BR112021003088A2 - miméticos de calcitonina acilados - Google Patents

Abstract

“miméticos de calcitonina acilados”. a presente invenção se refere a miméticos de calcitonina que são acilados em um resíduo de lisina localizado na posição (11) ou (19) do mimético de calcitonina e seu uso como medicamentos no tratamento de várias doenças e distúrbios, incluindo diabetes, excesso de peso corporal, consumo excessivo de alimentos e síndrome metabólica, nash, doença hepática gordurosa alcoólica e não alcoólica, a regulação dos níveis de glicose no sangue, a regulação da resposta aos testes de tolerância à glicose, a regulação de ingestão de alimentos e o tratamento de osteoporose e o tratamento de osteoartrite.

Description

“MIMÉTICOS DE CALCITONINA ACILADOS”

[0001] A presente invenção refere-se a miméticos de calcitonina acilados e se estende ao seu uso como medicamentos no tratamento de várias doenças e distúrbios, incluindo, mas sem limitação, diabetes (Tipo I e Tipo II), excesso de peso corporal, consumo excessivo de alimentos e síndrome metabólica, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa alcoólica e não alcoólica, a regulação dos níveis de glicose no sangue, a regulação da resposta aos testes de tolerância à glicose, a regulação de ingestão de alimentos, o tratamento da osteoporose e o tratamento de osteoartrite.

[0002] Em todo o mundo, existem cerca de 250 milhões de diabéticos e o número deve dobrar nas próximas duas décadas. Mais de 90% desta população sofre de diabetes mellitus tipo 2 (T2DM). Estima-se que apenas 50 a 60% das pessoas afetadas com T2DM ou em estágios anteriores à T2DM são diagnosticadas atualmente.

[0003] A T2DM é uma doença heterogênea caracterizada por anormalidades no metabolismo de carboidrato e gordura. As causas de T2DM são multifatoriais e incluem elementos genéticos e ambientais que afetam a função das células β e a sensibilidade à insulina em tecidos, tais como músculo, fígado, pâncreas e tecido adiposo. Como consequência, a secreção prejudicada de insulina é observada e acompanhada por um declínio progressivo na função de células β e resistência crônica à insulina.

[0004] A incapacidade do pâncreas endócrino para compensar a resistência periférica à insulina leva à hiperglicemia e ao aparecimento de diabetes clínico. A resistência de tecido à captação de glicose mediada pela insulina é agora reconhecida como o principal determinante fisiopatológico de T2DM.

[0005] Um critério de sucesso para uma intervenção de T2DM ideal é a redução de níveis de glicose no sangue, que pode ser tanto a redução crônica de níveis de glicose no sangue quanto o aumento da capacidade de tolerar altos níveis de glicose após a ingestão de alimentos,

descrita por níveis de glicose de pico mais baixos e depuração mais rápida. Ambas as situações exercem menos pressão sobre a produção e a função de insulina de células β.

[0006] A diabetes tipo I é caracterizada por uma perda da capacidade de produzir insulina em resposta à ingestão de alimentos e, portanto, uma incapacidade de regular a glicose no sangue para um nível fisiológico normal.

[0007] A estrutura física do osso pode ser comprometida por uma variedade de fatores, incluindo doenças e lesões. Uma das doenças ósseas mais comuns é a osteoporose, que se caracteriza pela baixa massa óssea e deterioração estrutural do tecido ósseo, levando à fragilidade óssea e aumento da suscetibilidade a fraturas, principalmente de quadril, coluna e punho. A osteoporose se desenvolve quando há um desequilíbrio de modo que a taxa de reabsorção óssea exceda a taxa de formação óssea. A administração de uma quantidade eficaz de um agente antirreabsorção, tal como a calcitonina, demonstrou prevenir a reabsorção óssea.

[0008] Doenças inflamatórias ou degenerativas, incluindo doenças das articulações, por exemplo, osteoartrite (OA), artrite reumatoide (RA) ou artrite reumatoide juvenil (JRA) e incluindo inflamação que resulta da resposta autoimune, por exemplo, lúpus, espondilite anquilosante (AS) ou esclerose múltipla (MS), podem levar a uma perda substancial de mobilidade devido à dor e destruição das articulações. A cartilagem que cobre e amortece o osso dentro das articulações pode se degradar ao longo do tempo, permitindo assim, indesejavelmente, o contato direto de dois ossos que podem limitar o movimento de um osso em relação ao outro e/ou causar danos a um pelo outro durante o movimento da articulação. O osso subcondral logo abaixo da cartilagem também pode se degradar. A administração de uma quantidade eficaz de um agente antirreabsorção, tal como a calcitonina, pode prevenir a reabsorção óssea.

[0009] As calcitoninas são altamente conservadas em uma ampla gama de espécies. A calcitonina nativa de comprimento total tem 32 aminoácidos de comprimento. As sequências de exemplos de calcitoninas naturais são definidas abaixo: Salmão CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP Enguia CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTDVGAGTP Galinha CASLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTDVGAGTP Camundongo CGNLSTCMLGTYTQDLNKFHTFPQTSIGVEAP Rato CGNLSTCMLGTYTQDLNKFHTFPQTSIGVGAP Cavalo CSNLSTCVLGTYTQDLNKFHTFPQTAIGVGAP Canina-1 CSNLSTCVLGTYSKDLNNFHTFSGIGFGAETP Canina-2 CSNLSTCVLGTYTQDLNKFHTFPQTAIGVGAP Porcina CSNLSTCVLSAYWRNLNNFHRFSGMGFGPETP Ser humano CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP

[0010] Variantes sintéticas de calcitoninas naturais com sequências de aminoácidos modificadas que se destinam a fornecer propriedades melhoradas são divulgadas nos documentos WO2013/067357 e WO 2015/071229.

[0011] No entanto, os peptídeos, tais como calcitonina e miméticos de calcitonina, normalmente têm propriedades de absorção, distribuição, metabolismo e excreção deficientes, com depuração rápida e meia- vida curta. Consequentemente, os fármacos peptídicos requerem tipicamente administração parentérica diária. A administração diária de tratamento por meio de injeções subcutâneas (s.c.) não é atualmente um método ideal de administração, pois representa um inconveniente para pacientes individuais e pode causar a não adesão ao plano de tratamento para evitar o desconforto associado às injeções diárias. Sendo assim, um fármaco uma vez por semana utilizando injeções s.c. aumenta a qualidade de vida dos pacientes em questão e auxilia ainda mais na adesão ao plano de tratamento.

[0012] Existem inúmeras abordagens conhecidas na técnica para tentar melhorar a meia-vida in vivo de fármacos peptídicos. Essas abordagens incluem melhorar a estabilidade proteolítica (por exemplo, protegendo os N- e C-terminais, substituindo os aminoácidos por aminoácidos D ou aminoácidos não naturais, ciclizando o peptídeo, etc.) e reduzindo a depuração renal (por exemplo, conjugando o peptídeo para macromoléculas, tais como polímeros grandes, albumina, imunoglobulinas, etc.). No entanto, também é conhecido na técnica que fazer tais modificações em peptídeos de fármacos pode ser deletério em termos de, por exemplo, potência de fármaco reduzida e reações colaterais adversas imprevisíveis, tal como sensibilização a fármacos. Sendo assim, não é possível prever se tais modificações iriam necessariamente melhorar o perfil terapêutico de um fármaco peptídico.

[0013] Consequentemente, o desenvolvimento de fármacos peptídicos que requerem administração apenas uma vez por semana é uma perspectiva desafiadora.

[0014] Uma abordagem para melhorar as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas de fármacos peptídicos é acilar o peptídeo. Trier et al (Tese de PhD, 2016, “Acylation of Therapeutic Peptides”, DTU; disponível para download em http://orbit.dtu.dk/files/127682557/PhD_thesis_Sofie_Trier.pdf) estudaram o efeito de acilação de dois peptídeos terapêuticos, a saber peptídeo semelhante a glucagon 2 (GLP2) e calcitonina de salmão (sCT), com grupos acila de comprimento variável (C8-C16). Embora os efeitos de acilação de GLP2 sejam amplamente previsíveis com base em observações anteriores em peptídeos similares, os efeitos observados durante a acilação de sCT foram considerados imprevisíveis. Por exemplo, Trier et al constataram que a acilação de sCT (em várias posições na estrutura do peptídeo) causou consistentemente uma perda substancial na potência do receptor (de 60 a 80% de perda), enquanto a potência do receptor foi mantida para GLP-2 após a acilação. Assim, enquanto Trier et al. constataram algumas propriedades úteis associadas à acilação de sCT (particularmente em relação às acilações de (C8) de cadeia curta), também ficou claro que havia inúmeros efeitos imprevisíveis e significativamente desvantajosos associados à acilação de sCT, mais notavelmente uma perda significativa na potência do receptor. Um ponto adicional importante é que os estudos de Trier et al. focaram na acilação da posição 18 (Lys18) de calcitonina de salmão. Isso ocorre porque estudos anteriores com o objetivo de melhorar a eficácia de calcitonina de salmão identificaram a posição 18 como sendo a posição superior para modificação (nesse caso, por PEGuilação, não por acilação). Nesses estudos, verificou-se que a PEGuilação da posição Lys18 de sCT resultou em melhor eficácia do que os peptídeos análogos modificados nas posições Cysl ou Lys11 (Youn et al, J. Control. Release, 2006, 334 a 342).

SUMARIO DA INVENÇÃO

[0015] Os presentes inventores constataram que a acilação de miméticos de calcitonina em um resíduo de lisina localizado na posição 11 dos miméticos de calcitonina ou em um resíduo de lisina localizado na posição 19 dos miméticos de calcitonina, em particular com certas porções acila específicas, resulta em uma melhora surpreendente na eficácia do peptídeo vis-à-vis o equivalente do peptídeo não acilado, além de aumentar a duração de ação do peptídeo. De modo similar, verificou-se que a maior melhora na eficácia do mimético de calcitonina correspondeu à acilação na posição 11 ou 19, enquanto a acilação na posição 18 produziu um resultado inferior, ao contrário das constatações de Youn et al. Sendo assim, os presentes inventores desenvolveram novos miméticos de calcitonina acilada potentes que podem apenas precisar ser administrados uma vez por semana, em vez de uma vez ao dia.

[0016] Consequentemente, em um aspecto, a presente invenção fornece um mimético de calcitonina que é acilado em um resíduo de lisina localizado na posição 11 do mimético de calcitonina e/ou que é acilado em um resíduo de lisina localizado na posição 19 do mimético de calcitonina. O grupo ε-amino de cadeia lateral do dito resíduo de lisina é acilado com um grupo acila selecionado a partir de qualquer um dos seguintes: um C 16 ou ácido graxo mais longo com um ligante opcional; ou um C16 ou diácido graxo mais longo com um ligante opcional.

[0017] Conforme usado no presente documento, “mimético de calcitonina” significa um peptídeo que ativa o receptor de calcitonina (isto é, um agonista do receptor de calcitonina) e, preferencialmente, também ativa o receptor de amilina (isto é, um agonista duplo de receptor de amilina e calcitonina).

[0018] Em certas modalidades preferenciais, o mimético de calcitonina tem de 32 a 37 aminoácidos de comprimento. Com a máxima preferência, o mimético de calcitonina tem 32 aminoácidos de comprimento.

[0019] Em um aspecto preferencial, em que o mimético de calcitonina é acilado em um resíduo de lisina localizado na posição 11, a presente invenção se refere a um mimético de calcitonina de fórmula (I) (a):

[0020] CX2X3LSTCX8LGKAc...

[0021] em que

[0022] X2 = A, G ou S

[0023] X3 = N ou S

[0024] X8 = M, V ou ácido α-aminoisobutírico (AiB)

[0025] e em que KAc é um resíduo de lisina em que o grupo ε-amino da cadeia lateral é acilado com um grupo acila selecionado a partir de qualquer um dos seguintes:

[0026] C16 ou ácido graxo mais longo com um ligante opcional, ou C16 ou diácido graxo mais longo com um ligante opcional.

[0027] Em outro aspecto preferencial, em que o mimético de calcitonina é acilado em um resíduo de lisina localizado na posição 19, a presente invenção se refere a um mimético de calcitonina de fórmula (I) (b):

[0028] CX2X3LSTCX8LGX11X12X13X14X15X16X17X18KAc

...

[0029] em que

[0030] X2 = A, G ou S

[0031] X3 = N ou S

[0032] X8 = M, V ou ácido α-aminoisobutírico (AiB)

[0033] X11 = R, K, T, A ou KAc (preferencialmente, R, K ou KAc, com a máxima preferência R ou K)

[0034] X12 = L ou Y (com a máxima preferência L)

[0035] X13 = S, T, W ou Y (preferencialmente, T, S ou Y)

[0036] X14 = Q, K, R ou A (preferencialmente, Q ou A, com a máxima preferência

[0037] Q)

[0038] X15 = D, E ou N (preferencialmente, D ou E)

[0039] X16 = L ou F (com a máxima preferência L)

[0040] X17 = H ou N

[0041] X18 = R, K ou N (preferencialmente, R ou K)

[0042] e em que KAc é um resíduo de lisina em que o grupo ε-amino de cadeia lateral é acilado com um grupo acila selecionado a partir de qualquer um dos seguintes:

[0043] C16 ou ácido graxo mais longo com um ligante opcional, ou C16 ou diácido graxo mais longo com um ligante opcional.

[0044] Preferencialmente, o mimético de calcitonina de fórmula (I) (a) ou (I) (b) tem de 32 a 37 aminoácidos de comprimento, preferencialmente, 32, 33, 35, 36 ou 37 aminoácidos de comprimento. Mais preferencialmente, o mimético de calcitonina de fórmula (I) (a) ou (I) (b) tem 32 aminoácidos de comprimento.

[0045] Em um aspecto preferencial da invenção, o mimético de calcitonina é um mimético de calcitonina de 32 mer de fórmula (II):

[0046] CX2X3LSTCX8LGX11X12X13X14X15X16X17X18X19

X20X21X22X23X24X25X26X27GX29X30X31P em que

[0047] X2 = A, G ou S

[0048] X3 = N ou S

[0049] X8 = M, V ou ácido α-aminoisobutírico (AiB)

[0050] X11 = KAc, R, K, T ou A (com a máxima preferência, KAc, R ou K)

[0051] X12 = L ou Y

[0052] X13 = S, T, W ou Y

[0053] X14 = Q, K, R ou A

[0054] X15 = D, E ou N

[0055] X16 = L ou F

[0056] X17 = H ou N

[0057] X18 = R, K ou N

[0058] X19 = KAc, L, F ou K (com a máxima preferência, KAc, L ou F)

[0059] X20 = Q, H ou A

[0060] X21 = T ou R

[0061] X22 = Y ou F

[0062] X23 = S ou P

[0063] X24 = G, K, Q ou R

[0064] X25 = T, I ou M

[0065] X26 = S, N, D, G ou A

[0066] X27 = T, V, F ou I

[0067] X29 = S, A, P ou V

[0068] X30 = N, G ou E

[0069] X31 = A, T ou S (com a máxima preferência A ou T)

[0070] em que X11 é KAc e/ou X19 é KAc (de modo que cada X11 seja KAc e X19 seja L, F ou K, preferencialmente L ou F; ou X 11 seja R, K, T ou A, preferencialmente, R ou K, em que X 11 é KAc e/ou X19 é KAc e X19 é

KAc; ou X11 é KAc e X19 é KAc),

[0071] e em que KAc é um resíduo de lisina em que o grupo ε-amino de cadeia lateral é acilado com um grupo acila selecionado a partir de qualquer um dos seguintes:

[0072] C16 ou ácido graxo mais longo,

[0073] C16 ou diácido graxo mais longo,

[0074] ligante-C16 ou ácido graxo mais longo, ou

[0075] ligante-C16 ou diácido graxo mais longo.

[0076] Preferencialmente, o mimético de calcitonina de 32 mer de fórmula (II) é:

[0077] CX2X3LSTCX8LGX11LX13X14X15LX17X18X19X20 TX22PX24TDVGANAP em que

[0078] X2 = A, G ou S

[0079] X3 = N ou S

[0080] X8 = M, V ou AiB

[0081] X11 = KAc, R, K, T ou A (com a máxima preferência KAc, R ou K) X13 = T, S ou Y

[0082] X14 = Q ou A (com a máxima preferência Q)

[0083] X15 = D ou E

[0084] X17 = H ou N

[0085] X18 = R ou K

[0086] X19 = KAc, L, F ou K (com a máxima preferência, KAc, L ou F)

[0087] X20 = Q, H ou A

[0088] X22 = Y ou F

[0089] X24 = K, Q ou R

[0090] em que X11 é KAc e/ou X19 é KAc,

[0091] e em que KAc é um resíduo de lisina em que o grupo ε-amino de cadeia lateral é acilado com um grupo acila selecionado a partir de qualquer um dos seguintes:

[0092] C16 ou ácido graxo mais longo,

[0093] C16 ou diácido graxo mais longo,

[0094] ligante-C16 ou ácido graxo mais longo, ou

[0095] ligante-C16 ou diácido graxo mais longo.

[0096] Preferencialmente, X2 é S e X3 é N; ou X2 é G e X3 é N; ou X2 é A e X3 é S.

[0097] Preferencialmente, X13 é S ou T, com a máxima preferência S.

[0098] Preferencialmente, X24 é R ou K.

[0099] Em uma modalidade preferencial

[0100] - X11 é KAc, X17 é H, X18 é K, X19 é L e X20 é Q ou

[0101] A; ou

[0102] - X11 é KAc, X17 é H, X18 é R, X19 é L e X20 é Q ou

[0103] A; ou

[0104] - X11 é KAc, X17 é N, X18 é K, X19 é F e X20 é H ou

[0105] A; ou

[0106] - X11 é KAc, X17 é N, X18 é R, X19 é F e X20 é H ou

[0107] A; ou

[0108] - X11 é R ou K, X17 é H, X18 é K, X19 é KAc e X20 é Q ou A; ou

[0109] - X11 é R ou K, X17 é H, X18 é R, X19 é KAc e X20 é Q ou A; ou

[0110] - X11 é R ou K, X17 é N, X18 é K, X19 é KAc e X20 é H ou A; ou

[0111] - X11 é R ou K, X17 é N, X18 é R, X19 é KAc e X20 é H ou A.

[0112] Em uma modalidade preferencial, X2 é S, X3 é N, X11 é KAc, X13 é S, X17 é H, X18 é K ou R, X19 é L, X20 é Q ou A e X22 é Y; ou X2 é S, X3 é N, X11 é R ou K, X13 é S, X17 é H, X18 é K ou R, X19 é KAc, X20 é Q ou A e X22 é Y. Em uma modalidade preferencial, X2 é A, X3 é S, X11 é KAc, X13 é S, X17 é H, X18 é K ou R, X19 é L, X20 é Q ou A e X22 é F; ou X2 é A, X3 é S, X11 é R ou K, Xi3 é S, X17 é H, X18 é K ou R, X19 é KAc, X20 é Q ou A e X22 é F. Em uma modalidade preferencial, X2 é G, X3 é N, X11 é KAc, X13 é T, X17 é N, X18 é K ou R, X19 é F, X20 é H ou A e X22 é F; ou X2 é G, X3 é N, X11 é R ou K, X13 é T, X17 é N, X18 é K ou R, X19 é KAc, X20 é H ou A e X22 é F.

[0113] Em outro aspecto preferencial, a invenção se refere a um mimético de calcitonina, em que o mimético de calcitonina é um peptídeo de 33 mer de acordo com a fórmula (III):

[0114] CSNLSTCX6LGX7LSQDLHRX8QTYPKX1TX5V GANAP (III)

[0115] ou em que o mimético de calcitonina é um peptídeo de 35 mer de acordo com a fórmula (IV):

[0116] CSNLSTCX6LGX7LSQDLHRX8QTYPKX1X2X3 TX5VGANAP (IV)

[0117] ou em que o mimético de calcitonina é um peptídeo de 36 mer de acordo com a fórmula (V):

[0118] CSNLSTCX6LGX7LSQDLHRX8QTYPKX1X2X3 X4X5VGANAP (V)

[0119] ou em que o mimético de calcitonina é um peptídeo de 37 mer de acordo com a fórmula (VI):

[0120] CSNLSTCX6LGKAcLZX1X2X3XTX5VGANAP (VI)

[0121] em que cada um dentre X1 a X4 é qualquer aminoácido, com a condição de que pelo menos um dentre X 1 a X4 seja um resíduo de aminoácido básico e/ou pelo menos dois dentre X 1 a X4 sejam independentemente um resíduo de aminoácido polar ou um resíduo de aminoácido básico, e/ou pelo menos um dentre X1 a X4 seja um resíduo Gly, e em que nenhum dentre X1 a X4 seja um resíduo ácido;

[0122] em que X5 é D ou N;

[0123] em que X6 é AiB ou M;

[0124] em que X7 é KAc e X8 é L, ou X7 é R ou K e X8 é KAc,

[0125] em que Z é selecionado a partir de SQDLHRLSNNFGA, SQDLHRLQTYGAI ou ANFLVHSSNNFGA; e

[0126] em que KAc é um resíduo de lisina em que o grupo ε-amino de cadeia lateral é acilado com um grupo acila selecionado a partir de qualquer um dos seguintes:

[0127] C16 ou ácido graxo mais longo,

[0128] C16 ou diácido graxo mais longo,

[0129] ligante-C16 ou ácido graxo mais longo, ou

[0130] ligante-C16 ou diácido graxo mais longo.

[0131] Preferencialmente, pelo menos um dentre X7 ou X4 de fórmulas (III) a (VI) é um resíduo de aminoácido básico. Ainda com preferência, pelo menos um dentre X7 ou X4 é um resíduo de aminoácido básico e pelo menos um dentre X7 a X4 é independentemente um resíduo de aminoácido polar ou um resíduo de aminoácido básico e nenhum dentre X7 a X4 é um resíduo ácido. Ainda com preferência, pelo menos três dentre X1 a X4 são independentemente um resíduo de aminoácido polar ou um resíduo de aminoácido básico, e nenhum dentre X7 a X4 é um resíduo ácido. Mais preferencialmente, todos dentre X7 a X4 são independentemente um resíduo de aminoácido polar ou um resíduo de aminoácido básico, e nenhum dentre X7 a X4 é um resíduo ácido. Com a máxima preferência, todos dentre X 1 a X4 são independentemente um resíduo de aminoácido polar ou um resíduo de aminoácido básico, pelo menos três dentre X1 a X4 são resíduos de aminoácidos básicos e nenhum dentre X1 a X4 é um resíduo ácido.

[0132] Os resíduos de aminoácidos básicos podem ser quaisquer resíduos de aminoácidos naturais ou não naturais com cadeias laterais básicas e podem ser selecionados a partir de, mas sem limitação, Arg, His ou Lys.

[0133] Os resíduos de aminoácidos polares podem ser quaisquer resíduos de aminoácidos naturais ou não naturais com cadeias laterais polares não carregadas e podem ser selecionados a partir de, mas sem limitação, Ser, Thr, Asn, Gln ou Cys. Conforme usado no presente documento, o termo “resíduo ácido” se refere a qualquer resíduo de aminoácido natural ou não natural que tenha uma cadeia lateral ácida, tal como, por exemplo, Glu ou Asp.

[0134] Em uma modalidade preferencial, X1 é selecionado a partir de Asn, Phe, Val, Gly, Ile, Leu, Lys, His ou Arg;

[0135] X2 é selecionado a partir de Ala, Asn, His, Leu, Ser, Thr, Gly ou Lys;

[0136] X3 é selecionado a partir de Ala, Phe, Ile, Ser, Pro, Thr, Gly ou Lys; e/ou

[0137] X4 é selecionado a partir de Ile, Leu, Gly, His, Arg, Asn, Ser, Lys, Thr ou Gln;

[0138] com a condição de que pelo menos um dentre X1 ou X4 é um resíduo de aminoácido básico e/ou pelo menos dois dentre X 1 a X4 são independentemente um resíduo de aminoácido polar e/ou um resíduo de aminoácido básico e/ou pelo menos um dentre X1 a X4 seja um resíduo Gly.

[0139] Em uma modalidade preferencial, X1 é selecionado a partir de Asn, Gly, Ile, His ou Arg;

[0140] X2 é selecionado a partir de Asn, Leu, Thr, Gly ou Lys;

[0141] X3 é selecionado a partir de Phe, Pro, Ile, Ser, Thr, Gly ou Lys; e/ou

[0142] X4 é selecionado a partir de Gly, His, Asn, Ser, Lys, Thr ou Gln;

[0143] com a condição de que pelo menos um dentre X1 ou X4 é um resíduo de aminoácido básico e/ou pelo menos dois dentre X1 a X4 sejam independentemente um resíduo de aminoácido polar e/ou um resíduo de aminoácido básico e/ou pelo menos um dentre X1 a X4 seja um resíduo Gly.

[0144] Os peptídeos da invenção de acordo com as fórmulas (III) a (V), supra, podem compreender uma ou mais das seguintes substituições conservativas:

[0145] - o resíduo Asp na posição 15 do peptídeo é substituído por Glu;

[0146] - o resíduo Arg na posição 18 do peptídeo é substituído por Lys; e/ou

[0147] - o resíduo Lys na posição 24 do peptídeo é substituído por Arg.

[0148] Os peptídeos da invenção de acordo com as fórmulas (VI), supra, em que o componente Z do peptídeo de fórmula (VI) é SQDLHRLSNNFGA ou SQDLHRLQTYGAI, podem compreender uma ou mais das seguintes substituições conservativas:

[0149] - o resíduo Asp na posição 15 do peptídeo é substituído por Glu; e/ou

[0150] - o resíduo Arg na posição 18 do peptídeo é substituído por Lys.

[0151] Em todos os aspectos da invenção, o ligante compreende preferencialmente um resíduo de ácido glutâmico e/ou um ligante de aminoácido de oligoetilenoglicol (OEG) compreendendo um aminoácido de OEG ou dois ou mais aminoácidos de OEG ligados entre si, em que o dito aminoácido de OEG é:

[0152] e em que n é de 1 a 10, preferencialmente 1 a

5, preferencialmente 1 a 3, preferencialmente 1 ou 2, e mais preferencialmente

1.

[0153] O ligante de aminoácido de OEG pode compreender preferencialmente um aminoácido de OEG ou dois a seis aminoácidos de OEG ligados entre si. Mais preferencialmente, o ligante de aminoácido de OEG compreende um aminoácido de OEG, ou dois a três aminoácidos de OEG ligados entre si. Mais preferencialmente, o ligante de aminoácido de OEG compreende dois aminoácidos de OEG ligados entre si. O ligante de aminoácido de OEG pode compreender ainda um ou mais resíduos de ácido glutâmico ligados ao terminal amino ou ao terminal carboxila do ligante de aminoácido de OEG. Preferencialmente, o ligante de aminoácido de OEG é selecionado a partir de qualquer um dos seguintes:

[0154] Preferencialmente, o ligante de aminoácido de OEG é:

[0155] Em uma modalidade preferencial, o grupo acila é selecionado a partir de C18 ou ácido graxo mais longo, C18 ou diácido graxo mais longo, ligante-C18 ou ácido graxo mais longo, ou ligante-C18 ou diácido graxo mais longo. Preferencialmente, o grupo acila é selecionado a partir de qualquer um dos seguintes:

[0156] C18 a C30 ácido graxo, preferencialmente C18 a C22 ácido graxo,

[0157] C18 a C30 diácido graxo, preferencialmente C18 a C22 diácido graxo,

[0158] ligante-C18 a C30 ácido graxo, preferencialmente ligante-C18 a C22 ácido graxo, ou

[0159] ligante-C18 a C30 diácido graxo, preferencialmente ligante-C18 a C22 ácido graxo.

[0160] Preferencialmente, o C18 diácido graxo é ácido octadecanodioico (CAS nº 871-70-5).

[0161] Em uma modalidade preferencial, KAc é acilado com um ligante-diácido graxo, em que o diácido graxo é um C18 a C22 diácido graxo e o ligante é Preferencialmente, o C18 diácido graxo é o ácido octadecanodioico.

[0162] Preferencialmente, o mimético de calcitonina da invenção é selecionado a partir de qualquer um dos seguintes:

[0163] em que KAc é conforme definido acima. O resíduo de aminoácido na posição 8 dos peptídeos acima é, quando já não for o caso, opcionalmente substituído por AiB.

[0164] Preferencialmente, o mimético de calcitonina da invenção é selecionado a partir de qualquer um dos seguintes:

[0165] em que KAc é acilado com um diácido graxo ligante, e em que o diácido graxo é um C18 a C22 diácido graxo e o ligante é

[0166] Preferencialmente, o C18 diácido graxo é o ácido octadecanodioico. O resíduo de aminoácido na posição 8 dos peptídeos acima é, quando já não for o caso, opcionalmente substituído por AiB. Nos peptídeos anteriores, “Ac” indica que o N-terminal do peptídeo está acetilado e “-NH2” indica que o terminal C do peptídeo está amidado.

[0167] O mimético de calcitonina da invenção pode ser formulado para administração entérica. Por exemplo, o mimético de calcitonina pode ser formulado em uma composição farmacêutica para administração oral que compreende partículas de ácido cítrico revestidas, e em que as partículas de ácido cítrico revestidas aumentam a biodisponibilidade oral do peptídeo. Alternativamente, ou adicionalmente, o mimético de calcitonina pode ser formulado com um carreador para administração oral. Um carreador exemplificativo pode compreender 5-CNAC, SNAD ou SNAC. O mimético de calcitonina da invenção também pode ser formulado para administração parentérica. Por exemplo, o mimético de calcitonina pode ser formulado para injeção.

[0168] A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica que compreende um mimético de calcitonina conforme acima descrito.

[0169] A presente invenção também se refere a um mimético de calcitonina conforme acima descrito para uso como um medicamento. Nesse sentido, o mimético de calcitonina pode ser para uso no tratamento de diabetes (Tipo I e/ou Tipo II), excesso de peso corporal, consumo excessivo de alimentos, síndrome metabólica, artrite reumatoide, esteato- hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica, doença hepática gordurosa alcoólica, osteoporose ou osteoartrite, níveis de glicose no sangue mal regulados, resposta mal regulada aos testes de tolerância à glicose ou má regulação da ingestão de alimentos. O mimético de calcitonina também pode ser administrado em conjunto com metformina ou outro sensibilizador de insulina.

[0170] Os peptídeos da invenção podem ser acilados em seu N-terminal ou modificados de outra forma para reduzir a carga positiva do primeiro aminoácido e, independentemente disso, podem ser amidados no seu C-terminal.

[0171] O peptídeo pode ser formulado para administração como um produto farmacêutico e pode ser formulado para administração entérica ou parentérica. As formulações preferenciais são injetáveis, preferencialmente para injeção subcutânea, no entanto, o peptídeo pode ser formulado com um carreador para administração oral e, opcionalmente, em que o carreador aumenta a biodisponibilidade oral do peptídeo. Os carreadores adequados incluem aqueles que compreendem 5-CNAC, SNAD ou SNAC.

[0172] Opcionalmente, o peptídeo é formulado em uma composição farmacêutica para administração oral que compreende partículas de ácido cítrico revestidas e em que as partículas de ácido cítrico revestidas aumentam a biodisponibilidade oral do peptídeo.

[0173] A invenção inclui um peptídeo da invenção para uso como um medicamento. O peptídeo pode ser usado no tratamento de diabetes (Tipo I e/ou Tipo II), excesso de peso corporal, consumo excessivo de alimentos, síndrome metabólica, artrite reumatoide, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica, doença hepática gordurosa alcoólica, osteoporose ou osteoartrite, níveis de glicose no sangue mal regulados, resposta mal regulada aos testes de tolerância à glicose ou regulação insuficiente da ingestão de alimentos. Em particular, os peptídeos podem ser usados para diminuir um nível indesejavelmente elevado de glicose no sangue em jejum ou para diminuir um HbA1c indesejavelmente elevado ou para reduzir uma resposta indesejavelmente elevada a um teste de tolerância à glicose. Os peptídeos da invenção também podem ser usados para produzir uma diminuição nos triglicerídeos do fígado e/ou para reduzir o acúmulo de gordura no fígado de um indivíduo.

[0174] Os peptídeos da invenção podem ser produzidos com o uso de qualquer método adequado conhecido na técnica para gerar peptídeos, tais como tecnologias sintéticas (químicas) e recombinantes. Preferencialmente, os peptídeos são produzidos com o uso de um método sintético. A síntese de peptídeos sintéticos é bem-conhecida na técnica e inclui (mas sem limitação) a síntese de peptídeos em fase sólida empregando várias estratégias de grupos de proteção (por exemplo, com o uso de Fmoc, Boc, Bzl, tBu, etc.).

[0175] Em algumas modalidades, o lado de N-terminal dos miméticos de calcitonina acima discutidos é modificado para reduzir a carga positiva do primeiro aminoácido. Por exemplo, um grupo acetila, propionila ou succinila pode ser substituído em cisteína-1. Formas alternativas de redução de carga positiva incluem, mas sem limitação, PEGuilação à base de polietilenoglicol ou a adição de outro aminoácido, tal como ácido glutâmico ou ácido aspártico no N-terminal. Alternativamente, outros aminoácidos podem ser adicionados ao N-terminal dos peptídeos acima discutidos incluindo, mas sem limitação, lisina, glicina, formilglicina, leucina, alanina, acetil alanina e dialanila. Como os versados na técnica observarão, os peptídeos com uma pluralidade de resíduos de cisteína frequentemente formam uma ponte de dissulfeto entre dois de tais resíduos de cisteína. Todos os peptídeos apresentados no presente documento são definidos como incluindo opcionalmente uma ou mais dessas pontes de dissulfeto, particularmente nas localizações Cysl-Cys7. Imitando isso, as cisteínas nas posições 1 e 7 podem ser substituídas em conjunto por uma ligação de ácido α-aminossubérico. Embora os miméticos de calcitonina da presente divulgação possam existir na forma de ácido livre, é preferível que o aminoácido de C-terminal seja amidado. Os requerentes esperam que tal amidação possa contribuir para a eficácia e/ou biodisponibilidade do peptídeo. Métodos químicos sintéticos podem ser empregados para amidar o aminoácido de C-terminal. Outra técnica para a fabricação de versões amidadas dos miméticos de calcitonina da presente divulgação é reagir precursores (tendo glicina no lugar do grupo amino de C-terminal do produto amidado desejado) na presença de mono-oxigenase de peptidilglicina alfa-amidante de acordo com técnicas conhecidas em que os precursores são convertidos em produtos amidados nas reações descritas, por exemplo, nos documentos US4708934 e EP0308067 e EP0382403.

[0176] A produção de produtos amidados também pode ser realizada com o uso do processo e da enzima amidante estabelecidos por Consalvo, et al no documento US7445911; Miller et al, documento US2006/0292672; Ray et al, 2002, Protein Expression and Purification, 26: 249 a 259; e Mehta, 2004, Biopharm. Internacional, julho, páginas 44 a 46.

[0177] A produção dos peptídeos amidados preferenciais pode prosseguir, por exemplo, pela produção de precursor estendido por glicina em E. coli como uma proteína de fusão solúvel com glutationa-S-transferase, ou por expressão direta do precursor de acordo com a técnica descrita no documento US6103495. Tal precursor estendido de glicina tem uma estrutura molecular que é idêntica ao produto amidado desejado, exceto no C-terminal (em que o produto termina --X-NH2, enquanto o precursor termina --X-gly, em que X é o resíduo de aminoácido de C-terminal do produto). Uma enzima alfa-amidante descrita nas publicações acima catalisa a conversão de precursores em produto. Essa enzima é preferencialmente produzida de forma recombinante, por exemplo, em células de ovário de hamster chinês (CHO), conforme descrito em Biotechnology and Biopharm. artigos citados acima.

[0178] As formas de ácido livre de agentes ativos peptídicos da presente divulgação podem ser produzidas de maneira semelhante, exceto sem incluir uma glicina de C-terminal no “precursor”, cujo precursor é, em vez disso, o produto peptídico final e não requer a etapa de amidação.

[0179] Exceto onde indicado de outra forma, a dosagem preferencial dos miméticos de calcitonina da presente divulgação é idêntica para fins terapêuticos e profiláticos. As dosagens desejadas são discutidas em mais detalhes, infra, e diferem dependendo do modo de administração.

[0180] Exceto onde indicado de outra forma ou quando evidente a partir do contexto, as dosagens do presente documento se referem ao peso de compostos ativos (isto é, miméticos de calcitonina) não afetados por ou descontando excipientes, diluentes, carreadores ou outros ingredientes farmacêuticos, embora tais ingredientes adicionais sejam desejavelmente incluídos. Qualquer forma de dosagem (cápsula, comprimido, injeção ou similares) comumente usada na indústria farmacêutica para distribuição de agentes ativos de peptídeo é apropriada para uso no presente documento, e os termos “excipiente”, “diluente” ou “carreador” incluem tais ingredientes ativos como são tipicamente incluídos, juntamente com ingredientes ativos em tal forma de dosagem na indústria. Uma forma de dosagem oral preferencial é discutida em mais detalhes, infra, mas não deve ser considerada o modo exclusivo de administração dos agentes ativos da presente divulgação.

[0181] Os miméticos de calcitonina da presente divulgação podem ser administrados a um paciente para tratar uma série de doenças ou distúrbios. Conforme usado no presente documento, o termo “paciente” significa qualquer organismo que pertence ao reino Animalia. Em uma modalidade, o termo “paciente” se refere a vertebrados, mais preferencialmente, mamíferos, incluindo seres humanos.

[0182] Consequentemente, a presente divulgação inclui o uso dos peptídeos em um método de tratamento de diabetes tipo I, diabetes tipo II ou síndrome metabólica, obesidade ou de supressão de apetite, ou para atenuar a resistência à insulina, ou para reduzir um nível de glicose sérica em jejum indesejavelmente alto, ou para reduzir um nível de glicose sérica de pico indesejavelmente alto, ou para reduzir um nível de insulina de pico sérico indesejavelmente alto, ou para reduzir uma resposta indesejavelmente grande a um teste de tolerância à glicose, ou para tratar osteoporose, ou para tratar osteoartrite, ou para tratar esteato-hepatite não alcoólica (NASH), ou para tratar doença hepática gordurosa alcoólica, ou para produzir uma diminuição de triglicerídeos no fígado, ou para reduzir o acúmulo de gordura no fígado de um indivíduo.

[0183] Há uma série de medições reconhecidas na técnica de variação normal para peso corporal em vista de uma série de fatores, tais como sexo, idade e altura. Um paciente em necessidade de tratamento ou regimes de prevenção estabelecidos no presente documento incluem pacientes cujo peso corporal excede as normas reconhecidas ou que, devido à hereditariedade, fatores ambientais ou outro fator de risco reconhecido, estão em maior risco do que a população geral de se tornarem com sobrepeso ou obesos. De acordo com a presente divulgação, é contemplado que os miméticos de calcitonina podem ser usados para tratar diabetes em que o controle de peso é um aspecto do tratamento.

[0184] Em uma modalidade, o método inclui a administração entérica a um paciente em necessidade do mesmo para o tratamento de uma dita condição de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de qualquer um dos peptídeos descritos no presente documento.

[0185] Em uma modalidade, o método inclui a administração parentérica a um paciente em necessidade do mesmo para o tratamento de uma dita condição de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de qualquer um dos peptídeos descritos no presente documento. Para administração parentérica (incluindo injeção intraperitoneal, subcutânea, intravenosa, intradérmica ou intramuscular), soluções de um peptídeo da presente divulgação em óleo de gergelim ou amendoim ou em propilenoglicol aquoso podem ser empregadas, por exemplo. As soluções aquosas devem ser adequadamente tamponadas se necessário e o diluente líquido primeiramente tornado isotônico. Essas soluções aquosas são adequadas para fins de injeção intravenosa. As soluções oleosas são adequadas para fins de injeções intra- articular, intramuscular e subcutânea. A preparação de todas essas soluções sob condições estéreis é prontamente realizada por técnicas farmacêuticas padrão bem conhecidas pelos versados na técnica. Para aplicação parentérica, exemplos de preparações adequadas incluem soluções, preferencialmente, soluções oleosas ou aquosas, bem como suspensões, emulsões ou implantes, incluindo supositórios. Os peptídeos podem ser formulados na forma estéril em formatos de dose múltipla ou única, como sendo dispersos em um carreador fluido, como solução salina fisiológica estéril ou soluções de dextrose salina a 5% comumente usadas com injetáveis.

[0186] O dito método pode incluir uma etapa preliminar para determinar se o paciente sofre de uma dita condição e/ou uma etapa subsequente para determinar em que medida o dito tratamento é eficaz na mitigação da condição no dito paciente, e em cada caso, realizar um teste oral de tolerância à glicose ou um nível de açúcar no sangue em repouso.

[0187] As formulações entéricas orais são para ingestão engolindo-se para subsequente liberação no intestino abaixo do estômago e, portanto, entrega através da veia porta para o fígado, em oposição às formulações para serem mantidas na boca para permitir a transferência para a corrente sanguínea através de vias sublinguais ou bucais.

[0188] As formas de dosagem adequadas para uso na presente divulgação incluem comprimidos, minicomprimidos, cápsulas, grânulos, péletes, pós, sólidos efervescentes e formulações sólidas mastigáveis. Essas formulações podem incluir gelatina que é preferencialmente gelatina hidrolisada ou gelatina de baixo peso molecular. Tais formulações podem ser obtidas por liofilização de uma solução aquosa homogênea que compreende um mimético de calcitonina e gelatina hidrolisada ou gelatina de baixo peso molecular e processamento adicional do material sólido resultante na dita formulação farmacêutica oral, e em que a gelatina pode ter um peso molecular médio de

1.000 a 15.000 Daltons. Tais formulações podem incluir um composto carreador protetor, tal como 5-CNAC ou outros, conforme divulgado neste documento.

[0189] Embora as formulações orais, tais como comprimidos e cápsulas, sejam preferenciais, as composições para uso na presente divulgação podem assumir a forma de xaropes, elixires ou similares e supositórios ou similares. A entrega oral é geralmente a via de entrega de escolha, uma vez que é conveniente, relativamente fácil e geralmente indolor, resultando em maior adesão do paciente em relação a outros modos de entrega. No entanto, barreiras biológicas, químicas e físicas, tais como variação de pH no trato gastrointestinal, enzimas digestivas poderosas e membranas gastrointestinais impermeáveis ao agente ativo, tornam problemática a entrega oral de peptídeos semelhantes à calcitonina a mamíferos, por exemplo, a liberação oral de calcitoninas, que são hormônios polipeptídicos de cadeia longa secretados pelas células parafoliculares da glândula da tireoide em mamíferos e pela glândula ultimobranquial de pássaros e peixes, provou-se originalmente difícil devido, pelo menos em parte, à estabilidade insuficiente da calcitonina no trato gastrointestinal, bem como à incapacidade da calcitonina de ser facilmente transportada através das paredes intestinais para a corrente sanguínea.

[0190] As formulações orais adequadas são, no entanto, descritas abaixo.

TRATAMENTO DE PACIENTES

[0191] Em uma modalidade, um mimético de calcitonina da presente divulgação é administrado em dosagem adequada para manter os níveis séricos do mimético em pacientes entre 5 picogramas e 1.000 nanogramas por mililitro, de preferência, entre 50 picogramas e 500 nanogramas, por exemplo, entre 1 e 300 nanogramas por mililitro. Os níveis séricos podem ser medidos por quaisquer técnicas adequadas conhecidas na técnica, tal como radioimunoensaio ou espectrometria de massa. O médico assistente pode monitorar a resposta do paciente e, então, alterar um pouco a dosagem para levar em consideração o metabolismo e a resposta do paciente individual. A liberação quase simultânea é melhor alcançada pela administração de todos os componentes da presente divulgação como um único comprimido ou cápsula. No entanto, a divulgação também inclui, por exemplo, dividir a quantidade necessária do mimético de calcitonina entre dois ou mais comprimidos ou cápsulas que podem ser administrados juntos de modo que juntos forneçam a quantidade necessária de todos os ingredientes. “Composição farmacêutica”, conforme usado no presente documento, inclui, mas sem limitação, uma dosagem completa apropriada para uma administração particular a um paciente, independentemente de se um ou mais comprimidos ou cápsulas (ou outras formas de dosagem) são recomendados em uma dada administração.

[0192] Um mimético de calcitonina da presente divulgação pode ser formulado para administração oral com o uso dos métodos empregados nos produtos Unigene Enteripep®. Esses podem incluir os métodos descritos na Patente no. US 5.912.014, Patente no. US 6.086.918, Patente no. US 6.673.574, Patente no. US 7.316.819, Patente no. US 8.093.207 e Publicação no. US 2009/0317462. Em particular, pode incluir o uso de conjugação do composto a um translocador de membrana, tal como o domínio de transdução de proteína da proteína TAT de HIV, coformulação com um ou mais inibidores de protease e/ou um agente de redução de pH que pode ser revestido e/ou um veículo protetor resistente a ácido e/ou um intensificador de absorção que pode ser um tensoativo.

[0193] Em uma modalidade, um mimético de calcitonina da presente divulgação é preferencialmente formulado para entrega oral de uma maneira conhecida na Publicação de Patente n o. U.S. 2009/0317462.

[0194] Em uma modalidade, um mimético de calcitonina da presente divulgação pode ser formulado para administração entérica, especialmente oral, por mistura com um composto carreador adequado. Compostos carreadores adequados incluem aqueles descritos na

Patente no. US 5.773.647 e Patente no. US 5866536 e dentre esses, 5-CNAC (ácido N-(5-clorossaliciloil)-8-aminocaprílico, comumente como seu sal dissódico) é particularmente eficaz. Outros carreadores ou agentes de entrega preferenciais são SNAD (sal de sódio de ácido 10-(2- hidroxibenzamido)decanoico) e SNAC (sal de sódio de ácido N-(8-[2- hidroxibenzoil]amino)caprílico). Em uma modalidade, uma composição farmacêutica da presente divulgação compreende uma quantidade eficaz de entrega de carreador, tal como 5-CNAC, isto é, uma quantidade suficiente para entregar o composto para o efeito desejado. Geralmente, o carreador, tal como 5-CNAC, está presente em uma quantidade de 2,5% a 99,4% em peso, mais preferencialmente 25% a 50% em peso da composição total.

[0195] Além disso, o documento WO 00/059863 divulga os sais dissódicos de fórmula I

[0196] em que

[0197] R1, R2, R3 e R4 são, independentemente, hidrogênio, -OH, -NR6R7, halogênio, C1-C4 alquila, ou C1-C4 alcóxi;

[0198] R5 é um C2-C16 alquileno substituído ou não substituído, C2-C16 alquenileno substituído ou não substituído, C1-C12 alquil(arileno) substituído ou não substituído ou aril(C1-C12 alquileno) substituído ou não substituído; e R6 e R7 são independentemente hidrogênio, oxigênio ou C1-C4 alquila; e seus hidratos e solvatos como particularmente eficazes para a entrega oral de agentes ativos, tais como calcitoninas, por exemplo, calcitonina de salmão, e esses podem ser usados na presente divulgação.

[0199] As formulações entéricas preferenciais com o uso de 5-CNAC opcionalmente micronizado podem ser geralmente conforme descrito no documento WO2005/014031.

[0200] O composto pode ser formulado para administração oral com o uso dos métodos empregados no produto de Capsitonina da Bone Medical Limited. Estes podem incluir os métodos incorporados em formulações de Axcess. Mais particularmente, o ingrediente ativo pode ser encapsulado em uma cápsula entérica capaz de resistir à circulação através do estômago. Este pode conter o composto ativo juntamente com um intensificador de absorção de álcool aromático hidrofílico, por exemplo, conforme descrito no documento WO02/028436. De um modo conhecido, o revestimento entérico pode se tornar permeável de modo sensível ao pH, por exemplo, a um pH de 3 a 7. O documento WO2004/091584 também descreve métodos de formulação adequados que usam intensificadores de absorção de álcool aromáticos.

[0201] O composto pode ser formulado com o uso dos métodos vistos nos produtos Oramed, que podem incluir a formulação com ácido graxo ômega-3, conforme visto no documento WO2007/029238 ou conforme descrito no documento US5.102.666.

[0202] Geralmente, os sais farmaceuticamente aceitáveis (especialmente sais monossódicos ou dissódicos), solvatos (por exemplo, solvatos de álcool) e hidratos desses carreadores e os agentes de entrega podem ser usados.

[0203] A administração oral das composições farmacêuticas de acordo com a divulgação pode ser realizada regularmente, por exemplo, uma ou mais em uma base diária ou semanal; intermitentemente, por exemplo, irregularmente durante um dia ou semana; ou ciclicamente, por exemplo, regularmente por um período de dias ou semanas seguido por um período sem administração. A forma de dosagem das composições farmacêuticas das modalidades atualmente divulgadas pode ser qualquer forma conhecida, por exemplo, formas de dosagem líquidas ou sólidas.

As formas de dosagem líquidas incluem emulsões em solução, suspensões, xaropes e elixires.

Além do composto ativo e veículo, tal como 5-CNAC, as formulações líquidas também podem incluir excipientes inertes comumente usados na técnica, tais como, agentes solubilizantes, por exemplo, etanol; óleos, tais como óleo de semente de algodão, rícino e gergelim; agentes umectantes; agentes emulsificantes; agentes de suspensão; edulcorantes; aromatizantes; e solventes, tal como água.

As formas de dosagem sólidas incluem cápsulas, cápsulas de gel mole, comprimidos, cápsulas com revestimento, pós, grânulos ou outras formas de dosagem oral sólidas, todas as quais podem ser preparadas por métodos bem conhecidos na técnica.

As composições farmacêuticas podem compreender adicionalmente aditivos em quantidades habitualmente empregadas incluindo, mas sem limitação, um ajustador de pH, um conservante, um aromatizante, um agente de mascaramento de sabor, uma fragrância, um umectante, um tonificante, um corante, um tensoativo, um plastificante, um lubrificante, tal como estearato de magnésio, um auxiliar de fluxo, um auxiliar de compressão, um solubilizante, um excipiente, um diluente, tal como celulose microcristalina, por exemplo, Avicel PH 102 fornecido pela FMC Corporation, ou qualquer combinação dos mesmos.

Outros aditivos podem incluir sais de tampão de fosfato, ácido cítrico, glicóis e outros agentes dispersantes.

A composição também pode incluir um ou mais inibidores de enzima, tal como actinonina ou epiactinonina e derivados dos mesmos; aprotinina, Trasylol e inibidor do tipo Bowman-Birk.

Além disso, um inibidor de transporte, isto é, uma [rho]- glicoproteína, tal como Cetoprofina, pode estar presente nas composições da presente divulgação.

As composições farmacêuticas sólidas da presente divulgação podem ser preparadas por métodos convencionais, por exemplo, mesclando-se uma mistura do composto ativo, do carreador, tal como 5-CNAC, e quaisquer outros ingredientes, amassando e preenchendo cápsulas ou, em vez de preencher cápsulas, moldagem seguida de mais compressão ou moldagem por compressão para gerar comprimidos.

Além disso, uma dispersão sólida pode ser formada por métodos conhecidos seguidos de processamento adicional para formar um comprimido ou cápsula. Preferencialmente, os ingredientes nas composições farmacêuticas da presente divulgação são homogênea ou uniformemente misturados em toda a forma de dosagem sólida.

[0204] Alternativamente, o composto ativo pode ser formulado como um conjugado com o dito carreador, que pode ser um oligômero, conforme descrito no documento US2003/0069170, por exemplo.

[0205] Esses conjugados podem ser administrados em combinação com um ácido graxo e um sal biliar, conforme descrito.

[0206] Podem ser usados conjugados com polietilenoglicol (PEG), conforme descrito, por exemplo, em Mansoor et al.

[0207] Alternativamente, os compostos ativos podem ser misturados com nitroso-N-acetil-D,L-penicilamina (SNAP) e solução de Carbopol ou com solução de taurocolato e Carbapol para formar uma emulsão mucoadesiva.

[0208] O composto ativo pode ser formulado carregando-se em nanocápsulas de quitosana, conforme divulgado em Prego et al (opcionalmente PEG modificado como em Prego C, Torres D, Fernandez- Megia E, Novoa-Carballal R, Quihoa E, Alonso MJ.) ou quitosana ou nanopartículas lipídicas revestidas com PEG, conforme divulgado em Garcia- Fuentes et al. Nanopartículas de quitosana para este propósito podem ser modificadas com iminotiolano, conforme descrito em Guggi et al. As mesmas podem ser formuladas em emulsões de água/óleo/água, conforme descrito em Dogru et al. A biodisponibilidade dos compostos ativos pode ser aumentada pelo uso de taurodeoxicolato ou lauroil carnitina, conforme descrito em Sinko et al ou em Song et al. Geralmente, nanopartículas adequadas como carreadores são discutidas em de la Fuente et al e podem ser usadas na presente divulgação.

[0209] Outras estratégias adequadas para formulação oral incluem o uso de um sistema intensificador de permeabilidade transitória (TPE), conforme descrito no documento WO2005/094785 de Chiasma Ltd. TPE faz uso de uma suspensão oleosa de partículas hidrofílicas sólidas em um meio hidrofóbico para proteger a molécula de fármaco da inativação pelo ambiente gastrointestinal hostil (GI) e ao mesmo tempo atua na parede do GI para induzir a permeação de suas moléculas de carga do fármaco.

[0210] Além disso, está incluído o uso de glutationa ou compostos que contêm vários grupos tiol, conforme descrito no documento US2008/0200563, para inibir a ação das bombas de efluxo na membrana de mucosa. Exemplos práticos de tais técnicas são descritos também em Caliceti, P. Salmaso, S., Walker, G. e Bernkop-Schnurch, A. (2004) 'Development and in vivo assessment of an oral insulin-PEG delivery system.' Eur. J. Pharm. Sci., 22, 315 a 323, em Guggi, D., Krauland, A.H., e Bernkop-Schnurch, A. (2003) 'Systemic peptide delivery via the stomach: in vivo evaluation of an oral dosage form for salmon calcitonin'. J. Control. Rel. 92, 125 a 135, e em Bernkop- Schnurch, A., Pinter, Y., Guggi, D., Kahlbacher, H., Schoffmann, G., Schuh, M., Schmerold, I., Del Curto, M.D., D'Antonio, M., Esposito, P. and Huck, Ch. (2005) 'The use of thiolated polymers as carrier matrix in oral peptide delivery' - Proof of concept. J. Control. Release, 106, 26 a 33.

[0211] O composto ativo pode ser formulado em microesferas sem costura, conforme descrito no documento WO2004/084870, em que o ingrediente farmacêutico ativo é solubilizado como uma emulsão, microemulsão ou suspensão formulada em miniesferas; e variavelmente revestido por tecnologias de revestimento convencionais ou inovadoras. O resultado é um fármaco encapsulado na forma “pré-solubilizada” que, quando administrado oralmente, fornece a liberação instantânea predeterminada ou sustentada do fármaco ativo em locais específicos e em taxas específicas ao longo do trato gastrointestinal. Em essência, a pré-solubilização do fármaco aumenta a previsibilidade de seu perfil cinético ao mesmo tempo em que aumenta a permeabilidade e a estabilidade do fármaco.

[0212] Pode-se empregar nanocápsulas revestidas com quitosana, conforme descrito no documento US2009/0074824. A molécula ativa administrada com essa tecnologia fica protegida dentro das nanocápsulas por serem estáveis contra a ação do fluido gástrico. Além disso, as propriedades mucoadesivas do sistema potencializam o tempo de adesão às paredes intestinais (constatou-se que há retardo na circulação gastrointestinal desses sistemas) facilitando uma absorção mais efetiva da molécula ativa.

[0213] Métodos desenvolvidos pela TSR1 Inc. podem ser usados. Isso inclui a Tecnologia de Solubilização Hidrofílica (HST), na qual a gelatina, um extrato de colágeno derivado naturalmente que carrega cargas positivas e negativas, reveste as partículas do ingrediente ativo contido nas micelas de lecitina e impede sua agregação ou aglomeração. Isso resulta em uma molhabilidade melhorada de partículas de fármacos hidrofóbicos por meio de interações polares. Além disso, a lecitina anfifílica reduz a tensão superficial entre o fluido de dissolução e a superfície de partícula.

[0214] O ingrediente ativo pode ser formulado com cucurbiturilos como excipientes.

[0215] Alternativamente, pode-se empregar a tecnologia GIPET da Merrion Pharmaceuticals para produzir comprimidos com revestimento entérico que contêm o ingrediente ativo com um intensificador de absorção que pode ser um ácido graxo de cadeia média ou um derivado de ácido graxo de cadeia média, conforme descrito no documento US2007/0238707 ou um peptídeo de translocação de membrana, conforme descrito no documento US7268214.

[0216] Pode-se empregar a tecnologia GIRES™, que consiste em uma forma de dosagem de liberação controlada dentro de uma bolsa inflável, que é colocada em uma cápsula de fármaco para administração oral. Após a dissolução da cápsula, um sistema de geração de gás infla a bolsa no estômago. Em ensaios clínicos, a bolsa demonstrou ser retida no estômago durante 16 a 24 horas.

[0217] Alternativamente, o ativo pode ser conjugado com um modificador protetor que o permite resistir à degradação enzimática no estômago e facilitar sua absorção. O ativo pode ser conjugado covalentemente com um derivado monodisperso de metoxipolietilenoglicol glicolipídeos de cadeia curta que é cristalizado e liofilizado no ingrediente farmacêutico ativo seco após purificação. Esses métodos são descritos no documento US5438040 e em www.biocon.com.

[0218] Pode-se também empregar uma vesícula direcionada ao fígado (HDV) para entrega ativa. Uma HDV pode consistir em lipossomas (≤150 nm de diâmetro) encapsulando o ativo, que também contém uma molécula de hepatócito em sua bicamada lipídica. A molécula de direcionamento direciona a entrega do ativo encapsulado às células do fígado e, portanto, quantidades relativamente reduzidas de ativo são necessárias para o efeito. Essa tecnologia é descrita no documento US2009/0087479 e posteriormente em www.diasome.com.

[0219] O ativo pode ser incorporado em uma composição que contém adicionalmente um meio hidrofílico substancialmente não aquoso que compreende um álcool e um cossolvente, em associação com um glicerídeo parcial de cadeia média, opcionalmente, em mistura com uma espécie de PEG de cadeia longa, conforme descrito no documento US2002/0115592 em relação à insulina.

[0220] Alternativamente, podem ser usados adesivos intestinais, conforme descrito no documento Shen Z, Mitragotri S, Pharm Res. abril de 2002;19 (4):391-5 'Intestinal patches for oral drug delivery.

[0221] O ativo pode ser incorporado em uma matriz erodível formada a partir de um hidrogel misturado com um polímero hidrofóbico, conforme descrito na Patente no. US 7189414.

[0222] Os níveis de dosagem oral adequados para humanos adultos a serem tratados podem estar na faixa de 0,05 a 5 mg,

preferencialmente de cerca de 0,1 a 2,5 mg.

[0223] A frequência do tratamento de dosagem dos pacientes pode ser de uma a quatro vezes por semana, preferencialmente uma a duas vezes por semana, e mais preferencialmente uma vez por semana. O tratamento será desejavelmente mantido por um período prolongado de pelo menos 6 semanas, preferencialmente pelo menos 6 meses, preferencialmente pelo menos um ano e, opcionalmente, por toda a vida.

[0224] Os tratamentos de combinação para condições relevantes podem ser realizados com o uso de uma composição de acordo com a presente divulgação e administração separada de um ou mais outros produtos terapêuticos. Alternativamente, a composição de acordo com a presente divulgação pode incorporar um ou mais outros produtos terapêuticos para administração combinada.

[0225] As terapias de combinação de acordo com a presente divulgação incluem combinações de um composto ativo, conforme descrito com insulina, GLP-2, GLP-1, GIP ou amilina, ou geralmente com outros antidiabéticos. Assim, as terapias de combinação, incluindo coformulações, podem ser feitas com sensibilizadores de insulina, incluindo biguanidas, tais como Metformina, Buformina e Fenformina, TZDs (PPAR), tais como Balaglitazona, Pioglitazona, Rivoglitazona, Rosiglitazona e Troglitazona, agonistas duplos de PPAR, tais como Aleglitazar, Muraglitazar e Tesaglitazar ou secretagogos, incluindo sulfonilureias, tais como Carbutamida, Cloropropamida, Gliclazida, Tolbutamida, Tolazamida, Glipizida, Glibenclamida, Gliburida, Gliquidona, Gliclopiramida e Glimepririda, Meglitinidas/glinidas (K+), tais como análogos de Nateglinida, Repaglinida e Mitiglinida, análogos de GLP-1, tais como Exenatida, Lixisenatida, Liraglutida, Semaglutida, dulaglutida e Albiglutida, inibidores de DPP-4, tais como Alogliptina, Linagliptina, Saxagliptina, Sitagliptina e Vildagliptina, análogos de insulina ou formulações especiais, tais como lispro, Insulina aspártica, Insulina glulisina, Insulina glargina (de ação prolongada), Insulina detemir), insulina inalável - Exubra e insulina NPH e outros incluindo inibidores de alfa-glucosidase, tais como Acarbose, Miglitol e Voglibose, análogos de amilina, tal como Pramlintida, inibidores de SGLT2, tais como Dapagliflozin, Empagliflozin, Remogliflozin e Sergliflozin, bem como diversos, incluindo Benfluorex e Tolrestat.

[0226] Outras combinações incluem coadministração ou coformulação com leptinas. A resistência à leptina é um componente bem estabelecido do diabetes tipo 2; entretanto, as injeções de leptina até agora não conseguiram melhorar essa condição. Em contrapartida, há evidências de que a amilina e, portanto, as moléculas com habilidades semelhantes à amilina, como os miméticos de calcitonina de salmão, são capazes de melhorar a sensibilidade à leptina. A combinação de amilina/leptina mostrou um efeito sinérgico no peso corporal e na ingestão de alimentos, e também na resistência à insulina [Kusakabe T et al].

[0227] Uma outra terapia de combinação preferencial inclui a coformulação ou coadministração dos peptídeos da invenção com um ou mais fármacos para perda de peso. Tais fármacos para perda de peso incluem, mas sem limitação, inibidores de lipase (por exemplo, inibidores de lipase pancreática, tal como Orlistat), derivados de anfetaminas supressores de apetite (por exemplo, fentermina), Topiramato, Qysmia® (combinação de fentermina/topiramato), agonistas de receptor de 5-HT2C (por exemplo, Locaserina), Contrave® (combinação de naltrexona/bupropiona), análogos e derivados de peptídeo-1 semelhante ao glucagon [GLP-1] (por exemplo, Liraglutida, semaglutida), sarco/retículo endoplasmático (SR), inibidores de Ca2+ ATPase (SERCA) (por exemplo, sarcolipina), agonistas do receptor de fator de crescimento de fibroblastos 21 [FGF-21] (por exemplo, análogos de FGF-21) e agonistas de adreno receptor β3 (por exemplo, Mirabegron). Essas combinações podem ser usadas para tratar uma condição de excesso de peso, tal como obesidade.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0228] Figura 1: Comparação de KBP346, KBP347,

KBP349, KBP351, KBP352, KBP353 e KBP089 na ingestão de alimentos e peso corporal. A) Ingestão de alimentos, 0 a 4 horas. B) Mudança de peso corporal, 4 horas. C) Ingestão de alimentos, 4 a 24 horas. D) Mudança de peso corporal, 24 horas. E) Consumo de alimentos, 24 a 49 horas. F) Mudança de peso corporal, 48 horas.

[0229] Figura 2: Teste de dose única de KBP375, KBP376 e KBP377. A dose única foi administrada em t = 0 e o efeito na ingestão de alimentos e no peso corporal de uma dose única de 36 nmol/kg de cada molécula foi monitorado por 168 horas e comparado frente a frente com um parâmetro de referência não acilado. A) Ingestão de alimentos. B) Mudança de peso corporal.

[0230] Figura 3: Teste de resposta à dose de KBP356, KB358, KBP362, KBP364, KB368 e KBP370. A dose única foi administrada em t = 0 e o efeito sobre a ingestão de alimentos e peso corporal de uma dose única de 36 nmol/kg de cada molécula foi monitorado por 168 horas. A-B) Ingestão de alimentos e peso corporal de variantes KBP-066 aciladas. C-D) Ingestão de alimentos e peso corporal de variantes KBP-062 aciladas. E-F) Ingestão de alimentos e peso corporal de variantes KBP-110 aciladas.

[0231] Figura 4: Efeito de uma única dose alta de KBP372 e KBP356 na ingestão de alimentos e no peso corporal. A) Efeito de KBP-042A11.03 (KBP372) sobre a ingestão de alimentos. B) Efeito de KBP- 042A11.03 (KBP372) sobre o peso corporal. C) Efeito de KBP-066A11.03 (KBP356) sobre a ingestão de alimentos. D) Efeito de KBP-066A11.03 (KBP356) sobre o peso corporal.

[0232] Figura 5: Estudo de ingestão de alimentos de 4 horas para KBP350.

[0233] Figura 6: Ingestão de alimentos acumulada. A) Ingestão de alimentos acumulada ao longo do tempo. A ingestão de alimentos é monitorada uma vez ao dia durante os 21 dias iniciais do estudo. n = 3 a 4 gaiolas. +/- SEM. B) Área total sob a curva dos dados apresentados na Figura 9A. n = 9 a 10. +/- SEM.

[0234] Figura 7: Peso corporal de ZDF durante o estudo. A) Peso corporal de ratos individuais em gramas B) Peso corporal normalizado para veículo em porcentagem. O peso corporal é registrado diariamente durante os primeiros 21 dias, depois duas vezes por semana até uma semana antes do final do estudo (dia 62). O peso corporal do grupo KBP- 066A11.03 foi monitorado diariamente até uma semana antes do final do estudo (dia 62). n = 9 a 10 ratos. +/- SEM.

[0235] Figura 8: Glicose no sangue em jejum de ZDF. A glicose no sangue em jejum é medida após 6 horas de jejum nos dias 0, 14, 28, 42 e 62 após o início do estudo. n = 9 a 10. +/- SEM.

[0236] Figura 9: Valores de ZDF HbAlc. A) HbAlc na linha de base. B) HbAlc no final do estudo. A HbAlc é medida no dia -3 a partir do início do estudo. A HbAlc é medida no final do estudo, dia 62. n = 9 a 10. +/- SEM.

[0237] Figura 10: Teste oral de tolerância à glicose (OGTT). A) um OGTT durante 180 min em ratos ZDF machos. B) Área total sob a curva durante o OGTT mostrado em A). O OGTT é realizado após 8 semanas de tratamento. Os ratos jejuaram por 11 h antes do ponto de tempo -30 minutos. Os níveis de glicose no sangue são medidos no ponto de tempo -30, 0, 15, 30, 60, 120 e 180 minutos. A glicose é administrada por via oral no ponto de tempo 0 minutos. Os valores de glicose no sangue acima de 33,3 mmol*L _1 foram atribuídos ao limite superior de detecção; 33,3 mmol*L_1. Os ratos não foram pré- doseados com solução salina ou KBP-066 ou KBP-066A no mesmo dia. n = 9 a

10. +/- SEM.

[0238] Figura 11: Teste de dose única de KBP-305, KBP-306, KBP-307, KBP-356, KBP-381, KBP-382 e KBP-383. A dose única foi dada em t = 0 e o efeito sobre a ingestão de alimentos e o peso corporal de uma dose única de 3 nmol/kg de cada molécula foram monitorados por 96 horas e comparados frente a frente entre si e com o veículo para determinar o comprimento de acilação ideal. A) Ingestão de alimentos aguda em gramas (g). B) Variação de peso corporal em gramas (g). n = 4 ratos por grupo. Dados como +/- SEM.

[0239] Figura 12: Estudo de perda de peso corporal de seis semanas em ratos HFD SD com o uso de compostos KBP-066A11 com diferentes comprimentos de acilação, acilações de 0,03, 0,04 e 0,05. Os ratos foram tratados com KBP-066A11.03, KBP-066A11.04, KBP-066A11.05 ou veículo e doseados a cada 3 dias com uma única injeção s.c. de composto de 4 nmol/kg. O peso corporal é registrado diariamente ao longo do estudo. A) Ingestão diária de alimentos em gramas (g) B) Perda de peso corporal de ratos individuais em gramas (g). n = 6 ratos por grupo. Dados como +/- SEM.

[0240] Figura 13: Parâmetros adicionais do estudo de perda de peso corporal em ratos HFD SD com o uso de compostos KBP-066A11 com diferentes comprimentos de acilação, acilação de 0,03, 0,04 ou 0,05. Os ratos foram tratados com KBP-066A11.03, KBP-066A11.04, KBP-066A11.05 ou veículo. Administrou-se aos ratos a cada 3 dias uma única injeção s.c. de composto de 4 nmol/kg. A) Teste oral de tolerância à glicose. B) Área incremental sob a curva do OGTT. C) Peso do WAT epididimal no final do estudo em gramas (g). D) Peso do WAT inguinal no final do estudo em gramas (g). E) Peso do WAT perirrenal no final do estudo em gramas (g). F) Mudança no peso corporal no final do estudo da linha de base em gramas (g). O peso corporal foi registrado diariamente ao longo do estudo. n = 6 ratos por grupo. Dados como +/- SEM.

[0241] Figura 14: Ensaio de ligação de ligante competitivo que usa calcitonina de salmão radiomarcada (125I-sCT) como traçador e conduziu 2% de albumina sérica de duas espécies diferentes, rato (Rattus norvegicus) e homem (Homo sapiens). Como marcador, foi usado 125I- sCT a 0,25 nM. A) Ensaio de ligação competitiva conduzido em 2% de RSA. B) Ensaio de ligação competitiva conduzido em 2% de HSA. Dados como +/- SEM.

[0242] Figura 15: Teste de dose única de KBP-356,

KBP-386, KBP-387, KBP-388, KBP-389 e KBP-390 para investigar a posição de acilação da estrutura principal de KBP-066. A dose única foi dada em t = 0 e o efeito sobre a ingestão de alimentos e o peso corporal de uma dose única de 3 nmol/kg de cada molécula foram monitorados por 96 horas e comparados frente a frente entre si e com o veículo para determinar a posição de acilação ideal. A) Ingestão de alimentos aguda em gramas (g). B) Variação de peso corporal em gramas (g). n = 4 ratos por grupo. Dados como +/- SEM.

[0243] Figura 16: Teste de dose única de KBP-391, KBP-312, KBP-313, KBP-314, KBP-315, KBP-316, KBP-317 e KBP-318 para investigar a posição de acilação da estrutura de KBP-021. A dose única foi dada em t = 0 e o efeito sobre a ingestão de alimentos e o peso corporal de uma dose única de 3 nmol/kg de cada molécula foram monitorados por 96 horas e comparados frente a frente entre si ou veículo para determinar a posição de acilação ideal. A) Ingestão de alimentos aguda em gramas (g). B) Variação de peso corporal em gramas (g). n = 4 ratos por grupo. Dados como +/- SEM.

[0244] Figura 17: Estudo de perda de peso corporal de seis semanas em ratos HFD SD com o uso de compostos KBP-066 com o mesmo comprimento de acilação, 0,03, mas posições diferentes, A11 e A19. Os ratos foram administrados a cada 3 dias com uma única injeção s.c. de composto 4 nmol/kg KBP-066A11.03 (KBP-356), KBP-066A19.03 (KBP-389) ou veículo. O peso corporal e a ingestão de alimentos foram registrados diariamente ao longo do estudo. A) Consumo diário de alimentos durante o estudo em gramas (g). B) Perda de peso corporal de ratos individuais em gramas (g). n = 6 ratos por grupo. Dados como +/- SEM.

[0245] Figura 18: Parâmetros adicionais do estudo de perda de peso corporal em ratos HFD SD com o uso de compostos KBP-066A11 com diferentes comprimentos de acilação, acilações 0,03, 0,04 e 0,05. Os ratos foram tratados com KBP-066A11.03 ou KBP-066A19.03 ou veículo. Administrou- se aos ratos a cada 3 dias uma única injeção s.c. de composto de 4 nmol/kg. A) Teste oral de tolerância à glicose. B) Área incremental sob a curva do OGTT. C)

Peso do WAT epididimal no final do estudo em gramas (g). D) Peso do WAT inguinal no final do estudo em gramas (g). E) Peso do WAT perirrenal no final do estudo em gramas (g). F) Mudança no peso corporal no final do estudo da linha de base em gramas (g). O peso corporal é registrado diariamente ao longo do estudo. n = 6 ratos por grupo. Dados como +/- SEM.

[0246] Figura 19: Investigação de ligante de acilação da estrutura principal de KBP-066 com o uso de teste de dose única de KBP- 356, KBP-384 e KBP-385. A dose única foi administrada em t = 0 e o efeito sobre o peso corporal de uma única dose de 4 nmol/kg de cada molécula foram monitorados por 96 horas e comparados frente a frente entre si para determinar o ligante de acilação ideal A) Ingestão de alimentos aguda em gramas (g). B) Variação de peso corporal em gramas (g). n = 4 ratos por grupo. Dados como +/- SEM.

EXEMPLOS

[0247] As modalidades atualmente divulgadas descritas nos Exemplos a seguir, que são estabelecidas para auxiliar na compreensão da divulgação, não devem ser interpretadas como limitando de forma alguma o escopo da divulgação, conforme definido nas reivindicações a seguir. Os exemplos a seguir são apresentados de modo a fornecer àqueles versados na técnica uma divulgação e descrição completas de como fazer e usar as modalidades descritas e não se destinam a limitar o escopo da presente divulgação nem se destinam a declarar que os experimentos abaixo são todos ou os únicos experimentos realizados. Esforços foram feitos para garantir a precisão com relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns desvios e erros experimentais devem ser levados em consideração. A menos que indicado de outra forma, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular médio em peso, a temperatura está em graus centígrados e a pressão é atmosférica ou próxima da atmosférica. Nos exemplos a seguir, os seguintes materiais e métodos foram empregados.

CÉLULAS E LINHAGENS CELULARES

[0248] As seguintes linhagens celulares que expressam os receptores de calcitonina, amilina e CGRP foram adquiridas e cultivadas de acordo com as instruções do fabricante.

[0249] 1. Receptor de Calcitonina (CTR): U20S- CALCR da DiscoveRx (Cat. no.: 93-0566C3).

[0250] 2. Receptor de Amilina (AMY-R): CHO-K1 CALCR + RAMP3 da DiscoveRx (Cat. no.: 93-0268C2).

PRODUTOS QUÍMICOS

[0251] Tioflavina T (T3516, Sigma). O estoque de ensaio ThT é preparado como uma solução a 10 mM em fosfato de sódio a 5 mM, pH 7,2. As alíquotas são armazenadas, protegidas da luz, a -20 °C. O estoque de ThT é descongelado e diluído antes do uso.

[0252] Para os miméticos de calcitonina testados (doravante denominados “KBPs acilados” ou simplesmente “KBPs”), as condições finais do tampão são Tris-HCl a 10 mM, pH 7,5.

[0253] A concentração final do peptídeo nos poços deve ser de 100 a 200 mM e a concentração final de ThT deve ser 4 mM. ThT é adicionado por último (10pl).

MODELOS ANIMAIS

[0254] Nos estudos de modelo animal, ratos Sprague Dawley (SD) saudáveis com 12 semanas foram usados para avaliar a potência dos KBPs acilados. Em alguns exemplos, os mesmos foram alimentados com ração normal antes e durante os testes, enquanto em outros exemplos, os ratos SD saudáveis de 12 semanas foram alimentados com dieta rica em gordura (HFD) por oito semanas antes do teste e durante o teste.

MIMÉTICOS DE CALCITONINA ACILADOS

[0255] As seguintes Tabelas 1a e 1b apresentam as sequências de aminoácidos dos miméticos de calcitonina acilados que foram testados. Conforme usado aqui:

[0256] Acilação 1 significa KAc-(ligante de ácido glutâmico)-(C16 ácido graxo [palmitato]);

[0257] Acilação 2 significa KAc-(ligante de ácido glutâmico)-(C18 diácido [ácido octadecanodioico]);

[0258] Acilação 3 significa KAc-(aminoácidos de 2xOEG ligados em conjunto com um resíduo de ácido glutâmico ligado ao N- terminal)-(C18 diácido [ácido octadecanodioico]).

[0259] Acilação 4 significa KAc-(aminoácidos de 2xOEG ligados em conjunto com um resíduo de ácido glutâmico ligado ao N- terminal)-(C20 diácido [ácido eicosanodioico]).

[0260] Acilação 5 significa KAc-(aminoácidos de 2xOEG ligados em conjunto com um resíduo de ácido glutâmico ligado ao N- terminal)-(C22 diácido [ácido docosanodioico]).

[0261] Acilação 6 significa KAc-(aminoácidos de 2xOEG ligados em conjunto com um resíduo de ácido glutâmico ligado ao N- terminal)-(C16 diácido [ácido hexadecanodioico]).

[0262] Acilação 7 significa KAc-(aminoácidos de 3xOEG ligados em conjunto com um resíduo de ácido glutâmico ligado ao N- terminal)-(C18 diácido [ácido octadecanodioico]).

[0263] Acilação 8 significa KAc-(aminoácidos de 1xOEG ligados em conjunto com um resíduo de ácido glutâmico ligado ao N- terminal)-(C18 diácido [ácido octadecanodioico]).

[0264] Acilação 9 significa KAc-(aminoácidos de 2xOEG ligados em conjunto com um resíduo de ácido glutâmico ligado ao N- terminal)-(C24 diácido [ácido tetracosanodioico]).

[0265] Acilação 10 significa KAc-(aminoácidos de 2xOEG ligados em conjunto com um resíduo de ácido glutâmico ligado ao N- terminal)-(C26 diácido [ácido hexacosanodioico]).

[0266] Acilação 11 significa KAc-(aminoácidos de 2xOEG ligados em conjunto com um resíduo de ácido glutâmico ligado ao N- terminal)-(C14 diácido [ácido tetradecanodioico]).

[0267] Os miméticos de calcitonina testados são baseados nas seguintes sequências de peptídeos centrais antes da modificação:

[0268] Na Tabela 1b, a seguinte nomenclatura adicional também é usada:

[0269] Assim, a título de exemplo, a nomenclatura KBP-066A11.03 indica que o peptídeo consiste na sequência central de KBP- 066, modificada por substituição na posição 11 por um resíduo de lisina com uma acilação de 2*OEG de C18 diácido.

As várias acilações têm as seguintes estruturas químicas: OEG-OEG-yGlu-C14 diácido (isto é, a acilação 11)

OEG-OEG-yGlu-C16 diácido (isto é, a acilação 6))

OEG-yGlu-C18 diácido (isto é, a acilação 8)

OEG-OEG-yGlu-C18 diácido (isto é, a acilação 3)

OEG-OEG-OEG-yGlu-C18 diácido (isto é, a acilação 7)

OEG-OEG-yGlu-C20 diácido (isto é a acilação 4)

OEG-OEG-yGlu-C22 diácido (isto é, a acilação 5)

OEG-OEG-yGlu-C24 diácido (isto é, a acilação 9)

OEG-OEG-yGlu-C26 diácido (isto é, a acilação 10) ESTUDOS INICIAIS DE ACILAÇÃO (EXEMPLOS 1 A 5) EXEMPLO 1 (FIGURAS 1 E 5)

[0270] Efeito comparativo de dose única de 1 variante acilada em diferentes posições (posição 9 “A09”, posição 11 “A11”, posição 16 “A16”, posição 18 “A18” e posição 32 “A32”) para um peptídeo de referência não acilado (KBP-089) na ingestão de alimentos e peso corporal em ratos SD magros de 12 semanas.

[0271] Os ratos foram mantidos em gaiolas individuais quatro dias antes do teste. Os ratos foram randomizados por peso em seis grupos (Veículo (0,9% de NaCl), KBPs (doses: 25 nmol/kg (ˆ100 μg/kg)). Eles jejuaram durante a noite e, em seguida, foram tratados com uma única dose de peptídeo ou veículo pela manhã, com o uso de administração subcutânea. A ingestão de alimentos foi monitorada nos seguintes intervalos (0 a 4 horas, 4 a 24 horas, 24 a 48 horas). O peso corporal foi medido na linha de base e às 24 horas e 48 horas após a injeção s.c.

[0272] A acilação nas posições “A09”, “A11” e “A32” com 1 acilação produziu uma resposta in vivo prolongada (Figura 1) que mereceu mais testes (consultar abaixo). As posições 12 (Figura 5), 16 e 18 retornaram um resultado inaceitável e não foram avançadas em novos experimentos. EXEMPLO 2: ENSAIO DE β-ARRESTINA

[0273] Os ensaios GPCR de PathHunter β-arrestina são ensaios funcionais de células inteiras que medem diretamente a capacidade de um ligante ativar um GPCR detectando a interação de β-arrestina com o GPCR ativado. Como o recrutamento de β-arrestina é independente da sinalização da proteína G, esses ensaios oferecem uma plataforma de triagem e perfilagem poderosa e universal que pode ser usada para virtualmente qualquer receptor acoplado a Gi-, Gs ou Gq.

[0274] Nesse sistema, o GPCR é fundido na estrutura com o pequeno fragmento de enzima ProLink™ e coexpresso em células que expressam de forma estável uma proteína de fusão de β-arrestina e o mutante de deleção de N-terminal maior de β-gal (denominado aceitador de enzima ou EA). A ativação do GPCR estimula a ligação de β-arrestina ao GPCR marcado com ProLink e força a complementação dos dois fragmentos de enzima, resultando na formação de uma enzima β-gal ativa. Essa interação leva a um aumento na atividade enzimática que pode ser medida com o uso de reagentes de detecção PathHunter® quimioluminescentes.

[0275] Em bioensaios independentes, as células CTR e AMY-R foram tratadas nos pontos de tempo indicados com doses crescentes de KBPs identificadas nas Tabelas 2 e 3 abaixo (100, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032 nM e veículo). O ensaio foi realizado em placas brancas de 384 poços (Greiner Bio- One, 784080). As células foram semeadas 2.500 células por poço em 10 μl de meio específico do tipo de célula no dia anterior ao experimento. Para quantificar o recrutamento de β-arrestina mediado por GPCR, o Kit de Detecção Pathhunter™ (93-0001, DiscoverX) foi usado e o ensaio realizado de acordo com as instruções do fabricante.

[0276] A resposta prolongada/demorada foi conduzida com o uso do receptor de calcitonina (CTR): U2OS-CALCR de DiscoveRx (Cat. no.: 93-0566C3), e ao contrário da produção clássica de três horas, a acumulação de β-arrestina foi conduzida ao longo de 3, 6, 24, 48 ou 72 horas e depois testada e analisada.

A Tabela 2 (acilação 2) e a Tabela 3 (acilação 3) apresentam os resultados do estudo de β-arrestina.

TABELA 2. ESTUDO DE β-ARRESTINA PARA A ACILAÇÃO 2 (KAc-(LIGANTE DE ÁCIDO GLUTÂMICO)-(C18 DIÁCIDO))

TABELA 3. ESTUDO DE β-ARRESTINA PARA A ACILAÇÃO 3 (KAC (AMINOÁCIDOS DE 2XOEG LIGADOS A UM RESÍDUO DE ÁCIDO GLUTÂMICO FIXADO A TERMINAIS N)-(C18 DIÁCIDO [ÁCIDO OCTADECANEDIOICO])

[0277] Os estudos de β-arrestina indicaram o seguinte:

[0278] 1) A potência das acilações em termos da posição de acilação no peptídeo é a seguinte: A11 > A32 > A09.

[0279] 2) A acilação 2 ou 3 na posição 11 (A11) é a combinação geralmente muito superior de acilação/posição para cada núcleo de peptídeo em termos de ativação do receptor de calcitonina (CTR), o receptor de amilina (AMY-R), resposta de CTR prolongada, e suprimindo a ingestão de alimentos.

[0280] 3) KBPs acilados com diferentes núcleos demonstram potência e padrões similares in vitro quando modificados com acilações idênticas. EXEMPLO 3 (FIGURA 2)

[0281] Efeito comparativo de dose única de 3 variantes aciladas de KBP089 A09 (KBP375), A11 (KBP376) e A32 (KBP377) com o KBP089 de Benchmark não acilado na ingestão de alimentos e peso corporal em ratos HFD SD de 20 semanas.

[0282] Os ratos foram mantidos em gaiolas individuais quatro dias antes do teste. Os ratos foram randomizados por peso em onze grupos (Veículo (0,9% de NaCl), KBPs (doses: 36 nmol/kg (150 a 157 μg/kg)). Eles jejuaram durante a noite e, em seguida, foram tratados com uma única dose de peptídeo ou veículo pela manhã, com o uso de administração subcutânea. A ingestão de alimentos foi monitorada nos seguintes intervalos (0 a 4 horas, 4 a 24 horas, 24 a 48 horas... 144 a 168 horas). O peso corporal foi medido na linha de base e a cada 24 horas após a injeção s.c.

[0283] Os estudos de modelo animal confirmaram os resultados do estudo de β-arrestina e demonstraram eficácia melhorada em relação ao peptídeo nu:

[0284] 1) A11 > A32 > A09 em termos de benefício da posição de acilação com o uso de KBP-089 como peptídeo central.

[0285] 2) Acilação 2 e acilação 3 são muito superiores ao KBP-089 não acilado na dose dada em termos de atividade e eficácia in vivo prolongadas.

[0286] O estudo em modelo animal também mostrou que a acilação na posição 9 reduziu a potência do peptídeo quando comparada ao peptídeo nu, descartando assim a posição 9 como uma posição de interesse em estudos posteriores.

EXEMPLO 4 (FIGURA 3)

[0287] Efeito comparativo de dose única de variantes aciladas A11 e A32 3 com diferentes núcleos de peptídeos para o respectivo KBP de Benchmark não acilado (KBP-066, KBP-062 e KBP-110) na ingestão de alimentos e peso corporal em ratos HFD SD de 20 semanas.

[0288] Os ratos foram mantidos em gaiolas individuais quatro dias antes do teste. Os ratos foram randomizados por peso em onze grupos (Veículo (0,9% de NaCl), KBPs (doses: 4 nmol/kg (ˆ17 μg/kg), 12 nmol/kg (ˆ50 μg/kg) ou 36 nmol/kg (ˆ150 μg/kg)). Eles jejuaram durante a noite e, em seguida, foram tratados com uma única dose de peptídeo ou veículo pela manhã, com o uso de administração subcutânea. A ingestão de alimentos foi monitorada nos seguintes intervalos (0 a 4 horas, 4 a 24 horas, 24 a 48 horas...144 a 168 horas). O peso corporal foi medido na linha de base e a cada 24 horas após a injeção s.c.

[0289] Os resultados são os seguintes:

[0290] 1) o núcleo do peptídeo não afeta a melhora observada pela acilação nas posições 11 ou 32.

[0291] 2) A11 é um sítio de acilação melhor do que A32. EXEMPLO 5 (FIGURA 4)

[0292] Efeito de alta dose única de variantes aciladas A11/3 de KBP-042 e KBP-066 na ingestão de alimentos e peso corporal em ratos HFD SD de 20 semanas. Os ratos foram mantidos em gaiolas individuais quatro dias antes do teste. Os ratos foram randomizados por peso em onze grupos

(Veículo (0,9% de NaCl), KBPs (doses: 300 nmol/kg (-1.000 μg/kg)). KBP Núcleo Anotação Posição/Acilação KBP-372 KBP-042 KBP-042A11.03 A11/3 acilação KBP-356 KBP-066 KBP-066A11.03 A11/3 acilação

[0293] Os ratos jejuaram durante a noite e depois foram tratados com uma dose única de peptídeo ou veículo pela manhã com o uso de administração subcutânea. A ingestão de alimentos foi monitorada nos seguintes intervalos (0 a 4 horas, 4 a 24 horas, 24 a 48 horas...188 a 312 horas). O peso corporal foi medido na linha de base e a cada 24 horas após a injeção s.c.

[0294] O teste de alta dose com o uso de KBP356 e KBP372 demonstrou uma eficácia superior in vivo prolongada que durou dias. Esses peptídeos acilados são, portanto, candidatos claros para o desenvolvimento de um peptídeo terapêutico uma vez por semana. EXEMPLO 6 (FIGURAS 6 A 10)

[0295] Trabalho adicional foi realizado no composto KBP-356 (KBP-066A11.03), que compreende um resíduo AiB na posição 8 e a acilação preferencial na posição 11 do peptídeo.

[0296] Um estudo crônico foi realizado em ratos ZDF machos (obesos homozigotos recessivos (fa/fa) cepa: 370) (Charles River, EUA). Os ratos nasceram com 5 semanas de idade. Os ratos foram alojados em 2 a 3 por gaiola. TRATAMENTO CRÔNICO DE RATOS ZDF MACHOS:

[0297] Os ratos foram entregues ao biotério da Nordic Bioscience com cinco semanas de idade (DIA - 6). Os ratos foram aclimatados por três dias. HbAlc e BW foram registrados (DIA - 3). Os ratos foram randomizados com base em HbAlc (principalmente) e BW (em segundo lugar) no dia 4. O estudo foi iniciado no DIA 1.

CONCENTRAÇÕES DE DOSAGEM E FREQUÊNCIA

[0298] Os animais foram doseados uma vez por dia com KBP-066 ou solução salina (veículo). A dosagem com KBP-066A11.03 foi realizada uma vez a cada três dias. A dosagem foi administrada por via subcutânea (SC) por volta do meio-dia.

[0299] Solução Salina: O volume de dosagem foi de 1 ml/kg.

[0300] KBP-066: O volume de dosagem foi de 1 ml/kg, a concentração de dosagem foi de 5, 50 ou 500 μg/kg e a concentração de composto foi de 5, 50 ou 500 mg/l. O equivalente de dose em nmol/kg é 1,43, 14,3 e 143 nmol/kg, respectivamente.

[0301] KBP-066A11.03: O volume de dosagem foi de 1 ml/kg, a concentração de dosagem foi de 25 nmol/kg e a concentração de composto foi de 25 mmol/l. A dose equivalente em μg/kg é de 104 μg/kg. GRUPOS DE TRATAMENTO EM nmol/kg GRUPOS DE TRATAMENTO EM μg/kg

DOSE TOTAL SEMANAL POR GRUPO DE TRATAMENTO:

[0302] 5 μg/kg de KBP-066 é igual a 35 μg/kg/semana ou 10 nmol/kg/semana

[0303] 50 μg/kg de KBP-066 é igual a 350 μg/kg/semana ou 100,4 nmol/kg/semana

[0304] 500 μg/kg de KBP-066 é igual a 3.500 μg/kg/semana ou 1.004 nmol/kg/semana

[0305] 25 nmol/kg de KBP-066 é igual a 243,4 μg/kg/semana ou 58,3 nmol/kg/semana

[0306] Os compostos foram dissolvidos em solução salina e armazenados a -20 °C.

[0307] As alíquotas foram descongeladas imediatamente antes da administração.

COLETA DE RESULTADOS DE TESTE

[0308] DIA -3: Medição de HbAlc

[0309] DIA 1: (primeiro dia de estudo), os ratos jejuaram por 6h e uma amostra de sangue e GB foi coletada. A dosagem foi realizada posteriormente.

[0310] DIA 14: Glicemia em jejum (FBG) + amostra de sangue (6 h em jejum)

[0311] DIA 28: FBG + amostra de sangue (6 h em jejum)

[0312] DIA 42: FBG + amostra de sangue (6 h em jejum)

[0313] DIA 57: (gr. 1+2)/58 (gr. 3+4) OGTT sem pré- dosagem de KBP-066 ou KBP-066A11.03 (11 horas em jejum). HblAc é medido durante o OGTT em t = 120 ou t = 180.

[0314] DIA 62: FBG + amostra de sangue (6 h rápido)

INGESTÃO DE ALIMENTOS

[0315] A ingestão de alimentos foi monitorada diariamente. O peso corporal foi monitorado diariamente durante as primeiras três semanas, depois duas vezes por semana após a terceira semana.

GLICOSE NO SANGUE EM JEJUM

[0316] A glicose no sangue em jejum foi monitorada a cada duas semanas com o uso do sistema de monitoramento Accu-Check® Avia (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Suíça): A medição foi feita na veia da cauda (agulha 25G). HbAlc

[0317] Os ratos não jejuaram na primeira (randomização) e na segunda medição (após o segundo OGTT) de HbAlc. Uma única gota de sangue foi aplicada ao cassete de HbAlc e a HbAlc foi medida com o uso de um Analisador DCA Vantage. A dosagem do composto ou solução salina foi realizada subsequentemente durante a primeira e a segunda medições de HbAlc.

TESTE ORAL DE TOLERÂNCIA À GLICOSE

[0318] Um teste oral de tolerância à glicose (OGTT) foi realizado após oito semanas de tratamento. O peso corporal do dia anterior foi usado para calcular a dose de glicose administrada. Os animais foram mantidos em jejum por 11 horas. O calor foi aplicado aprox. 45 min antes do ponto de tempo -30 min (consultar a figura abaixo). Os animais foram pré- doseados com KBP-066, KBP-066A11.03 ou solução salina durante o primeiro

OGTT, mas não no segundo OGTT, portanto (C) na figura abaixo. Gráfico de OGTT B = amostra de sangue (EDTA), aprox. 200 a 300 μl BG = glicose no sangue. G = glicose (oral, 1 g de glicose/kg de peso corporal, 2 ml/kg)) C = composto (ou solução salina) (SC.)

RESULTADOS FIGURA 6A+B, INGESTÃO DE ALIMENTOS

ACUMULADA

[0319] A Figura 6A mostra a ingestão de alimentos acumulada durante o curso do estudo. Todos os grupos de tratamento comem menos do que o veículo. Além disso, doses mais altas levam a maior redução na ingestão de alimentos. O grupo de tratamento KBP-066A11.03 acilado teve a maior redução da ingestão de alimentos em comparação com KBP-066 em todas as dosagens. No final do estudo, todos os grupos de tratamento tiveram uma redução significativa nos alimentos consumidos ao longo do estudo em comparação com o veículo, com o tratamento KBP-066A11.03 acilado mostrando a maior redução na ingestão de alimentos; -35% de redução na ingestão de alimentos face a face com o veículo (Figura 6B). FIGURA 7A+B, PESO CORPORAL

[0320] Todos os grupos de tratamento perderam peso corporal nas três primeiras semanas do estudo. À medida que os ratos com veículo ZDF ficaram progressivamente mais doentes e, portanto, não conseguiram manter seu peso corporal/taxa de ganho (Figura 7A), os grupos de tratamento alcançaram o grupo de veículo em termos de peso. A taxa de ganho de peso em comparação com o veículo era dependente da dose, bem como era dependente do tipo de composto usado no grupo de tratamento (Figura 7B). O grupo de tratamento acilado KBP-066A11.03 tem a taxa de recuperação mais lenta, seguido pelos grupos de 14,3 e 143 nmol/kg e 1,43 nmol/kg como o recuperador de peso mais rápido.

[0321] Isso mostra que o KBP-66A11.03 acilado administrado em um regime de dosagem s.c. uma vez a cada três dias tem benefícios farmacológicos adicionais em relação ao KBP-066 não acilado administrado s.c., uma vez ao dia. FIGURA 8, GLICOSE NO SANGUE EM JEJUM

[0322] Como os ratos de veículo ZDF se tornaram progressivamente mais doentes e não conseguiram manter a FBG, todos os grupos de tratamento atenuaram a FBG efetivamente durante o estudo em comparação com o veículo. O tratamento KBP-066A11.03 acilado foi o tratamento mais eficaz, permitindo apenas um aumento modesto de 5 mM em FBG durante o estudo de 62 dias nesse modelo animal superagressivo de diabetes tipo 2. O KBP-066 não acilado reduziu a FBG de uma maneira dependente da dose, mas não foi tão potente quanto o grupo de tratamento acilado na atenuação de FBG. Novamente, isso mostra que o KBP-66A11.03 acilado tem benefícios farmacológicos adicionais sobre o KBP-066 não acilado. FIGURA 9, HBALC NA LINHA DE BASE E FINAL DO

ESTUDO

[0323] Como esperado, os valores de HbAlc na linha de base são quase idênticos antes do início do diabetes e das modalidades de tratamento em ratos ZDF machos (Figura 9A). No final do estudo (Dia 62), todos os grupos de tratamento reduziram significativamente os níveis de HbAlc em comparação com o veículo. Curiosamente, o grupo de tratamento KBP- 066A11.03 acilado apresentou os valores de HbAlc mais baixos. Além disso, também foi significativamente menor do que todos os grupos de tratamento KBP-

066 não acilados (Figura 9B), demonstrando uma outra vantagem da acilação face a face ao equivalente não acilado. FIGURA 10, TESTE ORAL DE TOLERÂNCIA À GLICOSE (OGTT)

[0324] Um teste oral de tolerância à glicose foi conduzido após oito semanas de tratamento e os resultados são ilustrados na Figura 10A. Devido às diferenças induzidas pelo tratamento em FBG, as curvas de OGTT individuais são marcadamente diferentes. Essa diferença é destacada nos valores de tAUC calculados (Figura 10B). Todos os grupos de tratamento têm tAUC significativamente mais baixa em comparação com o veículo. O grupo de tratamento de KBP-066A11.03 acilado teve o menor valor de tAUC e também foi significativamente menor do que dois dos três grupos de tratamento de KBP- 066 não acilado e com um valor p de 0,06 quando comparado ao último grupo, 143 nmol/kg de KBP-066 (Figura 10B).

[0325] Em conclusão, os dados coletivos mostram que o KBP-66A11.03 acilado administrado em um regime de dose s.c a cada três dias tem benefícios farmacológicos adicionais significativamente vantajosos em relação ao KBP-066 não acilado administrado s.c. uma vez ao dia em ratos ZDF obesos e diabéticos. RESUMO DOS RESULTADOS DOS EXEMPLOS 1 A 6

RESULTADOS DOS ESTUDOS DE ACILAÇÃO POR

SÍTIO DE ACILAÇÃO POSIÇÃO A09 (ACILAÇÃO NA POSIÇÃO 9 DO PEPTÍDEO)

[0326] A acilação de posição A09 com 1 acilação produziu uma atividade in vivo prolongada sustentada que mereceu mais testes (Figura 1A a F).

[0327] Além disso, a acilação da posição A09 com 2 e 3 acilações atenuou EC50 no receptor CTR e AMYR e não produziu resposta prolongada no CTR (Tabelas 3 e 4).

[0328] No entanto, a acilação de A09 com 2 e 3 acilações interrompeu a eficácia prolongada in vivo observada anteriormente do peptídeo central, tornando a potência do KBP acilado semelhante à do veículo. Portanto, eles eram menos potentes do que o peptídeo central não acilado (Figuras 2A e B) na redução da ingestão de alimentos e do peso corporal após uma única injeção s.c. de 36 nmol/kg de composto.

[0329] A posição A09, portanto, não recebeu nenhuma consideração adicional. POSIÇÃO A11 (ACILAÇÃO NA POSIÇÃO 11 DO PEPTÍDEO)

[0330] A acilação de posição A11 com a acilação 1 produziu uma atividade in vivo prolongada sustentada que mereceu mais testes (Figuras 1A a F).

[0331] A acilação de posição A11 com as acilações 2 e 3 resultou no melhor valor de EC50 testado em ambos os receptores CTR e AMYR, e produziu os valores de resposta prolongada mais altos (tAUC) em todos os peptídeos centrais testados (Tabelas 3 e 4).

[0332] Além disso, as acilações A11/3 melhoraram a atividade in vivo do peptídeo central significativamente em comparação com o peptídeo central não acilado na redução da ingestão de alimentos (Figura 2A) e peso corporal (Figura 2B) após uma única injeção s.c. de 36 nmol/kg de composto. As acilações A11/3 também foram melhores na redução da ingestão de alimentos e peso corporal do que quaisquer outras posições aciladas ao usar KBP-089 como peptídeo central (Figuras 2A e B).

[0333] Essa diferença foi ainda acentuada em um teste de resposta à dose (Figuras 3A a F) em que três doses (4 nmol/kg, 12 nmol/kg e 36 nmol/kg) foram todas superiores aos peptídeos A32/3 acilados correspondentes. Em termos de potência, a dose mais baixa de 4 nmol/kg de A11/3 teve um perfil semelhante aos 36 nmol/kg de peptídeos acilados A32/3. Isso foi consistentemente demonstrado para todos os peptídeos centrais testados (Figuras 3A a F).

[0334] Para investigar melhor a potência da posição A11 com a acilação 3, KBP-042 e KBP-066 acilados na posição A11 com a acilação 3 foram testados em uma dose alta (300 nmol/kg) e comparados com as versões não aciladas para demonstrar o efeito máximo potencial da eficácia in vivo prolongada combinada com a biodisponibilidade prolongada (Figuras 4A a D).

[0335] A acilação 3 na posição A11 atenuou a ingestão de alimentos por mais de 120 horas, retornando aos níveis de consumo de alimentos do veículo após 144 horas tanto para KBP-042 (Figura 4A) quanto para KBP-066 (Figura 4C). A perda de peso corporal mediada pelo tratamento atingiu o pico após 96 horas e o peso corporal voltou aos níveis basais após 240 horas para KBP-042 (Figura 4B) e KBP-066 (Figura 4D).

[0336] Em conclusão, A11 foi a melhor posição testada em termos de preservação de potência de ligante e maximização da eficácia in vivo demorada. POSIÇÃO A12 (ACILAÇÃO NA POSIÇÃO 12 DO PEPTÍDEO)

[0337] A posição A12 com acilação 1 produziu o pior resultado in vivo no estudo de ingestão de alimentos de 4h quando comparada ao veículo (Figura 5).

[0338] Assim, a posição A12 não era uma boa candidata para acilação e não foi testada posteriormente. POSIÇÃO A16 (ACILAÇÃO NA POSIÇÃO 16 DO PEPTÍDEO)

[0339] A posição A16 com uma acilação 1 não demonstrou atividade prolongada in vivo (Figuras 1A a F).

[0340] Assim, a posição A16 não era uma boa candidata com o uso de acilação 1 e não foi testada posteriormente. POSIÇÃO A18 (ACILAÇÃO NA POSIÇÃO 18 DO

PEPTÍDEO)

[0341] A posição A18 com uma acilação 1 foi eficaz ao longo do período de teste de 4 a 24 horas, no entanto, a eficácia observada não foi mantida no estudo de atividade prolongada (KBP-347, 48 h, Figura 1F).

[0342] Assim, a posição A18 não era uma boa candidata com o uso de acilação 1 e não foi testada posteriormente. POSIÇÃO A32 (ACILAÇÃO NA POSIÇÃO 32 DO PEPTÍDEO)

[0343] A posição A32 com uma acilação 1 demonstrou um efeito prolongado in vivo sobre a ingestão de alimentos e sobre o peso corporal, e estava entre as melhores dos compostos testados (Figuras 1A a F).

[0344] A posição A32 com acilações 2 e 3 resultou em valores inferiores de EC50 tanto no receptor CTR quanto no receptor AMYR em comparação com a posição A11. A acilação da posição A32 atenuou a resposta prolongada mediada por CTR ligeiramente em comparação com a posição A11, mas ainda manteve uma resposta prolongada (Tabelas 3 e 4).

[0345] As acilações na posição A32 melhoraram a eficácia in vivo de uma única dose s.c. de tratamento em comparação com os equivalentes de não acilação para todos os peptídeos de núcleo testados.

[0346] No entanto, a posição foi inferior a A11 em todas as acilações 2 e 3 testadas durante os estudos in vivo em doses equivalentes (Figuras 2A e B, Figuras 3A a F).

[0347] Em conclusão, A32 foi uma posição medíocre em termos de preservação da potência de ligante e melhora da eficácia in vivo usando 1, 2 e 3 acilações em comparação com a posição A11. OUTROS ESTUDOS DE ACILAÇÃO (EXEMPLOS 7 A 12) EXEMPLO 7: ENSAIOS DE β-ARRESTINA E TIOFLAVINA

T

[0348] Ensaios de GPCR de β-Arrestina PathHunter adicionais foram realizados, com o uso do mesmo protocolo, conforme descrito acima em conexão com o Exemplo 2. Em bioensaios independentes, as células CTR e AMY-R foram tratadas nos pontos de tempo indicados com doses crescentes de KBPs identificadas nas Tabelas 4.1 a 4.4 (variando de 1 mM a 0,1 nM e veículo).

[0349] Ensaios de tioflavina T também foram realizados. A tioflavina T (ThT) é um corante amplamente utilizado para a detecção de fibrilas amiloides. Na presença de fibrilas, ThT tem um máximo de excitação em 450 nm e emissão aumentada em 480 nm, enquanto ThT é essencialmente não fluorescente nesses comprimentos de onda quando não está ligado a fibrilas amiloides.

[0350] Assim, o ThT em combinação com um leitor de placa fluorescente é uma ferramenta ideal para a triagem de um grande número de amostras in vitro quanto à presença de fibrilas amiloides. O ensaio ThT usado para o KBPS foi uma modificação do procedimento descrito por Nielsen et. al. (Nielsen L, Khurana R, Coats A, FrØkjaer S, Brange J, Vyas S, et al. Effect of environmental factors on the kinetics of insulin fibril formation: elucidation of the molecular mechanism. Biochemistry. 2001; 40 (20): 6036-46.1) para medir a fibrilação de insulina.

[0351] Os ensaios de triagem de fibrilação foram conduzidos em placas de 384 poços (Greiner Bio-One, 784080) em triplicatas de amostra com um volume final de 20 μl. A placa é selada com um filme adesivo óptico para evitar a evaporação da amostra durante o ensaio.

[0352] A placa é carregada em um leitor de placa fluorescente, tal como um software SpectraMax com SoftMax Pro 7.0.2, e o modelo definido para 37 °C com comprimento de onda de excitação em 450 nm e comprimento de onda de emissão em 480 nm.

[0353] O leitor de placa deve medir a fluorescência a cada 10 minutos por 24 horas com uma agitação de placa de cinco segundos antes da primeira leitura e uma agitação de placa de três segundos antes de todas as outras leituras. Alternativamente, a placa é lida após os seguintes tempos de incubação; 0, 1, 2, 4 e 24 horas.

[0354] Unidades de fluorescência relativa (RFU) de plotagem como uma função do tempo. A fibrilação é determinada como um aumento na RFU sobre a linha de base, conforme descrito por Nielsen et. al.

[0355] Neste processo, quatro camadas de fibrilação foram definidas com base no sinal de fluorescência de 18 h para obter uma única saída que reflete o potencial de fibrilação dos peptídeos:

[0356] Nenhum = < 1.000 RFU, Baixo = 1.000 a 3.000 RFU, Médio = 3.000 a 10.000, Alto = > 10.000

[0357] Os resultados dos ensaios de Tioflavina T também são mostrados nas Tabelas 4.1 a 4.4. TABELA 4.1. ESTUDO DE β-ARRESTINA PARA DIFERENTES COMPRIMENTOS DE ACILAÇÃO (KAc-(LIGANTE DE ÁCIDO GLUTÂMICO)-(C14 a C26 DIÁCIDO)) TABELA 4.2. ESTUDO DE β-ARRESTINA PARA

DIFERENTES POSIÇÕES DE ACILAÇÃO COM O USO DE ESTRUTURA PRINCIPAL (KBP-066) E ACILAÇÃO 3 (KAc-(LIGANTE DE ÁCIDO

GLUTÂMICO)-(C18 DIÁCIDO)) TABELA 4.3. ESTUDO DE β-ARRESTINA PARA

DIFERENTES POSIÇÕES DE ACILAÇÃO COM O USO DE ESTRUTURA PRINCIPAL (KBP-021) E ACILAÇÃO 3 (KAc-(LIGANTE DE ÁCIDO GLUTÂMICO)-(C18 DIÁCIDO))

TABELA 4.4. ESTUDO DE β-ARRESTINA PARA

DIFERENTES LIGANTES DE ACILAÇÃO USANDO A MESMA ESTRUTURA PRINCIPAL (KBP-066) E A MESMA ACILAÇÃO (C18 DIÁCIDO)) RESULTADOS - COMPRIMENTO DE ACILAÇÃO

[0358] Em termos de potência in vitro em função do comprimento de acilação, houve uma correlação clara entre o comprimento de acilação e a potência in vitro. Os valores de EC50 em ambos os CTR e AMYR pelas acilações mais curtas, 11 (C14 diácido) e 6 (C16 diácido), produziram as EC50 mais baixas em ambos os receptores (Tabela 4.1), enquanto as acilações mais longas, 9 (C24 diácido) e 10 (C26 diácido), produziram alguns dos valores de EC50 mais altos registrados em ambos os receptores.

[0359] Nenhum dos peptídeos acilados testados nesta série com o uso da estrutura principal de KBP-066 apresentou qualquer problema de fibrilação. RESULTADOS - POSIÇÃO DE ACILAÇÃO NA ESTRUTURA PRINCIPAL DE KBP-066

[0360] Os valores de EC50 no CTR e AMYR nessa série estão listados na Tabela 4.2. Em termos de potência in vitro em função da posição de acilação na estrutura principal de KBP-066, três posições se destacam como potentes agonistas de receptor de calcitonina e amilina duplos. Todos A11, A19 e A24 têm valores de EC50 em ambos os receptores na faixa de 5 × 10-9 M como os únicos, enquanto todas as outras posições testadas estão prejudicadas em comparação. A potência aumentada de A11, A19 e A24 parece traduzir-se em eficácia in vivo melhorada para a estrutura principal de KBP-066 (consultar Figuras 15, 17 e 18 descritas abaixo). Curiosamente, A09 está entre os melhores agonistas de CTR, mas tem atividade de AMYR fraca, sugerindo que uma acilação próxima ao N-terminal pode interromper a atividade de AMYR e gerar um ligante tendencioso.

[0361] A fibrilação não parece ser um problema para a estrutura principal de KBP-066 na maioria das posições, já que apenas um peptídeo (KBP-066A16.03 (387)) produziu uma pontuação “baixa" no ensaio de ThT. RESULTADOS - POSIÇÃO DE ACILAÇÃO NA ESTRUTURA PRINCIPAL DE KBP-021

[0362] Os valores de EC50 no CTR e AMYR para esta série estão listados na Tabela 4.3. Em termos de potência in vitro em função da posição de acilação na estrutura principal de KBP-021, duas posições se destacam como potentes agonistas duplos. Ambas A11 e A19 têm valores de EC50 em ambos os receptores na faixa de 5 × 10-9 M como os únicos, enquanto todas as outras posições testadas estão prejudicadas em comparação. A potência aumentada de A11 e A19 também parece traduzir-se em eficácia in vivo melhorada para a estrutura principal de KBP-021 (consultar Figura 16 descrita abaixo).

[0363] Curiosamente, a fibrilação parece ser um problema para a estrutura principal de KBP-021, em que a posição A19 como o único peptídeo testado obteve uma pontuação “Alta” no ensaio de ThT, apesar da boa potência tanto in vitro quanto in vivo. A posição próxima a ele “A18”

também teve uma pontuação alta com uma pontuação “Média” no ensaio de ThT, sugerindo que a estrutura principal de KBP-021 é suscetível à fibrilação quando acilada nessa área da estrutura principal.

[0364] Além disso, as acilações mais longas também parecem aumentar a fibrilação para esta estrutura principal, KBP-021, já que a acilação 4 e 5 na posição A11, obteve uma pontuação "Baixa" no ensaio de ThT, no entanto, este problema não afetou a posição A11 favorecida com a acilação

3. RESULTADOS - LIGANTE DE ACILAÇÃO

[0365] Os valores de EC50 no CTR e AMYR para essa série estão listados na Tabela 4.4. Em termos de potência in vitro em função da posição de acilação na estrutura principal de KBP-066, o ligante OEG-OEG- yGLU (356) tem uma EC50 quase 10 vezes melhor no CTR em comparação com OEG-OEG-OEG-yGLU (385) e OEG-yGLU (384), no entanto, todos os ligantes têm EC50 muito semelhante na faixa de 5 × 10-9 M no AMYR.

[0366] Em termos de fibrilação, o ligante mais curto, OEG-yGLU (384), produziu uma pontuação “baixa” no ensaio de ThT, enquanto os outros dois ligantes produzem uma pontuação “Nula”. EXEMPLO 8: (FIGURA 11)

[0367] Efeito comparativo de dose única de várias variantes aciladas (3, 4, 5, 6, 9, 10, 11) na mesma posição e estrutura principal, A11 e KBP-066, respectivamente, na ingestão de alimentos e peso corporal em um cenário agudo em 20 ratos SD com uma semana de idade alimentam HFD por 8 semanas antes do experimento.

[0368] Os ratos foram mantidos em gaiolas individuais quatro dias antes do teste. Os ratos foram randomizados por peso em oito grupos (Veículo (0,9% de NaCl), KBPs (doses: 3 nmol/kg (10 a 11 μg/kg)). Eles jejuaram durante a noite e, em seguida, tratados com uma única dose de peptídeo ou veículo pela manhã com o uso de administração subcutânea. A ingestão de alimentos foi monitorada nos seguintes intervalos (0 a 4 horas, 4 a 24 horas, 24 a 48 horas, 48 a 72 horas e 72 a 96 horas). O peso corporal foi medido na linha de base e às 4 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas e 96 horas após a injeção s.c. RESULTADOS DA FIGURA 11 - INGESTÃO DE

ALIMENTOS E PESO CORPORAL

[0369] A acilação 6, 10, 11 é capaz de atenuar a ingestão de alimentos e o peso corporal com um pico de supressão em 24 horas, seguido por rebote para os níveis de veículo. A acilação 9 é capaz de atenuar a ingestão de alimentos e o peso corporal com um pico de supressão em 48 horas, seguido por rebote para os níveis de veículo. A acilação 3 é capaz de atenuar a ingestão de alimentos e o peso corporal com um pico de supressão em 72 horas, seguido por rebote para os níveis de veículo. As acilações 4 e 5 foram capazes de atenuar a ingestão de alimentos e o peso corporal com um pico de supressão após 96 horas, seguido por um rebote.

[0370] Portanto, as acilações 3, 4 e 5 são todos os principais candidatos para o comprimento de acilação, já que o objetivo inicial era suprimir a ingestão de alimentos e o peso corporal por um mínimo de 72 horas, já que a cada terceiro dia de dosagem em roedores parece se traduzir em uma dosagem semanal no homem. EXEMPLO 9 (FIGURAS 12, 13 E 14)

[0371] Trabalho adicional foi conduzido nos melhores desempenhos do teste agudo, variantes aciladas (3, 4, 5), e um estudo com o uso de dosagem repetida para efeito comparativo das acilações com a mesma posição e estrutura, A11 e KBP-066 respectivamente, foi realizado. A ingestão de alimentos e o peso corporal foram investigados em um ambiente crônico (estudo de cinco semanas) em ratos SD de 20 semanas alimentados com HFD por 8 semanas antes do início do estudo.

[0372] Os ratos foram engaiolados dois e dois e foram randomizados por peso em grupos de tratamento (Veículo (0,9% de NaCl), KBPs (doses: 3 nmol/kg (14 μg/kg)). A ingestão de alimentos e o peso corporal foram monitorados diariamente por 35 dias. No final do estudo, foi realizado um OGTT seguido pela terminação do animal, no qual o tecido adiposo foi retirado e pesado.

TRATAMENTO CRÔNICO DE RATOS HFD SD MACHOS

[0373] Os ratos foram entregues ao biotério da Nordic Bioscience com doze semanas de idade e imediatamente colocados em HFD e alimentados por mais oito semanas. Antes do início do estudo, os ratos foram randomizados com base no peso corporal. O estudo foi iniciado no DIA 1.

CONCENTRAÇÕES DE DOSAGEM E FREQUÊNCIA

[0374] Administrou-se KBPs aos animais uma vez a cada três dias. A dosagem foi administrada por via subcutânea (SC) por volta do meio-dia todos os dias. Os compostos foram dissolvidos em solução salina e armazenados a -20 °C. As alíquotas foram descongeladas imediatamente antes da administração.

[0375] Solução Salina: O volume de dosagem foi de 1 ml/kg.

[0376] KBPs: O volume de dosagem foi de 1 ml/kg, a concentração de dosagem foi de 4 nmol/kg.

[0377] A dose equivalente em μg/kg foi de 14 μg/kg. Dose total semanal por grupo de tratamento: 4 nmol/kg de KBP é igual a 28 nmol/kg/semana ou 100 μg/kg/semana

COLETA DE RESULTADOS DE TESTE

[0378] DIA 1: (o primeiro dia de dosagem do estudo foi realizado

[0379] Dia 1 a 35: Monitoramento diário da ingestão de alimentos e peso corporal

[0380] DIA 35: Peso corporal no final do estudo

[0381] DIA 35: Teste de tolerância oral à glicose

[0382] DIA 35: Terminação + tecido adiposo pesado

TESTE ORAL DE TOLERÂNCIA À GLICOSE

[0383] Um teste de tolerância à glicose (OGTT) foi realizado após cinco semanas de tratamento. O peso corporal do dia anterior foi usado para calcular a dose de glicose administrada. Os animais foram mantidos em jejum por 11 horas. O calor foi aplicado aprox. 45 min antes do ponto de tempo -30 min (consultar a figura abaixo). Os animais foram doseados com KBPs ou veículo no dia anterior ao OGTT.

GRÁFICO DE OGTT BG = glicose no sangue. G = glicose (oral, 1 g de glicose/kg de peso corporal, 2 ml/kg)) PESAGEM DO TECIDO ADIPOSO BRANCO (WAT)

[0384] Todo o depósito de WAT epididimal e perirrenal foi dissecado e pesado. Para WAT inguinal, uma área limitada anatômica fixa foi dissecada e pesada. RESULTADOS DA FIGURA 12, INGESTÃO DE

ALIMENTOS E PESO CORPORAL

[0385] A Figura 12 mostra a mudança na ingestão de alimentos e no peso corporal ao longo do tempo durante o estudo crônico em função do tratamento. A Figura 12A mostra a dinâmica na ingestão de alimentos entre as acilações 3, 4 e 5, enquanto a Figura 12B mostra a perda de peso corporal mediada pelas acilações 3, 4 e 5. É evidente que todas as três acilações dão uma redução significativa no peso corporal após 5 semanas de tratamento, no entanto, não há diferenças entre a acilação 3, 4 e 5 em termos de eficácia no peso corporal. RESULTADOS DA FIGURA 13, OGTT E TECIDO

ADIPOSO

[0386] A Figura 13 mostra os resultados do OGTT com a iAUC correspondente (OGTT) (Figuras A+B), bem como o peso de três tecidos adiposos diferentes, epididimais, inguinais e perirrenais (Figuras 13C-E) e o peso corporal como final do estudo (Figura 13F). O tratamento com acilação 3 resultou em uma redução significativa em iAUC (OGTT), tamanho de WAT epididimal, tamanho de WAT perirrenal e peso corporal conforme o estudo. O tratamento com as acilações 4 e 5 resultou em uma redução significativa em iAUC (OGTT), tamanho de WAT epididimal e peso corporal no final do estudo, mas não no tamanho de WAT perirrenal. Nenhum dos tratamentos reduziu significativamente o tamanho de WAT inguinal. A acilação 3 teve um desempenho ligeiramente melhor contra o veículo em comparação com 4/5, mas não houve diferenças significativas entre os grupos de tratamento. RESULTADOS DA FIGURA 14, LIGAÇÃO COMPETITIVA DE LIGANTE I-125 sCT

[0387] Para investigar se a eficácia melhorada no cenário agudo de acilações 4 e 5 pode ser traduzida para o homem, um ensaio de ligação de ligante competitivo foi conduzido para explorar a ligação de acilação à albumina sérica em roedores e no homem. A Figura 14 mostra a ligação competitiva de KBP-066A11.03 e KBP-066A11.05 com calcitonina de salmão 1 a 125 radiomarcada (NEX423, Perkin Elmer) em 2% de albumina sérica de roedores (RSA) (Figura 4A) ou 2% de albumina sérica de humanos (HSA) (Figura 4B). Quando o ensaio é conduzido com 2% de HSA, não há diferenças quanto à EC50 entre as acilações 3 e 5. No entanto, quando o ensaio foi conduzido em RSA, a acilação 5 deslocou a IC50 ainda mais para a direita, sugerindo uma afinidade mais forte para RSA no ensaio. Portanto, a eficácia melhorada observada no cenário agudo em roedores é provavelmente um fenômeno exclusivo para roedores e não translacional para o homem. EXEMPLO 10 (FIGURA 15)

[0388] Efeito comparativo de dose única de 3 variantes aciladas em posições diferentes (posição 9 “A09”, posição 11 “A11”, posição 12 “A12”, posição 16 “A16”, posição 18 “A18”, posição 19 “A19” e posição 32 “A32”) entre si na ingestão de alimentos e peso corporal em ratos HFD SD de 20 semanas.

[0389] Os ratos foram mantidos em gaiolas individuais quatro dias antes do teste. Os ratos foram randomizados por peso em oito grupos (Veículo (0,9% de NaCl), KBPs (doses: 4 nmol/kg (10 a 11 μg/kg)). Eles jejuaram durante a noite e, em seguida, foram tratados com uma única dose de peptídeo ou veículo pela manhã, com o uso de administração subcutânea. A ingestão de alimentos foi monitorada nos seguintes intervalos (0 a 4 horas, 4 a 24 horas, 24 a 48 horas, 48 a 72 horas e 72 a 96 horas). O peso corporal foi medido na linha de base e às 4 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas e 96 horas após injeção s.c.. Duas estruturas principais foram testadas, KBP-066 e KBP-021.

FIGURA 15 RESULTADOS - INGESTÃO DE ALIMENTOS

E PESO CORPORAL

[0390] Em termos de posição na estrutura principal, os resultados de KBP-066 são os seguintes. A 4 nmol/kg em um cenário agudo (Figura 5), as posições A11 e A19 foram as duas melhores posições para suprimir a ingestão de alimentos por 72 horas e o peso corporal por 96 horas. A terceira melhor posição foi A24, seguido por A18 e A16. A posição menos potente para acilar foi A12, que parece uma posição desvantajosa para acilação, uma vez que parece interferir de alguma forma na eficácia mediada por DACRA na ingestão de alimentos e no peso corporal.

[0391] Com base nesses dados, A11 e A19 são as posições preferenciais para acilar a estrutura de KBP-066. FIGURA 16 RESULTADOS - INGESTÃO DE ALIMENTOS

E PESO CORPORAL

[0392] Ao usar uma estrutura principal diferente, o KBP-021, com os mesmos cenários experimentais de KBP-066, o padrão de posição era ligeiramente diferente.

[0393] A 3 nmol/kg em um cenário agudo (Figura 6), as posições A11 e A19 foram de longe as duas melhores posições para suprimir a ingestão de alimentos por 72 horas e o peso corporal por 96 horas, como o que foi observado para a estrutura principal de KBP-066. A terceira melhor posição era A18, mas era muito inferior quando comparada a A11 e A19. A posição A24 era melhor do que o veículo, mas longe do que foi observado para a estrutura principal de KBP-066. As posições A16, A12 e A09 falharam em se separar do veículo tanto na ingestão de alimentos quanto no peso corporal, sugerindo que as posições em que foram acilados eram desvantajosas, pois interferiam na atividade de peptídeo.

[0394] No entanto, como mostra a tabela 4.3 de características in vitro, A19 e A18 têm grandes problemas em termos de potencial de fibrilação em combinação com KBP-021, o que torna A11 a posição preferida para acilar quando se trata da estrutura principal de KBP-021. EXEMPLO 11 (FIGURAS 17 E 18)

[0395] Trabalho adicional foi conduzido nos melhores desempenhos do teste agudo, posições aciladas (A11 e A19), e um estudo com o uso de doses repetidas para efeito comparativo das acilações com a mesma acilação e estrutura principal, isto é, acilação 3 e KBP-066, respectivamente.

[0396] A ingestão de alimentos e o peso corporal foram investigados em um ambiente crônico (estudo de cinco semanas) em ratos SD de 20 semanas alimentados com HFD por 8 semanas antes do início do estudo.

[0397] O protocolo experimental, conforme descrito acima no Exemplo 9 foi seguido. Resumidamente, os ratos foram engaiolados dois e dois e foram randomizados por peso em grupos de tratamento (Veículo (NaCl de 0,9%), KBPs (doses: 4 nmol/kg (14 μg/kg)). A ingestão de alimentos e o peso corporal foram monitorados diariamente por 35 dias. No final do estudo, um OGTT foi realizado seguido pela terminação do animal em que o tecido adiposo foi retirado e pesado. RESULTADOS DA FIGURA 17 - INGESTÃO DE ALIMENTOS E PESO CORPORAL PARA A11 VS A19 EM UM AMBIENTE

CRÔNICO

[0398] A Figura 17 mostra a mudança na ingestão de alimentos (Figura 17A) e no peso corporal (Figura 17B) ao longo do tempo durante o estudo crônico em função do tratamento. É evidente que A11 e A19 suprimem a ingestão de alimentos de forma semelhante e geram uma redução significativa no peso corporal após 5 semanas de tratamento, no entanto, não há diferença entre as posições A11 e A19 em termos de eficácia no peso corporal. RESULTADOS DA FIGURA 18, OGTT E TECIDO

ADIPOSO

[0399] A Figura 18 mostra os resultados do OGTT com a iAUC correspondente (OGTT) (Figuras A+B), bem como o peso de três tecidos adiposos diferentes, epididimais, inguinais e perirrenais (Figuras 18C-E) e o peso corporal como final do estudo (Figura 18F). O tratamento com a posição A11 resultou em uma redução significativa na iAUC (OGTT), tamanho de WAT epididimal, tamanho de WAT perirrenal e peso corporal, conforme o estudo. O tratamento com a posição A19 resultou em uma redução significativa na iAUC (OGTT), tamanho de WAT epididimal e peso corporal, conforme o estudo, mas não no tamanho de WAT perirrenal. Nenhum dos tratamentos reduziu significativamente o tamanho de WAT inguinal. A posição A11 teve um desempenho ligeiramente melhor contra o veículo em comparação com a posição A19, mas não houve diferença significativa entre os grupos de tratamento. EXEMPLO 12 (FIGURA 19)

[0400] Efeito comparativo de dose única de três variantes de ligante acilado (3, 7 e 8) na mesma posição e estrutura, A11 e KBP- 066, respectivamente, na ingestão de alimentos e peso corporal em um cenário agudo em ratos SD de 20 semanas alimentados com HFD por 8 semanas antes do experimento.

[0401] Os ratos foram mantidos em gaiolas individuais quatro dias antes do teste. Os ratos foram randomizados por peso em oito grupos (Veículo (0,9% de NaCl), KBPs (doses: 4 nmols/kg (13 a 14 μg/kg)). Eles jejuaram durante a noite e depois foram tratados com uma única dose de peptídeo ou veículo de manhã com o uso de administração subcutânea. A ingestão de alimentos foi monitorada nos seguintes intervalos (0 a 4 horas, 4 a 24 horas, 24 a 48 horas, 48 a 72 horas e 72 a 96 horas). O peso corporal foi medido na linha de base e às 4 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas e 96 horas após a injeção s.c.. RESULTADOS DA FIGURA 19 - INGESTÃO DE

ALIMENTOS E PESO CORPORAL

[0402] Todos os três ligantes testados funcionaram bem em um cenário agudo e toda a ingestão de alimentos atenuada (Figura 19A) por até 72 horas antes da repercussão. A acilação 3 foi ligeiramente melhor do que 7 e 8 após 96 horas. Isso foi evidente na perda de peso corporal correspondente (Figura 19B), em que a acilação 3 se separou das acilações 7 e 8 no início (24 horas) e continuou a se separar em dois pontos de tempo seguintes, 72 horas e 96 horas. Além disso, em termos de potencial de fibrilação (Tabela 4.4), a acilação 8 parece ter algumas tendências menores que podem complicar o desenvolvimento posterior do composto com o uso desse tipo de acilação. RESUMO DOS RESULTADOS DOS EXEMPLOS 7 A 12

COMPRIMENTO DE ACILAÇÕES

[0403] Os dados coletados das Figuras 11 a 14 e Tabela 4.1 sugerem que as acilações, 3, 4 e 5, na faixa de C18 diácido a C22 diácido, são intercambiáveis ao desenvolver peptídeos acilados para um regime de dosagem uma vez por semana no homem.

[0404] Portanto, C18, C20 e C22 diácido são o comprimento de acilação preferido para esta invenção.

POSIÇÃO DE ACILAÇÃO

[0405] Os dados coletados nas Figuras 15, 17 e 18 demonstraram que A19 pode ter uma leve borda em um cenário agudo, enquanto A11 tem uma ligeira borda em um cenário crônico ao usar a estrutura principal de KBP-066 e acilação 3.

[0406] Nem A11 nem A19 tiveram problemas com fibrilação quando combinados com a estrutura principal de KBP-066 (Tabela 4.2)

[0407] No geral, esses dados sugerem que as posições de acilação A11 e A19 juntamente com KBP-066, são as duas melhores posições gerais para acilação para o desenvolvimento de um regime de dosagem uma vez por semana no homem.

[0408] Portanto, A11 e A19 são as posições preferidas para acilação de KBP-066.

[0409] De modo similar, com base na Tabela 4.3 e na Figura 16, é evidente que A11 e A19 são as duas melhores posições de acilação quando combinadas com KBP-021.

[0410] No entanto, como A19 é muito suscetível à fibrilação neste cenário, a A11 com acilação 3 é a posição e comprimento de acilação preferenciais para a estrutura principal de KBP-021 com base no desempenho geral.

LIGANTE DE ACILAÇÃO

[0411] Com base neste teste e na Tabela 4.4, parece que o ligante OEG-OEG-γGLU é o ligante ideal, pois encurtá-lo gera problemas de fibrilação em potencial e alongá-lo, na melhor das hipóteses, não faz nada. Além disso, como a Figura 19 demonstrou, o ligante OEG-OEG-γGLU também teve o melhor desempenho em um cenário agudo, in vivo, tornando-o o ligante de acilação global preferencial.

[0412] Neste relatório descritivo, a menos que expressamente indicado de outra forma, a palavra “ou” é usada no sentido de um operador que retorna um valor verdadeiro quando uma ou ambas as condições estabelecidas são atendidas, em oposição ao operador “exclusivo ou” que requer que apenas uma das condições seja atendida.

A palavra “compreendendo” é usada no sentido de “incluindo” e não no sentido de “consistindo em”. Todos os ensinamentos anteriores reconhecidos acima são incorporados ao presente documento a título de referência.

Claims (50)

REIVINDICAÇÕES

1. Mimético de calcitonina caracterizado pelo fato de que é acilado em um resíduo de lisina localizado na posição 11 do mimético de calcitonina e/ou que é acilado em um resíduo de lisina localizado na posição 19 do mimético de calcitonina, em que o grupo ε-amino da cadeia lateral do dito resíduo de lisina é acilado com um grupo acila selecionado a partir de qualquer um dos seguintes: C16 ou ácido graxo mais longo com um ligante opcional, ou C16 ou diácido graxo mais longo com um ligante opcional.

2. Mimético de calcitonina, de acordo com a reivindicação 1, em que o mimético de calcitonina é caracterizado pelo fato de que é um mimético de calcitonina de fórmula (I) (a): CX2X3LSTCX8LGKAc... em que X2 = A, G ou S X3 = N ou S X8 = M, V ou ácido α-aminoisobutírico (AiB) e em que KAc é um resíduo de lisina em que o grupo ε- amino de cadeia lateral é acilado com um grupo acila selecionado a partir de qualquer um dos seguintes: C16 ou ácido graxo mais longo com um ligante opcional, ou C16 ou diácido graxo mais longo com um ligante opcional.

3. Mimético de calcitonina, de acordo com a reivindicação 1, em que o mimético de calcitonina é caracterizado pelo fato de que é um mimético de calcitonina de fórmula (I) (b): CX2X3LSTCX8LGX11X12X13X14X15X16X17X18KAc. . . em que X2 = A, G ou S X3 = N ou S X8 = M, V ou ácido α-aminoisobutírico (AiB)

X11 = R, K, T, A ou KAc X12 = L ou Y X13 = S, T, W ou Y X14 = Q, K, R ou A X15 = D, E ou N X16 = L ou F X17 = H ou N X18 = R, K ou N e em que KAc é um resíduo de lisina em que o grupo ε- amino de cadeia lateral é acilado com um grupo acila selecionado a partir de qualquer um dos seguintes: C16 ou ácido graxo mais longo com um ligante opcional, ou C16 ou diácido graxo mais longo com um ligante opcional.

4. Mimético de calcitonina, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o mimético de calcitonina é caracterizado pelo fato de que é um mimético de calcitonina de fórmula (II): CX2X3LSTCX8LGX11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X2 3X24X25X26X27GX29X30X31P em que X2 = A, G ou S X3 = N ou S X8 = M, V ou ácido α-aminoisobutírico (AiB) X11 = KAc, R, K, T ou A X12 = L ou Y X13 = S, T, W ou Y X14 = Q, K, R ou A X15 = D, E ou N X16 = L ou F X17 = H ou N X18 = R, K ou N X19 = KAc, L, F ou K

X20 = Q, H ou A X21 = T ou R X22 = Y ou F X23 = S ou P X24 = G, K, Q ou R X25 = T, I ou M X26 = S, N, D, G ou A X27 = T, V, F ou I X29 = S, A, P ou V X30 = N, G ou E X31 = A, T ou S em que X11 é KAc e/ou X19 é KAc, e em que KAc é um resíduo de lisina em que o grupo ε- amino de cadeia lateral é acilado com um grupo acila selecionado a partir de qualquer um dos seguintes: C16 ou ácido graxo mais longo, C16 ou diácido graxo mais longo, ligante-C16 ou ácido graxo mais longo, ou ligante-C16 ou diácido graxo mais longo.

5. Mimético de calcitonina, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o mimético de calcitonina de fórmula (II) é: CX2X3LSTCX8LGX11LX13X14X15LX17X18X19X20TX22PX24TD VGANAP em que X2 = A, G ou S X3 = N ou S X8 = M, V ou AiB X11 = KAc, R, K, T ou A X13 = T, S ou Y X14 = Q ou A X15 = D ou E

X17 = H ou N X18 = R ou K X19 = KAc, L, F ou K X20 = Q, H ou A X22 = Y ou F X24 = K, Q ou R em que X11 = KAc e/ou X19 = KAc, e em que KAc é um resíduo de lisina em que o grupo ε- amino de cadeia lateral é acilado com um grupo acila selecionado a partir de qualquer um dos seguintes: C16 ou ácido graxo mais longo, C16 ou diácido graxo mais longo, ligante-C16 ou ácido graxo mais longo, ou ligante-C16 ou diácido graxo mais longo.

6. Mimético de calcitonina, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que X2 é S e X3 é N; ou X2 é G e X3 é N; ou X2 é A e X3 é S.

7. Mimético de calcitonina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que - X11 é KAc, X17 é H, X18 é K, X19 é L e X20 é Q ou A; ou - X11 é KAc, X17 é H, X18 é R, X19 é L e X20 é Q ou A; ou - X11 é KAc, X17 é N, X18 é K, X19 é F e X20 é H ou A; ou - X11 é KAc, X17 é N, X18 é R, X19 é F e X20 é H ou A; ou - X11 é R ou K, X17 é H, X18 é K, X19 é KAc e X20 é Q ou A; ou - X11 é R ou K, X17 é H, X18 é R, X19 é KAc e X20 é Q ou A ; ou - X11 é R ou K, X17 é N, X18 é K, X19 é KAc e X20 é H ou A ; ou - X11 é R ou K, X17 é N, X18 é R, X19 é KAc e X20 é H ou A .

8. Mimético de calcitonina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo fato de que X 2 é S, X3 é N, X11 é KAc, X13 é S, X17 é H, X18 é K ou R, X19 é L, X20 é Q ou A e X22 é Y; ou em que X2 é S, X3 é N, X11 é R ou K, X13 é S, X17 é H, X18 é K ou R, X19 é KAc, X20 é Q ou A e X22 é Y.

9. Mimético de calcitonina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo fato de que X2 é A, X3 é S , X11 é KAc, X13 é S , X17 é H, X18 é K ou R, X19 é L, X20 é Q ou A e X22 é F; ou em que X2 é A, X3 é S, X11 é R ou K, X13 é S , X17 é H, X18 é K ou R, X19 é KAc, X20 é Q ou A e X22 é F.

10. Mimético de calcitonina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo fato de que X2 é G, X3 é N, X11 é KAc, X13 é T, X17 é N, X18 é K ou R, X19 é F, X20 é H ou A e X22 é F; ou em que X2 é G, X3 é N, X11 é R ou K, X13 é T, X17 é N, X18 é K ou R, X19 é KAc, X20 é H ou A e X22 é F.

11. Mimético de calcitonina, de acordo com a reivindicação 1, em que o mimético de calcitonina é caracterizado pelo fato de que é um peptídeo de 33 mer de acordo com a fórmula (III): CSNLSTCX6LGX7LSQDLHRX8QTYPKX1TX5VGANAP ou em que o mimético de calcitonina é um peptídeo de 35 mer de acordo com a fórmula (IV): CSNLSTCX6LGX7LSQDLHRX8QTYPKX1X2X3TX5VGANA

P ou em que o mimético de calcitonina é um peptídeo de 36 mer de acordo com a fórmula (V): CSNLSTCX6LGX7LSQDLHRX8QTYPKX1X2X3X4TX5VGAN

AP ou em que o mimético de calcitonina é um peptídeo de 37 mer de acordo com a fórmula (VI): CSNLSTCX6LGKAcLZX1X2X3X4TX5VGANAP em que cada um dentre X1 a X4 é qualquer aminoácido, com a condição de que pelo menos um dentre X1 a X4 seja um resíduo de aminoácido básico e/ou pelo menos dois de X1 a X4 sejam independentemente um resíduo de aminoácido polar ou um resíduo de aminoácido básico, e/ou pelo menos um dentre X1 a X4 seja um resíduo Gly, e em que nenhum dentre X1 a X4 seja um resíduo ácido; em que X5 é D ou N; em que X6 é AiB ou M; em que X7 é KAc e X8 é L, ou X7 é R ou K e X8 é KAc; em que Z é selecionado a partir de SQDLHRLSNNFGA, SQDLHRLQTYGAI ou ANFLVHSSNNFGA; e em que KAc é um resíduo de lisina em que o grupo ε-amino de cadeia lateral é acilado com um grupo acila selecionado a partir de qualquer um dos seguintes: C16 ou ácido graxo mais longo, C16 ou diácido graxo mais longo, ligante-C16 ou ácido graxo mais longo, ou ligante-C16 ou diácido graxo mais longo.

12. Mimético de calcitonina, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dentre X1 ou X4 é um resíduo de aminoácido básico.

13. Mimético de calcitonina, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dentre X7 ou X4 é um resíduo de aminoácido básico e pelo menos dois dentre X 1 a X4 são independentemente um resíduo de aminoácido polar ou um resíduo de aminoácido básico e nenhum dentre X1 a X4 é um resíduo ácido.

14. Mimético de calcitonina, de acordo com as reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que pelo menos três dentre X1 a X4 são independentemente um resíduo de aminoácido polar ou um resíduo de aminoácido básico, e nenhum dentre X1 a X4 é um resíduo ácido.

15. Mimético de calcitonina, de acordo com as reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo fato de que todos dentre X1 a X4 são independentemente um resíduo de aminoácido polar ou um resíduo de aminoácido básico, e nenhum dentre X1 a X4 é um resíduo ácido.

16. Mimético de calcitonina, de acordo com as reivindicações 11 a 15, caracterizado pelo fato de que todos os X 1 a X4 são independentemente um resíduo de aminoácido polar ou um resíduo de aminoácido básico, pelo menos três dentre X1 a X4 são resíduos de aminoácidos básicos e nenhum dentre X1 a X4 é um resíduo ácido.

17. Mimético de calcitonina, de acordo com as reivindicações 11 a 16, caracterizado pelo fato de que os resíduos de aminoácidos básicos são selecionados a partir de Arg, His ou Lys, e/ou os resíduos de aminoácidos polares são selecionados a partir de Ser, Thr, Asn, Gln ou Cys.

18. Mimético de calcitonina, de acordo com as reivindicações 11 a 17, caracterizado pelo fato de que X 1 é selecionado a partir de Asn, Phe, Val, Gly, Ile, Leu, Lys, His ou Arg; X2 é selecionado a partir de Ala, Asn, His, Leu, Ser, Thr, Gly ou Lys; X3 é selecionado a partir de Ala, Phe, Ile, Ser, Pro, Thr, Gly ou Lys; e/ou X4 é selecionado a partir de Ile, Leu, Gly, His, Arg, Asn, Ser, Lys, Thr ou Gln; com a condição de que pelo menos um dentre X1 ou X4 seja um resíduo de aminoácido básico e/ou pelo menos dois dentre X 1 a X4 sejam independentemente um resíduo de aminoácido polar e/ou um resíduo de aminoácido básico e/ou pelo menos um dentre X1 a X4 seja um resíduo Gly.

19. Mimético de calcitonina, de acordo com as reivindicações 11 a 18, caracterizado pelo fato de que X1 é selecionado a partir de Asn, Gly, Ile, His ou Arg;

X2 é selecionado a partir de Asn, Leu, Thr, Gly ou Lys; X3 é selecionado a partir de Phe, Pro, Ile, Ser, Thr, Gly ou Lys; e/ou X4 é selecionado a partir de Gly, His, Asn, Ser, Lys, Thr ou Gln; com a condição de que pelo menos um dentre X1 ou X4 seja um resíduo de aminoácido básico e/ou pelo menos dois dentre X 1 a X4 sejam independentemente um resíduo de aminoácido polar e/ou um resíduo de aminoácido básico e/ou pelo menos um dentre X1 a X4 seja um resíduo Gly.

20. Mimético de calcitonina, de acordo com as reivindicações 11 a 19, caracterizado pelo fato de que o mimético de calcitonina de acordo com as fórmulas (III) a (V) compreende uma ou mais das seguintes substituições conservativas: - o resíduo Asp na posição 15 do peptídeo é substituído por Glu; - o resíduo Arg na posição 18 do peptídeo é substituído por Lys; e/ou - o resíduo Lys na posição 24 do peptídeo é substituído por Arg.

21. Mimético de calcitonina, de acordo com as reivindicações 11 a 19, em que o mimético de calcitonina, de acordo com as fórmulas (VI), em que o componente Z do peptídeo de fórmula (VI) é SQDLHRLQTYGAI ou SQDLHRLSNNFGA, é caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais das seguintes substituições conservativas: - o resíduo Asp na posição 15 do peptídeo é substituído por Glu; e/ou - o resíduo Arg na posição 18 do peptídeo é substituído por Lys.

22. Mimético de calcitonina, de acordo com as reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o ligante compreende um resíduo de ácido glutâmico e/ou um ligante de aminoácido de oligoetilenoglicol (OEG) que compreende um aminoácido de OEG ou dois ou mais aminoácidos de OEG ligados entre si, em que o dito aminoácido de OEG é: em que n é de 1 a 10.

23. Mimético de calcitonina, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o ligante de aminoácido de OEG compreende de dois a seis aminoácidos de OEG ligados entre si.

24. Mimético de calcitonina, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado pelo fato de que o dito ligante de aminoácido de OEG compreende ainda um ou mais resíduos de ácido glutâmico ligados ao terminal amino ou ao terminal carboxila do ligante de aminoácido de OEG.

25. Mimético de calcitonina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizado pelo fato de que n é 1.

26. Mimético de calcitonina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizado pelo fato de que o ligante de aminoácido de OEG é selecionado a partir de qualquer um dos seguintes:

27. Mimético de calcitonina, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o ligante é

28. Mimético de calcitonina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que o grupo acila é selecionado a partir de C 18 ou ácido graxo mais longo, C18 ou diácido graxo mais longo, ligante-C18 ou ácido graxo mais longo, ou ligante-C18 ou diácido graxo mais longo.

29. Mimético de calcitonina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que o grupo acila é selecionado a partir de qualquer um dos seguintes: C18 a C30 ácido graxo, C18 a C30 diácido graxo,

ligante-C16 a C30 ácido graxo, ou ligante-C16 a C30 diácido graxo.

30. Mimético de calcitonina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que o grupo acila é selecionado a partir de qualquer um dos seguintes: C18 a C22 ácido graxo, C18 a C22 diácido graxo, ligante-C18 a C22 ácido graxo, ou ligante-C18 a C22 diácido graxo.

31. Mimético de calcitonina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que K Ac é acilado com um ligante-diácido graxo, em que o diácido graxo é um C18 a C22 diácido graxo e o ligante é

32. Mimético de calcitonina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é selecionado a partir de qualquer um dos seguintes:

e em que KAc, é conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 32.

33. Mimético de calcitonina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é selecionado a partir de qualquer um dos seguintes:

e em que KAc é acilado com um ligante-diácido graxo, em que o diácido graxo é um C18 a C22 diácido graxo e o ligante é

34. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que é formulado para administração entérica.

35. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 34, em que o peptídeo é caracterizado pelo fato de que é formulado em uma composição farmacêutica para administração oral que compreende partículas de ácido cítrico revestidas, e em que as partículas de ácido cítrico revestidas aumentam a biodisponibilidade oral do peptídeo.

36. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, caracterizado pelo fato de que é formulado com um carreador para administração oral.

37. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o carreador compreende 5-CNAC, SNAD ou SNAC.

38. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que é formulado para administração parentérica.

39. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que é formulado para injeção.

40. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33.

41. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que é para uso como um medicamento.

42. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de diabetes (Tipo I e/ou Tipo II), excesso de peso corporal, consumo excessivo de alimentos, síndrome metabólica, artrite reumatoide, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica, doença hepática gordurosa alcoólica, osteoporose ou osteoartrite, níveis de glicose no sangue mal regulados, resposta mal regulada aos testes de tolerância à glicose ou regulação deficiente de ingestão de alimentos.

43. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que em combinação com metformina ou outro sensibilizador de insulina para uso no tratamento de diabetes (Tipo I e/ou Tipo II), excesso de peso corporal, consumo excessivo de alimentos, síndrome metabólica, artrite reumatoide, esteato-hepatite alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica, doença hepática gordurosa alcoólica, osteoporose ou osteoartrite, níveis de glicose no sangue mal regulados, resposta mal regulada aos testes de tolerância à glicose ou regulação deficiente de ingestão de alimentos.

44. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, em combinação com um fármaco para perder peso, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de uma condição de excesso de peso.

45. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que a condição de excesso de peso é obesidade.

46. Coformulação caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, e um sensibilizador de insulina.

47. Coformulação caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, e um fármaco para perder peso.

48. Método para tratar diabetes (Tipo I e/ou Tipo II), excesso de peso corporal, consumo excessivo de alimentos, síndrome metabólica, artrite reumatoide, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica, doença hepática gordurosa alcoólica, osteoporose, ou osteoartrite, níveis de glicose no sangue mal regulados, resposta mal regulada a testes de tolerância à glicose ou regulação deficiente de ingestão de alimentos, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, a um paciente em necessidade do dito tratamento.

49. Método para tratar diabetes (Tipo I e/ou Tipo II), excesso de peso corporal, consumo excessivo de alimentos, síndrome metabólica, artrite reumatoide, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica, doença hepática gordurosa alcoólica, osteoporose, ou osteoartrite, níveis de glicose no sangue mal regulados, resposta mal regulada a testes de tolerância à glicose ou regulação deficiente de ingestão de alimentos, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, em combinação com metformina ou outro sensibilizador de insulina para um paciente com necessidade do dito tratamento.

50. Método para tratar uma condição de excesso de peso, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz de um peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, em combinação com um fármaco para perda de peso a um paciente em necessidade do dito tratamento.