BR112020026602A2

BR112020026602A2 - Radiotraçador de tomografia por emissão de pósitrons (pet) para a imagiologia do receptor do fator estimulante de colônias de macrófagos 1 (csf1r) na neuroinflamação

Info

Publication number: BR112020026602A2
Application number: BR112020026602-7A
Authority: BR
Inventors: Andrew G. Horti; Ravi Naik; Robert F. Dannals; Martin G. Pomper
Original assignee: The Johns Hopkins University
Priority date: 2018-06-26
Filing date: 2019-06-26
Publication date: 2021-03-23
Also published as: WO2020006075A1; IL279768A; MX2021000141A; KR20210013769A; AU2019294699A1; US20210290784A1; CA3104520A1; CN112638431A; EP3813890A1; EA202092843A1; EP3813890A4; JP2021533087A

Abstract

radiotraçador de tomografia por emissão de pósitrons (pet) para a imagiologia do receptor do fator estimulante de colônias de macrófagos 1 (csf1r) na neuroinflamação. são revelados radiotraçadores de tomografia por emissão de pósitrons (pet) para gerar imagens de receptores do fator estimulante de colônias de macrófagos 1 em um paciente acometido ou suspeito de ter sido acometido por uma doença ou condição neuroinflamatória ou degenerativa.

Description

"RADIOTRAÇADOR DE TOMOGRAFIA POR EMISSÃO DE PÓSITRONS (PET) PARA A IMAGIOLOGIA DO RECEPTOR DO FATOR ESTIMULANTE DE COLÔNIAS DE MACRÓFAGOS 1 (CSF1R) NA NEUROINFLAMAÇÃO"

PESQUISA OU DENSENVOLVIMENTO COM PATROCÍNIO FEDERAL

[001]A presente invenção foi desenvolvida com apoio do governo, sob o número AG054802, concedido pelos National Institutes of Health. O Governo detém certos direitos sobre a invenção.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002]A tomografia por emissão de pósitrons (PET) é o método mais avançado para quantificar receptores cerebrais e sua ocupação por ligantes endógenos ou fármacos in vivo. A imagiologia PET de estados neuroinflamatórios putativos (Masgrau R, et al. (2017)) foi experimentada usando radioligantes que miram a proteína translocadora (TSPO), que reporta-se a células glicais reativas. Devido a limitações da PET dirigida à TSPO, incluindo a falta de especificidade ao tipo celular e sensibilidade ao genótipo, os pesquisadores desenvolveram radiotraçadores PET que miram outros aspectos da neuroinflamação (P2X7, COX-2, CB2, ROS, A2AR, MMP) [vide Tronel C, et al. (2017); Janssen B, et al. (2018)]. Todavia, alvos de imagiologia mais recentes, como o receptor da P2X7, são, outrossim, repletos de limitações, incluindo a falta de expressão celular específica (FIG. 7). Um agente que só mirasse as micróglias reativas, que respondem por até 10% das células no cérebro (Aguzzi A, et al. (2013)), poderia proporcionar uma leitura mais específica e menos ambígua dos estados neuroinflamatórios ao gerar imagens desses mediadores celulares de lesões e reparos no SNC.

[003]Dentro do cérebro, o receptor do fator estimulante de colônias de macrófagos 1 (CSF1R) (também conhecido como c-FMS, CD-115 ou M-CSFR) é expresso principalmente pelas micróglias, ao passo que sua expressão em outras células, incluindo neurônios, é baixa (Akiyama H, et al. (1994); Zhang Y, et al.

(2014)) (FIG. 7). O CSF1R é uma proteína de superfície celular associada a uma subfamília de receptores da tirosina quinase ativados por dois ligantes homodiméricos, CSF1 e IL-34 (Peyraud F, et al. (2017)). O CSF1R é o principal regulador da sobrevivência, proliferação, diferenciação e função das células precursoras hematopoiéticas (Chitu V, et al. (2016)). O CSF1R rege diretamente o desenvolvimento, a sobrevivência e a manutenção das micróglias e desempenha papel central na neuroinflamação (Ginhoux F, et al. (2010); Elmore MR, et al. (2014); Walker DG, et al. (2017); Smith AM, et al. (2013); Palle P, et al. (2017)). A inibição do CSF1R foi perseguida como uma forma de tratar uma variedade de transtornos inflamatórios e neuroinflamatórios (El-Gamal MI, et al. (2018)). A distribuição regional do CSF1R no cérebro mamífero saudável não foi estudada em detalhes, mas a análise de sua expressão em camundongos demonstrou níveis acentuados do mesmo nas regiões corticais superiores e níveis mais baixos em outras regiões do cérebro (Lue LF, et al. (2001)).

[004]Vários relatos demonstraram a suprarregulação do CSF1R e CSF1 no cérebro com doença de Alzheimer (AD) postmortem (Akiyama H, et al. (1994), Walker DG, et al. (2017), Lue LF, et al. (2001)). Estudos em camundongos exibiram a expressão moderada do CSF1R no cérebro controle e alta expressão nas micróglias localizadas próximas a depósitos de beta-amiloides (Aβ) em modelos de AD em camundongos transgênicos (Murphy GM Jr, et al. (2000); Yan SD, et al. (1997); Boissonneault V, et al. (2009)). O gene que codifica o ligante cognato para o CSF1R, o CSF1, é suprarregulado nas micróglias associadas a doença (DAM) de estágio 2, que exercem papel salutar em manter a AD sob controle (Deczkowska A, et al. (2018); Keren-Shaul H, et al. (2017)). A lesão cerebral traumática em roedores provocou um aumento alto e específico nos níveis de CSF1R nas regiões lesionadas (Raivich G, et al. (1998)). O CSF1R é alterado em lesões devidas à esclerose múltipla (Prieto-Morin C, et al. (2016)). O CSF1R suprarregulado foi exibido em tumores cerebrais (Alterman RL e Stanley ER (1994)). A disfunção cognitiva associada ao HIV está correlacionada aos níveis de CSF1R (Lentz MR, et al. (2010)). A imagiologia PET clínica do CSF1R poderia avançar a compreensão da via do CSF1R, relevante para a neuroinflamação em transtornos do SNC, e guiar o desenvolvimento de novas terapias anti-inflamatórias com o CSF1R.

[005]Radiotraçadores PET adequados para gerar imagens do CSF1R não encontram-se disponíveis. O único inibidor do CSF1R radiomarcado publicado foi sintetizado em 2014 (Bernard-Gauthier V, Schirrmacher R (2014)), mas não foram divulgados estudos de imagiologia com esse radiotraçador.

SUMÁRIO

[006]A matéria inventiva revelada neste documento propõe um agente de imagiologia para gerar imagens do receptor do fator estimulante de colônias de macrófagos 1 (CSF1R) em um paciente acometido ou suspeito de ter sido acometido por uma ou mais doenças ou condições neuroinflamatórias ou neurodegenerativas.

[007]Em alguns aspectos, a matéria inventiva revelada neste documento propõe um agente de imagiologia para gerar imagens do receptor do fator estimulante de colônias de macrófagos 1 (CSF1R) em um paciente acometido ou suspeito de ter sido acometido por uma ou mais doenças ou condições neuroinflamatórias ou neurodegenerativas, o agente de imagiologia compreendendo o composto de fórmula (I): (I); em que: cada um de X, Y e Z é selecionado independentemente dentre o grupo composto por -N- e -CR5-, em que R5 é selecionado dentre o grupo composto por H, alquila C1-C8 substituída ou não substituída ou R*, em que R* é um grupamento que compreende um radioisótopo adequado à imagiologia por tomografia por emissão de pósitrons (PET) ou o próprio radioisótopo; R1 é selecionado dentre o grupo composto por heteroalquila substituída ou não substituída, heteroarila substituída ou não substituída, alcoxila C1-C8, alquilamino C1-C8, dialquilamino C1-C8, -N(alquil C1-C8)(SO2)(alquila C1-C8), em que R1 pode ser opcionalmente substituído com R* ou R1 pode ser um radioisótopo adequado à imagiologia PET; R2 é heteroalquila substituída ou não substituída, em que R2 pode ser opcionalmente substituído com R*; R3 é heteroarila substituída ou não substituída, em que R3 pode ser opcionalmente substituído com R*; e R4 é selecionado dentre o grupo composto por H, alquila C1-C8 substituída ou não substituída, alcoxila C1-C8, cicloalquila, cicloeteroalquila, arila e heteroarila; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; em que ao menos um de R1, R2, R3 ou R5 é substituído com R* ou é um radioisótopo adequado à imagiologia PET.

[008]Em outros aspectos, a matéria inventiva revelada neste documento propõe um método para gerar imagens do receptor do fator estimulante de colônias de macrófagos 1 (CSF1R) em um paciente acometido ou suspeito de ter sido acometido por uma ou mais doenças ou condições neuroinflamatórias ou neurodegenerativas, o método compreendendo administrar ao paciente uma quantidade eficaz de um agente de imagiologia de fórmula (I), ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e gerar uma imagem PET.

[009]Embora certos aspectos da matéria inventiva revelada neste documento tenham sido mencionados acima, os quais tratam da matéria inventiva revelada como um todo ou em parte, outros transparecerão à medida que a descrição avança tomando como referência os Exemplos e Figuras concomitantes, conforme melhor descritos doravante.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[010]O arquivo da patente ou pedido contém ao menos um desenho em cores. Cópias desta publicação de patente ou pedido de patente com os desenhos em cores serão fornecidas pelo Escritório mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.

[011]Tendo assim descrito acima a matéria inventiva revelada neste documento em termos gerais, doravante far-se-á referência às Figuras concomitantes, as quais não são necessariamente proporcionais às dimensões reais e dentre as quais:

[012]a FIG. 1A e a FIG. 1B ilustram uma comparação da absorção cerebral de [11C]CPPC em camundongos sham e LPS: com injeção no prosencéfalo direito, referência, e bloqueio. Conduziram-se dois experimentos independentes (FIG. 1A e FIG. 1B). O ponto no tempo foi de 45 min após a injeção do radiotraçador; injetaram- se LPS (5 µg em 0,5 µL) ou soro fisiológico (0,5 µL) no prosencéfalo direito (quadrante frontal ipsilateral) 2 a 3 d antes do estudo com o radiotraçador. Injetou-se o bloqueador (CPPC) i.p. 5 min antes do radiotraçador. (FIG. 1A) As regiões de interesse (ROIs) são o cerebelo (CB), o hemisfério ipsilateral (IH) e o hemisfério contralateral (CH). Os dados são representados por %SUV média + SD (n = 3). (FIG. 1B) As ROIs são o cerebelo (CB), o hemisfério contralateral (CH), o hemisfério caudal ipsilateral (ICQ) e o quadrante frontal ipsilateral (IFQ). Os dados são representados por %SUV média + SD (n = 4). Análise estatística: comparação entre LPS-referência vs. sham ou LPS-bloqueio. *P < 0,05; a ausência de asterisco significa que P > 0,05 (ANOVA);

[013]A FIG. 2A, FIG. 2B e FIG. 2C ilustram a absorção cerebral do radiotraçador do CSF1R [11C]CPPC em camundongos controle (Ctrl), camundongos tratados com LPS (i.p.) (LPS referência) e camundongos tratados com LPS (i.p.) mais bloqueio com inibidores do CSF1R (LPS bloqueio) em três experimentos independentes. O ponto no tempo foi de 45 min após a injeção do radiotraçador [LPS (10 mg/kg)]. (FIG. 2A) Os dados são representados por %SUV média ± SD (n = 5). CB, cerebelo. (FIG. 2B) Os dados são representados por SUVR média ± SD (n = 5). Injetou-se o bloqueador (CPPC, 1 mg/kg, i.p.) nos camundongos tratados com LPS. (FIG. 2C) Os dados são representados por SUVR média ± SD (n = 3 a 6). Injetou-se o bloqueador (composto 8, 2 mg/kg, i.p.) nos camundongos tratados com LPS. Análise estatística: comparação entre LPS-referência vs. controle ou LPS- bloqueio. *P < 0,01; **P = 0,03; a ausência de asterisco significa que P > 0,05 (ANOVA);

[014]A FIG. 3 ilustra a comparação entre a absorção cerebral da [11C]CPPC em camundongos AD transgênicos (n = 6) e controle (n = 5). Ponto no tempo: 45 min após a injeção do radiotraçador. Dados: %SUV média ± SD. *P = 0,04, **P < 0,005 (ANOVA). A absorção da [11C]CPPC foi significativamente maior nas regiões cerebrais dos camundongos com AD. CB, cerebelo; Ctx, córtex; Hipp, hipocampo;

[015]A FIG. 4A e FIG. 4B ilustram a imagiologia PET/CT da [11C]CPPC na EAE murídea. (FIG. 4A) Fatias MIP (Topo), coronal (Centro), e sagital (Base) exibindo a absorção do radiotraçador de 45 a 60 min por projeção nos camundongos indicados. A variação na escala de cores representa a %ID/g de tecido. (FIG. 4B) Absorção cerebral regional normalizada por absorção em animal controle vs. gravidade da EAE. BS, tronco cerebral; FCTX, córtex frontal;

[016]A FIG. 5A, FIG. 5B, FIG. 5C e FIG. 5D ilustram a imagiologia PET da [11C]CPPC em um mesmo babuíno em experimentos de referência, LPS e LPS mais bloqueio. A dose de LPS foi de 0,05 mg/kg (i.v.) 4 h antes da injeção do radiotraçador. (FIG. 5A) Imagens (VT) paramétricas. (FIG. 5B) Curvas tempo-SUV da [11C]CPPC na região cerebral de referência. (FIG. 5C) Curvas tempo-SUV da

[11C]CPPC no cérebro inteiro: referência (verde), após tratamento com LPS (vermelho) e bloqueio após tratamento com LPS (preto). (FIG. 5D) Curvas tempo- SUV da [11C]CPPC no plasma corrigido para metabólitos: referência (verde), após tratamento com LPS (vermelho), e LPS mais bloqueio (preto). O influxo na FIG. 5D ilustra os primeiros 120 s da varredura;

[017]A FIG. 6 ilustra imagens da autorradiografia/[11C]CPPC humana postmortem (referência e bloqueio) em fatias da massa cinzenta do lóbulo parietal inferior. Três pacientes com doença de Alzheimer (1-AD, 2-AD e 3-AD) e um paciente controle (4-controle). Vide também a FIG. 20 e as Tabelas 5 e 6;

[018]a FIG. 7 ilustra que, nas células do SNC, o gene do CSF1R é expresso principalmente nas micróglias, ao passo que os genes da TSPO e P2RX7 exibem expressão multicelular. Abreviaturas: OPC = Células progenitoras oligodendrócitas; FPKM = fragmentos por quilobase do transcrito por milhão de leituras mapeadas. Os gráficos são da página http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html;

[019]A FIG. 8 ilustra a síntese do pre-CPPC;

[020]A FIG. 9 ilustra a radiossíntese da [11C]CPPC;

[021]A FIG. 10 ilustra um estudo de bloqueio com a [11C]CPPC e o bloqueador CPPC. O estudo demonstrou um bloqueio insignificante com doses mais baixas (0,6 a 3 mg/kg) e um aumento gradativo insignificante na absorção com doses escalonadas (10 a 20 mg/kg) de CPPC não marcada no ponto no tempo de 45 min após a injeção do traçador. Dados: %SUV ± SD (n = 5);

[022]A FIG. 11A e FIG. 11B ilustram uma comparação entre a absorção da [11C]CPPC referência e bloqueio no córtex de camundongos CD1 em um mesmo experimento sem (FIG. 11A) e com correção sanguínea (FIG. 11B). FIG. 11A: %SUV média ± SD (n = 3). Nenhuma diferença significativa entre a referência e o bloqueio com duas doses de CPPC não marcada (0,6 e 3 mg/kg) (P > 0,05). FIG. 11B: Dados: SUVR média no córtex ± SD (n = 3). Nos camundongos que receberam a injeção de duas doses do bloqueador da CPPC, o valor SUVR corrigido para o sangue foi significativamente mais baixo (P = 0,05) do que na referência (ANOVA). Esse experimento demonstra que a [11C]CPPC marca especificamente o CSF-1R no córtex cerebral de camundongos CD1;

[023]A FIG. 12A e FIG. 12B ilustram a comparação da absorção da [11C]CPPC no cérebro inteiro em camundongos controle vs. camundongos com as micróglias depletadas (FIG. 12A) e em camundongos controle vs. camundongos CSF1R knock-out (FIG. 12B) 45 min após a injeção do radiotraçador. FIG. 12A: Os dados são representados por %SUV média + SD (n = 5). FIG. 12B: Os dados são representados por %SUV média para o sangue + SD (n = 5). Análise estatística - ANOVA;

[024]A FIG. 13 ilustra fatias sagitais de imagens por PET/CT da [ 11C]CPPC em camundongos EAE sem delimitação. Todas as imagens foram ampliadas ao mesmo máximo exibido na FIG. 4. S = glândula salivar; H = glândula harderiana;

[025]A FIG. 14A, FIG. 14B e FIG. 14C demonstram que o tratamento com LPS induziu a aumento na expressão do CSF1R no cérebro murídeo. FIG. 14A: Nível relativo de mRNA do Csf1r medido por PCR quantitativa em tempo real (n=5). FIG. 14B: Análises Western blot de extratos de cérebros murídeos inteiros de camundongos controle e camundongos tratados com LPS. Cada linha representa um camundongo. FIG. 14C: As intensidades de banda do CSF1R foram calculadas e normalizadas com as de GAPDH da FIG. 14B (n=5);

[026]A FIG. 15 ilustra valores VT regionais da [11C]CPPC em estudos com babuínos referência (verde), tratados com LPS (vermelho) e tratados com LPS mais bloqueador (amarelo). Abreviaturas: Th = tálamo; Hp = hipocampo; CC = corpo caloso; WM = massa branca; Oc = córtex occipital; CB = cerebelo; Amyg = amígdala; WB = cérebro inteiro;

[027]A FIG. 16 ilustra os níveis de citocina inflamatória IL-6 no soro babuíno. O nível de IL-6 aumentou após a injeção de LPS e diminuiu no estudo LPS mais bloqueador. A IL-6 foi medida com um kit ELISA. Em suma: Em três pontos no tempo diferentes (15, 45 e 90 minutos após a injeção), coletaram-se 2 mL do sangue periférico babuíno em recipientes BD Vacutainer (BD Biosciences, cat# 367983, La Jolla, CA), os quais foram centrifugados a 2,000 x g durante 10 min em temperatura ambiente. O soro foi coletado em tubos estéreis e armazenado a -80° C para um imunoensaio futuro. As amostras do soro foram descongeladas em gelo e o nível de IL-6 foi medido usando um kit IL-6 Monkey Instant ELISA™ (Thermo Fisher Scientific, cat# BMS641INST, Halethorpe, MD) de acordo com o protocolo da fabricante;

[028]A FIG. 17A e FIG. 17B ilustra a análise por HPLC de radiometabólitos da [11C]CPPC ([11C]JHU11744) no plasma babuíno. FIG. 17A – cronogramas de rádio-HPLC da [11C]CPPC e amostra do plasma sanguíneo coletada em diferentes intervalos no tempo, FIG. 17B – redução dependente do tempo na porcentagem relativa de [11C]CPPC em babuínos controle e babuínos tratados com LPS ou LPS e agente bloqueador;

[029]A FIG. 18A, FIG. 18B, FIG. 18C e FIG. 18D ilustram gráficos representativos da análise cinética da [11C]CPPC usando (FIG. 18A) modelagem compartimental e (FIG. 18B) análise de Logan, demonstrando que ambos são métodos adequados (região representativa ilustrada: putâmen, marcadores verdes: pontos de dados de estudo PET, linhas sólidas: dados ajustados; (FIG. 18C) Comparações dos resultados VT por modelagem compartimental e análise de Logan em um estudo de referência representativo demonstrando que são altamente equiparáveis/correlacionados (R2 = 0,9657); (FIG. 18D) Gráficos de consistência no tempo representativos de estimativas de VT regional (região: putâmen),

demonstrando que obtiveram-se resultados estáveis (<2,5% de mudanças) 60 min após as injeções;

[030]A FIG. 19 ilustra valores K1 regionais da [11C]CPPC em estudos com babuínos referência (verde), tratados com LPS (vermelho) e tratados com LPS mais bloqueador (amarelo). Abreviaturas: Th = tálamo; Hp = hipocampo; CC = corpo caloso; WM = massa branca; Oc = córtex occipital; CB = cerebelo; Amyg = amígdala; WB = cérebro inteiro; e

[031]A FIG. 20 ilustra a razão referência/bloqueio com vários bloqueadores (PLX3397; BLZ945 e composto 8) nos experimentos de autorradiografia com [11C]CPPC nas fatias de cérebros humanos AD postmortem.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[032]Doravante, descrever-se-á a matéria inventiva revelada neste documento mais plenamente com referência às figuras concomitantes, nas quais são ilustradas algumas modalidades, mas não todas, da matéria inventiva revelada neste documento. Números iguais referem-se aos mesmos elementos em todo o documento. A matéria inventiva revelada neste documento pode ser concretizada em muitas formas diferentes e não deve ser interpretada como limitada às modalidades expostas neste documento; em vez disso, essas modalidades são dadas para que a presente revelação satisfaça os requisitos legais aplicáveis. Na verdade, muitas modificações e outras modalidades da matéria inventiva revelada neste documento ocorrerão aos versados na técnica a que pertence a matéria inventiva revelada neste documento à luz dos ensinamentos dados nas descrições precedentes e nas figuras associadas. Portanto, deve-se ter em mente que a matéria inventiva revelada neste documento não se limita às modalidades específicas relevadas e que tenciona-se que modificações e outras modalidades enquadrem-se no âmbito das reivindicações apensas.

I. RADIOTRAÇADOR PET PARA A IMAGIOLOGIA DO RECEPTOR DO FATOR ESTIMULANTE DE COLÔNIAS DE MACRÓFAGOS 1 (CSF1R) NA

NEUROINFLAMAÇÃO

[033]O fator estimulante de colônias de macrófagos 1 (CSF1) é uma das mais comuns citocinas pró-inflamatórias, responsável por vários transtornos inflamatórios. O CSF1 interage com seu receptor, o CSF1R, e provoca a diferenciação e proliferação de células da linhagem de monócitos/macrófagos. Níveis de expressão do CSF1R mais altos estão associados a vários transtornos neuroinflamatórios, inclusive, entre outros, doença de Alzheimer (AD), tumores cerebrais, esclerose múltipla (MS), lesão cerebral traumática, e seus semelhantes. Vide Walker et al., 2017.

[034]No SNC, os CSF1Rs são expressos principalmente pelas micróglias (Akiyama, et al., 1994; Raivich et al., 1998), ao passo que a expressão em outras células, inclusive nos neurônios, é baixa. Chitu et al., 2016. Potencialmente, o CSF1R representaria um sítio de ligação seletivo para a imagiologia da ativação microglial na neuroinflamação. Em contrapartida, os biomarcadores da neuroinflamação usados mais frequentemente, a TSPO e o P2RX7, ambos exibem expressão multicelular, Raivich et al., 1998, e, portanto, não podem ser considerados sítios de ligação seletivos da ativação microglial. Vide a FIG. 10.

[035]O inibidor potente e seletivo do CSF1R 5-ciano-N-(4-(4-metilpiperazin- 1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2-carboxamida (1) foi desenvolvido pela indústria farmacêutica como um agente anti-inflamatório em potencial. Illig et al., 2008.

5-ciano-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2-carboxamida (1)

[036]A matéria inventiva revelada neste documento propõe, em parte, a radiossíntese da [11C]1 ([11C]CMPPF; [11C]JHU11744; 5-ciano-N-(4-(4- [11C]metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2-carboxamida) e sua avaliação para gerar imagens PET do CSF1R na neuroinflamação.

[11C]1

[037]Em termos mais gerais, a matéria inventiva revelada neste documento propõe uma série de radiotraçadores PET para gerar imagens do receptor do fator estimulante de colônias de macrófagos 1 (CSF1R). A ligação dos radiotraçadores no CSF1R foi testada em modelos de neuroinflamação animais, em camundongos com encefalomielite autoimune experimental (EAE) (modelo de esclerose múltipla) e no tecido cerebral com doença de Alzheimer postmortem. Compostos específicos penetraram prontamente no cérebro nos modelos animais. Compostos ainda mais específicos ligaram-se especificamente ao CSF1R (e marcaram-no) em modelos de neuroinflamação animais. Em algumas modalidades, os compostos revelados neste documento exibiram significativamente mais absorção nos modelos de neuroinflamação animais do que nos controles. Em outras modalidades, compostos selecionados marcam especificamente o CSF1R no tecido cerebral humano com Alzheimer. Logo, os compostos revelados neste documento podem ser usados no estudo do CSF1R na neuroinflamação e na neurodegeneração. A. Agentes de Imagiologia de Fórmula (I)

[038]Em algumas modalidades, a matéria inventiva revelada neste documento propõe um agente de imagiologia para gerar imagens do receptor do fator estimulante de colônias de macrófagos 1 (CSF1R) em um paciente acometido ou suspeito de ter sido acometido por uma ou mais doenças ou condições neuroinflamatórias ou neurodegenerativas, o agente de imagiologia compreendendo o composto de fórmula (I):

(I); em que: cada um de X, Y e Z é selecionado independentemente dentre o grupo composto por -N- e -CR5-, em que R5 é selecionado dentre o grupo composto por H, alquila C1-C8 substituída ou não substituída ou R*, em que R* é um grupamento que compreende um radioisótopo adequado para a imagiologia por tomografia por emissão de pósitrons (PET) ou o próprio radioisótopo; R1 é selecionado dentre o grupo composto por heteroalquila substituída ou não substituída, heteroarila substituída ou não substituída, alcoxila C1-C8, alquilamino C1-C8, dialquilamino C1-C8, -N(alquil C1-C8)(SO2)(alquila C1-C8), em que R1 pode ser opcionalmente substituído com R* ou R1 pode ser um radioisótopo adequado à imagiologia PET; R2 é heteroalquila substituída ou não substituída, em que R2 pode ser opcionalmente substituído com R*; R3 é heteroarila substituída ou não substituída, em que R3 pode ser opcionalmente substituído com R*; e R4 é selecionado dentre o grupo composto por H, alquila C1-C8 substituída ou não substituída, alcoxila C1-C8, cicloalquila, cicloeteroalquila, arila e heteroarila; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; em que ao menos um de R1, R2, R3 ou R5 é substituído com R* ou é um radioisótopo adequado à imagiologia PET.

[039]Em algumas modalidades, R1 é selecionado dentre o grupo composto por piperazinila substituída ou não substituída, morfolinila substituída ou não substituída, 1,1-dióxido-tiomorfolinila, pirazolila substituída ou não substituída, imidazolila substituída ou não substituída, alcoxila C1-C8, alquilamino C1-C8, dialquilamino C1-C8, -N(alquil C1-C8)(SO2)(alquila C1-C8), em que R1 pode ser opcionalmente substituído com R* ou R1 pode ser um radioisótopo adequado à imagiologia PET.

[040]Em algumas modalidades, R2 é selecionado dentre o grupo composto por piperidinila substituída ou não substituída e morfolinila substituída ou não substituída, em que R2 pode ser opcionalmente substituído com R*.

[041]Em algumas modalidades, R3 é selecionado dentre o grupo composto por pirrolila substituída ou não substituída e furanila substituída ou não substituída, em que R3 pode ser opcionalmente substituído com R*.

[042]Em certas modalidades, R1 é selecionado dentre o grupo composto por: (R*)p (R*)p

O

N N (R11 )q (R11 )r , , , , e R*; em que: p é um número inteiro selecionado dentre 0 e 1; q é um número inteiro selecionado dentre o grupo composto por 0, 1, 2, 3, 4 e 5; r é um número inteiro selecionado dentre o grupo composto por 0, 1, 2, 3 e 4; R11 é selecionado dentre o grupo composto por alquila C1-C8 substituída ou não substituída, alcoxila C1-C8, hidroxila, amino, ciano, halogênio, carboxila e -CF3; e R12 é selecionado dentre o grupo composto por H, alquila C1-C8 substituída ou não substituída, carboxila, -(SO2)-(alquila C1-C8) e R*.

[043]Em certas modalidades, R2 é selecionado dentre o grupo composto por:

(R*)p (R*)p

O

N N (R11 )q (R11 )r ; e em que: p é um número inteiro selecionado dentre 0 e 1; q é um número inteiro selecionado dentre o grupo composto por 0, 1, 2, 3, 4 e 5; r é um número inteiro selecionado dentre o grupo composto por 0, 1, 2, 3 e 4; R11 é selecionado dentre o grupo composto por alquila C1-C8 substituída ou não substituída, alcoxila C1-C8, hidroxila, amino, ciano, halogênio, carboxila e -CF3.

[044]Em certas modalidades, R3 é selecionado dentre o grupo composto por: (R*)p (R11 )r ; ; ;e N ; em que: p é um número inteiro selecionado dentre o grupo composto por 0 e 1; R11 é selecionado dentre o grupo composto por alquila C1-C8 substituída ou não substituída, alcoxila C1-C8, hidroxila, amino, ciano, halogênio, carboxila e -CF3; e R12 é selecionado dentre o grupo composto por H, alquila C1-C8 substituída ou não substituída, carboxila, -(SO2)-(alquila C1-C8) e R*.

[045]Em certas modalidades, (a) cada um de X, Y e Z é -CR5-; (b) cada um de X e Z é -N-, e Y é -CR5-; (c) X é -N-, e cada um de Y e Z é -CR5-; (d) X e Y são N, e Z é -CR5-; (e) cada um de X e Y é -CR5-, e Z é N; em que R5, ao menos em uma ocorrência, pode ser opcionalmente substituído com R*.

[046]Em modalidades específicas, o composto de fórmula (I) é um composto de fórmula (Ia): (Ia); em que: R6 é selecionado dentre o grupo composto por H, alquila C1-C8, -C(=O)-O-R9 e -(CH2)n-R10, em que n é um número inteiro dentre 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8; cada um de R9 e R10 é alquila C1-C8 de cadeia linear ou ramificada, e em que R6 pode ser opcionalmente substituído com R* ou R6 pode ser R*; R7 é selecionado dentre o grupo composto por H ou alquila C1-C8, em que R7 pode ser opcionalmente substituído com R* ou R7 pode ser R*; e R8 é pirrolila substituída ou não substituída, furanila e piridinila, em que R8 pode ser opcionalmente substituído com R*; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; em que ao menos um de R6, R7 ou R8 é substituído com R* ou é R*.

[047]Em modalidades mais específicas, R6 é selecionado dentre o grupo composto por hidrogênio, metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec- butila, terc-butila, n-pentila, sec-pentila, isopentila, neopentila, n-hexila, sec-hexila, n- heptila, n-octila e -C(=O)-O-(alquila C1-C8)3; R7 é selecionado dentre o grupo composto por hidrogênio, metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec- butila, terc-butila, n-pentila, sec-pentila, isopentila, neopentila, n-hexila, sec-hexila, n- heptila, n-octila; R8 é selecionado dentre o grupo composto por (R*)p (R11 )r , , e N ;

em que: p é um número inteiro selecionado dentre o grupo composto por 0 e 1; R11 é selecionado dentre o grupo composto por alquila C1-C8 substituída ou não substituída, alcoxila C1-C8, hidroxila, amino, ciano, halogênio, carboxila e -CF3; e R12 é selecionado dentre o grupo composto por H, alquila C1-C8 substituída ou não substituída, carboxila, -(SO2)-(alquila C1-C8) e R*; e em que cada um de R6, R7 e R8 pode ser opcionalmente substituído com R*.

[048]Em modalidades ainda mais específicas, o agente de imagiologia é selecionado dentre o grupo composto por: 5-ciano-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2- carboxamida (1a); 5-ciano-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(4-metilpiperidin-1-il)fenil)furano-2- carboxamida (1c); 4-ciano-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(4-metilpiperidin-1-il)fenil)-1H-pirrol-2- carboxamida (1e); 4-ciano-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2- carboxamida (1g); 5-ciano-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-3- carboxamida (1h); 6-flúor-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)picolinamida (1i); 6-bromo-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)picolinamida (1i); 4-(4-(5-cianofurano-2-carboxamido)-3-(piperidin-1-il)fenil)piperazina-1- carboxilato de terc-butila(7a); 4-(4-(5-cianofurano-2-carboxamido)-3-(4-metilpiperidin-1-il)fenil)piperazina-1- carboxilato de terc-butila (7b); 4-(4-(4-ciano-1H-pirrol-2-carboxamido)-3-(4-metilpiperidin-1- il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila (7c);

5-ciano-N-(4-(piperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2-carboxamida (1b); 5-ciano-N-(2-(4-metilpiperidin-1-il)-4-(piperazin-1-il)fenil)furano-2- carboxamida (1d); 4-ciano-N-(2-(4-metilpiperidin-1-il)-4-(piperazin-1-il)fenil)-1H-pirrol-2- carboxamida (1f); 5-ciano-N-(4-(4-(2-fluoretil)piperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2- carboxamida (1k); 4-ciano-N-(4-(4-(2-fluoretil)piperazin-1-il)-2-(4-metilpiperidin-1-il)fenil)-1H- pirrol-2-carboxamida (1l); N-(4-(4-(2-bromoetil)piperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)-5-cianofurano-2- carboxamida (1m); {2-cicloex-1-enil-4-[1-(2-dimetilamino-acetil)-piperidin-4-il]-fenil}-amida de ácido 4-ciano-1H-imidazol-2-carboxílico (1g); e 4-ciano-N-(5-(1-(metilglicil)piperidin-4-il)-2',3',4',5'-tetraidro-[1,1'-bifenil]-2-il)- 1H-imidazol-2-carboxamida (1h).

[049]Em algumas modalidades, R* é selecionado dentre o grupo composto por 11C, 18F e -(CH2)m-R13, em que R13 é alquila C1-C8 de cadeia linear ou ramificada, que pode ser opcionalmente substituída com um radioisótopo adequado à imagiologia PET.

[050]Em certas modalidades, o radioisótopo adequado à imagiologia PET é selecionado dentre o grupo composto por 11C e 18F.

[051]Em ainda outras certas modalidades, o composto de fórmula (I) é: B. Métodos de Imagiologia

[052]Em algumas modalidades, a matéria inventiva revelada neste documento propõe um método para gerar imagens do receptor do fator estimulante de colônias de macrófagos 1 (CSF1R) em um paciente acometido ou suspeito de ter sido acometido por uma ou mais doenças ou condições neuroinflamatórias ou neurodegenerativas, o método compreendendo administrar ao paciente uma quantidade eficaz de um agente de imagiologia de fórmula (I), ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e gerar uma imagem PET.

[053]Em modalidades específicas, a doença ou condição neuroinflamatória ou neurodegenerativa é selecionada dentre o grupo composto por doença de Alzheimer (AD), esclerose múltipla (MS), uma lesão cerebral traumática, um tumor cerebral, disfunção cognitiva associada ao HIV e uma ou mais doenças desmielinizantes.

[054]Exemplos de doenças desmielinizantes incluem, entre outras, esclerose múltipla, doença de Devic e outras doenças desmielinizantes inflamatórias; transtornos leucodistróficos, inclusive neuropatias do SNC, mielinólise pontina central, tabes dorsalis (mielopatia sifilítica) e leucoencefalopatia multifocal progressiva; e doenças desmielinizantes do sistema nervoso periférico, inclusive síndrome de Guillain-Barré, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, doença de Charcot-Marie-Tooth, neuropatia hereditária com susceptibilidade a paralisia por pressão; e neuropatia periférica, mielopatia e neuropatia óptica.

[055]Em geral, a "quantidade eficaz" de um agente ativo refere-se à quantidade necessária para provocar a resposta biológica desejada. Como os versados na técnica apreciarão, a quantidade eficaz de um agente ou dispositivo pode variar dependendo de fatores como o resultado biológico desejado, o agente que será distribuído, o conteúdo da composição farmacêutica, o tecido alvo, e seus semelhantes.

[056]"Colocar em contato" significa qualquer ação que resulte no contato de ao menos um composto da matéria inventiva revelada neste documento com ao menos um tumor ou célula que expresse o CSF1R. "Colocar em contato" pode incluir expor a(s) célula(s) ou tumor(es) ao composto em uma quantidade suficiente para resultar no contato de ao menos um composto com ao menos uma célula ou tumor. O método pode ser praticado in vitro ou ex vivo introduzindo, e de preferência misturando, o composto e célula(s) ou tumor(es) em um ambiente controlado, tal como uma placa de cultura ou tubo de ensaio. O método pode ser praticado in vivo, caso esse em que "colocar em contato" significa expor ao menos uma célula ou tumor em um paciente a ao menos um composto da matéria inventiva revelada neste documento, tal como administrar o composto a um paciente por qualquer via adequada.

[057]Conforme usado neste documento, o termo "tratar" pode incluir reverter, atenuar, inibir a progressão, prevenir ou reduzir o risco da doença, transtorno ou condição à qual o termo se aplica, ou de um ou mais sintomas ou manifestações da referida doença, transtorno ou condição. "Prevenir" refere-se a fazer com que uma doença, transtorno, condição, ou um sintoma ou manifestação desses, ou a piora da gravidade desses, não ocorra. Logo, os compostos revelados neste documento podem ser administrados profilacticamente para prevenir ou reduzir a incidência ou recorrência da doença, transtorno ou condição.

[058]O termo "combinação" é usado em seu sentido mais amplo e significa que a um paciente são administrados ao menos dois agentes, mais particularmente um composto revelado neste documento de um agente ativo e ao menos um outro agente ativo. Mais particularmente, o termo "em combinação" refere-se à administração concomitante de dois (ou mais) agente ativos para o tratamento, por exemplo, de uma mesma enfermidade. Conforme usado neste documento, os agentes ativos podem ser combinados e administrados em uma forma de dosagem simples, podem ser administrados ao mesmo tempo como formas de dosagem distintas, ou podem ser administrados como formas de dosagem distintas que são administradas alternada ou sequencialmente no mesmo dia ou em dias diferentes. Em uma modalidade da matéria inventiva revelada neste documento, os agentes ativos são combinados e administrados em uma forma de dosagem simples. Em outra modalidade, os agentes ativos são administrados em formas de dosagem distintas (por exemplo, quando deseja-se variar a quantidade de um mas não do outro). A forma de dosagem simples pode incluir agentes ativos adicionais para o tratamento da enfermidade.

[059]O paciente tratado pelos métodos revelados neste documento em suas muitas modalidades é desejavelmente um paciente humano, embora entenda-se que os métodos descritos neste documento são eficazes em todas as espécies vertebradas, que tenciona-se que sejam abrangidas pelo termo "paciente". Logo, um "paciente" pode incluir um paciente humano para fins médicos, tal como para o tratamento de uma condição ou doença existentes ou para o tratamento profiláctico para prevenir o princípio de uma condição ou doença, ou um paciente animal (não humano) para fins veterinários ou desenvolvimentais. Pacientes animais adequados incluem mamíferos, inclusive, entre outros, primatas, por exemplo, seres humanos, macacos, símios, e seus semelhantes; bovinos, por exemplo, gado, bois, e seus semelhantes; ovinos, por exemplo, carneiros e seus semelhantes; caprinos, por exemplo, bodes e seus semelhantes; suínos, por exemplo, porcos, e seus semelhantes; equinos, por exemplo, cavalos, asnos, zebras, e seus semelhantes; felinos, inclusive gatos selvagens e domésticos; caninos, inclusive cães; lagomorfos, inclusive coelhos, lebres, e seus semelhantes; e roedores, inclusive camundongos, ratos, e seus semelhantes. Um animal pode ser um animal transgênico. Em algumas modalidades, o paciente é um ser humano, inclusive, entre outros, pacientes fetais, neonatos, bebês, infantis e adultos. Além disso, um "paciente" pode incluir um paciente acometido ou suspeito de ter sido acometido por uma condição ou doença. C. Kits

[060]Em ainda outras modalidades, a matéria inventiva revelada neste documento propõe um kit que compreende um composto revelado neste documento.

[061]Em certas modalidades, o kit contém composições farmacêuticas embaladas que compreendem um veículo farmaceuticamente aceitável e um composto da invenção. Em certas modalidades, a composição farmacêutica embalada compreenderá os precursores de reação necessários para gerar o composto da invenção quando da combinação a um precursor radiomarcado. Outras composições farmacêuticas embaladas propostas pela presente invenção compreendem ainda indícios que compreendem ao menos um de: instruções para preparar compostos de acordo com a invenção a partir dos precursores fornecidos, instruções para usar a composição para gerar imagens de células ou tecidos que expressam o CSF1, ou instruções para usar a composição para gerar imagens da neurotransmissão glutamatérgica em um paciente que sofre de um transtorno relacionado ao estresse, ou instruções para usar a composição para gerar imagens do câncer de próstata. D. Composições Farmacêuticas e Administração

[062]Em outro aspecto, a presente invenção propõe uma composição farmacêutica que inclui um composto revelado neste documento, sozinho ou em combinação a um ou mais agentes terapêuticos adicionais, misturado a um excipiente farmaceuticamente aceitável. Os versados na técnica reconhecerão que as composições farmacêuticas incluem sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos descritos acima. Em geral, sais farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos pelos versados na técnica e incluem sais de compostos ativos que são preparados com ácidos ou bases relativamente atóxicos, dependendo dos grupamentos substituintes específicos encontrados nos compostos descritos neste documento. Quando os compostos da presente invenção contêm funcionalidades relativamente ácidas, sais por adição de base podem ser obtidos colocando a forma neutra desses compostos em contato com uma quantidade suficiente da base desejada, ou pura ou em um solvente inerte adequado ou por troca iônica, com o quê um contraíon básico (base) em um complexo iônico é substituído por outro. Exemplos de sais por adição de base farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de sódio, potássio, cálcio, amônio, amino orgânico ou magnésio, ou um sal semelhante.

[063]Quando compostos da presente invenção contêm funcionalidades relativamente básicas, sais por adição de ácido podem ser obtidos colocando a forma neutra desses compostos em contato com uma quantidade suficiente do ácido desejado, ou puro ou em um solvente inerte adequado ou por troca iônica, com o quê um contraíon ácido (ácido) em um complexo iônico é substituído por outro. Exemplos de sais por adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos como os ácidos clorídrico, bromídrico, nítrico, carbônico, monoidrogenocarbônico, fosfórico, monoidrogenofosfórico, di- hidrogenofosfórico, sulfúrico, monoidrogenossulfúrico, hidriódico ou fosforoso, e seus semelhantes, bem como os sais derivados de ácidos orgânicos relativamente atóxicos, como os ácidos acético, propiônico, isobutírico, maleico, malônico, benzoico, succínico, subérico, fumárico, láctico, mandélico, ftálico, benzenossulfônico, p-toluenossulfônico, cítrico, tartárico, metanossulfônico, e seus semelhantes. Também são incluídos sais de aminoácidos, tais como arginato e seus semelhantes, e sais de ácidos orgânicos como os ácidos glucurônico ou galactunórico, e seus semelhantes (vide, por exemplo, Berge et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19). Certos compostos específicos da presente invenção contêm funcionalidades tanto básicas quanto ácidas que permitem que os compostos sejam convertidos em sais por adição ou de base ou de ácido.

[064]Logo, sais farmaceuticamente aceitáveis adequados para uso com a matéria inventiva revelada neste documento incluem, à guisa de exemplo, entre outros, acetato, benzenossulfonato, benzoato, bicarbonato, bitartarato, brometo, edetato de cálcio, cansilato, carbonato, citrato, edetato, edisilato, estolato, esilato, fumarato, gluceptato, gluconato, glutamato, glicolilarsanilato, hexilresorcinato, hidrabamina, hidrobrometo, hidrocloreto, hidroxinaftoato, iodeto, isetionato, lactato, lactobionato, malato, maleato, mandelato, mesilato, mucato, napsilato, nitrato, pamoato (embonato), pantotenato, fosfato/difosfato, poligalacturonato, salicilato, estearato, subacetato, succinato, sulfato, tanato, tartarato ou teoclato. Outros sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser encontrados, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20ª ed.), Lippincott, Williams & Wilkins (2000). Em aplicações terapêuticas e/ou diagnósticas, os compostos da invenção podem ser formulados para uma variedade de modos de administração, inclusive administração sistêmica e tópica ou localizada. Em geral, técnicas e fórmulas podem ser encontradas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20ª ed.), Lippincott, Williams & Wilkins (2000).

[065]Dependendo das condições específicas em tratamento, esses agentes podem ser formulados em formas de dosagem líquidas ou sólidas e administrados sistêmica ou localmente. Os agentes podem ser distribuídos, por exemplo, em uma forma com liberação lenta sustentada ou cronometrada, como é de conhecido dos versados na técnica. Técnicas para a formulação e administração podem ser encontradas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20ª ed.), Lippincott, Williams & Wilkins (2000). Vias adequadas podem incluir administração oral, bucal, por jato de inalação, sublingual, retal, transdérmica, vaginal, transmucosal, nasal ou intestinal; distribuição parentérica, inclusive injeções intramusculares, subcutâneas, intramedulares, bem como injeções intratecais, intraventriculares diretas, intravenosas, intra-articulares, intraesternais,

intrassinoviais, intra-hepáticas, intralesionais, intracranianas, intraperitoneais, intranasais ou intraoculares, ou outros modos de distribuição.

[066]Para a injeção, os agentes da invenção podem ser formulados e diluídos em soluções aquosas, tal como em tampões fisiologicamente compatíveis, tais como solução de Hank, solução de Ringer ou tampão de soro fisiológico. Para a referida administração transmucosal, penetrantes apropriados para a barreira que será penetrada podem ser usados na fórmula. Esses penetrantes são via de regra conhecidos na técnica.

[067]O uso de veículos inertes farmaceuticamente aceitáveis para formular os compostos revelados neste documento para a prática da invenção em dosagens adequadas à administração sistêmica enquadra-se no âmbito da invenção. Com a escolha apropriada do veículo e a prática de fabricação adequada, as composições da presente invenção, em especial as formuladas como soluções, podem ser administradas por via parentérica, tal como por injeção intravenosa. Os compostos podem ser formulados prontamente, usando veículos farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica, em dosagens adequadas à administração oral. Esses veículos permitem que os compostos da invenção sejam formulados como comprimidos, pílulas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões e seus semelhantes para ingestão oral por um paciente a ser tratado.

[068]Para a distribuição nasal ou inalada, os agentes da invenção também podem ser formulados por métodos conhecidos pelos versados na técnica e podem incluir, por exemplo, entre outros, exemplos de substâncias solubilizantes, diluentes ou dispersantes, tais como soro fisiológico; conservantes, tais como álcool benzílico; promotores de absorção, e fluorcarbonetos.

[069]Composições farmacêuticas adequadas para uso na presente invenção incluem composições nas quais os ingredientes ativos estão contidos em uma quantidade eficaz para atingir o fim tencionado. A determinação das quantidades eficazes está perfeitamente dentro da capacidade dos versados na técnica, em especial à luz da revelação detalhada dada neste documento. Em termos gerais, os compostos de acordo com a invenção são eficazes em uma ampla faixa de dosagens. Por exemplo, no tratamento de seres humanos adultos, as dosagens variam de 0,01 a 1.000 mg, de 0,5 a 100 mg, de 1 a 50 mg ao dia, e de 5 a 40 mg ao dia, como exemplos de dosagens que podem ser usadas. Uma dosagem não exaustiva é de 10 a 30 mg por dia. A dosagem exata dependerá da via de administração, da maneira como o composto é administrado, do paciente a ser tratado, do peso corporal do paciente a ser tratado, da biodisponibilidade do(s) composto(s), da toxicidade de adsorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) do(s) composto(s), e da preferência e experiência do médico responsável.

[070]Além dos ingredientes ativos, essas composições farmacêuticas podem conter veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados compreendendo excipientes e auxiliares que facilitem o processamento dos compostos ativos em preparados que possam ser usados farmaceuticamente. Os preparados formulados para administração oral podem ser na forma de comprimidos, drágeas, cápsulas ou soluções.

[071]Preparados farmacêuticos para uso oral podem ser obtidos ao combinar os compostos ativos a excipientes sólidos, opcionalmente triturar a mistura resultante e processar a mistura de grânulos, depois adicionar auxiliares adequados, se desejado, para obter comprimidos ou recheios de drágea. Excipientes adequados incluem, em particular, enchimentos tais como açúcares, inclusive lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; preparados de celulose, por exemplo, amido de maís, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulose, hidroxipropilmetil-celulose, carboximetil-celulose de sódio (CMC) e/ou polivinilpirrolidona (PVP: povidona). Se desejado, pode-se adicionar agentes desintegrantes, tais como polivinilpirrolidona reticulada, ágar ou ácido algínico, ou um sal desses, tal como alginato de sódio.

[072]Os recheios de drágea são munidos de revestimentos adequados. Para tanto, é possível usar soluções de açúcar concentradas, que podem conter opcionalmente goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietileno glicol (PEG) e/ou dióxido de titânio, soluções de laca e solventes orgânicos adequados, ou misturas de solventes. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos comprimidos ou revestimentos de drágea para identificação ou para caracterizar diferentes combinações de doses do composto ativo.

[073]Preparados farmacêuticos que podem ser usados por via oral incluem cápsulas push-fit feitas de gelatina, bem como cápsulas moles e vedadas feitas de gelatina e um plastificante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas push-it podem conter os ingredientes ativos misturados com enchimento, tal como lactose, aglutinantes, tais como amidos, e/ou lubrificantes, tais como talco ou estearato de magnésio, e, como opção, estabilizantes. Nas cápsulas moles, os compostos ativos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos graxos, parafina líquida ou polietileno glicóis (PEGs) líquidos. Além disso, estabilizantes podem ser adicionados. II. DEFINIÇÕES GERAIS

[074]Embora termos específicos sejam empregados neste documento, eles são usados em sentido amplo e descritivo e não para fins de restrição. Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm os mesmos significados de conhecimento geral por parte dos versados na técnica a que pertence a matéria inventiva descrita neste documento.

[075]Embora acredite-se que os termos a seguir referentes aos compostos revelados neste documento sejam bem entendidos pelos versados na técnica, as definições a seguir são dadas para facilitar a explicação da matéria inventiva revelada neste documento. Essas definições tencionam suplementar e ilustrar, não obstar, as definições que ocorreriam aos versados na técnica mediante o exame da presente revelação.

[076]Os termos "substituído", seja ou não precedido pelo termo "opcionalmente", e "substituinte", conforme usados neste documento, referem-se à capacidade, como reconhecida pelos versados na técnica, de trocar um grupo funcional por outro grupo funcional em uma molécula, contanto que a valência de todos os átomos mantenha-se. Quando mais de uma posição em qualquer dada estrutura pode ser substituída com mais de um substituinte selecionado de um grupo especificado, o substituinte pode ser ou o mesmo ou diferente em cada posição. Os substituintes também podem ser adicionalmente substituídos (por exemplo, um substituinte grupo arila pode ter outro substituinte nele, tal como outro grupo arila, que é adicionalmente substituído em uma ou mais posições).

[077]Quando os grupos substituintes ou grupos de ligação são especificados por suas fórmulas químicas convencionais, escritas da esquerda para a direita, eles abrangem igualmente os substituintes quimicamente idênticos que resultariam da escrita da estrutura da direita para a esquerda; por exemplo, -CH2O- é equivalente a -OCH2-; -C(=O)O- é equivalente a -OC(=O)-; -OC(=O)NR- é equivalente a -NRC(=O)O-, e assim por diante.

[078]Quando utiliza-se o termo "selecionado independentemente", os substituintes aludidos (por exemplo, grupos R, tais como grupos R1, R2 e seus semelhantes, ou variáveis, tais como "m" e "n") podem ser idênticos ou diferentes. Por exemplo, tanto R1 quanto R2 podem ser alquilas substituídas, ou R1 pode ser hidrogênio e R2 pode ser uma alquila substituída, e seus semelhantes.

[079]O termo "um(a)", quando usado em alusão a um grupo de substituintes neste documento, significa ao menos um(a). Por exemplo, quando um composto é substituído com "uma" alquila ou arila, o composto é opcionalmente substituído com ao menos uma alquila e/ou ao menos uma arila. Ademais, quando um grupamento é substituído com um substituinte R, o grupo pode ser chamado de "substituído com R". Quando um grupamento é substituído com R, ele é substituído com ao menos um substituinte R e cada substituinte R é opcionalmente diferente.

[080]Em geral, um grupo "R" ou nomeado terá a estrutura que é reconhecida na técnica como correspondente a um grupo com esse nome, salvo especificação em contrário neste documento. Para fins de ilustração, certos grupos "R" representativos conforme dados acima são definidos abaixo.

[081]As descrições dos compostos da presente invenção são limitadas por princípios de ligação química conhecidos dos versados na técnica. Logo, quando um grupo pode ser substituído com um ou mais de vários substituintes, essas substituições são selecionadas de modo a respeitar os princípios de ligação química e gerar compostos que não sejam inerentemente instáveis e/ou que seriam reconhecidos pelos versados na técnica como potencialmente instáveis em condições ambientes, tais como condições aquosas, neutras e diversas condições fisiológicas conhecidas. Por exemplo, uma heterocicloalquila ou heteroarila liga-se ao restante da molécula através de um heteroátomo de anel em cumprimento com os princípios de ligação química conhecidos pelos versados na técnica, evitando assim compostos inerentemente instáveis.

[082]Salvo definição explicitamente em contrário, um "grupo substituinte", conforme usado neste documento, inclui um grupo funcional selecionado dentre um ou mais dos grupamentos a seguir, que são definidos neste documento:

[083]O termo hidrocarboneto, conforme usado neste documento, refere-se a qualquer grupo químico que compreende hidrogênio e carbono. O hidrocarboneto pode ser substituído ou não substituído. Como seria de conhecimento dos versados na técnica, todas as valências devem ser satisfeitas na produção de quaisquer substituições. O hidrocarboneto pode ser insaturado, saturado, ramificado, não ramificado, cíclico, policíclico ou heterocíclico. Hidrocarbonetos ilustrativos são adicionalmente definidos neste documento abaixo e incluem, por exemplo, metila, etila, n-propila, isopropila, ciclopropila, alila, vinila, n-butila, terc-butila, etinila, cicloexila, e seus semelhantes.

[084]O termo "alquila", sozinho ou como parte de outro substituinte, significa, salvo menção em contrário, um grupo hidrocarboneto de cadeia linear (isto é, não ramificada) ou ramificada cíclico ou acíclico, ou combinações desse, que pode ser totalmente saturado, monoinsaturado ou poli-insaturado e pode incluir grupos bivalentes e multivalentes, contendo o número de átomos de carbono indicado (isto é, C1-C10 significa um a dez carbonos, incluindo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 carbonos). Em modalidades específicas, o termo "alquila" refere-se a radicais hidrocarboneto C1-20 inclusive, incluindo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20 carbonos, lineares (isto é, "de cadeia linear"), ramificados ou cíclicos, saturados ou ao menos em parte e, em alguns casos totalmente, insaturados (isto é, alquenila e alquinila) contendo entre um e vinte átomos de carbono pela remoção de um único átomo de hidrogênio.

[085]Grupos hidrocarboneto saturados representativos incluem, entre outros, metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, n-pentila, sec-pentila, isopentila, neopentila, n-hexila, sec-hexila, n-heptila, n-octila, n-decila, n- undecila, dodecila, cicloexila, (cicloexil)metila, ciclopropilmetila, e homólogos e isômeros desses.

[086]"Ramificado" refere-se um grupo alquila no qual um grupo alquila menor, tal como metila, etila ou propila, liga-se a uma cadeia alquila linear. "Alquila menor" refere-se a um grupo alquila com 1 a cerca de 8 átomos de carbono (isto é, alquila C1-8), por exemplo, com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 átomos de carbono. "Alquila maior" refere-se a um grupo alquila com cerca de 10 a cerca de 20 átomos de carbono, por exemplo, com 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 átomos de carbono. Em certas modalidades, "alquila" refere-se, em particular, a alquilas C1-8 de cadeia linear. Em outros modalidades, "alquila" refere-se, em particular, a alquilas C1-8 de cadeia ramificada.

[087]Os grupos alquila podem ser opcionalmente substituídos (uma "alquila substituída") com um ou mais substituintes de grupo alquila, que podem ser iguais ou diferentes. O termo "substituinte grupo alquila" inclui, entre outros, alquila, alquila substituída, halo, arilamino, acila, hidroxila, ariloxila, alcoxila, alquiltio, ariltio, aralquiloxila, aralquiltio, carboxila, alcoxicarbonila, oxo e cicloalquila. Podem ser opcionalmente inseridos ao longo da cadeia alquila um ou mais átomos de oxigênio, enxofre ou nitrogênio substituídos ou não substituídos, em que o substituinte nitrogênio é hidrogênio, alquila menor (também chamada neste documento de "alquilaminoalquila") ou arila.

[088]Sendo assim, conforme usado neste documento, o termo "alquila substituída" inclui grupos alquila, conforme usados neste documento, em que um ou mais átomos ou grupos funcionais do grupo alquila são substituídos com outro átomo ou grupo funcional, incluindo, por exemplo, alquila, alquila substituída, halogênio, arila, arila substituída, alcoxila, hidroxila, nitro, amino, alquilamino, dialquilamino, sulfato e mercapto.

[089]O termo "heteroalquila", sozinho ou em combinação a outro termo, significa, salvo menção em contrário, um grupo hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada estável ou cíclico, ou combinações desse, composto por ao menos um átomo de carbono e ao menos um heteroátomo selecionado dentre o grupo composto por O, N, P, Si e S, e em que os átomos de nitrogênio, fósforo e enxofre podem ser opcionalmente oxidados e o heteroátomo de nitrogênio pode ser opcionalmente quaternizado. O(s) heteroátomo(s) O, N, P, S e Si podem ser posicionados em qualquer posição interna do grupo heteroalquila ou na posição em que o grupo alquila liga-se ao restante da molécula. Exemplos incluem, entre outros, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -

CH2-CH25-S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N- OCH3, -CH=CH-N(CH3)- CH3, O-CH3, -O-CH2-CH3 e -CN. Até dois ou três heteroátomos podem ser consecutivos, tal como, à guisa de exemplo, -CH2-NH- OCH3 e -CH2-O-Si(CH3)3.

[090]Conforme descrito acima, grupos heteroalquila, conforme usados neste documento, incluem aqueles grupos que são ligados ao restante da molécula através de um heteroátomo, tal como -C(O)NR', -NR'R", -OR', -SR, -S(O)R e/ou -S(O2)R'. Quando uma "heteroalquila" é citada, seguida por citações de grupos heteroalquila específicos, tais como -NR'R ou seus semelhantes, entender-se-á que os termos heteroalquila e -NR'R" não são redundantes ou mutuamente excludentes. Em vez disso, os grupos heteroalquila específicos são citados para fins de clareza. Sendo assim, o termo "heteroalquila" não deve ser interpretado neste documento como se excluísse grupos heteroalquila específicos, tais como -NR'R" ou seus semelhantes.

[091]"Cíclico(a)" e "cicloalquila" referem-se a um sistema de anéis não aromáticos monocíclicos ou multicíclicos de cerca de 3 a cerca de 10 átomos de carbono, por exemplo, com 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 átomos de carbono. Como opção, o grupo cicloalquila pode ser parcialmente insaturado. O grupo cicloalquila também pode ser opcionalmente substituído com um substituinte grupo alquila conforme definido neste documento, oxo e/ou alquileno. Podem ser opcionalmente inseridos ao longo da cadeia alquila cíclica um ou mais átomos de oxigênio, enxofre ou nitrogênio substituídos ou não substituídos, em que o substituinte nitrogênio é hidrogênio, alquila não substituída, alquila substituída, arila ou arila substituída, provendo assim um grupo heterocíclica. Anéis cicloalquila monocíclicos representativos incluem ciclopentila, cicloexila e cicloeptila. Anéis cicloalquila multicíclicos incluem adamantila, octaidronaftila, decalina, cânfora, câmpano e noradamantila, e sistemas de anéis fusionados, tais como di-hidronaftaleno e tetraidronaftaleno, e seus semelhantes.

[092]O termo "cicloalquilalquila", conforme usado neste documento, refere- se a um grupo cicloalquila, conforme definido acima, que liga-se ao grupamento molecular pai através de um grupo alquila, também conforme definido acima. Exemplos de grupos cicloalquilalquila incluem ciclopropilmetila e ciclopentiletila.

[093]Os termos "cicloeteroalquila" ou "heterocicloalquila" referem-se a um sistema de anéis não aromáticos, sistema de anéis insaturados ou parcialmente insaturados, tal como um sistema de anéis cicloalquila substituído ou não substituído com 3 a 10 membros, incluindo um ou mais heteroátomos, que podem ser iguais ou diferentes e são selecionados dentre o grupo composto por nitrogênio (N), oxigênio (O), enxofre (S), fósforo (P) e silício (Si), e, como opção, podem incluir uma ou mais ligações duplas.

[094]O anel cicloeteroalquila pode ser opcionalmente fusionado ou ligado de alguma outra forma a anéis cicloeteroalquila e/ou anéis hidrocarboneto não aromáticos. Anéis heterocíclicos incluem aqueles com de um a três heteroátomos selecionados independentemente dentre oxigênio, enxofre e nitrogênio, em que os heteroátomos de nitrogênio e enxofre podem ser opcionalmente oxidados e o heteroátomo de nitrogênio pode ser opcionalmente quaternizado. Em certas modalidades, o termo heterocíclico refere-se a um anel não aromático de 5, 6 ou 7 membros ou a um grupo policíclico em que ao menos um átomo de anel é um heteroátomo selecionado dentre O, S e N (em que os heteroátomos de nitrogênio e enxofre podem ser opcionalmente oxidados), incluindo, entre outros, um grupo bi ou tricíclico compreendendo anéis de seis membros fusionados com entre um e três heteroátomos selecionados independentemente dentre oxigênio, enxofre e nitrogênio, em que (i) cada anel de 5 membros possui de 0 a 2 ligações duplas, cada anel de 6 membros possui de 0 a 2 ligações duplas, e cada anel de 7 membros possui de 0 a 3 ligações duplas, (ii) os heteroátomos de nitrogênio e enxofre podem ser opcionalmente oxidados, (iii) o heteroátomo de nitrogênio pode ser opcionalmente quaternizado, e (iv) qualquer um dos anéis heterocíclicos pode ser fusionado a um anel arila ou heteroarila. Sistemas de anéis cicloeteroalquila representativos incluem, entre outros, pirrolidinila, pirrolinila, imidazolidinila, imidazolinila, pirazolidinila, pirazolinila, piperidila, piperazinila, indolinila, quinuclidinila, morfolinila, tiomorfolinila, tiadiazinanila, tetraidrofuranila, e seus semelhantes.

[095]Os termos "cicloalquila" e "heterocicloalquila", sozinhos ou em combinação a outros termos, representam, salvo menção em contrário, versões cíclicas de "alquila" e "heteroalquila", respectivamente. Em aditamento, na heterocicloalquila, um heteroátomo pode ocupar a posição na qual o heterociclo liga- se ao restante da molécula. Exemplos de cicloalquila incluem, entre outros, ciclopentila, cicloexila, 1-cicloexenila, 3-cicloexenila, cicloeptila, e seus semelhantes. Exemplos de heterocicloalquila incluem, entre outros, 1-(1,2,5,6-tetraidropiridila), 1- piperidinila, 2-piperidinila, 3-piperidinila, 4-morfolinila, 3-morfolinila, tetraidrofuran-2- ila, tetraidrofuran-3-ila, tetraidrotien-2-ila, tetraidrotien-3-ila, 1-piperazinila, 2- piperazinila, e seus semelhantes. Os termos "cicloalquileno" e "heterocicloalquileno" referem-se aos derivados bivalentes de cicloalquila e heterocicloalquila, respectivamente.

[096]Um grupo alquila insaturado é um grupo com uma ou mais ligações duplas ou triplas. Exemplos de grupos alquila insaturados incluem, entre outros, vinila, 2-propenila, crotila, 2-isopentenila, 2-(butadienila), 2,4-pentadienila, 3-(1,4- pentadienila), etinila, 1- e 3-propinila, 3-butinila, e homólogos e isômeros maiores. Os grupos alquila que limitam-se a grupos hidrocarboneto são chamados de "homoalquila".

[097]Mais particularmente, o termo "alquenila", conforme usado neste documento, refere-se a um grupo monovalente derivado de um grupamento hidrocarboneto C1-20 inclusive de cadeia linear ou ramificada com ao menos uma ligação dupla carbono-carbono pela remoção de uma única molécula de hidrogênio. Grupos alquenila incluem, por exemplo, etenila (isto é, vinila), propenila, butenila, 1- metil-2-buten-1-ila, pentenila, hexenila, octenila, alenila e butadienila.

[098]O termo "cicloalquenila", conforme usado neste documento, refere-se a um hidrocarboneto cíclico que contém ao menos uma ligação dupla carbono- carbono. Exemplos de grupos cicloalquenila incluem ciclopropenila, ciclopentenila, ciclopentadieno, cicloexenila, 1,3-cicloexadieno, cicloeptenila, cicloeptatrienila, e ciclo-octenila.

[099]O termo "alquinila", conforme usado neste documento, refere-se a um grupo monovalente derivado de um hidrocarboneto C1-20 de cadeia linear ou ramificada com um número designado de átomos de carbono contendo ao menos uma ligação tripla carbono-carbono. Exemplos de "alquinila" incluem grupos etinila, 2-propinila (propargila), 1-propinila, pentinila, hexinila e heptinila, e seus semelhantes.

[0100]O termo "alquileno", sozinho ou como parte de outro substituinte, refere-se a um grupo hidrocarboneto alifático bivalente linear ou ramificado derivado de um grupo alquila com 1 a cerca de 20 átomos de carbono, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 átomos de carbono. O grupo alquileno pode ser linear, ramificado ou cíclico. O grupo alquileno também pode ser opcionalmente insaturado e/ou substituído com um ou mais "substituintes grupo alquila". Podem ser opcionalmente inseridos ao longo do grupo alquileno um ou mais átomos de oxigênio, enxofre ou nitrogênio substituídos ou não substituídos (também chamado neste documento de "alquilaminoalquila"), em que o substituinte nitrogênio é alquila, conforme descrito previamente. Exemplos de grupos alquileno incluem metileno (-CH2-); etileno (-CH2-CH2-); propileno (-(CH2)3-); cicloexileno (-C6H10-); -CH=CH-CH=CH-; -CH=CH-CH2-; -CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH=CHCH2-, -CH2CsCCH2-, -CH2CH2CH(CH2CH2CH3)CH2-, -(CH2)q-N(R)-(CH2)r-, em que cada um de q e r é independentemente um número inteiro de 0 a cerca de 20, por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20, e R é hidrogênio ou uma alquila menor; metilenodioxila (-O-CH2-O-); e etilenodioxila (-O-(CH2)2-O-). Um grupo alquileno pode ter cerca de 2 a cerca de 3 átomos de carbono e pode incluir ainda de 6 a 20 carbonos. Tipicamente, um grupo alquila (ou alquileno) terá de 1 a 24 átomos de carbono; os grupos com 10 ou menos átomos de carbono fazendo parte de algumas modalidades da presente invenção. Uma "alquila menor" ou "alquileno menor" é um grupo alquila ou alquileno de cadeia mais curta, geralmente com oito ou menos átomos de carbono.

[0101]O termo "heteroalquileno", sozinho ou como parte de outro substituinte, significa um grupo bivalente derivado de heteroalquila, como exemplificado, mas sem limitação, por -CH2-CH2-S-CH2-CH2- e -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. Nos grupos heteroalquileno, heteroátomos também pode ocupar um ou ambos os terminais de cadeia (por exemplo, alquileno-oxo, alquilenodioxo, alquilenoamino, alquilenodiamino, e seus semelhantes). Além do mais, nos grupos de ligação alquileno e heteroalquileno, a orientação do grupo de ligação não decorre da direção em que a fórmula do grupo de ligação foi escrita. Por exemplo, a fórmula -C(O)OR'- representa tanto -C(O)OR'- quanto -R'OC(O)-.

[0102]O termo "arila" significa, salvo menção em contrário, um substituinte hidrocarboneto aromático que pode ser um anel simples ou vários anéis (tal como de 1 a 3 anéis), que são conjuntamente fusionados ou ligados covalentemente. O termo "heteroarila" refere-se a grupos (ou anéis) arila que contêm de um a quatro heteroátomos (em cada anel distinto no caso de vários anéis) selecionados dentre N, O e S, em que os átomos de nitrogênio e enxofre são opcionalmente oxidados, e os um ou mais átomos de nitrogênio são opcionalmente quaternizados. Um grupo heteroarila pode ligar-se ao restante da molécula através de um carbono ou heteroátomo. Exemplos não exaustivos de grupos arila e heteroarila incluem fenila, 1-naftila, 2-naftila, 4-bifenila, 1-pirrolila, 2-pirrolila, 3-pirrolila, 3-pirazolila, 2- imidazolila, 4-imidazolila, pirazinila, 2-oxazolila, 4-oxazolila, 2-fenil-4-oxazolila, 5- oxazolila, 3-isoxazolila, 4-isoxazolila, 5-isoxazolila, 2-tiazolila, 4-tiazolila, 5-tiazolila, 2-furila, 3-furila, 2-tienila, 3-tienila, 2-piridila, 3-piridila, 4-piridila, 2-pirimidila, 4- pirimidila, 5-benzotiazolila, purinila, 2-benzimidazolila, 5-indolila, 1-isoquinolila, 5- isoquinolila, 2-quinoxalinila, 5-quinoxalinila, 3-quinolila e 6-quinolila. Substituintes para cada um dos sistemas de anéis arila e heteroarila mencionados acima são selecionados dentre o grupo composto por substituintes aceitáveis descrito abaixo. Os termos "arileno" e "heteroarileno" referem-se às formas bivalentes da arila e heteroarila, respectivamente.

[0103]Para fins de brevidade, o termo "arila", quando usado em combinação a outros termos (por exemplo, arilóxi, ariltióxi, arilalquila), inclui tanto anéis arila quanto anéis heteroarila, conforme definidos acima. Sendo assim, os termos "arilalquila" e "heteroarilalquila" visam a incluir aqueles grupos em que um grupo arila ou heteroarila liga-se a um grupo alquila (por exemplo, benzila, fenetila, piridilmetila, furilmetila e seus semelhantes), incluindo aqueles grupos alquila em que um átomo de carbono (por exemplo, um grupo metileno) foi substituído, por exemplo, por um átomo de oxigênio (por exemplo, fenoximetila, 2-piridiloximetila, 3-(1- naftilóxi)propila, e seus semelhantes). No entanto, o termo "haloarila", conforme usado neste documento, abrange somente arilas substituídas com um ou mais halogênios.

[0104]Quando uma heteroalquila, heterocicloalquila ou heteroarila inclui um número específico de membros (por exemplo, "3 a 7 membros"), o termo "membro" refere-se a um carbono ou heteroátomo.

[0105]Além disso, uma estrutura representada em geral pela fórmula: (R)n ou conforme usado neste documento, refere-se a uma estrutura anelar, por exemplo, entre outras, um composto cíclico alifático e/ou aromático de 3 carbonos, 4 carbonos, 5 carbonos, 6 carbonos, 7 carbonos e seus semelhantes, incluindo uma estrutura anelar saturada, uma estrutura anelar parcialmente saturada e uma estrutura anelar insaturada com um grupo R substituinte, em que o grupo R pode estar presente ou ausente, e, quando presente, um ou mais grupos R podem ser cada um substituído em um ou mais átomos de carbonos disponíveis da estrutura anelar. A presença ou ausência do grupo R e o número de grupos R são determinados pelo valor da variável "n", que é um número inteiro geralmente com um valor que varia de 0 ao número de átomos de carbono no anel disponíveis para substituição. Cada grupo R, se mais de um, é substituído em um carbono disponível da estrutura anelar em vez de em outro grupo R. Por exemplo, a estrutura acima, onde n é de 0 a 2 compreenderia grupos de compostos incluindo, entre outros: e seus semelhantes.

[0106]Uma linha tracejada representando uma ligação em uma estrutura anelar cíclica indica que a ligação pode estar ou presente ou ausente no anel. Ou seja, uma linha tracejada representando uma ligação em uma estrutura anelar cíclica indica que a estrutura anelar é selecionada dentre o grupo composto por uma estrutura anelar saturada, uma estrutura anelar parcialmente saturada e uma estrutura anelar insaturada.

[0107]O símbolo ( ) indica o ponto de ligação de um grupamento com o restante da molécula.

[0108]Quando um átomo nomeado de um anel aromático ou um anel aromático heterocíclico é definido como "ausente", o átomo nomeado é substituído por uma ligação direta.

[0109]Cada um dos termos acima (por exemplo, "alquila", "heteroalquila", "cicloalquila", "heterocicloalquila", "arila", "heteroarila", "fosfonato" e "sulfonato", bem como seus derivados bivalentes) visa a incluir formas tanto substituídas quanto não substituídas do grupo indicado. Substituintes opcionais para cada tipo de grupo são dados abaixo.

[0110]Substituintes para grupos derivados monovalentes e bivalentes de alquila, heteroalquila, cicloalquila, heterocicloalquila (incluindo aqueles grupos muitas vezes chamados de alquileno, alquenila, heteroalquileno, heteroalquenila, alquinila, cicloalquila, heterocicloalquila, cicloalquenila e heterocicloalquenila) podem ser um ou mais de uma variedade de grupos selecionados dentre, entre outros: -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -halogênio, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -C(O)NR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R'", -NR"C(O)OR', -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN e -NO2 em um número que varia de zero a (2m'+1), onde m' é o número total de átomos de carbono nesses grupos. Cada um de R', R", R'" e R"" pode referir-se independentemente a hidrogênio, heteroalquila substituída ou não substituída, cicloalquila substituída ou não substituída, heterocicloalquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída (por exemplo, arila substituída com 1 a 3 halogênios), alquila substituída ou não substituída, grupos alcóxi ou tioalcóxi, ou grupos arilalquila. Conforme usado neste documento, um grupo "alcóxi" é uma alquila ligada ao restante da molécula através de um oxigênio bivalente. Quando um composto da invenção inclui mais de um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é selecionado independentemente como cada grupo R', R", R'" e R"" quando mais de um desses grupos se faz presente. Quando R' e R" ligam-se ao mesmo átomo de nitrogênio, eles podem ser combinados ao átomo de nitrogênio para formar um anel de 4, 5, 6 ou 7 membros. Por exemplo, tenciona-se que -NR'R" inclua, entre outros, 1-pirrolidinila e 4-morfolinila. Com base na discussão acima sobre substituintes, os versados na técnica entenderão que o termo "alquila" visa a incluir grupos que contêm átomos de carbono ligados a grupos que não grupos hidrogênio, tais como haloalquila (por exemplo, -CF3 e -CH2CF3) e acila (por exemplo, -C(O)CH3, - C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3, e seus semelhantes).

[0111]À semelhança dos substituintes descritos para grupos alquila acima, exemplos de substituintes para grupos arila e heteroarila (bem como seus derivados bivalentes) são variados e selecionados, por exemplo, dentre: halogênio, -OR', -NR'R”, -SR', -SiR'R”R'”, -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -C(O)NR'R”, -OC(O)NR'R”, -NR”C(O)R', -NR'-C(O)NR”R'”, -NR”C(O)OR', -NR-C(NR'R”R'”)=NR””, -NR-C(NR'R”)=NR'” -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R”, -NRSO2R', -CN e -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, fluoralcoxo(C1-C4) e fluoralquila(C1-C4), em um número que varia de zero ao número total de valências abertas no sistema de anéis aromáticos; e onde R', R", R'" e R"" podem ser selecionados independentemente dentre hidrogênio, alquila substituída ou não substituída, heteroalquila substituída ou não substituída, cicloalquila substituída ou não substituída, heterocicloalquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída e heteroarila substituída,ou não substituída. Quando um composto da invenção inclui mais de um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é selecionado independentemente como cada grupo R', R", R'" e R"" quando mais de um desses grupos se faz presente.

[0112]Dois dos substituintes em átomos adjacentes do anel arila ou heteroarila podem formar opcionalmente um anel de fórmula -T-C(O)-(CRR')q-U-, em que T e U são independentemente -NR-, -O-, -CRR'- ou uma ligação simples, e q é um número inteiro de 0 a 3. Como alternativa, dois dos substituintes em átomos adjacentes do anel arila ou heteroarila podem ser opcionalmente substituídos com um substituinte de fórmula -A-(CH2)r-B-, em que A e B são independentemente -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'- ou uma ligação simples, e r é um número inteiro de 1 a 4.

[0113]Uma das ligações simples do novo anel assim formado pode ser opcionalmente substituída por uma ligação dupla. Como alternativa, dois dos substituintes em átomos adjacentes do anel arila ou heteroarila podem ser opcionalmente substituídos com um substituinte de fórmula -(CR')s-X'-(C"R'")d-, onde s e d são independentemente números inteiros de 0 a 3, e X' é -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2- ou -S(O)2NR'-. Os substituintes R, R', R'" e R"" podem ser selecionados independentemente dentre hidrogênio, alquila substituída ou não substituída, cicloalquila substituída ou não substituída, heterocicloalquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída e heteroarila substituída ou não substituída.

[0114]Conforme usado neste documento, o termo "acila" refere-se a um grupo ácido orgânico em que -OH do grupo carboxila foi substituído com outro substituinte e possui a fórmula geral RC(=O)-, em que R é um grupo alquila, alquenila, alquinila, arila, carbocíclico, heterocíclico ou heterocíclico aromático conforme definido neste documento. Como tal, o termo "acila" inclui especificamente grupos arilacila, tais como um grupo 2-(furan-2-il)acetila) e um grupo 2-fenilacetila. Exemplos específicos de grupos acila incluem acetila e benzoíla. Grupos acila também visam a incluir amidas, -RC(=O)NR', ésteres, -RC(=O)OR', cetonas, -RC(=O)R' e aldeídos, -RC(=O)H.

[0115]Os termos "alcoxila" ou "alcóxi" são usados neste documento de maneira intercambiável e referem-se a um grupo saturado (isto é, alquil-O-) ou insaturado (isto é, alquenil-O- e alquinil-O-) ligado ao grupamento molecular pai através de um átomo de oxigênio, em que os termos "alquila", "alquenila" e "alquinila" são conforme previamente descrito e podem incluir cadeias oxoidrocarboneto C1-20 inclusive lineares, ramificadas ou cíclicas saturadas ou insaturadas, incluindo, por exemplo, metoxila, etoxila, propoxila, isopropoxila, n- butoxila, sec-butoxila, terc-butoxila e n-pentoxila, neopentoxila, n-hexoxila, e seus semelhantes.

[0116]O termo "alcoxialquila", conforme usado neste documento, refere-se a um éter alquil-O-alquílico, por exemplo, um grupo metoxietila ou etoximetila.

[0117]"Ariloxila" refere-se a um grupo aril-O- em que o grupo arila é conforme descrito previamente, incluindo uma arila substituída. O termo "ariloxila", conforme usado neste documento, pode referir-se a feniloxila ou hexiloxila e alquila, alquila substituída, halo ou feniloxila ou hexiloxila substituída com alcoxila.

[0118]"Aralquila" refere-se a um grupo aril-alquila em que arila e alquila são conforme descrito previamente e incluem arila substituída e alquila substituída. Exemplos de grupos aralquila incluem benzila, feniletila e naftilmetila.

[0119]"Aralquiloxila" refere-se a um grupo aralquil-O- em que o grupo aralquila é conforme descrito previamente. Um grupo aralquiloxila exemplificativo é benziloxila, isto é, C6H5-CH2-O-. Um grupo aralquiloxila pode ser opcionalmente substituído.

[0120]"Alcoxicarbonila" refere-se a um grupo alquil-O-C(=O)-. Exemplos de grupos alcoxicarbonila incluem metoxicarbonila, etoxicarbonila, butiloxicarbonila e terc-butiloxicarbonila.

[0121]"Ariloxicarbonila" refere-se a um grupo aril-O-C(=O)-. Exemplos de grupos ariloxicarbonila incluem fenóxi- e naftóxi-carbonila.

[0122]"Aralcoxicarbonila" refere-se a um grupo aralquil-O-C(=O)-. Um grupo aralcoxicarbonila exemplificativo é benziloxicarbonila.

[0123]"Carbamoíla" refere-se a um grupo amida de fórmula -C(=O)NH2. "Alquilcarbamoíla" refere-se a um grupo R'RN-C(=O)- em que um de R e R' é hidrogênio e o outro de R e R' é alquila e/ou alquila substituída conforme descrito previamente. "Dialquilcarbamoíla" refere-se a um grupo R'RN-C(=O)- em que cada um de R e R' é independentemente alquila e/ou alquila substituída conforme descrito previamente.

[0124]O termo carbonildioxila, conforme usado neste documento, refere-se a um grupo carbonato de fórmula -O-C(=O)-OR.

[0125]"Aciloxila" refere-se a um grupo acil-O- em que acila é conforme descrito previamente.

[0126]O termo "amino" refere-se ao grupo -NH2 e também se refere a um grupo contendo nitrogênio, como é de conhecimento na técnica, derivado de amônia pela substituição de um ou mais radicais hidrogênio por radicais orgânicos. Por exemplo, os termos "acilamino" e "alquilamino" referem-se a radicais orgânicos substituídos com N específicos com grupos substituintes acila e alquila, respectivamente.

[0127]Uma "aminoalquila", conforme usado neste documento, refere-se a um grupo amino ligado de maneira covalente a um ligante alquileno. Mais particularmente, os termos alquilamino, dialquilamino e trialquilamino, conforme usados neste documento, referem-se a um, dois ou três grupos alquila, respectivamente, conforme definido previamente, ligados ao grupamento molecular pai através de um átomo de nitrogênio. O termo alquilamino refere-se a um grupo com a estrutura -NHR' em que R' é um grupo alquila, conforme definido previamente; ao passo que o termo dialquilamino refere-se a um grupo com a estrutura -NR'R", em que cada um de R' e R" é selecionado independentemente do grupo composto por grupos alquila. O termo trialquilamino refere-se a um grupo com a estrutura -NR'R"R'", em que cada um de R', R" e R'" é selecionado independentemente dentre o grupo composto por grupos alquila. Além disso, R', R" e/ou R'", juntos, podem ser opcionalmente -(CH2)k-, onde k é um número inteiro de 2 a 6. Exemplos incluem, entre outros, metilamino, dimetilamino, etilamino, dietilamino, dietilaminocarbonila, metiletilamino, isopropilamino, piperidino, trimetilamino e propilamino.

[0128]O grupo amino é -NR'R", em que R' e R" são selecionados tipicamente dentre hidrogênio, alquila substituída ou não substituída, heteroalquila substituída ou não substituída, cicloalquila substituída ou não substituída, heterocicloalquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída ou heteroarila substituída ou não substituída.

[0129]Os termos alquiltioéter e tioalcoxila referem-se a um grupo saturado (isto é, alquil-S-) ou insaturado (isto é, alquenil-S- e alquinil-S-) ligado ao grupamento molecular pai através de um átomo de enxofre. Exemplos de grupamentos tioalcoxila incluem, entre outros, metiltio, etiltio, propiltio, isopropiltio, n-butiltio, e seus semelhantes.

[0130]"Acilamino" refere-se a um grupo acil-NH- em que acila é conforme descrito previamente. "Aroilamino" refere-se a um grupo aroil-NH- em que aroíla é conforme descrito previamente.

[0131]O termo "carbonila" refere-se ao grupo -C(=O)- e pode incluir um grupo aldeído representado pela fórmula geral R-C(=O)H.

[0132]O termo "carboxila" refere-se ao grupo -COOH. Esses grupos também são chamados neste documento de grupamento "ácido carboxílico".

[0133]Os termos "halo", "haleto" ou "halogênio", conforme usados neste documento, referem-se a grupos flúor, cloro, bromo e iodo. Além disso, termos como "haloalquila" visam a incluir mono-haloalquila e poli-haloalquila. Por exemplo, o termo "haloalquila(C1-C4)" visa a incluir, entre outros, trifluormetila, 2,2,2-trifluoretila, 4-clorobutila, 3-bromopropila, e seus semelhantes.

[0134]O termo "hidroxila" refere-se ao grupo -OH.

[0135]O termo "hidroxialquila" refere-se a um grupo alquila substituído com um grupo -OH.

[0136]O termo "mercapto" refere-se ao grupo -SH.

[0137]O termo "oxo", conforme usado neste documento, significa um átomo de oxigênio que se liga duplamente a um átomo de carbono ou a outro elemento.

[0138]O termo "nitro" refere-se ao grupo -NO2.

[0139]O termo "tio" refere-se a um composto descrito previamente neste documento em que um átomo de carbono ou oxigênio é substituído por um átomo de enxofre.

[0140]O termo "sulfato" refere-se ao grupo -SO4.

[0141]O termo tio-hidroxila ou tiol, conforme usado neste documento, refere- se a um grupo de fórmula -SH.

[0142]Mais particularmente, o termo "sulfeto" refere-se a um composto com um grupo de fórmula -SR.

[0143]O termo "sulfona" refere-se a um composto com um grupo sulfonila -S(O2)R.

[0144]O termo "sulfóxido" refere-se a um composto com um grupo sulfinila -S(O)R.

[0145]O termo "ureído" refere-se a um grupo ureia de fórmula -NH-CO-NH2.

[0146]O termo "grupo protetor" em alusão aos compostos revelados neste documento refere-se a um substituinte químico que pode ser seletivamente removido por reagentes prontamente disponíveis que não atacam o grupo funcional regenerado ou outros grupos funcionais na molécula. Grupos protetores adequados são conhecidos na técnica e continuam sendo desenvolvidos. Grupos protetores adequados podem ser encontrados, por exemplo, em Wutz et al. ("Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, Fourth Edition", Wiley-Interscience, 2007). Grupos protetores para proteção do grupo carboxila, conforme descritos por Wutz et al. (páginas 533 a 643), são usados em certas modalidades. Em algumas modalidades, o grupo protetor é removível por tratamento com ácido. Exemplos representativos de grupos protetores incluem, entre outros, benzila, p-metoxibenzila (PMB), butila terciária (t-Bu), metoximetila (MOM), metoxietoximetila (MEM), metiltiometila (MTM), tetraidropiranila (THP), tetraidrofuranila (THF), benziloximetila (BOM), trimetilsilila (TMS), trietilsilila (TES), t-butildimetilsilila (TBDMS) e trifenilmetila (tritila, Tr). Os versados na técnica reconhecerão situações apropriadas nas quais grupos protetores são necessários e serão capazes de selecionar um grupo protetor apropriado para uso em uma circunstância específica.

[0147]Ao longo de todo o relatório descritivo e reivindicações, dada fórmula ou nome químico abrangerá todos os tautômeros, congêneres, isômeros ópticos e esteroisômeros, bem como misturas racêmicas onde houver esses isômeros e misturas.

[0148]Certos compostos da presente invenção podem ter átomos de carbono assimétricos (centros ópticos ou quirais) ou ligações duplas; os enantiômeros, racematos, diastereômeros, tautômeros, isômeros geométricos, formas esteroisométricas que podem ser definidos, em termos de estereoquímica absoluta, por (R) ou (S) ou por D ou L para aminoácidos e isômeros individuais enquadram-se no âmbito da presente invenção. Os compostos da presente invenção não incluem os que são reconhecidos na técnica por ser instáveis demais para sintetizar e/ou isolar. A presente invenção visa a incluir compostos nas formas racêmica, escalênica e opticamente pura. Os isômeros (R) e (S) ou D e L opticamente ativos podem ser preparados usando síntons quirais ou reagentes quirais, ou resolvidos usando técnicas convencionais. Quando os compostos descritos neste documento contiverem ligações olefínicas ou outros centros de assimetria geométrica, e salvo especificação em contrário, tenciona-se que eles incluam isômeros geométricos tanto E como Z.

[0149]Salvo menção em contrário, as estruturas representadas neste documento também visam a incluir todas as formas estereoquímicas das mesmas, isto é, as configurações R e S para cada centro assimétrico. Logo, isômeros estereoquímicos simples, bem como misturas enantioméricas e diastereoméricas dos presentes compostos, enquadram-se no âmbito da invenção.

[0150]Transparecerá aos versados na técnica que certos compostos da presente invenção podem existir em formas tautoméricas, todas essas formas tautoméricas dos compostos enquadrando-se no âmbito da invenção. O termo "tautômero", conforme usado neste documento, refere-se a um de dois ou mais isômeros estruturais que existem em equilíbrio e que são prontamente convertidos de uma forma isomérica em outra.

[0151]Salvo menção em contrário, as estruturas representadas neste documento também visam a incluir compostos que diferem somente na presença de um ou mais átomos enriquecidos isotopicamente. Por exemplo, compostos contendo as presentes estruturas com a substituição de um hidrogênio por um deutério ou trítio, ou a substituição de um carbono por um carbono enriquecido com 13C ou 14C, enquadram-se no âmbito da presente invenção.

[0152]Os compostos da presente invenção também podem conter proporções não naturais de isótopos atômicos em um ou mais dos átomos que os constituem. Por exemplo, os compostos podem ser radiomarcados com isótopos radioativos, tais como, por exemplo, trítio (3H), iodo-125 (125I) ou carbono-14 (14C). Todas as variações isotópicas dos compostos da presente invenção, sejam radioativas ou não, enquadram-se no âmbito da presente invenção.

[0153]Os compostos da presente invenção podem existir como sais. A presente invenção inclui esses sais. Exemplos de formas salinas aplicáveis incluem hidrocloretos, hidrobrometos, sulfatos, metanossulfonatos, nitratos, maleatos, acetatos, citratos, fumaratos, tartaratos (por exemplo, (+)-tartaratos, (-)-tartaratos ou misturas desses, inclusive misturas racêmicas, succinatos, benzoatos e sais com aminoácidos, tais como ácido glutâmico). Esses sais podem ser preparados por métodos conhecidos pelos versados na técnica. Também são incluídos sais por adição de base, tais como sais de sódio, potássio, cálcio, amônio, amino orgânico ou magnésio, ou um sal semelhante. Quando os compostos da presente invenção contiverem funcionalidades relativamente básicas, sais por adição de ácido podem ser obtidos colocando a forma neutra desses compostos em contato com uma quantidade suficiente do ácido desejado, ou puro ou em um solvente inerte adequado ou por troca iônica. Exemplos de sais por adição de ácido aceitáveis incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos como os ácidos clorídrico, bromídrico, nítrico, carbônico, monoidrogenocarbônico, fosfórico, monoidrogenofosfórico, di-hidrogenofosfórico, sulfúrico, monoidrogenossulfúrico, hidriódico ou fosforoso, e seus semelhantes, bem como os sais derivados de ácidos orgânicos como os ácidos acético, propiônico, isobutírico, maleico, malônico, benzoico, succínico, subérico, fumárico, láctico, mandélico, ftálico, benzenossulfônico, p-tolilsulfônico, cítrico, tartárico, metanossulfônico, e seus semelhantes. Também são incluídos sais de aminoácidos, tais como arginato e seus semelhantes, e sais de ácidos orgânicos, como os ácidos glucurônico ou galactunórico, e seus semelhantes. Certos compostos específicos da presente invenção contêm funcionalidades tanto básicas quanto ácidas que permitem que os compostos sejam convertidos em sais por adição ou de base ou de ácido.

[0154]As formas neutras dos compostos podem ser regeneradas colocando o sal em contato com uma base ou ácido e isolando o composto pai de maneira convencional. A forma mãe do composto difere das várias formas salinas em certas propriedades físicas, tais como solubilidade em solventes polares.

[0155]Certos compostos da presente invenção podem existir em formas não solvatadas, bem como em formas solvatadas, incluindo formas hidratadas. Em termos gerais, as formas solvatadas são equivalentes a formas não solvatadas e enquadram-se no âmbito da presente invenção. Certos compostos da presente invenção podem existir em várias formas cristalinas ou amorfas. Em termos gerais, todas as formas físicas são equivalentes aos usos contemplados pela presente invenção e visam a enquadrar-se no âmbito da presente invenção.

[0156]Além das formas salinas, a presente invenção propõe compostos que são na forma de um pró-fármaco. Pró-fármacos dos compostos descritos neste documento são aqueles compostos que passam, em condições fisiológicas, prontamente por mudanças químicas para prover os compostos da presente invenção. Em aditamento, os pró-fármacos podem ser convertidos nos compostos da presente invenção por métodos químicos ou bioquímicos em um ambiente ex vivo. Por exemplo, os pró-fármacos podem ser convertidos lentamente nos compostos da presente invenção quando introduzidos em um reservatório de adesivo transdérmico com uma enzima ou reagente químico adequado.

[0157]Seguindo-se a convenção da tradicional legislação de patente, os termos "um", "uma", "o" e "a" referem-se a "um(a) ou mais" quando usados neste pedido, inclusive nas reivindicações. Sendo assim, por exemplo, uma referência a "um paciente" inclui vários pacientes, salvo quando o contexto ditar claramente o contrário (por exemplo, vários pacientes), e assim por diante.

[0158]Ao longo de todo o relatório descritivo e reivindicações, o termo "compreender" é usado no sentido não exclusivo, salvo quando o contexto exigir o contrário. Outrossim, o termo "incluir" e suas conjugações não visam a ser exaustivos, de modo que a declamação de itens em lista não exclui outros itens semelhantes que possam substituir ou ser adicionados aos itens listados.

[0159]Para os fins deste relatório descritivo e das reivindicações apensas, salvo indicação em contrário, todos os números que expressam quantidades, tamanhos, dimensões, proporções, formatos, fórmulas, parâmetros, porcentagens, quantidades, características e outros valores numéricos usados neste relatório descritivo e nas reivindicações devem ser interpretados como se modificados, em todos os casos, pelo termo "cerca de", ainda que o termo "cerca de" não apareça explicitamente junto ao valor, quantidade ou faixa. Logo, salvo indicação em contrário, os parâmetros numéricos indicados no relatório descritivo a seguir e nas reivindicações anexas não são e não precisam ser exatos mas podem ser aproximações e/ou maiores ou menores de acordo com o desejado, refletindo assim tolerâncias, fatores de conversão, arredondamentos, erros de medição e seus semelhantes, além de outros fatores conhecidos pelos versados na técnica, dependendo das propriedades desejadas que busca-se obter com a matéria inventiva revelada neste documento. Por exemplo, o termo "cerca de", quando referindo-se a um valor, pode ser interpretado de modo a abranger variações, em algumas modalidades, de ±100%, em algumas modalidades, de ±50%, em algumas modalidades, de ±20%, em algumas modalidades, de ±10%, em algumas modalidades, de ±5%, em algumas modalidades, de ±1%, em algumas modalidades, de ±0,5% e, em algumas modalidades, de ±0,1% a quantidade especificada, uma vez que essas variações sejam apropriadas para praticar os métodos revelados ou empregar as composições reveladas.

[0160]Além disso, o termo "cerca de", quando usado em conexão com um ou mais números ou faixas numéricas, deve ser entendido como referindo-se a todos esses números, incluindo todos os números na faixa, e modifica essa faixa estendendo os limites acima e abaixo dos valores numéricos indicados. A citação de faixas numéricas por extremidades inclui todos os números, por exemplo, números inteiros completos, inclusive frações dos mesmos, incluídos dentro dessa faixa (por exemplo, a citação de 1 a 5 inclui 1, 2, 3, 4 e 5, bem como frações desses, por exemplo, 1,5, 2,25, 3,75, 4,1, e seus semelhantes) e qualquer faixa dentro dessa faixa.

EXEMPLOS

[0161]Os Exemplos a seguir são incluídos para orientar os versados na técnica na prática de modalidades representativas da matéria inventiva revelada neste documento. À luz da presente invenção e do nível geral de sua habilidade na técnica, os versados na técnica apreciarão que os Exemplos a seguir destinam-se a ser meramente exemplificativos e que diversas mudanças, modificações e alterações podem ser feitas sem divergir do âmbito da matéria inventiva revelada neste documento. As descrições das sínteses e os exemplos específicos que seguem são meramente ilustrativos e não devem ser interpretados de modo a limitar de maneira alguma a produção dos compostos da invenção por outros métodos. EXEMPLO 1 IMAGIOLOGIA POR PET DAS MICRÓGLIAS MIRANDO-SE O RECEPTOR DO FATOR ESTIMULANTE DE COLÔNIAS DE MACRÓFAGOS 1 (CSF1R)

1.1. Visão geral

[0162]A 5-ciano-N-(4-(4-[11C]metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano- 2-carboxamida ([11C]CPPC) é um radiotraçador PET específico ao CSF1R, um marcador específico das micróglias. Esse composto pode ser usado como uma ferramenta não invasiva para gerar imagens de micróglias reativas, de micróglias associadas a doença e de sua contribuição para a neuroinflamação in vivo. Postula- se que a neuroinflamação é uma característica patogênica subjacente de uma ampla variedade de transtornos neuropsiquiátricos. A [11C]CPPC também pode ser usada para estudar especificamente o ambiente imunológico de malignidades do sistema nervoso central e para monitorar potenciais efeitos neuroinflamatórios adversos da imunoterapia contra malignidades periféricas. Esse agente PET será caro ao desenvolvimento de novos produtos terapêuticos contra a neuroinflamação, em particular que miram o CSF1R, não só por prover uma leitura não invasiva repetível dos pacientes mas também por permitir medir o envolvimento alvo do fármaco.

[0163]Embora a neuroinflamação seja um conceito em evolução, e as células envolvidas e suas funções estejam sendo definidas, as micróglias são entendidas como um mediador celular chave da lesão e reparo cerebrais. A capacidade de medir a atividade microglial de maneira específica e não invasiva seria uma dádiva para o estudo da neuroinflamação, que está envolvida em uma ampla variedade de transtornos neuropsiquiáticos, inclusive lesão cerebral traumática, doença desmielinizante, doença de Alzheimer (AD) e doença de Parkinson, entre outros.

[0164]A [11C]CPPC é um ligante emissor de pósitrons de alta afinidade que é específico ao receptor do fator estimulante de colônias de macrófagos 1 (CSF1R), cuja expressão restringe-se essencialmente às micróglias dentro do cérebro. A [11C]CPPC exibe absorção cerebral alta e específica em modelos de neuroinflamação por lipopolissacarídeos murídeos e primatas não humanos. Ela também exibe absorção específica e elevada em modelos de AD murídeos, modelos de desmielinização com encefalomielite alérgica experimental murídeos e no tecido cerebral postmortem de pacientes com AD. A dosimetria de radiação em camundongos indicou que a [11C]CPPC seria segura para estudos humanos futuros. A [11C]CPPC pode ser sintetizada com rendimento radioquímico, pureza e radioatividade específica suficientes e exibe especificidade de ligação em modelos relevantes que indicam potencial para a imagiologia PET humana do CSF1R e do componente microglial da neuroinflamação.

1.2. Âmbito do Trabalho

[0165]O inibidor potente e seletivo do CSF1R 5-ciano-N-(4-(4-metilpiperazin- 1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2-carboxamida foi desenvolvido pela indústria farmacêutica (Illig CR, et al. (2008)). Aqui, a radiossíntese de seu isotopólogo, a 5- ciano-N-(4-(4-[11C]metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2-carboxamida ([11C]CPPC), é descrita, e o potencial da [11C]CPPC para a imagiologia PET do CSF1R na neuroinflamação é avaliado.

1.3. Materiais e Métodos

1.3.1. Química

[0166]Obtiveram-se os inibidores do CSF1R BLZ945 (Krauser JA, et al. (2015)) e pexidartinibe (PLX3397) (DeNardo DG, et al. (2011)) na praça, e o composto 8 foi preparado internamente conforme descrito previamente (Illig CR, et al. (2008)). A síntese da CPPC [5-ciano-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1- il)fenil)furano-2-carboxamida] foi realizada conforme descrito previamente (Illig CR, et al. (2008)), e o precursor não metila para a radiomarcação da [11C]CPPC, 5-ciano- N-(4-(piperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2-carboxamida (Pre-CPPC) foi preparado da mesma forma (FIG. 8). A [11C]CPPC foi preparada pela reação de [11C]CH3I com Pre-CPPC (FIG. 9).

1.3.2. Estudos de Biodistribuição e Imagiologia PET com a [11C]CPPC em Animais

[0167]Os protocolos animais foram aprovados pelo Comitê para Cuidado e Uso de Animais da Johns Hopkins Medical Institutions.

1.3.3. Animais

[0168]Camundongos C57BL/6J (com 22 a 27 g) ou camundongos CD-1 (com 25 a 27 g) da Charles River Laboratories fizeram as vezes de controle. Camundongos com as micróglias depletadas foram obtidos conforme descrito previamente (Elmore MR, et al. (2014)). Camundongos CSF1R KO (B6.Cg- Csf1rtm1.2Jwp/J) foram adquiridos junto à Jackson Laboratories. Um modelo camundongo da amiloidose relacionada à AD superexpressando a Proteína Precursora Amiloide com mutações Sueca e Indiana foi preparado internamente

(Melnikova T, et al. (2013)). Camundongos CD-1 machos receberam a injeção intracraniana (Dobos N, et al. (2012)) de LPS (5 µg; prosencéfalo direito) como modelo de neuroinflamação por LPS injetados por via intracraniana (i.c.-LPS). Um modelo de neuroinflamação i.p. (i.p.-LPS) foi gerado injetando em camundongos CD- 1 machos LPS (10 mg/kg; 0,2 mL; i.p.) conforme descrito previamente (Qin L, et al. (2007)). Para o modelo camundongo da Encefalite Autoimune Experimental (EAE), camundongos C57BL/6J fêmeos foram inoculados com o peptídeo MOG35-55 conforme descrito previamente (Jones MV, et al. (2008)). Camundongos inoculados com MOG sintomáticos e camundongos não inoculados saudáveis foram varridos 14 dias após a primeira inoculação.

1.3.4. Biodistribuição Cerebral Regional da [11C]CPPC nos Camundongos

[0169]O desfecho dos experimentos com camundongos foi calculado pela porcentagem do valor de absorção padronizado (%SUV) ou %SUV corrigida para a concentração de radioatividade no sangue. (SUVR):SUVR=%SUV nos tecidos/%SUV no sangueSUVR=%SUV nos tecidos/%SUV no sangue.

1.3.5. Referência

[0170]Os camundongos controle foram submetidos a eutanásia por deslocamento cervical em vários pontos no tempo após a injeção de 5,6 MBq (0,15 mCi) de [11C]CPPC em 0,2 mL de soro fisiológico em uma veia caudal lateral. Os cérebros foram removidos e dissecados em gelo. Várias regiões cerebrais foram pesadas, e o teor de radioatividade das mesmas determinado por um contador γ. Todos os demais estudos de biodistribuição em camundongos foram conduzidos da mesma maneira.

1.3.6. Bloqueio

[0171]Os camundongos (CD1 ou C57BL/6J machos) foram submetidos a eutanásia por deslocamento cervical 45 min após a injeção i.v. de [11C]CPPC. O bloqueador, CPPC (0,3, 0,6, 1,2, 3,0, 10 e 20 mg/kg), ou inibidor do CSF1R, composto 8 (Illig CR, et al. (2008)) (2 mg/kg), foram administrados i.p. 5 min antes da [11C]CPPC, ao passo que os animais de referência receberam veículo. Os cérebros foram removidos e dissecados em gelo, e amostras sanguíneas foram coletadas do coração. A absorção cerebral regional da [11C]CPPC na referência foi comparada ao bloqueio.

1.3.7. Estudos de biodistribuição em modelos camundongo de neuroinflamação (tratados com LPS, AD)

[0172]Estes estudos foram conduzidos da mesma forma que os experimentos de referência e bloqueio em camundongos controle.

1.3.8. Determinação dos níveis de CSF1R nos cérebros de camundongos controle e de camundongos tratados com LPS

[0173]Os níveis de mRNA do Csf1r e da proteína CSF1R foram medidos por análises por qRT-PCR e Western blot, respectivamente (FIG. 14).

1.3.9. Imagiologia PET/CT em camundongos EAE

[0174]Cada camundongo (três EAE e um controle) recebeu a injeção i.v. de [11C]CPPC, seguida por imagiologia com um varredor PET/CT. Os dados de PET e CT foram reconstruídos usando o software da fabricante e exibidos usando um software de análise de dados de imagiologia médica (AMIDE) (amide.sourceforge.net/). Para conservar a faixa dinâmica, o sinal PET das glândulas harderiana e salivar foi parcialmente mascarado.

1.3.10. Dosimetria da radiação de corpo inteiro em camundongos

[0175]Camundongos CD-1 machos receberam a injeção de [11C]CPPC, conforme descrito acima nos estudos de referência, e foram submetidos a eutanásia a 10, 30, 45, 60 e 90 min após o tratamento. Os vários órgãos foram rapidamente removidos, e determinou-se a porcentagem de dose injetada (%ID) por órgão. A dosimetria de radiação humana da [11C]CPPC foi extrapolada a partir dos dados de biodistribuição em camundongos usando o software SAAM II (Simulação, Análise e Modelagem II) e OLINDA/EXM. Os dados foram analisados comercialmente (RADAR, Inc.).

1.3.11. Estudos PET com a [11C]CPPC em babuíno

[0176]Três varreduras PET dinâmicas de 90 min (primeira: referência; segunda: referência após tratamento com LPS; terceira: tratamento com LPS mais bloqueio) foram realizadas em um babuíno macho (Papio Anubis; 25 kg) usando um Tomógrafo de Pesquisa de Alta Resolução (CPS Innovations, Inc.). Em suma, todas as varreduras PET foram conduzidas com uma injeção i.v. de 444 a 703 MBq (12 a 19 mCi) de [11C]CPPC [radioatividade específica: 1.096 a 1.184 GBq/µmol (29,6 a 32,0 Ci/µmol)]. Nas varreduras LPS, o babuíno recebeu a injeção i.v. de 0,05 mg/kg de LPS 4 h antes do radiotraçador. Na varredura LPS mais bloqueio, o inibidor seletivo do CSF1R CPPC (1 mg/kg) foi administrado s.c. 1,5 h antes do radiotraçador. As mudanças no nível sérico da citocina IL-6 foram monitoradas por ELISA (FIG. 14). A análise dos dados da PET e a análise dos radiometabólitos no sangue arterial do babuíno são descritas em detalhes neste documento abaixo.

1.3.12. Autorradiografia do Cérebro Humano Postmortem

[0177]O uso de tecidos humanos foi aprovado pelo Conselho de Ética em Pesquisa da Johns Hopkins Medical Institutions. Fatias do córtex parietal inferior (20 µm) de três pacientes humanos sofrendo de AD e de um controle saudável (vide a Tabela 5 para a demografia) sobre lâminas de vidro foram usadas na autorradiografia in vitro. As lâminas de referência foram sondadas com a [11C]CPPC, ao passo que as lâminas bloqueio foram sondadas com a [11C]CPPC mais bloqueador (CPPC, BLZ945, pexidartinibe ou composto 8) para testar a especificidade de ligação com o CSF1R. As lâminas foram expostas a filme de raios X e analisadas com o desfecho expresso por pmol/mm3 de tecido úmido ± SD.

Tabela 5. Dados demográficos referentes aos tecidos cerebrais humanos postmortem usados no estudo de autorradiografia.

Amostra Diagnóstico Pontuação Pontuação Idade Sexo Raça Retardo post- CERAD Braak mortem, h 1-AD Alzheimer C 6 88 F branca 8 2-AD Alzheimer C 6 58 F branca 8,5 3-AD Alzheimer C 6 61 M branca 13,5 4-Ctrl Controle n/a n/a 48 F negra 12 saudável

1.4. Resultados

1.4.1. Química

[0178]O precursor para radiomarcação, Pre-CPPC, foi preparado em quatro etapas com um rendimento geral de 54% (FIG. 7) em quantidades multimiligrâmicas. O radiotraçador [11C]CPPC foi preparado com um rendimento radioquímico sem correção do decaimento de 21 ± 8% (n = 17), pureza radioquímica >95% e radioatividade específica ao fim da síntese de 977 ± 451 GBq/µmol (26,4 ± 12,2 Ci/µmol) (FIG. 9).

1.4.2. Estudos de Biodistribuição Cerebral Regional em Camundongos Controle

[0179]A absorção cerebral regional da [11C]CPPC em vários pontos no tempo após a injeção do radiotraçador é dada nas Tabelas 1 e 2. Um valor de absorção pico de 150%SUV foi observado no córtex frontal 5 a 15 min após a injeção do radiotraçador. Entre 30 e 60 min, o que abrange o ponto no tempo de 45 min de vários estudos descritos abaixo, as mudanças na %SUV foram estáveis.

1.4.3. Avaliação da Ligação Específica da [11C]CPPC em Camundongos Controle

1.4.3.1. Estudo de bloqueio

[0180]O bloqueio da absorção de [11C]CPPC foi inicialmente realizado com doses escalonadas de CPPC sem radiomarcação (0,6 a 20 mg/kg). O estudo não exibiu redução na %SUV de absorção do radiotraçador a doses baixas, mas uma tendência gradativa à maior absorção a doses mais altas (FIG. 10). Quando a absorção no cérebro foi corrigida para a função de entrada no sangue por SUVR, contudo, observou-se um efeito de bloqueio significativo com 20% de redução da radioatividade (FIG. 11).

1.4.3.2. Comparação de camundongos controle normais vs. camundongos com as micróglias depletadas.

[0181]O estudo exibiu uma redução pequena (14%) porém significativa na absorção do radiotraçador no cérebro de camundongos com as micróglias depletadas (FIG. 12A).

1.4.3.3. Comparação de camundongos controle normais vs. camundongos CSF1R KO.

[0182]O estudo demonstrou uma absorção cerebral equiparável (%SUV) da [11C]CPPC no cérebro de camundongos KO vs. controles (FIG. 12B).

1.4.3.4. Biodistribuição da [11C]CPPC em Modelos Murídeos de Neuroinflamação Induzida por LPS

[0183]Esses estudos foram realizados em dois modelos murídeos de neuroinflamação induzida por LPS: LPS por via intracraniana (i.c.-LPS) (Dobos N, et al. (2012)) e LPS i.p. (i.p.-LPS) (Qin L, et al. (2007); Catorce MN e Gevorkian G (2016)). A princípio, a indução à expressão do CSF1R no cérebro de camundongos i.p.-LPS foi examinada, e descobriram-se um aumento de duas vezes para o mRNA do Csf1r e um aumento de seis vezes para proteína por análises por qRT-PCR e Western blot, respectivamente (FIG. 14).

1.4.4.1. Camundongos i.c.-LPS

[0184]Conduziram-se dois experimentos independentes (FIG. 1). Em ambos os experimentos, o aumento da %SUV em camundongos LPS em comparação a camundongos sham foi significativo e foi superior no hemisfério ipsilateral em comparação ao hemisfério contralateral. O aumento mais alto foi observado no quadrante frontal ispilateral (53%), onde injetaram-se LPS (FIG. 1B). O bloqueio da [11Cb]CPPC com a CPPC sem radiomarcação foi dependente da dose. A redução da absorção no primeiro experimento foi insignificante quando utilizou-se uma dose baixa do bloqueador (0,3 mg/kg) (FIG. 1A). As doses mais altas do bloqueador (0,6 ou 1,2 mg/kg) reduziram significativamente a absorção da [11C]CPPC nos animais tratados com LPS (FIG. 1B).

1.4.4.2. Camundongos i.p.-LPS

[0185]Conduziram-se três experimentos independentes. No primeiro experimento nos camundongos i.p.-LPS, a [11C]CPPC manifestou %SUV de absorção cerebral mais alta (55%) em relação aos animais controle, mas o bloqueio com a CPPC sem radiomarcação não causou uma redução significativa na %SUV de radioatividade nos animais LPS (FIG. 2A). Nos experimentos segundo e terceiro, a %SUV de absorção foi corrigida para a radioatividade sanguínea por SUVR (FIG. 2B e FIG. 2C). A absorção de SUVR foi significativamente maior nos camundongos i.p.-LPS do que nos controles. O bloqueio com dois inibidores do CSF1R diferentes, CPPC (FIG. 2B) e composto 8 (FIG. 2C), diminuiu significativamente a absorção ao nível controle. A concentração de radioatividade no sangue mudou nos experimentos de referência i.p.-LPS (14% de redução) e bloqueio i.p.-LPS (39% de aumento) vs. controles.

1.4.5.. Distribuição Regional Cerebral da [11C]CPPC em um Modelo de AD em Camundongos Transgênicos

[0186]A absorção da [11C]CPPC foi significativamente maior em todas as regiões do cérebro em camundongos AD, sendo o maior aumento (31%) no córtex (FIG. 3).

1.4.6. Dosimetria da Radiação de Corpo Inteiro em Camundongos

[0187]A maioria dos órgãos recebeu de 0,002 a 0,006 mSv/MBq [de 0,007 a 0,011 Röentgen equivalent man (Rem)/mCi]. O intestino delgado recebeu a dose mais alta, de 0,047 mSv/MBq (0,17 Rem/mCi). A dose eficaz foi de 0,0048 mSv/MBq (0,018 Rem/mCi) (Tabela 3).

1.4.7. PET/CT com a [11C]CPPC em Modelos EAE Murídeos de Esclerose Múltipla

[0188]Três camundongos representando um espectro de gravidade EAE (pontuações EAE de 0,5, 2,5 e 4,5) e um único camundongo saudável que não recebeu nenhum antígeno ou adjuvante receberam a injeção de [11C]CPPC e foram dinamicamente varridos por PET/CT (FIG. 4). As imagens de projeção de intensidade máxima (MIP) e fatias sagitais de cada camundongo (FIG. 4A) demonstram que a intensidade de absorção do radiotraçador está correlacionada à gravidade da doença, tendo sido o maior aumento (99%) no tronco cerebral (FIG. 4B), ao passo que a absorção muscular foi equiparável entre os camundongos. As imagens brutas, sem delimitação das glândulas harderiana e salivar, são dadas na FIG. 13.

1.4.8. PET em babuínos

[0189]Comparações das varreduras da [11C]CPPC por PET dinâmica no mesmo babuíno nos experimentos de referência, LPS e LPS mais bloqueio demonstraram um aumento no volume de distribuição (VT) paramétrico após o tratamento com LPS e redução do VT ao nível de referência após o tratamento com

LPS mais bloqueio (FIG. 5 e FIG. 15). Os níveis séricos de IL-6 aumentaram fortemente após a administração de LPS, sugerindo a indução bem-sucedida de inflamação aguda (FIG. 16).

[0190]A imagiologia de referência da [11C]CPPC por PET dinâmica em um babuíno exibiu acúmulo de radioatividade no cérebro com um SUV pico de 2,5 a 4,0 20 min após a injeção, seguido por declínio gradativo (FIG. 5B). O VT regional foi moderadamente heterogêneo: mais alto no putâmen, caudado, tálamo e ínsula; intermediário no córtex frontal; e mais baixo no cerebelo, hipotálamo e córtex occipital (FIG. 5A e FIG. 15).

[0191]A comparação da PET do babuíno na referência vs. LPS vs. LPS mais bloqueio exibiu uma pequena diferença no SUV dentro do cérebro. No entanto, a taxa de eliminação na varredura de referência foi mais rápida do que na varredura LPS (FIG. 5C).

[0192]A análise de radiometabólitos das amostras sanguíneas de babuínos demonstrou que a [11C]CPPC fora metabolizada em dois radiometabólitos (71% a 76% do total de radiometabólitos) 90 min após a injeção (FIG. 17). Os radiometabólitos hidrófilos penetraram minimamente no cérebro, como demonstrado nos experimentos com camundongos. A análise por HPLC demonstrou que ao menos 95% da radioatividade no cérebro dos camundongos foi da [11C]CPPC mãe (Tabela 4).

[0193]A radioatividade da [11C]CPPC corrigida para metabólitos no plasma babuíno caiu muito (~50%) no grupo tratado com LPS vs. referência, com a recuperação aos níveis de referência no experimento LPS mais bloqueio (FIG. 5D). A modelagem matemática usando análise comportamental e análise de Logan (FIG. 18) exibiu um aumento drástico (90% a 120%) nos valores VT paramétricos do babuíno tratado com LPS (VT = 35 a 52) vs. referência (VT = 15 a 25), com um retorno ao nível de referência no estudo LPS mais bloqueio (FIG. 5 e FIG. 15), ao passo que o valor K1 só mudou levemente (FIG. 19). O aumento da ligação com radiotraçadores no cérebro babuíno tratado com LPS foi específico ao CSF1R, como demonstrado na varredura do bloqueio.

1.4.9. Autorradiografia Postmortem da [11C]CPPC no Cérebro Humano

[0194]A comparação da autorradiografia da [11C]CPPC de referência nas fatias de cérebro AD vs. controle (FIG. 6 e Tabela 6) exibiu um aumento (75% a 99%) na ligação dos radiotraçadores no cérebro AD. A especificidade de ligação foi testada comparando a ligação de referência à ligação em experimentos com bloqueio usando quatro inibidores do CSF1R diferentes. A razão referência/bloqueio no cérebro AD foi de 1,7 a 2,7 (bloqueador: CPPC), ao passo que, no cérebro controle, a razão foi de 1,4 (FIG. 6 e Tabela 6). Quando outros bloqueadores do CSF1R (composto 8, BLZ945 e PLX3397) foram usados nos mesmos cérebros AD, as razões referência/bloqueio foram de 2,0 ± 0,23, 1,79 ± 0,88 e 1,25 ± 0,25, respectivamente (FIG. 20). Tabela 6. Ligação por autorradiografia (pmol/mm3) da [11C]CPPC nas fatias de cérebro humano AD e controle saudável postmortem (vide também a FIG. 13) Amostra 1-AD 2-AD 3-AD 4-controle Referência 8,18 ± 0,68 7,20 ± 1,55 7,43 ±1,59 4,11 ± 1,14 Bloqueio com CPPC não 4,72 ±1,07 2,67 ± 0,53 3,73 ± 1,07 2,88 ± 1,06 marcada

1.5. Discussão

[0195]A matéria inventiva revelada neste documento propõe um radiotraçador PET específico ao CSF1R in vitro em tecidos cerebrais humanos e in vivo em modelos de neuroinflamação primatas não humanos e murídeos. Embora pesquisadores [vide Tronel C, et al. (2017); Janssen B, et al. (2018)] tenham trabalhado para desenvolver e implementar biomarcadores PET para a neuroinflamação, nenhum provou-se seletivo para as micróglias, as células imunológicas residentes do cérebro, até a [11C]CPPC.

[0196]O principal inibidor do CSF1R para o desenvolvimento da [11C]CPPC foi selecionado com base na literatura (Illig CR, et al. (2008)). A CPPC original sem radiomarcação exibiu alto potencial inibidor do CSF1R [IC50 = 0,8 nM (Illig CR, et al. (2008))] e propriedades físicas adequadas para a PET do cérebro, incluindo lipofilia óptica com um coeficiente de partição calculado (clogD7,4) de 1,6 e massa molecular de 393 Da, pressagiando assim a permeabilidade da barreira sangue-cérebro. A [11C]CPPC foi preparada com rendimento radioquímico adequado com alta pureza e radioatividade específica (FIG. 9).

1.5.1. Biodistribuição e Ligação Específica em Estudos da [11C]CPPC em Camundongos Controle

[0197]A absorção cerebral da [11C]CPPC em camundongos controle foi robusta, com um pico de 150%SUV ou 6,4%ID/g de tecido no córtex frontal, seguidos por declínio (Tabela 2). A distribuição cerebral regional foi moderadamente heterogênea, tendo o acúmulo de radioatividade mais alto ocorrido no córtex frontal, em consonância com a análise da expressão do CSF1R no cérebro de camundongos normais (Nandi S, et al. (2012)). Entre as regiões cerebrais estudadas neste documento, o tronco cerebral e o cerebelo exibiram o mais baixo acúmulo de [11C]CPPC.

[0198]A especificidade de ligação com o CSF1R da [11C]CPPC no cérebro de camundongos normais foi avaliada usando três abordagens: comparação dos controles de referência a camundongos (i) com bloqueio, (ii) com as micróglias depletadas e (iii) CSF1R KO. O estudo com bloqueio por dose escalonada no cérebro de camundongos normais falhou em exibir uma redução significativa da %SUV (FIG. 9 e FIG. 10A). No entanto, quando a %SUV foi corrigida para a radioatividade no sangue por SUVR, observou-se uma redução moderada porém significativa (de 20%) (FIG. 10B), demonstrando que a [11C]CPPC marca especificamente o CSF1R no cérebro de camundongos normais. Também é digno de nota que a concentração de [11C]CPPC no sangue foi maior nos estudos com bloqueio.

[0199]O tratamento crônico de camundongos com o inibidor do CSF1R PLX3397 (pexidartinibe) depleta com eficácia as micróglias (90%) e reduz o CSF1R no cérebro animal (Elmore MR, et al. (2014)). A absorção cerebral da [11C]CPPC nos camundongos com as micróglias depletadas foi menor (14%) do que nos controles (FIG. 12A). Essa absorção reduzida pode dever-se a uma combinação de dois efeitos, a saber, a depleção das micróglias e o próprio efeito bloqueador da PLX3397. Por fim, a comparação da absorção de [11C]CPPC nos camundongos controle e CSF1R KO demonstrou uma absorção dos radiotraçadores equiparável entre os camundongos controle e KO (FIG. 12B). Embora um CSF1R alvo depletado (PLX3397) ou ausente (KO) indique que deveria haver pouca a nenhuma absorção cerebral de um agente de imagiologia específico ao CSF1R, só há uma expressão modesta do CSF1R no cérebro de roedores saudáveis (Nandi S, et al. (2012); Michaelson MD, et al. (1996); e Lee SC, et al. (1993)), exigindo atenção aos modelos animais relevantes nos quais o CSF1R far-se-ia presente em quantidades mais altas.

1.6.2 Avaliação da [11C]CPPC em Modelos Murídeos de Neuroinflamação Induzida por LPS

[0200]O estímulo por LPS é um modelo de neuroinflamação comum (Qin L, et al. (2007); Catorce MN e Gevorkian G (2016)). A neuroinflamação induzida por LPS já foi usada para testar vários radiotraçadores PET em roedores, primatas não humanos e até mesmo em pacientes humanos [vide Tronel C, et al. (2017)]. Relatos que descrevam a expressão do CSF1R em modelos de neuroinflamação por LPS não encontram-se disponíveis. Os níveis de CSF1R no cérebro de camundongos i.p.-LPS vs. camundongos controle foram comparados usando de qRT-PCR e Western blot, e descobriu-se um grande aumento no mRNA do Csf1r e na expressão da proteína CSF1R (FIG. 14). Neste estudo, utilizaram-se dois modelos murídeos de neuroinflamação induzida por LPS, i.c.-LPS (Dobos N, et al. (2012); Aid S, et al. (2010) e i.p.-LPS (Qin L, et al. (2007), Catorce MN e Gevorkian G (2016)). Ainda que a cirurgia estereotáxica possa danificar a barreira sangue-cérebro nos animais i.c- LPS, esse modelo, que produz neuroinflamação localizada, pareceu inicialmente mais atraente do que o modelo i.p-LPS com neuroinflamação difundida. No entanto, novos estudos com a [11C]CPPC exibiram resultados equiparáveis usando tanto um modelo quanto o outro.

[0201]Os experimentos de ligação com a [11C]CPPC demonstraram uma elevação significativa (de até 53%) na absorção em camundongos i.c.-LPS (FIG. 1). A ligação elevada foi ~50% específica vs. animais sham e mediada através do CSF1R, como demonstrado nos experimentos com bloqueio por dose escalonada (FIG. 1). Nos camundongos i.p.-LPS, a ligação com a [11C]CPPC também foi significativamente mais alta (de até 55% a 59%) vs. animais controle (FIG. 2). A ligação com a [11C]CPPC no cérebro inteiro nos camundongos i.p.-LPS foi mais de 50% específica e mediada através do CSF1R, como demonstrado em experimentos de bloqueio usando dois inibidores do CSF1R diferentes, CPPC (FIG. 2B) e composto 8 (FIG. 2C). Nos animais i.p.-LPS, a concentração de radioatividade no sangue mudou drasticamente, necessitando de correção da %SUV para a função de entrada no sangue por SUVR (FIG. 2B e FIG. 2C). As mudanças na radioatividade no sangue podem ser explicadas por mudanças sistêmicas inevitáveis nos níveis de CSF1R nos camundongos i.p.-LPS. Os estudos da [11C]CPPC em modelos murídeos LSP por via intracraniana e i.p. exibiram resultados equiparáveis, demonstrando que o radiotraçador marca especificamente o CSF1R tanto em um modelo quanto no outro. O potencial de ligação ex vivo (BPex vivo = 0,53 a 0,62) da

[11C]CPPC nos camundongos LPS foi estimado por: absorção LPS - absorção sham/absorção sham absorção LPS - absorção sham/absorção sham. Um estudo anterior em ratos tratados com LPS com o radiotraçador da TSPO [11C]PK11195 gerou um valor BP equiparável de 0,47 (Dickens AM, et al. (2014)).

1.5.3. Imagiologia da [11C]CPPC em Camundongos EAE

[0202]A imagiologia PET/CT no modelo EAE C57BL/6 MOG35-55 demonstrou que a intensidade do sinal PET foi proporcional à pontuação da doença (FIG. 4) e largamente concentrada no tronco cerebral, cerebelo e coluna cervical, em consonância com a distribuição regional da desmielinização no modelo EAE. A absorção de [11C]CPPC no tronco cerebral foi até duas vezes maior nos camundongos EAE vs. animais controle.

1.5.4. Dosimetria da Radiação de Corpo Inteiro em Camundongos

[0203]A dosimetria foi realizada para a futura tradução da [11C]CPPC para seres humanos. O estudo com camundongos demonstrou que uma dose proposta de 740 MBq (20 mCi) de [11C]CPPC administrada a um paciente humano resultaria em uma carga de radiação abaixo do limite atual da Food and Drug Administration (5 Rem; (5. Federal Register §361.1 (2018)), mas um estudo real em pacientes humanos se faz necessário para confirmar essa estimativa.

1.5.5. Imagiologia PET em Babuínos

[0204]A administração sistêmica de LPS a babuínos provoca a ativação microglial (Hannestad J, et al. (2012)). Neste relato, as propriedades de ligação da [11C]CPPC foram testadas em um babuíno controle e o mesmo babuíno recebeu a injeção de uma dose baixa de LPS (0,05 mg/kg, i.v.). Um aumento de mais de duas vezes nos valores de volume de distribuição (VT) foi observado em todas as regiões cerebrais do animal tratado com LPS (FIG. 5 e FIG. 15). O aumento do VT paramétrico no babuíno LPS foi totalmente bloqueado pela injeção de CPPC sem radiomarcação (FIG. 5A e FIG. 15). A modelagem paramétrica dessas imagens é essencial porque a injeção de LPS e do bloqueador causa mudanças na função de entrada no sangue (FIG. 5D), muito provavelmente devido a mudanças no CSF1R na periferia. A modelagem paramétrica não exigiu a inclusão de radiometabólitos cerebrais porque a análise por HPLC exibiu a maior parte da [11C]CPPC mãe inalterada no cérebro animal (>95%).

[0205]As varreduras por PET da [11C]CPPC demonstraram que a ligação com o radiotraçador no cérebro babuíno tratado com LPS foi específica e mediada pelo CSF1R, fazendo desse agente adequado para a imagiologia da neuroinflamação em primatas não humanos. O aumento no VT da [11C]CPPC (85% a 120%) no babuíno tratado com LPS (0,05 mg/kg) foi ao menos igual ou mais alto que o do radiotraçador da TSPO [11C]PBR28 (faixa de 35,6% a 100,7%) em resposta a uma dose mais alta de LPS (0,1 mg/kg), como demonstrado em um relato anterior (Hannestad J, et al. (2012)). Logo, a [11C]CPPC poderia servir como uma ferramenta inovadora com alta sensibilidade para a imagiologia quantitativa das micróglias ativadas na neuroinflamação.

1.5.6. Ligação da [11C]CPPC em Cérebro AD

[0206]Há um componente imunológico da AD, envolvendo particularmente o sistema imunológico inato, que é diferente das "típicas" doenças neuroinflamatórias, tais como a esclerose múltipla ou vários dos modelos descritos acima (Heppner FL, et al. (2015)). A pesquisa anterior ofereceu evidência da suprarregulação do CSF1R nos cérebros de pacientes humanos sofrendo de AD (Akiyama H, et al. (1994); Walker DG, et al. (2017); Lue LF, et al. (2001)) e em modelos de AD em camundongos transgênicos (Murphy GM Jr, et al., (2000); Yan SD, et al. (1997); e Boissonneault V, et al. (2009)). A ligação da [11C]CPPC foi testada no cérebro de camundongos AD transgênicos e no tecido cerebral humano AD postmortem. De acordo com dados anteriores (Murphy GM Jr, et al., (2000); Yan SD, et al. (1997); e Boissonneault V, et al. (2009)), a absorção cerebral ex vivo da [11C]CPPC em camundongos AD transgênicos foi significativamente mais alta (até 31%) do que em animais controle (FIG. 3).

[0207]A autorradiografia in vitro humana postmortem demonstrou que a [11C]CPPC marcou especificamente o CSF1R no cérebro AD (razão referência/autobloqueio de até 2,7) (FIG. 6 e Tabela 6). Em um experimento distinto, inibidores do CSF1R estruturalmente diferentes da CPPC [composto 8, IC50 = 0,8 nM (Illig CR, et al. (2008)); BLZ945, IC50 = 1,2 nM (Krauser JA, et al. (2015)); e PLX3397, IC50 = 20 nM (DeNardo DG, et al. (2011))] bloquearam a ligação com a [11C]CPPC no mesmo tecido AD (FIG. 20), confirmando assim que a ligação foi específica ao CSF1R (FIG. 6, FIG. 20 e Tabela 6). As razões referência/bloqueio para os inibidores do CSF1R mais potentes, a saber, o composto 8 e BLZ945, foram até duas vezes maiores que as do PLX3397, menos potente. Essas descobertas podem ser ampliadas para gerar imagens de outros transtornos ou condições neurodegenerativas com um componente imunológico inato, tais como esclerose lateral amiotrófica, envelhecimento ou doença de Parkinson (Deczkowska A, et al. (2018)), que envolvem a DAM. A [11C]CPPC também pode oferecer uma leitura de imagiologia indireta para a sinalização de TREM2 (Deczkowska A, et al. (2018); Hickman SE e El Khoury J (2014)), para a qual não foram feitas imagens in vivo.

1.6. Sumário

[0208]A matéria inventiva revelada neste documento propõe, em parte, a [11C]CPPC, um radiotraçador PET para gerar imagens do CSF1R na neuroinflamação. A ligação específica do radiotraçador cresce em modelos de neuroinflamação induzida por LPS em camundongos (até 59%) e em babuínos (até 120%), em modelos murídeos de AD (31%) e esclerose múltipla (até 100%) e no tecido cerebral humano AD postmortem (razão referência/bloqueio de 2,7). Os estudos de dosimetria da radiação em camundongos demonstraram que a [11C]CPPC é segura para estudos humanos. Os radiometabólitos da [11C]CPPC penetram minimamente no cérebro animal, indicando que sua inclusão na análise das imagens não se faz necessária. A [11C]CPPC está pronta para a tradução clínica a fim de estudar o CSF1R em uma variedade de cenários clínicos.

1.7. Material e métodos suplementares

1.7.1. Inibidores do CSF1R

[0209]A BLZ945 (Krauser JA, et al. (2015)) foi adquirida junto à AstaTech (Bristol, PA), o pexidartinibe (PLX3397) (DeNardo DG, et al. (2011)) foi adquirido junto à eNovation Chemicals (Bridgewater, NJ), e o composto 8 foi preparado internamente conforme descrito previamente (Illig CR, et al. (2008)).

1.7.2. Química

[0210]Espectros de RMN de 1H foram registrados com um espectrômetro de RMN Bruker-500 a frequências de ressonância nominal de 500 MHz em CDCl3, CD3OD ou DMSO-d6 (referenciado para Me4Si interno a δ 0 ppm). Espectros de massas de alta resolução foram registrados comercialmente utilizando ionização por eletropulverização (ESI) nas instalações de Espectrometria de Massas da Universidade de Notre Dame.

[0211]A síntese da 5-ciano-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1- il)fenil)furano-2-carboxamida (CPPC) foi realizada conforme descrito alhures (Illig CR, et al. (2008)).

[0212]1-(5-cloro-2-nitrofenil)piperidina: A uma solução resfriada (0° C) de 1,0 g (10,0 mmol) de 4-cloro-2-fluornitrobenzeno em 15 mL de EtOH, adicionou-se 1,7 mL (30,0 mmol) de piperidina gota a gota ao longo de 5 min. A solução foi agitada a 0° C durante 10 min e, em seguida, a 23° C durante 30 min. A mistura foi despejada em água (225 mL) e extraída com EtOAc (2 x 30 mL). Os extratos combinados foram lavados com NaHCO3 aq. saturado e salmoura (30 mL cada) e, em seguida, secos sobre Na2SO4 e evaporados para obter o composto bruto. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (Hexano:EtOAc = 9,5:0,5) para obter 1-(5-cloro-2- nitrofenil)piperidina na forma de um sólido amarelo (1,32 g, 96% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) δ 7,77 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,13 (s, 1H), 6,93 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 3,30-3,27 (m, 2H), 2,91-2,86 (m, 2H), 1,90-1,86 (m, 1H), 1,75-1,73 (m, 2H), 1,49-1,42 (m, 1H).

[0213]1-metil-4-(4-nitro-3-(piperidin-1-il)fenil)piperazina: Uma mistura de 1- (5-cloro-2- nitrofenil)piperidina (1,0 g, 4,15 mmol) e 1-metilpiperazina (1,38 mL, 12,46 mmol) foi aquecida com agitação sob N2 a 138° C durante 12 h. Depois de resfriá-la à temperatura ambiente, a mistura foi despejada em água e extraída com acetato de etila (2 x 100 mL). Os extratos combinados foram lavados com água e salmoura e, em seguida, secos sobre Na2SO4 e evaporados para obter o composto bruto. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter 1-metil-4-(4-nitro-3-(piperidin-1-il)fenil)piperazina na forma de um sólido amarelo (1,2 g, 96% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) δ 7,62 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 6,80 (s, 1H), 6,43 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 3,84 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 3,71 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 3,60 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 3,50 (d, J = 10,0 Hz, 2H), 3,80 (d, J = 5,0 Hz, 2H), 1,55-1,51 (m, 3H).

[0214]4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)anilina: A uma mistura de 1- metil-4-(4-nitro-3-(piperidin-1-il)fenil)piperazina (1,2 g, 3,94 mmol) e NH4Cl (2,10 g, 39,4 mmol) em THF/MeOH/H2O (10:5:3) (20 mL), adicionou-se Zn em pó (2,57 g, 39,4 mmol) a 90° C, e, em seguida, a mistura foi submetida a refluxo durante 1 h. Uma vez concluída a reação, a mistura de reação foi filtrada através de Celite e dividida entre EtOAc e salmoura. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter 4-(4- metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)anilina na forma de um sólido marrom (0,98 g, 90,7% de rendimento).

[0215]5-ciano-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2- carboxamida (CPPC): À mistura de 4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)anilina (0,5 g, 1,82 mmol), ácido 5-cianofurano-2-carboxílico (0,3 g, 2,18 mmol) e HATU (0,83 g, 2,18 mmol) em DMF (10 mL), adicionou-se DIPEA (0,63 mL, 3,64 mmol). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro e, em seguida, dividida entre EtOAc e salmoura. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter 5-ciano-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2-carboxamida na forma de um sólido amarelo (0,6 g, 84,5% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) δ 9,53 (s, 1H), 8,31 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,23 (d, J = 16,6 Hz, 2H), 6,80 (s, 1H), 6,72 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 3,20 (s, 4H), 2,85 (s, 4H), 2,59 (s, 4H), 2,36 (s, 3H), 1,80 (s, 4H), 1,65 (s, 2H). A HRMS calculada para C22H28N5O2 ([M + H)] 394,223752 descobriu 394,223065. Síntese de 5-ciano-N-(4-(piperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2- carboxamida (Pre-CPPC)

[0216]Com referência agora à FIG. 8, tratar-se-á da síntese de 5-ciano-N-(4- (piperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2-carboxamida (Pre-CPPC):

[0217]Etapa a. 4-(4-nitro-3-(piperidin-1-il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila: À mistura de 1-(5-cloro-2-nitrofenil)piperidina (1,0 g, 4,15 mmol) e piperazina-1-carboxilato de terc-butila (1,55 g, 8,30 mmol) em DMSO (10 mL), adicionou-se K2CO3 (1,72 g, 12,45 mmol). A mistura de reação foi agitada a 110° C durante 12 h e, em seguida, dividida entre EtOAc e salmoura. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (Hexano:EtOAc = 3:7) para obter 4-(4-nitro-3-(piperidin-1-il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila na forma de um sólido branco (1,40 g, 86,4% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz,

CDCl3) δ 7,99 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 6,38 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 6,31 (s, 1H), 3,58 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 3,34 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 2,28 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 2,78 (d, J = 10,0 Hz, 2H), 1,70 (d, J = 5,0 Hz, 2H), 1,55-1,51 (m, 3H), 1,47 (s, 9H).

[0218]Etapa b. 4-(4-amino-3-(piperidin-1-il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila: A uma mistura de 4-(4-nitro-3-(piperidin-1-il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila (1,20 g, 3,07 mmol) e NH4Cl (1,64 g, 30,7 mmol) em THF/MeOH/H2O (10:5:3) (20 mL), adicionou-se Zn em pó (2,0 g, 30,7 mmol) a 90° C, e, em seguida, a mistura foi submetida a refluxo durante 1 h. Uma vez concluída a reação, a mistura de reação foi filtrada através de Celite e dividida entre EtOAc e salmoura. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter 4-(4-amino-3-(piperidin-1-il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila na forma de um sólido marrom (1,0 g, 90,3% de rendimento).

[0219]Etapa c. 4-(4-(5-cianofurano-2-carboxamido)-3-(piperidin-1- il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila: À mistura de 4-(4-amino-3-(piperidin-1- il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila (0,5 g, 1,38 mmol), ácido 5-cianofurano- 2-carboxílico (0,23 g, 1,66 mmol) e HATU (0,63 g, 1,66 mmol) em DMF (10 mL), adicionou-se DIPEA (0,48 mL, 2,76 mmol). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro e, em seguida, dividida entre EtOAc e salmoura. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter 4-(4-(5-cianofurano-2- carboxamido)-3-(piperidin-1-il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila na forma de um sólido amarelo (0,60 g, 90,9% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) δ 9,59 (s, 1H), 8,31 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,25 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,21 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 6,79 (s, 1H), 6,72 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 3,58 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 3,10 (t, J = 5,0 Hz,

4H), 2,99 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 2,72 (t, J = 10,0 Hz, 2H), 1,83 (d, J = 10,0 Hz, 2H), 1,55- 1,51 (m, 3H), 1,49 (s, 9H).

[0220]Etapa d. 5-ciano-N-(4-(piperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2- carboxamida (Pre-CPPC): A uma solução de 4-(4-(5-cianofurano-2-carboxamido)-3- (piperidin-1- il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila (0,5 g, 1,04 mmol) em cloreto de metileno (5 mL), adicionou-se ácido trifluoracético (0,39 mL, 5,21 mmol) gota a gota a 0° C, e, em seguida, a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 12 h. Uma vez concluída a reação, a mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter 5-ciano-N-(4-(piperazin-1-il)-2-(piperidin- 1-il)fenil)furano-2-carboxamida na forma de um sólido amarelo pálido (0,3 g, 76,0% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) δ 9,60 (s, 1H), 8,31 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,25 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,21 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 6,79 (s, 1H), 6,72 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 3,15 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 3,08 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 2,99 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 2,73 (t, J = 10,0 Hz, 2H), 1,84 (d, J = 10,0 Hz, 2H), 1,57 (s, 1H), 1,55-1,51 (m, 3H); a HRMS calculada para C21H26N5O2 ([M + H)] 380,208102 descobriu 380,207980.

[0221]Com referência agora à FIG. 9, tratar-se-á da radiossíntese da [11C]CPPC:

[0222]A uma ampola V de 1 mL, adicionou-se Pre-CPPC (1 mg) a 0,2 mL de DMF anidro. Iodeto de [11C]metila, carregado por um fluxo de hélio, foi confinado na solução supramencionada. A reação foi aquecida a 80° C durante 3,5 min, em seguida temperada com 0,2 mL de água. O produto da reação bruta foi purificado por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) em fase reversa a uma taxa de fluxo de 12 mL/min. O produto radiomarcado (tR = 6,5-7,2 min), que foi plenamente separado do precursor (tR = 2,5 min), foi colhido remotamente em uma solução de 0,3 g de ascorbato de sódio em uma mistura de 50 mL de água com 1 mL de NaHCO3 aq. a 8,4%. A solução aquosa foi transferida através de um cartucho

Waters Oasis Sep-Pak light ativado (Milford, MA). Depois de lavar o cartucho com 10 mL de soro fisiológico, o produto foi eluído com 1 mL de etanol através de um filtro estéril de 0,2 μM a uma ampola estéril sem pirógeno, e adicionaram-se 10 mL de soro fisiológico a 0,9% através do mesmo filtro. O produto final, [11C]CPPC, foi analisado por HPLC analítica para determinar a pureza radioquímica e a radioatividade específica.

1.7.3. Condições de HPLC

[0223]Preparativa: Coluna, XBridge C18, 10x250 mm (Waters, Milford, MA). Fase móvel: 45%:55% de acetonitrila:tampão trietilamina-fosfato, pH 7.2. Taxa de fluxo: 12 mL/min, tempo de retenção de 7 min. Analítica: Coluna, Luna C18, 10 mícrons, 4,6x250 mm (Phenomenex, Torrance, CA). Fase móvel: 60%:40% de acetonitrila:formato de amônio aq. a 0,1 M. Taxa de fluxo: 3 mL/min, tempo de retenção de 3,5 min.

1.8.4 Estudos de biodistribuição e imagiologia PET com a [11C]CPPC em camundongos Tabela 1. Sumário de estudos sobre a biodistribuição da [11C]CPPC e outros estudos em camundongos Estudo Camundongos Bloqueador Figura ou (número de animais) (doses) Tabela Controles, Referência C57BL/6J – Tabela 2 (3 por ponto no tempo; Total: 12) Controles, bloqueio – CD1 CPPC (0-20 Fig. 10 escalada de dose (5 por dose; mg/kg, IP) Total: 30)

Controles, referência vs.

CD1 CPPC (0,05 Fig. 11 bloqueio, sem (Fig.

S5A) e (3 por grupo; ou 3,0 mg/kg, com correção sanguínea Total: 9) IP) (Fig.

S5B)

Controles vs. com as C57BL/8J PLX3397 (230 Fig. 12A micróglias depletadas (5 por grupo; mg/kg de 10 total) ração)

Controles vs.

CSF1R-KO Controles – C57BL/6J (5) – Fig. 12B CSF1R-KO – B6.Cg Csf1rtm1.2Kwp/J (5) Total: 10

Controles vs.

LPS Sham referência – CD1 (3) CPPC (0,3 FIG. 1A (intracranianamente) LPS referência – CD1 (3) mg/kg, IP) Experimento 1 LPS bloqueio – (3) Total: 9

Controles vs.

LPS Sham – CD1 (4) Bloqueio-1: Fig. 1B (intracranianamente) LPS referência – CD1 (4) CPPC (0,6 Experimento 2 LPS bloqueio-1 – CD1 (4) mg/kg, IP) LPS bloqueio-2 – CD1 (4) Bloqueio-2: Total de camundongos: 16 CPPC (1,2 mg/kg, IP)

Controles vs.

LPS (IP) Controles – CD1 (5), CPPC (1 Fig. 2A Experimento 1 Camundongos IP LPS de mg/kg, IP) referência – CD1 (5) Camundongos IP LPS bloqueio – CD 1 (5) Total de camundongos: 15

Controles vs.

LPS (IP) Controles – CD1 (5), CPPC (1 Fig. 2B Experimento 2 Camundongos IP LPS de mg/kg, IP) referência – CD1 (5) Camundongos IP LPS bloqueio – CD 1 (5) Total de camundongos: 15

Controles vs.

LPS (IP) Controles – CD1 (3), Composto 8 (2 Fig. 2C Experimento 3 Camundongos IP LPS de mg/kg, IP) referência – CD1 (6) Camundongos IP LPS bloqueio – CD 1 (6) Total de camundongos: 15

Controles vs. modelo Controles – (6) – Fig. 3 camundongo com APP transgênica – (6) Alzheimer Total de camundongos: 12

Dosimetria de radiação no CD1(3 por ponto no – Tabela 3 corpo todo tempo) Total: 15

PET/CT, camundongos Camundongos EAE (3) – FIG. 4 EAE Controle (1) FIG. 13 Total: 4

Radiometabólitos no CD1 (3 por ponto no – Tabela 4 plasma e cérebro tempo) murídeos Total: 6

PCR e Western blot de Controles – CD1 (6) – Fig. 14 cérebros murídeos com Tratados com LPS i.p. – LPS CD1 (6) Total: 12

1.7.5. Distribuição regional cerebral da [11C]CPPC em camundongos controle normais, referência

[0224]Utilizaram-se camundongos C57BL/6J machos com quatro a oito semanas de idade, pesando de 22 a 24 g, da Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical a 5, 15, 30 e 60 min (3 camundongos por ponto no tempo) após a injeção de 5,6 MBq (0,15 mCi) de [11C]CPPC [radioatividade específica = 462 GBq/μmol (12,5 Ci/μmol)] em 0,2 mL de soro fisiológico em uma veia caudal lateral. Os cérebros foram removidos e dissecados em gelo. As regiões cerebrais (cerebelo, bulbos olfatórios, hipocampo, córtex frontal, tronco cerebral e restante do cérebro) foram pesadas, e o teor de radioatividade das mesmas foi determinado por um contador γ LKB/Wallac 1283 CompuGamma CS (Bridgeport, CT). Calculou-se a porcentagem do valor de absorção padronizado (%SUV) (Tabela 2). Tabela 2. Distribuição cerebral regional da [11C]CPPC em camundongos controle após a injeção do radiotraçador: SUV ± SD (n = 3) 5 min 15 min 30 min 60 min Cerebelo 138 ±9 110 ± 17 70 ± 4 71 ± 3 Bulbos olfatórios 142 ± 12 124 ± 21 85 ± 9 90 ± 3 Hipocampo 124 ± 4 121 ± 25 94 ± 12 95 ± 3 Córtex frontal 147 ± 8 150 ± 30 102 ± 16 107 ± 8 Tronco cerebral 120 ± 19 106 ± 17 75 ± 11 79 ± 3 Restante do cérebro 137 ± 7 118 ± 21 81 ± 7 82 ± 3

1.7.6. Avaliação da ligação específica da [11C]CPPC em camundongos controle

1.7.6.1. Distribuição regional cerebral da [11C]CPPC em camundongos controle normais, estudo de bloqueio por dose escalonada com CPPC não marcada (FIG. 10).

[0225]Utilizaram-se camundongos CD-1 machos (26 a 28 g, idade = seis a sete semanas) da Charles River Laboratories. A solução de CPPC (0,3, 0,6, 1,2, 3,0, 10 e 20 mg/kg) foi administrada IP 5 min antes da [11C]CPPC IV, ao passo que os animais de referência receberam veículo (n = 5 por dose). Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical 45 min após a injeção de 5,1 MBq (0,14 mCi) de [11C]CPPC [radioatividade específica = 511 GBq/µmol (13,8 Ci/µmol)] em 0,2 mL de soro fisiológico em uma veia caudal lateral. Os cérebros inteiros foram removidos, pesados e tiveram seu teor de radioatividade determinado por um contador γ LKB/Wallac 1283 CompuGamma CS (Bridgeport, CT). Calculou-se a porcentagem do valor de absorção padronizado (%SUV).

1.7.7. Comparação da absorção da [11C]CPPC de referência e bloqueio no mesmo experimento sem e com correção sanguínea (FIG. 11)

[0226]Utilizaram-se camundongos CD-1 machos (25 a 27 g, idade = seis a sete semanas) da Charles River Laboratories. As soluções de CPPC (0,6 ou 3,0 mg/kg) foram administrada IP 5 min antes da [11C]CPPC IV, ao passo que os animais de referência receberam veículo (n = 3 por dose). Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical 45 min após a injeção de 5,0 MBq (0,135 mCi) de [11C]CPPC [radioatividade específica = 390 GBq/µmol (10,5 Ci/µmol)] em 0,2 mL de soro fisiológico em uma veia caudal lateral. Os cérebros foram removidos, o córtex foi rapidamente dissecado em gelo, e amostras sanguíneas (0,2 a 0,5 cc) foram coletadas do coração. As amostras do córtex e amostras sanguíneas foram pesadas, e o teor de radioatividade das mesmas foi determinado por um contador γ

LKB/Wallac 1283 CompuGamma CS (Bridgeport, CT). As variáveis de desfecho para o córtex são dadas sem correção sanguínea por %SUV (FIG. 11A) e com correção sanguínea por SUVR (FIG. 11B).

1.7.7.1. Absorção cerebral da [11C]CPPC em camundongos com depleção das micróglias e camundongos controle (FIG. 12A)

[0227]Adquiriram-se camundongos C57BL/6J (22 a 24 g) da Charles River Laboratories. Camundongos com depleção das micróglias foram obtidos alimentando os camundongos C57BL/6 (5 animais) durante 3 semanas com ração de camundongo formulada com pexidartinibe (PLX3397) (290 mg/kg), conforme descrito previamente (Elmore MR, et al. (2014)). Os camundongos C57BL/6J controle (5 animais) foram alimentados com ração de camundongo padrão durante 3 semanas. No último dia de tratamento, todos os animais foram sacrificados por deslocamento cervical 45 min após a injeção de 5,0 MBq (0,135 mCi) de [11C]CPPC [radioatividade específica = 475 GBq/µmol (12,8 Ci/µmol)] em 0,2 mL de soro fisiológico em uma veia caudal lateral. Os cérebros foram removidos, pesados e tiveram seu teor de radioatividade determinado por um contador γ LKB/Wallac 1283 CompuGamma CS (Bridgeport, CT). As variáveis de desfecho foram calculadas por %SUV.

1.7.7.2. Absorção cerebral da [11C]CPPC em camundongos CSF1R knock- out e controle (FIG. 12B). Métodos:

[0228]Utilizaram-se camundongos B6.Cg-Csf1rtm1.2Jwp/J (CSF1R knock-out, KO) (21 a 23 g; idade = quatro a oito semanas; Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) (5 animais) e controles C57BL/6J com a mesma idade (23 a 27 g) (5 animais). Os animais receberam injeção IV de 3,7 MBq (0,1 mCi) de [11C]CPPC [radioatividade específica = 306 GBq/µmol (8,3 Ci/µmol)] e foram sacrificados por deslocamento cervical 45 min após a injeção do radiotraçador. Os cérebros inteiros foram removidos, e amostras sanguíneas (0,2 a 0,5 cc) foram coletadas do coração. O cérebro inteiro e as amostras sanguíneas foram pesados, e o teor de radioatividade dos mesmos foi determinado por um contador γ LKB/Wallac 1283 CompuGamma CS. As variáveis de desfecho foram calculadas por %SUV.

1.7.7.3. Absorção cerebral da [11C]CPPC em camundongos controle e camundongos tratados com LPS (por via intracraniana) (FIG. 1)

[0229]Experimento 1, FIG. 1A. Nove camundongos CD-1 machos (25 a 27 g, idade = seis a sete semanas) da Charles River Laboratories foram divididos em três coortes: 1) camundongos tratados com sham (n = 3), referência; 2) camundongos tratados com lipopolissacarídeos (LPS-via intracraniana) (n = 3), referência; e 3) camundongos tratados com polissacarídeos (LPS-via intracraniana) (n = 3), bloqueio. Os camundongos CD1 foram submetidos a eutanásia com avertina (250 mg/kg, IP). A analgesia periprocedimental foi provida com finadina (2,5 mg/kg, SC). As coordenadas para injeção intraparenquimal no prosencéfalo foram de AP -0,5 mm' DV -2,5 mm; e ML 1,0 direita da linha média. Os orifícios foram perfurados perpendicularmente ao crânio previamente exposto. Soro fisiológico tamponado com fosfato estéril (PBS) (0,5 μL) ou 5 μg de lipopolissacarídeos (LPS, O11:B4, Calbiochem, San Diego, CA) em 0,5 μL de PBS foram injetados no parênquima cerebral usando uma seringa Hamilton de 1 μL. Após a injeção, a agulha foi mantida no cérebro por mais 3 min e lentamente removida. A incisão foi vedada com cimento dentário. O estudo com radiotraçadores foi realizado no 3º dia após a administração de LPS. A solução de CPPC (0,3 mg/kg) foi administrada IP 5 min antes da [11C]CPPC IV, ao passo que os animais de referência receberam veículo. Os animais LPS e controle receberam injeção IV de 3,7 MBq (0,1 mCi) de [11C]CPPC [radioatividade específica = 274 GBq/µmol (7,4 Ci/µmol)] e foram sacrificados por deslocamento cervical 45 min após a injeção do radiotraçador. Os cérebros inteiros foram removidos e dissecados em gelo. O cerebelo, o hemisfério cerebral ipsilateral, o hemisfério cerebral contralateral e amostras sanguíneas foram pesados, e o teor de radioatividade dos mesmos foi determinado por um contador γ LKB/Wallac 1283 CompuGamma CS. As variáveis de desfecho foram calculadas por %SUV.

[0230]Experimento 2, FIG. 1B. Dezesseis camundongos CD-1 machos (25 a 27 g, idade = seis a sete semanas) da Charles River Laboratories foram divididos em quatro coortes: 1) camundongos tratados com sham (n = 4), referência; 2) camundongos tratados com lipopolissacarídeos (LPS-via intracraniana) (n = 4), referência; 3) camundongos tratados com lipopolissacarídeos (LPS-via intracraniana) (n = 4), bloqueio-0,6 mg/kg de CPPC; 4) camundongos tratados com lipopolissacarídeos (LPS-via intracraniana) (n = 4), bloqueio-1,2 mg/kg de CPPC. Os camundongos foram submetidos a eutanásia com avertina (250 mg/kg, IP). A analgesia periprocedimental foi provida com finadina (2,5 mg/kg, SC). As coordenadas para injeção intraparenquimal no prosencéfalo foram de AP -0,5 mm' DV -2,5 mm; e ML 1,0 direita da linha média. Os orifícios foram perfurados perpendicularmente ao crânio previamente exposto. Soro fisiológico tamponado com fosfato estéril (PBS) (0,5 μL) ou 5 μg de lipopolissacarídeos (LPS, O11:B4, Calbiochem, San Diego, CA) em 0,5 μL de PBS foram injetados no parênquima cerebral usando uma seringa Hamilton de 1 μL. Após a injeção, a agulha foi mantida no cérebro por mais 3 min e lentamente removida. A incisão foi vedada com cimento dentário. O estudo com radiotraçadores foi realizado no 3º dia após a administração de LPS. A solução de CPPC (0,3 mg/kg) foi administrada IP 5 min antes da [11C]CPPC IV, ao passo que os animais de referência receberam veículo. Os animais LPS e controle receberam injeção IV de 3,7 MBq (0,1 mCi) de [11C]CPPC [radioatividade específica = 366 GBq/µmol (9,9 Ci/µmol)] e foram sacrificados por deslocamento cervical 45 min após a injeção do radiotraçador. Os cérebros inteiros foram removidos e dissecados em gelo. O cerebelo, o hemisfério cerebral ipsilateral, que foi adicionalmente cortado em dois quadrantes, frontal e caudal, o hemisfério cerebral contralateral e amostras sanguíneas foram pesados, e o teor de radioatividade dos mesmos foi determinado por um contador γ LKB/Wallac 1283 CompuGamma CS. As variáveis de desfecho foram calculadas por %SUV.

1.7.7.4. Absorção cerebral da [11C]CPPC em camundongos controle e camundongos tratados com LPS (por via intraperitoneal) (FIG. 2)

[0231]Experimento 1, FIG. 2A. Quinze camundongos CD-1 machos (25 a 27 g, idade = seis a sete semanas) da Charles River Laboratories foram divididos em três coortes: 1) camundongos controle (n = 5), referência; 2) camundongos tratados com lipopolissacarídeos (LPS) IP (n = 5), referência; e 3) camundongos tratados com lipopolissacarídeos (LPS) IP (n = 5), bloqueio com CPPC. A solução de LPS (O111:B4, Calbiochem, San Diego, CA) em soro fisiológico estéril (10 mg/kg, 0,2 mL) foi administrada por via intraperitoneal, e o estudo com radiotraçadores foi realizado no 5º dia após a administração de LPS. A solução de CPPC (1 mg/kg) foi administrada IP 5 min antes da [11C]CPPC IV, ao passo que os animais de referência receberam veículo. Os animais LPS e controle receberam injeção IV de 3,7 MBq (0,1 mCi) de [11C]CPPC [radioatividade específica = 444 GBq/µmol (12,0 Ci/µmol)] e foram sacrificados por deslocamento cervical 45 min após a injeção do radiotraçador. Os cérebros inteiros foram removidos e dissecados em gelo. O cerebelo e o restante do cérebro foram pesados, e o teor de radioatividade dos mesmos foi determinado por um contador γ LKB/Wallac 1283 CompuGamma CS. As variáveis de desfecho foram calculadas por %SUV.

[0232]Experimento 2, FIG. 2B. Quinze camundongos CD-1 machos (25 a 27 g, idade = seis a sete semanas) da Charles River Laboratories foram divididos em três coortes: 1) camundongos controle (n = 5), referência; 2) camundongos tratados com lipopolissacarídeos (LPS) IP (n = 5), referência; e 3) camundongos tratados com lipopolissacarídeos (LPS) IP (n = 5), bloqueio com CPPC. A solução de LPS (O111:B4, Calbiochem, San Diego, CA) em soro fisiológico estéril (10 mg/kg, 0,2 mL) foi administrada por via intraperitoneal, e o estudo com radiotraçadores foi realizado no 3º dia após a administração de LPS. A solução de CPPC (1 mg/kg) foi administrada IP 5 min antes da [11C]CPPC IV, ao passo que os animais de referência receberam veículo. Os animais LPS e controle receberam injeção IV de 3,7 MBq (0,1 mCi) de [11C]CPPC [radioatividade específica = 374 GBq/µmol (10,1 Ci/µmol)] e foram sacrificados por deslocamento cervical 45 min após a injeção do radiotraçador. Os cérebros inteiros foram removidos e dissecados em gelo, e amostras sanguíneas (0,2 a 0,5 cc) foram coletadas do coração. O cérebro inteiro e as amostras sanguíneas foram pesados, e o teor de radioatividade dos mesmos foi determinado por um contador γ LKB/Wallac 1283 CompuGamma CS. As variáveis de desfecho foram calculadas por SUVR.

[0233]Experimento 3, FIG. 2C. Quinze camundongos CD-1 machos (25 a 27 g, idade = seis a sete semanas) da Charles River Laboratories foram divididos em três coortes: 1) camundongos controle (n = 3), referência; 2) camundongos tratados com lipopolissacarídeos (LPS) IP (n = 6), referência; e 3) camundongos tratados com lipopolissacarídeos (LPS) IP (n = 6), bloqueio com o composto 8. A solução de LPS (O111:B4, Calbiochem, San Diego, CA) em soro fisiológico estéril (10 mg/kg, 0,2 mL) foi administrada por via intraperitoneal, e o estudo com radiotraçadores foi realizado no 3º dia após a administração de LPS. A solução de composto 8 (2 mg/kg) foi administrada IP 5 min antes da [11C]CPPC IV, ao passo que os animais de referência receberam veículo. Os animais LPS e controle receberam injeção IV de 3,0 MBq (0,08 mCi) de [11C]CPPC [radioatividade específica = 148 GBq/µmol (4,0 Ci/µmol)] e foram sacrificados por deslocamento cervical 45 min após a injeção do radiotraçador. Os cérebros inteiros foram removidos e dissecados em gelo, e amostras sanguíneas (0,2 a 0,5 cc) foram coletadas do coração. O cérebro inteiro e as amostras sanguíneas foram pesados, e o teor de radioatividade dos mesmos foi determinado por um contador γ LKB/Wallac 1283 CompuGamma CS. As variáveis de desfecho foram calculadas por SUVR para o sangue.

1.7.7.5. Absorção cerebral da [11C]CPPC em modelos murídeos de Alzheimer e camundongos controle (FIG. 3)

[0234]Utilizou-se um modelo murídeo de amiloidose relacionada à doença de Alzheimer superexpressando a Proteína Precursora Amiloide (APP) com mutações Sueca e Indiana. A APP transgênica tinha um promotor sensível ao transativador tetraciclina (tTa) que foi ativado superexpressando o tTa guiado pelo promotor CaMKII (5). Devido a essa combinação de transgenes, observou-se a superexpressão da APP transgênica somente nos neurônios principais do prosencéfalo. Os camundongos não expressaram nenhum dos transgenes que serviram de controle. Os camundongos machos com Alzheimer (AD) e suas ninhadas controle de mesmo sexo tinham 16 meses de idade quando do estudo. Com essa idade, os camundongos AD têm uma deposição das placas amiloides Aβ significativa no prosencéfalo, incluindo o córtex e o hipocampo (Melnikova T, et al. (2013). Utilizaram-se seis camundongos AD e seis controles com a mesma idade para esse estudo. Os animais receberam injeção IV de 5,6 MBq (0,15 mCi) de [11C]CPPC [radioatividade específica = 340 GBq/µmol (9,2 Ci/µmol)] e foram sacrificados por deslocamento cervical 45 min após a injeção do radiotraçador. Os cérebros inteiros foram removidos e rapidamente dissecados em gelo. O cerebelo e o restante do cérebro foram pesados, e o teor de radioatividade dos mesmos foi determinado por um contador γ LKB/Wallac 1283 CompuGamma CS. As variáveis de desfecho foram calculadas por %SUV.

1.7.8. Métodos de dosimetria da radiação de corpo inteiro para a [11C]CPPC em camundongos

[0235]A dosimetria de radiação para a [11C]CPPC foi estudada em quinze camundongos CD-1 machos (23-27 g) seguindo nosso procedimento publicado (Stabin MG, et al. (2005)). Uma solução de [11C]CPPC em 0,2 ml de soro fisiológico (7,4 MBq ou 0.2 mCi) foi injetada como um bólus na veia caudal lateral, e grupos de camundongos (n = 3) foram submetidos a eutanásia a 10, 30, 45, 60 e 90 min após a injeção do radiotraçador. Os pulmões, coração, rins, fígado, baço, intestino, estômago e cérebro foram rapidamente removidos e colocados em gelo. Um fêmur e amostras do músculo da coxa, medula óssea e sangue também foram coletados. Os órgãos foram pesados, e a radioatividade do tecido foi medida com um contador gama automatizado (LKB Wallac 1282 CompuGamma CS Universal Gamma Counter). A porcentagem de dose injetada por órgão (%ID/órgão) foi calculada por comparação com amostras de uma diluição padrão da dose inicial. Todas as medições foram corrigidas para o decaimento. Os valores resultantes de %ID/órgão foram ajustados usando o software SAAM II (Foster DM (1998)). Integrais temporais de atividade (Stabin MG e Siegel JA (2003)) foram introduzidas no software OLINDA/EXM (Stabin MG, et al. (2005)), usando o modelo macho adulto. Observou- se atividade nos intestinos (~35%). Considerou-se o número de desintegrações no restante do corpo igual a 100% da atividade administrada integrada ao decaimento total de 11C, menos as desintegrações em outros órgãos do corpo.

1.7.8.1. Resultados

[0236]O modelo metabólito ajustado, o número de desintegrações nos órgãos de origem e as doses nos órgãos são resumidos abaixo:

[0237]O modelo metabólito ajustado foi de acordo com o seguinte: Órgão % T-bio (h) % T-bio (h) Cérebro 3,83 0,302 0,38 ∞ Coração 1,00 0,272 0,14 ∞ Pulmões 8,27 0,159 1,53 2,27 Fígado 97,6 0,764 -100 0,335 Rins 8,32 0,297 1,52 ∞ Braço 1,43 0,823 -1,24 0,145

[0238]Os números de desintegrações nos órgãos de origem (em MBq-h/MBq administrado) foram de: Cérebro 1,10E-02 LLI 7,00E-04 Intestino delgado 1,53E-01 ULI 1,81E-02 Parede do coração 2,80E-03 Rins 2,65E-02 Fígado 8,80Е-02 Pulmões 2,00E-02 Baço 3,00E-03 Restante 1,68E-01 Tabela 3. Doses Humanas Estimadas Órgão Alvo mSv/MBq rem/mCi Adrenais 3,11E-03 1,15E-02 Cérebro 2,70E-03 9,99E-03 Mamas 1,29E-03 4,76E-03 Parede da vesícula 5,35 E-03 1,98E-02 Parede do LLI 4,29E-03 1,59E-02 Intestino delgado 4,73E-Q2 1,75E-01 Parede do estômago 2,76E-D3 1,02E-02 Parede do ULI 1,73E-Q2 6,42E-02 Parede do coração 3,72E-03 1,38E-02 Rins 2,56E-02 S,48E-02 Fígado 1,60E-02 5,90E-02 Pulmões 6,10E-03 2,26E-02 Músculo 1,84E-03 6,79E-03

Ovários 5,21E-G3 1,93E-02 Pâncreas 3,18E-03 118E-02 Medula vermelha 2,19E-03 8,09E-03 Células osteogênicas 2,13E-03 7,87E-03 Pele 1,19E-03 4,41 E-03 Baço 6,08E-03 2,25E-02 Testículos 1,20E-03 4,42E-G3 Timo 1,44E-03 5,33E-03 Tireoide 1,18E-03 4,38E-03 Parede da bexiga 2,14E-03 7,92E-03 Útero 4,57E-03 1,69E-02 Todo o corpo 2,90E-03 1,07E-02 Dose eficaz 4,80E-03 1,78E-02

1.7.8.2. Sumário do estudo de dosimetria da radiação

[0239]Os dados foram todos bem ajustados com duas funções exponenciais. A maioria dos órgãos parece receber em torno de 0,002 a 0,006 mSv/MBq (0,007 a 0,011 rem/mCi). O intestino delgado parece ter recebido a dose mais alta, em torno de 0,047 mSv/MBq (0,17 Rem/mCi). A dose eficaz é de cerca de 0,0048 mSv/MBq (0,018 rem/mCi).

1.7.9. Imagiologia PET/CT em camundongos com Encefalite Autoimune Experimental (FIG. 4, FIG. 13)

[0240]Camundongos C57BL/6J fêmeos adultos, idade = 13 semanas (Jackson Laboratories, Bar Harbor ME) foram inoculados com peptídeo MOG35-55 e pontuados compormentacionalmente conforme descrito previamente (Jones MV, et al. (2008)): Em suma, adjuvante de Freund incompleto (Pierce) contendo 8 mg/ml de micobactérias da tuberculose exterminadas por calor H37 RA (Difco) foi misturado a 1:1 com 2 mg/ml de uma solução de MOG35-55 (Johns Hopkins Biosynthesis &

Sequencing Facility): NH2-MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK-COOH diluído em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS). Depois de formar uma emulsão estável, um total de 100 μl da mistura resultante foi dividido entre dois sítios de injeção subcutânea na base da cauda (isto é, 400 μg de M. tuberculose e 100 μg de MOG35-55 por camundongo). No dia da imunização (dia 0 após a imunização: dia 0 p.i.) e 2 dias mais tarde, injetaram-se 250 ng de toxina da coqueluche (EMD/Calbiochem, EUA) diluída em PBS por via intravenosa. Camundongos inoculados com MOG sintomáticos e camundongos não inoculados saudáveis foram varridos 14 dias após a primeira inoculação. A pontuação é determinada de acordo com (Beeton C, et al. (2007)). Em suma, os camundongos são pontuados de 0 a 5, onde uma pontuação de 0 representa nenhuma característica observada clinicamente e uma pontuação de 5 representa paralisia dos membros traseiros com incontinência. Uma pontuação de 3 representa paraparesia moderada com cambaleios ocasionais. As pontuações de 0,5 (cauda mole distal), 2,5 (paraparesia leve/moderada com cambaleios) e 4,5 (paralisia total dos membros traseiros) foram avaliadas nesse estudo. Cada camundongo recebeu a injeção IV de 8,14 MBq [220 µCi, SA > 370 GBq/µmol (>10 Ci/µmol)], seguida pelo uso de um varredor PET/CT Sedecal SuperArgus (Madrid, Espanha). Varreduras CT para o corregistro anatômico foram realizadas em 512 fatias a 60 kVp. Os dados de PET e CT foram reconstruídos usando o software da fabricante e exibidos usando o software AMIDE (http://amide.sourceforge.net/). Para conservar a faixa dinâmica, o sinal de PET das glândulas harderiana e salivar foi parcialmente mascarado usando um método de delimitação (FIG. 4), ao passo que as imagens não mascaradas são ilustradas na FIG. 13. As regiões de interesse foram desenhadas sobre lesões visíveis na PET através de três fatias e quantificadas nas regiões indicadas.

1.7.10. Análise de radiometabólitos no plasma e cérebro murídeos

[0241]Utilizaram-se seis camundongos CD-1 machos (25 a 27 g, idade = seis a sete semanas) da Charles River Laboratories.

Os animais receberam injeção IV de 37 MBq (1 mCi) de [11C]CPPC [radioatividade específica = 673 GBq/µmol (18,2 Ci/µmol)] e foram sacrificados por deslocamento cervical a 10 min (3 animais) e 30 min (3 animais) após a injeção do radiotraçador.

Os cérebros inteiros foram removidos e dissecados em gelo, e amostras sanguíneas (0,5 cc) foram coletadas do coração.

Os radiometabólitos de [11C]CPPC no plasma e cérebro murídeos foram analisados usando um método de HPLC geral descrito acima para um babuíno.

Antes da análise por HPLC, o cérebro murídeo foi homogeneizado em 2 mL de mistura 50% de acetonitrila : 50% de tampão fosfato (Et3N, H3PO4, pH 7,2). Os homogenados foram centrifugados (1.4000 g durante 5 min), os sobrenadantes foram filtrados usando um filtro de 0,2 mícrons, e o filtrado foi analisado por rádio- HPLC com coluna phenomenex Gemini C18, 10 µ, 4,6 x 250 mm e 2 mL/min de eluição isocrática e 50% de acetonitrila - 50% de trietilamina aquosa, c = 0,06 M e pH = 7,2 como fase móvel.

O estudo demonstrou que, no plasma murídeo, o radiotraçador [11C]CPPC forma os mesmos dois radiometabólitos que no plasma babuíno (FIG. 17). Os radiometabólitos penetram precariamente a barreira sangue- cérebro, e sua presença no cérebro é baixa (Tabela 4) Tabela 4. [11C]CPPC mãe e seus radiometabólitos no plasma e cérebro murídeos

Ponto no Plasma Cérebro tempo Metabólitos, % [11C]CPPC mãe, % Metabólitos, % [11C]CPPC mãe, %

10 min 29,9 ± 2,3 70,2 ± 2,2 3,4 ± 0,1 96,6 ± 0,1

30 min 60,3 ± 1,4 39,7 ± 1,3 4,9 ± 1,7 95,1 ± 1,6

1.7.11. Análises por PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) e western blot do cérebro inteiro de camundongos CD1 controle e camundongos CD1 tratados com LPS.

[0242]Seis camundongos CD-1 (25 a 27 g, Charles River) receberam a injeção intraperitoneal de LPS (O111:B4, Calbiochem, San Diego, CA, 10 mg/kg, 0,2 mL). Os camundongos foram submetidos a eutanásia no 4º dia após a injeção de LPS, e os cérebros inteiros foram coletados. Metade dos cérebros foi liofilizada em nitrogênio líquido e armazenada a -80° C para as análises western blot. A outra metade dos cérebros foi armazenada em 1 mL de RNAlater® (Millipore Sigma, St. Luis, MO) a 4° C. Após 24 h, a solução RNAlater® foi removida das amostras, e o cérebro foi congelado a -80° C para o isolamento total do RNA.

[0243]Western Blot: Para western blot, as amostras cerebrais foram homogeneizadas com Reagente de Extração da Proteína de Tecido T-PER (Thermo Fisher Scientific, Halethorpe, MD) por 30 segundos ao todo de 6 vezes e centrifugadas a 12.000 rpm durante 5 min. O sobrenadante foi coletado, e 10 μg das proteínas foram separados por SDS-PAGE e transferidos à membrana NC. Utilizaram-se os anticorpos a seguir para a análise Western blot: Ab α-mCSF1R (Cell Signaling Technology, Danver, MA), Ab αmGAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX). Os blots foram visualizados pelo Substrato ECL Clarity Western (Bio- Rad, Hercules, CA) e Sistema XR+ Gel Doc™ (Bio-Rad). A intensidade de banda foi medida e calculada pelo software Image Lab™ (Bio-Rad).

[0244]qRT-PCR: Para qRT-PCR, o RNA total foi isolado do cérebro usando um Kit Miniprep Quick-RNA™ (Zymo Research, Irvine, CA), e o cDNA foi sintetizado a partir do RNA isolado usando um kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade (Thermo Fisher Scientific). As reações de qPCR foram realizadas usando os ensaios Taqman™ a seguir: Csf1r: Mm01266652_m1, Pgk1:

Mm00435617_m1, Gapdh: Mm99999915_g1). A quantidade relativa foi calculada usando Pgk1 e Gapdh como controles internos.

1.7.12. Análise dos radiometabólitos em babuínos

[0245]Os estudos PET em babuínos são exibidos na FIG. 15 e FIG. 16.

[0246]A porcentagem relativa de [11C]CPPC no plasma foi determinada por cromatografia líquida de alto desempenho (HLPC) em amostras sanguíneas coletadas 5, 10, 20, 30, 60 e 90 min após a injeção de radiotraçadores. Utilizou-se o método de HPLC com troca de coluna modificado (Coughlin, NeuroImage 165, 2018, página 120). O sistema de HPLC contendo uma bomba quaternária 1260 infinity, um módulo de compartimento de coluna 1260 infinity, detectores de radiação UV 1260 infinity e Raytest GABI Star foi operado com o software OpenLab CDS EZChrom (A.01.04). Quatro décimos a 1,5 mL de amostras do plasma carregadas em um loop injetor Rheodyne de 2 mL foram inicialmente dirigidos à coluna de captura (empacotada com 33 μm de sorvente de fase reversa polimérico Phenomenex Strata-X) e a ambos os detectores com fase móvel de 1% de acetonitrila e 99 de água a 2 mL/min. Após 1 min de eluição isocrática, uma fase móvel analítica composta por 65% de acetonitrila e 35% de solução aquosa de trietilamina, c = 0,06 M e pH = 7,2 (ajustado com ácido fosfórico) foi aplicada a compostos apolares diretamente confinados na coluna de captura a uma coluna analítica (Gemini C18(2) 10 µm 4,62 x 50 mm) e detectores a 2 mL/min. O sistema HPLC foi padronizado usando CPPC não radioativa e [11C]CPPC antes da análise das amostras do plasma sanguíneo, que foram reforçadas com 5 µL de CPPC a uma concentração de 1 mg/mL. As curvas de atividade no tempo do plasma total foram obtidas analisando 0,3 mL de amostras de plasma sanguíneo em um contador gama automático PerkinElmer Wizard 2480. A fração sem plasma (fp) da [11C]CPPC foi determinada usando dispositivos de ultrafiltragem Centrifree.

[0247]A análise dos radiometabólitos foi realizada usando um método de HPLC com troca de coluna, que permite injetar plasma sanguíneo diretamente no sistema de HPLC sem perder tempo com a precipitação e extração das proteínas. A princípio, a amostra é dirigida à coluna de captura para a extração em fase sólida do traçador pai e de seus radiometabólitos apolares. A maioria dos constituintes do plasma sanguíneo e dos radiometabólitos polares do radiotraçador pai não se mantém sobre a coluna de captura e é eluída a detectores. Em seguida, a fase móvel analítica é aplicada para eluir compostos confinados na coluna de captura à coluna analítica, onde eles são separados e adicionalmente dirigidos a detectores. Dessa maneira, todos os compostos radioativos presentes na amostra podem ser detectados, permitindo a quantificação precisa da porcentagem relativa do traçador pai vs. seus radiometabólitos. Como ilustra a FIG. 17A, 100% da [11C]CPPC injetada poderiam ser confinados com eficácia em uma coluna de captura utilizada e, com a fase móvel analítica, eluem a 7,35 min. O cromatograma de HPLC representativo das amostras de plasma obtidas em diferentes intervalos de tempo é dado na FIG. 17A, e a porcentagem relativa no plasma sanguíneo dependente do tempo da [11C]CPPC em babuínos controle não tratados e babuínos tratados com LPS ou LPS + agente bloqueador é dada na FIG. 17B. A administração de LPS ou LPS e agente bloqueador não afetou o padrão metabólico e a taxa de [11C]CPPC. Detectaram-se dois picos a 0,97 min e 4,82 min da eluição relacionados a radiometabólitos menos lipófilos do traçador pai. A porcentagem relativa de [11C]CPPC foi de 84,87 ±2,01, 75,57 ±1,76, 62,5 ±4,47, 51,73 ±6,14, 34,8 ±1,31 e 25,6 ±2,77 a 5, 10, 20, 30, 60 e 90 min após a injeção do radiotraçador.

[0248]A fração sem plasma de [11C]CPPC determinada usando dispositivos de ultrafiltragem Centrifree também não foi afetada pelos tratamentos com LPS ou LPS e bloqueio e foi de 5,48 ±0,98%.

1.7.13. Métodos de imagiologia PET em babuínos

[0249]Obtiveram-se imagens PET usando um Tomógrafo de Pesquisa de Alta Resolução CPS/CTI (HRRT), com resolução axial (FWHM) de 2,4 mm e resolução em plano de 2,4 a 2,8 mm. O animal foi anestesiado e tratado conforme descrito previamente (Horti AG, et al. (2016)). Os dados PET de 90 min foram binados em 30 quadros: quatro quadros de 15 s, quatro quadros de 30 s, três quadros de 1 min, dois quadros de 2 min, cinco quadros de 4 min e doze quadros de 5 min. As imagens foram reconstruídas usando o algoritmo de maximização da expectativa por subconjuntos ordenados (OS-EM) (com seis iterações e 16 subconjuntos) com correção para o decaimento radioativo, tempo morto, atenuação, espalhamento e aleatoriedades (Rahmim A, et al. (2005)). O espaço da imagem reconstruído consistiu em voxéis cúbicos, cada um com 1,22 mm3 de tamanho e dimensões de 31 cm x 31 cm (transaxialmente) e 25 cm (axialmente).

[0250]Obtiveram-se amostras sanguíneas através do cateter arterial em intervalos continuamente prolongados durante toda a varredura de 90 min (o mais rapidamente possível para os primeiros 90 segundos, com as amostras obtidas a intervalos cada vez mais longos depois disso). As amostras foram centrifugadas a

1.200 x g, e a radioatividade no plasma foi medida com um contador gama transcalibrado. Amostras de plasma selecionadas (5, 10, 20, 30, 60 e 90 min) foram analisadas por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) para metabólitos radioativos no plasma conforme descrito acima.

1.7.14. Análise dos dados de PET em babuíno

[0251]A análise das imagens e modelagem cinética foram realizadas usando o software PMOD (v3.7, PMOD Technologies Ltd, Zurique, Suíça). Imagens PET dinâmicas foram corregistradas primeiramente com as imagens MRI. Um modelo de volume de interesse (VOI) desenvolvido localmente, incluindo 13 estruturas de cérebro babuíno representativas, foi então transferido à imagem MRI do animal. Os VOIs incluíram os giros frontal e temporal, o tálamo, hipocampo, caudado, putâmen,

amígdala, globo pálido, ínsula, hipotálamo, cerebelo, corpo caloso e massa branca. A curva de atividade no tempo (TAC) de cada VOI foi obtida aplicando-se o VOI sobre os quadros de PET.

[0252]Em seguida, com base nas TACs e nas funções de entrada no plasma arterial corrigidas para metabólitos, a modelagem cinética foi realizada para caracterizar quantitativamente a ligação de [11C]CMPFF no cérebro. Na absorção cerebral, a medida de desfecho primária é o volume de distribuição (VT) cerebral regional da [11C]CPPC, definido pela concentração do radiotraçador no tecido regional em relação à concentração no sangue em equilíbrio. O VT regional é proporcional à densidade do receptor no VOI definido. Como não espera-se que nenhuma região cerebral seja isenta da absorção específica de [11C]CPPC, outra medida de desfecho comumente usada, a saber, o potencial de ligação deslocável (BPND), pode não ser obtida com confiança. Para cada VOI, calculou-se o VT usando tanto a modelagem compartimental quanto o método gráfico de Logan. Logan J, et al. (1990). Também realizou-se uma análise de consistência no tempo. Resultados representativos são dados na Fig. 18.

[0253]Em suma, tanto a modelagem compartimental quando o método de Logan são adequados para analisar os dados de PET da [11C]CPPC (exemplo ilustrado nas FIGs. 18-a e 18-b) e geraram resultados de VT regionais bastante equiparáveis (FIG. 18-c). Todas as regiões cerebrais produziram estimativas de VT estáveis para durações de varredura mais longas do que 60 minutos (FIG. 18-d). Para facilitar a obtenção de imagens paramétricas VT (FIG. 5 e FIG. 13), o método de Logan foi selecionado para apresentar todos os valores VT neste documento. EXEMPLO 2

SÍNTESE DE ARILAMIDAS

[0254]Em geral, a via sintética começou com a reação SNAr de 2-flúor-4- cloronitrobenzeno 2 com piperidina ou 4-metilpiperidina em etanol para obter os compostos N-alquilados 4a-b com altíssimo rendimento. A N-metil piperazina reage com 4a-b em reação pura a 140° C para obter os compostos 5a-b. Por outro lado, a N-Boc piperazina reage com 4a-b na presença da base inorgânica K2CO3 com DMSO como solvente para produzir os compostos 5c-5d. A redução do grupo nitro em anilina, seguida pela formação da ligação amida padrão com ácido 5- cianofurano-2-carboxílico ou ácido 4-ciano-1H-pirrol-2-carboxílico, produziu os produtos desejados 1a, 1c, 1e e 7a-c. Para a radiossíntese, obtiveram-se os precursores 1b, 1d e 1f a partir de 7a-c com a desproteção de N-Boc usando TFA em cloreto de metileno.

[0255]A síntese também incluiu acoplamento Suzuki-Miyaura, vide Miyaura e Suzuki, 1995, entre o éster anilinoborônico 8 (que distingue-se do "composto 8" aludido acima) e o derivado éster triflato de enol da piperidinona protegida com N- Boc 9. Vide Wustrow e Wise, 1991. Após a hidrogenação da olefina 10, a anilina resultante 11 foi bromada com N-bromosuccinimida (NBS) para obter 12. Após disso, o acoplamento Suzuki-Miyaura com ácido 1-cicloexenoborônico e o composto 12 produziu o composto amina 13. O sal de potássio do imidazol-2-carboxilato protegido com trimetilsililetoximetila (SEM) foi preparado de acordo com o procedimento relatado. Vide Wall et al., 2008. O composto 13 acopla-se a 14 usando HATU e N,N-diisopropiletilamina (DIPEA) em DMF para obter amida 15 com bom rendimento. A remoção simultânea de ambos os grupos Boc e SEM com ácido trifluoracético (TFA) produziu um intermediário 16, que foi usado no preparo de 1g e

17. A remoção de Boc produziu o composto precursor 1h. Síntese das arilamidas 7a-d e 8a-b.

[0256]Reagentes e condições: (a) Etanol, 0° C a t.a., 0,5 h, 96%; (b) 140° C, 12 h para 5a-b, K2CO3, DMSO, 110° C, 12 h para 5c-d, 80% a 95%; (c) Zn, NH4Cl, THF/MeOH/H2O, refluxo, 1 h, 90%; (d) HATU, DIPEA, DMF, t.a., ácido 5- cianofurano-2-carboxílico para 1a, 1c, 7a-b e ácido 4-ciano-1H-pirrol-2-carboxílico para 1e, 7c, 12 h, 75% a 82%; (e) TFA, MC, t.a., 12 h, 90%.

[0257]A síntese das arilamidas 1a-l é dada abaixo:

R R

R F R R1 -

O N N N N+ Cl + a N b NO2 c NH2 + O N NO 2 N

H H N N Cl N N R1 R1 2 3 4a-b 5a-d 6a-d 4a : R = H 5a : R = H, R1 = CH3 6a : R = H, R1 = CH3 4b : R= CH3 5b : R = CH3, R1 = CH3 6b : R = CH3, R1 = CH3 5c : R = H, R1 = COOC(CH3)3 6c : R = H, R1 = COOC(CH3)3 5d : R = CH3, R1 = COOC(CH3)3 6d : R = CH3, R1 = COOC(CH3)3

R R R N

N N H H e H f N R3 d N R2 N R2

O O O N N N

N N N R1 R1 R1 1b, 1d and 1f 1k-m 1a, 1c, 1e, 1g-i and 7a-c 1k : R = H, R1=CH2CH2F,R 3 = 1b : R = H, R1 = H, R2 = O CN 1a : R = H, R1 = CH3, R2 = O CN

O CN

CN 1d : R = CH3, R1 = H, R2 = 1c : R = CH3, R1 = CH3, R2 = O CN 1l : R = CH3, R1=CH2CH2F, R3 =

O CN N CN H

CN 1f : R = CH3, R1 = H, R2 = 1e : R = CH3, R1 = CH3, R2 = N H 1m : R = H, R1=CH2CH2Br,R 3 =

N O CN

H CN 1m : R = H, R1 = H, R2 =

O CN 1g : R = H, R1 = CH3, R2 =

O

CN 1h : R = H, R1 = CH3, R2 =

O 1i : R = H, R1 = CH3, R2 =

N F 1j : R = H, R1 = CH3, R2 = N Br 7a : R = H, R1 = COOC(CH3)3, R2 =

O CN 7b : R = CH3, R1 = COOC(CH3)3, R2 =

O CN

CN 7c : R = CH3, R1 = COOC(CH3)3, R2 =

N H

[0258]Reagentes e condições: (a) Etanol, 0° C a t.a., 0,5 h, 96%; (b) 140° C, 12 h para 5a-b, K2CO3, DMSO, 110° C, 12 h para 5c-d, 80% a 95%; (c) Zn, NH4Cl, THF/MeOH/H2O, refluxo, 1 h, 90%; (d) Ácido carboxílico, HATU, DIPEA, DMF, 12 h, 75% a 82%; (e) TFA, MC, t.a., 12 h, 90%; f) Tosilato de fluoretila, Et3N, ACN, 90° C, 12 h, 60% a 70% para 1k-l e 1,2-dibromoetano, Et3N, ACN, 90° C, 12 h, para 1m, 65%.

[0259]A síntese das arilamidas 1g e 1h é dada abaixo:

[0260]Reagentes e condições: (a) Pd(PPh3)4, LiCl, 2 M de Na2CO3, dioxano,

1.000° C, 2 h. (b) H2, 10% de Pd/C, MeOH, 20 psi, 1 h. (c) NBS, CH2Cl2, temperatura ambiente, 10 h. (d) Pd(dppf)Cl2.DCM, 2 M de Na2CO3, 1,4-Dioxano, 100° C, 15 h. (e) HATU, DIPEA, DMF, 10 h. (f) TFA, CH2Cl2, temperatura ambiente, 20 h. (g) HATU, DIPEA, DMF, dimetilglicina para 1g e N-(terc-butoxicarbonil)-N-metilglicina para 17, 12 h, h) TFA, CH2Cl2, temperatura ambiente, 20 h.

[0261]1-(5-cloro-2-nitrofenil)piperidina (4a): A uma solução resfriada (0° C) de 1,0 g (10,0 mmol) de 4-cloro-2-fluornitrobenzeno em 15 mL de EtOH, adicionou- se 1,7 mL (30,0 mmol) de piperidina gota a gota ao longo de 5 min. A solução foi agitada a 0° C durante 10 min e, em seguida, a 23° C durante 30 min. A mistura foi despejada em água (225 mL) e extraída com EtOAc (2 x 30 mL). Os extratos combinados foram lavados com NaHCO3 aq. saturado e salmoura (30 mL cada) e, em seguida, secos sobre Na2SO4 e evaporados para obter o composto bruto. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel

(Hexano:EtOAc = 9,5:0,5) para obter 1-(5-cloro-2-nitrofenil)piperidina na forma de um sólido amarelo (1,32 g, 96% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3)  7,77 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,13 (s, 1H), 6,93 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 3,30-3,27 (m, 2H), 2,91-2,86 (m, 2H), 1,90-1,86 (m, 1H), 1,75-1,73 (m, 2H), 1,49-1,42 (m, 1H).

[0262]1-(5-cloro-2-nitrofenil)-4-metilpiperidina (4b): A uma solução resfriada (0° C) de 1,0 g (10,0 mmol) de 4-cloro-2-fluornitrobenzeno em 15 mL de EtOH, adicionou-se 1,01 mL (30,0 mmol) de 4-metilpiperidina gota a gota ao longo de 5 min. A solução foi agitada a 0° C durante 10 min e, em seguida, a 23° C durante 30 min. A mistura foi despejada em água (225 mL) e extraída com EtOAc (2 x 30 mL). Os extratos combinados foram lavados com NaHCO3 aq. saturado e salmoura (30 mL cada) e, em seguida, secos sobre Na2SO4 e evaporados para obter o composto bruto. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (Hexano:EtOAc = 9,5:0,5) para obter 1-(5-cloro-2-nitrofenil)-4-metilpiperidina na forma de um sólido amarelo (1,4 g, 96% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3)  7,77 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,13 (s, 1H), 6,93 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 3,30-3,27 (m, 2H), 2,91-2,86 (m, 2H), 1,90-1,86 (m, 1H), 1,75-1,73 (m, 2H), 1,49-1,42 (m, 1H), 1,02 (d, J = 5,0 Hz, 3H).

[0263]1-metil-4-(4-nitro-3-(piperidin-1-il)fenil)piperazina (5a): Uma mistura de 1-(5-cloro-2-nitrofenil)piperidina (1,0 g, 4,15 mmol) e 1-metilpiperazina (1,38 mL, 12,46 mmol) foi aquecida com agitação sob N2 a 138° C durante 12 h. Depois de resfriá-la à temperatura ambiente, a mistura foi despejada em água e extraída com acetato de etila (2 x 100 mL). Os extratos combinados foram lavados com água e salmoura e, em seguida, secos sobre Na2SO4 e evaporados para obter o composto bruto. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter 1-metil-4-(4-nitro-3-(piperidin-1-il)fenil)piperazina na forma de um sólido amarelo (1,2 g, 96% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3)  7,62 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 6,80 (s, 1H), 6,43 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 3,84 (t, J =

5,0 Hz, 4H), 3,71 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 3,60 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 3,50 (d, J = 10,0 Hz, 2H), 3,80 (d, J = 5,0 Hz, 2H), 1,55-1,51 (m, 3H).

[0264]1-metil-4-(3-(4-metilpiperidin-1-il)-4-nitrofenil)piperazina (5b): Uma mistura de 1-(5-cloro-2-nitrofenil)-4-metilpiperidina (1,0 g, 3,92 mmol) e 1- metilpiperazina (1,30 mL, 11,77 mmol) foi aquecida com agitação sob N2 a 138° C durante 12 h. Depois de resfriá-la à temperatura ambiente, a mistura foi despejada em água e extraída com acetato de etila (2 x 100 mL). Os extratos combinados foram lavados com água e salmoura e, em seguida, secos sobre Na2SO4 e evaporados para obter o composto bruto. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter 1-metil-4-(3- (4-metilpiperidin-1-il)-4-nitrofenil)piperazina na forma de um sólido amarelo (1,2 g, 96% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3)  7,62 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 6,80 (s, 1H), 6,43 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 3,84 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 3,71 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 3,60 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 3,50 (d, J = 10,0 Hz, 2H), 1,80 (d, J = 5,0 Hz, 2H), 1,55-1,51 (m, 3H), 1,03 (d, J = 5,0 Hz, 3H).

[0265]4-(4-nitro-3-(piperidin-1-il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila (5c): À mistura de 1-(5-cloro-2-nitrofenil)piperidina (1,0 g, 4,15 mmol) e piperazina-1- carboxilato de terc-butila (1,55 g, 8,30 mmol) em DMSO (10 mL), adicionou-se K2CO3 (1,72 g, 12,45 mmol). A mistura de reação foi agitada a 110° C durante 12 h e, em seguida, dividida entre EtOAc e salmoura. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (Hexano:EtOAc = 3:7) para obter 4-(4-nitro-3-(piperidin-1-il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila na forma de um sólido branco (1,40 g, 86,4% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3)  7,99 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 6,38 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 6,31 (s, 1H), 3,58 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 3,34 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 2,28 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 2,78 (d, J = 10,0 Hz, 2H), 1,70 (d, J = 5,0 Hz, 2H), 1,55-1,51 (m, 3H), 1,47 (s, 9H).

[0266]4-(3-(4-metilpiperidin-1-il)-4-nitrofenil)piperazina-1-carboxilato de terc- butila (5d): À mistura de 1-(5-cloro-2-nitrofenil)-4-metilpiperidina (1,0 g, 3,92 mmol) e piperazina-1-carboxilato de terc-butila (1,46 g, 7,85 mmol) em DMSO (10 mL), adicionou-se K2CO3 (1,62 g, 11,77 mmol). A mistura de reação foi agitada a 110° C durante 12 h e, em seguida, dividida entre EtOAc e salmoura. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (Hexano:EtOAc = 3:7) para obter 4-(3-(4-metilpiperidin-1-il)-4-nitrofenil)piperazina-1-carboxilato de terc- butila na forma de um sólido branco (1,42 g, 89,8% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3)  7,99 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 6,38 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 6,31 (s, 1H), 3,58 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 3,34 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 2,28 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 2,78 (d, J = 10,0 Hz, 2H), 1,70 (d, J = 5,0 Hz, 2H), 1,55-1,51 (m, 3H), 1,47 (s, 9H), 1,00 (d, J = 5,0 Hz, 3H).

[0267]4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)anilina (6a): A uma mistura de 1-metil-4-(4-nitro-3-(piperidin-1-il)fenil)piperazina (1,2 g, 3,94 mmol) e NH4Cl (2,10 g, 39,4 mmol) em THF/MeOH/H2O (10:5:3) (20 mL), adicionou-se Zn em pó (2,57 g, 39,4 mmol) a 90° C, e, em seguida, a mistura foi submetida a refluxo durante 1 h. Uma vez concluída a reação, a mistura de reação foi filtrada através de Celite e dividida entre EtOAc e salmoura. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter 4-(4- metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)anilina na forma de um sólido marrom (0,98 g, 90,7% de rendimento).

[0268]4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(4-metilpiperidin-1-il)anilina (6b): A uma mistura de 1-metil-4-(3-(4-metilpiperidin-1-il)-4-nitrofenil)piperazina (1,2 g, 3,76 mmol) e NH4Cl (2,01 g, 37,6 mmol) em THF/MeOH/H2O (10:5:3) (20 mL), adicionou- se Zn em pó (2,46 g, 37,6 mmol) a 90° C, e, em seguida, a mistura foi submetida a refluxo durante 1 h. Uma vez concluída a reação, a mistura de reação foi filtrada através de Celite e dividida entre EtOAc e salmoura. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter 4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(4-metilpiperidin-1-il)anilina na forma de um sólido marrom (1,0 g, 92,0% de rendimento).

[0269]4-(4-amino-3-(piperidin-1-il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila (6c): A uma mistura de 4-(4-nitro-3-(piperidin-1-il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila (1,20 g, 3,07 mmol) e NH4Cl (1,64 g, 30,7 mmol) em THF/MeOH/H2O (10:5:3) (20 mL), adicionou-se Zn em pó (2,0 g, 30,7 mmol) a 90° C, e, em seguida, a mistura foi submetida a refluxo durante 1 h. Uma vez concluída a reação, a mistura de reação foi filtrada através de Celite e dividida entre EtOAc e salmoura. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter 4-(4-amino-3-(piperidin-1-il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila na forma de um sólido marrom (1,0 g, 90,3% de rendimento).

[0270]4-(4-amino-3-(4-metilpiperidin-1-il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila (6d): A uma mistura de 4-(3-(4-metilpiperidin-1-il)-4-nitrofenil)piperazina-1- carboxilato de terc-butila (1,2 g, 2,96 mmol) e NH4Cl (1,58 g, 29,6 mmol) em THF/MeOH/H2O (10:5:3) (20 mL), adicionou-se Zn em pó (1,93 g, 29,6 mmol) a 90° C, e, em seguida, a mistura foi submetida a refluxo durante 1 h. Uma vez concluída a reação, a mistura de reação foi filtrada através de Celite e dividida entre EtOAc e salmoura. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter 4-(4-amino-3-(piperidin-1- il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila na forma de um sólido marrom (1,0 g, 90,0% de rendimento).

[0271]5-ciano-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2- carboxamida (1a) (JHU11744): À mistura de 4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1- il)anilina (0,5 g, 1,82 mmol), ácido 5-cianofurano-2-carboxílico (0,3 g, 2,18 mmol) e HATU (0,83 g, 2,18 mmol) em DMF (10 mL), adicionou-se DIPEA (0,63 mL, 3,64 mmol). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro e, em seguida, dividida entre EtOAc e salmoura. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter 5-ciano-N-(4-(4- metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2- carboxamida na forma de um sólido amarelo (0,6 g, 84,5% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3)  9,53 (s, 1H), 8,31 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,23 (d, J = 16,6 Hz, 2H), 6,80 (s, 1H), 6,72 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 3,20 (s, 4H), 2,85 (s, 4H), 2,59 (s, 4H), 2,36 (s, 3H), 1,80 (s, 4H), 1,65 (s, 2H).

[0272]5-ciano-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(4-metilpiperidin-1-il)fenil)furano- 2-carboxamida (1c) (JHU11734): À mistura de 4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(4- metilpiperidin-1-il)anilina (0,5 g, 1,73 mmol), ácido 5-cianofurano-2-carboxílico (0,28 g, 2,08 mmol) e HATU (0,79 g, 2,08 mmol) em DMF (10 mL), adicionou-se DIPEA (0,60 mL, 3,46 mmol). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro e, em seguida, dividida entre EtOAc e salmoura. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter 5-ciano-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(4-metilpiperidin-1- il)fenil)furano-2-carboxamida na forma de um sólido amarelo (0,62 g, 87,8% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3)  9,60 (s, 1H), 8,30 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,25 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,21 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 6,79 (s, 1H), 6,72 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 3,19 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 2,99 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 2,73 (t, J = 10,0 Hz, 2H), 2,59 (t,

J = 5,0 Hz, 4H), 2,36 (s, 3H), 1,84 (d, J = 10,0 Hz, 2H), 1,52-1,47 (m, 3H), 1,07 (d, J = 5,0 Hz, 3H).

[0273]4-ciano-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(4-metilpiperidin-1-il)fenil)-1H- pirrol-2-carboxamida (1e) (JHU11761): À mistura de 4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(4- metilpiperidin-1-il)anilina (0,5 g, 1,73 mmol), ácido 5-cianofurano-2-carboxílico (0,28 g, 2,08 mmol) e HATU (0,79 g, 2,08 mmol) em DMF (10 mL), adicionou-se DIPEA (0,60 mL, 3,46 mmol). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro e, em seguida, dividida entre EtOAc e salmoura. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter 4-ciano-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(4-metilpiperidin-1- il)fenil)-1H-pirrol-2-carboxamida na forma de um sólido marrom (0,62 g, 87,8% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3)  10,58 (s, 1H), 9,0 (s, 1H), 8,25 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,45 (s, 1H), 6,82 (d, J = 10,0 Hz, 2H), 6,72 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 3,19 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 2,99 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 2,73 (t, J = 10,0 Hz, 2H), 2,60 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 2,37 (s, 3H), 1,84 (d, J = 10,0 Hz, 3H), 1,52-1,47 (m, 2H), 1,08 (d, J = 5,0 Hz, 3H).

[0274]4-ciano-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2- carboxamida (1g) (JHU11765): À mistura de 4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1- il)anilina (0,5 g, 1,82 mmol), ácido 4-cianofurano-2-carboxílico (0,3 g, 2,18 mmol) e HATU (0,83 g, 2,18 mmol) em DMF (10 mL), adicionou-se DIPEA (0,63 mL, 3,64 mmol). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro e, em seguida, dividida entre EtOAc e salmoura. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter 4-ciano-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2- carboxamida na forma de um sólido amarelo pálido (0,62 g, 86,1% de rendimento).

RMN de 1H (500 MHz, CDCl3)  9,41 (s, 1H), 8,31 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 8,03 (s, 1H), 7,33 (s, 1H), 6,78 (s, 1H), 6,72 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 3,19 (s, 4H), 2,83 (s, 4H), 2,59 (s, 4H), 2,36 (s, 3H), 1,76 (s, 4H), 1,63 (s, 2H).

[0275]5-ciano-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-3- carboxamida (1h) (JHU11766): À mistura de 4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1- il)anilina (0,5 g, 1,82 mmol), ácido 5-cianofurano-3-carboxílico (0,3 g, 2,18 mmol) e HATU (0,83 g, 2,18 mmol) em DMF (10 mL), adicionou-se DIPEA (0,63 mL, 3,64 mmol). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro e, em seguida, dividida entre EtOAc e salmoura. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter 5-ciano-N-(4-(4- metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-3- carboxamida na forma de um sólido amarelo (0,6 g, 84,5% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3)  8,92 (s, 1H), 8,28 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,11 (s, 1H), 7,37 (s, 1H), 6,79 (s, 1H), 6,73 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 3,18 (s, 4H), 2,82 (s, 4H), 2,59 (s, 4H), 2,36 (s, 3H), 1,74 (s, 4H), 1,65 (s, 2H).

[0276]6-flúor-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)picolinamida (1i) (JHU11767): À mistura de 4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)anilina (0,5 g, 1,82 mmol), ácido 6-fluorpicolínico (0,308 g, 2,18 mmol) e HATU (0,83 g, 2,18 mmol) em DMF (10 mL), adicionou-se DIPEA (0,63 mL, 3,64 mmol). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro e, em seguida, dividida entre EtOAc e salmoura. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter 5-ciano-N-(4- (4- metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2-carboxamida na forma de um sólido amarelo (0,52 g, 72,2% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3)  10,66 (s, 1H), 8,45 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 8,17 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 7,10 (d, J = 8,2 Hz, 1H),

6,78 (s, 1H), 6,72 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 3,21 (s, 4H), 2,87 (s, 4H), 2,62 (s, 4H), 2,38 (s, 3H), 1,87 (s, 4H), 1,64 (s, 2H).

[0277]6-bromo-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)picolinamida (1i) (JHU11769): À mistura de 4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)anilina (0,5 g, 1,82 mmol), ácido 6-bromopicolínico (0,441 g, 2,18 mmol) e HATU (0,83 g, 2,18 mmol) em DMF (10 mL), adicionou-se DIPEA (0,63 mL, 3,64 mmol). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro e, em seguida, dividida entre EtOAc e salmoura. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter 5-ciano-N-(4- (4- metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2-carboxamida na forma de um sólido amarelo (0,53 g, 63,8% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3)  10,89 (s, 1H), 8,45 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 8,23 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 7,74 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,62 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 6,79 (s, 1H), 6,73 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 3,20 (s, 4H), 2,87 (s, 4H), 2,60 (s, 4H), 2,36 (s, 3H), 1,91 (s, 4H), 1,64 (s, 2H).

[0278]4-(4-(5-cianofurano-2-carboxamido)-3-(piperidin-1-il)fenil)piperazina-1- carboxilato de terc-butila (7a): À mistura de 4-(4-amino-3-(piperidin-1- il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila (0,5 g, 1,38 mmol), ácido 5-cianofurano- 2-carboxílico (0,23 g, 1,66 mmol), HATU (0,63 g, 1,66 mmol) em DMF (10 mL), adicionou-se DIPEA (0,48 mL, 2,76 mmol). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro e, em seguida, dividida entre EtOAc e salmoura. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter 4-(4-(5-cianofurano-2- carboxamido)-3-(piperidin-1-il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila na forma de um sólido amarelo (0,60 g, 90,9% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3)  9,59 (s, 1H), 8,31 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,25 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,21 (d, J = 5,0 Hz,

1H), 6,79 (s, 1H), 6,72 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 3,58 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 3,10 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 2,99 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 2,72 (t, J = 10,0 Hz, 2H), 1,83 (d, J = 10,0 Hz, 2H), 1,55- 1,51 (m, 3H), 1,49 (s, 9H).

[0279]4-(4-(5-cianofurano-2-carboxamido)-3-(4-metilpiperidin-1- il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila (7b): À mistura de 4-(4-amino-3-(4- metilpiperidin-1-il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila (0,5 g, 1,33 mmol), ácido 5-cianofurano-2-carboxílico (0,22 g, 1,60 mmol), HATU (0,61 g, 1,60 mmol) em DMF (10 mL), adicionou-se DIPEA (0,46 mL, 2,66 mmol). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro e, em seguida, dividida entre EtOAc e salmoura. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter 4-(4-(5- cianofurano-2-carboxamido)-3-(4-metilpiperidin-1-il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila na forma de um sólido amarelo (0,58 g, 88,0% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3)  9,59 (s, 1H), 8,31 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,25 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,21 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 6,79 (s, 1H), 6,72 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 3,58 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 3,10 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 2,99 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 2,72 (t, J = 10,0 Hz, 2H), 1,83 (d, J = 10,0 Hz, 2H), 1,55-1,51 (m, 3H), 1,49 (s, 9H), 1,07 (d, J = 5,0 Hz, 3H).

[0280]4-(4-(4-ciano-1H-pirrol-2-carboxamido)-3-(4-metilpiperidin-1- il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila (7c): À mistura de 4-(4-amino-3-(4- metilpiperidin-1-il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila (0,5 g, 1,33 mmol), ácido 4-ciano-1H-pirrol-2-carboxílico (0,23 g, 1,60 mmol) e HATU (0,61 g, 1,60 mmol) em DMF (10 mL), adicionou-se DIPEA (0,46 mL, 2,66 mmol). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro e, em seguida, dividida entre EtOAc e salmoura. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter 4-(4-(4-

ciano-1H-pirrol-2-carboxamido)-3-(4-metilpiperidin-1-il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila na forma de um sólido amarelo (0,58 g, 88,0% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3)  10,40 (s, 1H), 8,99 (s, 1H), 8,26 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,45 (s, 1H), 6,83 (d, J = 10,0 Hz, 2H), 6,73 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 3,58 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 3,10 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 2,99 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 2,72 (t, J = 10,0 Hz, 2H), 1,83 (d, J = 10,0 Hz, 2H), 1,55-1,51 (m, 3H), 1,49 (s, 9H), 1,07 (d, J = 5,0 Hz, 3H).

[0281]5-ciano-N-(4-(piperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2- carboxamida (1b) (JHU11745): A uma solução de 4-(4-(5-cianofurano-2- carboxamido)-3-(piperidin-1- il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila (0,5 g, 1,04 mmol) em cloreto de metileno (5 mL), adicionou-se ácido trifluoracético (0,39 mL, 5,21 mmol) gota a gota a 0° C, e, em seguida, a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 12 h. Uma vez concluída a reação, a mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter 5-ciano-N-(4- (piperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2-carboxamida na forma de um sólido amarelo pálido (0,3 g, 76,0% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3)  9,54 (s, 1H), 8,31 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,25 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,21 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 6,79 (s, 1H), 6,73 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 3,18 (s, 4H), 3,11 (s, 4H), 2,85 (s, 4H), 2,36 (s, 1H), 1,80 (s, 4H), 1,66 (s, 2H).

[0282]5-ciano-N-(2-(4-metilpiperidin-1-il)-4-(piperazin-1-il)fenil)furano-2- carboxamida (1d) (JHU11735): A uma solução de 4-(4-(5-cianofurano-2- carboxamido)-3-(4-metilpiperidin-1-il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila (0,5 g, 1,01 mmol) em cloreto de metileno (5 mL), adicionou-se ácido trifluoracético (0,37 mL, 5,05 mmol) gota a gota a 0° C, e, em seguida, a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 12 h. Uma vez concluída a reação, a mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter 5-ciano-N-(2-

(4-metilpiperidin-1-il)-4-(piperazin-1-il)fenil)furano-2-carboxamida na forma de um sólido amarelo pálido (0,32 g, 80,4% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3)  9,60 (s, 1H), 8,31 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,25 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,21 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 6,79 (s, 1H), 6,72 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 3,15 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 3,08 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 2,99 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 2,73 (t, J = 10,0 Hz, 2H), 1,84 (d, J = 10,0 Hz, 2H), 1,57 (s, 1H), 1,55-1,51 (m, 3H), 1,07 (d, J = 5,0 Hz, 3H).

[0283]4-ciano-N-(2-(4-metilpiperidin-1-il)-4-(piperazin-1-il)fenil)-1H-pirrol-2- carboxamida (1f) (JHU11762): A uma solução de 4-(4-(4-ciano-1H-pirrol-2- carboxamido)-3-(4-metilpiperidin-1-il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila (0,5 g, 1,02 mmol) em cloreto de metileno (5 mL), adicionou-se ácido trifluoracético (0,37 mL, 5,05 mmol) gota a gota a 0° C, e, em seguida, a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 12 h. Uma vez concluída a reação, a mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter 4-ciano-N-(2- (4-metilpiperidin-1-il)-4-(piperazin-1-il)fenil)-1H-pirrol-2-carboxamida na forma de um sólido branco pálido (0,30 g, 78,4% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz, MeOD)  10,45 (s, 1H), 8,98 (s, 1H), 8,24 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,45 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 10,0 Hz, 2H), 6,72 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 3,15 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 3,08 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 2,99 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 2,73 (t, J = 10,0 Hz, 2H), 1,84 (d, J = 10,0 Hz, 2H), 1,57 (s, 1H), 1,55-1,51 (m, 3H), 1,07 (d, J = 5,0 Hz, 3H).

[0284]5-ciano-N-(4-(4-(2-fluoretil)piperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano- 2-carboxamida (1k) (JHU11763): A uma solução de 5-ciano-N-(4-(piperazin-1-il)-2- (piperidin-1-il)fenil)furano-2-carboxamida (1b) (0,1 g, 0,26 mmol) em acetonitrila (1 mL), adicionaram-se tosilato de 2-fluoretila (0,07 g, 0,31 mmol) e trietilamina (0,053 g, 0,52 mmol). A mistura de reação foi agitada a 90° C de um dia para o outro e, em seguida, dividida entre EtOAc e salmoura. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (Metanol: Diclorometano = 0,5:9,5) para obter 1k na forma de um sólido amarelo pálido (0,06 g, 53,57% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3)  9,53 (s, 1H), 8,31 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,25 (s, 1H), 7,21 (s, 1H), 6,79 (s, 1H), 6,72 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 4,67 (s, 1H), 4,58 (s, 1H), 3,21 (s, 4H), 2,89 - 2,68 (m, 10H), 1,80 (s, 4H), 1,65 (s, 2H).

[0285]4-ciano-N-(4-(4-(2-fluoretil)piperazin-1-il)-2-(4-metilpiperidin-1-il)fenil)- 1H-pirrol-2-carboxamida (1l) (JHU11764): A uma solução de 4-ciano-N-(2-(4- metilpiperidin-1-il)-4-(piperazin-1-il)fenil)-1H-pirrol-2-carboxamida (1f) (0,1 g, 0,25 mmol) em acetonitrila (1 mL), adicionaram-se tosilato de 2-fluoretila (0,066 g, 0,305 mmol) e trietilamina (0,051 g, 0,50 mmol). A mistura de reação foi agitada a 90° C de um dia para o outro e, em seguida, dividida entre EtOAc e salmoura. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (Metanol: Diclorometano = 0,5:9,5) para obter 1l na forma de um sólido amarelo pálido (0,057 g, 51,35% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3)  10,83 (s, 1H), 9,01 (s, 1H), 8,26 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,45 (s, 1H), 6,83 (d, J = 15,7 Hz, 2H), 6,74 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 4,67 (s, 1H), 4,58 (s, 1H), 3,21 (s, 4H), 2,98 (d, J = 11,2 Hz, 2H), 2,84 - 2,67 (m, 8H), 1,85 (d, J = 12,8 Hz, 2H), 1,43-1,26(m, 3H), 1,08 (d, J = 6,4 Hz, 3H).

[0286]N-(4-(4-(2-bromoetil)piperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)-5- cianofurano-2-carboxamida (1m) (JHU11768): A uma solução de 5-ciano-N-(4- (piperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2-carboxamida (1b) (0,01 g, 0,026 mmol) em acetonitrila (1 mL), adicionaram-se 1,2-dibromoetano (0,039 g, 2,10 mmol) e trietilamina (0,0053 g, 0,052 mmol). A mistura de reação foi agitada a 90° C de um dia para o outro e, em seguida, dividida entre EtOAc e salmoura. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (Metanol: Diclorometano = 0,5:9,5) para obter 1m na forma de um sólido amarelo pálido (0,01 g, 83,33% de rendimento). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3)  9,53 (s, 1H), 8,31 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,23 (d, J = 17,5 Hz, 2H), 6,80 (s, 1H), 6,72 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 3,20 (s, 4H), 2,84 (s, 4H), 2,69 (s, 4H), 2,64 (s, 2H), 1,80 (s, 4H), 1,65 (s, 2H).

[0287]Éster terc-butílico de ácido 4-(4-amino-fenil)-3,6-di-hidro-2H-piridina-1- carboxílico (10): Uma solução de 4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]-dioxaborolan-2-il)- fenilamina (4,0 g, 18 mmol), éster terc-butílico de ácido 4-trifluormetanossulfonilóxi- 3,6-di-hidro-2H-piridina-1-carboxílico (7,4 g, 22 mmol) e 2 M de Na2CO3 aquoso (80 mL) em tolueno (160 mL) e EtOH (80 mL) foi colocada sob argônio e aquecida a 80° C durante 3 h. A mistura foi lavada com 1 M de NaOH aquoso, e a camada orgânica foi removida, seca (Na2SO4) e concentrada a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em sílica-gel eluindo com 20% de EtOAc/hexanos para obter 3,2 g (63%) do composto do título na forma de uma espuma amarela. RMN de 1H (CDCl3, 500 MHz): δ 7,18-7,23 (m, 2H, J = 8,4 Hz), 6,64-6,69 (m, 2H, J = 8,6 Hz), 5,90 (br s, 1H), 4,02-4,08 (m, 2H), 3,68 (s, 2H), 3,62 (t, 2H, J = 5,6 Hz), 2,48 (br s, 2H), 1,49 (s, 9H).

[0288]Éster terc-butílico de ácido 4-(4-amino-fenil)-piperidina-1-carboxílico (11): Uma solução de éster terc-butílico 4-(4-amino-fenil)-3,6-di-hidro-2H-piridina-1- carboxílico (0,350 g, 1,28 mmol) em metanol foi hidrogenada sobre Pd/C a 10% a 20 psi durante 1 h. A solução foi filtrada através de terra diatomácea, e o filtrado foi concentrado para obter 0,35 g (100%) do composto do título na forma de um sólido amarelo. RMN de 1H (CDCl3, 500 MHz): δ 6,96-7,01 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 6,62-6,67 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 4,21 (br s, 2H), 3,58 (br s, 2H), 2,77 (t, 2H, J = 12,6 Hz), 2,53 (tt, 1H, J = 12,1, 3,5 Hz), 1,77 (d, 2H, J = 12,3 Hz), 1,52-1,59, (m, 2H), 1,48 (s, 9H).

[0289]Éster terc-butílico de ácido 4-(4-amino-3-bromo-fenil)-piperidina-1- carboxílico (12): A uma solução de éster terc-butílico de 4-(4-amino-fenil)-piperidina- 1-carboxílico (0,20 g, 0,71 mmol) em CH2Cl2 (3 mL), adicionou-se N- bromossuccinimida (NBS) (0,13 g, 0,71 mmol), e a reação foi agitada em temperatura ambiente durante 10 h. A reação foi diluída com EtOAc (10 mL) e lavada com NaHCO3 aquoso saturado (2 × 10 mL) e salmoura (10 mL). A concentração da camada orgânica rendeu 0,26 g (100%) do composto do título na forma de uma espuma amarela. RMN de 1H (CDCl3, 500 MHz): δ 7,27 (d, 1H, J = 2,1 Hz), 6,96 (dd, 1H, J = 8,1, 1,9 Hz), 6,73 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 4,24 (br s, 2H), 4,01 (br s, 2H), 2,78 (t, 2H, J = 12,2 Hz), 2,53 (tt, 1H, J = 12,2, 3,3 Hz), 1,79 (d, 2H, J = 12,6 Hz), 1,52-1,59 (m, 2H), 1,50 (s, 9H).

[0290]Éster terc-butílico de ácido 4-(4-amino-3-cicloex-1-enil-fenil)- piperidina-1-carboxílico (13): Éster terc-butílico de ácido 4-(4-amino-3-bromo-fenil)- piperidina-1-carboxílico (0,13 g, 0,42 mmol), ácido cicloex-1-enil borônico 4 (0,08 g, 0,63 mmol), Pd(dppf)Cl2. DCM (0,034 g, 0,042) e 2 M de Na2CO3 aquoso (1,5 mL) em 1,4-dioxano foram aquecidos a 100° C durante 20 h. A reação foi diluída com EtOAc (10 mL) e lavada com NaHCO3 aquoso saturado (2 × 10 mL) e salmoura (10 mL), e a camada orgânica foi seca sobre Na2SO4 e, em seguida, concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em sílica-gel, 30% de EtOAc/hexano, para obter 0,12 g (85%) do composto do título na forma de um óleo amarelo. RMN de 1H (CDCl3, 500 MHz): δ 6,90 (dd, 1H, J = 8,1, 2,1 Hz), 6,85 (d, 1H, J = 1,9 Hz), 6,67 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 5,76 (dq, 1H, J = 3,5, 1,8 Hz), 4,23 (br s, 2H), 3,71 (s, 2H), 2,79 (t, 2H, J = 12,7 Hz), 2,54 (tt, 1H, J = 12,3, 3,4 Hz), 2,22-2,29 (m, 2H), 2,16-2,22 (m, 2H), 1,62- 1,85 (m, 8H), 1,50 (s, 9H).

[0291]Éster terc-butílico de ácido (4-{[4-ciano-1-(2-trimetilsilanil-etoximetil)- 1H-imidazol-2-carbonil]-amino}-3-cicloex-1-enil-fenil)-piperidina-1-carboxílico (15): A uma solução de sal de potássio de 4-ciano-1-(2-trimetilsilanil-etoximetil)-1H-imidazol- 2-carboxilato (3,34 g, 10,9 mmol) em 20 mL de DMF, adicionaram-se DIPEA (3,80 mL, 21,8 mmol) e HATU (11,02 g, 12,0 mmol), e a reação foi agitada a 25° C durante 15 min. Adicionou-se uma solução de éster terc-butílico de ácido 4-(4-amino-3- cicloex-1-enil-fenil)-piperidina-1-carboxílico (3,92 g, 11,0 mmol) em 10 mL de DMF, e a reação foi agitada durante 12 h a 25° C. A reação foi diluída com EtOAc (60 mL) e lavada com NaHCO3 aquoso saturado (2 × 60 mL) e salmoura (100 mL), e a camada orgânica foi seca sobre Na2SO4 e, em seguida, concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (sílica-gel, 2% de EtOAc/CH2Cl2) para obter 5,5 g (85%) do composto do título na forma de um óleo amarelo. RMN de 1H (CDCl3, 500 MHz): δ 9,68 (s, 1H), 8,25 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 7,78 (s, 1H), 7,12 (dd, 1H, J = 8,6, 2,1 Hz), 7,02 (d, 1H, J = 2,1 Hz), 5,96 (s, 2H), 5,83 (dt, 1H, J = 3,6, 1,9 Hz), 4,25 (br s, 2H), 3,63-3,69 (m, 2H), 2,80 (t, 2H, J = 11,7 Hz), 2,63 (tt, 1H, J = 12,2, 3,5 Hz), 2,27-2,33 (m, 2H), 2,20-2,27 (m, 2H), 1,77-1,87 (m, 6H), 1,56-1,68 (m, 2H), 1,49 (s, 9H), 0,95- 1,00 (m, 2H), 0,01 (s, 9H).

[0292]Sal de ácido trifluoracético de (2-cicloex-1-enil-4-piperidin-4-il-fenil)- amida de ácido 4-ciano-1H-imidazol-2-carboxílico (16): A uma solução de éster terc- butílico de ácido 4-(4-{[4-ciano-1-(2-trimetilsilanil-etoximetil)-1Himidazol-2-carbonil]- amino}-3-cicloex-1-enil-fenil)-piperidina-1-carboxílico 7 (1,50 g, 2,48 mmol) em 10 mL de CH2Cl2, adicionaram-se 3 mL de TFA, e a solução foi agitada durante 20 h a 25° C. A reação foi diluída com 5 mL de EtOH e, em seguida, concentrada. O resíduo foi cristalizado a partir de metanol e éter etílico para obter 0,85 g (70%) do composto do título na forma de um sólido branco. RMN de 1H (CD3OD, 500 MHz): δ 8,18 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 8,04 (s, 1H), 7,22 (dd, 1H, J = 8,6, 2,1 Hz), 7,12 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 5,76 (m, 1H), 3,54 (m, 2H), 3,16 (m, 2H), 2,92 (m, 1H), 2,30 (m, 4H), 2,10 (m, 2H), 1,87 (m, 6H).

[0293]{2-cicloex-1-enil-4-[1-(2-dimetilamino-acetil)-piperidin-4-il]-fenil}-amida de ácido 4-ciano-1H-imidazol-2-carboxílico (1g) (JHU11759): A uma suspensão de sal de ácido trifluoracético de (2-cicloex-1-enil-4-piperidin-4-il-fenil)-amida de ácido 4- ciano-1H-imidazol-2-carboxílico (0,655 g, 1,34 mmol) em DMF (15 mL), adicionaram- se HATU (0,61 g, 1,60 mmol) e DIPEA (0,932 mL, 5,35 mmol), e a mistura de reação foi agitada durante 15 min. Em seguida, adicionou-se dimetilglicina (0,15 g, 1,47 mmol). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro e, em seguida, dividida entre EtOAc e salmoura. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter o composto do título na forma de um sólido branco. RMN de 1H (CDCl3, 500 MHz): δ 9,49 (s, 1H), 8,24 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 7,70 (s, 1H), 7,12 (dd, 1H, J = 8,4, 2,1 Hz), 7,01 (d, 1H, J = 2,1 Hz), 5,82 (m, 1H), 4,75 (d, 1H, J = 13,4 Hz), 4,13 (d, 1H, J = 13,4 Hz), 3,57 (d, 1H, J = 14,2 Hz), 3,18 (d, 1H, J = 14,2 Hz), 3,12 (td, 1H, J = 13,3, 2,4 Hz), 2,73 (dddd, 1H, J = 11,9, 11,9, 3,8, 3,8 Hz), 2,65 (ddd, 1H, J = 13,3, 13,3, 2,4 Hz), 2,40 (s, 6H), 2,18-2,32 (m, 4H), 1,60-1,98 (m, 9H).

[0294]((4-(6-(4-ciano-1H-imidazol-2-carboxamido)-2',3',4',5'-tetraidro-[1,1'- bifenil]-3-il)piperidin-1-il)metil)(metil)carbamato de terc-butila (17): A uma suspensão de sal de ácido trifluoracético de (2-cicloex-1-enil-4-piperidin-4-il-fenil)-amida de ácido 4-ciano-1H-imidazol-2-carboxílico (0,15 g, 0,30 mmol) em DMF (15 mL), adicionaram-se HATU (0,14 g, 0,36 mmol) e DIPEA (0,212 mL, 1,22 mmol), e a mistura de reação foi agitada durante 15 min. Em seguida, adicionou-se N-(terc- butoxicarbonil)-N-metilglicina (0,063 g, 0,33 mmol). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro e, em seguida, dividida entre EtOAc e salmoura. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter o composto do título na forma de um sólido branco. RMN de 1H (CDCl3, 500 MHz): δ 12,57 (s, 1H), 9,53 (s, 1H), 8,27 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,75 (s, 1H), 7,15-7,04 (m, 2H), 5,86 (s, 1H), 4,80 (s, 1H), 4,24-3,95 (m, 3H), 3,18 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 2,95 (s, 3H), 2,74-2,61 (m, 2H), 2,32-2,25 (m, 4H), 1,85-1,73 (m, 6H), 1,49 (s, 9H).

[0295]4-ciano-N-(5-(1-(metilglicil)piperidin-4-il)-2',3',4',5'-tetraidro-[1,1'- bifenil]-2-il)-1H-imidazol-2-carboxamida (1h) (JHU11760): A uma solução de ((4-(6-

(4-ciano-1H-imidazol-2-carboxamido)-2',3',4',5'-tetraidro-[1,1'-bifenil]-3-il)piperidin-1- il)metil)(metil)carbamato de terc-butila (0,1 g, 0,18 mmol) em cloreto de metileno (5 mL), adicionou-se ácido trifluoracético (0,056 mL, 0,73 mmol) gota a gota a 0° C, e, em seguida, a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 12 h. Uma vez concluída a reação, a mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2: MeOH = 9:1) para obter 4-ciano-N-(5-(1-(metilglicil)piperidin-4-il)-2',3',4',5'-tetraidro- [1,1'-bifenil]-2-il)-1H-imidazol-2-carboxamida na forma de um sólido amarelo pálido (0,04 g, 46,0% de rendimento). RMN de 1H (CDCl3, 500 MHz): δ 9,51 (s, 1H), 8,14 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,65 (s, 1H), 6,97-6,85 (m, 2H), 5,76 (s, 1H), 4,73 (d, J = 10,0, 1H), 4,00-3,66 (m, 3H), 3,14 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 2,71-2,67 (m, 6H), 2,24 (d, J = 5,0, 3H), 2,17-2,15 (m, 1H), 1,87-1,74 (s, 8H). EXEMPLO 3 AFINIDADE DE LIGAÇÃO DOS DERIVADOS DE CSF1R 1a, 1c, 1e, 1g-1l

R N

H N R2

O N

N R1 Nome do R R1 R2 IC50, nM IC50, KD, composto Illig et al., nM* nM** 2008 1a H CH3 0,8 4,1 8,2 JHU11744 1c CH3 CH3 1 1,9 2,5 JHU11734 1e CH3 CH3 0,8 3,94 0,54 JHU11761

Nome do R R1 R2 IC50, nM IC50, KD, composto Illig et al., nM* nM** 2008 1g H CH3 >1.00 JHU11765 0 1h H CH3 >1.00 JHU11766 0 1i H CH3 30 JHU11767 1k H -CH2CH2F 12,9 32 JHU11763 1l CH3 -CH2CH2F 3,14 2,6 JHU11764 *RTK Quinase Humana do CSF1R. Ensaio Radiométrico Enzimático, Eurofins, ensaio comercial; ** Ensaio de ligação e competição do CSF1R, KinomeScan, DiscoverX, ensaio comercial

REFERÊNCIAS

[0296]Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências mencionados no relatório descritivo são indicativos do nível dos versados na técnica a que pertence a matéria inventiva revelada neste documento. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências (por exemplo, sites, bases de dados etc.) mencionados no relatório descritivo incorporam-se ao presente documento por referência na íntegra na mesma medida como se cada publicação, pedido de patente, patente e outra referência fosse indicado específica e individualmente como incorporado por referência. Entender-se-á que, embora faça- se alusão a diversos pedidos de patente, patentes e outras referências neste documento, tal alusão não constitui a admissão de que nenhum desses documentos constitui parte do conhecimento geral comum na técnica. Em caso de conflito entre o relatório descritivo e qualquer uma das referências incorporadas, o relatório descritivo (incluindo quaisquer emendas ao mesmo, que podem basear-se em uma referência incorporada) prevalecerá. Os significados padrão aceitos na técnica dos termos são usados neste documento, salvo indicação em contrário. Abreviações padrão para vários termos são usadas neste documento.

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[0346]Embora tenha-se descrito a matéria inventiva acima em alguns detalhes à guisa de ilustração e exemplo para fins de clareza da compreensão, os versados na técnica perceberão que certas mudanças e modificações podem ser praticadas dentro do âmbito das reivindicações apensas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Agente de imagiologia para gerar imagens do receptor do fator estimulante de colônias de macrófagos 1 (CSF1R) em um paciente acometido ou suspeito de ter sido acometido por uma ou mais doenças ou condições neuroinflamatórias ou neurodegenerativas, o agente de imagiologia sendo CARACTERIZADO por compreender um composto de fórmula (I): (I); em que: cada um de X, Y e Z é selecionado independentemente dentre o grupo composto por -N- e -CR5-, em que R5 é selecionado dentre o grupo composto por H, alquila C1-C8 substituída ou não substituída ou R*, em que R* é um grupamento que compreende um radioisótopo adequado à imagiologia por tomografia por emissão de pósitrons (PET) ou é o próprio radioisótopo; R1 é selecionado dentre o grupo composto por heteroalquila substituída ou não substituída, heteroarila substituída ou não substituída, alcoxila C1-C8, alquilamino C1-C8, dialquilamino C1-C8, -N(alquil C1-C8)(SO2)(alquila C1-C8), em que R1 pode ser opcionalmente substituído com R* ou R1 pode ser um radioisótopo adequado à imagiologia PET; R2 é heteroalquila substituída ou não substituída, em que R2 pode ser opcionalmente substituído com R*; R3 é heteroarila substituída ou não substituída, em que R3 pode ser opcionalmente substituído com R*; e R4 é selecionado dentre o grupo composto por H, alquila C1-C8 substituída ou não substituída, alcoxila C1-C8, cicloalquila, cicloeteroalquila, arila e heteroarila; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; em que ao menos um de R1, R2, R3 ou R5 é substituído com R* ou é um radioisótopo adequado à imagiologia PET.

2. Agente de imagiologia, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 é selecionado dentre o grupo composto por piperazinila substituída ou não substituída, morfolinila substituída ou não substituída, 1,1-dióxido-tiomorfolinila, pirazolila substituída ou não substituída, imidazolila substituída ou não substituída, alcoxila C1-C8, alquilamino C1-C8, dialquilamino C1- C8, -N(alquil C1-C8)(SO2)(alquila C1-C8), em que R1 pode ser opcionalmente substituído com R* ou R1 pode ser um radioisótopo adequado à imagiologia PET.

3. Agente de imagiologia, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que R2 é selecionado dentre o grupo composto por piperidinila substituída ou não substituída e morfolinila substituída ou não substituída, em que R2 pode ser opcionalmente substituído com R*.

4. Agente de imagiologia, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que R3 é selecionado dentre o grupo composto por pirrolila substituída ou não substituída e furanila substituída ou não substituída, em que R3 pode ser opcionalmente substituído com R*.

5. Agente de imagiologia, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por ser selecionado dentre o grupo composto por: (R*)p (R*)p

O

N N (R11 )q (R11 )r , , , , e R*; em que: p é um número inteiro selecionado dentre 0 e 1; q é um número inteiro selecionado dentre o grupo composto por 0, 1, 2, 3, 4 e 5;

r é um número inteiro selecionado dentre o grupo composto por 0, 1, 2, 3 e 4; R11 é selecionado dentre o grupo composto por alquila C1-C8 substituída ou não substituída, alcoxila C1-C8, hidroxila, amino, ciano, halogênio, carboxila e -CF3; e R12 é selecionado dentre o grupo composto por H, alquila C1-C8 substituída ou não substituída, carboxila, -(SO2)-(alquila C1-C8) e R*.

6. Agente de imagiologia, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que R2 é selecionado dentre o grupo composto por: (R*)p (R*)p

O

7. Agente de imagiologia, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que R3 é selecionado dentre o grupo composto por: (R*)p (R11 )r , , e N ; em que: p é um número inteiro selecionado dentre o grupo composto por 0 e 1; R11 é selecionado dentre o grupo composto por alquila C1-C8 substituída ou não substituída, alcoxila C1-C8, hidroxila, amino, ciano, halogênio, carboxila e -CF3; e

R12 é selecionado dentre o grupo composto por H, alquila C1-C8 substituída ou não substituída, carboxila, -(SO2)-(alquila C1-C8) e R*.

8. Agente de imagiologia, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que: (a) cada um de X, Y e Z é -CR5-; (b) cada um de X e Z é -N-, e Y é -CR5-; (c) X é -N-, e cada um de Y, e Z é -CR5-; (d) X e Y são N, e Z é -CR5-; (e) cada um de X e Y é -CR5-, e Z é N; em que R5, ao menos em uma ocorrência, pode ser opcionalmente substituído com R*.

9. Agente de imagiologia, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto de fórmula (I) é um composto de fórmula (Ia): (Ia); em que: R6 é selecionado dentre o grupo composto por H, alquila C1-C8, -C(=O)-O-R9 e -(CH2)n-R10, em que n é um número inteiro selecionado dentre 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8; cada um de R9 e R10 é alquila C1-C8 de cadeia linear ou ramificada, e em que R6 pode ser opcionalmente substituído com R* ou R6 pode ser R*; R7 é selecionado dentre o grupo composto por H ou alquila C1-C8, em que R7 pode ser opcionalmente substituído com R* ou R7 pode ser R*; e

R8 é pirrolila substituída ou não substituída, furanila e piridinila, em que R8 pode ser opcionalmente substituído com R*; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; em que ao menos um de R6, R7 ou R8 é substituído com R* ou é R*.

10. Agente de imagiologia, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que: R6 é selecionado dentre o grupo composto por hidrogênio, metila, etila, n- propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, n-pentila, sec-pentila, isopentila, neopentila, n-hexila, sec-hexila, n-heptila, n-octila e -C(=O)-O-(alquila C1- C8)3; R7 é selecionado dentre o grupo composto por hidrogênio, metila, etila, n- propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, n-pentila, sec-pentila, isopentila, neopentila, n-hexila, sec-hexila, n-heptila, n-octila; R8 é selecionado dentre o grupo composto por (R*)p (R11 )r , , e N ; em que: p é um número inteiro selecionado dentre o grupo composto por 0 e 1; R11 é selecionado dentre o grupo composto por alquila C1-C8 substituída ou não substituída, alcoxila C1-C8, hidroxila, amino, ciano, halogênio, carboxila e -CF3; e R12 é selecionado dentre o grupo composto por H, alquila C1-C8 substituída ou não substituída, carboxila, -(SO2)-(alquila C1-C8) e R*; e em que cada um de R6, R7 e R8 pode ser opcionalmente substituído com R*.

11. Agente de imagiologia, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO por ser selecionado dentre o grupo composto por: 5-ciano-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2- carboxamida (1a);

5-ciano-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(4-metilpiperidin-1-il)fenil)furano-2- carboxamida (1c); 4-ciano-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(4-metilpiperidin-1-il)fenil)-1H-pirrol-2- carboxamida (1e); 4-ciano-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2- carboxamida (1g); 5-ciano-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-3- carboxamida (1h); 6-flúor-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)picolinamida (1i); 6-bromo-N-(4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)picolinamida (1i); 4-(4-(5-cianofurano-2-carboxamido)-3-(piperidin-1-il)fenil)piperazina-1- carboxilato de terc-butila (7a); 4-(4-(5-cianofurano-2-carboxamido)-3-(4-metilpiperidin-1-il)fenil)piperazina-1- carboxilato de terc-butila (7b); 4-(4-(4-ciano-1H-pirrol-2-carboxamido)-3-(4-metilpiperidin-1- il)fenil)piperazina-1-carboxilato de terc-butila (7c); 5-ciano-N-(4-(piperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2-carboxamida (1b); 5-ciano-N-(2-(4-metilpiperidin-1-il)-4-(piperazin-1-il)fenil)furano-2- carboxamida (1d); 4-ciano-N-(2-(4-metilpiperidin-1-il)-4-(piperazin-1-il)fenil)-1H-pirrol-2- carboxamida (1f); 5-ciano-N-(4-(4-(2-fluoretil)piperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)furano-2- carboxamida (1k); 4-ciano-N-(4-(4-(2-fluoretil)piperazin-1-il)-2-(4-metilpiperidin-1-il)fenil)-1H- pirrol-2-carboxamida (1l); N-(4-(4-(2-bromoetil)piperazin-1-il)-2-(piperidin-1-il)fenil)-5-cianofurano-2- carboxamida (1m);

{2-cicloex-1-enil-4-[1-(2-dimetilamino-acetil)-piperidin-4il]-fenil}-amida de ácido 4-ciano-1H-imidazol-2-carboxílico (1g); e 4-ciano-N-(5-(1-(metilglicil)piperidin-4-il)-2',3',4',5'-tetraidro-[1,1'-bifenil]-2-il)- 1H-imidazol-2-carboxamida (1h).

12. Agente de imagiologia, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que R* é selecionado dentre o grupo composto por 11C, 18F e -(CH2)m-R13, em que R13 é alquila C1-C8 de cadeia linear ou ramificada, que pode ser opcionalmente substituída com um radioisótopo adequado à imagiologia PET.

13. Agente de imagiologia, de acordo com as reivindicações de 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o radioisótopo adequado à imagiologia PET é selecionado dentre o grupo composto por 11C e 18F.

14. Agente de imagiologia, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto de fórmula (I) é: .

15. Método para gerar imagens do receptor do fator estimulante de colônias de macrófagos 1 (CSF1R) em um paciente acometido ou suspeito de ter sido acometido por uma ou mais doenças ou condições neuroinflamatórias ou neurodegenerativas, o método sendo CARACTERIZADO por compreender administrar ao paciente uma quantidade eficaz de um agente de imagiologia, de acordo com as reivindicações de 1 a 14, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e gerar uma imagem PET.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença ou condição neuroinflamatória ou neurodegenerativa é selecionada dentre o grupo composto por doença de Alzheimer (AD), esclerose múltipla (MS), uma lesão cerebral traumática, um tumor cerebral, disfunção cognitiva associada ao HIV e uma ou mais doenças desmielinizantes.