BR112021006153A2 - anticorpo monoclonal beta amiloide anti-n-truncado humanizado - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a anticorpos humanizados que ligam peptídeos amiloides, cujos anticorpos compreendem mutações nos domínios variáveis de cadeia pesada e/ou cadeia leve, cujas mutações melhoram a atividade de ligação. Os anticorpos podem ser úteis no tratamento da doença de Alzheimer (AD).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTI- CORPO MONOCLONAL BETA AMILOIDE ANTI-N-TRUNCADO HUMANIZADO, SEU USO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA". Campo

[0001] A presente invenção se refere a anticorpos humanizados que se ligam a peptídeos amiloides. Antecedentes

[0002] O anticorpo murino antiamiloide beta (Aβ) NT4X-167 foi ini- cialmente criado contra o peptídeo amiloide Aβ4-40 e é relatado como se ligando especificamente aos peptídeos amiloides N-truncados AβpE3-42 e Aβ4-42, mas não ao peptídeo amiloide Aβ1-42 (Antonios et al Acta Neuropathol. Commun. (2013) 6 1 56). A imunização passiva usando NT4X-167 demonstrou ser terapeuticamente benéfica em mo- delos de camundongos com Alzheimer (Antonios et al Scientific Re- ports 5 17338; 2015).

[0003] Versões humanizadas de NT4X-167 seriam úteis para apli- cações clínicas, por exemplo, no tratamento da doença de Alzheimer (AD). Sumário

[0004] Os presentes inventores descobriram inesperadamente que a atividade de ligação de versões humanizadas do anticorpo NT4X- 167 é melhorada por mutação de certos resíduos dentro dos domínios variáveis de cadeia pesada e/ou da cadeia leve. Isto pode ser útil, por exemplo, no desenvolvimento de moléculas candidatas para uso clíni- co.

[0005] Um primeiro aspecto da invenção fornece um anticorpo an- ti-Aβ compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, em que a) o domínio variável de cadeia pesada (domínio VH) compreende SEQ ID NO: 2 com quatro ou menos alterações adicio-

nais, tais como substituições, nas regiões estruturais, e b) o domínio variável de cadeia leve (domínio VK) com- preende SEQ ID NO: 6, opcionalmente com até quatro ou menos alte- rações adicionais, tais como substituições, nas regiões estruturais.

[0006] O anticorpo anti-Aβ pode ligar-se especificamente a peptí- deos amiloides truncados N-terminal (AβpE3-x ou Aβ4-x). Por exem- plo, o anticorpo anti-Aβ pode ligar-se especificamente a um ou mais, preferivelmente todos, AβpE3-38, AβpE3-40, AβpE3-14, AβpE3-42, Aβ4-38, Aβ4-40, Aβ4-14 e Aβ4-42

[0007] O anticorpo anti-Aβ pode exibir nenhuma ligação específica a peptídeos amiloides de comprimento total ou peptídeos amiloides sem truncamentos N terminais (Aβ1-x), tais como Aβ1-42, Aβ1-38, Aβ1-40 ou Aβ1-14.

[0008] Preferivelmente, o domínio variável de cadeia pesada (do- mínio VH) do anticorpo anti-Aβ compreende SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5.

[0009] Preferivelmente, o domínio variável de cadeia leve (domínio VL) do anticorpo anti-Aβ compreende SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8.

[0010] Um segundo aspecto aqui descrito fornece uma composi- ção farmacêutica compreendendo um anticorpo do primeiro aspecto e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0011] Um terceiro aspecto aqui descrito fornece um ácido nuclei- co que codifica um anticorpo do primeiro aspecto ou um domínio vari- ável de cadeia pesada e/ou domínio variável de cadeia leve do mes- mo.

[0012] Um quarto aspecto aqui descrito fornece um vetor que compreende um ácido nucleico do terceiro aspecto.

[0013] Um quinto aspecto aqui descrito fornece uma célula hospe- deira compreendendo um ácido nucleico do terceiro aspecto ou um vetor do quarto aspecto.

[0014] Um sexto aspecto aqui descrito fornece um método para preparar um anticorpo de acordo com o primeiro aspecto, o método compreendendo expressar, em uma cultura de células hospedeiras, um vetor de acordo com o quarto aspecto para produzir o referido anti- corpo; e recuperar o anticorpo da cultura de células.

[0015] Um sétimo aspecto aqui descrito fornece um método de tratamento da doença de Alzheimer pela administração, a um indivíduo em necessidade de tratamento, de uma quantidade eficaz de um anti- corpo de acordo com o primeiro aspecto ou a composição farmacêuti- ca de acordo com o segundo aspecto.

[0016] Um oitavo aspecto aqui descrito fornece um anticorpo de acordo com o primeiro aspecto ou a composição farmacêutica de acordo com o segundo aspecto, para uso em um método de tratamen- to do corpo humano ou animal.

[0017] Um nono aspecto aqui descrito fornece um anticorpo de acordo com o primeiro aspecto ou a composição farmacêutica de acordo com o segundo aspecto, para uso em um método de tratamen- to da doença de Alzheimer em um indivíduo.

[0018] Estes e outros aspectos e modalidades aqui descritos são descritos em mais detalhes abaixo. Breve Descrição das Figuras

[0019] A Figura 1 mostra a ligação do anticorpo NT4X-167 de mu- rino a peptídeos amiloides.

[0020] A Figura 2 mostra a ligação do anticorpo NT4X-167 de mu- rino e quimérico a peptídeos amiloides PSL

[0021] A Figura 3 mostra a ligação de NT4X-167 murino, humani- zado e quimérico aos peptídeos amiloides AβpE3-42: Versões iniciais

[0022] A Figura 4 mostra a ligação de variantes humanizadas a Aβ1-42.

[0023] A Figura 5 mostra a ligação de variantes humanizadas a

AβpE3-42.

[0024] A Figura 6 mostra a ligação da segunda rodada de anticor- pos NT4X-167 humanizados ao peptídeo AβpE3-42: Versões de HC a HR em combinação com RKA

[0025] A Figura 7 mostra a ligação da segunda rodada de anticor- pos NT4X-167 humanizados ao peptídeo AβpE3-42 por ELISA.

[0026] A Figura 8 mostra a ligação da terceira rodada de anticor- pos NT4X-167 humanizados ao peptídeo AβpE3-42: Versões de HS a HY em combinação com RKA

[0027] A Figura 9 mostra a ligação da quinta rodada de anticorpos NT4X-167 humanizados ao peptídeo AβpE3-42: versões rcNT4XS6A, rcNT4XS7A, rcNT4XS8A em combinação com RKA

[0028] A Figura 10 mostra a estabilidade térmica do rcNT4 huma- nizado X_SA, BA, TA, UA, VA, WA, YA ligação do anticorpo ao peptí- deo amiloide AβpE3-42

[0029] A Figura 11 mostra a Análise de Deslocamento Térmico do anticorpo rcNT4X_SA e rcNT4X_S7A humanizado.

[0030] A Figura 12 mostra as interações proteína-proteína não es- pecíficas (cromatografia de interação cruzada)

[0031] A Figura 13 mostra as interações proteína-proteína não es- pecíficas (cromatografia de interação cruzada) do candidato a líder humanizado rcNT4XS7A

[0032] A Figura 14 mostra os candidatos a anticorpos purificados avaliados quanto à solubilidade

[0033] A Figura 15 mostra a ligação da avaliação da estabilidade do soro do anticorpo rcNT4X_SA e rcNT4X_S7A humanizado ao pep- tídeo amiloide PSL AβpE3-42

[0034] A Figura 16 mostra a avaliação da estabilidade do soro do anticorpo rcNT4X_SA e rcNT4X_S7A humanizado ligado ao peptídeo amiloide Anaspec Aβ4-42

[0035] A Figura 17 mostra a quantidade de proteção fornecida aos neurônios embrionários primários de rato in vitro pelo rcNT4X_SA e rcNT4X_S7A humanizado, anticorpos de morte celular induzida por peptídeo amiloide 4-42.

[0036] A Figura 18 mostra a quantidade de proteção fornecida aos neurônios embrionários primários de rato in vitro pelo rcNT4X_SA e rcNT4X_S7A humanizado, anticorpos de morte celular induzida pelo peptídeo amiloide (AβGlp3)3-42.

[0037] A Figura 19 mostra a quantidade de proteção fornecida aos neurônios embrionários primários de rato in vitro pelo rcNT4X_SA e rcNT4X_S7A humanizado, anticorpos de morte celular induzida pelo peptídeo amiloide Aβ1-42.

[0038] A Figura 20 mostra a quantidade de proteção fornecida aos neurônios CNS.4U humanos in vitro pelo rcNT4X_SA e rcNT4X_S7A humanizado, anticorpos de morte celular induzida pelo peptídeo ami- loide Aβ4-42.

[0039] A Figura 21 mostra a quantidade de proteção fornecida aos neurônios CNS.4U humanos in vitro pelo rcNT4X_SA e rcNT4X_S7A humanizado, anticorpos de morte celular induzida pelo peptídeo ami- loide AβpE3-42.

[0040] A Figura 22 mostra a quantidade de proteção fornecida aos neurônios CNS.4U humanos in vitro pelo rcNT4X_SA e rcNT4X_S7A humanizado, anticorpos de morte celular induzida pelo peptídeo ami- loide Aβ1-42.

[0041] A Figura 23 mostra que a perda de neurônios no hipocam- po de camundongos Tg4-42 de 6 meses de idade é resgatada por am- bos os anticorpos rcNT4X. Quantificação de neurônios no CA1 usando estereologia imparcial. Número de neurônios no hipocampo de ca- mundongos Tg4-42 de seis meses de idade após imunização passiva com rcNT4X_SA e rcNT4X_S7A. Camundongos Tg4-42 imunizados com anticorpos rcNT4X exibiram significativamente mais neurônios do que camundongos injetados com IgG1 da mesma idade. Análise de variância unilateral (ANOVA) seguida por comparações múltiplas de Bonferroni; n = 5-6. *p <0,05; ***p <0,001; dados apresentados como média ± S.E.M.

[0042] A Figura 24 mostra que rcNT4X_S7A tem a maior potência no resgate de perda de neurônios em Tg4-42. Uma comparação de dados do NT4X original com rcNT4X_SA e rcNT4X_S7A. Teste T en- tre NT4X e rcNT4X_S7A. n = 5-7. *p <0,05; dados apresentados como média ± S.E.M.

[0043] A Figura 25 mostra que não há diferença significativa entre o anticorpo IgG1 de controle de MRCT em comparação com os grupos de controle IgG2b e PBS. Os dados dos grupos IgG2ba e PBS retira- dos de Antonios et al. [6]. Nem os testes t nem ANOVA mostraram di- ferenças significativas. Dados apresentados como média ± S.E.M. n = 5-7.

[0044] A Figura 26 mostra que a imunização passiva com rcNT4X_ S7A resgata os déficits de aprendizagem em camundongos Tg4-42. Camundongos Tg4-42 que receberam injeções semanais com o anti- corpo e um anticorpo de controle IgG1 (controle MRCT) por um perío- do de 12 semanas. Os camundongos foram testados aos 6 meses de idade no Morris Water Maze. A memória de referência espacial foi pre- judicada em camundongos Tg4-42 tratados com anticorpos de controle de MRCT, pois eles não mostraram preferência pelo quadrante alvo no teste da sonda. Em contraste, os camundongos Tg4-42 imunizados com o anticorpo rcNT4X_S7A não exibiram déficit de aprendizagem. ***p <0,001; **p <0,01; *p <0,05. n = 8 por grupo. Análise de variância unilateral (ANOVA) seguida por comparações múltiplas de Bonferroni. T quadrante alvo, L quadrante esquerdo, R quadrante direito, O qua- drante oposto. Dados apresentados como média ± S.E.M; m = meses.

[0045] A Figura 27 mostra que cargas de placa cortical reduziram em camundongos 5XFAD imunizados. Análise de carga de placa de camundongos 5XFAD imunizados com rcNT4X_SA e rcNT4X_S7A em comparação com camundongos 5XFAD injetados com IgG1. (a) Imu- nocoloração com um anticorpo contra pan-Aβ mostrou redução na carga de placa após a imunização com rcNT4X_S7A, mas não no gru- po imunizado com rcNT4X_SA. (b) Ambos os grupos tratados com rcNT4X mostraram depósitos fibrilares Aβ significativamente reduzidos demonstrados pela coloração com Tioflavina S. (c) Imunocoloração com um anticorpo contra Aβ1-x mostrou redução na carga da placa após a imunização com rcNT4X_S7A, mas não no grupo imunizado com rcNT4X_SA. (d) Imunocoloração com um anticorpo contra piroglu- tamato Aβ3-x revelou uma carga de placa reduzida com ambos os an- ticorpos rcNT4X, que no entanto foi apenas significativa para o anti- corpo rcNT4X_S7A e com uma tendência para o anticorpo rcNT4X_SA (e) Imunocoloração com um anticorpo contra Aβ4-x revelou uma carga de placa reduzida com ambos os anticorpos rcNT4X. Análise de vari- ância unilateral (ANOVA) seguida pelo teste de comparação múltipla de Dunnett contra o grupo de controle; n = 7-11; ***p <0,001, **p <0,01, *p <0,05 dados apresentados como média ± S.E.M. Descrição Detalhada

[0046] Esta invenção refere-se à descoberta de que a atividade de ligação de versões humanizadas do anticorpo murino antiamiloide beta (Aβ) NT4X-167 é significativamente melhorada pela mutação de certos resíduos dentro dos domínios variáveis.

[0047] Um anticorpo anti-Aβ como aqui descrito pode compreen- der um domínio variável de cadeia pesada (VH) e um domínio variável de cadeia leve (VL). O domínio variável de cadeia pesada pode com- preender a SEQ ID NO: 2 com quatro ou menos mutações de aminoá- cidos adicionais, por exemplo substituições, deleções ou inserções,

nas regiões estruturais.

[0048] O anticorpo pode se ligar especificamente a peptídeos ami- loides truncados N terminais, por exemplo, peptídeos amiloides modifi- cados com piroglutamato (pE) (também referidos como AβpE3-x, AβpGlu3-x, Aβ (Glp3) 3-x, e p3-x), tais como AβpE3-38, AβpE3-40, AβpE3-14 e AβpE3-42, e peptídeos amiloides não modificados com piroglutamato, tais como Aβ4-38, Aβ4-40, Aβ4-14 e Aβ4-40. A ligação pode ser determinada, por exemplo, usando um anticorpo anti-Aβ aqui descrito em um formato de IgG1 usando técnicas padrão, tais como ELISA ou Ressonância de Plasmon de Superfície, conforme descrito abaixo.

[0049] A VH pode compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; ou SEQ ID NO: 2 com, independentemente, 1 ou mais, por exemplo 2, 3 ou 4 mais outras alterações de aminoácidos ou mu- tações nas regiões estruturais em relação à SEQ ID NO: 2 (por exem- plo, substituições, deleções ou exclusões de aminoácidos inserções), preferivelmente substituições. As outras alterações de aminoácidos ou mutações nas regiões estruturais podem estar em resíduos diferentes de 27F, 29L, 63R e 70V, preferivelmente em resíduos diferentes de 27F, 29L, 63R, 70V, 52BX1, 52CX6, 53X2, 54X3, 55X4 e 56X5 de SEQ ID NO: 2.

[0050] O domínio VL pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou SEQ ID NO: 6 com, independentemente, 1 ou mais, por exemplo 2, 3 ou 4 mais alterações de aminoácidos ou mutações nas regiões estruturais em relação à SEQ ID NO: 6 (por exemplo, substituições, deleções ou inserções de aminoácidos individuais), pre- ferivelmente substituições. As outras alterações de aminoácidos ou mutações nas regiões estruturais podem estar em resíduos diferentes de 92X7 de SEQ ID NO: 6.

[0051] As substituições podem ser substituições conservativas.

Por exemplo, um anticorpo anti-Aβ aqui descrito pode compreender um domínio VH de SEQ ID NO: 3, 4 ou 5, opcionalmente com 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos nas regiões estruturais. Um anti- corpo anti-Aβ aqui descrito pode compreender um domínio VL de SEQ ID NO: 7 ou 8, opcionalmente com 1, 2, 3 ou 4 substituições de ami- noácidos nas regiões estruturais.

[0052] Um anticorpo anti-Aβ adequado pode compreender (i) o domínio VH de SEQ ID NO: 3 e o domínio VL de SEQ ID NO: 7, (ii) o domínio VH de SEQ ID NO: 4 e o domínio VL de SEQ ID NO: 7, (iii) o domínio VH de SEQ ID NO: 5 e o domínio VL de SEQ ID NO: 7 (iv) o domínio VH de SEQ ID NO: 3 e o domínio VL de SEQ ID NO: 8 (v) o domínio VH de SEQ ID NO: 4 e o domínio VL de SEQ ID NO: 8 e/ou (vi) o domínio VH de SEQ ID NO: 5 e o domínio VL de SEQ ID NO: 8. Alguns anti- Os anticorpos Aβ podem compreender o domínio VH de SEQ ID NO: 5 e o domínio VL de SEQ ID NO: 8.

[0053] Os termos "imunoglobulina" e "anticorpo" podem ser usa- dos indistintamente para se referir a qualquer proteína compreendendo um sítio de ligação a antígeno do anticorpo que tem a capacidade de se ligar especificamente a um ou mais antígenos.

[0054] Um "antígeno" é uma entidade (por exemplo, uma entidade proteica ou peptídeo) à qual uma imunoglobulina ou anticorpo (ou fra- gmento de ligação a antígeno do mesmo) se liga especificamente. Os antígenos de um anticorpo anti-Aβ aqui descritos podem incluir os pep- tídeos amiloides N-truncados AβpE3-42 e Aβ4-42.

[0055] Os anticorpos nativos são geralmente glicoproteínas hete- rotetraméricas de cerca de 150.000 Daltons, compostas por duas ca- deias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfe- to covalente, com vários números de ligações dissulfeto entre as ca- deias pesadas de diferentes isótipos de anticorpos. Cada cadeia pe-

sada e leve também tem pontes dissulfureto intracadeias regularmente espaçadas.

[0056] Os anticorpos compreendem regiões globulares de polipep- tídeos de cadeia pesada ou leve denominados "domínios". Um domí- nio pode compreender alças de peptídeo, geralmente 3 a 4 alças, que são estabilizadas, por exemplo, por folha plissada β e/ou ligação dis- sulfeto intracadeia. Os domínios são geralmente referidos como "cons- tantes" ou "variáveis", com base na relativa falta de variação de se- quência dentro dos domínios de vários membros da classe no caso de um domínio "constante", ou a variação significativa dentro dos domí- nios de vários membros da classe no caso de um domínio "variável". "Domínios" de anticorpos ou polipeptídeos são frequentemente referi- dos indistintamente na técnica como "regiões" de anticorpos ou poli- peptídeos.

[0057] Os domínios "constantes" de uma cadeia leve de anticorpo podem ser referidos como "regiões constantes de cadeia leve", "domí- nios constantes de cadeia leve", regiões "CL" ou domínios "CL". Os domínios "constantes" de uma cadeia pesada de anticorpo podem ser referidos como "regiões constantes de cadeia pesada", "domínios constantes de cadeia pesada", regiões "CH" ou domínios "CH". O do- mínio constante de cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante de cadeia pesada. O domínio constante de cadeia pesada que compreende a região da cauda do anticorpo é aqui referido como o domínio Fc (fragmento cristalizável) ou região Fc. A região Fc pode interagir com os receptores Fc da superfície celular e algumas proteí- nas do sistema complemento, método pelo qual o anticorpo pode ati- var o sistema imunológico. As regiões Fc contêm três domínios cons- tantes de cadeia pesada em cada cadeia polipeptídica.

[0058] Os domínios "variáveis" de uma cadeia leve de anticorpo podem ser referidos como "regiões variáveis de cadeia leve", "domí-

nios variáveis de cadeia leve", regiões "VL" ou domínios "VL" (o 'L' aqui se referindo a 'leve' em vez do isótipo de cadeia leve 'lambda'). Os domínios "variáveis" de uma cadeia pesada de anticorpo podem ser referidos como "regiões variáveis de cadeia pesada", "domínios variáveis de cadeia pesada", regiões "VH" ou domínios "VH". As ca- deias leves intactas têm, por exemplo, dois domínios (VL e CL) e as cadeias pesadas intactas têm, por exemplo, quatro ou cinco domínios (VH, CH1, CH2 e CH3).

[0059] Os domínios variáveis de cadeia leve e pesada incluem "regiões hipervariáveis" (HVR ou HV), também conhecidas como "re- giões determinantes de complementaridade" (CDRs), que são hiperva- riáveis em sequência e podem formar alças estruturalmente definidas. Geralmente, os anticorpos compreendem seis regiões hipervariáveis; três na cadeia pesada (H1, H2, H3) e três na cadeia leve (L1, L2, L3) intercaladas entre regiões estruturais relativamente conservadas (FRs). Nos anticorpos aqui descritos, as sequências de aminoácidos dos domínios variáveis são mostradas abaixo. As CDRs podem ser facilmente identificadas nessas sequências usando técnicas padrão (vide por exemplo, Kabat, E.A., Wu, T.T., Perry, H.M., Gottesmann, K.S & Foeller, C. (1991). Sequences of Proteins of Immunological In- terest, 5ª edição, NIH Publication No. 91-3242. Departamento de Saú- de e Serviços Humanos dos EUA). Na nomenclatura Kabat, VHCDR1 está localizada nas posições 31-35, VHCDR2 está localizada nas po- sições 50-65, VHCDR3 está localizada nas posições 95-102, VLCDR1 está localizada nas posições 24-34, VLCDR2 está localizada nas posi- ções 50-56, e VLCDR3 está localizada nas posições 89-97.

[0060] As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada formam o sítio de ligação a antígeno. O termo "sítio de ligação a antí- geno" refere-se a um sítio que se liga especificamente (imunorreage com) um antígeno. Os anticorpos aqui descritos compreendem pelo menos um sítio de ligação a antígeno, preferivelmente compreendendo dois sítios de ligação a antígeno. Um sítio de ligação a antígeno é for- mado a partir das CDRs das cadeias pesada e leve, alinhadas pelas regiões estruturais, que permitem a ligação a um epítopo específico. Uma "região de ligação a antígeno" ou "domínio de ligação a antígeno" é uma região ou domínio do anticorpo que inclui um sítio de ligação do anticorpo. Os anticorpos aqui descritos têm pelo menos um sítio de ligação a antígeno que reconhece os peptídeos amiloides AβpE3-42 e Aβ4-42.

[0061] Cadeias de anticorpos de ocorrência natural ou cadeias de anticorpos produzidas de forma recombinante podem ser expressas com uma sequência líder que é removida durante o processamento celular para produzir uma cadeia madura. As cadeias maduras tam- bém podem ser produzidas de forma recombinante, contendo uma se- quência líder de ocorrência não natural, por exemplo, para aumentar a secreção ou alterar o processamento de uma cadeia de interesse par- ticular.

[0062] As regiões constantes das cadeias pesadas e leves de um anticorpo podem apresentar variação fenotípica. As cadeias leves de anticorpos são classificadas como kappa (κ) ou lambda (λ) com base na sequência de aminoácidos da região constante de cadeia leve e têm cerca de 230 resíduos de comprimento. Um anticorpo aqui des- crito compreende uma cadeia leve kappa (o domínio variável de ca- deia leve kappa é aqui referido como VK).

[0063] Cadeias pesadas de humanos e mamíferos superiores são classificadas como gama (γ), mu (µ), alfa (α), delta (δ) ou épsilon (ε), têm cerca de 450-600 resíduos de comprimento e definem o isótipo do anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Existem duas subclasses de IgM (H e L), três subclasses de IgA (IgA1, IgA2 e IgA secretora) e quatro subclasses de IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4).

Um anticorpo aqui descrito é preferivelmente um anticorpo imunoglo- bulina G (IgG). Um anticorpo aqui descrito é mais preferivelmente um anticorpo IgG4ou um anticorpo IgG1 com função efetora mínima.

[0064] Os anticorpos aqui descritos podem compreender cadeias pesadas que pertencem a qualquer um dos isótipos de imunoglobulina aqui descritos. Os anticorpos aqui descritos podem compreender se- quências de mais de uma classe ou isótipo.

[0065] Um anticorpo anti-Aβ aqui descrito pode exibir atividade citotóxica. Em tal anticorpo, o domínio constante é geralmente um do- mínio constante de fixação de complemento e a classe é tipicamente IgG1. Os isótipos humanos IgG1 e IgG4 são exemplares.

[0066] Um anticorpo aqui descrito pode compreender um fragmen- to de um anticorpo completo. O termo "fragmento" refere-se a uma parte ou porção de um anticorpo ou cadeia de anticorpo compreen- dendo menos resíduos de aminoácidos do que um anticorpo ou cadeia de anticorpo intacto ou completo, em que a porção retém preferivel- mente pelo menos uma, preferivelmente a maioria ou todas as funções normalmente associadas a essa porção quando presente em um anti- corpo intacto. Os fragmentos podem ser obtidos por meio de tratamen- to químico ou enzimático de um anticorpo ou cadeia de anticorpo in- tacto ou completo. Os fragmentos também podem ser obtidos por mei- os recombinantes.

[0067] Os fragmentos dos anticorpos aqui descritos podem se ligar ao antígeno ou competir com o anticorpo intacto (ou seja, com o anti- corpo intacto do qual foram derivados) pela ligação a antígeno (ou se- ja, ligação específica). Os anticorpos aqui descritos ligam-se aos pep- tídeos amiloides AβpE3-42 e Aβ4-42. Os fragmentos de ligação são produzidos por técnicas de DNA recombinante ou por clivagem enzi- mática ou química de imunoglobulinas intactas.

[0068] Os anticorpos aqui descritos podem existir como fragmen-

tos de ligação, incluindo, mas não se limitando a, Fab, Fab', F(ab')2, F(ab')2 quimicamente ligado, Fab2 monoespecífico, Fab2 biespecífico, Fab2 triespecífico, IgG monovalente, scFv (fragmento variável de ca- deia única), di-scFv (scFv divalente), diacorpo biespecífico, triacorpo triespecífico, scFv-Fc, minicorpo ou sdAb (anticorpo de domínio único) e retém a capacidade de se ligar aos peptídeos amiloides AβpE3-42 e Aβ4-42 .

[0069] Um anticorpo aqui descrito pode ser parte de um anticorpo biespecífico ou triespecífico. Um biespecífico é um anticorpo híbrido artificial com dois pares de cadeia pesada/leve diferentes e dois sítios de ligação a antígeno diferentes; um anticorpo triespecífico é um anti- corpo híbrido artificial com três pares de cadeias pesadas/leves dife- rentes e três sítios de ligação a antígeno diferentes. Os anticorpos bi- específicos e triespecíficos podem ser produzidos por uma variedade de métodos, incluindo fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab'. Vide, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992). Um anticorpo exemplar aqui descrito pode ser um anticorpo biespecífico compreendendo pelo menos dois sítios de ligação a antí- geno diferentes.

[0070] A ligação específica refere-se à situação em que um anti- corpo não mostrará qualquer ligação significativa a moléculas diferen- tes de seu epítopo específico em um antígeno. O termo também é aplicável onde, por exemplo, um domínio de ligação a antígeno é es- pecífico para um epítopo particular que é transportado por uma série de antígenos, caso em que o anticorpo que transporta o domínio de ligação a antígeno será capaz de se ligar aos vários antígenos que transportam o epítopo.

[0071] Os anticorpos anti-Aβ aqui descritos, ou ácidos nucleicos que codificam tais anticorpos, estarão em um estado isolado. Os anti-

corpos e ácidos nucleicos estarão livres ou substancialmente livres de material com o qual estão naturalmente associados, como outros poli- peptídeos ou ácidos nucleicos com os quais são encontrados em seu ambiente natural, ou o ambiente em que são preparados (por exemplo, cultura de células) quando tal a preparação é por tecnologia de DNA recombinante praticada in vitro ou in vivo. Os anticorpos e o ácido nu- cleico podem ser formulados com diluentes ou adjuvantes e ainda para fins práticos ser isolados - por exemplo, os anticorpos serão normal- mente misturados com gelatina ou outros veículos se usados para re- vestir placas de microtitulação para uso em imunoensaios, ou serão misturados com produtos farmaceuticamente aceitáveis veículos ou diluentes quando usados em diagnóstico ou terapia.

[0072] Outro aspecto da invenção fornece um ácido nucleico que codifica um anticorpo ou uma cadeia leve, cadeia pesada, domínio VH ou domínio VL do mesmo, como aqui divulgado. Um ácido nucleico pode, por exemplo, codificar um domínio variável de cadeia pesada (domínio VH) compreendendo SEQ ID NO: 2, como SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5 e/ou uma variável de cadeia leve do- mínio (domínio VK) compreendendo SEQ ID NO: 6, tal como SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8, como descrito acima. Opcionalmente, o do- mínio VH codificado e/ou domínio VL pode ter até quatro mutações de aminoácidos adicionais na região estrutural.

[0073] Os ácidos nucleicos podem incluir sequências de DNA e RNA, em que as nucleobases de timina são substituídas por uracila.

[0074] Um anticorpo aqui descrito pode ser produzido por expres- são recombinante. Os ácidos nucleicos conforme descrito acima, que codificam regiões variáveis de cadeia leve e pesada opcionalmente ligadas a regiões constantes, podem ser inseridos em vetores de ex- pressão. Os vetores que compreendem ácidos nucleicos que codifi- cam anticorpos aqui descritos são eles próprios um aspecto da inven-

ção. As cadeias leve e pesada podem ser clonadas no mesmo ou em diferentes vetores de expressão. Os ácidos nucleicos que codificam as cadeias de anticorpos aqui descritos podem ser operacionalmente li- gados a uma ou mais sequências de controle no vetor (s) de expres- são que asseguram a expressão das cadeias de anticorpos. As se- quências de controle de expressão incluem, mas não estão limitadas a, promotores (por exemplo, promotores naturalmente associados ou heterólogos), sequências de sinal, elementos potenciadores e sequên- cias de terminação da transcrição. Preferivelmente, as sequências de controle de expressão são sistemas promotores eucarióticos em veto- res capazes de transformar ou transfectar células hospedeiras eucarió- ticas (por exemplo, células COS, CHO ou Expi293). Esses vetores po- dem ser incorporados em um aplicativo hospedeiro apropriado, em que o hospedeiro é mantido em condições adequadas para um alto nível de expressão das sequências de nucleotídeos e a coleta e purifi- cação dos anticorpos.

[0075] Aspectos da invenção fornecem um ácido nucleico que co- difica um anticorpo aqui descrito; um vetor, preferivelmente um vetor de expressão, compreendendo um ou mais ácidos nucleicos que codi- ficam um anticorpo aqui descrito; e um vetor compreendendo um ou mais ácidos nucleicos que codificam um anticorpo aqui descrito, ope- racionalmente ligado a um promotor. Vetores de expressão exempla- res são pHuK e pHuG1 que, em combinação com os ácidos nucleicos aqui divulgados, compreendem sequências de nucleotídeos que codi- ficam os anticorpos aqui descritos. Outros vetores que fornecem se- quências de nucleotídeos que codificam as regiões constantes das ca- deias leve e pesada do anticorpo também podem ser usados.

[0076] Os vetores de expressão para uso como aqui descrito são tipicamente replicáveis nos organismos hospedeiros como epissomas ou como uma parte integrante do DNA cromossômico do hospedeiro.

Comumente, os vetores de expressão contêm marcadores de seleção (por exemplo, resistência à ampicilina, resistência à higromicina, resis- tência à tetraciclina, resistência à canamicina ou resistência à neomi- cina) para permitir a detecção dessas células transformadas com as sequências de DNA desejadas (vide, por exemplo, Itakura et al. US4704362) .

[0077] As células hospedeiras podem ser transformadas com os vetores de expressão e cultivadas em meio nutriente convencional conforme apropriado para induzir promotores, selecionar transforman- tes e/ou amplificar os genes que codificam as sequências necessárias. Uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico ou vetor descrito acima é fornecida como um aspecto da invenção.

[0078] Outro aspecto da invenção fornece um método para fazer um anticorpo aqui descrito, o método compreendendo a expressão, em uma cultura de células hospedeiras, um vetor aqui descrito para produzir o referido anticorpo e recuperar o anticorpo da cultura de cé- lulas. Este método pode compreender a transferência de um vetor compreendendo um ou mais ácidos nucleicos que codificam um anti- corpo ou cadeias de anticorpos, como descrito acima, em uma célula hospedeira, como aqui descrito, cultivando a cultura de células hospe- deiras em condições que permitem a expressão do ácido (s) nucleico (s) e recuperar o anticorpo expresso. Qualquer método adequado co- nhecido na técnica pode ser empregado.

[0079] Organismos hospedeiros microbianos adequados para uso na clonagem e expressão dos ácidos nucleicos e vetores aqui descri- tos incluem hospedeiros procarióticos; Escherichia coli, bacilos, como Bacillus subtilis, e outras enterobacteriaceae, como Salmonella, Serra- tia e várias espécies de Pseudomonas. Nestes hospedeiros procarióti- cos, também se pode fazer vetores de expressão, que irão conter tipi- camente sequências de controle de expressão compatíveis com a cé-

lula hospedeira (por exemplo, uma origem de replicação). Além disso, qualquer número de uma variedade de promotores bem conhecidos estará presente, tal como o sistema promotor da lactose, um sistema promotor do triptofano (trp), um sistema promotor da beta-lactamase ou um sistema promotor do fago lambda. Os promotores irão tipica- mente controlar a expressão, opcionalmente com uma sequência de operador, e terão sequências de sítio de ligação ao ribossoma e seme- lhantes, para iniciar e completar a transcrição e tradução. Os vetores para uso em células procarióticas também podem exigir um compo- nente de origem de replicação.

[0080] Outros micróbios, como levedura, também podem ser usa- dos para expressar os ácidos nucleicos ou vetores aqui descritos. Saccharomyces é um hospedeiro de levedura preferido, com vetores adequados tendo sequências de controle de expressão (por exemplo, promotores), uma origem de replicação, sequências de terminação e semelhantes, conforme desejado. Promotores típicos incluem 3- fosfoglicerato quinase e outras enzimas glicolíticas. Os promotores de levedura induzíveis incluem, entre outros, promotores de álcool desi- drogenase, isocitocromo C e enzimas responsáveis pelo uso de malto- se e galactose.

[0081] Além de micro-organismos, a cultura de células de tecido de mamífero também pode ser usada para expressar os ácidos nuclei- cos ou vetores aqui descritos e produzir os polipeptídeos de anticorpos (por exemplo, polinucleotídeos que codificam anticorpos ou fragmen- tos dos mesmos (vide, por exemplo, Winnacker, From Genes to Clo- nes, VCH Publishers, Nova Iorque 1987). Um hospedeiro de células eucarióticas ou de mamífero compreendendo um ácido nucleico ou vetor aqui descrito é ele próprio um aspecto da invenção. As células eucarióticas são realmente preferidas, porque um número de linha- gens de células hospedeiras adequadas capazes de secretar proteí-

nas heterólogas (por exemplo, anticorpos intactos) foram desenvolvi- das na técnica e incluem linhagens de células CHO, várias linhagens de células COS, células HeLa, células Expi293, células ExpiCHO, li- nhagens de células de mieloma ou células B transformadas ou hibri- domas. As células podem ser humanas ou não humanas, por exemplo, células de mamíferos não humanos. Em algumas modalidades preferi- das, as células são células humanas Expi293. Os anticorpos aqui des- critos podem ser produzidos em linhagens de células projetadas para produzir proteínas afucosiladas, como a linhagem de células Potelli- gent® CHOK1SV (BioWa/Lonza), células construídas com GlymaxX® (ProBioGen) ou a linhagem de células-tronco embrionárias de pato EB66 (Valneva). Expressão vetores para células de mamíferos geral- mente incluem, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, um ou mais genes marcadores, um elemento potenciador, um promotor e sítios de informação de processamento necessários, tais como sítios de ligação ao ribossomo, sítios de emen- da de RNA, sítios de poliadenilação e sequências terminadoras da transcrição. As sequências de controle de expressão preferidas são promotores derivados de genes de imunoglobulina, SV40, adenovírus, vírus do papiloma bovino, citomegalovírus e semelhantes (vide por exemplo Co et al., J. Immunol. 148: 1149 1992).

[0082] Um vetor aqui descrito para uso em uma célula hospedeira eucariótica também pode codificar uma sequência de sinal ou outro polipeptídeo tendo um sítio de clivagem específico no terminal N da cadeia ou polipeptídeo de anticorpo maduro. As sequências de sinal adequadas podem ser heterólogas e podem ser reconhecidas e pro- cessadas (isto é, clivadas por uma peptidase de sinal) pela célula hos- pedeira. Na expressão de células de mamíferos, estão disponíveis se- quências de sinal de mamífero, bem como líderes secretores virais, por exemplo, o sinal gD de herpes simplex.

[0083] Alternativamente, as sequências de codificação de anticor- pos aqui descritas podem ser incorporadas em transgenes para intro- dução no genoma de um animal transgênico e expressão subsequente no leite do animal transgênico (vide, por exemplo, Deboer et al., US5741957, Rosen, US5304489 e Meade et al., US5849992). Os transgenes adequados incluem sequências de codificação para cadei- as leves e/ou pesadas em ligação operável com um promotor e inten- sificador de um gene específico da glândula mamária, tal como caseí- na ou β lactoglobulina.

[0084] Os vetores aqui descritos contendo as sequências polinu- cleotídicas de interesse (por exemplo, as sequências de codificação da cadeia pesada e leve e sequências de controle de expressão) podem ser transferidos para a célula hospedeira por métodos bem conheci- dos, que variam dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exem- plo, a transfecção com cloreto de cálcio é comumente utilizada para células procarióticas, enquanto o tratamento com fosfato de cálcio, ele- troporação, lipofecção, biolística ou transfecção baseada em vírus po- dem ser usados para outros hospedeiros celulares. (Vide geralmente Green e Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 4ª ed., 2012). Outros métodos usados para trans- formar células de mamíferos incluem o uso de polibreno, fusão de pro- toplastos, lipossomas, eletroporação e microinjeção (vide geralmente, Sambrook et al., supra) Para a produção de animais transgênicos, os transgenes podem ser microinjetados em oócitos fertilizados ou podem ser incorporados no genoma de células-tronco embrionárias e os nú- cleos dessas células transferidos para oócitos enucleados.

[0085] Quando as cadeias pesadas e leves são clonadas em veto- res de expressão separados, os vetores são cotransfectados para ob- ter a expressão e montagem de anticorpos intactos aqui descritos. Uma vez expressos, os anticorpos inteiros, seus dímeros, cadeias le-

ves e pesadas individuais ou outras formas de imunoglobulina aqui descritas podem ser purificados de acordo com os procedimentos pa- drão da técnica, incluindo precipitação com sulfato de amônio, colunas de afinidade, cromatografia em coluna, purificação de HPLC, eletrofo- rese em gel e semelhantes (vide geralmente Scopes, Protein Purifica- tion (Springer-Verlag, Nova Iorque, (1982)). Anticorpos substancial- mente puros de pelo menos cerca de 90 a 95% de homogeneidade são preferidos, e 98 a 99% ou mais homogeneidade são os mais pre- feridos, para produtos usos farmacêuticos como aqui descrito. Méto- dos de purificação de proteína padrão conhecidos na técnica podem ser empregados. Os procedimentos a seguir são exemplos de proce- dimentos de purificação de proteína adequados: fracionamento em imunoafinidade ou colunas de troca iônica, precipitação com etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica ou em uma resina de troca catiônica, como DEAE, cromatofocalização, SDS-PAGE, precipi- tação com sulfato de amônio e filtração em gel.

[0086] A produção dos anticorpos aqui descritos pode ser realiza- da por qualquer técnica adequada, incluindo técnicas aqui descritas, bem como outras técnicas conhecidas na área. Os anticorpos aqui descritos podem ser produzidos em escala comercial usando métodos que estão bem estabelecidos na técnica para a fabricação de anticor- pos em grande escala. Por exemplo, sistemas de expressão recombi- nantes, tais como aqueles descritos neste documento, podem ser em- pregados.

[0087] Um anticorpo aqui descrito pode ligar-se especificamente aos peptídeos amiloides AβpE3-42 e Aβ4-42. O anticorpo pode não apresentar ligação específica ou substancialmente nenhuma ligação específica ao peptídeo amiloide Aβ1-42. Um anticorpo aqui descrito também pode exibir as propriedades estruturais, físicas, biofísicas e químicas desejáveis descritas abaixo e com referência aos exemplos.

[0088] A afinidade de um anticorpo aqui descrito é a extensão ou força de ligação do anticorpo ao epítopo ou antígeno. A constante de dissociação, Kd, e a constante de afinidade, Ka, são medidas quantita- tivas de afinidade. Kd é a razão entre a taxa de dissociação do anticor- po (koff), a rapidez com que ele se dissocia de seu antígeno, e a taxa de associação do anticorpo (kon) do anticorpo, a rapidez com que ele se liga ao seu antígeno. A ligação de um anticorpo ao seu antígeno é um processo reversível, e a taxa da reação de ligação é proporcional às concentrações dos reagentes. Em equilíbrio, a taxa de formação do complexo [anticorpo] [antígeno] é igual à taxa de dissociação em seus componentes [anticorpo] + [antígeno]. A medição das constantes de taxa de reação pode ser usada para definir um equilíbrio ou constante de afinidade, Ka (Ka = 1/Kd). Quanto menor for o valor de Kd, maior se- rá a afinidade do anticorpo pelo seu alvo. A maioria dos anticorpos tem valores de Kd na faixa de baixo micromolar (10-6) a nanomolar (10-7 a 10-9). Os anticorpos de alta afinidade são geralmente considerados na faixa nanomolar baixa (10-9), com os anticorpos de afinidade muito alta na faixa picomolar (10-12).

[0089] Um anticorpo aqui descrito pode ter uma constante de taxa de associação (kon) de pelo menos 2x102 M-1s-1, pelo menos 5x102 M- 1 -1 s , pelo menos 103 M-1s-1 ou pelo menos 5x103 M-1s-1 .

[0090] Um anticorpo aqui descrito pode ter uma taxa de dissocia- ção (koff) de anticorpo inferior a 5x10-1 s-1, inferior a 10-1 s-1, inferior a 5x10-2 s-1, inferior a 10-2 s-1, ou menos de 5x10-3 s-1.

[0091] Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito se liga (por exemplo, se liga especificamente) aos peptídeos amiloides AβpE3-42 e Aβ4-42 com uma constante de afinidade ou Ka de pelo menos 102 M-1, pelo menos 5x102 M-1, pelo menos 103 M-1, pelo menos 5x103 M-1, pelo menos 104 M-1, pelo menos 5x104 M-1, pelo menos 105 M-1, pelo menos 5x105 M-1, pelo menos 106 M-1, pelo menos 5x106 M-1,

ou pelo menos 107 M-11.

[0092] Um anticorpo aqui descrito pode ter uma constante de dis- sociação ou Kd dos peptídeos amiloides AβpE3-42 e Aβ4-42 de menos de 5x10-2 M, menos de 10-2 M, menos de 5x10-3 M, menos de 10-3 M, menos de 5x10-4 M, menos de 10-4 M, menos de 5x10-5 M, menos de 10-5 M, menos de 5x10-6 M, menos de 10-6 M ou menos de 5x10-7 M,

[0093] A ligação específica de um anticorpo significa que o anti- corpo exibe afinidade apreciável para um antígeno ou epítopo particu- lar e, geralmente, não exibe reatividade cruzada significativa. Um anti- corpo que "não exibe reatividade cruzada significativa" é aquele que não se ligará de forma apreciável a uma entidade indesejável (por exemplo, uma entidade proteica indesejável). Um anticorpo específico para um determinado epítopo irá, por exemplo, não apresentar reação cruzada significativa com epítopos remotos na mesma proteína ou peptídeo. A ligação específica, isto é, koff, kon, Ka e Kd, de um anticorpo aqui descrito pode ser determinada de acordo com qualquer meio re- conhecido na técnica para determinar essa ligação.

[0094] Um anticorpo pode se ligar aos peptídeos amiloides Aβ4-42 ou AβpE3-42 com uma afinidade de ligação de pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pe- lo menos 90% ou pelo menos pelo menos 95% da afinidade de ligação do anticorpo NT4X-167 de murino ao peptídeo amiloide Aβ4-42 ou AβpE3-42, conforme medido por ELISA. As técnicas de ELISA ade- quadas são bem conhecidas na área. Por exemplo, o peptídeo amiloi- de imobilizado pode ser contatado com o anticorpo em um formato de IgG1 e lavado uma ou mais vezes em 0,1% de detergente não iônico, tal como polissorbato 20 (Tween 20), para remover o anticorpo não ligado. O anticorpo ligado ao peptídeo imobilizado pode então ser de- tectado usando qualquer técnica conveniente, por exemplo, usando um anticorpo secundário ligado a um marcador detectável, como HRP.

[0095] Um anticorpo aqui descrito pode ser termicamente estável, isto é, um anticorpo aqui descrito pode se ligar aos peptídeos amiloi- des AβpE3-42 e Aβ4-42) a temperaturas entre 30 ºC e 85 ºC, especifi- camente até 75 ºC. Um anticorpo aqui descrito pode ter uma tempera- tura de fusão entre 50 ºC e 100 ºC, especificamente entre 60 e 80 ºC, mais especificamente perto de 66-67 ºC.

[0096] Um anticorpo aqui descrito pode ter uma baixa propensão para agregação. A propensão para agregação pode ser analisada usando técnicas padrão, como dispersão de luz multiângulo ou disper- são de luz dinâmica. Um anticorpo aqui descrito pode ter uma baixa propensão para interações proteína-proteína não específicas e boa solubilidade.

[0097] Um anticorpo aqui descrito pode ter uma baixa propensão para agregação quando concentrado. Uma formulação aqui descrita pode compreender um anticorpo concentrado para 50-200 mg/ml, por exemplo 75-150 mg/ml, preferivelmente 80-120 mg/ml e mais preferi- velmente 90-110 mg/ml, com uma concentração preferida de cerca de 100 mg/ml, sem formar agregados solúveis em uma solução aquosa mantida a pH fisiológico, por exemplo por PBS de Dulbecco.

[0098] Um anticorpo aqui descrito pode ter uma baixa propensão para agregação quando submetido a repetidos congelamentos e des- congelamentos ou temperaturas prolongadas acima da temperatura corporal normal. Por exemplo, uma temperatura prolongada é de 50 ºC por 30 dias em PBS de Dulbecco.

[0099] Um anticorpo aqui descrito pode ter um ponto isoelétrico (pI) entre pH 8,6 e pH 9, preferivelmente pH 8,1 a pH 8,7

[00100] Um anticorpo aqui descrito pode reter a capacidade de liga- ção aos peptídeos amiloides AβpE3-42 e Aβ4-42 após incubação a 37 ºC em soro de um camundongo, humano e/ou primata cinomolgo. Por exemplo, um anticorpo descrito aqui pode reter a capacidade de liga-

ção a AβpE3-42 ou Aβ4-42 após incubação em soro de camundongo, humano e/ou cinomolgo por 10 a 50 dias, preferivelmente 20-40 dias, mais preferivelmente 30 dias. Um anticorpo que retém a capacidade de ligação pode apresentar a mesma ou substancialmente a mesma capacidade de ligação a 37 ºC que a observada em um anticorpo que não foi incubado em soro, ou que foi incubado em uma solução de controle.

[00101] Um anticorpo anti-Aβ divulgado aqui pode ser aglicosilado. As regiões Fc dos anticorpos IgG apresentam um sítio de N- glicosilação altamente conservado e a glicosilação do fragmento Fc é essencial para a atividade mediada pelo receptor Fc. As porções de carboidrato N-gly ligadas a este sítio são estruturas diantenárias com núcleo fucosilado predominantemente do tipo complexo. Além disso, pequenas quantidades desses N-glicanos também carregam resíduos de ácido siálico ligados a GlcNAc e α-2,6. Um anticorpo aglicosilado pode não ter uma ou mais porções de carboidrato em virtude de, por exemplo, um processo químico ou enzimático, a ausência ou mutação de um ou mais locais de glicosilação ou expressão em bactérias. .

[00102] Um anticorpo anti-Aβ como aqui descrito pode ser modifi- cado para aumentar sua citotoxicidade mediada por células dependen- te de anticorpos (ADCC). ADCC é uma reação mediada por células na qual células citotóxicas não específicas (por exemplo, células Assassi- nas Naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado a uma célula alvo e, subsequentemente, causam a lise da célula alvo. Essa célula pode ser uma célula humana. A atividade ADCC de anticorpos geralmente requer a ligação da região Fc de um anticorpo a um receptor de anticorpo existente na superfície de uma célula efetora, como, por exemplo, uma célula assassina, uma célula assassina natu- ral e um macrófago ativado. Ao alterar a fucosilação (por exemplo, re- duzindo ou eliminando) da estrutura de carboidrato de um anticorpo humanizado (ou seja, na região Fc), a atividade ADCC do anticorpo pode ser aumentada in vitro por, por exemplo, 10 vezes, ou 20 vezes, ou 30 vezes, ou 40 vezes, ou 50 vezes, ou 100 vezes, ou 500 vezes, ou 600 vezes, ou 700 vezes, ou 1000 vezes, em relação a um anticor- po humanizado não modificado. Devido ao aumento da atividade ADCC, tais anticorpos modificados podem ser usados em dosagens mais baixas do que suas contrapartes não modificadas e geralmente têm menos ou menos efeitos colaterais em pacientes.

[00103] Um anticorpo anti-Aβ como aqui descrito pode ser usado na citotoxicidade dependente de complemento (CDC). CDC envolve o sis- tema de complemento inato central que atua como o efetor da imuni- dade adaptativa. A via clássica da CDC é desencadeada pela ligação de moléculas de anticorpo a um antígeno em uma célula alvo e é inici- ada pela ligação de uma proteína C1q ao domínio Fc do anticorpo li- gado. A cascata de complemento resultante ativa uma via de ataque à membrana, levando à formação de um complexo de ataque à mem- brana que induz a lise da célula alvo. Um anticorpo, conforme descrito neste documento, pode ser modificado para aumentar sua capacidade de desencadear CDC por qualquer método conhecido na técnica, tal como, mas não se limitando a, a engenharia da estrutura da proteína para conter substituições de resíduos de aminoácidos nos domínios constantes de cadeia pesada do anticorpo. Para um exemplo de uma combinação de substituições de aminoácidos IgG1 usadas para au- mentar a atividade do CDC, vide Moore et al., MAbs, 2 (2), 181-189 (2010). A atividade de CDC de um anticorpo modificado, conforme descrito neste documento, pode ser aumentada em, por exemplo, 10 vezes, ou 20 vezes, ou 30 vezes, ou 40 vezes, ou 50 vezes, ou 100 vezes, ou 500- vezes, ou 600 vezes, ou 700 vezes, ou 1000 vezes, em relação a um anticorpo humanizado não modificado.

[00104] Os anticorpos anti-Aβ podem ser adicionalmente modifica-

dos por modificação química, por exemplo, por PEGuilação, ou por incorporação em um lipossoma, para melhorar suas propriedades far- macêuticas, por exemplo, aumentando a meia-vida in vivo.

[00105] Um anticorpo anti-Aβ aqui descrito pode ser formulado e/ou administrado como uma composição farmacêutica compreendendo o agente de anticorpo terapêutico ativo e uma variedade de outros com- ponentes farmaceuticamente aceitáveis, vide Remington: The Science and Practice of Pharmacy (22ª ed., Pharmaceutical Press, London, Pa. (2013)). A forma preferida depende do modo de administração preten- dido e da aplicação terapêutica. As composições também podem inclu- ir, dependendo da formulação desejada, veículos ou diluentes não tó- xicos farmaceuticamente aceitáveis, que são definidos como veículos comumente usados para formular composições farmacêuticas para administração animal ou humana. O diluente é selecionado de modo a não afetar a atividade biológica da combinação. Exemplos de tais dilu- entes são água destilada, solução salina tamponada com fosfato fisio- lógico, soluções de Ringer, solução de dextrose e solução de Hank. Além disso, a composição ou formulação farmacêutica também pode incluir outros veículos, adjuvantes ou estabilizadores não tóxicos, não terapêuticos, não imunogênicos e semelhantes.

[00106] As composições farmacêuticas contendo um anticorpo anti- Aβ aqui descrito também podem incluir macromoléculas grandes len- tamente metabolizadas como proteínas, polissacarídeos como quito- sana, ácidos poliláticos, ácidos poliglicólicos e copolímeros (como Sepharose™ funcionalizada com látex, agarose, celulose e semelhan- tes), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos e agrega- dos lipídicos (como gotículas de óleo ou lipossomas). Além disso, es- ses veículos podem funcionar como agentes imunoestimulantes (isto é, adjuvantes).

[00107] Para administração parenteral, um anticorpo ou composi-

ção aqui descrito pode ser administrado como dosagens injetáveis de uma solução ou suspensão da substância em um diluente fisiologica- mente aceitável com um veículo farmacêutico que pode ser um líquido estéril, como óleos de água, solução salina, glicerol ou etanol. Adicio- nalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsionantes, surfactantes, substâncias tamponantes de pH e seme- lhantes podem estar presentes nas composições. Outros componentes das composições farmacêuticas são os de origem petrolífera, animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja e óleo mineral. Em geral, glicóis tais como propilenoglicol ou polietileno- glicol são veículos líquidos preferidos, particularmente para soluções injetáveis. Os anticorpos podem ser administrados na forma de uma injeção de depósito ou preparação de implante, que pode ser formula- da de modo a permitir uma liberação sustentada do ingrediente ativo.

[00108] O termo parenteral, conforme aqui utilizado, inclui a admi- nistração subcutânea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intra- peritoneal e intratecal de um anticorpo ou composição aqui descrita. Um anticorpo anti-Aβ ou composição aqui descrito também pode ser administrado por métodos nasais ou gástricos.

[00109] Normalmente, as composições são preparadas como inje- táveis, como soluções ou suspensões líquidas; também podem ser preparadas formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em veículos líquidos antes da injeção. A preparação também pode ser emulsificada ou encapsulada em lipossomas ou micropartículas, tais como polilactídeo, poliglicólido ou copolímero para efeito adjuvante intensificado, como discutido acima (vide Langer, Science 249: 1527 (1990) e Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28:97 (1997)). Os agentes desta invenção podem ser administrados na forma de uma injeção de depósito ou preparação de implante, que pode ser formula- da de modo a permitir uma liberação sustentada ou pulsátil do ingredi-

ente ativo.

[00110] Formulações adicionais adequadas para outros modos de administração incluem formulações orais, intranasais e pulmonares, supositórios e aplicações transdérmicas. As formulações orais incluem excipientes, tais como qualidades farmacêuticas de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose e carbona- to de magnésio. Estas composições tomam a forma de soluções, sus- pensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de liberação sustentada ou pós e contêm 10% -95% do ingrediente ativo, preferi- velmente 25% - 70%.

[00111] Aplicação tópica pode resultar em administração transdér- mica ou intradérmica. A administração tópica pode ser facilitada pela coadministração do agente com toxina da cólera ou derivados desinto- xicados ou suas subunidades ou outras toxinas bacterianas semelhan- tes (vide Glenn et al., Nature 391, 851 (1998)). A coadministração po- de ser alcançada usando os componentes como uma mistura ou como moléculas ligadas obtidas por reticulação química ou expressão como uma proteína de fusão. Alternativamente, a entrega transdérmica pode ser alcançada usando um adesivo de pele ou usando transferossomos (Paul et al., Eur. J. Immunol. 25: 3521 (1995); Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368: 201-15 (1998)).

[00112] Preferivelmente, um anticorpo anti-Aβ aqui descrito ou uma composição compreendendo um anticorpo anti-Aβ aqui descrito pode ser administrado por via intravenosa (IV) ou intramuscular (IM).

[00113] As composições podem compreender um anticorpo anti-Aβ aqui descrito, veículos farmaceuticamente aceitáveis como aqui descri- tos e outros agentes terapêuticos, em particular agentes profiláticos ou terapêuticos úteis para a prevenção, gestão ou tratamento da doença de Alzheimer (AD). Tais agentes terapêuticos podem compreender drogas analgésicas, drogas anti-inflamatórias, drogas antivirais, drogas que melhoram a febre ou temperatura corporal elevada, compostos terapêuticos concebidos para anestesiar a dor, por exemplo, enxagua- tórios bucais ou sprays que podem anestesiar a dor na boca e tera- pêuticas de melhoria cognitiva, tais como memantina, donepezil, ga- lantamina e rivastigmina. Uma composição aqui descrita pode com- preender adicionalmente composições para reidratar um objeto, por exemplo, por terapia intravenosa.

[00114] As composições aqui descritas podem compreender ácidos nucleicos, isto é, DNA ou RNA, que codificam um anticorpo anti-Aβ aqui descrito, e qualquer método de entrega de tais ácidos nucleicos, com ou sem qualquer um dos outros compostos de composição discu- tidos acima. As composições também podem compreender vetores, por exemplo, mas não se limitando aos vetores de expressão descritos neste documento, eles próprios compreendendo os ácidos nucleicos descritos neste documento.

[00115] As composições aqui descritas podem compreender veto- res virais, para usar como sistemas de entrega de ácido nucleico nas células. Os sistemas de distribuição de ácido nucleico de vetor viral adequados incluem sistemas retrovirais, vetores adenovirais, vetores virais da família da varíola, incluindo vírus vaccinia e varíola aviária, e vetores virais do gênero de vírus alfa. Um ácido nucleico que codifica um anticorpo aqui descrito, ou um vetor contendo o mesmo, pode ser empacotado em lipossomas para entrega a um indivíduo ou célula, que pode ser incorporado em composições conforme descrito. Os ve- tores e ácidos nucleicos que codificam um anticorpo também podem ser adsorvidos ou associados a veículos particulados.

[00116] As composições aqui descritas podem compreender veto- res de terapia genética que contêm sequências de nucleotídeos que codificam para os anticorpos aqui descritos, ou cadeias polipeptídicas de anticorpos nuas de acordo com a invenção. As composições po-

dem compreender tais vetores ou polipeptídeos em combinação com os anticorpos aqui descritos e quaisquer outros componentes da com- posição descritos acima.

[00117] Um anticorpo aqui descrito pode ser usado em um kit. O termo "kit" é usado em referência a uma combinação de reagentes e outros materiais que facilitam a análise da amostra. Em algumas mo- dalidades, um kit de imunoensaio aqui descrito inclui um antígeno adequado, agente de ligação que compreende uma porção detectável e reagentes de detecção. Um sistema para amplificar o sinal produzido por porções detectáveis pode ou não estar incluído no kit. Além disso, em outras modalidades, o kit inclui, mas não está limitado a, compo- nentes como aparelhos para coleta de amostras, tubos de amostra, suportes, bandejas, suportes, pratos, placas, instruções para o usuário do kit, soluções ou outros reagentes químicos, e amostras a serem usadas para padronização, normalização e/ou amostras de controle.

[00118] Os kits podem conter pelo menos um anticorpo aqui des- crito. Um kit pode compreender uma composição aqui descrita, em um ou mais recipientes, opcionalmente com um ou mais outros agentes profiláticos ou terapêuticos úteis para a prevenção, gestão ou trata- mento da doença de Alzheimer (DA). Se a composição contendo com- ponentes para administração não for formulada para distribuição atra- vés do canal alimentar, tal como distribuição oral, um dispositivo capaz de fornecer os componentes do kit através de alguma outra via pode ser incluído, por exemplo, uma seringa. O kit pode incluir ainda instru- ções para prevenir, tratar, administrar ou melhorar a AD, bem como efeitos colaterais e informações de dosagem para o método de admi- nistração.

[00119] A presente invenção também fornece kits de diagnóstico. Os anticorpos descritos neste documento podem ser úteis para moni- torar, diagnosticar ou fornecer um prognóstico para o desenvolvimento ou progressão da DA e podem ser usados em um kit adequado para tais fins. Um anticorpo aqui descrito pode ser usado em um kit de di- agnóstico para detectar a presença de um peptídeo amiloide truncado N, como AβpE3-42 ou Aβ4-42, em uma amostra de fluido corporal reti- rada de um indivíduo, onde o indivíduo pode ser um humano, ou um mamífero, como um primata não humano ou um animal de laboratório, incluindo camundongos, ratos e coelhos. Uma amostra de fluido corpo- ral, tal como, mas não se limitando a, sangue, soro ou fluido cerebros- pinal (CSF), é retirada de um indivíduo e testada quanto à presença de N peptídeos amiloides truncados usando os anticorpos aqui descritos. Medir os níveis de peptídeo amiloide no sangue de um indivíduo usan- do um anticorpo aqui descrito pode fornecer informações sobre a sus- cetibilidade, risco de início, diagnóstico ou prognóstico de AD no indi- víduo, ou esquemas de administração adequados ou doses de um an- ticorpo ou composição aqui descrita para o tratamento o indivíduo. Os métodos de diagnóstico são geralmente realizados in vitro. Um método para detectar a presença de um peptídeo amiloide truncado N em uma amostra de um indivíduo pode compreender contatar a amostra com um anticorpo anti-Aβ aqui descrito e determinar a ligação do anticorpo a um ou mais peptídeos na amostra.

[00120] Um kit que é útil para o diagnóstico descrito acima pode compreender anticorpos aqui descritos que são acoplados a uma substância detectável incluindo, mas não se limitando a: várias enzi- mas para uso em ensaios incluindo EIA e ELISA, tais como, mas não limitado a, peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, beta- galactosidase ou acetilcolinesterase; grupos prostéticos, tais como, mas não limitados a, estreptavidina/biotina e avidina/biotina; partículas, como esferas de látex ou bactérias, para uso em testes de aglutina- ção; materiais fluorescentes, tais como, mas não limitados a, umbelife- rona, fluoresceína, isotiocinato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazi-

nilamina fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; materiais lumi- nescentes, tais como, mas não se limitando a, luminol; materiais bio- luminescentes, tais como, mas não se limitando a, luciferase, luciferina e aequorina; materiais radioativos, tais como, mas não limitados a, io- do (131I, 125 I, 123 I, 121 I), carbono (14C), enxofre (35S), trítio (3H), índio (115In, 113 In, 112 In, 111 In) e tecnécio (99Tc), tálio (201Ti), gálio (68Ga, 67Ga), paládio (103Pd), molibdênio (99Mo), xenônio (133Xe), flúor (18F), 153 Sm, 177 159 149 140 175 166 90 47 186 188 142 Lu, Gd, Pm, La, Yb, Ho, Y, Sc, Re, Re, Pr, 105 97 68 57 65 85 32 153 169 51 54 75 Rh, Ru, Ge, Co, Zn, Sr, P, Gd, Yb, Cr, Mn, Se, 113 117 Sn e Sn; metais emissores de pósitrons usando várias tomografi- as de emissão de pósitrons, íons metálicos paramagnéticos não radio- ativos e moléculas que são radiomarcadas ou conjugadas a radioisó- topos específicos. Qualquer marcador detectável que pode ser facil- mente medido pode ser conjugado a um anticorpo aqui descrito e usa- do no diagnóstico de uma doença como aqui descrito. A substância detectável pode ser acoplada ou conjugada diretamente a um anticor- po ou indiretamente, através de um intermediário (tal como, por exem- plo, um ligante conhecido na área) usando técnicas conhecidas na área. Os íons metálicos que podem ser conjugados a anticorpos para uso como um diagnóstico são conhecidos na técnica (vide, por exem- plo, US474900).

[00121] A detecção do antígeno usando qualquer um dos métodos ou substâncias detectáveis descritos acima pode dar um resultado po- sitivo para a presença do peptídeo amiloide AβpE3-42 ou Aβ4-42 usando os anticorpos aqui descritos em um kit como aqui descrito e pode diagnosticar um indivíduo como tendo AD ou fornecer informa- ções prognósticas sobre um indivíduo com AD ou em risco de AD. Tal indivíduo pode, subsequentemente, requerer e/ou ser submetido a tra- tamento para AD, conforme descrito neste documento.

[00122] Aspectos da invenção são direcionados, inter alia, ao tra-

tamento da doença de Alzheimer (AD) e outras doenças e distúrbios relacionados com a AD, bem como outras doenças neurológicas ca- racterizadas por amiloides solúveis. Aspectos da invenção também são direcionados a um método de tratamento, incluindo profilaxia, de AD, pela administração a um indivíduo em necessidade de tratamento, de uma quantidade eficaz de um anticorpo ou composição aqui descri- ta. Um anticorpo ou composição, preferivelmente uma composição farmacêutica (por exemplo, uma composição compreendendo um anti- corpo aqui descrito, um excipiente farmaceuticamente aceitável e op- cionalmente um agente terapêutico adicional) aqui descrita pode ser para uso em um método de tratamento do corpo humano ou animal. Um anticorpo ou composição, preferivelmente uma composição farma- cêutica, aqui descrita pode ser para uso em um método de tratamento do corpo humano ou animal, em que o tratamento é terapêutico ou profilático de AD em um indivíduo.

[00123] Os métodos de tratamento mencionados acima podem compreender a administração do anticorpo ou composição (por exem- plo, uma composição compreendendo um anticorpo aqui descrito, um excipiente farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, um agente terapêutico adicional) aqui descrito a um indivíduo sob condições que geram uma resposta terapêutica benéfica no individual, por exemplo, para a prevenção ou tratamento da DA.

[00124] Esse indivíduo pode estar sofrendo de AD. Os métodos de tratamento aqui descritos podem ser usados em pacientes assintomá- ticos e naqueles que atualmente apresentam sintomas de AD. Um an- ticorpo aqui descrito pode ser administrado profilaticamente a um indi- víduo que não tem AD. Um anticorpo aqui descrito pode ser adminis- trado a um indivíduo que não tem, ou não exibe os sintomas de AD. Um anticorpo aqui descrito pode ser administrado a um indivíduo que tem, ou parece ter, AD. Indivíduos passíveis de tratamento incluem indivíduos em risco ou suscetíveis à AD, mas que não apresentam sin- tomas e indivíduos com suspeita de ter AD, bem como indivíduos que apresentam sintomas atualmente. Os anticorpos aqui descritos podem ser administrados profilaticamente à população em geral sem a neces- sidade de qualquer avaliação do risco do indivíduo objeto. Em algumas modalidades, os indivíduos adequados para o tratamento, conforme descrito neste documento, podem incluir indivíduos com AD de início precoce ou um ou mais sintomas dos mesmos, e indivíduos para os quais o peptídeo amiloide é detectado em uma amostra de fluido cor- poral, como CSF.

[00125] Os termos "tratar", "tratando" ou "tratamento" (ou termos gramaticalmente equivalentes) significam que a gravidade da condição do indivíduo é reduzida, ou melhorada ou pelo menos parcialmente melhorada e/ou que algum alívio, mitigação ou diminuição em pelo menos um sintoma clínico é alcançado e/ou há uma inibição ou retardo na progressão da condição e/ou prevenção ou retardo no início de uma doença ou enfermidade.

[00126] Um anticorpo aqui descrito que pode ser usado em um mé- todo de tratamento para AD pode ser um anticorpo de qualquer se- quência e formato aqui descrito que se liga especificamente aos N peptídeos amiloides truncados AβpE3-42 e/ou Aβ4-42. Os anticorpos usados para métodos de tratamento como aqui descritos podem ser fragmentos de anticorpos aqui descritos, por exemplo, fragmentos de ligação a antígeno. Um anticorpo aqui descrito pode ser administrado a um indivíduo com AD.

[00127] Um anticorpo aqui descrito pode ser administrado a um in- divíduo em necessidade de tratamento com um veículo farmacêutico ou composição farmacêutica, ou em qualquer composição descrita aqui. Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado a um indiví- duo pela administração de um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma cadeia de anticorpo. O polinucleotídeo é expresso para produzir a cadeia do anticorpo no paciente. Opcionalmente, o polinucleotídeo co- difica as cadeias pesadas e leves do anticorpo. O polinucleotídeo é expresso para produzir as cadeias pesadas e leves no indivíduo.

[00128] Um anticorpo aqui descrito pode ser usado em um método de prevenção ou tratamento de AD que envolve a administração ao paciente de uma dosagem eficaz do anticorpo como aqui descrito. Tal como aqui utilizado, uma "quantidade eficaz" ou uma "dosagem eficaz" ou uma "quantidade suficiente" (ou termos gramaticalmente equivalen- tes) de um anticorpo terapêutico aqui descrito refere-se a uma quanti- dade de anticorpo ou composição aqui descrita que é eficaz para pro- duzir um efeito, que é opcionalmente um efeito terapêutico (isto é, pela administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz). Por exemplo, uma "quantidade eficaz" ou uma "dosagem eficaz" ou uma "quantidade suficiente" pode ser uma quantidade de modo que a gra- vidade da condição do indivíduo, por exemplo, AD, seja reduzida ou pelo menos parcialmente melhorada ou melhorada e/ou que algum alívio, mitigação ou diminuição em pelo menos um sintoma clínico é alcançado e/ou há uma inibição ou atraso na progressão da DA e/ou prevenção ou atraso no início da DA.

[00129] Os termos "paciente", "indivíduo" ou "objeto" incluem seres humanos e outros mamíferos que recebem tratamento profilático ou terapêutico com um ou mais agentes (por exemplo, agentes imunote- rapêuticos ou anticorpos) aqui descritos. Objetos mamíferos incluem primatas, por exemplo, primatas não humanos. Os mamíferos também incluem animais de laboratório comumente usados em pesquisas, co- mo, mas não se limitando a, coelhos e roedores, como ratos e camun- dongos.

[00130] Uma quantidade de um anticorpo ou composição aqui des- crita adequada para realizar o tratamento terapêutico ou profilático é definida como uma dose eficaz, por exemplo, uma dose terapêutica ou profilaticamente eficaz. Em ambos os regimes de tratamento profilático e terapêutico, os reagentes podem ser administrados em várias dosa- gens até que uma resposta imune suficiente seja alcançada. O termo "resposta imune" ou "resposta imunológica" inclui o desenvolvimento de uma resposta humoral (mediada por anticorpo) e/ou celular (media- da por células T específicas para o antígeno ou seus produtos de se- creção) dirigida contra um antígeno em um objeto receptor. Normal- mente, a resposta imune é monitorada e dosagens repetidas são da- das se a resposta imune começar a diminuir.

[00131] Doses eficazes das composições aqui descritas, para o tra- tamento das condições descritas acima variam dependendo de muitos fatores diferentes, incluindo meios de administração, sítio alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é humano ou animal, outros me- dicamentos administrados, e se o tratamento é profilático ou terapêuti- co. Normalmente, o paciente é um humano, mas mamíferos não hu- manos, por exemplo, primatas não humanos, coelhos, ratos e camun- dongos, incluindo mamíferos transgênicos, também podem ser trata- dos. As dosagens de tratamento precisam ser tituladas para otimizar a segurança e eficácia.

[00132] Para imunização passiva com um anticorpo aqui descrito, a dosagem varia de cerca de 0,01 a 100 mg/kg, e mais geralmente de 0,1 a 50 mg/kg, do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as do- sagens podem ser de pelo menos 1 mg/kg de peso corporal ou pelo menos 10 mg/kg de peso corporal ou na faixa de 1-100 mg/kg. Em ou- tro exemplo, as dosagens podem ser de pelo menos 0,5 mg/kg de pe- so corporal ou pelo menos 50 mg/kg de peso corporal ou dentro da faixa de 0,5-50 mg/kg, preferivelmente pelo menos 5 mg/kg. Num exemplo preferido, as dosagens podem ser cerca de 50 mg/kg.

[00133] Os métodos aqui descritos podem compreender a adminis-

tração de um anticorpo a um objeto como uma dose única, em duas doses ou em doses múltiplas. A dose do anticorpo pode ser de cerca de 100 µg/kg a 100 mg/kg de peso corporal do paciente, de cerca de 300 µg/kg a 60 mg/kg de peso corporal do paciente ou de cerca de 10 mg/kg a 50 mg/kg de peso corporal do paciente. Os objetos podem receber tais doses diariamente, em dias alternativos, semanalmente ou de acordo com qualquer outro cronograma determinado por análise empírica. Um tratamento pode envolver a administração em múltiplas dosagens ao longo de um período prolongado, por exemplo, de pelo menos seis meses. Os regimes de tratamento adicionais podem en- volver a administração uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês ou uma vez a cada 3 a 6 meses. Esquemas de dosagem exem- plares incluem 1-20 mg/kg ou 15 mg/kg em dias consecutivos, 30 mg/kg em dias alternados ou 60 mg/kg semanalmente.

[00134] Um anticorpo aqui descrito pode ser administrado em várias ocasiões. Os intervalos entre as doses únicas podem ser semanais, mensais ou anuais. Os intervalos também podem ser irregulares, con- forme indicado pela medição dos níveis sanguíneos do anticorpo anti- Aβ no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para atin- gir uma concentração de anticorpo no plasma de 1-1000 µg/ml e em alguns métodos 25-300 µg/ml. Alternativamente, um anticorpo aqui descrito pode ser administrado como uma formulação de liberação sustentada, caso em que é necessária uma administração menos fre- quente. A dosagem e a frequência variam dependendo da meia-vida do anticorpo no paciente. Em geral, os anticorpos humanizados mos- tram uma meia-vida mais longa do que os anticorpos quiméricos e não humanos.

[00135] A dosagem e frequência de administração podem variar dependendo de se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em apli- cações profiláticas, as composições contendo os anticorpos aqui des-

critos ou um coquetel dos mesmos são administradas a um paciente que ainda não está no estado de doença para aumentar a resistência do paciente. Tal quantidade é definida como uma "dose profilática efi- caz". Neste uso, as quantidades precisas dependem novamente do estado de saúde do paciente e da imunidade geral, mas geralmente variam de 0,1 a 25 mg por dose, especialmente 0,5 a 2,5 mg por dose. Uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relati- vamente infrequentes durante um longo período de tempo.

[00136] As doses para ácidos nucleicos que codificam anticorpos aqui descritos variam de cerca de 10 ng a 1 g, 100 ng a 100 mg, 1 µg a 10 mg ou 30-300 µg de DNA por paciente. As doses para vetores virais infecciosos variam de 10-100, ou mais, vírions por dose.

[00137] Os anticorpos e composições aqui descritos podem ser administrados para tratamento terapêutico e/ou profilático por métodos parenteral, tópico, intravenoso, oral, gástrico, subcutâneo, intra-arterial, intracraniano, intraperitoneal, intranasal ou intramuscular, como aqui descrito. A injeção intramuscular ou infusão intravenosa são preferidas para a administração de anticorpos.

[00138] Outros aspectos e modalidades aqui descritos fornecem os aspectos e modalidades descritos acima com o termo "compreenden- do" substituído pelo termo "consistindo em" e os aspectos e modalida- des descritos acima com o termo "compreendendo" substituído pelo termo "consistindo essencialmente em".

[00139] Deve ser entendido que o pedido divulga todas as combi- nações de qualquer um dos aspectos e modalidades acima descritos entre si, a menos que o contexto exija o contrário. Da mesma forma, o pedido divulga todas as combinações das características preferidas e/ou opcionais, individualmente ou em conjunto com qualquer um dos outros aspectos, a menos que o contexto exija o contrário.

[00140] As modificações das modalidades acima, outras modalida-

des e modificações das mesmas serão evidentes para o especialista ao ler esta divulgação e, como tal, estão dentro do escopo aqui des- crito.

[00141] Todos os documentos e entradas de banco de dados de sequência mencionados nesta especificação são incorporados aqui por referência em sua totalidade para todos os fins.

[00142] As posições dos resíduos de anticorpos aqui descritas são numeradas de acordo com o esquema estabelecido em Kabat, E.A., Wu, T.T., Perry, H.M., Gottesmann, K.S & Foeller, C. (1991). Sequen- ces of Proteins of Immunological Interest, 5ª edição, Publicação NIH no. 91-3242. Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA. Quando apropriado, a posição de uma substituição pode ser descrita em relação a um resíduo numerado de Kabat que é invariante nas se- quências de imunoglobulina. Esquemas alternativos de numeração de anticorpos são descritos em Honegger, A e Plückthun A. (2001). J. Mol. Biol 309, 657-67.

[00143] "E/ou", onde usado neste documento, deve ser considerado como divulgação específica de cada um dos dois recursos ou compo- nentes especificados com ou sem o outro. Por exemplo, "A e/ou B" deve ser considerado como divulgação específica de cada um de (i) A, (ii) B e (iii) A e B, assim como se cada um fosse estabelecido individu- almente neste documento. Experimental Materiais e métodos

1. Preparação de RNA a partir de células de hibridoma.

[00144] Péletes congelados de células de hibridoma de camundon- go NT4X-167, que foram armazenados a -80 ºC, foram fornecidos por Thomas Bayer e foram processados usando o kit Qiagen RNeasy para isolar RNA seguindo o protocolo do fabricante.

2. Síntese de cDNA da 1ª filamento

[00145] O RNA NT4X-167 (~26 μg) foi transcrito reversamente para produzir cDNA usando o kit de síntese de cDNA de 1ª filamento GE Life Sciences seguindo o protocolo do fabricante. Isto foi repetido duas vezes para gerar 3 produtos de cDNA NT4X-167 independentes (ro- dadas 1, 2 e 3) para detectar e evitar mutações de cDNA induzidas pela Transcriptase Reversa.

3. Determinação da sequência de cDNA

[00146] O cDNA NT4X-167 foi amplificado por PCR em 3 reações separadas. O cDNA da imunoglobulina foi amplificado por PCR com iniciadores de cadeia leve kappa mais MKC ou iniciadores de cadeia pesada mais mistura de MHC usando o Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix. O resultado de cada reação de PCR foi um único produto de amplificação que foi purificado usando o kit de purificação de PCR QIAquick e sequenciado (por GATC Biotech) em ambas as direções usando os iniciadores M13-Direto e M13-Reverso para obter três conjuntos independentes de informações de sequência para cada cadeia de imunoglobulina.

4. Sequência de DNA VK e VH NT4X-167

[00147] A sequência de DNA de consenso do produto NT4X-167 VK PCR foi designada NT4X-167 VK e a sequência de DNA de con- senso do produto NT4X-167 VH PCR foi designada NT4X-167 VH e são mostradas nas SEQ ID NOs 9-12, respectivamente. A análise da linhagem germinal das sequências NT4X-167 mostra que a cadeia le- ve Kappa é um MKV4 murino e a cadeia pesada é um MHV7 murino.

5. Construção dos vetores de expressão quiméricos NT4X-167

[00148] A construção de vetores de expressão quiméricos envolve a clonagem das regiões variáveis amplificadas em vetores IgG/kappa (pHuK e pHuG1), usando clonagem independente de ligase (LIC). Os vetores (pCMV modificado) foram digeridos com BfuA1 (BspM1) e en- tão saliências compatíveis foram geradas com atividade de T4 DNA polimerase 3'-5' exonuclease (+dATP). As sequências de anticorpos foram geradas primeiramente pela amplificação da região variável por PCR de cDNA de NT4X-167 com iniciadores contendo a extremidade 3' da sequência líder (a maior parte da sequência está presente no ve- tor) - iniciador direto - ou o início da constante região (IgG1 ou kappa) - iniciador reverso - seguido pelo início da região variável (em cada dire- ção). As saliências complementares foram geradas nos produtos de PCR pelo tratamento com T4 DNA polimerase +dTTP. O vetor e as inserções foram incubados à temperatura ambiente, transformados em bactérias TOP10 quimicamente competentes e semeados em placas de canamicina. Vários clones foram isolados e as colônias seleciona- das por PCR usando os iniciadores HCMVi e HuG1 LIC Rev para VH ou HuK LIC Rev para VK. Os clones que geraram os produtos de PCR de tamanho correto foram selecionados, minipreparados usando o kit QIAGEN e sequenciados usando os mesmos iniciadores.

6. Geração de anticorpos quiméricos

[00149] As células de suspensão Expi293 crescendo em meio de transfecção Expi293 e antibióticos foram cotransfectadas com cNT4X- 167 VH.pHuG1 e cNT4X-167 VK.pHuK (1 μg de DNA cada) usando o reagente ExpiFectamine 293. As células foram cultivadas em 1 mL de meio de crescimento durante 5 dias. Até 81 μg/mL de anticorpo quimé- rico NT4X-167 foi medido no meio condicionado por ELISA.

7. Peptídeos amiloides

[00150] Peptídeos amiloides, Aβ1-42, AβpE3-42 e 4-42 foram ad- quiridos de Peptide Specialty Laboratories (PSL) ou California pepti- des.

8. Camundongos transgênicos

[00151] A linhagem de camundongos homozigotos transgênicos Tg4-42hom (posteriormente denominada Tg4-42) e 5XFAD usados neste estudo foram descritos anteriormente [1,2].

10. Imunização passiva

[00152] Os potenciais efeitos terapêuticos dos anticorpos NT4X humanizados (rcNT4X_SA e rcNT4X_S7A) de clonagem reversa (rc) foram estudados usando imunização passiva em camundongos Tg4- 42 e 5XFAD. A imunização passiva foi realizada por injeções intraperi- toneais e comparada a um grupo de controle usando um anticorpo da mesma classe de imunoglobulina de ambos os anticorpos rcNT4X (IgG1, anticorpo de controle MRCT).

[00153] Camundongos Tg4-42 machos e fêmeas foram imunizados por injeções dos anticorpos, 10 mg/kg de peso corporal, diluídos em PBS estéril (pH 7,4). Os camundongos receberam injeções semanais a partir dos três meses de idade. Cada camundongo recebeu um total de 12 injeções. O teste de comportamento foi realizado entre a 10ª e a 11ª injeção. Os animais foram sacrificados após a última injeção. O grupo controle recebeu injeções intraperitoneais com o anticorpo IgG1 MRCT-controle (10mg/kg de peso corporal). Os animais foram sacrifi- cados após a última injeção aos 6 meses de idade.

[00154] Camundongos 5XFAD fêmeas de seis semanas de idade receberam injeções semanais com rcNT4X_SA e rcNT4X_S7A (10 mg/kg de peso corporal, diluído em PBS estéril) ou controle MRCT (IgG1; 10 mg/kg de peso corporal, diluído em PBS estéril). Cada ca- mundongo recebeu um total de 12 injeções intraperitoneais. Os ani- mais foram sacrificados após a última injeção às 18 semanas de ida- de.

[00155] Os grupos de controle foram tratados como os grupos tera- pêuticos.

11. Memória de referência espacial por labirinto aquático de Morris

[00156] A memória de referência espacial em camundongos Tg4-42 foi avaliada usando o labirinto aquático de Morris [3], conforme des- crito anteriormente [2].

12. Quantificação de números de neurônios usando estereologia im- parcial

[00157] Análise estereológica foi realizada conforme descrito ante- riormente [2,4]. A camada de células do hipocampo CA1 (Bregma - 1,22 a -3,52 mm) foi delineada em seções coradas com violeta cresil e analisada com uma estação de trabalho de estereologia (Olympus BX51 com um estágio de espécime motorizado para amostragem au- tomática), StereoInvestigator 7 (MicroBrightField, Williston, EUA) e uma lente de óleo 100x (NA = 1,35).

13. Imunohistoquímica e histologia

[00158] Amostras de tecido de camundongo foram processadas conforme descrito anteriormente [5]. Para cloração de carga de placa, os seguintes anticorpos foram usados: anticorpo 1-57 (piroglutamato Aβ3-x, 1: 5000, monoclonal de camundongo [5]), anticorpo 80C2 (con- tra Aβ1-X, Synaptic Systems Göttingen, 1:500, camundongo monoclo- nal), anticorpo policlonal 24311 (contra pan-Aβ, 1:500, coelho [2]) e anticorpo policlonal 029 (contra Aβ4-x; 1:500; cobaia). Anticorpos anti- coelho e anticamundongo secundários biotinilados (1:200) foram ad- quiridos da DAKO. A coloração foi visualizada pelo método ABC, com kit Vectastain (Vetor Laboratories) e diaminobenzidina como cromóge- no. A contracoloração foi realizada com hematoxilina. Para DAPI, as seções de coloração foram desparafinizadas e lavadas em PBS, se- guido por incubação em 4',6-diamidina-2'-fenilindol (DAPI, 1 µg/ml) por 1 min. Para Thioflavin S, as seções de tecido com coloração fluores- cente foram desparafinizadas e reidratadas, lavadas duas vezes em água desionizada tratada com 1% (p/v) de TioflavinaS em solução aquosa e contracorada em solução aquosa 1% (p/v) de 4´6-diamidina- 2-fenilindol. A incorporação foi realizada em meio de montagem fluo- rescente aquoso (DAKO).

14. Quantificação da carga Aβ

[00159] A carga da placa foi quantificada em camundongos 5XFAD imunizados. Para cada animal, três seções embebidas em parafina, distantes pelo menos 40 µm uma da outra. A carga relativa da placa foi avaliada no córtex usando um microscópio Olympus BX-51 equipado com uma câmera Olympus DP-50 e o software ImageJ (NIH, EUA). Imagens representativas de ampliação de 20x foram capturadas sis- tematicamente. Usando ImageJ, as imagens foram binarizadas para imagens em preto e branco de 8 bits e um limite de intensidade fixa foi aplicado definindo a coloração DAB. As medições foram realizadas para uma área percentual coberta pela coloração DAB, bem como pa- ra o número de grãos por mm2 e o tamanho médio dos grãos.

15. Análise estatística

[00160] As diferenças entre os grupos foram testadas com análise de variância unilateral (ANOVA) seguida por comparações múltiplas de Bonferroni, ANOVA seguida por comparação múltipla de Dunnett ou teste t de estudante conforme indicado. Todos os dados são apresen- tados como médias ± erro padrão da média (SEM), conforme indicado. Todas as estatísticas foram calculadas usando GraphPad Prism ver- são 5.04 para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA).

16. Aprovação do estudo

[00161] As experiências com animais foram aprovadas pelas auto- ridades locais de proteção dos animais (Niedersächisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit) com o número de aprovação 17/2447. Os experimentos foram conduzidos de acordo com os protocolos aprovados.

17. ELISA

[00162] Cada poço de uma placa MaxiSorp de 94 poços (Nunc) foi revestido com alíquotas de 50 µL de 200 ng/mL de 1-42, pE3-42 ou 4- 42 peptídeos amiloides em PBS e incubados durante a noite a 4ºC. Os poços foram lavados 3x com PBS-T (0,1% Tween20) e bloqueados com 150 µL de 5% de leite em PBS/0,05% Tween20 por poço. Os po- ços foram então incubados à temperatura ambiente com agitação du- rante 1 hora e lavados 3x com PBS-T (0,1% Tween20). 50 µl de anti- corpo primário diluído em série em PBS de leite a 1%/Tween20 a 0,05% foram adicionados aos poços da placa de ensaio usando uma série de diluição de 3 vezes começando em ~ 100 /g/mL. A etapa de incubação e lavagem foi então repetida. HRP de cadeia kapa anti- humana (Sigma A7164-1mL) foi diluído 4.000 vezes em PBS/1% lei- te/0,05% Tween20 e 50 µL adicionados a cada poço. A etapa de incu- bação e lavagem foi repetida e, em seguida, 75 µL de substrato K-Blue (Neogen) foram adicionados por poço e incubados por 5-10 minutos à temperatura ambiente. A reação foi interrompida pela adição de 50 µl de solução RED STOP (Neogen) a cada poço e a densidade óptica foi lida a 650 nm. Resultados Geração de uma versão quimérica do anticorpo NT4X-167

[00163] A ligação de peptídeos amiloides, Aβ1-42, AβpE3-42 e 4-42 ao anticorpo quimérico NT4X-167 foi medida por ELISA e comparada com o anticorpo NT4X-167 de camundongo original. Anticorpo quimé- rico NT4X-167 ligado ao peptídeo AβpE3-42 no ensaio ELISA e não se ligou aos peptídeos Aβ1-42 ou 4-42 (Figura 2) com valores EC50 comparáveis, do que o anticorpo NT4X-167 murino (Figura 1) .

[00164] Para caracterizar ainda mais a ligação de anticorpos NT4X- 167 quiméricos e de camundongo aos peptídeos amiloides, a análise de SPR foi realizada usando o Biacore T200 (GE Healthcare). O anti- corpo quimérico NT4X-167 ligou-se aos peptídeos AβpE3-42 e 4-42, mas não se ligou a Aβ1-42 com valores Kd aparentes comparáveis aos do anticorpo NT4X-167 de camundongo original. A sequência NT4X- 167 foi usada para projetar a versão humanizada do anticorpo anti- NT4X-167.

Projeto de variantes de anticorpo humanizado NT4X-167 Bancos de dados de cDNA VH e VK humanos

[00165] As sequências de proteínas de imunoglobulinas humanas e de camundongo do International Immunogenetics Database 20099 e do Kabat Database Versão 5 de Sequences of Proteins of Immunolo- gical Interest (última atualização 17-Nov-1999)8 foram usadas para compilar um banco de dados de sequências de imunoglobulinas hu- manas no alinhamento de Kabat. Nosso banco de dados contém

10.406 de sequências VH e 2.894 VK. Modelo molecular de NT4X-167

[00166] Um modelo de homologia de regiões variáveis de anticorpo NT4X-167 de camundongo foi calculado. As coordenadas atômicas de 2DQU_L.pdb e 1WEJ_H.pdb foram os modelos de sequência de maior pontuação para VL e VH, respectivamente, conforme determinado pela análise Blast do banco de dados de estruturas de pdb de anticorpo Accelrys, e as coordenadas atômicas de 1YNL_LH.pdb foram o mode- lo de sequência com maior pontuação geral (interface). Esses modelos foram usados para gerar 20 modelos iniciais; o modelo de pontuação superior foi refinado modelando cada alça de CDR com seus 5 melho- res modelos de alça. Os vinte modelos finais foram usados para de- terminar um consenso de resíduos que estavam dentro de 4Å das al- ças de CDR. Seleção de estrutura humana

[00167] Bancos de dados VH e VK humanos com sequências de proteínas NT4X-167 VH e VK foram interrogados usando vários crité- rios de seleção. Os resíduos FW dentro de 4Å dos resíduos CDR (de- finição de Kabat) nas estruturas do anticorpo NT4X-167 de camun- dongo foram identificados, e designados como "4Å Resíduos de Pro- ximidade".

[00168] Sequências humanizadas e sequências incompletas foram removidas da análise. A sequência AF062228 foi escolhida como can- didata a doador de cadeia pesada humana. Esta sequência tem pon- tuação elevada em identidade de sequência e similaridade e não tem mutações somáticas em sua linhagem germinativa. AF062228 tem oito mudanças de Resíduos de Proximidade de 4Å (Tabelas 1 e 2).

[00169] Da mesma forma, a sequência AY942002 foi escolhida co- mo candidata a doador de cadeia leve kappa humana (Tabela 4). AY942004, AF054661 e AF113887 foram rejeitados devido ao número de mutações somáticas nas estruturas. AJ698329 foi rejeitado devido a uma alteração G-> Q na Estrutura 4. Todas as outras sequências examinadas eram muito semelhantes, mas AY942002 mostrou a iden- tidade e semelhança da estrutura melhor para NT4X_VK. AY942002 não tem mutações somáticas de sua linhagem germinativa e tem três mudanças potenciais de resíduo de proximidade de 4Å (Tabela 4). Projeto de NT4X-167 RHA e RHB

[00170] Uma vez que foi identificada uma estrutura humana ade- quada, a proteína sintética e a sequência de DNA podem ser concebi- das. O projeto inicial da versão humanizada de NT4X-167 é o enxerto de CDR 1, 2 e 3 de NT4X-167 VH no aceitador FW de AF062228, cri- ando, portanto, a variante NT4X-167 RHA. Os oito Resíduos de Pro- ximidade de 4Å são então mutados de volta para os resíduos equiva- lentes de camundongo, criando assim a variante NT4X-167 RHB e mu- tados um de cada vez nas seguintes variantes: as sequências foram montadas in silico e designadas NT4X-167 RHA para NT4X-167 RHJ. As tabelas 1-3 comparam as versões murina e humanizada das se- quências da proteína VH NT4X-167. Todas as variantes humanizadas foram clonadas nos vetores pMoG1 e pMoK para que os anticorpos pudessem ser purificados a partir dessas construções para estudos in vivo em uma série de modelos de camundongo (5XFAD e Tg4-42). Os candidatos humanizados líderes finais serão clonados nos vetores pHuG4 e pHuK. Projeto de NT4X-167 RKA e NT4X-167 RKB

[00171] O quadro estrutural de AY942002 foi usado para projetar o DNA e a proteína para os construtos humanizados. As CDRs 1, 2 e 3 de NT4X-167 VK são mostradas enxertadas no aceitador FW de AY942002 para gerar a versão inicial do NT4X-167 RKA humanizado. Existem três resíduos de proximidade de 4Å não correspondentes em NT4X-167 RKA que sofreram mutação reversa para o resíduo de ca- mundongo equivalente na variante NT4X-167 RKB. Estes resíduos so- frem mutação reversa, um de cada vez, nas seguintes variantes: as sequências foram montadas in silico e designadas NT4X-167 RKA a NT4X-167 RKE (Tabela 4). Geração de anticorpos humanizados NT4X-167

[00172] Os genes para NT4X-167 HA, HB, KA e KB foram sintetiza- dos por GenScript. As sequências estruturais humanas naturais AF062228 e AY942002, cadeias pesadas e leves, respectivamente, e as sequências de CDR naturais de camundongos foram montadas in silico e designadas NT4X-167 RHA para NT4X-167 RHJ e NT4X-167 RKA para NT4X-167 RKE. Usando algoritmos de software proprietá- rios do GenScript, as sequências de RHA/RHB e RKA/RKB foram oti- mizadas por mutagênese silenciosa para usar códons preferivelmente utilizados por células humanas e sintetizados. Os construtos RKA/RKB e RHA/RHB foram amplificados por PCR com iniciadores específicos para o vetor de expressão + inserção (conforme descrito anteriormente para as versões quiméricas) e inseridos em pMoK e pMoG1, respecti- vamente em reações de clonagem independentes de ligase e usados para transformar bactérias TOP10. A versão HA foi posteriormente modificada por mutagênese por PCR para obter outras variantes hu- manizadas anotadas na Tabela 4.

[00173] Os clones foram sequenciados e o DNA de plasmídeo foi preparado usando o kit QIAGEN Plasmid Miniprep ou o kit Qiagen Plasmid Maxiprep. As sequências de construto de expressão (HA, HB, KA e KB) são mostradas nas SEQ ID NOs: 13-20. As preparações de expressão de plasmídeo que codificam (humanizado ou quimérico) VH e VK foram usadas para transfectar células Expi293, cultivadas duran- te 5-7 dias em meio sem soro, após o que o meio condicionado con- tendo o anticorpo segregado foi colhido. Expressão de anticorpo

[00174] As concentrações de anticorpos IgG1κ em meio condicio- nado de células Expi293 foram medidas por ELISA. A maioria dos an- ticorpos foi produzida em bons níveis de expressão. Ligação a antígeno por versões iniciais (rodada 1 e rodada 2) dos anti- corpos NT4X-167 humanizados

[00175] Os dados mostrados na Figura 3 exibem a ligação das ca- deias pesadas de RHA/RHB em combinação com versões de cadeia leve de RKA/RKB do anticorpo NT4X-167 humanizado aos peptídeos amiloides Aβ1-42 e AβpE3-42. Nenhuma diferença na ligação entre as versões contendo a versão RKA ou RKB da cadeia leve capa pode ser observada, implicando que as mutações reversas introduzidas em KB não são essenciais para a ligação. A versão RHA não mostrou ne- nhuma evidência de ligação aos peptídeos amiloides e nas versões humanizadas contendo as versões RHB ligadas a AβpE3-42. Conside- rando esses dados, apenas a cadeia leve KA foi levada adiante e ou- tras versões da cadeia pesada humanizada foram sintetizadas usando o kit de mutagênese Stratagene QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), gerando versões NT4X RHC-RHJ (Ta- bela 1). Os resultados de um ELISA de ligação usando as versões humanizadas RHC-RHJ novamente O peptídeo AβpE3-42 é mostrado na Figura 5. Versões humanizadas RHB/RKA e RHB/RKB ligaram-se ao peptídeo AβpE3-42 enquanto as outras versões humanizadas não mostraram evidência de ligação e uma terceira rodada de variantes humanizadas foi sintetizada. Ligação a antígeno pela terceira e quarta rodadas dos anticorpos NT4X-167 humanizados

[00176] Uma terceira rodada de variantes da cadeia pesada de NT4X-167 humanizada foi gerada, RHK a RHR (Tabela 2). As varian- tes RHK-RHR foram obtidas usando o kit de mutagênese Stratagene (QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit).

[00177] As cadeias pesadas RHC-RHR foram combinadas com a versão RKA da cadeia leve e ELISAs de ligação foram realizados usando o peptídeo AβpE3-42 (Figura 6). Versões humanizadas RHB, RHM, RHN, RHO e RHR em combinação com RKA ligado ao peptídeo AβpE3-42 com RHB/RKA, RHM/RKA, RHN/RKA, RHO/RKA e RHR/RKA sendo os aglutinantes mais ideais. Quatro dos oito resíduos estruturais de CDR de cadeia pesada chave em RHP (a arginina foi novamente mutada por SDM para valina), RHQ (a valina foi novamente mutada para fenilalanina), RHK (fenilalanina foi novamente mutada para glicina e RHL (leucina foi novamente mutada para isoleucina)), mostrou liga- ção reduzida, sugerindo que estes quatro resíduos devem ser manti- dos como resíduos de camundongo para ligação total. Outras varian- tes humanizadas foram geradas incorporando todos os quatro resí- duos de camundongo representados por RHP, RHQ, RHK e RHL e os quatro resíduos de estrutura principais representados por RHM, RHN RHO e RHR foram mantidos como resíduos de estrutura humana para gerar as versões RHS, RHT, RHU, RHV, RHW RHX e RHY (Tabela 2). ELISA de ligação de peptídeo usando AβpE3-42 mostrou que as vari- antes RHS a RHY em combinação com RKA têm perfis de ligação AβpE3-42 PSL similares para RHB/RKA (Figura 8). A variante RHS/RKA é preferível em termos do número de resíduos de estrutura de CDR chave "humana" que contém (imunogenicidade inferior).

Ligação a antígeno por anticorpos SA, S6A, S7A e S8A NT4X-167 humanizados

[00178] Outras variantes de RHS/KA (SA) foram geradas para atin- gir> 85% de identidade com a linhagem germinativa humana. A análise de intervalo de domínio IMGT foi realizada na versão SA para identifi- car resíduos que poderiam sofrer mutação para aumentar a porcenta- gem de identidade com a linhagem germinativa humana. A cadeia leve RKA tinha 89,6% de identidade com as sequências da linhagem ger- minativa humana IGKV1-39*01 e IGKJ4*01. A cadeia pesada RHS, no entanto, tinha 79,4% de identidade com a sequência IGHV4-4*08 da linhagem germinativa humana. A análise da linhagem germinativa da sequência RHS identificou seis resíduos que podem sofrer mutação para a linhagem germinativa humana e gerar as versões RHS6, RHS7 e RHS8 em combinação com RKA. ELISA de ligação de peptídeo usando AβpE3-42 mostrou que a variante RHS7RKA (S7A) era o can- didato humanizado ideal e tinha 84,5% de identidade com a linhagem germinativa humana. Ligação a antígeno por variantes adicionais geradas com base na es- trutura de cristal dos anticorpos NT4X-167

[00179] Outras variantes de RHS7 para aumentar a % de identida- de com a linhagem germinativa humana foram geradas com base na estrutura de cristal do peptídeo pE3-14 ligado a NT4X FAB de camun- dongo. A estrutura cristalina destacou F67, Y68 e I39 como aminoáci- dos potenciais que poderiam ser alterados sem afetar a ligação do peptídeo. Portanto, F67Y, Y68N, I39W e uma variante adicional que combinou F67Y e Y68N foram gerados (Tabela 2) e a ligação a Aβ1- 42, AβpE3-42 e 4-42 foi investigada. RHS71 que tem a mutação F67Y retida propriedades de ligação equivalentes à variante de cadeia pe- sada S7A parental e foi, portanto, escolhido como uma variante huma- nizada de cadeia pesada potencial em combinação com a cadeia leve

RKA. Como a afinidade desses anticorpos estava na faixa de nM, que- ríamos investigar se era possível prever quais aminoácidos poderiam sofrer mutação com base na estrutura do cristal e no software de pre- visão de modelagem Schrodinger para aumentar a afinidade do anti- corpo RHS71/RKA. Cinco variantes adicionais da cadeia pesada foram geradas com as seguintes mutações, S53M, S53H, R100H, L103R e L103H (Tabela 4b). Além disso, cinco variantes da cadeia leve tam- bém foram geradas RKF (N92W), RKG (N92Y), RKH (N92H), RKI (L94R) e RKJ (L94H). As sequências das variantes da cadeia leve são mostradas na Tabela 4. A ligação dessas variantes humanizadas adi- cionais a Aβ1-42, AβpE3-42 e 4-42 foi investigada por ELISA (Figura 9) e Biacore. Entre todas as variantes testadas, RHS71 (que contém a mutação F67Y na cadeia pesada) em combinação com RKH (que con- tém a mutação N92H) mostrou uma melhoria de duas vezes no Biaco- re. Estabilidade térmica do anticorpo candidato BA, SA, TA, UA, VA, WA, YA humanizado a altas temperaturas

[00180] O objetivo deste experimento é testar a estabilidade térmica dos anticorpos humanizados quando submetidos a temperaturas mais elevadas, variando de 30 ºC a 85 ºC por 10 minutos, resfriados a 4 ºC e utilizados em ensaio ELISA na concentração de EC80 de cada can- didato. Todas as versões humanizadas pareceram estáveis, retendo sua capacidade de ligação ao peptídeo AβpE3-42 até 75 ºC, onde a ligação ao peptídeo diminuiu. Determinação de Tm (temperatura de fusão) do anticorpo candidato a NT4X-167-SA e NT4X-167-S7A humanizado

[00181] A fim de determinar a temperatura de fusão dos anticorpos candidatos principais NT4X-167-SA e NT4X-167-S7A, os anticorpos foram testados em um ensaio de desvio térmico. As amostras foram incubadas com um corante fluorescente (Sypro Orange) por 71 ciclos com aumento de 1 ºC por ciclo em um termociclador qPCR. A Tm para os anticorpos humanizados foi calculado como sendo 66-67 ºC. Agregação de anticorpo candidato NT4X-167-SA e NT4X-167-S7A humanizado

[00182] As amostras foram injetadas a 0,4mL/min em uma coluna de exclusão de tamanho em um sistema de HPLC e analisadas por espalhamento de luz multiângulo para determinar as massas molares absolutas e verificar a agregação (vide Figura 10). O perfil não mostra sinais de agregação com um peso molecular médio de cerca de 133,98 KDa para NT4X-167_SA e 129,92 KDa para NT4X-167_S7A, que é o intervalo esperado para um monômero de IgG nesta configu- ração de análise. O anticorpo é monodisperso (Mw/Mn < 1,05). A re- cuperação da massa é de 100% (massa calculada sobre a massa inje- tada), o que indica boa recuperação da proteína e que a amostra não parece aderir à coluna ou conter agregados insolúveis, que seriam re- tidos pela coluna de guarda. No geral, os dados sugerem que não há preocupações de agregação para os anticorpos humanizados NT4X- 167_SA e NT4X-167_S7A. Interações Proteína-Proteína Não Específicas (CIC)

[00183] Cromatografia de interação cruzada usando IgG policlonal humana purificada em massa é uma técnica para monitorar interações proteína-proteína não específicas e pode ser usada para discriminar entre anticorpos solúveis e insolúveis (Seção 8.19). Um índice de re- tenção elevado (k') indica uma propensão para a autointeração e uma baixa solubilidade. Os anticorpos humanizados NT4X-167 RHS/RKA, RHB/RKA e RHS7/RKA (clonados como MoG1K) mostram um índice de retenção abaixo de 0,2, indicando uma baixa propensão para inte- rações não específicas e boa solubilidade (Figura 11). Solubilidade de anticorpos candidatos NT4X-167 RHS/RKA e RHS7/RKA humanizados

[00184] Os anticorpos humanizados NT4X-167 RHS/RKA (SA) e RHS7/RKA (S7A) foram concentrados usando concentradores de ab- sorção de solvente (MWCO 7500 KDa) e a concentração medida em intervalos de tempo. O anticorpo foi concentrado a >50 mg/mL sem precipitação aparente. Análise de estresse de congelamento/descongelamento de anticorpos candidatos NT4X-167 RHS/RKA e RHS7/RKA humanizados

[00185] As amostras dos anticorpos candidatos purificados foram submetidas a 10 ciclos de 15 minutos a -80 ºC seguido de desconge- lamento durante 15 minutos à temperatura ambiente. As amostras fo- ram então analisadas por SEC-MALS para verificar a agregação (Figu- ras 12 e 13). Os dados sugerem que o congelamento/descongela- mento não causa agregação nos anticorpos NT4X-167 humanizados. Análise de estresse induzido por calor de anticorpos candidatos NT4X- 167 RHS/RKA e RHS7/RKA humanizados

[00186] As amostras dos anticorpos candidatos purificados foram expostas a a) 4 ºC, b) 25 ºC, c) 37 ºC e d) 50 ºC durante 30 dias. As amostras foram então analisadas por SEC-MALS para verificar a agregação (Figura 14). No geral, os dados sugerem que não há pro- blemas de agregação nos anticorpos NT4X-167 humanizados. Avaliação da estabilidade do soro de anticorpos candidatos NT4X-167 RHS/RKA e RHS7/RKA humanizados

[00187] Amostras purificadas de anticorpos NT4X-167 RHS/RKA e RHS7/RKA humanizados foram incubadas em soro de camundongo, humano e cinomolgo. A capacidade de ligação do anticorpo após a incubação foi medida por ELISA de ligação aos peptídeos AβpE3-42 e 4-42. A ligação dos anticorpos humanizados NT4X-167 que foram in- cubados nos 3 soros diferentes foi comparada com a ligação dos anti- corpos que não foram submetidos a qualquer incubação e com os an- ticorpos que foram incubados em PBS. O ensaio ELISA mostrou que a ligação do anticorpo incubado com soro aos peptídeos AβpE3-42 e 4- 42 é muito semelhante à ligação do anticorpo PBS incubado e não in- cubado. Portanto, os anticorpos humanizados NT4X-167 RHS/RKA e RHS7/RKA mantiveram sua capacidade de ligação após serem incu- bados em soro de camundongo, humano e cinomolgo por 30 dias.

[00188] O NT4X-167 humanizado mostrou ser capaz de se ligar aos peptídeos amiloides 4-42, AβpE3-42 e sem se ligar a Aβ1-42. O anti- corpo humanizado também mostrou proteção contra a morte de célu- las neuronais em neurônios de camundongos e humanos. O anticorpo foi projetado e expresso como um anticorpo totalmente humanizado sem perda significativa de potência de ligação. As experiências com anticorpos quiméricos, consistindo em regiões variáveis murinas em regiões constantes humanas, mostraram potência semelhante ou me- lhorada em ELISAs de ligação ou estudos cinéticos usando o Biacore, ao do anticorpo murino (Figuras 1 e 2).

[00189] Os experimentos iniciais mostraram que o NT4X-167 total- mente humanizado, ou seja, sem mutações estruturais para introduzir resíduos de proximidade de 4Å de murino, não se ligou ao peptídeo AβpE3-42, bem como ao anticorpo de controle positivo quimérico, mas as versões com o conjunto completo de mutações ligadas em pé de igualdade com o controle positivo quimérico. Esta redução na ligação foi isolada na cadeia pesada totalmente humanizada. No entanto, des- cobrimos inesperadamente que a introdução de mutações reversas específicas nos permitiu gerar dois anticorpos candidatos principais, NT4X RH S/RKA (SA) e NT4X RHS7/RKA (S7A). Esses candidatos principais também foram clonados em vetores HuG1K e HuG4K, bem como nos vetores MoG1 iniciais. Ambos os candidatos exibiram exce- lente ligação, expressão, termoestabilidade, afinidade e atividade fun- cional. Ensaios de células in vitro

Proteção neuronal por anticorpos humanizados NT4X_SA e NT4X_S7A em culturas corticais primárias de ratos e humanos

[00190] Foi considerado que os anticorpos humanizados NT4X_SA e NT4X_S7A retêm as propriedades do anticorpo NT4X de camun- dongo original na proteção da morte celular induzida em neurônios de camundongo com os peptídeos amiloides N-truncados (4-42 e pyro- Gul3-42; Figs 17 e 18), mas não contra o peptídeo amiloide de com- primento total Aβ1-42 (Figura 19). Todos os 3 anticorpos são bastante equipotentes contra o peptídeo 4-42, mas o NT4X de camundongo é ligeiramente mais potente contra o piro3-42 do que SA ou S7A com S7A sendo ligeiramente mais potente do que SA.

[00191] Foi considerado que os anticorpos humanizados NT4X_SA e NT4X_S7A retêm as propriedades do anticorpo NT4X de camun- dongo original na proteção da morte celular induzida com os peptídeos amiloides N-truncados (4-42 e pyroGul3-42; Figs 20 e 21), mas não contra peptídeo amiloide de comprimento completo Aβ1-42 em neurô- nios humanos (Fig 22). Todos os 3 anticorpos humanizados são mais potentes do que o anticorpo de camundongo NT4X original na prote- ção da morte celular com o peptídeo 4-42, no entanto, o anticorpo hu- manizado N92H é mais potente com o pyro 3-42. Nenhum dos anticor- pos NT4X ou versão humanizada protege os neurônios humanos da morte induzida pelo peptídeo amiloide Aβ1-42. Os resultados estão amplamente de acordo com os neurônios de camundongos com algu- ma potência aumentada contra pyro3-42 em neurônios humanos. Testes in vivo em modelos de camundongos transgênicos Terapia de Alzheimer com rcNT4X_SA e rcNT4X_S7A em modelos de camundongos 5XFAD e Tg4-42

[00192] Os camundongos Tg4-42 que expressam Aβ4-42 foram imunizados começando às 12 semanas de idade durante 12 semanas. Demonstramos que rcNT4X_SA e rcNT4X_S7A resgataram a perda de neurônios CA1 no hipocampo de Tg4-42, com maior efeito terapêu- tico para rcNT4X_S7A. rcNT4X_S7A foi testado adicionalmente no tes- te de labirinto aquático de Morris para desempenho de memória de referência espacial. Os déficits de memória de referência espacial de Tg4-42 na idade de seis meses foram completamente resgatados.

[00193] Os camundongos 5XFAD foram imunizados começando às seis semanas de idade durante 12 semanas. O efeito na carga da pla- ca foi analisado no córtex. rcNT4X SA reduziu as placas coradas com Tioflavina e anticorpos específicos do terminal N contra o piroglutama- to Aβ3-X e Aβ4-X. Nenhum efeito foi observado com anticorpos contra pan-Aβ e Aβ1-X. Em contraste com os camundongos imunizados com rcNT4X_S7A, que demonstrou redução significativa da placa com to- dos os ensaios de coloração: as placas coradas com Tioflavina ou com anticorpos que reconhecem Aβ1-X, pirogluatamato Aβ3-X, Aβ4-X e pan-Aβ foram significativamente reduzidas. rcNT4X_SA e rcNT4X_S7A resgata perda de neurônios e declínio de memória em camundongos Tg4-42

[00194] A perda de neurônios CA1 no hipocampo de camundongos Tg4-42 é significativa aos quatro meses de idade [6]. Portanto, come- çamos o tratamento de imunização passiva aos três meses por um pe- ríodo de 12 semanas. Os camundongos Tg4-42 imunizados com rcNT4X_SA e rcNT4X_S7A exibiram significativamente mais neurônios em comparação com o grupo de controle IgG1. O nível de significância foi maior no grupo rcNT4X_S7A (Fig 23). A imunização de Tg4-42 com rcNT4X_S7A foi significativamente mais potente em comparação com NT4X (Fig. 24). Nenhuma diferença nos números de neurônios entre o NT4X original e o rcNT4X_SA. Os dados da imunização com rcNT4X_SA e rcNT4X_S7A são representados graficamente contra a imunização com imunização com anticorpo NT4X murino original. Os grupos de controle injetados com IgG1, IgG2b e PBS não diferiram significativamente (Fig. 25). Dados de IgG2ba e PBS retirados de An- tonios et al. [6]. A imunização passiva com rcNT4X_S7A resgatou completamente os déficits de memória de referência espacial em ca- mundongos Tg4-42 testados pelo labirinto aquático de Morris (Fig. 26). rcNT4X_SA e rcNT4X_S7A menor carga de placa em camundongos 5XFAD

[00195] Os camundongos 5XFAD foram tratados entre seis sema- nas e 18 semanas de idade. A imunização passiva com ambos os an- ticorpos rcNT4X reduziu a carga de placa para espécies Aβ distintas em comparação com um anticorpo IgG1 de controle de isótipo. rcNT4X reduziu significativamente as placas coradas contra piroglutamato Aβ3-x, Aβ4-x e Tioflavina. Nenhum efeito foi detectado em placas posi- tivas para Aβ1-x e pan-Aβ. O efeito de redução da placa de rcNT4X_S7A foi significativamente alterado, pois as placas positivas para piroglutamato Aβ3-x, Aβ4-x e Tioflavina, mas também positivas para Aβ1-x e pan-Aβ foram reduzidas (Fig. 27).

[00196] Os camundongos Tg4-42 desenvolvem perda severa de neurônios do hipocampo e déficits de memória de referência espacial [2,6]. O modelo Tg4-42 representa o primeiro modelo de camundongo expressando exclusivamente Aβ4-42 N-truncado. Aos seis meses de idade, este modelo apresenta perda significativa de memória de refe- rência espacial avaliada pelo teste do labirinto aquático de Morris e neurônios CA1 degenerados maciços no hipocampo de camundongos Tg4-42, que podem ser resgatados por imunização passiva com anti- corpo NT4X [6]. No presente estudo, usamos uma nova versão huma- nizada do anticorpo NT4X clonado em um esqueleto IgG1 murino. A imunização passiva de rcNT4X_S7A começando aos três meses de idade por 12 semanas também resgatou déficits de memória de refe- rência espacial em camundongos Tg4-42. Além disso, o número de neurônios CA1 no hipocampo foi significativamente resgatado em comparação com o grupo de animais Tg4-42 tratados com IgG1. Curi- osamente, comparando o efeito do tratamento entre NT4X, rcNT4X_SA e rcNT4X_S7A, os camundongos Tg4-42 expostos a rcNT4X_S7A foram significativamente maiores em comparação com NT4X. Portanto, assumimos que rcNT4X_S7A tem a potência mais alta entre as diferentes versões do NT4X. Sequências

QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSIS SYGIHWIRQP PGKGLEWIGV MWSGGITDFY AAFISRVTIS VDTSKNQFSL

KLSSVTAADT AVYYCARGSR YALDYWGQGT LVTVSS SEQ ID NO: Sequência 1 RHA

QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGFSLS SYGIHWIRQP PGKGLEWIGV MWSGGITX1X6Y X2X3X4X5SRVTIS RDTSKNQVSL

KLSSVTAADT AVYYCARGSR YALDYWGQGT LVTVSS SEQ ID NO: 2: Sequência RHA com 27F, 29L, 63R e 70V e 52BX1, 53X2, 54X3, 55X4, 56X5 e 52CX6, onde X1 é D ou N, X2 é A, N, ou P, X3 é A ou S, X4 é F ou L, X5 é I ou K, e X6 é F ou Y.

QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGFSLS SYGIHWIRQP PGKGLEWIGV MWSGGITDFY AAFISRVTIS RDTSKNQVSL

KLSSVTAADT AVYYCARGSR YALDYWGQGT LVTVSS SEQ ID NO: Sequência 3 RHS

QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGFSLS SYGIHWIRQP PGKGLEWIGV MWSGGITNFY PSLKSRVTIS RDTSKNQVSL

KLSSVTAADT AVYYCARGSR YALDYWGQGT LVTVSS SEQ ID NO: Sequência 4 RHS7

QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGFSLS SYGIHWIRQP PGKGLEWIGV MWSGGITNYY PSLKSRVTIS RDTSKNQVSL

KLSSVTAADT AVYYCARGSR YALDYWGQGT LVTVSS SEQ ID NO: Sequência 5 RHS71

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP

GKAPKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ GX7TLPPTFGG GTKLEIK SEQ ID NO: Sequência 6 RKA com 92X7, onde X7 é N, H, Y ou W

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP

EDFATYYCQQ GNTLPPTFGG GTKLEIK SEQ ID NO: Sequência 7 RKA

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP

EDFATYYCQQ GHTLPPTFGG GTKLEIK SEQ ID NO: Sequência 8 RKH

SEQ ID NOs: 9 e 10: Proteína e sequência de DNA de Região Variável de Cadeia Leve Kappa NT4X-167

5' CAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACCTGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACTAGCTATGGTATACACTGGGTTCGCCAGTCT 120

62/79 1 Q V Q L K Q S G P G L V Q P S Q S L S I T C T V S G F S L T S Y G I H W V R Q S

5' CCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGATGTGGAGTGGTGGAATCACAGACTTTTATGCAGCTTTCATATCCAGACTGAGCATCAGCAGGGACATCTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTT 240 1 P G K G L E W L G V M W S G G I T D F Y A A F I S R L S I S R D I S K S Q V F F

5' AAAATGAACAGTCTGCAAGCTGATGACACAGCCATATACTACTGTGCCAGAGGGAGTCGCTATGCTTTGGACTACTGGGGTCAAGGCACCTCAGTCTCCGTCTCCTCA

1 K M N S L Q A D D T A I Y Y C A R G S R Y A L D Y W G Q G T S V S V S S

SEQ ID NOs: 11 e 12: Proteína e Sequência de DNA de Região Variável de Cadeia Pesada NT4X-167

SEQ ID NOs: 13 e 14: Proteína e Sequência de DNA de NT4X-167 HA

SEQ ID NOs: 15 e 16: Proteína e Sequência de DNA de NT4X-167 HB

SEQ ID NOs: 17 e 18: Proteína e Sequência de DNA de NT4X-167 KA

SEQ ID NOs: 19 e 20: Proteína e Sequência de DNA de NT4X-167 KB

Tabelas

67/79 CDRs em caixas Resíduos sublinhados indicam retrotraduções ao Resíduo de camundongo Resíduos em negrito indicam resíduos FW críticos retidos como humanos para aumentar a % de identidade humana Tabela 1 alinha as sequências de NT4X_VH (SEQ ID NO: 12), AF062228 (SEQ ID NO: 21), NT4X RHA (SEQ ID NO: 22), NT4X RHB (SEQ ID NO: 23), NT4X RHC (SEQ ID NO: 24), NT4X RHD (SEQ ID NO: 25), NT4X RHE (SEQ ID NO: 26), NT4X RHF (SEQ ID NO: 27), NT4X RHG (SEQ ID NO: 28), NT4X RHH (SEQ ID NO: 29), NT4X RHI (SEQ ID NO: 30), NT4X RHJ (SEQ ID NO: 31), NT4X RHK (SEQ ID NO: 32), NT4X RHL (SEQ ID NO: 33), NT4X RHM (SEQ ID NO: 34), NT4X RHN (SEQ ID NO: 35), NT4X RHO (SEQ ID NO: 36), NT4X RHP (SEQ ID NO: 37), NT4X RHQ (SEQ

ID NO: 38), NT4X RHR (SEQ ID NO: 39), NT4X RHS (SEQ ID NO: 40), e NT4X RHT (SEQ ID NO: 41). Tabela 1 Estratégia de Humanização de Cadeia Pesada NT4X-167

68/79

CDRs em caixas Resíduos sublinhados indicam retrotraduções ao Resíduo de camundongo Resíduos em negrito indicam resíduos FW críticos retidos como humanos Resíduos em Negrito indicam resíduos de CDR KABAT mutada para escolher resíduos FW humanos (considerando CDRs IMGT) Resíduos em Negrito indicam mutações adicionais para aumentar % de identidade humana Resíduos em Negrito indicam mutações de Maturação de Afinidade Tabela 2 alinha as sequência de NT4X_VH (SEQ ID NO: 12), AF062228 (SEQ ID NO: 21), NT4X RHA (SEQ ID NO: 22), NT4X RHB (SEQ ID NO: 23), NT4X RHS (SEQ ID NO: 40), NT4X RHS2 (SEQ ID NO: 42), NT4X RHS3 (SEQ ID

69/79 NO: 43), NT4X RHS4 (SEQ ID NO: 44), NT4X RHS5 (SEQ ID NO: 45), NT4X*RHS6 (SEQ ID NO: 46), NT4X*RHS7 (SEQ ID NO: 47), NT4X*RHS8 (SEQ ID NO: 48), NT4X*RHS71(F67Y) (SEQ ID NO: 49), NT4X*RHS72(Y68N) (SEQ ID NO: 50), NT4X*RHS73(F67Y/Y68N) (SEQ ID NO: 51), NT4X*RHS74(I39W) (SEQ ID NO: 52), NT4X*RHS81(S53M) (SEQ ID NO: 53), NT4X*RHS82(S53H) (SEQ ID NO: 54), NT4X*RHS83(R100H) (SEQ ID NO: 55), NT4X*RHS84(L103R) (SEQ ID NO: 56), and NT4X*RHS85(L103H) (SEQ ID NO: 57).

Tabela 2 Estratégia de Humanização de Cadeia Pesada NT4X-167 – versões de cadeia pesada adicionais que aumentam % de identidade humana e afinidade % Geral de HuID (regiçao J Sequência NT4X (VH) mo (Resíduos) Alterados para Resíduos hu Alterações AA não not inc) RHS 79.4 RHS6 H40 S40 1 80.4 RHS7 D66&AAFI (69-72) N66 & PSLK(69-72) 5 84.5 RHS8 H40; D66 & AAFI (69-72) S40; N66 & PSLK (69-72) 6 85.6 RHS71 F67 F67Y 1 85.6

70/79 RHS72 Y68 Y68N 1 85,6 RHS73 F67 & Y68 F67Y & Y68N 2 86.6 RHS74 I39 I39W 1 85.6

Tabela 3 % de Identidade Humana de Versões RHS de Humanização de Cadeia Pesada NT4X-167

71/79 CDRs em caixa Resíduos em negrito indicam retrotraduções ao Resíduo de camundongo Resíduos em negrito indicam resíduos FW críticos retidos como humanos

Tabela 4 alinha as sequências de NT4X_VK (SEQ ID NO: 10), AY942002 (SEQ ID NO: 58), NT4X RKA (SEQ ID NO: 59), NT4X RKB (SEQ ID NO: 60), NT4X RKC (SEQ ID NO: 61), NT4X RKD (SEQ ID NO: 62), NT4X RKE (SEQ ID NO: 63), NT4X RKF (N92W) (SEQ ID NO: 64), NT4X RKG (N92Y) (SEQ ID NO: 65), NT4X RKH (N92H) (SEQ ID NO: 66), NT4X RKI (L94R) (SEQ ID NO: 67), e NT4X RKJ (L94H) (SEQ ID NO: 68). Tabela 4 Estratégia de Humanização de Cadeia Leve Kappa NT4X-167

Tabela 5 73/79 TABELA 6 Sequências de Aminoácido de Cadeia Pesada (vide Figura 7)

[00197] Tabela 6 mostra as sequências de NT4X_VH (SEQ ID NO: 12), AF062228 (SEQ ID NO: 21), NT4X RHA (SEQ ID NO: 22), NT4X RHB (SEQ ID NO: 23), NT4X RHK (SEQ ID NO: 32), NT4X RHL (SEQ ID NO: 33), NT4X RHM (SEQ ID NO: 34), NT4X RHN (SEQ ID NO: 35), NT4X RHO (SEQ ID NO: 36), NT4X RHP (SEQ ID NO: 37), NT4X RHQ (SEQ ID NO: 38), e NT4X RHR (SEQ ID NO: 39).

Referências

1. Oakley, H., et al J Neurosci 2006, 26, 10129-10140

2. Bouter, Y. et al Acta Neuropathol 2013, 126, 189-205

3. Morris, R. J Neurosci Methods 1984, 11, 47-60.

4. Jawhar, S. et al Neurobiol Aging 2012, 33, 196.e129 –196.e140.

5. Wirths, O. et al J Neural Transm 2010, 117, 85-96

6. Antonios, G., et al Scientific reports 2015, 5, 17338. doi:10.1038/ srep17338

7. Wittnam, J.L. et al J Biol Chem 2012, 287, 8154-8162

8. Kabat, E. A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5 ed. NIH National Technical Information Service. (1991) 1-3242.

9. Lefranc, M.-P., et al.. Nucl. Acids Res. (2015) 43 (D1): D413-D422. doi: 10.1093/nar/gku1056 Declarações Adicionais de Invenção:

[00198] As seguintes declarações numeradas de invenção fazem parte da descrição;

1. Um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, em que a) o domínio variável de cadeia pesada (domínio VH) com- preende SEQ ID NO: 2 com quatro ou menos alterações adicionais, como substituições, nas regiões estruturais e b) o domínio variável de cadeia leve (domínio VK) compre- ende SEQ ID NO: 6 com quatro ou menos alterações adicionais, tais como substituições, nas regiões estruturais.

2. Um anticorpo, de acordo com a declaração 1, em que o anticorpo se liga aos peptídeos amiloides AβpE3-42 e Aβ4-42 e não se liga ao peptídeo amiloide Aβ1-42.

3. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das declara- ções anteriores, em que o anticorpo se liga ao peptídeo amiloide AβpE3-42 com uma afinidade de ligação de pelo menos 85% da afini-

dade de ligação do anticorpo NT4X-167 murino ao peptídeo amiloide AβpE3-42, como medido por ELISA.

4. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das declara- ções anteriores, em que o domínio VH compreende SEQ ID NO: 2.

5. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das declara- ções anteriores, em que o domínio VL compreende SEQ ID NO: 6.

6. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das declara- ções anteriores, em que o domínio variável de cadeia pesada compre- ende SEQ ID NO: 2 em que X1 (posição Kabat 52B) é D.

7. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das declara- ções de 1 a 5, em que o domínio variável de cadeia pesada compre- ende SEQ ID NO: 2 em que X1 (posição Kabat 52B) é N.

8. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das declara- ções anteriores, em que o domínio variável de cadeia pesada compre- ende SEQ ID NO: 2, em que X2 (posição 53 de Kabat) é A.

9. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das declara- ções 1 a 7, em que o domínio variável de cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 2, em que X2 (posição 53 de Kabat) é P.

10. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das decla- rações anteriores, em que o domínio variável de cadeia pesada com- preende SEQ ID NO: 2 em que X3 (posição 54 de Kabat) é A.

11. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das decla- rações de 1 a 9, em que o domínio variável de cadeia pesada compre- ende SEQ ID NO: 2, em que X3 (posição de Kabat 54) é S.

12. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das decla- rações anteriores, em que o domínio variável de cadeia pesada com- preende SEQ ID NO: 2 em que X4 (posição 55 de Kabat) é F.

13. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das decla- rações de 1 a 11, em que o domínio variável de cadeia pesada com- preende SEQ ID NO: 2, em que X4 (posição 55 de Kabat) é L.

14. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das decla- rações anteriores, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 2, em que X5 (posição Kabat 56) é I.

15. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das decla- rações de 1 a 13, em que o domínio variável de cadeia pesada com- preende SEQ ID NO: 2 em que X5 (posição Kabat 56) é K.

16. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das decla- rações anteriores, em que o domínio variável de cadeia pesada com- preende SEQ ID NO: 2 em que X6 (posição Kabat 52C) é F.

17. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das decla- rações 1 a 15, em que o domínio variável de cadeia pesada compre- ende SEQ ID NO: 2, em que X6 (posição Kabat 52C) é Y.

18. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das decla- rações de 1 a 5, em que o domínio variável de cadeia pesada compre- ende SEQ ID NO: 3 com quatro ou menos substituições adicionais nas regiões estruturais.

19. Um anticorpo, de acordo com a declaração 18, caracte- rizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada compre- ende SEQ ID NO: 3

20. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das decla- rações de 1 a 5, em que o domínio variável de cadeia pesada compre- ende SEQ ID NO: 4 com quatro ou menos alterações adicionais, tais como substituições nas regiões estruturais

21. Um anticorpo, de acordo com a declaração 20, em que o domínio variável de cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 4.

22. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das decla- rações de 1 a 5, em que o domínio variável de cadeia pesada compre- ende SEQ ID NO: 5 com quatro ou menos alterações adicionais, tais como substituições nas regiões estruturais

23. Um anticorpo, de acordo com a declaração 22, em que o domínio variável de cadeia pesada (VH) compreende SEQ ID NO: 5.

24. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das decla- rações anteriores, em que o domínio variável de cadeia leve compre- ende SEQ ID NO: 6, em que X7 (posição 92 de Kabat) é N.

25. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das decla- rações de 1 a 23, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia leve compreende SEQ ID NO: 6, em que X7 (posição 92 de Kabat) é H

26. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das decla- rações de 1 a 23, em que o domínio variável de cadeia leve compre- ende SEQ ID NO: 6, em que X7 (posição 92 de Kabat) é Y.

27. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das decla- rações de 1 a 23, em que o domínio variável de cadeia leve compre- ende SEQ ID NO: 6, em que X7 (posição 92 de Kabat) é W.

28. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das decla- rações de 1 a 25, em que o domínio variável de cadeia leve compre- ende SEQ ID NO: 7 com quatro ou menos alterações adicionais, tais como substituições, nas regiões estruturais

29. Um anticorpo, de acordo com a declaração 28, em que o domínio variável de cadeia leve compreende SEQ ID NO: 7.

30. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das decla- rações de 1 a 23 e 25, em que o domínio variável de cadeia leve com- preende SEQ ID NO: 8 com quatro ou menos alterações adicionais, tais como substituições, nas regiões estruturais

31. Um anticorpo, de acordo com a declaração 30, em que o domínio variável de cadeia leve compreende SEQ ID NO: 8.

32. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das decla- rações 1 a 5, em que compreende o domínio VH de SEQ ID NO: 3 e o domínio VK de SEQ ID NO: 7.

33. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das decla- rações 1 a 5, em que compreende o domínio VH de SEQ ID NO: 4 e o domínio VK de SEQ ID NO: 7.

34. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das decla- rações 1 a 5, em que compreende o domínio VH de SEQ ID NO: 5 e o domínio VK de SEQ ID NO: 8.

35. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das decla- rações de 1 a 5, em que compreende o domínio VH de SEQ ID NO: 5 e o domínio VK de SEQ ID NO: 7.

36. Uma composição farmacêutica que compreende um an- ticorpo de acordo com qualquer uma das declarações anteriores com um veículo farmaceuticamente aceitável.

37. Um ácido nucleico que codifica um anticorpo, de acordo com qualquer uma das declarações de 1 a 35.

38. Um vetor compreendendo o ácido nucleico da declara- ção 37 operacionalmente ligado a um promotor.

39. Uma célula hospedeira compreendendo o ácido nuclei- co da declaração 37 ou vetor da declaração 38.

40. Um método para preparar um anticorpo de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 35, o método compreendendo ex- pressar, em uma cultura de células hospedeiras, um vetor de acordo com a declaração 36 para produzir o referido anticorpo; e recuperar o anticorpo da cultura de células.

41. Um método de tratamento ou profilaxia da doença de Alzheimer pela administração, a um indivíduo em necessidade de tra- tamento, de uma quantidade eficaz de um anticorpo de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 35 ou a composição farmacêutica da declaração 36.

42. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das decla- rações 1 a 35 ou a composição farmacêutica da declaração 36, para uso em um método de tratamento do corpo humano ou animal.

43. Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das decla- rações 1 a 35 ou a composição farmacêutica da declaração 36, para uso em um método de tratamento da doença de Alzheimer em um in- divíduo.

Claims (18)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de ca- deia leve, em que a) o domínio variável de cadeia pesada (domínio VH) com- preende SEQ ID NO: 2 com quatro ou menos alterações adicionais nas regiões estruturais, e b) o domínio variável de cadeia leve (domínio VK) compre- ende SEQ ID NO: 6 com quatro ou menos alterações adicionais nas regiões estruturais.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo fato de que o anticorpo se liga aos peptídeos amiloides Αβpe3- 42 e Αβ4-42 e não se liga ao peptídeo amiloide αβ1-42.

3. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que o domínio VH com- preende SEQ ID NO: 2 e o domínio VL compreende SEQ ID NO: 6.

4. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de ca- deia pesada compreende SEQ ID NO: 3 com quatro ou menos altera- ções adicionais nas regiões estruturais, opcionalmente, em que o do- mínio variável de cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 3

5. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de ca- deia pesada compreende SEQ ID NO: 4 com quatro ou menos altera- ções adicionais nas regiões estruturais, opcionalmente, em que o do- mínio variável de cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 4.

6. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de ca- deia pesada compreende SEQ ID NO: 5 com quatro ou menos altera- ções adicionais, tais como substituições, nas regiões estruturais, opci-

onalmente em que o domínio variável de cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 5.

7. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de ca- deia leve compreende SEQ ID NO: 7 com quatro ou menos alterações adicionais, tais como substituições, nas regiões estruturais, opcional- mente em que o domínio variável de cadeia leve compreende SEQ ID NO: 7.

8. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de ca- deia leve compreende SEQ ID NO: 8 com quatro ou menos alterações adicionais, tais como substituições, nas regiões estruturais, opcional- mente em que o domínio variável de cadeia leve compreende SEQ ID NO: 8.

9. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende o domínio VH de SEQ ID NO: 3 e o domínio VK de SEQ ID NO: 7.

10. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende o domínio VH de SEQ ID NO: 4 e o domínio VK de SEQ ID NO: 7.

11. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende o domínio VH de SEQ ID NO: 5 e o domínio VK de SEQ ID NO: 8.

12. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende o domínio VH de SEQ ID NO: 5 e o domínio VK de SEQ ID NO: 7.

13. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes com um veículo farmaceuticamente acei- tável.

14. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12 ou composição farmacêutica de acordo com a reivindica- ção 13, caracterizado(a) pelo fato de que é para tratar o corpo humano ou animal.

15. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12 ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindi- cação 13, caracterizado(a) pelo fato de que é para tratar doença de Alzheimer em um indivíduo.

16. Uso de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é na prepa- ração de uma composição e/ou um medicamento e/ou um kit para tra- tar o corpo humano ou animal.

17. Uso de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é na prepa- ração de uma composição e/ou um medicamento e/ou um kit para tra- tar doença de Alzheimer em um indivíduo.

18. Invenção, caracterizada por quaisquer de suas concre- tizações ou categorias de reivindicações, por exemplo, produto ou pro- cesso ou uso englobadas pela matéria inicialmente descrita, revelada ou ilustrada no pedido de patente; Anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, em que a) o domínio variável de cadeia pesada (domínio VH) compreende SEQ ID NO: 2 com quatro ou menos alterações adicionais, como substituições, nas regiões estruturais e b) o domínio variável de cadeia leve (domínio VK) compreende SEQ ID NO: 6 com quatro ou menos alterações adicio- nais, tais como substituições, nas regiões estruturais; Composição farmacêutica que compreende um anticorpo como aqui definido com um veículo farmaceuticamente aceitável; Ácido nucleico que codifica um anticorpo, como aqui defini-

do; Vetor compreendendo o ácido nucleico como aqui definido operacionalmente ligado a um promotor; Célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico como aqui definido ou vetor como aqui definido; Método para preparar um anticorpo como aqui definido, o método compreendendo expressar, em uma cultura de células hospe- deiras, um vetor como aqui definido para produzir o referido anticorpo; e recuperar o anticorpo da cultura de células; Kit que contém pelo menos um anticorpo como aqui defini- do ou, em que o kit compreende uma composição como aqui definida, em um ou mais recipientes, opcionalmente com um ou mais outros agentes profiláticos ou terapêuticos úteis para a prevenção, gestão ou tratamento da doença de Alzheimer (DA).