BR112020026314A2 - Novos compostos - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a compostos, composições, combinações e medicamentos contendo os ditos compostos e processos para sua preparação. a invenção também se refere ao uso dos ditos compostos, combinações, composições e medicamentos, por exemplo, como moduladores de alfa-1-antitripsina e tratamento de doenças associadas com alfa-1-antitripsina, particularmente doenças hepáticas.

Description

“NOVOS COMPOSTOS” CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a compostos, composições, combinações e medicamentos contendo os ditos compostos e processos para sua preparação. A invenção também se refere ao uso dos ditos compostos, combinações, composições e medicamentos, por exemplo, no tratamento de doenças e condições associadas com alfa-1-antitripsina.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Muitos distúrbios genéticos humanos são causados por mutações que prejudicam o dobramento e o tráfico de proteínas. As proteínas podem ser produzidas em quantidades normais, mas, devido ao seu dobramento deficiente, podem causar problemas.

[003] Alfa-1-antitripsina ou α-1-antitripsina (A1AT) é um inibidor de protease pertencente à superfamília das serpinas. É uma proteína produzida nos hepatócitos e, em menor grau, em outras células, e secretada no sangue, onde atua limitando a atividade enzimática de proteases-chave, em particular a elastase de neutrófilos. Na sua ausência (como na deficiência de alfa-1-antitripsina), a atividade das principais proteases, incluindo a elastase de neutrófilos, é desmarcada, resultando na quebra excessiva da elastina e dos tecidos conjuntivos. O tecido mais comum em que isso se manifesta patologicamente é no pulmão, onde a degradação aumentada do tecido conjuntivo pulmonar comumente resulta em complicações respiratórias, como enfisema ou doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Mais raramente, outros tecidos também podem ser afetados por uma deficiência/disfunção de A1AT, como a pele.

[004] Em muitos pacientes, a deficiência de alfa-1-antitripsina é causada por mutações, incluindo, por exemplo, uma mutação missense E342K (Glu342Lys) aqui denominada como o mutante Z (Z-AT). Z alfa-1-antitripsina mutante forma polímeros que se acumulam nas células e podem perturbar a função do tecido afetado. O órgão mais comumente afetado pelo acúmulo de polímero na deficiência de alfa-1- antitripsina é o fígado, causando danos ao fígado e, em casos graves, evoluindo para a necessidade de transplante de fígado. Os polímeros de A1AT também são encontrados em outros tecidos, incluindo sangue, pulmões e pele. Os polímeros demonstraram ser pró-inflamatórios e podem contribuir para a patologia nos tecidos onde são encontrados, particularmente no pulmão e na pele.

[005] A terapia atual para condições associadas à deficiência de alfa-1- antitripsina é limitada à terapia de substituição de proteína com M-AT (proteína alfa- 1-antitripsina do tipo selvagem) derivada de plasma humano, tipicamente dosada semanalmente. Embora tal terapia seja eficaz para patologia pulmonar, incluindo enfisema, não tem efeito sobre doenças hepáticas causadas pelo acúmulo de Z-AT polimerizado no RE dos hepatócitos. Para 10 a 15 % dos homozigotos para doença hepática afetada por Z-AT, incluindo fibrose, cirrose e carcinoma hepatocelular, o transplante de fígado é a única opção de tratamento disponível. Além disso, o acúmulo de Z-AT polimerizado no epitélio pulmonar tem um efeito quimioatraente em neurófilos, o que pode causar destruição adicional do tecido conjuntivo pulmonar. Assim, há uma necessidade de terapêuticas e métodos que abordem as condições de doença associadas tanto à deficiência de alfa-1-antitripsina quanto ao acúmulo tóxico de alfa-1-antitripsina.

[006] Os presentes inventores identificaram compostos que são capazes de modular a alfa-1-antitripsina, particularmente a forma Z-AT mutante, evitando sua polimerização no fígado, sendo, portanto, potencialmente útil no tratamento de doenças associadas à alfa-1-antitripsina, mais particularmente com formas mutantes de alfa-1-antitripsina, particularmente Z-AT, incluindo doenças do fígado.

[007] Os presentes inventores identificaram, em particular, compostos que são capazes de se ligar a α-1-antitripsina de modo a prevenir a polimerização da proteína e, assim, dar origem a efeitos terapêuticos benéficos. Embora as proteínas de α-1-antitripsina tenham sido previamente cristalizadas e sua estrutura tridimensional estudada, o sítio de ligação dos compostos identificados pelos inventores não foi previamente identificado. Como discutido em mais detalhes aqui, é um sítio de ligação críptico formado por meio da interação entre a proteína e os presentes compostos, cuja localização e estrutura específicas dão origem à inibição benéfica da polimerização de proteínas. Os presentes inventores, além disso, identificaram motivos estruturais específicos que contribuem para a criação do sítio de ligação críptico relevante e ligação dos compostos nele. Assim, a presente invenção, portanto, aborda uma necessidade de longa data para o fornecimento de compostos que são capazes de tratar doenças ou condições mediadas pela polimerização de α-1-antitripsina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma substância para o uso em um método para tratamento de uma doença ou condição mediada pela polimerização de α-1-antitripsina, em que a dita substância é: (a) um composto que é capaz de inibir polimerização de α-1-antitripsina; ou (b) um solvato farmaceuticamente aceitável, complexo, tautômero, isotopicamente rotulado derivado ou pró-fármaco do mesmo. De preferência, a doença ou condição é mediada pela polimerização de Z-α- 1-antitripsina e o composto é capaz de inibir polimerização de Z-α-1-antitripsina. A substância é tipicamente um composto de molécula pequena, por exemplo, um composto que tem um peso molecular de 1.000 Daltons ou menos.

[009] De preferência, o composto é capaz de se ligar a α-1-antitripsina induzindo formação de um sítio de ligação críptico dentro da estrutura de proteína de α-1-antitripsina, a dita α-1-antitripsina compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 1. Por exemplo, o sítio de ligação pode ser localizado entre β-folha-A e β-folha-B da dita α-1-antitripsina, em que: a dita β-folha-A compreende os aminoácidos correspondentes aos resíduos 140 - 144, 111 - 121, 181 - 191, 330 - 340 e 292 - 299 de SEQ ID NO: 1; e a dita β-folha-B compreende os aminoácidos correspondentes aos resíduos 228 - 231, 236 - 244, 248 - 256, 369 - 376, 381 - 389, e 49 - 53 de SEQ ID NO: 1. Mais preferencialmente, o sítio de ligação está localizado entre as cadeias de aminoácido correspondentes a cada um de: (a) resíduos 191 - 194 de SEQ ID NO: 1; (b) resíduos 288 - 293 de SEQ ID NO: 1; (c) resíduos 371 - 374 de SEQ ID NO: 1; (d) resíduos 249 - 253 de SEQ ID NO: 1; e (e) resíduos 240 - 243 de SEQ ID NO: 1; e opcionalmente também (f) resíduos 338 - 341 de SEQ ID NO: 1. O sítio de ligação pode compreender um ou mais de W194, Y244, L291, P289, F252, K290, I293, L338, I340, F372 e M374 de SEQ ID NO: 1.

[010] De preferência, o KD do composto para M-α-1-antitripsina é menor do que cerca de 250 nM, a dita M-α-1-antitripsina compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 2. De preferência, o KD do composto para Z-α-1-antitripsina é menor do que cerca de 25 nM, a dita Z-α-1-antitripsina compreendendo a sequência de SEQ ID NO:

3. De preferência, o KD do composto para Z-α-1-antitripsina é pelo menos dez vezes menor do que o KD do composto para M-α-1-antitripsina, a dita M-α-1-antitripsina compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 2 e a dita Z-α-1-antitripsina compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 3.

[011] O composto pode compreender uma porção tetravalente da Fórmula (IA)

I HO H II H (IA) N

O III ; em que o composto é capaz de se ligar a α-1-antitripsina compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 1 pela formação de ligação de hidrogênio entre: (i) grupo hidroxila I e L291 de SEQ ID NO: 1; (ii) grupo NH II e P289 de SEQ ID NO: 1; e (iii)

grupo carbonila III e Y244 de SEQ ID NO: 1. Por exemplo, o composto pode compreender uma porção divalente da Fórmula (IB) ; em que: o composto é capaz de se ligar a α-1-antitripsina compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 1 pela formação de ligação de hidrogênio entre: (i) grupo hidroxila I e L291 de SEQ ID NO: 1; (ii) grupo NH II e P289 de SEQ ID NO: 1; e (iii) grupo carbonila III e Y244 de SEQ ID NO: 1; R4 é selecionado a partir de hidrogênio, alquila C1-5, alquenila C2-5, alquinila C2-5 e alcóxi C1-4; e R5 é selecionado a partir de hidrogênio, alquila C1-5, alquenila C2-5, alquinila C2-5 e alcóxi C1-4. Opcionalmente, R5 é hidrogênio. Opcionalmente, R4 é alquila C2-4, alquenila C2-4, alquinila C2-4 ou alcóxi C1-3. Opcionalmente, R4 é n-propila.

[012] Mais especificamente, o composto pode compreender uma porção monovalente da Fórmula (IC) ; em que: o composto é capaz de se ligar a α-1-antitripsina compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 1 pela formação de ligação de hidrogênio entre: (i) grupo hidroxila I e L291 de SEQ ID NO: 1; (ii) grupo NH II e P289 de SEQ ID NO: 1; e (iii) grupo carbonila III e Y244 de SEQ ID NO: 1; R4 e R5 são conforme definidos acima; e R6 é um grupo arila ou heteroarila substituído ou não substituído capaz de empilhar com a cadeia lateral de W194 de SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, R6 é um grupo 4- oxidonlila substituído ou não substituído. Por exemplo, opcionalmente R6 é um grupo da Fórmula R6′ ; em que R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, F, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH(CH3)2, NH2, NHCH3, N(CH3)2, OH, Cl, Br e I. Opcionalmente, R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, F, CH3, NH2, OH e Cl. Por exemplo, opcionalmente R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em H e F.

[013] Ainda mais especificamente, o composto pode ter a Fórmula (ID) ; em que: o composto é capaz de se ligar a α-1-antitripsina compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 1 pela formação de ligação de hidrogênio entre: (i) grupo hidroxila I e L291 de SEQ ID NO: 1; (ii) grupo NH II e P289 de SEQ ID NO: 1; e (iii) grupo carbonila III e Y244 de SEQ ID NO: 1; R4 e R5 são conforme definidos acima; R6 é conforme definido acima; e R7 é um grupo arila ou heteroarila substituído ou não substituído.

[014] Opcionalmente, R7 é um grupo fenila substituído ou não substituído. Por exemplo, opcionalmente R7 é um grupo da Fórmula R7′

; em que: R2 é selecionado a partir do grupo que consiste em CH3, Cl, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH(CH3)2, NH2, NHCH3, N(CH3)2, OH, SH, CN, F, Br e I; e R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em F, Cl, CN, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH(CH3)2, NH2, NHCH3, N(CH3)2, OH, Br, I e SH. Opcionalmente, R2 é selecionado a partir do grupo que consiste em CH3, Cl, NH2, OH, SH, CN e F; e R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em F, Cl, CN, CH3, NH2, OH e SH. Por exemplo, opcionalmente R2 é selecionado a partir do grupo que consiste em CH3 e Cl; e R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em F, Cl e CN.

[015] Por exemplo, o composto pode ter a Fórmula (I) (I); em que: R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, F, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH(CH3)2, NH2, NHCH3, N(CH3)2, OH, Cl, Br e I; R2 é selecionado a partir do grupo que consiste em CH3, Cl, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH(CH3)2, NH2, NHCH3, N(CH3)2, OH, SH, CN, F, Br e I; e R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em F, Cl, CN, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH(CH3)2, NH2, NHCH3, N(CH3)2, OH, Br, I e SH.

[016] Opcionalmente, na Fórmula (I): R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, F, CH3, NH2, OH e Cl; R2 é selecionado a partir do grupo que consiste em CH3, Cl, NH2, OH, SH, CN e F; e R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em F, Cl, CN, CH3, NH2, OH e SH. Por exemplo, opcionalmente: R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em H e F; R2 é selecionado a partir do grupo que consiste em CH3 e Cl; e R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em F, Cl e CN. Por exemplo, opcionalmente: R1 é H, R2 é CH3 e R3 é F; ou R1 é H, R2 é CH3 e R3 é Cl; ou R1 é F, R2 é Cl e R3 é CN; ou R1 é F, R2 é Cl e R3 é F.

[017] A presente invenção também fornece uma substância conforme definida acima. Além disso, a presente invenção fornece um método para identificar um composto candidato a fármaco, o método compreendendo: contatar o composto candidato a fármaco com α-1-antitripsina compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 1 para formar um complexo entre o composto candidato a fármaco e a dita α-1- antitripsina; resolver a estrutura do complexo; e determinar se, no complexo, o composto candidato a fármaco está presente em um sítio de ligação conforme definido acima.

[018] Em ainda outros aspectos, a presente invenção fornece as seguintes modalidades [1] a [11].

[1] um composto que: (a) tem a Fórmula (I): (I) em que: R1 é H, R2 é CH3 e R3 é F; ou R1 é H, R2 é CH3 e R3 é Cl; ou R1 é F, R2 é Cl e R3 é CN; ou R1 é F, R2 é Cl e R3 é F; ou (b) é um solvato farmaceuticamente aceitável, complexo, tautômero, derivado marcado isotopicamente ou pró-fármaco do mesmo.

[2] Um composto conforme definido em [1] para o uso em terapia.

[3] Um composto conforme definido em [1] para o uso no tratamento de uma doença ou condição mediada pela alfa-1-antitripsina.

[4] Uma composição farmacêutica compreendendo um composto conforme definido em [1] e um ou mais de portadores, diluentes e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[5] Um método de tratar uma doença ou condição mediada pela alfa-1- antitripsina em um sujeito compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto conforme definido em [1].

[6] Uso de um composto conforme definido em [1], na fabricação de um medicamento para o uso no tratamento de uma doença ou condição mediada pela alfa-1-antitripsina.

[7] Uma combinação compreendendo um composto conforme definido em [1], e pelo menos um agente terapêutico adicional.

[8] Uma combinação compreendendo um composto conforme definido em [1] e pelo menos um agente terapêutico adicional para o uso em terapia, particularmente para tratar uma doença ou condição mediada pela alfa-1-antitripsina.

[9] Uma combinação compreendendo um composto conforme definido em [1] e pelo menos um agente terapêutico adicional para o uso no tratamento de uma doença ou condição mediada pela alfa-1-antitripsina.

[10] Um método de tratar uma doença ou condição mediada pela alfa-1- antitripsina compreendendo administrar a um ser humano em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma combinação compreendendo um composto conforme definido em [1], e pelo menos um agente terapêutico adicional.

[11] Uso de uma combinação compreendendo um composto conforme definido em [1] e pelo menos um agente terapêutico adicional na fabricação de um medicamento para tratar uma doença ou condição mediada pela alfa-1-antitripsina.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[019] A Figura 1 é uma imagem representativa do complexo cristalizado formado entre um complexo representativo da presente invenção e uma proteína de α-1-antitripsina, como descrito em mais detalhes no exemplo 2.

[020] A Figura 2 é uma imagem representativa de uma porção do complexo cristalizado formado entre um complexo representativo da presente invenção e uma proteína de α-1-antitripsina, como descrito em mais detalhes no exemplo 2 (especificamente a porção contém o sítio de ligação entre a proteína e o composto da invenção).

[021] A Figura 3 é uma visualização esquemática bidimensional de um complexo representativo da presente invenção no sítio de ligação da proteína, e destacando alguns dos resíduos de aminoácido que compreendem o sítio de ligação bem como estruturas químicas parciais dentro da proteína que formam interações intermoleculares significativas (por exemplo, ligações de hidrogênio) com o composto (mostrado como linhas tracejadas), como descrito em mais detalhes no exemplo 2.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições

[022] Conforme usado aqui, um grupo alquila é um radical hidrocarboneto saturado linear ou ramificado. Em um exemplo um grupo alquila contém 1 a 5 átomos de carbono. Exemplos de grupos alquila incluem metila, etila, n-propila, iso-propila, n- butila, sec-butila, terc-butila, n-pentila, isopentila e neopentila.

[023] Conforme usado aqui, um grupo alquenila é um radical hidrocarboneto linear ou ramificado que contém uma ou mais (por exemplo, uma) ligações duplas carbono carbono. Em um exemplo um grupo alquenila contém 2 a 5 átomos de carbono.

[024] Conforme usado aqui, um grupo alquenila é um radical hidrocarboneto linear ou ramificado que contém uma ou mais (por exemplo, uma) ligações triplas carbono carbono. Em um exemplo um grupo alquinila contém 2 a 5 átomos de carbono.

[025] Conforme usado aqui, um grupo alcóxi (por exemplo, um grupo alcóxi C1-4) é um grupo da Fórmula -OR em que R é um grupo alquila (por exemplo, uma alquila C1-4).

[026] Conforme usado aqui, um grupo alquiltiol (por exemplo, um grupo alquiltiol C1-4) é um grupo da Fórmula -SR em que R é um grupo alquila (por exemplo, uma alquila C1-4).

[027] Conforme usado aqui, um grupo arila é tipicamente um anel aromático mono-carbocíclico C6-14 ou sistema de anel poli-carbocíclico, em que pelo menos um dos anéis nele é aromático. De preferência, um tal grupo é um anel aromático mono- carbocíclico C6-10 ou sistema de anel bi-carbocíclico, em que pelo menos um dos anéis nele é aromático. Exemplos incluem fenila, naftila, e indanila. A menos que expressamente indicado de outro modo, valência pode ser localizada em qualquer átomo de qualquer anel do grupo arila.

[028] Conforme usado aqui, um grupo heteroarila é tipicamente um sistema de anel aromático monocíclico ou anel policíclico contendo de 5 a 14 átomos de anel, em que pelo menos um dos anéis nele é aromático. O grupo heteroarila contém pelo menos um (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) anel heteroátomo selecionado a partir de O, S, N (por exemplo, formando pelo menos uma porção do anel O, S(O)x (em que x é 0, 1 ou 2), N, NH ou N+O-), com os outros átomos do anel sendo átomos de carbono. De preferência, um tal grupo contém de 5 a 10 átomos do anel. A menos que expressamente indicado de outro modo, a valência pode ser localizada em qualquer átomo de qualquer anel do grupo heteroarila.

[029] Exemplos de monocíclico grupos heteroarila incluem grupos tienila, furila, pirrolila, imidazolila, tiazolila, isotiazolila, pirazolila, oxazolila, isoxazolila, triazolila, tiadiazolila, oxadiazolila, piridinila, piridazinila, pirimidinila, pirazinila, triazinila e tetrazolila.

[030] Exemplos de grupos heteroarila policíclicos incluem grupos oxindolila, benzotienila, benzofuranila, benzimidazolila, benzotiazolila, benzisotiazolila, benzoxazolila, benzisoxazolila, benztriazolila, indolila, isoindolila e indazolila.

Oxindolila inclui 2-oxindolila (isto é, um grupo monovalente derivado de 2-oxindola, também conhecido como 2-Indolinona) e 3-oxindolila (isto é, um grupo monovalente derivado de 3-oxindola, também conhecido como 3-Indolinona).

[031] Em um grupo arila ou grupo heteroarila, pelo menos um (por exemplo, 1, 2 ou 3) átomo do anel de carbono pode ser substituído por um grupo carbonila (isto é, -C(O)-). Por exemplo, uma benzoxazolila pode opcionalmente compreender -C(O)- no lugar de carbono em sua 2-posição, desse modo dando origem a um grupo heteroarila monovalente derivado de benzoxazolona.

[032] A menos que de outro modo especificado, um grupo heteroarila ou arila é tipicamente não substituído. Entretanto, onde um tal grupo é indicado para ser não substituído ou substituído, um ou mais átomos de hidrogênio são opcionalmente substituídos por átomos de deutério, átomos de halogênio ou hidroxila, tiol (-SH), nitro, ácido sulfônico, nitrila (-CN), amino (por exemplo, -NR2 onde cada R é independentemente selecionado a partir de H e alquila C1-5), alquila (por exemplo, alquila C1-5), alquila deuterada (por exemplo, alquila deuterada C1-5), alquenila (por exemplo, alquenila C2-5), alquinila (por exemplo, alquinila C2-5), haloalquila (por exemplo, haloalquila C1-5), haloalquenila (por exemplo, haloalquenila C2-5), alcóxi (por exemplo, alcóxi C1-4), alquiltio (por exemplo, alquiltio C1-4), alquilsulfonila (por exemplo, alquilsulfonila C1-4), haloalcóxi (por exemplo, haloalcóxi C1-4), haloalquiltio (por exemplo, haloalquiltio C1-4), haloalquilsulfonila (por exemplo, haloalquilsulfonila C1-4), cicloalquila (por exemplo, cicloalquila C3-5) ou heterocicloalquila (por exemplo, heterocicloalquila C3-5).

[033] Tais substituintes preferidos são átomos de deutério, átomos de flúor, átomos de cloro, ou hidroxila, nitro, nitrila (-CN), -NR2 (onde cada R é independentemente selecionado a partir de H e metila), alquila C1-5, -CD3, alquenila C2-3, alquinila C2-3, CF3, CHF2, CH2CF3, C2F5, CF=CF2, alcóxi C1-3, alquiltio C1-3, alquilsulfonila C1-3, OCF3, SCF3, SO2CF3, ciclopropila, ciclobutila, oxetanila e azetidinila.

[034] De preferência, um grupo heteroarila ou arila substituído tem de 1 a 5 substituintes, mais preferencialmente de 1 a 3 substituintes e o mais preferencialmente de 1 ou 2 substituintes. De preferência, um grupo heteroarila ou arila substituído não transporta mais do que 2 substituintes nitro e não mais do que 2 substituintes de ácido sulfônico.

[035] Conforme usado aqui, os átomos de halogênio são tipicamente átomos de F, Cl, Br ou I, preferencialmente átomos de F ou Cl.

[036] Para se evitar dúvidas, os termos α-1-antitripsina, alfa-1-antitripsina, alfa-1-antitripsina, etc., são usados permutavelmente aqui.

[037] A menos que de outro modo especificado, todas as referências a grupos orgânicos contendo um mais átomos de hidrogênio também incluem suas contrapartes deuteradas parcial ou completamente. Por exemplo, as referências aqui a grupos alquila abrangem grupos alquila que consistem em átomos de carbono e de hidrogênio, grupos alquila contendo átomos de carbono e uma mistura de átomos de hidrogênio e de deutério, e grupos alquila completamente deuterados. De preferência, entretanto, tais grupos orgânicos não são parcial ou totalmente deuterados, exceto onde expressamente indicado. Informações gerais a respeito dos compostos da invenção, composições farmacêuticas que compreendem tais compostos e terapias de combinação

[038] Conforme usado aqui, “um composto da invenção” inclui compostos que são capazes de inibir polimerização de α-1-antitripsina e todos os solvatos, complexos, tautômeros, polimorfos, derivados marcados com isótopo, estereoisômeros e isômeros ópticos de tais compostos.

[039] Conforme usado aqui, o termo “quantidade eficaz” significa que quantidade de um fármaco ou agente farmacêutico que que irá provocar a resposta biológica ou médica de um tecido, sistema, animal ou humano que está sendo procurado, por exemplo, por um pesquisador ou clínico. Além disso, o termo “quantidade terapeuticamente eficaz” significa qualquer quantidade que, em comparação com um sujeito correspondente que não recebeu tal quantidade, resulta em melhor tratamento, cura, prevenção ou melhora de uma doença, distúrbio ou efeito colateral, ou uma diminuição na taxa de avanço de uma doença ou distúrbio. O termo também inclui em seu escopo quantidades eficazes para melhorar a função fisiológica normal.

[040] Conforme usado aqui, o termo “farmaceuticamente aceitável” refere-se aos compostos, materiais, composições e formas de dosagem que são, dentro do escopo do bom julgamento médico, adequados para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, ou outro problema ou complicação, proporcional a uma razão risco/benefício razoável.

[041] Os compostos da presente invenção podem estar na forma de um sal.

[042] Tipicamente, os sais da presente invenção são sais farmaceuticamente aceitáveis. Sais abrangidos dentro do termo “sais farmaceuticamente aceitáveis” referem-se a sais não tóxicos dos compostos desta invenção. Para uma revisão sobre os sais adequados, ver Berge et al, J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1 - 19.

[043] Os compostos da invenção podem existir na forma de sólido ou líquido. Na forma de sólido, o composto da invenção pode existir em um continuum de estados sólidos variando de completamente amorfo para completamente cristalino. O termo “amorfo” se refere a um estado em que o material carece de ordem de longo alcance no nível molecular e, dependendo da temperatura, pode exibir as propriedades físicas de um sólido ou líquido. Normalmente, esses materiais não fornecem padrões de difração de raios-X distintos e, embora exibam as propriedades de um sólido, são descritos mais formalmente como um líquido. Após o aquecimento, ocorre uma mudança de propriedades sólidas para líquidas que é caracterizada por uma mudança de estado, normalmente de segunda ordem (“transição vítrea”). O termo “cristalino” se refere a uma fase sólida em que o material tem uma estrutura interna ordenada regular no nível molecular e dá um padrão de difração de raios-X distinto com picos definidos. Esses materiais, quando suficientemente aquecidos, também exibirão as propriedades de um líquido, mas a mudança de sólido para líquido é caracterizada por uma mudança de fase, normalmente de primeira ordem (“ponto de fusão”).

[044] O composto da presente invenção pode existir em formas solvatadas e não solvatadas. Conforme usado neste documento, o termo “solvato” refere-se a um complexo de estequiometria variável formado por um soluto (nesta invenção, um composto da invenção e um solvente). Tais solventes para o propósito da invenção podem não interferir com a atividade biológica do soluto. A pessoa versada na técnica apreciará que solvatos farmaceuticamente aceitáveis podem ser formados para compostos cristalinos em que as moléculas de solvente são incorporadas na rede cristalina durante a cristalização. As moléculas de solvente incorporadas podem ser moléculas de água ou não aquosas, como etanol, isopropanol, DMSO, ácido acético, etanolamina e moléculas de acetato de etila. Redes cristalinas incorporadas com moléculas de água são normalmente chamadas de “hidratos”. Os hidratos incluem hidratos estequiométricos, bem como composições contendo quantidades variáveis de água. A presente invenção inclui todos esses solvatos.

[045] Os compostos da invenção podem ter a capacidade de cristalizar em mais de uma forma, uma característica, que é conhecida como polimorfismo, e entende-se que tais formas polimórficas (“polimorfos”) estão dentro do escopo da invenção. O polimorfismo geralmente pode ocorrer como uma resposta a mudanças na temperatura ou pressão ou ambos e também pode resultar de variações no processo de cristalização. Os polimorfos podem ser distinguidos por várias características físicas conhecidas na técnica, como padrões de difração de raios-X, solubilidade e ponto de fusão.

[046] Também é observado que os compostos da invenção podem formar tautômeros. Entende-se que todos os tautômeros e misturas de tautômeros dos compostos da presente invenção estão incluídos no escopo dos compostos da presente invenção.

[047] A invenção também inclui compostos marcados isotopicamente, que são idênticos aos compostos da invenção, mas pelo fato de que um ou mais átomos são substituídos por um átomo com uma massa atômica ou número de massa diferente da massa atômica ou número de massa mais comumente encontrado na natureza. Exemplos de isótopos adequados para inclusão nos compostos da invenção incluem isótopos de hidrogênio, tais como 2H e 3H, carbono, tais como 11C, 13C e 14C, cloro, tais como 36Cl, flúor, tais como 18F, iodo, tais como 123I e 125I, nitrogênio, tais como 13N e 15N, oxigênio, tais como 15O, 17O e 18O, fósforo, tais como 32P, e enxofre, tais como 35S.

[048] Certos compostos marcados isotopicamente da presente invenção, por exemplo, aqueles que incorporam um isótopo radioativo, são úteis em estudos de distribuição de fármacos e/ou substrato em tecidos. Os isótopos radioativos de trítio, isto é, 3H, e carbono-14, isto é, 14C, são particularmente úteis para esse propósito em vista de sua facilidade de incorporação e meios rápidos de detecção.

[049] A substituição por isótopos mais pesados, como deutério, isto é, 2H, pode proporcionar certas vantagens terapêuticas resultantes de maior estabilidade metabólica, por exemplo, meia-vida in vivo aumentada ou requisitos de dosagem reduzidos e, portanto, pode ser preferida em algumas circunstâncias.

[050] Os compostos marcados isotopicamente da presente invenção podem geralmente ser preparados pelas técnicas convencionais conhecidas por aquelas pessoas versadas na técnica ou por processos análogos aos descritos nos Exemplos e Preparações que os acompanham usando reagentes marcados isotopicamente apropriados no lugar do reagente não marcado anteriormente empregado.

[051] Em uma modalidade, o composto da presente invenção é um de:

Número de Estrutura Nome Exemplo N-((1S,2R)-1-(3-fluoro-2-metilfenil)-1- 1 hidroxipentan-2-il)-2-oxoindolina-4- carboxamida N-((1S,2R)-1-(3-cloro-2-metilfenil)-1- 2 hidroxipentan-2-il)-2-oxoindolina-4- carboxamida N-((1S,2R)-1-(2-cloro-3-cianofenil)-1- 3 hidroxipentan-2-il)-7-fluoro-2-oxoindolina-4- carboxamida N-((1S,2R)-1-(2-cloro-3-fluorofenil)-1- 4 hidroxipentan-2-il)-7-fluoro-2-oxoindolina-4- carboxamida

[052] Embora seja possível que, para uso em terapia, o composto da invenção possa ser administrado como o produto químico bruto, é possível apresentar o composto da invenção como o ingrediente ativo em uma composição farmacêutica. Essas composições podem ser preparadas de uma maneira bem conhecida na técnica farmacêutica e compreendem pelo menos um composto ativo. Consequentemente, a invenção fornece ainda composições farmacêuticas compreendendo um composto da invenção e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. O(s) excipiente(s) deve(m) ser aceitável (is) no sentido de ser(em) compatível(is) com os outros ingredientes da composição e não deletérios para o receptor dos mesmos. De acordo com outro aspecto da invenção, também é fornecido um processo para a preparação de uma composição farmacêutica incluindo o agente, com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. A composição farmacêutica pode ser para uso no tratamento e/ou profilaxia de qualquer uma das condições aqui descritas.

[053] Geralmente, o composto da invenção é administrado em uma quantidade farmaceuticamente eficaz. A quantidade do composto realmente administrada será tipicamente determinada por um médico, à luz das circunstâncias relevantes, incluindo a condição a ser tratada, a via de administração escolhida, o composto real administrado, a idade, o peso e a resposta de o paciente individual, a gravidade dos sintomas do paciente e semelhantes.

[054] As composições farmacêuticas podem ser apresentadas em formas de dosagem unitária contendo uma quantidade predeterminada de ingrediente ativo por dose unitária. O termo “formas de dosagem unitária” refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para sujeitos humanos e outros mamíferos, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de material ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com um excipiente, veículo ou portador farmacêutico adequado. As formas de dosagem unitária típicas incluem ampolas ou seringas pré-cheias e pré-medidas das composições líquidas ou pílulas, comprimidos, cápsulas ou semelhantes no caso de composições sólidas.

[055] As composições de dosagem unitária preferidas são aquelas que contêm uma dose diária ou subdose, ou uma fração apropriada da mesma, de um ingrediente ativo. Essas doses unitárias podem, portanto, ser administradas uma ou mais do que uma vez por dia. Essas composições farmacêuticas podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica farmacêutica.

[056] As composições farmacêuticas podem ser adaptadas para administração por qualquer via apropriada, por exemplo, por via oral (incluindo bucal ou sublingual), retal, inalada, intranasal, tópica (incluindo bucal, sublingual ou transdérmica), vaginal ou parenteral (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa via intradérmica). Essas composições podem ser preparadas por qualquer método conhecido na técnica de farmácia, por exemplo, associando o ingrediente ativo com o(s) portador(s) ou excipiente(s).

[057] As composições farmacêuticas adaptadas para administração oral podem ser apresentadas como unidades discretas, tais como cápsulas ou comprimidos; pós ou grânulos; soluções ou suspensões em líquidos aquosos ou não aquosos; espumas comestíveis ou chicotes; ou emulsões líquidas óleo-em-água ou emulsões líquidas água-em-óleo.

[058] Por exemplo, para administração oral na forma de um comprimido ou cápsula, o componente do fármaco ativo pode ser combinado com um excipiente inerte oral, não tóxico farmaceuticamente aceitável, como etanol, glicerol, água e semelhantes. Os pós são preparados reduzindo o composto a um tamanho fino adequado e misturando-o com um excipiente farmacêutico preparado de forma semelhante, como um carboidrato comestível, como, por exemplo, amido ou manitol. Agente aromatizante, conservante, dispersante e corante também podem estar presentes.

[059] As cápsulas são feitas preparando uma mistura de pó, como descrito acima, e enchendo bainhas de gelatina formadas. Excipientes incluindo deslizantes e lubrificantes, tais como sílica coloidal, talco, estearato de magnésio, estearato de cálcio ou polietilenoglicol sólido podem ser adicionados à mistura de pó antes da operação de enchimento. Um agente desintegrante ou solubilizante, tal como ágar- ágar, carbonato de cálcio ou carbonato de sódio também pode ser adicionado para melhorar a disponibilidade do medicamento quando a cápsula é ingerida.

[060] Além disso, quando desejado ou necessário, excipientes incluindo aglutinantes, deslizantes, lubrificantes, agentes adoçantes, aromatizantes, agentes desintegrantes e agentes corantes adequados também podem ser incorporados na mistura.

Aglutinantes adequados incluem amido, gelatina, açúcares naturais como glicose ou beta-lactose, adoçantes de milho, gomas naturais e sintéticas como acácia, traga canto ou alginato de sódio, carboximetilcelulose, polietilenoglicol, ceras e semelhantes.

Lubrificantes usados nestas formas de dosagem incluem oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio e semelhantes.

Os desintegrantes incluem, sem limitação, amido, metilcelulose, ágar, bentonita, goma xantana e semelhantes.

Os comprimidos são formulados, por exemplo, preparando uma mistura de pó, granulando ou diluindo, adicionando um lubrificante e desintegrante e comprimindo em comprimidos.

Uma mistura de pó é preparada misturando o composto, adequadamente triturado, com um diluente ou base conforme descrito acima e, opcionalmente, com um aglutinante, tal como carboximetilcelulose, um aliginato, gelatina ou polivinil pirrolidona, um retardador de solução, como parafina, uma reabsorção acelerador como um sal quaternário e/ou um agente de absorção como bentonita, caulim ou fosfato dicálcico.

A mistura de pó pode ser granulada por umedecimento com um aglutinante, como xarope, pasta de amido, mucilagem de acádia ou soluções de materiais celulósicos ou poliméricos e forçando através de uma tela.

Como alternativa à granulação, a mistura de pó pode ser passada através da máquina de comprimidos e o resultado são blocos formados de forma imperfeita e quebrados em grânulos.

Os grânulos podem ser lubrificados para evitar a aderência aos moldes de formação de comprimidos por meio da adição de ácido esteárico, um sal de estearato, talco ou óleo mineral.

A mistura lubrificada é então comprimida em comprimidos.

Os compostos da presente invenção também podem ser combinados com um portador inerte de fluxo livre e comprimidos diretamente em comprimidos sem passar pelas etapas de granulação ou fragmentação.

Pode ser fornecido um revestimento protetor transparente ou opaco que consiste em uma camada de selagem de goma-laca, uma camada de açúcar ou material polimérico e uma camada de polimento de cera. Corantes podem ser adicionados a esses revestimentos para distinguir diferentes dosagens unitárias.

[061] Os fluidos orais, tais como soluções, suspensões, xaropes e elixires podem ser preparados na forma de dosagem unitária de modo que uma dada quantidade contenha uma quantidade predeterminada do composto. Os xaropes podem ser preparados dissolvendo o composto em uma solução aquosa com sabor adequado, enquanto os elixires são preparados por meio do uso de um veículo alcoólico não tóxico. As suspensões podem ser formuladas dispersando o composto em um veículo não tóxico. Podem também ser adicionados solubilizantes e emulsionantes, tais como álcoois isoestearílicos etoxilados e éteres de polioxietileno sorbitol, conservantes, aditivos de aroma, tais como óleo de hortelã-pimenta ou adoçantes naturais ou sacarina ou outros adoçantes artificiais e semelhantes.

[062] Quando apropriado, as composições de unidade de dosagem para administração oral podem ser microencapsuladas. A composição também pode ser preparada para prolongar ou sustentar a distribuição como, por exemplo, revestindo ou incorporando material particulado em polímeros, cera ou semelhantes.

[063] Os compostos da invenção também podem ser administrados na forma de sistemas de distribuição de lipossomas, tais como pequenas vesículas unilamelares, grandes vesículas unilamelares e vesículas multilamelares. Os lipossomas podem ser formados a partir de uma variedade de fosfolipídios, tais como colesterol, estearilamina ou fosfatidilcolinas.

[064] As composições farmacêuticas adaptadas para administração transdérmica podem ser apresentadas como pensos discretos destinados a permanecer em contato íntimo com a epiderme do receptor por um período de tempo prolongado.

[065] As composições farmacêuticas adaptadas para administração tópica podem ser formuladas como pomadas, cremes, suspensões, loções, pós, soluções, pastas, géis, sprays, aerossóis ou óleos.

[066] Para tratamentos dos olhos ou outros tecidos externos, por exemplo, boca e pele, as composições são aplicadas preferencialmente como uma pomada ou creme tópico. Quando formulado em uma pomada, o ingrediente ativo pode ser empregado com uma base de pomada parafínica ou miscível em água. Alternativamente, o ingrediente ativo pode ser formulado em um creme com uma base de creme óleo-em-água ou uma base água-em-óleo.

[067] As composições farmacêuticas adaptadas para administrações tópicas no olho incluem colírios em que o ingrediente ativo é dissolvido ou suspenso em um portador adequado, especialmente um solvente aquoso.

[068] As composições farmacêuticas adaptadas para administração tópica na boca incluem drágeas, pastilhas e colutórios.

[069] As composições farmacêuticas adaptadas para administração retal podem ser apresentadas como supositórios ou enemas.

[070] As formas de dosagem para administração nasal ou inalada podem ser convenientemente formuladas como aerossóis, soluções, suspensões, gotas, géis ou pós secos.

[071] As composições para administração intranasal incluem composições aquosas administradas ao nariz por meio de gotas ou por bomba pressurizada. As composições adequadas contêm água como diluente ou portador para este fim. As composições para administração ao pulmão ou nariz podem conter um ou mais excipientes, por exemplo, um ou mais agentes de suspensão, um ou mais conservantes, um ou mais tensoativos, um ou mais agentes de ajuste de tonicidade, um ou mais co-solventes e podem incluir componentes para controlar o pH da composição, por exemplo, um sistema tampão. Além disso, as composições podem conter outros excipientes, tais como antioxidantes, por exemplo, metabissulfito de sódio e agentes para mascarar o sabor. As composições também podem ser administradas no nariz ou outras regiões do trato respiratório por nebulização.

[072] As composições intranasais podem permitir que o(s) composto(s) da invenção sejam administrados a todas as áreas das cavidades nasais (o tecido alvo) e, além disso, podem permitir que o(s) composto(s) da invenção permaneçam em contato com o tecido alvo por períodos mais longos de tempo. Um regime de dosagem adequado para composições intranasais seria o paciente inalar lentamente pelo nariz após a cavidade nasal ser limpa. Durante a inalação, a composição seria administrada a uma narina enquanto a outra é comprimida manualmente. Este procedimento seria então repetido para a outra narina. Normalmente, uma ou duas pulverizações por narina seriam administradas pelo procedimento acima uma, duas ou três vezes ao dia, idealmente uma vez ao dia. De particular interesse são as composições intranasais adequadas para administração uma vez ao dia.

[073] As composições para administração ao pulmão ou nariz podem conter um ou mais excipientes e podem ser protegidas da contaminação microbiana ou fúngica e do crescimento por inclusão de um ou mais conservantes. Exemplos de agentes antimicrobianos ou conservantes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, compostos de amônio quaternário (por exemplo, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, cetrimida, cloreto de cetilpiridínio, cloreto de lauralcônio e cloreto de miristil picolínio), agentes mercuriais (por exemplo, nitrato fenilmercúrico, acetato fenilmercúrico e timerosal), agentes alcoólicos (por exemplo clorobutanol, álcool feniletílico e álcool benzílico), ésteres antibacterianos (por exemplo, ésteres de ácido para-hidroxibenzóico), agentes quelantes como edetato dissódico (EDTA) e outros agentes antimicrobianos, tais como como clorexidina, clorocresol, ácido sórbico e seus sais (como sorbato de potássio) e polimixina. Exemplos de agentes antifúngicos ou conservantes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, benzoato de sódio, ácido sórbico, propionato de sódio, metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno e butilparabeno. O(s) conservante(s), se incluídos, podem estar presentes em uma quantidade de 0,001 a 1 % (p/p), tal como de 0,015 % a 0,5 % (p/p) com base no peso total da composição.

[074] As composições (por exemplo, em que pelo menos um composto está em suspensão) podem incluir um ou mais tensoativos que funcionam para facilitar a dissolução das partículas do medicamento na fase aquosa da composição. Por exemplo, a quantidade de tensoativo usada é uma quantidade que não causa formação de espuma durante a mistura. Exemplos de tensoativos farmaceuticamente aceitáveis incluem álcoois graxos, ésteres e éteres, tais como monooleato de polioxietileno (20) sorbitano (Polissorbato 80), éteres de macrogol e poloxâmeros. O tensoativo pode estar presente em uma quantidade entre cerca de 0,01 a 10 % (p/p), tal como de 0,01 a 0,75 % (p/p), por exemplo cerca de 0,5 % (p/p), com base no peso total da composição.

[075] Um ou mais agentes de ajuste de tonicidade podem ser incluídos para atingir a tonicidade com fluidos corporais, por exemplo, fluidos da cavidade nasal, resultando em níveis reduzidos de irritação. Exemplos de agentes de ajuste de tonicidade farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, cloreto de sódio, dextrose, xilitol, cloreto de cálcio, glicose, glicerina e sorbitol. Um agente de ajuste de tonicidade, se presente, pode ser incluído em uma quantidade de 0,1 a 10 % (p/p), tal como de 4,5 a 5,5 % (p/p), por exemplo cerca de 5,0 % (p/p) , com base no peso total da composição.

[076] As composições da invenção podem ser tamponadas pela adição de agentes tamponantes adequados, como citrato de sódio, ácido cítrico, trometamol, fosfatos, como fosfato dissódico (por exemplo, o dodeca-hidrato, hepta-hidratado, di- hidratado e formas anidras) ou fosfato de sódio e misturas dos mesmos.

[077] Um agente tamponante, se presente, pode ser incluído em uma quantidade de 0,1 a 5 % (p/p), por exemplo 1 a 3 % (p/p) com base no peso total da composição.

[078] Exemplos de agentes de mascaramento de sabor incluem sucralose, sacarose, sacarina ou um sal da mesma, frutose, dextrose, glicerol, xarope de milho, aspartame, acessulfame-K, xilitol, sorbitol, eritritol, glicirrizinato de amônio, taumatol, neotame, manitol, mentol, mentol óleo, cânfora, um agente aromatizante natural, um agente aromatizante artificial, e combinações dos mesmos.

[079] Um ou mais co-solvente(s) podem ser incluídos para auxiliar a solubilidade do (s) composto (s) de medicamento e/ou outros excipientes. Exemplos de co-solventes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, propilenoglicol, dipropilenoglicol, etilenoglicol, glicerol, etanol, polietilenoglicóis (por exemplo PEG300 ou PEG400) e metanol. Em uma modalidade, o co-solvente é propilenoglicol.

[080] Co-solvente(s), se presentes, podem ser incluídos em uma quantidade de 0,05 a 30 % (p/p), tal como de 1 a 25 % (p/p), por exemplo, de 1 a 10 % (p/p) com base no peso total da composição.

[081] As composições para administração inalada incluem misturas aquosas, orgânicas ou aquosas/orgânicas, pó seco ou composições cristalinas administradas ao trato respiratório por bomba pressurizada ou inalador, por exemplo, inaladores de pó seco de reservatório, inaladores de pó seco de dose unitária, inaladores pré- medidos de pó seco multidose, inaladores nasais ou inaladores de aerossol pressurizados, nebulizadores ou insufladores. As composições adequadas contêm água como diluente ou portador para este fim e podem ser fornecidas com excipientes convencionais, tais como agentes tamponantes, agentes modificadores da tonicidade e semelhantes. As composições aquosas também podem ser administradas ao nariz e outras regiões do trato respiratório por nebulização. Essas composições podem ser soluções aquosas ou suspensões ou aerossóis entregues a partir de embalagens pressurizadas, como um inalador de dose medida, com o uso de um propulsor liquefeito adequado.

[082] As composições para administração tópica ao nariz (por exemplo, para o tratamento da rinite) ou ao pulmão, incluem composições em aerossol pressurizado e composições aquosas distribuídas nas cavidades nasais por bomba pressurizada. As composições que são não pressurizadas e adequadas para administração tópica na cavidade nasal são de particular interesse. As composições adequadas contêm água como diluente ou portador para este fim. As composições aquosas para administração ao pulmão ou nariz podem ser fornecidas com excipientes convencionais, tais como agentes tamponantes, agentes modificadores da tonicidade e semelhantes. As composições aquosas também podem ser administradas ao nariz por nebulização.

[083] Um dispensador de fluido pode tipicamente ser usado para distribuir uma composição de fluido às cavidades nasais. A composição de fluido pode ser aquosa ou não aquosa, mas tipicamente aquosa. Tal dispensador de fluido pode ter um bico dispensador ou orifício dispensador através do qual uma dose medida da composição de fluido é dispensada mediante a aplicação de uma força aplicada pelo usuário a um mecanismo de bomba do dispensador de fluido. Tais distribuidores de fluido são geralmente fornecidos com um reservatório de múltiplas doses dosadas da composição de fluido, as doses sendo dispensáveis mediante acionamentos de bomba sequenciais. O bico de distribuição ou orifício pode ser configurado para inserção nas narinas do usuário para distribuição por pulverização da composição de fluido na cavidade nasal.

[084] As composições de pó seco para administração tópica ao pulmão por inalação podem, por exemplo, ser apresentadas em cápsulas e cartuchos de, por exemplo, gelatina, ou blisters de, por exemplo, folha de alumínio laminada, para uso em um inalador ou insuflador. As composições de mistura de pó geralmente contêm uma mistura de pó para inalação do composto da invenção e uma base de pó adequada (substância de portador/diluente/excipiente), como mono-, di- ou polissacarídeos (por exemplo, lactose ou amido). As composições de pó seco também podem incluir, além do fármaco e portador, um outro excipiente (por exemplo, um agente ternário, como um éster de açúcar, por exemplo, octaacetato de celobiose, estearato de cálcio ou estearato de magnésio.

[085] Em uma modalidade, uma composição adequada para administração por inalação pode ser incorporada em uma pluralidade de recipientes de dose vedados fornecidos em embalagens de medicamento montadas dentro de um dispositivo de inalação adequado. Os recipientes podem ser rompíveis, destacáveis ou, de outra forma, abríveis um de cada vez e as doses da composição de pó seco administradas por inalação em um bocal do dispositivo de inalação, como conhecido na técnica. A embalagem de medicamento pode assumir várias formas diferentes, por exemplo, uma forma de disco ou uma tira alongada.

[086] Um outro método de distribuição para uma composição inalável de pó seco é para doses medidas da composição a serem fornecidas em cápsulas (uma dose por cápsula) que são então carregadas em um dispositivo de inalação, tipicamente pelo paciente sob demanda. O dispositivo tem meios para romper, perfurar ou de outra forma abrir a cápsula de modo que a dose possa ser arrastada para o pulmão do paciente quando ele inalar no bocal do dispositivo.

[087] As composições de aerossol pressurizadas adequadas para inalação podem ser uma suspensão ou uma solução e podem conter um composto da invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um propulsor adequado, como um fluorocarbono ou clorofluorocarbono contendo hidrogênio ou suas misturas, particularmente hidrofluoroalcanos, especialmente 1,1,1,2-tetrafluoroetano, 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoro-n-propano ou uma mistura dos mesmos. A composição de aerossol pode conter opcionalmente excipientes de composição adicionais bem conhecidos na técnica, tais como tensoativos, por exemplo, ácido oleico, lecitina ou um ácido oligoláctico ou derivado dos mesmos, por exemplo, como descrito em WO 94/21229 e WO 98/34596 (Minnesota Mining and Manufacturing Company) e co- solventes, por exemplo, etanol. As composições pressurizadas serão geralmente retidas em um recipiente (por exemplo, um recipiente de alumínio) fechado com uma válvula (por exemplo, uma válvula de medição) e encaixado em um atuador fornecido com um bocal.

[088] As composições farmacêuticas adaptadas para administração vaginal podem ser apresentadas como pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou formulações em spray.

[089] As composições farmacêuticas adaptadas para administração parentérica incluem soluções de injeção estéreis aquosas e não aquosas que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a composição isotônica com o sangue do receptor pretendido; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. As composições podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou multidose, por exemplo, ampolas e frascos vedados, e podem ser armazenadas em uma condição de liofilizada (liofilizada) exigindo apenas a adição do portador líquido estéril, por exemplo, água para injeções, imediatamente antes do uso. As soluções e suspensões de injeção extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis.

[090] Deve ser entendido que além dos ingredientes particularmente mencionados acima, as composições podem incluir outros agentes convencionais na técnica tendo em conta o tipo de formulação em questão, por exemplo, aqueles adequados para administração oral podem incluir agentes aromatizantes.

[091] Uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente dependerá de uma série de fatores, incluindo, por exemplo, a idade e o peso do sujeito, a condição precisa que requer tratamento e sua gravidade, a natureza da formulação e a via de administração, e em última análise, ficará a critério do médico ou veterinário assistente. Em particular, o sujeito a ser tratado é um mamífero, particularmente um ser humano.

[092] O agente pode ser administrado em uma dose diária. Esta quantidade pode ser dada em uma única dose por dia ou mais geralmente em um número (como duas, três, quatro, cinco ou seis) de subdoses por dia, de modo que a dose diária total seja a mesma.

[093] Adequadamente, a quantidade do composto da invenção administrada de acordo com a presente invenção será uma quantidade selecionada a partir de 0,01 mg a 5 g por dia.

[094] Adicionalmente, os compostos da invenção podem ser administrados como pró-fármacos. Conforme usado aqui, um “pró-fármaco” de um composto da invenção é um derivado funcional do composto que, após administração a um paciente, eventualmente libera o composto da invenção in vivo. A administração de um composto da invenção como um pró-fármaco pode permitir ao técnico habilitado fazer um ou mais dos seguintes: (a) modificar o início da atividade do composto in vivo; (b) modificar a duração da ação do composto in vivo; (c) modificar o transporte ou distribuição do composto in vivo; (d) modificar a solubilidade do composto in vivo; e (e) superar um efeito colateral ou outra dificuldade encontrada com o composto. Derivados funcionais típicos usados para preparar pró-fármacos incluem modificações do composto que são quimicamente ou enzimaticamente cliváveis in vivo. Essas modificações, que incluem a preparação de fosfatos, amidas, ésteres, tioésteres, carbonatos e carbamatos, são bem conhecidas pelas pessoas versadas na técnica.

[095] Exemplos específicos e estritamente não limitantes de pró-fármacos dentro do significado da presente invenção incluem derivados de compostos da Fórmulas (IA), (IB), (IC), (ID) e (I) em que a porção hidroxila é substituída por um porção reativa que é capaz de se degradar in vivo (por exemplo, por hidrólise) para produzir a porção hidroxila. Para evitar dúvidas, a porção hidroxila das Fórmulas (IA), (IB), (IC) e (ID) é que indicada pelo rótulo “I” nas Fórmulas químicas, e a porção hidroxila da Fórmula (I) é aquela ligada ao átomo de carbono que está entre o anel fenila e o grupo lateral propila do composto. Da mesma forma, a presente invenção inclui derivados de compostos da Fórmula (II) em que Z é uma porção reativa que é capaz de se degradar in vivo (por exemplo, por hidrólise) para produzir uma porção hidroxila. Exemplos estritamente não limitantes e meramente representativos de tais porções reativas incluem porções da Fórmula ORz em que Rz tem a Fórmula PO3H2, CO(CH2)nNH2 e PO3H(CH2)n-NH2 (onde n é número inteiro, por exemplo, de 2 a 5). Como aquelas pessoas versadas na técnica apreciariam prontamente, uma grande quantidade de outras frações reativas também poderiam ser utilizadas. Em um composto contendo uma pluralidade de grupos hidroxila, é claro que é possível que alguns ou todos dos ditos grupos hidroxila sejam substituídos por tais porções reativas.

[096] Os compostos da invenção podem ser utilizados sozinhos ou em combinação com outros agentes terapêuticos. Os compostos da invenção e o(s) outro(s) agente(s) farmaceuticamente ativo(s) podem ser administrados em conjunto ou separadamente e, quando administrados separadamente, a administração pode ocorrer simultânea ou sequencialmente, em qualquer ordem. por qualquer via conveniente em composições farmacêuticas separadas ou combinadas.

[097] As quantidades do(s) composto(s) da invenção e do(s) outro(s) agente(s) farmaceuticamente ativo(s) e as temporizações relativas de administração serão selecionadas a fim de atingir o efeito terapêutico combinado desejado. Os compostos da presente invenção e outro(s) agente(s) terapêutico(s) podem ser empregues em combinação por administração simultaneamente numa composição farmacêutica unitária incluindo ambos os compostos. Alternativamente, a combinação pode ser administrada separadamente em composições farmacêuticas separadas, cada uma incluindo um dos compostos de uma maneira sequencial em que, por exemplo, o composto da invenção é administrado primeiro e o outro segundo e vice- versa. Tal administração sequencial pode ser próxima no tempo (por exemplo, simultaneamente) ou remota no tempo. Além disso, não importa se os compostos são administrados na mesma forma de dosagem, por exemplo, um composto pode ser administrado topicamente e o outro composto pode ser administrado oralmente. Adequadamente, ambos os compostos são administrados por via oral.

[098] As combinações podem ser apresentadas como um kit de combinação. Pelo termo “kit de combinação” “ou kit de partes”, conforme usado neste documento, entende-se a composição ou composições farmacêuticas que são usadas para administrar a combinação de acordo com a invenção. Quando ambos os compostos são administrados simultaneamente, o kit de combinação pode conter ambos os compostos em uma única composição farmacêutica, como um comprimido, ou em composições farmacêuticas separadas. Quando os compostos não são administrados simultaneamente, o kit de combinação conterá cada composto em composições farmacêuticas separadas em uma única embalagem ou em composições farmacêuticas separadas em embalagens separadas.

[099] O kit de combinação também pode ser fornecido por instrução, como dosagem e instruções de administração. Essas instruções de dosagem e administração podem ser do tipo fornecido a um médico, por exemplo, por um rótulo de medicamento, ou podem ser do tipo fornecido por um médico, como instruções a um paciente.

[0100] Quando a combinação é administrada separadamente de uma maneira sequencial em que um é administrado primeiro e o outro segundo ou vice-versa, essa administração sequencial pode ser próxima no tempo ou remota no tempo. Por exemplo, a administração do outro agente vários minutos a várias dezenas de minutos após a administração do primeiro agente e a administração do outro agente várias horas a vários dias após a administração do primeiro agente estão incluídas, em que o lapso de tempo não é limitado, por exemplo, um agente pode ser administrado uma vez por dia, e o outro agente pode ser administrado 2 ou 3 vezes por dia, ou um agente pode ser administrado uma vez por semana, e o outro agente pode ser administrado uma vez por dia e semelhantes.

[0101] Será claro para uma pessoa versada na técnica que, quando apropriado, os outros ingredientes terapêuticos podem ser usados na forma de sais, por exemplo, como metais alcalinos ou sais de amina ou como sais de adição de ácido, ou pró-fármacos, ou como ésteres, por exemplo, ésteres de alquil inferior, ou como solvatos, por exemplo, hidratos, para otimizar a atividade e/ou estabilidade e/ou características físicas, tais como solubilidade, do ingrediente terapêutico. Será claro também que, quando apropriado, os ingredientes terapêuticos podem ser usados na forma opticamente pura.

[0102] Quando combinados na mesma composição, será apreciado que os dois compostos devem ser estáveis e compatíveis um com o outro e com os outros componentes da composição e podem ser formulados para administração. Quando formulados separadamente, podem ser fornecidos em qualquer composição conveniente, convenientemente, de uma maneira conhecida para tais compostos na técnica.

[0103] Quando o composto da invenção é usado em combinação com um segundo agente terapêutico ativo contra a mesma doença, condição ou distúrbio, a dose de cada composto pode diferir daquela quando o composto é usado sozinho. Doses apropriadas serão prontamente apreciadas aquelas pessoas versadas na técnica.

[0104] Em uma modalidade, o mamífero nos métodos e usos da presente invenção é um ser humano.

Descrição detalhada de compostos da presente invenção

[0105] O composto da presente invenção é um composto que é capaz de inibir polimerização de α-1-antitripsina. Normalmente, o composto é capaz de inibir polimerização de Z-α-1-antitripsina.

[0106] O composto é tipicamente um composto de molécula pequena. Conforme usado aqui, um composto de molécula pequena tipicamente tem um peso molecular de 2.000 Daltons ou menos, mais usualmente 1.000 Daltons ou menos e preferencialmente 800 Daltons ou menos. Mais preferencialmente, o peso molecular é 600 ou menos e o mais preferencialmente 500 ou menos. Por exemplo, o fármaco de molécula pequena pode ter um peso molecular de 250 a 800, tal como de 300 a

600.

[0107] Em um aspecto da presente invenção, o composto que é capaz de inibir polimerização de α-1-antitripsina é um composto da Fórmula geral (II): ; em que: - R4, R5, R6 e R7 são conforme definidos em outro lugar aqui (por exemplo, em relação à Fórmula geral (ID)); - R8 é hidrogênio, deutério, alquila (por exemplo, alquila C1-5) ou alquila deuterada (por exemplo, alquila deuterada C1-5); - R9 é hidrogênio, deutério, alquila (por exemplo, alquila C1-5) ou alquila deuterada (por exemplo, alquila deuterada C1-5); - Z é OH, F, -NHCHO, -CH2F, -CHF2 ou CF3; e - Q é -C(=O)-, -C(=S)-, -C(=NOH)-, -C(=NNH2)- ou -S(O)2-.

[0108] Exemplos de grupos preferidos R4, R5, R6 e R7 são conforme definidos em outro lugar aqui.

[0109] Grupos preferidos R8 são hidrogênio, deutério, e alquila C1-2 opcionalmente deuterada. Mais preferencialmente R8 é hidrogênio, metila ou etila, ainda mais preferencialmente hidrogênio ou metila e o mais preferencialmente hidrogênio.

[0110] Grupos preferidos R9 são hidrogênio, deutério, e alquila C1-2 opcionalmente deuterada. Mais preferencialmente R9 é hidrogênio, metila ou etila, ainda mais preferencialmente hidrogênio ou metila e o mais preferencialmente hidrogênio. Z é preferencialmente OH ou F, o mais preferencialmente OH. Q é preferencialmente -C(=O)-, -C(=S)- ou -S(O)2-, mais preferencialmente - C(=O)- ou -C(=S)-, e o mais preferencialmente -C(=O)-.

[0111] Em modalidades preferidas, o composto da Fórmula geral (II) é um composto da Fórmula geral (ID), e ainda mais preferencialmente um composto da Fórmula geral (I), como ainda definido em outro lugar aqui. Ligação do composto a α-1-antitripsina

[0112] O composto da presente invenção é capaz de se ligar a α-1-antitripsina. Normalmente, o composto é capaz de se ligar a α-1-antitripsina por meio de um sítio de ligação críptico dentro da estrutura de proteína de α-1-antitripsina. Um sítio de ligação críptico como definido aqui se refere a um sítio de ligação que está ausente, ocluído ou apenas acessado transitoriamente na proteína não ligada, mas presente quando o composto está ligado à proteína; por exemplo, o sítio de ligação críptico pode surgir como consequência do contato da proteína com o composto e/ou uma configuração de proteína anteriormente apenas acessada de forma transitória caracterizando o sítio de ligação pode se tornar estabilizada pela presença da proteína.

[0113] Por “α-1-antitripsina” na expressão “o composto é capaz de se ligar a α-1-antitripsina” é significado uma proteína que compreende a sequência de SEQ ID NO: 1, isto é, X1DPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIF FSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLX2TLNQPDSQ

LQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQ GKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQX3TTVKVPMMK RLGMFNIQHX4KKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENED

RRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVL TIDX5KGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIX6QNTKSPLFMGKVVNPTQK em que X1 é T ou E, X2 é R ou H, X3 é A ou V, X4 é C ou S, X5 é E ou K, e X6 é D ou E.

[0114] Para se evitar dúvidas, um composto é um composto da invenção que é capaz de se ligar a qualquer tal proteína, isto é, qualquer proteína única que compreende a sequência de SEQ ID NO: 1 (isto é, não é essencial que o composto deva liga-se a todas as variantes possíveis abrangidas pela SEQ ID NO: 1, e nem tal ligação exclui a possibilidade de que o composto também pode se ligar a outras proteínas, como aquelas contendo sequências de aminoácidos que diferem de SED ID NO: 1).

[0115] Além disso, também para se evitar dúvidas, todos os números de resíduos atribuídos a aminoácidos específicos na proteína de α-1-antitripsina, por exemplo, em relação a definição do sítio de ligação dos compostos da presente invenção, são contados a partir do N-terminal da sequência de SEQ ID NO: 1, isto é, X1 é contado como resíduo 1, o D adjacente como resíduo 2, o P adjacente como resíduo 3, o Q adjacente como resíduo 4, o G adjacente como resíduo 5, e assim por diante. Esta numeração se aplica também quando a proteína contém aminoácidos adicionais no N-terminal em relação a SEQ ID NO: 1, isto é, quaisquer tais aminoácidos adicionais “flanqueadores” não mudam a convenção de numeração com

X1 ainda sendo contado como resíduo 1, D como resíduo 2, P como resíduo 3, Q como resíduo 4, G como resíduo 5, e assim por diante. Assim, a numeração é sempre contada apenas com referência aos aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e exclui quaisquer resíduos de aminoácidos adicionais presentes, por exemplo, em qualquer peptídeo sinal ou etiqueta de afinidade e/ou quaisquer aminoácidos adicionais fornecidos por um vetor de expressão utilizado na síntese da proteína. Consequentemente, em qualquer proteína relevante, X1 é aminoácido 1, X4 é aminoácido 232, X5 é aminoácido 342, e assim por diante.

[0116] O alelo mais comum de M-AT de tipo selvagem é o alelo M1V (estimado em 44 a 49 % do total). No alelo M1V, X1 é E, X2 é R, X3 é V, X4 é C, X5 é E X6 é E. A proteína M1V humana completa compreende ainda um peptídeo sinal no N- terminal tendo a sequência MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLA. Assim, a sequência completa da proteína M1V humana corresponde à sequência de SEQ ID NO: 2, isto é,

MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLAEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKIT PNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLT EIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAF TVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEV KDTEEEDFHVDQVTTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPD EGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNG ADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFL MIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK.

[0117] O mutante Z-α-1-antitripsina difere a partir do alelo M1V em que X5 é K em vez de E (isto é, a mutação é definida como E342K) e X3(213) é A. Assim, a sequência completa de Z-A1AT corresponde à sequência de SEQ ID NO: 3, isto é,

MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLAEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKIT PNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLT EIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAF TVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEV KDTEEEDFHVDQATTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPD EGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNG ADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDKKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFL MIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK.

[0118] Para facilidade de manuseio (por exemplo, na geração de cristais de proteína de α-1-antitripsina e/ou geração de complexos de proteína de α-1-antitripsina ligada a um composto da invenção), pode ser desejável transformar cisteína 232 da proteína em uma serina, isto é, para efetuar a mutação C232S. Isso é uma mutação conservadora e não está localizada em uma posição diretamente associada com o sítio de ligação do composto. SEQ ID NO:1 abrange ambas as proteínas em vista de seu resíduo de aminoácido variável X4.

[0119] Em uma modalidade preferida, o composto é capaz de se ligar a uma proteína compreendendo SEQ ID NO: 1 em que X1 é E, X2 é R, X3 é A, X4 é C, X5 é K e X6 é E, isto é, a sequência tem 100 % de identidade de sequência para a porção correspondente de Z-α-1-antitripsina.

[0120] Em uma outra modalidade exemplificativa, a proteína pode ser uma sequência que compreende SEQ ID NO: 1 e que adicionalmente compreende um etiqueta de afinidade (por exemplo, um etiqueta de afinidade de hexahistidina) e/ou aminoácidos fornecidos por um vetor de expressão. Por exemplo, uma tal proteína pode ser uma expressada em E. coli. A sequência completa de uma tal proteína exemplificativa é que de SEQ ID NO: 4, isto é,

MRGSHHHHHHTDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQ LAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQEL LRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQ INDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQV TTVKVPMMKRLGMFNIQHSKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTH DIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLK LSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMG KVVNPTQK.

[0121] Essa proteína, que é usada no Exemplo 2 aqui, compreende sequência N-terminal MRGSHHHHHHT tendo uma etiqueta de afinidade de hexahistidina e aminoácidos fornecidos por um vetor de expressão usado na síntese, e em que X1 é T. Essa proteína compreende ainda uma serina na posição 232 (isto é, X4 é S) para facilitar o manuseio. Essa proteína compreende ainda glutamato na posição 342 (isto é, X5 é E).

[0122] Uma importante descoberta da presente invenção é que os compostos em questão são capazes de ligação específica à proteína de α-1-antitripsina em um parte da proteína que não foi previamente demonstrada a ser um sítio for fármaco ligação (e ainda menos um que, após a formação da ligação composto-proteína, é capaz de inibir a polimerização da proteína).

[0123] Mais particularmente, o dito sítio de ligação é preferencialmente localizado entre β-folha-A e β-folha-B da dita α-1-antitripsina. A dita β-folha-A compreende os aminoácidos correspondentes a um ou mais de: (i) resíduos 140 - 144; (ii) resíduos 111 - 121; (iii) resíduos 181 - 191; (iv) resíduos 330 - 340; e (v) resíduos 292 - 299 de SEQ ID NO: 1. De preferência, a dita β-folha-A compreende os aminoácidos correspondentes a dois ou mais de, mais preferencialmente três ou mais, ainda mais preferencialmente four ou mais, e o mais preferencialmente todos cinco, de (i) a (v). A dita β-folha-B compreende os aminoácidos correspondentes a um ou mais de: (i′) resíduos 228 - 231; (ii′) resíduos 236 - 244; (iii′) resíduos 248 - 256; (iv′) resíduos 369 - 376; (v′) resíduos 381 - 389; e (vi′) resíduos 49 - 53 de SEQ ID NO: 1. De preferência, a dita β-folha-B compreende os aminoácidos correspondentes a dois ou mais de, mais preferencialmente três ou mais, ainda mais preferencialmente four ou mais, ainda mais preferencialmente cinco ou mais, e o mais preferencialmente todos seis, de (i′) a (vi′).

[0124] Assim, preferencialmente o sítio de ligação está localizado entre β- folha-A e β-folha-B da dita α-1-antitripsina, em que: a dita β-folha-A compreende os aminoácidos correspondentes aos resíduos 140 - 144, 111 - 121, 181 - 191, 330 - 340 e 292 - 299 de SEQ ID NO: 1; e a dita β-folha-B compreende os aminoácidos correspondentes aos resíduos 228 - 231, 236 - 244, 248 - 256, 369 - 376, 381 - 389, e 49 - 53 de SEQ ID NO: 1.

[0125] Por “localizado entre β-folha-A e β-folha-B” é significado que, quando o composto é ligado à α-1-antitripsina, pelo menos parte (por exemplo, substancialmente todo ou todo) do composto é acomodado no espaço físico entre a dita β-folha-A e a dita β-folha-B. Como será prontamente apreciado por aquelas pessoas versadas na técnica, a confirmação da localização do sítio de ligação do composto na proteína pode ser fornecida pelos métodos bem conhecidos na técnica, tal como usando técnicas cristalográficas de rotina (ver, por exemplo, Exemplo 2 aqui).

[0126] Ainda mais especificamente, o sítio de ligação é mais preferencialmente localizado entre as cadeias de aminoácido correspondentes a três ou mais de: (a) resíduos 191 - 194 de SEQ ID NO: 1; (b) resíduos 288 - 293 de SEQ ID NO: 1; (c) resíduos 371 - 374 de SEQ ID NO: 1; (d) resíduos 249 - 253 de SEQ ID NO: 1; e (e) resíduos 240 - 243 de SEQ ID NO: 1. É particularmente preferido que o sítio de ligação esteja localizado entre as cadeias de aminoácido correspondentes a quatro ou mais, e o mais preferencialmente cada um de: (a) resíduos 191 - 194 de SEQ ID NO: 1; (b) resíduos 288 - 293 de SEQ ID NO: 1; (c) resíduos 371 - 374 de SEQ ID NO: 1; (d) resíduos 249 - 253 de SEQ ID NO: 1; e (e) resíduos 240 - 243 de SEQ ID NO: 1. É adicionalmente preferível que o sítio de ligação também esteja localizado entre as cadeias de aminoácido correspondentes a (f) resíduos 338 - 341 de SEQ ID NO: 1. Por “cadeia de aminoácido” é significado uma pluralidade de resíduos de aminoácidos na proteína como numerado aqui, por exemplo, uma cadeia de aminoácido correspondente aos resíduos 191 - 194 de SEQ ID NO: 1 se refere a aminoácidos 191, 192, 193 e 194 de SEQ ID NO: 1. Por “localizado entre” as ditas cadeias de aminoácido é significado que, quando o composto é ligado à α-1- antitripsina, pelo menos parte (por exemplo, substancialmente todo ou todo) do composto é acomodado no espaço físico entre as respectivas cadeias de aminoácido.

[0127] Em um aspecto exemplificativo, o sítio de ligação compreende um ou mais de W194, Y244, L291, P289, F252, K290, I293, L338, I340, F372 e M374 de SEQ ID NO: 1. Neste aspecto exemplificativo, o sítio de ligação preferencialmente compreende três ou mais, mais preferencialmente cinco ou mais, ainda mais preferencialmente sete ou mais, e mais preferencialmente nove ou mais de W194, Y244, L291, P289, F252, K290, I293, L338, I340, F372 e M374 de SEQ ID NO: 1. O sítio de ligação pode, por exemplo, compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou todos 11 de W194, Y244, L291, P289, F252, K290, I293, L338, I340, F372 e M374 de SEQ ID NO: 1. Aminoácidos particularmente preferidos associados com o sítio de ligação são W194, Y244, L291 e P289 e, assim, preferencialmente o sítio de ligação compreende pelo menos W194, Y244, L291 e P289. Como ainda descrito aqui, o composto pode otimamente ser capaz de formar ligações não covalentes (incluindo mas não limitado às ligações de hidrogênio) com os grupos funcionais dos resíduos de aminoácido relevantes da proteína.

[0128] De preferência, o KD do composto para M-α-1-antitripsina é menor do que cerca de 250 nM, a dita M-α-1-antitripsina compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 2 e/ou o KD do composto para Z-α-1-antitripsina é menor do que cerca de 25 nM, a dita Z-α-1-antitripsina compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 3. De preferência o KD do composto para Z-α-1-antitripsina é pelo menos dez vezes menor do que o KD do composto para M-α-1-antitripsina, a dita M-α-1-antitripsina compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 2 e a dita Z-α-1-antitripsina compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 3. Métodos para medir KD são bem conhecidos na técnica e qualquer um desses métodos podem ser usados. Um exemplo de tal método é descrito no Exemplo 2. Todas as referências aqui a KD são como determinadas na temperatura ambiente (por exemplo, a 20 °C). Elementos estruturais preferidos que contribuem para a ligação de proteínas

[0129] Em um aspecto exemplificativo da presente divulgação, o composto compreende uma porção de β-hidroxiamida, isto é, uma porção da Fórmula - C(OH)(X)-CX2-NH-C(O)-, onde cada X independentemente representa um substituinte (por exemplo, qualquer substituinte específico como definido em outro lugar aqui).

[0130] Importantemente, descobriu-se que um tal motivo estrutural de β- hidroxiamida contribui substancialmente para a capacidade dos presentes compostos para ligar a α-1-antitripsina no presente sítio de ligação. Em particular, uma tal porção pode fornecer ligação à α-1-antitripsina compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 1 pela formação de ligação de hidrogênio entre: (i) o grupo β-hidroxila e L291 de SEQ ID NO: 1; (ii) o NH do grupo carboxamida e P289 de SEQ ID NO: 1; e (iii) a carbonila do grupo carboxamida e Y244 de SEQ ID NO: 1.

[0131] Consequentemente, é preferido que o composto compreende uma porção tetravalente da Fórmula (IA)

I HO H II H (IA) N

O III ; em que o composto é capaz de se ligar a α-1-antitripsina compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 1 pela formação de ligação de hidrogênio entre: (i) grupo hidroxila I e L291 de α SEQ ID NO: 1; (ii) grupo NH II e P289 de SEQ ID NO: 1; e (iii) grupo carbonila III e Y244 de SEQ ID NO: 1.

[0132] Por tetravalente é significado que a porção da Fórmula (IA) contém quatro pontos de união, isto é, nas posições 1, 2, 3 e 4 indicadas abaixo: .

[0133] Mais preferencialmente, o composto compreende uma porção divalente da Fórmula (IB) .

[0134] Por divalente é significado que a porção da Fórmula (IB) contém dois pontos de união, isto é, nas posições 1 e 2 abaixo .

[0135] Na Fórmula (IB), como na Fórmula (IA), tipicamente o composto é capaz de se ligar a α-1-antitripsina pela formação de ligação de hidrogênio entre: (i) grupo hidroxila I e L291 de SEQ ID NO: 1; (ii) grupo NH II e P289 de SEQ ID NO: 1; e (iii) grupo carbonila III e Y244 de SEQ ID NO: 1.

[0136] R4 e R5 podem ser os mesmos ou diferentes um do outro. Eles são independentemente selecionados a partir de hidrogênio, alquila C1-5, alquenila C2-5, alquinila C2-5 e alcóxi C1-4.

[0137] R5 é preferencialmente hidrogênio, metila, etila, etenila, etinila ou metóxi. Mais preferencialmente, R5 é hidrogênio, metila ou etila. O mais preferencialmente, R5 é hidrogênio.

[0138] R4 é preferencialmente alquila C2-4, alquenila C2-4, alquinila C2-4 ou alcóxi C1-3. Mais preferencialmente, R4 é n-propila, -CH=CH-CH3, -C-C=CH2 ou etóxi. O mais preferencialmente, R4 é n-propila.

[0139] Uma combinação particularmente preferida de R5 e R4 é quando R5 é hidrogênio e R4 é n-propila. A presença de um único substituinte de n-propila no carbono α para a carboxamida foi verificada ser particularmente benéfica para permitir que o composto se ligue a α-1-antitripsina no sítio de ligação relevante.

[0140] Ainda mais preferencialmente, o composto compreende uma porção monovalente da Fórmula (IC) .

[0141] Por monovalente é significado que a porção da Fórmula (IC) contém um ponto de união, isto é, na posição 1 abaixo

[0142] Na Fórmula (IC), como nas Fórmulas (IA) e (IB), tipicamente o composto é capaz de se ligar a α-1-antitripsina pela formação de ligação de hidrogênio entre: (i) grupo hidroxila I e L291 de SEQ ID NO: 1; (ii) grupo NH II e P289 de SEQ ID NO: 1; e (iii) grupo carbonila III e Y244 de SEQ ID NO: 1. R4 e R5 são conforme definidos com referência à Fórmula (IB). R6 é um grupo arila ou heteroarila substituído ou não substituído. Normalmente, R6 é capaz de empilhar com a cadeia lateral de W194 de SEQ ID NO: 1 quando o composto é ligado à dita α-1-antitripsina.

[0143] R6 é preferencialmente substituído ou não substituído e é: (a) um grupo arila C6-10; ou (b) um grupo heteroarila que contém 5 a 10 átomos do anel. Mais preferencialmente, R6 é substituído ou não substituído e é: (a) um grupo aromático bicarbocíclico; ou (b) um grupo heteroarila bicíclico.

[0144] Quando R6 é um grupo arila, particularmente grupos preferidos incluem naftila e indanila (em ambos os casos substituídos ou não substituídos e em ambos os casos em que opcionalmente um átomo do anel de carbono pode ser substituído por um grupo carbonila), o mais preferencialmente indanila (opcionalmente em que um átomo do anel de carbono pode ser substituído por um grupo carbonila).

[0145] Quando R6 é um grupo heteroarila, grupos preferidos incluem oxindolila (por exemplo, 2-oxindolila ou 3-oxindolila), benzotienila, benzofuranila, benzimidazolila, benzotiazolila, benzisotiazolila, benzoxazolila, benzisoxazolila, benzotriazolila, indolila, isoindolila e indazolila (em todos os casos substituídos ou não substituídos e em todos os casos em que opcionalmente um átomo do anel de carbono pode ser substituído por um grupo carbonila) e mais grupos preferidos incluem oxindolila (por exemplo, 2-oxindolila ou 3-oxindolila), benzotienila, benzofuranila, benzimidazolila, benzotiazolila, benzoxazolila e indolila (em todos os casos substituídos ou não substituídos e em todos os casos em que opcionalmente um átomo do anel de carbono pode ser substituído por um grupo carbonila).

[0146] Para qualquer grupo heteroarila ou arila em que um átomo do anel de carbono é substituído por um grupo carbonila, a entidade de anel resultante é -C (O) -. Quando o átomo do anel de carbono “precursor” forma uma ligação dupla a um átomo do anel adjacente, a substituição desse átomo do anel de carbono por -C (O) - é acompanhada pela saturação do dito átomo do anel adjacente, e. por adição de um átomo de hidrogênio ou de um substituinte opcional conforme definido neste documento.

[0147] Os grupos R6 particularmente preferidos são grupos arila e heteroarila bicíclicos substituídos ou não substituídos compreendendo um anel de seis membros fundido a um anel de cinco membros (isto é, contendo 9 átomos do anel). De tais grupos R6, preferencialmente o átomo do anel do anel de cinco membros que não é adjacente a qualquer um dos átomos do anel compartilhados pelo anel de cinco membros e o anel de seis membros é um átomo de carbono que carrega um grupo carbonila, isto é, é -C(O)-. Por exemplo, grupos R6 preferidos incluem os seguintes 6 a 1 a 6 a 12:

; em que um ou mais grupos H ligados a átomos do anel (preferencialmente átomos de carbono do anel) podem ser substituídos pelos substituintes.

[0148] Ainda mais preferencialmente, R6 é um grupo 4-oxidonlila substituído ou não substituído (isto é, um grupo 4-(2-oxindolila)), que é grupo 6 - 1 acima.

[0149] Preferencialmente the R6 grupo é não substituído ou substituído com 1 a 4 substituintes, por exemplo, 1 ou 2 substituintes. Mais preferencialmente, o grupo R6 é não substituído ou substituído com 1 ou 2 substituintes. O mais preferencialmente o grupo R6 é não substituído ou substituído com 1 substituinte.

[0150] Substituintes opcionais para R6 incluem aqueles definidos na seção “Definições” aqui. Substituintes particularmente preferidos para R6 incluem átomos de halogênio, alquila C1-5, -NR2 (onde cada R é independentemente selecionado a partir de H e alquila C1-5), e hidroxila. Substituintes particularmente ainda mais preferidos incluem F, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH(CH3)2, NH2, NHCH3, N(CH3)2, OH, Cl, Br e I e substituintes ainda mais preferidos são F, CH3, NH2, OH e Cl. Substituintes mais preferidos são F e Cl (por exemplo, F).

[0151] Em um aspecto exemplificativo, R6 é um grupo da Fórmula R6′

; em que R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, F, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH(CH3)2, NH2, NHCH3, N(CH3)2, OH, Cl, Br e I. Na Fórmula R6′, R1 é mais preferencialmente selecionado a partir do grupo que consiste em H, F, CH3, NH2, OH e Cl e ainda mais preferencialmente selecionado a partir do grupo que consiste em H e F.

[0152] É particularmente preferido que o composto tenha a Fórmula (ID) .

[0153] Na Fórmula (ID), como nas Fórmulas (IA), (IB) e (IC), tipicamente o composto é capaz de se ligar a α-1-antitripsina pela formação de ligação de hidrogênio entre: (i) grupo hidroxila I e L291 de SEQ ID NO: 1; (ii) grupo NH II e P289 de SEQ ID NO: 1; e (iii) grupo carbonila III e Y244 de SEQ ID NO: 1. R4 e R5 são conforme definidos com referência à Fórmula (IB). R6 é conforme definido com referência à Fórmula (IC).

[0154] R7 na Fórmula (ID) é um grupo arila ou heteroarila substituído ou não substituído. De preferência, R7 é um grupo fenila, piridinila, piridazinila, pirimidinila pirazinila ou triazinila substituído ou não substituído. Mais preferencialmente, R7 é um grupo fenila substituído ou não substituído.

[0155] R7 é preferencialmente substituído pelos substituintes 1, 2, 3, 4 ou 5,

mais preferencialmente os substituintes 1, 2 ou 3 e o mais preferencialmente substituintes 2. Substituintes opcionais para R7 incluem aqueles definidos na seção “Definições” aqui. Substituintes R7 particularmente preferidos incluem átomos de halogênio e alquila C1-5, -NR2 (onde cada R é independentemente selecionado a partir de H e alquila C1-5), grupos hidroxila, -SH e -CN.

[0156] Um R7 particularmente preferido é um grupo fenila substituído com substituintes 1, 2, 3, 4 ou 5 (preferencialmente pelo menos 2). De preferência um tal grupo fenila compreende pelo menos um meta-substituinte e um orto-substituinte, isto é, tem a Fórmula R7″ em que R2 e R3 são substituintes, cada Rx é um substituinte independentemente selecionado e n é um número inteiro de 0 a 3. Mais preferencialmente, um tal grupo fenila tem a Fórmula R7′ .

[0157] De preferência, em R7′ e R7″, cada um de R2, R3 e qualquer Rx é independentemente selecionado a partir de átomos de halogênio e alquila C1-5, -NR2 (onde cada R é independentemente selecionado a partir de H e alquila C1-5), grupos hidroxila, -SH e -CN. Mais preferencialmente, R2 é selecionado a partir do grupo que consiste em CH3, Cl, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH(CH3)2, NH2, NHCH3, N(CH3)2, OH, SH, CN, F, Br e I; e R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em F, Cl, CN, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH(CH3)2, NH2, NHCH3, N(CH3)2, OH, Br, I e SH. Ainda mais preferencialmente, R2 é selecionado a partir do grupo que consiste em CH3, Cl, NH2, OH, SH, CN e F; e R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em F, Cl, CN, CH3, NH2, OH e SH. O mais preferencialmente, R2 é selecionado a partir do grupo que consiste em CH3 e Cl; e R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em F, Cl e CN.

[0158] Uma combinação preferida de R4, R5, R6 e R7 na Fórmula (ID) é que em que: - R4 e R5 são independentemente selecionados a partir de hidrogênio, alquila C1-5, alquenila C2-5, alquinila C2-5 e alcoxila C1-4; - R6 é um grupo arila C6-10 ou um grupo heteroarila que contém 5 a 10 átomos do anel, o dito grupo heteroarila ou arila sendo não substituído ou substituído por um ou mais (por exemplo, 1 a 5) substituintes selecionados a partir de átomos de halogênio e alquila C1-5, alcóxi C1-4, alquiltiol C1-4, -NR2 (onde cada R é independentemente selecionado a partir de H e alquila C1-5), grupos hidroxila, tiol (SH), nitrila (CN), nitro e ácido sulfônico; e - R7 é um grupo fenila, piridinila, piridazinila, pirimidinila pirazinila ou triazinila que é não substituído ou substituído por um ou mais (por exemplo, 1 a 4) substituintes selecionados a partir de átomos de halogênio e alquila C1-5, alcóxi C1-4, alquiltiol C1-4, -NR2 (onde cada R é independentemente selecionado a partir de H e alquila C1-5), grupos hidroxila, tiol (SH), nitrila (CN), nitro e ácido sulfônico.

[0159] Uma combinação mais preferida de R4, R5, R6 e R7 na Fórmula (ID) é que em que: - R4 é alquila C2-4, alquenila C2-4, alquinila C2-4 ou alcóxi C1-3; - R5 é hidrogênio, metila, etila, etenila, etinila ou metóxi; - R6 é selecionado a partir dos seguintes 6 a 1 a 6 a 12:

; em que um ou mais (por exemplo, 1 a 3) grupos H ligados a átomos do anel são opcionalmente substituídos pelos substituintes selecionados a partir de átomos de halogênio e alquila C1-5, alcóxi C1-4, alquiltiol C1-4, -NR2 (onde cada R é independentemente selecionado a partir de H e alquila C1-5), grupos hidroxila, tiol (SH), nitrila (CN), nitro e ácido sulfônico; e

R7 é um grupo fenila, piridinila, piridazinila, pirimidinila pirazinila ou triazinila que é não substituído ou substituído por um ou mais (por exemplo, 1 a 4) substituintes selecionados a partir de átomos de halogênio e alquila C1-5, -NR2 (onde cada R é independentemente selecionado a partir de H e alquila C1-5), grupos hidroxila, -SH e - CN.

[0160] Uma combinação ainda mais preferida de R4, R5, R6 e R7 na Fórmula (ID) é que em que: - R4 é n-propila, -CH=CH-CH3, -C-C=CH2 ou etóxi; - R5 é hidrogênio, metila ou etila; - R6 é um grupo 4-(2-oxindolila) que é não substituído ou substituído por um ou mais (por exemplo, 1 a 3) substituintes selecionados a partir de átomos de halogênio e alquila C1-5, -NR2 (onde cada R é independentemente selecionado a partir de H e alquila C1-5), e grupos hidroxila; e - R7 é um grupo da Fórmula R7″ em que R2 e R3 são substituintes, cada Rx é um substituinte independentemente selecionado, n é um número inteiro de 0 a 3, e cada substituinte é independentemente selecionado a partir de átomos de halogênio e alquila C1-5, -NR2 (onde cada R é independentemente selecionado a partir de H e alquila C1-5), grupos hidroxila, -SH e -CN.

[0161] Em um aspecto exemplificativo, o composto tem a Fórmula (I)

(I); em que - R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, F, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH(CH3)2, NH2, NHCH3, N(CH3)2, OH, Cl, Br e I; - R2 é selecionado a partir do grupo que consiste em CH3, Cl, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH(CH3)2, NH2, NHCH3, N(CH3)2, OH, SH, CN, F, Br e I; e - R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em F, Cl, CN, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH(CH3)2, NH2, NHCH3, N(CH3)2, OH, Br, I e SH.

[0162] De preferência, na Fórmula (I), R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, F, CH3, NH2, OH e Cl. De preferência na Fórmula (I), R2 é selecionado a partir do grupo que consiste em CH3, Cl, NH2, OH, SH, CN e F. De preferência na Fórmula (I), R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em F, Cl, CN, CH3, NH2, OH e SH. De preferência na Fórmula (I), R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, F, CH3, NH2, OH e Cl; e R2 é selecionado a partir do grupo que consiste em CH3, Cl, NH2, OH, SH, CN e F; e R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em F, Cl, CN, CH3, NH2, OH e SH.

[0163] Particularmente, de preferência, na Fórmula (I), R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em H e F. Particularmente, de preferência, na Fórmula (I), R2 é selecionado a partir do grupo que consiste em CH3 e Cl. Particularmente, de preferência, na Fórmula (I), R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em F, Cl e CN. Particularmente, de preferência, na Fórmula (I), R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em H e F; e R2 é selecionado a partir do grupo que consiste em CH3 e Cl; e R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em F, Cl e CN.

[0164] Os compostos exemplificativos não limitantes da Fórmula (I) são aqueles em que: (a) R1 é H, R2 é CH3 e R3 é F; (b) R1 é H, R2 é CH3 e R3 é Cl; (c) R1 é F, R2 é Cl e R3 é CN; e (d) R1 é F, R2 é Cl e R3 é F. Indicações Terapêuticas

[0165] Os compostos da invenção podem ser úteis no tratamento de doenças mediadas pela alfa-1-antitripsina, incluindo deficiência de alfa-1-antitripsina. Doenças mediadas pela alfa-1-antitripsina incluem deficiência de alfa-1-antitripsina, disfunção hepática, fibrose, cirrose, insuficiência hepática e carcinoma hepatocelular, doenças do pulmão, disfunção e inflamação, incluindo asma, DPOC, enfisema e câncer de pulmão, condições inflamatórias da pele, incluindo dermatite e prurido. Normalmente, as doenças mediadas pela alfa-1-antitripsina serão o resultado de uma mutação no gene da alfa-1-antitripsina e estarão em conformidade com a classe geral de doenças denominadas “serpinopatias”.

[0166] Os compostos desta invenção podem ser particularmente úteis no tratamento de doença respiratória incluindo COPD e enfisema.

[0167] Mais particularmente, os compostos da invenção podem ser úteis no tratamento de distúrbios devido a formas mutantes de alfa-1-antitripsina, incluindo a forma Z-AT mutante de alfa-1-antitripsina, sendo, portanto, potencialmente úteis no tratamento de doenças associadas com Z-AT, particularmente doenças do fígado, incluindo icterícia, insuficiência hepática, cirrose hepática, hepatite autoimune e carcinoma hepatocelular.

[0168] A deficiência de alfa-1-antitripsina afeta 1 em 2.000 pessoas de ascendência do norte da Europa, levando a doenças hepáticas e pulmonares. Mais de 100 mutações diferentes foram identificadas no gene SERPINA1 que codifica α-1- antitripsina mas cerca de 95 % dos resultados de deficiência severa da forma Z-AT (Glu342Lys). Esta substituição de aminoácidos perturba o dobramento de α-1- antitripsina resultando na secreção de apenas ~ 15 % da proteína madura. A maior parte da proteína restante é degradada pela via ERAD-proteassoma, mas aproximadamente 15 % forma polímeros ordenados que se acumulam no retículo endoplasmático dos hepatócitos. A consequente deficiência de um importante inibidor de protease na circulação resulta em proteção insuficiente dos pulmões contra a elastase neutrofilia, levando ao enfisema. O acúmulo de polímeros nos hepatócitos é citotóxico para as células, causando hepatite neonatal, cirrose e carcinoma hepatocelular. Os polímeros intra-hepáticos também sensibilizam o fígado a danos causados por agressões ambientais, como álcool, gordura ou hepatite viral.

[0169] A inibição da protease alvo-elastase por α-1-antitripsina envolve uma subversão do mecanismo proteolítico: após o ataque nucleofílico a uma sequência de reconhecimento no loop central reativo (RCL) de α-1-antitripsina, as duas proteínas tornam-se covalentemente ligadas por meio de uma ligação éster. A rápida inserção do RCL na β-folha A central segue, convertendo-o de uma configuração de 5 filamentos para 6 filamentos. A translocação concomitante da protease de um pólo da serpina para o outro, e a compressão de seu sítio ativo, evita a hidrólise dessa ligação normalmente transitória; os dois são assim irreversivelmente aprisionados em um complexo covalente protease-serpina inativado. A mutação Z encontra-se na cabeça de filamento 5 de β-folha A. Ela perturba o ambiente local, permitindo que a α-1- antitripsina povoe um intermediário instável (que foi denominado estado M *), no qual β-folha A abre e a parte superior da hélice F se desenrola. Resta ser estabelecido se a incorporação do RCL é intermolecular resultando em um dímero de folha de loop que se estende para formar polímeros mais longos ou intramolecular com uma troca de domínio da região C-terminal fornecendo a ligação entre subunidades para o polímero patológico que se deposita no tecido do fígado. Outras formas de polimerização por diferentes mutantes de α-1-antitripsina pode ser possível. A capacidade de uma β-folha A desestabilizada A de incorporar o loop central reativo é uma etapa obrigatória na formação de polímeros. Isso torna o mecanismo de polimerização intimamente relacionado ao da inibição da protease: em ambos, o loop central reativo é um ator central em uma transição termodinamicamente orientada entre uma conformação moderadamente estável e uma hiperestável.

[0170] A semelhança entre o mecanismo fisiológico de inibição da serpina e a geração patológica do polímero também é observada em outros membros da superfamília da serpina e dá origem a uma classe de patologias relacionadas denominadas serpinopatias. Estes incluem encefalopatia familiar com corpos de inclusão de neuroserpina (FENIB) causada por mutações polimerogênicas em neuroserpina e formas de trombose causadas por polimerização e deficiência de antitrombina. Terapia e métodos de tratamento

[0171] Esta invenção também fornece um composto da invenção, para o uso em terapia. Esta invenção especificamente fornece o uso de um composto da invenção, como uma substância terapêutica alvo no tratamento de doenças mediadas pela alfa-1-antitripsina.

[0172] A invenção também fornece o uso de um composto da invenção na fabricação de um medicamento para o uso no tratamento de doenças mediadas pela alfa-1-antitripsina.

[0173] Em um outro aspecto é fornecido uma combinação compreendendo um composto da invenção e pelo menos um agente terapêutico adicional útil no tratamento de doenças mediadas pela alfa-1-antitripsina.

[0174] Em um outro aspecto é fornecido uma combinação compreendendo um composto da invenção e pelo menos um agente terapêutico adicional útil no tratamento de doenças mediadas pela alfa-1-antitripsina, para o uso no tratamento de doenças mediadas pela alfa-1-antitripsina.

[0175] Em um outro aspecto é fornecido o uso de uma combinação compreendendo um composto da invenção e pelo menos um agente terapêutico adicional útil no tratamento de COPD na fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças mediadas pela alfa-1-antitripsina.

[0176] Em um outro aspecto é fornecido um método de tratar COPD compreendendo administrar a um ser humano em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma combinação compreendendo um composto da invenção e pelo menos um agente terapêutico adicional útil no tratamento de doenças mediadas pela alfa-1-antitripsina.

[0177] Em um outro aspecto é fornecido uma composição farmacêutica compreendendo uma combinação compreendendo um composto da invenção e pelo menos um agente terapêutico adicional útil no tratamento de doenças mediadas alfa- 1-antitripsina e um ou mais de excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Doença Respiratória

[0178] Para o tratamento de doença respiratória, incluindo COPD, compostos ou composições farmacêuticas da invenção podem ser administrados junto com um ou mais broncodilatadores, ou composições farmacêuticas do mesmo. Por exemplo, os compostos da invenção podem ser formulados junto com um ou mais broncodilatadores em uma única composição, tal como um pó seco para inalação. Alternativamente, uma composição farmacêutica compreendendo um composto da invenção pode ser administrada em conjunto com uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais broncodilatadores, tanto simultânea quanto sequencialmente. Em uma outra alternativa, uma composição compreendendo um composto da invenção e um broncodilatador pode ser administrada em conjunto com uma composição farmacêutica compreendendo um outro broncodilatador. Em uma modalidade, uma composição farmacêutica compreendendo um composto da invenção e uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais broncodilatadores podem ser cada uma mantida em dispositivo adequado para a administração simultânea de ambas as composições via inalação. Em uma outra modalidade, uma composição farmacêutica compreendendo um composto da invenção junto com um broncodilatador e uma composição farmacêutica compreendendo um outro broncodilatador podem ser cada uma mantida em dispositivo adequado para a administração simultânea de ambas as composições via inalação.

[0179] Broncodilatadores adequados para administração juntamente com compostos da invenção incluem agonistas 2-adrenoreceptor e agentes anticolinérgicos. Exemplos de agonistas de 2-adrenoreceptor, incluem, por exemplo, vilanterol, salmeterol, salbutamol, formoterol, salmefamol, fenoterol carmoterol, etanterol, naminterol, clenbuterol, pirbuterol, flerbuterol, reproterol, bambuterol, indacaterol, terbutalina e sais dos mesmos, por exemplo, o sal de xinafoato (1-hidróxi- 2-naftalenocarboxilato) de salmeterol, o sal de sulfato de salbutamol ou sal fumarato de formoterol. Exemplos de agentes anticolinérgicos incluem umeclidínio (por exemplo, como o brometo), ipratrópio (por exemplo, como o brometo), oxitrópio (por exemplo, como o brometo) e tiotrópio (por exemplo, como o brometo). Em uma modalidade, um composto da invenção pode ser administrado em conjunto com um agonista de 2-adrenoreceptor, tal como vilanterol, e um agente anticolinérgico, tal como umeclidínio. Doença hepática

[0180] Para o tratamento de doença hepática os compostos ou composições farmacêuticas da invenção podem ser administrados com outros agentes terapêuticos úteis no tratamento dessas doenças. Métodos Sintéticos Gerais

[0181] Os compostos de fórmula geral (I) podem ser preparados por métodos conhecidos na técnica de síntese orgânica. Em todos os métodos, é bem entendido que grupos de proteção para grupos sensíveis ou reativos podem ser empregados quando necessário, de acordo com os princípios gerais da química. Os grupos de proteção são manipulados de acordo com métodos padrão de síntese orgânica (T. W.

Green e P. G. M. Wuts (1999) Protective Groups in Organic Synthesis, 3ª edição, John Wiley & Sons). Estes grupos são removidos em uma fase conveniente da síntese do composto usando métodos que são facilmente evidentes para os especialistas na técnica. A seleção de processos, bem como as condições de reação e a ordem de sua execução, devem ser consistentes com a preparação de compostos de Fórmula (I). Outros compostos da invenção também podem ser preparados usando métodos rotineiramente conhecidos na técnica e, quando aplicável, com referência aos princípios e reações específicas aqui descritas. Método para identificar um composto candidato a fármaco

[0182] A descoberta dos presentes inventores de que os compostos da invenção inibem a polimerização de α-1-antitripsina pela ligação à proteína de α-1- antitripsina em um sítio de ligação particular também fornece origem a um método de ensaio com base em determinar a capacidade de um composto candidato a fármaco arbitrário para ligar no mesmo sítio na proteína.

[0183] Assim, a presente invenção ainda fornece um método para identificar um composto candidato a fármaco. No método, o composto candidato a fármaco é contatado com α-1-antitripsina para formar um complexo entre o composto candidato a fármaco e α-1-antitripsina. A α-1-antitripsina é uma proteína compreendendo SEQ ID NO: 1 como definido em outro lugar aqui (ou um derivado de sua sequência com uma ou mais substituições de aminoácido). De preferência, a etapa de contatar o composto candidato a fármaco com α-1-antitripsina compreende formando um cristal de α-1-antitripsina e contatar o dito cristal com o dito candidato a fármaco.

[0184] Subsequentemente, o método compreende resolver a estrutura do complexo, que pode ser feito rotineiramente usando métodos de resolução de estrutura de cristal bem conhecidos na técnica (ver também, por exemplo, o Exemplo 2 deste pedido).

[0185] Finalmente, o método compreende determinar se, no complexo, o composto candidato a fármaco está presente no sítio de ligação conforme definido aqui. Se o composto candidato a fármaco está presente no sítio de ligação, então isso é indicativo de um composto que pode ser capaz de inibir a polimerização de α-1- antitripsina, e assim ter propriedades terapêuticas benéficas, por analogia com os compostos da presente invenção conforme discutido em outro lugar aqui.

EXEMPLOS Exemplo 1 Métodos Gerais

[0186] A menos que estabelecido de outro modo, os materiais de partida estavam disponíveis comercialmente. Todos os solventes e reagentes comerciais eram de qualidade laboratorial e foram usados conforme recebidos.

[0187] Os compostos da Fórmula (I) podem ser sintetizados substancialmente de acordo com o Esquema de reação 1 de um acoplamento de amida do amino álcool correspondente e ácido benzoico correspondente. Esquema de reação 1

Abreviações: DMSO Dimetilsulfóxido HATU N-óxido de N-[(Dimetilamino)-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]piridin-1- ilmetileno]-N- metilmetanamínio hexafluorofosfato r.t.

Temperatura Ambiente RT Tempo de retenção Métodos LCMS Método Descrição Coluna: coluna Acquity UPLC CSH C18 (tamanho de partícula de 50 mm x 2,1 mm i.d. 1,7 μm) Fase móvel: A: 0,1 % de ácido fórmico em água; B: 0,1 % de A ácido fórmico em acetonitrila Tempo (min) /% B: 0/3 %, 1,5/99,9 %, 1,9/99,9 %, 2,0/3,0 % Temp.

Da coluna: 40 ºC Taxa de fluxo: 1,0 mL/min

Coluna: coluna Acquity UPLC BEH C18 (tamanho de partícula de 50 mm x 2,1 mm d.i. 1,7 μm) Fase móvel: A: solução aquosa de amônia 0,1 % v/v pH 10; B: B acetonitrila Tempo (min) /% B: 0/3 %, 1,5/99,9 %, 1,9/99,9 %, 2,0/3,0 % Temp.

Da coluna: 40 ºC Taxa de fluxo: 1,0 mL/min Coluna: Acquity UPLC BEH C18 (50 mm x 2,1 mm, tamanho de partícula de 1,7 µm) Fase móvel: A: 0,1 % de ácido fórmico em água; B: 0,1 % de C ácido fórmico em acetonitrila Tempo (min) /% B: 0/3,0 %, 1,5/100,0 %, 1,9/100,0 %, 2,0/3 % Temp.

Da coluna: 40 ºC Taxa de fluxo: 1,0 mL/min

Método HPLC Quiral

Método Descrição

HPLC Coluna Chiralpak AS-H (25 x 0,46 cm, tamanho de Quiral partícula de 5 µm) Fase móvel: n-Hexano/(Etanol + 0,1 % de isopropilamina) 65/35 % v/v Taxa de fluxo: 1,0 ml/min Fluxo taxa: 1,0 ml/min

Composto 1: N-[(1S,2R)-1-(3-fluoro-2-metilfenil)-1-hidroxipentan-2-il]-2-oxo-2,3-dihidro-1H- indol-4-carboxamida

[0188] Em um frasco de fundo redondo, para uma solução de cloreto de (1S,2R)-2-amino-1-(3-fluoro-2-metilfenil)pentan-1-ol (intermediário 1, 12,9 g, 51,9 mmol), ácido 2-Oxoindolina-4-carboxílico (9,2 g, 51,9 mmol) e trietilamina (10,5 g, 103,9 mmol) em dimetilformamida (100 ml) a 0 °C, HATU (19,8 g, 51,9 mmol) foram adicionados. A mistura de reação foi agitada a 0 °C por 1 h e, em seguida, foi diluída com acetato de etila (200 ml). A solução foi lavada com uma solução saturada de NaHCO3 (100 ml) e salmoura (2 x 100 ml). A porção orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada e evaporada sob pressão reduzida para obter material bruto que foi purificado por cromatografia instantânea (Biotage Isolera, cartucho de 340 g, Diclorometano/Acetonitrila 80/20 a 40/60 como eluente) para gerar N-[(1S,2R)-1-(3- fluoro-2-metilfenil)-1-hidroxipentan-2-il]-2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-4-carboxamida como sólido branco (12,5 g, Y = 65,0 %).

[0189] Em um frasco de fundo redondo, (12,5 g, 33,74 mmol) foram colocados em suspensão em acetato de etila (100 ml) a temperatura ambiente. A suspensão foi aquecida a 60 °C e acetato de etila foi adicionado até a mistura torna-se homogênea (≈ 200 ml de solvente totalmente). A solução foi deixada arrefecer a temperatura ambiente durante a noite e o branco precipitado formado foi coletado por filtração de sucção. O sólido foi armazenado em forno a 40 °C sob vácuo para obter cristalino N- [(1S,2R)-1-(3-fluoro-2-metilfenil)-1-hidroxipentan-2-il]-2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-4- carboxamida como sólido branco (10,8 g, > 98 % ee, 87 % de recuperação). LCMS: Temperatura ambiente 0,90 min, MH+ 371 (Método A)

[0190] RMN de 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0,80 (t, J = 7,34 Hz, 3 H), 1,07 - 1,21 (m, 1 H), 1,30 - 1,43 (m, 1 H), 1,45 - 1,54 (m, 1 H), 1,56 - 1,67 (m, 1 H), 2,31 (d, J=1,51

Hz, 3 H), 3,46 (s, 2 H), 4,06 - 4,17 (m, 1 H), 4,85 (t, J = 5,21 Hz, 1 H), 5,44 (d, J = 4,80 Hz, 1 H), 6,89 (d, J = 7,68 Hz, 1 H), 6,99 (t, J = 8,92 Hz, 1 H), 7,11 - 7,25 (m, 3 H), 7,28 (d, J = 7,68 Hz, 1 H), 7,97 (d, J = 8,92 Hz, 1 H), 10,45 (s, 1 H). HPLC Quiral: Temperatura ambiente de 6,3 min Intermediário 1: cloreto de (1S,2R)-2-amino-1-(3-fluoro-2-metilfenil)pentan-1-ol

[0191] Em um frasco de fundo redondo, terc-butil ((1S,2R)-1-(3-fluoro-2- metilfenil)-1-hidroxipentan-2-il)carbamato (intermediário 2, 15,8 g, 50,74 mmol) foi dissolvido em HCl em dioxano 4 M (100 ml) a 0 °C. A mistura foi agitada por 2 h na mesma temperatura e o solvente foi evaporado. O resíduo foi colocado em suspensão em 300 ml de éter dietílico e agitado por 1 h. A suspensão foi filtrada para obter cloreto de (1S,2R)-2-amino-1-(3-fluoro-2-metilfenil)pentan-1-ol como um sólido branco (11,9 g, Y = 95,0 %). LCMS: Temperatura ambiente de 0,85 min, MH+ 212 (Método B) Intermediário 2: terc-butil ((1S,2R)-1-(3-fluoro-2-metilfenil)-1-hidroxipentan-2-il)carbamato

[0192] (R)-terc-butil (1-(3-fluoro-2-metilfenil)-1-oxopentan-2-il)carbamato (intermediário 3, 18,7 g, 60,4 mmol) foi dissolvido em tolueno (150 ml) em um frasco de fundo redondo, e isopropanol (100 ml) a temperatura ambiente e isopropóxido de alumínio (49,4 g, 241,8 mmol) foram adicionados. A solução foi agitada a 50 °C por 16 h e, em seguida, foi vertida em uma solução saturada de NH4Cl e extraída com acetato de etila (4 x 300 ml). As porções orgânicas foram coletadas, secas sobre sulfato de sódio e o solvente foi removido sob pressão reduzida para obter material bruto nomeado como óleo amarelo pálido. Esse material bruto foi purificado por cromatografia instantânea (Biotage Isolera, cartucho de 340 g, Cicloexano/Acetato de etila 80/20 a 50/50 como eluente) para gerar terc-butil ((1S,2R)-1-(3-fluoro-2- metilfenil)-1-hidroxipentan-2-il)carbamato como um óleo incolor (15,8 g, Y = 84,0 %) LCMS: Temperatura ambiente de 1,16 min, MH+ 312 (Método A) Intermediário 3: (R)-terc-butil (1-(3-fluoro-2-metilfenil)-1-oxopentan-2-il)carbamato

[0193] Para uma mistura de ácido (3-fluoro-2-metilfenil)borônico (intermediário 4, 50 g, 0,32 mol) em um frasco de fundo redondo, (R)-S-p-tolil 2-((terc- butoxicarbonil)amino)pentanotioato (53,2g, 0,16 mol), tris(dibenzilidenoacetona)dipaládio(0) (7,3 g, 8,0 mmol), e cobre(I) tiofeno-2- carboxilato (61,0 g, 0,32 mol) em 1,4-Dioxano (500 ml) a temperatura ambiente, trietil fosfito (10,6 g, 64,0 mmol) foram adicionados. A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 4 h e, em seguida, foi filtrada sobre uma almofada de celite. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida e o bruto foi dissolvido em acetato de etila (500 ml); a solução foi lavada com água (500 ml) e salmoura (2 x 500 ml). A porção orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada e evaporada sob pressão reduzida para obter material bruto (100 g) como óleo preto. Um lote de 65 g do material bruto foi purificado por cromatografia instantânea (Biotage Isolera, cartucho de 3 x 340 g, Cicloexano/Diclorometano 60/40 a 0/100 como eluente) para gerar (R)-terc-butil (1- (3-fluoro-2-metilfenil)-1-oxopentan-2-il)carbamato como óleo incolor (18,7 g, 60,4 mmol). LCMS: Temperatura ambiente de 1,26 min, MH+ 310 (Método A) Intermediário 4:

(R)-S-p-tolil 2-((terc-butoxicarbonil)amino)pentanotioato

[0194] Para uma solução de ácido (R)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)pentanóico (intermediário 5, 85,0 g, 0,39 mol) em acetato de etila (800 ml) em um frasco de fundo redondo, 4-metilbenzeno-1-tiol (53,5 g, 0,43 mol) e 1- Hidroxibenzotriazol (50,0 g, 0,59 mol) foram adicionados. A mistura foi arrefecida a 0 °C e N,N′-Diciclohexilcarbodiimida (80,5 g, 0,39 mol) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 16 h; o sólido branco formado depois foi removido por filtração de sucção. O filtrado foi lavado com uma solução saturada de NaHCO3 (700 ml), água (700 ml) e salmoura (700 ml). A porção orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida para obter material bruto como um sólido branco. O material bruto foi purificado por cromatografia instantânea (Biotage Isolera, cartucho de 340 g, Cicloexano/Diclorometano 60/40 a 0/100 como eluente) para gerar (R)-S-p-tolil 2- ((terc-butoxicarbonil)amino)pentanotioato como um sólido branco (111,0 g, Y = 88,0 %). LCMS: Temperatura ambiente de 1,30 min, MH+ 324 (Método A) Intermediário 5: ácido (R)-2-((terc-butoxicarbonil)amino)pentanóico

[0195] Em um frasco de fundo redondo, para uma suspensão de ácido (2R)- 2-aminopentanóico (75,0 g, 0,64 mol) foi colocada em um frasco de fundo redondo em água (250 ml) a temperatura ambiente, carbonato de sódio (68,0 g, 0,64 mol) foi adicionado.

Uma solução de dicarbonato de di-terc-butila (139,9 g, 0,64 mol) em tetra- hidrofurano (400 ml) foi adicionado às gotas por uma hora.

A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 24 h e, em seguida, concentrada sob pressão reduzida (aproximadamente 400 ml). Uma solução saturada de ácido cítrico (300 ml) foi adicionada até o pH atingir o valor de ≈ 3. A camada aquosa foi lavada com acetato de etila (4 x 500 ml). As porções orgânicas foram coletadas, secas sobre sulfato de magnésio e evaporadas sob pressão reduzida para obter ácido (R)-2-((terc- butoxicarbonil)amino)pentanóico como um óleo amarelo pálido (137,0 g, Y = 98,6 %). LCMS: Temperatura ambiente de 0,82 min, MH+ 218 (Método A) Preparados da mesma forma foram:

Tempo de retenção

+ molecular

Método LCMS Exemplo n°

Identidade Estrutura

Nome

(min)

Íon

Composto N-((1S,2R)-1-(3- 0,93 387 C 2 cloro-2- (MH+) metilfenil)-1- hidroxipentan-2- il)-2-oxoindolina- 4-carboxamida Composto N-((1S,2R)-1-(2- 0,82 416 C 3 cloro-3- (MH+) cianofenil)-1- hidroxipentan-2- il)-7-fluoro-2- oxoindolina-4- carboxamida

Composto N-((1S,2R)-1-(2- 0,89 409 C 4 cloro-3- (MH+) fluorofenil)-1- hidroxipentan-2- il)-7-fluoro-2- oxoindolina-4- carboxamida

[0196] As potências dos compostos da invenção para a inibição da polimerização de Z-alfa-1-antitripsina (Z-A1AT) podem ser determinadas por um ensaio de transferência de energia de fluorescência resolvido no tempo (TR-FRET) realizado em Z-A1AT purificado como aqui descrito. Todos os compostos da Fórmula (I) demonstraram atividade inibitória de polimerização de Z-A1AT in vitro com uma metade da concentração inibitória máxima (IC50) de menos do que um micromolar (1 µM). Dados de atividade média para o ensaio descrito abaixo para os compostos 1 a 4: Composto 1 PIC50 8,3 SD= ,18, Faixa 8,0 a 8,4 Composto 2 PIC50 8,6 SD= ,15, Faixa 8,4 a 9,9 Composto 3 PIC50 8,5 SD= ,1 Faixa 8,4 a 8,6 Composto 4 PIC50 8,2 SD= ,21, Faixa 7,8 a 8,5 Inibição de protocolo de ensaio de polimerização de Z-alfa-1-antitripsina

[0197] Z-alfa-1-antitripsina foi purificada a partir de plasma humano de doadores homozigotos para a forma Z-A1AT. A purificação foi realizada de acordo com um protocolo publicado (Lomas et al. Biochemistry 1993; 32:500-508) envolvendo precipitação com sulfato de amônio, fracionamento por troca de tiol e fracionamento por troca aniônica.

[0198] Z-A1AT purificado foi diluído para 5 nM em tampão PBS com 0,01 % de Tween-20 e misturado com diferentes concentrações de compostos inibidores dissolvidos em DMSO, em placas de ensaio de 384 poços. Após incubação por 72 horas a 37 ºC, a quantidade de polímero de Z-A1AT foi detectada usando um formato de ensaio de transferência de energia de ressonância de fluorescência resolvido no tempo (TR-FRET), adicionando uma mistura de detecção de anticorpo às placas de ensaio. A mistura de detecção continha um anticorpo monoclonal específico do polímero de A1AT (Miranda et al. Hepatology 2010; 52:1078-1088), anticorpo anti- camundongo marcado com Térbio, um anticorpo anti-A1AT policlonal de coelho e um anti-coelho marcado com anticorpo Alexa488. Os dados de TR-FRET foram normalizados para controles (controle de veículo de DMSO dando 0 % de inibição, concentrações de saturação de um composto ativo dando 100 % de inibição) e os valores de IC50 foram derivados ajustando curvas logísticas de 4 parâmetros aos dados normalizados. Exemplo 2 Introdução

[0199] O objetivo deste trabalho foi desenvolver um corretor de pequenas moléculas de dobramento de Z-α-1-antitripsina capaz de bloquear a formação de polímero dentro do retículo endoplasmático de hepatócitos e que fosse adequado para dosagem oral como um tratamento potencial para a deficiência de α-1-antitripsina. Para conseguir isso, uma série de desafios precisava ser superada: (i) a forma específica da proteína que representa o alvo do fármaco é um intermediário de dobramento altamente móvel, localizado no retículo endoplasmático; (ii) a farmacologia direcionada envolve a prevenção de uma grande interação proteína- proteína e o requisito de que uma molécula tenha propriedades semelhantes a fármacos para permitir a dosagem oral restringe muito o espaço químico adequado; (iii) como um fármaco alvo não clássico, os ligantes de pequenas moléculas podem não estar bem representados em bibliotecas de pesquisa de compostos; (iv) a concentração relativamente alta de Z-α-1-antitripsina monomérica circulante (~ 5 µM), mesmo em indivíduos com deficiência plasmática grave, representa um sumidouro de alta afinidade para o composto, restringindo seu acesso ao alvo no hepatócito e exigindo alta concentrações sanguíneas totais de fármaco para atingir concentração de fármaco livre suficiente e engajamento alvo no fígado.

[0200] São relatados neste documento os primeiros corretores semelhantes a fármacos de molécula pequena de dobramento de Z-α-1-antitripsina obtidos por meio da otimização de resultados de uma triagem de tecnologia de biblioteca codificada, que são adequados para administração oral, dobramento correto em hepatócitos derivados de iPSC de pacientes humanos e aumento de níveis de Z-α-1-antitripsina circulantes em um modelo de camundongo transgênico de deficiência de α-1- antitripsina. Materiais e Métodos

[0201] A alfa1-antitripsina foi purificada a partir do plasma de homozigotos ZZ e MM α-1-antitripsina conforme descrito em Lomas et al., Biochemistry. 1993;32:500-

8. A α-1-antitripsina Cys232Ser recombinante foi expressada e purificada como detalhado em Irving et al. Methods Enzymol. 2011;501:421-66 e Haq et al. Biosci Rep. 2013;33(3):e00046. “Composto 1” é N-[(1S,2R)-1-(3-fluoro-2-metilfenil)-1-hidroxipentan-2-il]-2- oxo-2,3-dihidro-1H-indol-4-carboxamida: .

Triagem de tecnologia de biblioteca codificada por DNA (ELT)

[0202] Uma triagem de tecnologia de biblioteca codificada (ELT) de aproximadamente 10 milhões de compostos foi usada para identificar pequenas moléculas que irão estabilizar a Z-α-1-antitripsina monomérica a 37 e 41 ºC. Os ligantes mais fortes foram eluídos, identificados por sua etiqueta de DNA e sintetizados. Avaliação baseada em anticorpos da polimerização de Z-α-1-antitripsina

[0203] Um ensaio de transferência de energia de ressonância de fluorescência resolvida no tempo baseado em anticorpo (TR-FRET) foi usado para monitorar a polimerização de Z-α-1-antitripsina 5 nM após incubação com concentrações variáveis de compostos a 37 °C por 72 horas. Este ensaio usou o anticorpo monoclonal 2C1 que é específico para polímeros patológicos de α-1- antitripsina (Miranda et al. Hepatology 2010; 52:1078-1088), um anticorpo policlonal que se liga a todas as formas de α-1-antitripsina, um anti-doador de fluorescência de IgG de camundongo (Eu-W1024) e um aceitador de IgG anti-coelho (APC). Ensaio de ligação de competição bioquímica para Z-α-1-antitripsina e M α-1- antitripsina

[0204] Um derivado fluorescente do composto 1 foi preparado por derivatização do composto 1 em seu átomo de nitrogênio do anel com um marcador Alexa Fluor 488 por meio de um grupo ligante orgânico curto.

[0205] Uma diluição em série de compostos de teste em DMSO foi diluída 25 vezes com tampão de ensaio, e 2,5 μl desta diluição intermediária transferidos para uma placa de microtitulação de 384 poços de baixo volume preta (Greiner BioOne; produto nº 784076). 5 μl de uma solução pré-misturada de tampão de ensaio contendo 2,3 nM de ligação do anticorpo monoclonal 3Cl 1 à antitripsina, 3 nM de IgG anti- camundongo marcado com Térbio LanthaScreen que se ligará ao anticorpo 3C11 (Invitrogen), bem como Z-alAT 2 nM ou M-alAT 10 nM foram adicionados usando um dispensador Thermo Multidrop (ThermoFisher). As placas foram incubadas em temperatura ambiente por 30 min, em seguida, 2,5 μl de solução de ligante foram adicionados, contendo 40 nM (para Z-α-1-antitripsina) ou 2 μM (para M α-1- antitripsina) do derivado fluorescente do composto 1, usando um dispensador Thermo Multidrop.

[0206] As placas foram seladas e incubadas durante a noite à temperatura ambiente ou durante 3 dias a 4 °C e depois 6 horas à temperatura ambiente. Na ausência de compostos competidores, a transferência de energia pode ocorrer entre os fluoróforos Terbium- e Alexa488. Os compostos que competem com o derivado fluorescente do composto 1 inibem este sinal. O sinal de TR-FRET foi lido em um leitor de placas Envision, por excitação de Térbio a 337 nm e detecção da emissão a 520 nm e 495 nm.

[0207] As constantes de dissociação (KD) para a afinidade de compostos para a proteína de Z-a1AT ou M-a1AT foram derivadas dos valores de pIC50 de acordo com a equação de Cheng-Prusoff, levando em consideração a concentração do ligante fluorescente utilizado em relação à sua afinidade conforme determinado em experimentos independentes de polarização de fluorescência e TR-FRET: KD(composto) = 10-pIC50(composto)/(1 -([Aglutinante]/KD(Aglutinante)). Experimentos de associação de compostos

[0208] A fluorescência intrínseca do triptofano de α-1-antitripsina é dominada por Trp194 na região de violação (Tew et al. J Mol Biol. 9 de novembro de 2001; 313 (5):1161-9) e pode ser usada para monitorar o progresso da ligação do composto. Plasma M e Z-α-1-antitripsina foram diluídos para 0,2 mg/ml em PBS 100 µM e Composto 1 (ou um volume equivalente de DMSO) adicionado a uma concentração de 10 µM. A fluorescência (λex = 280 nm, λem = 330 nm) foi monitorada por pelo menos 2 horas, e o tempo de meia mudança foi calculado.

[0209] Os dados cinéticos em experimentos de fluxo interrompido foram ajustados a curvas de decaimento exponencial com deslocamento e inclinação linear, para contabilizar uma variação constante no fundo, resultando em constantes de taxa de pseudo-primeira ordem k(obs): y = A0 · e-k(obs)t + inclinação · t + deslocamento onde t = tempo e A0 = amplitude a t = 0. A taxa de ativação de segunda ordem foi então obtida como a inclinação ao traçar os valores de k(obs) versus concentração de composto. As taxas de desativação foram calculadas a partir das taxas de ativação e os valores de KD determinados a partir dos ensaios de ligação. Biologia Celular

[0210] As células CHO Tet-On que expressam condicionalmente Z-α-1- antitripsina (Ordóñez A et al. Hepatology 2013;57(5):2049-60.) foram simultaneamente tratados com 0,5 µg/mL de oxiciclina e várias concentrações de compostos durante 48 horas em placas de 6 poços. As células sem doxiciclina ou tratadas com DMSO a 1 % v/v atuaram como controles. As células foram lisadas e o polímero de Z-α-1-antitripsina intracelular foi avaliado por sanduíche ELISA com o anticorpo monoclonal 2C1 (Miranda et al. Hepatology. 2010;52:1078-88). A α-1- antitripsina recentemente sintetizada foi avaliada pelo crescimento de células induzidas para expressar Z-α-1-antitripsina em DMEM sem metionina (Met) e cisteína (Cys) por 1 h e, em seguida, marcando com 1,3 MBq de 35S-Met/Cys por 15 min. As células foram então enxaguadas e incubadas em meio de busca contendo um excesso de Met e Cys não marcados por 0, 2 e 6 h. Após o período de perseguição, o meio foi coletado e as células foram colhidas. A α-1-antitripsina do meio e lisados celulares foi imunoprecipitada com um anticorpo de α-1-antitripsina policlonal ou o anticorpo monoclonal 2C1 que detecta polímeros dividindo cada amostra em duas partes iguais. As proteínas marcadas radioativamente foram ressuspensas em tampão de carregamento de SDS, fervidas durante 5 min, separadas por SDS-PAGE de acrilamida a 10 % p/v e quantificadas por autorradiografia. Microscopia de Imunofluorescência

[0211] As células CHO-K1 foram incubadas com/sem doxiciclina para expressar α-1-antitripsina e com ou sem a pequena molécula de interesse, fixada com formaldeído a 3,7 % v/v em PBS por 15 min, permeabilizada com Triton X- 100 a 0,1 % v/v em PBS e então bloqueado com FBS a 10 % v/v em PBS por 30 min. As células foram marcadas com um anticorpo policlonal de coelho para antitripsina-1 total ou o anticorpo monoclonal 2C1 que detecta polímeros seguidos por anticorpos secundários anti-coelho conjugados com vermelho de Texan ou anti-camundongo marcados com FITC, respectivamente. As células foram fotografadas usando um microscópio de fluorescência de campo amplo Axiovert 200 (Carl Zeiss Microimaging Inc., Thornwood, NY). Experimentos de estabilidade térmica

[0212] A estabilidade do estado nativo das serpinas na adição de compostos foi investigada por desnaturação térmica na presença de uma concentração 5 X de solução corante SYPRO Orange (Life Technologies). Foi utilizada uma concentração final de proteína de 0,1 mg/ml e 50 µM de composto suspenso em PBS (Nettleship et al. Methods Mol Biol. 2008; 426:299-318). As amostras foram aquecidas de 25 °C a 95 °C a uma taxa de 1 °C/min em três experimentos separados em um instrumento de PCR em tempo real quantitativo Eppendorph Mastercycler Realplex4, e a fluorescência no bin 605 ± 15 nm registrada. O ponto médio de desnaturação (Tm) é a temperatura na qual a primeira derivada da intensidade da fluorescência contra a temperatura atinge um máximo.

[0213] A resistência à polimerização induzida por calor também foi determinada usando um ensaio de temperatura constante de ponto final. O plasma purificado M e Z-α-1-antitripsina foram diluídos para 0,2 mg/ml em PBS com glicerol a 5 % v/v, incubados com 10 µM de Composto 1 (ou com DMSO sozinho) por 2 horas e depois aquecidos em alíquotas de 20 µL por um mais 4 horas em um termociclador com um gradiente de 48 a 65 °C aplicado através da placa. As amostras foram analisadas em gel de acrilamida Bis-Tris Native-PAGE a 3 a 12 % p/v (Life Technologies). Desdobramento de equilíbrio

[0214] Bis-ANS é um corante que relata o aparecimento do intermediário de desdobramento de α-1-antitripsina (Dafforn et al. J Biol Chem. 1999;274:9548-55.). Em uma microplaca, alíquotas de 10 µl de M e Z-α-1-antitripsina a 0,5 mg/ml com 100 µM de bis-ANS e 100 µM de Composto 1 (ou um volume equivalente de DMSO) foram rapidamente misturadas com várias concentrações de cloridrato de guanidina dando um concentração final de 0 a 6 M desnaturante em PBS. As medições de intensidade de fluorescência de bis-ANS (λex = 385 nm, λem = 490 nm) foram registradas uma vez que um sinal estável foi alcançado, e os valores escalados para ficar entre 0 e 1,0. Redobramento rápido

[0215] O redobramento de α-1-antitripsina in vitro não é totalmente reversível, devido à perda de material por agregação amorfa, polimerização e dobramento incorreto. Essas contribuições não podem ser facilmente deconvoluídas por métodos espectroscópicos em massa e, portanto, o redobramento foi avaliado por PAGE não desnaturante. M e Z-α-1-antitripsina a 9,6 mg/ml foram desnaturados em ureia 6 M e fosfato de sódio 15 mM pH 8,0 por 4 horas à temperatura ambiente, e 1,25 µl foi dobrado rapidamente em 250 µl de PBS contendo 0 50 µM de Composto 1 e um concentração normalizada de DMSO a 5 % v/v. Após incubação durante 1 hora à temperatura ambiente, as amostras foram analisadas por gel PAGE Bis-Tris nativo de acrilamida corado com Coomassie de 3 a 12 % p/v (Life Technologies). Cristalografia

[0216] Cristais de α-1-antitripsina Cys232Ser recombinante foram cultivados usando o método de difusão de vapor de gota suspensa combinando 1 μl de 12,1 mg/ml de proteína com 1 μl de tampão de reservatório e equilibrando contra tampão de reservatório, que compreendia MES 0,1 M de tampão de pH 6,0 com PEG 1500 de 20 a 22,25 % p/v. Um cristal que se formou em MES 0,1 M pH 6,0 com PEG 1500 a 22,25 % p/v foi transferido para um tampão contendo MES 0,09 M pH 6,0, PEG1500 a 18 %, glicerol a 13,5 %, d6 DMSO a 5 % e 25 mM do composto para incubação a

20 °C durante 24 horas. Os cristais foram congelados em nitrogênio líquido e os dados foram coletados na linha de luz Diamond synchrotron I03.

[0217] Especificamente, a proteína de α-1-antitripsina usada para os experimentos de cristalização correspondeu à variante M1V de M-AT com as seguintes modificações: (a) Cys232 é mutado para Ser (para facilidade de manuseio, eliminando a necessidade de agentes redutores durante diferentes ensaios; a substituição é conservadora); (b) o componente do peptídeo sinal (MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLA) e Glu1 no N-terminal de M-AT de mamífero não estão presentes no N-terminal da proteína usada; (c) o N-terminal da proteína usada tem uma etiqueta de afinidade hexahistidina para facilidade de purificação e alguns aminoácidos fornecidos pelo vetor de expressão, sendo a sua sequência MRGSHHHHHHT.

[0218] A sequência completa da proteína usada foi assim:

MRGSHHHHHHTDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQ LAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQEL LRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQ INDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQV TTVKVPMMKRLGMFNIQHSKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTH DIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLK

LSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMG KVVNPTQK; em que a porção sublinhada corresponde à SEQ ID NO: 1. Resultados Identificação do Composto 1 por meio de triagem de Tecnologia de Biblioteca Codificada, projeto de fármacos guiado por estrutura e perfil celular.

[0219] A Z-α-1-antitripsina é uma molécula conformacionalmente dinâmica que polimeriza a partir de uma conformação quase nativa no final da via de dobramento e, portanto, representa um alvo não clássico para a descoberta de fármacos. Assim, concluiu-se que a descoberta de acertos pode se beneficiar da exploração de um espaço químico amplo e minimamente enviesado. Uma triagem de tecnologia de biblioteca codificada (ELT) foi usada para pesquisar ligantes para Z-α- 1-antitripsina. A Z-α-1-antitripsina glicosilada, purificada a partir do plasma de homozigotos Z-α-1-antitripsina, foi usada uma vez que representa o fármaco fisiopatológico humano relevante para a doença. As seleções de ELT foram realizadas imobilizando Z-α-1-antitripsina em uma resina de afinidade baseada em anticorpo para incubação com bibliotecas de compostos codificados por DNA, com triagem secundária por experimentos de mudança térmica.

[0220] Uma única série principal de hidroxi-carboxamidas quirais foi identificada a partir da triagem de ELT que demonstrou atividade funcional no bloqueio da polimerização no imunoensaio de TR-FRET. A otimização do acerto inicial seguiu uma abordagem de projeto baseada em estrutura, explorando o conhecimento de estruturas cristalinas de ligantes de pequenas moléculas complexados com α-1- antitripsina. Verificou-se que a hidroxicarboxamida central facilita a ligação à Z-α-1- antitripsina. Uma cadeia lateral de alquila (no carbono adjacente ao átomo N da carboxamida) também foi considerada benéfica, particularmente uma cadeia lateral de propila. O desenvolvimento da química medicinal centrou-se nas modificações, como os grupos aromáticos nas extremidades terminais do composto. Isso resultou na descoberta do Composto 1. Composto 1 é um potente inibidor de polimerização in vitro e em modelos celulares de doença

[0221] O Composto 1 se liga a Z-α-1-antitripsina com uma alta afinidade (KD) de 1,5 nM conforme determinado por um ensaio de ligação de competição com um derivado marcado com fluorescência; um valor semelhante foi obtido por termoforese em microescala. A ligação demonstra seletividade com afinidade pelo menos 50 vezes inferior para a M α-1-antitripsina de tipo selvagem purificada por plasma.

[0222] A forma das curvas e a espectrometria de massa nativa eram consistentes com um único sítio de ligação do composto. Nenhuma ligação do derivado fluorescente a polímeros da variante Z pode ser observada, indicando perda da bolsa de ligação após a polimerização e uma seletividade conformacional marcada resultante. A taxa de interação do composto com o alvo pode ser monitorada por meio de alterações na fluorescência do triptofano intrínseco; esta propriedade foi usada para determinar as taxas de associação de segunda ordem para a ligação do Composto 1 a Z (4,1 x 104 M-1 s-1) e M α-1-antitripsina (2,1 x 102 M-1 s-1). A partir desses valores, as taxas de dissociação de primeira ordem foram calculadas para Z (6,1 x 10 - 5 s-1) e M α-1-antitripsina (1,6 x 10 - 5 s-1) e consideradas da mesma ordem de magnitude. Portanto, a seletividade do composto para Z sobre M α-1-antitripsina é dominada pela diferença na taxa de associação em vez de dissociação.

[0223] Verificou-se que o Composto 1 ablava a polimerização in vitro da Z-α- 1-antitripsina derivada do plasma de uma maneira dependente da dose com um pIC50 medido de 8,3, próximo do limite de ligação apertado do ensaio de TR-FRET. A sua capacidade de bloquear a polimerização de Z-α-1-antitripsina no ER durante o dobramento foi avaliada pela adição do Composto 1 às células CHO-TET-ON-Z-A1AT (Ordóñez et al. Hepatology. 2013;57(5):2049-60) com indução simultânea da expressão de Z-α-1-antitripsina usando doxiciclina. Em comparação com os controles, o Composto 1 bloqueou completamente a formação intracelular de polímeros de Z-α- 1-antitripsina, conforme medido por coloração com o anticorpo monoclonal de polímero anti-α-1-antitripsina 2C1 (pIC50 = 6,3). Para investigar se, além de bloquear a polimerização, o Composto 1 também foi capaz de aumentar a secreção de Z-α-1- antitripsina, expressão de Z-α-1-antitripsina foi induzida em células CHO-TET-ON-Z- A1AT, o Composto 1 foi adicionado, e a Z-α-1-antitripsina total no sobrenadante foi medida pelo imunoensaio depois de 6 horas. O Composto 1 aumentou os níveis segregados aproximadamente 3 vezes em comparação com o controle do veículo com um pEC50 de 6,3. Potência semelhante entre os efeitos na secreção e polimerização foi observada para outros compostos da invenção, apoiando a hipótese de que esses efeitos são causados pelo mesmo modo de ação farmacológica.

[0224] De modo a confirmar que a potência e eficácia do Composto 1 em CHO-TET-ON-Z-A1AT foi uma estimativa razoável do que poderia ser esperado em hepatócitos com níveis de expressão de endógenos, o efeito do Composto 1 na secreção e polimerização de Z-α-1-antitripsina foi medida em hepatócitos derivados de iPSC com o genótipo ZZ-α-1-antitripsina (Yusa et al. Nature. 2011;478:39-4). O Composto 1 inibiu a polimerização e aumentou a secreção com uma potência semelhante em iPSC-hepatócitos como em células CHO-TET-ON-Z-A1AT, com um pIC50 de 6,4 e pEC50 de 6,5 respectivamente, e com uma eficácia semelhante, induzindo aproximadamente 3 vezes em aumento dos níveis secretados de Z-α-1- antitripsina.

[0225] Visto que, todos os indivíduos com o alelo de α-1-antitripsina Z exibem polímero em seus fígados, mas apenas uma fração relativamente pequena desenvolve doença hepática clínica, é provável que a doença hepática α-1-antitripsina em adultos seja um processo duplo pelo qual a geração de polímero de Z-α-1- antitripsina no fígado sensibiliza o fígado a um insulto secundário, como álcool, fármacos ou gordura do fígado. Para investigar a capacidade do Composto 1 de proteger as células da sensibilização a uma toxina secundária, a expressão de Z-α-1- antitripsina foi induzida em células CHO-TET-ON-Z-A1AT na presença ou ausência de 10 µM de Composto 1 antes da exposição a concentrações variáveis do estressor ER tunicamicina. Em um ensaio de viabilidade celular, as células que expressam a M α-1-antitripsina de tipo selvagem foram menos sensíveis à tunicamicina do que as células que expressam a Z-α-1-antitripsina. O Composto 1 anulou completamente a formação de polímero em células que expressam Z-α-1-antitripsina e restaurou a sensibilidade das células que expressam α-1-antitripsina àquela das células de controle de tipo selvagem. Composto 1 se liga a um novo sítio de ligação criptográfico amostrado com mais frequência pela variante Z

[0226] Estruturas de cristal de alta resolução de α-1-antitripsina complexada com o Composto 1 foram geradas por imersão do composto em cristais de apo α-1- antitripsina (Tabela 1). Tabela 1 Coleta de dados e estatísticas de refinamento Composto 1 Coleta de dados Grupo espacial C2 Dimensões celulares a, b, c (Å) 113,9, 39,6, 90,5 α, β, ɣ () 90,0, 105,0, 90,0 Resolução (Å) 55,05 - 1,76 (1,85 - 1,76) Rmerge (%) 0,025(0,398) Meio CC 0,999(0,842) I/δI 19,6(2,4) Completude (%) 99,2(99,2) Multiplicidade 3,3(3,3) Distinção Resolução (Å) 55,05 - 1,76(1,80 - 1,76)* Nº de reflexões 36959(2858) Rtrabalho/Rlivre 18,7 (27,8)/22,2 (32,1) Nº de átomos Proteína 2868 Água 289 Fatores B Proteína 46,8

Água 59,2 Desvios R.m.s. Comprimentos de ligação (Å) 0,05 Ângulos de ligação () 1,03 *Valores entre parênteses são para a camada de maior resolução.

[0227] As estruturas revelam que a interação com os compostos induz a formação de um sítio de ligação críptico não evidente nas estruturas apo, no topo da β-folha-A atrás do filamento 5. Esta região é referida como a “ruptura”, pois é o ponto em que o loop central reativo se insere pela primeira vez durante a inibição da protease (Whisstock et al. J Mol Biol. 2.000;295(3):651-65), e inclui o sítio da mutação E342K Z.

[0228] Imagens representativas do sítio de ligação identificado são mostradas nas Figuras 1 a 3. A Figura 1 mostra uma visão geral da proteína ligada ao Composto 1 (os resíduos 342 - 356 estão desordenados e, portanto, ausentes da representação). A Figura 2 fornece uma vista mais detalhada do sítio de ligação incluindo alguns dos resíduos próximos, com ligações de hidrogênio mostradas como linhas tracejadas. A Figura 3 é uma visualização esquemática bidimensional do Composto 1 no sítio de ligação da proteína, e destacando alguns dos resíduos de aminoácido que compreendem o sítio de ligação bem como estruturas químicas parciais dentro da proteína que formam interações intermoleculares significativas (por exemplo, ligações de hidrogênio) para o Composto 1 (mostrado como linhas tracejadas).

[0229] Em mais detalhe, a estrutura de α-1-antitripsina complexada com o Composto 1 revela que o anel oxindolila se acumula com a cadeia lateral de Trp194 enquanto o grupo carbonila forma uma ligação de hidrogênio com a cadeia principal de Trp194 (ver Figura 2 e Figura 3), consistente com a mudança na fluorescência do triptofano intrínseca induzida pela ligação. O anel fenila e a cadeia propila ocupam duas bolsas altamente hidrofóbicas. As ligações de hidrogênio são formadas entre o grupo hidroxila do Composto 1 e a estrutura Leu291, o nitrogênio da amida, hidrogênio e a estrutura do oxigênio carbonila de Pro289, e entre a carbonila da amida e o grupo hidroxila de Tyr244 (ver Figura 2 e Figura 3). Como consequência, há deslocamento dos resíduos 189 a 195, 290 a 295 e 336 a 342, de filamento 5A com uma perda correspondente de densidade de elétrons para a dobradiça proximal do loop central reativo, uma rotação de ~ 170° da cadeia lateral de Trp194 e deslocamento de 3,8 Å no grupo hidroxila de Tyr244 e deslocamento dos resíduos 196 a 203. Uma comparação da estrutura ligada ao Composto 1 com a forma apo mostra um desvio médio quadrático médio geral de 0,64 Å para 335 pares de resíduos.

[0230] Especificamente, portanto, verificou-se que o Composto 1 é capaz de se ligar à α-1-antitripsina em um sítio de ligação críptico como definido em outro lugar aqui. Para completar, nota-se que a etiqueta de afinidade de hexahistidina e os aminoácidos fornecidos pelo vetor de expressão na proteína usada não eram aparentes no perfil de densidade de elétrons do sítio de ligação e não estavam, portanto, associados à ligação do composto 1. Da mesma forma, o Ser232 mutado (substituindo Cys232 na proteína de tipo selvagem) não estava em uma posição diretamente associada com o sítio de ligação do composto. Composto 1 interfere na transição para o intermediário M* propenso à polimerização ao estabilizar a β-folha A

[0231] A polimerização de α-1-antitripsina ocorre a partir de um estado intermediário transitório conhecido como M*, que é prontamente preenchido pela variante Z. Uma das marcas registradas do M* é seu reconhecimento por corantes repórter fluorescentes sensíveis ao ambiente. Ensaios de mudança térmica que fazem uso do corante SYPRO Orange relatam a estabilidade do estado nativo da proteína contra o desdobramento induzido pelo calor. Uma série de experimentos, realizados usando diferentes gradientes de temperatura na presença e ausência de 50 μM do Composto 1, demonstrou um aumento acentuado na temperatura do ponto médio de transição; em α-1-antitripsina isso é indicativo de um estado nativo estabilizado contra a transição para M*. Correspondentemente, em um experimento de temperatura constante, os oligômeros foram gerados em temperaturas mais altas na presença do composto do que em sua ausência quando visualizados por PAGE não desnaturante. A estabilidade do estado nativo também pode ser testada por desdobramento de equilíbrio usando desnaturantes químicos, onde um pico na fluorescência de bis-ANS corresponde a um intermediário de desdobramento populado ao máximo. Os perfis medidos mostraram que para o desdobramento induzido por cloridrato de guanidínio este ponto ocorre em desnaturante 1,8 M na presença de 50 µM do Composto 1, refletindo um aumento na estabilidade do estado nativo em relação à sua ausência (1,2 M).

[0232] Mutações que interferem na abertura de β-folha A ou que perturbam sua interação com a porção N-terminal do loop central reativo alteram a capacidade das serpinas de inibir proteases alvo. A estequiometria de inibição (SI) foi determinada para M e Z-α-1-antitripsina em experimentos descontínuos contra um modelo de protease alvo, quimiotripsina. A pré-incubação de ambas as variantes com o Composto 1 levou a uma perda > 98 % da atividade inibidora da protease. A resolução dos produtos da interação por SDS-PAGE mostrou clivagem completa do loop central reativo; portanto, isso não é uma consequência do sítio de reconhecimento da protease no loop do centro reativo se tornar inacessível à enzima. Estes dados são consistentes com um mecanismo no qual o composto estabiliza a β-folha A contra a mudança conformacional que medeia a atividade inibitória e o dobramento patológico incorreto.

[0233] Para investigar se esta atividade era consistente com a ação como uma chaperona química, M e Z-α-1-antitripsina foram desdobradas in vitro em cloridrato de guanidina 6 M e rapidamente redobradas por diluição instantânea em tampão livre de desnaturante na presença ou ausência de Composto 1. A eletroforese dos produtos por PAGE não desnaturante mostrou uma migração anodalmente deslocada para a variante Z na ausência de composto consistente com um subproduto mal dobrado de M* (Ekeowa et al. Proc Natl Acad Sci EUA. 2010; 107 (40):17146-51) que foi corrigido em concentrações estequiométricas e superiores. Caracterização das propriedades semelhantes a fármacos do Composto 1

[0234] De modo a investigar a adequação do Composto 1 para a progressão em estudos in vivo e o potencial para avançar como um candidato clínico para teste em seres humanos, o Composto 1 foi perfilado contra um painel de ensaios in vitro para alvos considerados preditivos de potenciais riscos de segurança. O Composto 1 foi inativo contra a maioria desses alvos com um baixo nível de atividade próximo ao limite inferior de sensibilidade em 16 ensaios. A potência medida dessas atividades marginais foi pelo menos 10 vezes abaixo da atividade celular do Composto 1 no bloqueio da polimerização de Z-α-1-antitripsina (pEC50 6,3).

[0235] A perda da atividade inibitória representa um meio pelo qual o possível envolvimento fora do alvo com outras serpinas pode ser avaliado. No entanto, em contraste com α-1-antitripsina após incubação com 50 µM de Composto 1, a atividade inibitória dos homólogos antitrombina, neuroserpina e antitripsina não foi afetada.

[0236] Visto que, o Composto 1 exibiu um bom nível de seletividade sobre o painel fora do alvo e outras serpinas, as propriedades de PK in vitro e in vivo da molécula foram exploradas com o objetivo de explorar o envolvimento do alvo in vivo. O Composto 1 tem um ChromLogD medido (pH 7,4) de 3,8, baixa ligação à albumina de soro humano de 84,2 % e boa solubilidade da substância amorfa do fármaco em FaSSIF.

[0237] O Composto 1 tinha propriedades ADME in vitro adequadas para avaliação in vivo da farmacologia pré-clínica e clínica da molécula. A permeabilidade foi alta e a depuração in vitro em hepatócitos criopreservados foi baixa em seres humanos e cães (0,3 ± 0,05 e < 0,65 mL/min/g respectivamente) e moderada a alta em camundongos e ratos (4,6 e 7,4 ± 0,7 mL/min/kg, respectivamente ) A exposição média do Composto 1 no sangue no camundongo CD-1 macho aumentou com a dose após administração de PO única a 10, 30 ou 100 mg/kg (Cmax normalizado da dose média 58 ± 112, 113 ± 27 e 113 ± 27; DNAUCinf 202 ± 101, 294 ± 47 e 403 ± 246, respectivamente). Composto 1 aumenta a secreção de Z-α-1-antitripsina em um modelo de camundongo transgênico de deficiência de α-1-antitripsina

[0238] De modo a investigar o potencial terapêutico do Composto 1 na deficiência de Z-α-1-antitripsina, o composto foi testado em um modelo de camundongo transgênico projetado com uma inserção aleatória do gene de Z-α-1- antitripsina humano (Teckman et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2004;286:G851-G62). Para determinar um regime de dose adequado para o Composto 1 nesses estudos, a exposição total e não ligada em camundongos transgênicos foi estimada em um modelo in silico. Isso foi baseado nos parâmetros de PK observados de camundongos de tipo selvagem e incorporando um coletor de alta afinidade circulante para o fármaco, representando a média de 5 µM total de Z-α-1- antitripsina no sangue dos camundongos na linha de base com uma afinidade para fármaco de 1,5 nM. Com base nesta modelagem, um regime de dosagem oral de 100 mg/kg três vezes ao dia foi previsto para manter a concentração de fármaco livre acima da EC50 medida para a secreção de Z-α-1-antitripsina (~ 300 nM) durante o período de dosagem. Em contraste, as concentrações não ligadas do Composto 1 após 30 e 10 mg/kg três vezes ao dia seriam esperadas estar bem abaixo da EC50 para secreção durante a maior parte do período de dosagem.

[0239] Para explorar a relação PK-PD do Composto 1, os animais transgênicos de Z-α-1-antitripsina foram doseados com 100, 30 ou 10 mg/kg de Composto 1 três vezes ao dia e no dia 6 sangue e fígado foram colhidos às 3 horas (~ Cmax) e 8 h (Cmin) após a dose para dosagem do fármaco total e livre em ambos os tecidos. O sangue também foi coletado para a medição da Z-α-1-antitripsina monomérica no plasma. As concentrações totais do Composto 1 foram determinadas por ensaio de LC-MS/MS específico e o fármaco livre não ligado em ambos os tecidos foi determinado usando diálise de equilíbrio e usada para derivar concentrações não ligadas. As concentrações de sangue livre e total foram consistentes com as previsões e confirmaram que os níveis de Cmin da concentração de fármaco livre eram iguais ou superiores a 300 nM durante a maior parte do período de dosagem após a dosagem de 100 mg/kg, enquanto as doses de 30 mg/kg e 10 mg/kg resultaram em níveis de fármaco livre no sangue significativamente abaixo das concentrações celulares de EC50 durante grande parte do período de dosagem. Ambas as concentrações de fármaco livre e total do Composto 1 no sítio de ação alvo no fígado foram equivalentes às do sangue.

[0240] Um trabalho recente mostrou que uma fração significativa da Z-α-1- antitripsina total na circulação está na conformação polimérica (Tan et al. Eur Respir J. 2014;43(5):1501-4). Visto que, não há anticorpos específicos para Z-α-1-antitripsina monomérica para determinar diretamente sua concentração, um método de deconvolução foi desenvolvido com base em imunoensaios com anticorpos para α-1- antitripsina total ou polimérica e curvas de calibração com Z-α-1-antitripsina monomérica e polimérica purificada. A Z-α-1-antitripsina monomérica foi medida em amostras de plasma após 6 dias de dosagem e os níveis foram normalizados para os níveis de controle de pré-dose de cada animal para levar em consideração a variação natural da Z-α-1-antitripsina entre animais. 100 mg/kg de Composto 1 resultou em um aumento de 6 a 7 vezes nos níveis circulantes de Z-α-1-antitripsina monomérica demonstrando um envolvimento robusto do alvo no fígado. Os grupos de 30 mg/kg e 10 mg/kg também deram aumentos significativos, dependentes da dose, na Z-α-1- antitripsina circulante, apesar das concentrações livres estarem abaixo da EC50 celular para secreção durante grande parte ou todo o período de dosagem. Os níveis totais do fármaco e as alterações na Z-α-1-antitripsina após 3 dias de dosagem eram indistinguíveis daqueles após 6 dias de dosagem.

[0241] Tomados em conjunto, estes resultados confirmam o envolvimento do alvo no fígado após a dosagem oral do Composto 1 e demonstram que os níveis circulantes de Z-α-1-antitripsina podem ser aumentados em uma magnitude terapeuticamente relevante em uma deficiência de modelo de α-1-antitripsina. O aumento de Z-α-1-antitripsina circulante em doses mais baixas pode sugerir que a obtenção de níveis sustentados do fármaco livre acima da EC50 celular para secreção pode não ser necessária in vivo para aumentar significativamente os níveis da Z-α-1- antitripsina.

[0242] Visto que, o Composto 1 bloqueia a formação de polímero nas células, o efeito da dosagem do Composto 1 nos níveis de polímero do fígado foi explorado. Foi recentemente demonstrado que os polímeros de Z-α-1-antitripsina formados em CHO-TET-EM-Z-A1AT e ZZ-iPSC-hepatócitos são eliminados das células com um t1/2 entre 8 e 48 horas dependendo se eles se dividem em as frações solúveis ou insolúveis. Uma vez que o composto não se liga ao polímero de Z-α-1-antitripsina um efeito nos níveis totais de polímero do fígado dependerá da taxa na qual o fígado pode limpar o polímero já presente e da taxa na qual o polímero continua a se acumular em animais não tratados com medicamento. O Composto 1 foi, portanto, doseado a 100 mg/kg três vezes ao dia como acima durante 20 dias. Nos dias 15 e 21 de dosagem, as alterações das amostras de plasma de Z-α-1-antitripsina monomérica foram determinadas como acima, e aumentos de 7 a 8 vezes em relação aos níveis de linha de base de pré-dosagem foram observados, semelhante ao efeito em animais dosados por 3 ou 6 dias, consistente com engajamento alvo durante o período de dosagem. Os níveis de polímero hepático foram investigados por coloração com anticorpo monoclonal anti-polímero 2C1 e foram avaliados cegamente por um patologista ou por quantificação usando um algoritmo para medir todas as áreas de coloração positiva. Não houve diferença observada na carga total de polímero do fígado por meio de pontuação manual ou quantitativa. Camundongos Z-α-1- antitripsina envelhecidos exibem inclusões poliméricas densas que não são observadas em fígados de indivíduos com deficiência de α-1-antitripsina.

[0243] Para investigar se há uma subpopulação de polímero no fígado que estava respondendo ao composto durante o período do experimento, as áreas de coloração foram divididas em regiões de baixa, média e alta intensidade e pontuadas separadamente para resposta ao composto. Nenhum efeito do composto foi discernível em qualquer uma dessas regiões subdivididas. Dado que a formação de polímero é completamente bloqueada pelo Composto 1 in vitro, concluiu-se que a dosagem de prazo mais longo será necessária para afetar a carga total de polímero em camundongos transgênicos Z-α-1-antitripsina. Entretanto, ainda precisa ser determinado se o fígado do camundongo tem a capacidade de limpar o polímero de Z-α-1-antitripsina após o insulto crônico de geração de Z-α-1-antitripsina no fígado ao longo da vida ou mesmo se isso é necessário para provocar um benefício para o sensibilidade a gatilhos secundários de disfunção hepática. Debate

[0244] As estruturas de cocristal com α-1-antitripsina fornecem informações sobre o modo de ação pelo qual o Composto 1 inibe a polimerização de Z-α-1- antitripsina. Embora o mecanismo que resulta na formação de polímero hepático patológico não tenha sido estabelecido, o papel obrigatório e central do loop central reativo neste processo é bem aceito (ver (a) Lomas et al. Nature. 1992;357:605-7; (b) Ekeowa et al. Proc Natl Acad Sci EUA. 2010;107(40):17146-5; e (c) Yamasaki et al. EMBO Rep. 2011;12(10):1011-7). Todos os modelos existentes são baseados na inserção de um β-filamento extra derivado do loop central reativo entre as cadeias 3 e 5 da folha A, facilitada pelo efeito desestabilizador da mutação Z neste elemento estrutural. A estrutura de cocristal de α-1-antitripsina e Composto 1 sugere que o composto pode melhorar o efeito da mutação Z de E342K devido a: (i) otimização do empacotamento hidrofóbico na região de violação; (ii) formação de ligações de hidrogênio com átomos polares enterrados; e também (iii) deslocamento da espinha dorsal no topo do filamento 5A em uma configuração menos compatível com a inserção de loop parcial, que é sugerida como uma etapa inicial na polimerização de loop-folha (Gooptu et al. Proc Natl Acad Sci (EUA). 2.000;97(1):67-72.) e um obrigatório na polimerização C-terminal (Yamasaki et al. EMBO Rep. 2011;12(10):1011-7.). O deslocamento evidente no topo do filamento 5A é consistente com a preferência orientada pela taxa de associação para a variante Z, que desestabiliza esta região em relação à proteína de tipo selvagem. Nas estruturas cristalinas, a cadeia lateral em 342 está orientada para o solvente e não interage diretamente com o Composto 1; assim, o principal parâmetro que direciona a preferência do composto é provavelmente uma maior disponibilidade da bolsa enigmática. A bolsa, uma vez formada, parece ser estruturalmente equivalente em ambas as variantes, conforme refletido por uma taxa semelhante de dissociação. Este modo de ação também é compatível com a falta de ligação aos polímeros, em que a inserção parcial ou completa do loop central reativo completa uma curva beta-hairpin que ocluiria o sítio de ligação do composto.

[0245] Após a ligação do Composto 1 na região de violação, há uma estabilização marcada do estado nativo de α-1-antitripsina contra a mudança conformacional associada à formação do intermediário M*. Isso, por sua vez, evita a formação de polímeros. O precedente para este mecanismo geral pode ser encontrado em uma ferramenta de anticorpo monoclonal que exerceu um efeito semelhante na α-1-antitripsina (Ordóñez et al. FASEB J. 2015;29:2667-78; Motamedi- Shad et al. Biochem J. 2016;473(19):3269-90).

[0246] A falta de atividade da serpina nas vias aéreas inferiores levando à digestão do parênquima pulmonar pela elastase neutrofílica liberada localmente contribui para o enfisema observado em indivíduos com deficiência de α-1-antitripsina,

visto que, raros pacientes que são completamente nulos para α-1-antitripsina desenvolvem pan-enfisema lobular (Fregonese et al. Respir Med. 2008;102(6):876-

84.) e a terapia de reposição de α-1-antitripsina demonstrou algum benefício na progressão da doença (Chapman et al. Lancet. 2015;386(9991):360-8.). O Composto 1 aumenta a secreção de Z-α-1-antitripsina corrigindo o defeito de dobramento e aumenta as concentrações plasmáticas da serpina em até 8 vezes em um modelo de camundongo transgênico de deficiência de α-1-antitripsina

[0247] Visto que, o Composto 1 inibe a atividade da serpina de α-1-antitripsina enquanto está ligado à proteína, não seria esperado que aumentasse significativamente a atividade da serpina durante o período de dosagem, de fato o Composto 1 inibiria a atividade da serpina de α-1-antitripsina residual em pacientes e seria esperado que bloqueasse a atividade da terapia de substituição caso esta fosse coadministrada com o Composto 1. No entanto, acredita-se que a meia-vida da Z-α- 1-antitripsina monomérica em humanos seja de ~ 3-5 dias, enquanto o fármaco deveria ser eliminado com um t1/2 de algumas horas após a dosagem, aumentando a possibilidade de um regime de dosagem pulsátil que levaria a um aumento da serpina ativa. A definição de quanto tempo a exposição ao fármaco seria necessária para elevar significativamente os níveis, para esgotar o polímero inflamatório nos pulmões e o período de washout entre as doses para reter a atividade da serpina requer mais estudos. Da mesma forma, o risco-benefício do bloqueio da atividade residual da serpina durante o período de dosagem precisará ser avaliado; entretanto, o lento desenvolvimento da doença pulmonar em indivíduos com deficiência de α-1- antitripsina ao longo de muitas décadas sugere que os efeitos agudos associados à inibição da atividade da serpina são improváveis. Os polímeros de α-1-antitripsina foram identificados nos pulmões de pacientes com DPOC com dois alelos normais de α-1-antitripsina, sugerindo que os polímeros de α-1-antitripsina podem ser uma característica prevalente da inflamação na DPOC, independente do genótipo α-1-

antitripsina (Bazzan et al. Chest,. 2018;154:607-16).

[0248] O Composto 1 bloqueia a polimerização de Z-α-1-antitripsina em meios livres de células e no ER de células e o polímero recém-formado é eliminado por células por meio de secreção, degradação proteassomal ou autofagia com meia-vida de 8 a 48 horas. No entanto, nenhuma redução nos polímeros de Z-α-1-antitripsina foi observada no fígado após 20 dias de dosagem do Composto 1 em um camundongo transgênico Z-α-1-antitripsina apesar de um aumento de 7 vezes nos níveis circulantes dentro de 3 dias da dosagem que foi mantido ao longo o experimento, indicando um envolvimento robusto do alvo. A explicação provável para isso é que os polímeros que se acumulam nos fígados dos camundongos transgênicos não são eliminados tão prontamente quanto aqueles que podem ser gerados em sistemas modelo, como células CHO e iPSC-hepatócitos ao longo de alguns dias. Embora isso provavelmente resulte da cronicidade do insulto, o mecanismo molecular ou celular disso não está claro, mas o envelhecimento celular e a senescência podem contribuir para esse efeito. Estudos anteriores com o ativador de autofagia Carbamazapina demonstraram efeitos pronunciados no polímero do fígado em camundongos transgênicos Z-α-1- antitripsina após 2 semanas de dosagem, sugerindo que o fígado retém a capacidade de limpar o polímero após o insulto crônico do acúmulo de polímero Z-α-1-antitripsina (Hidvegi et al. Science. 2010;329:229-32.). Ao contrário, as abordagens de RNAi que inibem a expressão de Z-α-1-antitripsina expressão e a formação de polímero relataram diminuições na Z-α-1-antitripsina no fígado de camundongo transgênico após 12 a 33 semanas de tratamento, embora sem relatos de dados em pontos temporais anteriores (Guo et al. J Clin Invest 2014;124(1):251-61). Juntos, esses dados sugerem que o fígado retém a capacidade de limpar o polímero após o insulto crônico e que é provável que o Composto 1 precise ser dosado a camundongos Z-α- 1-antitripsina transgênicos por significativamente mais do que 20 dias para demonstrar um efeito no fígado total níveis de polímero. Resta saber se o polímero acumulado é realmente tóxico para as células e precisa ser eliminado do fígado para ter algum benefício funcional ou se as inclusões de polímero acumuladas são realmente inertes e a interrupção da produção de polímero é suficiente para restaurar o funcionamento do ER e a saúde das células (Ordóñez et al. Hepatology. 2013;57(5):2049-60; Dickens et al. FASEB J. 2016;30(12):4083-97).

[0249] Os níveis de compostos totais e livres em estado estacionário observados do Composto 1 no camundongo Z-α-1-antitripsina transgênico foram bem previstos pelo modelo de PK in silico construído em dados de depuração metabólica in vitro e dados de ligação de proteínas plasmáticas, dados de PK in vivo de tipo selvagem camundongos e um termo que compreende um coletor circulante de 5 µM para o fármaco com uma afinidade de 1,5 nM, representando a Z-α-1-antitripsina no sangue. A concentração alvo do fármaco livre foi selecionada com base na potência observada nos ensaios de secreção in vitro em que o fármaco total se aproxima do fármaco livre no ensaio. No entanto, o aumento da Z-α-1-antitripsina na circulação nas doses mais baixas do Composto 1 é surpreendente, dado que os níveis sistêmicos do fármaco livre estão entre EC10-EC20 e EC20-EC30 durante o período de dosagem de 10 e 30 mg/doses de kg, respectivamente. A razão para isto não é clara, no entanto, é possível que o envolvimento do alvo in vivo seja maior do que o previsto a partir da potência nos ensaios celulares in vitro. Alternativamente, é possível que o efeito de primeira passagem do fármaco que atinge o fígado imediatamente após a absorção forneça alguma eficácia em relação ao previsto pela modelagem da concentração do composto em níveis de estado estacionário. Juntos, esses dados sugerem vantagens potenciais para a exposição necessária ao composto para fornecer eficácia na clínica. Novo mecanismo para tratar uma doença conformacional

[0250] Acredita-se que os compostos da invenção estabilizam a Z-α-1- antitripsina monomérica pela ligação na cabeça de filamento 5 de β-folha A negando assim o efeito no sítio da mutação Z (Lomas et al. Bioquímica. 1993;32:500-8).

Especificamente, eles deslocam o filamento 5 em direção ao filamento 3 e, assim, “corrigem” a perturbação local induzida por um resíduo de lisina na posição 342. O sítio de ligação do Composto 1 não foi identificado em estruturas de cristal anteriores de α-1-antitripsina (Elliott et al.

Proteína Science. 2.000;9:1274-81.). Entretanto seu efeito no bloqueio da transição da Z-α-1-antitripsina totalmente dobrada para o intermediário polimerogênico e sua eficácia em modelos celulares e animais de doença sugere que eles estão agindo na Z-α-1-antitripsina em uma conformação quase nativa ou nativa.

Isso implica que os polímeros se formam a partir de uma conformação quase nativa ou nativa, em vez de um intermediário mais estendido, e que as moléculas pequenas evitam que o monômero se ligue para formar um polímero.

Esta pequena correção de molécula da mutação Z fornece uma nova estratégia para tratar a doença hepática em indivíduos com deficiência de α-1- antitripsina.

Claims (33)

REIVINDICAÇÕES

1. Substância para o uso em um método para tratamento de uma doença ou condição mediada pela polimerização de α-1-antitripsina, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita substância é: (a) um composto que é capaz de inibir polimerização de α-1-antitripsina; ou (b) um solvato farmaceuticamente aceitável, complexo, tautômero, derivado isotopicamente marcado ou pró-fármaco do mesmo.

2. Substância para o uso, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a doença ou condição é mediada pela polimerização de Z-α-1-antitripsina e o composto é capaz de inibir polimerização de Z-α-1-antitripsina.

3. Substância para o uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o composto é um composto de molécula pequena.

4. Substância para o uso, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de que o composto tem um peso molecular de 1.000 Daltons ou menos.

5. Substância para o uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADA pelo fato de que o composto é capaz de se ligar a α- 1-antitripsina induzindo formação de um sítio de ligação críptico dentro da estrutura de proteína de α-1-antitripsina, a dita α-1-antitripsina compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 1.

6. Substância para o uso, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADA pelo fato de que o sítio de ligação está localizado entre β-folha-A e β-folha-B da dita α-1-antitripsina, em que: - a dita β-folha-A compreende os aminoácidos correspondentes aos resíduos 140 - 144, 111 - 121, 181 - 191, 330 - 340 e 292 - 299 de SEQ ID NO: 1; e - a dita β-folha-B compreende os aminoácidos correspondentes aos resíduos

228 - 231, 236 - 244, 248 - 256, 369 - 376, 381 - 389, e 49 - 53 de SEQ ID NO: 1.

7. Substância para o uso, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, CARACTERIZADA pelo fato de que o sítio de ligação está localizado entre as cadeias de aminoácido correspondentes a cada um de: (a) resíduos 191 - 194 de SEQ ID NO: 1; (b) resíduos 288 - 293 de SEQ ID NO: 1; (c) resíduos 371 - 374 de SEQ ID NO: 1; (d) resíduos 249 - 253 de SEQ ID NO: 1; e (e) resíduos 240 - 243 de SEQ ID NO: 1; e opcionalmente também (f) resíduos 338 - 341 de SEQ ID NO: 1.

8. Substância para o uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o sítio de ligação compreende um ou mais de W194, Y244, L291, P289, F252, K290, I293, L338, I340, F372 e M374 de SEQ ID NO: 1.

9. Substância para o uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o KD do composto para M-α-1-antitripsina é menor do que cerca de 250 nM, a dita M-α-1-antitripsina compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 2.

10. Substância para o uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9, CARACTERIZADA pelo fato de que o KD do composto para Z-α-1-antitripsina é menor do que cerca de 25 nM, a dita Z-α-1-antitripsina compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 3.

11. Substância para o uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 10, CARACTERIZADA pelo fato de que o KD do composto para Z-α-1-antitripsina é pelo menos dez vezes menor do que o KD do composto para M-α-1-antitripsina, a dita M-α-1-antitripsina compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 2 e a dita Z-α-1- antitripsina compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 3.

12. Substância para o uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADA pelo fato de que o composto compreende uma porção tetravalente da Fórmula (IA)

I

HO H II H (IA)

N

O III ; em que o composto é capaz de se ligar a α-1-antitripsina compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 1 pela formação de ligação de hidrogênio entre: (i) grupo hidroxila I e L291 de SEQ ID NO: 1; (ii) grupo NH II e P289 de SEQ ID NO: 1; e (iii) grupo carbonila III e Y244 de SEQ ID NO: 1.

13. Substância para o uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADA pelo fato de que o composto compreende uma porção divalente da Fórmula (IB) ; em que: - o composto é capaz de se ligar a α-1-antitripsina compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 1 pela formação de ligação de hidrogênio entre: (i) grupo hidroxila I e L291 de SEQ ID NO: 1; (ii) grupo NH II e P289 de SEQ ID NO: 1; e (iii) grupo carbonila III e Y244 de SEQ ID NO: 1; - R4 é selecionado a partir de hidrogênio, alquila C1-5, alquenila C2-5, alquinila C2-5 e alcóxi C1-4; e - R5 é selecionado a partir de hidrogênio, alquila C1-5, alquenila C2-5, alquinila C2-5 e alcóxi C1-4.

14. Substância para o uso, de acordo com a reivindicação 13,

CARACTERIZADA pelo fato de que R5 é hidrogênio.

15. Substância para o uso, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, CARACTERIZADA pelo fato de que R4 é alquila C2-4, alquenila C2-4, alquinila C2-4 ou alcóxi C1-3.

16. Substância para o uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, CARACTERIZADA pelo fato de que R4 é n-propila.

17. Substância para o uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADA pelo fato de que o composto compreende uma porção monovalente da Fórmula (IC) ; em que: - o composto é capaz de se ligar a α-1-antitripsina compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 1 pela formação de ligação de hidrogênio entre: (i) grupo hidroxila I e L291 de SEQ ID NO: 1; (ii) grupo NH II e P289 de SEQ ID NO: 1; e (iii) grupo carbonila III e Y244 de SEQ ID NO: 1; - R4 e R5 são conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 13 a 16; e - R6 é um grupo arila ou heteroarila substituído ou não substituído capaz de empilhar com a cadeia lateral de W194 de SEQ ID NO: 1.

18. Substância para o uso, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de que R6 é um grupo 4-oxidonlila substituído ou não substituído.

19. Substância para o uso, de acordo com a reivindicação 17 ou 18,

CARACTERIZADA pelo fato de que R6 é um grupo da Fórmula R6′ ; em que R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, F, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH(CH3)2, NH2, NHCH3, N(CH3)2, OH, Cl, Br e I.

20. Substância para o uso, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADA pelo fato de que R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, F, CH3, NH2, OH e Cl.

21. Substância para o uso, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADA pelo fato de que R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em H e F.

22. Substância para o uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADA pelo fato de que o composto tem a Fórmula (ID) ; em que: - o composto é capaz de se ligar a α-1-antitripsina compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 1 pela formação de ligação de hidrogênio entre: (i) grupo hidroxila I e L291 de SEQ ID NO: 1; (ii) grupo NH II e P289 de SEQ ID NO: 1; e (iii) grupo carbonila III e Y244 de SEQ ID NO: 1; - R4 e R5 são conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 13 a

16; - R6 é conforme definido em qualquer uma das reivindicações 17 a 21; e - R7 é um grupo arila ou heteroarila substituído ou não substituído.

23. Substância para o uso, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADA pelo fato de que R7 é um grupo fenila substituído ou não substituído.

24. Substância para o uso, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADA pelo fato de que R7 é um grupo da Fórmula R7′ ; em que: - R2 é selecionado a partir do grupo que consiste em CH3, Cl, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH(CH3)2, NH2, NHCH3, N(CH3)2, OH, SH, CN, F, Br e I; e - R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em F, Cl, CN, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH(CH3)2, NH2, NHCH3, N(CH3)2, OH, Br, I e SH.

25. Substância para o uso, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADA pelo fato de que R2 é selecionado a partir do grupo que consiste em CH3, Cl, NH2, OH, SH, CN e F; e R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em F, Cl, CN, CH3, NH2, OH e SH.

26. Substância para o uso, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADA pelo fato de que R2 é selecionado a partir do grupo que consiste em CH3 e Cl; e R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em F, Cl e CN.

27. Substância para o uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADA pelo fato de que o composto tem a Fórmula (I) (I); em que - R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, F, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH(CH3)2, NH2, NHCH3, N(CH3)2, OH, Cl, Br e I; - R2 é selecionado a partir do grupo que consiste em CH3, Cl, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH(CH3)2, NH2, NHCH3, N(CH3)2, OH, SH, CN, F, Br e I; e - R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em F, Cl, CN, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH(CH3)2, NH2, NHCH3, N(CH3)2, OH, Br, I e SH.

28. Substância para o uso, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de que - R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, F, CH3, NH2, OH e Cl; - R2 é selecionado a partir do grupo que consiste em CH3, Cl, NH2, OH, SH, CN e F; e - R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em F, Cl, CN, CH3, NH2, OH e SH.

29. Substância para o uso, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que - R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em H e F; - R2 é selecionado a partir do grupo que consiste em CH3 e Cl; e - R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em F, Cl e CN.

30. Substância para o uso, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADA pelo fato de que

- R1 é H, R2 é CH3 e R3 é F, ou - R1 é H, R2 é CH3 e R3 é Cl, ou - R1 é F, R2 é Cl e R3 é CN, ou - R1 é F, R2 é Cl e R3 é F.

31. Substância, CARACTERIZADA pelo fato de que conforme é definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 30.

32. Método para identificar um composto candidato a fármaco, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: i) contatar o composto candidato a fármaco com α-1-antitripsina compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 1 para formar um complexo entre o composto candidato a fármaco e a dita α-1-antitripsina; ii) resolver a estrutura do complexo; e iii) determinar se, no complexo, o composto candidato a fármaco está presente em um sítio de ligação conforme definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 8.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito contato do composto candidato a fármaco com a dita α-1-antitripsina compreende formar um cristal da dita α-1-antitripsina e contatar o dito cristal com o dito candidato a fármaco.