BR112021003146A2 - sistema e métodos para detectar o tempo de vida ao usar fotodetectores de contagem de fótons - Google Patents

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Abstract

"SISTEMA E MÉTODOS PARA DETECTAR O TEMPO DE VIDA AO USAR FOTODETECTORES DE CONTAGEM DE FÓTONS". A presente invenção refere-se a sistemas e métodos para detectar o tempo de vida de moléculas luminescentes ao usar fotodetectores configurados para executar a contagem de fótons. Os sistemas e os métodos podem envolver uma disposição de fotodetectores para detectar os fótons emitidos de uma amostra, que pode incluir moléculas luminescentes, e circuito de detecção associado com a disposição de fotodetectores. O circuito de detecção podem ser configurados para contar, pelo menos durante um primeiro período de tempo e um segundo período de tempo, uma quantidade de fótons incidentes em um fotodetector na disposição de fotodetectores.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SISTE-
MA E MÉTODOS PARA DETECTAR O TEMPO DE VIDA AO USAR FOTODETECTORES DE CONTAGEM DE FÓTONS". REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS DE PATENTE RELACIONA- DOS
[001] O presente pedido de patente reivindica o benefício sob o 35 U.S.C. § 119(e) do Pedido de Patente Norte-americano Provisório nº. de série 62/724.167, intitulado "SISTEMA E MÉTODOS PARA DE-
TECTAR O TEMPO DE VIDA AO USAR FOTODETECTORES DE CONTAGEM DE FÓTONS", e depositado em 29 de agosto de 2018, o qual é incorporado a título de referência no presente documento em sua totalidade.
ANTECEDENTES Campo
[002] O presente pedido de patente refere-se a sistemas, méto- dos e técnicas para detectar moléculas em amostras biológicas e quí- micas mediante a execução da análise paralela dessas amostras. Técnica Relacionada
[003] A detecção e a análise de amostras biológicas e químicas podem ser executadas ao etiquetar as amostras com etiquetas lumi- nescentes que emitem a luz que tem um comprimento de onda carac- terístico em resposta à iluminação das amostras com luz que excita as etiquetas luminescentes. Os fotodetectores posicionados para detectar a luz emitida podem gerar sinais, os quais podem ser usados para analisar a amostra.
SUMÁRIO
[004] Algumas modalidades são dirigidas a um sistema que inclui uma disposição de fotodetectores e um circuito de detecção associado com a disposição de fotodetectores. O circuito de detecção é configu- rado para contar, durante um primeiro período de tempo e um segundo período de tempo depois da iluminação de uma molécula luminescente com luz de excitação, uma quantidade de fótons incidentes recebidos da molécula luminescente em um fotodetector da disposição de foto- detectores.
[005] Em algumas modalidades, o circuito de detecção é configu- rado para contar os fótons individuais incidentes na disposição de fo- todetectores durante o primeiro período de tempo e o segundo período de tempo. Em algumas modalidades, o circuito de detecção também é configurado para gerar os sinais que identificam a molécula lumines- cente.
[006] Em algumas modalidades, o circuito de detecção também é configurado para gerar sinais que distinguem entre tipos diferentes de moléculas luminescentes incluindo um primeiro sinal que identifica um primeiro tipo de molécula luminescente e um segundo sinal que identi- fica um segundo tipo de molécula luminescente. Em algumas modali- dades, os tipos diferentes de moléculas luminescentes são associados com nucleotídeos diferentes, e o circuito de detecção é configurado para gerar um conjunto de sinais que identificam uma série de nucleo- tídeos. Em algumas modalidades, o conjunto de sinais que identificam a série de nucleotídeos arranja em sequência uma molécula de ácido nucleico modelo. Em algumas modalidades, a série de nucleotídeos identificados pelo conjunto de sinais é uma série de nucleotídeos de uma molécula de ácido nucleico complementar à molécula de ácido nucleico modelo. Em algumas modalidades, os tipos diferentes de nu- cleotídeos na série de nucleotídeos são etiquetados com tipos diferen- tes de moléculas luminescentes.
[007] Em algumas modalidades, o circuito de detecção também é configurado para gerar os sinais indicativos de um tempo de vida da molécula luminescente.
[008] Em algumas modalidades, o circuito de detecção têm pelo menos dois circuitos de contagem de fótons associados com um foto- detector na disposição e configurados para contar a quantidade de fó- tons incidentes recebidos pelo fotodetector. Em algumas modalidades, o circuito de detecção também é configurado para gerar os sinais indi- cativos da quantidade de fótons incidentes recebidos pelo fotodetector durante o primeiro período de tempo e o segundo período de tempo. Em algumas modalidades, os sinais gerados pelo circuito de detecção incluem um primeiro sinal que identifica uma primeira quantidade de fótons incidentes recebidos pelo fotodetector durante o primeiro perío- do de tempo e um segundo sinal que identifica uma segunda quanti- dade de fótons incidentes recebidos pelo fotodetector durante o se- gundo período de tempo. Em algumas modalidades, pelo menos dois circuitos de contagem de fótons incluem um primeiro circuito de conta- gem de fótons e um segundo circuito de contagem de fótons, e o pri- meiro circuito de contagem de fótons é configurado para gerar o pri- meiro sinal e o segundo circuito de contagem de fótons é configurado para gerar o segundo sinal. Em algumas modalidades, o circuito de detecção é configurado para gerar um sinal de leitura que inclui o pri- meiro sinal e o segundo sinal. Em algumas modalidades, o primeiro período de tempo e o segundo período de tempo são períodos de tempo não superpostos.
[009] Em algumas modalidades, o circuito de detecção é configu- rado para receber um sinal de controle que indica um tempo de refe- rência e para executar a contagem de fótons em resposta à recepção do sinal de controle. Em algumas modalidades, o circuito de detecção é configurado para receber um sinal de controle de uma fonte de luz configurada para emitir um pulso de luz de excitação e para executar a contagem de fótons em resposta à recepção do sinal de controle.
[0010] Em algumas modalidades, o sistema também compreende: pelo menos uma fonte de luz configurada para emitir luz de excitação;
e um circuito configurado para controlar pelo menos uma fonte de luz para emitir pulsos de luz de excitação e gerar os sinais de controle que correspondem aos pulsos emitidos. O circuito de detecção associado com um fotodetector na disposição é configurado para executar a con- tagem de fótons em resposta à recepção de pelo menos um dos sinais de controle dos circuitos.
[0011] Em algumas modalidades, o sistema também compreende: uma disposição de poços de amostras, onde os poços de amostras individuais na disposição de poços de amostras é configurado para receber uma amostra. Em algumas modalidades, uma posição de ali- nhamento da disposição de poços de amostras à disposição de fotode- tectores inclui um primeiro subconjunto de poços de amostras posicio- nados para alinhar opticamente com pelo menos uma porção dos foto- detectores na disposição de fotodetectores e um segundo subconjunto de poços de amostras posicionados para não alinhar opticamente com os fotodetectores na disposição de fotodetectores. Em algumas moda- lidades, o primeiro subconjunto de poços de amostras inclui pelo me- nos uma fileira de poços de amostras na disposição de poços de amostras que alinha opticamente com pelo menos uma fileira dos fo- todetectores na disposição de fotodetectores quando na posição de alinhamento. Em algumas modalidades, o primeiro subconjunto de po- ços de amostras inclui uma primeira fileira e uma segunda fileira de poços de amostras na disposição de poços de amostras, em que a primeira fileira e a segunda fileira são separadas por pelo menos uma fileira de poços de amostras no segundo subconjunto de poços de amostras.
[0012] Em algumas modalidades, o sistema também compreende: pelo menos um elemento óptico posicionado para dirigir os fótons emi- tidos da disposição da poços de amostras rumo à disposição de foto- detectores. Em algumas modalidades, pelo menos um elemento óptico é posicionado para dirigir os fótons emitidos de um poço de amostras da disposição de poços de amostras rumo a um fotodetector na dispo- sição de fotodetectores. Em algumas modalidades, pelo menos um elemento óptico é configurado para alinhar os fótons emitidos de um poço de amostras da disposição de poços de amostras para se sobre- por com uma região de detecção de um fotodetector na disposição de fotodetectores. Em algumas modalidades, pelo menos um elemento óptico inclui um espelho dicroico posicionado para dirigir a luz emitida por pelo menos uma fonte de luz rumo à disposição de poços de amostras e para transmitir a luz emitida pela molécula luminescente à disposição de fotodetectores.
[0013] Em algumas modalidades, o sistema também compreende: pelo menos um guia de ondas, em que pelo menos uma porção dos poços de amostras na disposição de poços de amostras é posicionada para receber a luz de pelo menos um guia de ondas. Em algumas mo- dalidades, a disposição de poços de amostras e pelo menos um guia de ondas são integrados em um chip de amostra, e a disposição de poços de amostras é arranjada em uma superfície do chip de amostra. Em algumas modalidades, o chip de amostra também compreende um acoplador de grade configurado para receber a luz de uma fonte de luz externa e para acoplar opticamente a luz em pelo menos um guia de ondas. Em algumas modalidades, pelo menos um elemento óptico inclui uma pluralidade de lentes arranjadas em uma configura- ção de lente de retransmissão.
[0014] Em algumas modalidades, a disposição de fotodetectores compreende uma disposição de fotodiodos de avalanche de fótons in- dividuais.
[0015] Algumas modalidades são dirigidas a um aparelho que in- clui o circuito de detecção que compreende uma disposição de fotode- tectores. O circuito de detecção é configurado para contar os fótons incidentes recebidos pela disposição de fotodetectores das moléculas luminescentes para distinguir entre as moléculas luminescentes asso- ciadas com nucleotídeos diferentes que são incorporados em uma mo- lécula de ácido nucleico.
[0016] Em algumas modalidades, o circuito de detecção também é configurado para gerar os sinais que identificam uma série de nucleo- tídeos quando os nucleotídeos individuais são incorporados na molé- cula de ácido nucleico. Em algumas modalidades, as moléculas lumi- nescentes etiquetam tipos diferentes de nucleotídeos.
[0017] Em algumas modalidades, o aparelho também compreende uma pluralidade de poços de amostras configurados para receber uma molécula de ácido nucleico modelo, em que um fotodetector na dispo- sição é posicionado para recebe a luz de um poço da pluralidade de poços de amostras. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico é complementar à molécula de ácido nucleico modelo.
[0018] Algumas modalidades são dirigidas a um método de fotode- tecção que inclui a recepção, por um fotodetector em uma disposição de fotodetectores, dos fótons de uma molécula luminescente, e a con- tagem, ao usar o circuito de detecção, de uma quantidade de fótons incidentes no fotodetector durante um primeiro período de tempo e um segundo período de tempo.
[0019] Em algumas modalidades, o método de fotodetecção tam- bém compreende a geração dos sinais que identificam a molécula lu- minescente, em que os sinais indicam uma primeira quantidade de fó- tons recebidos pelo fotodetector durante o primeiro período de tempo e uma segunda quantidade de fótons recebidos pelo fotodetector duran- te o segundo período de tempo. Em algumas modalidades, o método de fotodetecção também compreende a iluminação da amostra com um pulso de luz de excitação, e em que a contagem da quantidade dos fótons ocorre em resposta à iluminação da amostra com um pulso de luz de excitação.
[0020] Algumas modalidades são dirigidas a pelo menos um meio de armazenamento que pode ser lido por computador não transitório que armazena instruções executáveis por processador que, quando executadas por pelo menos um processador de hardware, fazem com que pelo menos um processador de hardware execute um método de detecção de fótons que compreende: a recepção, do circuito configu- rado para controlar pelo menos uma fonte de luz, de um sinal de con- trole que corresponde a um pulso de luz emitido por pelo menos uma fonte de luz; e o controle, em resposta à recepção do sinal de controle, do circuito de detecção configurado para executar a contagem dos fó- tons incidentes em um fotodetector em uma disposição de fotodetecto- res, em que a contagem inclui a contagem de uma quantidade de fó- tons incidentes recebidos pelo detetor durante um primeiro período de tempo e um segundo período de tempo.
[0021] Em algumas modalidades, o circuito de detecção também é configurado para gerar os sinais indicativos da quantidade de fótons incidentes recebidos pelo fotodetector durante o primeiro período de tempo e o segundo período de tempo. Em algumas modalidades, os sinais gerados pelo circuito de detecção incluem um primeiro sinal que identifica uma primeira quantidade de fótons incidentes recebidos pelo fotodetector durante o primeiro período de tempo e um segundo sinal que identifica uma segunda quantidade de fótons incidentes recebidos pelo fotodetector durante o segundo período de tempo.
[0022] Algumas modalidades são dirigidas a um método para ali- nhar uma disposição de poços de amostras com uma disposição de fotodetectores, em que o método compreende: a detecção, ao usar a disposição de fotodetectores, da luz da disposição de poços de amos- tras incidente na disposição de fotodetectores; e o ajuste, com base na luz detectada, do posicionamento da disposição de poços de amostras em relação à disposição de fotodetectores para permitir que pelo me- nos uma porção de poços de amostras na disposição de poços de amostras alinhe opticamente com pelo menos uma porção dos fotode- tectores na disposição de fotodetectores.
[0023] Em algumas modalidades, uma quantidade de luz detecta- da por fotodetectores individuais na disposição de fotodetectores indi- ca um grau de alinhamento da disposição de poços de amostras com a disposição de fotodetectores. Em algumas modalidades, o ajuste do posicionamento da disposição de poços de amostras em relação à disposição de fotodetectores inclui o deslocamento da disposição de poços de amostras de uma primeira posição a uma segunda posição, em que um primeiro subconjunto de fotodetectores na disposição de fotodetectores detecta uma quantidade maior de fótons quando a dis- posição de poços de amostras está na segunda posição e não na pri- meira posição. Em algumas modalidades, um segundo subconjunto de fotodetectores na disposição de fotodetectores detecta uma quantida- de menor de fótons quando a disposição de poços de amostras está na segunda posição e não na primeira posição.
[0024] Em algumas modalidades, o ajuste do posicionamento da disposição de poços de amostras em relação à disposição de fotode- tectores compreende o posicionamento de pelo menos uma fileira de poços de amostras na disposição de poços de amostras para alinhar opticamente com pelo menos uma fileira de fotodetectores na disposi- ção de fotodetectores. Em algumas modalidades, o ajuste do posicio- namento da disposição de poços de amostras em relação à disposição de fotodetectores compreende o deslocamento da disposição de po- ços de amostras e/ou da disposição de fotodetectores em uma direção translacional. Em algumas modalidades, o ajuste do posicionamento da disposição de poços de amostras em relação à disposição de foto- detectores compreende a rotação da disposição de poços de amostras e/ou da disposição de fotodetectores a um ângulo. Em algumas moda- lidades, o ajuste do posicionamento da disposição de poços de amos- tras em relação à disposição de fotodetectores compreende a compa- ração de um padrão da luz detectada a um padrão de alinhamento, em que o padrão de alinhamento tem pelo menos um dos fotodetectores como detectando uma quantidade de luz abaixo de um limite.
[0025] Algumas modalidades são dirigidas a um meio de armaze- namento que pode ser lido por computador que armazena no mesmo instruções, que quando executadas por um processador, executam um método de fotodetecção que inclui a recepção, do circuito configurado para controlar pelo menos uma fonte de luz, de um sinal de controle que corresponde a um pulso de luz emitido por pelo menos uma fonte de luz, e o controle, em resposta à recepção do sinal de controle, do circuito de detecção configurado para executar a contagem dos fótons incidentes em um fotodetector em uma disposição de fotodetectores. A contagem dos fótons inclui a contagem de uma quantidade de fótons incidentes recebidos pelo detetor durante um primeiro período de tem- po e um segundo período de tempo.
[0026] Algumas modalidades são dirigidas a um método para ali- nhar uma disposição de poços de amostras a uma disposição de foto- detectores. O método inclui a detecção, ao usar a disposição de foto- detectores, da luz da disposição da poços de amostras incidente na disposição de fotodetectores, e o ajuste, com base na luz detectada, do posicionamento da disposição de poços de amostras em relação à disposição de fotodetectores para permitir que pelo menos uma porção dos poços de amostras na disposição de poços de amostras alinhe opticamente com pelo menos uma porção dos fotodetectores na dis- posição de fotodetectores.
[0027] Algumas modalidades são dirigidas a um sistema que inclui um estrado, uma disposição de fotodetectores configurados para de-
tectar a luz, um circuito de detecção associado com a disposição de fotodetectores e configurado para gerar os sinais indicativos dos fótons incidentes na disposição de fotodetectores, e um circuito. O circuito é configurado para executar um método que inclui a recepção dos sinais do circuito de detecção, e o ajuste, com base nos sinais recebidos, do posicionamento do estrado em relação à disposição de fotodetectores para permitir que pelo menos uma porção de poços de amostras na disposição de poços de amostras alinhe opticamente com pelo menos uma porção dos fotodetectores na disposição de fotodetectores.
[0028] Em algumas modalidades, o circuito compreende: pelo me- nos um processador; e pelo menos um meio de armazenamento que pode ser lido por computador codificado com instruções executáveis por computador que, quando executadas, executam o método.
[0029] Em algumas modalidades, os sinais recebidos indicam uma quantidade de luz detectada por fotodetectores individuais na disposi- ção de fotodetectores, e a quantidade de luz indica um grau de ali- nhamento da disposição de poços de amostras com a disposição de fotodetectores. Em algumas modalidades, o ajuste do posicionamento do estrado em relação à disposição de fotodetectores também com- preende o ajuste da posição do estrado de uma primeira posição a uma segunda posição, em que um primeiro subconjunto de fotodetec- tores na disposição de fotodetectores detecta uma quantidade maior de fótons quando o estrado está na segunda posição e não na primei- ra posição. Em algumas modalidades, um segundo subconjunto de fotodetectores na disposição de fotodetectores detecta uma quantida- de menor de fótons quando a disposição de poços de amostras está na segunda posição e não na primeira posição. Em algumas modali- dades, o ajuste do posicionamento da disposição de poços de amos- tras em relação à disposição de fotodetectores compreende o posicio- namento de pelo menos uma fileira de poços de amostras na disposi-
ção de poços de amostras para alinhar com pelo menos uma fileira de fotodetectores na disposição de fotodetectores Breve Descrição dos Desenhos
[0030] Vários aspectos e modalidades do pedido de patente serão descritos com referência às figuras a seguir. Deve ser apreciado que as figuras não estão necessariamente desenhadas em escala. Os itens que aparecem em múltiplas figuras são indicados pelo mesmo número de referência em todas as figuras em que aparecem.
[0031] A FIGURA 1 é um diagrama de blocos que ilustra um sis- tema de detecção, de acordo com algumas modalidades da tecnologia descrita no presente documento.
[0032] A FIGURA 2 é um diagrama esquemático que ilustra os componentes ópticos exemplificadores, que podem ser incluídos em um sistema de detecção, de acordo com algumas modalidades da tec- nologia descrita no presente documento.
[0033] A FIGURA 3 é um gráfico que ilustra a operação de portas elétricas com o passar do tempo, de acordo com algumas modalida- des da tecnologia descrita no presente documento.
[0034] A FIGURA 4A é um diagrama esquemático de tipos exem- plificadores de circuitos que podem ser incluídos no circuito de detec- ção, de acordo com algumas modalidades da tecnologia descrita no presente documento.
[0035] A FIGURA 4B é um fluxograma de um processo ilustrativo para a obtenção de contagens de fótons, de acordo com algumas mo- dalidades da tecnologia descrita no presente documento.
[0036] A FIGURA 5 é um gráfico da eficiência de detecção de fó- tons espectral para uma disposição de fotodiodos de avalanche de fó- tons individuais, de acordo com algumas modalidades da tecnologia descrita no presente documento.
[0037] A FIGURA 6 é um gráfico da eficiência de detecção de fó-
tons espectral para um fotodiodo de avalanche de fótons individuais, de acordo com algumas modalidades da tecnologia descrita no pre- sente documento.
[0038] A FIGURA 7 é um gráfico das curvas de probabilidade da emissão para duas moléculas luminescentes diferentes que têm carac- terísticas diferentes de deterioração da emissão, de acordo com algu- mas modalidades da tecnologia descrita no presente documento.
[0039] A FIGURA 8 é um gráfico da contagem de fótons dos fótons da emissão, de acordo com algumas modalidades da tecnologia des- crita no presente documento.
[0040] A FIGURA 9 é um gráfico de um trem de pulsos ópticos, de acordo com algumas modalidades da tecnologia descrita no presente documento.
[0041] A FIGURA 10 é um diagrama esquemático de uma reação biológica exemplificadora que pode ocorrer dentro de um poço de amostras, de acordo com algumas modalidades da tecnologia descrita no presente documento.
[0042] A FIGURA 11 é um diagrama esquemático de uma vista em seção transversal de um chip de amostra exemplificador que tem uma fileira de poços de amostras, de acordo com algumas modalidades da tecnologia descrita no presente documento.
[0043] A FIGURA 12A é uma vista planar que ilustra o alinhamento óptico de uma disposição de poços de amostras a uma disposição de fotodetectores, de acordo com algumas modalidades da tecnologia descrita no presente documento.
[0044] A FIGURA 12B é uma vista planar que ilustra o desalinha- mento translacional entre uma disposição de poços de amostras e uma disposição de fotodetectores, de acordo com algumas modalida- des da tecnologia descrita no presente documento.
[0045] A FIGURA 12C é uma vista planar que ilustra o desalinha-
mento rotacional entre uma disposição de poços de amostras e uma disposição de fotodetectores, de acordo com algumas modalidades da tecnologia descrita no presente documento.
[0046] A FIGURA 13 é um fluxograma de um processo ilustrativo para alinhar uma disposição de poços de amostras com uma disposi- ção de fotodetectores, de acordo com algumas modalidades da tecno- logia descrita no presente documento.
[0047] A FIGURA 14 é um diagrama de blocos de um dispositivo de computação ilustrativo que pode ser usado na implementação de algumas modalidades da tecnologia descrita no presente documento.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0048] Os aspectos do presente pedido de patente se referem a sistemas e métodos relacionados para analisar amostras em paralelo, incluindo a identificação de moléculas individuais dentro de uma amos- tra e o arranjar em sequência de ácidos nucleicos. A análise de uma amostra pode incluir a etiquetação de moléculas na amostra com uma ou mais etiquetas luminescentes (por exemplo, moléculas fluorescen- tes), que podem ser usadas para detectar a amostra e/ou identificar moléculas individuais da amostra (por exemplo, identificar nucleotí- deos individuais como parte do arranjo em sequência de ácidos nu- cleicos). Uma molécula luminescente, tal como um uma molécula eti- quetada com uma molécula fluorescente ou um uma molécula que po- de então emitir luz, pode ficar excitada em resposta à iluminação da molécula luminescente com lux de excitação (por exemplo, a luz que tem um comprimento de onda característico que pode excitar a molé- cula luminescente a um estado excitado) e, se a molécula luminescen- te ficar excitada, emite a luz de emissão (por exemplo, a luz que tem um comprimento de onda característico emitida pela molécula lumi- nescente ao retornar de um estado excitado a um estado aterrado). A detecção da luz de emissão pode permitir a identificação da molécula luminescente ao usar uma ou mais características da luz, incluindo uma característica de luz temporal que emite (por exemplo, seu perío- do de tempo de deterioração da emissão, ou "tempos de vida"), um comprimento de onda de emissão característico, e um comprimento de onda de absorção característico. Uma característica temporal da luz pode ser identificada ao iluminar uma molécula luminescente com luz de excitação e ao determinar os tempos associados com o tempo quando os fótons são recebidos da molécula luminescente por um fo- todetector depois da iluminação. As características temporais típicas da luz podem variar de picosegundos a centenas de nanossegundos.
[0049] As limitações na identificação de características temporais da luz podem advir da escala temporal curta durante a qual os fótons são emitidos de uma molécula luminescente ao atingir um estado exci- tado, e de que alguns fotodetectores podem não conseguir operar de uma maneira que permita a detecção dos fótons nessas escalas tem- porais. Estas limitações podem se tornar mais significativas no contex- to da detecção de uma só molécula onde a identificação de moléculas luminescentes pode ficar limitada ao usar uma única molécula lumi- nescente ou um número baixo de moléculas luminescentes para eti- quetar uma única molécula e a probabilidade das moléculas lumines- centes de emitir luz em resposta a se tornarem excitadas. Até alguma extensão, essas limitações podem ser superadas ao executar a ilumi- nação repetida da amostra e a detecção dos fótons emitidos, onde os fótons detectados durante o mesmo período de tempo depois de even- tos diferentes de iluminação podem ser acumulados para identificar um perfil de tempo que caracteriza a luz emitida de uma amostra parti- cular. No entanto, o tempo associado com tal iluminação repetida e a detecção de fótons torna-se limitada em alguns respeitos pelos fotode- tectores que são usados. Por exemplo, alguns fotodetectores podem ser capazes de detectar somente os fótons recebidos dentro de um período de tempo depois da iluminação da amostra porque o fotode- tector pode não ter a capacidade de se configurar por múltiplos perío- dos de tempo de detecção dentro do quadro temporal curto necessário para detectar as características temporais da luz, que podem varia de picosegundos a centenas de nanossegundos. Estes tipos de limita- ções podem conduzir a perfis temporais incompletos ou imprecisos da luz emitida, o que pode resultar na identificação incorreta das molécu- las como estando presentes na amostra ou uma indicação que uma molécula particular não está presente na amostra. No contexto do ar- ranjo em sequência de ácidos nucleicos em tempo real onde a molécu- la luminescente que está sendo identificada é usada para etiquetar um nucleotídeo ou um análogo de nucleotídeo é incorporado em um cor- dão de ácido nucleico complementar, outras limitações podem advir do tempo dos eventos de incorporação, que podem ficar na faixa de 10 ms a 1.000 ms. Alguns fotodetectores convencionais podem não ter a capacidade de executar a detecção de fótons repetida, temporalmente sincronizada à iluminação repetida dentro dessa escala temporal e, desse modo, não têm a capacidade de detectar atributos (por exem- plo, o tempo de vida da fluorescência) de eventos de incorporação in- dividual com um nível desejado de exatidão.
[0050] Os autores da presente invenção reconheceram e aprecia- ram que a identificação dos fótons recebidos durante múltiplos perío- dos de tempo depois da iluminação de uma amostra pode melhorar a detecção de uma característica temporal de uma molécula lumines- cente presente na amostra. Os aspectos do presente pedido de paten- te e referem aos fotodetectores e aos circuitos de detecção associados configurados para detectar uma quantidade dos fótons recebidos por um fotodetector dentro de múltiplos períodos de tempo depois de um tempo de referência, o qual pode ser um tempo associado com um pulso de luz de excitação que ilumina a amostra. Em algumas modali-
dades, o circuito de detecção pode contar uma quantidade de fótons incidentes recebidos de uma molécula luminescente em um fotodetec- tor durante um primeiro período de tempo e um segundo período de tempo depois da iluminação da molécula luminescente com luz de ex- citação. O circuito de detecção pode incluir pelo menos um primeiro circuito de contagem de fótons e um segundo circuito de contagem de fótons associado com o fotodetector e pode gerar os sinais indicativos da quantidade de fótons incidentes recebidos durante o primeiro perí- odo de tempo e o segundo período de tempo, respectivamente. Um sinal de leitura gerado pelo circuito de detecção pode incluir o primeiro sinal e o segundo sinal. Desta maneira, o sinal de leitura resultante do circuito de detecção pode fornecer uma indicação de uma característi- ca temporal (por exemplo, tempo de vida) da luz emitida pela molécula luminescente. Em algumas modalidades, o fotodetector é um fotodiodo de avalanche de fótons individuais, e o circuito de detecção pode exe- cutar a contagem de fótons com base nos sinais elétricos gerados pelo fotodiodo de avalanche de fótons individuais em resposta à recepção dos fótons incidentes.
[0051] Os autores da presente invenção reconheceram e aprecia- ram que a implementação dos fotodetectores e dos circuitos de detec- ção associados configurados para executar a contagem de fótons du- rante múltiplos períodos de tempo tal como descrito no presente do- cumento pode acarretar vários benefícios que melhoram a detecção de características temporais de moléculas luminescentes. Estes bene- fícios incluem a capacidade de detectar uma quantidade dos fótons recebidos durante múltiplos períodos de tempo depois de um caso simples de iluminação da amostra. Isto pode permitir a identificação melhorada de um perfil temporal que caracteriza as características temporais das moléculas luminescentes, o que pode resultar em uma detecção mais exata de moléculas luminescentes como estando pre-
sentes em uma amostra. Os fotodetectores e circuitos de detecção tal como descrito no presente documento podem ser particularmente be- néficos para as aplicações que envolvem a detecção de moléculas lu- minescentes dentro de escalas temporais curtas, tais como aqueles necessários para a execução do arranjo em sequência de ácidos nu- cleicos em tempo real. Em particular, as limitações do tempo associa- das com os eventos de incorporação individuais podem limitar a dura- ção do tempo permitido para detectar os fótons emitidos pelas molécu- las luminescentes usadas para etiquetar nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos que são incorporados em um cordão de ácido nucleico em crescimento. Por meio da implementação de fotodetectores e cir- cuitos de detecção configurados para executar a contagem e a acumu- lação de fótons durante múltiplos períodos de tempo, menos repeti- ções de iluminação seguidas pela detecção de fótons podem ser ne- cessárias para obter o perfil temporal idêntico ou similar para uma mo- lécula luminescente do que o uso de fotodetectores convencionais que só podem detectar os fótons dentro de um único período de tempo de- pois da iluminação. Além disso, os fotodetectores e os circuitos de de- tecção operando em um modo no qual um quadro de leitura inclui os sinais associados com a acumulação de contagens de fótons para múltiplas repetições de iluminação podem melhorar a razão entre sinal e ruído, o que também pode reduzir a intensidade da iluminação ne- cessária para obter uma razão entre sinal e ruído desejada.
[0052] Algumas modalidades do presente pedido de patente se referem a um sistema de detecção para detectar moléculas lumines- centes, o qual inclui fotodetectores e o circuito de detecção configura- dos para executar a contagem de fótons durante múltiplos períodos de tempo tal como descrito no presente documento. O sistema de detec- ção pode incluir uma disposição de poços de amostras, onde os poços de amostras individuais na disposição são configurados para receber uma amostra (por exemplo, molécula de ácido nucleico modelo). O sistema de detecção pode incluir uma ou mais fontes de luz configura- das para emitir luz, a qual pode excitar as moléculas luminescentes presentes na amostra, e um ou mais componentes ópticos configura- dos para dirigir a luz rumo à disposição de poços de amostras. De acordo com algumas modalidades, uma ou mais fontes de luz podem ser configuradas para emitir pulsos de luz e o tempo da contagem de fótons executada pelo circuito de detecção pode depender do tempo dos pulsos de luz. Em particular, os circuitos de controle associados com uma ou mais fontes de luz podem gerar os sinais de controle que correspondem a quando os pulsos de luz individuais são emitidos, e o circuito de detecção pode começar a executar a contagem de fótons em resposta à recepção dos sinais de controle. Desta maneira, os pul- sos de luz emitidos por uma fonte de luz podem agir como um ativador externo para que o circuito de detecção comece a executar a conta- gem de fótons.
[0053] A disposição de poços de amostras pode ser integrada co- mo parte de um chip de amostra, que pode formar uma interface com um outro componente do sistema de detecção, tal como um estrado. O estrado pode ser usado para posicionar a disposição de poços de amostras em relação aos fotodetectores. O chip de amostra pode ser unido de maneira removível ao componente, o que pode permitir que as os chips de amostras separados sejam usados para amostras dife- rentes durante a operação. Por conseguinte, os aspectos da presente pedido de patente são dirigidos a técnicas para alinhar uma disposição de poços de amostras a uma disposição de fotodetectores de uma maneira que permite que os fótons emitidos de diferentes poços de amostras sejam distinguidos uns dos outros com base em qual fotode- tector é usado para detectar os fótons emitidos. O alinhamento da dis- posição de poços de amostras com a disposição de fotodetectores po-
de envolver o posicionamento das duas disposições uma em relação à outra (por exemplo, ao ajustar o posicionamento de um estrado em relação à disposição de fotodetectores e/ou de um estrado em relação à disposição de poços de amostras) de maneira tal que alguns ou to- dos os poços de amostras alinhem opticamente com pelo menos al- guns dos fotodetectores. Em algumas modalidades, o alinhamento da disposição de poços de amostras com a disposição de fotodetectores pode envolver o posicionamento das duas disposições uma em rela- ção à outra de maneira tal que haja uma correspondência de um para um entre os poços de amostras individuais e os fotodetectores indivi- duais.
[0054] Os autores da presente invenção também reconheceram e apreciaram que a configuração da disposição de poços de amostras e a disposição de fotodetectores de maneira tal que nem todos os foto- detectores são alinhados opticamente aos poços de amostras pode conferir determinados benefícios durante o processo de alinhamento. Em particular, o arranjo dos fotodetectores na disposição de fotodetec- tores e o arranjo de poços de amostras na disposição de poços de amostras podem ser tais que, quando alguns poços de amostras estão em alinhamento óptico com os fotodetectores, há alguns fotodetecto- res não alinhados opticamente com os poços de amostras. Nesses casos, as técnicas para alinhar a disposição de poços de amostras com a disposição de fotodetectores podem envolver o ajuste do posi- cionamento relativo das duas disposições com base nos sinais indica- tivos da quantidade de luz que está sendo detectada pelos fotodetec- tores de maneira tal que um subconjunto de fotodetectores detecta uma quantidade maior de fótons em uma posição subsequente quando um outro subconjunto de fotodetectores detecta uma quantidade me- nor de fótons na posição subsequente. Desta maneira, alguns fotode- tectores podem ser designados como fotodetectores posicionados pa-
ra receber a luz, os quais podem ser indicados como fotodetectores "brilhantes", ao passo que outros fotodetectores podem ser designa- dos como fotodetectores posicionados para não receber a luz, os quais podem ser indicados como fotodetectores "escuros" uma vez que eles não detectam nenhum fóton ou uma pequena quantidade de fótons quando em alinhamento. Por exemplo, o posicionamento das fileiras e/ou das colunas de poços de amostras na disposição de poços de amostras e o posicionamento das fileiras e/ou das colunas de foto- detectores na disposição de fotodetectores podem ser tais que, quan- do algumas fileiras ou colunas de fotodetectores estão em alinhamento óptico com os poços de amostras, há outras fileiras ou colunas de fo- todetectores que não estão. Nesses casos, um processo para alinhar a disposição de poços de amostras com a disposição de fotodetectores pode envolver o ajuste da posição da disposição de poços de amos- tras em relação à disposição de fotodetectores de maneira tal que al- gumas fileiras ou colunas de fotodetectores detectam uma quantidade maior de fótons ao passo que outras fileiras ou colunas de fotodetecto- res detectam uma quantidade menor de fótons. Estas técnicas de ali- nhamento podem superar determinadas dificuldades no alinhamento óptico de uma disposição de poços de amostras com uma disposição de fotodetectores. Por exemplo, a designação de alguns fotodetecto- res como "escuros" pode facilitar os ajustes mais finos porque a detec- ção da falta de um sinal óptico ou de um sinal óptico menor pode ser mais fácil do que a detecção quando um sinal óptico aumenta. Estas técnicas de alinhamento óptico podem ser particularmente adequadas quando o número de poços de amostras é grande, tal como quando o número de poços de amostras fica na faixa de 100 a 100.000.
[0055] Os aspectos e as modalidades descritos acima, bem como aspectos e modalidades adicionais, são descritos mais adiante. Estes aspectos e/ou modalidades podem ser usados individualmente, todos juntos, ou em qualquer combinação de dois ou mais, uma vez que o pedido de patente não é limitado neste respeito.
[0056] A FIGURA 1 é um diagrama de blocos que ilustra o sistema de detecção de moléculas 100, o qual pode detectar as moléculas lu- minescentes presentes em uma amostra de acordo com algumas mo- dalidades. O sistema de detecção 100 pode incluir a disposição de po- ços de amostras 104 que tem poços de amostras configurados para receber moléculas, incluindo as moléculas de uma amostra (por exemplo, ácido nucleico modelo) e as moléculas luminescentes 106 (por exemplo, nucleotídeos etiquetados de maneira fluorescente). O sistema de detecção 100 pode incluir a(s) fonte(s) de luz de excitação 108, que emite(m) a luz 122 que pode excitar a(s) molécula(s) lumi- nescente(s) 106. Quando uma molécula luminescente é posicionada dentro de um poço de amostras da disposição 104 e recebe a luz 122, a molécula luminescente pode emitir a luz de emissão 124 em respos- ta. O sistema de detecção 100 pode incluir a disposição de fotodetec- tores 114 configurados para detectar a luz 124 da disposição de poços de amostras 104, incluindo a luz 124 emitida pela(s) molécula(s) lumi- nescente(s) 106. Os fotodetectores individuais na disposição 114 po- dem corresponder a um poço de amostras na disposição 104 de ma- neira tal que a luz detectada por um fotodetector particular é identifica- da como sendo originária de um poço de amostras particular. O siste- ma de detecção 100 pode incluir o circuito de detecção 110, que pode detectar os sinais gerados pelos fotodetectores na disposição de foto- detectores 114, onde os sinais indicam os fótons incidentes detectados pelos fotodetectores. Em algumas modalidades, um fotodetector pode gerar uma corrente que corresponde a um fóton incidente recebido pe- lo fotodetector, e o circuito de detecção 116 pode detectar a corrente. Desta maneira, a disposição de fotodetectores 114 e o circuito de de- tecção 116 podem permitir a detecção de fótons individuais e a conta-
gem de fótons individuais. Em algumas modalidades, a disposição de fotodetectores 114 inclui diodos de avalanche de fótons individuais (SPADs). Em tais modalidades, um SPAD pode gerar um portador de carga em resposta à recepção de um fóton incidente, o que pode ati- var uma corrente de avalanche que tem uma duração de tempo. O cir- cuito de detecção 116 pode detectar a corrente de avalanche, e gerar um sinal que indica que o SPAD recebeu um fóton incidente.
[0057] Em algumas modalidades, o arranjo dos fotodetectores na disposição de fotodetectores 114 pode incluir o posicionamento dos fotodetectores de maneira tal que os fotodetectores são espaçados uns dos outros por uma distância particular, que pode ficar na faixa de 50 µm a 600 µm, ou qualquer valor ou gama de valores nessa faixa. Em algumas modalidades, o arranjo dos fotodetectores na disposição 114 pode ser tal que os fotodetectores são espaçados uns dos outros por uma distância que é de pelo menos 500 µm. Estes tipos de arran- jos de fotodetectores podem melhorar a capacidade do sistema de de- tecção de detectar moléculas individuais, uma vez que os fotodetecto- res individuais podem ser posicionados para receber a luz emitida de uma região ou de uma posição particular. Nesses casos, a disposição de fotodetectores pode ter uma porcentagem entre a área do detetor e a área da imagem igual a menos de 10%. Em algumas modalidades, porcentagem entre a área do detetor e a área da imagem pode ficar na faixa de 1% a 5%. Os fotodetectores individuais na disposição 114 po- dem ter um diâmetro ativo na faixa de 10 µm a 50 µm, ou qualquer va- lor ou gama de valores nessa faixa. No contexto de usar o dispositivo integrado descrito no presente documento para a análise de moléculas individuais, estes arranjos de fotodetectores podem melhorar a detec- ção da luz emitida de um único poço de amostras pelos fotodetectores individuais na disposição 114.
[0058] Deve ser apreciado que estes tipos de arranjos do fotode-
tectores podem ser apropriados para outras técnicas de detecção de luz e formação de imagem que envolvem a detecção da luz de uma região particular.
No contexto de técnicas de formação de imagem, ter um arranjo de fotodetectores com uma razão apropriadamente baixa entre a área do detetor e a área da imagem, que também pode ser in- dicado como tendo um fator baixo de preenchimento, pode permitir que os fotodetectores individuais ajam como uma disposição de aber- turas capazes de detectar a luz originária de regiões particulares den- tro de uma amostra.
Em particular, tais arranjos de fotodetectores po- dem ser implementados para obter uma definição óptica melhorada de uma amostra que tem sua imagem formada por causa do posiciona- mento dos fotodetectores para detectar a luz originária da amostra em uma região particular.
Por exemplo, tais arranjos de fotodetectores po- dem conferir benefícios a tipos particulares de técnicas de formação de imagem que envolvem áreas de exploração de uma amostra, tais como a microscopia confocal.
Na microscopia confocal convencional, a definição óptica da amostra que tem a imagem formada pode ser obti- da ao usar a iluminação de ponto para iluminar uma seção na amostra em um momento e fazer a varredura da iluminação de ponto sobre uma região particular da amostra para obter uma imagem da região da amostra, a qual pode ser indicada como uma varredura de quadricula- ção.
Por outro lado, um arranjo de fotodetectores que têm um fator baixo de preenchimento pode ser implementado para fornecer uma definição óptica desejada em uma imagem de uma amostra sem ter que executar uma varredura completa tal como na microscopia confo- cal convencional, uma vez que os fotodetectores individuais corres- pondem a seções particulares discerníveis da amostra que tem a ima- gem formada.
Em vez de fazer a varredura da região inteira da amos- tra para formar uma imagem, o plano da amostra ou a disposição de fotodetectores pode ser movido de maneira tal que os fotodetectores individuais são usados para fazer a varredura de seções particulares dentro de uma região da amostra para formar uma imagem completa da região. Tais técnicas podem melhorar a velocidade em que uma imagem que tem uma definição óptica similar como uma imagem con- focal é obtida, uma vez que os dados da imagem são adquiridos por alguns ou todos os fotodetectores durante cada reposicionamento da disposição de fotodetectores e da amostra uns em relação aos outros de maneira tal que a varredura das seções menores da amostra é feita eficazmente. Essas seções menores nas quais foi feita a varredura podem então ser combinadas para formar uma imagem completa da região de interesse na amostra. Deve ser apreciado que estas técnicas de formação de imagem podem ser aplicadas a tipos diferentes de iluminação da amostra incluindo a iluminação de fluorescência de re- flexão interna total (TIRF), a iluminação de campo amplo incoerente, a iluminação por uma disposição de pontos laser, ou quaisquer outras técnicas de iluminação de amostras estruturadas.
[0059] Quaisquer técnicas de acoplamento óptico apropriadas po- dem ser implementadas para acoplar a luz emitida pela(s) fonte(s) de luz de excitação 108 para amostrar a disposição de poços de amostras 104 de maneira tal que alguns ou todos os poços de amostras na dis- posição 104 recebem a luz. Em algumas modalidades, um feixe de luz emitida pela(s) fonte(s) de luz de excitação 108 pode iluminar alguns ou todos os poços de amostras na disposição 104. Nas modalidades em que um feixe de luz é dirigido para um lado da disposição 104, tal posicionamento da(s) fonte(s) de luz de excitação 108 na disposição de poços de amostras 104 pode ser considerado como iluminação da parte traseira. Em um exemplos, um ou mais componentes ópticos po- sicionados em relação à(s) fonte(s) de luz de excitação 108 e a dispo- sição de poços de amostras 104 podem agir de modo a espalhar o di- âmetro do feixe de luz emitida pela(s) fonte(s) de luz de excitação 108 de uma maneira que permite que múltiplos poços de amostras na dis- posição recebam a luz 122. Em outras modalidades, a disposição de poços de amostras 104 é integrada como parte de um dispositivo fotô- nico, o qual pode ser indicado como um "chip de amostra". O chip de amostra pode incluir um ou mais guias de ondas configurados para propagar a luz aos poços de amostras. Um ou mais guias de ondas podem acoplar opticamente à(s ) fonte(s) de luz de excitação 108 atra- vés de qualquer componente de acoplamento apropriado, incluindo um acoplador óptico de faceta e um acoplador óptico de grade.
[0060] O sistema de detecção 100 pode incluir os componentes ópticos 112, que podem incluir qualquer sistema óptico apropriado pa- ra dirigir a luz emitida da disposição de poços de amostras 104 rumo à disposição de fotodetectores 114. Em algumas modalidades, os com- ponentes ópticos 112 podem ser posicionados para dirigir os fótons emitidos de um poço de amostras na disposição de poços de amostras 104 rumo a um fotodetector na disposição de fotodetectores 114. Co- mo um exemplo, os componentes ópticos 112 podem dirigir a luz dos poços de amostras individuais aos seus fotodetectores corresponden- tes de maneira tal que a luz emitida do poço de amostras só é detec- tada pelo seu fotodetector correspondente. Nesses casos, os compo- nentes ópticos 112 posicionados no sistema de detecção 100 podem alinhar com os fótons emitidos de um poço de amostras da disposição de poços de amostras 104 para se sobrepor opticamente com uma região de detecção de um fotodetector na disposição de fotodetectores 114 de maneira tal que alguns ou todos os fótons emitidos são inciden- tes na região de detecção.
[0061] Os componentes ópticos 112 podem incluir um ou mais sis- temas ópticos para dirigir a luz de excitação 122 emitida pela(s) fon- te(s) de luz de excitação 108 rumo à disposição de poços de amostras 104 de maneira tal que os pares de luz de excitação acopla optica-
mente com a disposição de poços de amostras 104. Alguma combina- ção dos componentes ópticos 112 (que podem incluir, por exemplo, nenhum, um, ou mais de cada um de: lente, espelho, filtro óptico, ate- nuador, componente direcionador de feixe, componente formador de feixe) e configurados para operarem e/ou aplicar a luz de uma fonte de luz de excitação à disposição de poços de amostras 104. Os compo- nentes ópticos 112 podem ser arranjados para dirigir a luz pelo menos um poço de amostras, que pode incluir uma amostra a ser analisada, e dirigir os sinais ópticos (por exemplo, fluorescência, radiação dispersa de volta) de pelo menos um poço de amostras para a disposição de fotodetectores 114, onde os circuitos de detecção 116 podem produzir um ou mais sinais elétricos representativos dos sinais ópticos recebi- dos. Em algumas modalidades, os componentes ópticos 112 podem incluir um espelho dicroico posicionado para dirigir a luz emitida pe- la(s) fonte(s) de luz de excitação rumo à disposição de poços de amostras 104. O espelho dicroico pode permitir que a luz emitida pe- la(s) molécula(s) luminescente(s) 106 seja transmitida através do es- pelho dicroico rumo à disposição de fotodetectores 114 enquanto re- duz a transmissão de luz de excitação à disposição de fotodetectores
114. Em algumas modalidades, os componentes ópticos 112 podem incluir múltiplas lentes arranjadas em uma configuração de lente de retransmissão. A configuração de lente de retransmissão pode permitir uma correspondência de um para um entre os poços de amostras indi- viduais na disposição 104 e os fotodetectores individuais na disposição de fotodetectores 114.
[0062] O sistema de detecção 100 pode incluir um estrado(s) com circuitos de controle de estrado associados para posicionar a disposi- ção de poços de amostras 104 e a disposição de fotodetectores 114 uma em relação à outra. O(s) estrado(s) pode(m) ser configurado(s) para prover graus de liberdade translacional e/ou rotacional quando a disposição de poços de amostras 104 e/ou a disposição de fotodetec- tores 114 são movidas. Por exemplo, a disposição de poços de amos- tras 104 pode ser montada no estrado 102 e a disposição de fotode- tectores 114 pode ser montada no estrado 126. Tal como mostrado na FIGURA 1, o sistema de detecção 100 pode incluir o estrado 122 para posicionar a disposição de poços de amostras 104 e o estrado 126 pa- ra posicionar a disposição de fotodetectores 114. Os circuitos de con- trole de estrado 110 acoplados ao estrado 122 podem fornecer sinais de controle para controlar o estrado 122, ao passo que os circuitos de controle de estrado 128 acoplados ao estrado 126 podem fornecer si- nais de controle para controlar o estrado 126. O estrado 102 e/ou es- trado 126 podem ser configurados para prover o deslocamento trans- lacional e/ou rotacional para a disposição de poços de amostras 104 e/ou a disposição de fotodetectores 114. Por exemplo, o estrado 102 pode ser configurado para prover o deslocamento de translação para a disposição de poços de amostras 104, ao passo que o estrado 126 pode ser configurado para prover o deslocamento de rotação para a disposição de fotodetectores 114. Em contudo um outro exemplo, o estrado 102 pode ser configurado para prover o deslocamento de rota- ção para a disposição de poços de amostras 104, ao passo que o es- trado 126 pode ser configurado para prover o deslocamento de trans- lação para a disposição de fotodetectores 114. Em contudo umas ou- tras modalidades, ambos o estrado 102 e o estrado 126 podem ser configurados para prover ambos os deslocamentos de rotação e de translação.
[0063] Embora os estrados 102 e 126 e os circuitos de controle associados 110 e 128 sejam mostrados na FIGURA 1, deve ser apre- ciado que algumas modalidades do sistema de detecção descrito no presente documento podem envolver o uso de somente um estrado, tal como um estrado para mover a disposição de poços de amostras
104 ou um estrado para mover a disposição de fotodetectores 114. Em tais modalidades, o estrado pode ser configurado para prover o deslo- camento de rotação e de translação para posicionar a disposição de poços de amostras 104 em relação à disposição de fotodetectores
114. Por exemplo, em algumas modalidades do sistema de detecção descrito no presente documento, o estrado 102 pode ser configurado para prover o deslocamento de translação e de rotação para a disposi- ção de poços de amostras 104. Como um outro exemplo, o estrado 126 pode ser configurado para prover o deslocamento de translação e de rotação para a disposição de fotodetectores 114.
[0064] Em algumas modalidades, alguns ou todos os componen- tes ópticos 112 podem ser montados em um ou mais estrados do sis- tema de detecção, tal como no estrado 102 ou no estrado 126, tal co- mo mostrado na FIGURA 1. Em algumas modalidades, a(s) fonte(s) de luz de excitação 108 pode(m) ser montada(s) em um dos estrados do sistema de detecção, tal como no estrado 102. A montagem de alguns ou todos os componentes ópticos 112 e/ou fonte(s) de luz de excitação 108 em um estrado pode reduzir a necessidade de realinhar luz de ex- citação à disposição de poços de amostras 104 durante o posiciona- mento da disposição de poços de amostras 104 em relação à disposi- ção de fotodetectores 114, o que pode permitir o alinhamento óptico melhorado da disposição de poços de amostras 104 em relação à(s) fonte(s) de luz de excitação.
[0065] A FIGURA 2 é um diagrama esquemático dos componentes ópticos exemplificadores 220, 222, 224, 226 e 228 que podem ser usados no sistema de detecção 100 para dirigir a luz emitida dos po- ços de amostras 204 da disposição de poços de amostras 104 rumo aos fotodetectores 214 na disposição de fotodetectores 114, de acordo com algumas modalidades. Tal como mostrado na FIGURA 2, os componentes ópticos incluem a lente 220, o filtro 222, a lente 224, a lente 226 e a lente 228. Em algumas modalidades, a lente 220 é uma objetiva de 60x. Em algumas modalidades, a lente 224 é uma lente de tubo de 1x. Em algumas modalidades, a lente 226 é uma lente de re- transmissão que tem um comprimento focal de 100 mm. Em algumas modalidades, a lente 228 é uma lente de retransmissão que tem um comprimento focal de 200 mm. O filtro 222 pode ser configurado para reduzir ou bloquear a transmissão da luz de excitação, o que pode re- duzir a luz de excitação que alcança os fotodetectores 214 na disposi- ção de fotodetectores 114.
[0066] O circuito de detecção 116 associado com a disposição de fotodetectores 114 é configurado para executar a contagem de fótons dos fótons incidentes nos fotodetectores individuais. Em algumas mo- dalidades, o circuito de detecção 116 pode incluir componentes eletrô- nicos de processamento de sinais (por exemplo, um ou mais microcon- troladores, uma ou mais disposições de portas programáveis no cam- po, um ou mais microprocessadores, um ou mais processadores de sinais digitais, portas lógicas, etc.) configurados para processar os si- nais elétricos dos fotodetectores. Durante a operação quando a dispo- sição de fotodetectores 114 é posicionada para receber os fótons emi- tidos da(s) molécula(s) luminescente(s) 106, o circuito de detecção 116 pode gerar sinais que identificam moléculas luminescentes indivi- duais. Os sinais gerados pelo circuito de detecção 116 podem permitir a distinção entre tipos diferentes de moléculas luminescentes. O circui- to de detecção 116 pode gerar um primeiro sinal que identifica um pri- meiro tipo de molécula luminescente e um segundo sinal que identifica um segundo tipo de molécula luminescente.
[0067] Em algumas modalidades, o circuito de detecção 116 pode contar uma quantidade de fótons incidentes em um fotodetector na disposição de fotodetectores 114 durante períodos de tempo diferen- tes depois de um tempo de referência. O tempo de referência pode agir como um ativador para que o circuito de detecção 116 comece a contar os fótons que são incidentes em um fotodetector na disposição
114. O circuito de detecção 116 podem receber os sinais de controle que indicam o tempo de referência de um dispositivo externo e, em resposta à recepção dos sinais de controle, o circuito de detecção 116 pode começar a executar a contagem de fótons dos fótons incidentes nos fotodetectores na disposição 114. Em algumas modalidades, o circuito de detecção 116 é configurado para contar uma quantidade de fótons incidentes em um fotodetector durante um primeiro período de tempo e um segundo período de tempo depois de um tempo de refe- rência. O primeiro período de tempo e o segundo período de tempo pode ser períodos de tempo não superpostos. Em algumas modalida- des, um período de tempo onde os fótons incidentes não são contados pelo circuito de detecção 116 pode separar o primeiro período de tem- po e o segundo período de tempo. Tal período de tempo, que pode ser considerado como "tempo de retardamento", pode permitir que o cir- cuito de detecção seja rearmado entre o primeiro e o segundo perío- dos de tempo e pode melhorar a exatidão da contagem de fótons pelo circuito de detecção.
[0068] Em algumas modalidades, o circuito de detecção 116 pode incluir múltiplos circuitos de contagem de fótons para contar os fótons incidentes nos fotodetectores na disposição de fotodetectores 114. Em tais modalidades, o circuito de detecção 116 pode incluir um ou mais circuitos de contagem de fótons associados com os fotodetectores in- dividuais na disposição de fotodetectores 114 onde cada um dos cir- cuitos de contagem de fótons é configurado para contar uma quanti- dade de fótons incidentes recebidos por seu fotodetector correspon- dente durante um período de tempo. Quando múltiplos circuitos de contagem de fótons são associados com um fotodetector na disposi- ção de fotodetectores, então cada um dos circuitos de contagem de fótons pode corresponder a um período de tempo diferente durante o qual os fótons incidentes no fotodetector são contados. Em algumas modalidades, dois ou mais circuitos de contagem de fótons são asso- ciados com os fotodetectores individuais na disposição de fotodetecto- res 114 e configurados para gerar os sinais indicativos da quantidade de fótons incidentes recebidos por um fotodetector durante dois ou mais períodos de tempo. Como um exemplo, os fotodetectores indivi- duais na disposição de fotodetectores 114 podem ter dois circuitos de contagem de fótons, os quais são configurados para gerar os sinais indicativos de uma quantidade de fótons incidentes em um fotodetector durante um primeiro período de tempo e um segundo período de tem- po depois de um tempo de referência. Os sinais gerados pelos circui- tos de contagem de fótons podem incluir um primeiro sinal que identifi- ca uma primeira quantidade de fótons incidentes recebidos pelo foto- detector durante o primeiro período de tempo e um segundo sinal que identifica uma segunda quantidade de fótons incidentes recebidos pelo fotodetector durante o segundo período de tempo. Os dois circuitos de contagem de fótons podem gerar individualmente um primeiro e um segundo sinais de maneira tal que um primeiro circuito de contagem de fótons executa a contagem de fótons durante o primeiro período de tempo e gera o primeiro sinal, e um segundo circuito de contagem de fótons executa a contagem de fótons durante o segundo período de tempo e gera o segundo sinal. Em tais modalidades, o circuito de de- tecção 116 pode gerar um sinal de leitura que inclui o primeiro sinal e o segundo sinal.
[0069] O tempo de referência que é ativado quando o circuito de detecção 116 começa a executar a contagem de fótons podem corres- ponder a um tempo associado com a iluminação da disposição de po- ços de amostras 104 com a luz de excitação. Tal tempo de referência pode permitir que o circuito de detecção 116 comece a contar os fó-
tons emitidos pela(s) molécula(s) luminescente(s) 106 que foram exci- tadas ao serem iluminadas com a luz de excitação. Os sinais gerados pelo circuito de detecção 116 podem fornecer uma indicação do tempo de vida da emissão da(s) molécula(s) luminescente(s). O circuito de detecção 116 pode receber sinais de controle periódicos que indicam múltiplos tempos de referência, e o circuito de detecção 116 pode exe- cutar a contagem de fótons depois de cada um dos tempos de refe- rência individuais. Desta maneira, o circuito de detecção 116 pode executar a contagem de fótons repetida depois da iluminação da(s) molécula(s) luminescente(s), o que pode melhorar a detecção da(s) molécula(s) luminescente(s) pelo sistema 100. Em algumas modalida- des, a(s) fonte(s) de luz de excitação 108 emite(m) pulsos de luz e o tempo de referência corresponde a um tempo associado com a(s) fon- te(s) de luz de excitação 108 que emitem um pulso de luz. Em tais modalidades, os circuitos associados com a(s) fonte(s) de luz de exci- tação 108 podem gerar sinais de controle que correspondem aos pul- sos de luz emitidos. Os sinais de controle podem ser transmitidos ao circuito de detecção 116 e ser usados como uma série de tempos de referência para serem ativados quando o circuito de detecção 116 executa a contagem de fótons.
[0070] De acordo com algumas modalidades, o circuito de detec- ção 116 pode executar a contagem de fótons ao gerar sinais elétricos associados algumas vezes com os períodos de tempo de contagem de fótons para controlar se os fótons individuais detectados pelos fotode- tectores são contados pelo circuito de detecção 116. Estes sinais elé- tricos podem agir como uma porta elétrica de maneira tal que, quando a porta elétrica está em um estado DESLIGADO, o circuito de detec- ção executa a contagem de fótons e, quando a porta elétrica está em um estado LIGADO, o circuito de detecção não executa a contagem de fótons. Nas modalidades em que os fotodetectores são fotodiodos de avalanche de fótons individuais, os quais geram a corrente em res- posta à recepção dos fótons incidentes, os sinais elétricos gerados pe- lo circuito de detecção 116 podem controlar se o circuito de detecção 116 recebe a corrente gerada por um fotodiodo de avalanche de fótons individuais. Na execução da contagem de fótons por múltiplos perío- dos de tempo, o circuito de detecção 116 pode operar a porta elétrica de maneira tal que a porta elétrica fica DESLIGADA durante os tempos associados com os períodos de tempo individuais e LIGADA durante os tempos fora dos períodos de tempo. Desta maneira, o circuito de detecção 116 pode controlar o tempo quando a contagem de fótons ocorre. Em algumas modalidades, o circuito de detecção 116 pode ser configurado para operar múltiplas portas elétricas. Em tais exemplos, o circuito de detecção 116 pode ter uma porta elétrica que corresponde a cada circuito de contagem de fótons associado com um fotodetector, onde a porta elétrica para um circuito de contagem de fótons particular é configurada para controlar o tempo associado com o momento em que o circuito de contagem de fótons executa a contagem de fótons.
[0071] A porta elétrica pode depender do tempo de um sinal de referência, que possa ser externo ao circuito de detecção, de maneira tal que o tempo dos estados LIGADO e DESLIGADO da porta elétrica pode começar em resposta à recepção do sinal da referência pelo cir- cuito de detecção 116. O tempo da porta elétrica pode depender dos tempos associadas com os pulsos de luz emitidos pela(s) fonte(s) de luz de excitação 108. Tal como discutido no presente documento, a(s) fonte(s) de luz de excitação 108 pode(m) gerar os sinais de controle que correspondem ao tempos dos pulsos de luz emitidos e o circuito de detecção 116 pode operar a porta elétrica para executar a conta- gem de fótons em resposta à recepção dos sinais de controle.
[0072] A FIGURA 3 é um gráfico exemplificador que ilustra como o circuito de detecção 116 pode operar a porta elétrica 301 e a porta elé-
trica 302 com o passar do tempo.
Tal como mostrado na FIGURA 3, as portas elétricas 301 e 302 são sinais de voltagem que são mantidos a uma voltagem particular, VON, quando as portas elétricas estão em um estado LIGADO para impedir que o circuito de detecção 116 execute a contagem de fótons.
Quando as portas elétricas 301 e 302 são ajusta- dos a uma outra voltagem, VOFF, as portas elétricas ficam em um esta- do DESLIGADO, e o circuito de detecção 116 pode executar a conta- gem de fótons.
O tempo a partir do momento em que as portas elétri- cas são ajustadas o estado DESLIGADO ocorre após um tempo de referência, T0, que pode em algumas modalidades ser um tempo as- sociado com um pulso de luz emitido pela(s) fonte(s) de luz de excita- ção 108. Tal como mostrado na FIGURA 3, a porta elétrica 301 é re- duzida até a voltagem VOFF para o período de tempo T1 depois de T0. Além disso, a porta elétrica 302 é reduzida até a voltagem VOFF para o período de tempo T2 subsequente ao período de tempo T1. A conta- gem de fótons pode ser executada pelo circuito de detecção durante os períodos de tempo T1 e T2. Por exemplo, a porta elétrica 301 pode corresponder a uma porta elétrica para um primeiro circuito de conta- gem de fótons, que pode executar a contagem de fótons durante o pe- ríodo de tempo T1, e a porta elétrica 302 pode corresponder a uma porta elétrica para um segundo circuito de contagem de fótons, que pode executar a contagem de fótons durante o período de tempo T2. Embora o período de tempo T1 seja mostrado como sendo mais curto do que o período de tempo T2 na FIGURA 3, deve ser apreciado que algumas modalidades podem envolver o período de tempo T1 mais longo do que ou igual ao período de tempo T2. Tal como mostrado na FIGURA 3, pode haver um tempo de retardamento, Td, entre o período de tempo T1 e o período de tempo T2. O tempo de retardamento, Td, pode ser um tempo associado com a permissão para que o fotodetec- tor seja rearmado, o que pode melhorar a detecção dos fótons durante o período de tempo T2. O período de tempo T1 e o período de tempo T2 podem ficar na faixa de 1,5 ns a 20 ns, ou qualquer valor ou gama de valores nessa faixa. O tempo de retardamento, Td, pode ficar na faixa de 0,5 ns a 10 ns, ou qualquer valor ou gama de valores nessa faixa. Embora dois períodos de tempo sejam mostrados na FIGURA 3, deve ser apreciado que o circuito de detecção pode operar mais de duas portas elétricas, dependendo do número de períodos de tempo que são usados para executar a contagem de fótons.
[0073] A FIGURA 4A é um diagrama esquemático exemplificador dos tipos de circuitos que podem ser incluídos no circuito de detecção 116, de acordo com algumas modalidades. Tal como mostrado na FI- GURA 4A, o circuito de detecção pode incluir o circuito de recuperação de relógio 410, o circuito de laço de travamento de fase, o relógio 1 430, o relógio 2 440, o circuito de porta 450, o contador 1 460, o con- tador 2 470 e o circuito de restauração 480. O circuito de recuperação de relógio 410 pode receber um sinal de controle de um dispositivo externo, tal como uma fonte de luz de excitação (por exemplo, um la- ser de modo travado), e pode transmitir um sinal ao circuito de laço de travamento de fase, o que pode ajustar os períodos de tempo durante os quais a contagem de fótons é executada. O circuito de laço de tra- vamento de fase 420 pode transmitir sinais de controle ao relógio 1 430 e ao relógio 2 440. Nas modalidades onde o laço de travamento de fase 420 é comum ao relógio 1 430 e ao relógio 2 440, o relógio 1 430 e o relógio 2 440 podem ter um retardamento de fase programado pelo usuário entre o relógio 1 430 e o relógio 2 440. O relógio 1 430 e o relógio 2 440 podem controlar o tempo do circuito de porta 450 na operação de uma porta elétrica. Em particular, o circuito de porta 450 pode controlar a disposição de fotodetectores 114 para operar em um modo bloqueado com o tempo do relógio 1 430 e do relógio 2 440 ajustando o tempo de operação da porta controlada pelo circuito de porta 450. A disposição de fotodetectores 114 pode transmitir os sinais que indicam a detecção de fótons pela disposição de fotodetectores 114 ao contador 1 460 e ao contador 2 470, que podem executar a contagem de fótons. O tempo ajustado pelo relógio 1 430 e pelo reló- gio 2 440 pode controlar os períodos de tempo durante os quais o con- tador 1 460 e o contador 2 470 executam a contagem de fótons. Os sinais de leitura que indicam as contagens de fótons podem ser obti- dos do contador 1 460 e do contador 2 470. O circuito de restauração 480 pode agir para restaurar o contador 1 460 e o contador 2 470 de maneira tal que o contador 1 460 e o contador 2 470 ficam em um es- tado para executar a contagem de fótons.
[0074] O tempo de contagem de fótons executado pelo contador 1 460 e pelo contador 2 470 pode ser ajustado por sinais de controle transmitidos do circuito de porta 450 ao contador 1 460 e ao contador 2 470 onde o tempo dos sinais de controle transmitidos pelo circuito de porta 450 é determinado pelo tempo do relógio 1 430 e do relógio 2
440. Por exemplo, o relógio 1 430 pode ajustar um primeiro período de tempo e o circuito de porta 450 pode controlar o contador 1 460 para que execute a contagem de fótons durante o primeiro período de tem- po, e o relógio 2 440 pode ajustar um segundo período de tempo e o circuito de porta 450 pode controlar o contador 2 470 para que execute a contagem de fótons durante o segundo período de tempo. Deve ser apreciado que o circuito de relógio e contador adicional pode ser inclu- ído para executar a contagem de fótons durante mais de dois períodos de tempo.
[0075] A FIGURA 4B mostra um fluxograma de um processo ilus- trativo 490 para obter contagens de fótons, de acordo com algumas modalidades da tecnologia descrita no presente documento. O proces- so 490 pode ser executado pelo menos parcialmente pelo circuito de detecção 116.
[0076] O processo 490 começa na etapa 491, onde a contagem de fótons pode ser iniciada por um evento de ativação. Um evento de ati- vação pode ser um evento que serve como uma referência do tempo para executar a contagem de fótons. O evento de ativação pode ser um pulso óptico, tal como um pulso óptico gerado pela(s) fonte(s) de luz de excitação 108, ou um pulso elétrico, tal como um pulso elétrico gerado em um tempo depois de um pulso óptico. O evento de ativação pode ser um evento singular ou um evento periódico de repetição. No contexto de medições do tempo de vida da fluorescência, o evento de ativação pode ser a geração de um pulso de luz de excitação para ex- citar um ou mais fluoróforos. Os fótons que alcançam a disposição de fotodetectores 114 podem produzir portadores de carga, e o circuito de detecção 116 pode executar a contagem de fótons dos portadores de carga fotogerados.
[0077] O processo 490 prossegue para a etapa 492 onde o relógio 1 controla a operação de uma porta, tal como o relógio 1 430 que con- trola o circuito de porta 450 tal como mostrado na FIGURA 4A. O reló- gio 1 pode ajustar um primeiro período de tempo durante o qual a por- ta fica em um estado DESLIGADO de maneira tal que alguns ou todos os fotodetectores na disposição de fotodetectores 114 podem gerar um sinal em resposta à recepção dos fótons durante o primeiro perío- do de tempo. A seguir, o processo 490 prossegue para a etapa 493 onde o contador 1 executa a contagem de fótons durante o primeiro período de tempo de maneira tal que os fótons detectados por um fo- todetector na disposição 114 durante o primeiro período de tempo são contados pelo contador 1. Algumas modalidades podem incluir um contador 1 para fotodetectores individuais na disposição 114 de ma- neira tal que os fótons detectados por fotodetectores diferentes são contados separadamente por contadores diferentes durante o primeiro período de tempo. Em algumas modalidades, a porta pode alcançar um estado LIGADO depois do primeiro período de tempo ter passado, tal como pela transmissão pelo relógio 1 de um sinal ao circuito de por- ta 450 no final do primeiro período de tempo para ajustar o sinal elétri- co a um estado LIGADO.
[0078] O processo 490 prossegue para a etapa 494 onde o relógio 2 controla operação da porta, tal como o relógio 2 440 que controla o circuito de porta 450 tal como mostrado na FIGURA 4A. O relógio 2 pode ajustar um segundo período de tempo durante o qual a porta fica em um estado DESLIGADO de maneira tal que alguns ou todos os fo- todetectores na disposição de fotodetectores 114 podem gerar um si- nal em resposta à recepção dos fótons durante o segundo período de tempo. A seguir, o processo 490 prossegue para a etapa 495 onde o contador 2 executa a contagem de fótons durante o segundo período de tempo de maneira tal que os fótons detectados por um fotodetector na disposição 114 durante o segundo período de tempo são contados pelo contador 2. Tal como discutido acima em relação ao contador 1, algumas modalidades podem incluir um contador 2 para fotodetectores individuais na disposição 114 de maneira tal que os fótons detectados por fotodetectores diferentes são contados separadamente por conta- dores diferentes durante o segundo período de tempo. Em algumas modalidades, a porta pode alcançar um estado LIGADO depois do se- gundo período de tempo ter passado, tal como pela transmissão pelo relógio 2 de um sinal ao circuito de porta 450 no final do segundo perí- odo de tempo.
[0079] Algumas modalidades podem envolver a repetição deste processo por múltiplas vezes para obter a informação estatística a respeito dos períodos de tempo em que os fótons chegam depois de um evento de ativação. As contagens de fótons obtidas pelo contador 1 e pelo contador 2 podem ser agregadas em múltiplos eventos de ati- vação para gerar os sinais de contagem de fótons que representam um número total dos fótons detectados durante o primeiro período de tempo e o segundo período em múltiplos eventos de ativação. A repe- tição da medição pode permitir a agregação de contagens de fótons para obter resultados estatisticamente significativos. Por exemplo, no contexto da medição do tempo de vida da fluorescência, pode-se es- perar que um evento de detecção de fótons em resposta a um fóton recebido de um fluoróforo pode ocorrer de maneira relativamente rara, tal como uma vez em cerca de 1.000 eventos de excitação.
[0080] Uma vez que o número de repetições de eventos de ativa- ção tenha sido executado, o processo 490 pode prosseguir para a eta- pa 496 de leitura das contagens de fótons do contador 1 e do contador
2. Nas modalidades onde há contadores separados para fotodetecto- res individuais, a leitura das contagens de fótons podem incluir a leitu- ra das contagens de fótons para o contador 1 e o contador 2 associa- das com fotodetectores diferentes de maneira tal que uma primeira contagem de fótons associada com o contador 1 e uma segunda con- tagem de fótons associada com o contador 2 são obtidas para fotode- tectores individuais.
[0081] Em algumas modalidades, uma vez que as contagens de fótons tenham sido lidas, o processo 490 pode prosseguir para a etapa 497 onde o contador 1 e o contador 2 podem ser restaurados a um estado para permitir que a contagem de fótons subsequente seja exe- cutada pelo contador 1 e pelo contador 2, tal como depois de um even- to de ativação subsequente. A etapa 497 pode ser executado pelo cir- cuito de restauração 480 mostrado na FIGURA 4A, de acordo com al- gumas modalidades. Algumas modalidades podem envolver a execu- ção de uma restauração dos contadores 1 e 2 depois de cada evento de ativação de maneira tal que as contagens de fótons para o primeiro período de tempo e o segundo período de tempo são obtidas para eventos de ativação individuais.
[0082] Tal como discutido no presente documento, os fotodetecto- res na disposição de fotodetectores 114 podem incluir fotodiodos de avalanche de fótons individuais (SPADs). Os SPADs podem ter uma eficiência desejada de detecção de fótons dentro de uma faixa espec- tral entre 550 nm e 650 nm, que pode corresponder à luz emitida pe- la(s) molécula(s) luminescente(s) 106. Em algumas modalidades, os SPADs podem ter uma eficiência de detecção de fótons na faixa de 15% a 50%, ou qualquer porcentagem ou gama de porcentagens nes- sa faixa para comprimentos de ondas entre 550 nm e 650 nm. A FI- GURA 5 é um gráfico da eficiência de detecção de fótons espectral para uma disposição de SPADs, os quais podem ser usados como fo- todetectores na disposição de fotodetectores 114 de acordo com al- gumas modalidades. Tal como mostrado na FIGURA 5, a disposição de SPADs tem uma eficiência de detecção de fótons na faixa de 16% a 26% dentro da faixa de comprimentos de onda entre 550 nm e 650 nm. A FIGURA 6 é um gráfico da eficiência de detecção de fótons es- pectral para um SPAD, o qual pode ser usado como um fotodetector na disposição de fotodetectores 114 de acordo com algumas modali- dades. Tal como mostrado na FIGURA 6, o SPAD tem uma eficiência de detecção de fótons na faixa de 37% a 48% dentro da faixa de com- primentos de onda entre 550 nm e 650 nm.
[0083] Embora os aspectos da tecnologia sejam descritos em co- nexão com os SPADs, deve ser apreciado que a disposição de fotode- tectores 114 pode incluir outros tipos de fotodetectores configurados para bloquear com um tempo desejado enquanto têm uma razão entre sinal e ruído que permite a detecção de fótons individuais. Como um exemplo, os fotodetectores que têm uma operação a baixa corrente escura e baixo ruído de leitura, enquanto exibem uma alta sensibilida- de a fótons, podem ser implementados na tecnologia descrita no pre- sente documento. Os exemplos dos fotodetectores apropriados que podem ser implementados na disposição de fotodetectores podem in- cluir fotodetectores de semicondutores de óxido de metal complemen- tares (CMOS) como parte de um sensor de imagem de CMOS (CIS), fotodiodos de avalanche (APDs), e fotodetectores que combinam as- pectos de fotodetectores de CMOS e APDs, por exemplo, mediante a implementação de características de amplificação de ganho para pro- ver um fotodetector de CMOS com uma sensibilidade mais elevada. Um benefício dos fotodetectores de CMOS é que o processamento de CMOS pode permitir a fabricação de uma disposição de fotodetectores que tem uma densidade elevada dos fotodetectores. Algumas modali- dades podem incluir a disposição de fotodetectores 114 que tem foto- detectores retroiluminados, o que pode melhorar a eficiência de quan- tum eficaz dos fotodetectores.
[0084] De acordo com algumas modalidades, um sistema de de- tecção, tal como o sistema de detecção 100, configurado para analisar as amostras com base em características da emissão, pode detectar diferenças nos tempos de vida e/ou nas intensidades entre moléculas luminescentes diferentes. A título de explanação, a FIGURA 7 traça duas curvas de probabilidades de emissão diferentes (A e B), que po- dem ser representativas da emissão de duas moléculas luminescentes diferentes. Com referência à curva A (mostrada como uma linha trace- jada), depois de ser excitada por um pulso óptico curto ou ultracurto, uma probabilidade pA(t) de uma emissão de uma primeira molécula pode deteriorar com o passar do tempo, tal como descrito. Em alguns casos, a diminuição na probabilidade de um fóton ser emitido com o passar do tempo pode ser representada por uma função de deteriora- ção exponencial pA(t) = PAoe-t/A, onde PAo é uma probabilidade de emissão inicial e A é um parâmetro temporal associado com a primei- ra molécula que caracteriza a probabilidade de deterioração da emis- são. A pode ser indicado como o "tempo de vida da emissão" ou o
"tempo de vida" da primeira molécula luminescente. Outras moléculas luminescentes podem ter características de emissão diferentes daque- la mostrada na curva A. Por exemplo, uma outra molécula luminescen- te pode ter um perfil de deterioração que difira de uma única deteriora- ção exponencial, e o seu tempo de vida pode ser caracterizado por um valor de meia-vida ou por alguma outra métrica.
[0085] Uma segunda molécula luminescente pode ter um perfil de deterioração que é exponencial, mas tem um tempo de vida mensura- velmente diferente. Na FIGURA 7, uma molécula luminescente que tem a probabilidade de emissão da curva B pode ter a função de dete- rioração exponencial pB(t) = PBoe-t/B), onde PBo é uma probabilidade de B emissão inicial e é um parâmetro temporal associado com a segun- da molécula luminescente que caracteriza a probabilidade de deterio- ração da emissão. No exemplo mostrado, o tempo de vida para a se- gunda molécula luminescente da curva B é mais curto do que o tempo de vida para a primeira molécula luminescente da curva A, e a proba- bilidade de emissão é mais elevada mais cedo depois da excitação da segunda molécula luminescente representada pela curva B do que pa- ra a primeira molécula luminescente representada pela curva A. As moléculas luminescentes diferentes podem ter tempos de vida ou valo- res de meia-vida que variam de cerca de 0,1 ns a cerca de 20 ns, em algumas modalidades.
[0086] A identificação das moléculas luminescentes com base no tempo de vida (e não no comprimento de onda de emissão, por exem- plo) pode simplificar os aspectos de um sistema de detecção. Como um exemplo, o sistema óptico discriminador de comprimento de onda (tais como filtros de comprimento de onda, detetores dedicados para cada comprimento de onda, fontes ópticas pulsadas dedicadas a com- primento de ondas diferentes, e/ou sistema óptico de difração) pode ser reduzido no número ou ser eliminado quando da identificação de moléculas luminescentes com base no tempo de vida. Em alguns ca- sos, uma única fonte óptica pulsada que opera a um único comprimen- to de onda característico pode ser usada para excitar as moléculas luminescentes diferentes que são emitidas dentro de uma mesma re- gião de comprimento de onda do espectro óptico mas têm tempos de vida mensuravelmente diferentes. Um sistema de detecção que usa uma única fonte óptica pulsada, ao invés de múltiplas fontes ópticas que operam a comprimentos de onda diferentes, para excitar e discer- nir as moléculas luminescentes diferentes que emitem em uma mesma região de comprimento de onda pode ser menos complexo para operar e manter, mais compacto, e pode ser manufaturado a um custo mais baixo.
[0087] Embora os sistemas de detecção com base na análise do tempo de vida possam ter determinados benefícios, a quantidade de informação obtida por um sistema de detecção e/ou a exatidão de de- tecção podem ser aumentadas com a permissão de técnicas de detec- ção adicionais. Por exemplo, alguns sistemas de detecção podem ser adicionalmente configurados para discernir uma ou mais propriedades de uma amostra com base no comprimento de onda da emissão e/ou na intensidade da emissão.
[0088] Com referência outra vez à FIGURA 7, de acordo com al- gumas modalidades, tempos de vida de emissão diferentes podem ser distinguidos com um fotodetector e um circuito de detecção associado que é configurado para executar a contagem de fótons dos fótons inci- dentes no fotodetector depois da excitação de uma molécula lumines- cente. A contagem de fótons pode ocorrer durante um único intervalo entre os eventos de leitura durante os quais o circuito de detecção conta uma quantidade dos fótons recebidos durante múltiplos períodos de tempo. O conceito de determinação do tempo de vida de emissão pela contagem de fótons é introduzido graficamente na FIGURA 8. No tempo te imediatamente antes de T1, uma molécula luminescente é ex- citada por um pulso óptico curto ou ultracurto. O circuito de detecção associado com um fotodetector que detecta os fótons emitidos pela molécula luminescente pode contar os fótons durante múltiplos perío- dos de tempo, tais como o período de tempo 1 entre T1 e T2 e o perío- do de tempo 2 entre T3 e T4 indicados na FIGURA 8, que são resolvi- dos temporalmente com respeito ao tempo de excitação da(s) molécu- la(s) luminescente(s). Ao somar os múltiplos eventos de excitação, a quantidade de fótons em cada período de tempo pode se aproximar da curva de deterioração da intensidade mostrada na FIGURA 8, e pode ser usada para distinguir entre moléculas luminescentes diferentes.
[0089] De acordo com algumas modalidades, a(s) fonte(s) de luz de excitação 108 no sistema de detecção 100 pode compreender um ou mais módulos laser de modo travado configurados para produzir pulsos de luz de excitação. A FIGURA 9 ilustra perfis de intensidade temporais dos pulsos de saída de um módulo laser de modo travado exemplificador. Em algumas modalidades, os valores de pico da inten- sidade dos pulsos emitidos podem ser mais ou menos iguais, e os per- fis podem ter um perfil temporal de Gauss, embora outros perfis tais como um perfil sech2 possam ser possíveis. Em alguns casos, os pul- sos podem não ter perfis temporais simétricos e podem ter outros for- matos temporais. A duração de cada pulso pode ser caracterizada por um valor máximo de metade da largura total (FWHM), tal como indica- do na FIGURA 9. De acordo com algumas modalidades de um laser de modo travado, os pulsos ópticos ultracurtos podem ter valores de FWHM de menos de 100 picosegundos (ps). Em alguns casos, os va- lores de FWHM podem ficar entre cerca de 5 ps e cerca de 30 ps.
[0090] Em algumas modalidades, a(s) fonte(s) de luz de excitação 180 pode(m) incluir um ou mais módulos laser comutados em ganho configurados para produzir pulsos de luz de excitação. Os exemplos de módulos laser comutados em ganho apropriados são descritos no Pedido de Patente U.S. no. 16/043.651, depositado em 24 de julho de 2018, intitulado "INSTRUMENTO BIO-OPTOELETRÔNICO MACIÇA- MENTE PARALELO MANUALMENTE TRANSPORTÁVEL", o qual é incorporado a título de referência em sua totalidade.
[0091] Os pulsos de saída podem ser separados por intervalos re- gulares T. Por exemplo, T pode ser determinado por um tempo de percurso de ida e volta entre um acoplador de saída e um espelho de extremidade da cavidade do módulo laser. De acordo com algumas modalidades, o intervalo de separação de pulsos T pode ficar na faixa de cerca de 1 ns a cerca de 30 ns, ou qualquer valor ou gama de valo- res dentro dessa faixa. Em alguns casos, o intervalo de separação de pulsos T pode ficar na faixa de cerca de 5 ns a cerca de 20 ns, que corresponde a um comprimento da cavidade laser (um comprimento aproximado de um eixo óptico dentro de uma cavidade laser do módu- lo laser) entre cerca de 0,7 metro e cerca de 3 metros.
[0092] De acordo com algumas modalidades, um intervalo de se- paração de pulsos desejado T e o comprimento da cavidade laser po- dem ser determinados por uma combinação do número de poços de amostras, características da emissão, e velocidade de circuitos de manipulação de dados para a leitura de dados do circuito de detecção
116. Os autores da presente invenção reconheceram e apreciaram que as moléculas luminescentes diferentes podem ser distinguidas por suas taxas diferentes de deterioração de emissão ou tempos de vida característicos. Por conseguinte, precisa haver um intervalo de sepa- ração de pulsos suficiente T para coletar as estatísticas adequadas para que as moléculas luminescentes selecionadas façam a distinção entre as suas taxas de deterioração diferentes. Além disso, se o inter- valo de separação de pulsos T for demasiadamente curto, o circuito de manipulação de dados pode não dar conta da grande quantidade de dados que são coletados pelo grande número de poços de amostras.
[0093] De acordo com algumas implementações, um módulo dire- cionador de feixe pode receber os pulsos de saída de um módulo laser de modo travado e ser configurado para ajustar pelo menos a posição e os ângulos incidentes dos pulsos ópticos em um acoplador óptico (por exemplo, acoplador de grade) de um chip de amostra que tem uma disposição de amostras. Em alguns casos, os pulsos de saída do módulo laser de modo travado podem ser operados por um módulo direcionados de feixe para mudar adicional ou alternativamente uma forma do feixe e/ou uma rotação do feixe em um acoplador óptico. Em algumas implementação, o módulo direcionador de feixe também pode prover ajustes na focalização e/ou na polarização do feixe de pulsos de saída no acoplador óptico. Um exemplo de um módulo direcionador de feixe é descrito no Pedido de Patente U.S. no. 15/161.088 intitulado "LASER PULSADO E SISTEMA BIOANALÍTICO", depositado em 20 de maio de 2016, o qual é incorporado no presente documento a título de referência. Um outro exemplo de um módulo direcionador de feixe é descrito em um Pedido de Patente U.S. no. 15/843.720 separado, "CONJUNTO DE FORMAÇÃO E DIRECIONAMENTO DE FEIXE COMPACTO", depositado em 14 de dezembro de 2017, o qual é in- corporado no presente documento a título de referência.
[0094] Nas modalidades que envolvem o uso do sistema de detec- ção 100 para o arranja em sequência de ácidos nucleicos, a(s) molé- cula(s) luminescente(s) 106 pode(m) incluir tipos diferentes de molécu- las luminescentes associadas com tipos diferentes de nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos, tal como ao usar tipos diferentes de molé- culas luminescentes para etiquetar os tipos diferentes de nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos. Os poços de amostras individuais na disposição de poços de amostras 104 podem ser configurados para receber uma molécula de ácido nucleico modelo e nucleotídeos e/ou análogos de nucleotídeos etiquetados. Um exemplo não limitador de uma reação de sequenciamento que ocorre em um poço de amostras é ilustrado na FIGURA 10. Neste exemplo, a incorporação sequencial de nucleotídeos e/ou análogos de nucleotídeos em um cordão em crescimento que é complementar a um ácido nucleico alvo está ocor- rendo no poço de amostras. A incorporação sequencial pode ser de- tectada para arranjar em sequência uma série de ácidos nucleicos (por exemplo, DNA, RNA). De acordo com algumas modalidades, a polime- rase 1020 pode ficar localizada dentro do poço de amostras (por exemplo, unida a uma base do poço de amostras). A polimerase pode absorver um ácido nucleico alvo (por exemplo, uma porção de ácido nucleico derivada do DNA), e arranjar em sequência um cordão em crescimento de ácido nucleico complementar para produzir um cordão em crescimento do DNA. Os nucleotídeos e/ou os análogos de nucleo- tídeos etiquetados com moléculas luminescentes diferentes podem ser dispersos em uma solução acima e dentro do poço da amostra.
[0095] Quando um nucleotídeo e/ou um análogo de nucleotídeo etiquetado 1010 é incorporado em um cordão em crescimento de áci- do nucleico complementar, tal como mostrado na FIGURA 10, uma ou mais moléculas luminescentes 1030 unidas podem ser repetidamente excitadas pelos pulsos de energia óptica acoplados ao poço da amos- tra. Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) luminescente(s) 1030 pode(m) ser unida(s) a um ou mais nucleotídeos e/ou análogos de nu- cleotídeo 1010 com qualquer ligante 1040 apropriado. Um evento de incorporação pode durar um período de tempo de até cerca de 100 ms. Durante este tempo, os pulsos da luz de emissão resultantes da excitação da(s) molécula(s) luminescente(s) por pulsos de uma fonte de excitação, tal como um laser de modo travado, podem ser detecta- dos com um fotodetector de contagem de fótons. Ao unir a(s) molécu- la(s) luminescente(s) com características diferentes de emissão (por exemplo, taxas de deterioração da emissão, intensidade) a nucleotí- deos (A, C, G, T) ou análogos de nucleotídeos diferentes, são detecta- das e distinguidas as características diferentes da emissão enquanto o cordão de DNA incorpora um ácido nucleico e permite a determinação da sequência de nucleotídeos do cordão em crescimento do DNA.
[0096] O circuito de detecção 116 pode ser configurado para con- tar os fótons incidentes recebidos pela disposição de fotodetectores 114 da disposição de poços de amostras 104 para distinguir entre as moléculas luminescentes associadas com os nucleotídeos ou análo- gos de nucleotídeos diferentes que são incorporados em uma molécu- la de ácido nucleico. O circuito de detecção 116 pode gerar os sinais que correspondem a tipos diferentes de moléculas luminescentes, e um conjunto de sinais pode identificar uma série de nucleotídeos eti- quetados com tipos diferentes de moléculas luminescentes e pode ser usado para arranjar em sequência uma molécula de ácido nucleico modelo. Em particular, a série de nucleotídeos identificada pelo con- junto de sinais gerados pelo circuito de detecção 116 pode correspon- der a uma série de nucleotídeos de uma molécula de ácido nucleico complementar ao cordão de ácido nucleico modelo. Como um exem- plo, quatro fluoróforos diferentes podem ser usados para etiquetar quatro tipos diferentes de nucleotídeos (por exemplo, os nucleotídeos que têm as bases adenina "A", guanina "G”, citosina "C” e timina "T") e o circuito de detecção 116 pode gerar quatro tipos diferentes de sinais, os quais são usados para distinguir entre os quatro fluoróforos e identi- ficar quais dos quatro nucleotídeos são incorporados em uma molécu- la de ácido nucleico complementar a uma molécula de ácido nucleico modelo que é arranjada em sequência. Em particular, os quatro fluoró- foros diferentes podem variar no perfil do tempo de vida da fluorescên- cia e/ou intensidade de maneira tal que os sinais gerados pelo circuito de detecção 116 podem fazer a distinção entre os quatro fluoróforos com base em seu perfil do tempo de vida da fluorescência e/ou inten- sidade. Um conjunto exemplificador dos sinais gerados pelo circuito de detecção 116 pode identificar uma série de nucleotídeos como ATTA- CAGG, o qual pode ser usado para identificar a série complementar dos nucleotídeos como TAATGACC como estando presente em uma molécula de ácido nucleico modelo.
[0097] Antes de executar a análise de uma amostra ao usar um sistema de detecção tal como descrito no presente documento, o ali- nhamento da disposição de poços de amostras e da disposição de fo- todetectores pode ter que ser obtido de maneira tal que pelo menos alguns dos poços de amostras ficam posicionados opticamente em relação à disposição de fotodetectores para pelo menos alguns dos fotodetectores receberem a luz emitida de um respectivo poço de amostra. Por conseguinte, algumas modalidades do presente pedido de patente se referem a técnicas para alinhar opticamente a disposi- ção de poços de amostras em relação à disposição de fotodetectores.
[0098] Com relação outra vez à FIGURA 1, em algumas modalida- des, os sinais gerados pelo circuito de detecção 116 podem ser usa- dos no alinhamento da disposição de poços de amostras 104 em rela- ção à disposição de fotodetectores 114. Em tais modalidades, o pro- cessador 118 pode processar os sinais gerados pelo circuito de detec- ção 116 para gerar sinais de controle do estrado para o reposiciona- mento da disposição de poços de amostras 104 e para transmitir os sinais de controle do estrado ao circuito de controle do estrado 110. O circuito de controle do estrado 110 podem agir para mover o estrado 102 em resposta à recepção dos sinais de controle do estrado, e a disposição de poços de amostras 104 no estrado 102 pode mudar a as posições em relação à disposição de fotodetectores 114. Adicional ou alternativamente, o processador 118 pode gerar sinais de controle do estrado para o reposicionamento da disposição de fotodetectores 114 e transmitir os sinais de controle do estrado ao circuito de controle do estrado 128. O circuito de controle do estrado 128 pode agir para mo- ver o estrado 126 em resposta à recepção dos sinais de controle do estrado, e a disposição de fotodetectores 114 pode mudar as posições em relação à disposição de poços de amostras 104. O estrado 102 e/ou o estrado 126 podem ser configurados para se mover em qual- quer número apropriado de eixos, incluindo os eixos de translação e rotação. Em algumas modalidades, o estrado 102 pode ser um piezo- estrado configurado para ter uma faixa de deslocamento ao longo de três eixos diferentes. Em algumas modalidades, o estrado 126 pode ser um estrado montado em um goniômetro, o qual pode permitir que o estrado 126 incline a ângulos particulares.
[0099] Embora os estrados 102 e 126 e os circuitos de controle associados 110 e 128 sejam mostrados na FIGURA 1, deve ser apre- ciado que algumas modalidades podem envolver o uso de somente um estrado, tal como um estrado para mover a disposição de poços de amostras 104 ou um estrado para mover a disposição de fotodetecto- res 114, e pode incluir somente circuitos de controle do estrado para controlar o posicionamento do estrado. Adicional ou alternativamente, algumas modalidades podem envolver o controle manual (por exem- plo, botões giráveis para posicionamento mecânico por um usuário) de um ou ambos os estrados 102 e 126 para posicionar a disposição de poços de amostras 104 e/ou a disposição de fotodetectores 114.
[00100] Os sinais gerados pelo circuito de detecção 116 podem ser providos ao processador 118, o qual pode executar a análise ao usar os sinais. O processador 118 pode incluir um hardware de transmissão de dados configurado para transmitir e receber dados de e para dispo- sitivos externos através de um ou mais links de transmissão de dados. Em algumas modalidades, o processador 118 pode gerar dados da imagem ao usar os sinais e transmitir os dados da imagem ao disposi-
tivo de exibição 120, e o dispositivo de exibição 120 pode exibir uma imagem ao usar os dados da imagem. Uma imagem exibida no dispo- sitivo de exibição 120 pode permitir que um usuário veja se a disposi- ção de poços de amostras 104 está alinhada apropriadamente com a disposição de fotodetectores 114.
[00101] Em algumas modalidades, a disposição de poços de amos- tras 104 é integrada como parte de um chip de amostra, onde a dispo- sição de poços de amostras 104 é arranjada em uma superfície do chip de amostra. O chip de amostra pode incluir um ou mais compo- nentes ópticos para aplicar a luz de excitação 122 aos poços de amos- tras individuais da disposição de poços de amostras 104. O chip de amostra pode incluir um ou mais guias de ondas posicionados em re- lação aos poços de amostras de maneira tal que alguns ou todos os poços de amostras na disposição ficam posicionados para receber a luz de um ou mais guias de ondas. Em algumas modalidades, o chip de amostra pode incluir um ou mais acopladores de grade configura- dos para receber a luz e para acoplar opticamente a luz a um ou mais guia de ondas. Em tais modalidades, um feixe de luz de excitação in- cidente pode ser dirigido a uma região do chip de amostra que é sepa- rada de uma região que tem os poços de amostras. Os componentes ópticos 112 podem ser configurados para dirigir um feixe da luz de ex- citação 122 rumo a um ou mais acopladores de grade no chip de amostra, o que pode permitir o acoplamento de luz de excitação a um ou mais guias de ondas.
[00102] A FIGURA 11 é uma vista em seção transversal de um chip de amostra exemplificador 1100, de acordo com algumas modalida- des. O chip de amostra 1100 inclui poços múltiplos poços de amostras 204 arranjados em uma superfície do chip de amostra 1100. A fileira de poços de amostras 204 mostrada na FIGURA 11 é posicionada a uma distância D do guia de ondas 1108 para permitir o acoplamento óptico com o guia de ondas 1108. A distância D pode ficar na faixa de 50 nm a 500 nm, incluindo qualquer valor ou gama de valores nessa faixa. Em algumas modalidades, a distância D fica entre 100 nm e 200 nm, incluindo qualquer valor ou gama de valores nessa faixa. Em- bora cinco poços de amostras sejam mostrados, deve ser apreciado que o chip de amostra 1100 pode incluir qualquer número apropriado de poços de amostras em uma vista em seção transversal do chip de amostra 1100. Em algumas modalidades, os poços de amostras 204 são posicionados em relação ao guia de ondas 1108 para permitir que um campo óptico evanescente acople a energia óptica aos poços de amostras individuais 204 enquanto a luz se propaga ao longo do guia de ondas 1108. O chip de amostra 1100 pode incluir o acoplador de grade 1106, o qual pode acoplar a luz de excitação 122 (mostrada pe- las setas tracejadas na FIGURA 11) ao guia de ondas 1108. Durante a operação, um feixe de luz de excitação 122 pode ser posicionado para acoplar com o acoplador de grade 1106, tal como pelos componentes ópticos 112 tal como mostrado na FIGURA 1, e a luz pode se propagar ao longo do guia de ondas 1108 e acoplar a alguns ou todos os poços de amostras 204 posicionados ao longo do guia de ondas 1108. Uma molécula luminescente posicionada dentro de um poço de amostras particular 204 pode receber a luz de excitação do guia de ondas 1108, e em resposta pode emitir a luz 124, a qual pode ser detectada por um fotodetector 214 na disposição de fotodetectores 114.
[00103] A FIGURA 12A é uma vista planar esquemática que ilustra o alinhamento óptico dos poços de amostras 204 com os fotodetecto- res 214. Os poços de amostras 204 são mostrados como os círculos, e os fotodetectores 214 são mostrados como quadrados. No entanto, deve ser apreciado que os poços de amostras e os fotodetectores po- dem ter qualquer formato em seção transversal apropriado e que os aspectos do presente pedido de patente não são limitados aos forma-
tos dos poços de amostras 204 e dos fotodetectores 214 mostrados na FIGURA 12A. O(s) componente(s) óptico(s) 112 pode(m) ser configu- rado(s) para ajustar a ampliação relativa entre o plano óptico da dispo- sição de poços de amostras e o plano óptico da disposição de fotode- tectores de maneira tal que pelo menos uma porção dos poços de amostras se sobrepõe opticamente com pelo menos alguns dos foto- detectores. O arranjo dos poços de amostras em uma disposição, in- cluindo as distâncias entre os poços de amostras ao longo de uma fi- leira e entre as fileiras de poços de amostras, assim como o arranjo dos fotodetectores em uma disposição, incluindo as distâncias entre os fotodetectores e as fileiras de fotodetectores, pode ter uma configura- ção que permita o alinhamento óptico de alguns ou todos os poços de amostras para alinhar opticamente com os fotodetectores individuais. Tal como mostrado na FIGURA 12A, o afastamento relativo entre os poços de amostras individuais 204 e os fotodetectores individuais 214 pode permitir que pelo menos algumas das fileiras de poços de amos- tras em uma disposição de poços de amostras alinhe opticamente com algumas das fileiras de fotodetectores. Em algumas modalidades, o alinhamento óptico pode envolver o fato que a distância entre os poços de amostras em uma fileira seja a mesma ou similar à distância entre os fotodetectores em uma fileira.
[00104] O alinhamento óptico pode ser considerado em um plano óptico que inclui poços de amostras e/ou em um plano óptico que in- clui fotodetectores. Em algumas modalidades, um plano óptico dos po- ços de amostras pode ter uma distância Dw entre os poços de amos- tras individuais ao longo de uma fileira e entre fotodetectores individu- ais ao longo de uma fileira como sendo igual a cerca de 5 micra. Em algumas modalidades, um plano óptico dos fotodetectores pode ter uma distância Dw entre os poços de amostras individuais ao longo de uma fileira e entre fotodetectores individuais ao longo de uma fileira como sendo igual a cerca de 150 micra. Os fotodetectores individuais podem ter uma dimensão w dentro da qual um poço de amostras se sobrepõe opticamente quando no alinhamento óptico. Em algumas modalidades, a dimensão w pode ser de cerca de 1 mícron no plano óptico que inclui os poços de amostras. Em algumas modalidades, a dimensão w pode ser de cerca de 30 micra no plano óptico que inclui os fotodetectores. A distância Ds entre as fileiras de poços de amos- tras e a distância Dp entre as fileiras de fotodetectores podem permitir o alinhamento óptico. Em algumas modalidades, a distância Ds pode ficar na faixa de cerca de 7,5 micra a cerca de 225 micra, ou qualquer valor ou gama de valores nessa faixa, no plano óptico dos poços de amostras. Em algumas modalidades, a distância Dp pode ficar na faixa de cerca de 5 micra a cerca de 150 micra, ou qualquer valor ou gama de valores nessa faixa, no plano óptico dos poços de amostras. Em algumas modalidades, a distância Dp pode ser de cerca de 150 micra no plano óptico dos poços de amostras.
[00105] Algumas modalidades podem envolver o alinhamento ópti- co dos poços de amostras posicionados ao longo de um guia de ondas com uma fileira de fotodetectores. Tal como mostrado na FIGURA 12A, os poços de amostras, incluindo o poço de amostras 204a, são posicionados ao longo do guia de ondas 1108a e alinham opticamente com uma fileira de fotodetectores, incluindo o fotodetector 214a. Em quanto que uma outra fileira de poços de amostras, tal como a fileira dos poços de amostras posicionada ao longo do guia de ondas 1108b, que inclui o poço de amostras 204b, não seja alinhada opticamente com os fotodetectores individuais, tais como as fileiras dos fotodetecto- res que incluem os fotodetectores 214b e 214c. Este tipo de configura- ção pode permitir uma maior facilidade no alinhamento de poços de amostras com os fotodetectores, uma vez que alguns dos fotodetecto- res são usados para detectar quando os poços de amostras estão em alinhamento enquanto que outros fotodetectores são usados para de- tectar quando os poços de amostras não estão alinhados. O ajuste do posicionamento relativo de uma disposição de poços de amostras em relação a uma disposição de fotodetectores pode incluir o deslocamen- to de uma ou ambas as disposições para uma posição onde um pri- meiro subconjunto de fotodetectores detecta uma quantidade maior de fótons ao passo que um segundo subconjunto de fotodetectores detec- ta uma quantidade menor de fótons.
[00106] A FIGURA 12B é uma vista planar que ilustra o desalinha- mento óptico dos poços de amostras 204 em relação aos fotodetecto- res 214 da amostra. Em particular, a FIGURA 12B ilustra o desalinha- mento translacional com os poços de amostras 204 deslocados dos fotodetectores 214 ao longo da direção X. A correção de tal desali- nhamento translacional pode envolver o deslocamento incremental da disposição de poços de amostras ao longo da direção x até que uma fileira de fotodetectores detecte uma determinada quantidade de fó- tons, tais como uma quantidade máxima de fótons ou uma quantidade de fótons acima de um valor limite, para obter o alinhamento mostrado na FIGURA 12A.
[00107] Em alguns exemplos, o desalinhamento óptico de uma dis- posição de poços de amostras e de uma disposição de fotodetectores pode incluir o desalinhamento rotacional. A FIGURA 12C é uma vista planar que ilustra o desalinhamento rotacional dos poços de amostras 204 em relação aos fotodetectores 214 onde os poços de amostras 204 são desalinhados em relação aos fotodetectores 214 por um ân- gulo θ. Em tal posição de desalinhamento rotacional, os poços de amostras ao longo dos guias de ondas individuais só podem se sobre- por com alguns dos fotodetectores em uma fileira da disposição de fo- todetectores, e o desalinhamento pode ser corrigido ou reduzido ao girar a disposição de poços de amostras em relação à disposição de fotodetectores ou ao girar a disposição de fotodetectores em relação à disposição de poços de amostras de maneira tal que mais fotodetecto- res na fileira detectam a luz. Por exemplo, tal como mostrado na FI- GURA 12C, somente alguns dos poços de amostras ao longo do guia de ondas 1108a se sobrepõem opticamente com os fotodetectores em uma fileira que inclui o fotodetector 214a de maneira tal que somente os fotodetectores que se sobrepõem opticamente com os poços de amostras são posicionados para receber os fótons. A correção de tal desalinhamento rotacional pode envolver a rotação incremental da disposição de poços de amostras em relação à disposição de fotode- tectores de modo que haja mais fotodetectores posicionados para de- tectar a luz.
[00108] Além disso, tal como discutido acima, a disposição de po- ços de amostras e a disposição de fotodetectores podem ser projeta- das de maneira tal que nem todas as fileiras de poços de amostras alinham com os fotodetectores, onde tais fotodetectores podem ser considerados como fotodetectores "escuros". Em tais modalidades, a correção do desalinhamento rotacional pode envolver o posicionamen- to da disposição de poços de amostras em relação à disposição de fotodetectores de maneira tal que algumas das fileiras de poços de amostras não se sobrepõem com os fotodetectores. Por exemplo, o desalinhamento rotacional pode envolver uma situação na qual uma única fileira de poços de amostras é posicionada para a sobreposição com múltiplas fileiras de fotodetectores. Tal como mostrado na FIGU- RA 12C, os fotodetectores 214b e 214d ficam em fileiras separadas na disposição de fotodetectores, e os poços de amostras 204b e 204d, que são posicionados ao longo do guia de ondas 1108b, se sobre- põem com os fotodetectores 214b e 214d, respectivamente. A corre- ção para este tipo de desalinhamento rotacional pode envolver a rota- ção da disposição de poços de amostras em relação à disposição de fotodetectores de maneira tal que a fileira de poços de amostras ao longo do guia de ondas 1108b alinha com uma fileira de fotodetectores ou não alinha com nenhum dos fotodetectores.
Uma vez que este tipo de desalinhamento é observado por fileiras vizinhas dos fotodetectores que têm pelo menos um fotodetector de detecção de luz, a correção pode envolver o reposicionamento da disposição de poços de amos- tras e a disposição de fotodetectores até que as fileiras dos fotodetec- tores que estão posicionados para receber a luz da disposição de po- ços de amostras sejam separadas por uma ou mais fileiras de fotode- tectores que são posicionados para não receber a luz da disposição de poços de amostras.
Em tais exemplos, o processo de alinhamento po- de envolver a comparação do padrão de fotodetectores na disposição de fotodetectores que estão detectando a luz em qualquer estrado par- ticular do processo de alinhamento a um padrão de luz desejado que é detectado pela disposição de fotodetectores para determinar se etapas adicionais de alinhamento são necessárias para obter o padrão dese- jado.
Como um exemplo, o padrão desejado dos fotodetectores que detectam a luz com respeito às FIGURAS 12A, 12B e 12C podem ser descritos como alternando entre uma fileira de fotodetectores que de- tectam a luz, ou fotodetectores "claros", com uma fileira de fotodetecto- res que não detectam a luz, ou fotodetectores "escuros". Este padrão pode então ser comparado aos padrões de detecção de luz durante o processo de alinhamento para determinar se a disposição de poços de amostras e a disposição de fotodetectores foram alinhadas de maneira apropriada.
Em algumas modalidades, um padrão de fotodetector es- curo pode identificar uma orientação particular da disposição de poços de amostras, e é usado para ajustar o alinhamento.
Por exemplo, um padrão rotacionalmente assimétrico, tal como um padrão em forma de L de fotodetectores escuros, pode ser usado na determinação que a disposição de poços de amostras e a disposição de fotodetectores não estão alinhadas rotacionalmente.
[00109] A FIGURA 13 é um fluxograma de um processo ilustrativo 1300 para alinhar opticamente uma disposição de poços de amostras com uma disposição de fotodetectores, de acordo com algumas moda- lidades da tecnologia descrita no presente documento. O processo 1300 começa na etapa 1310, onde a luz emitida dos poços de amos- tras em uma disposição de poços de amostras, tal como a disposição de poços de amostras 104, é detectada ao usar uma disposição de fotodetectores, tal como a disposição de fotodetectores 114. Uma quantidade de luz detectada por fotodetectores individuais pode forne- cer uma indicação de um grau de alinhamento da disposição de poços de amostras em relação à disposição de fotodetectores. A detecção da luz ao usar a disposição de fotodetectores pode envolver um circuito de detecção, tal como o circuito de detecção 116, para executar a con- tagem de fótons dos fótons incidentes recebidos em fotodetectores individuais. Em algumas modalidades, o alinhamento pode envolver o direcionamento da luz de excitação para os poços de amostras na dis- posição de poços de amostras (por exemplo, ao propagar a luz ao lon- go dos guias de ondas em um chip de amostra) e a detecção da luz emitida dos poços de amostras ao usar a disposição de fotodetectores.
[00110] Em seguida, o processo 1300 prossegue para a etapa 1320, onde o posicionamento da disposição de poços de amostras e/ou da disposição de fotodetectores é ajustado com base na luz de- tectada de maneira tal que pelo menos alguns dos poços de amostras são alinhados opticamente com pelo menos alguns dos fotodetectores. O ajuste do posicionamento da disposição de poços de amostras e/ou da disposição de fotodetectores pode envolver o ajuste para responder pelo desalinhamento rotacional e/ou translacional entre a disposição de poços de amostras e a disposição de fotodetectores. O ajuste do posicionamento da disposição de poços de amostras pode incluir o deslocamento da disposição de poços de amostras de uma primeira posição para uma segunda posição, o que pode envolver o uso de um estrado, tal como o estrado 102. O ajuste do posicionamento da dispo- sição de fotodetectores pode incluir o deslocamento da disposição de fotodetectores de uma primeira posição para uma segunda posição, o que pode envolver o uso de um estrado, tal como o estrado 126. Um primeiro conjunto de fotodetectores pode detectar uma quantidade maior de fótons quando na segunda posição e não na primeira posi- ção. Um segundo conjunto de fotodetectores pode detectar uma quan- tidade menor de fótons quando na segunda posição e não na primeira posição. Em algumas modalidades, o ajuste do posicionamento da disposição de poços de amostras em relação à disposição de fotode- tectores pode envolver o ajuste de suas posições relativas de maneira tal que uma ou os mais fileiras de poços de amostras alinha optica- mente com uma ou mais fileiras de fotodetectores. Deve ser apreciado que a disposição de poços de amostras, a disposição de fotodetecto- res, ou ambas, podem ser reposicionados durante a etapa 1320.
[00111] Em seguida, o processo 1300 pode prosseguir para a etapa 1330, onde o foco da disposição de poços de amostras em relação à disposição de detectores é ajustado. Este processo pode envolver o ajuste de um ou mais sistemas ópticos no sistema, tais como os com- ponentes ópticos 112, para colocar um plano de imagem da disposição de poços de amostras em alinhamento com o plano das regiões de detecção dos fotodetectores.
[00112] Em seguida, o processo 1300 pode prosseguir para a etapa 1340, onde o padrão de luz detectado pela disposição de fotodetecto- res é comparado a um padrão de luz desejado. Em particular, a etapa 1340 pode ser incluída no processo de alinhamento quando há um conjunto de fotodetectores na disposição de fotodetectores designado como fotodetectores "escuros". A comparação de um determinado pa-
drão de luz detectado pela disposição de fotodetectores a um padrão desejado pode envolver uma comparação de um para um da luz de- tectada por fotodetectores individuais na disposição de fotodetectores com sua posição correspondente dentro do padrão de luz desejado e/ou a comparação de tal padrão de luz com o padrão geral desejado para obter um grau de alinhamento.
[00113] Algumas modalidades podem envolver a repetição das eta- pas 1310, 1320, 1330 e/ou 1340 para obter uma quantidade desejada de alinhamento óptico entre a disposição de poços de amostras e a disposição de fotodetectores. Em algumas modalidades, o ajuste de uma posição da disposição de poços de amostras, da disposição de fotodetectores, ou de ambas, na etapa 1320 pode ser uma mudança incremental na posição, a qual pode ser subsequentemente avaliada quanto ao fato se o reposicionamento melhora o alinhamento mediante a detecção de luz da disposição de poços de amostras ao usar a dis- posição de fotodetectores. Se a nova posição melhorar o alinhamento óptico, então a nova posição pode ser mantida. Se a nova posição não melhorar o alinhamento óptico, então o sistema pode reverter de volta a uma posição prévia. Desta maneira, o alinhamento da disposição de poços de amostras com a disposição de fotodetectores pode prosse- guir em incrementos.
[00114] Em algumas modalidades, uma parte ou todo o processo 1300 pode ser executado por qualquer(quaisquer) dispositivo(s) de computação apropriado(s) (por exemplo, um único dispositivo de com- putação, múltiplos dispositivos de computação colocalizados em uma única posição física ou posicionados em múltiplas posições físicas afastadas umas das outras, etc.), uma vez que os aspectos da tecno- logia descrita não são limitados no presente documento a este respei- to. Em algumas modalidades, uma parte ou todo o processo 1300 po- de ser executado por um usuário que opera um ou mais componentes de um sistema de detecção, tal como o sistema de detecção 100. Por exemplo, o estrado 102, o estrado 126, ou ambos, podem ser contro- lados por um ou por mais dispositivos de computação, que podem ge- rar e transmitir sinais de controle aos estrados.
[00115] Deve ser apreciado que as técnicas descritas no presente documento para alinhar uma disposição de fotodetectores a uma dis- posição de poços de amostras podem ser implementadas na formação de um dispositivo monolítico onde a formação do dispositivo monolítico envolve a união de dois substratos separados: um substrato que tem uma disposição de fotodetectores e um outro substrato que tem uma disposição de poços de amostras, ou uma outra disposição configura- da para emitir a luz de locais particulares. Neste contexto, a formação do dispositivo monolítico pode envolver o posicionamento dos dois substratos um em relação ao outro de maneira tal que alguns ou todos os fotodetectores no primeiro substrato alinham opticamente com os poços de amostras, ou outros pontos de interesse, no segundo subs- trato antes de unir os dois substratos. É nesta etapa na formação do dispositivo monolítico em que as técnicas de alinhamento descritas no presente documento podem ser implementadas para obter um grau desejado de funcionalidade no dispositivo monolítico resultante. Em algumas modalidades, os dois substratos podem ser colocados em contato físico e a luz detectada pela disposição de fotodetectores pode ser usada para ajustar o alinhamento da disposição de fotodetectores com a disposição de poços de amostras. Em algumas modalidades, estas técnicas de alinhamento podem ser usadas no alinhamento de componentes ópticos, tais como disposições de microlentes e disposi- ções de fibras, com as disposições de fontes de luz (por exemplo, la- sers de emissão na superfície de cavidade vertical (VCSELs)). Aspectos Adicionais
[00116] Em algumas modalidades, as técnicas descritas no presen-
te documento podem ser realizadas ao usar um ou mais dispositivos de computação. As modalidades não são limitadas à operação com qualquer tipo particular de dispositivo de computação.
[00117] A FIGURA 14 é um diagrama de blocos de um sistema de computação ilustrativo 1400 que pode ser usado para implementar um circuito de controle para controlar a disposição de fotodetectores, o circuito de detecção, uma ou mais fontes de luz, um estrado para posi- cionar a disposição de poços de amostras, ou para executar a análise dos dados da disposição de fotodetectores. O sistema de computação 1400 inclui o(s) processador(es) 1410 e um ou mais artigos de manu- fatura que compreendem meios de armazenamento que podem ser lidos por computador não transitórios (por exemplo, a memória 1420 e um ou mais meios de armazenamento não volátil 1430). O(s) proces- sador(es) 1410 pode(m) controlar os dados de escrita e os dados de leitura da memória 1420 e do armazenamento não volátil 1430 de qualquer maneira apropriada, uma vez que os aspectos da tecnologia descrita no presente documento não são limitados a este respeito. Pa- ra executar qualquer uma das funcionalidades descritas no presente documento, o(s) processador(es) 1410 pode(m) executar um ou mais instruções executáveis por processador armazenadas em um ou mais meios de armazenamento que podem ser lido por computador não transitórios (por exemplo, a memória 1420), que podem servir como meios de armazenamento que podem ser lido por computador não transitórios que armazenam instruções executáveis por processador para a execução pelo(s) processador(es) 1410.
[00118] O sistema de computação 1400 também pode incluir inter- face(s) de entrada/saída (I/O) de rede 1440 através da(s) qual(is) o sistema de computação 1400 pode se comunicar com outros dispositi- vos de computação (por exemplo, por uma rede). O sistema de com- putação 1400 pode incluir a interface de entrada/saída (I/O) do usuário
1460, através da qual o sistema de computação 1400 pode prover a saída e receber a entrada de um usuário. A interface I/O do usuário 1460 pode incluir dispositivos tais como um teclado, um mouse, um microfone, um dispositivo de exibição (por exemplo, um monitor ou uma tela de toque), alto-falantes, uma câmera, e/ou vários outros tipos de dispositivos de I/O.
[00119] As modalidades descritas acima podem ser implementadas em qualquer uma de numerosas maneiras. Por exemplo, as modalida- des podem ser implementadas ao usar um hardware, um software ou uma combinação dos mesmos. Quando implementada no software, o código do software pode ser executado em qualquer processador apropriado (por exemplo, um microprocessador) ou uma coleção de processadores, se for provido em um único dispositivo de computação ou distribuído entre múltiplos dispositivos de computação. Deve ser apreciado que qualquer componente ou coleção de componentes que executam as funções descritas acima podem ser genericamente con- siderados como um ou mais controladores que controlam as funções acima discutidas. Um ou mais controladores podem ser implementa- dos de numerosas maneiras, tal como com um hardware dedicado, ou com um hardware de finalidades gerais (por exemplo, um ou mais pro- cessadores) que é programado ao usar o microcódigo ou o software para executar as funções recitadas acima.
[00120] A este respeito, deve ser apreciado que uma implementa- ção das modalidades descritas no presente documento compreende pelo menos um meio de armazenamento que pode ser lido por compu- tador (por exemplo, RAM, ROM, EEPROM, memória flash ou uma ou- tra tecnologia de memória, CD-ROM, discos versáteis digitais (DVD) ou um outro armazenamento em disco óptico, fitas cassete magnéti- cas, fitas magnéticas, armazenamento em disco magnético ou outros dispositivos de armazenamento magnético, ou um outro meio de ar-
mazenamento que pode ser lido por computador não transitório tangí- vel) codificado com um programa de computador (por exemplo, uma pluralidade de instruções executáveis) que, quando executado em um ou mais processadores, executa as funções acima discutidas de uma ou mais modalidades. O meio que pode ser lido por computador pode ser transportável de maneira tal que o programa armazenado no mesmo pode ser carregado em qualquer dispositivo de computação para implementar aspectos das técnicas descritas no presente docu- mento. Além disso, deve ser apreciado que a referência a um progra- ma de computador que, quando executado, executa algumas das fun- ções acima discutidas, não é limitada a um programa de aplicativo que roda em um computador hospedeiro. Ao invés disto, os termos pro- grama de computador e software são usados no presente documento para se referir a qualquer tipo de código de computador (por exemplo, software de aplicativo, firmware, microcódigo, ou qualquer outra forma de instrução de computador) que pode ser empregado para programar um ou mais processadores para implementar aspectos das técnicas descritas no presente documento.
[00121] As modalidades descritas podem ser implementadas em várias combinações. As configurações exemplificadoras incluem as configurações (1) - (36), (40)-(42) e (51)-(56), e os métodos (37)-(39) e (43)-(50) a seguir.
[00122] (1) Um sistema que compreende: uma disposição de foto- detectores; e um circuito de detecção associado com a disposição de fotodetectores, em que o circuito de detecção é configurado para con- tar, durante um primeiro período de tempo e um segundo período de tempo depois da iluminação de uma molécula luminescente com luz de excitação, uma quantidade de fótons incidentes recebidos da molé- cula luminescente em um fotodetector da disposição de fotodetectores.
[00123] (2) O sistema da configuração (1), em que o circuito de de-
tecção é configurado para contar os fótons individuais incidentes na disposição de fotodetectores durante o primeiro período de tempo e o segundo período de tempo.
[00124] (3) O sistema da configuração (1) ou (2), em que o circuito de detecção também é configurado para gerar sinais que identificam a molécula luminescente.
[00125] (4) O sistema de qualquer uma das configurações (1) a (3), em que o circuito de detecção também é configurado para gerar os sinais que distinguem entre tipos diferentes de moléculas luminescen- tes incluindo um primeiro sinal que identifica um primeiro tipo de molé- cula luminescente e um segundo sinal que identifica um segundo tipo de molécula luminescente.
[00126] (5) O sistema da configuração (4), em que tipos diferentes de moléculas luminescentes são associados com nucleotídeos diferen- tes, e o circuito de detecção é configurado para gerar um conjunto de sinais que identifica uma série de nucleotídeos.
[00127] (6) O sistema da configuração (5), em que o conjunto de sinais que identifica a série de nucleotídeos arranja em sequência uma molécula de ácido nucleico modelo.
[00128] (7) O sistema da configuração (6), em que a série de nucle- otídeos identificados pelo conjunto de sinais é uma série de nucleotí- deos de uma molécula de ácido nucleico complementar à molécula de ácido nucleico modelo.
[00129] (8) O sistema da configuração (7), em que tipos diferentes de nucleotídeos na série de nucleotídeos são etiquetados com tipos diferentes de moléculas luminescentes.
[00130] (9) O sistema de qualquer uma das configurações (1) a (8), em que o circuito de detecção também é configurado para gerar os sinais indicativos de um tempo de vida da molécula luminescente.
[00131] (10) O sistema de qualquer uma das configurações (1) a
(9), em que o circuito de detecção tem pelo menos dois circuitos de contagem de fótons associados com um fotodetector na disposição e configurados para contar a quantidade de fótons incidentes recebidos pelo fotodetector.
[00132] (11) O sistema da configuração (10), em que o circuito de detecção também é configurado para gerar os sinais indicativos da quantidade de fótons incidentes recebidos pelo fotodetector durante o primeiro período de tempo e o segundo período de tempo.
[00133] (12) O sistema da configuração (11), em que os sinais ge- rados pelo circuito de detecção incluem um primeiro sinal que identifi- ca uma primeira quantidade de fótons incidentes recebidos pelo foto- detector durante o primeiro período de tempo e um segundo sinal que identifica uma segunda quantidade de fótons incidentes recebidos pelo fotodetector durante o segundo período de tempo.
[00134] (13) O sistema da configuração (12), em que pelo menos dois circuitos de contagem de fótons incluem um primeiro circuito de contagem de fótons e um segundo circuito de contagem de fótons, e em que o primeiro circuito de contagem de fótons é configurado para gerar o primeiro sinal e o segundo circuito de contagem de fótons é configurado para gerar o segundo sinal.
[00135] (14) O sistema da configuração (12) ou (13), em que o cir- cuito de detecção é configurado para gerar um sinal de leitura que in- clui o primeiro sinal e o segundo sinal.
[00136] (15) O sistema de qualquer uma das configurações (12) a (14), em que o primeiro período de tempo e o segundo período de tempo são períodos de tempo não superpostos.
[00137] (16) O sistema de qualquer uma das configurações (1) a (15), em que o circuito de detecção é configurado para receber um si- nal de controle que indica um tempo de referência e para executar a contagem de fótons em resposta à recepção do sinal de controle.
[00138] (17) O sistema de qualquer uma das configurações (1) a (16), em que o circuito de detecção é configurado para receber um si- nal de controle de uma fonte de luz configurada para emitir um pulso de luz de excitação e para executar a contagem de fótons em resposta à recepção do sinal de controle.
[00139] (18) O sistema de qualquer uma das configurações (1) a (17), em que o sistema também compreende: pelo menos uma fonte de luz configurada para emitir luz de excitação; e um circuito configu- rado para controlar pelo menos uma fonte de luz para emitir pulsos de luz de excitação e gerar os sinais de controle que correspondem aos pulsos emitidos, em que o circuito de detecção associado com um fo- todetector na disposição é configurado para executar a contagem de fótons em resposta à recepção de pelo menos um dos sinais de con- trole dos circuitos.
[00140] (19) O sistema de qualquer uma das configurações (1) a (18), em que o sistema também compreende: uma disposição de po- ços de amostras, em que os poços de amostras individuais na disposi- ção de poços de amostras são configurados para receber uma amos- tra.
[00141] (20) O sistema da configuração (19), em que uma posição de alinhamento da disposição de poços de amostras com a disposição de fotodetectores inclui um primeiro subconjunto de poços de amos- tras posicionado para alinhar opticamente com pelo menos uma por- ção dos fotodetectores na disposição de fotodetectores e um segundo subconjunto de poços de amostras posicionado para não alinhar opti- camente com os fotodetectores na disposição de fotodetectores.
[00142] (21) O sistema da configuração (20), em que o primeiro subconjunto de poços de amostras inclui pelo menos uma fileira de poços de amostras na disposição de poços de amostras que alinha opticamente com pelo menos uma fileira de fotodetectores na disposi-
ção de fotodetectores quando na posição de alinhamento.
[00143] (22) O sistema da configuração (20) ou (21), em que o pri- meiro subconjunto de poços de amostras inclui uma primeira fileira e uma segunda fileira de poços de amostras na disposição de poços de amostras, em que a primeira fileira e a segunda fileira são separadas por pelo menos uma fileira de poços de amostras no segundo subcon- junto de poços de amostras.
[00144] (23) O sistema de qualquer uma das configurações (19) a (22), em que o sistema também compreende pelo menos um elemento óptico posicionado para dirigir os fótons emitidos da disposição de po- ços de amostras rumo à disposição de fotodetectores.
[00145] (24) O sistema da configuração (23), em que pelo menos um elemento óptico é posicionado para dirigir os fótons emitidos de um poço de amostras da disposição de poços de amostras rumo a um fo- todetector na disposição de fotodetectores.
[00146] (25) O sistema da configuração (23) ou (24), em que pelo menos um elemento óptico é configurado para alinhar os fótons emiti- dos de um poço de amostras da disposição de poços de amostras pa- ra se sobrepor com uma região de detecção de um fotodetector na disposição de fotodetectores.
[00147] (26) O sistema de qualquer uma das configurações (23) a (25), em que pelo menos um elemento óptico inclui um espelho dicroi- co posicionado para dirigir a luz emitida por pelo menos uma fonte de luz rumo à disposição de poços de amostras e para transmitir a luz emitida pela molécula luminescente à disposição de fotodetectores.
[00148] (27) O sistema de qualquer uma das configurações (23) a (26), em que pelo menos um elemento óptico inclui uma pluralidade de lentes arranjadas em uma configuração de lente de retransmissão.
[00149] (28) O sistema de qualquer uma das configurações (19) a (27), em que o sistema também compreende pelo menos um guia de ondas, em que pelo menos uma porção dos poços de amostras na disposição de poços de amostras é posicionada para receber a luz de pelo menos um guia de ondas.
[00150] (29) O sistema da configuração (28), em que a disposição de poços de amostras e pelo menos um guia de ondas são integrados em um chip de amostra, e a disposição de poços de amostras é arran- jada em uma superfície do chip de amostra.
[00151] (30) O sistema da configuração (29), em que o chip de amostra também compreende um acoplador de grade configurado pa- ra receber a luz de uma fonte de luz externa e para acoplar opticamen- te a luz a pelo menos um guia de ondas.
[00152] (31) O sistema de qualquer uma das configurações (1) a (30), em que a disposição de fotodetectores compreende uma disposi- ção de fotodiodos de avalanche de fótons individuais.
[00153] (32) Um aparelho que compreende: um circuito de detecção que compreende uma disposição de fotodetectores, em que o circuito de detecção é configurado para contar os fótons incidentes recebidos pela disposição de fotodetectores das moléculas luminescentes para distinguir entre as moléculas luminescentes associadas com os nucle- otídeos diferentes que são incorporados em uma molécula de ácido nucleico.
[00154] (33) O aparelho da configuração (32), em que o circuito de detecção também é configurado para gerar os sinais que identificam uma série de nucleotídeos quando os nucleotídeos individuais são in- corporados na molécula de ácido nucleico.
[00155] (34) O aparelho da configuração (32) ou (33), em que as moléculas luminescentes etiquetam tipos diferentes de nucleotídeos.
[00156] (35) O aparelho de qualquer uma das configurações (32) a (34), em que o aparelho também compreende uma pluralidade de po- ços de amostras configurados para receber uma molécula de ácido nucleico modelo, em que um fotodetector na disposição é posicionado para receber a luz de um poço da pluralidade de poços de amostras.
[00157] (36) O aparelho da configuração (35), em que a molécula de ácido nucleico é complementar à molécula de ácido nucleico mode- lo.
[00158] (37) Um método de fotodetecção, o qual compreende: a recepção, por um fotodetector em uma disposição de fotodetectores, dos fótons de uma molécula luminescente; e a contagem, ao usar o circuito de detecção, de uma quantidade de fótons incidentes no foto- detector durante um primeiro período de tempo e um segundo período de tempo.
[00159] (38) O método de fotodetecção de (37), o qual também compreende: a geração dos sinais que identificam a molécula lumi- nescente, em que os sinais indicam uma primeira quantidade dos fó- tons recebidos pelo fotodetector durante o primeiro período de tempo e uma segunda quantidade dos fótons recebidos pelo fotodetector du- rante o segundo período de tempo.
[00160] (39) O método de fotodetecção de (37) ou (38), o qual tam- bém compreende: a iluminação da amostra com um pulso de luz de excitação, e em que a contagem da quantidade de fótons ocorre em resposta à iluminação da amostra com um pulso de luz de excitação.
[00161] (40) Pelo menos um meio de armazenamento que pode ser lido por computador não transitório que armazena instruções executá- veis por processador que, quando executadas por pelo menos um pro- cessador de hardware, fazem com que pelo menos um processador de hardware execute um método de fotodetecção que compreende: a re- cepção, do circuito configurado para controlar pelo menos uma fonte de luz, de um sinal de controle que corresponde a um pulso de luz emitido por pelo menos uma fonte de luz; e o controle, em resposta à recepção do sinal de controle, do circuito de detecção configurado pa-
ra executar a contagem de fótons incidentes em um fotodetector em uma disposição de fotodetectores, em que a contagem inclui a conta- gem de uma quantidade de fótons incidentes recebidos pelo detetor durante um primeiro período de tempo e um segundo período de tem- po.
[00162] (41) Pelo menos um meio de armazenamento que pode ser lido por computador não transitório (40), em que o circuito de detecção também é configurado para gerar os sinais indicativos da quantidade de fótons incidentes recebidos pelo fotodetector durante o primeiro pe- ríodo de tempo e o segundo período de tempo.
[00163] (42) Pelo menos um meio de armazenamento que pode ser lido por computador não transitório (40) ou (41), em que os sinais ge- rados pelo circuito de detecção incluem um primeiro sinal que identifi- ca uma primeira quantidade de fótons incidentes recebidos pelo foto- detector durante o primeiro período de tempo e um segundo sinal que identifica uma segunda quantidade de fótons incidentes recebidos pelo fotodetector durante o segundo período de tempo.
[00164] (43) Um método para alinhar uma disposição de poços de amostras com uma disposição de fotodetectores, em que o método compreende: a detecção, ao usar a disposição de fotodetectores, da luz da disposição da poços de amostras incidente na disposição de fotodetectores; e o ajuste, com base na luz detectada, do posiciona- mento da disposição de poços de amostras em relação à disposição de fotodetectores para permitir que pelo menos uma porção dos poços de amostras na disposição de poços de amostras alinhe opticamente com pelo menos uma porção dos fotodetectores na disposição de fo- todetectores.
[00165] (44) O método de (43), em que uma quantidade de luz de- tectada por fotodetectores individuais na disposição de fotodetectores indica um grau de alinhamento da disposição de poços de amostras com a disposição de fotodetectores.
[00166] (45) O método de (43) ou (44), em que o ajuste do posicio- namento da disposição de poços de amostras em relação à disposição de fotodetectores inclui o deslocamento da disposição de poços de amostras de uma primeira posição para uma segunda posição, em que um primeiro subconjunto de fotodetectores na disposição de fotodetec- tores detecta uma quantidade maior de fótons quando a disposição de poços de amostras está na segunda posição e não na primeira posi- ção.
[00167] (46) O método de (45), em que um segundo subconjunto de fotodetectores na disposição de fotodetectores detecta uma quantida- de menor de fótons quando a disposição de poços de amostras está na segunda posição e não na primeira posição.
[00168] (47) O método de qualquer um de (43) a (46), em que o ajuste do posicionamento da disposição de poços de amostras em re- lação à disposição de fotodetectores compreende o posicionamento de pelo menos uma fileira de poços de amostras na disposição de poços de amostras para alinhar opticamente com pelo menos uma fileira de fotodetectores na disposição de fotodetectores.
[00169] (48) O método de qualquer um de (43) a (47), em que o ajuste do posicionamento da disposição de poços de amostras em re- lação à disposição de fotodetectores compreende o deslocamento da disposição de poços de amostras e/ou da disposição de fotodetectores em uma direção translacional.
[00170] (49) O método de qualquer um de (43) a (48), em que o ajuste do posicionamento da disposição de poços de amostras em re- lação à disposição de fotodetectores compreende a rotação da dispo- sição de poços de amostras e/ou da disposição de fotodetectores a um ângulo.
[00171] (50) O método de qualquer um de (43) a (49), em que o ajuste do posicionamento da disposição de poços de amostras em re- lação à disposição de fotodetectores compreende a comparação de um padrão de luz detectada a um padrão de alinhamento, em que o padrão de alinhamento tem pelo menos um dos fotodetectores como detectando uma quantidade de luz abaixo de um limite.
[00172] (51) Um sistema, o qual compreende: um estrado; uma dis- posição de fotodetectores configurados para detectar a luz; um circuito de detecção associado com a disposição de fotodetectores e configu- rado para gerar os sinais indicativos dos fótons incidentes na disposi- ção de fotodetectores; e um circuito configurado para executar um mé- todo que compreende: a recepção dos sinais do circuito de detecção; e o ajuste, com base nos sinais recebidos, do posicionamento do es- trado em relação à disposição de fotodetectores para permitir que pelo menos uma porção dos poços de amostras na disposição de poços de amostras alinhe opticamente com pelo menos uma porção de fotode- tectores na disposição de fotodetectores.
[00173] (52) O sistema da configuração (51), em que o circuito compreende: pelo menos um processador; e pelo menos um meio de armazenamento que pode ser lido por computador codificado com ins- truções executáveis por computador que, quando executadas, execu- tam o método.
[00174] (53) O sistema da configuração (51) ou (52), em que os si- nais recebidos indicam uma quantidade de luz detectada por fotode- tectores individuais na disposição de fotodetectores, e a quantidade de luz indica um grau de alinhamento da disposição de poços de amos- tras com a disposição de fotodetectores.
[00175] (54) O sistema de qualquer uma das configurações (51) a (53), em que o ajuste do posicionamento do estrado em relação à dis- posição de fotodetectores também compreende o ajuste da posição do estrado de uma primeira posição a uma segunda posição, em que um primeiro subconjunto de fotodetectores na disposição de fotodetecto- res detecta uma quantidade maior de fótons quando o estrado está na segunda posição e não na primeira posição.
[00176] (55) O sistema da configuração (54), em que um segundo subconjunto de fotodetectores na disposição de fotodetectores detecta uma quantidade menor de fótons quando a disposição de poços de amostras está na segunda posição e não na primeira posição.
[00177] (56) O sistema da configuração (55), em que o ajuste do posicionamento da disposição de poços de amostras em relação à disposição de fotodetectores compreende o posicionamento de pelo menos uma fileira de poços de amostras na disposição de poços de amostras para alinhar com pelo menos uma fileira de fotodetectores na disposição de fotodetectores.
[00122] Tem desse modo sido descritos vários aspectos e modali- dades da tecnologia deste pedido de patente, deve ser apreciado que várias alterações, modificações e melhorias irão ocorrer de imediato aos elementos normalmente versados no estado da técnica. Tais alte- rações, modificações e melhorias devem ficar dentro do caráter e do âmbito da tecnologia descrita no pedido de patente. Portanto, deve ser compreendido que as modalidades acima são apresentadas apenas a título de exemplo e que, dentro do âmbito das reivindicações e dos equivalentes adicionados às mesmas, as modalidades da invenção podem ser praticadas de outra maneira que não tal como descrito es- pecificamente. Além disso, qualquer combinação de duas ou mais ca- racterísticas, sistemas, artigos, materiais, conjuntos e/ou métodos descritos no presente documento, se tais características, sistemas, artigos, materiais, conjuntos e/ou métodos não forem mutuamente in- consistentes, é incluída dentro do âmbito da presente invenção.
[00123] Além disso, tal como descrito, alguns aspectos podem ser incorporados como um ou mais métodos. Os atos executados como parte do método podem ser ordenados de qualquer maneira apropria- da. Por conseguinte, podem ser construídas modalidades em que os atos são executados em uma ordem diferente do que é ilustrado, o que pode incluir a execução de alguns atos simultaneamente, mesmo que sejam mostrados como etapas sequenciais em modalidades ilus- trativas.
[00124] Todas as definições, tal como definidas e usadas no pre- sente documento, devem ser compreendidas como preponderantes em relação às definições de dicionários, as definições nos documentos incorporados a título de referência, e/ou os significados comuns dos termos definidos.
[00125] Os artigos indefinidos "um" e "uma", tal como usados no presente documento no relatório descritivo e nas reivindicações, a me- nos que esteja indicado claramente de alguma outra maneira, devem ser compreendidos como significando "pelo menos um."
[00126] A expressão "e/ou”, tal como usada no presente documento no relatório descritivo e nas reivindicações, deve ser compreendida como significando "qualquer um ou ambos" dos elementos assim uni- dos, isto é, os elementos que estão conjuntamente presentes em al- guns casos e não conjuntamente presentes em outros casos.
[00127] Tal como usado no presente documento no relatório descri- tivo e nas reivindicações, a expressão "pelo menos um”, em referência a uma lista de um ou mais elementos, deve ser compreendida como significando pelo menos um elemento selecionado de qualquer um ou mais dos elementos na lista de elementos, mas não incluindo necessa- riamente pelo menos um de cada elemento listado especificamente dentro da lista de elementos e não excluindo quaisquer combinações de elementos na lista de elementos. Esta definição também permite que os elementos possam estar opcionalmente presentes além dos elementos identificados especificamente dentro da lista de elementos aos quais se refere a expressão "pelo menos um", que estejam relaci- onados ou não relacionados aos elementos especificamente identifi- cados.
[00128] O uso de termos ordinais tais como "primeiro”, "segundo”, "terceiro”, etc., nas reivindicações para modificar um elemento da rei- vindicação não é conotado em si a nenhuma prioridade, precedência, ou ordem de um elemento da reivindicação em relação a uma outro ordem ou ordem temporal em que os atos de um método são executa- dos, mas eles são usados meramente como etiquetas para distinguir um elemento da reivindicação que tem um determinado nome de um outro elemento que tem um mesmo nome (mas para o uso do termo ordinal) para distinguir os elementos da reivindicação.
[00129] Nas reivindicações, assim como no relatório descritivo aci- ma, todas as expressões transicionais tais como "que compreende”, "que inclui”, "que carrega”, "que tem”, "que contém”, "que envolve”, "contendo”, "composto de”, e outras ainda devem ser compreendidas como de sentido aberto, isto é, para significar incluindo mas sem ficar limitado a. As expressões transicionais "que consiste em" e "que con- siste essencialmente em" serão frases transicionais de sentido fecha- do ou semifechado, respectivamente.

Claims (56)

REIVINDICAÇÕES
1.Sistema, caracterizado pelo fato de que compreende: uma disposição de fotodetectores; e um circuito de detecção associado com a disposição de fo- todetectores, em que o circuito de detecção é configurado para contar, durante um primeiro período de tempo e um segundo período de tem- po depois da iluminação de uma molécula luminescente com luz da excitação, uma quantidade de fótons incidentes recebidos da molécula luminescente em um fotodetector da disposição de fotodetectores.
2.Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o circuito de detecção é configurado para contar os fótons individuais incidentes na disposição de fotodetectores durante o primeiro período de tempo e o segundo período de tempo.
3.Sistema de acordo com a reivindicação 1 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o circuito de detecção também é configurado para gerar os sinais que identificam a molécula luminescente.
4.Sistema de acordo com a reivindicação 1 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o circuito de detecção também é configurado para gerar os sinais que distinguem entre tipos diferentes de moléculas luminescen- tes incluindo um primeiro sinal que identifica um primeiro tipo de molé- cula luminescente e um segundo sinal que identifica um segundo tipo de molécula luminescente.
5.Sistema de acordo com a reivindicação 4 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que os tipos diferentes de moléculas luminescentes são asso- ciados com nucleotídeos diferentes, e o circuito de detecção é configu- rado para gerar um conjunto de sinais que identificam uma série de nucleotídeos.
6.Sistema de acordo com a reivindicação 5 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o conjunto de sinais que identificam a série de nucleotí- deos arranja em sequência uma molécula de ácido nucleico modelo.
7.Sistema de acordo com a reivindicação 6 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a série de nucleotídeos identificados pelo conjunto de si- nais é uma série de nucleotídeos de uma molécula de ácido nucleico complementar à molécula de ácido nucleico modelo.
8.Sistema de acordo com a reivindicação 7 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que tipos diferentes de nucleotídeos na série de nucleotídeos são etiquetados com tipos diferentes de moléculas luminescentes.
9.Sistema de acordo com a reivindicação 1 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o circuito de detecção também é configurado para gerar os sinais indicativos de um tempo de vida da molécula luminescente.
10.Sistema de acordo com a reivindicação 1 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o circuito de detecção tem pelo menos dois circuitos de contagem de fótons associados com um fotodetector na disposição e é configurado para contar a quantidade de fótons incidentes recebidos pelo fotodetector.
11.Sistema de acordo com a reivindicação 10 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o circuito de detecção também é configurado para gera os sinais indicativos da quantidade de fótons incidentes recebidos pelo fotodetector durante o primeiro período de tempo e o segundo período de tempo.
12.Sistema de acordo com a reivindicação 11 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que os sinais gerados pelo circuito de detecção incluem um primeiro sinal que identifica uma primeira quantidade de fótons inci- dentes recebidos pelo fotodetector durante o primeiro período de tem- po e um segundo sinal que identifica uma segunda quantidade de fó- tons incidentes recebidos pelo fotodetector durante o segundo período de tempo.
13.Sistema de acordo com a reivindicação 12 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que pelo menos dois circuitos de contagem de fótons incluem um primeiro circuito de contagem de fótons e um segundo circuito de contagem de fótons, e em que o primeiro circuito de contagem de fó- tons é configurado para gerar o primeiro sinal e o segundo circuito de contagem de fótons é configurado para gerar o segundo sinal.
14.Sistema de acordo com a reivindicação 12 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o circuito de detecção é configurado para gerar um sinal de leitura que inclui o primeiro sinal e o segundo sinal.
15.Sistema de acordo com a reivindicação 12 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o primeiro período de tempo e o segundo período de tem- po são períodos de tempo não superpostos.
16.Sistema de acordo com a reivindicação 1 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o circuito de detecção é configurado para receber um sinal de controle que indica um tempo de referência e para executar a con- tagem de fótons em resposta à recepção do sinal de controle.
17.Sistema de acordo com a reivindicação 1 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o circuito de detecção é configurado para receber um sinal de controle de uma fonte de luz configurada para emitir um pulso de luz de excitação e para executar a contagem de fótons em resposta à recepção do sinal de controle.
18.Sistema de acordo com a reivindicação 1 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: pelo menos uma fonte de luz configurada para emitir luz de excitação; e um circuito configurado para controlar pelo menos uma fon- te de luz para emitir pulsos de luz de excitação e gerar sinais de con- trole que correspondem aos pulsos emitidos, em que o circuito de de- tecção associado com um fotodetector na disposição é configurado para executar a contagem de fótons em resposta à recepção de pelo menos um dos sinais de controle do circuito.
19.Sistema de acordo com a reivindicação 1 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: uma disposição de poços de amostras, em que os poços de amostras individuais na disposição de poços de amostras são configu- rados para receber uma amostra.
20.Sistema de acordo com a reivindicação 19 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que uma posição de alinhamento da disposição de poços de amostras para a disposição de fotodetectores inclui um primeiro sub- conjunto de poços de amostras posicionados para alinhar opticamente com pelo menos uma porção dos fotodetectores na disposição de fo- todetectores e um segundo subconjunto de poços de amostras posici- onado para não alinhar opticamente com os fotodetectores na disposi- ção de fotodetectores.
21.Sistema de acordo com a reivindicação 20 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o primeiro subconjunto de poços de amostras inclui pelo menos uma fileira de poços de amostras na disposição de poços de amostras que alinha opticamente com pelo menos uma fileira de foto- detectores na disposição de fotodetectores quando na posição de ali- nhamento.
22.Sistema de acordo com a reivindicação 20 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o primeiro subconjunto de poços de amostras inclui uma primeira fileira e uma segunda fileira de poços de amostras na disposi- ção de poços de amostras, em que a primeira fileira e a segunda fileira são separadas por pelo menos uma fileira de poços de amostras no segundo subconjunto de poços de amostras.
23.Sistema de acordo com a reivindicação 19 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: pelo menos um elemento óptico posicionado para dirigir os fótons emitidos da disposição de poços de amostras rumo à disposi- ção de fotodetectores.
24.Sistema de acordo com a reivindicação 23 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que pelo menos um elemento óptico é posicionado para dirigir os fótons emitidos de um poço de amostras da disposição de poços de amostras rumo a um fotodetector na disposição de fotodetectores.
25.Sistema de acordo com a reivindicação 23 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que pelo menos um elemento óptico é configurado para alinhar os fótons emitidos de um poço de amostras da disposição de poços de amostras para se sobrepor com uma região de detecção de um fotode- tector na disposição de fotodetectores.
26.Sistema de acordo com a reivindicação 23 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que pelo menos um elemento óptico inclui um espelho dicroico posicionado para dirigir a luz emitida por pelo menos uma fonte de luz rumo à disposição de poços de amostras e para transmitir a luz emiti- da pela molécula luminescente à disposição de fotodetectores.
27.Sistema de acordo com a reivindicação 23 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que pelo menos um elemento óptico inclui uma pluralidade de lentes arranjadas em uma configuração de lente de retransmissão.
28.Sistema de acordo com a reivindicação 19 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: pelo menos um guia de ondas, em que pelo menos uma porção dos poços de amostras na disposição de poços de amostras é posicionada para receber a luz de pelo menos um guia de ondas.
29.Sistema de acordo com a reivindicação 28 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a disposição de poços de amostras e pelo menos um guia de ondas são integrados em um chip de amostra, e a disposição de poços de amostras é arranjada em uma superfície do chip de amostra.
30.Sistema de acordo com a reivindicação 29 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o chip de amostra também compreende um acoplador de grade configurado para receber a luz de uma fonte de luz externa e para acoplar opticamente a luz em pelo menos um guia de ondas.
31.Sistema de acordo com a reivindicação 1 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a disposição de fotodetectores compreende uma disposi- ção de fotodiodos de avalanche de fótons individuais.
32.Aparelho, caracterizado pelo fato de que compreende: um circuito de detecção que compreende uma disposição de fotodetectores, em que o circuito de detecção é configurado para contar os fótons incidentes recebidos pela disposição de fotodetecto- res de moléculas luminescentes para distinguir entre as moléculas lu- minescentes associadas com nucleotídeos diferentes que são incorpo- rados em uma molécula de ácido nucleico.
33.Aparelho de acordo com a reivindicação 32, caracteriza- do pelo fato de que o circuito de detecção também é configurado para gerar os sinais que identificam uma série de nucleotídeos quando os nucleotídeos individuais são incorporados na molécula de ácido nu- cleico.
34.Aparelho de acordo com a reivindicação 32 ou de acor- do com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que as moléculas luminescentes etiqueta, tipos diferentes de nucleotídeos.
35.Aparelho de acordo com a reivindicação 32 ou de acor- do com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma pluralidade de poços de amostras configurados para receber uma molécula de ácido nucleico modelo, em que um fotodetector na disposição é posicionado para re- cebe a luz de um poço da pluralidade de poços de amostras.
36.Aparelho de acordo com a reivindicação 35 ou de acor- do com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico é complementar à molé- cula de ácido nucleico modelo.
37.Método de fotodetecção, caracterizado pelo fato de que compreende: a recepção, por um fotodetector em uma disposição de fo- todetectores, dos fótons de uma molécula luminescente; e a contagem, ao usar o circuito de detecção, de uma quanti- dade de fótons incidentes no fotodetector durante um primeiro período de tempo e um segundo período de tempo.
38.Método de fotodetecção de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: a geração de sinais que identificam a molécula luminescen- te, em que os sinais indicam uma primeira quantidade de fótons rece- bidos pelo fotodetector durante o primeiro período de tempo e uma se- gunda quantidade de fótons recebidos pelo fotodetector durante o se- gundo período de tempo.
39.Método de fotodetecção de acordo com a reivindicação 37 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: a iluminação da amostra com um pulso de luz de excitação, e em que a contagem da quantidade de fótons ocorre em resposta à iluminação da amostra com um pulso de luz de excitação.
40.Meio de armazenamento que pode ser lido por compu- tador não transitório, caracterizado pelo fato de que armazena instru- ções executáveis por processador que, quando executadas por pelo menos um processador de hardware, fazem com que pelo menos um processador de hardware execute um método de fotodetecção, o qual compreende: a recepção, do circuito configurado para controlar pelo me- nos uma fonte de luz, um sinal de controle que corresponde a um pul- so de luz emitido por pelo menos uma fonte de luz; e o controle, em resposta à recepção do sinal de controle, do circuito de detecção configurado para executar a contagem dos fótons incidentes em um fotodetector em uma disposição de fotodetectores, em que a contagem inclui a contagem de uma quantidade de fótons incidentes recebidos pelo detetor durante um primeiro período de tem-
po e um segundo período de tempo.
41.Meio de armazenamento que pode ser lido por compu- tador não transitório da reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o circuito de detecção também é configurado para gerar os sinais indicativos da quantidade de fótons incidentes recebidos pelo fotode- tector durante o primeiro período de tempo e o segundo período de tempo.
42.Meio de armazenamento que pode ser lido por compu- tador não transitório de acordo com a reivindicação 40 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que os sinais gerados pelo circuito de detecção incluem um primeiro sinal que identifica uma primeira quantidade de fótons inci- dentes recebidos pelo fotodetector durante o primeiro período de tem- po e um segundo sinal que identifica uma segunda quantidade de fó- tons incidentes recebidos pelo fotodetector durante o segundo período de tempo.
43.Método para alinhar uma disposição de poços de amos- tras a uma disposição de fotodetectores, caracterizado pelo fato de que compreende: detectar, ao usar a disposição de fotodetectores, a luz da disposição de poços de amostras incidente na disposição de fotode- tectores; e ajustar, com base na luz detectada, o posicionamento da disposição de poços de amostras em relação à disposição de fotode- tectores para permitir que pelo menos uma porção de poços de amos- tras na disposição de poços de amostras alinhe opticamente com pelo menos uma porção dos fotodetectores na disposição de fotodetecto- res.
44.Método, de acordo com a reivindicação 43, caracteriza- do pelo fato de que uma quantidade de luz detectada por fotodetecto-
res individuais na disposição de fotodetectores indica um grau de ali- nhamento da disposição de poços de amostras com a disposição de fotodetectores.
45.Método, de acordo com a reivindicação 43 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o ajuste do posicionamento da disposição de poços de amostras em relação à disposição de fotodetectores inclui o desloca- mento da disposição de poços de amostras de uma primeira posição a uma segunda posição, em que um primeiro subconjunto de fotodetec- tores na disposição de fotodetectores detecta uma quantidade maior de fótons quando a disposição de poços de amostras está na segunda posição e não na primeira posição.
46.Método, de acordo com a reivindicação 45 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que um segundo subconjunto de fotodetectores na disposição de fotodetectores detecta uma quantidade menor de fótons quando a disposição de poços de amostras está na segunda posição e não na primeira posição.
47.Método, de acordo com a reivindicação 43 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o ajuste do posicionamento da disposição de poços de amostras em relação à disposição de fotodetectores compreende o posicionamento de pelo menos uma fileira de poços de amostras na disposição de poços de amostras para alinhar opticamente com pelo menos uma fileira de fotodetectores na disposição de fotodetectores.
48.Método, de acordo com a reivindicação 43 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o ajuste do posicionamento da disposição de poços de amostras em relação à disposição de fotodetectores compreende o deslocamento da disposição de poços de amostras e/ou da disposição de fotodetectores em uma direção translacional.
49.Método, de acordo com a reivindicação 43 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o ajuste do posicionamento da disposição de poços de amostras em relação à disposição de fotodetectores compreende a rotação da disposição de poços de amostras e/ou da disposição de fotodetectores a um ângulo.
50.Método, de acordo com a reivindicação 43 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o ajuste do posicionamento da disposição de poços de amostras em relação à disposição de fotodetectores compreende a comparação de um padrão da luz detectada a um padrão de alinha- mento, em que o padrão de alinhamento tem pelo menos um dos foto- detectores como detectando uma quantidade de luz abaixo de um limi- te.
51.Sistema, caracterizado pelo fato de que compreende: um estrado; uma disposição de fotodetectores configurados para detec- tar a luz; um circuito de detecção associado com a disposição de fo- todetectores e configurado para gerar os sinais indicativos dos fótons incidentes na disposição de fotodetectores; e um circuito configurado para executar um método que com- preende: a recepção dos sinais do circuito de detecção; e o ajuste, baseado nos sinais recebidos, do posicionamento do estrado em relação à disposição de fotodetectores para permitir que pelo menos uma porção dos poços de amostras na disposição de poços de amostras alinhe opticamente com pelo menos uma porção dos fotodetectores na disposição de fotodetectores.
52.Sistema, de acordo com a reivindicação 51, caracteriza- do pelo fato de que os circuitos compreendem: pelo menos um processador; e pelo menos um meio de armazenamento que pode ser lido por computador codificado com instruções executáveis por computa- dor que, quando executadas, executam o método.
53.Sistema de acordo com a reivindicação 51 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que os sinais recebidos indicam uma quantidade de luz detec- tada por fotodetectores individuais na disposição de fotodetectores, e a quantidade de luz indica um grau de alinhamento da disposição de po- ços de amostras com a disposição de fotodetectores.
54.Sistema de acordo com a reivindicação 51 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o ajuste do posicionamento do estrado em relação à dis- posição de fotodetectores também compreende o ajuste da posição do estrado de uma primeira posição a uma segunda posição, em que um primeiro subconjunto de fotodetectores na disposição de fotodetecto- res detecta uma quantidade maior de fótons quando o estrado está na segunda posição e não na primeira posição.
55.Sistema de acordo com a reivindicação 54 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que um segundo subconjunto de fotodetectores na disposição de fotodetectores detecta uma quantidade menor de fótons quando a disposição de poços de amostras está na segunda posição e não na primeira posição.
56.Sistema de acordo com a reivindicação 55 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o ajuste do posicionamento da disposição de poços de amostras em relação à disposição de fotodetectores compreende o posicionamento de pelo menos uma fileira de poços de amostras na disposição de poços de amostras para alinhar com pelo menos uma fileira de fotodetectores na disposição de fotodetectores.
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