BR112021007254A2 - composição nutricional para lactentes ou crianças de primeira infância - Google Patents

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Ingrid Brunhilde RENES
Selma Paulien Wiertsema
Gabriël Thomassen
Saskia Adriana Overbeek
Kaouther Ben Amor
Saskia Braber
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Abstract

COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL PARA LACTENTES OU CRIANÇAS DE PRIMEIRA INFÂNCIA. A invenção refere-se a uma composição nutricional para lactentes ou crianças de primeira infância, que compreende 2?-fucosil-lactose, butirato dietético e, opcionalmente, 3?-galactosil-lactose.

Description

COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL PARA LACTENTES OU CRIANÇAS DE
PRIMEIRA INFÂNCIA Campo da Invenção
[001] A presente invenção refere-se ao campo de fórmula infantil e para criança de primeira infância e à melhora da saúde intestinal. Antecedentes da Invenção
[002] O leite humano é o alimento preferencial para lactentes. O leite humano fornece vários fatores bioativos que beneficiam o sistema imune relativamente imaturo e a saúde intestinal de neonatos no início de vida. Lactentes alimentados com leite humano têm uma menor incidência de infecções do que lactentes alimentados com fórmula. Acredita-se que muitos dos componentes no leite humano, incluindo imunoglobulinas (como sIgA), interleucina (IL)-1, IL-6, IL-8, IL-10, interferon-γ (IFN-γ), células imunocompetentes, fator de crescimento transformador-β (TGF-β), lactoferrina, nucleotídeos e oligossacarídeos do leite humano (HMOs) desempenhem uma função na proteção contra a infecção por patógenos. Além disso, a maturação intestinal e o desenvolvimento da microbiota em lactentes alimentados com leite humano é considerada ideal.
[003] No entanto, nem sempre é possível ou desejável amamentar um lactente. Nesses casos, as fórmulas infantis ou as fórmulas de seguimento são uma boa alternativa. Essas fórmulas devem ter uma ótima composição a fim de imitar os efeitos benéficos do leite humano o mais próximo possível.
[004] O documento WO 2005/122790 divulga um método para estimular a integridade da barreira pela administração de uma composição que compreende ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosahexaenoico (DHA) e ácido araquidônico (ARA), e pelo menos dois oligossacarídeos distintos. Os oligossacarídeos atuam indiretamente por serem fermentados para ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) pela microbiota intestinal.
[005] O documento WO 2016/013935 divulga o uso de um oligossacarídeo não digerível na fabricação de uma composição para fornecer nutrição para um lactente que sofre de um risco aumentado de alergia alimentar. O lactente preferencialmente está em risco aumentado de exposição à micotoxina tricoteceno, por exemplo, por comer muito cereal. Nos Exemplos, VivinalGOS é a fonte de galacto-oligossacarídeos.
[006] O documento WO 2006/115412 refere-se a uma composição líquida nutricional para melhorar a função da barreira intestinal e para prevenir alergia. A composição compreende lipídeos com cadeias acila de ácido graxo de cadeia curta e sacarídeos não digeríveis, fermentáveis.
[007] O documento WO 2004/112509 divulga uma composição para induzir um padrão de maturação da barreira intestinal similar àquela observada com a amamentação. A composição ajuda a melhorar a maturação da barreira intestinal, por exemplo, durante o estresse neonatal. É divulgado que a separação materna em ratos aumenta a permeabilidade intestinal e que uma blenda contendo LC-PUFA, Lactobacillus paracasei e oligossacarídeos não digeríveis pode restaurar a permeabilidade intestinal para níveis normais.
[008] Ainda há necessidade de melhorar as fórmulas infantis e composições para crianças de primeira infância para que se aproximem do leite humano na estrutura e função. Descrição Resumida da Invenção
[009] Os inventores descobriram que uma combinação dos ingredientes nutricionais, 2’-FL e ácido butírico dietético, tem um efeito benéfico na função da barreira intestinal. Também, descobriu-se que a resposta do sistema imune e da microbiota são diferentes quando ambos, 2’-FL e ácido butírico dietético estão presentes, em comparação com quando apenas um desses ingredientes está presente. Demonstrou-se que a mistura e 2’-FL e ácido butírico dietético tem um efeito benéfico na expressão de fosfatase alcalina, o que é indicativo de uma melhor maturação e função da barreira intestinal e uma melhor defesa contra bactérias patogênicas intestinais. Esses efeitos foram ainda melhorados pela presença de 3’-GL. Então, uma composição nutricional que compreende tanto ácido butírico dietético como 2’-FL e, de preferência,
adicionalmente 3’-GL, terá efeitos melhorados na saúde para lactentes e crianças de primeira infância. Lista de Realizações
[010] 1 Uma composição nutricional para lactentes ou crianças de primeira infância, que compreende: a. 2’-fucosil-lactose, e b. butirato dietético.
[011] 2 A composição nutricional de acordo com a realização 1, que compreende ainda 3’-galactosil-lactose.
[012] 3 A composição nutricional de acordo com qualquer uma das realizações anteriores, sendo que a composição é pelo menos parcialmente fermentada por bactérias produtoras de ácido láctico e compreende de 0,1 a 1,5%, em peso, da soma de ácido láctico e lactato, com base no peso seco da composição nutricional, e em que pelo menos 90%, em peso, da soma de ácido láctico e lactato é ácido L-láctico e L-lactato.
[013] 3 A composição nutricional de acordo com qualquer uma das realizações anteriores, sendo que a composição compreende ainda LC-PUFA selecionado a partir do grupo dentre DHA, ARA e EPA, preferencialmente DHA e EPA, preferencialmente DHA, EPA e ARA, em que a composição nutricional compreende preferencialmente pelo menos 1%, em peso, da soma de DHA, ARA e EPA, com base no teor total de ácidos graxos.
[014] 4 A composição nutricional de acordo com qualquer uma das realizações anteriores, em que a fórmula compreende ainda galacto- oligossacarídeos e/ou fruto-oligossacarídeos.
[015] 5 A composição nutricional de acordo com qualquer uma das realizações anteriores, sendo que a composição nutricional é selecionada a partir do grupo que consiste em uma fórmula infantil, uma fórmula de seguimento ou uma fórmula para criança de primeira infância, preferencialmente uma fórmula infantil.
[016] 6 A composição nutricional, de acordo com qualquer uma das realizações anteriores, sendo que a composição compreende (i) 0,02 a 1 g de 2’-FL por 100 mL da composição nutricional; (ii) 0,15 a 7,5%, em peso, com base no peso seco; e/ou (iii) 0,03 a 1,5 g por 100 kcal.
[017] 7 A composição nutricional de acordo com qualquer uma das realizações anteriores, sendo que a composição nutricional compreende (i) 0,010 a 0,250 g de 3’-GL por 100 mL; (ii) 0,075 a 2%, em peso, com base no peso seco; e/ou (iii) 0,015 a 0,4 g por 100 kcal.
[018] 8 A composição nutricional de acordo com qualquer uma das realizações anteriores, sendo que a composição nutricional compreende (i) 0,3 a 5%, em peso, de ácido butírico dietético, com base no teor total de ácidos graxos; (ii) 10 mg a 175 mg por 100 mL; (iii) 15 a 250 mg por 100 kcal; e/ou (iv) 0,075 a 1,3%, em peso, com base no peso seco da composição nutricional.
[019] 9 A composição nutricional de acordo com qualquer uma das realizações anteriores, sendo que a composição nutricional compreende (i) 0,2 a 5 g, da soma de galacto-oligossacarídeos e fruto-oligossacarídeos por 100 mL; e/ou (ii) 0,3 a 7,5 g por 100 kcal, 1,5 a 35%, em peso, com base no peso seco.
[020] 10 A composição nutricional de acordo com quaisquer das realizações anteriores, para uso na melhora da função da barreira intestinal e/ou para uso na melhora do sistema imune e/ou para uso na melhora da microbiota intestinal e/ou para uso no tratamento ou na prevenção de infecções.
[021] 11 A composição nutricional de acordo com quaisquer das realizações anteriores, para uso no tratamento ou na prevenção de alergia, preferencialmente para uso na indução de tolerância oral a alérgenos.
[022] 12 Composição nutricional para uso de acordo com a realização 11 ou 12, sendo que a composição nutricional é administrada a lactentes ou crianças de primeira infância, preferencialmente lactentes.
[023] 13 A composição nutricional de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 10 ou a composição nutricional para uso de acordo com qualquer uma das realizações 11 a 13, para uso no fornecimento de nutrição para lactentes.
Descrição Detalhada
[024] A presente invenção refere-se a uma composição nutricional para lactentes ou para crianças de primeira infância, que compreende: a. 2’-fucosil-lactose, e b. butirato dietético.
[025] Em uma realização preferencial, a composição nutricional compreende ainda 3’-galactosil-lactose.
[026] Em outra realização preferencial ou adicional, a composição nutricional é pelo menos parcialmente fermentada por bactérias produtoras de ácido láctico e compreende de 0,1 a 1,5%, em peso, da soma de ácido láctico e lactato, com base no peso seco da composição nutricional, e em que pelo menos 90%, em peso, da soma de ácido láctico e lactato é ácido L-láctico e L-lactato.
[027] A invenção refere-se ainda à dita composição nutricional para uso como um medicamento, preferencialmente para o tratamento, a prevenção e/ou a atenuação de uma doença e/ou enfermidade. A composição nutricional é preferencialmente para uso na melhora da função da barreira intestinal, para uso na melhora do sistema imune, para uso na melhora da microbiota intestinal, para uso no tratamento ou na prevenção de infecções, em particular, as infecções intestinais e/ou para uso no tratamento ou na prevenção de alergia, preferencialmente para uso na indução de tolerância oral a alérgenos.
[028] Este aspecto da invenção pode ser também redigido como o uso da dito composição nutricional na fabricação de um medicamento para o tratamento, a prevenção e/ou a atenuação de uma doença e/ou enfermidade, preferencialmente para o tratamento de uma doença. O uso da composição nutricional é preferencialmente para melhorar a função da barreira intestinal, para melhorar a microbiota intestinal, para o tratamento ou a prevenção de infecções, em particular, as infecções intestinais e/ou para uso no tratamento ou na prevenção de alergia, preferencialmente para uso na indução de tolerância oral a alérgenos.
[029] Este aspecto da invenção pode ser também redigido como o uso da dita composição nutricional para o tratamento, a prevenção e/ou a atenuação de uma doença e/ou enfermidade. O uso da composição nutricional é preferencialmente para melhorar a função da barreira intestinal, para melhorar a microbiota intestinal, para o tratamento ou a prevenção de infecções, em particular, as infecções intestinais e/ou para uso no tratamento ou na prevenção de alergia, preferencialmente para uso na indução de tolerância oral a alérgenos.
[030] Este aspecto da invenção pode ser também redigido como um método para o tratamento, a prevenção e/ou a atenuação de uma doença e/ou enfermidade, que compreende a administração da dita composição a um sujeito com necessidade da mesma. O método é preferencialmente para melhorar a função da barreira intestinal, para melhorar a microbiota intestinal, para o tratamento ou a prevenção de infecções, em particular, as infecções intestinais e/ou para uso no tratamento ou na prevenção de alergia, preferencialmente para uso na indução de tolerância oral a alérgenos. Definições
[031] No contexto da presente invenção, o termo “prevenção” significa “reduzir o risco de (ocorrência)” ou “reduzir a severidade de”. O termo “prevenção de uma certa condição” inclui também o “tratamento de uma pessoa em risco (aumentado) da dita condição”.
[032] Neste documento e nas suas reivindicações, o verbo “compreender” e suas conjugações é usado em seu sentido não limitante para significar que itens após a palavra estão incluídos, mas itens não especificamente mencionados não estão excluídos. Além disso, referência a um elemento pelo artigo indefinido “um” ou “uma” não exclui a possibilidade de que mais do que um elemento esteja presente, a menos que o contexto claramente exija que haja um e somente um dos elementos. O artigo indefinido “um” ou “uma”, dessa forma, geralmente significa “pelo menos um”. 2’-Fucosil-Lactose
[033] A composição nutricional da presente invenção compreende 2’- fucosil-lactose (2’-FL). Descobriu-se que 2’-FL melhora a função da barreira intestinal. Descobriu-se também que 2’-FL melhora o sistema imune. Fucosil- lactose (FL) é um oligossacarídeo não digerível presente no leite humano. Ele não está presente no leite bovino. Ele consiste em três unidades de monose, fucose, galactose e glicose ligadas em conjunto. A lactose é uma unidade de galactose ligada a uma unidade de glicose através de uma ligação beta 1,4. Uma unidade de fucose está ligada a uma unidade de galactose de uma molécula de lactose através de uma ligação alfa 1,2 (2’-fucosil-lactose, 2’-FL) ou através de uma ligação alfa-1,3 à unidade de glicose de uma lactose (3-fucosil-lactose, 3- FL).
[034] 2’-FL, preferencialmente -L-Fuc-(1→2)--D-Gal-(1→4)-D-Glc, está comercialmente disponível, por exemplo, junto à Sigma-Aldrich. Alternativamente, ele pode ser isolado a partir do leite humano, por exemplo, conforme descrito em Andersson & Donald, 1981, J Chromatogr. 211:170-1744, ou produzido por microrganismos geneticamente modificados, por exemplo, conforme descrito em Albermann et al, 2001, Carbohydrate Res. 334:97-103.
[035] Preferencialmente, uma composição nutricional de acordo com a invenção compreende de 10 mg a 1 g de 2’-FL por 100 mL, mais preferencialmente de 20 mg a 0,5 g, até mais preferencialmente de 40 mg a 0,2 g de 2’-FL por 100 mL. Com base no peso seco, a presente composição nutricional preferencialmente compreende de 0,075%, em peso, a 7,5%, em peso, de 2’-FL, mais preferencialmente de 0,15%, em peso, a 3,75%, em peso, de 2’-FL, até mais preferencialmente de 0,3%, em peso, a 1,5%, em peso, de 2’- FL. Com base em energia, a presente composição nutricional preferencialmente compreende de 0,015 a 1,5 g de 2’-FL por 100 kcal, mais preferencialmente de 0,03 a 0,075 g de 2’-FL por 100 kcal, até mais preferencialmente de 0,06 a 0,3 g de 2’-FL por 100 kcal. Uma quantidade menor de fucosil-lactose será menos efetiva em estimular o sistema imune ou melhorar a função da barreira intestinal, enquanto que uma quantidade muito alta resultará em altos custos desnecessários do produto. Butirato Dietético
[036] A presente composição nutricional contém butirato dietético. Descobriu-se que o butirato melhora a função da barreira intestinal. A composição nutricional preferencialmente compreende entre 0,3 e 5%, em peso, de ácido butírico, com base nas cadeias acila do teor total de ácidos graxos, preferencialmente entre 0,6 e 5%, em peso, até mais preferencialmente entre 1 e 5%, em peso. A presente composição nutricional preferencialmente contém tributirina (isto é, um triglicerídeo com 3 cadeias de ácido butírico fixados à cadeia principal de glicerol através de ligações éster).
[037] Preferencialmente, a composição nutricional contém de 0,075 a 1,3%, em peso, de butirato, com base no peso seco da composição, preferencialmente entre 0,15 e 1,3%, em peso, e mais preferencialmente entre 0,25 e 1,3%, em peso. Alternativamente, a composição nutricional compreende de 0,015 a 0,25 g de butirato por 100 kcal, preferencialmente de 0,03 a 0,25 g de butirato por 100 kcal, e mais preferencialmente de 0,05 a 0,25 g de butirato por 100 kcal. Quando a composição nutricional é um líquido, a composição preferencialmente contém de 0,01 a 0,175 g de butirato por 100 mL, mais preferencialmente de 0,02 a 0,175 g de butirato por 100 mL, e mais preferencialmente de 0,035 a 0,175 g de butirato por 100 mL. Sabe-se que o leite humano contém níveis muito baixos de butirato, em particular, < 0,1%, em peso, com base no teor total de ácidos graxos.
[038] O butirato dietético pode ser fornecido por qualquer fonte adequada conhecida na técnica. Fontes não-limitantes de butirato dietético incluem gorduras de fonte animal e produtos derivados como, mas não se limitando a, leite, gordura de leite, gordura butírica, óleo butírico, manteiga, leitelho, soro de leite coalhado, creme de leite; produtos derivados de fermentação microbiana como, mas não se limitando a, iogurte e leitelho fermentado; e produtos de óleo de sementes derivados de fonte vegetal, como abacaxi e/ou óleo de abacaxi, damasco e/ou óleo de damasco, cevada, aveia, arroz integral, farelo de trigo, vagem, legumes, folhas verdes, maçãs, kiwi, laranjas. Em algumas realizações, o butirato dietético é produzido sinteticamente. A fonte preferencial de butirato dietético é a gordura de leite de ruminantes, preferencialmente a gordura de leite bovino.
[039] Em realizações em que o butirato dietético é produzido sinteticamente, a estrutura química do butirato dietético pode ser modificada conforme necessário. Além disso, o butirato dietético produzido sinteticamente pode ser purificado por qualquer meio conhecido na técnica para produzir um aditivo de butirato dietético purificado que pode ser incorporado nas composições nutricionais divulgadas no presente pedido. O butirato dietético pode ser fornecido por lipídeos de produtos lácteos e/ou por formas de butirato ligado a triglicerídeos.
[040] Em algumas realizações, o butirato dietético pode compreender sais de butirato, por exemplo, butirato de sódio, butirato de potássio, butirato de cálcio, butirato de magnésio e combinações dos mesmos. Em certas realizações, o butirato dietético compreende um sal de butirato adequado que foi revestido com um ou mais dentre gorduras ou lipídeos. Em certas realizações em que o butirato dietético compreende um sal de butirato revestido com gordura, a composição nutricional pode ser uma composição em pó seco na qual o butirato dietético está incorporado. Preferencialmente, o butirato dietético é fornecido como parte de um triglicerídeo. Isto é vantajoso porque o butirato é volátil (e fétido) quando fornecido na forma livre ou de sal. Na forma de triglicerídeo, o butirato será liberado no estômago e depois dele, devido à ação de lipases.
[041] Em uma realização preferencial, a razão, em peso, de 2’-FL para butirato dietético situa-se na faixa de 10:1 a 1:10, preferencialmente de 5:1 a 1:5, mais preferencialmente de 3:1 a 1:3. 3’-Galactosil-Lactose
[042] A composição nutricional da presente invenção preferencialmente compreende 3’-galactosil-lactose. Preferencialmente, 3’- galactosil-lactose é o trissacarídeo Gal-(beta 1,3)-Gal-(beta 1,4)-Glc. No contexto da invenção, todas as citações de 3’-GL referem-se a beta1,3- galactosil-lactose ou beta3’-GL, a menos que especificamente indicado que este não é o caso. Esse trissacarídeo pode ser administrado em uma matriz adequada ou em uma composição nutricional. O Trissacarídeo pode ser, por exemplo, parte de uma mistura de galacto-oligossacarídeos (GOS), preferencialmente beta-galacto-oligossacarídeos (betaGOS). Descobriu-se que beta3’-GL melhora a função da barreira intestinal.
[043] A composição nutricional de acordo com a presente invenção compreende preferencialmente de 0,07 a 3,75%, em peso, de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc, com base no peso seco da composição nutricional. Em uma realização preferencial, a composição nutricional compreende 0,07 a 0,375%, em peso, de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 4) - Glc, com base no peso seco da composição nutricional. Em outra realização preferencial, a composição nutricional compreende 1,125 a 1,725%, em peso, de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 4) - Glc, com base no peso seco da composição nutricional.
[044] A composição nutricional de acordo com a presente invenção compreende preferencialmente de 15 a 750 mg de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1- 4) - Glc, por 100 kcal, da composição nutricional. Em uma realização preferencial, a composição nutricional compreende de 15 a 75 mg de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 4) - Glc, por 100 kcal da composição nutricional. Em outra realização preferencial, a composição nutricional compreende de 225 a 375 mg de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 4) - Glc, por 100 kcal da composição nutricional.
[045] A composição nutricional de acordo com a presente invenção compreende preferencialmente de 10 a 500 mg de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1- 4) - Glc, por 100 mL da composição nutricional. Em uma realização preferencial, a composição nutricional compreende de 15 a 50 mg de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 4) - Glc, por 100 mL da composição nutricional. Em outra realização preferencial, a composição nutricional compreende de 150 a 250 mg de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 4) - Glc, por 100mL da composição nutricional. Sabe-se que o leite humano contém baixos níveis de 3’-GL, em particular, em média não excedendo 5 mg/100 mL.
[046] A combinação de 2’-FL, butirato e 3’-GL terá um efeito aprimorado adicional na saúde, em particular, em particular, na melhora da função da barreira intestinal, na melhora do sistema imune, na melhora da microbiota intestinal e/ou no tratamento ou na prevenção de infecções, em particular, as infecções intestinais.
[047] Em uma realização preferencial, a razão, em peso, de 2’-FL para 3’-GL situa-se na faixa de 10:1 a 1:10, preferencialmente de 5:1 a 1:5, mais preferencialmente de 3:1 a 1:3. Outros Oligossacarídeos
[048] Se presente, beta1,3’-galactosil-lactose pode ser parte de uma mistura de galacto-oligossacarídeos (GOS), preferencialmente beta-galacto- oligossacarídeos (BGOS). É vantajoso adicionar GOS à presente composição nutricional, em adição a beta1,3’-galactosil-lactose (beta3’-GL) especificamente. Uma mistura de GOS com diferentes tamanhos e ligações terá um efeito benéfico maior na microbiota e melhor produção de ácidos graxos de cadeia curta, o que, por sua vez, tem um efeito adicional de melhora no sistema imune e/ou no tratamento ou na prevenção de infecções, em particular, as infecções intestinais. A presença de GOS, além de beta3’-GL, em particular, terá um efeito adicional na função da barreira intestinal no intestino grosso e no final do intestino delgado, enquanto que beta3’-GL será também - e principalmente - efetivo no intestino delgado. A adição de 3’-GL e GOS terá, portanto, um efeito aprimorado adicional na saúde, em particular, em particular, na melhora da função da barreira intestinal, na melhora do sistema imune, na melhora da microbiota intestinal e/ou no tratamento ou na prevenção de infecções, em particular, as infecções intestinais.
[049] No contexto da invenção, uma maneira adequada para forma GOS é tratar a lactose com beta-galactosidases. Dependendo da especificidade da enzima usada, uma unidade de galactose é hidrolisada a partir da lactose e acoplada a outra unidade de lactose através de ligações beta para formar um trissacarídeo. Uma unidade de galactose pode ser também acoplada a uma outra unidade individual de galactose para formar um dissacarídeo. Unidades de galactose subsequentes são acoplados para formar oligossacarídeos. A maioria desses dos oligossacarídeos formados têm um grau de polimerização (DP) de 7 ou menor. Dependendo da enzima, essas ligações entre os resíduos de galactose podem ser predominantemente beta1,4’, beta1,6’ ou beta1,3’.
[050] Uma maneira adequada para preparar beta1,6’ e/ou beta1,4’ GOS é pelo uso da beta-galactosidase de Bacillus circulans. Uma fonte comercialmente disponível de BGOS é Vivinal-GOS da FrieslandCampina Domo (Amersfoort, Países Baixos). Vivinal-GOS compreende principalmente BGOS com DP2-8 (pico a DP3) e principalmente com ligações beta1,4’ e beta1,6’, sendo as ligações beta1,4’ mais predominantes. Beta1,4’- e beta1,6’-galactosil- lactose podem ser enriquecidos ou purificados a partir destas misturas de GOS, como conhecido na técnica, por exemplo, por cromatografia de exclusão por tamanho. Outra fonte comercialmente disponível de BGOS predominantemente com ligações beta1,4’ e/ou beta 1,6’ são Oligomate 55 e 50 da Yakult, e Cup Oligo da Nissin Sugar. Alternativamente, beta1,4’- e beta1,6’-galactosil-lactose estão comercialmente disponíveis como componentes únicos (Carbosynth).
[051] Uma maneira adequada para produzir beta1,3’ GOS é pelo uso de uma beta-galactosidase de S. thermophilus. É particularmente adequado o uso de beta-galactosidase de linhagem CNCM I-1470 e/ou CNCM I-1620 em um processo conforme divulgado no Exemplo 4 da patente FR2723960 ou no Exemplo 6 da patente EP0778885. S. thermophilus CNCM I-1620 foi depositado no Tratado de Budapeste em 23 de agosto de 1995 na Collection Nationale de Cultures de Microorganisms van Institute Pasteur, Paris, França pela Compagnie Gervais Danone. A linhagem S. thermophilus CNCM I-1620 também é citada como linhagem S. thermophilus ST065. S. thermophilus CNCM I-1470 foi depositado no Tratado de Budapeste em 25 de agosto de 1994 na Collection Nationale de Cultures de Microorganisms van Institute Pasteur, Paris, França pela Compagnie Gervais Danone. A composição deste GOS é também descrita em mais detalhes em LeForestier et al., 2009 Eur J Nutr, 48:457-464. Ambas as linhagens foram também publicadas no documento WO 96/06924. Outro GOS comercialmente disponível e rico em beta1,3 e beta1,6 galacto-oligossacarídeos é Bimuno da Clasado, ou Purimune da GTC Nutrition. Beta1,6’- e beta1,3’- galactosil-lactose podem ser enriquecidos ou purificados a partir destas misturas de GOS, como conhecido na técnica, por exemplo, por cromatografia de exclusão por tamanho. Alternativamente, beta1,3’-galactosil-lactose puro está comercialmente disponível (Carbosynth).
[052] Os GOS, incluindo BGOS, não são digeríveis. As enzimas digestivas humanas (incluindo lactase humana) não são capazes de hidrolisar GOS. GOS quando consumido, portanto, atinge intacto o intestino grosso e está disponível para fermentação pela microbiota intestinal.
[053] Preferencialmente, a composição nutricional compreende pelo menos 250 mg de GOS por 100 mL, mais preferencialmente pelo menos 400, até mais preferencialmente pelo menos 600 mg por 100 mL. Preferencialmente, a composição nutricional não compreende mais que 2500 mg de GOS por 100 mL, preferencialmente não mais que 1500 mg, mais preferencialmente não mais que 1000 mg. Mais preferencialmente, a composição nutricional de acordo com a presente invenção compreende GOS em uma quantidade de 250 a 2500 mg/100 mL, até mais preferencialmente em uma quantidade de 400 a 1500 mg/100mL, até mais preferencialmente em uma quantidade de 600 a 1000 mg/100 mL.
[054] Preferencialmente, a composição nutricional compreende pelo menos 1,75%, em peso, de GOS, com base no peso seco da composição total, mais preferencialmente pelo menos 2,8%, em peso, até mais preferencialmente pelo menos 4,2%, em peso, todos com base no peso seco da composição total. Preferencialmente, a composição nutricional não compreende mais que 17,5%, em peso, de GOS, com base no peso seco da composição total, mais preferencialmente não mais que 10,5%, em peso, até mais preferencialmente não mais que 7%, em peso. A composição nutricional de acordo com a presente invenção compreende preferencialmente GOS em uma quantidade de 1,75 a 17,5%, em peso, mais preferencialmente em uma quantidade de 2,8 para 10,5%,
em peso, com a máxima preferência em uma quantidade de 4,2 a 7%, em peso, todos com base no peso seco da composição total.
[055] Preferencialmente, a composição nutricional de acordo com a presente invenção compreende pelo menos 0,35 g de GOS por 100 kcal, mais preferencialmente pelo menos 0,6 g, até mais preferencialmente pelo menos 0,8 g por 100 kcal. Preferencialmente, a composição nutricional não compreende mais que 3,7 g de GOS por 100 kcal, preferencialmente não mais que 2,5 g por 100 kcal, mais preferencialmente não mais que 1,5 g por 100 Kcal. Mais preferencialmente, a composição nutricional de acordo com a presente invenção compreende GOS em uma quantidade de 0,35 a 3,7 g por 100 kcal, até mais preferencialmente em uma quantidade de 0,6 a 2,5 g por 100 mL, até mais preferencialmente em uma quantidade de 0,8 a 1,5 g por 100 mL.
[056] Quantidades mais baixas resultam em uma composição menos efetiva, considerando que a presença de quantidades mais altas de GOS podem resultar em efeitos colaterais, como distúrbios osmóticos, dor abdominal, inchaço, formação de gases e/ou flatulência.
[057] A quantidade total de GOS, conforme definida para a presente composição nutricional, está incluindo a quantidade de beta1,3’-galactosil- lactose.
[058] Em uma realização preferencial, a composição nutricional compreende de 0,25 a 2,5 g de galacto-oligossacarídeos por 100 mL, em que 10 mg a 500 mg por 100 mL dos galacto-oligossacarídeos é Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc. Em outra realização preferencial, a composição nutricional compreende de 0,25 a 2,5 g de galacto-oligossacarídeos por 100 mL, em que a quantidade de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc é maior que 20%, em peso, com base no teor total galacto-oligossacarídeos. Em outra realização preferencial, a composição nutricional compreende de 0,25 a 2,5 g de galacto- oligossacarídeos por 100 mL, em que a quantidade de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc está entre 10 a 500 mg por 100 mL. Em outra realização preferencial, a composição nutricional compreende de 0,25 a 2,5 g de galacto-
oligossacarídeos por 100 mL, em que a quantidade de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc é maior que 20%, em peso, com base no teor total de galacto- oligossacarídeos e em que a quantidade de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc está entre 150 mg e 250 mg por 100 mL.
[059] Em outra realização preferencial, a composição nutricional compreende de 0,25 a 2,5 g de galacto-oligossacarídeos por 100 mL, em que a quantidade de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc está entre 10 mg e 50 mg por 100 mL.
[060] A quantidade de beta1,3’-galactosil-lactose nesta preparação de GOS é preferencialmente na faixa de 60 a 65%, em peso, com base no teor total de galacto-oligossacarídeos (excluindo a lactose, a galactose e a glicose). Outras fontes preferenciais de beta1,3’-galactosil-lactose incluem Bimuno (Clasado) ou Purimune (GTC Nutrition).
[061] Preferencialmente, como ainda explicado abaixo, a composição nutricional de acordo com a presente invenção compreende também fruto- oligossacarídeos (FOS). Composição Fermentada
[062] A presente composição nutricional é preferencialmente pelo menos parcialmente fermentada. Uma composição nutricional parcialmente fermentada compreende pelo menos uma parte de uma composição que foi fermentada por bactérias produtoras de ácido láctico. Demonstrou-se que uma fórmula parcialmente fermentada tem um efeito protetor na manutenção da permeabilidade intestinal quando exposto ao estresse físico ou psicológico.
[063] A fermentação preferencialmente ocorre durante o processo de produção da composição nutricional. Preferencialmente, a composição nutricional não contém quantidades significativas de bactérias viáveis no produto final, e isto pode ser obtido por inativação por calor após a fermentação ou inativação por outros meios. Preferencialmente, a composição fermentada é um produto derivado do leite, que é um substrato de leite que é fermentado por bactérias produtoras de ácido láctico, em que o substrato de leite compreende pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em leite, soro do leite, proteína de soro do leite, hidrolisado de proteína de soro do leite, caseína, hidrolisado de caseína ou misturas dos mesmos. Adequadamente, as composições nutricionais que compreendem composições fermentadas e oligossacarídeos não digeríveis e o modo de produção das mesmas são descritos nos documentos WO 2009/151330, WO 2009/151331 e WO 2013/187764.
[064] A composição fermentada preferencialmente compreende fragmentos de células bacterianas como glicoproteínas, glicolipídeos, peptidoglicanos, ácido lipoteicóico (LTA), lipoproteínas, nucleotídeos e/ou polissacarídeos capsulares. É vantagem usar a composição fermentada que compreende as bactérias inativadas e/ou fragmentos celulares diretamente como uma parte do produto nutricional final, já que isto resultará em uma concentração mais alta de fragmentos celulares bacterianos. Quando as preparações comerciais de bactérias produtoras de ácido láctico são usadas, essas geralmente são lavadas e o material é separado do meio aquoso de crescimento que compreende os fragmentos celulares bacterianos, reduzindo assim ou eliminando a presença de fragmentos celulares bacterianos. Além disso, mediante a fermentação e/ou outras interações de bactérias produtoras de ácido láctico com o substrato de leite, podem ser formados compostos bioativos adicionais, como ácidos graxos de cadeia curta, peptídeos bioativos e/ou oligossacarídeos, e outros metabólitos, o que pode também resultar em uma função de microbiota intestinal mais similar à função de microbiota intestinal dos lactentes amamentados. Esses compostos bioativos que são produzidos durante a fermentação por bactérias produtoras de ácido láctico podem ser também citados como pós-bioticos. Acredita-se que uma composição que compreende esses pós-bioticos seja vantajosamente mais próxima do leite materno, já que o leite materno não é uma fórmula sintética, mas contém metabólitos, células bacterianas, fragmentos celulares e similares. Portanto, acredita-se que a composição fermentada, em particular, de produto derivado de leite fermentado, tenha um efeito aprimorado, em comparação ao produto derivados de leite não fermentado com ou sem bactérias produtoras de ácido láctico meramente adicionadas, na prevenção de maturação precoce do intestino em um lactente, na indução, em um lactente, de um padrão de maturação intestinal que é mais similar ao padrão de maturação intestinal observado em lactentes alimentados com leite humano.
[065] Preferencialmente, a composição nutricional final compreende de 5 a 97,5%, em peso, da composição fermentada, com base no peso seco, mais preferencialmente de 10 a 90%, em peso, mais preferencialmente de 20 a 80%, em peso, até mais preferencialmente de 25 a 60%, em peso. Como uma maneira para especificar que a composição nutricional final compreende pelo menos parcialmente uma composição fermentada, e para especificar o grau de fermentação, pode ser obtido o nível da soma de ácido láctico e lactato na composição nutricional final, visto que este é o produto metabólico final produzido pelas bactérias produtoras de ácido láctico mediante a fermentação. A presente composição nutricional final preferencialmente compreende de 0,1 a 1,5%, em peso, da soma de ácido láctico e lactato, com base no peso seco da composição, mais preferencialmente de 0,15 a 1,0%, em peso, até mais preferencialmente de 0,2 a 0,5%, em peso. Alternativamente, a composição nutricional compreende de 0,02 a 0,3 g da soma de ácido láctico e lactato por 100 kcal, preferencialmente de 0,03 a 0,2 da soma de ácido láctico e lactato por 100 kcal, preferencialmente de 0,04 a 0,1 da soma de ácido láctico e lactato por 100 kcal. Alternativamente, quando a composição é um líquido, a soma de ácido láctico e lactato é de 0,0125 a 0,2 g por 100 mL, preferencialmente de 0,02 a 0,125 g por 100 mL, preferencialmente de 0,03 a 0,07 g por 100 mL.
[066] Preferencialmente, pelo menos 50%, em peso, até mais preferencialmente pelo menos 90%, em peso, da soma de ácido láctico e lactato está sob a forma de L(+)-isômero. Dessa forma, em uma realização, a soma de ácido L(+)-láctico e L(+)-lactato é maior que 50%, em peso, mais preferencialmente maior que 90%, em peso, com base na soma do teor total de ácido láctico e lactato. No presente pedido, L(+)-lactato e ácido L (+)-láctico também é citado como L-lactato e ácido L-láctico.
[067] A combinação de 2’-FL, butirato e 3’-GL opcional e a fórmula parcialmente fermentada terá um efeito aprimorado adicional na saúde, em particular, em particular, na melhora da função da barreira intestinal, na melhora do sistema imune, na melhora da microbiota intestinal e/ou no tratamento ou na prevenção de infecções, em particular, as infecções intestinais. LC-PUFA
[068] A presente composição nutricional compreende preferencialmente ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa (LC-PUFA). LC-PUFA são ácidos graxos ou cadeias acila de ácidos graxos com um comprimento de 20 a 24 átomos de carbono, preferencialmente de 20 ou 22 átomos de carbono, que compreendem duas ou mais ligações insaturadas. Preferencialmente, a composição nutricional compreende pelo menos um, preferencialmente dois, mais preferencialmente três LC-PUFA selecionados a partir do ácido docosahexaenoico (DHA), ácido eicosapentaenoico (EPA) e ácido araquidônico (ARA). Descobriu-se que esses LC-PUFA melhoram a função da barreira intestinal e, portanto, podem ser particularmente vantajosos combinados com 2’-FL, butirato e 3’-GL opcional, a fim de melhorar ainda mais a barreira intestinal. Esta combinação tem efeitos vantajosos inesperados e, preferencialmente, funciona de forma sinérgica. Preferencialmente, a composição nutricional compreende uma quantidade elevada desses LC-PUFA. A atual fórmula infantil, no caso delas compreenderem estes LC-PUFA, tipicamente têm uma quantidade da soma de DHA, ARA e EPA de 0,4 a 0,9%, em peso, com base no teor total de ácidos graxos. Na composição nutricional de acordo com a presente invenção, preferencialmente a quantidade desses LC- PUFA está acima de 1%, em peso, preferencialmente acima de 1,1%, em peso, com base no teor total de ácidos graxos. Preferencialmente, a quantidade desses LC-PUFA é não mais que 15%, em peso, preferencialmente é não mais que 5%, em peso, com base no teor total de ácidos graxos, preferencialmente é não mais que 2,5%, em peso, com base no teor total de ácidos graxos. É mais preferencial que a quantidade desses LC-PUFA situe-se na faixa de 1 a 15%, em peso, preferencialmente de 1,1 a 5%, em peso, mais preferencialmente de 1,5 a 2,5%, em peso, com base no teor total de ácidos graxos. Esta é considerada a faixa mais ideal a ser usada nas fórmulas infantis para melhorar a função da barreira intestinal.
[069] Preferencialmente, a quantidade de DHA é de pelo menos 0,4, preferencialmente pelo menos 0,5%, em peso, com base no teor total de ácidos graxos. Preferencialmente, a quantidade de DHA é não mais que 2,0%, em peso, preferencialmente é não mais que 1,0%, em peso, com base no teor total de ácidos graxos. Preferencialmente, a composição nutricional compreende uma quantidade de DHA de pelo menos 0,5%, em peso, preferencialmente pelo menos 0,7%, em peso, mais preferencialmente pelo menos 1%, em peso, com base no teor total de ácidos graxos. Preferencialmente, a composição nutricional compreende uma quantidade de DHA de 0,4 a 1%, em peso, mais preferencialmente, de 0,5 a 0,7%, em peso.
[070] Preferencialmente, a composição nutricional compreende uma quantidade de EPA de pelo menos 0,09%, em peso, preferencialmente pelo menos 0,1%, em peso, com base no teor total de ácidos graxos, e preferencialmente não mais que 0,4%, em peso, mais preferencialmente não mais que 0,1%, em peso. Preferencialmente, a composição nutricional compreende uma quantidade de EPA de 0,09 a 0,4%, em peso, mais preferencialmente, de 0,1 a 0,2%, em peso.
[071] Preferencialmente, a composição nutricional compreende uma quantidade de ARA de pelo menos 0,25%, em peso, com base no teor total de ácidos graxos, mais preferencialmente pelo menos 0,5%, em peso, e preferencialmente não mais que 1%, em peso. Preferencialmente, a composição nutricional compreende uma quantidade de ARA de 0,4 a 1%, em peso, mais preferencialmente, de 0,5 a 0,7%, em peso.
[072] Preferencialmente, a composição nutricional compreende DHA em uma quantidade de 0,4 a 1,0%, em peso, com base no teor total de ácidos graxos, e EPA em uma quantidade de 0,09 a 0,4%, em peso, com base no teor total de ácidos graxos. Mais preferencialmente, a composição nutricional compreende DHA em uma quantidade de 0,5 a 0,7%, em peso, com base no teor total de ácidos graxos, e EPA em uma quantidade de 0,1 para 0,2%, em peso, com base no teor total de ácidos graxos. É particularmente preferencial que a composição nutricional compreenda DHA em uma quantidade de mais que 0,5%, em peso, com base no teor total de ácidos graxos, e EPA em uma quantidade de mais que 0,1%, em peso, com base no teor total de ácidos graxos. Preferencialmente, a composição nutricional compreende DHA, EPA e ARA em uma quantidade de 0,4 a 1,0%, em peso, de 0,09 a 0,4%, em peso, e de 0,25 a 1,0%, em peso, com base no teor total de ácidos graxos, respectivamente. Mais preferencialmente, a composição nutricional compreende DHA, EPA, e ARA em uma quantidade de 0,5 a 0,7%, em peso, de 0,1 a 0,2%, em peso, e de 0,5 a 0,7%, em peso, com base no teor total de ácidos graxos, respectivamente.
[073] Preferencialmente, a composição nutricional compreende DHA em uma quantidade de 20 a 50 mg/100 kcal e EPA em uma quantidade de 4,3 a 10,8 mg/100 kcal. Mais preferencialmente, a composição nutricional compreende DHA em uma quantidade de 25 a 33,5 mg/100 kcal e EPA em uma quantidade de 5,4 a 7,2 mg/100 kcal. Com a máxima preferência, a composição nutricional compreende DHA em uma quantidade de cerca de 25 mg/100 kcal e EPA em uma quantidade de cerca de 5,4 mg/100 kcal. Nestas realizações, a presença de ARA é opcional. Se presente, a quantidade de ARA é preferencialmente de 12,5 a 50 mg, mais preferencialmente de 25 s 33,5 mg, e com a máxima preferência cerca de 25 mg por 100 kcal. Preferencialmente, a razão, em peso, de DHA/ARA é de 0,9 para 2.
[074] Preferencialmente, a razão, em peso de DHA/EPA/ARA é 1: (0,19 a 0,7) : (0,9 a 2,0). Essas quantidades e/ou razões de DHA, EPA e ARA são ideais para melhora adicional da função da barreira intestinal, para melhora adicional da microbiota intestinal e/ou para o tratamento ou a prevenção de infecções, em particular, as infecções intestinais. O LC-PUFA pode ser fornecido como ácidos graxos livres, na forma de triglicerídeo, na forma de diglicerídeo, na forma de monoglicerídeo, na forma de fosfolipídeo, ou como uma mistura de um ou mais dos acima. Fontes adequadas desses LC-PUFA são, por exemplo, óleo de peixe e óleo de Mortierella alpina.
[075] Preferencialmente, a composição nutricional de acordo com a presente invenção compreende lipídeo, em que o lipídeo compreende LC-PUFA selecionado a partir do grupo que consiste em DHA, EPA e ARA, e em que a soma de DHA, ARA e EPA é de pelo menos 1%, em peso, com base no teor total de ácidos graxos, e em que o lipídeo compreende DHA em uma quantidade de 0,4 a 1,0%, em peso, com base no teor total de ácidos graxos, EPA em uma quantidade de 0,09 a 0,4%, em peso, com base no teor total de ácidos graxos e ARA em uma quantidade de 0,25 a 1%, em peso, com base no teor total de ácidos graxos. Nesta realização é ainda preferencial que o lipídeo compreenda DHA em uma quantidade de 0,5 a 0,7%, em peso, com base no teor total de ácidos graxos, EPA em uma quantidade de 0,1 a 0,2%, em peso, com base no teor total de ácidos graxos e ARA em uma quantidade de 0,5 a 0,7%, em peso, com base no teor total de ácidos graxos. Mais preferencialmente, o lipídeo compreende DHA em uma quantidade de pelo menos 0,5%, em peso, EPA em uma quantidade de pelo menos 0,1%, em peso, e ARA em uma quantidade de pelo menos 0,5%, em peso, todos com base no teor total de ácidos graxos.
[076] A combinação de 2’-FL, butirato, 3’-GL opcional e LC-PUFA, em particular, EPA, DHA e/ou ARA, terá um efeito mais aprimorado na saúde, em particular, em particular, na melhora da função da barreira intestinal, na melhora do sistema imune, na melhora da microbiota intestinal e/ou no tratamento ou na prevenção de infecções, em particular, as infecções intestinais. Composição Nutricional
[077] A composição nutricional de acordo com a presente invenção não é leite humano.
[078] A composição nutricional de acordo com a presente invenção é para uso em lactentes ou em crianças de primeira infância.
[079] A presente composição nutricional compreende preferencialmente lipídeo, proteína e carboidrato e é preferencialmente administrada na forma líquida. A presente composição nutricional pode estar também sob a forma de um alimento seco, preferencialmente sob a forma de pó, que é acompanhado por instruções para misturar o dito alimento seco, preferencialmente pó, com um líquido adequado, preferencialmente água. A presente composição nutricional pode, assim, estar sob a forma de um pó adequado para ser reconstituído com água para fornecer uma composição nutricional pronta pra beber, preferencialmente uma fórmula infantil, fórmula de seguimento ou fórmula para criança de primeira infância pronta para beber, mais preferencialmente uma fórmula infantil ou fórmula de seguimento pronta para beber. A composição nutricional de acordo com a invenção compreende preferencialmente outras fracções, como vitaminas, minerais, oligoelementos e outros micronutrientes a fim de se tornar uma composição nutricional completa. Preferencialmente, as fórmulas para lactentes e fórmulas de seguimento compreendem vitaminas, minerais, oligoelementos e outros micronutrientes de acordo com as diretivas internacionais.
[080] A presente composição nutricional compreende preferencialmente lipídeo, proteína e carboidrato digerível, em que o lipídeo fornece de 25 a 65% do total de calorias, a proteína fornece de 6,5 a 16% do total de calorias e o carboidrato digerível fornece de 20 a 80% do total de calorias. Preferencialmente, na presente composição nutricional, o lipídeo fornece de 30 a 55% do total de calorias, a proteína fornece de 7,5 a 9% do total de calorias, e o carboidrato digerível fornece de 35 a 60% do total de calorias. Para o cálculo da % do total de calorias para a proteína, o total de energia fornecido pelas proteínas, pelos peptídeos e pelos aminoácidos deve ser levado em conta.
[081] Preferencialmente, o lipídeo fornece de 3 a 7 g de lipídeos por 100 kcal, preferencialmente de 3,5 a 6 g por 100 kcal, a proteína fornece de 1,6 a 4 g por 100 kcal, preferencialmente de 1,7 a 2,3 g/100 kcal e o carboidrato digerível fornece de 5 a 20 g por 100 kcal, preferencialmente de 8 a 15 g por 100 kcal da composição nutricional. Preferencialmente, a presente composição nutricional compreende lipídeo fornecendo de 3,5 a 6 g por 100 kcal, proteína fornecendo de 1,7 a 2,3 g/100 kcal e carboidrato digerível fornecendo de 8 a 15 g por 100 kcal da composição nutricional.
[082] Preferencialmente, o lipídeo fornece de 2,5 a 6,5 g de lipídeos por 100 mL, preferencialmente de 2,5 a 4 g por 100 mL, a proteína fornece de 1 a 3 g por 100 mL, preferencialmente de 1 a 1,5 g por 100 mL, e o carboidrato digerível fornece de 3 a 13 g por 100 mL, preferencialmente de 5 a 10 g por 100 mL da composição nutricional. Preferencialmente, a presente composição nutricional compreende lipídeo fornecendo de 2,0 a 6,5 g por 100 mL, proteína fornecendo de 1 a 3 g por 100 mL e carboidrato digerível fornecendo de 5 a 10 g por 100 mL da composição nutricional.
[083] Preferencialmente, o lipídeo fornece de 15 a 45%, em peso, preferencialmente de 20 a 30%, em peso, com base no peso seco da composição, a proteína fornece de 8 a 20%, em peso, preferencialmente de 8,5 a 11,5%, em peso, com base no peso seco da composição e os carboidratos digeríveis compreendem de 25 a 90%, em peso, preferencialmente de 40 a 75%, em peso, com base no peso seco da composição. Preferencialmente, a presente composição nutricional compreende lipídeo fornecendo de 20 a 30%, em peso, proteína fornecendo de 8,5 a 11,5%, em peso, e carboidrato digerível fornecendo de 40 a 75%, em peso, todos com base no peso seco da composição.
[084] A presente composição compreende preferencialmente lipídeos. Preferencialmente, a presente composição compreende pelo menos um lipídeo selecionado a partir do grupo que consiste em lipídeos de origem vegetal. Preferencialmente, a presente composição compreende uma combinação de lipídeos de origem vegetal e pelo menos um óleo selecionado a partir do grupo que consiste em óleo de peixe, óleo algáceo, óleo de fungos e óleo de bactérias. O lipídeo da presente composição nutricional preferencialmente fornece de 3 a 7 g por 100 kcal da composição, preferencialmente o lipídeo fornece de 3,5 a 6 g por 100 kcal. Quando na forma líquida, por exemplo, como um líquido pronto para alimentação, a composição nutricional compreende preferencialmente de 2,0 a 6,5 g de lipídeo por 100 mL, mais preferencialmente de 2,5 a 4,0 g por 100 mL. Com base no peso seco, a presente composição nutricional preferencialmente compreende de 15 a 45%, em peso, de lipídeo, mais preferencialmente de 20 a 30%, em peso. Preferencialmente, a presente composição nutricional compreende pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas fontes de lipídeos selecionadas a partir do grupo que consiste em óleo de semente de colza (como óleo de colza, óleo de semente de colza com baixo teor de ácido erúcico e óleo de canola), óleo de girassol com alto teor oleico, óleo de cártamo com alto teor oleico, azeite de oliva, óleos marinhos, óleos microbianos, óleo de coco, óleo de palmiste.
[085] A presente composição nutricional compreende preferencialmente proteína. A proteína usada na composição nutricional é preferencialmente selecionada a partir do grupo que consiste em proteínas de animais não humanos, preferencialmente proteínas do leite, proteínas vegetais, preferencialmente como proteína de soja e/ou proteína de arroz, e misturas das mesmas. A presente composição nutricional preferencialmente contém caseína e/ou proteína de soro do leite, mais preferencialmente proteínas de soro do leite bovino e/ou caseína bovina. Dessa forma, em uma realização, a proteína na presente composição nutricional compreende proteína selecionada a partir do grupo que consiste em proteína de soro do leite e caseína, preferencialmente proteína de soro do leite e caseína, preferencialmente a proteína de soro do leite e/ou a caseína são de leite de vaca. Preferencialmente, a proteína compreende pelo menos 5%, em peso, com base no teor total de proteína de aminoácidos livres, dipeptídeos, tripeptídeos ou proteína hidrolisada. A presente composição nutricional compreende preferencialmente caseína e proteínas de soro do leite em uma razão, em peso, de caseína : proteína de soro do leite de 10 : 90 a 90 : 10, mais preferencialmente 20 : 80 a 80 : 20, até mais preferencialmente 35 : 65 a 55 : 45.
[086] Em uma realização, a proteína usada na composição nutricional compreende proteína hidrolisada, preferencialmente a proteína usada na composição nutricional é proteína hidrolisada ou, em outras palavras, consiste em proteína hidrolisada. A proteínas hidrolisada pode compreender também aminoácidos livres. Preferencialmente, a proteína hidrolisada compreende proteína hidrolisada de soro do leite. Em uma realização, a proteína usada na composição nutricional são aminoácidos livres ou, em outras palavras, consiste em aminoácidos livres. Dessa forma, em uma realização preferencial, a composição nutricional de acordo com a invenção que compreende 2’-FL e butirato dietético e, opcionalmente, também 3’GL, compreende ainda proteína hidrolisada e/ou aminoácidos livres. Essas composições são preferencialmente usadas para a prevenção ou para o tratamento de alergia, mais preferencialmente para a prevenção ou para o tratamento de alergia à proteína do leite de vaca.
[087] A %, em peso, de proteína, com base no peso seco da presente composição nutricional é calculada de acordo com o método de Kjeldahl, pela medição do nitrogênio total e usando um fator de conversão de 6,38, no caso de caseína, ou um fator de conversão de 6,25 para outras proteínas diferentes de caseína. O termo “proteína” ou “componente proteico”, como usado na presente invenção, refere-se à soma de proteínas, peptídeos e aminoácidos livres.
[088] A presente composição nutricional compreende preferencialmente proteína fornecendo de 1,6 a 4,0 g de proteína por 100 kcal da composição nutricional, preferencialmente fornecendo de 11,7 a 2,3 g por 100 kcal da composição nutricional. Um teor de proteína muito baixo, com base no teor total de calorias, resultará em crescimento e desenvolvimento menos adequados em lactentes e crianças de primeira infância. Uma quantidade muita alta vai colocar uma carga metabólica, por exemplo, os rins de lactentes e crianças de primeira infância. Quando na forma líquida, como um líquido pronto para alimentação, a composição nutricional compreende preferencialmente de 1,0 a 3,0 g, mais preferencialmente de 1,0 a 1,5 g de proteína por 100 mL. Com base no peso seco, a presente composição nutricional compreende preferencialmente de 8 a 20%, em peso, de proteína, mais preferencialmente de 8,5 a 11,5%, em peso, com base no peso seco da composição nutricional total.
[089] A presente composição nutricional compreende preferencialmente carboidrato digerível fornecendo de 5 a 20 g por 100 kcal, preferencialmente de 8 a 15 g por 100 kcal. Preferencialmente, a quantidade de carboidrato digerível na presente composição nutricional é de 25 a 90%, em peso, mais preferencialmente de 8,5 a 11,5%, em peso, com base no peso seco total da composição. Carboidratos digeríveis preferenciais são lactose, glicose, sacarose, frutose, galactose, maltose, amido e maltodextrina. A lactose é o principal carboidrato digerível presente no leite humano. A presente composição nutricional preferencialmente compreende lactose. Preferencialmente, a presente composição nutricional não compreende quantidades altas de outros carboidratos além de lactose. Em comparação aos carboidratos digeríveis como maltodextrina, sacarose, glicose, maltose e outros carboidratos digeríveis com alto índice glicêmico, a lactose tem índice glicêmico mais baixo e é, portanto, preferencial. A presente composição nutricional preferencialmente compreende carboidrato digerível, em que pelo menos 35%, em peso, mais preferencialmente pelo menos 50%, em peso, mais preferencialmente pelo menos 60%, mais preferencialmente pelo menos 75%, em peso, até mais preferencialmente pelo menos 90%, em peso, com a máxima preferência pelo menos 95%, em peso, do carboidrato digerível é lactose. Com base no peso seco, a presente composição nutricional preferencialmente compreende pelo menos 25%, em peso, de lactose, preferencialmente pelo menos 40%, em peso, de lactose, mais preferencialmente pelo menos 50%, em peso, de lactose.
[090] A presente composição nutricional compreende preferencialmente oligossacarídeos não digeríveis (OND). O termo “oligossacarídeos”, como usado no presente pedido, refere-se a sacarídeos com um grau de polimerização (DP) de 2 a 250, preferencialmente um DP de 2 a 100, mais preferencialmente de 2 a 60, até mais preferencialmente de 2 a 10. Se o oligossacarídeo com um DP de 2 a 100 está incluído na presente composição nutricional, isto resulta em composições que podem conter oligossacarídeos com um DP de 2 a 5, um DP de 50 a 70 e/ou um DP de 7 a 60. O termo “oligossacarídeos não digeríveis” (OND), como usado na presente invenção, refere-se a oligossacarídeos que não são digeridos no intestino pela ação de ácidos ou enzimas digestivas presentes no trato digestivo superior humano, por exemplo, estômago e intestino delgado, mas que são preferencialmente fermentados pela microbiota intestinal humana. Por exemplo, sacarose, lactose, maltose e maltodextrinas são consideradas digeríveis.
[091] Preferencialmente, os presentes oligossacarídeos não digeríveis não digeríveis são solúveis. O termo “solúvel”, como usado no presente pedido, ao fazer referência a um polissacarídeo, fibra ou oligossacarídeo, significa que a substância é pelo menos solúvel de acordo com o método descrito por L. Prosky et al., J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71, 1017-1023 (1988).
[092] O beta1,3’-galactosil-lactose pode estar presente na composição nutricional de acordo com a invenção como tal, ou como parte de uma mistura de galacto-oligossacarídeos (GOS), preferencialmente beta- galacto-oligossacarídeos (BGOS). Em uma realização preferencial, o beta1,3’- galactosil-lactose está presente como parte de uma mistura de galacto- oligossacarídeos. Em uma realização, a quantidade de Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc é maior que 20%, em peso, com base no teor total de galacto- oligossacarídeos.
[093] Preferencialmente, a presente composição nutricional compreende também fruto-oligossacarídeos (FOS). O termo “fruto- oligossacarídeos”, como usado na presente invenção, refere-se a carboidratos compostos por mais de 50%, preferencialmente mais de 65% de unidades de frutose, com base em subunidades monoméricas, nas quais pelo menos 50%, mais preferencialmente pelo menos 75%, até mais preferencialmente pelo menos 90% das unidades de frutose estão ligadas em conjunto através de uma ligação beta-glicosídica, preferencialmente uma ligação beta-2,1 glicosídica.
Uma unidade de glicose pode estar presente na extremidade redutora da cadeia de unidades de frutose. Preferencialmente, os fruto-oligossacarídeos têm um DP ou DP médio na faixa de 2 a 250, mais preferencialmente de 2 a 100, até mais preferencialmente de 10 a 60. O termo “fruto-oligossacarídeos” compreende levana, levana hidrolisada, inulina, inulina hidrolisada e fruto-oligossacarídeos sintetizados. Preferencialmente, a preparação compreende fruto- oligossacarídeos de cadeia curta com um grau médio de polimerização (DP) de 3 a 6, mais preferencialmente inulina hidrolisada ou fruto-oligossacarídeo sintético. Preferencialmente, a preparação compreende fruto-oligossacarídeos de cadeia longa com um DP médio acima de 20. Preferencialmente, a preparação compreende tanto fruto-oligossacarídeos de corrente curta como de cadeia longa. Os fruto-oligossacarídeos adequados para uso na composição estão também comercialmente disponíveis facilmente, por exemplo, RaftilineHP (Orafti). Preferencialmente, a composição nutricional de acordo com a presente invenção compreende pelo menos 25 mg de FOS por 100 mL, mais preferencialmente pelo menos 40, até mais preferencialmente pelo menos 60 mg. Preferencialmente, a composição não compreende mais que 250 mg de FOS por 100 mL, mais preferencialmente não mais que 150 mg por 100 mL, e com a máxima preferência não mais que 100 mg por 100 mL. A quantidade de FOS é preferencialmente de 25 a 250 g de fruto-oligossacarídeos por 100 mL, preferencialmente de 40 a 150 g por 100 mL, mais preferencialmente de 60 a 100 g por 100 mL. Preferencialmente, a composição nutricional de acordo com a presente invenção compreende pelo menos 0,15%, em peso, de FOS, com base no peso seco, mais preferencialmente pelo menos 0,25%, em peso, até mais preferencialmente pelo menos 0,4%, em peso. Preferencialmente, a composição não compreende mais que 1,5%, em peso, de FOS, com base no peso seco da composição total, mais preferencialmente não mais que 2%, em peso. A presença de FOS mostra um efeito aprimorado adicional na microbiota e em sua produção de AGCC.
[094] Preferencialmente, a presente composição nutricional compreende uma mistura de galacto-oligossacarídeos (incluindo o beta1,3’- galactosil-lactose) e fruto-oligossacarídeos. Preferencialmente, a mistura de galacto-oligossacarídeos e fruto-oligossacarídeos está presente em uma razão, em peso, de 1/99 a 99/1, mais preferencialmente de 1/19 a 19/1, mais preferencialmente de 1/1 a 19/1, mais preferencialmente de 2/1 a 15/1, mais preferencialmente de 5/1 a 12/1, até mais preferencialmente de 8/1 a 10/1, até mais preferencialmente em uma razão de cerca de 9/1. Esta razão, em peso, é particularmente vantajosa quando os galacto-oligossacarídeos têm um DP médio baixo e os fruto-oligossacarídeos tem um DP relativamente alto. É mais preferencial uma mistura de galacto-oligossacarídeos com um DP médio abaixo de 10, preferencialmente abaixo de 6, e fruto-oligossacarídeos com um DP médio acima de 7, preferencialmente acima de 11, até mais preferencialmente acima de 20.
[095] Em uma realização preferencial, a presente composição nutricional compreende uma mistura de fruto-oligossacarídeos de cadeia curta (cc) e fruto-oligossacarídeos de cadeia longa (cl). Preferencialmente, a mistura de fruto-oligossacarídeos de cadeia curta e fruto-oligossacarídeos de cadeia longa está presente em uma razão, em peso, de 1/99 a 99/1, mais preferencialmente de 1/19 a 19/1, até mais preferencialmente de 1/10 a 19/1, mais preferencialmente de 1/5 a 15/1, mais preferencialmente de 1/1 a 10/1. É preferencial uma mistura de fruto-oligossacarídeos de cadeia curta com um DP médio abaixo de 10, preferencialmente abaixo de 6, e fruto-oligossacarídeos com um DP médio acima de 7, preferencialmente acima de 11, até mais preferencialmente acima de 20.
[096] Em outra realização preferencial, a presente composição nutricional compreende uma mistura de fruto-oligossacarídeos de cadeia curta (cc) e galacto-oligossacarídeos de cadeia curta (cc). Preferencialmente, a mistura de fruto-oligossacarídeos de cadeia curta e galacto-oligossacarídeos de cadeia longa está presente em uma razão, em peso, de 1/99 a 99/1, mais preferencialmente de 1/19 a 19/1, até mais preferencialmente de 1/10 a 19/1,
mais preferencialmente de 1/5 a 15/1, mais preferencialmente de 1/1 a 10/1. É preferencial uma mistura de fruto-oligossacarídeos de cadeia curta e galacto- oligossacarídeos de cadeia curta com um DP médio abaixo de 10, preferencialmente abaixo 6.
[097] A presente composição nutricional compreende preferencialmente de 1,75 a 17,5%, em peso, do teor total de oligossacarídeos não digeríveis, mais preferencialmente de 2,8 a 10.5%, em peso, com a máxima preferência de 4,2 a 7%, em peso, com base no peso seco da composição nutricional. Com base em 100 mL, a presente composição nutricional compreende preferencialmente de 0,25 a 2,5 g do teor total de oligossacarídeos não digeríveis, em peso, mais preferencialmente de 0,4 a 1,5 g, com a máxima preferência de 0,6 a 1 g, com base em 100 mL da composição nutricional. Uma quantidade mais baixa de oligossacarídeos não digeríveis será menos efetiva na melhora da função da barreira intestinal, enquanto que uma quantidade muito alta resultará em efeitos colaterais de inchaço e desconforto abdominal. A quantidade total de oligossacarídeos não digeríveis inclui galacto- oligossacarídeos, incluindo beta3’-GL, fruto-oligossacarídeos e quaisquer outros oligossacarídeos não digeríveis adicionais que podem ainda estar presentes na composição.
[098] É também importante que a composição nutricional de acordo com a presente invenção não tem uma densidade calórica excessiva, no entanto, ainda fornece calorias suficientes para alimentar o sujeito. Então, o alimento líquido tem preferencialmente uma densidade calórica entre 0,1 e 2,5 kcal/mL, mais preferencialmente uma densidade calórica entre 0,5 e 1,5 kcal/mL, até mais preferencialmente entre 0,6 e 0,8 kcal/mL, e com a máxima preferência entre 0,65 e 0,7 kcal/mL. Aplicação
[099] A presente composição nutricional é preferencialmente uma fórmula infantil, uma fórmula de seguimento ou uma fórmula para criança de primeira infância. Exemplos de uma fórmula para criança de primeira infância são leite para crianças que estão começando a andar (12 a 36 meses), fórmula para crianças que estão começando a andar e leite de crescimento. Mais preferencialmente, a composição nutricional é uma fórmula infantil ou uma fórmula de seguimento. A presente composição nutricional pode ser vantajosamente aplicada como uma nutrição completa para lactentes. Uma fórmula infantil é definida como uma fórmula para uso em lactentes e pode ser, por exemplo, uma fórmula de partida, destinada para lactentes de 0 a 6 ou de 0 a 4 meses de idade. Uma fórmula de seguimento é destinada para lactentes de 4 ou 6 meses até 12 meses de idade. Nesta idade, os lactentes iniciam o desmame com outros alimentos. Uma fórmula para criança de primeira infância, criança que está começando a andar ou leite de crescimento é destinada para crianças de 12 a 36 meses de idade. Preferencialmente, a presente composição nutricional é uma fórmula infantil.
[0100] A fórmula infantil, fórmula de seguimento ou fórmula para criança de primeira infância pode estar sob a forma de um líquido, preferencialmente um líquido pronto para beber, ou sob a forma de um pó. Em uma realização, a fórmula infantil, fórmula de seguimento ou fórmula para criança de primeira infância está sob a forma de um pó, adequado para ser reconstituído com água, para fornecer uma fórmula infantil pronta para beber, fórmula de seguimento ou fórmula para criança de primeira infância. Deve-se entender que quando a fórmula infantil, fórmula de seguimento ou fórmula para criança de primeira infância, de acordo com a invenção, está sob a forma de pó, as quantidades de todos os ingredientes, incluindo oligossacarídeos não digeríveis, 2’-FL e 3’-GL na dita fórmula são definidas conforme as quantidades que estariam presentes após a reconstituição do pó com água, isto é, as quantidades são definidas em mg por 100 mL, da fórmula pronto para beber.
[0101] A composição nutricional de acordo com a invenção é para uso no fornecimento de nutrição para um lactente ou criança de primeira infância, preferencialmente um lactente, preferencialmente até 12 meses de idade.
[0102] A fórmula infantil, fórmula de seguimento ou fórmula para criança de primeira infância, de acordo com a invenção, é para uso no fornecimento de nutrição para um lactente ou criança de primeira infância, preferencialmente até 12 meses de idade.
[0103] As realizações preferenciais descritas acima para a fórmula infantil, fórmula de seguimento e fórmula para criança de primeira infância, de acordo com a invenção, também se aplicam à presente fórmula para infantil para uso, fórmula de seguimento para uso e fórmula para criança de primeira infância para uso.
[0104] A invenção refere-se ainda a uma composição que compreende 2’-FL, butirato dietético e, opcionalmente, 3’-GL ou a composição de acordo com a invenção para uso como um medicamento. Preferencialmente, a dita composição é para uso na melhora da saúde intestinal em lactentes, em particular, da função da barreira intestinal e maturação intestinal, para uso na melhora da fisiologia intestinal, para uso na melhora da função da barreira intestinal, para uso na melhora da microbiota intestinal, em particular, para uso na redução de bactérias patogênicas intestinais, para uso no tratamento ou na prevenção de infecções, em particular, as infecções intestinais e/ou para uso no tratamento e/ou na prevenção de alergia, e/ou para uso na indução de tolerância oral a alérgenos.
[0105] Preferencialmente, a dito composição é para uso na melhora do sistema imune, preferencialmente para uso na redução da resposta de Th2.
[0106] Como a composição nutricional da invenção tem um efeito aprimorado na função da barreira intestinal, ela irá reduzir a translocação de alérgenos, toxinas e/ou patógenos e, dessa forma, irá prevenir e/ou tratar alergia e/ou prevenir ou tratar infecções. Como também se descobriu um efeito aprimorado na atividade de fosfatase alcalina intestinal, a composição nutricional irá reduzir os patógenos intestinais, através disso, prevenindo e/ou tratando infecções, em particular, as infecções intestinais. A melhora de maturação da lactase e proliferação celular intestinal é mais um indicativo de uma melhor maturação da barreira intestinal. A melhora na microbiota, um aumento nas bifidobactérias, um aumento na acidificação por fermentação e uma redução de patógenos foram observados. A melhora da microbiota intestinal e/ou do sistema imune, além disso, de forma benéfica, irá prevenir e/ou tratar alergia e infecções e, em particular, as infecções intestinais. Os efeitos no sistema imune terão um efeito na indução de tolerância oral a alérgenos.
[0107] Ambos os efeitos em IL-10, bem como com nos níveis de CCL20 indicaram uma modulação melhorada inesperada na responsividade de PBMC humana na presença de uma combinação de 2’-FL e butirato, o que é melhorada ainda mais quando 3’-GL está presente.
[0108] Como a composição nutricional da invenção tem um efeito aprimorado na diminuição da resposta de Th2, através disso, irá prevenir e/ou tratar alergia.
[0109] A composição nutricional de acordo com a invenção é preferencialmente para uso no fornecimento de nutrição para um lactente ou criança de primeira infância, preferencialmente um lactente, que sofre de alergia ou tem um risco aumentado para sofrer de alergia.
[0110] A invenção também se refere ao uso da composição nutricional de acordo com a presente invenção para fornecer nutrição para lactentes ou crianças de primeira infância, preferencialmente para fornecer nutrição para lactentes. Breve Descrição das Figuras
[0111] Figura 1: Efeitos de galactosil-lactoses diferentes (GLs) sobre o dano induzido por DON da integridade da monocamada de células Caco-2. As Figuras 1A e 1B mostram a resistência elétrica transepitelial (TEER) para diferentes GLs. As Figuras 1C e 1D mostram a translocação de amarelo Lúcifer (LYF) para o compartimento basolateral. TEER foi expressa como uma porcentagem do valor inicial e LYF foi expressa em ng/cm 2 x h, isto é, em ng/mL. alfa3’-GL é Gal (alfa 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc; beta3’-GL é Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc; beta4’-GL é Gal (beta 1-4) - Gal (beta 1-4) - Glc’; beta6’-GL é Gal (beta 1-6) - Gal (beta 1-4) - Glc. Os dados são a média ± e.p. *: p < 0,05 em comparação ao controle, **: p < 0,01 em comparação ao controle, ***: p < 0,001 em comparação ao controle, ^: p < 0,05 em comparação ao controle DON, ^^ p < 0,01 em comparação ao controle DON, ^^^ p < 0,001 em comparação ao controle DON.
[0112] Figura 2: Diferentes efeitos de GLs no aumento induzido por DON na liberação de IL8 pelas células Caco-2. A secreção de IL-8 é expressa como pg/mL como média ± e.p. alfa3’-GL é Gal (alfa 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc; beta3’-GL é Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc; beta4’-GL é Gal (beta 1-4) - Gal (beta 1-4) - Glc, beta6’-GL é Gal (beta 1-6) - Gal (beta 1-4) - Glc. Os dados são a média ± e.p. *: p < 0,05 em comparação ao controle, **: p < 0,01 em comparação ao controle, ***: p < 0,001 em comparação ao controle, ^: p < 0,05 em comparação ao controle DON, ^^ p < 0,01 em comparação ao controle DON, ^^^ p < 0,001 em comparação ao controle DON. Exemplos Exemplo 1 Fórmula Infantil com 2’-FL e Butirato Dietético Melhora a Expressão de Fosfatase Alcalina Intestinal
[0113] Duas fórmulas infantis foram submetidas a uma etapa de digestão in vitro e após a etapa de digestão in vitro o efeito na maturação da barreira intestinal foi examinado, em particular, a maturação de fosfatase alcalina (FA). A FA é uma enzima intestinal que é expressa e secretada pelos enterócitos e usada como marcador de diferenciação. A FA desempenha um papel fundamental na homeostase intestinal e na defesa imune inata por substâncias nocivas desfosforilantes como ligante de lipopolissacarídeo microbiana (endotoxina).
[0114] A fórmula infantil de controle era uma fórmula infantil não fermentados, suplementad< com oligossacarídeos não digeríveis (ccGos/clFOS) em uma quantidade de 0,8 mg/100 mL, quando na forma pronta para beber. O ccGOS sendo derivado do Vivinal GOS e o clFOS sendo derivado do RaftilineHP. O componente de gordura sendo principalmente óleos vegetais, óleo de peixe e óleo microbiano (fonte de ácido araquidônico). A quantidade de ácido butírico foi abaixo de 0,05%, em peso, com base no teor total de gordura.
[0115] A fórmula infantil ativa era a fórmula infantil parcialmente fermentada similar à do Exemplo 8, isto é, contendo adicionalmente 0,1 g de 2’- FL, o componente lipídico compreendendo cerca de 50%, em peso, de gordura de leite bovino, e tendo cerca de 1,5%, em peso, de ácido butírico, com base no teor total de ácidos graxos, cerca de 3,4 g de gordura por 100 mL, cerca de 0,28%, em peso, de ácido láctico, com base no peso seco, e cerca de 25 mg de 3’-GL por 100 mL, quando na forma pronta para beber. Digestão In Vitro
[0116] As fórmulas infantis foram preparadas a 13,7% (p/v) em água MiliQ e 35 mL foram transferidos para biorreatores em um modelo gastrointestinal semi-dinâmico controlado por computador, simulando as condições do lactente. Cada reator foi equipado com um eletrodo de pH e quatro linhas de dosagem. Cada linha de dosagem foi conectada a uma bomba adicionando tanto; a) ácido clorídrico 0,25m e b) bicarbonato de sódio 0,5 M para controle de pH como c) fluido gástrico simulado (FGS), d) fluido intestinal simulado (FIS). O pH foi controlado por padronização para 6,8 no início da digestão e, em seguida, reduzindo o pH gradualmente durante uma fase gástrica de 2 horas para 4,3. Na fase intestinal de digestão, o pH é gradualmente aumentado de 6,5 para 7,2 por 2 horas. Em t = 0 (o início da digestão), 5,8 mL de fluido salivar simulado (NaCl 100 mM, KCl 30 mM, CaCl₂ 1,4 mM, NaHCO₃ 14 mM, 0,6 mg/mL de α-amilase de Aspergillus oryzae (SIGMA, A9857)) foram adicionados como um bolus. A partir de t = 0, 12,25 mL de FGS (NaCl 100 mM, KCl 30 mM, CaCl₂ 1,4 mM, acetato de sódio 50 mM, 0,125 mg/mL de pepsina de mucosa gástrica suína (SIGMA, P7012) e 0,05 mg/mL de lipase de Rhizopus oryzae, Amano) foram gradualmente adicionados até t = 120 (o fim da fase gástrica). A fase intestinal consecutiva começou com o aumento de pH para 6,5, e a adição gradual de 31,5 mL de FIS (NaCl 100 mM, Kcl 10 mM, CaCl₂ 1,7 mM, 0,17 mg/mL de tripsina de pâncreas bovino (SIGMA, T9201), 0,18 mg/mL de quimiotripsina de pâncreas bovino (SIGMA, C4129), 0,09 mg/mL de lipase pancreática de pâncreas de suíno (SIGMA, L0382), 1,42 mg/mL de Taurocolato (SIGMA, 86339) e 0,6 mg/mL de tauroursodesoxicolato (SIGMA, T0266)). No final da digestão gastrointestinal simulada, foi obtida uma amostra de 5 mL, misturada com 5 mL de tampão inibidor de enzima (fosfato de sódio 0,1 M, pH 5,5, 0,58 mg/mL de inibidor de tripsina-quimiotripsina de Glycine max (SIGMA, T9777), 34,5 µg/mL de Orlistat (SIGMA, O4139)) congelada instantaneamente e armazenada a -20 ºC até o uso. Diferenciação Celular
[0117] Células da linhagem celular intestinal humana C2BBe1 (ATCC® ™ CRL-2102) expressando similares a enterócitos e borda estriada foram semeadas em 5000 células/poço em 96 poços de placas Nunc™ Edge e cultivadas até confluência em meio de Eagle modificado por Dulbecco (Catálogo n.º 30-2002) com 10% de soro bovino fetal, 1% de penicilina/estreptomicina e 0,01 mg/mL de transferrina humana. Após atingir a confluência, o meio de cultura foi substituído por fórmula infantil pré-digerida diluída em meio de cultura sem soro bovino fetal em concentrações finais de 0,34%, 0,17% e 0,085% (p/v) em quadruplicatas e incubadas a 37 ºC, 5 % de CO₂ por 96 horas, revigorando com a fórmula infantil pré-digerida diluída após 48 horas. No final do período de incubação, 50 µL de meio de cultura foram coletados por poço, as quadruplicatas foram agrupadas e armazenadas a -20 ºC até a medição da atividade de FA. Então, todos os poços foram lavados com solução salina tamponada com fosfato e resfriada em gelo, e a cada poço foram adicionados 100 µL de tampão Tris- HCL 50 mM, NaCl 150 mM, triton-100 0,5% em pH 7,0. Após incubação de 30 min em gelo, os lisados celulares foram coletados e o teor de proteína foi determinado com o uso do kit de ensaio Pierce BCA Protein, de acordo com as instruções do fabricante. A atividade de FA foi determinada pelo kit de ensaio colorimétrico de atividade de fosfatase alcalina Biovision, de acordo com as instruções do fabricante. A atividade de FA foi expressa como unidades/mg de proteína.
Resultados
[0118] A atividade de FA foi estatisticamente significativamente aumentada (p < 0,05, teste t) nos enterócitos que foram tratados com a fórmula infantil pré-digerida da invenção, em comparação aos enterócitos tratados com fórmula de controle pré-digerida. Este efeito foi dependente da dose e significativamente diferente em todas as concentrações testadas. O aumento na atividade de FA extracelular em comparação à fórmula de controle foi de 43%, 36% e 32% nas concentrações de fórmula infantil de 0,34, 0,17 e 0,085% (p/v), respectivamente, consulte a Tabela 1. Este aumento na atividade extracelular de FA é indicativo de uma maturação melhorada da função da barreira intestinal e uma defesa melhorada contra bactérias patogênicas intestinais. Tabela 1 Atividade de FA de Enterócitos Intestinais Expostos à Fórmula de Controle Pré-digerida ou Experimental em mU/mg de proteína. Diluição Concentração Fórmula Fórmula (x) de IF (g/100 mL) de controle de teste Média EPM Média EPM P* 40 0,34 0,84485 0,08992 1,20802 4,601E-02 0,023 80 0,17 1,16073 0,05346 1,57569 6,284E-02 0,007 160 0,085 1,49291 0,11494 1,96274 5736E-02 0,022 * valor-p determinado pelo teste t, bicaudal, com variâncias iguais para duas amostras. Exemplo 2 Fórmula Infantil com 2’-FL e Butirato Dietético Melhora a Expressão de Lactase Intestinal e Proliferação Celular
[0119] As composições nutricionais do Exemplo 1 foram testadas em um experimento similar, como Exemplo 1. Em vez de 13,7, foram usados 13,6% (p/v) da fórmula. Em vez de lipase de Rhizopus oryzae, foi usada lipase de coelho com 16,6 mg/mL (Germ, REG.340) na fase gástrica. Durante a fase intestinal, 0,06 mg/mL de lipase pancreática de pâncreas de suíno (Sigma, L0382) e 3,5 mg/mL de lipase pancreática de suíno (SIGMA L0126) foram usadas em vez de 0,09 mg/mL de lipase pancreática de suíno (Sigma, L0382).
[0120] A atividade de lactase foi medida pela mistura de 30 µL de lisado celular com 30 µL de tampão de ensaio (ácido maleico 0,625 M, lactose 0,12 M, pH 6,0) e incubados a 37ºC por 4 horas, a glicose resultante foi quantificada. A atividade de lactase foi expressa como µmol de glicose/min/mg.
[0121] Descobriu-se que a atividade de lactase foi significativamente aumentada quando as células foram tratadas com a fórmula infantil de teste experimental pré-digerida, em comparação à fórmula de controle pré-digerida, consulte a Tabela 2. Tabela 2 Atividade de Lactase em Enterócitos Intestinais Expostos à Fórmula de Controle Pré-digerida ou Experimental em mU/mg de Proteína. Diluição Concentração de Fórmula de Fórmula de (x) IF (g/100 mL) controle teste Média EPM Média EPM P* 80 0,17 0,63 0,02 0,816 0,008 0,001 160 0,085 0,69 0,01 0,831 0,037 0,020 * valor-p determinado pelo teste t, bicaudal, com variâncias iguais para duas amostras.
[0122] A atividade de lactase aumenta na diferenciação de enterócitos, seguida por um aumento na atividade de sacarase, depois da qual a atividade de lactase da borda estriada começa a cair. Visto que as células não apresentaram atividade de sacarase no momento da medição (dados não mostrados), um aumento da atividade de lactase é assim indicativo de um estado de células mais diferenciadas. Teste de Proliferação Celular
[0123] Células HT-29 de carcinoma de cólon humano similar às da cripta foram semeadas a 5,104 em placas de 96 poços Nunc™ Edge em meio DMEM com 10% de SFB, 1% de penicilina/estreptomicina e 1g/L de galactose. As células foram deixadas para aderir por 30 horas, período após o qual, foram substituídas por IF diluído digerido em meio de cultura sem soro bovino fetal em concentrações finais de 0,23%, 0,17% e 0,085% (p/v) em triplicatas. Diferentes taxas de proliferação celular resultaram em diferentes teores de proteína celular após 72 horas de incubação, estes foram medidos pela lise celular seguida pela determinação do teor de proteína com o Kit de ensaio Pierce BCA Protein, Thermo Fischer, de acordo com as instruções do fabricante.
[0124] A proliferação celular foi significativamente aumentada conforme mostrado por um aumento do teor de proteína celular de células tratadas com a fórmula infantil de teste experimental pré-digerida, em comparação à fórmula de controle pré-digerida (Tabela 3). Tabela 3 Proliferação (Proteína Celular ug/poço) de Enterócitos Intestinais Expostos à Fórmula de Controle Pré-digerida ou Experimental em mU/mg de Proteína. Diluição Concentração Fórmula de Fórmula de (x) de IF (g/100 mL) controle teste Média EPM Média EPM P* 80 0,17 21,2 0,1 23,9 0,6 0,011 160 0,085 21,4 0,3 23,9 0,6 0,018 * valor-p determinado pelo teste t, bicaudal, com variâncias iguais para duas amostras.
[0125] Para alcançar a sua função como barreira para o ambiente externo, o epitélio intestinal deve ser constantemente renovado. O crescimento e a renovação das células epiteliais do intestino dependem da proliferação de células nas criptas intestinais. Espera-se assim que a estimulação da taxa de proliferação suporte a função de barreira do intestino. Exemplo 3 3’-GL e 2’-FL Protegem contra a Ruptura da Barreira Intestinal e Previnem o Aumento de Permeabilidade.
[0126] Beta1,3’-galactosil-lactose (beta3’-GL), beta1,4’-galactosil- lactose (beta4’-GL) e beta1,6’-galactosil-lactose (beta6’-GL) foram obtidos junto à Carbosynth (Berkshire, Reino Unido). Alfa1,3’-galactosil-lactose (alfa3’-GL) foi obtido junto à Elicityl (Crolles, França). Desoxinivalenol purificado (DON) (D0156; Sigma Aldrich, St Luis, MO, EUA), foi dissolvido em etanol puro e armazenado a -20 ºC. As células de adenocarcinoma colorretal epitelial humano (Caco-2) foram obtidas junto à American Type Tissue Collection (código HTB-37) (Manasse, VA, EUA, passagem 90-102).
[0127] As células Caco-2 foram usadas de acordo com os métodos estabelecidos. Em resumo: as células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e semeadas a uma densidade de 0,3 x 105 células em insertos de 0,3 cm2 com alta densidade de poros (0,4 µm) com uma membrana de tereftalato de polietileno (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA) colocados em uma placa de 24 poços. As células Caco-2 foram mantidas em uma atmosfera umidificada de 95% de ar e 5 % de CO 2 a 37 ºC. Após 17 a 19 dias de cultivo, foi obtida uma monocamada confluente com uma resistência elétrica transepitelial média (TEER) excedendo 400 Ω cm 2 medida por um ohmímetro com sistema de resistência elétrica Millicell (Millipore, Temecula, CA, EUA).
[0128] As monocamadas de células Caco-2 foram, assim, cultivadas em um sistema de transpoços, que é um modelo para a função da barreira intestinal. As monocamadas foram pré-tratadas por 24 h com diferentes GLs, incluindo beta3’-GL, alfa3’-GL, beta4’-GL e beta6’-GL em uma concentração de 0,75%, em peso, do GL, antes de serem expostos à toxina fúngica desoxinivalenol (DON), que é composto acionador e modelo para prejudicar a barreira intestinal. DON foi diluído até uma concentração final de 4,2 µM em meio celular completo e adicionado ao lado apical, bem como ao lado basolateral dos insertos de transpoços. Esta concentração de DON não afetou a viabilidade das células Caco-2. A incubação com DON foi de 24 horas.
[0129] As medições da resistência elétrica transepitelial (TEER) e permeabilidade para amarelo Lúcifer (LY) foram conduzidas para investigar a integridade da barreira. Para as medições de TEER um voltímetro Millicel-ERS conectado a um par de varetas de eletrodo foi usado para medir os valores de
TEER. Os resultados são expressos como uma porcentagem do valor inicial. Para o ensaio de fluxo de traçador paracelular, a membrana impermeável a amarelo Lúcifer (LY) (Sigma, St Luis, MO, EUA) foi adicionada em uma concentração de 16 µg/mL ao compartimento apical na placa de transpoços por 4 h, e o fluxo paracelular foi determinado pela medição da intensidade de fluorescência no compartimento basolateral com um espetrofotômetro- fluorímetro (FLUOstar Labtech Optima, BMG, Offenburg, Alemanha) ajustado em comprimentos de onda de excitação e emissão de 410 e 520 nm, respectivamente. A liberação de interleucina-8 (IL-8 ou CXCL8), que é um marcador típico para inflamação, foi quantificada no meio do lado apical e do lado basolateral dos insertos de transpoços Caco-2 em resposta aos tratamentos. As concentrações de CXCL8 foram medidas pelo uso do ensaio ELISA de IL-8 humana (BD Biosciences, Pharmingem, San Diego, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Para mais detalhes sobre materiais e métodos consulte Akbari et al, 2016, Eur J Nutr. 56(5):1919-1930.
[0130] Os resultados são mostrados nas Figuras 1 A, B, C e D e na Figura 2. A Figura 1 mostra os efeitos de diferentes galactosil-lactoses (GLs) sobre o dano induzido por DON da integridade da monocamada de células Caco-
2. As Figuras 1A e 1B mostram a resistência elétrica transepitelial (TEER) para diferentes GLs. As Figuras 1C e 1D mostram a translocação de amarelo Lúcifer (LYF) para o compartimento basolateral. TEER foi expressa como uma porcentagem do valor inicial e LYF foi expressa em ng/cm 2xh. Alfa3’-GL é Gal (alfa 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc; beta3’-GL é Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc; beta4’-GL é Gal (beta 1-4) - Gal (beta 1-4) -; beta6’-GL é Gal (beta 1-6) - Gal (beta 1-4) - Glc. Os dados são a média ± e.p. *: p < 0,05 em comparação ao controle, **: p < 0,01 em comparação ao controle, ***: p < 0,001 em comparação ao controle, ^: p < 0,05 em comparação ao controle DON, ^^ p < 0,01 em comparação ao controle DON, ^^^ p < 0,001 em comparação ao controle DON.
[0131] Como pode-se observar a partir das Figuras 1A a D, a presença de DON danificou a função da barreira, conforme mostrado por uma diminuição no valor de TEER e um aumento no valor de fluxo de LY para as amostras de controle. Além disso, a presença de DON aumentou a liberação de CXCL8 (IL- 8), conforme mostrado na Figura 2. As Figuras 1A a D mostram ainda que a presença de beta3’-GL preveniu a perda induzida por DON da integridade da barreira epitelial, conforme medido pelo aumento de valores de TEER e uma redução no fluxo de LY afetado por DON através da monocamada epitelial intestinal.Beta4’-GL e beta6’-GL não mostrou um efeito significativo na função da barreira epitelial intestinal. Curiosamente, beta3’-GL, isto é, galactosil-lactose com uma ligação glicosídica β1-3, foi efetivo na proteção da função da barreira intestinal, considerando alfa3’-GL, isto é, galactosil-lactose com uma ligação glicosídica α1-3, não preveniu a ruptura da barreira intestinal induzida por DON. Ao contrário, todos os galactosil-lactoses foram capazes de diminuir a liberação de IL-8 induzido por DON, como é mostrado na Figura 2.
[0132] Estes resultados são indicativos para o efeito específico de beta3’-GL (no presente pedido também citado como beta1,3’-galactosil ou Gal (beta 1-3) - Gal (beta 1-4) - Glc) na proteção da função da barreira epitelial intestinal, em particular, sob condições de desafios, que vai além e/ou é independente de um efeito na prevenção de uma resposta inflamatória e/ou de um efeito sobre ou através da microbiota. Estes resultados são assim indicativos de um efeito de que beta3’-GL tem um aumento da função da barreira intestinal e/ou na prevenção e/ou no tratamento de ruptura da barreira intestinal. Além disso, estes resultados são indicativos de um efeito de beta3'-GL no tratamento, na prevenção e/ou na atenuação de uma condição associada à exposição a toxinas em um sujeito, em particular, quando a toxina é uma toxina tricoteceno e, mais em particular, quando a toxina é desoxinivalenol.
[0133] Em um experimento separado, o efeito de 2’-fucosil-lactose em TEER e o fluxo de LYF foi determinado no mesmo modelo. 2’-FL foi testado em uma concentração de 1 mg/mL, e descobriu-se a prevenção estatisticamente significativa da redução induzida DON em TEER e aumento LYF, consulte a Tabela 4. Isto é indicativo para o efeito vantajoso que 2’-FL tem na função da barreira intestinal. Portanto, este exemplo é indicativo de um efeito aprimorado adicional na função da barreira intestinal em uma composição, ao combinar 2’- FL e beta3’-GL. Tabela 4 Efeito de 2’-FL sobre o Dano Induzido por DON da Integridade da Monocamada de Células Caco-2. TEER (% do valor inicial) Fluxo de amarelo Lúcifer em Média (e.p.) ng/mL (cm2xh) Controle 101,3 (0,379) 302,7 (7,325) Controle com DON 34,33 (1,088)*** 530,8 (3,975)*** DON com 2’-FL (1 mg/mL) 42,79 (0,844)^^ 446,4 (8,302)^ *** p < 0,001 em comparação ao controle sem DON.
^^ p < 0,01 em comparação ao controle com DON, ^p < 0,05 em comparação ao controle com DON Exemplo 4 Butirato Melhora a Função da Barreira Intestinal
[0134] O efeito de butirato na função da barreira intestinal foi examinado. Métodos
[0135] As células epiteliais intestinais humanas T84 são comumente usadas para estudar a integridade da barreira intestinal in vitro. As células T84 (ATCC, EUA) foram cultivadas em insertos de transpoços de 12 mm (0,4 µm, Corning Costrar, EUA) em meio DMEM-F12 glutamax com penicilina- estreptomicina (100 UI/mL), suplementado com 5% de SFB-HI. As células T84 foram usadas 14 dias após atingir a confluência. Monocamadas de T84 cultivadas em filtros de transpoços foram pré-incubadas por 48 h com ou sem butirato. Estas amostras foram posteriormente incubadas por mais 48 h na presença de IL-4 (25 ng/mL). A IL-4 foi adicionada ao compartimento basolateral; o meio e os aditivos foram trocados a cada 24 horas.
[0136] A integridade da barreira epitelial foi avaliada medindo a resistência transepitelial (TEER; Ω x cm2) com o ohmímetro (EVOM; World Precision Instruments, Alemanha).
[0137] Os resultados são mostrados na Tabela 5, onde são apresentados os valores relativos de TEER. A coluna de 48 h e 96 h é o aumento de TEER em relação ao valor t = 0. O tratamento com IL-4 interrompeu a função da barreira intestinal; no entanto, na presença de butirato essa interrupção foi melhorada. Tabela 5 Efeito de Butirato na Função da Barreira Intestinal. Concentração de Ácido Butírico % de TEER em 48 h % de TEER em 96 h (IL-4) (mM) - 17 (12) 0 (4) 4 79 (25) 26 (16)
[0138] Portanto, este exemplo é indicativo de um efeito aprimorado adicional na função da barreira intestinal em uma composição, ao combinar 2’- FL e butirato dietético e, opcionalmente, beta3’-GL. Exemplo 5 Efeito de 2’-FL e (3’-GL e/ou Butirato) no Sistema Imunológico de Forma Diferente
[0139] A ativação de células imunes e as respostas foram determinadas pela cultura de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) na presença ou na ausência de 2’-FL, 3’-GL e ácido butírico com ou sem a estimulação de células T específicas. Material e Métodos
[0140] Isolamento de PBMC de doadores saudáveis: As células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) de doadores saudáveis foram isoladas a partir das camadas leucoplaquetária (Sanquin, Amsterdã, Países Baixos). As PBMC foram obtidas por centrifugação com o uso de tubos Leucosep (Greiner Bio-One). As PBMC foram coletadas e lavadas em PBS (Gibco, Thermo Fisher Technologies) + 2% de SFB inativadas por calor
(Invitrogen), seguido por lise hipotônica dos eritrócitos com solução de lise estéril (NH4Cl 0,15 M, KHCO3 0,01 M e EDTA 0,1 mM, pH de 7,4 a 4 ºC, todos da Merck, Darmstadt, Alemanha). Após a lise, as PBMC foram ressuspensas em meio de congelamento (70% de meio RPMI 1640 (Gibco, Thermo Fisher Technologies) suplementado com 10% de SFB inativado por calor e 100 U/mL de penicilina- estreptomicina, 20% de SFB inativado por calor e 10% de DMSO (Sigma)) e criopreservadas.
[0141] Modelo de ativação de PBMC: As PBMC (0,2·106 células/poço) foram cultivadas em placas de fundo plano com 96 poços (Corning). Por 24 horas, as células foram pré-incubadas com 2’-FL (Jennewein), 3’-GL (0 a 0,3% p/v; Carbosynth) ou butirato de sódio (0,2 mM; Sigma Aldrich) e combinações dos mesmos. Subsequentemente, as células foram ativadas com CD3/CD28 (Pelicluster CD3 and Pelicluster CD28, Sanquin) por mais 24 horas. Após a incubação, IFNγ foi medido por ELISA nos sobrenadantes (consulte abaixo). Para determinar a atividade celular após a estimulação, as PBMC foram incubadas com reagente de proliferação celular WST-1 (10 µL; Roche) e/ou Triton 10% (5 µL; controle negativo). Após 3 horas, a absorbância foi medida em OD450 nm e OD650 nm e a atividade celular foi calculada de acordo com as instruções do fabricante.
[0142] Produção de IFNγ por PBMC: As PBMC foram incubadas com reagentes indicados e após a incubação, os sobrenadantes foram coletados e os níveis de mediador foram medidos com o uso dos kits ELISA IFNγ (R&D Systems Europe Ltd.), de acordo com as instruções do fabricante.
[0143] Produção de citocinas de PBMC: As PBMC foram incubadas com os reagentes indicados. Após a incubação, os sobrenadantes foram coletados e os níveis de IL2, IL6, IL10, IL13, IL21, TNFα, IFNγ, MIF, CCL1, CCL13, CCL17, CCL20, CCL22 e CXCL8-11 foram medidos conduzindo um imunoensaio multiplex validado com base em Luminex technology (xMAP, Luminex Austin TX EUA). A aquisição foi realizada com o Biorad FlexMAP3D (Biorad Laboratories, Hercules EUA), em combinação com software xPONENT versão 4,2 (Luminex). Os dados foram analisados pelo ajuste de 5 curvas paramétricas com o uso de Bio-Plex, versão 6.1.1 (Biorad).
[0144] Após a estimulação de PBMC, os sobrenadantes de cultura celular foram coletados, período após o qual as respostas de citocinas foram medidas a fim de se testar a responsividade imune das células. Os níveis de citocinas medidos em condições estimuladas foram corrigidos para os níveis (baixos) das citocinas, medidos em condições não estimuladas. Além disso, uma vez que cada doador está reagindo em sua própria eficiência para o estímulo de células T, foi calculado o índice individual de citocinas dividindo a resposta induzida por intervenção pela resposta estimulada basal.
[0145] Geralmente, IL2, IL6, TNF-alfa, CCL1, CCL17, CCL20 são considerados como estando associados com inflamação e/ou proliferação. IFN- gama, CXCL9, CXCL10 e CXCL11 são considerados como estando associados a uma resposta Th1. IL13, CCL13, CCL22 são considerados como estando associados a uma resposta de Th2. IL10 e galectina-9 são considerados como estando associados a um efeito de Treg e IL21 está associado a um efeito de células B.
[0146] Análise estatística: A comparação entre os controles e estimuladas com CD3/CD28 foi feita com o uso de um teste t unicaudal pareado (Wilcoxon), p < 0,05 foi considerado significativamente diferente.
[0147] A média relativa ± EPM dos valores medidos e calculados na condição estimulada foram estatisticamente testados com o uso de teste t bicaudal pareado (Wilcoxon), p < 0,05 foi considerado significativamente diferente. Os valores de cálculo do efeito combinado dos ingredientes individuais foram baseados nos valores medidos por doador.
[0148] A atividade das células imunes conforme medida por WST foi significativamente aumentada após 24 h pela adição de 2’-FL, enquanto que uma diminuição na ativação foi detectada após a adição de 3’-GL. A adição de butirato não influenciou a atividade metabólica das células imunes nem em condições não estimuladas, nem sob condições estimuladas de células T (CD3/CD28).
[0149] A adição de 2’-FL alterou a resposta de citocinas, enquanto que a adição de 3’-GL não resultou nas mesmas alterações. É interessante notar que a adição de 3’-GL com 2’-FL pareceu estimular o desempenho de 2’-FL significativamente. Além disso, verificou-se que a diferença entre a resposta derivada de 3’-GL, 2’-FL e butato na atividade metabólica das células versus a produção de IFN-gama, é indicativo para outras respostas imunes a serem indiciadas.
[0150] No geral, conclui-se que o pool total de PBMCs humanas isoladas é um pool diverso de células imunes, que respondem diretamente e de forma diferente para HMOs fornecidos. Embora as células se tornem metabolicamente mais ativas, a produção de citocinas na presença de 2’-FL não é igual à produção de citocinas na presença de 3’-GL, sugerindo respostas reativas imunes diferenciais. O mesmo foi observado para a interação com 2’-FL e butirato. Resultados em 2’-FL e Ácido Butírico
[0151] A interleucina-10 (IL-10) não é uma citocina específica para tipo celular, mas é amplamente expressa por muitas células imunes. A indução de IL10 ocorre frequentemente em conjunto com outras citocinas pró-inflamatórias, embora as vias que induzem IL10 podem regular negativamente essas citocinas pró-inflamatórias. A IL10 tem um papel central na infecção pela limitação/regulação da resposta imune a patógenos e, assim, evitando danos para o hospedeiro. Portanto, a IL10 é geralmente considerada uma citocina regulatória. Os níveis de IL 10 foram medidos em culturas de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de 10 doadores humanos. Tabela 6 Níveis de IL10 em PBMC sob Condição Não Estimulada, Mostrados como Valores Relativos (Normalizados), em Comparação aos Valores em Branco (Blank), Corrigindo Assim a Variação de Doador Nível relativo de IL10, média (e.p.) branco (blank) 1 (0)
Nível relativo de IL10, média (e.p.) 2’-FL 0,2% p/v 3,361 (1,867) butirato 0,2 mM 1,911 (0,203) 0,2% p/v de 2’-FL + butirato 0,2 mM 14,77 (5,074)* Valor observado 0,2% p/v de 2’-FL + butirato 0,2 mM 4,272 (0,643) Valor calculado *: teste t bicaudal pareado (Wilcoxon), p <0,05, em comparação aos valores calculados.
[0152] Em PBMCs humanas cocultivadas com 2’-FL 0,2% um nível significativamente aumentado (p < 0,05) de IL10 foi detectado, em comparação aos controles em branco, enquanto que a adição de butirato não tem efeito nos níveis de IL10. A combinação de 2’-FL 0,2% e butirato 0,2 mM aumentou significativamente os níveis de IL10, em comparação ao controle em branco e ao butirato 0,2 mM. É interessante notar que a combinação de 2’-FL e butirato aumentou a IL10 para níveis mais altos do que teoricamente pode ser esperado, com base nos componentes individuais, consulte a Tabela 6. Isto é indicativo para uma capacidade reguladora aumentada benéfica e inesperada das PBMC humanas na presença de uma combinação de 2’-FL e butirato, em comparação aos ingredientes simples.
[0153] Em geral, CCL20 e CCR6 desempenham uma função no recrutamento de DCs imaturas e seus precursores para sítios de entrada potencial de antígeno. Dependendo do microambiente tecidual local (por exemplo, a presença de TGF-beta, IL10 ou IL15), as células imunes podem adquirir CCR6 funcional e, assim, migrarem para os sítios de produção de CCL20. Mostrou-se que CCL20 induz rapidamente a firme adesão de subconjuntos de linfócitos T isolados frescos para molécula de adesão intercelular-1. A regulação pode, portanto, ser obtida através da modulação de CCL20 em condições não estimuladas. Tabela 7 Níveis de CCL-20 em Condição Não Estimulada, Mostrados como Valores
Relativos, Corrigindo Assim a Variação de Doador Média de CCL-20 relativo (e.p.) branco (blank) 1 (0) 2-’FL 0,2% p/v 2,586 (0,281) 3’-GL 0,1% p/v 1,164 (0,212) butirato 0,2 mM 1,053 (0,127) 2’-FL 0,2% p/v + butirato 0,2 mM 4,955 (1,206)** Valor observado 2’-FL 0,2% p/v + 3’-GL 0,1% p/v + butirato 0,2 mM 8,127 (2,264)* Valor observado 2-FL 0,2% p/v + butirato 0,2 mM 2,639 (0,347) Valor calculado 2’-FL 0,2% p/v + 3’-GL 0,1% p/v + butirato 0,2 mM 2,803 (0,524) Valor calculado teste t bicaudal pareado (Wilcoxon): * p < 0,05, ** p < 0,01 em comparação ao valor calculado.
[0154] Em PBMCs humanas expostas a 2’-FL, foi detectado um nível aumentado de CCL20, em comparação ao controle em branco, enquanto que a adição de butirato ou de 3’-GL isoladamente não tem efeito significativo nos níveis de CCL20. A incubação de PBMCs humanas com a combinação de 2’-FL e butirato induziu significativamente níveis mais altos de CCL20, em comparação ao branco e butirato isoladamente. A presença adicional de 3’-GL nesta combinação de 2’-FL e butirato melhorou ainda mais os níveis de CCL20. Inesperadamente, os níveis observados da combinação de 2’-FL e butirato foram significativamente mais altos do que podem ser calculados, em peso, com base nos ingredientes individuais. Este foi também o caso quando o valor observado da combinação de 2’-FL, butirato e 3´’-GL foi comparado com o valor calculado teoricamente, em peso, com base nos ingredientes individuais, consulte a Tabela
7.
[0155] Estes dados indicam que a adição de 2’-FL e butirato influenciam a responsividade imune de PBMCs humanas. A presença adicional de 3’-GL melhora ainda mais a resposta imune. O pool total de PBMCs humanas isoladas é um pool diverso de células imunes, que respondem diretamente e de forma diferente para HMOs fornecidos. As alterações conforme detectadas em IL-10, bem como nos níveis de CCL20 são sugestivas para uma modulação melhorada inesperada na responsividade das PBMC humanas na presença de uma combinação de 2’-FL e butirato, o que é melhorado ainda mais quando 3’-GL está presente. Resultados em 2’-FL, 3’-GL e Sua Combinação
[0156] Foi estudado o efeito da cocultura com 2’-FL e 3’-GL e sua combinação nas culturas de PBMC de 10 doadores humanos. Primeiro foi determinado o efeito da estimulação específica de células T através de CD3/CD28.
[0157] Após a estimulação das PBMCs humanas, os sobrenadantes de cultura celular foram coletados, período após o qual as respostas de citocinas foram medidas a fim de se testar a responsividade imune das células. Mediante a estimulação específica de células T com CD3/CD28, várias citocinas foram detectados no sobrenadante de células com o uso da tecnologia Luminex. O tipo Th2 de citocinas IL-4 e IL-13, as quimiocinas CCL17 estavam significativamente aumentadas mostrando uma estimulação robusta das células T (Tabela 8). Tabela 8 Níveis de Citocina IL-4, IL-13 e Quimiocina CCL17 (pg/mL), conforme Medido em Sobrenadantes de Cultura Celular de PBMCs após Estimulação com CD3/CD28, em Comparação com as Condições Não Estimuladas. Estimulado com Não Estimulado CD3/CD28 Média (e.p.) Média (e.p.) IL-4 1,117 (0,062) 25,83 (5,45)*** IL-13 6 (0) 50,25 (9,13)*** CCL17 1,80 (0,267) 83,97 (19,89)*** Teste t unicaudal pareado (Wilcoxon) *p < 0,05, ** p< 0,01, ***p < 0,001, ****p <
0,0001 estimulado versus não estimulado
[0158] Subsequentemente, a fim de testar o efeito direto de compostos específicos na atividade de PBMC, as células foram ativadas com CD3/CD28 por 24 horas após um período de pré-incubação de 24h tanto com 2’-FL, 3’-GL como com combinações dos mesmos. Além disso, uma vez que cada doador está reagindo em sua própria eficiência para o estímulo de células T, foi calculado o índice individual de citocinas dividindo a resposta induzida por intervenção pela resposta estimulada basal (o branco é ajustado em 1). Desse modo, foi estudada a intervenção em 10 doadores.
[0159] IL-4 e IL-13 são citocinas intimamente relacionadas, conhecidas por regular muitos aspectos da inflamação alérgica. Elas desempenham um papel importante na regulação das respostas dos linfócitos, células mieloides e não-hematopoieticas. Por exemplo, nas células-T, IL-4 induz a diferenciação de células T CD4 virgens em tipo Th2 de células T, em células B, IL-4 direciona a troca de classe de imunoglobulina (Ig) para IgG1 e IgE, e em macrófagos, IL-4 e IL-13 induzem a ativação alternativa de macrófagos. Tabela 9 Nível relativo de IL-4, IL-13 e CCL17 em Condição Estimulada com CD3/CD28 com 2’-FL e 3’-GL, ou a Combinação. IL-4 IL-13 CCL17 Média (e.p.) Média (e.p.) Média (e.p) branco (blank) 1 (0) 1 (0) 1 (0) 0,2%, em peso, de 2’-FL 0,9887 (0,0517) 1,039 (0,080) 1,061 (0,117) 0,1%, em peso, de 3’-GL 0,5825 (0,0413) 0,5472 (0,0723) 0,6212 (0,0531) 0,2%, em peso, de 2’-FL + 0,1%, em peso, de 3’-GL 0,4290 (0,0280)* 0,4822 (0,0451)* 0,4647 (0,614)* Efeito observado 0,2%, em peso, de 2’-FL + 0,1%, em peso, de 3’-GL 0,5712 (0,062) 0,687 (90,090) 0,6822 (0,123) Efeito calculado * teste t unicaudal pareado (Wilcoxon), p <0,05, em comparação ao efeito calculado de 2’-FL + 3’-GL.
[0160] A estimulação de células T das PBMCs humanas resultou no aumento significativo de IL-4 e IL-13. A pré-incubação das células com 2’-FL não teve nenhum efeito sobre os níveis de IL-4 e IL-13, em comparação aos controles. No entanto, foi detectada uma diminuição na presença de 3’-GL, em comparação ao controle. Além disso, a combinação de 2’-FL e 3’-GL induziu significativamente níveis menores de IL-4 e IL-13, em comparação aos controle e 2’-FL. Curiosamente, estes níveis reduzidos de IL-4 e IL-13 foram significativamente menores do que poderia ser esperado, com base nos cálculos dos efeitos individuais de 2’-FL e 3’-GL, consulte a Tabela 9.
[0161] Esses dados mostram um tipo Th2 reduzido inesperado de responsividade mediante a estimulação de células T na população total de PBMC quando as células estão na presença de uma combinação de 2’-FL e 3’- GL, em comparação a 3’-GL ou 2’-FL isoladamente.
[0162] As citocinas regulam as respostas celulares em nível transcricional, enquanto que as quimiocinas desempenham uma função no recrutamento de células inflamatórias para os locais de inflamação. A quimiocina CCL17 (timo e quimiocina regulada por ativação) é um potente quimioatrativo para linfócitos Th2 e é acredita-se que desempenhem um papel importante nas doenças inflamatórias como alergia. No exemplo, os níveis de CCL17 no soro refletem acentuadamente a atividade da doença de dermatite atópica, que é considerada como sendo uma doença inflamatória da peleTh2-dominante, especialmente na fase aguda.
[0163] A estimulação de células T humanas resultou em aumento significativo em CCL17, consulte a Tabela 9. Embora a pré-incubação tanto com 2’-FL como 3’-GL não tenha tido efeito significativo nos níveis de CCL17 nas PBMCs estimuladas com células T, foi detectada uma diminuição significativa nos níveis de CCL17 quando as PBMCs ativadas foram pré-incubadas com 2’- FL e 3’-GL, em comparação a 2’-FL e 3’-GL isoladamente. Com base nas alterações induzidas por componentes individuais, em comparação aos níveis de controle, pode-se calcular a alteração esperada combinando as intervenções.
É interessante notar que quando as PBMCs estimuladas com células T foram cultivadas na presença da combinação de 2’-FL e 3’-GL, níveis menores de CCL17 foram induzidos além do esperado. As alterações nos níveis de CCL17 indicam uma redução inesperada da responsividade do tipo Th2 mediante a estimulação de células T na população total de PBMC quando as células estão na presença de uma combinação de 2’-FL e 3’-GL. Estes dados de CCL17 estão de acordo com os dados de IL-4 e IL-13.
[0164] O pool total de PBMCs humanas isoladas é um pool diverso de células imunes, que pode responder diretamente e de forma diferente para HMOs fornecidos. Embora as células se tornem metabolicamente mais ativas, os níveis de mediadores de Th2, IL-4, IL-13 e CCL17 não foram significativamente afetados por uma exposição a 2’-FL isoladamente, enquanto a exposição isolada a 3’-GL resultou em uma redução destes níveis de mediadores. Curiosamente, a exposição simultânea de 2’-FL e 3’-GL reduziu estatisticamente de forma significativa os níveis de IL-4, IL-13 e CCL17, reduzindo assim o tipo Th2 de respostas. Estes dados indicam que a adição de 3’-GL de 2’-FL tem o potencial de reduzir o desenvolvimento de alergia. Exemplo 6 2’-FL Aumenta a Formação de Butirate pela Microbiota, em Particular, se GOS Também Estiver Presente
[0165] Uma amostra fecal de um lactente saudável de 3 meses de idade que nasceu através de cesariana, amamentado exclusivamente sem histórico de uso de antibiótico, foi usado como inóculo para simular a microbiota intestinal de lactente nos compartimentos do cólon de um modelo dinâmico quad-SHIME® do trato gastrointestinal humano que compreende 4 unidades de SHIME ®, que funcionam em paralelo e cada unidade de SHIME® é composta por 3 reatores simulando o estômago e o intestino delgado, cólons proximal e distal.
[0166] Os perfis de SCFA mostraram que o acetato é o mais abundante no cólon distal, seguido por propionato (Tabela 10). As concentrações de acetato e propionato foram maiores na presença de ccGOS/clFOS e ccGOS/lcFOS/2’-
FL do que no controle e nas unidades suplementadas com 2’-FL. Observações similares também foram observadas nos cólons proximais (dados não mostrados). Curiosamente, foi gerado butirato anteriormente no cólon distal e em uma concentração mais alta na presença de 2’-FL e ccGOS/clFOS/2’-FL em relação ao controle e aos grupos ccGOS/clFOS. O nível de isobutirato, um AGCC ramificado resultante da fermentação proteolítica, foi reduzido no cólon distal na presença de ccGOS/clFOS/2’-FL e ccGOS/clFOS. Tabela 10 Ácidos Graxos de Cadeia Curta Produzidos nos Cólons Distais de Unidades de SHIME® Não Suplementadas (Controle) e Suplementadas no Dia1 até o Dia3 (D1 a D3), do Dia 4 até o Dia 11 (D4 - D11) e no Dia 12 até o Dia D15 (D12 - D15).
Controle ccG/clF 2’-FL 2’-FL + ccG/clF D1-D3 D4-D11 D12-D15 D1-D3 D4-D11 D12-D15 D1-D3 D4-D11 D12-D15 D1-D3 D4-D11 D12-D15 Acetato 37 27,77 27,31 58,83 84,3 82,13 38,67 26,22 22,96 58,5 83,94 84,43 (Média ± ± 3,77 ± 2,32 ± 5,43 ± 17,67 ± 9,8 ± 3,35 ± 10,25 ± 0,97 ± 1,04 ± 9,26 ± 6,8 ± 9,20 DP) Propion ato 10 6,58 6,5 13,83 18,75 18,63 10,17 6,58 6,13 14,17 20,17 21,50 (Média ± ± 1 ± 0,58 ± 1,08 ± 3,4 ± 3,5 ± 1,03 ± 3,01 ± 0,49 ± 0,63 ± 1,04 ± 2,36 ± 2,55 DP) Butirato 0 0,05 0,71 0 0,04 0,29 0 0,74 0,99 0 0,64 1,06 (Média ± ±0 ± 0,12 ± 0,15 ±0 ± 0,1 ± 0,08 ±0 ± 0,49 ± 0,09 ±0 ± 0,32 ± 0,15 DP) Iso- Butirato 0 0,6 1,29 0 0,43 0,20 0 0,68 0,93 0 0,16 0 (Média ± ± 0 ± 0,93 ± 0,28 ±0 ± 0,49 ± 0,23 ±0 ± 0,75 ± 0,21 ±0 ± 0,19 ± 0 DP)
[0167] Os dados do glicoperfil revelaram que 2’-FL não foi metabolizado quando suplementado isoladamente, mas somente utilizado na presença de ccGOS/clFOS quando foi lentamente metabolizado em todo o cólon proximal e distal. Todos os outros carboidratos incluindo ccGOS foram esgotados na primeira hora no cólon proximal.
[0168] Demonstrou-se que 2’-FL foi fermentado somente na presença de outros GOS, em particular, GOS/clFOS resultando em um ecossistema microbiano que é sugerido como conferindo benefícios à saúde.
[0169] ccGOS/clFOS/2’-FL reforçaram a produção de butirato, um AGCC importante para a função de barreira do intestino. ccGOS/clFOS/2’-FL resultou em um nível surpreendentemente menor de isobutirato, o que é uma indicação de uma menor atividade proteolítica no cólon. Exemplo 7 Inibição de Patógenos na Microbiota por 2’-FL, 3’-GL e Butirato
[0170] A fermentação anaeróbica de amostras de pasta fluida fecal foi testada em um mini multifermentador microfluídico BioLector Pro. As amostras de pasta fluida fecal foram coletadas de lactentes amamentados e de lactentes alimentados com fórmula. Estas amostras de pasta fluida fecal foram processadas pela adição de 0,6 gramas de fezes em 40 mL de meio Baby Reichardt V.6 + muco + sulfato de amônio + lactato e acetato. As soluções resultantes foram inseridas no mini multifermentador microfluídico BioLector Pro. As amostras de teste foram suplementadas com 3-GL, 2’-FL, 3-GL + 2’-FL e GOS/FOS. A amostra de controle foi suplementada com água estéril.
[0171] Além disso, as amostras de teste foram suplementadas com Clostridium difficile C153 (ágar difficile), Salmonella enteriditis S29 (ágar XLD), Cronobacter sakasakii E71 (ágar cromogênico) ou Klebsiella pneumonia K2 (ágar citrato de inositol Simons). Para cada OND e para o controle uma cultura livre do patógeno foi também preparada.
[0172] Após a fermentação, as soluções fermentadas foram testadas quanto ao teor de AGCC (em particular, ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico e ácido isobutírico), teor de amônia, teor de lactato e concentração do patógeno. Também, o isolamento de DNA + a identificação e o sequenciamento 16s foram realizados para determinar a composição da microbiota.
[0173] Foi usada uma placa de 32 poços que pode lidar com pH baixo. Os poços desta placa foram preenchidos com solução fecal. 2,5% (p/v) de diferentes soluções estéreis de carboidrato (3’-GL, 2’-FL, 2’-FL/3’-GL (2,0 + 0,5%)) e glicose foram adicionados à pasta fluida fecal de acordo com um modelo.
[0174] O experimento foi iniciado, e o ajuste de pH foi tanto 5,5 (inóculo facial de 1 lactente, nascido por via vaginal, amamentados, com 5 meses de idade) como pH 6,0 (inóculo de 2 lactentes, nascidos por via vaginal, amamentados, com 5 meses de idade), com regulação contínua do pH, e temperatura de 37 ºC, umidade 85%, controle de OD. Em 4, 8 e 24 horas, retirou- se uma amostra para determinação de UFC em ágar TOS-propionato MUP (Bifidobactérias totais), ágar XLD para Salmonella enteriditis S29, e ágar citrato de inositol Simons Klebsiella pneumonia K2 para AGCC, análise de D- e L-lactato e amônia. O pélete fecal foi usado para o sequenciamento de DNA de 16s.
[0175] Para ambos os inóculos, o grau de fermentação, conforme medido por consumo de NaOH, isto é, produção de ácido foi mais alto com a combinação de 3’-GL/2’-FL, em comparação a 3’-GL ou 2’-FL isoladamente. A taxa de acidificação inicial foi alta para 3’-GL e para 3’-GL/2’-FL. Em geral, 2’-FL isoladamente resultou em acidificação mais lenta e menor. Como a quantidade de carboidratos que pode ser fermentada é a mesma nos recipientes de reação, a maior a acidificação total com a combinação é indicativa de um efeito sinérgico inesperado da combinação de 2’-FL e 3’-GL. O AGCC produzido foi para a maior parte de ácido acético. Foi também produzido ácido L-láctico.
[0176] O crescimento de bifidobactérias foi observado com 3’-GL, 2’-FL e com a mistura de 2’-FL/3’-GL e a estimulação do crescimento foi, em geral, muito similar. No entanto, em 24 h o nível mais alto foi observado com a mistura de 3’-GL/2’-FL 1 para o bebê 1. O crescimento de Enterobacteriaceae foi também observado, e foi muito similar mediante as condições testadas, mas foi menor em 8 h para a combinação de 2’-FL/3’-GL para o inóculo do bebê 1. Os dados de sequenciamento de 16s da microbiota neste ponto no tempo mostraram que foi observada uma diminuição relativa do filo de Proteobacteria (principal contribuinte sendo o gênero Escherichia). No final da fermentação, quando os carboidratos foram esgotados, a microbiota alimentada com 2’-FL/3’-GL foi capaz de reter uma composição de microbiota mais positiva do que a dos controles (glicose e branco (blank). Para o inóculo do bebê 2, o efeito sobre as bifidobactérias foi maior na presença de 3’-GL, e o efeito de redução do crescimento nas enterobacteriacea foi melhor quando foi usada uma combinação de 3’-GL/2’-FL.
[0177] Sob as condições em que os recipientes foram reforçados com a mistura de patógenos, em geral, uma acidificação ligeiramente reduzida foi observada em comparação às condições onde não havia reforço com patógenos. No entanto, os efeitos de 2’-FL, 3’-GL e 2’-FL/3’-GL na acidificação, conforme determinado pelo consumo de NaOH, não foram afetados, e novamente foi mais alto com 3’-GL/2’-FL para ambos os inóculos. Para o inóculo do bebê 1, o crescimento de Salmonella foi mais restrito por 2’-FL, enquanto que o crescimento de Klebsiella foi mais inibido pela combinação de 3’-GL/2’-FL. Para o inóculo do bebê 2, o crescimento de Salmonella foi mais restrito por 2’- FL, enquanto que o crescimento de Klebsiella foi mais inibido por 3’-GL ou a combinação de 3’-GL/2’-FL. Para ambos os inóculos, o crescimento de C. difficile foi restrito sob todas as condições.
[0178] Estes resultados são indicativos de um efeito aprimorado na função da composição da microbiota intestinal e a combinação da composição de 2’-FL e 3’-GL indo além dos efeitos de 2’-FL isoladamente ou de 3’-GL isoladamente. Isto indica que uma composição com butirato dietético e 2’-FL terá um efeito aprimorado adicional na microbiota quando mais 3’-GL estiver presente. Exemplo 8 Fórmula Infantil
[0179] Fórmula infantil, destinada para lactentes de 0 a 6 meses de idade, compreendendo por 100 mL, após reconstituição, 13,7 g de pó para um volume final de 100 mL: - 66 kcal, - 1,3 g de proteína (proteína de soro do leite/caseína na razão, em peso, 1/1), - 7,3 g de carboidratos digeríveis (sendo principalmente lactose), - 3,4 gramas de gordura (das quais cerca de 50%, em peso, de gordura de leite, sendo o restante, óleos vegetais, óleo de peixe e óleo microbiano). Com base no teor total de ácidos graxos, a quantidade de ácido butírico é de 1,48%, em peso, a quantidade de ácido araquidônico é de 0,52%, em peso, a quantidade de ácido eicosapentaenoico é de 0,11%, em peso, a quantidade de ácido docosahexaenoico é de 0,52%, em peso, - 0,9 g de oligossacarídeos não digeríveis, dos quais 0,1 g de 2’-FL (fonte, Jennewein), 0,08 g de fruto-oligossacarídeos de cadeia longa (fonte, RaftilineHP), 0,72 g de galacto-oligossacarídeos (dos quais cerca de 25 mg de 3’-galactosil-lactose obtidos por fermentação, sendo o restante galacto- oligossacarídeos da Vivinal GOS), - Minerais, vitaminas, oligoelementos e outros micronutrientes estão de acordo com as diretivas para as fórmulas infantis. - Parte da fórmula, cerca de 26%, em peso, com base no peso seco, é derivada do produto fermentado Lactofidus pelas linhagens S. thermophilus e B. breve, resultando em cerca de 0,28%, em peso, de ácido láctico, com base no peso seco da composição, dos quais mais de 95%, em peso, está na forma L. Exemplo 9 Fórmula de Seguimento
[0180] Fórmula de seguimento, destinada para lactentes com mais de 6 meses de idade, compreendendo por 100 mL, após reconstituição, 14,55 g de pó para um volume final de 100 mL: - 68 kcal, - 1,36 g de proteína (proteína de soro do leite/caseína na razão, em peso, 4/6),
- 8,1 g de carboidratos digeríveis (sendo principalmente lactose), - 3,2 gramas de gordura (das quais cerca de 50%, em peso, de gordura de leite, sendo o restante, óleos vegetais, óleo de peixe e óleo microbiano). Com base no teor total de ácidos graxos, a quantidade de ácido butírico é de 1,47%, em peso, a quantidade de ácido araquidônico é de 0,29%, em peso, a quantidade de ácido eicosapentaenoico é de 0,12%, em peso, a quantidade de ácido docosahexaenoico é de 0,56%, em peso, - 0,85 g de oligossacarídeos não digeríveis, dos quais 0,05 g de 2’-FL (fonte, Jennewein), 0,08 g de fruto-oligossacarídeos de cadeia longa (fonte, RaftilineHP), 0,72 g de galacto-oligossacarídeos (dos quais cerca de 25 mg de 3’-galactosil-lactose obtidos por fermentação, sendo o restante galacto- oligossacarídeos da Vivinal GOS), - Minerais, vitaminas, oligoelementos e outros micronutrientes estão de acordo com as diretivas para as fórmulas infantis. - Parte da fórmula, cerca de 26%, em peso, com base no peso seco, é derivada do produto fermentado Lactofidus pelas linhagens S. thermophilus e B. breve, resultando em cerca de 0,28%, em peso, de ácido láctico, com base no peso seco da composição, dos quais mais de 95%, em peso, está na forma L. Exemplo 10 Fórmula para Criança de Primeira Infância
[0181] Fórmula de seguimento, destinada para crianças de primeira infância com mais de 12 meses de idade até 36 meses de idade, compreendendo por 100 mL, após reconstituição, 15,07 g de pó para um volume final de 100 mL: - 65 kcal, - 1,3 g de proteína (proteína de soro do leite/caseína na razão, em peso, 4/6), - 8,7 g de carboidratos digeríveis (sendo principalmente lactose), - 2,6 gramas de gordura (das quais cerca de 10%, em peso, de gordura de leite, sendo o restante, óleos vegetais, óleo de peixe). Com base no teor total de ácidos graxos, a quantidade de ácido butírico é cerca de 0,35%, em peso, a quantidade de ácido eicosapentaenoico é de 0,42%, em peso, a quantidade de ácido docosahexaenoico é de 0,63%, em peso, - 1,22 g de oligossacarídeos não digeríveis, dos quais 0,02 g de 2’-FL (fonte, Jennewein), 0,12 g de fruto-oligossacarídeos de cadeia longa (fonte, RaftilineHP), 1,08 g de galacto-oligossacarídeos (dos quais cerca de 17 mg de 3’-galactosil-lactose obtidos por fermentação, sendo o restante galacto- oligossacarídeos da Vivinal GOS), - Minerais, vitaminas, oligoelementos e outros micronutrientes estão de acordo com as diretivas para as fórmulas infantis. - Parte da fórmula, cerca de 18%, em peso, com base no peso seco, é derivada do produto fermentado Lactofidus pelas linhagens S. thermophilus e B. breve, resultando em cerca de 0,2%, em peso, de ácido láctico, com base no peso seco da composição, dos quais mais de 95%, em peso, está na forma L.

Claims (14)

Reivindicações
1. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL PARA LACTENTES OU CRIANÇAS DE PRIMEIRA INFÂNCIA, a qual não é leite humano, caracterizada por compreender: a. 2’-fucosil-lactose (2’-FL), e b. butirato dietético.
2. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender ainda beta 3’-galactosil-lactose (beta3’-GL).
3. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, sendo a composição caracterizada por ser pelo menos parcialmente fermentada por bactérias produtoras de ácido láctico e compreender de 0,1 a 1,5%, em peso, da soma de ácido láctico e lactato, com base no peso seco da composição nutricional, e em que pelo menos 90%, em peso, da soma de ácido láctico e lactato é ácido L-láctico e L-lactato.
4. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, sendo a composição caracterizada por compreender ainda LC-PUFA selecionado a partir do grupo dentre DHA, ARA e EPA, preferencialmente DHA e EPA, preferencialmente DHA, EPA e ARA, em que a composição nutricional compreende preferencialmente pelo menos 1%, em peso, da soma de DHA, ARA e EPA, com base no teor total de ácidos graxos.
5. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pela fórmula compreender ainda galacto- oligossacarídeos e/ou fruto-oligossacarídeos.
6. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, sendo a composição nutricional caracterizada por ser selecionada a partir do grupo que consiste em uma fórmula infantil, uma fórmula de seguimento ou uma fórmula para criança de primeira infância, preferencialmente uma fórmula infantil.
7. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, sendo a composição caracterizada por compreender (i) 0,02 a 1 g de 2’-FL por 100 mL da composição nutricional; (ii) 0,15 a 7,5%, em peso, com base no peso seco; e/ou (iii) 0,03 a 1,5 g por 100 kcal.
8. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, sendo a composição nutricional caracterizada por compreender (i) 0,010 a 0,250 g de beta3’-GL por 100 mL; (ii) 0,075 a 2%, em peso, com base no peso seco; e/ou (iii) 0,015 a 0,4 g por 100 kcal.
9. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, sendo a composição nutricional caracterizada por compreender (i) 0,3 a 5%, em peso, de butirato dietético, com base no teor total de ácidos graxos; (ii) 10 mg a 175 mg por 100 mL; (iii) 15 a 250 mg por 100 kcal; e/ou (iv) 0,075 a 1,3%, em peso, com base no peso seco da composição nutricional.
10. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, sendo a composição nutricional caracterizada por compreender (i) 0,2 a 5 g, da soma de galacto-oligossacarídeos e fruto- oligossacarídeos por 100 mL; e/ou (ii) 0,3 a 7,5 g por 100 kcal, 1,5 a 35%, em peso, com base no peso seco.
11. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada por se destinar ao uso na melhora da função da barreira intestinal e/ou ao uso na melhora do sistema imune e/ou ao uso na melhora da microbiota intestinal e/ou ao uso no tratamento ou na prevenção de infecções.
12. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada por se destinar ao uso no tratamento ou na prevenção de alergia, preferencialmente ao uso na indução de tolerância oral a alérgenos.
13. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 12, sendo a composição nutricional caracterizada por ser administrada a lactentes ou crianças de primeira infância, preferencialmente lactentes.
14. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada por fornecer nutrição a lactentes ou crianças de primeira infância, preferencialmente para fornecer nutrição a lactentes.
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