BR112021003092A2

BR112021003092A2 - métodos para produzir precursores neurais entéricos, para produzir um organoide intestinal, para produzir um trato intestinal artificial e de expansão de cultura para precursores neurais entéricos, precursores neurais entéricos, estoque congelado, medicamento de célula, e, meio de precursor neural entérico

Info

Publication number: BR112021003092A2
Application number: BR112021003092-1A
Authority: BR
Inventors: Makoto Ikeya; Yayoi Kamiya; Daisuke Kamiya; Teruyoshi Yamashita; Kazumi Take
Original assignee: Kyoto University; Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority date: 2018-08-22
Filing date: 2019-08-21
Publication date: 2021-05-11
Also published as: IL280621A; TW202024322A; WO2020040166A1; JP7341433B2; EA202190582A1; JPWO2020040166A1; US20210198624A1; CN112585262B; AU2019326179A8; AU2019326179A1; CN117551598A; CO2021002704A2; SG11202101565XA; KR20210049779A; CA3110026A1; EP3842525A4; CN112585262A; EP3842525A1; MX2021002018A

Abstract

Como uma tecnologia para cultivar e propagar células precursoras do nervo do trato intestinal enquanto mantém a potência de diferenciação das mesmas em células nervosas do trato intestinal e células gliais, a presente invenção provê um método para produzir células precursoras do nervo do trato intestinal, incluindo (1) uma etapa para prover células precursoras do nervo do trato intestinal e (2) uma etapa para cultivar as células precursoras do nervo do trato intestinal em um meio incluindo um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4.

Description

1 / 63 MÉTODOS PARA PRODUZIR PRECURSORES NEURAIS ENTÉRICOS, PARA PRODUZIR UM ORGANOIDE INTESTINAL, PARA PRODUZIR

UM TRATO INTESTINAL ARTIFICIAL E DE EXPANSÃO DE CULTURA PARA PRECURSORES NEURAIS ENTÉRICOS, PRECURSORES NEURAIS ENTÉRICOS, ESTOQUE CONGELADO, MEDICAMENTO DE CÉLULA, E, MEIO DE PRECURSOR NEURAL

ENTÉRICO [Campo Técnico]

[001] A presente invenção se refere a um método para produzir precursores neurais entéricos e um método de expansão de cultura e um meio para uso nestes métodos. [Fundamentos da Invenção]

[002] As células da crista neural (NCCs) são células que se desenvolvem entre o neuroectoderma e o ectoderma epidérmico quando o tubo neural é formado a partir da placa neural durante o desenvolvimento inicial. Os precursores neurais entéricos (ENPs) são células que se desenvolveram a partir destas NCCs e diferenciaram em uma linhagem de célula de nervo entérico. Os ENPs têm capacidade de diferenciação em células nervosas entéricas e células gliais.

[003] A doença de Hirschsprung, que suprime a motilidade gastrointestinal, é uma doença causada pela aganglionose intestinal congênita. Em anos recentes, uma abordagem fundamental destinada ao tratamento da doença de Hirschsprung pelo autotransplante de ENPs que foram coletados dos pacientes e deixados proliferar ex vivo foi relatada (Literatura Não Patentária 1).

[004] Estudos para induzir NCCs a partir das células-tronco pluripotentes tais como as células-tronco pluripotentes indutíveis (iPSCs) e adicionalmente induzir ENPs a partir das NCCs foram feitos para a produção de medicamento de células contendo ENPs.

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[005] Por exemplo, a Literatura Não Patentária 2 estabelece que progenitores do sistema nervoso entérico foram preparados a partir das células-tronco pluripotentes humanas. A Literatura Não Patentária 2 não divulga precursores neurais entéricos positivos em PHOX2B nem descreve a neurregulina-1 (NRG1).

[006] A Literatura Não Patentária 3 estabelece que os precursores da célula de Schwann foram preparados pelo cultivo de iPSCs humanas em um meio contendo um inibidor de TGFβ, um inibidor de GSK3β e NRG1. O método descrito na Literatura Não Patentária 3 não utiliza ácido retinoico e os precursores da célula de Schwann resultantes são células diferentes dos ENPs (por exemplo, os ENPs são positivos para a expressão de PHOX2B, ao passo que os precursores da célula de Schwann descritos na literatura são negativos para tal). [Lista de Citação] [Literatura Não Patentária]

[007] [Literatura Não Patentária 1] “Postnatal human enteric neuronal progenitors can migrate, differentiate, and proliferate in embryonic and postnatal aganglionic gut environments”, Pediatric Research, 2017, 81, 5, 838-846 [Literatura Não Patentária 2] “Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease”, Nature, 2016, 531, 105-109 [Literatura Não Patentária 3] “Schwann Cell Precursors from Human Pluripotent Stem Cells as a Potential Therapeutic Target for Myelin Repair”, Stem Cell Reports, 2017, 8, 1714-1726 [Sumário da Invenção] [Problema Técnico]

[008] Uma técnica capaz de suprir ENPs em grandes quantidades é exigida para a obtenção de terapia celular, etc. usando ENPs. Embora um

3 / 63 método para induzir progenitores do sistema nervoso entérico a partir das células-tronco pluripotentes humanas tenha sido relatado como mencionado acima (Literatura Não Patentária 2), uma abordagem para a proliferação e cultura de expansão de ENPs induzidos não foi ainda desenvolvida.

[009] Um objetivo principal da presente invenção é prover uma técnica para permitir que ENPs proliferem enquanto mantêm a sua capacidade de diferenciação em células nervosas entéricas e células gliais (multipotência). [Solução para o Problema]

[0010] De modo a alcançar o objetivo, a presente invenção provê os seguintes [1] a [27].

[0011] [1] Um método para produzir precursores neurais entéricos, compreendendo as etapas de: (A1) prover precursores neurais entéricos; (A2) cultivar os precursores neurais entéricos em um meio compreendendo um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4.

[0012] [2] O método para produzir de acordo com [1], em que o meio compreende ainda um inibidor de TGFβ e um inibidor de GSK3β.

[0013] [3] O método para produzir de acordo com [1] ou [2], em que o meio compreende ainda ácido retinoico e/ou um derivado do mesmo.

[0014] [4] O método para produzir de acordo com qualquer um de [1] a [3], em que o meio compreende ainda GDNF.

[0015] [5] O método para produzir de acordo com qualquer um de [1] a [4], em que o meio compreende ainda Matrigel.

[0016] [6] O método para produzir de acordo com qualquer um de [1] a [5], em que o agonista de ERBB3 e/ou o agonista de ERBB4 é NRG1.

[0017] [7] Precursores neurais entéricos obtidos por um método para produzir de acordo com qualquer um de [1] a [6].

[0018] [8] Um estoque congelado compreendendo precursores neurais

4 / 63 entéricos de acordo com [7].

[0019] [9] Um medicamento de célula compreendendo precursores neurais entéricos de acordo com [7].

[0020] [10] Um método para produzir precursores neurais entéricos, compreendendo as etapas de: (B1) prover células da crista neural; (B2) cultivar as células da crista neural em um meio compreendendo um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4 e ácido retinoico e/ou um derivado do mesmo.

[0021] [11] O método para produzir de acordo com [10], em que as células da crista neural são células da crista neural vagal.

[0022] [12] O método para produzir de acordo com [11], em que as células da crista neural vagal são positivas em SOX10, positivas em HOXB5, negativas em HOXB9 e negativas em PHOX2B, e os precursores neurais entéricos são positivos em SOX10 e positivos em PHOX2B.

[0023] [12a] O método para produzir de acordo com qualquer um de

[10] a [12], em que o meio compreende ainda um inibidor de TGFβ e/ou um inibidor de GSK3β.

[0024] [12b] O método para produzir de acordo com qualquer um de

[10] a [12a], em que o meio compreende ainda ácido retinoico e/ou um derivado do mesmo.

[0025] [12c] O método para produzir de acordo com qualquer um de

[10] a [12b], em que o meio compreende ainda GDNF.

[0026] [12d] O método para produzir de acordo com qualquer um de

[10] a [12c], em que o meio compreende ainda Matrigel.

[0027] [12e] O método para produzir de acordo com qualquer um de

[10] a [12d], em que o agonista de ERBB3 e/ou o agonista de ERBB4 é NRG1.

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[0028] [12f] Precursores neurais entéricos obtidos por um método para produzir de acordo com qualquer um de [10] a [12e].

[0029] [13] Um meio de precursor neural entérico compreendendo um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4.

[0030] [14] O meio de acordo com [13], adicionalmente compreendendo um inibidor de TGFβ e/ou um inibidor de GSK3β.

[0031] [15] O meio de acordo com [13] ou [14], adicionalmente compreendendo ácido retinoico e/ou um derivado do mesmo.

[0032] [16] O meio de acordo com qualquer um de [13] a [15], adicionalmente compreendendo GDNF.

[0033] [17] O meio de acordo com qualquer um de [13] a [16], adicionalmente compreendendo Matrigel.

[0034] [18] O meio de acordo com qualquer um de [13] a [17], em que o agonista de ERBB3 e/ou o agonista de ERBB4 é NRG1.

[0035] [19] Um método de expansão de cultura para precursores neurais entéricos, compreendendo as etapas de: (C1) prover precursores neurais entéricos; e (C2) cultivar os precursores neurais entéricos em um meio compreendendo um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4.

[0036] [20] Um método para produzir um organoide intestinal, compreendendo a etapa de cocultivar precursores neurais entéricos e células do intestino grosso.

[0037] [21] Um método para produzir um trato intestinal artificial, compreendendo as etapas de: cocultivar precursores neurais entéricos e células do intestino grosso para se obter um organoide intestinal; e transplantar o organoide intestinal dentro de um corpo vivo para formar um trato intestinal artificial.

[0038] [21a] Um método para produzir um trato intestinal artificial, compreendendo as etapas de: cocultivar precursores neurais entéricos e

6 / 63 células do intestino grosso para se obter um organoide intestinal; e transplantar o organoide intestinal dentro de um corpo vivo mamífero não humano para formar um trato intestinal artificial.

[0039] [22] O método para produzir de acordo com qualquer um de

[20] a [21a], em que os precursores neurais entéricos são precursores neurais entéricos obtidos por um método para produzir de acordo com qualquer um de

[1] a [6].

[0040] [23] Um organoide intestinal obtido por um método para produzir de acordo com [20] ou [22].

[0041] [24] Um trato intestinal artificial obtido por um método para produzir de acordo com qualquer um de [21] a [22].

[0042] [25] Um aditivo para um meio de precursor neural entérico, compreendendo um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4.

[0043] [26] Uso de um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4 para a cultura de expansão de precursores neurais entéricos.

[0044] [27] O aditivo de acordo com [25] ou o uso de acordo com

[26], em que o agonista de ERBB3 e/ou o agonista de ERBB4 é NRG1.

[0045] Na presente invenção, “células da crista neural (NCCs)” são células que desenvolvem entre o neuroectoderma e o ectoderma epidérmico quando o tubo neural é formado a partir da placa neural durante o desenvolvimento inicial. Estas células têm multipotência para diferenciar em muitos tipos de células tais como células nervosas, células gliais, células estrômicas mesenquimatosas, células ósseas, condrócitos, células corneais e células pigmentares e a capacidade para autoproliferar. As NCCs são positivas em SOX10.

[0046] As “células da crista neural craniana (NCCs craniana)” são uma população de célula que emerge mais perto do lado craniano do que da vesícula auricular durante o desenvolvimento e diferencia no osso facial, cartilagem e nervo, etc. As células da crista neural craniana são células

7 / 63 positivas para um marcador de célula da crista neural SOX10 e negativas para um grupo de genes HOXB (HOXB1-10).

[0047] As “células da crista neural vagal (NCCs vagais)” são uma população de células que emergem de um sítio correspondente ao 1o ao 7o segmentos durante o desenvolvimento e diferencia no sistema de nervo entérico, etc. As células da crista neural vagal são positivas para um marcador de célula da crista neural SOX10 e são positivas em HOXB5, negativas em HOXB9 e negativas em PHOX2B. Preferivelmente, estas células são positivas em SOX10 e são positivas em HOXB1-7, negativas em HOXB9, negativas em HOXB10 e negativas em PHOX2B.

[0048] As “células-tronco da crista neural (NCCs troncos)” são uma população de células que emergem a partir de um sítio correspondendo ao 8o segmento para a extremidade caudal durante o desenvolvimento e diferenciam no sistema nervoso automático, nervo sensorial, células pigmentares e células da cromafin cortical adrenal, etc. As células-tronco da crista neural são positivas para um marcador de célula da crista neural SOX10 e são positivas em HOXB1-9, negativas em HOXB10 e negativas em PHOX2B.

[0049] As “células sacrais da crista neural (NCCs sacrais)” são uma população de células que emergem a partir de um sítio correspondente à extremidade caudal extrema durante o desenvolvimento e diferenciam em um sistema nervoso entérico parcial do intestino grosso, etc. As células sacrais da crista neural são positivas para um marcador de célula da crista neural SOX10 e são positivas em HOXB1 a 10 e negativas em PHOX2B.

[0050] Os “precursores neurais entéricos (ENPs)” são células que emergem pela diferenciação das células da crista neural vagal e células sacrais da crista neural e são positivas para os marcadores da célula da crista neural e célula glial SOX10 e PHOX2B. Os ENPs têm capacidade de diferenciação nas células nervosas entéricas positivas em PHOX2B e negativas em SOX10 e células gliais positivas em S100β, positivas em PLP1 e positivas em

8 / 63 SOX10.

[0051] As “células nervosas entéricas” são derivadas de precursores neurais entéricos e são positivas em PHOX2B e negativas em SOX10.

[0052] As “células gliais” são positivas em S100β, positivas em PLP1 e positivas em SOX10, ou são positivas em GFAP. Como aqui usada, as células gliais também são aludidas como, particularmente, “células gliais entéricas”. As células gliais entéricas podem ser obtidas, por exemplo, permitindo-se que os precursores neurais entéricos se diferenciem em células gliais.

[0053] O “meio de precursor neural entérico” é um meio que é usado para a produção de ENPs e/ou a cultura de expansão de ENPs. A produção de ENPs pode incluir a diferenciação das células-tronco tais como as células iPS, células ES e NCCs em ENPs.

[0054] “Organoide intestinal” é uma estrutura de tecido preparada in vitro e significa uma estrutura de tecido tendo uma ou mais de uma pluralidade de funções possuídas pelos intestinos de mamíferos tais como seres humanos (por exemplo, uma função de movimento peristáltico, uma função secretora de muco e uma função de absorção de substância) ou funções similares a estas. O organoide intestinal é constituído por uma população de células compreendendo, por exemplo, células da origem de várias células constituindo o trato intestinal, tais como as células do intestino grosso e células do intestino anterior e pelo menos um tipo de célula selecionada a partir de várias células constituindo o trato intestinal, tais como células do intestino grosso, células do intestino anterior, células nervosas entéricas, precursores neurais entéricos, células-tronco intestinais (positivas em LGR5), células de Paneth (positivas em LYZ), células de goblet (positivas em Mucina) e células secretoras e células da origem destas células.

[0055] O “trato intestinal artificial” é uma estrutura de tecido obtida pelo transplante de um organoide intestinal dentro de um corpo vivo de

9 / 63 mamífero humano ou não humano e maturando o organoide intestinal e significa uma estrutura de tecido tendo uma ou mais de uma pluralidade de funções possuídas pelos intestinos de mamíferos tais como seres humanos (por exemplo, uma função de movimento peristáltico, uma função de secreção de muco e uma função de absorção de substância) ou funções similares a estas. O trato intestinal artificial é preparado, por exemplo, pelo transplante de um organoide intestinal dentro do corpo (por exemplo, a cavidade peritoneal) de um mamífero tal como um camundongo, seguido por um lapso de um dado período. O trato intestinal artificial compreende uma população de célula compreendendo, por exemplo, células da origem de várias células constituindo o trato intestinal, tais como células do intestino grosso e células do intestino anterior e pelo menos um tipo de célula selecionada a partir de várias células constituindo o trato intestinal, tais como células do intestino grosso, células do intestino anterior, células nervosas entéricas, precursores neurais entéricos, células-tronco intestinais (positivas em LGR5), células de Paneth (positivas em LYZ), células de goblet (positivas em Mucina) e células secretoras e células da origem destas células. O trato intestinal artificial pode compreender ainda, por exemplo, células musculares e células de marcapasso. Neste caso, as células nervosas são arranjadas entre as células musculares.

[0056] As “células do intestino grosso” são células que emergem pela diferenciação do endoderma no curso de desenvolvimento e são definidas por serem positivas em CDX2. Uma massa de célula do intestino grosso pode compreender as células do intestino grosso assim como células epiteliais (positivas em E-caderina) e células mesenquimatosas (positivas em vimentina).

[0057] O “endoderma definitivo” é uma célula que emerge pela diferenciação da linha primitiva anterior no curso de desenvolvimento e é definida por ser positiva em SOX17 e positiva em FOXA2.

[0058] O “ERBB3” é um receptor da tirosina cinase codificada pelo

10 / 63 gene ERBB3 e é um membro da família de receptor de EGF. O ERBB3 é também chamado de HER3 (receptor do fator de crescimento epidérmico humano 3). O ERBB3 forma um heterodímero com ERBB2 e ativa os cinese caminhos da sinalização envolvidas na proliferação ou diferenciação das células. O ERBB3 é conhecido ser expresso em precursores neurais entéricos. O ERBB3 é conhecido ter variantes de junção. O ERBB3 de acordo com a presente invenção abrange estas variantes sem limitações particulares.

[0059] O “agonista de ERBB3” pode ser qualquer substância tendo a capacidade para ativar um caminho de sinalização a jusante (atividade agonista de ERBB3) pela ligação ao ERBB3 e pode incluir uma proteína, um peptídeo, um ácido nucléico e um composto molecular baixo e seus derivados, etc. O agonista de ERBB3 é, por exemplo, uma proteína tal como NRG1, NRG2 e NRG6. A proteína tal como NRG1, NRG2 e NRG6 pode ser uma proteína de tamanho completo ou pode ser um fragmento do mesmo tendo atividade agonista de ERBB3.

[0060] O “ERBB4” é um receptor da tirosina cinase codificado pelo gene ERBB4 e é um membro da família de receptor de EGF. O ERBB4 é também chamado de HER4 (receptor do fator de crescimento epidérmico humano 4). O ERBB4 forma um heterodímero com ERBB2 e ativa os caminhos da sinalização envolvidas na proliferação ou diferenciação das células. O ERBB4 é conhecido ter várias variantes de junção. O ERBB4 de acordo com a presente invenção abrange estas variantes sem limitações particulares.

[0061] O “agonista de ERBB4” pode ser qualquer substância tendo a capacidade para ativar um caminho da sinalização a jusante (atividade agonista de ERBB4) pela ligação ao ERBB4 e pode incluir uma proteína, um peptídeo, um ácido nucléico e um composto molecular baixo e seus derivados, etc. O agonista de ERBB4 é, por exemplo, uma proteína tal como NRG1, NRG2, NRG3, NRG4, NRG5, BTC, EPR e HBEGF. A proteína tal

11 / 63 como NRG1-5, BTC, EPR e HBEGF pode ser uma proteína de tamanho completo ou pode ser um fragmento da mesma tendo atividade agonista de ERBB4.

[0062] “Neurregulina-1 (NRG1)” é um fator de crescimento semelhante a EGF codificado pelo gene NRG1. A NRG1 também é chamada heregulina. NRG1 é conhecida ativar um caminho de sinalização a jusante pela ligação a ERBB3 e ERBB4.

[0063] O “fator neurotrófico derivado da linhagem de célula glial (GDNF)” é um fator codificado pelo gene GDNF e atua como um agonista de GFRα1 e RET. GDNF é conhecido estar associado com a proteção de células nervosas e células gliais e a proliferação de precursores neurais entéricos.

[0064] “Matrigel” é uma preparação de membrana de base solúvel extraída do sarcoma de camundongo Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) rico em proteína de matriz extracelular. A Matrigel é composta principalmente de laminina, colágeno IV, proteoglicano sulfato de heparana e entactina/nidogen 1 e 2. A Matrigel contém, além destes componentes principais, TGFβ, um fator de crescimento de célula epitelial (EGF), um fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), um fator de crescimento de fibroblasto (FGF), ativadores de plasminogênio tecidual 3 e 4 e outros fatores de crescimento naturalmente produzido no tumor de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS).

[0065] A “cultura” se refere à manutenção, proliferação (crescimento) e/ou diferenciação de células em ambiente in vitro. “Cultivar” significa manter as células e/ou permitir que as células proliferem (cresçam) e/ou diferenciem do tecido ou do corpo, por exemplo, em uma placa de cultura de célula ou um frasco.

[0066] “Cultura de expansão” significa cultura com o objetivo de permitir uma população de célula desejada para proliferar e aumentar um número de célula. O aumento no número de célula pode ser obtido através do número aumentado de células pela proliferação excedendo o número

12 / 63 diminuído de células pela morte e não requer a proliferação de todas as células na população de célula. O aumento no número de célula pode ser 1,1 vezes, 1,2 vezes, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, ou 30 vezes ou mais quando comparado com um número de célula antes do início da cultura de expansão.

[0067] A “cultura de manutenção” significa a cultura de uma população de célula desejada com o seu número de célula mantido. A manutenção do número de célula pode ser obtida pela sobrevivência de células sem proliferação ou pode ser obtida pelo equilíbrio entre o número aumentado de células pela proliferação e o número diminuído de células pela morte. A manutenção do número de célula não requer que as células sejam mantidas completamente no mesmo número. Substancialmente o mesmo número de células pode ser mantido em função do objetivo da presente invenção.

[0068] “População de célula” significa duas ou mais células do mesmo tipo ou tipos diferentes. “População de célula” também significa uma massa de células do mesmo tipo ou tipos diferentes.

[0069] “Cultura aderente” significa cultura em um estado onde as células são fixadas a um recipiente, por exemplo, em um estado onde as células são fixadas a uma placa de cultura de célula ou um frasco fabricado de um plástico esterilizado (ou plástico revestido) na presença de um meio apropriado.

[0070] “Cultura em suspensão” significa cultura em um estado onde as células são dispersas em um meio apropriado sem serem fixadas a um recipiente.

[0071] “Pluripotência” significa a capacidade de ser capaz de diferenciar em tecidos e células tendo vários formatos e funções diferentes e ser capaz de diferenciar em células de qualquer linhagem das 3 camadas germinativas. “Pluripotência” é diferente de “totipotência”, que é a

13 / 63 capacidade para ser capaz de diferenciar em qualquer tecido do corpo vivo, incluindo a placenta, em que as células pluripotentes não podem diferenciar dentro da placenta e portanto, não têm a capacidade para formar um indivíduo.

[0072] “Multipotência” significa a capacidade para ser capaz de diferenciar em números plurais e números limitados de linhagens de células. Por exemplo, células-tronco mesenquimatosas, células-tronco hematopoiéticas, célula-tronco neurais são multipotentes, mas não pluripotentes. As ENPs têm multipotência para diferenciar em células nervosas e células gliais.

[0073] “Marcador” é “proteína marcadora” ou “gene marcador” e significa uma proteína que é especificamente expressa na superfície da célula, no citosol e/ou no núcleo de um tipo de célula predeterminado ou um gene do mesmo. O marcador pode ser um marcador de seleção positivo ou um marcador de seleção negativo. Preferivelmente, o marcador é um marcador de superfície celular. Particularmente, um marcador de seleção positiva em superfície celular permite a concentração, isolação e/ou detecção de células vivas.

[0074] A proteína marcadora pode ser detectada pelo uso de ensaio imunológico, por exemplo, ELISA, imunotingimento ou citometria de fluxo, usando um anticorpo específico para a proteína marcadora. Um anticorpo que se liga a uma sequência de aminoácido específica da proteína marcadora ou uma cadeia de açúcar específica ligada à proteína marcadora, etc. pode ser usado como o anticorpo específico para a proteína marcadora. No caso de uma proteína marcadora intracelularmente expressa que não aparece na superfície das células (por exemplo, um fator de transcrição ou uma subunidade do mesmo), a proteína marcadora de interesse pode ser detectada pela expressão da proteína marcadora com uma proteína repórter e detectando a proteína repórter (por exemplo, Literatura Não Patentária 4). Este método

14 / 63 pode ser preferivelmente usado quando um marcador da superfície de célula apropriado não é encontrado. O gene marcador pode ser detectado pelo uso de um método de amplificar e/ou detectar ácido nucléico conhecido na técnica, por exemplo, RT-PCR, microarranjo, biochip ou RNAseq.

[0075] A “expressão” é definida como transcrição e/ou tradução de uma certa sequência de nucleotídeo conduzida por um promotor intracelular.

[0076] O termo “positivo” ou “expressando” significa que uma proteína ou um gene é expresso em uma quantidade detectável por uma abordagem conhecida na técnica. A proteína pode ser detectada pelo uso de ensaio imunológico, por exemplo, ELISA, imunotingimento ou citometria de fluxo, usando um anticorpo. No caso de uma proteína intracelularmente expressa que não aparece na superfície das células (por exemplo, um fator de transcrição ou uma subunidade do mesmo), a proteína de interesse pode ser detectada pela expressão da proteína com uma proteína repórter e detectando a proteína repórter. O gene pode ser detectado pelo uso de um método de amplificar e/ou detectar ácido nucléico, por exemplo, RT-PCR, microarranjo, biochip ou RNAseq.

[0077] O termo “negativo” ou “não expresso” significa que o nível de expressão de uma proteína ou um gene é menor do que o limite inferior de detecção com base em toda ou qualquer uma das abordagens conhecidas como descritas acima. O limite inferior de detecção da expressão de uma proteína ou um gene pode diferir dependendo de cada abordagem.

[0078] “SOX10” é verificado ser expresso em todas das células da crista neural, precursores neurais entéricos e células gliais derivadas dos mesmos. Por outro lado, SOX10 não é expresso nas células nervosas entéricas.

[0079] “HOXB5” é expresso nas células da crista neural vagal, células-tronco da crista neural e células sacrais da crista neural e conhecido ser necessário para o desenvolvimento normal das células nervosas entéricas.

15 / 63 Por outro lado, HOXB5 não é expresso nas células da crista neural craniana.

[0080] “HOXB9” é expresso nas células-tronco da crista neural e células sacrais da crista neural. Por outro lado, HOXB9 não é expresso nas células da crista neural craniana e células da crista neural vagal.

[0081] “PHOX2B” é verificado ser expresso em precursores neurais entéricos e células nervosas entéricas derivadas dos mesmos.

[0082] “GFAP (proteína ácida fibrilar glial)” é expressa em células gliais. Por outro lado, GFAP não é expresso nos precursores neurais entéricos e células nervosas entéricas.

[0083] O termo “compreende(m)” ou “compreendendo” se refere à inclusão do(s) elemento(s) seguindo a palavra sem limitações para isto. Assim, isto sugere a inclusão do(s) elemento(s) a seguir da palavra, mas não sugere a exclusão de qualquer outro elemento.

[0084] O termo “cerca de” ou “em torno de” se refere a um valor que pode variar até mais ou menos 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% do valor de referência. Preferivelmente, o termo “cerca de” ou “em torno” se refere a uma faixa de menos ou mais 15%, 10%, 5% ou 1% do valor de referência. [Efeitos Vantajosos da Invenção]

[0085] A presente invenção provê uma técnica para permitir que ENPs proliferem enquanto mantém a sua capacidade de diferenciação em células nervosas entéricas e células gliais. [Descrição Resumida dos Desenhos]

[0086] [Figura 1] A Figura 1 é um diagrama mostrando um método para produzir ENPs de acordo com a segunda modalidade da presente invenção.

[0087] [Figura 2] A Figura 2 é um diagrama mostrando um perfil de expressão de gene de células da crista neural vagal obtidas pela diferenciação de iPSCs humanas. A Figura 2(A) mostra os níveis de expressão de HOXB2,

16 / 63 HOXB3, HOXB4, HOXB5, HOXB7 e HOXB9. A Figura 2(B) mostra os níveis de expressão de SOX10 e EDNRB. A ordenada mostra os níveis de expressão (alteração numérica) pelos valores de uma razão indicada em log2 com os níveis de expressão nas células da crista neural craniana definidos como 1.

[0088] [Figura 3] A Figura 3 é um diagrama mostrando a alteração dependente do tempo no número de células acumuladas quando as células da crista neural vagal foram subcultivadas em um meio de precursor neural entérico.

[0089] [Figura 4] A Figura 4 é um diagrama mostrando resultados da análise de citometria de fluxo nas células obtidas pelo cultivo de da crista neural vagal em um meio de precursor neural entérico. A Figura 4(A) mostra a expressão de SOX10-tdTomato e PHOX2B-emGFP nas células da crista neural vagal nos 11 dias de cultura. A Figura 4(B) mostra a expressão de SOX10-tdTomato e PHOX2B-emGFP nos precursores neurais entéricos no número de passagens (1 a 6 passagens).

[0090] [Figura 5] A Figura 5 é um diagrama mostrando imagens fluorescentes de células obtidas pelo cultivo de células da crista neural vagal em um meio de precursor neural entérico ou este meio exceto quanto a NRG1 ou GDNF e os resultados da análise de expressão no SOX10-tdTomato e PHOX2B-emGFP pela citometria de fluxo. Nas imagens fluorescentes, a cor vermelha representa a fluorescência de SOX10-tdTomato e a cor verde representa a fluorescência de PHOX2B-emGFP.

[0091] [Figura 6] A Figura 6 é um diagrama mostrando um perfil de expressão de gene de células obtidas pelo cultivo de células da crista neural vagal em um meio de precursor neural entérico. EDNRB e RET representam “receptor de endotelina tipo B” e “proto-oncogene ret”, respectivamente.

[0092] [Figura 7] A Figura 7 mostra imagens do imunotingimento fluorescente de células obtidas pelo cultivo de precursores neurais entéricos

17 / 63 em um meio de indução de nervo entérico. Nas imagens de imunotingimento fluorescente, a cor verde representa a fluorescência de PHOX2B-emGFP e a cor púrpura representa a expressão de Chat, nNOS, GABA ou 5-HT.

[0093] [Figura 8] A Figura 8 mostra imagens de imunotingimento fluorescente de um trato intestinal artificial formado a partir de um organoide intestinal. As células positivas em PHOX2B-emGFP e SOX10-tdTomato derivadas a partir de precursores neurais entéricos são mostradas. A imagem direita superior é uma vista parcialmente ampliada da imagem esquerda superior e a imagem direita inferior é uma vista parcialmente ampliada da imagem à esquerda inferior. Nas imagens de imunotingimento fluorescente, a cor vermelha representa a fluorescência de SOX10-tdTomato, a cor verde representa a fluorescência de PHOX2B-emGFP e a cor azul representa um núcleo.

[0094] [Figura 9] A Figura 9 mostra imagens de imunotingimento fluorescente de um trato intestinal artificial formado a partir de um organoide intestinal. As células nervosas ou células gliais positivas em S100β (A), positivas em GFAP (B) ou positivas em TUBB3 (C) derivadas de precursores neurais entéricos são mostradas. Nas imagens de imunotingimento fluorescente, a cor vermelha representa a fluorescência de SOX10-tdTomato, a cor verde representa a fluorescência de PHOX2B-emGFP, a cor amarela representa a expressão de S100β, GFAP ou TUBB3 e a cor azul representa um núcleo.

[0095] [Figura 10] A Figura 10 é um gráfico mostrando resultados da medição de respostas contráteis e relaxantes para a estimulação elétrica de um trato intestinal artificial formado a partir de um organoide intestinal.

[0096] [Figura 11] A Figura 11 é um gráfico mostrando resultados da medição de respostas contráteis e relaxantes à estimulação elétrica de um trato intestinal artificial formado a partir de um organoide intestinal.

[0097] [Figura 12] A Figura 12 é um gráfico mostrando resultados da

18 / 63 medição de respostas contráteis e relaxantes à estimulação elétrica de um trato intestinal artificial formado a partir de um organoide intestinal.

[0098] [Figura 13] A Figura 13 mostra resultados da avaliação da capacidade proliferativa e capacidade de diferenciação dos precursores neurais entéricos congelados-descongelados depois da cultura de expansão. A Figura 13(A) mostra alteração dependente do tempo no número de célula durante a cultura de expansão (esquerda) e alteração dependente do tempo na razão de precursores neurais entéricos para todas as células (direita). A Figura 13(B) mostra resultados de analisar a expressão de PHOX2B e SOX10 pela citometria de fluxo nos precursores neurais entéricos (ENP, esquerda) e células nervosas entéricas (ENS, direita) obtidos pela diferenciação das mesmas. A Figura 13(C) mostra imagens de imunotingimento fluorescente de células nervosas entéricas e células gliais obtidas pela diferenciação de precursores neurais entéricos. Nas imagens de imunotingimento fluorescente, a cor verde representa a fluorescência de PHOX2B-emGFP ou a expressão de GFAP e a cor púrpura representa a expressão de periferina, Chat, nNOS, GABA, TH ou SST.

[0099] [Figura 14] A Figura 14 mostra uma imagem de imunotingimento fluorescente de células gliais obtida pela diferenciação de precursores neurais entéricos depois da cultura de expansão.

[00100] [Figura 15] A Figura 15 mostra imagens de imunotingimento fluorescente de um sítio de transplante depois de um lapso de 1 semanas do transplante de precursores neurais entéricos depois da cultura de expansão para parede cecal de camundongo. Nas imagens de imunotingimento fluorescente, a cor azul representa um núcleo, a cor verde representa a fluorescência de PHOX2B-emGFP, a cor vermelha representa a fluorescência de SOX10-tdTomato e a cor púrpura representa a expressão de TUBB3. A Figura 15b é uma vista parcialmente ampliada da Figura 15a. [Descrição Detalhada da Invenção]

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[00101] Daqui em diante, modos adequados para realizar a presente invenção serão descritos. As modalidades descritas abaixo são dadas meramente para ilustrar as modalidades típicas da presente invenção. O escopo da presente invenção não deve ser interpretado como estando limitado por estas modalidades.

[00102] Os presentes inventores verificaram que os precursores neurais entéricos (ENPs) podem ser deixados proliferar pelo cultivo dos ENPs na presença de um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4 enquanto a sua capacidade de diferenciação nas células nervosas entéricas e células gliais é mantida.

[00103] Com base nesta verificação, a primeira modalidade da presente invenção provê um método para produzir ENPs, compreendendo as seguintes etapas (A1) e (A2): (A1) prover ENPs; e (A2) cultivar os ENPs em um meio compreendendo um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4.

[00104] Os ENPs proliferam na etapa (A2). A partir deste ponto de vista, o método para produzir ENPs de acordo com a primeira modalidade é sinônimo com um método de expansão de cultura para ENPs.

[00105] No método para produzir ENPs de acordo com a presente invenção, ENPs podem ser obtidos pela diferenciação e proliferação de células da crista neural (NCCs). A partir deste ponto de vista, a segunda modalidade da presente invenção provê um método para produzir ENPs, compreendendo as seguintes etapas (B1) e (B2): (B1) prover NCCs; e (B2) cultivar as NCCs em um meio compreendendo um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4 e ácido retinoico e/ou um derivado do mesmo.

[00106] A terceira modalidade da presente invenção provê um método

20 / 63 de expansão de cultura para ENPs, compreendendo as seguintes etapas (C1) e (C2): (C1) prover ENPs; e (C2) cultivar os ENPs em um meio compreendendo um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4.

[00107] Daqui em diante, as etapas (A1) e (A2) do método para produzir ENPs de acordo com a primeira modalidade, as etapas (B1) e (B2) do método para produzir ENPs de acordo com a segunda modalidade e as etapas (C1) e (C2) do método de expansão de cultura para ENPs de acordo com a terceira modalidade serão descritas na ordem. [Método para produzir de acordo com a primeira modalidade (método envolvendo a etapa de proliferação de ENP)] [Primeira modalidade; etapa (A1): etapa de prover precursores neurais entéricos]

[00108] Nesta etapa, ENPs são providos. Nesta etapa, pelo menos ENPs podem ser providos. Uma única célula de ENP, uma população de células de ENPs ou uma população de células compreendendo ENPs pode ser provida.

[00109] Os ENPs a serem providos nesta etapa podem ser ENPs comercialmente obtidos, podem ser ENPs separados de um corpo vivo ou podem ser ENPs induzidos a partir de NCCs, etc. por um método mencionado mais tarde. Os ENPs comercialmente obtidos podem ser ENPs em um estado cultivado ou podem ser ENPs em um estado congelado. Quando os ENPs são ENPs induzidos a partir de NCCs, etc., os ENPs também podem estar em um estado cultivado ou em um estado congelado.

[00110] Por exemplo, um método de cortar um tecido de trato intestinal em 1 mm quadrado, realizando o tratamento enzimático (Dispase e colagenase tipo XI, 37°C, 90 min) e depois cultivar as células obtidas em um meio contendo EGF e FGF para separar ENPs como células agregadas é

21 / 63 conhecido como um método para separar ENPs a partir de um corpo vivo. Para a separação, a pureza dos ENPs pode ser realçada pela combinação com a classificação de célula usando um anticorpo anti-CD271. [Primeira modalidade; etapa (A2): etapa de cultivar precursores neurais entéricos]

[00111] Nesta etapa, os ENPs são cultivados em um meio compreendendo um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4.

[00112] O agonista de ERBB3 pode ser qualquer substância tendo a capacidade para ativar um caminho de sinalização a jusante (atividade agonista de ERBB3) pela ligação a ERBB3 e pode incluir uma proteína, um peptídeo, um ácido nucléico e um composto de baixo peso molecular e os seus derivados, etc. O agonista de ERBB3 é, por exemplo, uma proteína tal como NRG1, NRG2 e NRG6. A proteína tal como NRG1, NRG2 e NRG6 pode ser uma proteína de tamanho completo ou pode ser um fragmento da mesma tendo atividade agonista de ERBB3.

[00113] O agonista de ERBB4 pode ser qualquer substância tendo a capacidade para ativar um caminho de sinalização a jusante (atividade agonista de ERBB4) pela ligação a ERBB4 e pode incluir uma proteína, um peptídeo, um ácido nucléico e um composto de peso molecular baixo e seus derivados, etc. O agonista de ERBB4 é, por exemplo, uma proteína tal como NRG1, NRG2, NRG3, NRG4, NRG5, BTC, EPR e HBEGF. A proteína tal como NRG1-5, BTC, EPR e HBEGF pode ser uma proteína de tamanho completo ou pode ser um fragmento do mesmo tendo atividade agonista de ERBB4.

[00114] Uma proteína derivada de ser humano ou uma proteína derivada de um mamífero não humano, por exemplo, um macaco, um porco, gado, uma cabra, ovelha, um camundongo ou um rato é apropriadamente usada como a proteína tal como NRG1, NRG2, NRG3, NRG4, NRG5, NRG6, BTC, EPR e HBEGF de acordo com as espécies da origem das células a

22 / 63 serem cultivadas.

[00115] Estas proteínas podem ser preparadas como proteínas recombinantes pelo uso de uma abordagem biológica molecular usual e podem ser obtidas como reagentes comercialmente disponíveis.

[00116] O agonista de ERBB3 e o agonista de ERBB4 são preferivelmente NRG1 ou um fragmento do mesmo tendo atividade agonista de ERBB3 ou atividade agonista de ERBB4.

[00117] A sequência de aminoácido de tamanho completo de NRG1 humana é mostrada na SEQ ID NO: 1 (número de acesso NCBI: NP_039250).

[00118] Os exemplos do fragmento de NRG1 tendo atividade agonista de ERBB3 ou atividade agonista de ERBB4 incluem fragmentos de 10 a 300, 20 a 150 ou 30 a 100 aminoácidos derivados da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1.

[00119] O fragmento de NRG1 pode ser, por exemplo, um fragmento compreendendo um domínio de ligação de ERBB3 ou ERBB4 (domínio semelhante a EGF). O domínio de ligação está supostamente localizado nas posições de aminoácido de 190 a 220 na SEQ ID NO: 1.

[00120] NRG1 e o fragmento da mesma podem ser preparados como proteínas recombinantes pelo uso de uma abordagem biológica molecular usual e podem ser obtidos como reagentes comercialmente disponíveis. Um fragmento de NRG1 compreendendo um domínio de ligação de ERBB3 ou ERBB4 (domínio semelhante a EGF) é comercialmente disponível (por exemplo, Herregulina Humana Recombinante β-1, Número de Catálogo: 100- 03, PeproTech, Inc.).

[00121] NRG1 ou o fragmento da mesma podem consistir de uma sequência de aminoácido modificada derivada da sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 1 ou uma sequência parcial da mesma pela deleção, substituição, inserção ou adição de um ou diversos aminoácidos e têm atividade agonista de ERBB3 ou atividade agonista de ERBB4.

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[00122] Neste contexto, o termo “diversos” significa 20 ou menos, preferivelmente 10 ou menos, mais preferivelmente 5 ou menos, de modo adicionalmente preferido 3 ou menos, o mais preferivelmente 2.

[00123] A sequência de aminoácido modificada pode ser uma sequência de aminoácido tendo 80% ou mais alto, preferivelmente 85% ou mais alto, mais preferivelmente 90% ou mais alto, de modo adicionalmente preferido 95% ou mais alto, o mais preferivelmente 98% ou mais alto de identidade com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1. A identidade de uma sequência de aminoácido pode ser calculada com uma ferramenta de análise de uso geral. Por exemplo, BLAST provido pelo National Center for Biotechnology Information (NCBI) pode ser utilizado.

[00124] NRG1 ou o fragmento da mesma podem ser uma proteína de fusão com uma outra proteína ou uma proteína modificada ligada com uma outra molécula contanto que a proteína possa reter a atividade agonista de ERBB3 ou atividade agonista de ERBB4.

[00125] A atividade agonista de ERBB3 ou atividade agonista de ERBB4 de um fragmento de proteína ou semelhante pode ser avaliada usando um kit comercialmente disponível. Por exemplo, Ensaio Funcional de ERBB2-ERBB3 PathHunter(R) ou Ensaio Funcional de ERBB4 PathHunter(R) (ambos da DiscoverX Corp.) é usado. Uma linhagem de célula contida no kit é cultivada na presença de um candidato agonista tendo concentrações variáveis, seguido pela medição da atividade β-galactosidase. Um candidato que exiba um alto valor da atividade de β-galactosidase tem atividade agonista.

[00126] A concentração do agonista de ERBB3 e/ou do agonista de ERBB4 no meio nesta etapa é apropriadamente ajustado dependendo do tipo do agonista de ERBB3 e/ou do agonista de ERBB4 a ser adicionado. A concentração pode ser, por exemplo, de 1 a 1000 ng/mL, preferivelmente 50 a 200 ng/mL.

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[00127] No caso de usar NRG1 como o agonista de ERBB3 e/ou o agonista de ERBB4, a sua concentração no meio pode ser, por exemplo, de 1 a 1000 ng/mL, preferivelmente 50 a 200 ng/mL, de modo particularmente preferível cerca de 100 ng/mL.

[00128] O meio pode compreender um inibidor de TGFβ e um inibidor de GSK3β.

[00129] O “inibidor de TGFβ” é uma substância tendo atividade inibidora contra TGFβ (fator de crescimento transformador β). O TGFβ é uma ligação de citocina para dois tipos de receptores de serina/treonina proteína cinase e controla a proliferação de célula, diferenciação de célula, morte de célula, etc. através da transdução de sinal, principalmente, para a ativação de Smad (R-Smad). Os exemplos da substância tendo atividade inibidora de TGFβ incluem substâncias inibidoras da ligação de TGFβ ao seu receptor e substâncias inibindo os sinais a jusante depois da ligação de TGFβ ao seu receptor. Os exemplos dos sinais a jusante incluem a fosforilação do receptor de TGFβI pelo receptor de TGFβII e a fosforilação de Smad pelo receptor de TGFβI fosforilado. O “inibidor de TGFβ” usado na presente invenção não é particularmente limitado contanto que o inibidor de TGFβ tenha atividade inibidora de TGFβ.

[00130] Os exemplos do inibidor de TGFβ incluem SB431542 (4-[4- (1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1H-imidazol-2-il]-benzamida), A83-01 (4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1H-imidazol-2-il]-benzamida), LDN193189 (4-[6-[4-(1-piperazinil)fenil]pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il]- quinolina), GW788388 (4-[4-[3-(2-piridinil)-1H-pirazol-4-il]-2-piridinil]-N- (tetra-hidro-2H-piran-4-il)-benzamida), SM16 (4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5- (6-metil-2-piridinil)-1H-imidazol-2-il]-biciclo[2,2,2]octano-1-carboxamida), IN-1130 (3-[[5-(6-metil-2-piridinil)-4-(6-quinoxalinil)-1H-imidazol-2-il]- metil]-benzamida), GW6604 (2-fenil-4-[3-(piridin-2-il)-1H-pirazol-4- il]piridina) e SB505124 (2-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-2-(1,1-dimetiletil)-1H-

25 / 63 imidazol-5-il]-6-metil-piridina). Dois ou mais destes inibidores de TGFβ podem ser usados em combinação.

[00131] A concentração do inibidor de TGFβ no meio nesta etapa é apropriadamente ajustada dependendo do tipo do inibidor de TGFβ a ser adicionado. A concentração pode ser, por exemplo, de 0,1 a 50 µM, preferivelmente 1 a 20 µM.

[00132] No caso de usar SB431542 (4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2- piridinil)-1H-imidazol-2-il]-benzamida) como o inibidor de TGFβ, a sua concentração no meio pode ser, por exemplo, de 1 a 100 µM, preferivelmente 5 a 20 µM, de modo particularmente preferível cerca de 10 µM.

[00133] O “inibidor de GSK3β” é uma substância tendo atividade inibidora contra GSK3β (glicogênio sintase cinase 3β). GSK3 (glicogênio sintase cinase 3) é uma serina/treonina proteína cinase e envolvida em muitos dos caminhos da sinalização associados com a produção de glicogênio, apoptose, manutenção de célula-tronco, etc. GSK3 tem as 2 isoformas α e β. O “inibidor de GSK3β” usado na presente invenção não é particularmente limitada contanto que o inibidor de GSK3β tem atividade inibidora de GSK3β. O inibidor de GSK3β pode ser uma substância tendo tanto atividade inibidora de GSK3βy quanto atividade inibidora de GSK3α.

[00134] Os exemplos do inibidor de GSK3β incluem CHIR98014 (N6- [2-[[4-(2,4-diclorofenil)-5-(1H-imidazol-1-il)-2-pirimidinil]amino]etil]-3- nitro-2,6-piridinodiamina), CHIR99021 (6-{2-[4-(2,4-diclorofenil)-5-(5- metil-1H-imidazol-2-il)pirimidin-2-ilamino]etilamino}nicotinonitrila), CP21R7 (3-(3-aminofenil)-4-(1-metil-1H-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona), LY2090314 (3-[9-fluoro-1,2,3,4-tetra-hidro-2-(1-piperidinilcarbonil)pirrolo- [3,2,1-jk][1,4]benzodiazepin-7-il]-4-imidazo[1,2-a]piridin-3-il-1h-pirrol-2,5- diona), TDZD-8 (4-benzil-2-metil-1,2,4-tiadiazolidino-3,5-diona), SB216763 (3-(2,4-diclorofenil)-4-(1-metil-1H-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona), TWS- 119 (ditrifluoroacetato de 3-[[6-(3-aminofenil)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-

26 / 63 il]oxifenol), kenpaullone, 1-azakenpaullone, SB415286 (3-[(3-cloro-4- hidroxifenil)-amino]-4-(2-nitrofenil)-1H-pirrol-2,5-diona), AR-AO144-18 (1- [(4-metoxifenil)metil]-3-(5-nitro-1,3-tiazol-2-il)ureia), CT99021, CT20026, BIO ((2’Z,3’E)-6-bromoindirrubin-3’-oxima), BIO-acetoxima, complexos de piridocarbazol-ciclopentadienil rutênio, OTDZT, alfa-4-dibromoacetofenona e lítio. Dois ou mais destes inibidores de GSK3β podem ser usados em combinações.

[00135] O inibidor de GSK3β não é limitado a estas substâncias. Por exemplo, um oligonucleotídeo antissentido ou siRNA contra GSK3β mRNA, um anticorpo ligando ao GSK3β ou um mutante de GSK3β negativo dominante também pode ser usado como o inibidor de GSK3β. Estes inibidores de GSK3β estão comercialmente disponíveis ou podem ser sintetizados de acordo com um método conhecido.

[00136] A concentração do inibidor de GSK3β no meio nesta etapa é apropriadamente ajustada dependendo do tipo do inibidor de GSK3β a ser adicionado. A concentração pode ser, por exemplo, de 0,1 a 10 µM, preferivelmente 0,5 a 2 µM.

[00137] No caso de usar CHIR99021 como o inibidor de GSK3β, a sua concentração no meio pode ser, por exemplo, de 0,1 a 10 µM, preferivelmente 0,5 a 2 µM, de modo particularmente preferível cerca de 1 µM.

[00138] O meio nesta etapa pode compreender ainda qualquer um ou mais de ácido retinoico (RA) e/ou um derivado do mesmo (daqui em diante, também simplesmente aludido como “RA, etc.”), fator neurotrófico derivado da linhagem de célula glial (GDNF) e Matrigel.

[00139] Retinol, retinal, retinoína, isorretinoína, alitretinoína, etretinato, acitretina, tazaroteno, bexaroteno ou adapaleno podem ser usados como o derivado do ácido retinoico (RA). Dois ou mais destes derivados podem ser usados em combinações.

[00140] A concentração de RA, etc. no meio nesta etapa é

27 / 63 apropriadamente ajustada dependendo do tipo do RA, etc. a ser adicionado. A concentração pode ser, por exemplo, de 0,001 a 50 µM, preferivelmente 0,1 a 10 µM.

[00141] No caso de usar RA como RA, etc., a sua concentração no meio pode ser, por exemplo, de 0,001 a 50 µM, preferivelmente 0,1 a 10 µM, de modo particularmente preferível cerca de 1 µM.

[00142] A concentração de GDNF no meio nesta etapa pode ser, por exemplo, de 1 a 1000 ng/mL, preferivelmente 50 a 200 ng/mL.

[00143] A concentração de Matrigel no meio nesta etapa é, por exemplo, de 0,2 a 20% (v/v), preferivelmente 1 a 4% (v/v), de modo particularmente preferível cerca de 2% (v/v).

[00144] O meio basal não é particularmente limitado. Por exemplo, uma mistura das soluções A e B de StemFit AK03 (Ajinomoto Healthy Supply Co., Inc.), meio TeSR1 e meio de Meio Quimicamente Definido (CDM) são adequadamente usados. Além disso, por exemplo, meio BME, meio BGJb, meio CMRL 1066, meio Glasgow MEM, meio MEM melhorado (IMEM), meio MDM melhorado (IMDM), meio de Meio 199, meio MEM de Eagle, meio αMEM, meio DMEM (alta glicose ou baixa glicose), meio DMEM/F12, meio de Ham, meio RPMI 1640, meio de Fischer e meios misturados dos mesmos podem ser usados.

[00145] O meio CDM não é particularmente limitado. Por exemplo, um meio preparado a partir do meio de Dulbecco modificado de Iscove (fabricado pela GE Healthcare Japan Corp.) pode ser usado.

[00146] O meio basal pode ser suplementado com uma substância para uso na cultura de célula usual, tal como apotransferrina, monotioglicerol, albumina sérica bovina (BSA), insulina e/ou um antibiótico.

[00147] ENPs podem ser cultivados para a proliferação com a sua multipotência mantida pelo cultivo dos ENPs em um meio compreendendo um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4 e de modo

28 / 63 preferivelmente adicional compreendendo qualquer um ou mais de um inibidor de TGFβ, um inibidor de GSK3β, RA, etc., GDNF e Matrigel.

[00148] O período de cultura nesta etapa pode ser um período no qual ENPs proliferam para atingir o número de célula de interesse. Este período de cultura não é particularmente limitado e pode ser, por exemplo, 7 dias ou mais longo, 10 dias ou mais longo, 14 dias ou mais longo, 20 dias ou mais longo, 25 dias ou mais longo, 30 dias ou mais longo, 40 dias ou mais longo, 50 dias ou mais longo, 60 dias ou mais longo, 70 dias ou mais longo, 80 dias ou mais longo, 90 dias ou mais longo, 7 a 100 dias ou 100 dias ou mais longo.

[00149] A taxa de proliferação das células neste período alcança uma taxa tão alta quanto cerca de 75 horas em termos de um tempo de duplicação de célula.

[00150] Esta etapa é preferivelmente realizada pela cultura aderente e pode ser realizada pela cultura em suspensão.

[00151] Para a cultura aderente, um recipiente de cultura, por exemplo, uma placa, um frasco, uma microplaca ou uma folha de cultura de célula tal como OptiCell (nome do produto, Nunc), é usado.

[00152] O recipiente para uso na cultura aderente pode ser tratado na superfície de modo a melhorar a adesividade das células (hidrofilicidade) ou revestido com um substrato para a adesão de célula tal como colágeno, gelatina, poli-L-lisina, poli-D-lisina, laminina, fibronectina, Matrigel ou vitronectina. Um recipiente sem tal tratamento de superfície ou revestimento é mais preferivelmente usado.

[00153] Na cultura em suspensão, as células são dispersas dentro de um meio e uma massa de célula agregada é formada enquanto os componentes do meio e a concentração de oxigênio interna do meio são uniformizados pela agitação ou sacudidela. A taxa de agitação adequada é apropriadamente ajustada de acordo com uma densidade de célula e o tamanho de um recipiente de cultura. A agitação ou sacudidela excessivas

29 / 63 coloca estresse físico sobre as células e inibe a formação de massa de célula agregada. Assim, a taxa de agitação ou sacudidela é controlada de modo a ser capaz de uniformizar os componentes do meio e a concentração de oxigênio interna do meio e de modo a não inibir a formação de massa de célula agregada. A cultura de suspensão pode ser realizada pelo repouso imóvel sem agitação ou sacudidela.

[00154] Para a cultura em suspensão, é preferido usar um recipiente com revestimento de baixa adesão tal como superfície Prime (nome do produto, Sumitomo Bakelite Co., Ltd.).

[00155] A temperatura da cultura não é particularmente limitada e pode ser de 30 a 40°C (por exemplo, 37°C). Uma concentração de dióxido de carbono no recipiente de cultura pode ser da ordem de, por exemplo, 5%. [Método para produzir de acordo com a segunda modalidade (método envolvendo a diferenciação de NCCs em ENPs e proliferação de ENPs)] [Segunda modalidade; etapa (B1): etapa de prover células da crista neural]

[00156] Nesta etapa, as NCCs são providas. Nesta etapa, pelo menos NCCs podem ser providas. Uma única célula NCC, uma população de células NCC ou uma população de células compreendendo NCCs podem ser providas.

[00157] As NCCs a serem providas nesta etapa podem ser NCCs comercialmente obtidas, podem ser NCCs separadas de um corpo vivo ou podem ser NCCs obtidas pela diferenciação de célula-tronco, etc. As NCCs comercialmente obtidas podem ser NCCs em um estado cultivado ou podem ser NCCs em um estado congelado. Quando as NCCs são NCCs obtidas pela diferenciação de célula-tronco, etc., as NCCs também podem estar em um estado cultivado ou em um estado congelado.

[00158] Os exemplos das NCCs comercialmente disponíveis incluem as Células da bainha da Raiz Externa do Folículo Capilar Humano (fabricado pela Cosmo Bio Co., Ltd.) e Linhagem de Célula da Crista Neural Craniana

30 / 63 de camundongo O9-1 (fabricada pela Merck Millipore).

[00159] As NCCs supostamente existem nos corpos vivos de mamíferos, por exemplo, tubo neural embrionário humano em torno de 30 dias depois da fertilização, tubo neural embrionário de camundongo em torno do 9o dia fetal e pele adulta de ser humano, de suíno e roedor (Betters et al., Developmental biology, 2010, 344 (2): 578-592; Jiang et al., Development, 2000, 127 (8): 1607-1616; Dupin et al., Developmental biology, 2012, 366 (1): 83-95; e Nagoshi et al., Cell Stem Cell 2, Abril 2008, 392-403). As NCCs podem ser coletadas pelo uso de um método conhecido (por exemplo, Motohashi et al., Biology open, 2016, 5: 311-322; e Pfaltzgraff et al., Journal of Visualized Experiments, 2012, 64: 4134) e submetidas a esta etapa.

[00160] Os exemplos da célula-tronco para uso na diferenciação nas NCCs incluem células-tronco pluripotentes. As “células-tronco pluripotentes” que podem ser usadas na presente invenção se referem à célula-tronco que podem diferenciar em tecidos e células tendo vários formatos e funções diferentes e têm a capacidade de diferenciar em células de qualquer linhagem das 3 camadas germinativas (endoderma, mesoderma e ectoderma). Os exemplos das mesmas incluem, mas não são particularmente limitadas à célula-tronco embrionária (ESCs), célula-tronco embrionária derivada de embriões clonados obtidos pelo transplante nuclear, célula-tronco espermatogonial, células germinativas embrionárias e células-tronco pluripotentes induzidas (aqui também aludidas como “iPSCs”). A “célula- tronco multipotente” que pode ser usada na presente invenção se refere à célula-tronco tendo a capacidade de ser capaz de diferenciar em números plurais e limitados de linhagens de células. Os exemplos da “célula-tronco multipotente” que pode ser usada na presente invenção incluem célula-tronco da polpa dentária, célula-tronco derivada da mucosa oral, célula-tronco do folículo capilar e célula-tronco somática derivada de fibroblastos cultivados ou célula-tronco da medula óssea. As células-tronco pluripotentes são

31 / 63 preferivelmente ESCs e iPSCs.

[00161] As “ESCs” disponíveis incluem ESCs de murino tais como várias linhagens de ESC de murino estabelecidas pela inGenious Targeting Laboratory, Riken (Institute of Physical and Chemical Research) e semelhantes e ESCs humanas tais como várias linhagens de ESC humanas estabelecidas pela University of Wisconsin, NIH, Riken, Kyoto University, National Center for Child Health and Development, Cellartis e semelhantes. Por exemplo, as linhagens CHB-1 a CHB-12, linhagem RUES1, linhagem RUES2 e linhagens HUES1 a HUES28 distribuídas pela ESI Bio, linhagem H1 e linhagem H9 distribuídas pela WiCell Research e linhagem KhES-1, linhagem KhES-2, linhagem KhES-3, linhagem KhES-4, linhagem KhES-5, linhagem SSES1, linhagem SSES2 e linhagem SSES3 distribuídas pela Riken podem ser usadas como as linhagens de ESC humanas.

[00162] As “células-tronco pluripotentes induzidas” se referem às células que são obtidas pela reprogramação de células somáticas mamíferas ou célula-tronco não diferenciadas pela introdução de fatores particulares (fatores de reprogramação nuclear). No presente, existem várias “células- tronco pluripotentes induzidas” e iPSCs estabelecidas por Yamanaka, et al. pela introdução dos 4 fatores Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc dentro de fibroblastos de murino (Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663- 676); iPSCs derivadas de células humanas, estabelecidas pela introdução similar de 4 fatores dentro dos fibroblastos humanos (Takahashi K, Yamanaka S., et al. Cell, (2007) 131: 861-872.); Nanog-iPSCs estabelecidas pela classificação de células usando a expressão de Nanog como um indicador depois da introdução dos 4 fatores (Okita, K., Ichisaka, T. e Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317); iPSCs produzidas por um método não usando c-Myc (Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101-106); iPSCs estabelecidas pela introdução de 6 fatores por um método livre de vírus (Okita K et al. Nat. Methods maio de 2011; 8(5): 409-12, Okita

32 / 63 K et al. Stem Cells. 31 (3) 458-66); e semelhantes também podem ser usadas. Também, células-tronco pluripotentes induzidas estabelecidas pela introdução dos 4 fatores OCT3/4, SOX2, NANOG e LIN28 por Thomson et al. (Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.); células-tronco pluripotentes induzidas produzidas por Daley et al. (Park IH, Daley GQ et al., Nature (2007) 451: 141-146); células-tronco pluripotentes induzidas produzidas por Sakurada et al. (Publicação de Pedido de Patente Não Examinado Japonês No. 2008-307007) e semelhantes podem ser usadas.

[00163] Além disso, qualquer uma das células-tronco pluripotentes induzidas conhecidas na técnica descritas em todos os artigos publicados (por exemplo, Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol 3, Edição 5, 568- 574; Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650; Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No. 7, 795-797) ou patentes (por exemplo, Publicação de Pedido de Patente Não Examinado Japonês No. 2008-307007, Publicação de Pedido de Patente Não Examinado Japonês No. 2008-283972, US2008-2336610, US2009-047263, WO2007- 069666, WO2008-118220, WO2008-124133, WO2008-151058, WO2009- 006930, WO2009-006997, WO2009-007852) podem ser usadas.

[00164] As linhagens de células pluripotentes induzidas disponíveis incluem várias linhagens de iPSC estabelecidas pela NIH, Riken, Kyoto University e semelhantes. Os exemplos de tais linhagens de iPSC humana incluem a linhagem HiPS-RIKEN-1A, linhagem HiPS-RIKEN-2A, linhagem HiPS-RIKEN-12A e linhagem Nips-B2 da Riken e linhagem253G1, linhagem 201B7, linhagem409B2, linhagem 454E2, linhagem 606A1, linhagem 610B1, linhagem 648A1, linhagem 1231A1 e linhagem 1231A3 da Kyoto University. linhagem 1231A1 e linhagem 1231A3 são preferidas e a linhagem 1231A3 é a mais preferida.

[00165] A diferenciação de célula-tronco em NCCs pode ser realizada de acordo com um método conhecido descrito em uma literatura (por

33 / 63 exemplo, Literatura Não Patentária 2). As etapas exemplares para permitir que as iPSCs humanas diferenciem em NCCs são mostradas na Figura 1. Primeiro, as iPSCs são semeadas em uma placa ou semelhante, cultivadas aderentes e depois cultivadas aderentes em um meio compreendendo um inibidor de TGFβ e um inibidor de GSK3β (Figura 1, etapa i) e deste modo permitidas diferenciar em NCCs pela cultura aderente em um meio adicionalmente suplementada com RA e/ou um derivado do mesmo (etapa ii).

[00166] A concentração do inibidor de TGFβ no meio nesta etapa é apropriadamente ajustada dependendo do tipo do inibidor de TGFβ a ser adicionado. A concentração pode ser, por exemplo, de 0,1 a 50 µM, preferivelmente 1 a 20 µM.

[00167] No caso de usar SB431542 (4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2- piridinil)-1H-imidazol-2-il]-benzamida) como o inibidor de TGFβ, a sua concentração no meio pode ser, por exemplo, de 1 a 100 µM, preferivelmente 5 a 20 µM, de modo particularmente preferível cerca de 10 µM.

[00168] A concentração do inibidor de GSK3β no meio nesta etapa é apropriadamente ajustada dependendo do tipo do inibidor de GSK3β a ser adicionado. A concentração pode ser, por exemplo, de 0,1 a 10 µM, preferivelmente 0,5 a 2 µM.

[00169] No caso de usar CHIR99021 como o inibidor de GSK3β, a sua concentração no meio pode ser, por exemplo, de 0,1 a 10 µM, preferivelmente 0,5 a 2 µM, de modo particularmente preferível cerca de 1 µM.

[00170] A célula-tronco pode ser deixada diferenciar em células da crista neural craniana (NCCs cranianas), células da crista neural vagal (NCCs vagais), células-tronco da crista neural (NCCs tronco) ou células da crista neural sacral (NCCs sacral) de acordo com a concentração de RA, etc. no meio na etapa ii.

[00171] Por exemplo, no caso de deixar as iPSCs humanas diferenciar em células da crista neural craniana, RA, etc. não é adicionado.

34 / 63

[00172] No caso de deixar as iPSCs humanas diferenciar nas células da crista neural vagal ou células-tronco da crista neural, a concentração de RA, etc. no meio é, por exemplo, de 0,001 a 50 µM, preferivelmente 0,1 a 10 µM.

[00173] Entretanto, a concentração de RA, etc. no meio é apropriadamente ajustada dependendo do tipo do RA, etc. a ser adicionado.

[00174] Para obter ENPs tendo alta capacidade de diferenciação em células nervosas entéricas e células gliais na etapa subsequente (B2), a diferenciação em células da crista neural vagal (NCCs vagal) é preferida.

[00175] O período de cultura em um meio compreendendo um inibidor de TGFβ e um inibidor de GSK3β (Figura 1, etapa i) pode ser, por exemplo, de 0 a 12 dias e pode ser, particularmente, de cerca de 6 dias.

[00176] O período de cultura em um meio adicionalmente suplementado com RA, etc. (etapa ii) pode ser, por exemplo, de 1 a 12 dias e pode ser, particularmente, de cerca de 5 dias.

[00177] O meio basal mencionado acima pode ser usado.

[00178] O recipiente de cultura mencionado acima pode ser usado na cultura aderente.

[00179] O recipiente de cultura é preferivelmente tratado na superfície de modo a melhorar a adesividade das células (hidrofilicidade) ou revestido com um substrato para a adesão de célula tal como colágeno, gelatina, poli-L- lisina, poli-D-lisina, laminina, fibronectina, Matrigel ou vitronectina.

[00180] A temperatura de cultura não é particularmente limitada e é de 30 a 40°C (por exemplo, 37°C). Uma concentração de dióxido de carbono no recipiente de cultura é, por exemplo, de cerca de 5%. [Segunda modalidade; etapa (B2): etapa de cultivar células da crista neural]

[00181] Nesta etapa, as NCCs são cultivadas em um meio compreendendo um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4 e ácido retinoico e/ou um derivado do mesmo (Figura 1, etapa iii). As NCCs aqui usadas são preferivelmente células da crista neural vagal (NCCs vagais).

35 / 63

[00182] O agonista de ERBB3, o agonista de ERBB4 e RA, etc. usados e as suas concentrações no meio podem ser os mesmos como na etapa (A2).

[00183] O meio pode compreender ainda um inibidor de TGFβ e/ou um inibidor de GSK3β.

[00184] O inibidor de TGFβ e o inibidor de GSK3β usados e as suas concentrações no meio podem ser as mesmas como na etapa (A2).

[00185] O meio pode compreender ainda qualquer um ou mais do GDNF e Matrigel.

[00186] As concentrações de GDNF e Matrigel no meio e o meio basal usado também podem ser os mesmos como na etapa (A2).

[00187] Esta etapa é preferivelmente realizada pela cultura aderente e pode ser realizada pela cultura em suspensão, como na etapa (A2).

[00188] Os ENPs podem ser deixados proliferar com a sua multipotência mantida pelo cultivo dos ENPs em um meio compreendendo um agonista de ERBB3 e um agonista de ERBB4 e RA, etc. e de modo preferivelmente adicional compreendendo qualquer um ou mais de um inibidor de TGFβ, um inibidor de GSK3β, GDNF e Matrigel.

[00189] O período de cultura nesta etapa pode ser um período no qual os ENPs proliferam para atingir o número de célula de interesse. Este período de cultura não é particularmente limitado e pode ser, por exemplo, de 7 dias ou mais longo, 10 dias ou mais longo, 14 dias ou mais longo, 20 dias ou mais longo, 25 dias ou mais longo, 30 dias ou mais longo, 40 dias ou mais longo, 50 dias ou mais longo, 60 dias ou mais longo, 70 dias ou mais longo, 80 dias ou mais longo, 90 dias ou mais longo, 7 a 100 dias ou 100 dias ou mais longo.

[00190] A taxa de proliferação das células neste período alcança uma taxa tão alta quanto cerca de 75 horas em termos de um tempo de duplicação de célula. [Método de cultura por expansão de acordo com a terceira modalidade] [Terceira modalidade; etapa (C1): etapa de prover precursores neurais

36 / 63 entéricos]

[00191] Nesta etapa, os ENPs são providos.

[00192] Os ENPs a serem providos nesta etapa podem ser os mesmos como na etapa (A1). [Terceira modalidade; etapa (C2): etapa de cultivar precursores neurais entéricos]

[00193] Nesta etapa, os ENPs são cultivados em um meio compreendendo um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4.

[00194] O agonista de ERBB3 e/ou o agonista de ERBB4 usados e as suas concentrações no meio podem ser os mesmos como na etapa (A2).

[00195] O meio pode compreender ainda um inibidor de TGFβ e um inibidor de GSK3β.

[00196] O inibidor de TGFβ e o inibidor de GSK3β usados e as suas concentrações no meio podem ser os mesmos como na etapa (A2).

[00197] O meio pode compreender ainda qualquer um ou mais de RA, etc., fator neurotrófico derivado da linhagem de célula glial (GDNF) e Matrigel.

[00198] O RA, etc. usados e a concentração do RA, etc. a ser adicionada podem ser o mesmo como na etapa (A2).

[00199] As concentrações de GDNF e Matrigel no meio e o meio basal usado também pode ser o mesmo como na etapa (A2).

[00200] Esta etapa é preferivelmente realizada pela cultura aderente e pode ser realizada pela cultura em suspensão, como na etapa (A2).

[00201] Os ENPs podem ser cultivados pela proliferação com a sua multipotência mantida pelo cultivo dos ENPs em um meio compreendendo um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4 e RA, etc. e de modo preferivelmente adicional compreendendo qualquer um ou mais de um inibidor de TGFβ, um inibidor de GSK3β, GDNF e Matrigel.

[00202] O período de cultura nesta etapa pode ser um período no qual

37 / 63 os ENPs proliferam para atingir o número de célula de interesse. Este período de cultura não é particularmente limitado e pode ser, por exemplo, de 7 dias ou mais longo, 10 dias ou mais longo, 14 dias ou mais longo, 20 dias ou mais longo, 25 dias ou mais longo, 30 dias ou mais longo, 40 dias ou mais longo, 50 dias ou mais longo, 60 dias ou mais longo, 70 dias ou mais longo, 80 dias ou mais longo, 90 dias ou mais longo, 7 a 100 dias ou 100 dias ou mais longo.

[00203] A taxa de proliferação das células neste período alcança uma taxa tão alta quanto cerca de 75 horas em termos de um tempo de duplicação de célula. [Meio de precursor neural entérico]

[00204] A presente invenção também provê um meio de ENP para uso no método para produzir ENPs ou o método de expansão de cultura mencionado acima. A composição preferida do meio é como mencionada acima. A produção de ENPs pode incluir a diferenciação de célula-tronco tal como iPSCs, ESC e NCCs em ENPs.

[00205] Em um aspecto da presente invenção, o meio de precursor neural entérico compreende um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4. Em um outro aspecto da presente invenção, o meio de precursor neural entérico pode compreender um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4 assim como um inibidor de TGFβ e/ou um inibidor de GSK3β e preferivelmente compreende um inibidor de TGFβ e um inibidor de GSK3β. Em um aspecto alternativo da presente invenção, o meio de precursor neural entérico pode compreender um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4 assim como GDNF. Em um aspecto alternativo da presente invenção, o meio de precursor neural entérico pode compreender um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4 assim como Matrigel. Em um aspecto alternativo da presente invenção, o meio de precursor neural entérico pode compreender um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4 assim como GDNF e Matrigel. Em um aspecto alternativo da presente invenção, o

38 / 63 meio de precursor neural entérico pode compreender um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4 assim como um inibidor de TGFβ, um inibidor de GSK3β, GDNF e Matrigel. Estes meios de precursor neural entérico podem compreender ainda RA, etc. As concentrações do agonista de ERBB3 e/ou do agonista de ERBB4, do inibidor de TGFβ, do inibidor de GSK3β, GDNF, Matrigel e RA, etc. no meio de precursor neural entérico pode cada um ser o mesmo como na etapa (A2).

[00206] Em um aspecto alternativo, a presente invenção também provê um meio aditivo de ENP compreendendo um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4 e o uso de um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4 para a cultura de expansão de ENP. [Precursores neurais entéricos]

[00207] O método para produzir ENPs ou o método de expansão de cultura de acordo com a presente invenção podem produzir grandes quantidades de ENPs que mantêm a sua capacidade de diferenciação em células nervosas entéricas e células gliais (multipotência).

[00208] Os “ENPs que mantêm multipotência” podem ser avaliados por uma pluralidade de métodos. Os exemplos dos métodos incluem, mas não são particularmente limitados a um método de causar a diferenciação dos ENPs a serem avaliados em células nervosas entéricas e células gliais. Contanto que os ENPs a serem avaliados possam de fato ser diferenciados em células nervosas entéricas e células gliais, os ENPs a serem avaliados podem ser determinados como os “ENPs que mantém a multipotência”.

[00209] Um outro exemplo do método inclui um método de medir a expressão de uma proteína marcadora ou gene. Contanto que os fatores de transcrição SOX10 e PHOX2B sejam expressos nos ENPs a serem avaliados, os ENPs a serem avaliados podem ser determinados como os “ENPs que mantêm multipotência”.

[00210] SOX10 e PHOX2B podem ser detectados pelo uso de ensaio

39 / 63 imunológico, por exemplo, ELISA, imunotingimento ou citometria de fluxo, usando um anticorpo específico para a proteína marcadora. O gene marcador pode ser detectado pelo uso de um método de amplificar e/ou detectar ácido nucléico conhecido na técnica, por exemplo, RT-PCR, microarranjo ou biochip. Quando as células têm um inserto de uma sequência de nucleotídeo codificando uma proteína repórter (por exemplo, Nano-Lantern (Saito K. et al., “Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging.” Nat. Commun., 2012; 3: 1262)) a jusante dos genes SOX10 e PHOX2B e expressam a proteína repórter ou a sua proteína de fusão de SOX10, etc. sob o controle do promotor SOX10 ou semelhante, um método para detectar a proteína repórter (por exemplo, medir a intensidade de fluorescência) pode ser usado. [Medicamento de célula e estoque congelado]

[00211] Os ENPs obtidos pelo método para produzir ou pelo método de expansão de cultura de acordo com a presente invenção podem ser aplicados a um medicamento de célula para a prevenção ou tratamento de uma doença causada pela deficiência ou anormalidade nas células nervosas entéricas. Os exemplos de uma tal doença incluem doença de Hirschsprung, acalasia de esôfago, gastroparesia, estenose pilórica hipertrófica congênita, pseudo-obstrução intestinal idiopática crônica, constipação neuropática e doença de Chagas.

[00212] Os ENPs contidos no medicamento de célula podem ser, por exemplo, células recuperadas pelo descolamento de células durante a cultura ou podem ser células congeladas em uma solução de criopreservação. As células no mesmo lote obtidas pela cultura de expansão são preferivelmente criopreservadas em pequenas porções e usadas, por exemplo, porque efeitos de trabalho similares são estavelmente obtidos e porque o manuseio é excelente.

[00213] O medicamento de célula pode conter outros componentes tais

40 / 63 como um carreador ou aditivo farmaceuticamente aceitáveis apropriados para um propósito ou uma forma de acordo com um método de rotina. Os exemplos do carreador ou do aditivo incluem agentes de tonicidade, espessantes, açúcares, álcoois de açúcar, antissépticos (preservantes), germicidas ou agentes antimicrobianos, ajustadores de pH, estabilizantes, agentes queladores, bases oleosas, bases em gel, tensoativos, agentes de suspensão, fluidizantes, dispersantes, tampões e antioxidantes.

[00214] O medicamento de célula provê um método para tratar a doença, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do medicamento de célula a um paciente.

[00215] A quantidade terapeuticamente eficaz é a quantidade de ENPs que pode produzir um efeito terapêutico na doença pela administração dos ENPs a um paciente quando comparado com um controle sem a administração. Especificamente, a quantidade terapeuticamente eficaz pode ser apropriadamente ajustada dependendo da forma de dosagem de ENPs, de um método de administração, do propósito de uso e da idade, peso corporal, sintomas, etc. de um paciente. A quantidade eficaz por curso de tratamento em um ser humano (por exemplo, um ser humano adulto) é, por exemplo, de

200.000 a 1.00.000.000 células/kg de peso corporal. Estas células podem ser dispersas em um estado de células únicas, podem ser uma massa de célula (esfera) na qual uma pluralidade de células foi coletada ou pode ser uma mistura das mesmas.

[00216] Os exemplos do método para administrar o medicamento de célula incluem injeção intraperitoneal, injeção subcutânea, injeção dentro do linfonodo, injeção intravenosa, injeção intratorácica, injeção direta para um local de órgão gastrointestinal (por exemplo, o esôfago, o estômago, o duodeno, o intestino delgado, o jejuno, o íleo, o cólon e o reto) pela abertura do abdômen e administração dentro da cavidade retal.

[00217] A presente invenção também provê um estoque congelado

41 / 63 compreendendo ENPs obtidos pelo método para produzir ou pelo método de expansão de cultura mencionado acima.

[00218] O estoque congelado pode ser produzido pela separação dos ENPs do meio pela centrifugação e suspensão dos ENPs em uma solução de criopreservação para congelamento. Um reagente convencional para uso na criopreservação de células pode ser usado como a solução de criopreservação. Por exemplo, Meio de Congelamento Cryostem (marca registrada) e Stemcell Banker GMP Grade (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.) são comercialmente disponíveis.

[00219] O estoque congelado pode ser usado como um material de partida para causar a diferenciação de ENPs para obter células nervosas entéricas e células gliais. Também, o estoque congelado pode ser usado para preparar modelos de tecido tendo ENPs como um constituinte. [Indução de precursores neurais entéricos em células nervosas entéricas ou células gliais]

[00220] Os ENPs obtidos e as células nervosas e células gliais obtidas pela diferenciação dos mesmos por uma abordagem conhecida descrita em uma literatura podem ser úteis como uma preparação de célula para a medicina regenerativa e também pode ser adequadamente usado na construção de vários sistemas de triagem.

[00221] Para a indução de ENPs em células nervosas entéricas, ver, por exemplo, Literatura Não Patentária 2. Também, uma abordagem convencionalmente conhecida (por exemplo, “A novel bidirectional interaction between endothelin-3 and retinoic acid in rat enteric nervous system precursors”, Gisser, J. M. et al., PLosOne 2013) pode ser aplicada à indução de ENPs em células gliais. [Método para produzir organoide intestinal ou trato intestinal artificial]

[00222] O método para produzir um organoide intestinal de acordo com a presente invenção compreende a etapa de cocultivar ENPs e células do

42 / 63 intestino grosso.

[00223] Os ENPs podem ser aqueles obtidos pelo método para produzir ENPs ou o método de expansão de cultura mencionados acima.

[00224] As células do intestino grosso podem ser obtidas pela diferenciação de célula-tronco de acordo com uma abordagem convencionalmente conhecida. Uma abordagem exemplar envolve cultivar células-tronco pluripotentes induzidas humanas em um meio contendo activina A, BMP4 e bFGF para obter o endoderma definido e cultivar o endoderma definitivo em um meio contendo FGF4 e um inibidor de GSK3β para se obter células do intestino grosso.

[00225] O meio basal mencionado acima também pode ser usado como um meio basal para a indução de endoderma definida e para a indução de célula do intestino grosso.

[00226] A concentração de activina A no meio para a indução de endoderma definida pode ser, por exemplo, de 10 a 1000 ng/mL, preferivelmente 50 a 500 ng/mL, mais preferivelmente de cerca de 100 ng/mL. A concentração de BMP4 no meio pode ser, por exemplo, de 1 a 100 ng/mL, preferivelmente 5 a 50 ng/mL, mais preferivelmente de cerca de 10 ng/mL. A concentração de bFGF no meio pode ser, por exemplo, de 1 a 200 ng/mL, preferivelmente de 5 a 100 ng/mL, mais preferivelmente de cerca de 20 ng/mL. O período de cultura pode ser, por exemplo, de 1 a 10 dias, preferivelmente 2 a 6 dias, mais preferivelmente de cerca de 4 dias.

[00227] A concentração de FGF4 no meio para a indução de célula do intestino grosso pode ser, por exemplo, de 10 a 1000 ng/mL, preferivelmente 50 a 500 ng/mL, mais preferivelmente de cerca de 100 ng/mL. No caso de usar, por exemplo, CHIR99021, a concentração do inibidor de GSK3β no meio pode ser, por exemplo, de 1 a 30 µM, preferivelmente 4 a 10 µM, mais preferivelmente de cerca de 6 µM. O período de cultura pode ser, por exemplo, de 4 a 12 dias, preferivelmente 6 a 10 dias, mais preferivelmente de

43 / 63 cerca de 8 dias.

[00228] Uma abordagem convencionalmente conhecida para produzir um organoide intestinal pela cocultura de NCCs e células do intestino grosso pode ser apropriadamente modificada e aplicada à cocultura de ENPs e células do intestino grosso.

[00229] Uma abordagem exemplar envolve inocular células do intestino grosso e ENPs colocados em suspensão em uma solução de Matrigel em uma placa para a formação de gel e adicionando à mesma um meio contendo R-espondina-1, noggin, Wnt3a, EGF, prostaglandina-E2 e um inibidor de ROCK, seguido pela cultura. O organoide intestinal obtido pela cocultura pode ser recolocado em suspensão em uma solução de Matrigel e depois amadurecido pela reaplicação de uma abordagem similar, se necessária.

[00230] Uma outra abordagem exemplar envolve inocular células do intestino grosso colocadas em suspensão em uma solução de Matrigel a uma placa para a formação de gel, adicionando a ela um meio contendo R- espondina-1, noggin, Wnt3a, EGF, prostaglandina-E2 e um inibidor de ROCK, seguido pela cultura para se obter um organoide intestinal, depois temporariamente dispersando o organoide intestinal, misturando a dispersão com uma suspensão de célula de ENPs, centrifugando a solução mista e cultivando as pelotas de célula resultantes em um meio contendo R- espondina-1, noggin, Wnt3a, EGF, prostaglandina-E2 e um inibidor de ROCK. Neste caso também, o organoide intestinal obtido pela cocultura pode ser amadurecido, se necessário.

[00231] O meio basal mencionado acima também pode ser usado como um meio basal para a cocultura de ENPs e células do intestino grosso.

[00232] A concentração de R-espondina-1 no meio pode ser, por exemplo, de 100 a 10.000 ng/mL, preferivelmente 500 a 5000 ng/mL, mais preferivelmente de cerca de 1000 ng/mL.

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[00233] A concentração de noggin no meio pode ser, por exemplo, de 10 a 1000 ng/mL, preferivelmente 50 a 500 ng/mL, mais preferivelmente de cerca de 100 ng/mL.

[00234] A concentração de Wnt3a no meio pode ser, por exemplo, de 10 a 1000 ng/mL, preferivelmente 50 a 500 ng/mL, mais preferivelmente de cerca de 100 ng/mL.

[00235] A concentração de EGF no meio pode ser, por exemplo, de 10 a 1000 ng/mL, preferivelmente 50 a 500 ng/mL, mais preferivelmente de cerca de 100 ng/mL.

[00236] A concentração de prostaglandina-E2 no meio pode ser, por exemplo, de 0,5 a 10 µM, preferivelmente 1 a 5 µM, mais preferivelmente de cerca de 2,5 µM.

[00237] No caso de usar, por exemplo, Y27632, a concentração do inibidor de ROCK pode ser de 1 a 100 µM, preferivelmente 5 a 50 µM, mais preferivelmente de cerca de 10 µM.

[00238] O período de cultura pode ser, por exemplo, de 15 a 40 dias, preferivelmente 20 a 30 dias, mais preferivelmente 24 a 25 dias.

[00239] O método para produzir um trato intestinal artificial de acordo com a presente invenção compreende a etapa de transplantar o organoide intestinal assim obtido dentro de um corpo vivo para formar um trato intestinal artificial.

[00240] O transplante dentro de um corpo vivo não é particularmente limitado e pode ser realizado, por exemplo, pela centrifugação de uma dispersão do organoide intestinal, fixando as pelotas de célula obtidas a um material de suporte apropriado e implantando a suporte dentro da gordura da membrana intestinal. Vários materiais de suporte comercialmente disponíveis podem ser usados. Por exemplo, Neoveil Sheet (Gunze Ltd.) ou poli-L- lactídeo (DURECT Corp.) podem ser usados.

[00241] O animal receptor pode ser um mamífero não humano tal

45 / 63 como um camundongo, um rato, um coelho, um cão, um porco, gado, um cavalo e um macaco ou um animal humano. Preferivelmente, um mamífero não humano é selecionado. Também, um animal imunodeficiente pode ser preferivelmente usado.

[00242] O organoide intestinal assim transplantado diferencia e amadurece no corpo vivo para formar um trato intestinal artificial. Um período necessário para a diferenciação e maturação pode diferir dependendo de um número de célula para transplantação, do material de suporte usado, do animal receptor e um sítio e é, por exemplo, de 5 semanas ou mais longo, preferivelmente 10 semanas ou mais longo, mais preferivelmente de cerca de 13 a 20 semanas.

[00243] O trato intestinal artificial resultante compreende células nervosas e células gliais derivadas de ENPs e pode exibir respostas contráteis e relaxantes à estimulação elétrica.

[00244] As células nervosas no trato intestinal artificial têm funções de contrair o músculo pela produção de acetilcolina e adrenalina, relaxar o músculo pela produção de monóxido de nitrogênio e relaxar o músculo em resposta à estimulação elétrica. [Exemplos] [Exemplo de Teste 1: Cultura de manutenção de iPSCs humanas]

[00245] As iPSCs humanas usadas foram da linhagem 1231A3 (ver Scientific Reports, 2014, 4, 3594).

[00246] As iPSCs foram cultivadas para manutenção usando uma placa revestida com iMatrix 511 Silk (Nippi Inc.) sem o uso de células de alimentação. A cultura foi realizada a 37°C sob 5% de CO2. O meio usado para a cultura de manutenção foi uma mistura das soluções A, B e C de StemFit AK03N (Ajinomoto Healthy Supply Co., Inc.).

[00247] O meio foi substituído todos os dias e as células foram passadas a cada 6 a 7 dias. A passagem foi realizada pela preparação das

46 / 63 iPSCs em células únicas usando TrypLE Select CTS (Life Technologies Corp.) diluídas 2 vezes com solução salina tamponada com fosfato (daqui em diante, aludida como “PBS”) suplementada com 0,5 mM de EDTA, descolando as células da placa e depois inoculando as iPSCs descoladas sobre uma placa fresca revestida com iMatrix 511 Silk. O meio usado para inoculação foi uma mistura das soluções A, B e C de StemFit AK03N suplementada com 10 µM de Y27632 (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.). [Exemplo de Teste 2: Estabelecimento da linhagem de iPSC repórter humana SOX10::tdTomato-PHOX2B::emGFP]

[00248] As iPSCs humanas preparadas como células únicas foram cotransfectadas com um plasmídeo de expressão da SpCas9 D10A nicase, um plasmídeo de expressão SOX10 sgRNA, um plasmídeo doador SOX10-F2A- tdTomato e um plasmídeo de expressão de gene da resistência de puromicina (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.) usando o sistema de Transfecção de Neon (Life Technologies Corp.).

[00249] As células obtidas foram submetidas à seleção por fármaco pelo tratamento com puromicina, depois coleta da colônia e cultura de expansão. Entretanto as colônias obtidas, uma colônia confirmada ter um inserto da sequência de interesse pela PCR foi usado como uma linhagem de SOX10::tdTomato.

[00250] As iPSCs humanas (linhagem SOX10::tdTomato) preparadas como células únicas foram adicionalmente cotransfectadas com uma proteína da SpCas9 D10A nicase, um gRNA de PHOX2B (Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT)), um plasmídeo doador PHOX2B-F2A-emGFP e um plasmídeo de expressão de gene de resistência à puromicina (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.) usando o sistema de Transfecção de Neon (Life Technologies Corp.).

[00251] As células obtidas foram submetidas à seleção por fármaco

47 / 63 pelo tratamento com puromicina, depois da coleta da colônia e cultura de expansão. Entre as colônias obtidas, uma colônia confirmada ter um inserto da sequência de interesse pela PCR foi usada como uma linhagem SOX10::tdTomato-PHOX2B::emGFP. [Exemplo de Teste 3: Diferenciação de iPSCs humanas em células da crista neural vagal] (1) Pré-cultura de iPSCs

[00252] iPSCs humanas (linhagem SOX10::tdTomato- PHOX2B::emGFP) cultivadas pelo método descrito no Exemplo de Teste 1 foram semeadas em uma densidade de 2 a 4 × 104 ou 2,4 a 4,9 × 105 células/poço ou placa respectivamente para uma placa de 6 poços ou uma placa de 10 cm revestida com iMatrix 511 Silk e cultivada a 37°C por 3 a 4 dias sob 5% de CO2 (pré-cultura). A solução de cultura usada para inoculação foi uma mistura das soluções A, B e C de StemFit AK03N suplementada com 10 µM de Y27632 (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.). (2) Diferenciação de iPSCs em células da crista neural vagal

[00253] Depois da pré-cultura, o meio foi substituído com um meio contendo 10 µM de SB431542 (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.) e 1 µM de CHIR99021 (Axon MedChem) (dia 0 da cultura) e as células foram cultivadas a 37°C por 6 dias sob 5% de CO2. Depois, o meio foi substituído com um meio adicionalmente contendo 1 µM de ácido retinoico (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.) e as células foram cultivadas a 37°C por 5 dias sob 5% de CO2 (um total de 11 dias). O meio aqui usado foi uma mistura das soluções A e B de StemFit AK03N. Durante estes períodos de cultura, o meio foi substituído a cada dia.

[00254] As células da crista neural vagal foram obtidas nos 11 dias de cultura.

[00255] As células da crista neural craniana foram induzidas pela cultura de iPSCs sob as mesmas condições como acima exceto que o ácido

48 / 63 retinoico não foi adicionado.

[00256] De modo a examinar a expressão de marcadores de diferenciação de células da crista neural vagal, as células nos 11 dias de cultura foram recuperadas e uma fração de RNA total foi purificada usando RNeasy (Qiagen N.V.). O cDNA foi sintetizado usando o kit de reagente Prime Script RT (Takara Bio Inc.). Depois, a RT-PCR quantitativa foi realizada para medir os níveis de expressão dos marcadores de célula da crista neural vagal SOX10 e receptor de endotelina tipo B (EDNRB) e os genes HOXB2, HOXB3, HOXB4, HOXB5, HOXB7 e HOXB9 entre um grupo de genes HOX definindo informação posicional sobre o eixo anteroposterior. Os níveis de expressão de gene foram determinados como as razões para o nível de expressão de um controle interno GAPDH.

[00257] O nível de expressão de cada gene é mostrado na Figura 2. No desenho, a ordenada mostra a alteração numérica (valores de uma razão indicada em log2 com os níveis de expressão nas células da crista neural craniana definidas como 1). SOX10, EDNRB, HOXB2, HOXB3, HOXB4, HOXB5 e HOXB7 foram expressos ao passo que HOXB9 não foi expresso. Assim, a diferenciação nas células da crista neural vagal foi capaz de ser confirmada. [Exemplo de Teste 4: Diferenciação de células da crista neural vagal em precursores neurais entéricos e cultura de expansão]

[00258] As células (células da crista neural vagal) nos 11 dias de cultura obtidas pelo método do Exemplo de Teste 3 foram dissociadas pelo tratamento enzimático e recuperadas. O tratamento enzimático foi realizado como segue.

[00259] O meio foi aspirado e substituído com PBS. Depois, as células foram descoladas usando um raspador de célula. A massa de célula descolada foi dissociada pela pipetagem em Accutase (Innovative Cell Technologies, Inc.). Depois, Tampão MACS (Miltenyi Biotec) foi adicionado a isso e as

49 / 63 células foram preparadas em células únicas através de uma peneira de célula de 40 µm. A suspensão de célula obtida foi centrifugada a 300 × g por 3 minutos. Depois, o sobrenadante foi removido e as células foram colocadas em suspensão em um meio de precursor neural entérico. O meio de precursor neural entérico usado foi uma mistura de soluções A e B de StemFit AK03N contendo 10 µM de SB431542 (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.), 1 µM de CHIR99021 (Axon MedChem), 1 µM de ácido retinoico (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.), 100 ng/mL de neurregulina 1 (NRG1) (PeproTech, Inc.) e 50 mg/mL de fator neurotrófico derivado de célula glial (GDNF) (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.). Para a cultura aderente, Matrigel (Corning Inc.) foi adicionado a 2% à suspensão de célula, que foi depois cultivada usando uma placa de múltiplos poços (Corning Inc.). Para a cultura em suspensão, uma placa de múltiplos poços (Corning Inc.) tratada para a adesão de célula baixa foi usada. A cultura em ambos os casos foi realizada a 37°C sob 5% de CO2.

[00260] Um método de passagem para cultura aderente será dado abaixo.

[00261] O meio foi aspirado e substituído com PBS. Depois, o PBS foi aspirado. TrypLE Select CTS (Life Technologies Corp.) foi adicionado às células, que foram depois deixadas repousar a 37°C por 10 minutos. Depois, TrypLE Select CTS foi aspirado. Um meio de precursor neural entérico foi adicionado às células, que foram depois dissociadas pela pipetagem.

[00262] As células assim dissociadas foram semeadas em uma densidade de 2 a 10 × 104 células/cm2. Matrigel foi adicionado a 2% (p/v) às células assim semeadas.

[00263] As células obtidas foram passadas uma vez por 1 a 2 semanas. Para cada passagem, um número de células acumuladas, um número de células vivas e um número de células mortas foram contados usando um contador de célula automático. O número de células acumuladas foi calculado

50 / 63 a partir de um número de células vivas semeadas para cada passagem e um número de células vivas obtidos pela passagem seguinte.

[00264] A alteração dependente do tempo no número de células acumuladas é mostrada na Figura 3. As células foram capazes de ser passadas pelo menos 7 vezes e exibiram proliferação de célula linear. [Exemplo de Teste 5: Análise da citometria de fluxo nos precursores neurais entéricos]

[00265] A expressão de SOX10-tdTomato e PHOX2B-emGFP nas células cultivadas no Exemplo de Teste 4 foi analisada para cada passagem pelo uso de citometria de fluxo.

[00266] A dispersão de célula obtida por cada passagem foi centrifugada a 300 × g por 3 minutos. Depois da remoção do sobrenandante, as células foram colocadas em suspensão em HBSS contendo DAPI e 1% de albumina sérica bovina e analisadas usando FACS Aria Fusion (Becton Dickinson Japan).

[00267] Os resultados da análise da expressão de SOX10-tdTomato e PHOX2B-emGFP são mostrados na Figura 4. No desenho, P1 a P6 significam os números de passagens (1 a 6 passagens). A proporção de precursores neurais entéricos coexpressando SOX10-tdTomato e PHOX2B-emGFP foi elevada com o aumento no número de passagens. A proporção dos precursores neurais entéricos foi de 80% ou mais na 5a ou passagens posteriores. [Exemplo de Teste 6: Estudo sobre a composição do meio de precursor neural entérico]

[00268] As células da crista neural vagal foram cultivadas em um meio de precursor neural entérico sob as mesmas condições como no Exemplo de Teste 4 exceto que NRG1 e/ou GDNF não foi adicionado ao meio de precursor neural entérico. As células foram observadas sob um microscópio de fluorescência (BZ-X700, Keyence Corp.). Também, a análise de citometria

51 / 63 de fluxo foi conduzida pelo mesmo método como no Exemplo de Teste 5.

[00269] As imagens fluorescentes das células e os resultados da análise da expressão de SOX10-tdTomato e PHOX2B-emGFP são mostrados na Figura 5. Sob as condições livres de NRG1, a proliferação de célula foi muito lenta e um número de células necessário para conduzir a citometria de fluxo não foi obtido. Sob as condições livres de GDNF, a proliferação de célula foi mais lenta do que sob as condições envolvendo GDNF, embora os precursores neurais entéricos coexpressando SOX10-tdTomato e PHOX2B-emGFP fossem obtidos. [Exemplo de Teste 7: Análise da expressão de gene sobre os precursores neurais entéricos]

[00270] O RNA total foi extraído a partir de células obtidas pelas passagens no Exemplo de Teste 4 e a expressão de gene de marcadores precursores neurais entéricos SOX10, PHOX2B, HOXB5, EDNRB e ret proto-oncogene (RET) foi confirmada. A análise da expressão de gene foi conduzida do mesmo modo como o método mencionado acima.

[00271] Os resultados são mostrados na Figura 6. No desenho, a ordenada mostra os níveis de expressão (razões para o nível de expressão de um controle endógeno GAPDH) ou alteração numérica (valores de uma razão indicada em log2 com os níveis de expressão em iPSCs definidos como 1). As células cultivadas no meio de precursor neural entérico expressam SOX10, PHOX2B, HOXB5, EDNRB e RET mesmo depois das passagens. [Exemplo de Teste 8: Diferenciação de precursores neurais entéricos no sistema nervoso entérico]

[00272] Os precursores neurais entéricos obtidos do mesmo modo como no Exemplo de Teste 4 foram cultivados em um meio para a diferenciação em nervo entérico e deste modo permitiu diferenciar em nervo entérico. O meio para a diferenciação em nervo entérico usado foi o Meio neurobasal (Life Technologies Corp.) suplementado com B27 (Life

52 / 63 Technologies Corp.), suplemento N2 (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.), L-glutamina (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.), penicilina/estreptomicina (Life Technologies Corp.), 100 µM de ácido ascórbico (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.) e 25 ng/mL de GDNF.

[00273] As células nos 40 dias de cultura foram fixadas na temperatura ambiente pela adição de 4% de PFA e submetidas ao imunotingimento fluorescente de modo a avaliara a capacidade de diferenciação em vários subtipos de nervo entérico. As células foram sequencialmente reagidas com um anticorpo anticolina acetiltransferase (Chat) (ab224267, Abcam plc), um anticorpo antióxido nítrico sintases neuronais (nNOS) (ab76067, Abcam plc), um anticorpo antiácido gama-aminobutírico (GABA) (A2052, Sigma-Aldrich Co. LLC) ou um anticorpo anti5-hidroxitriptamina (5-HT) (S5545, Sigma- Aldrich Co. LLC) como um anticorpo primário e adicionalmente com um anticorpo secundário rotulado com Alexa 647 apropriado para um animal imunizado do anticorpo primário como um anticorpo secundário e depois observadas sob um microscópio de fluorescência.

[00274] As imagens de imunotingimento fluorescente são mostradas in Figura 7. Os nervos positivos em Chat, nNOS, GABA e 5-HT foram confirmados e mostraram ter neurônios colinérgicos, neurônios inibidores, neurônios GABAérgicos e neurônios serotonérgicos, respectivamente. Assim, os precursores neurais entéricos obtidos por este método de cultura foram mostrados reter a capacidade de diferenciação em vários subtipos de nervo entérico. [Exemplo de Teste 9: Cultura de manutenção de iPSCs humanas]

[00275] As iPSCs humanas usadas foram da linhagem 253G1 (ver Nature Biotechnology, 2008, 26, (1): 101-106).

[00276] As iPSCs foram cultivadas para manutenção usando uma placa revestida com Proteína Humana Recombinante de Vitronectina (VN-N), Truncada (fabricada pela Thermo Fisher Scientific, Inc.) sem o uso de células

53 / 63 de alimentação. A cultura foi realizada a 37°C sob 5% de CO2.

[00277] O meio usado para a cultura de manutenção foi uma mistura de Meio basal e Suplemento do Kit Essential 8 Flex Medium (Thermo Fisher Scientific, Inc.). O meio foi substituído todos os dias e as células foram passadas a cada 6 a 7 dias.

[00278] A passagem foi realizada pela preparação das iPSCs em células únicas usando PBS suplementado com 0,5 mM de EDTA, descolando as células da placa e depois inoculando as iPSCs descoladas em uma placa nova revestida com Proteína Humana Recombinante de Vitronectina (VN-N), Truncada.

[00279] O meio usado para a inoculação foi uma mistura de Meio basal e Suplemento do Kit Essential 8 Flex Medium suplementado com 10 µM de Y27632 (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.). [Exemplo de Teste 10: Estabelecimento da linhagem de iPSC repórter humana LGR5::emGFP]

[00280] As iPSCs humanas preparadas como células únicas no Exemplo de Teste 9 foram cotransfectadas com um plasmídeo de expressão SpCas9, um plasmídeo de expressão LGR5 sgRNA e um plasmídeo doador de LGR5::emGFP (construção capaz de knocking-in “intron quimérico + emGFP + SV40poliA” ao terminal N de LGR5) usando NEPA21 (Nepa Gene Co., Ltd).

[00281] As células obtidas foram submetidas à seleção de fármaco pelo tratamento com puromicina, depois coleta de colônia e cultura de expansão. Entre as colônias obtidas, uma colônia confirmada ter monoalelicamente um inserto da sequência de interesse pela PCR foi usado como uma linhagem LGR5::emGFP. [Exemplo de Teste 11: Diferenciação de iPSCs humanas em organoide intestinal] (1) Pré-cultura de iPSCs

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[00282] A linhagem LGR5::emGFP do Exemplo de Teste 10 foi semeada a uma densidade de 4 × 105 células/poço em uma placa de 12 poços revestida com Matrigel (Corning Inc.) e cultivada a 37°C por 2 dias sob 5% de CO2 (pré-cultura). A solução de cultura usada para a inoculação foi uma mistura de Meio basal e Suplemento do Kit Essential 8 Flex Medium suplementado com 10 µM de Y27632. (2) Diferenciação de iPSCs humanas em endoderma definitivo

[00283] Depois da pré-cultura, o meio foi substituído com um meio contendo 100 ng/mL de Activina A (PeproTech, Inc.), 10 ng/mL de BMP4 (R&D Systems, Inc.), 20 ng/mL de bFGF (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.) (dia 0 de cultura) e as células foram cultivadas a 37°C por 4 dias sob 5% de CO2. O meio usado foi uma mistura de RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific, Inc.) com Suplemento B-27, menos insulina (Thermo Fisher Scientific, Inc.) e Penicilina-Estreptomicina (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Durante o período de cultura, o meio foi substituído todos os dias.

[00284] De modo a confirmar a diferenciação na endoderma definitiva, as células foram recuperadas 4 dias depois do início da cultura e confirmadas pela RT-PCR quantitativa expressar os marcadores de endoderma definitiva SOX17 e FOXA2. (3) Diferenciação de endoderma definitiva em intestino grosso

[00285] Depois da diferenciação na endoderma definitiva, o meio foi substituído com um meio contendo 100 ng/mL de FGF4 (PeproTech, Inc.) e 6 µM de CHIR99021 (Axon MedChem) (4 dias de cultura) e as células foram cultivadas a 37°C por 4 dias sob 5% de CO2 (um total de 8 dias). O meio usado foi uma mistura de RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific, Inc.) com Suplemento B-27, menos vitamina A (Thermo Fisher Scientific, Inc.) e Penicilina-Estreptomicina (Thermo Fisher Scientific, Inc.). a quantidade total do meio foi substituída nos 4 dias de cultura e metade da quantidade do meio foi substituída do dia 5 ao dia 7 da cultura. De modo a confirmar a

55 / 63 diferenciação no intestino grosso, as células foram recuperadas 8 dias depois do início da cultura e confirmada pela RT-PCR quantitativa para expressar um marcador do intestino grosso CDX2. (4) Diferenciação em organoide intestinal - 1

[00286] Uma massa de célula do intestino grosso formada em cada poço foi recuperada junto com um sobrenadante de cultura. Uma suspensão de célula contendo os precursores neurais entéricos preparados no Exemplo de Teste 4 foi adicionada à solução contendo a massa de célula do intestino grosso e centrifugada, seguido pela remoção do sobrenadante da cultura. A massa de célula do intestino grosso e os precursores neurais entéricos recolocados em suspensão em uma solução de Matrigel foram semeados a 50 µL/poço em uma placa de 24 poços e cultivados a 37°C por 30 minutos sob 5% de CO2 para a formação do gel de Matrigel. Um meio contendo 1000 ng/mL de R-espondina-1 (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.), 100 ng/mL de noggin (PeproTech, Inc.), 100 ng/mL de Wnt3a (R&D Systems, Inc.), 100 ng/mL de EGF e 2,5 µM de prostaglandina-E2 foi adicionado ao gel de Matrigel, seguido pela cultura a 37°C sob 5% de CO2. O meio usado foi uma mistura de Advanced DMEM/F-12 (Thermo Fisher Scientific, Inc.) com Suplemento B-27, menos vitamina A (Thermo Fisher Scientific, Inc.), Suplemento N-2 (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 10 µM de Y27632, 10 mM de HEPES (Thermo Fisher Scientific, Inc.) e Penicilina-Estreptomicina (Thermo Fisher Scientific, Inc.).

[00287] D-PBS(-) (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.) de 4°C foi adicionado ao Matrigel contendo um organoide intestinal obtido pela diferenciação da massa de célula do intestino grosso e os precursores neurais entéricos assim cultivados por cerca de 2 semanas, para dissolver o Matrigel. O sobrenadante de cultura foi removido pela centrifugação. O organoide intestinal recolocado em suspensão em uma solução de Matrigel foi semeado a 50 µL/poço sobre uma placa de 24 poços e cultivado a 37°C por 30 minutos

56 / 63 sob 5% de CO2 para a formação do gel de Matrigel. Um meio contendo 1000 ng/mL de R-espondina-1, 100 ng/mL de noggin, 100 ng/mL de Wnt3a, 100 ng/mL de EGF, 2,5 µM de prostaglandina-E2 e Y27632 foi adicionado sobre o gel de Matrigel, seguido pela cultura a 37°C sob 5% de CO2 (período de cultura do organoide intestinal: um total de 24 a 25 dias). (5) Diferenciação em organoide intestinal - 2

[00288] Uma massa de célula do intestino grosso formada em cada poço foi recuperada junto com um sobrenadante de cultura. O sobrenadante de cultura foi removido pela centrifugação. A massa de célula recolocada em suspensão em uma solução de Matrigel foram semeadas a 50 µL/poço em uma placa de 24 poços e cultivada a 37°C por 30 minutos sob 5% de CO2 para a formação do gel de Matrigel. Um meio contendo 1000 ng/mL de R- espondina-1, 100 ng/mL de noggin, 100 ng/mL de Wnt3a, 100 ng/mL de EGF e 2,5 µM de prostaglandina-E2 foi adicionado sobre o gel de Matrigel, seguido pela cultura a 37°C sob 5% de CO2. O meio usado foi uma mistura de Advanced DMEM/F-12 (Thermo Fisher Scientific, Inc.) com Suplemento B- 27, menos vitamina A (Thermo Fisher Scientific, Inc.), Suplemento N-2 (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 10 µM de Y27632, 10 mM de HEPES (Thermo Fisher Scientific, Inc.) e Penicilina-Estreptomicina (Thermo Fisher Scientific, Inc.).

[00289] D-PBS(-) de 4°C foi adicionado ao Matrigel contendo um organoide intestinal obtido pela diferenciação da massa de célula do intestino grosso assim cultivada por cerca de 2 semanas, para dissolver o Matrigel. Uma suspensão de célula contendo os precursores neurais entéricos preparados no Exemplo de Teste 4 foi adicionado à solução contendo o organoide intestinal e centrifugada, seguido pela remoção do sobrenadante de cultura. Depois da remoção do sobrenadante, um meio contendo 1000 ng/mL de R-espondina-1, 100 ng/mL de noggin, 100 ng/mL de Wnt3a, 100 ng/mL de EGF, 2,5 µM de prostaglandina-E2 e 10 µM de Y27632 foi adicionado às

57 / 63 pelotas de célula, seguido pela cultura a 37°C por 2 dias sob 5% de CO2. O organoide intestinal recolocado em suspensão em uma solução de Matrigel depois da cultura foi semeado a 50 µL/poço sobre uma placa de 24 poços e cultivado a 37°C por 30 minutos sob 5% de CO2 para a formação do gel de Matrigel. Um meio contendo 1000 ng/mL de R-espondina-1, 100 ng/mL de noggin, 100 ng/mL de Wnt3a, 100 ng/mL de EGF, 2,5 µM de prostaglandina- E2 e Y27632 foi adicionado sobre o gel de Matrigel, seguido pela cultura a 37°C sob 5% de CO2 (período de cultura do organoide intestinal: um total de 24 a 25 dias). [Exemplo de Teste 12: Formação in vivo de trato intestinal artificial a partir do organoide intestinal] (1) Transplante de organoide intestinal para camundongo

[00290] Matrigel contendo o organoide intestinal obtido no Exemplo de Teste 11 foi dissolvido pela adição de D-PBS(-) de 4°C. A solução contendo o organoide intestinal foi centrifugada, seguida pela remoção do sobrenadante de cultura. Depois da remoção do sobrenadante de cultura, colágeno I (Corning Inc.) foi adicionado às pelotas de célula. A solução contendo as pelotas de célula e colágeno I foi adicionada a um suporte preparado usando Neoveil Sheet (Gunze Ltd.) e poli-L-lactídeo (DURECT Corp.) de modo que as pelotas de célula fossem fixadas ao suporte.

[00291] O abdômen de um camundongo imunodeficiente de 6 semanas de idade (camundongo NOG macho, Central Institute for Experimental Animals) foi aberto sob anestesia com isoflurano. O suporte fixado às pelotas de célula foi implantado sobre a gordura da membrana intestinal e a abertura foi suturada. O camundongo foi criado por 13 semanas depois do transplante. (2) Coleta de organoide intestinal transplantado

[00292] O abdome dos camundongos foi aberto sob anestesia com isoflurano. Um trato intestinal artificial formado sobre a gordura da membrana intestinal foi separado da gordura da membrana intestinal e

58 / 63 coletado. (3) Análise histológica no trato intestinal artificial

[00293] O trato intestinal artificial coletado foi fixado em paraformaldeído 4%/solução salina tamponada com fosfato (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.) e submetido ao imunotingimento fluorescente. O trato intestinal artificial foi sequencialmente reagido com um anticorpo antiTUBB3 (Abcam plc), um anticorpo antiS100β (Abcam plc) ou um anticorpo antiGFAP (Abcam plc) como um anticorpo primário e adicionalmente com um anticorpo secundário fluorescentemente rotulado apropriado para um animal imunizado do anticorpo primário como um anticorpo secundário e depois observado sob um microscópio de fluorescência.

[00294] As imagens de imunotingimento fluorescente são mostradas nas Figuras 8 e 9. Como mostrado na Figura 8, as células positivas em PHOX2B-emGFP e SOX10-tdTomato (células nervosas e células gliais) derivadas a partir de precursores neurais entéricos foram presentes. Como mostrado na Figura 9, uma imagem positiva em S100β (A), GFAP (B) ou TUBB3 (C) idêntica ou similar à imagem positiva em PHOX2B-emGFP ou SOX10-tdTomato foi observada, confirmando que as células derivadas a partir de precursores neurais entéricos diferenciaram nas células nervosas e células gliais. Os precursores neurais entéricos obtidos no Exemplo 4 mostraram ter a capacidade para diferenciar nas células nervosas entéricas e constituir um trato intestinal artificial. (4) Análise da função motora no trato intestinal artificial

[00295] O trato intestinal artificial coletado foi cortado em seções de tecido semelhantes a tiras. Uma extremidade da tira foi pendurada em uma câmara de um aparelho de ensaio de banho de órgão (Panlab, S.L.U.). A outra extremidade foi conectada a um transdutor de pressão (fabricado pela Bio Research Center Co., Ltd.) de modo que as respostas contráteis e relaxantes da seção de tecido foi quantitativamente monitorável. A câmara foi cheia com

59 / 63 uma solução de Krebs (NaCl: 120,7 mM, KCl: 5,9 mM, NaHCO3: 15,5 mM, NaH2PO4: 1,2 mM, MgCl2: 1,2 mM, CaCl2: 2,5 mM, glicose: 11,5 mM) e 95% de O2 foram expostos dentro da solução. A seção de tecido na câmara foi eletricamente estimulada e as suas respostas contráteis e relaxantes foram medidas.

[00296] Os resultados são mostrados nas Figuras 10 a 12. As respostas contráteis e relaxantes à estimulação elétrica foram confirmadas (ver a Figura 10). A resposta contrátil foi parcialmente cancelada pela adição de 1 µM de inibidor do receptor de acetilcolina muscarínico sulfato de atropina mono- hidratado (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.), 10 µM de fármaco bloqueador α-adrenérgico cloridreto de fenoxibenzamina (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) ou 10 µM de fármaco bloqueador β-adrenérgico cloridreto de propranolol (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.) (ver a Figura 11). Isto sugeriu que os precursores neurais entéricos obtidos no Exemplo 4 formaram músculo contrator de nervo pela produção de acetilcolina e adrenalina no trato intestinal artificial.

[00297] Por outro lado, a resposta relaxante dependente da estimulação elétrica permaneceu. A resposta relaxante desapareceu pela adição de um inibidor da monóxido de nitrogênio sintase cloridreto do éster metílico de NG-nitro-L-arginina (ver a Figura 11). Isto sugeriu que os precursores neurais entéricos obtidos no Exemplo 4 formaram músculo relaxante de nervo pela produção de monóxido de nitrogênio no trato intestinal artificial.

[00298] O cancelamento da resposta contrátil pela adição de 1 µM de sulfato de atropina mono-hidratado, 10 µM de cloridreto de fenoxibenzamina ou 10 µM de cloridreto de propranolol desapareceu pela adição de 3 µM de tetrodotoxina (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.). Isto também sugeriu que as células nervosas obtidas pela diferenciação dos precursores neurais entéricos têm a função de relaxar músculo em resposta à estimulação elétrica. [Exemplo de Teste 13: Preparação de estoque congelado de precursores

60 / 63 neurais entéricos cultivados para expansão e caracterização depois do descongelamento do estoque congelado]

[00299] Um estoque congelado foi preparado usando precursores neurais entéricos obtidos do mesmo modo como no Exemplo de Teste 4. Também, a capacidade proliferativa e a capacidade de diferenciação dos precursores neurais entéricos foram confirmadas depois do descongelamento do estoque congelado.

[00300] Uma suspensão de células dos precursores neurais entéricos nos 76 dias de diferenciação foi centrifugada a 300 × g por 3 minutos, seguido pela remoção do sobrenadante. Depois, as células foram colocadas em suspensão a uma concentração de 200.000 células/200 µL em Stemcell Banker GMP Grade (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.) e criopreservadas a - 80°C.

[00301] O estoque congelado foi descongelado a 37°C. As células foram colocadas em suspensão em um meio de precursor neural entérico e depois centrifugadas a 300 × g por 3 minutos, seguido pela remoção do sobrenadante. Depois, as células foram recolocadas em suspensão em um meio de precursor neural entérico. As células foram cultivadas pelo método descrito no Exemplo de Teste 4. Também, as passagens e análise de citometria de fluxo foram realizadas pelos métodos descritos nos Exemplos de Teste 4 e 5. Adicionalmente, a capacidade de diferenciação em células nervosas entéricas e células gliais foi confirmada de acordo com os métodos descritos nos Exemplos de Teste 8 e 14.

[00302] Os resultados são mostrados na Figura 13. A Figura 13(A) mostra a alteração dependente do tempo no número de célula durante a cultura de expansão e alteração dependente do tempo na razão de precursores neurais entéricos para todas as células durante a cultura de expansão. A Figura 13(B) mostra os resultados da análise da expressão de PHOX2B e SOX10 pela citometria de fluxo em precursores neurais entéricos (ENP) e

61 / 63 células nervosas entéricas (ENS) obtidas pela diferenciação dos mesmos. A Figura 13(C) mostra imagens de imunotingimento fluorescente das células nervosas entéricas e células gliais obtidas pela diferenciação de precursores neurais entéricos. Os precursores neurais entéricos assim congelados- descongelados foram confirmados manter excelente capacidade proliferativa. Também, os precursores neurais entéricos congelados-descongelados foram confirmados reter a capacidade de diferenciação em células nervosas entéricas (positivas em PHOX2B e periferina e negativas em SOX10) e células gliais (positivas em GFAP). As células nervosas entéricas incluíram vários subtipos expressando nNOS (óxido nítrico sintase neuronal), TH (tirosina hidroxilase), Chat (colina acetiltransferase), GABA (ácido gama amino butírico) ou SST (somatostatina). [Exemplo de Teste 14: Diferenciação dos precursores neurais entéricos em células gliais]

[00303] A diferenciação em células gliais foi realizada usando precursores neurais entéricos obtidos do mesmo modo como no Exemplo de Teste 4.

[00304] O meio para a diferenciação em células gliais usado foi o kit de maturação Astrocyte (STEMCELL Technologies Inc.) suplementado com Penicilina-Estreptomicina (Life Technologies Corp.).

[00305] As células nos 46 dias de cultura foram fixadas em paraformaldeído/solução salina tamponada com fosfato e submetidas ao imunotingimento fluorescente. As células foram sequencialmente reagidas com um anticorpo antiGFAP (CST #3670, Cell Signaling Technology, Inc.) como um anticorpo primário e adicionalmente com um anticorpo secundário fluorescentemente rotulado apropriado para um animal imunizado do anticorpo primário como um anticorpo secundário e depois observado sob um microscópio de fluorescência.

[00306] A imagem de imunotingimento fluorescente é mostrada na

62 / 63 Figura 14. As células gliais positivas em GFAP foram confirmadas. Assim, os precursores neurais entéricos obtidos por este método de cultura foram mostradas reter a capacidade de diferenciação em células gliais. [Exemplo de Teste 15: Confirmação da sobrevivência do enxerto de precursores neurais entéricos no trato intestinal de camundongo imunodeficiente]

[00307] A sobrevivência do enxerto no trato intestinal de camundongo imunodeficiente foi confirmada usando precursores neurais entéricos obtidos do mesmo modo como no Exemplo de Teste 4. (1) Preparação da massa de célula de precursores neurais entéricos para transplante

[00308] Os precursores neurais entéricos foram colocados em suspensão em um meio de precursor neural entérico, semeados a 320.000 células/poço a uma placa de cultura de esfera (RB500 400 NA 24, Kuraray Co., Ltd.) e cultivados por 3 dias para construir uma massa de célula (esfera). (2) Transplante de precursores neurais entéricos para camundongo

[00309] A massa de células (esfera) obtida foi recuperada e transplantada a 580 esferas/sítio/camundongo para as paredes cecais de camundongos imunodeficientes (NOD. CB17-Prkdc<scid>/J, macho, 6 semanas de idade, Charles River Laboratories Japan, Inc.) cujos abdomes foram abertos sob anestesia, usando uma agulha de seringa (calibre 30). O meio usado para o transplante foi uma mistura de Matrigel e um meio de precursor neural entérico a uma razão de 1:1 (v/v). Uma semana mais tarde, os animais foram eutanizados e os tecidos em torno dos sítios de transplante foram coletados e fixados em paraformaldeído a 4%/solução salina tamponada com fosfato. (3) Análise histológica na amostra depois do transplante

[00310] As amostras fixadas foram submetidas ao imunotingimento fluorescente. As amostras foram sequencialmente reagidas com um anticorpo

63 / 63 antiTUBB3 (Abcam plc) como um anticorpo primário e adicionalmente com um anticorpo secundário fluorescentemente rotulado apropriado para um animal imunizado do anticorpo primário como um anticorpo secundário e depois observado sob um microscópio de fluorescência.

[00311] As imagens de imunotingimento fluorescente são mostradas na Figura 15. As células positivas em PHOX2B-emGFP e SOX10-tdTomato (células consideradas estar no processo de diferenciação em células nervosas e células gliais) derivadas a partir de precursores neurais entéricos estavam presentes em um sítio correspondente à camada submucósica da camada muscular do trato intestinal de camundongo (a e b). Os precursores neurais entéricos foram confirmado estar enxertados no trato intestinal de camundongo. Uma imagem positiva em TUBB3 (c) idêntica ou similar à imagem positiva em PHOX2B-emGFP ou SOX10-tdTomato foi observada, confirmando que as células derivadas a partir de precursores neurais entéricos estavam no processo de diferenciação em células nervosas. [Texto Livre da Listagem de Sequências]

[00312] SEQ ID NO: 1: Sequência de aminoácido de tamanho completo de NRG1 humana [Listagem de Sequências]

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para produzir precursores neurais entéricos, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (A1) prover precursores neurais entéricos; e (A2) cultivar os precursores neurais entéricos em um meio compreendendo um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4.

2. Método para produzir de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio compreende ainda um inibidor de TGFβ e um inibidor de GSK3β.

3. Método para produzir de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o meio compreende ainda ácido retinoico e/ou um derivado do mesmo.

4. Método para produzir de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o meio compreende ainda GDNF.

5. Método para produzir de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o meio compreende ainda Matrigel.

6. Método para produzir de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o agonista de ERBB3 e/ou o agonista de ERBB4 é NRG1.

7. Precursores neurais entéricos, caracterizados pelo fato de serem obtidos por um método para produzir como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

8. Estoque congelado, caracterizado pelo fato de que compreende precursores neurais entéricos como definidos na reivindicação 7.

9. Medicamento de célula, caracterizado pelo fato de que compreende precursores neurais entéricos como definidos na reivindicação 7.

10. Método para produzir precursores neurais entéricos,

caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (B1) prover células da crista neural; e (B2) cultivar as células da crista neural em um meio compreendendo um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4 e ácido retinoico e/ou um derivado do mesmo.

11. Método para produzir de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que as células da crista neural são células da crista neural vagal.

12. Método para produzir de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que as células da crista neural vagal são positivas em SOX10, positivas em HOXB5, negativas em HOXB9 e negativas em PHOX2B, e os precursores neurais entéricos são positivos em SOX10 e positivos em PHOX2B.

13. Meio de precursor neural entérico, caracterizado pelo fato de que compreende um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4.

14. Meio de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um inibidor de TGFβ e/ou um inibidor de GSK3β.

15. Meio de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente ácido retinoico e/ou um derivado do mesmo.

16. Meio de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente GDNF.

17. Meio de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente Matrigel.

18. Meio de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 17, caracterizado pelo fato de que o agonista de ERBB3 e/ou o agonista de ERBB4 é NRG1.

19. Método de expansão de cultura para precursores neurais entéricos, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (C1) prover precursores neurais entéricos; e (C2) cultivar os precursores neurais entéricos em um meio compreendendo um agonista de ERBB3 e/ou um agonista de ERBB4.

20. Método para produzir um organoide intestinal, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de cocultivar precursores neurais entéricos e células do intestino grosso.

21. Método para produzir um trato intestinal artificial, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: cocultivar precursores neurais entéricos e células do intestino grosso para se obter um organoide intestinal; e transplantar o organoide intestinal dentro de um organismo vivo para formar um trato intestinal artificial.

22. Método para produzir de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que os precursores neurais entéricos são precursores neurais entéricos obtidos por um método para produzir como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.