com água em um fotômetro a 600 nm em cubetas com trajetos de luz de 1 cm.
1.3 Propriedades de filtração estéril
[0043] 5 ml de preparações de líquido foram filtradas através de um filtro de seringa estéril de 0,2 µm. A facilidade da filtração foi avaliada por meio do aumento da contrapressão ou entupimento completo. A medição da turbidez por meio de fotometria a 600 nm foi avaliada antes e depois da filtração. A turbidez maior está correlacionada com tamanhos de partículas maiores. A redução da turbidez é um sinal de perda de material através da filtração, o que é indesejável visto que a composição da amostra deve ser alterada o mínimo possível.
1.4 Secagem e avaliação das propriedades do pó
[0044] As preparações foram secas por congelamento e as preparações secas foram avaliadas qualitativamente em relação à consistência e comportamento de fluxo. Exemplo 1: Preparação e caracterização de dispersões de ácidos graxos ômega-3 com dioleilfosfatidilcolina (DOPC) em tampão de fosfato
[0045] Para preparar formulações de dispersões de ácidos graxos ômega-3, 0,8 g de dioleilfosfatidilcolina (DOPC, Lipoid GmbH) foi dissolvido em 1 ml de etanol. 0,2 g de óleo de peixe (Omega-3 1400, Doppelherz®), éster etílico ômega-3 (PronovaPure® 500:200 EE, BASF), sal de lisina de ácidos graxos ômega-3 livre na forma de sal de lisina de ômega-3 (AvailOm®, Evonik), sal de ornitina de ácidos graxos ômega- 3 ou sal de arginina de ácidos graxos ômega-3 foram adicionados e dissolvidos. O sal de lisina não se dissolveu em etanol, mas foi constatado que ele pode ser dissolvido quando adicionalmente 20 µl de água destilada são adicionados.
[0046] O sal de lisina do ácido graxo ômega-3 livre na forma de sal de lisina de ômega-3 (AvailOm®, Evonik) contém cerca de 67 % de ácidos graxos e grandes quantidades de EPA e DHA de ácidos graxos ômega-3 e pequenas quantidades de ácido docosapentaenoico de ácidos graxos ômega-3 e ácido araquidônico de ácidos graxos ômega-6, isômero de ácido docosaenoico e ácido docosatetraenoico.
[0047] 1 ml das respectivas soluções foi adicionado por gotejamento a 20 ml de um tampão de fosfato 0,1 M, pH = 8, a uma temperatura de 45 °C e sob agitação intensa. O pH foi ajustado para pH = 8 com NaOH se necessário. Posteriormente, a dispersão foi colocada no gelo e sonicada (Branson Sonifier, 100 % de amplitude, 50 % de impulso) por 15 minutos para gerar dispersões de escala nanométrica, presumivelmente lipossomas. As dispersões foram filtradas de modo estéril através de filtros de seringa de 0,2 µm. A turbidez e tamanho de partícula foram medidos antes e depois da filtração estéril conforme descrito em 1.2. A preparação continha 40 g/l de fosfolipídeos e 10 g/l de ésteres ou ácidos graxos ômega-3. Em uma última etapa, as dispersões foram secas por congelamento e a aparência da preparação obtida foi analisada visualmente.
[0048] De modo surpreendente, constatou-se que as preparações obtidas com o sal de lisina, arginina ou ornitina de ácidos graxos ômega-3 tinham um tamanho de partícula menor, mostraram as melhores propriedades de filtração e resultaram em um pó substancialmente menos pegajoso após a secagem por congelamento.
Os resultados para o triglicerídeo e éster etílico como exemplo comparativo (comp.) e os sais de lisina, arginina e ornitina de ácidos graxos (de acordo com a invenção) são resumidos na tabela 1. Composição 1.1 (comp.) 1.2 (comp.) 1.3 1.4 1.5 (inv.) (inv.) (inv.) Fosfolipídeo DOPC DOPC DOPC DOPC DOPC Forma de Triglicerídeo Éster Sal de Sal de Sal de ácidos etílico lisina arginina ornitina graxos de de de ômega-3 ácidos ácidos ácidos graxos graxos graxos Tamanho 168 148 132 97 95 médio de partícula (nm) antes da filtração estéril Turbidez 0,42 0,38 0,05 n.d. n.d. antes da filtração estéril (AU) Turbidez 0,25 0,17 0,04 n.d. n.d. depois da filtração estéril (AU) Redução da 0,17 0,21 0,01 n.d. n.d. turbidez por meio de filtração estéril (AU) Desempenho entupimento entupimento fácil fácil de fácil de da filtração do filtro do filtro de filtrar filtrar filtrar
Composição 1.1 (comp.) 1.2 (comp.) 1.3 1.4 1.5 (inv.) (inv.) (inv.) Propriedades 1 1 3 n.d. n.d. do produto seco (1 = pegajoso – 4 = fluxo livre) Tabela 1: Propriedades de várias dispersões de ácidos graxos ômega-3 com DOPC Exemplo 2: Preparação de dispersões de ácidos graxos ômega- 3 e de sal de lisina de ácidos graxos ômega-3 com DOPC em água
[0049] As formulações foram preparadas conforme descrito no exemplo 1 exceto por ter sido usada água em vez de tampão de fosfato. Além do sal de lisina de ácidos graxos ômega-3 (AvailOm®, Evonik), o ácido graxo ômega-3 livre correspondente foi usado para determinar as diferenças entre as duas formas. A medição de pH com um eletrodo de pH após a adição de lipídeos à água mostrou que as formulações com o ácido livre eram bastante ácidas e precisavam ser ajustadas com NaOH antes da sonicação para obter a dispersão apropriada, ao passo que a adição dos respectivos sais resultou em preparações com um pH apropriado que poderia ser disperso por meio de sonicação sem adição de uma base. De modo surpreendente, o produto seco por congelamento contendo o sal de lisina de ácidos graxos ômega-3 (2.2) tinha fluxo melhor e era menos pegajoso do que o pó obtido a partir do processamento do ácido graxo ômega-3 livre (2.1 comparativo) e, assim, fornece benefícios em relação ao processamento de tais pós. Os resultados são mostrados na tabela 2.
Composição 2.1 (comp.) 2.2 (inventivo) Fosfolipídeo DOPC DOPC Forma de ácidos graxos ômega-3 Ácidos Sal de graxos lisina de livres ácidos graxos pH após adição de solução 4,6 9,1 etanólica de lipídeos à água Adição de NaOH (base) necessário Sim Não para obter pH neutro ou alcalino Propriedades de produto seco 2 3 (1 = oleoso, pegajoso – 5 = fluxo livre) Tabela 2: Diferenças entre as composições preparadas com ácidos graxos ômega-3 livres e sal de lisina de ácidos graxos ômega-3. Exemplo 3: Preparação e caracterização de dispersões de sal de lisina de ácidos graxos ômega-3 com DOPC em várias razões de sal de ácidos graxos para fosfolipídeo
[0050] As formulações foram preparadas conforme descrito no exemplo 1 exceto por ter sido usada água em vez de tampão de fosfato e diferentes razões de sal de ácidos graxos ômega- 3 para fosfolipídeo foram usadas. Todas as dispersões aquosas obtidas continham 10 g/l de sal de ácidos graxos ômega-3, mas diferentes concentrações de DOPC. Uma solução coloidal aquosa de sal de ácidos graxos ômega-3 sem fosfolipídeo também foi preparada para comparação. 5 ml das dispersões obtidas foram diluídas em 45 ml de tampão de fosfato 20 mM, pH = 7, para avaliar as propriedades de dispersão em pH fisiológico por meio de medições de tamanho de partícula e turbidez. A turbidez das dispersões diluídas foi medida em placas de microtitulação de 96 poços a 600 nm com um volume de líquido de 100 µl em um leitor de microplaca (Tecan Infinite 200 PRO). De modo surpreendente, constatou-se que pequenas quantidades de DOPC já foram suficientes para aprimorar a dispersão de sal de ácidos graxos ômega-3 em comparação com o sal de ácidos graxos ômega-3 sem adição de fosfolipídeo. Isso pode ser demonstrado por redução da turbidez e tamanhos menores de partículas. Os resultados estão resumidos na Tabela 3.
Composição 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 DOPC (g/l) 40 20 10 4 1 0 Sal de lisina de 10 10 10 10 10 10 ácidos graxos ômega-3 (g/l) Razão DOPC/ômega-3 4 2 1 0,4 0,1 - Diâmetro médio de 95 194 226 157 388 n. partícula (nm) após d. diluição em pH = 7 Absorbância (AU) a 0,2 0,2 0,3 0,3 0,4 0,9 600 nm após diluição em pH = 7 Tabela 3: Composições com várias razões de sal de lisina de ácidos graxos ômega-3 de DOPC, tamanho de partícula e turbidez obtidos após diluição de composições em pH = 7 (n. d.: não determinado) Exemplo 4: Preparação e caracterização de dispersões de ácidos graxos ômega-3 com lecitina em água
[0051] As formulações foram preparadas conforme descrito no exemplo 3, exceto por 0,8 g de lecitina de girassol sem óleo/fosfatidilcolina com um teor de fosfatidilcolina > 90
% em peso (Lipoid H 100) ter sido usado em vez de DOPC. As diluições em tampão de fosfato em pH = 7 foram preparadas e a turbidez foi medida conforme descrito no exemplo 3. Os resultados são mostrados na tabela 4 e foram comparáveis àqueles obtidos com DOPC. Pequenas quantidades de fosfolipídeo já resultaram em uma dispersão muito mais fina dos sais de ácidos graxos nesse valor de pH conforme indicado por uma menor turbidez. As diferenças também foram fáceis de observar visualmente. Embora 4.6 parecesse bastante leitosa, as composições contendo fosfolipídeo eram quase transparentes e apenas ligeiramente turvas. Composição 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 Fosfatidilcolina Lipoid 40 20 10 4 1 0 H100 (g/l) Sal de lisina de ácidos 10 10 10 10 10 10 graxos ômega-3 (g/l) Razão Lipoid H100/ômega-3 4 2 1 0,4 0,1 Absorbância (600 nm) após 0,21 0,18 0,26 0,13 0,29 0,75 diluição em pH = 7 Tabela 4: Composições com várias razões de sal de lisina de ácidos graxos ômega-3 de lecitina, tamanho de partícula e turbidez obtidos após diluição de composições em pH = 7 Exemplo 5: Método alternativo para preparar dispersões de sal de ácidos graxos ômega-3 com dioleilfosfatidilcolina em água
[0052] Constatou-se que as preparações de acordo com a invenção podem ser preparadas em uma sequência de mistura que simplifica o processo e não é adequada para forma de ácidos graxos ômega-3 livres ou respectivos ésteres. Em vez de dissolver o sal de lisina de ácidos graxos ômega-3 com o fosfolipídeo em etanol, ele foi diretamente dissolvido em água em uma concentração de 10 g/l, e a solução etanólica de fosfolipídeo foi adicionada subsequentemente. Posteriormente, a dispersão foi sonicada e filtrada de modo estéril conforme descrito nos exemplos anteriores. Exemplo 6: Estimulação da produção de ácido 18-hidroxi- eicosapentaenoico (18-HEPE) na cepa B. megaterium DSM 32963
[0053] Devido a sua baixa polaridade, a biodisponibilidade de ácidos graxos ômega-3 frequentemente não é suficiente, e apenas pequenas quantidades são realmente usadas e convertidas pelas células em reações bioquímicas. Pode-se mostrar que as preparações descritas nesta invenção intensificam a biodisponibilidade e a conversão metabólica de ácidos graxos ômega-3 de células microbianas, o que é relevante em aplicações nutricionais como utilização e modulação de microbioma.
[0054] O Bacillus megaterium DSM 32963 foi identificado por triagem de isolados de ocorrência natural. O mesmo foi depositado junto à DSMZ em 27 de novembro de 2018 sob as provisões do Tratado de Budapeste sob o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para fins de Procedimento de Patentes sob o Número de Acesso como mencionado anteriormente em nome da Evonik Degussa GmbH.
[0055] As preparações descritas na tabela 1 foram adicionadas a culturas microbianas de Bacillus megaterium DSM 32963 em culturas líquidas em frascos agitadores. Com a finalidade de comparação, uma solução de sal de lisina de ácidos graxos ômega-3 em água com a mesma concentração dos ácidos graxos ômega-3 também foi adicionada. Constatou-se que o Bacillus megaterium DSM 32963 catalisa a conversão de ácido eicosapentaenoico (EPA) em ácido 18-hidroxi-
eicosapentaenoico (18-HEPE) bioativo.
[0056] A partir de um caldo de 10 ml de Luria Bertami (LB, Thermo Fisher Scientific) com 0,1 % de glicose (LBG), uma cultura de B. megaterium DSM 32963 foi cultivada por 24 h a 30 °C e 200 rpm em um frasco de 100 ml. A cultura completa foi transferida para uma cultura principal de 200 ml em LBG. A cultura principal foi cultivada por 6 h a 30 °C e 200 rpm em um frasco de 2 l. A cultura celular foi então colhida em porções de 10 ml, o sobrenadante foi removido por centrifugação (15 min, 4000 rpm, temperatura ambiente), e o pélete celular foi ressuspenso em 10 ml de LBG ou LBG contendo 9,76 g/l de FeSSIF-V2 (biorelevant.com), que é uma mistura de taurocolato, fosfolipídeos e outros componentes projetados para estimular os tensoativos biliares, e 2 ml de solução estoque de lipídeos foram adicionados, os quais foram preparados a partir das preparações filtradas de modo estéril no exemplo 2 para obter a mesma concentração de EPA em cada experimento (tabela 5), respectivamente. Além disso, os suplementos também foram adicionados respectivamente aos diferentes meios em frascos agitadores sem células, e tratados sob as mesmas condições para controlar a formação de produto não bioquímico. Essas culturas e respectivos controles foram incubados em frascos agitadores de 100 ml por 16 h a 30 °C e 200 rpm.
Preparação Preparação de Teor de EPA solução estoque calculado (g/l) Sal de lisina de ômega-3 0,6 g em 100 ml 2,04 (preparação 4.6) em tampão de PBS
Preparação Preparação de Teor de EPA solução estoque calculado (g/l) Preparação de óleo de não diluído 2,04 peixe com DOPC (preparação
1.1) Preparação de éster 4,08 ml + 2,04 etílico ômega-3 com DOPC 5,92 ml em (preparação 1.2) tampão de PBS Preparação de sal de 6 ml + 4 ml em 2,04 lisina de ômega-3 com DOPC tampão de PBS (preparação 1.3) Tabela 5: Suplementos, preparação de soluções estoque e seu teor de EPA calculado (g/l)
[0057] Subsequentemente, as células foram separadas por centrifugação (15 min, 4000 rpm, temperatura ambiente), e os sobrenadantes foram retirados para analisar a presença de metabólitos de ômega-3. Os sobrenadantes foram diluídos com um solvente consistindo em uma mistura de água/acetonitrila (a razão sobrenadantes : solvente foi de 1:2, composição de solvente: 65 % de H2O, pH8 e 35 % de MeCN).
[0058] As amostras de sobrenadante diluído foram filtradas e, então, usadas para a detecção de ácido 18- hidroxi-eicosapentaenoico (18-HEPE) por análise de LC/ESI- MS (Agilent QQQ 6420, Gemini 3 µ de C6-Fenila) em Modo SIM positivo em m/z 318, bem como o composto precursor de EPA em m/z 302.
[0059] Na presença e ausência de sais biliares, o 18-HEPE foi formado e detectado no sobrenadante com a máxima eficácia, quando o ácido graxo ômega-3 foi fornecido a células de Bacillus megaterium DSM 32963 como sal de lisina de ômega-3 formulado com fosfolipídeos. Os resultados estão resumidos na Tabela 6. Teor de 18-HEPE (mg/l) Suplemento adicionado ácidos sobrenadante controle -netto- biliares de cultura sem células celular produzido Tampão de PBS - 0,0 0,0 0,0 Sal de lisina de ômega-3 - >0,2 >0,3 0,0 (4.6) Sal de lisina de ômega-3 - >0,5 >0,1; <0,2 >0,3 com DOPC (1.3) Óleo de peixe com DOPC - >0,05 0,0 >0,05 (1.1) Éster etílico ômega-3 com - 0,0 >0,1 0,0 DOPC (1.2) Tampão de PBS + 0,0 0,0 0,0 Sal de lisina de ômega-3 + >1,2 >0,5; <1 >0,2 com DOPC (1.3) Óleo de peixe com DOPC + 0,0 0,0 0,0 (1.1) Éster etílico ômega-3 com + 0,0 0,0 0,0 DOPC (1.2) Tabela 6: concentrações de 18-HEPE medidas (mg/l) de sobrenadantes de cultura na ausência e presença de ácidos biliares Exemplo 7: Expansão estimulada de células estromais mesenquimais da medula óssea humana pela adição de sais de ácidos graxos ômega-3 dispersos em fosfolipídeo
[0060] As células estromais mesenquimais da medula óssea humana (MSCs) são usadas para propósitos médicos na forma de terapias celulares e para derivar tipos específicos de células e tecidos para engenharia de tecidos, por exemplo, para a geração de condrócitos para produzir cartilagem in vitro. Para fazer isso, são necessárias composições de meio adequadas que permitem a expansão/multiplicação eficiente de células isoladas. Em geral, presume-se que os lipídeos precisem ser suplementados se forem usados meios quimicamente definidos livres de soro. A adequação das formulações de lipídeos descritas nesta invenção para expandir de modo eficiente as células estromais foi avaliada conforme descrito na seguinte passagem.
[0061] Um meio de cultura celular quimicamente definido foi preparado conforme descrito por Jung et al. (Cytotherapy, 2010; 12: 637–657). A composição do meio é mostrada na Tabela
7. Ingrediente Concentração aplicada Meio de DMEM/Ham F-12, 1:1 L-glutamina 1,5 mM Concentrado de lipídeos 0,1 % quimicamente definido Bicarbonato de sódio 1,725 g/l HEPES 4,90 mM Insulina 23 mg/l Apo-transferrina humana 25 mg/l Dicloridrato de putrescina 9 mg/l Progesterona 5,66 µg/l Albumina sérica humana (HSA) 4 g/l bFGF 20 µg/l TGF-ß1 10 µg/l Ácido ascórbico 50 mg/l Hidrocortisona 100 nM Fetuína 1 g/l Substrato de fixação 0,1 % de Gelatina Tabela 7: composição de meio quimicamente definido para cultivo de células estromais mesenquimais
[0062] O concentrado de lipídeos quimicamente definido foi obtido por Thermo Fisher Scientific (nº de Catálogo 11905031) e consistia em uma mistura de ácidos graxos e colesterol formulada com tensoativos não iônicos (Polissorbato 80 e Pluronic F-68).
[0063] Dois lotes adicionais desse meio foram preparados, um sem concentrado de lipídeos quimicamente definido e um em que o concentrado de lipídeos quimicamente definido foi substituído pela preparação de sal de lisina de ômega-3 formulada com DOPC (exemplo 1.3). 0,1 ml de preparação líquida foi adicionado a 100 ml de meio de cultura celular, correspondendo a uma diluição de 1000x e resultando em uma concentração de ácidos graxos de cerca de 10 mg/l.
[0064] As células estromais mesenquimais da medula óssea humana derivadas em meio quimicamente definido a partir de células mononucleares de medula óssea foram obtidas junto à StemCell Technologies, degeladas conforme recomendado pelo fornecedor e expandidas nas três versões diferentes de meio. O meio foi inoculado em uma densidade celular de 150.000 células/ml, e as células foram expandidas em frascos de cultura celular T25 em uma incubadora de CO2. O meio foi substituído a cada 2-3 dias, e as células foram movidas antes de se tornarem confluentes. As células foram separadas com AccutaseTM (StemCell Technologies), a concentração celular viável foi determinada, e o meio fresco foi inoculado com
150.000 células/ml em cada passagem.
[0065] As duplicações da população acumulada (CPD), como um indicador de desempenho de crescimento, foram calculadas a partir do número de passagens e as concentrações celulares foram medidas.
De modo surpreendente, constatou-se que o concentrado de lipídeos quimicamente definido conforme descrito na literatura não teve um efeito positivo nas CPD (CPD = 4,63) quando em comparação com o meio sem adição de lipídeos (CPD = 4,77). Em contrapartida a isso, a adição de sal de lisina de ômega-3 formulada com DOPC teve efeitos positivos e resultou no aumento das CPD de 7,37.

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES
1. Preparação caracterizada por compreender uma dispersão de - pelo menos um fosfolipídeo e - pelo menos um sal de ácidos graxos de um cátion com um ânion derivado de um ácido graxo ômega-3 ou ômega-6.
2. Preparação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o ácido graxo é selecionado a partir de ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosa- hexaenoico (DHA), ácido araquidônico (ARA), ácido alfa- linolênico, ácido estearidônico, ácido eicosatetraenoico, ácido docosapentaenoico, ácido linoleico, ácido γ-linolênico e/ou seus derivados, preferencialmente selecionados a partir de EPA e DHA de ácidos graxos ômega-3.
3. Preparação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o cátion no sal de ácidos graxos é um cátion orgânico derivado de uma das seguintes: lisina, arginina, ornitina, colina e misturas das mesmas.
4. Preparação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o fosfolipídeo é um fosfolipídeo sem óleo que compreende um teor de fosfatidilcolina de mais de 40 % em peso, preferencialmente 70 % em peso, mais preferencialmente mais de 90 % em peso, e um teor de fosfatidiletanolamina de menos de 5 % em peso, preferencialmente menos de 1 % em peso.
5. Preparação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o fosfolipídeo é um fosfolipídeo não hidrogenado que tem um teor de ácido oleico e/ou linoleico de mais de 70 % em peso de ácidos graxos totais.
6. Preparação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a razão de massa de fosfolipídeo para sal de ácidos graxos é de mais de 0,005, preferencialmente mais de 0,01, mais preferencialmente mais de 0,09, com a máxima preferência mais de 0,39.
7. Preparação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a preparação está na forma de um pó ou de um líquido que resulta em dispersões coloidais com tamanhos médios de partícula de menos de 1 µm, preferencialmente menos de 500 nm, com a máxima preferência menos de 250 nm, quando misturados com água em um valor de pH entre pH 6,5 e 7,5.
8. Preparação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que os componentes são finamente dispersos uns nos outros, de modo que tanto os fosfolipídeos quanto os sais de ácidos graxos estejam presentes e detectáveis em quantidades de 100 µg e menores.
9. Meio de cultura, como um meio de cultura celular, caracterizado por compreender uma preparação conforme definida em qualquer uma das reivindicações anteriores.
10. Meio de cultura, de acordo com a reivindicação 9, sendo o dito meio de cultura caracterizado por estar na forma de líquido, na forma de um gel, um pó, um granulado, um pélete ou na forma de um comprimido.
11. Método para preparar uma preparação conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 caracterizado por compreender pelo menos as seguintes etapas: a. Dissolver um fosfolipídeo e um sal de ácidos graxos juntos em um solvente miscível em água e adicionar pequenas quantidades de água para dissolver totalmente o sal; b. Adicionar a solução a um sistema aquoso para preparar uma dispersão de lipídeo; c. Reduzir o tamanho de partícula da dispersão de lipídeo a um tamanho médio de partícula de menos de 500 nm, preferencialmente menos de 250 nm, por meio de sonicação ou homogeneização; d. Opcionalmente secar a preparação, preferencialmente por meio de secagem por aspersão ou congelamento.
12. Método para preparar uma preparação conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 caracterizado por compreender pelo menos as seguintes etapas: a. Dissolver o fosfolipídeo em um solvente miscível em água; b. Dissolver o sal de ácidos graxos em um sistema aquoso e adicionar a solução de fosfolipídeo para preparar uma dispersão de lipídeo; c. Reduzir o tamanho de partícula da dispersão de lipídeo a um tamanho médio de partícula de menos de 500 nm, preferencialmente menos de 250 nm, por meio de sonicação ou homogeneização; d. Opcionalmente secar a preparação, preferencialmente por meio de secagem por aspersão ou congelamento.
13. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que o solvente miscível em água é selecionado a partir de um ou mais dentre os seguintes: etanol, glicerol e propilenoglicol.
14. Uso de uma preparação conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 caracterizado por ser para fornecer ácidos graxos poli-insaturados a células, tecidos, órgãos ou organismos, preferencialmente no campo de cultura de células e tecidos, preservação de órgãos, nutrição humana ou animal, farmacêutica ou cosmética.
15. Uso de uma preparação conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 caracterizado por ser para o cultivo e estímulo de expansão de células-tronco mesenquimais.
16. Uso de uma preparação conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 caracterizado por ser como um suplemento de alimento ou ração ou como um produto farmacêutico.
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