BR112021008082A2

BR112021008082A2 - terapia contra o câncer com células imunitárias anti-liv1

Info

Publication number: BR112021008082A2
Application number: BR112021008082-1A
Authority: BR
Inventors: Jonathan Alexander Terrett; Jason Sagert
Original assignee: Crispr Therapeutics Ag
Priority date: 2018-11-07
Filing date: 2019-11-07
Publication date: 2021-08-10
Also published as: IL282531A; US20200231699A1; EP3877419A1; CO2021006493A2; PH12021551036A1; CA3118824A1; JP7471289B2; CN113015750A; ZA202102740B; JP2022513586A; WO2020095249A1; US20210292429A1; AU2019376903A1; SG11202104523PA; EA202191257A1; MX2021005395A; KR20210089707A

Abstract

TERAPIA CONTRA O CÂNCER COM CÉLULAS IMUNITÁRIAS ANTI-LIV1. A presente invenção refere-se, em algumas modalidades, a métodos e composições (por exemplo, composições celulares) para o tratamento de câncer, tais como malignidades LIV1+.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TERA- PIA CONTRA O CÂNCER COM CÉLULAS IMUNITÁRIAS ANTI- LIV1".

PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório sob no U.S. 62/756.723 depositado em 7 de novembro de 2018, cuja reve- lação é deste modo incorporada a título de referência em sua totalida- de.

INCORPORAÇÃO A TÍTULO DE REFERÊNCIA DE MATERIAL APRESENTADO ELETRONICAMENTE

[002] A Listagem de Sequências, que faz parte da presente reve- lação, é apresentada simultaneamente com o relatório descritivo como um arquivo de texto. O nome do arquivo de texto que contém a Lista- gem de Sequências é "CT113_Seqlisting.txt", que foi criado em 7 de novembro de 2019 e tem 191.166 bytes. A matéria da Listagem de Sequência é incorporada no presente documento em sua totalidade a título de referência.

ANTECEDENTES

[003] A terapia com células T de receptor de antígeno quimérico (CAR) usa células T geneticamente modificadas para alvejar e matar mais especificamente e eficientemente células cancerosas. Após as células T terem sido coletadas do sangue, as células são manipuladas para incluírem CARs em sua superfície. Os CARs podem ser introdu- zidos nas células T usando tecnologia de edição gênica CRISPR/Cas9. Quando estas células T de CAR alogênicas são injeta- das em um paciente, os receptores permitem que as células T matem as células cancerosas.

SUMÁRIO

[004] LIV1, um membro da família ZIP de proteínas transportado- ras de zinco transmembranares altamente conservadas, é expresso em níveis elevados nos tumores e câncer de mama de receptor de es- trogênio-positivo e tumores dos linfonodos. A expressão aberrante adi- cional de transportadores de zinco como LIV1 é conhecida por levar à deficiência ou admissão de Zn desregulada, levando ao crescimento descontrolado tal aquele que ocorre no câncer. Portanto, LIV1 é uma proteína transmembranar desejável para alvejar câncer. De fato, a pro- teína LIV-1 foi implicada no câncer de mama, câncer de próstata, tu- mores escamosos e tumores neurais.

[005] Alguns aspectos da presente revelação fornecem uma célu- la T manipulada que compreende um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que o CAR compreende um ectodomínio que se liga especificamente a LIV1. Em algumas modali- dades, a célula T manipulada compreende adicionalmente um gene interrompido da região constante de cadeia alfa do receptor de células T (TRAC). Por exemplo, o gene TRAC pode ser interrompido por in- serção do ácido nucleico que codifica um CAR. Em algumas modali- dades, a célula T manipulada compreende adicionalmente um gene interrompido de beta-2-microglobulina (β2M).

[006] O ectodomínio do CAR, em algumas modalidades, compre- ende um anticorpo anti-LIV1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-LIV1 é um fragmento variável de cadeia única (scFv) anti-LIV1. O scFv anti-LIV1, em algumas modalidades, compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer um dos SEQ ID NOs: 54, 70, 83 ou 86. Em algumas modalidades, o scFv anti-LIV1 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 55 ou 90 e/ou uma re- gião variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 56 ou 88. Em algumas modalidades, o scFv anti-LIV1 compreende um VH que compreende sequências de aminoácidos de CDR de SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO:

58 e/ou SEQ ID NO: 59; e/ou o scFv anti-LIV1 compreende uma se- quência de VL que compreende sequências de aminoácidos de CDR de SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 e/ou SEQ ID NO: 62.

[007] O CAR, em algumas modalidades, compreende um domí- nio de sinalização citoplasmática CD3ζ. Em algumas modalidades, o CAR compreende um domínio coestimulador CD28 ou um domínio co- estimulador 41BB.

[008] Em algumas modalidades, o gene TRAC compreende a se- quência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 63, 64, 107 ou 111, e/ou em que o CAR compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer um dos SEQ ID NOs: 49, 51, 104 ou 108. Em algumas modalidades, o gene β2M interrompido compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir de qualquer um dos SEQ ID NOs: 9 a 14.

[009] É também proporcionada aqui, em alguns aspectos, uma população de células T manipuladas (por exemplo, que compreende um ácido nucleico que codifica um CAR anti-LIV1), em que pelo me- nos 25% ou pelo menos 50% das células T manipuladas da população expressam o CAR. Em alguns aspectos, pelo menos 15% ou pelo me- nos 50% das células T manipuladas da população expressam o CAR. Por exemplo, pelo menos 70% das células T manipuladas da popula- ção expressam o CAR. Em outro exemplo, pelo menos 30% das célu- las T manipuladas da população expressam o CAR.

[0010] Em algumas modalidades, pelo menos 25% das células T manipuladas da população expressam o CAR após pelo menos 7 dias ou pelo menos 14 dias de proliferação in vitro.

[0011] Em algumas modalidades, pelo menos 50% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectável de pro- teína do receptor de células T (TCR). Por exemplo, pelo menos 90% das células T manipuladas da população podem não expressar um nível detectável de proteína TCR.

[0012] Em algumas modalidades, pelo menos 50% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectável de pro- teína β2M. Por exemplo, pelo menos 70% das células T manipuladas da população podem não expressar um nível detectável de proteína β2M.

[0013] Em algumas modalidades, as células T manipuladas da po- pulação, quando cocultivadas in vitro com uma população de células cancerosas que expressam LIV1, induzem a lise celular de pelo menos 50% das células cancerosas da população. Por exemplo, as células T manipuladas da população podem induzir a lise celular de pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% das células cancerosas da população. Em algumas modalidades, as células T manipuladas da população, quando cocultivadas in vitro com uma população de células cancerosas, secretam IFNγ. Em algumas modalidades, a razão entre células T manipuladas e células cancerosas é 1:1 a 2:1. As células cancerosas podem ser, por exemplo, células de sarcoma ou células de câncer de mama. Outras células cancerosas podem ser alvejadas.

[0014] Em algumas modalidades, a capacidade proliferativa das células T manipuladas da população está dentro de 10% da capacida- de proliferativa das células de controle.

[0015] Outros aspectos da presente revelação fornecem um méto- do que compreende a administração da população de células T mani- puladas como descrito no presente documento. Em algumas modali- dades, a porcentagem de peso corporal do indivíduo, após 5-10 dias de administração, está dentro de 10% do peso corporal inicial do indi- víduo, em que o peso corporal inicial do indivíduo é o peso corporal do indivíduo no momento da administração. Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer. O câncer pode expressar LIV1, por exemplo.

[0016] Aspectos adicionais da presente revelação fornecem um método para produção de uma célula T manipulada, em que o método compreende (a) entregar a uma célula T de uma nuclease guiada por RNA, um gRNA que alveja um gene TRAC e um vetor que compreen- de um modelo doador que compreende um ácido nucleico que codifica um CAR que compreende um ectodomínio que se liga especificamente a LIV1, em que o ácido nucleico que codifica o CAR é flanqueado por braços de homologia esquerdo e direito para o gene TRAC e (b) pro- dução de uma célula T manipulada. Em algumas modalidades, o gRNA que alveja o gene TRAC compreende a sequência de nucleotí- deos de SEQ ID NO: 18 ou 19 ou alveja a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40.

[0017] Em algumas modalidades, o método compreende adicio- nalmente entregar à célula T um gRNA que alveja o gene β2M. Em algumas modalidades, o gRNA que alveja o gene β2M compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 20 ou 21 ou alveja a se- quência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 41.

[0018] Em algumas modalidades, a nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cas9, opcionalmente uma nuclease Cas9 de S. pyoge- nes.

[0019] Em algumas modalidades, o modelo doador compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer um dos SEQ ID NOs: 63, 64, 107 ou 111.

[0020] Em algumas modalidades, o CAR compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 49, 51, 104 ou 108.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0021] A Figura 1 mostra resultados de citometria de fluxo para avaliar níveis de expressão de CAR de TRAC, β2M, e anti-Liv1a na superfície celular da população de célula editada.

[0022] As Figuras 2A-2B mostram que as células T de CAR anti-

Liv1a, particularmente aquelas que expressam os construtos de CTX971, CTX975 e CTX976, exibiram citotoxicidade potente para as linhagens celulares A498 (Figura 2A) e ZR-75-1 (Figura 2B).

[0023] As Figuras 3A-3D mostram a secreção de citocina de célu- las T de CAR anti-Liv1a quando cocultivadas com linhagens celulares alvo A498 e ZR-75-1. As Figuras 3A e 3B mostram secreção da citoci- na efetora interferon-ɣ (IFN-ɣ) nas linhagens celulares A498 (Figura 3A) e ZR-75-1 (Figura 3B). As Figuras 3C e 3D mostram secreção da citocina efetora interleucina-2 (IL-2) nas linhagens celulares A498 (Fi- gura 3C) e ZR-75-1 (Figura 3D).

[0024] A Figura 4 mostra um alinhamento dos construtos de scFV (VL e VH) – 971 (SEQ ID NO: 54); 973 (SEQ ID NO: 82); 975 (SEQ ID NO: 83); 977 (SEQ ID NO: 84)

[0025] A Figura 5 mostra um alinhamento dos construtos de scFV (VH e VL) - 979 (SEQ ID NO: 70); 974 (SEQ ID NO: 85); 976 (SEQ ID NO: 86); 978 (SEQ ID NO: 87), 972 (SEQ ID NO: 127)

DESCRIÇÃO DETALHADA Antígeno de Câncer LIV1

[0026] Em algumas modalidades, as células T da presente revela- ção são manipuladas com um receptor de antígeno quimérico (CAR) projetado para alvejar LIV1. LIV1, também conhecido como Família de Carreador Soluto 39 Membro 6, SLC39A6, ZIP6, e LIV-1, é um mem- bro da família ZIP de proteínas transportadoras de zinco transmem- branares altamente conservadas. LIV1 é expresso em níveis elevados no câncer de mama, por exemplo, câncer de mama positivo de recep- tor de estrogênio, câncer de próstata, tumores escamosos, por exem- plo, da pele, bexiga, pulmão, colo uterino, endométrio, cabeça e pes- coço e trato biliar e tumores neuronais. Notavelmente, LIV1 tem uma expressão restrita em tecidos normais, por exemplo, mama, próstata e testículo não canceroso. Portanto, LIV1 é uma proteína transmembra-

nar desejável para alvejar câncer. De fato, a proteína LIV-1 foi implica- da no câncer de mama, câncer de próstata, tumores escamosos e tu- mores neurais.

[0027] Assim, em algumas modalidades, as células T da presente revelação são manipuladas para expressarem um CAR que compre- ende um anticorpo anti-LIV1 (por exemplo, scFv anti-LIV1). Em algu- mas modalidades, o anticorpo anti-LIV1 é um scFv anti-LIV1 codificado pela sequência de qualquer um dos SEQ ID NOs: 53, 69, 97, 102, 106, 110, 114 ou 118. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-LIV1 é um scFv anti-LIV1 que compreende a sequência de qualquer um dos SEQ ID NOs: 54, 70, 82, 83, 84, 85, 86 ou 87. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-LIV1 é um scFv anti-LIV1 que compreende um VH que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer um dos SEQ ID NOs: 55, 90 ou 98. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-LIV1 é um scFv anti-LIV1 compreendendo uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 56, 88 ou

128. Em algumas modalidades, um CAR que compreende um anticor- po anti-LIV1 é codificado pela sequência de qualquer um dos SEQ ID NOs: 49, 51, 65, 67, 95, 100, 104, 108, 112 ou 116. Em algumas mo- dalidades, um CAR que compreende um anticorpo anti-LIV7 é codifi- cado por uma sequência que compreende um ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntico aos SEQ ID NOs: 49, 51, 65, 67, 95, 100, 104, 108, 112 ou 116. Em algumas modalidades, um CAR que com- preende um anticorpo anti-LIV1 compreende a sequência de qualquer um dos SEQ ID NOs: 49, 51, 65, 67, 95, 100, 104, 108, 112 ou 116. Em algumas modalidades, um CAR que compreende um anticorpo an- ti-LIV1 compreende um anticorpo anti-LIV1 como descrito no docu- mento US 9.228.026. Edição de Múltiplos Genes

[0028] As células T manipuladas da presente revelação, em algu-

mas modalidades, incluem mais do que uma edição gênica, por exem- plo, em mais do que um gene. Por exemplo, uma célula T manipulada pode compreender um gene da região constante de cadeia alfa do re- ceptor de células T (TRAC) interrompido, um gene da beta-2- microglobulina (β2M) interrompido, um gene de morte celular progra- mada-1 (PD-1 ou PDCD1) interrompido, um gene CD70 interrompido ou qualquer combinação de dois ou mais dos genes interrompidos an- teriores. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compre- ende um gene TRAC interrompido, um gene β2M interrompido e um gene CD70 interrompido. Em algumas modalidades, uma célula T ma- nipulada compreende um gene TRAC interrompido, um gene β2M in- terrompido e um gene PD-1 interrompido. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende um gene TRAC interrompido, um gene β2Minterrompido, um gene CD70 interrompido e um gene PD-1 interrompido.

[0029] Deve ser entendido que a interrupção gênica engloba modi- ficação gênica através da edição gênica (por exemplo, usando edição gênica CRISPR/Cas para inserir ou deletar um ou mais nucleotídeos). Em algumas modalidades, um gene interrompido é um gene que não codifica proteína funcional. Em algumas modalidades, uma célula que compreende um gene interrompido não expressa (por exemplo, na su- perfície da célula) um nível detectável (por exemplo, por anticorpo, por exemplo, por citometria de fluxo) da proteína codificada pelo gene. Uma célula que não expressa um nível detectável da proteína pode ser referida como uma célula inativada. Por exemplo, uma célula que tem uma edição no gene β2M pode ser considerada uma célula com nocaute de β2M se a proteína β2M não puder ser detectada à superfí- cie da célula usando um anticorpo que se liga especificamente à prote- ína β2M.

[0030] São fornecidas no presente documento, em algumas moda-

lidades, as populações de células nas quais uma determinada porcen- tagem das células foi editada (por exemplo, geneβ2M editado), resul- tando em uma determinada porcentagem de células que não expres- sam um determinado gene e/ou proteína. Em algumas modalidades, pelo menos 50% (por exemplo, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 85%) das células de uma população de células editadas por genes são células inativadas em β2M. Em algumas mo- dalidades, pelo menos 50% das células (por exemplo, células T) da população não expressam níveis detectáveis de proteína β2M. Em al- gumas modalidades, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo me- nos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% das células de uma população de células editadas por genes podem ser células com no- caute de β2M.

[0031] Métodos para usar a tecnologia de edição gênica CRISPR- Cas para criar uma deleção genômica em uma célula (por exemplo, para realizar nocaute de um gene em uma célula) são conhecidos (Bauer DE et al. Vis. Exp. 2015;95;e52118). Edição do Gene TRAC

[0032] Em algumas modalidades, uma célula T manipulada com- preende um gene TRAC interrompido. Esta interrupção leva à perda de função do TCR e torna as células T manipuladas não alorreativas e adequadas para transplante alogênico, minimizando o risco de doença de enxerto versus hospedeiro. Em algumas modalidades, a expressão do gene TRAC endógeno é eliminada para prevenir uma resposta de enxerto-versus-hospedeiro. Em algumas modalidades, uma interrup- ção na expressão do gene TRAC é criada inserindo um receptor de antígeno quimérico (CAR) no gene TRAC (por exemplo, usando um vetor viral adenoassociado (AAV) e modelo de doador). Em algumas modalidades, uma interrupção na expressão do gene TRAC é criada por gRNAs que alvejam a região genômica de TRAC. Em algumas modalidades, uma deleção genômica no gene TRAC é criada reali- zando-se nocaute de um receptor de antígeno quimérico (CAR) no ge- ne TRAC (por exemplo, usando um vetor AAV e um modelo de doa- dor). Em algumas modalidades, uma interrupção na expressão do ge- ne TRAC é criada por gRNAs que alvejam a região genômica de TRAC e inserção de um receptor de antígeno quimérico (CAR) no ge- ne TRAC.

[0033] Exemplos não limitantes de sequências de gRNA de TRAC modificadas e não modificadas que podem ser usadas como fornecido no presente documento para criar uma interrupção genômica no gene TRAC estão listados na Tabela 4 (por exemplo, SEQ ID NOS: 18 e 19). Consulte também Pedido Internacional sob no PCT/US2018/032334, depositado em 11 de maio de 2018, incorporado no presente a título de referência. Outras sequências de gRNA podem ser desenhadas usando a sequência do gene TRAC localizada no cromossomo 14 (GRCh38: cromossomo 14: 22,547,506-22,552,154; Ensembl; ENSG00000277734). Em algumas modalidades, gRNAs que alvejam a região genômica de TRAC criam Indels no gene TRAC inter- rompendo a expressão do mRNA ou proteína.

[0034] Em algumas modalidades, pelo menos 50% de uma popu- lação de células T manipuladas não expressam um nível detectável de proteína de superfície do receptor de células T (TCR). Por exemplo, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de uma população podem não expressar um nível detec- tável de proteína de superfície TCR. Em algumas modalidades, 50%- 100%, 50%-90%, 50%-80%, 50%-70%, 50%-60%, 60%-100%, 60%- 90%, 60%-80%, 60%-70%, 70%-100%, 70%-90%, 70%-80%, 80%- 100%, 80%-90%, ou 90%-100% da população de células T manipula-

das não expressam um nível detectável de proteína de superfície TCR.

[0035] Em algumas modalidades, os gRNAs que alvejam a região genômica de TRAC criam Indels no gene TRAC que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das se- guintes sequências na Tabela 1: Tabela 1. Sequência SEQ ID NO: AAGAGCAACAAATCTGACT 1 AAGAGCAACAGTGCTGTGCCTGGAGCAACAAATCT 2

GACTAAGAGCAACAAATCTGACT AAGAGCAACAGTGCTGGAGCAACAAATCTGACTAA 3

GAGCAACAAATCTGACT AAGAGCAACAGTGCCTGGAGCAACAAATCTGACTA 4

AGAGCAACAAATCTGACT AAGAGCAACAGTGCTGACTAAGAGCAACAAATCTG 5

ACT AAGAGCAACAGTGCTGTGGGCCTGGAGCAACAAA 6

TCTGACTAAGAGCAACAAATCTGACT AAGAGCAACAGTGCTGGCCTGGAGCAACAAATCT 7

GACTAAGAGCAACAAATCTGACT AAGAGCAACAGTGCTGTGTGCCTGGAGCAACAAAT 8

CTGACTAAGAGCAACAAATCTGACT

[0036] Em algumas modalidades, uma célula T manipulada com- preende uma deleção no gene TRAC em relação às células T não mo- dificadas. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada com- preende uma deleção de 15-30 pares de bases no gene TRAC em re- lação às células T não modificadas. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende uma deleção de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 pares de bases no gene TRAC relativo às células T não modificadas. Em algumas modalida- des, uma célula T manipulada compreende uma deleção de mais do que 30 pares de bases no gene TRAC em relação às células T não modificadas. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende uma deleção de 20 pares de bases no gene TRAC em relação às células T não modificadas. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende uma deleção de SEQ ID NO: 92 (AGAGCAACAGTGCTGTGGCC) no gene TRAC em relação às célu- las T não modificadas. Em algumas modalidades, uma célula T mani- pulada compreende uma deleção que compreende o SEQ ID NO: 92 (AGAGCAACAGTGCTGTGGCC) no gene TRAC em relação às célu- las T não modificadas. Em algumas modalidades, uma célula T mani- pulada compreende uma deleção de SEQ ID NO: 40 no gene TRAC em relação às células T não modificadas. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende uma deleção compreendendo SEQ ID NO: 40 no gene TRAC em relação às células T não modifica- das. Edição do Geneβ 2M

[0037] Em algumas modalidades, uma célula T manipulada com- preende um gene β2M interrompido. β2M é um componente comum (invariante) dos complexos MHC I. A interrupção de sua expressão por edição gênica prevenirá respostas hospedeiro versus células T alogê- nicas terapêuticas levando a persistência aumentada de células T alo- gênicas. Em algumas modalidades, a expressão do gene β2M endó- geno é eliminada para evitar uma resposta hospedeiro-versus-enxerto.

[0038] Os exemplos não limitadores de sequências de gRNA de β2M modificadas e não modificadas que podem ser usados como for- necido no presente documento para criar uma perturbação genômica no gene β2M são listados na Tabela 4 (por exemplo, SEQ ID NOs: 20 e 21). Consulte também Pedido Internacional sob no PCT/US2018/032334, depositado em 11 de maio de 2018, incorporado no presente a título de referência. Outras sequências de gRNA podem ser desenhadas usando a sequência do gene β2M localizada no Cro- mossomo 15 (coordenadas de GRCh38: Cromossomo 15: 44,711,477-

44,718,877; Ensembl: ENSG00000166710).

[0039] Em algumas modalidades, gRNAs que alvejam a região genômica de β2M criam Indels no gene β2M interrompendo a expres- são do mRNA ou proteína.

[0040] Em algumas modalidades, pelo menos 50% das células T manipuladas de uma população de células T manipuladas não expres- sam um nível detectável de proteína de superfície β2M. Por exemplo, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% das células T manipuladas de uma população podem não expressar um nível detectável de proteína de superfície β2M. Em al- gumas modalidades, 50%-100%, 50%-90%, 50%-80%, 50%-70%, 50%-60%, 60%-100%, 60%-90%, 60%-80%, 60%-70%, 70%-100%, 70%-90%, 70%-80%, 80%-100%, 80%-90%, ou 90%-100% das célu- las T manipuladas de uma população não expressam um nível detec- tável de proteína de superfície β2M.

[0041] Em algumas modalidades, um gene β2M editado compre- ende pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada das se- guintes sequências na Tabela 2. Tabela 2. Sequências SEQ ID NO: CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTT 9

CTGCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTAC

CCTCCCGCT CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTT 10

CGCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTAC

CCTCCCGCT CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTT 11

CTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTC CCGCT

Sequências SEQ ID NO: CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTT 12

CTGGATAGCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTC

TCCTACCCTCCCGCT CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTATCCAGCGTG 13

AGTCTCTCCTACCCTCCCGCT CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTT 14

CTGTGGCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTC

CTACCCTCCCGCT Edição do Gene PD-1

[0042] PD-1 é uma molécula de ponto de verificação imunológico que é suprarregulada nas células T ativadas e serve para atenuar ou parar as respostas das células T. A interrupção de PD-1 por edição gênica pode levar a respostas de células T terapêuticas mais persis- tentes e/ou potentes e/ou reduzir a supressão imunitária em um indiví- duo. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende um gene PD-1 interrompido. Em algumas modalidades, a expressão do gene PD-1 endógeno é eliminada para intensificar a eficácia anti- tumoral das células T de CAR da presente revelação.

[0043] Exemplos não limitantes de sequências de gRNA de PD-1 modificadas e não modificadas que podem ser usadas como fornecido no presente documento para criar uma deleção genômica no gene PD- 1 estão listados na Tabela 4 (por exemplo, SEQ ID NOS: 22 e 23). Consulte também Pedido Internacional sob no PCT/US2018/032334, depositado em 11 de maio de 2018, incorporado no presente a título de referência. Outras sequências de gRNA podem ser desenhadas usando a sequência do gene PD-1 localizada no cromossomo 2 (coor- denadas de GRCh38: Cromossomo 2: 241,849,881-241,858,908; En- sembl: ENSG00000188389).

[0044] Em algumas modalidades, gRNAs que alvejam a região genômica de PD-1 criam Indels no gene PD-1 interrompendo a ex- pressão da proteína ou mRNA de PD-1.

[0045] Em algumas modalidades, uma célula T manipulada com- preende um gene PD-1 interrompido. Em algumas modalidades, pelo menos 50% das células T manipuladas de uma população de células T manipuladas não expressam um nível detectável de proteína de super- fície PD-1. Por exemplo, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo me- nos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% das células T manipuladas de uma população podem não expressar um nível detectável de proteína de superfície PD-1. Em algumas modalidades, 50%-100%, 50%-90%, 50%-80%, 50%-70%, 50%-60%, 60%-100%, 60%-90%, 60%-80%, 60%-70%, 70%-100%, 70%-90%, 70%-80%, 80%-100%, 80%-90%, ou 90%-100% das células T manipuladas de uma população não expres- sam um nível detectável de proteína de superfície PD-1. Edição do Gene CD70

[0046] Agrupamento de Diferenciação 70 (CD70) é um membro da superfamília dos fatores de necrose tumoral e sua expressão é restrita a linfócitos T e B ativados e células dendríticas maduras. CD70 foi também detectado em tumores hematológicos e em carcinomas. CD70 está implicado na sobrevivência das células tumorais e células T regu- ladoras através da interação com seu aglutinante, CD27. A interrupção de CD70 por edição gênica aumenta a expansão celular e reduz a exaustão celular. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende um gene CD70 interrompido. Em algumas modalidades, a expressão do gene CD70 endógeno é eliminada para intensificar a efi- cácia antitumoral das células T de CAR da presente revelação. Em algumas modalidades, gRNAs que alvejam a região genômica de CD70 criam Indels no, ou em torno do, gene CD70 interrompendo a expressão da proteína e/ou mRNA de CD70.

[0047] Exemplos não limitantes de sequências de gRNA de CD70 modificadas e não modificadas que podem ser usadas como fornecido no presente documento para criar uma interrupção genômica no gene CD70 estão listados na Tabela 4 (por exemplo, SEQ ID NOs: 24-27). Outras sequências de gRNA podem ser desenhadas usando a se- quência do gene CD70 localizada no cromossomo 19 (coordenadas de GRCh38: Cromossomo 19: 6,583,183-6,604,103; Ensembl: ENSG00000125726).

[0048] Em algumas modalidades, uma célula T manipulada com- preende um gene CD70 interrompido. Em algumas modalidades, pelo menos 50% das células T manipuladas de uma população de células T manipuladas não expressam um nível detectável de proteína de super- fície CD70. Por exemplo, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo me- nos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% das células T manipuladas de uma população podem não expressar um nível detectável de proteína de superfície CD70. Em algumas modalidades, 50%-100%, 50%-90%, 50%-80%, 50%-70%, 50%-60%, 60%-100%, 60%-90%, 60%-80%, 60%-70%, 70%-100%, 70%-90%, 70%-80%, 80%-100%, 80%-90%, ou 90%-100% das células T manipuladas de uma população não expres- sam um nível detectável de proteína de superfície CD70. Fenótipos Celulares

[0049] Em algumas modalidades, uma ou mais edições gênicas dentro de uma população de células resulta em um fenótipo associado a mudanças na capacidade proliferativa celular, exaustão celular, via- bilidade celular, capacidade de lise celular (por exemplo, produção e/ou liberação de citocinas aumentadas) ou qualquer sua combinação.

[0050] Em algumas modalidades, as células T manipuladas da presente revelação exibem capacidade proliferativa celular pelo menos 20% maior, em relação às células T de controle. Por exemplo, as célu- las T manipuladas podem exibir capacidade proliferativa celular pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pe-

lo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60 %, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% maior, em relação às células de controle. Em al- gumas modalidades, as células T manipuladas da presente divulgação exibem capacidade proliferativa celular 20%-100%, 20%-90%, 20%- 80%, 20%-70%, 20%-60%, 20%-50%, 30%-100%, 30%-90%, 30%- 80%, 30%-70%, 30%-60%, 30%-50%, 40%-100%, 40%-90%, 40%- 80%, 40%-70%, 40%-60%, 40%-50%, 50%-100%, 50%-90%, 50%- 80%, 50%-70%, ou 50%-60% maior, em relação às células T de con- trole.

[0051] Em algumas modalidades, as células T manipuladas da presente revelação exibem um aumento de pelo menos 20% na viabi- lidade celular, em relação às células de controle. Por exemplo, as célu- las T manipuladas da presente revelação podem exibir aumento de pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo me- nos 60 %, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% na viabilidade celular em relação às células de controle. Em algumas modalidades, as células T manipula- das da presente revelação exibem um aumento de 20%-100%, 20%- 90%, 20%-80%, 20%-70%, 20%-60%, 20%-50%, 30%-100%, 30%- 90%, 30%-80%, 30%-70%, 30%-60%, 30%-50%, 40%-100%, 40%- 90%, 40%-80%, 40%-70%, 40%-60%, 40%-50%, 50%-100%, 50%- 90%, 50%-80%, 50%-70%, ou 50%-60% na viabilidade celular em re- lação às células de controle.

[0052] Em algumas modalidades, as células T manipuladas da presente revelação exibem um aumento de pelo menos 20% na capa- cidade de lise celular (matam pelo menos 20% mais células alvo) em relação às células de controle. Por exemplo, as células T manipuladas da presente revelação podem exibir um aumento de pelo menos 25%,

pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60 %, pelo me- nos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% na capacidade de lise celular, em relação às células de controle. Em algumas modalidades, as células T manipuladas da pre- sente revelação exibem um aumento de 20%-100%, 20%-90%, 20%- 80%, 20%-70%, 20%-60%, 20%-50%, 30%-100%, 30%-90%, 30%- 80%, 30%-70%, 30%-60%, 30%-50%, 40%-100%, 40%-90%, 40%- 80%, 40%-70%, 40%-60%, 40%-50%, 50%-100%, 50%-90%, 50%- 80%, 50%-70%, ou 50%-60% na capacidade de lise celular, em rela- ção às células de controle. Por exemplo, o nível de citocinas (por exemplo, IL-2 e/ou IFN-gama) secretadas pelas células T manipuladas pode pelo menos 2 vezes (por exemplo, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes ou pelo menos 5 vezes) maior do que o nível de citoci- nas secretadas pelas células T de controle.

[0053] As células T de controle, em algumas modalidades, são cé- lulas T manipuladas (por exemplo, células T com edição gênica). Em algumas modalidades, as células T de controle são células T manipu- ladas que compreendem um gene TRAC interrompido, um ácido nu- cleico codificando um CAR (p.ex., um CAR anti-LIV1) inserido no gene TRAC e/ou um gene β2M interrompido. Em algumas modalidades, as células T de controle são células T não editadas. Métodos de Edição Gênica

[0054] A edição gênica (incluindo edição genômica) é um tipo de manipulação genética na qual nucleotídeo(s)/ácido(s) nucleico(s) é/são inserido(s), deletado(s) e/ou substituído(s) em uma sequência de DNA, tal como no genoma de uma célula visada. A edição de genes direcio- nados permite a inserção, exclusão e/ou substituição em sítios pré- selecionados no genoma de uma célula-alvo (por exemplo, em um ge- ne direcionado ou sequência de DNA direcionada). Quando uma se-

quência de um gene endógeno for editada, por exemplo por deleção, inserção ou substituição de nucleotídeo(s)/ácido(s) nucleico(s), o gene endógeno que compreende a sequência afetada pode ser inativado ou silenciado devido à alteração de sequência. Portanto, a edição alveja- da pode ser usada para interromper a expressão do gene endógeno. "Integração alvejada" se refere a um processo envolvendo inserção de uma ou mais sequências exógenas, com ou sem deleção de uma se- quência endógena no local de inserção. A integração alvejada pode resultar da edição gênica alvejada quando um modelo doador conten- do uma sequência exógena está presente.

[0055] A edição alvejada pode ser alcançada através de uma abordagem independente de nucleases ou através de uma abordagem dependente de nucleases. Na abordagem de edição alvejada inde- pendente de nucleases, a recombinação homóloga é guiada por se- quências homólogas flanqueando um polinucleotídeo exógeno a ser introduzido em uma sequência endógena através da maquinaria enzi- mática da célula hospedeira. O polinucleotídeo exógeno pode introdu- zir deleções, inserções ou substituição de nucleotídeos na sequência endógena.

[0056] Alternativamente, a abordagem dependente de nucleases pode alcançar edição visada com frequência mais elevada através da introdução específica de quebras de fita dupla (DSBs) por nucleases de corte raro específicas (p.ex., endonucleases). Essa edição alvejada dependente de nucleases utiliza também mecanismos de reparo do DNA, por exemplo, junção de extremidades não homólogas (NHEJ), que ocorre em resposta a DSBs. O reparo do DNA por NHEJ leva fre- quentemente a inserções ou deleções (indels) aleatórias de um pe- queno número de nucleotídeos endógenos. Em contraste com o repa- ro mediada por NHEJ, o reparo pode também ocorrer por um reparo dirigido por homologia (HDR). Quando um modelo doador contendo material genético exógeno flanqueado por um par de braços de homo- logia está presente, o material genético exógeno pode ser introduzido no genoma por HDR, o que resulta em integração alvejada do material genético exógeno.

[0057] Endonucleases disponíveis capazes de introduzir DSBs es- pecíficas e alvejadas incluem, mas não limitadas a, nucleases de de- dos de zinco (ZFN), nucleases efetoras tipo ativador de transcrição (TALEN) e nuclease CRISPR-Cas9 guiada por RNA (CRISPR/Cas9; Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas Regularmente Intercala- das Associadas 9). Adicionalmente, o sistema DICE (troca de cassete de integrase dupla) utilizando integrases phiC31 e Bxb1 pode ser tam- bém usado para integração alvejada.

[0058] As ZFNs são nucleases alvejadas que compreende uma nuclease fundida a um domínio de ligação de DNA de dedos de zinco (ZFBD), que é um domínio de polipeptídeo que se liga ao DNA de uma maneira específica da sequência através de um ou mais dedos de zin- co. Um dedo de zinco é um domínio de cerca de 30 aminoácidos den- tro do domínio de ligação dos dedos de zinco cuja estrutura é estabili- zada através da coordenação de um íon de zinco. Exemplos de dedos de zinco incluem, mas não limitados a, dedos de zinco C2H2, dedos de zinco C3H e dedos de zinco C4. Um domínio de dedo de zinco de- senhado é um domínio não ocorrendo na natureza cujo dese- nho/composição resulta principalmente de critérios racionais, por exemplo, aplicação de regras de substituição e algoritmos computado- rizados para processamento de informação em uma base de dados armazenando informação de desenhos de ZFP existentes e dados de ligação. Consulte, por exemplo, Patente sob nos U.S. 6.140.081;

6.453.242; e 6.534.261; consulte também WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 e WO 03/016496. Um domí- nio de dedo de zinco selecionado é um domínio não encontrado na natureza cuja produção resulta principalmente de um processo empíri- co como exibição em fagos, armadilha de interação ou seleção de hí- bridos. Os ZFNs são descritos em maior detalhe na Pat. sob nº U.S.

7.888.121 e Pat. sob nº U.S. 7.972.854. O exemplo mais conhecido de um ZFN é uma fusão da nuclease FokI com um domínio de ligação ao DNA de dedos de zinco.

[0059] Uma TALEN é uma nuclease alvejada que compreende uma nuclease fundida a um domínio de ligação ao DNA efetor de TAL. Um "domínio de ligação ao DNA efetor tipo ativador de transcrição", "domínio de ligação ao DNA efetor de TAL" ou "domínio de ligação ao DNA TALE" é um domínio de polipeptídeo de proteínas efetoras de TAL que é responsável pela ligação da proteína efetora de TAL ao DNA. As proteínas efetoras TAL são secretadas por patógenos de plantas do gênero Xanthomonas durante a infeção. Estas proteínas entram no núcleo da célula vegetal, se ligam a sequências de DNA específicas do efetor através de seu domínio de ligação ao DNA e ati- vam a transcrição gênica em estas sequências através de seus domí- nios de transativação. A especificidade do domínio de ligação ao DNA efetor de TAL depende de um número variável efetor de repetições imperfeitas de 34 aminoácidos, que compreendem polimorfismos em posições repetidas selecionadas chamadas dirresíduos variáveis de repetição (RVD). As TALENs são descritas em maior detalhe no Pedi- do de Patente dos EUA No. 2011/0145940. O exemplo mais reconhe- cido de uma TALEN na técnica é um polipeptídeo de fusão da nu- clease FokI a um domínio de ligação ao DNA efetor de TAL.

[0060] Exemplos adicionais de nucleases alvejadas adequadas para uso como fornecido no presente documento incluem, mas não estão limitados a, Bxb1, phiC31, R4, PhiBT1 e Wβ/SPBc/TP901-1, quer sejam usadas individualmente ou em combinação.

[0061] Outros exemplos não limitantes de nucleases alvejadas in-

cluem nucleases de ocorrência natural e recombinantes, por exemplo, CRISPR/Cas9, endonucleases de restrição, endonucleases de migra- ção de meganucleases e similares. Edição Gênica CRISPR-Cas9

[0062] O sistema CRISPR-Cas9 é um mecanismo de defesa ocor- rendo naturalmente em procariotas que foi reaproveitado como uma plataforma de direcionamento de DNA guiado por RNA usada para edição gênica. Se baseia na DNA nuclease Cas9 e dois RNAs não co- dificantes - crisprRNA (crRNA) e RNA transativador (tracrRNA) - para alvejar a clivagem do DNA.

[0063] O crRNA conduz o reconhecimento de sequência e a espe- cificidade do complexo CRISPR-Cas9 através do emparelhamento de bases de Watson-Crick tipicamente com uma sequência de 20 nucleo- tídeos (nt) no DNA alvo. Alterar a sequência de 5’ 20nt no crRNA per- mite direcionar o complexo CRISPR-Cas9 para loci específicos. O complexo CRISPR-Cas9 se liga somente a sequências de DNA que contêm uma sequência correspondente aos primeiros 20 nt do crRNA, RNA guia único (sgRNA), se a sequência alvo for seguida por um mo- tivo de DNA curto específico (com a sequência NGG) referido como um motivo adjacente protoespaçador (PAM).

[0064] TracrRNA hibridiza com a extremidade 3’ de crRNA para formar uma estrutura duplex de RNA que é ligada pela endonuclease Cas9 para formar o complexo CRISPR-Cas9 cataliticamente ativo, que pode então clivar o DNA alvo.

[0065] Uma vez que o complexo CRISPR-Cas9 está ligado ao DNA em um sítio alvo, dois domínios de nuclease independentes den- tro da enzima Cas9 clivam cada um dos filamentos de DNA a montan- te do local de PAM, deixando uma quebra de filamento duplo (DSB) em que ambos os filamentos do DNA terminam em um par de bases (uma extremidade cega).

[0066] Após ligação do complexo CRISPR-Cas9 ao DNA em um sítio alvo específico e formação da DSB sítio-específica, a próxima etapa crítica é reparo da DSB. As células usam duas vias principais de reparo de DNA para reparar o DSB: união de extremidade não homó- loga (NHEJ) e reparo dirigido por homologia (HDR).

[0067] NHEJ é um mecanismo de reparo robusto que parece alta- mente ativo na maioria dos tipos de células, que inclui células que não se dividem. NHEJ é propensa a erros e pode frequentemente resultar na remoção ou adição de entre uma e várias centenas de nucleotídeos no local da DSB, embora tais modificações tenham tipicamente < 20 nt. As inserções e deleções (indels) resultantes podem interromper as regiões codificantes ou não codificantes dos genes. Alternativamente, HDR usa um longo trecho de DNA doador homólogo, proporcionado endógena ou exogenamente, para reparar a DSB com elevada fideli- dade. HDR é ativo apenas na divisão das células e ocorre em uma frequência relativamente baixa na maioria dos tipos de células. Em muitas modalidades da presente revelação, NHEJ é utilizada como o operante do reparo.

[0068] Em algumas modalidades, a endonuclease Cas9 (proteína 9 associada a CRISPR) é de Streptococcus pyogenes, embora outros homólogos Cas9 possam ser usados. Deve ser entendido que Cas9 de tipo selvagem pode ser usada ou versões modificadas de Cas9 po- dem ser usadas (por exemplo, versões evoluídas de Cas9 ou ortólo- gos ou variantes de Cas9), como fornecido no presente documento. Em algumas modalidades, Cas9 pode ser substituída por outra endo- nuclease guiada por RNA, como Cpf1 (de um sistema CRISPR/Cas de classe II). RNAs Guia

[0069] A presente revelação proporciona um ácido nucleico que alveja o genoma que pode direcionar as atividades de um polipeptídeo associado (por exemplo, um polipeptídeo sítio-dirigido) para uma se- quência alvo específica dentro de um ácido nucleico alvo. O ácido nu- cleico que alveja o genoma pode ser um RNA. Um RNA que alveja o genoma é referido como um "RNA guia" ou "gRNA" no presente do- cumento. Um RNA guia compreende pelo menos uma sequência es- paçadora que hibrida com uma sequência de ácido nucleico alvo de interesse e uma sequência repetida de CRISPR. Nos sistemas do Tipo II, o gRNA compreende também um segundo RNA chamado a se- quência de tracrRNA. No RNA guia de Tipo II (gRNA), a sequência re- petida de CRISPR e a sequência de tracrRNA hibridam entre si para formar um dúplex. No RNA guia de Tipo V (gRNA), o crRNA forma um dúplex. Em ambos os sistemas, o dúplex se liga a um polipeptídeo sí- tio-dirigido, tal que o RNA guia e o polipeptídeo sítio-dirigido formem um complexo. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que alveja o genoma fornece a especificidade do alvo para o complexo em virtude de sua associação ao polipeptídeo sítio-dirigido. O ácido nucleico que alveja o genoma direciona assim a atividade do polipeptídeo sítio- dirigido.

[0070] Como é entendido pelo perito na técnica, cada RNA guia é desenhado para incluir uma sequência espaçadora complementar à sua sequência alvo genômica. Consulte Jinek et al., Science, 337, 816 a 821 (2012) e Deltcheva et al., Nature, 471, 602 a 607 (2011).

[0071] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que alveja o genoma é um RNA guia de molécula dupla. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que alveja o genoma é um RNA guia de molécula úni- ca.

[0072] Um RNA guia de molécula dupla compreende dois filamen- tos de RNA. O primeiro filamento compreende, na direção 5’ para 3', uma sequência de extensão espaçadora opcional, uma sequência es- paçadora e uma sequência repetida de CRISPR mínima. O segundo filamento compreende uma sequência de tracrRNA mínima (comple- mentar à sequência repetida de CRISPR mínima), uma sequência de tracrRNA 3’ e uma sequência de extensão de tracrRNA opcional.

[0073] Um RNA guia de molécula única (sgRNA) em um sistema de Tipo II compreende, na direção 5’ para 3', uma sequência de exten- são espaçadora opcional, uma sequência espaçadora, uma sequência repetida de CRISPR mínima, um ligante guia de molécula única, uma sequência de tracrRNA mínima, uma sequência de tracrRNA 3’ e uma sequência de extensão de tracrRNA opcional. A extensão de tracrRNA opcional pode compreender elementos que contribuem funcionalidade adicional (por exemplo, estabilidade) ao RNA guia. O ligante guia de molécula única liga a repetição de CRISPR mínima e a sequência de tracrRNA mínima para formar uma estrutura em grampo. A extensão de tracrRNA opcional compreende um ou mais grampos.

[0074] Um RNA guia de molécula única (referido como um "sgR- NA" ou "gRNA") em um sistema de Tipo V compreende, na direção 5' para 3', uma sequência repetida de CRISPR mínima e uma sequência espaçadora.

[0075] O sgRNA pode compreender uma sequência espaçadora de 20 nucleotídeos na extremidade 5’ da sequência de sgRNA. O sgRNA pode compreender uma sequência espaçadora com menos do que 20 nucleotídeos na extremidade 5’ da sequência de sgRNA. O sgRNA pode compreender uma sequência espaçadora de mais de 20 nucleotídeos na extremidade 5’ da sequência de sgRNA. O sgRNA pode compreender uma sequência espaçadora de comprimento variá- vel com 17-30 nucleotídeos na extremidade 5’ da sequência de sgRNA (ver Tabela 3).

[0076] O sgRNA pode compreender nenhuma uracila na extremi- dade 3' da sequência de sgRNA. O sgRNA pode compreender uma ou mais uracilas na extremidade 3' da sequência de sgRNA. Por exemplo,

o sgRNA pode compreender 1 uracila (U) na extremidade 3' da se- quência de sgRNA. O sgRNA pode compreender 2 uracilas (UU) na extremidade 3' da sequência de sgRNA. O sgRNA pode compreender 3 uracilas (UUU) na extremidade 3' da sequência de sgRNA. O sgRNA pode compreender 4 uracilas (UUUU) na extremidade 3' da sequência de sgRNA. O sgRNA pode compreender 5 uracilas (UUUUU) na ex- tremidade 3' da sequência de sgRNA. O sgRNA pode compreender 6 uracilas (UUUUUU) na extremidade 3' da sequência de sgRNA. O sgRNA pode compreender 7 uracilas (UUUUUUU) na extremidade 3' da sequência de sgRNA. O sgRNA pode compreender 8 uracilas (UUUUUUUU) na extremidade 3' da sequência de sgRNA.

[0077] O sgRNA pode ser não modificado ou modificado. Por exemplo, os sgRNAs modificados podem compreender um ou mais nucleotídeos de fosforotioato de 2'-O-metila. Tabela 3. SEQ ID NO. Sequência de sgRNA 15 nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuuuagagcuagaaauagcaaguu aaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagu cggugcuuuu 16 nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuuuagagcuagaaauagcaaguu aaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagu cggugc 17 n(17-30) guuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguua ucaacuug aaaaaguggcaccgagucggugcu(1-8)

[0078] A título de ilustração, os RNAs guia usados no sistema CRISPR/Cas/Cpf1 ou outros RNAs menores podem ser prontamente sintetizados por meios químicos, como ilustrado em baixo e descrito na técnica. Embora os procedimentos químicos sintéticos estejam con- tinuamente em expansão, a purificação de tais RNAs por procedimen- tos tais como cromatografia líquida de elevado desempenho (HPLC, que evita o uso de géis tais como PAGE) tende a se tornar mais desa-

fiante à medida que os comprimentos dos polinucleotídeos aumentam significativamente para além de uma centena ou assim de nucleotí- deos. Uma abordagem usada para gerar RNAs de maior comprimento é produzir duas ou mais moléculas que são ligadas entre si. RNAs muito mais longos, tais como aqueles que codificam uma endonu- clease Cas9 ou Cpf1, são mais prontamente gerados enzimaticamen- te. Vários tipos de modificações de RNA podem ser introduzidos du- rante a ou após síntese química e/ou geração enzimática de RNAs, por exemplo, modificações que intensificam a estabilidade, reduzem a probabilidade ou o grau de resposta imunológica inata e/ou intensifi- cam outros atributos, como descrito na técnica. Sequência Espaçadora

[0079] Um gRNA compreende uma sequência espaçadora. Uma sequência espaçadora é uma sequência (por exemplo, uma sequência de 20 nucleotídeos) que define a sequência alvo (por exemplo, uma sequência alvo de DNA, como uma sequência alvo genômica) de um ácido nucleico alvo de interesse. Em algumas modalidades, a sequên- cia espaçadora tem 15 a 30 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a sequência espaçadora tem 15, 16, 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos. Em algumas modalidades, uma se- quência espaçadora tem 20 nucleotídeos.

[0080] A "sequência alvo" é adjacente a uma sequência PAM e é a sequência modificada por uma nuclease guiada por RNA (por exem- plo, Cas9). O "ácido nucleico alvo" é uma molécula de filamento duplo: um filamento compreende a sequência alvo e é referida como o "fila- mento de PAM", e o outro filamento complementar é referido como o "filamento diferente de PAM". Um perito na técnica reconhece que a sequência espaçadora de gRNA hibrida com o complemento reverso da sequência alvo, que está localizado no filamento diferente de PAM do ácido nucleico alvo de interesse. Assim, a sequência espaçadora de gRNA é o equivalente de RNA da sequência alvo. Por exemplo, se a sequência alvo é 5-AGAGCAACAGTGCTGTGGCC-3 (SEQ ID NO: 92), então a sequência espaçadora de gRNA é 5- AGAGCAACAGUGCUGUGGCC-3 (SEQ ID NO: 93). O espaçador de um gRNA interage com um ácido nucleico alvo de interesse de uma maneira específica da sequência através de hibridação (isto é, empa- relhamento de bases). A sequência de nucleotídeos do espaçador va- ria assim dependendo da sequência alvo do ácido nucleico alvo de in- teresse.

[0081] Em um sistema CRISPR/Cas aqui, a sequência espaçadora é desenhada para hibridar com uma região do ácido nucleico alvo que está localizada 5’ de um PAM da enzima Cas9 usada no sistema. O espaçador pode corresponder perfeitamente à sequência alvo ou pode ter incompatibilidades. Cada enzima Cas9 tem uma sequência PAM específica que reconhece em um DNA alvo. Por exemplo, S. pyogenes reconhece em um ácido nucleico alvo um PAM que compreende a se- quência 5'-NRG-3', em que R compreende A ou G, em que N é qual- quer nucleotídeo e N é imediatamente 3' da sequência de ácidos nu- cleicos alvo alvejada pela sequência espaçadora.

[0082] Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos alvo compreende 20 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo compreende menos do que 20 nucleotídeos. Em algu- mas modalidades, o ácido nucleico alvo compreende mais do que 20 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo com- preende pelo menos: 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 ou mais nucleotídeos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo compreende no máximo: 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 ou mais nucleotídeos. Em algumas modalidades, a sequên- cia de ácidos nucleicos alvo compreende 20 bases imediatamente 5’ do primeiro nucleotídeo de PAM. Por exemplo, em uma sequência que compreende 5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3' (SEQ ID NO: 130), o ácido nucleico alvo compreende a sequência que corresponde aos Ns, em que N é qualquer nucleotídeo, e a sequência NRG subli- nhada é o PAM de S. pyogenes.

[0083] Exemplos não limitantes de gRNAs que podem ser usados como fornecido no presente documento são proporcionados na Tabela 4 e PCT/US2018/032334, depositada em 11 de maio de 2018. Tabela 4. Sequências de gRNA/Sequências Alvo Sequências de gRNA Nome Sequência Não modifi- Sequência Modifica- cada da sgRNA de TRAC AGAGCAACAGUGCU- A*G*A*GCAACAGUG GUGGCCguuuuagag- CUGUGG- cuagaaauagcaa- CCguuuuagag- guuaaaauaaggcuaguc- cuagaaauagcaa- cguuaucaacuugaaaaa- guuaaaauaaggcua- guggcaccgagucggug- guccguuaucaacuu- cUUUU gaaaaaguggcaccga- (SEQ ID NO: 18) gucggugcU*U*U*U (SEQ ID NO: 28) Espaçador de AGAGCAACAGUGCU- A*G*A*GCAACAGUG sgRNA de TRAC GUGGCC (SEQ ID NO: CUGUGGCC (SEQ ID 19) NO: 29) sgRNA de β2M GCUACUCUCUCUUU- G*C*U*ACUCUCUCU CUGGCCguuuuagag- UUCUGG- cuagaaauagcaa- CCguuuuagag- guuaaaauaaggcuaguc- cuagaaauagcaa- cguuaucaacuugaaaaa- guuaaaauaaggcua- guggcaccgagucggug- guccguuaucaacuu- cUUUU gaaaaaguggcaccga- (SEQ ID NO: 20) gucggugcU*U*U*U (SEQ ID NO: 30) Espaçador de GCUACUCUCUCUUU- G*C*U*ACUCUCUCU sgRNA de β2M CUGGCC (SEQ ID NO: UUCUGGCC (SEQ ID 21) NO: 31)

Sequências de gRNA Nome Sequência Não modifi- Sequência Modifica- cada da sgRNA de PD-1 CUGCAGCUUCUCCAA- C*U*G*CAGCUUCUC CACAUguuuuagag- CAACACAU- cuagaaauagcaa- guuuuagag- guuaaaauaaggcuaguc- cuagaaauagcaa- cguuaucaacuugaaaaa- guuaaaauaaggcua- guggcaccgagucggug- guccguuaucaacuu- cUUUU (SEQ ID NO: 22) gaaaaaguggcaccga- gucggugcU*U*U*U (SEQ ID NO: 32) Espaçador de CUGCAGCUUCUCCAA- C*U*G*CAGCUUCUC sgRNA de PD-1 CACAU (SEQ ID NO: 23) CAACACAU (SEQ ID NO: 33) sgRNA de CD70 GCUUUGGUC- G*C*U*UUGGUCCCA (E1_T7) CCAUUGGUCG- UUGGUCG- Cguuuuagag- Cguuuuagag- cuagaaauagcaa- cuagaaauagcaa- guuaaaauaaggcuaguc- guuaaaauaaggcua- cguuaucaacuugaaaaa- guccguuaucaacuu- guggcaccgagucggug- gaaaaaguggcaccga- cUUUU gucggugcU*U*U*U (SEQ ID NO: 24) (SEQ ID NO: 34), T7 Espaçador CD70 GCUUUGGUC- G*C*U*UUGGUCCCA sgRNA (E1_T7) CCAUUGGUCGC (SEQ UUGGUCGC (SEQ ID ID NO: 25) NO: 35) sgRNA de CD70 GCCCGCAGGACG- G*C*C*CGCAGGACG (E1_T8) CACCCAUAguuuuagag- CACCCAUA- cuagaaauagcaa- guuuuagag- guuaaaauaaggcuaguc- cuagaaauagcaa- cguuaucaacuugaaaaa- guuaaaauaaggcua- guggcaccgagucggug- guccguuaucaacuu- cUUUU gaaaaaguggcaccga- (SEQ ID NO: 26) gucggugcU*U*U*U (SEQ ID NO: 36), T8

Sequências de gRNA Nome Sequência Não modifi- Sequência Modifica- cada da Espaçador CD70 GCCCGCAGGACG- G*C*C*CGCAGGACG sgRNA (E1_T8) CACCCAUA (SEQ ID CACCCAUA (SEQ ID NO: 27) NO: 37) Sequências Alvo Nome do Guia Sequência Alvo (PAM) sgRNA de CD70 GCTTTGGTCCCATTGGTCGC (GGG) (SEQ ID (E1_T7) NO: 38) sgRNA de CD70 GCCCGCAGGACGCACCCATA (GGG) (SEQ ID (E1_T8) NO: 39) sgRNA de TRAC AGAGCAACAGTGCTGTGGCC (TGG) (SEQ ID NO: 40) sgRNA de ββ2M GCTACTCTCTCTTTCTGGCC (TGG) (SEQ ID NO: 41) sgRNA de PD-1 CTGCAGCTTCTCCAACACAT (CGG) (SEQ ID NO: 42) *: Resíduo de fosforotioato de 2'-O-metila Células T de receptor de antígeno quimérico (CAR)

[0084] Um receptor de antígeno quimérico se refere a um receptor de célula imunitária artificial que é manipulado para reconhecer e se ligar a um antígeno expresso por células tumorais. Geralmente, um CAR é projetado para uma célula T e é uma quimera de um domínio de sinalização do complexo de receptor de células T (TCR) e um do- mínio de reconhecimento de antígeno (por exemplo, um fragmento de cadeia simples (scFv) de um anticorpo ou outro fragmento de anticor- po) (Enblad et al., Human Gene Therapy. 2015; 26 (8): 498 a 505). Uma célula T que expressa um CAR é referida como uma célula T de CAR. Os CARs têm a capacidade para redirecionar a especificidade e a reatividade das células T na direção de um alvo selecionado de uma maneira não restrita ao MHC. O reconhecimento do antígeno não res- trito a MHC dá às células T que expressam CARs a capacidade para reconhecerem um antígeno independentemente do processamento do antígeno, ignorando assim um mecanismo principal do escape tumo- ral. Além disso, quando expressos em células T, os CARs não se di- merizam vantajosamente com as cadeias alfa e beta do receptor de células T (TCR) endógeno.

[0085] Existem quatro gerações de CARs, cada uma das quais contém componentes diferentes. Os CARs de primeira geração unem um scFv derivado de anticorpo ao domínio de sinalização intracelular CD3zeta (ζ ou z) do receptor de células T através de domínios de charneira e transmembranar. Os CARs de segunda geração incorpo- ram um domínio adicional, por exemplo, CD28, 4-1BB (41BB) ou ICOS, para fornecer um sinal coestimulador. Os CARs de terceira ge- ração contêm dois domínios coestimuladores fundidos com a cadeia CD3ζ de TCR. Os domínios coestimuladores de terceira geração po- dem incluir, por exemplo, uma combinação de CD3ζ, CD27, CD28, 4- 1BB, ICOS ou OX40. Os CARs, em algumas modalidades, contêm um ectodomínio (por exemplo, CD3ζ), comummente derivado de um frag- mento variável de cadeia única (scFv), uma charneira, um domínio transmembranar e um endodomínio com um (primeira geração), dois (segunda geração) ou três domínios de sinalização (terceira geração) derivados de CD3Ζ e/ou moléculas coestimuladoras (Maude et al., Blood. 2015; 125 (26): 4.017 a 4.023; Kakarla e Gottschalk, Cancer J. 2014; 20 (2): 151 a 155).

[0086] Os CARs diferem tipicamente em suas propriedades funci- onais. O domínio de sinalização CD3ζ do receptor de células T, quan- do envolvido, ativará e induzirá a proliferação de células T mas pode levar à anergia (uma ausência de reação pelos mecanismos de defesa do corpo, resultando em indução direta da tolerância de linfócitos peri- féricos). Os linfócitos são considerados anérgicos quando falham em responder a um antígeno específico. A adição de um domínio coesti-

mulador nos CARs de segunda geração melhorou a capacidade repli- cativa e a persistência de células T manipuladas. Efeitos antitumorais similares são observados in vitro com CARs CD28 ou 4-1BB, mas es- tudos pré-clínicos in vivo sugerem que os CARs 4-1BB podem produzir proliferação e/ou persistência superiores. Os testes clínicos sugerem que ambos estes CARs de segunda geração têm capacidade para in- duzir proliferação substancial de células T in vivo, mas os CARs que contêm o domínio coestimulador 4-1BB parecem persistir mais tempo. Os CARs de terceira geração combinam múltiplos domínios de sinali- zação (coestimuladores) para aumentar a potência.

[0087] Em algumas modalidades, um receptor de antígeno quimé- rico é um CAR de primeira geração. Em outras modalidades, um re- ceptor de antígeno quimérico é um CAR de segunda geração. Em ain- da outras modalidades, um receptor de antígeno quimérico é um CAR de terceira geração.

[0088] Um CAR, em algumas modalidades, compreende um do- mínio extracelular (ecto) que compreende um domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, um anticorpo, como um scFv), um domínio transmembranar e um domínio citoplasmático (endo).

[0089] Ectodomínio. O ectodomínio é a região do CAR que é ex- posta ao fluido extracelular e, em algumas modalidades, inclui um do- mínio de ligação ao antígeno e, opcionalmente, um peptídeo de sinal, um domínio espaçador e/ou um domínio de charneira. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno é um fragmento variá- vel de cadeia única (scFv) que inclui cadeias pesadas e leves de imu- noglobulinas conectadas a um peptídeo ligante curto. O ligante, em algumas modalidades, inclui resíduos hidrofílicos com trechos de glici- na e serina para flexibilidade bem como trechos de glutamato e lisina para solubilidade adicionada. Um fragmento variável de cadeia única (scFv) não é realmente um fragmento de um anticorpo, mas ao invés é uma proteína de fusão das regiões variáveis das cadeias pesada (VH) e leve (VL) de imunoglobulinas, conectadas a um peptídeo ligante cur- to de dez a cerca de 25 aminoácidos. O ligante é geralmente rico em glicina para flexibilidade, bem como serina ou treonina para solubilida- de, e pode conectar o terminal N da VH ao terminal C da VL ou vice- versa. Esta proteína retém a especificidade da imunoglobulina original, apesar da remoção das regiões constantes e da introdução do ligante. Exemplos não limitantes de sequências de proteína de VH e VL que podem ser usadas para criar um scFv anti-LIV1 podem incluir a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 55, 90 ou 98 (VH) e SEQ ID NOs: 56, 88 ou 128 (VL). Em algumas modalidades, o scFv da presen- te revelação é humanizado. Em outras modalidades, o scFv é total- mente humano. Em ainda outras modalidades, o scFv é uma quimera (por exemplo, de sequência de camundongo e humana). Em algumas modalidades, o scFv é um scFv anti-LIV1 (se liga especificamente a LIV1). Exemplos não limitantes de proteínas scFv anti-LIV1 que podem ser usadas como fornecido no presente documento podem incluir a sequência de aminoácidos de qualquer um dos SEQ ID NOs: 54, 70, 82, 83, 84, 85, 86 ou 87. Podem ser usadas outras proteínas scFv.

[0090] O peptídeo de sinal pode intensificar a especificidade do antígeno da ligação ao CAR. Os peptídeos de sinal podem ser deriva- dos de anticorpos, tais como, mas não se limitando a, CD8, bem como marcadores de epítopos tais como, mas não se limitando a, GST ou FLAG. Exemplos de peptídeos de sinal incluem MLLLVTSLLLCEL- PHPAFLLIP (SEQ ID NO: 94) e MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 73). Podem ser usados outros peptídeos de sinal.

[0091] Em algumas modalidades, um domínio espaçador ou domí- nio de charneira está localizado entre um domínio extracelular (que compreende o domínio de ligação ao antígeno) e um domínio trans- membranar de um CAR ou entre um domínio citoplasmático e um do-

mínio transmembranar do CAR. Um domínio espaçador é qualquer oligopeptídeo ou polipeptídeo que funciona para ligar o domínio trans- membranar ao domínio extracelular e/ou ao domínio citoplasmático na cadeia de polipeptídeos. Um domínio de charneira é qualquer oli- gopeptídeo ou polipeptídeo que funciona para proporcionar flexibilida- de ao CAR, ou seus domínios, ou para prevenir o impedimento estéri- co do CAR ou seus domínios. Em algumas modalidades, um domínio espaçador ou um domínio de charneira pode compreender até 300 aminoácidos (por exemplo, 10 a 100 aminoácidos ou 5 a 20 aminoáci- dos). Em algumas modalidades, um ou mais domínio(s) espaçador(es) pode(m) ser incluído(s) em outras regiões de um CAR. Em algumas modalidades, o domínio de charneira é um domínio de charneira CD8. Podem ser usados outros domínios de charneira.

[0092] Domínio Transmembranar. O domínio transmembranar é uma hélice alfa hidrofóbica que abrange a membrana. O domínio transmembranar proporciona estabilidade do CAR. Em algumas moda- lidades, o domínio transmembranar de um CAR como fornecido no presente documento é um domínio transmembranar CD8. Em outras modalidades, o domínio transmembranar é um domínio transmembra- nar CD28. Ainda em outras modalidades, o domínio transmembranar é uma quimera de um domínio transmembranar CD8 e CD28. Outros domínios transmembranares podem ser utilizados como aqui forneci- do. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar é um domí- nio transmembranar CD8a: FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIAS- QPLSLRPEACRPAAGG AVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLS- LVITLYCNHRNR (SEQ ID NO: 129). Podem ser usados outros domí- nios transmembranares.

[0093] Endodomínio. O endodomínio é a extremidade funcional do receptor. Após reconhecimento do antígeno, os receptores se agrupam e um sinal é transmitido para a célula. O componente de en-

dodomínio mais comummente usado é CD3-zeta, que contém três (3) motivos de ativação à base de imunorreceptor de tirosina (ITAM). Isto transmite um sinal de ativação para a célula T após o antígeno estar ligado. Em muitos casos, CD3-zeta pode não proporcionar um sinal de ativação totalmente competente e, assim, é usada uma sinalização coestimuladora. Por exemplo, CD28 e/ou 4-1BB podem ser usados com CD3-zeta (CD3ζ) para transmitir um sinal proliferativo/de sobrevi- vência. Portanto, em algumas modalidades, a molécula coestimulado- ra de um CAR como fornecido no presente documento é uma molécula coestimuladora CD28. Em outras modalidades, a molécula coestimu- ladora é uma molécula coestimuladora 4-1BB. Em algumas modalida- des, um CAR inclui CD3ζ e CD28. Em outras modalidades, um CAR inclui CD3-zeta e 4-1BB. Ainda em outras modalidades, um CAR inclui CD3ζ, CD28 e 4-1BB. A Tabela 5 fornece exemplos de moléculas de sinalização que podem ser usadas como fornecido no presente docu- mento. Tabela 5 Nome Sequência SEQ ID NO: 4-1BB AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATA 43

TATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTA CAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTA GCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAG

GAGGATGTGAACTG KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCS 44

CRFPEEEEGGCEL CD28 TCAAAGCGGAGTAGGTTGTTGCATTCCG 45

ATTACATGAATATGACTCCTCGCCGGCC TGGGCCGACAAGAAAACATTACCAACCC TATGCCCCCCCACGAGACTTCGCTGCG

TACAGGTCC SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQP 46

YAPPRDFAAYRS

Nome Sequência SEQ ID NO: CD3-zeta CGAGTGAAGTTTTCCCGAAGCGCAGAC 47

GCTCCGGCATATCAGCAAGGACAGAAT CAGCTGTATAACGAACTGAATTTGGGAC GCCGCGAGGAGTATGACGTGCTTGATA AACGCCGGGGGAGAGACCCGGAAATG GGGGGTAAACCCCGAAGAAAGAATCCC CAAGAAGGACTCTACAATGAACTCCAGA AGGATAAGATGGCGGAGGCCTACTCAG AAATAGGTATGAAGGGCGAACGACGAC GGGGAAAAGGTCACGATGGCCTCTACC AAGGGTTGAGTACGGCAACCAAAGATA CGTACGATGCACTGCATATGCAGGCCC

TGCCTCCCAGA RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGR 48

REEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQ EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRG KGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP

R Anticorpos

[0094] Um anticorpo (indistintamente usado na forma plural) é uma molécula de imunoglobulina capaz de ligação específica a um alvo, como um carboidrato, polinucleotídeo, lipídeo, polipeptídeo, etc., atra- vés de pelo menos um local de reconhecimento do antígeno, localiza- do na região variável da molécula de imunoglobulina. Como usado aqui, o termo "anticorpo" engloba não só anticorpos monoclonais intac- tos (isto é, de comprimento total), mas também fragmentos de ligação ao antígeno (tais como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), fragmento variável de cadeia única (scFv), seus mutantes, proteínas de fusão que compre- ende uma porção de anticorpo, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, diacorpos, anticorpos lineares, anticorpos de cadeia única, anticorpos de domínio único (por exemplo, anticorpos VHH de camelo ou lhama), anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos bies- pecíficos) e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um local de reconhecimento do antí- geno da especificidade requerida, que inclui variantes de glicosilação de anticorpos, variantes de sequência de aminoácidos de anticorpos e anticorpos covalentemente modificados.

[0095] Uma molécula de anticorpo típica compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), que estão usualmente envolvidas na ligação ao antígeno. Estas regiões/resíduos que são responsáveis pela ligação ao antígeno po- dem ser identificadas a partir de sequências de aminoácidos das se- quências de VH/VL de um anticorpo de referência (por exemplo, um anticorpo anti-LIV1 como descrito no presente documento) por méto- dos conhecidos na técnica. As regiões VH e VL podem ser adicional- mente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, também conhe- cidas como "regiões determinantes da complementaridade" ("CDR"), intercaladas com regiões que são mais conservadas, que são conhe- cidas como "regiões estruturais" ("FR"). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino para o terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. A extensão da região estrutural e CDRs pode ser precisamente identificada usando metodologia conhecida na técnica, por exemplo, pela definição de Kabat, pela definição de Chothia, pela definição de AbM e/ou pela definição de contato, todas as quais são bem conheci- das na técnica. Como usado aqui, uma CDR pode se referir à CDR definida por qualquer método conhecido na técnica. Dois anticorpos que têm a mesma CDR significa que os dois anticorpos têm a mesma sequência de aminoácidos dessa CDR como determinado pelo mesmo método. Consulte, por exemplo, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH No. 91 a 3242, Chothia et al., (1989) Nature 342:877; Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol.

196:901 a 917, Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927 a 948; and Almagro, J. Mol. Recognit. 17: 132 a 143 (2004). Ver também hgmp.mrc.ac.uk e bioinf.org.uk/abs.

[0096] Em algumas modalidades, o anticorpo é um scFv, como um scFv anti-LIV1. Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, como IgD, IgE, IgG, IgA ou IgM (ou sua subclasse), e o anticorpo não necessita de ser de qualquer classe particular. Dependendo da se- quência de aminoácidos do anticorpo do domínio constante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferen- tes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias destas podem ser adicionalmente dividi- das em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que corres- pondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectivamente. As estruturas de subuni- dade e configurações tridimensionais de diferentes classes de imuno- globulinas são bem conhecidas.

[0097] Os anticorpos a serem usados como fornecido no presente documento podem ser murinos, de rato, humanos ou qualquer outra origem (que inclui anticorpos quiméricos ou humanizados). Em alguns exemplos, o anticorpo compreende uma região constante modificada, como uma região constante que é imunologicamente inerte, por exem- plo, não desencadeia a lise mediada pelo complemento, ou não esti- mula a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC).

[0098] Em algumas modalidades, um anticorpo da presente reve- lação é um anticorpo humanizado. Os anticorpos humanizados se re- ferem a formas não humanas (por exemplo, murinas) que são imuno- globulinas quiméricas específicas, cadeias de imunoglobulina ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que contêm sequência mínima de-

rivada de imunoglobulina não humana. Na maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo destinatário) nos quais os resíduos de uma região determinante da complementari- dade (CDR) do destinatário são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) como camundongo, rato ou coelho que tem a especificidade, afinidade e capacidade dese- jadas. Em alguns casos, os resíduos da região estrutural (FR) de Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não huma- nos correspondentes. Ademais, o anticorpo humanizado pode com- preender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo destina- tário nem nas sequências de CDR ou estruturais importadas, mas são incluídos para refinar e otimizar adicionalmente o desempenho do an- ticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substanci- almente todos os ou pelo menos um, e tipicamente dois, domínios va- riáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. Um anticorpo humanizado compreenderá também otimamente pelo menos uma porção de uma região ou domínio constante (Fc) da imunoglobulina, tipicamente aque- la de uma imunoglobulina humana. Outras formas de anticorpos hu- manizados têm uma ou mais CDRs (uma, duas, três, quatro, cinco, seis) que estão alteradas no que diz respeito ao anticorpo original, que são também denominadas uma ou mais CDRs "derivadas de" uma ou mais CDRs do anticorpo original. Os anticorpos humanizados podem também envolver maturação de afinidade.

[0099] Em algumas modalidades, um anticorpo da presente reve- lação é um anticorpo quimérico, que pode incluir uma região constante pesada e uma região constante leve de um anticorpo humano. Os an- ticorpos quiméricos se referem a anticorpos que tem uma região variá-

vel ou parte da região variável de uma primeira espécie e uma região constante de uma segunda espécie. Tipicamente, em estes anticorpos quiméricos, a região variável de ambas as cadeias leve e pesada mi- metiza as regiões variáveis de anticorpos derivados de uma espécie de mamífero (por exemplo, um mamífero não humano como camun- dongo, coelho e rato), enquanto as porções constantes são homólogas às sequências em anticorpos derivados de outro mamífero como hu- mano. Em algumas modalidades, modificações de aminoácidos podem ser feitas na região variável e/ou na região constante.

[00100] Em algumas modalidades, um anticorpo da presente reve- lação se liga especificamente a um antígeno alvo, como LIV1 humano. Um anticorpo que "se liga especificamente" (usado indistintamente aqui) a um alvo ou epítopo é um termo bem entendido na técnica, e métodos para determinar tal ligação específica são também bem co- nhecidos na técnica. Se diz que uma molécula exibe "ligação específi- ca" se reagir ou se associar mais frequentemente, mais rapidamente, com maior duração e/ou com maior afinidade com um antígeno alvo particular do que com alvos alternativos. Um anticorpo "se liga especi- ficamente" a um antígeno alvo se se ligar com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que se liga a outras substâncias. Por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente (ou preferencialmente) a um epítopo de LIV1 é um anticorpo que se liga a este epítopo de LIV1 com maior afinidade, avidez, mais pronta- mente e/ou com maior duração do que se liga a outros epítopos de LIV1 ou epítopos diferentes de LIV1. É também entendido pela leitura desta definição que, por exemplo, um anticorpo que se liga especifi- camente a um primeiro antígeno alvo pode ou não pode se ligar espe- cificamente ou preferencialmente a um segundo antígeno alvo. Como tal, "ligação específica" ou "ligação preferencial" não requer necessari- amente (embora possa incluir) ligação exclusiva. Geralmente, mas não necessariamente, a referência à ligação significa ligação preferencial.

[00101] Em algumas modalidades, a constante de dissociação de equilíbrio (KD) entre o anticorpo e LIV1 é 100 pM a 1 µM. Em algumas modalidades, o KD entre o anticorpo e LIV1 é 1 nM a 100 nM.

[00102] Também dentro do escopo da presente revelação estão as variantes funcionais de qualquer um dos anticorpos exemplificativos, conforme revelado no presente documento. Uma variante funcional pode conter uma ou mais variações de resíduo de aminoácido em VH e/ou VL, ou em uma ou mais das CDRs de VH e/ou uma ou mais das CDRs de VL em relação a um anticorpo de referência, embora retendo substancialmente semelhante ligação e atividades biológicas (por exemplo, afinidade de ligação, especificidade de ligação, atividade ini- bidora, atividade antitumoral substancialmente semelhantes ou uma combinação das mesmas) como o anticorpo de referência.

[00103] Em alguns exemplos, um anticorpo aqui revelado compre- ende uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH, que coletivamente não contém mais do que 10 variações de aminoácidos (por exemplo, não mais do que 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 variação de aminoácido) em comparação à CDR1 de VH, CDR2 de VH e CDR3 de VH de um anticorpo de referência, como em VH: As SEQ ID NO: 55 ou 90 ou 98; VL: As SEQ ID NO: 56 ou 88 ou 128. "Coletivamente" signifi- ca que o número total de variações de aminoácidos em todas as três CDRs de VH está dentro da gama definida. Adicional ou alternativa- mente, o anticorpo pode compreender uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL e uma CDR3 de VL, que coletivamente não contém mais do que 10 variações de aminoácidos (por exemplo, não mais do que 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 variação de aminoácido) em comparação à CDR1 de VL, CDR2 de VL e CDR3 de VL do anticorpo de referência.

[00104] Em alguns exemplos, um anticorpo aqui revelado pode compreender uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de

VH, pelo menos uma das quais contém não mais do que 5 variações de aminoácidos (por exemplo, não mais do que 4, 3, 2 ou 1 variação de aminoácidos) como a contraparte CDR de VH de um anticorpo de referência, como em VH: As SEQ ID NO: 55 ou 90 ou 98; VL: As SEQ ID NO: 56 ou 88 ou 128. Em exemplos específicos, o anticorpo com- preende uma CDR3 de VH, que contém não mais do que 5 variações de aminoácidos (por exemplo, não mais do que 4, 3, 2 ou 1 variação de aminoácido) como a CDR3 de VH de um anticorpo de referência, como em VH: As SEQ ID NO: 55 ou 90 ou 98; VL: As SEQ ID NO: 56 ou 88 ou 128. Adicional ou alternativamente, um anticorpo pode com- preender uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL e uma CDR3 de VL, pelo menos uma das quais contém não mais do que 5 variações de aminoácidos (por exemplo, não mais do que 4, 3, 2 ou 1 variação de aminoácidos) como a contraparte CDR de VL do anticorpo de referên- cia. Em exemplos específicos, o anticorpo compreende uma CDR3 de VL, que contém não mais do que 5 variações de aminoácidos (por exemplo, não mais do que 4, 3, 2 ou 1 variação de aminoácido) como a CDR3 de LC do anticorpo de referência.

[00105] Em alguns casos, as variações de resíduos de aminoácidos podem ser substituições conservativas de resíduos de aminoácidos. Como usado aqui, uma "substituição conservativa de aminoácidos" se refere a uma substituição de aminoácidos que não altera a carga rela- tiva ou as características de tamanho da proteína na qual a substitui- ção de aminoácidos é feita. As variantes podem ser preparadas de acordo com métodos para alterar a sequência polipeptídica conhecida por um perito na técnica, tais como são encontradas em referências que compilam tais métodos, por exemplo, Molecular Cloning: A Labo- ratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989, ou Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John

Wiley & Sons, Inc., New York. As substituições conservativas de ami- noácidos incluem substituições feitas entre os aminoácidos dentro dos seguintes grupos: (a) A  G, S; (b) R  K, H; (c) N  Q, H; (d) D  E, N; (e) C  S, A; (f) Q  N; (g) E  D, Q; (h) G  A; (i) H  N, Q; (j) I  L, V; (k) L  I, V; (l) K  R, H; (m) M L, I, Y; (n) F  Y, M, L; (o) P  A; (p) S  T; (q) T S; (r) W  Y, F; (s) Y  W, F; e (t) V I, L.

[00106] Em algumas modalidades, um anticorpo revelado no pre- sente documento pode compreender CDRs de VH que coletivamente são pelo menos 80% (por exemplo, 85%, 90%, 95% ou 98%) idênticas às CDRs de VH de um anticorpo de referência como Anticorpo A (VH: SEQ ID NO: 55; VL: SEQ ID NO: 56) ou Anticorpo B (VH: SEQ ID NO: 90; VL: SEQ ID NO: 88). Adicional ou alternativamente, o anticorpo pode compreender CDRs de VL que coletivamente são pelo menos 80% (por exemplo, 85%, 90%, 95% ou 98%) idênticas às CDRs de VL do anticorpo de referência. Em algumas modalidades, um anticorpo pode compreender um VH que é pelo menos 80% (por exemplo, 85%, 90%, 95% ou 98%) idêntico ao VH de um anticorpo de referência co- mo em VH: As SEQ ID NO: 55 ou 90 ou 98; VL: As SEQ ID NO: 56 ou 88 ou 128 e/ou uma região variável de VL que é pelo menos 80% (por exemplo, 85%, 90%, 95%, ou 98%) idêntica à região variável de VL do anticorpo de referência. Modelo Doador

[00107] O ácido nucleico que codifica um CAR pode ser entregue a uma célula T que compreende o que é aqui referido como um modelo doador (também referido como um polinucleotídeo doador). Um mode- lo doador pode conter uma sequência não homóloga, como o ácido nucleico que codifica um CAR, flanqueada por duas regiões de homo- logia para permitir HDR eficiente em uma localização genômica de in- teresse. Alternativamente, um modelo doador pode não ter regiões de homologia com a localização alvejada no DNA e pode ser integrado por união de extremidade dependente de NHEJ após clivagem no local alvo.

[00108] Um modelo doador pode ser DNA ou RNA, de filamento único e/ou filamento duplo, e pode ser introduzido em uma célula na forma linear ou circular. Se introduzido na forma linear, as extremida- des da sequência doadora podem ser protegidas (por exemplo, da de- gradação exonucleolítica) por métodos conhecidos por aqueles indiví- duos versados na técnica. Por exemplo, um ou mais resíduos de dide- soxinucleotídeo são adicionados ao terminal 3’ de uma molécula linear e/ou oligonucleotídeos autocomplementares são ligados a uma das ou ambas as extremidades. Ver, por exemplo, Chang et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4959-4963; Nehls et al., (1996) Science 272: 886-889. Métodos adicionais para proteção de polinucleotídeos exó- genos da degradação incluem, mas não estão limitados a, adição de grupo(s) amino terminal(ais) e o uso de ligações internucleotídeos mo- dificadas tais como, por exemplo, fosforotioatos, fosforamidatos e resí- duos de ribose de O-metila ou desoxirribose.

[00109] Um modelo doador pode ser introduzido em uma célula como parte de uma molécula de vetor que tem sequências adicionais tais como, por exemplo, origens de replicação, promotores e genes que codifica resistência a antibióticos. Além disso, um modelo doador pode ser introduzido como ácido nucleico nu, como ácido nucleico complexado com um agente como um lipossomo ou poloxâmero, ou pode ser entregue por vírus (por exemplo, adenovírus, AAV, herpesví- rus, retrovírus, lentivírus e lentivírus defeituoso em integrase (IDLV)).

[00110] Um modelo doador, em algumas modalidades, é inserido tal que sua expressão seja conduzida pelo promotor endógeno no local de integração, nomeadamente o promotor que conduz a expressão do gene endógeno no qual o doador é inserido. No entanto, em algumas modalidades, o modelo dador compreende um promotor e/ou intensifi- cador exógenos, por exemplo um promotor constitutivo, um promotor indutível ou promotor específico de tecido. Em algumas modalidades, o promotor exógeno é um promotor de EF1α que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 79. Podem ser usados outros promotores.

[00111] Além do mais, as sequências exógenas podem também incluir sequências reguladoras transcricionais ou translacionais, por exemplo, promotores, intensificadores, isoladores, locais internos de entrada de ribossomos, sequências codificando peptídeos 2A e/ou si- nais de poliadenilação. Métodos e Construtos de Entrega

[00112] Nucleases e/ou modelos dadores podem ser entregues usando um sistema de vetor, incluindo, mas não se limitando a, veto- res de plasmídeo, minicírculos de DNA, vetores retrovirais, vetores len- tivirais, vetores de adenovírus, vetores de poxvírus; vetores de her- pesvírus e vetores de vírus adenoassociados e suas combinações.

[00113] Métodos convencionais de transferência de genes basea- dos em vírus e não virais podem ser usados para introduzir ácidos nu- cleicos que codifica nucleases e modelos doadores em células (por exemplo, células T). Os sistemas de entrega de vetor não viral incluem plasmídeos de DNA, minicírculos de DNA, ácido nucleico nu e ácido nucleico complexado com um veículo de entrega, como um lipossomo ou poloxâmero. Os sistemas de entrega de vetor viral incluem vírus de DNA e RNA, que possuem genomas epissomais ou integrados após a entrega à célula.

[00114] Os métodos de entrega não viral de ácidos nucleicos inclu- em eletroporação, lipofecção, microinjeção, biolística, virossomas, li- possomas, imunolipossomas, policação ou conjugados lipídeo:ácido nucleico, DNA nu, RNA nu, RNA coberto, vírions artificiais e absorção intensificada por agente do DNA. Sonoporação usando, por exemplo,

o sistema Sonitron 2000 (Rich-Mar) pode ser também usada para en- trega de ácidos nucleicos. Entrega Viral Adenoassociada

[00115] O ácido nucleico doador que codifica um construto de CAR pode ser entregue a uma célula usando um vírus adenoassociado (AAV). Os AAVs são pequenos vírus que se integram especificamente por sítio no genoma do hospedeiro e podem, portanto, entregar um transgene, como CAR. Repetições terminais invertidas (ITRs) estão presentes flanqueando o genoma de AAV e/ou o transgene de interes- se e servem como origens de replicação. Estão também presentes no genoma de AAV proteínas rep e cap que, quando transcritas, formam capsídeos que encapsulam o genoma de AAV para entrega em células alvo. Receptores de superfície em estes capsídeos que conferem o serotipo de AAV, que determina a que órgãos alvo os capsídeos se ligarão principalmente e assim que células o AAV infetará mais eficien- temente. Existem doze serotipos de AAV humanos correntemente co- nhecidos. Em algumas modalidades, o AAV é serotipo 6 de AAV (AAV6).

[00116] Os vírus adenoassociados estão entre os vírus o mais fre- quentemente usados para terapia gênica por várias razões. Em primei- ro lugar, os AAVs não provocam uma resposta imunológica após ad- ministração a mamíferos, que inclui humanos. Em segundo lugar, os AAVs são efetivamente entregues às células alvo, particularmente quando é dada consideração à seleção do serotipo de AAV apropria- do. Finalmente, os AAVs têm a capacidade de infetar células tanto em divisão como não em divisão porque o genoma pode persistir na célula hospedeira sem integração. Este traço os torna um candidato ideal pa- ra terapia gênica. Reparação Dirigida por Homologia (HDR)

[00117] O ácido nucleico doador que codifica um CAR é inserido por reparo dirigido por homologia (HDR) no lócus do gene alvo. Ambas as cadeias do DNA no lócus alvo são cortadas por uma enzima CRISPR Cas9. HDR ocorre então para reparar a quebra de filamento duplo (DSB) e inserir o DNA doador. Para que isto ocorra corretamen- te, a sequência doadora é desenhada com resíduos de flanqueamento que são complementares à sequência rodeando o local de DSB no gene alvo (doravante "braços de homologia"). Estes braços de homo- logia servem como o modelo paro reparo de DSB e permitem que HDR seja um mecanismo essencialmente isento de erros. A taxa de reparo dirigido por homologia (HDR) é uma função da distância entre a mutação e o local de corte, logo é importante escolher locais alvo so- brepostos ou próximos. Os modelos podem incluir sequências extras flanqueadas pelas regiões homólogas ou podem conter uma sequên- cia que difere da sequência genômica, permitindo assim a edição da sequência.

[00118] O gene alvo pode ser associado a uma resposta imunológi- ca em um indivíduo, em que a deleção permanente de pelo menos uma porção do gene alvo modulará a resposta imunológica. Por exemplo, para gerar uma célula T de CAR, o gene alvo pode ser a re- gião constante de TCRα (TRAC). A interrupção de TRAC leva à perda da função do TCR endógeno.

[00119] Em algumas modalidades, o gene alvo está em um lócus de porto seguro. Células T manipuladas

[00120] As células T de CAR manipuladas (com edição gênica) da presente revelação podem ser autólogas ("próprias") ou não autólogas ("não próprias", por exemplo, alogênicas, singênicas ou xenogênicas). "Autólogo" se refere a células do mesmo indivíduo. "Alogênico" se re- fere a células da mesma espécie que um indivíduo, mas que diferem geneticamente das células do indivíduo. Em algumas modalidades, as células T são obtidas de um indivíduo mamífero. Em algumas modali- dades, as células T são obtidas de um ser humano.

[00121] As células T podem ser obtidas de um número de fontes que inclui, mas não se limitando a, células mononucleares do sangue periférico, medula óssea, tecido de linfonodos, sangue do cordão um- bilical, tecido do timo, tecido de um local de infeção, ascites, derrame pleural, tecido do baço e tumores. Em determinadas modalidades, as células T podem ser obtidas de uma unidade de sangue coletada de um indivíduo usando qualquer número de técnicas conhecidas do peri- to, como sedimentação, por exemplo, separação com FICOLL™.

[00122] Em algumas modalidades é usada uma população isolada de células T. Em algumas modalidades, após isolamento das células mononucleares do sangue periférico (PBMC), os linfócitos T tanto cito- tóxicos como auxiliares podem ser classificados em subpopulações de células T virgem, de memória e efetoras antes da ou após ativação, expansão e/ou modificação genética.

[00123] Uma subpopulação específica de células T, que expressam um ou mais dos seguintes marcadores de superfície celular: TCRab, CD3, CD4, CD8, CD27 CD28, CD38 CD45RA, CD45RO, CD62L, CD127, CD122, CD95, CD197, CCR7, KLRG1, proteínas MCH-I e/ou proteínas MCH-II, pode ser adicionalmente isolada por técnicas de se- leção positiva ou negativa. Em algumas modalidades, uma subpopula- ção específica de células T, que expressam um ou mais dos marcado- res selecionados do grupo consistindo em TCRab, CD4 e/ou CD8, é adicionalmente isolada por técnicas de seleção positiva ou negativa. Em algumas modalidades, as populações de células T manipuladas não expressam ou não expressam substancialmente um ou mais dos seguintes marcadores: CD70, CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, HΜ3 e LAG3. Em algumas modalidades, as subpopulações de células T podem ser isoladas por seleção positiva ou negativa antes da mani-

pulação genética e/ou pós-manipulação genética.

[00124] Em algumas modalidades, uma população isolada de célu- las T expressa um ou mais dos marcadores que inclui, mas não se li- mitando a, um CD3+, CD4+, CD8+ ou uma sua combinação. Em al- gumas modalidades, as células T são isoladas de um indivíduo e pri- meiramente ativadas e estimuladas para proliferarem in vitro antes de serem submetidas a edição gênica.

[00125] Para alcançar doses terapêuticas suficientes de composi- ções de células T, as células T são frequentemente sujeitas a uma ou mais rondas de estimulação, ativação e/ou expansão. As células T po- dem ser ativadas e expandidas geralmente usando métodos como descrito, por exemplo, nas Patentes dos E.U.A. 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; e 6,867,041. Em algumas modalidades, as células T são ativadas e expandidas durante cerca de 1 dia a cerca de 4 dias, cerca de 1 dia a cerca de 3 dias, cerca de 1 dia a cerca de 2 dias, cerca de 2 dias a cerca de 3 dias, cerca de 2 dias a cerca de 4 dias, cerca de 3 dias a cerca de 4 dias, ou cerca de 1 dia, cerca de 2 dias, cerca de 3 dias ou cerca de 4 dias antes da introdução das composições de edi- ção do genoma nas células T.

[00126] Em algumas modalidades, as células T são ativadas e ex- pandidas durante cerca de 4 horas, cerca de 6 horas, cerca de 12 ho- ras, cerca de 18 horas, cerca de 24 horas, cerca de 36 horas, cerca de 48 horas, cerca de 60 horas ou cerca de 72 horas antes da introdução das composições de edição gênica nas células T.

[00127] Em algumas modalidades, as células T são ativadas ao mesmo tempo que as composições de edição do genoma são introdu- zidas nas células T. Métodos de Tratamento e Composições

[00128] São fornecidos no presente documento, em algumas moda- lidades, métodos para o tratamento de câncer (por exemplo: câncer de mama). Os exemplos não limitadores de cânceres que podem ser tra- tados como fornecidos no presente documento incluem: câncer de mama, por exemplo, câncer de mama receptor de estrogênio-positivo, câncer de próstata, tumores escamosos, por exemplo, da pele, bexiga, pulmão, colo uterino, endométrio, cabeça e pescoço, e trato biliar e tumores neurais. Em algumas modalidades, os métodos compreen- dem entregar as células T de CAR (por exemplo, células T de CAR anti-LIV1) da presente revelação para um indivíduo que tem câncer, incluindo, câncer de mama, por exemplo, câncer de mama de receptor de estrogênio positivo, câncer de próstata, tumores escamosos, por exemplo, da pele, bexiga, pulmão, colo uterino, endométrio, cabeça e pescoço e trato biliar e/ou tumores neurais.

[00129] A etapa de administrar pode incluir a colocação (por exem- plo, transplante) de células, por exemplo, células T manipuladas, em um indivíduo, por um método ou rota que resulta na localização pelo menos parcial das células introduzidas em um local desejado, como tumor, de modo que o efeito (ou efeitos) desejado seja produzido. As células T manipuladas podem ser administradas por qualquer via apropriada que resulte na entrega em uma localização desejada no indivíduo onde pelo menos uma porção das células implantadas ou componentes das células permanece viáveis. O período de viabilidade das células após administração a um indivíduo pode ser tão curto quanto algumas horas, por exemplo, vinte e quatro horas, a alguns di- as, até tão longo quanto vários anos, ou mesmo o tempo de vida do indivíduo, isto é, enxerto de longo prazo. Por exemplo, em alguns as- pectos descritos no presente documento, uma quantidade eficaz de células T manipuladas é administrada através uma via de administra- ção sistémica, como uma via intraperitoneal ou intravenosa.

[00130] Um indivíduo pode ser qualquer indivíduo para o qual diag- nóstico, tratamento ou terapia é desejado. Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero. Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano.

[00131] Um doador é um indivíduo que não é o indivíduo a ser tra- tado. Um doador é um indivíduo que não é o paciente. Em algumas modalidades, um doador é um indivíduo que não tem ou não é suspei- to de ter o câncer a ser tratado. Em algumas modalidades são usados múltiplos doadores, por exemplo, dois ou mais doadores.

[00132] Em algumas modalidades, a população de células T mani- puladas sendo administrada de acordo com os métodos descritos no presente documento compreende células T alogênicas obtidas de um ou mais doadores. "Alogênico" se refere a uma célula, população celu- lar ou amostras biológicas que compreende células, obtidas de um ou mais doadores diferentes da mesma espécie, onde os genes em um ou mais loci não são idênticos ao receptor. Por exemplo, uma popula- ção de células T manipuladas, sendo administrada a um indivíduo, po- de ser derivada de um ou mais doadores não relacionados ou de um ou mais irmãos não idênticos. Em algumas modalidades podem ser usadas populações de células singênicas, tais como aquelas obtidas de doadores geneticamente idênticos (por exemplo, gêmeos idênti- cos). Em algumas modalidades, as células são células autólogas; isto é, as células T manipuladas são obtidas ou isoladas a partir de um in- divíduo e administradas ao mesmo indivíduo, isto é, o doador e o des- tinatário são os mesmos.

[00133] Em algumas modalidades, uma população de células T manipuladas sendo administrada de acordo com os métodos descritos no presente documento não induz toxicidade no indivíduo, por exem- plo, as células T manipuladas não induzem toxicidade em células não cancerosas. Em algumas modalidades, uma população de células T manipuladas sendo administrada não desencadeia a lise mediada por complemento ou não estimula a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC).

[00134] Uma quantidade eficaz se refere à quantidade de uma po- pulação de células T manipuladas necessária para prevenir ou aliviar pelo menos um ou mais sinais ou sintomas de uma condição médica (por exemplo, câncer) e se relaciona com uma quantidade suficiente de uma composição para proporcionar o desejado efeito, por exemplo, para tratar um indivíduo que tem uma condição médica. Uma quanti- dade eficaz inclui também uma quantidade suficiente para prevenir ou retardar o desenvolvimento de um sintoma da doença, alterar o decur- so de um sintoma da doença (por exemplo, mas não se limitando a, desacelerar a progressão de um sintoma da doença) ou reverter um sintoma da doença. É entendido que, para qualquer dado caso, uma quantidade eficaz apropriada pode ser determinada por um perito na técnica usando experimentação de rotina.

[00135] Para uso nos vários aspectos descritos no presente docu- mento, uma quantidade eficaz de células (por exemplo, células T ma- nipuladas) compreende pelo menos 102 células, pelo menos 5 X 102 células, pelo menos 103 células, pelo menos 5 X 103 células, pelo me- nos 104 células, pelo menos 5 X 104 células, pelo menos 105 células, pelo menos 2 X 105 células, pelo menos 3 X 105 células, pelo menos 4 X 105 células, pelo menos 5 X 105 células, pelo menos 6 X 105 células, pelo menos 7 X 105 células, pelo menos 8 X 105 células, pelo menos 9 X 105 células, pelo menos 1 X 106 células, pelo menos 2 X 106 células, pelo menos 3 X 106 células, pelo menos 4 X 106 células, pelo menos 5 X 106 células, pelo menos 6 X 106 células, pelo menos 7 X 106 células, pelo menos 8 X 106 células, pelo menos 9 X 106 células ou seus múlti- plos. As células são derivadas de um ou mais doadores ou são obtidas de uma fonte autóloga. Em alguns exemplos descritos no presente do-

cumento, as células são expandidas em cultura antes da administra- ção a um indivíduo com sua necessidade.

[00136] Os modos de administração incluem injeção, infusão, insti- lação ou ingestão. Injeção inclui, sem limitação, injeção e infusão in- travenosas, intramusculares, intra-arteriais, intratecais, intraventricula- res, intracapsulares, intraorbitais, intracardíacas, intradérmicas, intra- peritoneais, transtraqueais, subcutâneas, subcuticulares, intra- articulares, subcapsulares, subaracnoides, intraespinhais, intracere- broespinhais e intraesternais. Em algumas modalidades, a via é intra- venosa.

[00137] Em algumas modalidades, as células T manipuladas são administradas sistemicamente, o que se refere à administração de uma população de células sem ser diretamente em um local, tecido ou órgão alvo, tal que entrem, ao invés, no sistema circulatório do indiví- duo e, assim, sejam sujeitas ao metabolismo e outros processos simi- lares.

[00138] A eficácia de um tratamento que compreende uma compo- sição para o tratamento de uma condição médica pode ser determina- da pelo médico perito. Um tratamento é considerado "tratamento efi- caz" se qualquer um dos ou todos os sinais ou sintomas de, como um exemplo, níveis de alvo funcional forem alterados de uma maneira be- néfica (por exemplo, aumentado em pelo menos 10%) ou outros sin- tomas clinicamente aceitos ou marcadores da doença (por exemplo, câncer) forem melhorados ou aliviados. A eficácia pode ser também medida pela falha de um indivíduo em piorar como avaliado por hospi- talização ou necessidade de intervenções médicas (por exemplo, a progressão da doença é interrompida ou pelo menos desacelerada). Os métodos de medição destes indicadores são conhecidos por aque- les indivíduos versados na técnica e/ou descritos no presente docu- mento. O tratamento inclui qualquer tratamento de uma doença no in-

divíduo e inclui: (1) inibir a doença, por exemplo, parar, ou desacelerar a progressão dos sintomas; ou (2) atenuar a doença, por exemplo, causar a regressão dos sintomas; e (3) prevenir ou reduzir a probabili- dade do desenvolvimento de sintomas.

[00139] A presente revelação é exemplificada pelas seguintes mo- dalidades:

[00140] Modalidade 1. Célula T manipulada caracterizada pelo fato de que compreende um ácido nucleico codificando um receptor de an- tígeno quimérico (CAR), em que o CAR compreende um ectodomínio que se liga especificamente a LIV1.

[00141] Modalidade 2. A célula T manipulada, de acordo com a mo- dalidade 1, que compreende adicionalmente um gene da região cons- tante alfa do receptor de células T (TRAC) interrompido.

[00142] Modalidade 3. A célula T manipulada da modalidade 2, em que o ácido nucleico codificando o CAR é inserido no gene TRAC.

[00143] Modalidade 4. A célula T manipulada, de acordo com qual- quer uma das modalidades 1 a 3, que compreende adicionalmente um gene da beta-2-microglobulina (β2M) interrompido.

[00144] Modalidade 5. A célula T manipulada, de acordo com qual- quer uma das modalidades 1 a 4, em que o ectodomínio do CAR com- preende um anticorpo anti-LIV1.

[00145] Modalidade 6. A célula T manipulada, de acordo com a mo- dalidade 5, em que o anticorpo anti-LIV1 é um fragmento variável de cadeia única (scFv) anti-LIV1.

[00146] Modalidade 7. A célula T manipulada da modalidade 6, em que o scFv anti-LIV1 compreende as mesmas regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da região variável da cadeia pesada (VH) e as mesmas CDRs da região variável da cadeia leve (VL) como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compre- ende uma VH estabelecida como SEQ ID NO: 55 e um VL estabeleci-

do como SEQ ID NO: 56, (ii) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 69 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 70, (iii) um VH estabeleci- do como SEQ ID NO: 76 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 77, ou (iii) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 83 e um VL estabeleci- do como SEQ ID NO: 84.

[00147] Modalidade 8. A célula T manipulada, de acordo com a mo- dalidade 7, em que o scFv anti-LIV1 compreende as mesmas cadeias de VH e VL que o anticorpo de referência.

[00148] Modalidade 8,1. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade 7, em que o scFv anti-LIV1 compreende a sequência de aminoácidos de qualquer um dos SEQ ID NOs: 54 ou 70.

[00149] Modalidade 9. A célula T manipulada, de acordo com qual- quer uma das modalidades 1 a 8.1, em que o CAR compreende adici- onalmente um domínio coestimulador CD28 ou um domínio coestimu- lador 41BB.

[00150] Modalidade 10. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade 9, em que o CAR compreende adicionalmente um domínio de sinalização citoplasmática CD3z.

[00151] Modalidade 11. A célula T manipulada de qualquer uma das modalidades 3 a 10, em que o gene TRAC compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer um dos SEQ ID NOs: 63, 64, 71 ou 72 e/ou em que o CAR é codificado pela sequência de nucleotídeos de qualquer um dos SEQ ID NOs: 49, 51, 65 ou 67.

[00152] Modalidade 12. A célula T manipulada de qualquer uma das modalidades 4 a 11, em que o gene β2M compreende o gene de pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir de qual- quer um dos SEQ ID NOS: 9 a 14.

[00153] Modalidade 13. Uma população da célula T manipulada, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que pelo menos 25% ou pelo menos 50% das células T manipuladas da população expressam o CAR.

[00154] Modalidade 14. A população, de acordo com a modalidade 14, em que pelo menos 70% das células T manipuladas da população expressam o CAR.

[00155] Modalidade 15. A população, de acordo com a modalidade 13, em que pelo menos 25% das células T manipuladas da população expressam o CAR após pelo menos 7 dias ou pelo menos 14 dias de proliferação in vitro.

[00156] Modalidade 16. A população de qualquer uma das modali- dades 13-15, em que pelo menos 50% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectável de proteína do receptor de células T (TCR).

[00157] Modalidade 17. A população, de acordo com a modalidade 16, em que pelo menos 90% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectável de proteína de TCR.

[00158] Modalidade 18. A população de qualquer uma das modali- dades 13-17, em que pelo menos 50% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectável de proteína β2M.

[00159] Modalidade 19. A população da modalidade 18, em que pe- lo menos 70% das células T manipuladas da população não expres- sam um nível detectável de proteína β2M.

[00160] Modalidade 20. A população de qualquer uma das modali- dades 13-19, em que as células T manipuladas da população, quando cocultivadas in vitro com uma população de células cancerosas que expressam LIV1, induzem a lise celular de pelo menos 10%, pelo me- nos 25% ou pelo menos 50% das células cancerosas da população.

[00161] Modalidade 21. A população, de acordo com a modalidade 20, em que as células T manipuladas da população, quando cocultiva- das in vitro com uma população de células cancerosas que expressam LIV1, induzem a lise celular de pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% da população de células cancerosas.

[00162] Modalidade 22. A população, de acordo com qualquer uma das modalidades 20 ou 21, caracterizada por as células T manipuladas da população, quando cocultivadas in vitro com uma população de cé- lulas cancerosas, secretarem IFNγ.

[00163] Modalidade 23. A população de qualquer uma das modali- dades 20-22, em que a razão entre células T manipuladas e células cancerosas é 1:1 a 2:1.

[00164] Modalidade 24. A população, de acordo com qualquer uma das modalidades 20 a 23, em de que as células cancerosas compre- endem células de sarcoma.

[00165] Modalidade 25. A população, de acordo com qualquer uma das modalidades 20 a 23, em que as células cancerosas compreen- dem células de câncer de mama.

[00166] Modalidade 27. A população, de acordo com qualquer uma das modalidades 13 a 26, em que quando administrada in vivo a um indivíduo, não induz toxicidade no indivíduo.

[00167] Modalidade 26. Um método que compreende a administra- ção da população de células T manipuladas de qualquer uma das mo- dalidades 13 a 27 a um indivíduo.

[00168] Modalidade 27. O método, de acordo com a modalidade 26, em que o indivíduo é um ser humano.

[00169] Modalidade 28. O método, de acordo com a modalidade 27, em que o indivíduo tem um câncer.

[00170] Modalidade 29. O método, de acordo com a modalidade 28, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado dentre o grupo que consiste em: câncer de mama, por exemplo, câncer de mama po- sitivo de receptor de estrogênio, câncer de próstata, tumores escamo- sos, por exemplo, da pele, bexiga, pulmão, colo uterino, endométrio, cabeça e pescoço e trato biliar e/ou tumores neuronais.

[00171] Modalidade 30. O método, de acordo a modalidade 28 ou 31, em que o câncer compreende células cancerosas que expressam LIV1.

[00172] Modalidade 31. Um método para produzir uma célula T ma- nipulada, em que o método compreende (a) entregar a uma célula T uma nuclease guiada por RNA, um gRNA que alveja um gene TRAC e um vetor que compreende um modelo de doador que compreende um ácido nucleico que codifica um CAR que compreende um ectodomínio que se liga especificamente a LIV1; e (b) produzir uma célula T modifi- cada com um gene TRAC interrompido e que expressam o CAR.

[00173] Modalidade 32. O método, de acordo com a modalidade 31, em que o gRNA que alveja o gene TRAC compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 18 ou 19 ou alveja a sequência de nucle- otídeos de SEQ ID NO: 40.

[00174] Modalidade 33. O método, de acordo com a modalidade 31 ou 32 em que o ácido nucleico que codifica o CAR é flanqueado por braços de homologia esquerdo e direito para o gene TRAC.

[00175] Modalidade 34. O método de qualquer uma das modalida- des 31-33 compreendendo adicionalmente entrega à célula T de um gRNA visando o gene β2M.

[00176] Modalidade 35. O método da modalidade 34, em que o gRNA visando o gene β2M compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 20 ou 21 ou alveja a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 41.

[00177] Modalidade 36. O método de qualquer uma das modalida- des 31-35, em que a nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cas9, opcionalmente uma nuclease Cas9 de S. pyogenes.

[00178] Modalidade 37. O método de qualquer uma das modalida- des 31-38, em que o ectodomínio do CAR é um anticorpo anti-LIV1.

[00179] Modalidade 38. O método, de acordo com a modalidade 37,

em que o anticorpo anti-LIV1 é um fragmento variável de cadeia única (scFv) anti-LIV1.

[00180] Modalidade 39. O método da modalidade 38, em que o scFv anti-LIV1 compreende as mesmas regiões determinantes de complementaridade de VH (CDRs) e as mesmas CDRs de VL como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compre- ende (i) uma VH estabelecida como SEQ ID NO: 55 e um VL estabele- cido como SEQ ID NO: 56.

[00181] Modalidade 40. O método, de acordo com a modalidade 39, em que o scFv anti-LIV1 compreende as mesmas cadeias de VH e VL que o anticorpo de referência.

[00182] Modalidade 41. O método, de acordo com a modalidade 39, em que o scFv anti-LIV1 compreende a sequência de aminoácidos de qualquer um dos SEQ ID NOs: 54 ou 70.

[00183] Modalidade 42. O método de qualquer uma das modalida- des 31-41, em que o CAR compreende um domínio coestimulador CD28 ou um domínio coestimulador 41BB.

[00184] Modalidade 43. O método, de acordo com a modalidade 42, em que o CAR compreende adicionalmente um domínio de sinalização citoplasmática CD3z.

[00185] Modalidade 44. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 31 a 43, em que o modelo doador compreende a se- quência de nucleotídeos de qualquer um dos SEQ ID NOs: 63, 64, 71 ou 72.

[00186] Modalidade 45. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 31 a 44 em que o CAR é codificado por uma se- quência de nucleotídeos de qualquer um dos SEQ ID NOs: 49, 51, 65 ou 67.

[00187] A presente revelação é exemplificada adicionalmente pelas seguintes modalidades:

[00188] Modalidade A1. Uma célula T manipulada que compreende um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que o CAR compreende um ectodomínio que se liga espe- cificamente a LIV1.

[00189] Modalidade A2. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade A1, que compreende adicionalmente um gene da região constante alfa do receptor de células T (TRAC) interrompido.

[00190] Modalidade A3. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade A1 ou A2, que compreende adicionalmente um gene beta- 2-microglobulina (β2M) interrompido.

[00191] Modalidade A4. A célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das modalidades A1 a A3, em que o ectodomínio do CAR compreende um anticorpo anti-LIV1.

[00192] Modalidade A5. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade A4, em que o anticorpo anti-LIV1 é um fragmento variável de cadeia única (scFv) anti-LIV1.

[00193] Modalidade A6. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade A5, em que o scFv anti-LIV1 compreende as mesmas re- giões determinantes da complementaridade (CDRs) do domínio variá- vel de cadeia pesada (VH) e as mesmas CDRs do domínio variável de cadeia leve (VL) que um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende (i) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 55 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 56 ou (ii) um VH estabele- cido como SEQ ID NO: 90 e um VL estabelecido como SEQ ID NO:

88.

[00194] Modalidade A7. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade A6, em que o scFv anti-LIV1 compreende as mesmas ca- deias de VH e VL que o anticorpo de referência.

[00195] Modalidade A8. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade A6, em que o scFv anti-LIV1 compreende a sequência de aminoácidos de qualquer um dos SEQ ID NOs: 54, 70, 83 ou 86.

[00196] Modalidade A9. A célula T manipulada de qualquer uma das modalidades A1 a A8, em que o CAR compreende adicionalmente um domínio coestimulador CD28 ou um domínio coestimulador 41BB.

[00197] Modalidade A10. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade A9, em que o CAR compreende adicionalmente um domí- nio de sinalização citoplasmática CD3ζ.

[00198] Modalidade A11. A célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das modalidade A1 a A10, em que o CAR é codificado pela sequência de nucleotídeos de qualquer um dos SEQ ID NOs: 49, 51, 104 ou 108 ou uma sequência de nucleotídeos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 90% idêntica às SEQ ID NOs: 49, 51, 104 ou 108.

[00199] Modalidade A12. A célula T modificada, de acordo com qualquer uma das modalidades A1 a A11, em que o ácido nucleico que codifica o CAR é inserido no gene TRAC interrompido.

[00200] Modalidade A13. A célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das modalidades A2 a A12, em que o gene TRAC inter- rompido compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 63, 64, 107 ou 111 e/ou a sequência de nucleotí- deos de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 49, 51, 104 ou 108.

[00201] Modalidade A14. A célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das modalidades A4 a A13, em que o gene β2M inter- rompido compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos se- lecionada a partir de qualquer um dos SEQ ID NOs: 9 a 14.

[00202] Modalidade A15. Uma célula T manipulada que compreen- de: (i) um gene TRAC interrompido; (ii) um gene β2M interrompido; e (iii) um ácido nucleico que codifica um CAR que compreende um frag- mento de ligação ao antígeno anti-LIV1.

[00203] Modalidade A16. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade A15, em que o CAR compreende (a) um ectodomínio que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti-LIV1, (b) um domínio transmembranar CD8 e (c) um endodomínio que compreende um domínio coestimulador 41BB e um domínio de sinalização cito- plasmático CD3ζ.

[00204] Modalidade A17. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade A15 ou A16, em que o gene TRAC interrompido compre- ende o ácido nucleico que codifica o CAR.

[00205] Modalidade A18. Uma célula T manipulada que compreen- de: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompi- do compreende um ácido nucleico codificando um CAR compreenden- do (a) um ectodomínio que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti-LIV1, (b) um domínio transmembranar CD8 e (c) um en- dodomínio que compreende um domínio coestimulador 41BB e um domínio de sinalização citoplasmático CD3ζ; e (ii) um gene β2M inter- rompido.

[00206] Modalidade A19. Uma célula T manipulada que compreen- de: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompi- do compreende um ácido nucleico que codifica um CAR que compre- ende uma sequência de aminoácidos de qualquer um dos SEQ ID NOs: 50, 52, 105, 109, 68 ou 66; e (ii) um gene β2M interrompido.

[00207] Modalidade A20. Uma célula T manipulada que compreen- de: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompi- do compreende um ácido nucleico que codifica um CAR, em que a se- quência de ácidos nucleicos é pelo menos 90% idêntica ao SEQ ID NO: 49, 51, 104 ou 108 e/ou codifica um CAR que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 50, 52, 105, 109, 68 ou 66; e (ii) um gene β2M interrompido.

[00208] Modalidade A21. A célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das modalidades A1 a A20, em que a célula T é uma célula T humana.

[00209] Modalidade A22. Uma população de células que as com- preendem células T manipuladas, de qualquer uma das modalidades A1 a A21, em que pelo menos 15% ou pelo menos 50% das células T manipuladas da população expressam o CAR.

[00210] Modalidade A23. A população, de acordo com a modalida- de A22, em que pelo menos 30% das células T manipuladas da popu- lação expressam o CAR.

[00211] Modalidade A24. A população, de acordo com a modalida- de A22, em que pelo menos 70% das células T manipuladas da popu- lação expressam o CAR.

[00212] Modalidade A25. A população, de acordo com a modalida- de A22, em que pelo menos 25% das células T manipuladas da popu- lação expressam o CAR após pelo menos 7 dias ou pelo menos 14 dias de proliferação in vitro.

[00213] Modalidade A26. A população, de acordo com qualquer uma das modalidades A22 a A25, em que pelo menos 50% das célu- las T manipuladas da população não expressam um nível detectável de proteína do receptor de células T (TCR).

[00214] Modalidade A27. A população, de acordo com a modalida- de A26, em que pelo menos 90% das células T manipuladas da popu- lação não expressam um nível detectável de proteína TCR.

[00215] Modalidade A28. A população, de acordo com qualquer uma das modalidades A22a A27, em que pelo menos 50% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectável de proteína β2M.

[00216] Modalidade A29. A população, de acordo com a modalida- de A28, em que pelo menos 70% das células T manipuladas da popu- lação não expressam um nível detectável de proteína β2M.

[00217] Modalidade A30. A população, de acordo com qualquer uma das modalidades A22 a A29 em que as células T manipuladas da população, quando cocultivadas in vitro com uma população de células cancerosas que expressam LIV1, induzem a lise celular de pelo menos 10%, pelo menos 25% ou pelo menos 50% das células cancerosas da população.

[00218] Modalidade A31. A população, de acordo com a modalida- de A30, em que as células T manipuladas da população, quando co- cultivadas in vitro com uma população de células cancerosas que ex- pressam LIV1, induzem a lise celular de pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% da população de células cancerosas.

[00219] Modalidade A32. A população, de acordo com a modalida- de A30 ou A31, em que as células T manipuladas da população, quando cocultivadas in vitro com uma população de células cancero- sas, secretam IFNγ.

[00220] Modalidade A33. A população, de acordo com qualquer uma das modalidades A30 a A32, em que a razão entre células T ma- nipuladas e células cancerosas é 1:1 a 2:1.

[00221] Modalidade A34. A população, de acordo com qualquer uma das modalidades A30 a A33, em de que as células cancerosas compreendem células de sarcoma.

[00222] Modalidade A35. A população, de acordo com qualquer uma das modalidades A30 a A33, em que as células cancerosas com- preendem células de câncer de mama.

[00223] Modalidade A36. A população, de acordo com qualquer uma das modalidades A22 a A35, em que quando administrada in vivo a um indivíduo, não induz toxicidade no indivíduo.

[00224] Modalidade A37. Uma população de células que compre- ende células T manipuladas, em que as células T manipuladas com- preendem: (i) um gene TRAC interrompido; (ii) um gene β2M interrom- pido; e (iii) um ácido nucleico que codifica um CAR que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti-LIV1.

[00225] Modalidade A38. A população de células, de acordo com a modalidade A37, em que o CAR compreende (a) um ectodomínio que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti-LIV1, (b) um domínio transmembranar CD8 e (c) um endodomínio que compreende um domínio coestimulador 41BB e um domínio coestimulador CD3ζ.

[00226] Modalidade A39. A população de células, de acordo com a modalidade A37 ou A38, em que o gene TRAC interrompido compre- ende o ácido nucleico que codifica o CAR.

[00227] Modalidade A40. Uma população de células que compre- ende células T manipuladas, em que as células T manipuladas com- preendem: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC in- terrompido compreende um ácido nucleico codificando um CAR com- preendendo (a) um ectodomínio que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti-LIV1, (b) um domínio transmembranar CD8 e (c) um endodomínio que compreende um domínio coestimulador 41BB e um domínio de sinalização citoplasmático CD3ζ; e (ii) um gene β2M interrompido.

[00228] Modalidade A41. Uma população de células que compre- ende células T manipuladas, em que as células T manipuladas com- preendem: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC in- terrompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR, em que a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 90% idêntica ao SEQ ID NO: 49, 51, 104 ou 108 e/ou codifica o CAR de SEQ ID NOs: 50, 52, 105, 109, 68 ou 66; e (ii) um gene β2M interrompido.

[00229] Modalidade A42. Um método que compreende a adminis- tração da população de células T manipuladas de qualquer uma das modalidades A22 a A41 a um indivíduo.

[00230] Modalidade A43. O método, de acordo com a modalidade A42, em que o indivíduo é um ser humano.

[00231] Modalidade A44. O método, de acordo com a modalidade A43, em que o indivíduo tem um câncer.

[00232] Modalidade A45. O método, de acordo com a reivindicação A44, em que o câncer é selecionado dentre o grupo que consiste em: câncer de mama, por exemplo, câncer de mama positivo de receptor de estrogênio, câncer de próstata, tumores escamosos, por exemplo, da pele, bexiga, pulmão, colo uterino, endométrio, cabeça e pescoço e trato biliar e/ou tumores neuronais.

[00233] Modalidade A46. O método, de acordo com as modalidades A44 ou A45, em que o câncer compreende células cancerosas que expressam LIV1.

[00234] Modalidade A47. Um método para produzir uma célula T manipulada, em que o método compreende (a) entregar a uma célula T (i) uma nuclease guiada por RNA, (ii) um gRNA que alveja um gene TRAC e (iii) um vetor que compreende um modelo de doador que compreende um ácido nucleico que codifica um CAR que compreende um ectodomínio que se liga especificamente a LIV1; e (b) produzir uma célula T modificada com um gene TRAC interrompido e que ex- pressam o CAR.

[00235] Modalidade A48. O método, de acordo com a modalidade A47, em que o gRNA que alveja o gene TRAC compreende a sequên- cia de nucleotídeos de SEQ ID NO: 18 ou 19 ou alveja a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40.

[00236] Modalidade A49. O método, de acordo com a modalidade A47 ou A48, que compreende adicionalmente a entrega à célula T de um gRNA que alveja o gene β2M.

[00237] Modalidade A50. O método, de acordo com a modalidade A49, em que o gRNA visando o gene β2M compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 20 ou 21 ou alveja a sequência de nu- cleotídeos de SEQ ID NO: 41.

[00238] Modalidade A51. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades A47 a A50, em que o ectodomínio do CAR compre- ende um anticorpo anti-LIV1.

[00239] Modalidade A52. O método, de acordo com a modalidade A51, em que o anticorpo anti-LIV1 é um fragmento variável de cadeia única (scFv) anti-LIV1.

[00240] Modalidade A53. O método, de acordo com a modalidade A52, em que o scFv anti-LIV1 compreende as mesmas regiões deter- minantes da complementaridade (CDRs) do domínio variável de ca- deia pesada (VH) e as mesmas CDRs do domínio variável de cadeia leve (VL) que um anticorpo de referência, em que o anticorpo de refe- rência compreende (i) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 55 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 56 ou (ii) um VH estabelecido co- mo SEQ ID NO: 90 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 88.

[00241] Modalidade A54. O método, de acordo com a modalidade A53, em que o scFv anti-LIV1 compreende as mesmas cadeias de VH e VL que o anticorpo de referência.

[00242] Modalidade A55. O método, de acordo com a modalidade A53, em que o scFv anti-LIV1 compreende a sequência de aminoáci- dos de qualquer um dos SEQ ID NOs: 54, 83, 86 ou 70.

[00243] Modalidade A56. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades A47 a A56, em que o CAR compreende adicional- mente um domínio coestimulador CD28 ou um domínio coestimulador 41BB.

[00244] Modalidade A57. O método, de acordo com a modalidade A56, em que o CAR compreende adicionalmente um domínio de sina- lização citoplasmática CD3ζ.

[00245] Modalidade A58. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades A47 a A57, em que o CAR é codificado por uma se- quência de nucleotídeos de qualquer um dos SEQ ID NOs: 49, 51, 104 ou 108 ou uma sequência de nucleotídeos que compreende uma se- quência de ácidos nucleicos que é pelo menos 90% idêntica às SEQ ID NOs: 49, 51, 104 ou 108.

[00246] Modalidade A59. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades A47 a A58, em que o ácido nucleico que codifica o CAR é flanqueado pelos braços de homologia esquerdo e direito do gene TRAC.

[00247] Modalidade A60. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades A47 a A59, em que o modelo doador compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer um dos SEQ ID NOs: 63, 64, 107 ou 111.

[00248] Modalidade A61. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades A47 a A60, em que a nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cas9, opcionalmente uma nuclease Cas9 de S. pyoge- nes.

[00249] Modalidade A62. Uma célula T manipulada produzida pelo método de qualquer uma das modalidades A47 a A61.

[00250] Modalidade A63. Uma população de células que compre- ende a célula T manipulada da modalidade A62.

[00251] Modalidade A64. Um método para tratar o câncer em um indivíduo, em que compreende a administração ao indivíduo da popu- lação de células de qualquer uma das modalidades A22 a A41 ou A63.

[00252] Modalidade A65. O método, de acordo com a reivindicação A64, em que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em: câncer pancreático, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer ute- rino, câncer de mama, câncer de próstata, câncer testicular, câncer de tireoide, câncer nasofaríngeo, câncer pulmonar de células não peque- nas (NSCLC), glioblastoma, neuronal, sarcomas de tecidos moles, leucemia, linfoma, melanoma, câncer de cólon, adenocarcinoma de cólon, glioblastoma cerebral, carcinoma hepatocelular, hepatocolangi-

ocarcinoma hepático, osteossarcoma, câncer gástrico, carcinoma de célula escamosa esofágico, câncer de pâncreas em estágio avançado, adenocarcinoma pulmonar, carcinoma de célula escamosa pulmonar, câncer de célula pequena pulmonar, carcinoma renal e câncer biliar intra-hepático.

[00253] Modalidade A66. O método, de acordo com as modalidades A64 ou A65, em que o câncer compreende células cancerosas que expressam LIV1.

EXEMPLOS Exemplo 1. Geração de célula T de CAR e expressão de CAR

[00254] Células T humanas primárias ativadas foram eletroporadas com complexos de Cas9:RNP de gRNA e vetores adenovirais adeno- associados (AAVs) para gerar células T de TRAC-/β2M-/CAR+ anti- Liv1a. Sorotipo 6 de AAV recombinante (AAV6) que compreende uma das sequências de nucleotídeos que codificam um CAR anti-Liv1a (971(SEQ ID NO: 49), 972 (SEQ ID NO: 65), 972b (SEQ ID NO: 67), 973 (SEQ ID NO: 95), 974 (SEQ ID NO: 100), 975 (SEQ ID NO: 104), e 976 (SEQ ID NO: 108) foi entregue com Cas9:sgRNA RNPs (1 µM Cas9, 5 µM gRNA) a células T humanas alogênicas ativadas. Os se- guintes sgRNAs foram usados: TRAC (SEQ ID NO: 28) e β2M (SEQ ID NO: 30). As versões não modificadas (ou outras versões modifica- das) dos gRNAs também podem ser usadas (por exemplo, SEQ ID NO: 18 ou 20).

[00255] Cerca de uma (1) semana após a eletroporação, as células foram processadas por citometria de fluxo para avaliar os níveis de expressão de TRAC, β2M e CAR anti-Liv1a na superfície celular da população de células editada (Figura 1). Para todas as células T de CAR anti-Liv1a e células de controle de TRAC-/β2M-, >90% das célu- las viáveis careciam de expressão de TCR e >60% careciam de ex- pressão de β2M. As células tratadas com o construto que codifica o

CAR de Liv1a 975 e 976 tiveram a maior porcentagem de células viá- veis que expressam um CAR+ anti-Liv1a (>30%). Exemplo 2. Citotoxicidade

[00256] Ensaio de Morte Celular. Um ensaio de morte celular (cito- toxicidade) foi usado para avaliar a capacidade das células T de TRAC-/β2M-/CAR+ anti-Liv1a para causar lise celular em linhagens celulares de câncer de mama e carcinoma de rim aderentes (A498 e ZR-75-1, respectivamente). As células aderentes foram semeadas em placas de 96 poços a 50.000 células por poço e deixadas durante a noite a 37 °C. Durante o dia seguinte, as células T foram adicionadas aos poços contendo células alvo em proporções de 8: 1, 4: 1, 2: 1 ou 1: 1 célula T:célula alvo. Células T de TRAC-/β2M- foram utilizadas como controle negativo. Após aproximadamente 24 horas, 100 µl de sobrenadante foram removidas para quantificação de citocina (ver abaixo) e células T foram removidas da cultura por aspiração e 100 µl de Celltiter-Glo® (Promega) foram adicionados a cada poço da placa para avaliar o número de células viáveis restantes. A quantidade de luz emitida por cada poço foi então quantificada usando um leitor de placas. As células T de CAR anti-Liv1a, particularmente aquelas que expressam os construtos de CTX971, CTX975 e CTX976, exibiram potente citotoxicidade para as linhagens celulares A498 (Figura 2A) e ZR-75-1 (Figura 2B). Exemplo 3. Secreção de citocina efetora

[00257] O Painel de Esferas Magnéticas de Citocina/Quimiocina Humana MILLIPLEX MAP - Kit de Ensaio Multiplex Imunológico (Milli- pore, no de catálogo HCYTOMAG-60K) usandos microesferas magné- ticas, esfera anti-IFNγ humano (Millipore, no de catálogo HCYIFNG- MAG) e esfera anti-IL-2 humana (Millipore, no de catálogo HIL2-MAG), respectivamente, foi usado para quantificar a secreção de IFN-γ e IL-2 nas amostras do ensaio de citotoxicidade. O ensaio foi conduzido se-

guindo o protocolo do fabricante. As amostras de controle de qualida- de (QC) e padrão de MILLIPLEX®, e diluições em série dos padrões de trabalho de 10.000 pg/ml a 3,2 pg/ml foram preparadas. Os sobre- nadantes celulares, QCs e padrão MILLIPLEX® foram adicionados a cada placa, e o meio de ensaio foi usado para diluir os sobrenadantes. Todas as amostras foram incubadas com esferas anti-IFNγ humano e anti-IL-2 humana por 2 horas. Após a incubação, a placa foi lavada usando-se um lavador de placa magnética automatizado. A solução de anticorpo de detecção de citocina/quimiocina humana foi adicionada a cada poço e incubado por 1 hora seguido da incubação com Estrepta- vidina-Ficoeritrina por 30 minutos. A placa foi subsequentemente lava- da, amostras foram suspensas novamente com 150 µl de Fluido de Bainha, e agitada em um agitador de placa por 5 minutos. As amostras foram lidas usando-se o instrumento Luminex® 100/200™ com softwa- re xPONENT® e aquisição de dados e análise foi concluída usando-se o software Analyst MILLIPLEX®. Os dados de Intensidade Fluorescen- te Mediana (MFI) foram analisados automaticamente usando-se um método de adaptação de curva logística de 5 parâmetros para calcular a concentração de citocina medida nas amostras desconhecidas.

[00258] Como mostrado nas Figuras 3A-3D, as células T alogências que contêm os CARS CTX971, 975, ou 976 secretaram as citocinas efetoras interferon-ɣ (3A, B) e interleucina-2 (3C, D) quando cocultiva- das com as linhagens celulares alvo A498 e ZR-75-1 em níveis signifi- cativamente acima do meio (Células T de 2KO/AAV neg. cocultivadas com as linhagens celulares alvo).

Tabela 6. CAR Estrutura de CAR SEQ ID NO: CAR de CD8 [peptídeo de sinal]-VL-ligante-VH- 49, 50 CTX-971 CD8 [tm] -CD28[domínio coestimulador]- CD3ζ CAR de CD8 [peptídeo de sinal]-VL-ligante-VH- 51, 52 CTX-971b CD8 [tm] -41BB[domínio coestimulador]- CD3ζ CAR de CD8 [peptídeo de sinal]-VH-ligante-VL- 65, 125 CTX-972 CD8[tm]-CD28[domínio coestimulador]- CD3ζ CAR de CD8 [peptídeo de sinal]-VH-ligante-VL- 67, 126 CTX-972b CD8[tm]-41BB[domínio coestimulador]- CD3ζ Tabela 7. Componentes de CAR Estrutura de CAR: CD8[peptídeo de sinal]-anti-LIV1[scFV]-CD8[tm]-CD28[domínio coes- timulador]-CD3ζ; ou CD8[peptídeo de sinal]-anti-LIV1[scFV]-CD8[tm]-41BB[domínio coes- timulador]-CD3ζ Nome Sequência SEQ ID NO: CAR de CCACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCA 49 CTX-971 CTGCTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCT CD28 coes- CCACGCAGCAAGGCCGGACGTGGTC tim ATGACTCAAAGCCCACTTTCCTTGCC

CGTGACTCTCGGACAACCGGCTTCAA TATCTTGCCGCTCATCACAGTCCCTG CTGCATAGCAGTGGTAACACTTATCTT GAGTGGTACCAACAGCGGCCCGGCC AATCTCCTAGGCCCCTGATATATAAGA TAAGTACTCGCTTTTCCGGGGTCCCG GACCGGTTCAGCGGGTCTGGGAGTG GTACAGACTTCACATTGAAGATTTCAC GAGTAGAAGCCGAAGACGTGGGTGTT TATTACTGCTTCCAAGGATCTCACGTG

Nome Sequência SEQ ID NO:

CCATATACGTTTGGTGGGGGCACAAA AGTCGAGATTAAGGGAGGCGGAGGA TCAGGAGGTGGGGGAAGTGGAGGTG GTGGGTCACAAGTACAGCTCGTGCAA TCAGGGGCGGAGGTGAAGAAACCAG GGGCGTCTGTGAAGGTAAGCTGTAAG GCATCCGGATTGACAATCGAGGATTA TTACATGCATTGGGTCCGCCAGGCAC CAGGGCAGGGATTGGAGTGGATGGG GTGGATAGATCCTGAAAATGGGGATA CAGAGTATGGCCCTAAGTTCCAGGGC AGAGTTACGATGACTCGAGATACTAG CATTAATACGGCCTACATGGAGCTTA GCCGCCTGCGGTCCGATGACACGGC CGTTTATTATTGCGCCGTACACAATGC GCACTACGGGACATGGTTCGCGTATT GGGGTCAAGGAACGCTCGTTACTGTC TCAAGTAGTGCTGCTGCCTTTGTCCC GGTATTTCTCCCAGCCAAACCGACCA CGACTCCCGCCCCGCGCCCTCCGAC ACCCGCTCCCACCATCGCCTCTCAAC CTCTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGC CGACCCGCCGCCGGGGGTGCTGTTC ATACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGT GATATTTACATTTGGGCTCCGTTGGC GGGTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGT CACTCGTTATTACTTTGTATTGTAATC ACAGGAATCGCTCAAAGCGGAGTAGG TTGTTGCATTCCGATTACATGAATATG ACTCCTCGCCGGCCTGGGCCGACAA GAAAACATTACCAACCCTATGCCCCC CCACGAGACTTCGCTGCGTACAGGTC CCGAGTGAAGTTTTCCCGAAGCGCAG ACGCTCCGGCATATCAGCAAGGACAG AATCAGCTGTATAACGAACTGAATTTG GGACGCCGCGAGGAGTATGACGTGC TTGATAAACGCCGGGGGAGAGACCC

Nome Sequência SEQ ID NO:

GGAAATGGGGGGTAAACCCCGAAGA AAGAATCCCCAAGAAGGACTCTACAA TGAACTCCAGAAGGATAAGATGGCGG AGGCCTACTCAGAAATAGGTATGAAG GGCGAACGACGACGGGGAAAAGGTC ACGATGGCCTCTACCAAGGGTTGAGT ACGGCAACCAAAGATACGTACGATGC ACTGCATATGCAGGCCCTGCCTCCCA

GATAAT CAR de MALPVTALLLPLALLLHAARPDVVMTQS 50 CTX-971 PLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLHSSGN CD28 coes- TYLEWYQQRPGQSPRPLIYKISTRFSG tim VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVG

VYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIKGGG GSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKK PGASVKVSCKASGLTIEDYYMHWVRQA PGQGLEWMGWIDPENGDTEYGPKFQ GRVTMTRDTSINTAYMELSRLRSDDTA VYYCAVHNAHYGTWFAYWGQGTLVTV SSSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPA PTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRG LDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY CNHRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPG PTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRS ADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYD VLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLY NELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKG

HDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CAR de CCACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCA 51 CTX-971b CTGCTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCT 41BB coes- CCACGCAGCAAGGCCGGACGTGGTC tim ATGACTCAAAGCCCACTTTCCTTGCC

CGTGACTCTCGGACAACCGGCTTCAA TATCTTGCCGCTCATCACAGTCCCTG CTGCATAGCAGTGGTAACACTTATCTT GAGTGGTACCAACAGCGGCCCGGCC

Nome Sequência SEQ ID NO:

AATCTCCTAGGCCCCTGATATATAAGA TAAGTACTCGCTTTTCCGGGGTCCCG GACCGGTTCAGCGGGTCTGGGAGTG GTACAGACTTCACATTGAAGATTTCAC GAGTAGAAGCCGAAGACGTGGGTGTT TATTACTGCTTCCAAGGATCTCACGTG CCATATACGTTTGGTGGGGGCACAAA AGTCGAGATTAAGGGAGGCGGAGGA TCAGGAGGTGGGGGAAGTGGAGGTG GTGGGTCACAAGTACAGCTCGTGCAA TCAGGGGCGGAGGTGAAGAAACCAG GGGCGTCTGTGAAGGTAAGCTGTAAG GCATCCGGATTGACAATCGAGGATTA TTACATGCATTGGGTCCGCCAGGCAC CAGGGCAGGGATTGGAGTGGATGGG GTGGATAGATCCTGAAAATGGGGATA CAGAGTATGGCCCTAAGTTCCAGGGC AGAGTTACGATGACTCGAGATACTAG CATTAATACGGCCTACATGGAGCTTA GCCGCCTGCGGTCCGATGACACGGC CGTTTATTATTGCGCCGTACACAATGC GCACTACGGGACATGGTTCGCGTATT GGGGTCAAGGAACGCTCGTTACTGTC TCAAGTAGTGCTGCTGCCTTTGTCCC GGTATTTCTCCCAGCCAAACCGACCA CGACTCCCGCCCCGCGCCCTCCGAC ACCCGCTCCCACCATCGCCTCTCAAC CTCTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGC CGACCCGCCGCCGGGGGTGCTGTTC ATACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGT GATATTTACATTTGGGCTCCGTTGGC GGGTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGT CACTCGTTATTACTTTGTATTGTAATC ACAGGAATCGCAAACGGGGCAGAAA GAAACTCCTGTATATATTCAAACAACC ATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCA AGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGAT

Nome Sequência SEQ ID NO:

TTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGT GAACTGCGAGTGAAGTTTTCCCGAAG CGCAGACGCTCCGGCATATCAGCAAG GACAGAATCAGCTGTATAACGAACTG AATTTGGGACGCCGCGAGGAGTATGA CGTGCTTGATAAACGCCGGGGGAGA GACCCGGAAATGGGGGGTAAACCCC GAAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTC TACAATGAACTCCAGAAGGATAAGAT GGCGGAGGCCTACTCAGAAATAGGTA TGAAGGGCGAACGACGACGGGGAAA AGGTCACGATGGCCTCTACCAAGGGT TGAGTACGGCAACCAAAGATACGTAC GATGCACTGCATATGCAGGCCCTGCC

TCCCAGATAAT CAR de MALPVTALLLPLALLLHAARPDVVMTQS 52 CTX-971b PLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLHSSGN 41BB coes- TYLEWYQQRPGQSPRPLIYKISTRFSG tim VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVG

VYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIKGGG GSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKK PGASVKVSCKASGLTIEDYYMHWVRQA PGQGLEWMGWIDPENGDTEYGPKFQ GRVTMTRDTSINTAYMELSRLRSDDTA VYYCAVHNAHYGTWFAYWGQGTLVTV SSSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPA PTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRG LDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY CNHRNRKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQT TQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFS RSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREE YDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEG LYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGK GHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP

R CTX-971 e GACGTGGTCATGACTCAAAGCCCACT 53

Nome Sequência SEQ ID NO: CTX-971b TTCCTTGCCCGTGACTCTCGGACAAC scFv CGGCTTCAATATCTTGCCGCTCATCA

CAGTCCCTGCTGCATAGCAGTGGTAA CACTTATCTTGAGTGGTACCAACAGC GGCCCGGCCAATCTCCTAGGCCCCT GATATATAAGATAAGTACTCGCTTTTC CGGGGTCCCGGACCGGTTCAGCGGG TCTGGGAGTGGTACAGACTTCACATT GAAGATTTCACGAGTAGAAGCCGAAG ACGTGGGTGTTTATTACTGCTTCCAA GGATCTCACGTGCCATATACGTTTGG TGGGGGCACAAAAGTCGAGATTAAGG GAGGCGGAGGATCAGGAGGTGGGGG AAGTGGAGGTGGTGGGTCACAAGTAC AGCTCGTGCAATCAGGGGCGGAGGT GAAGAAACCAGGGGCGTCTGTGAAG GTAAGCTGTAAGGCATCCGGATTGAC AATCGAGGATTATTACATGCATTGGGT CCGCCAGGCACCAGGGCAGGGATTG GAGTGGATGGGGTGGATAGATCCTGA AAATGGGGATACAGAGTATGGCCCTA AGTTCCAGGGCAGAGTTACGATGACT CGAGATACTAGCATTAATACGGCCTA CATGGAGCTTAGCCGCCTGCGGTCC GATGACACGGCCGTTTATTATTGCGC CGTACACAATGCGCACTACGGGACAT GGTTCGCGTATTGGGGTCAAGGAACG

CTCGTTACTGTCTCAAGT CTX-971 e DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQ 54 CTX-971b SLLHSSGNTYLEWYQQRPGQSPRPLIY scFv KISTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISR (ligante VEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTK sublinhado) VEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQ

SGAEVKKPGASVKVSCKASGLTIEDYY MHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDT EYGPKFQGRVTMTRDTSINTAYMELSR

Nome Sequência SEQ ID NO:

LRSDDTAVYYCAVHNAHYGTWFAYWG

QGTLVTVSS CTX-971 e QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG 55 CTX-971b LTIEDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWID VH de scFv PENGDTEYGPKFQGRVTMTRDTSINTA CDRs- em YMELSRLRSDDTAVYYCAVHNAHYGT negrito WFAYWGQGTLVTVSS CTX-971 e DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQ 56 CTX-971b SLLHSSGNTYLEWYQQRPGQSPRPLIY VL de scFv KISTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISR CDRs- em VEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTK negrito VEIK CTX-971 e DYYMH 57 CTX-971b CDR1 de

VH CTX-971 e WIDPENGDTEYGPKFQG 58 CTX-971b CDR2 de

VH CTX-971 e HNAHYGTWFAY 59 CTX-971b CDR3 de

VH CTX-971 e RSSQSLLHSSGNTYLE 60 CTX-971b CDR1 de

VL CTX-971 e KISTRFS 61 CTX-971b CDR2 de

VL CTX-971 e FQGSHVPYT 62 CTX-971b

Nome Sequência SEQ ID NO: CDR3 de

VL Doador de GAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTG 63 CTX-971 CTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGG LHA para TAGTGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGT

RHA TCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATC AATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAATG TGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAAC ATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAAT GCCCAGCCTAAGTTGGGGAGACCACT CCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTT TGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTGCC TTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGG GGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAA AAGAATAAGCAGTATTATTAAGTAGCC CTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGC AGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGTTC ACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAG ATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAG TCCCAGTCCATCACGAGCAGCTGGTT TCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGC ATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCAC AGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGG CATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGG GCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCC TAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGAT ATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTA CCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTG ACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATT TTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAA GTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAG

ACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCT ATGGACTTCAggctccggtgcccgtcagtgggc agagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggg gggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaag gtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtact

Nome Sequência SEQ ID NO: ggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtat ataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacg ggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggtt cccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgt gccttgaattacttccactggctgcagtacgtgattcttga tcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcga ggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagt tgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcg aatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgata agtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacg ctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaag atctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcgg cgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcg aggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcgg acgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgc ctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcg gcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcg gaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagct caaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcg ggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgt cctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgg gcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttgg agtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcga tggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagtt aggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgc cctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagac agtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaCC

ACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCACT GCTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCTCC ACGCAGCAAGGCCGGACGTGGTCAT GACTCAAAGCCCACTTTCCTTGCCCG TGACTCTCGGACAACCGGCTTCAATA TCTTGCCGCTCATCACAGTCCCTGCT GCATAGCAGTGGTAACACTTATCTTG AGTGGTACCAACAGCGGCCCGGCCA ATCTCCTAGGCCCCTGATATATAAGAT AAGTACTCGCTTTTCCGGGGTCCCGG

Nome Sequência SEQ ID NO:

ACCGGTTCAGCGGGTCTGGGAGTGG TACAGACTTCACATTGAAGATTTCACG AGTAGAAGCCGAAGACGTGGGTGTTT ATTACTGCTTCCAAGGATCTCACGTG CCATATACGTTTGGTGGGGGCACAAA AGTCGAGATTAAGGGAGGCGGAGGA TCAGGAGGTGGGGGAAGTGGAGGTG GTGGGTCACAAGTACAGCTCGTGCAA TCAGGGGCGGAGGTGAAGAAACCAG GGGCGTCTGTGAAGGTAAGCTGTAAG GCATCCGGATTGACAATCGAGGATTA TTACATGCATTGGGTCCGCCAGGCAC CAGGGCAGGGATTGGAGTGGATGGG GTGGATAGATCCTGAAAATGGGGATA CAGAGTATGGCCCTAAGTTCCAGGGC AGAGTTACGATGACTCGAGATACTAG CATTAATACGGCCTACATGGAGCTTA GCCGCCTGCGGTCCGATGACACGGC CGTTTATTATTGCGCCGTACACAATGC GCACTACGGGACATGGTTCGCGTATT GGGGTCAAGGAACGCTCGTTACTGTC TCAAGTAGTGCTGCTGCCTTTGTCCC GGTATTTCTCCCAGCCAAACCGACCA CGACTCCCGCCCCGCGCCCTCCGAC ACCCGCTCCCACCATCGCCTCTCAAC CTCTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGC CGACCCGCCGCCGGGGGTGCTGTTC ATACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGT GATATTTACATTTGGGCTCCGTTGGC GGGTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGT CACTCGTTATTACTTTGTATTGTAATC ACAGGAATCGCTCAAAGCGGAGTAGG TTGTTGCATTCCGATTACATGAATATG ACTCCTCGCCGGCCTGGGCCGACAA GAAAACATTACCAACCCTATGCCCCC CCACGAGACTTCGCTGCGTACAGGTC CCGAGTGAAGTTTTCCCGAAGCGCAG

Nome Sequência SEQ ID NO:

ACGCTCCGGCATATCAGCAAGGACAG AATCAGCTGTATAACGAACTGAATTTG GGACGCCGCGAGGAGTATGACGTGC TTGATAAACGCCGGGGGAGAGACCC GGAAATGGGGGGTAAACCCCGAAGA AAGAATCCCCAAGAAGGACTCTACAA TGAACTCCAGAAGGATAAGATGGCGG AGGCCTACTCAGAAATAGGTATGAAG GGCGAACGACGACGGGGAAAAGGTC ACGATGGCCTCTACCAAGGGTTGAGT ACGGCAACCAAAGATACGTACGATGC ACTGCATATGCAGGCCCTGCCTCCCA GATAATAATAAAATCGCTATCCATCGA AGATGGATGTGTGTTGGTTTTTTGTGT GTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCAT GTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATT ATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAG CCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGCCT TCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTCAGGA ATGGCCAGGTTCTGCCCAGAGCTCTG GTCAATGATGTCTAAAACTCCTCTGAT TGGTGGTCTCGGCCTTATCCATTGCC ACCAAAACCCTCTTTTTACTAAGAAAC AGTGAGCCTTGTTCTGGCAGTCCAGA GAATGACACGGGAAAAAAGCAGATGA AGAGAAGGTGGCAGGAGAGGGCACG TGGCCCAGCCTCAGTCTCTCCAACTG AGTTCCTGCCTGCCTGCCTTTGCTCA GACTGTTTGCCCCTTACTGCTCTTCTA GGCCTCATTCTAAGCCCCTTCTCCAA GTTGCCTCTCCTTATTTCTCCCTGTCT GCCAAAAAATCTTTCCCAGCTCACTAA GTCAGTCTCACGCAGTCACTCATTAA CCCACCAATCACTGATTGTGCCGGCA CATGAATGCACCAGGTGTTGAAGTGG AGGAATTAAAAAGTCAGATGAGGGGT GTGCCCAGAGGAAGCACCATTCTAGT

Nome Sequência SEQ ID NO:

TGGGGGAGCCCATCTGTCAGCTGGG AAAAGTCCAAATAACTTCAGATTGGAA TGTGTTTTAACTCAGGGTTGAGAAAAC AGCTACCTTCAGGACAAAAGTCAGGG AAGGGCTCTCTGAAGAAATGCTACTT GAAGATACCAGCCCTACCAAGGGCAG GGAGAGGACCCTATAGAGGCCTGGG

ACAGGAGCTCAATGAGAAAGG CTX-971b GAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTG 64 Dador CTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGG LHA para TAGTGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGT

RHA TCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATC AATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAATG TGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAAC ATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAAT GCCCAGCCTAAGTTGGGGAGACCACT CCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTT TGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTGCC TTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGG GGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAA AAGAATAAGCAGTATTATTAAGTAGCC CTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGC AGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGTTC ACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAG ATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAG TCCCAGTCCATCACGAGCAGCTGGTT TCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGC ATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCAC AGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGG CATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGG GCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCC TAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGAT ATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTA CCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTG ACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATT TTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAA

Nome Sequência SEQ ID NO:

GTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAG

ACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCT ATGGACTTCAggctccggtgcccgtcagtgggc agagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggg gggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaag gtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtact ggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtat ataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacg ggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggtt cccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgt gccttgaattacttccactggctgcagtacgtgattcttga tcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcga ggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagt tgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcg aatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgata agtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacg ctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaag atctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcgg cgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcg aggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcgg acgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgc ctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcg gcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcg gaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagct caaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcg ggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgt cctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgg gcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttgg agtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcga tggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagtt aggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgc cctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagac agtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaCC

ACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCACT GCTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCTCC ACGCAGCAAGGCCGGACGTGGTCAT GACTCAAAGCCCACTTTCCTTGCCCG

Nome Sequência SEQ ID NO:

TGACTCTCGGACAACCGGCTTCAATA TCTTGCCGCTCATCACAGTCCCTGCT GCATAGCAGTGGTAACACTTATCTTG AGTGGTACCAACAGCGGCCCGGCCA ATCTCCTAGGCCCCTGATATATAAGAT AAGTACTCGCTTTTCCGGGGTCCCGG ACCGGTTCAGCGGGTCTGGGAGTGG TACAGACTTCACATTGAAGATTTCACG AGTAGAAGCCGAAGACGTGGGTGTTT ATTACTGCTTCCAAGGATCTCACGTG CCATATACGTTTGGTGGGGGCACAAA AGTCGAGATTAAGGGAGGCGGAGGA TCAGGAGGTGGGGGAAGTGGAGGTG GTGGGTCACAAGTACAGCTCGTGCAA TCAGGGGCGGAGGTGAAGAAACCAG GGGCGTCTGTGAAGGTAAGCTGTAAG GCATCCGGATTGACAATCGAGGATTA TTACATGCATTGGGTCCGCCAGGCAC CAGGGCAGGGATTGGAGTGGATGGG GTGGATAGATCCTGAAAATGGGGATA CAGAGTATGGCCCTAAGTTCCAGGGC AGAGTTACGATGACTCGAGATACTAG CATTAATACGGCCTACATGGAGCTTA GCCGCCTGCGGTCCGATGACACGGC CGTTTATTATTGCGCCGTACACAATGC GCACTACGGGACATGGTTCGCGTATT GGGGTCAAGGAACGCTCGTTACTGTC TCAAGTAGTGCTGCTGCCTTTGTCCC GGTATTTCTCCCAGCCAAACCGACCA CGACTCCCGCCCCGCGCCCTCCGAC ACCCGCTCCCACCATCGCCTCTCAAC CTCTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGC CGACCCGCCGCCGGGGGTGCTGTTC ATACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGT GATATTTACATTTGGGCTCCGTTGGC GGGTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGT CACTCGTTATTACTTTGTATTGTAATC

Nome Sequência SEQ ID NO:

ACAGGAATCGCAAACGGGGCAGAAA GAAACTCCTGTATATATTCAAACAACC ATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCA AGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGAT TTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGT GAACTGCGAGTGAAGTTTTCCCGAAG CGCAGACGCTCCGGCATATCAGCAAG GACAGAATCAGCTGTATAACGAACTG AATTTGGGACGCCGCGAGGAGTATGA CGTGCTTGATAAACGCCGGGGGAGA GACCCGGAAATGGGGGGTAAACCCC GAAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTC TACAATGAACTCCAGAAGGATAAGAT GGCGGAGGCCTACTCAGAAATAGGTA TGAAGGGCGAACGACGACGGGGAAA AGGTCACGATGGCCTCTACCAAGGGT TGAGTACGGCAACCAAAGATACGTAC GATGCACTGCATATGCAGGCCCTGCC TCCCAGATAATAATAAAATCGCTATCC ATCGAAGATGGATGTGTGTTGGTTTTT TGTGTGTGGAGCAACAAATCTGACTT TGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACA GCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCC CCAGCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGT GCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTC AGGAATGGCCAGGTTCTGCCCAGAG CTCTGGTCAATGATGTCTAAAACTCCT CTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCA TTGCCACCAAAACCCTCTTTTTACTAA GAAACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGT CCAGAGAATGACACGGGAAAAAAGCA GATGAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGG GCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCC AACTGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTT GCTCAGACTGTTTGCCCCTTACTGCT CTTCTAGGCCTCATTCTAAGCCCCTTC TCCAAGTTGCCTCTCCTTATTTCTCCC

Nome Sequência SEQ ID NO:

TGTCTGCCAAAAAATCTTTCCCAGCTC ACTAAGTCAGTCTCACGCAGTCACTC ATTAACCCACCAATCACTGATTGTGCC GGCACATGAATGCACCAGGTGTTGAA GTGGAGGAATTAAAAAGTCAGATGAG GGGTGTGCCCAGAGGAAGCACCATT CTAGTTGGGGGAGCCCATCTGTCAGC TGGGAAAAGTCCAAATAACTTCAGATT GGAATGTGTTTTAACTCAGGGTTGAG AAAACAGCTACCTTCAGGACAAAAGT CAGGGAAGGGCTCTCTGAAGAAATGC TACTTGAAGATACCAGCCCTACCAAG GGCAGGGAGAGGACCCTATAGAGGC CTGGGACAGGAGCTCAATGAGAAAG

G CAR de CCACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCA 65 CTX-972 CTGCTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCT CD28 coes- CCACGCAGCAAGGCCGCAAGTTCAAC tim TGGTCCAGTCAGGCGCTGAGGTCAAA

AAGCCCGGCGCGAGCGTAAAAGTCT CCTGCAAGGCGTCAGGGTTGACGATA GAAGATTATTACATGCATTGGGTCAG ACAGGCACCCGGACAGGGATTGGAG TGGATGGGTTGGATCGACCCGGAAAA CGGTGACACGGAGTATGGGCCGAAG TTTCAGGGGAGGGTCACAATGACACG AGATACGTCCATAAATACCGCTTACAT GGAACTTTCTCGGCTTCGCTCTGATG ATACAGCAGTTTACTACTGCGCTGTTC ATAATGCCCATTACGGAACCTGGTTC GCGTACTGGGGCCAAGGGACCCTGG TTACGGTTAGCTCTGGTGGGGGTGGA AGCGGGGGAGGGGGTAGCGGAGGT GGCGGAAGTGATGTTGTTATGACACA GAGTCCCCTGTCATTGCCCGTCACCC TCGGACAACCAGCTAGCATTTCATGC

Nome Sequência SEQ ID NO:

AGGTCTAGTCAAAGCCTCCTTCACAG TAGCGGCAACACCTACCTCGAATGGT ATCAACAACGGCCAGGGCAATCTCCT CGCCCACTCATATACAAAATCTCTACA CGCTTCTCAGGTGTTCCCGACCGCTT CAGCGGTTCCGGCTCTGGGACAGAC TTTACCTTGAAAATAAGCAGGGTTGAA GCTGAGGACGTAGGGGTATATTATTG TTTTCAGGGCAGTCACGTGCCGTACA CTGGGGGCGGAACCAAAGTCGAGAT AAAGAGTGCTGCTGCCTTTGTCCCGG TATTTCTCCCAGCCAAACCGACCACG ACTCCCGCCCCGCGCCCTCCGACAC CCGCTCCCACCATCGCCTCTCAACCT CTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGCCG ACCCGCCGCCGGGGGTGCTGTTCAT ACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTGA TATTTACATTTGGGCTCCGTTGGCGG GTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTCA CTCGTTATTACTTTGTATTGTAATCAC AGGAATCGCTCAAAGCGGAGTAGGTT GTTGCATTCCGATTACATGAATATGAC TCCTCGCCGGCCTGGGCCGACAAGA AAACATTACCAACCCTATGCCCCCCC ACGAGACTTCGCTGCGTACAGGTCCC GAGTGAAGTTTTCCCGAAGCGCAGAC GCTCCGGCATATCAGCAAGGACAGAA TCAGCTGTATAACGAACTGAATTTGG GACGCCGCGAGGAGTATGACGTGCT TGATAAACGCCGGGGGAGAGACCCG GAAATGGGGGGTAAACCCCGAAGAAA GAATCCCCAAGAAGGACTCTACAATG AACTCCAGAAGGATAAGATGGCGGAG GCCTACTCAGAAATAGGTATGAAGGG CGAACGACGACGGGGAAAAGGTCAC GATGGCCTCTACCAAGGGTTGAGTAC GGCAACCAAAGATACGTACGATGCAC

Nome Sequência SEQ ID NO:

TGCATATGCAGGCCCTGCCTCCCAGA

TAAT CAR de MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQS 125 CTX-972 GAEVKKPGASVKVSCKASGLTIEDYYM CD28 coes- HWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTE tim YGPKFQGRVTMTRDTSINTAYMELSRL

RSDDTAVYYCAVHNAHYGTWFAYWGQ GTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDV VMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLL HSSGNTYLEWYQQRPGQSPRPLIYKIS TRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCFQGSHVPYTGGGTKVEIK SAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPT IASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLD FACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCN HRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPT RKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSAD APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVL DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNE LQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHD

GLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CAR de CCACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCA 67 CTX-972b CTGCTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCT 41BB coes- CCACGCAGCAAGGCCGCAAGTTCAAC tim TGGTCCAGTCAGGCGCTGAGGTCAAA

AAGCCCGGCGCGAGCGTAAAAGTCT CCTGCAAGGCGTCAGGGTTGACGATA GAAGATTATTACATGCATTGGGTCAG ACAGGCACCCGGACAGGGATTGGAG TGGATGGGTTGGATCGACCCGGAAAA CGGTGACACGGAGTATGGGCCGAAG TTTCAGGGGAGGGTCACAATGACACG AGATACGTCCATAAATACCGCTTACAT GGAACTTTCTCGGCTTCGCTCTGATG ATACAGCAGTTTACTACTGCGCTGTTC ATAATGCCCATTACGGAACCTGGTTC

Nome Sequência SEQ ID NO:

GCGTACTGGGGCCAAGGGACCCTGG TTACGGTTAGCTCTGGTGGGGGTGGA AGCGGGGGAGGGGGTAGCGGAGGT GGCGGAAGTGATGTTGTTATGACACA GAGTCCCCTGTCATTGCCCGTCACCC TCGGACAACCAGCTAGCATTTCATGC AGGTCTAGTCAAAGCCTCCTTCACAG TAGCGGCAACACCTACCTCGAATGGT ATCAACAACGGCCAGGGCAATCTCCT CGCCCACTCATATACAAAATCTCTACA CGCTTCTCAGGTGTTCCCGACCGCTT CAGCGGTTCCGGCTCTGGGACAGAC TTTACCTTGAAAATAAGCAGGGTTGAA GCTGAGGACGTAGGGGTATATTATTG TTTTCAGGGCAGTCACGTGCCGTACA CTGGGGGCGGAACCAAAGTCGAGAT AAAGAGTGCTGCTGCCTTTGTCCCGG TATTTCTCCCAGCCAAACCGACCACG ACTCCCGCCCCGCGCCCTCCGACAC CCGCTCCCACCATCGCCTCTCAACCT CTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGCCG ACCCGCCGCCGGGGGTGCTGTTCAT ACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTGA TATTTACATTTGGGCTCCGTTGGCGG GTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTCA CTCGTTATTACTTTGTATTGTAATCAC AGGAATCGCAAACGGGGCAGAAAGA AACTCCTGTATATATTCAAACAACCAT TTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAG AGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTT CCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGA ACTGCGAGTGAAGTTTTCCCGAAGCG CAGACGCTCCGGCATATCAGCAAGGA CAGAATCAGCTGTATAACGAACTGAA TTTGGGACGCCGCGAGGAGTATGAC GTGCTTGATAAACGCCGGGGGAGAG ACCCGGAAATGGGGGGTAAACCCCG

Nome Sequência SEQ ID NO:

AAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTCT ACAATGAACTCCAGAAGGATAAGATG GCGGAGGCCTACTCAGAAATAGGTAT GAAGGGCGAACGACGACGGGGAAAA GGTCACGATGGCCTCTACCAAGGGTT GAGTACGGCAACCAAAGATACGTACG ATGCACTGCATATGCAGGCCCTGCCT

CCCAGATAAT CAR de MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQS 126 CTX-972b GAEVKKPGASVKVSCKASGLTIEDYYM 41BB coes- HWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTE tim YGPKFQGRVTMTRDTSINTAYMELSRL

RSDDTAVYYCAVHNAHYGTWFAYWGQ GTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDV VMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLL HSSGNTYLEWYQQRPGQSPRPLIYKIS TRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCFQGSHVPYTGGGTKVEIK SAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPT IASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLD FACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCN HRNRKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQ EEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRS ADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYD VLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLY NELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKG

HDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CTX-972 e CAAGTTCAACTGGTCCAGTCAGGCGC 69 CTX-972b TGAGGTCAAAAAGCCCGGCGCGAGC scFv GTAAAAGTCTCCTGCAAGGCGTCAGG

GTTGACGATAGAAGATTATTACATGCA TTGGGTCAGACAGGCACCCGGACAG GGATTGGAGTGGATGGGTTGGATCGA CCCGGAAAACGGTGACACGGAGTAT GGGCCGAAGTTTCAGGGGAGGGTCA CAATGACACGAGATACGTCCATAAAT

Nome Sequência SEQ ID NO:

ACCGCTTACATGGAACTTTCTCGGCT TCGCTCTGATGATACAGCAGTTTACTA CTGCGCTGTTCATAATGCCCATTACG GAACCTGGTTCGCGTACTGGGGCCAA GGGACCCTGGTTACGGTTAGCTCTGG TGGGGGTGGAAGCGGGGGAGGGGG TAGCGGAGGTGGCGGAAGTGATGTT GTTATGACACAGAGTCCCCTGTCATT GCCCGTCACCCTCGGACAACCAGCTA GCATTTCATGCAGGTCTAGTCAAAGC CTCCTTCACAGTAGCGGCAACACCTA CCTCGAATGGTATCAACAACGGCCAG GGCAATCTCCTCGCCCACTCATATAC AAAATCTCTACACGCTTCTCAGGTGTT CCCGACCGCTTCAGCGGTTCCGGCT CTGGGACAGACTTTACCTTGAAAATAA GCAGGGTTGAAGCTGAGGACGTAGG GGTATATTATTGTTTTCAGGGCAGTCA CGTGCCGTACACTGGGGGCGGAACC

AAAGTCGAGATAAAG CTX-972 e QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG 127 CTX-972b LTIEDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWID scFv PENGDTEYGPKFQGRVTMTRDTSINTA (ligante YMELSRLRSDDTAVYYCAVHNAHYGT sublinhado) WFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS

GGGGSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASIS CRSSQSLLHSSGNTYLEWYQQRPGQS PRPLIYKISTRFSGVPDRFSGSGSGTDF TLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTG

GGTKVEIK CTX-972 e QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG 55 CTX-972b LTIEDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWID scFv VH PENGDTEYGPKFQGRVTMTRDTSINTA CDRs- em YMELSRLRSDDTAVYYCAVHNAHYGT negrito WFAYWGQGTLVTVSS CTX-972 e DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQ 128

Nome Sequência SEQ ID NO: CTX-972b SLLHSSGNTYLEWYQQRPGQSPRPLIY scFv VL KISTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISR CDRs- em VEAEDVGVYYCFQGSHVPYTGGGTKV negrito EIK CTX-972 e DYYMH 57 CTX-972b CDR1 de

VH CTX-972 e WIDPENGDTEYGPKFQG 58 CTX-972b CDR2 de

VH CTX-972 e HNAHYGTWFAY 59 CTX-972b CDR3 de

VH CTX-972 e RSSQSLLHSSGNTYLE 60 CTX-972b CDR1 de

VL CTX-972 e KISTRFS 61 CTX-972b CDR2 de

VL CTX-972 e FQGSHVPYT 62 CTX-972b CDR3 de

VL Doador de GAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTG 71 CTX-972 CTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGG LHA para TAGTGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGT

RHA TCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATC AATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAATG TGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAAC ATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAAT

Nome Sequência SEQ ID NO:

GCCCAGCCTAAGTTGGGGAGACCACT CCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTT TGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTGCC TTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGG GGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAA AAGAATAAGCAGTATTATTAAGTAGCC CTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGC AGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGTTC ACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAG ATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAG TCCCAGTCCATCACGAGCAGCTGGTT TCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGC ATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCAC AGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGG CATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGG GCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCC TAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGAT ATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTA CCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTG ACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATT TTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAA GTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAG

ACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCT ATGGACTTCAggctccggtgcccgtcagtgggc agagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggg gggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaag gtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtact ggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtat ataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacg ggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggtt cccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgt gccttgaattacttccactggctgcagtacgtgattcttga tcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcga ggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagt tgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcg aatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgata agtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacg

Nome Sequência SEQ ID NO: ctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaag atctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcgg cgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcg aggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcgg acgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgc ctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcg gcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcg gaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagct caaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcg ggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgt cctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgg gcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttgg agtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcga tggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagtt aggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgc cctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagac agtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaCC

ACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCACT GCTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCTCC ACGCAGCAAGGCCGCAAGTTCAACTG GTCCAGTCAGGCGCTGAGGTCAAAAA GCCCGGCGCGAGCGTAAAAGTCTCC TGCAAGGCGTCAGGGTTGACGATAGA AGATTATTACATGCATTGGGTCAGACA GGCACCCGGACAGGGATTGGAGTGG ATGGGTTGGATCGACCCGGAAAACG GTGACACGGAGTATGGGCCGAAGTTT CAGGGGAGGGTCACAATGACACGAG ATACGTCCATAAATACCGCTTACATGG AACTTTCTCGGCTTCGCTCTGATGATA CAGCAGTTTACTACTGCGCTGTTCATA ATGCCCATTACGGAACCTGGTTCGCG TACTGGGGCCAAGGGACCCTGGTTAC GGTTAGCTCTGGTGGGGGTGGAAGC GGGGGAGGGGGTAGCGGAGGTGGC GGAAGTGATGTTGTTATGACACAGAG TCCCCTGTCATTGCCCGTCACCCTCG

Nome Sequência SEQ ID NO:

GACAACCAGCTAGCATTTCATGCAGG TCTAGTCAAAGCCTCCTTCACAGTAG CGGCAACACCTACCTCGAATGGTATC AACAACGGCCAGGGCAATCTCCTCGC CCACTCATATACAAAATCTCTACACGC TTCTCAGGTGTTCCCGACCGCTTCAG CGGTTCCGGCTCTGGGACAGACTTTA CCTTGAAAATAAGCAGGGTTGAAGCT GAGGACGTAGGGGTATATTATTGTTTT CAGGGCAGTCACGTGCCGTACACTG GGGGCGGAACCAAAGTCGAGATAAA GAGTGCTGCTGCCTTTGTCCCGGTAT TTCTCCCAGCCAAACCGACCACGACT CCCGCCCCGCGCCCTCCGACACCCG CTCCCACCATCGCCTCTCAACCTCTT AGTCTTCGCCCCGAGGCATGCCGAC CCGCCGCCGGGGGTGCTGTTCATAC GAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTGATA TTTACATTTGGGCTCCGTTGGCGGGT ACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTCACT CGTTATTACTTTGTATTGTAATCACAG GAATCGCTCAAAGCGGAGTAGGTTGT TGCATTCCGATTACATGAATATGACTC CTCGCCGGCCTGGGCCGACAAGAAA ACATTACCAACCCTATGCCCCCCCAC GAGACTTCGCTGCGTACAGGTCCCGA GTGAAGTTTTCCCGAAGCGCAGACGC TCCGGCATATCAGCAAGGACAGAATC AGCTGTATAACGAACTGAATTTGGGA CGCCGCGAGGAGTATGACGTGCTTG ATAAACGCCGGGGGAGAGACCCGGA AATGGGGGGTAAACCCCGAAGAAAGA ATCCCCAAGAAGGACTCTACAATGAA CTCCAGAAGGATAAGATGGCGGAGG CCTACTCAGAAATAGGTATGAAGGGC GAACGACGACGGGGAAAAGGTCACG ATGGCCTCTACCAAGGGTTGAGTACG

Nome Sequência SEQ ID NO:

GCAACCAAAGATACGTACGATGCACT GCATATGCAGGCCCTGCCTCCCAGAT AATAATAAAATCGCTATCCATCGAAGA TGGATGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGTG GAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTG CAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTC CAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCA GGTAAGGGCAGCTTTGGTGCCTTCGC AGGCTGTTTCCTTGCTTCAGGAATGG CCAGGTTCTGCCCAGAGCTCTGGTCA ATGATGTCTAAAACTCCTCTGATTGGT GGTCTCGGCCTTATCCATTGCCACCA AAACCCTCTTTTTACTAAGAAACAGTG AGCCTTGTTCTGGCAGTCCAGAGAAT GACACGGGAAAAAAGCAGATGAAGAG AAGGTGGCAGGAGAGGGCACGTGGC CCAGCCTCAGTCTCTCCAACTGAGTT CCTGCCTGCCTGCCTTTGCTCAGACT GTTTGCCCCTTACTGCTCTTCTAGGC CTCATTCTAAGCCCCTTCTCCAAGTTG CCTCTCCTTATTTCTCCCTGTCTGCCA AAAAATCTTTCCCAGCTCACTAAGTCA GTCTCACGCAGTCACTCATTAACCCA CCAATCACTGATTGTGCCGGCACATG AATGCACCAGGTGTTGAAGTGGAGGA ATTAAAAAGTCAGATGAGGGGTGTGC CCAGAGGAAGCACCATTCTAGTTGGG GGAGCCCATCTGTCAGCTGGGAAAAG TCCAAATAACTTCAGATTGGAATGTGT TTTAACTCAGGGTTGAGAAAACAGCT ACCTTCAGGACAAAAGTCAGGGAAGG GCTCTCTGAAGAAATGCTACTTGAAG ATACCAGCCCTACCAAGGGCAGGGA GAGGACCCTATAGAGGCCTGGGACA

GGAGCTCAATGAGAAAGG CTX-972b GAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTG 72

Nome Sequência SEQ ID NO: Dador CTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGG LHA para TAGTGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGT

ACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCT ATGGACTTCAggctccggtgcccgtcagtgggc agagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggg gggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaag gtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtact ggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtat ataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacg ggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggtt cccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgt

Nome Sequência SEQ ID NO: gccttgaattacttccactggctgcagtacgtgattcttga tcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcga ggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagt tgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcg aatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgata agtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacg ctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaag atctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcgg cgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcg aggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcgg acgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgc ctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcg gcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcg gaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagct caaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcg ggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgt cctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgg gcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttgg agtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcga tggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagtt aggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgc cctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagac agtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaCC

ACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCACT GCTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCTCC ACGCAGCAAGGCCGCAAGTTCAACTG GTCCAGTCAGGCGCTGAGGTCAAAAA GCCCGGCGCGAGCGTAAAAGTCTCC TGCAAGGCGTCAGGGTTGACGATAGA AGATTATTACATGCATTGGGTCAGACA GGCACCCGGACAGGGATTGGAGTGG ATGGGTTGGATCGACCCGGAAAACG GTGACACGGAGTATGGGCCGAAGTTT CAGGGGAGGGTCACAATGACACGAG ATACGTCCATAAATACCGCTTACATGG AACTTTCTCGGCTTCGCTCTGATGATA CAGCAGTTTACTACTGCGCTGTTCATA

Nome Sequência SEQ ID NO:

ATGCCCATTACGGAACCTGGTTCGCG TACTGGGGCCAAGGGACCCTGGTTAC GGTTAGCTCTGGTGGGGGTGGAAGC GGGGGAGGGGGTAGCGGAGGTGGC GGAAGTGATGTTGTTATGACACAGAG TCCCCTGTCATTGCCCGTCACCCTCG GACAACCAGCTAGCATTTCATGCAGG TCTAGTCAAAGCCTCCTTCACAGTAG CGGCAACACCTACCTCGAATGGTATC AACAACGGCCAGGGCAATCTCCTCGC CCACTCATATACAAAATCTCTACACGC TTCTCAGGTGTTCCCGACCGCTTCAG CGGTTCCGGCTCTGGGACAGACTTTA CCTTGAAAATAAGCAGGGTTGAAGCT GAGGACGTAGGGGTATATTATTGTTTT CAGGGCAGTCACGTGCCGTACACTG GGGGCGGAACCAAAGTCGAGATAAA GAGTGCTGCTGCCTTTGTCCCGGTAT TTCTCCCAGCCAAACCGACCACGACT CCCGCCCCGCGCCCTCCGACACCCG CTCCCACCATCGCCTCTCAACCTCTT AGTCTTCGCCCCGAGGCATGCCGAC CCGCCGCCGGGGGTGCTGTTCATAC GAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTGATA TTTACATTTGGGCTCCGTTGGCGGGT ACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTCACT CGTTATTACTTTGTATTGTAATCACAG GAATCGCAAACGGGGCAGAAAGAAAC TCCTGTATATATTCAAACAACCATTTA TGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAG GAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCC AGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAAC TGCGAGTGAAGTTTTCCCGAAGCGCA GACGCTCCGGCATATCAGCAAGGACA GAATCAGCTGTATAACGAACTGAATTT GGGACGCCGCGAGGAGTATGACGTG CTTGATAAACGCCGGGGGAGAGACC

Nome Sequência SEQ ID NO:

CGGAAATGGGGGGTAAACCCCGAAG AAAGAATCCCCAAGAAGGACTCTACA ATGAACTCCAGAAGGATAAGATGGCG GAGGCCTACTCAGAAATAGGTATGAA GGGCGAACGACGACGGGGAAAAGGT CACGATGGCCTCTACCAAGGGTTGAG TACGGCAACCAAAGATACGTACGATG CACTGCATATGCAGGCCCTGCCTCCC AGATAATAATAAAATCGCTATCCATCG AAGATGGATGTGTGTTGGTTTTTTGTG TGTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCA TGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCAT TATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCA GCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGC CTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTCAG GAATGGCCAGGTTCTGCCCAGAGCTC TGGTCAATGATGTCTAAAACTCCTCTG ATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCATTG CCACCAAAACCCTCTTTTTACTAAGAA ACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGTCCA GAGAATGACACGGGAAAAAAGCAGAT GAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGGGCA CGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCCAAC TGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTTGCT CAGACTGTTTGCCCCTTACTGCTCTTC TAGGCCTCATTCTAAGCCCCTTCTCC AAGTTGCCTCTCCTTATTTCTCCCTGT CTGCCAAAAAATCTTTCCCAGCTCACT AAGTCAGTCTCACGCAGTCACTCATT AACCCACCAATCACTGATTGTGCCGG CACATGAATGCACCAGGTGTTGAAGT GGAGGAATTAAAAAGTCAGATGAGGG GTGTGCCCAGAGGAAGCACCATTCTA GTTGGGGGAGCCCATCTGTCAGCTG GGAAAAGTCCAAATAACTTCAGATTG GAATGTGTTTTAACTCAGGGTTGAGA AAACAGCTACCTTCAGGACAAAAGTC

Nome Sequência SEQ ID NO:

AGGGAAGGGCTCTCTGAAGAAATGCT ACTTGAAGATACCAGCCCTACCAAGG GCAGGGAGAGGACCCTATAGAGGCC

TGGGACAGGAGCTCAATGAGAAAGG peptídeo de MALPVTALLLPLALLLHAARP 73 sinal CD8 CD8a GCTGCTGCCTTTGTCCCGGTATTTCT 74 transmem- CCCAGCCAAACCGACCACGACTCCC branar + li- GCCCCGCGCCCTCCGACACCCGCTC gante de 5’ CCACCATCGCCTCTCAACCTCTTAGT (sublinha- CTTCGCCCCGAGGCATGCCGACCCG do) CCGCCGGGGGTGCTGTTCATACGAG

GGGCTTGGACTTCGCTTGTGATATTT ACATTTGGGCTCCGTTGGCGGGTACG TGCGGCGTCCTTTTGTTGTCACTCGT TATTACTTTGTATTGTAATCACAGGAA

TCGC CD8a SAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPT 75 transmem- IASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLD branar + li- FACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCN gante de 5’ HRNR (sublinha- do) CD8a TTTGTCCCGGTATTTCTCCCAGCCAAA 76 transmem- CCGACCACGACTCCCGCCCCGCGCC branar CTCCGACACCCGCTCCCACCATCGCC (sem ligan- TCTCAACCTCTTAGTCTTCGCCCCGA te) GGCATGCCGACCCGCCGCCGGGGGT

GCTGTTCATACGAGGGGCTTGGACTT CGCTTGTGATATTTACATTTGGGCTCC GTTGGCGGGTACGTGCGGCGTCCTTT TGTTGTCACTCGTTATTACTTTGTATT

GTAATCACAGGAATCGC CD8a FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQ 77 transmem- PLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD branar IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNR

Nome Sequência SEQ ID NO: (sem ligan- te) CD28 coes- TCAAAGCGGAGTAGGTTGTTGCATTC 45 timulador CGATTACATGAATATGACTCCTCGCC

GGCCTGGGCCGACAAGAAAACATTAC CAACCCTATGCCCCCCCACGAGACTT

CGCTGCGTACAGGTCC CD28 coes- SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHY 46 timulador QPYAPPRDFAAYRS 41BB coes- AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTA 43 timulador TATATTCAAACAACCATTTATGAGACC

AGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATG GCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAA

GAAGAAGGAGGATGTGAACTG 41BB coes- KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDG 44 timulador CSCRFPEEEEGGCEL CD3ζ CGAGTGAAGTTTTCCCGAAGCGCAGA 47

CGCTCCGGCATATCAGCAAGGACAGA ATCAGCTGTATAACGAACTGAATTTGG GACGCCGCGAGGAGTATGACGTGCT TGATAAACGCCGGGGGAGAGACCCG GAAATGGGGGGTAAACCCCGAAGAAA GAATCCCCAAGAAGGACTCTACAATG AACTCCAGAAGGATAAGATGGCGGAG GCCTACTCAGAAATAGGTATGAAGGG CGAACGACGACGGGGAAAAGGTCAC GATGGCCTCTACCAAGGGTTGAGTAC GGCAACCAAAGATACGTACGATGCAC

TGCATATGCAGGCCCTGCCTCCCAGA CD3ζ RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNL 48

GRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRK NPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGE RRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALH MQALPPR

Tabela 8. Componentes Doadores Estrutura doadora: TRAC[LHA]-EF1a[promotor]-CAR-poliA– TRAC[RHA] Nome Sequência SEQ ID NO: TRAC-LHA GAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTG 78

CTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGG TAGTGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGT TCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATC AATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAATG TGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAAC ATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAAT GCCCAGCCTAAGTTGGGGAGACCACT CCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTT TGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTGCC TTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGG GGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAA AAGAATAAGCAGTATTATTAAGTAGCC CTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGC AGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGTTC ACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAG ATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAG TCCCAGTCCATCACGAGCAGCTGGTT TCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGC ATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCAC AGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGG CATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGG GCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCC TAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGAT ATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTA CCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTG ACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATT TTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAA GTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAG ACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCT

ATGGACTTCA Promotor GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAG 79 EF1α AGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGA

Nome Sequência SEQ ID NO:

GAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAAT TGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGC GCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTC GTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGA GGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGT GCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTT TCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACAC AGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGC GGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGG CCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCA CTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATC CCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTG GGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAG GAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTT GAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCC GCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTT CGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAA GTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATG ACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGC AAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAA GATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTT GGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCC CGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGG CGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGC CACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTC TCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTG CCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCG CCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGC CCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCG GAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTG CTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGAC GCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGG TGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGG CCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCA TGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGC CGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCG AGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGG

Nome Sequência SEQ ID NO:

TTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATG GAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGA GACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACT TGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCC TTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTC TCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGT

TTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA Sinal poli(A) AATAAAATCGCTATCCATCGAAGATG 80 sintético GATGTGTGTTGGTTTTTTGTGTG TRAC–RHA TGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATG 81

TGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTAT TCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCC CAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGCCTTC GCAGGCTGTTTCCTTGCTTCAGGAAT GGCCAGGTTCTGCCCAGAGCTCTGGT CAATGATGTCTAAAACTCCTCTGATTG GTGGTCTCGGCCTTATCCATTGCCAC CAAAACCCTCTTTTTACTAAGAAACAG TGAGCCTTGTTCTGGCAGTCCAGAGA ATGACACGGGAAAAAAGCAGATGAAG AGAAGGTGGCAGGAGAGGGCACGTG GCCCAGCCTCAGTCTCTCCAACTGAG TTCCTGCCTGCCTGCCTTTGCTCAGA CTGTTTGCCCCTTACTGCTCTTCTAGG CCTCATTCTAAGCCCCTTCTCCAAGTT GCCTCTCCTTATTTCTCCCTGTCTGCC AAAAAATCTTTCCCAGCTCACTAAGTC AGTCTCACGCAGTCACTCATTAACCC ACCAATCACTGATTGTGCCGGCACAT GAATGCACCAGGTGTTGAAGTGGAGG AATTAAAAAGTCAGATGAGGGGTGTG CCCAGAGGAAGCACCATTCTAGTTGG GGGAGCCCATCTGTCAGCTGGGAAAA GTCCAAATAACTTCAGATTGGAATGTG TTTTAACTCAGGGTTGAGAAAACAGCT ACCTTCAGGACAAAAGTCAGGGAAGG

Nome Sequência SEQ ID NO:

GCTCTCTGAAGAAATGCTACTTGAAG ATACCAGCCCTACCAAGGGCAGGGA GAGGACCCTATAGAGGCCTGGGACA

GGAGCTCAATGAGAAAGG Tabela 9. CAR Estrutura de CAR SEQ ID NO: CAR de CD8 [peptídeo de sinal]-VL-ligante-VH- 95, 96 CTX-973 CD8 [tm] -41BB[domínio coestimulador]- CD3ζ CAR de CD8 [peptídeo de sinal]-VL-ligante-VH- 100, 101 CTX-974 CD8 [tm] -41BB[domínio coestimulador]- CD3ζ CAR de CD8 [peptídeo de sinal]-VH-ligante-VL- 104, 105 CTX-975 CD8[tm]-41BB[domínio coestimulador]- CD3ζ CAR de CD8 [peptídeo de sinal]-VH-ligante-VL- 108, 109 CTX-976 CD8[tm]-41BB[domínio coestimulador]- CD3ζ CAR de CD8 [peptídeo de sinal]-VL-ligante-VH- 112, 113 CTX-977 CD8 [tm] -41BB[domínio coestimulador]- CD3ζ CAR de CD8 [peptídeo de sinal]-VH-ligante-VL- 116, 117 CTX-978 CD8[tm]-41BB[domínio coestimulador]- CD3ζ CAR de CD8 [peptídeo de sinal]-VL-ligante-VH- 68 CTX-979 CD8 [tm] -41BB[domínio coestimulador]- CD3ζ CAR de CD8 [peptídeo de sinal]-VH-ligante-VL- 66 CTX-979b CD8[tm]-CD28[domínio coestimulador]- CD3ζ

Tabela 10. Componentes de CAR Nome Sequência SEQ ID NO: CAR de CCACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCA 95 CTX-973 CTGCTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCT 41BB coes- CCACGCAGCAAGGCCGGATGTCGTTA tim (nt) TGACACAATCTCCCTTGAGTTTGCCG

GTTACCTTGGGACAACCTGCTAGTAT TTCATGTAGGAGTTCTCAAAGTCTCTT GCACTCCTCAGGGAACACCTACCTCG AATGGTACCAACAACGCCCTGGCCAA AGCCCGCGGCCCTTGATATACAAAAT ATCAACAAGATTTAGCGGGGTACCCG ATAGATTCAGCGGCTCTGGCAGCGG GACGGATTTTACCCTGAAAATTAGTC GCGTAGAAGCTGAAGACGTTGGTGTG TATTACTGCTTTCAAGGGAGCCATGT GCCTTACACATTTGGAGGAGGCACCA AGGTCGAGATTAAGGGAGGGGGTGG ATCAGGTGGGGGTGGGTCCGGAGGC GGCGGCAGTCAAGTGCAGTTGGTTCA ATCAGGAGCTGAAGTTAAAAAGCCAG GAGCTTCAGTCAAGGTTTCATGCAAG GCGTCCGGTCTCACTATAGAGGATTA CTACATGCACTGGGTGCGGCAAGCTC CAGGCCAGGGGCTGGAGTGGATGGG ATGGATTGATCCGGAAAACGGGGACA CAGAGTATGGGCCCAAATTCCAAGGC CGGGTGACAATGACCAGAGATACTAG TATTTCAACAGCATACATGGAGCTGTC ACGGCTGAGGTCAGACGATACGGCA GTCTACTATTGTGCAGTACATAACGCA CATTATGGTACGTGGTTCGCTTATTG GGGTCAAGGTACCCTGGTCACGGTAA GTTCAAGTGCTGCTGCCTTTGTCCCG GTATTTCTCCCAGCCAAACCGACCAC GACTCCCGCCCCGCGCCCTCCGACA CCCGCTCCCACCATCGCCTCTCAACC

Nome Sequência SEQ ID NO:

TCTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGCC GACCCGCCGCCGGGGGTGCTGTTCA TACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTG ATATTTACATTTGGGCTCCGTTGGCG GGTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTC ACTCGTTATTACTTTGTATTGTAATCA CAGGAATCGCAAACGGGGCAGAAAG AAACTCCTGTATATATTCAAACAACCA TTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAA GAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATT TCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTG AACTGCGAGTGAAGTTTTCCCGAAGC GCAGACGCTCCGGCATATCAGCAAG GACAGAATCAGCTGTATAACGAACTG AATTTGGGACGCCGCGAGGAGTATGA CGTGCTTGATAAACGCCGGGGGAGA GACCCGGAAATGGGGGGTAAACCCC GAAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTC TACAATGAACTCCAGAAGGATAAGAT GGCGGAGGCCTACTCAGAAATAGGTA TGAAGGGCGAACGACGACGGGGAAA AGGTCACGATGGCCTCTACCAAGGGT TGAGTACGGCAACCAAAGATACGTAC GATGCACTGCATATGCAGGCCCTGCC

TCCCAGATAAT CAR de ALPVTALLLPLALLLHAARPDVVMTQSP 96 CTX-973 LSLPVTLGQPASISCRSSQSLLHSSGNT 41BB coes- YLEWYQQRPGQSPRPLIYKISTRFSGV tim (aa) PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV

YYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIKGGGG SGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKP GASVKVSCKASGLTIEDYYMHWVRQAP GQGLEWMGWIDPENGDTEYGPKFQG RVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAV YYCAVHNAHYGTWFAYWGQGTLVTVS SSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAP

Nome Sequência SEQ ID NO:

TIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGL DFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC NHRNRKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTT QEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSR SADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEY DVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL YNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGK GHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP

R CTX-973 GATGTCGTTATGACACAATCTCCCTTG 97 scFv (nt) AGTTTGCCGGTTACCTTGGGACAACC

TGCTAGTATTTCATGTAGGAGTTCTCA AAGTCTCTTGCACTCCTCAGGGAACA CCTACCTCGAATGGTACCAACAACGC CCTGGCCAAAGCCCGCGGCCCTTGA TATACAAAATATCAACAAGATTTAGCG GGGTACCCGATAGATTCAGCGGCTCT GGCAGCGGGACGGATTTTACCCTGAA AATTAGTCGCGTAGAAGCTGAAGACG TTGGTGTGTATTACTGCTTTCAAGGGA GCCATGTGCCTTACACATTTGGAGGA GGCACCAAGGTCGAGATTAAGGGAG GGGGTGGATCAGGTGGGGGTGGGTC CGGAGGCGGCGGCAGTCAAGTGCAG TTGGTTCAATCAGGAGCTGAAGTTAA AAAGCCAGGAGCTTCAGTCAAGGTTT CATGCAAGGCGTCCGGTCTCACTATA GAGGATTACTACATGCACTGGGTGCG GCAAGCTCCAGGCCAGGGGCTGGAG TGGATGGGATGGATTGATCCGGAAAA CGGGGACACAGAGTATGGGCCCAAA TTCCAAGGCCGGGTGACAATGACCAG AGATACTAGTATTTCAACAGCATACAT GGAGCTGTCACGGCTGAGGTCAGAC GATACGGCAGTCTACTATTGTGCAGT ACATAACGCACATTATGGTACGTGGT

Nome Sequência SEQ ID NO:

TCGCTTATTGGGGTCAAGGTACCCTG

GTCACGGTAAGTTCA CTX-973 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQ 82 scFv (aa) SLLHSSGNTYLEWYQQRPGQSPRPLIY (ligante KISTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISR sublinhado) VEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTK

VEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQ SGAEVKKPGASVKVSCKASGLTIEDYY MHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDT EYGPKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSR LRSDDTAVYYCAVHNAHYGTWFAYWG

QGTLVTVSS CTX-973 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG 98 VH de scFv LTIEDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWID (aa) PENGDTEYGPKFQGRVTMTRDTSISTA

YMELSRLRSDDTAVYYCAVHNAHYGT

WFAYWGQGTLVTVSS CTX-973 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQ 56 VL de scFv SLLHSSGNTYLEWYQQRPGQSPRPLIY (aa) KISTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISR

VEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTK

VEIK CTX-973 GAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTG 99 Doador (nt) CTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGG LHA para TAGTGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGT

RHA TCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATC AATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAATG TGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAAC ATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAAT GCCCAGCCTAAGTTGGGGAGACCACT CCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTT TGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTGCC TTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGG GGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAA AAGAATAAGCAGTATTATTAAGTAGCC CTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGC

Nome Sequência SEQ ID NO:

AGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGTTC ACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAG ATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAG TCCCAGTCCATCACGAGCAGCTGGTT TCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGC ATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCAC AGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGG CATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGG GCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCC TAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGAT ATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTA CCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTG ACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATT TTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAA GTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAG

ACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCT ATGGACTTCAggctccggtgcccgtcagtgggc agagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggg gggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaag gtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtact ggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtat ataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacg ggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggtt cccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgt gccttgaattacttccactggctgcagtacgtgattcttga tcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcga ggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagt tgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcg aatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgata agtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacg ctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaag atctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcgg cgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcg aggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcgg acgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgc ctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcg gcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcg

Nome Sequência SEQ ID NO: gaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagct caaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcg ggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgt cctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgg gcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttgg agtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcga tggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagtt aggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgc cctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagac agtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaCC

ACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCACT GCTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCTCC ACGCAGCAAGGCCGGATGTCGTTATG ACACAATCTCCCTTGAGTTTGCCGGT TACCTTGGGACAACCTGCTAGTATTTC ATGTAGGAGTTCTCAAAGTCTCTTGCA CTCCTCAGGGAACACCTACCTCGAAT GGTACCAACAACGCCCTGGCCAAAGC CCGCGGCCCTTGATATACAAAATATC AACAAGATTTAGCGGGGTACCCGATA GATTCAGCGGCTCTGGCAGCGGGAC GGATTTTACCCTGAAAATTAGTCGCGT AGAAGCTGAAGACGTTGGTGTGTATT ACTGCTTTCAAGGGAGCCATGTGCCT TACACATTTGGAGGAGGCACCAAGGT CGAGATTAAGGGAGGGGGTGGATCA GGTGGGGGTGGGTCCGGAGGCGGC GGCAGTCAAGTGCAGTTGGTTCAATC AGGAGCTGAAGTTAAAAAGCCAGGAG CTTCAGTCAAGGTTTCATGCAAGGCG TCCGGTCTCACTATAGAGGATTACTA CATGCACTGGGTGCGGCAAGCTCCA GGCCAGGGGCTGGAGTGGATGGGAT GGATTGATCCGGAAAACGGGGACACA GAGTATGGGCCCAAATTCCAAGGCCG GGTGACAATGACCAGAGATACTAGTA TTTCAACAGCATACATGGAGCTGTCA

Nome Sequência SEQ ID NO:

CGGCTGAGGTCAGACGATACGGCAG TCTACTATTGTGCAGTACATAACGCAC ATTATGGTACGTGGTTCGCTTATTGG GGTCAAGGTACCCTGGTCACGGTAAG TTCAAGTGCTGCTGCCTTTGTCCCGG TATTTCTCCCAGCCAAACCGACCACG ACTCCCGCCCCGCGCCCTCCGACAC CCGCTCCCACCATCGCCTCTCAACCT CTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGCCG ACCCGCCGCCGGGGGTGCTGTTCAT ACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTGA TATTTACATTTGGGCTCCGTTGGCGG GTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTCA CTCGTTATTACTTTGTATTGTAATCAC AGGAATCGCAAACGGGGCAGAAAGA AACTCCTGTATATATTCAAACAACCAT TTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAG AGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTT CCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGA ACTGCGAGTGAAGTTTTCCCGAAGCG CAGACGCTCCGGCATATCAGCAAGGA CAGAATCAGCTGTATAACGAACTGAA TTTGGGACGCCGCGAGGAGTATGAC GTGCTTGATAAACGCCGGGGGAGAG ACCCGGAAATGGGGGGTAAACCCCG AAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTCT ACAATGAACTCCAGAAGGATAAGATG GCGGAGGCCTACTCAGAAATAGGTAT GAAGGGCGAACGACGACGGGGAAAA GGTCACGATGGCCTCTACCAAGGGTT GAGTACGGCAACCAAAGATACGTACG ATGCACTGCATATGCAGGCCCTGCCT CCCAGATAATAATAAAATCGCTATCCA TCGAAGATGGATGTGTGTTGGTTTTTT GTGTGTGGAGCAACAAATCTGACTTT GCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAG CATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCC

Nome Sequência SEQ ID NO:

CAGCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGT GCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTC AGGAATGGCCAGGTTCTGCCCAGAG CTCTGGTCAATGATGTCTAAAACTCCT CTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCA TTGCCACCAAAACCCTCTTTTTACTAA GAAACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGT CCAGAGAATGACACGGGAAAAAAGCA GATGAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGG GCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCC AACTGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTT GCTCAGACTGTTTGCCCCTTACTGCT CTTCTAGGCCTCATTCTAAGCCCCTTC TCCAAGTTGCCTCTCCTTATTTCTCCC TGTCTGCCAAAAAATCTTTCCCAGCTC ACTAAGTCAGTCTCACGCAGTCACTC ATTAACCCACCAATCACTGATTGTGCC GGCACATGAATGCACCAGGTGTTGAA GTGGAGGAATTAAAAAGTCAGATGAG GGGTGTGCCCAGAGGAAGCACCATT CTAGTTGGGGGAGCCCATCTGTCAGC TGGGAAAAGTCCAAATAACTTCAGATT GGAATGTGTTTTAACTCAGGGTTGAG AAAACAGCTACCTTCAGGACAAAAGT CAGGGAAGGGCTCTCTGAAGAAATGC TACTTGAAGATACCAGCCCTACCAAG GGCAGGGAGAGGACCCTATAGAGGC CTGGGACAGGAGCTCAATGAGAAAG

G CAR de CCACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCA 100 CTX-974 CTGCTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCT 41BB co- CCACGCAGCAAGGCCGCAGGTGCAG stim (nt) CTGGTCCAAAGCGGCGCCGAGGTTA

AGAAACCAGGCGCATCCGTCAAGGTT TCATGTAAAGCAAGTGGCTTGACTATA GAAGACTACTACATGCATTGGGTACG

Nome Sequência SEQ ID NO:

GCAAGCCCCTGGGCAGGGGCTGGAA TGGATGGGGTGGATCGACCCGGAGA ATGGTGATACAGAGTACGGACCTAAG TTCCAGGGACGAGTTACCATGACGCG AGATACATCCATCTCCACGGCATACA TGGAGCTGAGTCGACTGCGGAGCGA TGATACAGCTGTCTATTATTGTGCTGT CCACAATGCGCACTACGGCACCTGGT TCGCTTATTGGGGACAAGGTACCCTG GTCACAGTCAGCTCTGGGGGTGGCG GCAGTGGAGGGGGTGGTTCTGGTGG CGGGGGTTCCGATGTTGTAATGACTC AAAGCCCTCTTTCTTTGCCAGTCACTC TCGGACAACCCGCGAGCATATCTTGC AGGTCTTCACAATCACTCCTTCACAGT AGCGGGAATACTTACTTGGAGTGGTA TCAGCAGCGGCCTGGTCAGTCCCCTA GACCGCTTATATATAAGATCTCCACTA GGTTCAGTGGAGTGCCGGACCGCTTT TCAGGCTCAGGTTCCGGGACGGACTT TACATTGAAAATATCCAGGGTGGAGG CGGAGGACGTCGGAGTCTACTATTGC TTCCAAGGCTCCCACGTCCCATACAC TTTCGGTGGCGGTACAAAAGTGGAAA TAAAAAGTGCTGCTGCCTTTGTCCCG GTATTTCTCCCAGCCAAACCGACCAC GACTCCCGCCCCGCGCCCTCCGACA CCCGCTCCCACCATCGCCTCTCAACC TCTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGCC GACCCGCCGCCGGGGGTGCTGTTCA TACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTG ATATTTACATTTGGGCTCCGTTGGCG GGTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTC ACTCGTTATTACTTTGTATTGTAATCA CAGGAATCGCAAACGGGGCAGAAAG AAACTCCTGTATATATTCAAACAACCA TTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAA

Nome Sequência SEQ ID NO:

GAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATT TCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTG AACTGCGAGTGAAGTTTTCCCGAAGC GCAGACGCTCCGGCATATCAGCAAG GACAGAATCAGCTGTATAACGAACTG AATTTGGGACGCCGCGAGGAGTATGA CGTGCTTGATAAACGCCGGGGGAGA GACCCGGAAATGGGGGGTAAACCCC GAAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTC TACAATGAACTCCAGAAGGATAAGAT GGCGGAGGCCTACTCAGAAATAGGTA TGAAGGGCGAACGACGACGGGGAAA AGGTCACGATGGCCTCTACCAAGGGT TGAGTACGGCAACCAAAGATACGTAC GATGCACTGCATATGCAGGCCCTGCC

TCCCAGATAAT CAR de MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQS 101 CTX-974 GAEVKKPGASVKVSCKASGLTIEDYYM 41BB coes- HWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTE tim (aa) YGPKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRL

RSDDTAVYYCAVHNAHYGTWFAYWGQ GTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDV VMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLL HSSGNTYLEWYQQRPGQSPRPLIYKIS TRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEI KSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAP TIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGL DFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC NHRNRKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTT QEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSR SADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEY DVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL YNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGK GHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP R

Nome Sequência SEQ ID NO: CTX-974 CAGGTGCAGCTGGTCCAAAGCGGCG 102 scFv (nt) CCGAGGTTAAGAAACCAGGCGCATCC

GTCAAGGTTTCATGTAAAGCAAGTGG CTTGACTATAGAAGACTACTACATGCA TTGGGTACGGCAAGCCCCTGGGCAG GGGCTGGAATGGATGGGGTGGATCG ACCCGGAGAATGGTGATACAGAGTAC GGACCTAAGTTCCAGGGACGAGTTAC CATGACGCGAGATACATCCATCTCCA CGGCATACATGGAGCTGAGTCGACTG CGGAGCGATGATACAGCTGTCTATTA TTGTGCTGTCCACAATGCGCACTACG GCACCTGGTTCGCTTATTGGGGACAA GGTACCCTGGTCACAGTCAGCTCTGG GGGTGGCGGCAGTGGAGGGGGTGGT TCTGGTGGCGGGGGTTCCGATGTTGT AATGACTCAAAGCCCTCTTTCTTTGCC AGTCACTCTCGGACAACCCGCGAGCA TATCTTGCAGGTCTTCACAATCACTCC TTCACAGTAGCGGGAATACTTACTTG GAGTGGTATCAGCAGCGGCCTGGTC AGTCCCCTAGACCGCTTATATATAAGA TCTCCACTAGGTTCAGTGGAGTGCCG GACCGCTTTTCAGGCTCAGGTTCCGG GACGGACTTTACATTGAAAATATCCAG GGTGGAGGCGGAGGACGTCGGAGTC TACTATTGCTTCCAAGGCTCCCACGT CCCATACACTTTCGGTGGCGGTACAA

AAGTGGAAATAAAA CTX-974 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG 85 scFv (aa) LTIEDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWID (ligante PENGDTEYGPKFQGRVTMTRDTSISTA sublinhado) YMELSRLRSDDTAVYYCAVHNAHYGT

WFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASIS CRSSQSLLHSSGNTYLEWYQQRPGQS

Nome Sequência SEQ ID NO:

PRPLIYKISTRFSGVPDRFSGSGSGTDF TLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTF

GGGTKVEIK CTX-974 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG 98 scFv VH LTIEDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWID (aa) PENGDTEYGPKFQGRVTMTRDTSISTA

YMELSRLRSDDTAVYYCAVHNAHYGT

WFAYWGQGTLVTVSS CTX-974 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQ 56 scFv VL SLLHSSGNTYLEWYQQRPGQSPRPLIY (aa) KISTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISR

VEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTK

VEIK CTX-974 GAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTG 103 Doador (nt) CTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGG LHA para TAGTGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGT

RHA TCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATC AATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAATG TGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAAC ATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAAT GCCCAGCCTAAGTTGGGGAGACCACT CCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTT TGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTGCC TTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGG GGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAA AAGAATAAGCAGTATTATTAAGTAGCC CTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGC AGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGTTC ACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAG ATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAG TCCCAGTCCATCACGAGCAGCTGGTT TCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGC ATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCAC AGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGG CATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGG GCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCC

Nome Sequência SEQ ID NO:

TAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGAT ATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTA CCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTG ACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATT TTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAA GTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAG

ACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCT ATGGACTTCAggctccggtgcccgtcagtgggc agagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggg gggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaag gtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtact ggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtat ataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacg ggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggtt cccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgt gccttgaattacttccactggctgcagtacgtgattcttga tcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcga ggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagt tgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcg aatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgata agtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacg ctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaag atctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcgg cgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcg aggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcgg acgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgc ctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcg gcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcg gaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagct caaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcg ggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgt cctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgg gcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttgg agtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcga tggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagtt aggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgc cctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagac

Nome Sequência SEQ ID NO: agtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaCC

ACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCACT GCTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCTCC ACGCAGCAAGGCCGCAGGTGCAGCT GGTCCAAAGCGGCGCCGAGGTTAAG AAACCAGGCGCATCCGTCAAGGTTTC ATGTAAAGCAAGTGGCTTGACTATAG AAGACTACTACATGCATTGGGTACGG CAAGCCCCTGGGCAGGGGCTGGAAT GGATGGGGTGGATCGACCCGGAGAA TGGTGATACAGAGTACGGACCTAAGT TCCAGGGACGAGTTACCATGACGCGA GATACATCCATCTCCACGGCATACAT GGAGCTGAGTCGACTGCGGAGCGAT GATACAGCTGTCTATTATTGTGCTGTC CACAATGCGCACTACGGCACCTGGTT CGCTTATTGGGGACAAGGTACCCTGG TCACAGTCAGCTCTGGGGGTGGCGG CAGTGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGC GGGGGTTCCGATGTTGTAATGACTCA AAGCCCTCTTTCTTTGCCAGTCACTCT CGGACAACCCGCGAGCATATCTTGCA GGTCTTCACAATCACTCCTTCACAGTA GCGGGAATACTTACTTGGAGTGGTAT CAGCAGCGGCCTGGTCAGTCCCCTA GACCGCTTATATATAAGATCTCCACTA GGTTCAGTGGAGTGCCGGACCGCTTT TCAGGCTCAGGTTCCGGGACGGACTT TACATTGAAAATATCCAGGGTGGAGG CGGAGGACGTCGGAGTCTACTATTGC TTCCAAGGCTCCCACGTCCCATACAC TTTCGGTGGCGGTACAAAAGTGGAAA TAAAAAGTGCTGCTGCCTTTGTCCCG GTATTTCTCCCAGCCAAACCGACCAC GACTCCCGCCCCGCGCCCTCCGACA CCCGCTCCCACCATCGCCTCTCAACC TCTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGCC

Nome Sequência SEQ ID NO:

GACCCGCCGCCGGGGGTGCTGTTCA TACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTG ATATTTACATTTGGGCTCCGTTGGCG GGTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTC ACTCGTTATTACTTTGTATTGTAATCA CAGGAATCGCAAACGGGGCAGAAAG AAACTCCTGTATATATTCAAACAACCA TTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAA GAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATT TCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTG AACTGCGAGTGAAGTTTTCCCGAAGC GCAGACGCTCCGGCATATCAGCAAG GACAGAATCAGCTGTATAACGAACTG AATTTGGGACGCCGCGAGGAGTATGA CGTGCTTGATAAACGCCGGGGGAGA GACCCGGAAATGGGGGGTAAACCCC GAAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTC TACAATGAACTCCAGAAGGATAAGAT GGCGGAGGCCTACTCAGAAATAGGTA TGAAGGGCGAACGACGACGGGGAAA AGGTCACGATGGCCTCTACCAAGGGT TGAGTACGGCAACCAAAGATACGTAC GATGCACTGCATATGCAGGCCCTGCC TCCCAGATAATAATAAAATCGCTATCC ATCGAAGATGGATGTGTGTTGGTTTTT TGTGTGTGGAGCAACAAATCTGACTT TGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACA GCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCC CCAGCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGT GCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTC AGGAATGGCCAGGTTCTGCCCAGAG CTCTGGTCAATGATGTCTAAAACTCCT CTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCA TTGCCACCAAAACCCTCTTTTTACTAA GAAACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGT CCAGAGAATGACACGGGAAAAAAGCA GATGAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGG

Nome Sequência SEQ ID NO:

GCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCC AACTGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTT GCTCAGACTGTTTGCCCCTTACTGCT CTTCTAGGCCTCATTCTAAGCCCCTTC TCCAAGTTGCCTCTCCTTATTTCTCCC TGTCTGCCAAAAAATCTTTCCCAGCTC ACTAAGTCAGTCTCACGCAGTCACTC ATTAACCCACCAATCACTGATTGTGCC GGCACATGAATGCACCAGGTGTTGAA GTGGAGGAATTAAAAAGTCAGATGAG GGGTGTGCCCAGAGGAAGCACCATT CTAGTTGGGGGAGCCCATCTGTCAGC TGGGAAAAGTCCAAATAACTTCAGATT GGAATGTGTTTTAACTCAGGGTTGAG AAAACAGCTACCTTCAGGACAAAAGT CAGGGAAGGGCTCTCTGAAGAAATGC TACTTGAAGATACCAGCCCTACCAAG GGCAGGGAGAGGACCCTATAGAGGC CTGGGACAGGAGCTCAATGAGAAAG

G CAR de CCACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCA 104 CTX-975 CTGCTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCT 41BB co- CCACGCAGCAAGGCCGGATGTAGTTA stim (nt) TGACCCAGAGTCCGCTCTCTTTGCCG

GTGACGCTCGGCCAACCGGCGTCTAT TTCTTGCAGAAGTAGTCAATCACTTCT GCACTCTAGCGGTAACACTTATTTGG AGTGGTATCTCCAACGACCAGGGCAA AGCCCCAAGCCGTTGATTTATAAGAT CTCTACAAGATTCAGCGGAGTGCCCG ACAGATTTTCCGGGAGTGGGTCCGGT ACTGATTTCACTTTGAAAATTTCCCGC GTCGAGGCTGAAGATGTTGGTGTCTA CTACTGCTTTCAGGGGAGCCATGTTC CATATACCTTTGGAGGTGGGACTAAG GTAGAAATTAAAGGTGGGGGTGGATC

Nome Sequência SEQ ID NO:

AGGGGGTGGCGGCAGCGGGGGAGG GGGCTCACAAGTGCAACTTGTGCAAA GTGGGGCCGAGGTGAAAAAACCCGG TGCAAGTGTAAAGGTCTCATGCAAAG CGTCTGGTTTGACAATTGAAGACTATT ATATGCATTGGGTGAGACAGGCCCCG GGCCAAGGCTTGGAATGGATGGGAT GGATAGACCCCGAAAACGGTGACAC GGAGTACGGACCTAAATTTCAAGGAA GAGTGACAATGACACGCGATACATCT ATTAACACGGCTTATATGGAACTGAG CCGACTTCGGAGTGATGACACTGCTG TATATTATTGCGCCGTCCACAACGCA CATTATGGCACCTGGTTTGCGTACTG GGGACAGGGAACTTTGGTTACAGTAT CAAGCAGTGCTGCTGCCTTTGTCCCG GTATTTCTCCCAGCCAAACCGACCAC GACTCCCGCCCCGCGCCCTCCGACA CCCGCTCCCACCATCGCCTCTCAACC TCTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGCC GACCCGCCGCCGGGGGTGCTGTTCA TACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTG ATATTTACATTTGGGCTCCGTTGGCG GGTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTC ACTCGTTATTACTTTGTATTGTAATCA CAGGAATCGCAAACGGGGCAGAAAG AAACTCCTGTATATATTCAAACAACCA TTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAA GAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATT TCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTG AACTGCGAGTGAAGTTTTCCCGAAGC GCAGACGCTCCGGCATATCAGCAAG GACAGAATCAGCTGTATAACGAACTG AATTTGGGACGCCGCGAGGAGTATGA CGTGCTTGATAAACGCCGGGGGAGA GACCCGGAAATGGGGGGTAAACCCC GAAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTC

Nome Sequência SEQ ID NO:

TACAATGAACTCCAGAAGGATAAGAT GGCGGAGGCCTACTCAGAAATAGGTA TGAAGGGCGAACGACGACGGGGAAA AGGTCACGATGGCCTCTACCAAGGGT TGAGTACGGCAACCAAAGATACGTAC GATGCACTGCATATGCAGGCCCTGCC

TCCCAGATAAT CAR de MALPVTALLLPLALLLHAARPDVVMTQS 105 CTX-975 PLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLHSSGN 41BB coes- TYLEWYLQRPGQSPKPLIYKISTRFSGV tim (aa) PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV

YYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIKGGGG SGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKP GASVKVSCKASGLTIEDYYMHWVRQAP GQGLEWMGWIDPENGDTEYGPKFQG RVTMTRDTSINTAYMELSRLRSDDTAV YYCAVHNAHYGTWFAYWGQGTLVTVS SSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAP TIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGL DFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC NHRNRKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTT QEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSR SADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEY DVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL YNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGK GHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP

R CTX-975 GATGTAGTTATGACCCAGAGTCCGCT 106 scFv (nt) CTCTTTGCCGGTGACGCTCGGCCAAC

CGGCGTCTATTTCTTGCAGAAGTAGT CAATCACTTCTGCACTCTAGCGGTAA CACTTATTTGGAGTGGTATCTCCAAC GACCAGGGCAAAGCCCCAAGCCGTT GATTTATAAGATCTCTACAAGATTCAG CGGAGTGCCCGACAGATTTTCCGGGA GTGGGTCCGGTACTGATTTCACTTTG

Nome Sequência SEQ ID NO:

AAAATTTCCCGCGTCGAGGCTGAAGA TGTTGGTGTCTACTACTGCTTTCAGG GGAGCCATGTTCCATATACCTTTGGA GGTGGGACTAAGGTAGAAATTAAAGG TGGGGGTGGATCAGGGGGTGGCGGC AGCGGGGGAGGGGGCTCACAAGTGC AACTTGTGCAAAGTGGGGCCGAGGT GAAAAAACCCGGTGCAAGTGTAAAGG TCTCATGCAAAGCGTCTGGTTTGACA ATTGAAGACTATTATATGCATTGGGTG AGACAGGCCCCGGGCCAAGGCTTGG AATGGATGGGATGGATAGACCCCGAA AACGGTGACACGGAGTACGGACCTAA ATTTCAAGGAAGAGTGACAATGACAC GCGATACATCTATTAACACGGCTTATA TGGAACTGAGCCGACTTCGGAGTGAT GACACTGCTGTATATTATTGCGCCGT CCACAACGCACATTATGGCACCTGGT TTGCGTACTGGGGACAGGGAACTTTG

GTTACAGTATCAAGC CTX-975 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQ 83 scFv (aa) SLLHSSGNTYLEWYLQRPGQSPKPLIY (ligante KISTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISR sublinhado) VEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTK

VEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQ SGAEVKKPGASVKVSCKASGLTIEDYY MHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDT EYGPKFQGRVTMTRDTSINTAYMELSR LRSDDTAVYYCAVHNAHYGTWFAYWG

QGTLVTVSS CTX-975 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG 90 VH de scFv LTIEDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWID (aa) PENGDTEYGPKFQGRVTMTRDTSINTA

YMELSRLRSDDTAVYYCAVHNAHYGT

WFAYWGQGTLVTVSS CTX-975 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQ 88

Nome Sequência SEQ ID NO: VL de scFv SLLHSSGNTYLEWYLQRPGQSPKPLIY (aa) KISTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISR

VEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTK

VEIK CTX-975 GAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTG 107 Doador (nt) CTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGG LHA para TAGTGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGT

ACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCT ATGGACTTCAggctccggtgcccgtcagtgggc agagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggg

Nome Sequência SEQ ID NO: gggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaag gtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtact ggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtat ataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacg ggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggtt cccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgt gccttgaattacttccactggctgcagtacgtgattcttga tcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcga ggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagt tgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcg aatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgata agtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacg ctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaag atctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcgg cgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcg aggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcgg acgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgc ctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcg gcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcg gaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagct caaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcg ggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgt cctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgg gcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttgg agtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcga tggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagtt aggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgc cctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagac agtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaCC

ACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCACT GCTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCTCC ACGCAGCAAGGCCGGATGTAGTTATG ACCCAGAGTCCGCTCTCTTTGCCGGT GACGCTCGGCCAACCGGCGTCTATTT CTTGCAGAAGTAGTCAATCACTTCTG CACTCTAGCGGTAACACTTATTTGGA GTGGTATCTCCAACGACCAGGGCAAA

Nome Sequência SEQ ID NO:

GCCCCAAGCCGTTGATTTATAAGATC TCTACAAGATTCAGCGGAGTGCCCGA CAGATTTTCCGGGAGTGGGTCCGGTA CTGATTTCACTTTGAAAATTTCCCGCG TCGAGGCTGAAGATGTTGGTGTCTAC TACTGCTTTCAGGGGAGCCATGTTCC ATATACCTTTGGAGGTGGGACTAAGG TAGAAATTAAAGGTGGGGGTGGATCA GGGGGTGGCGGCAGCGGGGGAGGG GGCTCACAAGTGCAACTTGTGCAAAG TGGGGCCGAGGTGAAAAAACCCGGT GCAAGTGTAAAGGTCTCATGCAAAGC GTCTGGTTTGACAATTGAAGACTATTA TATGCATTGGGTGAGACAGGCCCCG GGCCAAGGCTTGGAATGGATGGGAT GGATAGACCCCGAAAACGGTGACAC GGAGTACGGACCTAAATTTCAAGGAA GAGTGACAATGACACGCGATACATCT ATTAACACGGCTTATATGGAACTGAG CCGACTTCGGAGTGATGACACTGCTG TATATTATTGCGCCGTCCACAACGCA CATTATGGCACCTGGTTTGCGTACTG GGGACAGGGAACTTTGGTTACAGTAT CAAGCAGTGCTGCTGCCTTTGTCCCG GTATTTCTCCCAGCCAAACCGACCAC GACTCCCGCCCCGCGCCCTCCGACA CCCGCTCCCACCATCGCCTCTCAACC TCTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGCC GACCCGCCGCCGGGGGTGCTGTTCA TACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTG ATATTTACATTTGGGCTCCGTTGGCG GGTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTC ACTCGTTATTACTTTGTATTGTAATCA CAGGAATCGCAAACGGGGCAGAAAG AAACTCCTGTATATATTCAAACAACCA TTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAA GAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATT

Nome Sequência SEQ ID NO:

TCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTG AACTGCGAGTGAAGTTTTCCCGAAGC GCAGACGCTCCGGCATATCAGCAAG GACAGAATCAGCTGTATAACGAACTG AATTTGGGACGCCGCGAGGAGTATGA CGTGCTTGATAAACGCCGGGGGAGA GACCCGGAAATGGGGGGTAAACCCC GAAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTC TACAATGAACTCCAGAAGGATAAGAT GGCGGAGGCCTACTCAGAAATAGGTA TGAAGGGCGAACGACGACGGGGAAA AGGTCACGATGGCCTCTACCAAGGGT TGAGTACGGCAACCAAAGATACGTAC GATGCACTGCATATGCAGGCCCTGCC TCCCAGATAATAATAAAATCGCTATCC ATCGAAGATGGATGTGTGTTGGTTTTT TGTGTGTGGAGCAACAAATCTGACTT TGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACA GCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCC CCAGCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGT GCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTC AGGAATGGCCAGGTTCTGCCCAGAG CTCTGGTCAATGATGTCTAAAACTCCT CTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCA TTGCCACCAAAACCCTCTTTTTACTAA GAAACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGT CCAGAGAATGACACGGGAAAAAAGCA GATGAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGG GCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCC AACTGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTT GCTCAGACTGTTTGCCCCTTACTGCT CTTCTAGGCCTCATTCTAAGCCCCTTC TCCAAGTTGCCTCTCCTTATTTCTCCC TGTCTGCCAAAAAATCTTTCCCAGCTC ACTAAGTCAGTCTCACGCAGTCACTC ATTAACCCACCAATCACTGATTGTGCC GGCACATGAATGCACCAGGTGTTGAA

Nome Sequência SEQ ID NO:

GTGGAGGAATTAAAAAGTCAGATGAG GGGTGTGCCCAGAGGAAGCACCATT CTAGTTGGGGGAGCCCATCTGTCAGC TGGGAAAAGTCCAAATAACTTCAGATT GGAATGTGTTTTAACTCAGGGTTGAG AAAACAGCTACCTTCAGGACAAAAGT CAGGGAAGGGCTCTCTGAAGAAATGC TACTTGAAGATACCAGCCCTACCAAG GGCAGGGAGAGGACCCTATAGAGGC CTGGGACAGGAGCTCAATGAGAAAG

G CAR de CCACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCA 108 CTX-976 CTGCTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCT 41BB coes- CCACGCAGCAAGGCCGCAGGTTCAA tim (nt) CTGGTTCAGAGTGGAGCAGAGGTAAA

AAAGCCCGGAGCGTCCGTCAAAGTGT CATGTAAAGCCTCTGGACTTACTATC GAAGACTACTACATGCACTGGGTGAG GCAGGCGCCTGGCCAAGGTCTCGAG TGGATGGGTTGGATTGACCCTGAAAA TGGAGATACAGAATACGGCCCTAAGT TTCAAGGGCGAGTAACTATGACTCGA GATACGTCAATTAATACGGCATACATG GAGTTGTCTCGGCTCCGATCTGATGA CACTGCAGTTTACTATTGTGCCGTCC ACAATGCTCATTACGGGACATGGTTC GCTTACTGGGGGCAAGGGACACTCG TAACGGTTAGCTCTGGGGGAGGAGG GTCTGGTGGAGGGGGCTCAGGAGGG GGTGGTAGCGACGTAGTAATGACCCA GTCACCTCTGTCTTTGCCGGTCACGT TGGGCCAGCCTGCATCCATATCCTGC AGATCCAGCCAGAGCCTCCTGCACAG TAGTGGCAACACGTATTTGGAATGGT ACCTGCAGAGGCCGGGTCAAAGTCC AAAACCGCTGATCTATAAGATATCTAC

Nome Sequência SEQ ID NO:

GCGATTTTCAGGGGTGCCGGACCGAT TTAGCGGATCAGGAAGTGGAACCGAC TTTACGCTCAAGATCAGCCGGGTTGA AGCCGAAGATGTCGGCGTTTACTACT GTTTCCAAGGAAGCCACGTACCCTAT ACGTTTGGTGGCGGCACGAAGGTCG AGATAAAGAGTGCTGCTGCCTTTGTC CCGGTATTTCTCCCAGCCAAACCGAC CACGACTCCCGCCCCGCGCCCTCCG ACACCCGCTCCCACCATCGCCTCTCA ACCTCTTAGTCTTCGCCCCGAGGCAT GCCGACCCGCCGCCGGGGGTGCTGT TCATACGAGGGGCTTGGACTTCGCTT GTGATATTTACATTTGGGCTCCGTTG GCGGGTACGTGCGGCGTCCTTTTGTT GTCACTCGTTATTACTTTGTATTGTAA TCACAGGAATCGCAAACGGGGCAGAA AGAAACTCCTGTATATATTCAAACAAC CATTTATGAGACCAGTACAAACTACTC AAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGA TTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATG TGAACTGCGAGTGAAGTTTTCCCGAA GCGCAGACGCTCCGGCATATCAGCAA GGACAGAATCAGCTGTATAACGAACT GAATTTGGGACGCCGCGAGGAGTAT GACGTGCTTGATAAACGCCGGGGGA GAGACCCGGAAATGGGGGGTAAACC CCGAAGAAAGAATCCCCAAGAAGGAC TCTACAATGAACTCCAGAAGGATAAG ATGGCGGAGGCCTACTCAGAAATAGG TATGAAGGGCGAACGACGACGGGGA AAAGGTCACGATGGCCTCTACCAAGG GTTGAGTACGGCAACCAAAGATACGT ACGATGCACTGCATATGCAGGCCCTG

CCTCCCAGATAAT CAR de MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQS 109

Nome Sequência SEQ ID NO: CTX-976 GAEVKKPGASVKVSCKASGLTIEDYYM 41BB coes- HWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTE tim (aa) YGPKFQGRVTMTRDTSINTAYMELSRL

RSDDTAVYYCAVHNAHYGTWFAYWGQ GTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDV VMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLL HSSGNTYLEWYLQRPGQSPKPLIYKIST RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEA EDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK SAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPT IASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLD FACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCN HRNRKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQ EEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRS ADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYD VLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLY NELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKG

HDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CTX-976 CAGGTTCAACTGGTTCAGAGTGGAGC 110 scFv (nt) AGAGGTAAAAAAGCCCGGAGCGTCC

GTCAAAGTGTCATGTAAAGCCTCTGG ACTTACTATCGAAGACTACTACATGCA CTGGGTGAGGCAGGCGCCTGGCCAA GGTCTCGAGTGGATGGGTTGGATTGA CCCTGAAAATGGAGATACAGAATACG GCCCTAAGTTTCAAGGGCGAGTAACT ATGACTCGAGATACGTCAATTAATACG GCATACATGGAGTTGTCTCGGCTCCG ATCTGATGACACTGCAGTTTACTATTG TGCCGTCCACAATGCTCATTACGGGA CATGGTTCGCTTACTGGGGGCAAGG GACACTCGTAACGGTTAGCTCTGGGG GAGGAGGGTCTGGTGGAGGGGGCTC AGGAGGGGGTGGTAGCGACGTAGTA ATGACCCAGTCACCTCTGTCTTTGCC GGTCACGTTGGGCCAGCCTGCATCCA

Nome Sequência SEQ ID NO:

TATCCTGCAGATCCAGCCAGAGCCTC CTGCACAGTAGTGGCAACACGTATTT GGAATGGTACCTGCAGAGGCCGGGT CAAAGTCCAAAACCGCTGATCTATAA GATATCTACGCGATTTTCAGGGGTGC CGGACCGATTTAGCGGATCAGGAAGT GGAACCGACTTTACGCTCAAGATCAG CCGGGTTGAAGCCGAAGATGTCGGC GTTTACTACTGTTTCCAAGGAAGCCA CGTACCCTATACGTTTGGTGGCGGCA

CGAAGGTCGAGATAAAG CTX-976 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG 86 scFv (aa) LTIEDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWID (ligante PENGDTEYGPKFQGRVTMTRDTSINTA sublinhado) YMELSRLRSDDTAVYYCAVHNAHYGT

WFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASIS CRSSQSLLHSSGNTYLEWYLQRPGQS PKPLIYKISTRFSGVPDRFSGSGSGTDF TLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTF

GGGTKVEIK CTX-976 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG 90 VH de scFv LTIEDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWID (aa) PENGDTEYGPKFQGRVTMTRDTSINTA

YMELSRLRSDDTAVYYCAVHNAHYGT

WFAYWGQGTLVTVSS CTX-976 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQ 88 VL de scFv SLLHSSGNTYLEWYLQRPGQSPKPLIY (aa) KISTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISR

VEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTK

VEIK CTX-976 GAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTG 111 Doador (nt) CTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGG LHA para TAGTGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGT

RHA TCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATC AATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAATG

Nome Sequência SEQ ID NO:

TGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAAC ATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAAT GCCCAGCCTAAGTTGGGGAGACCACT CCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTT TGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTGCC TTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGG GGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAA AAGAATAAGCAGTATTATTAAGTAGCC CTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGC AGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGTTC ACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAG ATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAG TCCCAGTCCATCACGAGCAGCTGGTT TCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGC ATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCAC AGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGG CATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGG GCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCC TAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGAT ATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTA CCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTG ACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATT TTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAA GTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAG

ACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCT ATGGACTTCAggctccggtgcccgtcagtgggc agagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggg gggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaag gtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtact ggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtat ataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacg ggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggtt cccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgt gccttgaattacttccactggctgcagtacgtgattcttga tcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcga ggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagt tgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcg

Nome Sequência SEQ ID NO: aatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgata agtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacg ctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaag atctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcgg cgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcg aggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcgg acgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgc ctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcg gcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcg gaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagct caaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcg ggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgt cctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgg gcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttgg agtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcga tggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagtt aggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgc cctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagac agtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaCC

ACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCACT GCTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCTCC ACGCAGCAAGGCCGCAGGTTCAACT GGTTCAGAGTGGAGCAGAGGTAAAAA AGCCCGGAGCGTCCGTCAAAGTGTCA TGTAAAGCCTCTGGACTTACTATCGAA GACTACTACATGCACTGGGTGAGGCA GGCGCCTGGCCAAGGTCTCGAGTGG ATGGGTTGGATTGACCCTGAAAATGG AGATACAGAATACGGCCCTAAGTTTC AAGGGCGAGTAACTATGACTCGAGAT ACGTCAATTAATACGGCATACATGGA GTTGTCTCGGCTCCGATCTGATGACA CTGCAGTTTACTATTGTGCCGTCCAC AATGCTCATTACGGGACATGGTTCGC TTACTGGGGGCAAGGGACACTCGTAA CGGTTAGCTCTGGGGGAGGAGGGTC TGGTGGAGGGGGCTCAGGAGGGGGT

Nome Sequência SEQ ID NO:

GGTAGCGACGTAGTAATGACCCAGTC ACCTCTGTCTTTGCCGGTCACGTTGG GCCAGCCTGCATCCATATCCTGCAGA TCCAGCCAGAGCCTCCTGCACAGTAG TGGCAACACGTATTTGGAATGGTACC TGCAGAGGCCGGGTCAAAGTCCAAAA CCGCTGATCTATAAGATATCTACGCG ATTTTCAGGGGTGCCGGACCGATTTA GCGGATCAGGAAGTGGAACCGACTTT ACGCTCAAGATCAGCCGGGTTGAAGC CGAAGATGTCGGCGTTTACTACTGTT TCCAAGGAAGCCACGTACCCTATACG TTTGGTGGCGGCACGAAGGTCGAGAT AAAGAGTGCTGCTGCCTTTGTCCCGG TATTTCTCCCAGCCAAACCGACCACG ACTCCCGCCCCGCGCCCTCCGACAC CCGCTCCCACCATCGCCTCTCAACCT CTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGCCG ACCCGCCGCCGGGGGTGCTGTTCAT ACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTGA TATTTACATTTGGGCTCCGTTGGCGG GTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTCA CTCGTTATTACTTTGTATTGTAATCAC AGGAATCGCAAACGGGGCAGAAAGA AACTCCTGTATATATTCAAACAACCAT TTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAG AGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTT CCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGA ACTGCGAGTGAAGTTTTCCCGAAGCG CAGACGCTCCGGCATATCAGCAAGGA CAGAATCAGCTGTATAACGAACTGAA TTTGGGACGCCGCGAGGAGTATGAC GTGCTTGATAAACGCCGGGGGAGAG ACCCGGAAATGGGGGGTAAACCCCG AAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTCT ACAATGAACTCCAGAAGGATAAGATG GCGGAGGCCTACTCAGAAATAGGTAT

Nome Sequência SEQ ID NO:

GAAGGGCGAACGACGACGGGGAAAA GGTCACGATGGCCTCTACCAAGGGTT GAGTACGGCAACCAAAGATACGTACG ATGCACTGCATATGCAGGCCCTGCCT CCCAGATAATAATAAAATCGCTATCCA TCGAAGATGGATGTGTGTTGGTTTTTT GTGTGTGGAGCAACAAATCTGACTTT GCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAG CATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCC CAGCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGT GCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTC AGGAATGGCCAGGTTCTGCCCAGAG CTCTGGTCAATGATGTCTAAAACTCCT CTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCA TTGCCACCAAAACCCTCTTTTTACTAA GAAACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGT CCAGAGAATGACACGGGAAAAAAGCA GATGAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGG GCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCC AACTGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTT GCTCAGACTGTTTGCCCCTTACTGCT CTTCTAGGCCTCATTCTAAGCCCCTTC TCCAAGTTGCCTCTCCTTATTTCTCCC TGTCTGCCAAAAAATCTTTCCCAGCTC ACTAAGTCAGTCTCACGCAGTCACTC ATTAACCCACCAATCACTGATTGTGCC GGCACATGAATGCACCAGGTGTTGAA GTGGAGGAATTAAAAAGTCAGATGAG GGGTGTGCCCAGAGGAAGCACCATT CTAGTTGGGGGAGCCCATCTGTCAGC TGGGAAAAGTCCAAATAACTTCAGATT GGAATGTGTTTTAACTCAGGGTTGAG AAAACAGCTACCTTCAGGACAAAAGT CAGGGAAGGGCTCTCTGAAGAAATGC TACTTGAAGATACCAGCCCTACCAAG GGCAGGGAGAGGACCCTATAGAGGC CTGGGACAGGAGCTCAATGAGAAAG

Nome Sequência SEQ ID NO:

G CAR de CCACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCA 112 CTX-977 CTGCTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCT 41BB coes- CCACGCAGCAAGGCCGGACGTTGTG tim (nt) ATGACGCAGTCTCCTCTGAGCCTGCC

AGTTACGTTGGGGCAACCCGCATCAA TATCTTGTAGGTCCAGTCAGAGCCTG CTTCACAGCTCTGGCAACACTTACTT GGAATGGTACCTCCAGAGACCTGGAC AGAGTCCCAAGCCATTGATTTACAAG ATTTCAACGCGATTTAGTGGAGTGCC CGATCGATTCTCTGGGAGTGGCTCTG GGACTGATTTCACACTTAAAATAAGTA GGGTGGAGGCTGAAGATGTGGGTGT ATATTATTGTTTTCAAGGGTCCCATGT CCCTTACACTTTCGGCGGCGGCACCA AAGTTGAGATCAAAGGTGGTGGTGGG TCCGGCGGTGGAGGCAGTGGGGGTG GCGGGTCACAAGTTCAACTTGTCCAG TCAGGGGCTGAAGTAAAAAAGCCTGG TGCATCAGTTAAAGTTTCATGTAAGGC TTCCGGCCTTACCATTGAAGATTACTA TATGCACTGGGTTAGACAAGCTCCTG GACAAGGTCTGGAGTGGATGGGCTG GATAGACCCCGAGAATGGTGACACAG AATACGGGCCTAAGTTCCAGGGTAGG GTAACAATGACGCGGGATACATCCAT TTCCACAGCTTACATGGAACTGAGTA GACTCAGATCTGACGACACTGCTGTC TACTATTGTGCCGTCCATAACGCGCA TTATGGCACTTGGTTCGCATATTGGG GGCAAGGCACTCTTGTTACAGTGTCC TCAAGTGCTGCTGCCTTTGTCCCGGT ATTTCTCCCAGCCAAACCGACCACGA CTCCCGCCCCGCGCCCTCCGACACC CGCTCCCACCATCGCCTCTCAACCTC

Nome Sequência SEQ ID NO:

TTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGCCGA CCCGCCGCCGGGGGTGCTGTTCATA CGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTGAT ATTTACATTTGGGCTCCGTTGGCGGG TACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTCAC TCGTTATTACTTTGTATTGTAATCACA GGAATCGCAAACGGGGCAGAAAGAA ACTCCTGTATATATTCAAACAACCATT TATGAGACCAGTACAAACTACTCAAG AGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTT CCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGA ACTGCGAGTGAAGTTTTCCCGAAGCG CAGACGCTCCGGCATATCAGCAAGGA CAGAATCAGCTGTATAACGAACTGAA TTTGGGACGCCGCGAGGAGTATGAC GTGCTTGATAAACGCCGGGGGAGAG ACCCGGAAATGGGGGGTAAACCCCG AAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTCT ACAATGAACTCCAGAAGGATAAGATG GCGGAGGCCTACTCAGAAATAGGTAT GAAGGGCGAACGACGACGGGGAAAA GGTCACGATGGCCTCTACCAAGGGTT GAGTACGGCAACCAAAGATACGTACG ATGCACTGCATATGCAGGCCCTGCCT

CCCAGATAAT CAR de MALPVTALLLPLALLLHAARPDVVMTQS 113 CTX-977 PLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLHSSGN 41BB coes- TYLEWYLQRPGQSPKPLIYKISTRFSGV tim (aa) PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV

Nome Sequência SEQ ID NO:

R CTX-977 GACGTTGTGATGACGCAGTCTCCTCT 114 scFv (nt) GAGCCTGCCAGTTACGTTGGGGCAAC

CCGCATCAATATCTTGTAGGTCCAGT CAGAGCCTGCTTCACAGCTCTGGCAA CACTTACTTGGAATGGTACCTCCAGA GACCTGGACAGAGTCCCAAGCCATTG ATTTACAAGATTTCAACGCGATTTAGT GGAGTGCCCGATCGATTCTCTGGGAG TGGCTCTGGGACTGATTTCACACTTA AAATAAGTAGGGTGGAGGCTGAAGAT GTGGGTGTATATTATTGTTTTCAAGGG TCCCATGTCCCTTACACTTTCGGCGG CGGCACCAAAGTTGAGATCAAAGGTG GTGGTGGGTCCGGCGGTGGAGGCAG TGGGGGTGGCGGGTCACAAGTTCAA CTTGTCCAGTCAGGGGCTGAAGTAAA AAAGCCTGGTGCATCAGTTAAAGTTT CATGTAAGGCTTCCGGCCTTACCATT GAAGATTACTATATGCACTGGGTTAG ACAAGCTCCTGGACAAGGTCTGGAGT GGATGGGCTGGATAGACCCCGAGAA TGGTGACACAGAATACGGGCCTAAGT TCCAGGGTAGGGTAACAATGACGCG GGATACATCCATTTCCACAGCTTACAT GGAACTGAGTAGACTCAGATCTGACG ACACTGCTGTCTACTATTGTGCCGTC CATAACGCGCATTATGGCACTTGGTT

Nome Sequência SEQ ID NO:

CGCATATTGGGGGCAAGGCACTCTTG

TTACAGTGTCCTCA CTX-977 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQ 84 scFv (aa) SLLHSSGNTYLEWYLQRPGQSPKPLIY (ligante KISTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISR sublinhado) VEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTK

QGTLVTVSS CTX-977 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG 98 VH de scFv LTIEDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWID (aa) PENGDTEYGPKFQGRVTMTRDTSISTA

YMELSRLRSDDTAVYYCAVHNAHYGT

WFAYWGQGTLVTVSS CTX-977 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQ 88 VL de scFv SLLHSSGNTYLEWYLQRPGQSPKPLIY (aa) KISTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISR

VEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTK

VEIK CTX-977 GAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTG 115 Doador (nt) CTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGG LHA para TAGTGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGT

Nome Sequência SEQ ID NO:

ACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCACT GCTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCTCC ACGCAGCAAGGCCGGACGTTGTGAT GACGCAGTCTCCTCTGAGCCTGCCAG TTACGTTGGGGCAACCCGCATCAATA TCTTGTAGGTCCAGTCAGAGCCTGCT TCACAGCTCTGGCAACACTTACTTGG AATGGTACCTCCAGAGACCTGGACAG AGTCCCAAGCCATTGATTTACAAGATT TCAACGCGATTTAGTGGAGTGCCCGA TCGATTCTCTGGGAGTGGCTCTGGGA CTGATTTCACACTTAAAATAAGTAGGG TGGAGGCTGAAGATGTGGGTGTATAT TATTGTTTTCAAGGGTCCCATGTCCCT TACACTTTCGGCGGCGGCACCAAAGT TGAGATCAAAGGTGGTGGTGGGTCC GGCGGTGGAGGCAGTGGGGGTGGC GGGTCACAAGTTCAACTTGTCCAGTC AGGGGCTGAAGTAAAAAAGCCTGGTG CATCAGTTAAAGTTTCATGTAAGGCTT CCGGCCTTACCATTGAAGATTACTATA TGCACTGGGTTAGACAAGCTCCTGGA CAAGGTCTGGAGTGGATGGGCTGGA TAGACCCCGAGAATGGTGACACAGAA TACGGGCCTAAGTTCCAGGGTAGGGT AACAATGACGCGGGATACATCCATTT CCACAGCTTACATGGAACTGAGTAGA

Nome Sequência SEQ ID NO:

CTCAGATCTGACGACACTGCTGTCTA CTATTGTGCCGTCCATAACGCGCATT ATGGCACTTGGTTCGCATATTGGGGG CAAGGCACTCTTGTTACAGTGTCCTC AAGTGCTGCTGCCTTTGTCCCGGTAT TTCTCCCAGCCAAACCGACCACGACT CCCGCCCCGCGCCCTCCGACACCCG CTCCCACCATCGCCTCTCAACCTCTT AGTCTTCGCCCCGAGGCATGCCGAC CCGCCGCCGGGGGTGCTGTTCATAC GAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTGATA TTTACATTTGGGCTCCGTTGGCGGGT ACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTCACT CGTTATTACTTTGTATTGTAATCACAG GAATCGCAAACGGGGCAGAAAGAAAC TCCTGTATATATTCAAACAACCATTTA TGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAG GAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCC AGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAAC TGCGAGTGAAGTTTTCCCGAAGCGCA GACGCTCCGGCATATCAGCAAGGACA GAATCAGCTGTATAACGAACTGAATTT GGGACGCCGCGAGGAGTATGACGTG CTTGATAAACGCCGGGGGAGAGACC CGGAAATGGGGGGTAAACCCCGAAG AAAGAATCCCCAAGAAGGACTCTACA ATGAACTCCAGAAGGATAAGATGGCG GAGGCCTACTCAGAAATAGGTATGAA GGGCGAACGACGACGGGGAAAAGGT CACGATGGCCTCTACCAAGGGTTGAG TACGGCAACCAAAGATACGTACGATG CACTGCATATGCAGGCCCTGCCTCCC AGATAATAATAAAATCGCTATCCATCG AAGATGGATGTGTGTTGGTTTTTTGTG TGTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCA TGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCAT TATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCA

Nome Sequência SEQ ID NO:

GCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGC CTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTCAG GAATGGCCAGGTTCTGCCCAGAGCTC TGGTCAATGATGTCTAAAACTCCTCTG ATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCATTG CCACCAAAACCCTCTTTTTACTAAGAA ACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGTCCA GAGAATGACACGGGAAAAAAGCAGAT GAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGGGCA CGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCCAAC TGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTTGCT CAGACTGTTTGCCCCTTACTGCTCTTC TAGGCCTCATTCTAAGCCCCTTCTCC AAGTTGCCTCTCCTTATTTCTCCCTGT CTGCCAAAAAATCTTTCCCAGCTCACT AAGTCAGTCTCACGCAGTCACTCATT AACCCACCAATCACTGATTGTGCCGG CACATGAATGCACCAGGTGTTGAAGT GGAGGAATTAAAAAGTCAGATGAGGG GTGTGCCCAGAGGAAGCACCATTCTA GTTGGGGGAGCCCATCTGTCAGCTG GGAAAAGTCCAAATAACTTCAGATTG GAATGTGTTTTAACTCAGGGTTGAGA AAACAGCTACCTTCAGGACAAAAGTC AGGGAAGGGCTCTCTGAAGAAATGCT ACTTGAAGATACCAGCCCTACCAAGG GCAGGGAGAGGACCCTATAGAGGCC

TGGGACAGGAGCTCAATGAGAAAGG CAR de CCACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCA 116 CTX-978 CTGCTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCT 41BB coes- CCACGCAGCAAGGCCGCAGGTACAA tim (nt) CTCGTTCAGAGCGGTGCAGAGGTTAA

GAAACCGGGCGCCAGTGTCAAAGTAT CATGCAAGGCGAGTGGTCTGACCATC GAAGATTATTATATGCATTGGGTGAGA CAAGCACCGGGGCAGGGGCTCGAAT

Nome Sequência SEQ ID NO:

GGATGGGTTGGATCGACCCCGAAAAT GGTGATACGGAGTATGGCCCGAAATT TCAGGGTCGGGTCACGATGACCCGC GATACAAGCATCAGTACTGCATACAT GGAGCTCTCTCGCTTGCGGAGTGATG ATACCGCCGTTTATTATTGCGCGGTT CACAACGCTCATTATGGCACTTGGTT CGCGTATTGGGGCCAAGGAACACTG GTTACAGTGAGCAGTGGAGGGGGTG GCTCTGGTGGCGGCGGGAGCGGCG GAGGGGGCAGTGATGTTGTGATGACA CAGTCACCCCTGAGTCTCCCGGTCAC TCTTGGGCAACCAGCCAGCATAAGCT GTCGCAGTTCTCAGAGCTTGCTCCAT AGCTCCGGGAATACCTACCTCGAATG GTATCTCCAAAGACCCGGTCAATCTC CAAAGCCTTTGATTTACAAGATTAGTA CACGATTTAGTGGGGTCCCAGATAGA TTTTCAGGTAGTGGATCTGGTACAGA TTTCACATTGAAAATATCACGCGTCGA GGCGGAGGATGTCGGGGTCTACTATT GCTTTCAAGGTAGTCACGTGCCCTAC ACGTTTGGTGGCGGTACGAAGGTCGA AATCAAGAGTGCTGCTGCCTTTGTCC CGGTATTTCTCCCAGCCAAACCGACC ACGACTCCCGCCCCGCGCCCTCCGA CACCCGCTCCCACCATCGCCTCTCAA CCTCTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATG CCGACCCGCCGCCGGGGGTGCTGTT CATACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTG TGATATTTACATTTGGGCTCCGTTGGC GGGTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGT CACTCGTTATTACTTTGTATTGTAATC ACAGGAATCGCAAACGGGGCAGAAA GAAACTCCTGTATATATTCAAACAACC ATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCA AGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGAT

Nome Sequência SEQ ID NO:

TCCCAGATAAT CAR de MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQS 117 CTX-978 GAEVKKPGASVKVSCKASGLTIEDYYM 41BB coes- HWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTE tim (aa) YGPKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRL

HDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CTX-978 CAGGTACAACTCGTTCAGAGCGGTGC 118 scFv (nt) AGAGGTTAAGAAACCGGGCGCCAGT

Nome Sequência SEQ ID NO:

GTCAAAGTATCATGCAAGGCGAGTGG TCTGACCATCGAAGATTATTATATGCA TTGGGTGAGACAAGCACCGGGGCAG GGGCTCGAATGGATGGGTTGGATCG ACCCCGAAAATGGTGATACGGAGTAT GGCCCGAAATTTCAGGGTCGGGTCAC GATGACCCGCGATACAAGCATCAGTA CTGCATACATGGAGCTCTCTCGCTTG CGGAGTGATGATACCGCCGTTTATTA TTGCGCGGTTCACAACGCTCATTATG GCACTTGGTTCGCGTATTGGGGCCAA GGAACACTGGTTACAGTGAGCAGTGG AGGGGGTGGCTCTGGTGGCGGCGGG AGCGGCGGAGGGGGCAGTGATGTTG TGATGACACAGTCACCCCTGAGTCTC CCGGTCACTCTTGGGCAACCAGCCAG CATAAGCTGTCGCAGTTCTCAGAGCT TGCTCCATAGCTCCGGGAATACCTAC CTCGAATGGTATCTCCAAAGACCCGG TCAATCTCCAAAGCCTTTGATTTACAA GATTAGTACACGATTTAGTGGGGTCC CAGATAGATTTTCAGGTAGTGGATCT GGTACAGATTTCACATTGAAAATATCA CGCGTCGAGGCGGAGGATGTCGGGG TCTACTATTGCTTTCAAGGTAGTCACG TGCCCTACACGTTTGGTGGCGGTACG

AAGGTCGAAATCAAG CTX-978 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG 87 scFv (aa) LTIEDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWID (ligante PENGDTEYGPKFQGRVTMTRDTSISTA sublinhado) YMELSRLRSDDTAVYYCAVHNAHYGT

Nome Sequência SEQ ID NO:

GGGTKVEIK CTX-978 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG 98 VH de scFv LTIEDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWID (aa) PENGDTEYGPKFQGRVTMTRDTSISTA

YMELSRLRSDDTAVYYCAVHNAHYGT

WFAYWGQGTLVTVSS CTX-978 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQ 88 VL de scFv SLLHSSGNTYLEWYLQRPGQSPKPLIY (aa) KISTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISR

VEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTK

VEIK CTX-978 GAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTG 119 Doador (nt) CTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGG LHA para TAGTGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGT

RHA TCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATC AATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAATG TGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAAC ATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAAT GCCCAGCCTAAGTTGGGGAGACCACT CCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTT TGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTGCC TTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGG GGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAA AAGAATAAGCAGTATTATTAAGTAGCC CTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGC AGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGTTC ACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAG ATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAG TCCCAGTCCATCACGAGCAGCTGGTT TCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGC ATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCAC AGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGG CATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGG GCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCC TAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGAT ATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTA

Nome Sequência SEQ ID NO:

CCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTG ACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATT TTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAA GTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAG

ACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCACT

Nome Sequência SEQ ID NO:

GCTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCTCC ACGCAGCAAGGCCGCAGGTACAACT CGTTCAGAGCGGTGCAGAGGTTAAGA AACCGGGCGCCAGTGTCAAAGTATCA TGCAAGGCGAGTGGTCTGACCATCGA AGATTATTATATGCATTGGGTGAGACA AGCACCGGGGCAGGGGCTCGAATGG ATGGGTTGGATCGACCCCGAAAATGG TGATACGGAGTATGGCCCGAAATTTC AGGGTCGGGTCACGATGACCCGCGA TACAAGCATCAGTACTGCATACATGG AGCTCTCTCGCTTGCGGAGTGATGAT ACCGCCGTTTATTATTGCGCGGTTCA CAACGCTCATTATGGCACTTGGTTCG CGTATTGGGGCCAAGGAACACTGGTT ACAGTGAGCAGTGGAGGGGGTGGCT CTGGTGGCGGCGGGAGCGGCGGAG GGGGCAGTGATGTTGTGATGACACAG TCACCCCTGAGTCTCCCGGTCACTCT TGGGCAACCAGCCAGCATAAGCTGTC GCAGTTCTCAGAGCTTGCTCCATAGC TCCGGGAATACCTACCTCGAATGGTA TCTCCAAAGACCCGGTCAATCTCCAA AGCCTTTGATTTACAAGATTAGTACAC GATTTAGTGGGGTCCCAGATAGATTT TCAGGTAGTGGATCTGGTACAGATTT CACATTGAAAATATCACGCGTCGAGG CGGAGGATGTCGGGGTCTACTATTGC TTTCAAGGTAGTCACGTGCCCTACAC GTTTGGTGGCGGTACGAAGGTCGAAA TCAAGAGTGCTGCTGCCTTTGTCCCG GTATTTCTCCCAGCCAAACCGACCAC GACTCCCGCCCCGCGCCCTCCGACA CCCGCTCCCACCATCGCCTCTCAACC TCTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGCC GACCCGCCGCCGGGGGTGCTGTTCA TACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTG

Nome Sequência SEQ ID NO:

ATATTTACATTTGGGCTCCGTTGGCG GGTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTC ACTCGTTATTACTTTGTATTGTAATCA CAGGAATCGCAAACGGGGCAGAAAG AAACTCCTGTATATATTCAAACAACCA TTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAA GAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATT TCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTG AACTGCGAGTGAAGTTTTCCCGAAGC GCAGACGCTCCGGCATATCAGCAAG GACAGAATCAGCTGTATAACGAACTG AATTTGGGACGCCGCGAGGAGTATGA CGTGCTTGATAAACGCCGGGGGAGA GACCCGGAAATGGGGGGTAAACCCC GAAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTC TACAATGAACTCCAGAAGGATAAGAT GGCGGAGGCCTACTCAGAAATAGGTA TGAAGGGCGAACGACGACGGGGAAA AGGTCACGATGGCCTCTACCAAGGGT TGAGTACGGCAACCAAAGATACGTAC GATGCACTGCATATGCAGGCCCTGCC TCCCAGATAATAATAAAATCGCTATCC ATCGAAGATGGATGTGTGTTGGTTTTT TGTGTGTGGAGCAACAAATCTGACTT TGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACA GCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCC CCAGCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGT GCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTC AGGAATGGCCAGGTTCTGCCCAGAG CTCTGGTCAATGATGTCTAAAACTCCT CTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCA TTGCCACCAAAACCCTCTTTTTACTAA GAAACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGT CCAGAGAATGACACGGGAAAAAAGCA GATGAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGG GCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCC AACTGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTT

Nome Sequência SEQ ID NO:

GCTCAGACTGTTTGCCCCTTACTGCT CTTCTAGGCCTCATTCTAAGCCCCTTC TCCAAGTTGCCTCTCCTTATTTCTCCC TGTCTGCCAAAAAATCTTTCCCAGCTC ACTAAGTCAGTCTCACGCAGTCACTC ATTAACCCACCAATCACTGATTGTGCC GGCACATGAATGCACCAGGTGTTGAA GTGGAGGAATTAAAAAGTCAGATGAG GGGTGTGCCCAGAGGAAGCACCATT CTAGTTGGGGGAGCCCATCTGTCAGC TGGGAAAAGTCCAAATAACTTCAGATT GGAATGTGTTTTAACTCAGGGTTGAG AAAACAGCTACCTTCAGGACAAAAGT CAGGGAAGGGCTCTCTGAAGAAATGC TACTTGAAGATACCAGCCCTACCAAG GGCAGGGAGAGGACCCTATAGAGGC CTGGGACAGGAGCTCAATGAGAAAG

G CAR de MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQS 68 CTX-979 GAEVKKPGASVKVSCKASGLTIEDYYM 41BB coes- HWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTE tim (aa) YGPKFQGRVTMTRDTSINTAYMELSRL

RSDDTAVYYCAVHNAHYGTWFAYWGQ GTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDV VMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLL HSSGNTYLEWYQQRPGQSPRPLIYKIS TRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEI KSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAP TIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGL DFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC NHRNRKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTT QEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSR SADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEY DVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL YNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGK

Nome Sequência SEQ ID NO:

GHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP

R CAR de MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQS 66 CTX-979b GAEVKKPGASVKVSCKASGLTIEDYYM CD28 coes- HWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTE tim (aa) YGPKFQGRVTMTRDTSINTAYMELSRL

RSDDTAVYYCAVHNAHYGTWFAYWGQ GTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDV VMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLL HSSGNTYLEWYQQRPGQSPRPLIYKIS TRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEI KSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAP TIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGL DFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC NHRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGP TRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSA DAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDV LDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYN ELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGH

DGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CTX-979 e QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG 70 CTX-979b LTIEDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWID scFv (aa) PENGDTEYGPKFQGRVTMTRDTSINTA (ligante YMELSRLRSDDTAVYYCAVHNAHYGT sublinhado) WFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS

GGGGSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASIS CRSSQSLLHSSGNTYLEWYQQRPGQS PRPLIYKISTRFSGVPDRFSGSGSGTDF TLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTF

GGGTKVEIK CTX-979 e QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG 55 CTX-979b LTIEDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWID VH de scFv PENGDTEYGPKFQGRVTMTRDTSINTA (aa) CDRs - YMELSRLRSDDTAVYYCAVHNAHYGT em negrito WFAYWGQGTLVTVSS

Nome Sequência SEQ ID NO: CTX-979 e DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQ 56 CTX-979b SLLHSSGNTYLEWYQQRPGQSPRPLIY VL de scFv KISTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISR (aa) CDRs - VEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTK em negrito VEIK

[00259] Todas as referências, patentes e pedidos de patentes reve- lados no presente documento são incorporados a título de referência no que diz respeito à matéria para a qual cada um é citado, o que em alguns casos pode englobar a totalidade do documento.

[00260] Os artigos indefinidos "um" e "uma", como usados aqui no relatório descritivo e nas reivindicações, a não ser que claramente in- dicado em contrário, devem ser entendidos como significando "pelo menos um(a)".

[00261] Deve ser também entendido que, a não ser que claramente indicado em contrário, em quaisquer métodos reivindicados no presen- te documento que incluam mais do que uma etapa ou ação, a ordem dos passos ou atos do método não está necessariamente limitada à ordem na qual os passos ou atos do método são recitados.

[00262] Nas reivindicações, bem como no relatório descritivo acima, todas as frases de transição tais como "que compreende", "que inclui", "que porta", "que tem", "que contém", "que envolve", "que mantém", "composto por" e similares são para serem entendidas como sendo abertas, isto é, como significando que inclui mas não se limitando a. Somente as frases transicionais "que consiste em" e "que consiste es- sencialmente em" deverão ser frases transicionais fechadas ou semi- fechadas, respectivamente, como apresentado no Manual do Escritório de Patentes de Procedimentos de Examinação de Patente dos EUA, Seção 2111.03.

[00263] Os termos "cerca de" e "substancialmente" precedendo um valor numérico significam ±10% do valor numérico recitado.

[00264] Onde uma faixa de valores é fornecida, cada valor entre as extremidades superior e inferior da faixa é especificamente contem- plado e descrito no presente documento.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Célula T manipulada, caracterizada pelo fato de que compreende um ácido nucleico codificando um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que o CAR compreende um ectodomínio que se liga especificamente a LIV1.

2. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um gene da região constante de cadeia alfa do receptor de células T (TRAC) interrompido.

3. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um gene beta-2-microglobulina (β2M) interrompido.

4. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o ectodomínio do CAR compreende um anticorpo anti-LIV1.

5. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-LIV1 é um fragmento variável de cadeia única (scFv) anti-LIV1.

6. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-LIV1 compreende as mes- mas regiões determinantes da complementaridade (CDRs) do domínio variável de cadeia pesada (VH) e as mesmas CDRs do domínio variá- vel de cadeia leve (VL) que um anticorpo de referência, em que o anti- corpo de referência compreende (i) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 55 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 56 ou (ii) um VH es- tabelecido como SEQ ID NO: 90 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 88.

7. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-LIV1 compreende as mes- mas cadeias de VH e VL que o anticorpo de referência.

8. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-LIV1 compreende a se- quência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 54, 70, 83 ou 86.

9. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o CAR compreen- de adicionalmente um domínio coestimulador CD28 ou um domínio coestimulador 41BB.

10. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o CAR compreende adicionalmente um domínio de sinalização citoplasmático CD3ζ.

11. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o CAR é codifi- cado pela sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 49, 51, 104 ou 108 ou uma sequência de nucleotídeos que com- preende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 90% idêntica às SEQ ID NOs: 49, 51, 104 ou 108.

12. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o CAR é inserido no gene TRAC interrompido.

13. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 12, caracterizada pelo fato de que o gene TRAC interrompido compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 63, 64, 107 ou 111 e/ou a sequência de nu- cleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 49, 51, 104 ou 108.

14. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 13, caracterizada pelo fato de que o gene β2M inter- rompido compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos se- lecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 9 a 14.

15. Célula T manipulada, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) um gene TRAC interrompido; (i) um gene β2M interrompido; e (iii) um ácido nucleico que codifica um CAR que compre- ende um fragmento de ligação ao antígeno anti-LIV1.

16. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o CAR compreende (a) um ectodomínio que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti-LIV1, (b) um domínio transmembranar CD8 e (c) um endodomínio que compre- ende um domínio coestimulador 41BB e um domínio de sinalização citoplasmático CD3ζ.

17. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizada pelo fato de que o gene TRAC interrompido com- preende o ácido nucleico que codifica o CAR.

18. Célula T manipulada, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC inter- rompido compreende um ácido nucleico codificando um CAR compre- endendo (a) um ectodomínio que compreende um fragmento de liga- ção ao antígeno anti-LIV1, (b) um domínio transmembranar CD8 e (c) um endodomínio que compreende um domínio coestimulador 41BB e um domínio de sinalização citoplasmático CD3ζ; e (ii) um gene β2M interrompido.

19. Célula T manipulada, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC inter- rompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 50, 52, 105, 109, 68 ou 66; e (ii) um gene β2M interrompido.

20. Célula T manipulada, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC inter- rompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR, em que a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 90% idêntica às SEQ ID NOs: 49, 51, 104 ou 108 e/ou codifica um CAR que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 50, 52, 105, 109, 68 ou 66; e (ii) um gene β2M interrompido.

21. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que a célula T é uma célula T humana.

22. População de células, caracterizada pelo fato de que compreende as células T manipuladas, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, em que pelo menos 15% ou pelo me- nos 50% das células T manipuladas da população expressam o CAR.

23. População, de acordo com a reivindicação 22, caracte- rizada pelo fato de que pelo menos 30% das células T manipuladas da população expressam o CAR.

24. População, de acordo com a reivindicação 22, caracte- rizada pelo fato de que pelo menos 70% das células T manipuladas da população expressam o CAR.

25. População, de acordo com a reivindicação 22, caracte- rizada pelo fato de que pelo menos 25% das células T manipuladas da população expressam o CAR após pelo menos 7 dias ou pelo menos 14 dias de proliferação in vitro.

26. População, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 22 a 25, caracterizada pelo fato de que pelo menos 50% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectá- vel de proteína do receptor de células T (TCR).

27. População, de acordo com a reivindicação 26, caracte- rizada pelo fato de que pelo menos 90% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectável de proteína TCR.

28. População, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 22 a 27, caracterizada pelo fato de que pelo menos 50% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectá- vel de proteína β2M.

29. População, de acordo com a reivindicação 28, caracte- rizada pelo fato de que pelo menos 70% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectável de proteína β2M.

30. População, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 22 a 29, caracterizada pelo fato de que as células T manipula- das da população, quando cocultivadas in vitro com uma população de células cancerosas que expressam LIV1, induzem a lise celular de pe- lo menos 10%, pelo menos 25% ou pelo menos 50% das células can- cerosas da população.

31. População, de acordo com a reivindicação 30, caracte- rizada pelo fato de que as células T manipuladas da população, quan- do cocultivadas in vitro com uma população de células cancerosas que expressam LIV1, induzem a lise celular de pelo menos 70%, pelo me- nos 80% ou pelo menos 90% da população de células cancerosas.

32. População, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, caracterizada pelo fato de que as células T manipuladas da população, quando cocultivadas in vitro com uma população de células cancero- sas, secretam IFNγ.

33. População, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 30 a 32, caracterizada pelo fato de que a razão entre células T manipuladas e células cancerosas é 1:1 a 2:1.

34. População, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 30 a 33, caracterizada pelo fato de que as células cancerosas compreendem células de sarcoma.

35. População, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 30 a 33, caracterizada pelo fato de que as células cancerosas compreendem células de câncer de mama.

36. População, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 22 a 35, caracterizada pelo fato de que, quando administrada in vivo a um indivíduo, não induz toxicidade no indivíduo.

37. População de células, caracterizada pelo fato de que compreende células T manipuladas em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrompido; (i) um gene β2M interrompido; e (iii) um ácido nucleico que codifica um CAR que compre- ende um fragmento de ligação ao antígeno anti-LIV1.

38. População de células, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que o CAR compreende (a) um ectodo- mínio que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti- LIV1, (b) um domínio transmembranar CD8 e (c) um endodomínio que compreende um domínio coestimulador 41BB e um domínio de sinali- zação citoplasmático CD3ζ.

39. População de células, de acordo com a reivindicação 37 ou 38, caracterizada pelo fato de que o gene TRAC interrompido com- preende o ácido nucleico que codifica o CAR.

40. População de células que compreende células T mani- puladas, caracterizada pelo fato de que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC inter- rompido compreende um ácido nucleico codificando um CAR compre- endendo (a) um ectodomínio que compreende um fragmento de liga- ção ao antígeno anti-LIV1, (b) um domínio transmembranar CD8 e (c)

um endodomínio que compreende um domínio coestimulador 41BB e um domínio de sinalização citoplasmático CD3ζ; e (ii) um gene β2M interrompido.

41. População de células que compreende células T mani- puladas, caracterizada pelo fato de que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC inter- rompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR, em que a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 90% idêntica às SEQ ID NOs: 49, 51, 104 ou 108 e/ou codifica o CAR de SEQ ID NOs: 50, 52, 105, 109, 68 ou 66; e (ii) um gene β2M interrompido.

42. Método, caracterizado pelo fato de que compreende a administração da população de células T manipuladas, como definida em qualquer uma das reivindicações 22 a 41, a um indivíduo.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracteriza- do pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.

44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracteriza- do pelo fato de que o indivíduo tem um câncer.

45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracteriza- do pelo fato de que o câncer é selecionado dentre o grupo que consis- te em: câncer de mama, por exemplo, câncer de mama positivo de re- ceptor de estrogênio, câncer de próstata, tumores escamosos, por exemplo, da pele, bexiga, pulmão, colo uterino, endométrio, cabeça e pescoço e trato biliar e/ou tumores neuronais.

46. Método, de acordo com a reivindicação 44 ou 45, carac- terizado pelo fato de que o câncer compreende células cancerosas que expressam LIV1.

47. Método para produção de uma célula T manipulada, caracterizado pelo fato de que compreende

(a) distribuir a uma célula T (i) uma nuclease guiada por RNA, (ii) um gRNA que alveja um gene TRAC e (iii) um vetor que compreende um modelo doador que com- preende um ácido nucleico que codifica um CAR que compreende um ectodomínio que se liga especificamente a LIV1; e (b) produzir uma célula T manipulada que tem um gene TRAC interrompido e que expressa o CAR.

48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracteriza- do pelo fato de que o gRNA que alveja o gene TRAC compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 18 ou 19 ou alveja a se- quência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40.

49. Método, de acordo com a reivindicação 47 ou 48, carac- terizado pelo fato de que compreende adicionalmente entregar à célula T um gRNA que alveja o gene β2M.

50. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracteriza- do pelo fato de que o gRNA que alveja o gene β2M compreende a se- quência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 20 ou 21 ou alveja a sequên- cia de nucleotídeos de SEQ ID NO: 41.

51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 47 a 50, caracterizado pelo fato de que o ectodomínio do CAR é um anticorpo anti-LIV1.

52. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracteriza- do pelo fato de que o anticorpo anti-LIV1 é um fragmento variável de cadeia única (scFv) anti-LIV1.

53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracteriza- do pelo fato de que o scFv anti-LIV1 compreende as mesmas regiões determinantes da complementaridade (CDRs) do domínio variável de cadeia pesada (VH) e as mesmas CDRs do domínio variável de cadeia leve (VL) que um anticorpo de referência, em que o anticorpo de refe-

rência compreende (i) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 55 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 56 ou (ii) um VH estabelecido co- mo SEQ ID NO: 90 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 88.

54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracteriza- do pelo fato de que o scFv anti-LIV1 compreende as mesmas cadeias de VH e VL que o anticorpo de referência.

55. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracteriza- do pelo fato de que o scFv anti-LIV1 compreende a sequência de ami- noácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 54, 83, 86 ou 70.

56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 47 a 55, caracterizado pelo fato de que o CAR compreende ainda um domínio coestimulador CD28 ou um domínio coestimulador 41BB.

57. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracteriza- do pelo fato de que o CAR compreende adicionalmente um domínio de sinalização citoplasmático CD3ζ.

58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 47 a 57, caracterizado pelo fato de que o CAR é codificado por uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 49, 51, 104 ou 108 ou uma sequência de nucleotídeos que compreen- de uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 90% idêntica às SEQ ID NOs: 49, 51, 104 ou 108.

59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 47 a 58, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codi- fica o CAR é flanqueado pelos braços de homologia esquerdo e direito do gene TRAC.

60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 47 a 59, caracterizado pelo fato de que o modelo de doador compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 63, 64, 107 ou 111.

61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-

ções 47 a 60, caracterizado pelo fato de que a nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cas9, opcionalmente uma nuclease Cas9 de S. pyogenes.

62. Célula T manipulada caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método, como definido em qualquer uma das reivindi- cações 47 a 61.

63. População de células caracterizada pelo fato de que compreende a célula T manipulada, como definida na reivindicação 62.

64. Método para tratar o câncer em um indivíduo, caracteri- zado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo da população de células, como definida em qualquer uma das reivindica- ções 22 a 41 ou 63.

65. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracteriza- do pelo fato de que o câncer é selecionado a partir do grupo que con- siste em: câncer pancreático, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer uterino, câncer de mama, câncer de próstata, câncer testicular, câncer de tireoide, câncer nasofaríngeo, câncer de pulmão de células não pe- quenas (NSCLC), glioblastoma, tumor neuronal, sarcomas de tecidos moles, leucemia, linfoma, melanoma, câncer de cólon, adenocarcino- ma de cólon, glioblastoma cerebral, carcinoma hepatocelular, hepato- colangiocarcinoma hepático, osteossarcoma, carcinoma de células es- camosas de esôfago, câncer de pâncreas em estágio avançado, ade- nocarcinoma de pulmão, carcinoma de células escamosas do pulmão, câncer de pulmão de células pequenas, carcinoma renal e câncer biliar intra-hepático.

66. Método, de acordo com a reivindicação 64 ou 65, carac- terizado pelo fato de que o câncer compreende células cancerosas que expressam LIV1.