BR112020023782A2 - Proteínas de planta mutante cinamoil-coa redutase - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a uma proteína de planta mutante cinamoil-coa redutase (ccr) capaz de restaurar a penalização de produtividade em plantas com características de lignina, tal como deficiências relacionadas a ccr e métodos e usos da mesma. mais especificamente, a invenção refere-se a plantas sem proteína ccr de ocorrência natural funcional, mas tendo um alelo ccr fraco resultando em menores quantidades de lignina e aumento da sacarificação, acompanhada ainda pela restauração do crescimento de plantas do nanismo induzido por modificação de lignina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍNAS DE PLANTA MUTANTE CINAMOIL-CoA REDUTASE".

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a uma proteína de planta mutante Cinamoil-CoA Redutase (CCR) capaz de restaurar a penalização de produtividade em plantas com características de lignina, tal como deficiências relacionadas a ccr e métodos e usos da mesma. Mais especificamente, a invenção refere-se a plantas sem proteína CCR de ocorrência natural funcional, mas tendo um alelo ccr fraco resultando em menores quantidades de lignina e aumento da sacarificação, acompanhada ainda pela restauração do crescimento de plantas do nanismo induzido por modificação de lignina.

ANTECEDENTES

[0002] Por causa do aumento da demanda de energia, do esgotamento de matéria-prima de combustível fóssil e do aquecimento global, uma mudança da economia baseada em fósseis atual em direção a uma economia de base biológica é inevitável. Neste último caso, a biomassa lignocelulósica, que consiste principalmente dos polissacarídeos celulose e hemicelulose embebidos em lignina, pode desempenhar um papel crucial, pois pode ser usada para a produção tanto de energia quanto de uma infinidade de produtos químicos. Na biorrefinaria, os polissacarídeos da parede celular são despolimerizados em açúcares monoméricos por meio de um processo denominado sacarificação. Estes monômeros de açúcar podem ser convertidos em etanol ou outros compostos através, por exemplo, de fermentação por micro-organismos. No entanto, a parede celular da planta é recalcitrante à desconstrução, principalmente por causa da presença de lignina. Este heteropolímero aromático, que confere resistência e hidrofobicidade à parede celular da planta, dificulta o processo de sacarificação por imobilizar as enzimas hidrolíticas e limitar fisicamente seu acesso aos substratos de celulose e hemicelulose. Para melhorar a acessibilidade dos polissacarídeos para a digestão enzimática, a biomassa é pré- tratada com produtos químicos para quebrar e extrair a lignina. Visto que o pré-tratamento é uma etapa dispendiosa no processo de conversão, estratégias estão sendo buscadas para desenvolver variedades de plantas que depositem menos lignina. No entanto, as plantas modificadas com lignina que mostram a maior melhora na eficiência de sacarificação tipicamente sofrem de perturbações de crescimento. Esse nanismo induzido pela modificação da lignina (LMID) descreveu ser causado principalmente pela perda de integridade vascular levando ao colapso dos vasos nas respectivas plantas modificadas com lignina (Piquemal e outros, 1998; Zhong e outros, 1998; Jones e outros, 2001; Franke e outros, 2002; Stout e Chapple, 2004; Besseau e outros, 2007; Huang e outros, 2010; Voelker e outros, 2010; Vanholme e outros, 2013b; Yang e outros, 2013; Vargas e outros, 2016; De Meester e outros, 2018).

[0003] A cinamoil-CoA redutase (CCR) catalisa a primeira etapa da via específica de monolignol. Ela converte os tioésteres de hidroxicinamoil-CoA em seus hidroxicinamaldeídos correspondentes e a repressão de CCR tipicamente resulta em uma redução significativa no teor de lignina (Chabannes e outros, 2001; Jones e outros, 2001; Goujon e outros, 2003; Dauwe e outros, 2007; Leplé e outros, 2007; Jackson e outros, 2008; Tamasloukht e outros, 2011; Van Acker e outros, 2014; Smith e outros, 2017a). As plantas deficientes em CCR aumentaram tremendamente a eficiência de sacarificação. Por exemplo, a conversão de celulose em glicose no mutante ccr1 de Arabidopsis thaliana é mais de 3 vezes maior do que em plantas de ocorrência natural. No entanto, essas plantas também apresentam uma produtividade reduzida de biomassa. Usando o elemento de ligação nac à parede secundária artificial específico de vasos do promotor cisteína protease 1 do xilema (ProSNBE) para conduzir a expressão do gene cinamoil-coa redutase1 (CCR1) em um fundo mutante ccr1 de Arabidopsis, a biomassa total da planta foi totalmente recuperada embora ainda tenha a alta eficiência de conversão de celulose em glicose de mutantes ccr1 (De Meester e outros, 2018).

[0004] O álamo (Populus ssp.) é uma cultura promissora para a biorrefinaria lignocelulósica, uma vez que esta árvore tem crescimento rápido, é eficiente em nutrientes e não requer lavoura para crescer. Além disso, esta espécie pode ser propagada clonalmente, tem um genoma totalmente sequenciado e anotado e várias espécies de álamo, incluindo híbridos comerciais, são fáceis de transformar (Gelfand e outros, 2013). O álamo híbrido apresenta grande potencial como cultura lenhosa para energia (Carroll e Somerville, 2009), e a madeira do álamo com repressão de CCR teve um aumento de até 161% na produção de etanol por unidade de biomassa (Van Acker e outros, 2014). Os álamos com repressão de CCR2 são caracterizados por uma coloração vermelha do xilema que frequentemente apareceu em manchas ao longo do caule (Leplé e outros, 2007; Van Acker e outros, 2014). Infelizmente, esses álamos transgênicos não foram reprimidos de forma estável para CCR2 e sofreram com o colapso dos vasos e penalizações de produtividade associadas. Como em Arabidopsis (De Meester e outros, 2018), é possível restaurar a penalização da produtividade de álamos ccr2 sem adaptar a produção de açúcar por meio do reforço suficiente dos vasos. Mas ainda assim, RNAi ou álamos transgênicos antissenso com quantidades reduzidas de lignina são i) não estavelmente reprimidos para o respectivo gene de biossíntese de lignina e ii) podem ainda sofrer penalizações de produtividade por outros mecanismos.

[0005] Portanto, existe uma necessidade não atendida para a geração de plantas lenhosas, tal como álamos i) que têm atividade estavelmente reduzida da enzima de biossíntese de lignina direcionada e, portanto, reduções estáveis nas quantidades de lignina e ii) que não sofrem penalizações da produtividade. No milho, por exemplo, foi demonstrado que simplesmente uma menor atividade de CCR de ocorrência natural foi suficiente para reduzir o teor de lignina, e para manter o crescimento similar ao de ocorrência natural (Tamasloukht e outros, 2011; Smith e outros, 2017a).

[0006] Portanto, em conclusão, plantas ou árvores lenhosas com teor alterado de lignina seriam matéria-prima muito promissora para a biorrefinaria para a produção de biocombustíveis e outros materiais de base biológica. Além disso, esforços de melhoramento têm sido feitos para reduzir o teor de lignina na bioenergia e silagem, mas as soluções atualmente obtidas ainda apresentam algumas desvantagens, uma vez que são transgênicas (incluindo RNAi e muitas vezes muito dispendiosas para desregular) e / ou têm uma inferioridade na produtividade, portanto, é necessário encontrar alternativas para contornar essas desvantagens.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0007] A presente invenção é baseada na descoberta de que uma nova proteína CCR de planta mutante, codificada por um alelo fraco após a modificação genética de álamo híbrido, foi capaz de introduzir a vantagem de reduzir as quantidades de lignina e aumentar a sacarificação sem induzir uma inferioridade na produtividade ou nanismo. Esta descoberta permite editar elegantemente o genoma, visando certas posições em genes de biossíntese de lignina, tal como CCR, para modificar a estabilidade da proteína ou atividade enzimática, por exemplo, dessas proteínas CCR, ajustando assim o equilíbrio para superar um problema de penalização de produtividade, que é frequentemente observada em características de lignina, preservando a valiosa característica de lignina. Essas variantes da proteína CCR de planta mutante podem ser introduzidas transgenicamente em plantas que já pronunciam deficiências relacionadas à característica de lignina para restaurar o nanismo. Além disso, esses novos alelos são essenciais para a produção de produtos de organismos não geneticamente modificados (GMO) com alta produtividade de açúcar em plantações de bioenergia. Finalmente, tais proteínas CCR de planta mutantes também podem melhorar a digestibilidade no caso de milho para silagem.

[0008] Em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína de planta mutante Cinamoil-CoA Redutase (CCR) que é mutada no domínio conservado da dita sequência de aminoácidos de CCR conforme representado na SEQ ID NO: 1, em que o dito domínio conservado corresponde à parte mais conservada de um domínio anotado FR_SDR_e, que contém a assinatura de CCR típica e NADP e resíduos de sítio ativo importantes para a identidade e atividade de CCR. A mutação é caracterizada pelo fato de que a(s) posição(ões) de aminoácido 98, 99 e / ou 100 do dito domínio conservado, conforme representado na SEQ ID NO: 1, são os sítios de mutação. Alternativamente, a invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína CCR de planta mutante que é mutada no domínio conservado da dita sequência de aminoácidos de CCR com um domínio conservado com pelo menos 50% de identidade de aminoácidos com a SEQ ID NO: 1, e caracterizada pelo fato de que a(s) posição(ões) de aminoácido 98, 99 e / ou 100 do dito domínio conservado com pelo menos 50% de identidade de aminoácidos com a SEQ ID NO: 1 são os sítios de mutação. Embora a(s) posição(ões) mutada(s) digam respeito a resíduos que são diferentes dos ditos resíduos característicos para identidade e atividade de CCR, os resíduos de posição 98 e 100 são conservados dentre as proteínas CCR de planta, a posição 99 mostra alguma variação em sua identidade de resíduo (Figura 6). Em uma modalidade, a dita mutação constitui pelo menos uma deleção na posição 98, 99 e / ou 100. Em outra modalidade, a dita mutação diz respeito exatamente a uma das 3 posições de aminoácidos a serem deletadas. Em uma modalidade específica, o resíduo de aminoácido da posição 98 é deletado ou, alternativamente, a posição 99 é deletada, ou a posição 100 é deletada. Em outra modalidade, a mutação constitui pelo menos uma deleção da posição 98, 99 e / ou 100 e, além disso, uma substituição de resíduos de aminoácidos 99 ou 100 em comparação com a SEQ ID NO: 1, ou em comparação com o domínio conservado com pelo menos 50% de identidade de aminoácidos com a SEQ ID NO: 1. Especificamente, o resíduo 98 é deletado e o resíduo 99 ou 100 é substituído, alternativamente o resíduo 99 é deletado e o resíduo 100 é substituído, ou uma modalidade contém uma mutação em que o resíduo 100 é deletado e o resíduo 99 é substituído. Outra modalidade refere-se a uma mutação que consiste de pelo menos uma deleção do resíduo na posição 98-100, e uma substituição do resíduo na posição 99 ou 100, a dita substituição consistindo de um aminoácido polar. Especificamente, a dita substituição na posição 99 ou 100 resulta em uma treonina, serina, glutamina, asparagina, tirosina ou cisteína. Uma modalidade específica refere-se a uma mutação em que os resíduos 99 e 100 da SEQ ID NO: 1 são substituídos por um único aminoácido que é diferente daqueles nas posições 99 e 100 na SEQ ID NO: 1.

[0009] Outra modalidade refere-se a um vetor de expressão compreendendo a dita molécula de ácido nucleico para expressão em uma célula de planta. Uma modalidade particular descreve a proteína CCR de planta mutante codificada pela dita molécula de ácido nucleico ou pelo dito vetor de expressão.

[0010] Outro aspecto refere-se a uma planta sem proteína CCR funcional, compreendendo ainda o ácido nucleico, o vetor ou a proteína CCR de planta mutante da invenção, caracterizada pelo fato de que o crescimento da planta é pelo menos comparável a uma planta de controle. Em outra modalidade, uma planta com pelo menos um alelo ccr nocaute, e compreendendo ainda o ácido nucleico, o vetor ou a proteína CCR de planta mutante da invenção, é ainda caracterizada pelo fato de que o crescimento da planta é pelo menos comparável a uma planta de controle. E uma modalidade refere-se a uma planta com quantidades reduzidas de lignina em comparação com uma planta de controle, compreendendo ainda o ácido nucleico, o vetor ou a proteína CCR de planta mutante da invenção, sendo caracterizada pelo fato de que o crescimento da planta é pelo menos comparável a uma planta de controle. Em uma modalidade específica, a dita redução das quantidades de lignina é de pelo menos 10% em comparação com uma planta de ocorrência natural ou de controle. E outra modalidade refere- se a uma planta com maior eficiência de sacarificação em comparação com uma planta de controle, compreendendo ainda o ácido nucleico, o vetor ou a proteína CCR de planta mutante da invenção, sendo caracterizada pelo fato de que o crescimento da planta é pelo menos comparável a uma planta de controle. Em uma modalidade específica, o dito aumento na eficiência de sacarificação é de pelo menos 30% em comparação com uma planta de ocorrência natural ou de controle.

[0011] Em uma modalidade específica, a dita planta é uma cultura. Alternativamente, a dita planta é uma planta de cereal. E em outra modalidade, a dita planta é uma planta lenhosa, que pode ser considerada uma árvore, tal como álamo, pinheiro ou eucalipto. Uma modalidade específica refere-se a uma semente ou célula de planta derivada da dita planta da invenção.

[0012] Em um segundo aspecto da invenção, um método para produzir uma planta com crescimento restaurado com uma característica de lignina é descrito, compreendendo as etapas de: (i) introduzir a molécula de ácido nucleico, vetor ou proteína CCR mutante da presente invenção na dita planta com crescimento anormal ou em suas células, e ii) incubar e isolar uma planta regenerada a partir da dita planta, e iii) identificar as plantas com crescimento normal restaurado. Em uma modalidade específica, a dita introdução da proteína mutante ou sequência mutante é obtida através da transformação de um elemento de DNA recombinante, ou usando edição de genes direcionada ao(s) gene(s) de CCR endógeno(s) para inserir uma mutação e / ou rompimento em pelo menos 1 alelo. Especificamente, a dita mutação introduzida é a mutação em que os resíduos de aminoácidos de CCR correspondentes às posições 99 e 100, conforme representado na SEQ ID NO: 1, são substituídos por um aminoácido que é diferente de ambos, e de preferência, é um aminoácido polar, a maioria preferencialmente treonina e serina.

[0013] Um aspecto final da invenção refere-se a um método para identificar proteínas de biossíntese de lignina de planta mutantes capazes de restaurar o crescimento em uma planta anã, compreendendo as etapas de: (i) introduzir uma mutação em uma planta que tem pelo menos um alelo nocaute de um gene de biossíntese de lignina, de modo a induzir pelo menos uma mutação em um segundo alelo do dito gene de biossíntese de lignina da dita planta, (ii) seguido pela triagem de plantas com um fenótipo de crescimento normal, mas com a característica de lignina, e (iii) identificar a natureza da mutação no dito alelo de biossíntese de lignina mutante da planta. Em uma modalidade específica, o dito gene de biossíntese de lignina é CCR. Em outra modalidade específica, o dito método para introduzir a dita mutação em uma planta que tem pelo menos um alelo nocaute de um gene de biossíntese de lignina, faz uso de edição de genes, de modo a induzir pelo menos uma mutação em um segundo alelo em uma forma direcionada. Em outra modalidade específica, a dita introdução de uma mutação em uma planta é bialélica, e refere-se à mutação de um gene de biossíntese de lignina, tal como CCR, resultando em uma planta com proteína CCR mutante, e na etapa ii) para triar uma planta com crescimento normal e quantidades reduzidas ou alteradas de lignina, e iii) identificar a natureza da mutação no gene de biossíntese de lignina mutante da planta. Em uma outra modalidade específica, a dita mutação induzida na etapa i) resulta em atividade de biossíntese de lignina reduzida ou alterada na dita planta. Especificamente, a dita mutação resulta em atividade reduzida do gene de biossíntese de lignina, tal como CCR, e a dita redução é de preferência uma atividade enzimática inferior à atividade de ocorrência natural em uma planta normal, e dentro da faixa de pelo menos 60% a no máximo 90% de atividade de ocorrência natural. Em uma modalidade particular, a dita atividade reduzida é obtida para a planta através da redução da expressão do gene de biossíntese de lignina na dita planta, ou através da inserção de uma mutação e / ou rompimento em pelo menos 1 alelo do dito gene de biossíntese de lignina da dita planta. Em uma modalidade específica, o dito gene de biossíntese de lignina é CCR.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0014] Os desenhos descritos são apenas esquemáticos e não são limitantes. Nos desenhos, o tamanho de alguns dos elementos pode ser exagerado e não em escala para propósitos ilustrativos.

[0015] Figura 1. Fenótipo de álamos ccr2 cultivados in vitro com mutações bialélicas de deslocamento do quadro de leitura.

[0016] Ocorrência natural e ccr2 após crescimento por três meses em meio MS em condições de dias longos.

[0017] Figura 2. Fenótipo de álamos ccr2 cultivados em solo.

[0018] As plantas foram cultivadas por quatro meses em estufa. Os álamos mutantes ccr2 portadores de mutações bialélicas de deslocamento de quadro de leitura foram cultivados sob uma cúpula para mantê-los vivos. A cúpula foi removida antes de tirar a foto.

[0019] Figura 3. Deposição de lignina em caules de álamos ccr2.

[0020] Seções transversais do caule de mutantes de ocorrência natural e ccr2 (portadores de mutações bialélicas de deslocamento do quadro de leitura) cultivadas por 4 meses em meio MS. As seções tratadas com etanol mostraram uma coloração vermelha das células do xilema nas linhagens de ccr2. A coloração com azul de toluidina descreveu a presença de vasos redondos e abertos no xilema de vasos de ocorrência natural e vasos colapsados (pontas de seta pretas) no xilema de ccr2. Além disso, estruturas azuis em forma de círculo foram encontradas em vasos e fibras de ccr2 (pontas de setas brancas e inserções). A coloração de Mäule e Wiesner mostrou lignificação reduzida nas linhagens de ccr2 quando comparada à de ocorrência natural. As imagens mostradas são representativas de todas as linhagens de ccr2 portadoras de mutações bialélicas de deslocamento de quadro de leitura. Barras de escala = 50 μm.

[0021] Figura 4. Sequência de proteína e fenótipo de ccr2 12.

[0022] (A) Sequência de aminoácidos das proteínas CCR2 de ocorrência natural e mutadas do alelo de Populus alba. Os aminoácidos que são alterados em ccr2 12 são indicados em vermelho negrito. (B) Fenótipo de álamos de ocorrência natural e ccr2 12 cultivados em meio MS em condições de dias longos por 3 meses. (C) Fenótipo de caules de ocorrência natural descascados e ccr2 12 cultivados em estufa quando atingiram alturas de 1,20 m. A cor vermelha dos caules de ccr2 12 indicativa de deficiência de CCR (D) Curva de crescimento de ocorrência natural e ccr2 12 (após o corte do caule original). Não foram encontradas diferenças significativas na altura entre as linhagens de ocorrência natural e as linhagens de ccr2 12 (teste t de ajuste de

Dunnett-Hsu; valor de p > 0,05; ocorrência natural, n = 11; ccr2 12, n = 11). (E) Fenótipo de ccr2 12 após crescimento por 20 semanas em estufa (após corte do caule original).

[0023] Figura 5. Eficiência de sacarificação de álamos ccr2 12.

[0024] Liberação de glicose (% CWR) após 2 h e 48 h de sacarificação de caules de ocorrência natural com 3 meses de idade (tamanho ~ 1,2 m) e caules de ccr2 12 (n = 12). As amostras foram sacarificadas sem pré-tratamento, com pré-tratamento ácido (H2SO4 0,4 M), ou com pré-tratamento alcalino (NaOH 62,5 mM). A porcentagem de aumento da produtividade de glicose (e valor p associado) nas linhagens de ccr2 12 quando comparada a de ocorrência natural é indicada para cada pré-tratamento usado. As linhagens ccr2 12 mostraram uma liberação de glicose até 50% maior em comparação com a de ocorrência natural em condições de pré-tratamento.

[0025] Figura 6. Alinhamento de sequências de aminoácidos de CCR a partir de diferentes plantas ilustrando um domínio conservado funcional FR_SDR_e (Dihidroflavanol redutase).

[0026] A sequência Ll-CCRH1 (apresentada na cor cinza) foi alinhada com as sequências de CCR homólogas, mostrando a sequência de CCR de assinatura (NWYCYGK (SEQ ID NO: 65); cor rosa). Os resíduos do sítio ativo obtidos na pesquisa do Banco de Dados de Domínios Conservados (CDD) são mostrados em vermelho; os resíduos do domínio de ligação NADP são distinguidos pela cor amarela; o bolso de ligação ao substrato é indicado pela cor verde. Espaços são introduzidos para maximizar a homologia e são mostrados por características. Resíduos altamente conservados; Tyr (172), Lys (174) e Ser (136), estão presentes em todos os motivos conservados de CCRs e supostamente desempenham um papel crucial na catálise. As posições de aminoácidos correspondentes aos aminoácidos alterados na proteína codificada pelo alelo fraco ccr2 12 estão dentro de uma caixa. Os números de acesso ao GenBank de todos os CCRs usados no alinhamento são os seguintes (começando de cima): ADC40029, NP_173047, AEK27166, AAL47684, ACE76870, CAK18610, ABL01801.3, EU195224, AF297877_1, CBG37721, AAT74875, CAZA9056103, CAC2476 ACE95172, ADU64758, ACQ59094, ADK24219, ACJ38670, AAY41879, AAN71761, BAE48787, ACI14382, AAP46143, AAN71760, ABE01883, CAA13176, ACG33996, ACZ74584, ADQ304553, ACZ74593, ADQ3053751. Adotado a partir de Sonawane e outros, 2013.

[0027] Figura 7. Ensaios de sacarificação de ccr2 12.

[0028] Eficiência de sacarificação da biomassa do caule de plantas de 2 m de altura de ocorrência natural (WT) e ccr2 12. As amostras foram sacarificadas sem pré-tratamento, com pré-tratamento ácido (HCl 1 m) ou com pré-tratamento alcalino (NaOH 62,5 mm). Em todos os pré- tratamentos testados, ccr2 12 teve uma quantidade aumentada de glicose liberada (% CWR) (teste t de Student bicaudal; ** P < 0,01; de ocorrência natural, n = 10; ccr2 12, n = 11). Barras de erro indicam o erro padrão (ocorrência natural, n = 10; ccr2 12, n = 11).

[0029] Figura 8. Fenótipo de nanismo do álamo ccr2 nocaute bialélico T2_1 gerado com o gRNA direcionado ao quarto éxon do gene CCR2, versus híbridos de álamo de ocorrência natural.

[0030] Figura 9. Crescimento de plantas de diferentes linhagens de álamo.

[0031] Fenótipo dos álamos com mutação ccr2 e de ocorrência natural. Da direita para a esquerda, ocorrência natural, CCR2 monoalélica nocaute de Populus tremula, CCR2 monoalélica nocaute de Populus alba, e ccr2 12.

[0032] Figura 10. Fenótipo de caules descascados de plantas WT, CCR2 monoalélica nocaute de P. alba, CCR2 monoalélica nocaute de P. tremula, e ccr2 12.

[0033] As plantas foram cultivadas por 11 semanas em estufa. O fenótipo do xilema vermelho está presente apenas em ccr2 12.

[0034] Figura 11. Sequência e fenótipo do álamo mutante ccr2

116.

[0035] A. Sequência de aminoácidos das proteínas CCR2 mutantes (SEQ ID NO: 93) e de ocorrência natural (SEQ ID NO: 2) de Populus tremula. O aminoácido mutado em ccr2 116 está indicado em negrito / sublinhado. B. Fenótipo de caules descascados de plantas WT, ccr2 116 e ccr2 12. As plantas foram cultivadas durante 11 semanas em estufa. O fenótipo do xilema vermelho está presente apenas em ccr2 12.

[0036] Figura 12. Princípio do ensaio de alimentação de levedura para testar a atividade da proteína CCR2 mutante produzida de forma recombinante, conforme expresso nas linhagens ccr2 12.

[0037] As culturas de levedura foram modificadas para expressar 4CL e WT (SEQ ID NO: 3) ou proteína CCR2 de P. alba mutada (SEQ ID NO: 4). Após alimentar as culturas de levedura com ácido ferúlico, a atividade da respectiva proteína CCR2 foi avaliada com base na produção de coniferaldeído (o produto de CCR2).

[0038] Figura 13. Ensaios de alimentação de levedura para determinar a atividade da proteína CCR2 de P. alba mutante presente em ccr2 12.

[0039] (A) Cromatogramas de GC-MS dos compostos extraídos presentes na levedura modificada com 4CL (preta) e levedura modificada com 4CL e com CCR2 WT de P. alba (cinza), ambas alimentadas com ácido ferúlico. (B) Cromatogramas de GC-MS dos compostos extraídos presentes em levedura modificada com 4CL alimentada com coniferaldeído (preto) e levedura modificada com 4CL e CCR2 WT de P. alba (cinza), ambas alimentadas com ácido ferúlico. (C) Cromatogramas de GC-MS dos compostos extraídos presentes em levedura modificada com 4CL e CCR2 mutada de P. alba (preta) e levedura modificada com 4CL e CCR2 WT de P. alba (cinza), ambas alimentadas com ácido ferúlico. O pico (1) representa coniferaldeído, o pico (2) e (3) são marcadores adicionais para a presença de coniferaldeído. TIC, corrente iônica total; EV, vetor vazio.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0040] A presente invenção será descrita em relação a modalidades particulares e com referência a certos desenhos, mas a invenção não está limitada a eles, mas apenas pelas reivindicações. Quaisquer símbolos de referência nas reivindicações não devem ser interpretados como limitando o escopo. Certamente, deve ser entendido que nem todos os aspectos ou vantagens necessariamente podem ser alcançados de acordo com qualquer modalidade particular da invenção. Assim, por exemplo, aqueles versados na técnica reconhecerão que a invenção pode ser incorporada ou realizada de uma maneira que atinja ou otimize uma vantagem ou grupo de vantagens como descrito neste documento, sem necessariamente atingir outros aspectos ou vantagens como pode ser descrito ou sugerido neste documento.

[0041] A invenção, tanto quanto à organização e método de operação, juntamente com suas características e vantagens, pode ser melhor compreendida por referência à seguinte descrição detalhada quando lida em conjunto com os desenhos em anexo. Os aspectos e vantagens da invenção serão evidentes e elucidados com referência à(s) modalidade(s) descrita(s) a seguir. A referência ao longo desta especificação a "uma modalidade" significa que um determinado recurso, estrutura ou característica descrito em conjunto com a modalidade está incluído em pelo menos uma modalidade da presente invenção. Assim, o aparecimento da frase "em uma modalidade" em vários lugares ao longo desta especificação não se refere necessariamente à mesma modalidade, mas pode se referir. Da mesma forma, deve ser apreciado que na descrição de modalidades exemplificativas da invenção, várias características da invenção são, por vezes, agrupadas em uma única modalidade, figura ou descrição da mesma com o objetivo de simplificar a descrição e auxiliar na compreensão de um ou mais dos vários aspectos da invenção. Este método de descrição, no entanto, não deve ser interpretado como refletindo uma intenção de que a invenção reivindicada requer mais recursos do que os expressamente citados em cada reivindicação. Em vez disso, como as seguintes reivindicações refletem, os aspectos da invenção estão em menos do que todas as características de uma única modalidade descrita precedentemente.

[0042] Quando um artigo indefinido ou definido é usado para se referir a um substantivo no singular, por exemplo, "um" ou "uma", "o", "a", isso inclui um plural desse substantivo, a menos que seja especificamente determinado de outra forma. Quando o termo "compreendendo" é usado na presente descrição e nas reivindicações, ele não exclui outros elementos ou etapas. Além disso, os termos primeiro, segundo, terceiro e similares na descrição e nas reivindicações, são usados para distinguir entre elementos similares e não necessariamente para descrever uma ordem sequencial ou cronológica. Deve ser entendido que os termos assim usados são intercambiáveis em circunstâncias apropriadas e que as modalidades da invenção no presente documento descritas são capazes de operar em outras sequências que não as descritas ou ilustradas neste documento. Os seguintes termos ou definições são fornecidos unicamente para auxiliar na compreensão da invenção. A menos que especificamente definido no presente documento, todos os termos usados no presente documento têm o mesmo significado que teriam para um versado na técnica da presente invenção. Os versados na técnica são particularmente direcionados a Sambrook e outros,

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4ª ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, Nova Iorque (2012); e Ausubel e outros, Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 114), John Wiley & Sons, Nova Iorque (2016), para definições e termos da técnica. As definições fornecidas neste documento não devem ser interpretadas como tendo um escopo menor do que o entendido por um versado na técnica. Definições

[0043] "Cerca de", tal como no presente documento utilizado quando se refere a um valor mensurável, tal como uma quantidade, uma duração de tempo e similares, destina-se a abranger variações de ± 20% ou ± 10%, mais preferencialmente ± 5%, ainda mais preferencialmente ± 1 %, e ainda mais preferencialmente ± 0,1% do valor especificado, uma vez que tais variações são apropriadas para realizar os métodos descritos.

[0044] Tal como no presente documento utilizado, "polinucleotídeo" inclui referência a um desoxirribopolinucleotídeo, ribopolinucleotídeo ou seus análogos que têm a natureza essencial de um ribonucleotídeo natural em que eles hibridizam, sob condições de hibridização rigorosas, para substancialmente a mesma sequência de nucleotídeos que os nucleotídeos de ocorrência natural e / ou permitem tradução no(s) mesmo(s) aminoácido(s) que o(s) nucleotídeo(s) de ocorrência natural. Um polinucleotídeo pode ser de comprimento total ou uma subsequência de um gene estrutural ou regulador nativo ou heterólogo. A menos que indicado ao contrário, o termo inclui referência à sequência especificada, bem como a sua sequência complementar. Assim, DNAs ou RNAs com estruturas modificadas para estabilidade ou por outras razões são "polinucleotídeos" como esse termo é pretendido no presente documento. Além disso, DNAs ou RNAs compreendendo bases incomuns, tal como inosina, ou bases modificadas, tal como bases tritiladas, para citar apenas dois exemplos, são polinucleotídeos como o termo é usado no presente documento. Será apreciado que uma grande variedade de modificações foi feita ao DNA e RNA que servem a muitos propósitos úteis conhecidos pelos versados na técnica. O termo polinucleotídeo, tal como é usado no presente documento, abrange tais formas química, enzimática ou metabolicamente modificadas de polinucleotídeos, bem como as formas químicas de DNA e RNA características de vírus e células, incluindo, entre outros, células simples e complexas.

[0045] Tal como no presente documento utilizado de forma intercambiável, "ácido nucleico" ou "molécula de ácido nucleico" inclui referência a um polímero desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo na forma de fita simples ou dupla e, a menos que de outra forma limitado, abrange análogos conhecidos tendo a natureza essencial dos nucleotídeos naturais pelo fato de que eles hibridizam com ácidos nucleicos de fita simples de maneira similar aos nucleotídeos de ocorrência natural (por exemplo, ácidos nucleicos de peptídeo). "Gene", conforme usado no presente documento, inclui tanto a região promotora do gene, bem como a sequência de codificação. Refere-se tanto à sequência genômica (incluindo possíveis íntrons) quanto ao cDNA derivado do mensageiro spliced, operacionalmente ligado a uma sequência promotora. Um "alelo" é uma variante de um gene, que pode resultar em uma característica fenotípica diferente do dito gene.

[0046] O termo "ocorrência natural" refere-se a um gene ou produto gênico isolado a partir de uma fonte de ocorrência natural. Um gene ou produto gênico de ocorrência natural é aquele que é mais frequentemente observado em uma população ou espécie e, portanto, é arbitrariamente designado como a forma "normal" ou "de ocorrência natural" do gene ou produto gênico. Em contraste, o termo "modificado", "mutante", "mutado" ou "variante" refere-se a um gene ou produto gênico que exibe modificações na sequência, modificações pós-

tradução e / ou propriedades funcionais (ou seja, características alteradas) quando comparado com o gene ou produto gênico de ocorrência natural da mesma espécie. Nota-se que mutantes de ocorrência natural podem ser isolados; estes são identificados pelo fato de terem características alteradas quando comparados ao gene ou produto gênico de ocorrência natural.

[0047] O termo "anormal" quando usado no contexto de organismos, plantas, tecidos, células ou atividades enzimáticas, refere- se aos organismos, plantas, tecidos, células ou atividades enzimáticas dos mesmos que diferem em pelo menos uma característica observável ou detectável (por exemplo, fenótipo, processamento, função, nível quantitativo, etc.) desses organismos, plantas, tecidos, células ou atividades enzimáticas que exibem a respectiva característica ou nível "normal" (esperado). Características ou níveis que são normais ou esperados para um organismo, espécie ou tipo de proteína podem ser anormais para uma espécie, organismo ou tipo de proteína diferente.

[0048] "Sequência de codificação" é uma sequência de nucleotídeos, que é transcrita em mRNA e / ou traduzida em um polipeptídeo quando colocada sob o controle de sequências regulatórias apropriadas. Os limites da sequência de codificação são determinados por um códon de início de tradução no terminal 5’ e um códon de terminação de tradução no terminal 3’. Uma sequência de codificação pode incluir, mas não está limitada a mRNA, cDNA, sequências de nucleotídeos recombinantes ou DNA genômico, enquanto íntrons também podem estar presentes em certas circunstâncias. Por "codificação" ou "codificado", no que diz respeito a um ácido nucleico especificado, entende-se que compreende a informação para a transcrição em um RNA e, em algumas modalidades, a tradução na proteína especificada. Um ácido nucleico codificando uma proteína pode compreender sequências não traduzidas (por exemplo, íntrons)

dentro de regiões traduzidas do ácido nucleico, ou pode não ter essas sequências não traduzidas intervenientes (por exemplo, como no cDNA). A informação pela qual uma proteína é codificada é especificada pelo uso de códons. Tipicamente, a sequência de aminoácidos é codificada pelo ácido nucleico usando o código genético "universal". Um "gene quimérico" ou "construto quimérico" é uma sequência de ácido nucleico recombinante na qual um promotor ou sequência de ácido nucleico regulatória está operacionalmente ligada a, ou associada a, uma sequência de ácido nucleico codificando um mRNA, de modo que a sequência de ácido nucleico regulatória seja capaz de regular a transcrição ou a expressão da sequência de codificação do ácido nucleico associada. A sequência de ácido nucleico regulatória do gene quimérico não está operacionalmente ligada à sequência de ácido nucleico associada, conforme encontrada na natureza.

[0049] O termo "expressão", conforme no presente documento utilizado, refere-se à biossíntese de um produto gênico, incluindo a transcrição e / ou a tradução do dito produto gênico. Por exemplo, para os propósitos da presente invenção, a expressão de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo CCR (mutante), por meio da produção de uma molécula de RNA que traduz um polipeptídeo CCR (mutante) da invenção. A "expressão" ou "produção" de uma proteína ou polipeptídeo a partir de uma molécula de DNA refere-se à transcrição e tradução da sequência de codificação para produzir a proteína ou polipeptídeo, enquanto a "expressão" ou "produção" de uma proteína ou polipeptídeo a partir de uma molécula de RNA refere-se à tradução da sequência de codificação de RNA para produzir a proteína ou polipeptídeo. Além disso, a "expressão" de um gene pode referir-se à transcrição do gene em um transcrito não codificando proteína.

[0050] Os termos "proteína", "polipeptídeo", "peptídeo" são usados de forma intercambiável adicionalmente neste documento para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos e a variantes e análogos sintéticos dos mesmos. Assim, estes termos se aplicam a polímeros de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos são um aminoácido sintético não natural, tal como um análogo químico de um aminoácido natural correspondente, bem como a polímeros de aminoácidos naturais. Este termo também inclui modificações pós- tradução do polipeptídeo, tal como glicosilação, fosforilação e acetilação. Com base na sequência de aminoácidos e nas modificações, a massa atômica ou molecular ou o peso de um polipeptídeo é expresso em (quilo) dalton (kDa). Por "polipeptídeo recombinante" entende-se um polipeptídeo feito usando técnicas recombinantes, isto é, através da expressão de um polinucleotídeo sintético ou recombinante, preferencialmente em um sistema de expressão heterólogo ou hospedeiro. Por "isolado" entende-se o material que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que tipicamente o acompanham em seu estado nativo. Por exemplo, um "polipeptídeo isolado" refere-se a um polipeptídeo que foi purificado a partir das moléculas que o flanqueiam em um estado de ocorrência natural, por exemplo, uma proteína CCR que foi removida dos compostos de planta ou moléculas de meio do hospedeiro de produção que são adjacentes à proteína. Uma proteína isolada pode ser gerada por síntese química de aminoácidos ou pode ser gerada por produção recombinante, ou mesmo ser isolada a partir de seu ambiente natural, isto é, para proteínas CCR de planta isoladas do tecido de planta.

[0051] O termo "transgênico", "transgene" ou "recombinante", tal como no presente documento utilizado, significa, no que diz respeito a, por exemplo, uma sequência de ácido nucleico, um cassete de expressão, construto de gene quimérico ou um vetor compreendendo a sequência de ácido nucleico ou um organismo transformado com as sequências de ácido nucleico, cassetes de expressão ou vetores de acordo com a invenção.

Uma planta transgênica, para os propósitos da invenção, é assim entendida como significando, como acima, que os ácidos nucleicos usados no método da invenção não estão presentes ou se originam do genoma da dita planta, ou estão presentes no genoma da dita planta, mas não no seu lócus natural no genoma da dita planta, sendo possível que os ácidos nucleicos sejam expressos de forma homóloga ou heteróloga.

No entanto, como mencionado, transgênico também significa que, embora os ácidos nucleicos de acordo com a invenção ou usados no método da invenção estejam em sua posição natural no genoma de uma planta, a sequência foi modificada em relação à sequência natural, e / ou que as sequências regulatórias das sequências naturais foram modificadas.

Transgênico é preferencialmente entendido como significando a expressão dos ácidos nucleicos de acordo com a invenção em um lócus não natural no genoma, isto é, ocorre expressão homóloga ou heteróloga dos ácidos nucleicos.

As plantas transgênicas preferenciais são mencionadas no presente documento.

O termo "transformação", como citado no presente documento, abrange a transferência de um polinucleotídeo exógeno para uma célula hospedeira, independentemente do método usado para a transferência.

O tecido de planta capaz de subsequente propagação clonal, seja por organogênese ou embriogênese, pode ser transformado com um construto genético ou vetor da presente invenção e uma planta inteira regenerada a partir dele.

O tecido particular escolhido variará dependendo dos sistemas de propagação clonal disponíveis e mais adequados para a espécie particular sendo transformada.

Alvos de tecido exemplificativos incluem discos de folhas, pólen, embriões, cotilédones, hipocótilos, megagametófitos, tecido caloso, tecido meristemático existente (por exemplo, meristema apical, botões axilares e meristemas de raiz), e tecido de meristema induzido (por exemplo, meristema de cotilédones e meristema de hipocótilo). O polinucleotídeo pode ser introduzido de forma transiente ou estável em uma célula hospedeira e pode ser mantido não integrado, por exemplo, como um plasmídeo.

Alternativamente, ele pode ser integrado no genoma do hospedeiro.

A célula de planta transformada resultante pode então ser usada para regenerar uma planta transformada de uma maneira conhecida pelos versados na técnica.

A transformação de espécies de plantas é agora uma técnica bastante rotineira.

Vantajosamente, qualquer um dos vários métodos de transformação pode ser usado para introduzir o gene de interesse em uma célula ancestral adequada.

Os métodos descritos para a transformação e regeneração de plantas a partir de tecidos ou células de plantas podem ser utilizados para transformação transiente ou estável.

Os métodos de transformação incluem o uso de lipossomas, eletroporação, produtos químicos que aumentam a absorção livre de DNA, injeção do DNA diretamente na planta, bombardeio de partículas, transformação usando vírus ou pólen e microprojeção.

Os métodos podem ser selecionados a partir do método de cálcio / polietileno glicol para protoplastos (Krens, F.A. e outros, (1982) Nature 296, 72 a 74; Negrutiu I e outros (1987) Plant Mol Biol 8: 363 a 373); eletroporação de protoplastos (Shillito R.D. e outros (1985) Bio / Technol 3, 1099 a 1102); microinjeção em material de planta (Crossway A e outros, (1986) Mol.

Gen Genet 202: 179 a 185); Bombardeio de partículas revestidas com DNA ou RNA (Klein TM e outros, (1987) Nature 327: 70), infecção com vírus (não integrativos) e similares.

Plantas transgênicas, incluindo plantas de cultura transgênicas, são preferencialmente produzidas por meio de transformação mediada por Agrobactérias.

Um método de transformação vantajoso é a transformação in planta.

Para tanto, é possível, por exemplo, permitir que as agrobactérias atuem sobre as sementes das plantas ou inocular o meristema da planta com agrobactérias.

Provou-se ser particularmente conveniente, de acordo com a invenção, permitir que uma suspensão de agrobactérias transformadas atue sobre a planta intacta ou pelo menos sobre os primórdios da flor. A planta é subsequentemente cultivada até que as sementes da planta tratada sejam obtidas (Clough e Bent, Plant J. (1998) 16, 735 a 743). Os métodos para a transformação de arroz mediada por Agrobactérias incluem métodos bem conhecidos para a transformação de arroz, tal como os descritos em qualquer um dos seguintes: Pedido de patente europeia EP1198985, Aldemita e Hodges (Planta 199: 612 a 617, 1996); Chan e outros (Plant Mol Biol 22 (3): 491 a 506, 1993), Hiei e outros (Plant J 6 (2): 271 a 282, 1994). No caso da transformação do milho, o método preferencial é como descrito por Ishida e outros (Nat. Biotechnol 14 (6): 745-50, 1996) ou Frame e outros (Plant Physiol 129 (1): 13 a 22, 2002). Os ditos métodos são ainda descritos a título de exemplo por B. Jenes e outros, Techniques for Gene Transfer, em: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. SD. Kung e R. Wu, Academic Press (1993) 128 a 143 e em Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205 a 225). A transformação mediada por Agrobactérias de P. tremula × P. alba 717- 1B4 é, por exemplo, realizada de acordo com Leplé e outros (1992).

[0052] A molécula de ácido nucleico ou o construto a ser expresso é preferencialmente clonado em um vetor, que é adequado para transformar Agrobacterium tumefaciens, por exemplo pBin19 (Bevan e outros (1984) Nucl. Acids Res. 12-8711). As agrobactérias transformadas por tal vetor podem então ser usadas de maneira conhecida para a transformação de plantas, tal como plantas usadas como modelo, como Arabidopsis ou plantas de cultivo, tal como, a título de exemplo, plantas de tabaco, por exemplo, por imersão de folhas machucadas ou folhas cortadas em uma solução de agrobactérias e depois cultivadas em meios adequados. A transformação de plantas por meio de Agrobacterium tumefaciens é descrita, por exemplo, por Hofgen e Willmitzer em Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 ou é conhecida, entre outros, por F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; em Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. SD. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, págs. 15 a 38.

[0053] As células de plantas geneticamente modificadas podem ser regeneradas por meio de todos os métodos com os quais o versado na técnica está familiarizado. Métodos adequados podem ser encontrados nas publicações mencionadas acima por S.D. Kung e R. Wu, Potrykus ou Hofgen e Willmitzer, ou Leplé e outros (1992). Geralmente, após a transformação, as células de plantas ou agrupamentos de células são selecionados quanto à presença de um ou mais marcadores que são codificados por genes expressáveis em plantas co-transferidos com o gene de interesse, após o que o material transformado é regenerado em uma planta inteira. Para selecionar plantas transformadas, o material de planta obtido na transformação é, via de regra, submetido a condições seletivas para que as plantas transformadas possam ser distinguidas das plantas não transformadas. Por exemplo, as sementes obtidas da maneira descrita acima podem ser plantadas e, após um período inicial de crescimento, submetidas a uma seleção adequada por pulverização. Uma outra possibilidade consiste em cultivar as sementes, se apropriado após a esterilização, em placas de ágar usando um agente de seleção adequado, de modo que apenas as sementes transformadas possam crescer e se transformar em plantas. Alternativamente, as plantas transformadas são triadas quanto à presença de um marcador selecionável, como os descritos acima. Após a transferência e regeneração de DNA, as plantas supostamente transformadas também podem ser avaliadas, por exemplo, usando a análise de Southern, quanto à presença do gene de interesse, número de cópias e / ou organização genômica. Alternativamente ou adicionalmente, os níveis de expressão do DNA recém-introduzido podem ser monitorados usando análise Northern e / ou Western, ambas as técnicas sendo bem conhecidas pelos versados na técnica. As plantas transformadas geradas podem ser propagadas por uma variedade de meios, tal como por propagação clonal ou técnicas de reprodução clássicas. Por exemplo, uma planta transformada de primeira geração (ou T1) pode ser autofecundada e transformantes homozigóticos de segunda geração (ou T2) selecionados, e as plantas T2 podem então ser propagadas através de técnicas clássicas de melhoramento. Os organismos transformados gerados podem assumir uma variedade de formas. Por exemplo, eles podem ser quimeras de células transformadas e células não transformadas; transformantes clonais (por exemplo, todas as células transformadas para conter o cassete de expressão); enxertos de tecidos transformados e não transformados (por exemplo, em plantas, um porta-enxerto transformado enxertado em uma copa não transformada).

[0054] O termo "planta", tal como no presente documento utilizado, abrange plantas inteiras, ancestrais e progênie das plantas e partes de plantas, incluindo sementes, brotos, caules, folhas, raízes (incluindo tubérculos), flores e tecidos e órgãos, em que cada um dos mencionados acima compreende o gene / ácido nucleico de interesse. O termo "planta" também abrange células de plantas, culturas em suspensão, tecido caloso, embriões, regiões meristemáticas, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos, novamente em que cada um dos mencionados acima compreende o gene / ácido nucleico de interesse. A escolha de plantas de controle adequadas é uma parte de rotina de uma configuração experimental e pode incluir plantas de ocorrência natural correspondentes, ou também pode incluir plantas correspondentes sem o gene de interesse, ou seja, plantas com um nocaute de ccr, ou podem também incluir plantas seguindo o mesmo tratamento (por exemplo, transformação), mas sem o efeito (por exemplo, usando um vetor vazio sem gene CCR mutante). A planta de controle é tipicamente da mesma espécie de planta, até mesmo da mesma variedade da planta a ser avaliada. A planta de controle também pode ser um nulizigoto da planta a ser avaliada. Nulizigotos são indivíduos sem o transgene por segregação. Uma "planta de controle", conforme no presente documento utilizada, refere-se não apenas a plantas inteiras, mas também a partes de plantas, incluindo sementes e partes de sementes. Descrição detalhada

[0055] A necessidade por níveis de expressão alterados de forma estável ou nocautes / silenciamento de CCR2 em plantas de álamo era clara a partir de observações precedentes de que o RNAi de CCR2 em álamo não era capaz de atingir um fenótipo de ccr estável, tal como uma coloração vermelha uniforme do xilema. Assim, plantas de álamo ccr2 nocaute foram geradas usando o sistema de edição de genes CRISPR / Cas9, usando um gRNA para direcionar especificamente o terceiro éxon de ambos os alelos CCR2 no álamo híbrido P. tremula x P. alba. No entanto, álamos ccr2 com mutações bialélicas de deslocamento do quadro de leitura foram severamente nanificados e mal podiam sobreviver em condições úmidas de cultura in vitro (Figura 1; Figura 2), que é um problema conhecido em várias características de lignina. Inesperadamente, uma linhagem de ccr2 modificada não apresentou tal defeito de crescimento, o ccr2 12, que formou a base desta invenção, uma vez que esta linhagem continha uma mutação de deslocamento do quadro de leitura em um alelo, embora tivesse uma deleção de 3 pares de bases no outro alelo resultante em uma alteração de 2 aminoácidos em sua sequência de proteína de ocorrência natural de álamo, a mutação estando presente em uma região ou motivo muito conservado da proteína. Como um resultado, a proteína CCR mutante da linhagem ccr2 12 é caracterizada por uma mutação incluindo uma deleção e uma substituição dos aminoácidos correspondentes às posições 114 e 115 do CCR2 de ocorrência natural (envolvendo uma isoleucina e alanina em P. tremula e P. alba, conforme representado na SEQ ID NO: 2 e 3, resp.), em que a dita substituição é diferente dos ditos aminoácidos, e em ccr2 12 diz respeito a uma substituição para uma Treonina, resultando na proteína CCR2 mutante com uma sequência correspondente à SEQ ID NO: 4 e / ou 5 (proteínas mutantes para CCR2 de P. alba e P. tremula, resp.), respectivamente. Surpreendentemente, as plantas ccr2 12 carregando um alelo ccr2 nocaute (ko) e um alelo ccr2 mutante não apresentaram um fenótipo anão. Uma coloração vermelha do xilema foi observada em ccr2 12, indicativa de reduções na atividade de CCR, e típica de quantidades reduzidas de lignina e eficiência de sacarificação aumentada. No entanto, as plantas de álamo ko monoalélicas não apresentaram esse fenótipo típico de deficiência de CCR, permitindo concluir que o alelo CCR2 mutante, ao invés da atividade CCR parcial causada por apenas um alelo ko, é causador dessa característica de lignina que não sofre perdas de produtividade.

[0056] Além de tais proteínas CCR2 mutantes, a invenção refere-se ainda a um método de triagem para identificar proteínas de biossíntese de lignina mutantes capazes de restaurar o crescimento das plantas, por exemplo, de plantas anãs induzidas por modificação de lignina, portanto, um método de triagem para produzir plantas com quantidades reduzidas de lignina e crescimento normal. O dito método de triagem pode compreender etapas de fornecer plantas com pelo menos um alelo nocaute de um gene de biossíntese de lignina, e induzir um segundo alelo mutante do dito gene de biossíntese de lignina, tal como uma mutação que difere em n x 3 nucleotídeos, selecionar adicionalmente a dita sequência mutante como uma variante alélica. O dito método também permite identificar como modificar a proteína de biossíntese de lignina codificada por pequenas deleções / alterações de aminoácidos,

resultando em menor teor de lignina e sem impacto na biomassa. O dito método de triagem é interessante para identificar alelos mutantes específicos que não resultam em um nocaute, mas em um efeito de nocaute estável. Especificamente relacionado a esta invenção, o dito gene de biossíntese de lignina é CCR, e / ou a dita introdução de uma segunda mutação é obtida por edição de gene.

[0057] Em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína CCR de planta mutante que tem uma mutação no domínio conservado de proteínas CCR conforme descrito na SEQ ID NO: 1 (correspondendo à sequência de domínio conservado de CCR2 de P. alba), em que a dita mutação está presente na posição de aminoácido 98, 99 e / ou 100 do dito domínio conforme representado na SEQ ID NO: 1. A mutação pode ainda ser caracterizada por se referir a uma deleção de pelo menos um dos resíduos correspondentes à posição 98, 99 e / ou 100 da SEQ ID NO: 1. Outra modalidade refere-se a uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína CCR de planta mutante que é mutada em um domínio conservado de CCR com uma sequência de pelo menos 50% de identidade de aminoácidos com o domínio de SEQ ID NO: 1, em que a dita mutação está presente no aminoácido correspondente alinhado à posição 98, 99 e / ou 100 do dito domínio representado na SEQ ID NO: 1 (ver Figura 6 para um exemplo de um alinhamento para identificar as posições 98, 99 e 100). A mutação pode ainda ser caracterizada pelo fato de que se refere a uma deleção de pelo menos um dos resíduos correspondentes à posição 98, 99 e / ou 100 de uma sequência de pelo menos 50% de identidade de aminoácidos com o domínio de SEQ ID NO: 1. O dito domínio conservado de proteínas CCR é definido no presente documento como um domínio conservado de uma proteína CCR de planta compreendendo os resíduos característicos para a identidade e atividade de CCR presentes na dita sequência de proteína

(como representado na Figura 6). Os ditos resíduos característicos incluem a assinatura de CCR ‘NWYCYGK’, bem como os resíduos do sítio de ligação a NADP e resíduos do sítio ativo conforme representado e anotado no alinhamento das sequências da proteína CCR mostradas na Figura 6, representando uma população de diferentes proteínas CCR de uma série de espécies de plantas. De fato, o dito domínio conservado de proteínas CCR como mostrado para CCR2 de P. alba em SEQ ID NO: 1 representa a região mais conservada da proteína completa (sem uma parte C-terminal mais divergente de cerca de 100 aminoácidos), e inclui o domínio FR_SDR_e funcionalmente conservado presente em proteínas CCR de plantas, que é responsável por sua função em plantas.

[0058] De fato, a enzima cinamoil-CoA redutase (EC 1.2.1.44), sistematicamente denominada cinamaldeído:NADP + oxidoredutase (CoA-cinamoilatação), mas comumente dita pela sigla CCR, é uma enzima que catalisa a redução de uma cinamoil-CoA substituída em seu cinamaldeído correspondente, utilizando NADPH e H+ e liberando CoA e NADP+ livres no processo. Os substratos de cinamoil-CoA biologicamente relevantes comuns para CCR incluem p-coumaroil-CoA e feruloil-CoA, que são convertidos em p-cumaraldeído e coniferaldeído, respectivamente, embora a maioria das CCRs mostrem atividade em relação a uma variedade de outras cinamoil-CoA substituídas. Catalisando a primeira etapa comprometida na biossíntese de monolignol, esta enzima desempenha um papel crucial na formação de lignina, um processo importante nas plantas tanto para o desenvolvimento estrutural quanto para a resposta de defesa.

[0059] A relação evolutiva entre diferentes sequências está confinada na terminologia de "homologia", que descreve uma relação evolutiva divergente entre genes e proteínas com base em sua similaridade / identidade de sequência, e que descendem de uma sequência de DNA ancestral comum. "Ortólogos" e "parálogos" abrangem conceitos evolutivos usados para descrever as relações ancestrais dos genes.

Parálogos são genes dentro da mesma espécie que se originaram pela duplicação de um gene ancestral; enquanto "ortólogos" são genes de diferentes organismos que se originaram por meio de especiação, e também são derivados de um gene ancestral comum.

Portanto, um "homólogo" de uma proteína abrange peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e enzimas tendo substituições, deleções e / ou inserções de aminoácidos em relação à proteína não modificada ou de ocorrência natural em questão.

Os "ortólogos" também são definidos por terem atividade biológica e funcional similar.

Um ortólogo de planta funcional (ou um gene ortólogo de planta funcional) dos genes CCR é um gene ortólogo de planta de CCR codificando uma proteína com as mesmas propriedades enzimáticas de CCR.

Os ortólogos funcionais de genes CCR podem ser isolados a partir dos bancos de dados de sequência disponíveis (publicamente). Os termos "resíduo" ou "resíduo de aminoácido" ou "aminoácido" são usados no presente documento de forma intercambiável para se referir a um aminoácido que é incorporado em uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo (coletivamente "proteína"). O aminoácido pode ser um aminoácido de ocorrência natural e, a menos que de outra forma limitado, pode abranger análogos conhecidos de aminoácidos naturais que podem funcionar de maneira similar aos aminoácidos de ocorrência natural.

O termo "identidade de aminoácidos", tal como no presente documento utilizado, refere-se à extensão em que as sequências são idênticas em uma base de aminoácido por aminoácido ao longo de uma janela de comparação.

Assim, uma "porcentagem de identidade de sequência" é calculada comparando-se duas sequências otimamente alinhadas ao longo da janela de comparação, determinando o número de posições nas quais o resíduo de aminoácido idêntico (por exemplo,

Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys e Met) ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na janela de comparação (ou seja, o tamanho da janela), e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência. Um espaço, isto é, uma posição em um alinhamento onde um resíduo está presente em uma sequência, mas não na outra, é considerado como uma posição com resíduos não idênticos. O alinhamento das duas sequências é realizado pelo algoritmo de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch (1970) J Mol Biol. 48: 443 a 453). O alinhamento de sequências assistido por computador acima pode ser convenientemente realizado usando um programa de software padrão, tal como GAP, que faz parte do Wisconsin Package Versão 10.1 (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, EUA) usando a matriz de escore padrão com uma penalização de criação de espaço de 50 e uma penalização de extensão de espaço de 3. As sequências são indicadas como "essencialmente similares" ou "homólogas" quando tais sequências de aminoácidos têm uma identidade de sequência de pelo menos cerca de 70%, particularmente pelo menos cerca de 75%, particularmente pelo menos cerca de 80%, mais particularmente pelo menos cerca de 85%, muito particularmente cerca de 90%, especialmente cerca de 95%, mais especialmente cerca de 100%, muito especialmente são idênticas. Alternativamente, o versado na técnica pode isolar genes de CCR de plantas homólogas por meio de métodos de hibridização genética. Tais métodos são bem conhecidos do biólogo molecular versado na técnica (planta).

[0060] A relação funcional entre genes CCR entre plantas, conforme descrito neste documento, refere-se à sua contribuição para a lignificação. Para facilidade de referência e evitar dúvidas, um representante da proteína CCR (proteína codificada pela sequência de codificação de comprimento total) é representado por CCR1 de Arabidopsis thaliana NP_173047 (Acesso ao Genbank NCBI), e como derivado do gene CCR codificado por AT1G15950 (acesso TAIR, www.arabidopsis.org). No álamo, a proteína CCR2 é representada no presente documento, com CCR2 de Populus trichocarpa como mostrado no alinhamento da Figura 6 (SEQ ID NO: 22), e para o híbrido P. tremula x P. alba, a sequência genômica fornecida pelo banco de dados Aspen (Xue e outros, 2015; Zhou e outros, 2015; http://aspendb.uga.edu/) revela ambos os alelos CCR2 codificando proteínas CCR2 com apenas diferença em 1 aminoácido (SEQ ID NO: 6 e 7, resp., codificando proteínas CCR2 de SEQ ID NO: 2 e 3, resp.). Conforme descrito por Sonawane e outros (2013; ver também a Figura 6), as sequências da proteína CCR são caracterizadas pela presença de vários motivos: uma assinatura de CCR (NWYCYGK), bem como resíduos de sítio ativo NADP conservados e resíduos de sítio ativo, todos juntos presentes dentro de um domínio conservado de proteínas CCR presentes em um domínio estendido de flavonoide redutase (FR) (e) Desidrogenase / Redutase de Cadeia Curta e Enzimas Relacionadas (SDR) (FR_SDR_e). A Figura 6 (adaptada de Sonawane e outros, 2013) ilustra o alinhamento de uma série de sequências de CCR homólogas a partir de diferentes espécies de plantas, e a região conservada no presente documento citada, chamada no presente documento de a parte mais N-terminal do domínio FR_SDR_e conservado, e tem cerca de 190 aminoácidos, como representado na SEQ ID NO: 1 para a proteína CCR2 de Populus alba, e corresponde à região que compreende os aminoácidos 16 a 208 da sequência da proteína CCR2 de P. alba como representada na SEQ ID NO: 3.

[0061] > SEQ ID NO: 1: domínio conservado de CCR2 de Populus alba (compreendendo a assinatura de CCR e NADP e resíduos de sítio ativo do domínio FR_SDR_e como indicado nas sequências de domínio correspondentes na Figura 6) (193 aa; a partir de aa16 a aa 208 de SEQ ID NO: 3)

[0062] CVTGAGGFIASWMVKLLLDKGYTVRGTARNPADPKNSHL

RELEGAQERLTLCKADLLDYESLKEAIQGCDGVFHTASPVTDDPEEM VEPAVNGTKNVIIAAAEAKVRRVVFTSSIGAVYMDPNKGPDVVIDESC WSDLEFCKNTKNWYCYGKAVAEQAAWDMAKEKGVDLVVVNPVLVL GPLLQPTVNASIVH

[0063] A anotação do domínio FR-SDR_e (Marchler-Bauer e outros, 2017) é derivada da ação de flavonol redutases na redução dependente de NADP de flavonoides, metabólitos secundários de planta contendo cetonas, que têm a tríade de sítio ativo característico dos SDRs (embora não o sítio ativo a montante Asn) e um motivo de ligação a NADP que é muito similar ao motivo SDR estendido típico. Além da dobra Rossmann (padrão de dobramento alfa / beta com uma folha beta central) da região central típica de todos os SDRs, os SDRs estendidos têm uma extensão C-terminal menos conservada de aproximadamente 100 aminoácidos (não incluídos na SEQ ID NO: 1). Os SDRs estendidos são uma coleção diversa de proteínas, e incluem isomerases, epimerases, oxidorredutases e liases; eles tipicamente têm um motivo de ligação ao cofator TGXXGXXG (SEQ ID NO: 60). Os SDRs são uma família funcionalmente diversa de oxidorredutases que têm um único domínio com uma dobra de Rossmann estruturalmente conservada, uma região de ligação a NAD(P)(H), e uma região C-terminal estruturalmente diversa (a região C-terminal não está incluída em SEQ ID NO: 1). A identidade de sequências entre diferentes enzimas SDR está tipicamente na faixa de 15 a 30%; eles catalisam uma ampla gama de atividades, incluindo o metabolismo de esteroides, cofatores, carboidratos, lipídios, compostos aromáticos e aminoácidos, e atuam no sensoriamento redox. Os SDRs clássicos têm um motivo de ligação a cofator TGXXX[AG]XG (SEQ ID NO: 61 e 62) e um motivo de sítio ativo YXXXK (SEQ ID NO: 63), com o resíduo Tyr do motivo de sítio ativo servindo como um resíduo catalítico crucial (Tyr-151, numeração da 15- hidroxiprostaglandina desidrogenase humana). Além de Tyr e Lys, frequentemente há uma Ser e / ou Asn a montante, contribuindo para o sítio ativo; enquanto a ligação ao substrato está na região C-terminal, que determina a especificidade. O mecanismo de reação padrão é uma transferência de 4-pro-S hidreto e retransmissão de prótons envolvendo Tyr e Lys conservadas, uma molécula de água estabilizada por Asn, e nicotinamida.

[0064] As posições que são mutadas na proteína CCR mutante, conforme descrito neste documento, são indicadas em destaque cinza em negrito na SEQ ID NO: 1, nas posições 98, 99 e / ou 100, e correspondem às posições 113, 114 e / ou 115 nas sequências de proteína CCR2 de P. alba (SEQ ID NO: 3). Uma mutação da(s) dita(s) Isoleucina(s) (I) e / ou Alanina(s) (A) pode compreender uma deleção, substituição ou inserção.

[0065] O termo "proteína CCR de planta mutante", conforme descrito neste documento, refere-se a uma proteína CCR de planta que é diferente em uma série de aminoácidos em comparação com sua sequência de proteína CCR de ocorrência natural (em que a ocorrência natural se refere à sequência mais frequentemente observada para a dita espécie). Para proteínas CCR2 mutantes de P. alba, em uma modalidade, os aminoácidos correspondentes às posições 113, 114 e / ou 115 de SEQ ID NO: 3, são mutados, resultando em uma CCR2 de P. alba mutada. As ditas mutações podem ser inserções, deleções e substituições. Em uma modalidade específica, a proteína CCR2 mutante de P. alba está representada na SEQ ID NO: 4 e compreende especificamente uma substituição de IA nas posições 114 e 115 por uma Treonina.

[0066] Para identificar uma proteína CCR mutante como no presente documento descrito, o versado na técnica poderia fazer um alinhamento da sequência da proteína CCR mutante com a sequência da proteína CCR de ocorrência natural originária da mesma espécie e / ou incluir proteínas CCR adicionais (ortólogas) (como mostrado em Figura 6). Este alinhamento permite identificar se uma proteína CCR mutante está de fato mutada nas posições correspondentes à posição 113, 114 e / ou 115 de CCR2 (conforme representado na SEQ ID NO: 2 ou 3), que estão presentes em um motivo muito conservado de resíduos em proteínas CCR de ocorrência natural (ver Figura 6).

[0067] Em uma modalidade, a proteína CCR mutante é mutada em um domínio conservado de pelo menos 50% de identidade de aminoácidos para SEQ ID NO: 1, que tipicamente refere-se ao domínio conservado de outra proteína CCR de planta ou de outra proteína CCR de planta de outra espécie de planta, ou CCR ortóloga, que após alinhamento com SEQ ID NO: 1 corresponde ao dito domínio conservado e, portanto, será pelo menos 50% idêntico em sua sequência de aminoácidos. No presente pedido, a referência a ‘uma sequência com pelo menos 50% de identidade com a SEQ ID NO: 1’, refere-se à sequência de proteína SEQ ID NO: 1 alinhada com a sequência mutada, em que a identidade de 50% de aminoácidos é calculada como indicado acima, mas pode excluir os resíduos 98-100 para o cálculo. Assim, o presente pedido refere-se a moléculas de ácido nucleico codificando uma proteína CCR de planta mutante mutada na posição 98, 99 e / ou 100 de uma sequência com pelo menos 50% de identidade com a SEQ ID NO: 1, em que os ditos 50% são calculados no alinhamento de todos os resíduos de SEQ ID NO: 1 excluindo os resíduos 98-100. Assim, na dita proteína CCR mutante, os resíduos conservados correspondentes às posições 98, 99 e / ou 100 da SEQ ID NO: 1 podem ser diferentes dos resíduos nas posições correspondentes da SEQ ID NO: 1 sem contribuir para a diferença de 50% de identidade. Em modalidades alternativas, a molécula de ácido nucleico da invenção pode codificar uma proteína CCR de planta mutante que é mutada no domínio conservado da dita proteína com pelo menos 60% de identidade de aminoácidos com SEQ ID NO: 1, ou com pelo menos 70% de aminoácidos identidade de ácido para SEQ ID NO: 1, ou pelo menos 75% de identidade de aminoácidos para SEQ ID NO: 1, ou pelo menos 80% de identidade de aminoácidos para SEQ ID NO: 1, ou pelo menos 85% de identidade de aminoácidos para SEQ ID NO: 1, ou pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com SEQ ID NO: 1, ou pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com SEQ ID NO: 1, ou pelo menos 97% de identidade de aminoácidos com SEQ ID NO: 1, ou pelo menos 99% de identidade de aminoácidos com a SEQ ID NO: 1, caracterizada pelo fato de que a mutação compreende uma deleção de pelo menos um aminoácido da posição 98 a 100 do dito domínio conservado. Ou em que a dita mutação compreende uma deleção de uma das posições 98, 99 ou 100, ou em que a dita mutação compreende uma deleção e uma substituição de um daqueles resíduos correspondentes à posição 98, 99 ou 100 após o alinhamento dessas sequências de proteínas de domínio conservado das ditas proteínas CCR.

[0068] Portanto, a % de identidade de aminoácidos é baseada na comparação dos resíduos 1-97 e 100 a 193 de SEQ ID NO: 1. Como mostrado na Figura 6, para um número não limitante de proteínas CCR de diferentes espécies de plantas, a região conservada correspondente à SEQ ID NO: 1 é conservada entre outros ortólogos de CCR em pelo menos 50% de identidade de aminoácidos. Portanto, tipicamente, a proteína CCR mutante é um mutante em comparação com sua forma de ocorrência natural nativa, para descrever se é uma proteína CCR mutante como no presente documento definido, no motivo nas posições 98-100.

[0069] A mutação pode ser uma substituição, inserção ou deleção de aminoácido(s). Especificamente, o tipo de mutação está, entretanto, limitado a uma mutação que não resulta em uma inativação completa da proteína (ou nocaute do gene). Para produzir uma proteína CCR mutante, é considerada a produção de proteína recombinante, heteróloga ou sintética, bem como a mutação direcionada de genes endógenos.

Quando as proteínas CCR de planta mutantes estão no escopo de serem produzidas dentro de uma planta, uma planta pode ser adequada para produzir a dita proteína CCR mutante de várias maneiras.

As plantas podem ser transformadas para introduzir um vetor ou cassete de expressão para expressar de forma recombinante a molécula de ácido nucleico codificando a proteína CCR mutante dentro das células da planta.

Alternativamente, o gene endógeno codificando o polipeptídeo CCR pode ser rompido ou mutado por qualquer método conhecido na técnica.

Por exemplo, o gene é mutado usando diferentes tecnologias, tal como marcação de transposon ou, alternativamente, por mutagenização de plantas usando mutagênese aleatória ou direcionada e triagem de plantas que têm uma mutação de CCR (ou o fenótipo correspondente da invenção). Métodos adicionais para alterar os genes CCR endógenos na planta também são conhecidos na técnica e podem ser aplicados de forma similar à presente invenção.

Estes métodos incluem outras formas de mutagênese, tal como mutagênese induzida por etil metanossulfonato, mutagênese por deleção, e mutagênese por deleção rápida de nêutrons usados em um sentido de genética reversa (com PCR) para identificar linhagens de plantas nas quais o gene endógeno foi deletado.

Para exemplos destes métodos, ver Ohshima, e outros, (1998) Virology 243: 472 a 481; Okubara, e outros, (1994) Genetics 137: 867 a 874, e Quesada, e outros, (2000) Genetics 154: 421 a 436, cada um dos quais é no presente documento incorporado por referência.

Além disso, um método rápido e automatizado para a triagem de mutações quimicamente induzidas, TILLING (Segmentação Induzida por Lesões Locais nos Genomas), usando HPLC desnaturante ou digestão com endonuclease seletiva de produtos de PCR selecionados também é aplicável à presente invenção (ver, McCallum, e outros, (2000) Nat.

Biotechnol 18: 455 a 457). As mutações que afetam a expressão do gene ou que interferem com a função da proteína codificada são bem conhecidas na técnica.

Mutações de inserção em éxons de genes geralmente resultam em mutantes nulos.

As mutações em resíduos conservados são particularmente eficazes na inibição da atividade da proteína codificada.

Resíduos conservados de polipeptídeo CCR de planta adequados para mutagênese com o objetivo de eliminar, reduzir ou alterar a atividade de CCR foram descritos.

Esses mutantes podem ser isolados de acordo com procedimentos bem conhecidos.

Outra abordagem é aplicar a edição de genoma (também chamada de edição de gene), também chamada neste documento de ‘meio de edição de gene’, e refere-se a um grupo de tecnologias que permitem alterar o DNA de um organismo, tal como uma planta ou célula de planta.

Essas tecnologias permitem que o material genético seja adicionado, removido ou alterado em localizações particulares no genoma.

Várias abordagens para a edição de genoma foram desenvolvidas.

Avanços significativos foram feitos nos últimos anos para o desenvolvimento de métodos e composições para direcionar e clivar o DNA genômico por nucleases sítio-específicas (por exemplo, Nucleases dedo de zinco (ZFNs), Meganucleases, Nucleases efetoras semelhantes a ativadores de transcrição (TALENS) e Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas / nuclease associada a CRISPR (CRISPR / Cas) com um crRNA / tracr RNA manipulado), para induzir mutagênese direcionada, induzir deleções direcionadas de sequências de DNA celular, e facilitar a recombinação direcionada de um polinucleotídeo de DNA exógeno doador dentro de um lócus genômico predeterminado. Ver, por exemplo, Publicações de Patente U.S. Nos. 20030232410, 20050208489, 20050026157, 20050064474, e 20060188987 e WO 2007/014275, cujas descrições são no presente documento incorporadas por referência em sua totalidade para todos os efeitos. A Publicação de Patente U.S. No. 20080182332 descreve o uso de nucleases dedo de zinco (ZFNs) não canônicas para modificação direcionada de genomas de plantas e a Publicação de Patente U.S. No. 20090205083 descreve a modificação direcionada mediada por ZFN de um lócus genômico de EPSPs de plantas. Os métodos atuais para a inserção direcionada de DNA exógeno tipicamente envolvem a co-transformação de tecido de planta com um polinucleotídeo de DNA doador contendo pelo menos um transgene e uma nuclease sítio-específica (por exemplo, ZFN) que é projetada para ligar e clivar um lócus genômico específico de um sequência de codificação ativamente transcrita. Isso faz com que o polinucleotídeo de DNA doador se insira de forma estável no lócus genômico clivado, resultando na adição de um gene direcionado a um lócus genômico especificado compreendendo uma sequência de codificação ativamente transcrita.

[0070] O sistema de nuclease CRISPR (Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas) / Cas (CRISPR Associated) atua como segue. Resumidamente, um "domínio de ligação ao DNA CRISPR" é uma molécula de RNA de fita curta que, atuando em conjunto com a enzima CAS, pode reconhecer, ligar e clivar seletivamente o DNA genômico. O sistema CRISPR / Cas pode ser projetado para criar uma quebra de fita dupla (DSB) em um alvo desejado em um genoma, e o reparo da DSB pode ser influenciado pelo uso de inibidores de reparo para causar um aumento no reparo propenso a erros. Ver, por exemplo, Jinek e outros (2012) Science 337, pág. 816 a 821, Jinek e outros, (2013), eLife 2: e00471 e David Segal,

(2013) eLife 2: e00563). Em métodos de edição de genes sem DNA, são utilizadas partículas de ribonucleoproteína (RNP) para editar os genes de interesse. Tais RNPs compreendem, por exemplo, um gRNA e uma proteína Cas9, e podem ser entregues na célula de planta usando a transformação de protoplastos biolística (por exemplo, conforme descrito em WO 2017/070032A1 e WO 2016/155482A). os domínios de ligação dedo de zinco, CRISPR e TALE podem ser "manipulados" para se ligar a uma sequência de nucleotídeos predeterminada, por exemplo, por meio de engenharia (alterando um ou mais aminoácidos) da região de hélice de reconhecimento de um dedo de zinco de ocorrência natural. Da mesma forma, os TALEs podem ser "manipulados" para se ligarem a uma sequência de nucleotídeos predeterminada, por exemplo, por engenharia dos aminoácidos envolvidos na ligação ao DNA (o diresíduo variável de repetição ou região RVD). Portanto, as proteínas de ligação ao DNA manipuladas (dedos de zinco ou TALEs) são proteínas que não ocorrem naturalmente. Exemplos não limitantes de métodos para a engenharia de proteínas de ligação a DNA são design e seleção. Uma proteína de ligação ao DNA projetada é uma proteína que não ocorre na natureza, cujo projeto / composição resulta principalmente de critérios racionais. Os critérios racionais para design incluem a aplicação de regras de substituição e algoritmos computadorizados para processamento de informações em um banco de dados que armazena informações de designs de ZFP e / ou TALE existentes e dados de ligação. Ver, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 6.140.081, 6.453.242, e

6.534.261; ver também WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 e WO 03/016496 e Publicações U.S. Nos. 20110301073, 20110239315 e 20119145940.

[0071] Qualquer método conhecido na técnica para eliminar ou alterar um gene CCR de planta pode ser usado para gerar uma planta tendo uma proteína CCR de planta não funcional e / ou mutante. De acordo com a presente invenção, a expressão do gene CCR da planta endógena é eliminada (por exemplo, quando um alelo nocaute é desejado) se não houver transcritos ou proteínas detectáveis. A atividade de uma proteína CCR funcional é "eliminada" ou "ausente" de acordo com a invenção quando não é detectável por pelo menos um método de ensaio convencionalmente conhecido.

[0072] De acordo com a presente invenção, a expressão do gene CCR da planta endógena é reduzida (por exemplo, se um alelo mutante for desejado) se o transcrito ou nível de proteína CCR for estatisticamente inferior ao transcrito ou nível de proteína da mesma CCR em uma planta que não foi geneticamente modificado (transformado) ou mutagenizado ou editado para eliminar / reduzir a expressão dessa CCR. Em modalidades particulares da invenção, o transcrito ou nível de proteína da CCR endógena em uma planta modificada de acordo com a invenção é inferior a 90%, inferior a 80%, inferior a 70%, inferior a 60%, mais preferencialmente inferior a 50 %, inferior a 40%, inferior a 30%, inferior a 20%, inferior a 10% ou inferior a 5% do nível de proteína da mesma CCR em uma planta de controle, que é uma planta que não é mutante ou que não foi geneticamente modificada ou transformada para reduzir a expressão dessa CCR. O nível de expressão da CCR endógena pode ser medido diretamente, por exemplo, pelo ensaio do nível de CCR endógena expresso na célula ou planta, ou indiretamente, por exemplo, medindo-se a atividade da CCR endógena ou de ocorrência natural na célula ou planta. No entanto, este último não permitirá distinguir entre a atividade da proteína CCR endógena e a atividade relacionada com a introdução de uma proteína CCR mutante. Os métodos para avaliar a atividade de CCR são conhecidos na técnica e incluem a medição dos níveis de CCR, ou de seus produtos de reação enzimática feitos dentro de uma célula, que podem ser recuperados e testados a partir de extratos celulares.

[0073] Em outras modalidades, a atividade de uma proteína CCR endógena funcional pode ser reduzida ou eliminada rompendo-se (para um alelo nocaute) ou mutando-se o gene (ou genes) codificando a CCR. Em uma modalidade, a proteína CCR endógena é codificada por um ou mais, ou por dois ou mais genes de CCR endógena. Da mesma forma, em outra modalidade, em plantas particulares, a proteína CCR endógena é codificada por três ou mais genes de CCR endógena. Em outra modalidade, o rompimento ou nocaute compreende a inserção de um ou mais transposons, onde um ou mais transposons são inseridos no gene de CCR endógena. Em ainda outra modalidade, o rompimento ou mutação compreende uma ou mais mutações pontuais no gene de CCR endógena. O rompimento ou mutação pode ser um rompimento ou mutação homozigótica no gene de CCR. Em outra modalidade, o rompimento compreende uma alteração de quadro de leitura para introduzir um códon de terminação precoce no dito gene de CCR. Alternativamente, o rompimento ou mutação é um rompimento ou mutação heterozigótica ou hemizigótica no gene de CCR. Em certas modalidades, quando mais de um gene de CCR está envolvido, há mais de um rompimento ou nocaute, ou mais de uma mutação, que pode incluir mutações homozigóticas, heterozigóticas ou uma combinação de rompimentos ou mutações homozigóticas e heterozigóticas.

[0074] A detecção de produtos de expressão é realizada qualitativamente (detectando a presença ou ausência de um ou mais produtos de interesse) ou quantitativamente (monitorando o nível de expressão de um ou mais produtos de interesse). Em uma modalidade, o produto de expressão é um produto de expressão de RNA, uma proteína, ou um produto metabólico ou enzimático da atividade da proteína.

[0075] Assim, muitos métodos podem ser usados para reduzir, eliminar ou alterar a atividade de uma proteína CCR. Mais de um método pode ser usado para reduzir a atividade de um único gene de CCR de planta. Além disso, combinações de métodos podem ser usadas para reduzir, eliminar ou alterar a atividade de duas ou mais combinações diferentes de genes de CCR. Por exemplo, um método pode incluir engenharia genética, tal como meios de edição de genes ou transformação, enquanto outro método em combinação com o mesmo pode ser cruzamento sexual ou reprodução de diferentes linhagens de plantas. Em uma outra modalidade, os mesmos métodos podem ser usados para reduzir ou eliminar a atividade de outra proteína de biossíntese de lignina em uma planta. Além disso, a dita planta em que pelo menos um alelo é rompido de sua atividade de codificação de biossíntese de lignina pode ser suficiente para identificar novos alelos para características de lignina, isto é, reduzir as quantidades de lignina na dita planta sem penalização de produtividade.

[0076] Em uma modalidade específica, uma molécula de ácido nucleico é considerada, codificando uma proteína CCR de planta mutante, em que a dita molécula de ácido nucleico é mutada (por exemplo, mas não limitada a uma mutação em n x 3 nucleotídeos), para obter uma proteína CCR mutante com menor atividade enzimática ou atividade enzimática alterada. Mais especificamente, a dita molécula de ácido nucleico codifica uma proteína CCR mutante com uma atividade enzimática, conforme determinado em um ensaio bioquímico ou com uma leitura quantitativa (por exemplo de um produto feito pela atividade enzimática dentro de uma célula), que é inferior à atividade da proteína de ocorrência natural, mas superior ao nocaute ou CCR não funcional, de preferência superior a 50% da atividade da proteína de ocorrência natural. Em algumas modalidades, a dita proteína CCR mutante é considerada como tendo atividade enzimática de CCR que está em uma faixa de 50% a 10% da atividade da proteína CCR de ocorrência natural, em que a atividade da proteína CCR de ocorrência natural também é determinada em um ensaio de atividade bioquímica ou celular, e em que a proteína CCR de ocorrência natural é o membro da família de proteínas CCR não mutada correspondente da mesma espécie de planta, produzida da mesma forma ou no mesmo sistema de expressão que a proteína CCR mutante. Alternativamente, a atividade da proteína CCR mutante está em uma faixa de 90% a 5% da atividade da proteína CCR de ocorrência natural, ou na faixa de 80% a 10%, ou na faixa de 70% a 20%, ou na faixa de 60% a 30%, ou na faixa de 55% a 40% da atividade da proteína CCR de ocorrência natural. De preferência, a atividade da proteína CCR mutante está na faixa de 60% a 15%, 50% a 10%, 40% a 10%, 40% a 15% ou 30% a 20% em relação à atividade enzimática de CCR de ocorrência natural ou de controle.

[0077] Em uma modalidade da invenção, a molécula de ácido nucleico da invenção codifica uma proteína CCR mutante que é mutada em localizações correspondentes à posição 98, 99 e / ou 100 da SEQ ID NO: 1, ou uma sequência com 50% de identidade de aminoácidos com a SEQ ID NO: 1, em que a dita mutação leva ao efeito de obtenção de uma proteína CCR mutante que é capaz de manter o crescimento normal em plantas que, de outra forma, seriam deficientes em ccr, portanto, contendo uma característica de lignina. Com uma característica de lignina, ela é citada no presente documento como uma característica para reduzir quantidades de lignina, composição de lignina alterada, eficiência de sacarificação alterada ou fenótipos metabólicos relacionados. Em uma modalidade específica, a dita proteína CCR mutante corresponde à proteína CCR mutante de SEQ ID NO: 4 ou 5. Os aminoácidos nas posições 98, 99 e 100 de SEQ ID NO: 1 representam uma Isoleucina, uma Isoleucina e uma Alanina, respectivamente em álamo. As proteínas CCR mutantes representadas em SEQ ID NO: 4 ou 5 mostram que a isoleucina na posição 99 e a alanina conservada na posição 100 foram substituídas por apenas um aminoácido, uma treonina, na proteína de álamo CCR mutante.

Por meio dessas mutações na CCR de álamo, um novo fenótipo de planta foi obtido, o que demonstra que a posição e / ou o tipo de mutação está induzindo um efeito elegante, mas drástico sobre a atividade da proteína.

A importância deste alelo mutante e de sua proteína codificada tornou-se ainda mais clara quando plantas híbridas de álamo com um único alelo ko foram geradas sem a característica de lignina, indicando que simplesmente reduzir o nível de proteína CCR para menos de 51% não é suficiente para superar o nanismo em álamo híbrido.

Além disso, outra linhagem híbrida com um alelo ko e o segundo alelo sofreu mutação de modo que o motivo IIA das posições 98-100 foi substituído por um motivo IA também reteve seu crescimento normal, mas parece não ter a característica de lignina, pelo menos em árvores jovens.

Isso pode indicar que já 1 deleção da posição 99 ou 100 é suficiente para obter o fenótipo descrito para ccr2 12. Assim, em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico que é descrita tem 1 deleção do resíduo correspondente ao aminoácido 98, 99, ou 100 na SEQ ID NO: 1, ou uma sequência com 50% de identidade de aminoácidos com a mesma.

Outra modalidade refere-se ao mutante em que o resíduo na posição 100, sendo alanina em SEQ ID NO: 1, é deletado.

Uma outra modalidade refere-se ao ácido nucleico em que a proteína codificada é mutada no sentido de que pelo menos um de 98, 99 e / ou 100 é deletado e pelo menos um de 98, 99 e / ou 100 é substituído.

Mais especificamente, em que a substituição se refere a um resíduo polar, mais especificamente em que a substituição se refere ao resíduo 99 ou 100 e resulta em um resíduo de aminoácido polar.

Ao modelar as mutações nesses sítios na estrutura da proteína CCR, ficou claro que essas mutações não influenciam diretamente o NADP ou a ligação ao substrato, e são provavelmente parte da hélice α4 de acordo com a estrutura de Pan e outros (2014). De fato, as mutações em si não descrevem o mecanismo de ação para chegar ao novo fenótipo, o que pode indicar que mutações alternativas nesta região conservada podem ou não resultar em um fenótipo similar, dependendo da estrutura resultante e / ou atividade da proteína CCR mutante após a introdução das ditas mutações alternativas.

[0078] A deleção de Isoleucina ou Alanina, que é relativamente conservada entre os homólogos de CCR de planta (por exemplo, como mostrado na Figura 6), bem como a substituição da Isoleucina ou do pequeno resíduo de Alanina altamente conservado, em uma modalidade particular por um resíduo de aminoácido polar (Treonina em SEQ ID NO: 4 e 5), representam mutações de resíduo conservado, das quais se pode imaginar não apenas impactar na atividade da proteína em proteínas CCR2 de álamo e em plantas de álamo, mas também em proteínas CCR homólogas e ortólogas, bem como em outras espécies de plantas (por exemplo, mas não se limitando às proteínas CCR de plantas mostradas na Figura 6). De fato, enquanto a isoleucina correspondente à posição 98 é isoleucina, leucina ou valina, indicando resíduos estruturalmente muito similares, a posição 99 é ligeiramente mais variável entre homólogos de CCR e também identificada como aminoácido D, R, N, S, M ou V. No entanto, ao comparar uma proteína mutante com a sequência da proteína CCR nativa da espécie de interesse para expressar a proteína CCR mutante, será possível obter uma indicação sobre se a mutação pode ter um efeito similar ao no presente documento apresentado. Finalmente, a alanina na posição 100 da SEQ ID NO: 1 parece ser extremamente conservada no motivo de IIAAA nesta região de CCR, indicando que este pode ser o aminoácido mais crucial, embora pequeno, neste motivo. O fato de sua alanina não estar presente na proteína CCR mutante codificada ccr2 12 (ver Figura 4A), sugere a identificação da causa raiz do fenótipo observado e característica de lignina relacionada. Este exercício de localização traz a vantagem de que as plantas com nocaute ccr endógeno ou outras deficiências que levam a características de lignina resultando em nanismo, podem provavelmente manter o crescimento normal da planta após a introdução de tal proteína CCR mutante da invenção. A dita deleção de alanina na posição 100 da SEQ ID NO: 1, ou uma substituição de 99 ou 100 por outro resíduo de aminoácido, que é mais particularmente um resíduo polar, ou seja, um resíduo de treonina, serina, cisteína, tirosina, asparagina ou glutamina, que são definidos no presente documento como aminoácidos com cadeias laterais polares, resultará em uma planta da invenção como no presente documento apresentada.

[0079] Em uma modalidade específica, a mutação do aminoácido de CCR correspondente à posição 98 ou 99 na SEQ ID NO: 1 é suficiente para obter uma proteína CCR mutante da invenção, ou seja, com a capacidade de restaurar o crescimento normal em uma planta deficiente em ccr. A dita mutação de 98 ou 99 pode incluir uma substituição ou uma deleção ou uma inserção de um aminoácido. Em uma modalidade alternativa, a mutação do aminoácido de CCR correspondente à posição 99 e / ou 100 na SEQ ID NO: 1 é suficiente para obter uma proteína CCR mutante da invenção, ou seja, com a capacidade de restaurar o crescimento normal em uma planta deficiente em ccr. Em outra modalidade, ambas as mutações do aminoácido de CCR correspondentes à posição 99 e 100 na SEQ ID NO: 1 são necessárias para a obtenção do efeito mais pronunciado, tal como a retenção do crescimento normal da planta em uma planta deficiente em ccr. Em outra modalidade específica, a mutação do aminoácido de CCR correspondente à posição 100 apenas na SEQ ID NO: 1 é suficiente para obter uma proteína CCR mutante da invenção, isto é, com a capacidade de restaurar o crescimento normal em uma planta deficiente em ccr. Em uma outra modalidade, a posição 100 é deletada na proteína

CCR que compreende a sequência representada na SEQ ID NO: 1 ou uma sequência com 50% de identidade de aminoácidos com a mesma. Em outra modalidade específica, a posição 100 é deletada e a posição 99 é deletada. Em outra modalidade, as posições 100, 99 e 98 são deletadas. Em outra modalidade, as posições 100 e 98 são deletadas. Em outra modalidade, a posição 100 é deletada e a posição 98 ou 99 é substituída por um resíduo de aminoácido diferente. Em outra modalidade específica, a posição 100 é substituída por outro aminoácido diferente de alanina e, opcionalmente, a posição 99 é substituída por um aminoácido diferente em comparação com a proteína CCR de ocorrência natural. Finalmente, a posição 100 pode ser substituída e a posição 98 ou 99 pode ser deletada.

[0080] Outro aspecto da invenção refere-se à proteína CCR de planta mutante codificada pela molécula de ácido nucleico da invenção ou expressa a partir do vetor da invenção. A dita proteína CCR mutante é no presente documento definida como uma CCR mutante em comparação com a proteína CCR de ocorrência natural da mesma espécie de origem. A mutação como no presente documento definida diz respeito às posições de aminoácidos correspondentes às posições 98, 99 e / ou 100 após o alinhamento da SEQ ID NO: 1 com o domínio conservado da proteína CCR mutante de interesse. Alternativamente, a mutação conforme no presente documento definida, diz respeito às posições de aminoácidos correspondentes ao aminoácido 113, 114 e / ou 115 da SEQ ID NO: 2 ou 3, ou seja, a mutação diz respeito a uma alteração (inserção, deleção ou substituição) dos aminoácidos que se alinham com a(s) Isoleucina(s) e / ou Alanina(s) nessas posições nas sequências de aminoácidos de CCR2 de P. alba ou P. tremula. Em uma modalidade alternativa, a proteína CCR de planta mutante da invenção é mutada em um domínio conservado correspondente à SEQ ID NO: 1 ou um domínio conservado com pelo menos 50% de identidade de aminoácidos com a SEQ ID NO: 1; em que a proteína CCR de planta mutante exibe uma atividade enzimática dentro de uma faixa que é inferior à atividade de CCR de ocorrência natural, ou inferior à atividade de CCR de planta monoalélica de ocorrência natural, mas maior do que a proteína CCR nocaute ou não funcional, isto é uma faixa de pelo menos 80 a 10% de atividade de CCR de ocorrência natural, pelo menos 70 a 15% da atividade de CCR de ocorrência natural, pelo menos 60 a 20% da atividade de CCR de ocorrência natural, pelo menos 50 a 30% da atividade de CCR de ocorrência natural, ou pelo menos 50 a 10% da atividade de CCR de ocorrência natural.

[0081] Em outro aspecto da invenção, um método para produzir e / ou identificar uma proteína CCR de planta mutante capaz de restaurar o crescimento em uma planta com baixas quantidades de lignina é considerado, compreendendo as etapas de: produzir proteínas CCR de planta mutantes; determinar a atividade enzimática de CCR das ditas proteínas CCR mutantes usando um ensaio bioquímico em comparação com mutante derivado de ccr212 e atividade da proteína CCR de ocorrência natural no dito ensaio; identificar uma proteína CCR de planta mutante em que a atividade está na faixa correspondente à atividade da proteína CCR mutante derivada de ccr2 12 e menor do que a atividade da proteína CCR de ocorrência natural. Em uma modalidade específica, a dita proteína CCR mutante capaz de restaurar o crescimento da planta em uma planta com uma característica de lignina compreende uma atividade enzimática na faixa de 90% a 5% da atividade da proteína CCR de ocorrência natural, ou na faixa de 80% a 10%, ou na faixa de 70% a 20%, ou na faixa de 60% a 30%, ou na faixa de 55% a 40% da atividade da proteína CCR de ocorrência natural. De preferência, a atividade da proteína CCR mutante está na faixa de 60% a 15%, 50% a 10%, 40% a 10%, 40% a 15% ou 30% a 20% em relação à atividade enzimática de CCR de ocorrência natural ou de controle.

[0082] De fato, a atividade enzimática é basicamente determinada e dependente da estrutura da proteína. A posição e a natureza de uma mutação na proteína, portanto, decidirão se um impacto relativamente pequeno ou nenhum impacto na atividade enzimática é observado para um mutante em comparação com uma ocorrência natural, ou se uma pequena alteração de até mesmo um aminoácido pode induzir deslocamentos drásticos em atividade. Por exemplo, Pan e outros (2014) e Prasad e outros (2011) descreveram várias mutações de CCR, que demonstram, por meio do estudo da estrutura das proteínas CCR, que tais diferenças em afetar a estrutura e / ou a atividade das proteínas CCR são esperadas.

[0083] Alternativamente, um método para produzir e / ou identificar uma proteína com atividade de CCR capaz de restaurar o crescimento em uma planta com baixas quantidades de lignina é considerado, compreendendo as etapas de: produzir a dita proteína de planta; determinar a atividade enzimática de CCR da dita proteína usando um ensaio bioquímico, e comparar a atividade da proteína CCR mutante derivada de ccr212 e de ocorrência natural no dito ensaio; identificar a dita atividade de proteína da dita proteína que está na faixa correspondente à atividade da proteína CCR mutante derivada de ccr2 12 e menor do que a atividade da proteína CCR de ocorrência natural. Em uma modalidade específica, a dita proteína CCR identificada com atividade capaz de restaurar o crescimento da planta em uma planta com uma característica de lignina compreende uma atividade enzimática na faixa de 90% a 5% da atividade da proteína CCR de ocorrência natural, ou na faixa de 80% a 10%, ou na faixa de 70% a 20%, ou na faixa de 60% a 30%, ou na faixa de 55% a 40% da atividade da proteína CCR de ocorrência natural. De preferência, a atividade da proteína CCR mutante está na faixa de 60% a 15%, 50% a 10%, 40% a 10%, 40% a 15% ou 30% a 20% em relação à atividade enzimática de

CCR de ocorrência natural ou de controle.

[0084] Em uma modalidade particular, a dita proteína CCR é uma proteína de ocorrência natural com atividade alterada, e é utilizável para complementação de plantas com características de lignina para recuperar o nanismo induzido por modificação de lignina.

[0085] Em outra modalidade, um método para produzir uma planta com uma característica de lignina (isto é, quantidade e / ou composição de lignina alterada e / ou eficiência de sacarificação), e desenvolver-se como uma planta normal saudável é considerado, compreendendo a etapa de introduzir uma atividade de biossíntese de lignina reduzida na dita planta. Especificamente, a dita atividade reduzida é definida como a atividade enzimática inferior à atividade de CCR de ocorrência natural em uma planta normal, e dentro da faixa de pelo menos 10% a no máximo 80% da atividade de ocorrência natural. Em outra modalidade, a dita atividade reduzida está na faixa de pelo menos 20% a 70% da atividade da ocorrência natural, ou na faixa de pelo menos 30% a 60% da atividade da ocorrência natural, ou 40% a 50% da atividade da ocorrência natural atividade. Em uma modalidade particular, a dita atividade reduzida é obtida para a planta através da redução da expressão do gene da biossíntese de lignina na dita planta, ou através da inserção de uma mutação e / ou rompimento em pelo menos 1 alelo do dito gene de biossíntese de lignina da dita planta. Neste último caso, a atividade reduzida e o fenótipo são obtidos devido à haplo- insuficiência do dito alelo. De fato, em uma modalidade, o dito alelo pode ser usado para complementar um nocaute do dito gene de biossíntese de lignina na mesma espécie ou em outra espécie. Em uma modalidade específica, o dito gene de biossíntese de lignina é CCR, e a dita atividade reduzida está na faixa da atividade da proteína CCR mutante derivada de ccr2 12.

[0086] Outro aspecto refere-se a um método de triagem para identificar proteínas CCR de planta mutantes capazes de restaurar o crescimento em uma planta anã, até o crescimento normal em comparação com a de ocorrência natural, compreendendo as etapas de: introduzir uma mutação em uma planta que tem pelo menos um alelo nocaute em um gene de biossíntese de lignina, de preferência em um alelo ccr, de modo a induzir pelo menos uma mutação em um segundo alelo ccr da dita planta, e triar as plantas com fenótipo de crescimento normal, ou seja, crescimento comparável como o de plantas de ocorrência natural ou plantas de controle, e identificar a natureza da mutação no dito segundo alelo ccr mutante da planta. Os ditos métodos de identificação são conhecidos por um versado na técnica e, por exemplo, mas não limitados a, incluem PCR no DNA genômico da planta, sequenciamento do DNA da planta, ou outros meios. Em uma modalidade particular, a dita indução de uma mutação no (segundo) alelo ccr da dita planta é realizada usando tecnologia de edição de genes. Em certas modalidades, o dito alelo nocaute pode se referir a qualquer gene de biossíntese de lignina.

[0087] Alternativamente, um método de triagem para identificar proteínas CCR mutantes ou para produzir plantas compreendendo proteínas CCR mutantes da invenção é considerado, compreendendo as etapas de: introduzir um construto de CCR mutante (usando um vetor ou outros meios descritos neste documento) em uma planta com desenvolvimento ou crescimento anormal (devido ao nanismo induzido pela característica de lignina), por exemplo, uma planta sem atividade de CCR funcional (ou seja, uma planta com genes CCR rompidos); e incubar o tecido ou plantas e isolar uma planta ou broto regenerado a partir da dita planta ou células de plantas incubadas, para finalmente triar as plantas com crescimento normal (mas com uma característica de lignina em comparação com os controles); e opcionalmente identificar a sequência de CCR e / ou a atividade enzimática da dita proteína CCR mutante.

[0088] Evidências adicionais que suportam o potencial do alelo mutante ccr2 12 identificado, isto é, a nova proteína mutante codificada por este alelo, referem-se ao nível da atividade enzimática de CCR da dita proteína CCR2 mutante (conforme representado nas SEQ ID NOs: 4 e 5). Quando a atividade de CCR é inferior à de ocorrência natural, efeitos vantajosos na sacarificação para plantas que compreendem a dita atividade são fornecidos, enquanto a atividade também deve ser alta o suficiente para evitar uma penalização de produtividade quando expressa em plantas deficientes em ccr. A atividade de CCR pode ser determinada, por exemplo, mas não limitada a sua medição usando a proteína CCR recombinante em um ensaio bioquímico in vitro. Os ensaios de atividade enzimática, por exemplo, utilizam o substrato feruloil-CoA, em que as conversões enzimáticas são seguidas por análise UHPLC-MS direcionada do substrato (feruloil-CoA), e do produto (coniferaldeído) (ver também Goffner e outros (1994); Kawasaki e outros (2006)). Da mesma forma, Chao e outros (2017) descreveram um ensaio bioquímico usado para medição da atividade de CCR para o qual vários substratos foram testados na presença de NADPH. Feruloil- CoA, p-coumaroil-CoA, cafeoil-CoA e sinapoil-CoA. O ensaio envolve uma reação de redução de substratos de ésteres de hidroxicinamoil- Coenzima A na presença de NADPH, que é consistente com a reação de CCR na via de biossíntese. A determinação dos parâmetros cinéticos é realizada de forma espectrofotométrica a 366 nm (Lüderitz e Griseback, 1981) para calcular a atividade de CCR usando coeficientes de absorção molar fornecidos por Stöekigt e Zen (1975). Esses tipos de ensaios permitem a determinação da atividade da proteína CCR mutante codificada pelo alelo ccr2 12 de forma a mostrar um perfil reduzido em comparação com a proteína CCR2 codificada pelo alelo CCR2 de ocorrência natural.

[0089] A partir destes dados de atividade CCR relativos às ditas proteínas CCR mutantes, o versado na técnica é capaz de decidir facilmente se uma proteína CCR está dentro da faixa de atividade, ou escopo da invenção, isto é, dentro da faixa de atividade da proteína CCR mutante que fornece a vantagem de menores quantidades de lignina e maior sacarificação quando expressa em uma planta com deficiência de ccr, sem afetar negativamente o crescimento da planta ou biomassa.

[0090] Portanto, em uma modalidade específica, uma molécula de ácido nucleico é considerada codificando uma proteína CCR de planta mutante, que tem uma mutação no domínio conservado de CCR representado em SEQ ID NO: 1 ou em um domínio conservado de CCR ortólogo de planta com pelo menos 50% de identidade de aminoácidos com a SEQ ID NO: 1, caracterizada ainda pelo fato de que a dita proteína CCR mutante tem uma atividade enzimática na faixa da proteína CCR mutante codificada por ccr2 12 e níveis de atividade de CCR de ocorrência natural mais baixos, de preferência dentro de uma faixa de 0 a 50% da atividade de ocorrência natural, conforme medido em um ensaio bioquímico ou um ensaio celular.

[0091] Outro aspecto da invenção refere-se a um vetor de expressão que compreende o ácido nucleico da invenção, para expressão em uma célula de planta. A molécula de ácido nucleico da invenção como tal, ou na forma de um gene quimérico, a ser expressa está preferencialmente presente em um cassete de expressão e clonada em um vetor, que é adequada para transformar Agrobacterium tumefaciens, por exemplo pBin19 (Bevan e outros (1984) Nucl. Acids Res. 12-8711). O termo "cassete de expressão" refere-se a qualquer sistema de expressão recombinante com o propósito de expressar uma sequência de ácido nucleico da invenção in vitro ou in vivo, de forma constitutiva ou induzível, em qualquer célula, incluindo, além de células de planta, procarióticas, de levedura, células de fungos, insetos ou mamíferos.

O termo inclui sistemas de expressão lineares e circulares.

O termo inclui todos os vetores.

Os cassetes podem permanecer epissomais ou integrar-se ao genoma da célula hospedeira.

Os cassetes de expressão podem ter a capacidade de se autorreplicar ou não (ou seja, conduzir apenas a expressão transiente em uma célula). O termo inclui cassetes de expressão recombinante que contêm apenas os elementos mínimos necessários para a transcrição do ácido nucleico recombinante.

De preferência, os vetores que compreendem o ácido nucleico da invenção ou o gene (ou genes) quiméricos da invenção compreendem um marcador selecionável ou gene repórter.

Um "marcador selecionável", "gene marcador selecionável" ou "gene repórter" inclui qualquer gene que confere um fenótipo a uma célula na qual é expresso para facilitar a identificação e / ou seleção de células que são transfectadas ou transformadas com um construto de gene quimérico ou vetor compreendendo um construto de gene quimérico da invenção.

Esses genes marcadores permitem a identificação de uma transferência bem-sucedida das moléculas de ácido nucleico por meio de uma série de princípios diferentes.

Os marcadores adequados podem ser selecionados a partir de marcadores que conferem resistência a antibióticos ou herbicidas, que introduzem uma nova característica metabólica ou que permitem a seleção visual.

Exemplos de genes marcadores selecionáveis incluem genes que conferem resistência a antibióticos (tais como nptll que fosforila neomicina e canamicina, ou hpt, que fosforila higromicina, ou genes que conferem resistência a, por exemplo, bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina ou blasticidina), a herbicidas (por exemplo, bar que fornece resistência a Basta™; aroA ou gox que fornece resistência contra glifosato, ou os genes que conferem resistência a, por exemplo,

imidazolinona, fosfinotricina ou sulfonilureia), ou genes que fornecem uma característica metabólica (tal como manA, que permite às plantas usar manose como única fonte de carbono ou xilose isomerase para a utilização de xilose, ou marcadores antinutritivos, tal como a resistência a 2-desoxiglicose). A expressão de genes marcadores visuais resulta na formação de cor (por exemplo β-glucuronidase, GUS ou β- galactosidase com seus substratos coloridos, por exemplo, X-Gal), luminescência (tal como o sistema luciferina / luciferase) ou fluorescência (Proteína Fluorescente Verde, GFP, e seus derivados). Esta lista representa apenas um pequeno número de marcadores possíveis.

O versado na técnica está familiarizado com esses marcadores.

Diferentes marcadores são preferenciais, dependendo da planta e do método de seleção.

Sabe-se que após a integração estável ou transiente de ácidos nucleicos em células de planta, apenas uma minoria das células absorve o DNA estranho e, se desejado, integra-o em seu genoma, dependendo do vetor de expressão usado e da técnica de transfecção usada.

Para identificar e selecionar esses integrantes, um gene codificando um marcador selecionável (tal como os descritos acima) é geralmente introduzido nas células hospedeiras junto com o gene de interesse.

Esses marcadores podem, por exemplo, ser usados em mutantes nos quais esses genes não são funcionais, por exemplo, por deleção por métodos convencionais.

Além disso, as moléculas de ácido nucleico codificando um marcador selecionável podem ser introduzidas em uma célula hospedeira no mesmo vetor que compreende a sequência codificando os polipeptídeos da invenção ou usados nos métodos da invenção, ou então em um vetor separado.

As células que foram transfectadas de forma estável com o ácido nucleico introduzido podem ser identificadas, por exemplo, por seleção (por exemplo, as células que integraram o marcador selecionável sobrevivem enquanto as outras células morrem). Uma vez que os genes marcadores, particularmente genes para resistência a antibióticos e herbicidas, não são mais necessários ou são indesejados na célula hospedeira transgênica e uma vez que os ácidos nucleicos tenham sido introduzidos com sucesso, o processo de acordo com a invenção para a introdução de ácidos nucleicos utiliza vantajosamente técnicas que permitir a remoção ou excisão desses genes marcadores.

Um desses métodos é conhecido como co-transformação.

O método de co- transformação usa dois vetores simultaneamente para a transformação, um vetor contendo o ácido nucleico de acordo com a invenção e um segundo contendo o(s) gene(s) marcador(es). Uma grande proporção de transformantes recebe ou, no caso de plantas, compreende (até 40% ou mais dos transformantes), ambos os vetores.

No caso de transformação com Agrobactérias, os transformantes geralmente recebem apenas uma parte do vetor, isto é, a sequência flanqueada pelo T-DNA, que geralmente representa o cassete de expressão.

Os genes marcadores podem ser subsequentemente removidos da planta transformada por meio de cruzamentos.

Em outro método, os genes marcadores integrados em um transposon são usados para a transformação juntamente com o ácido nucleico desejado (conhecido como tecnologia Ac / Ds). Os transformantes podem ser cruzados com uma fonte de transposase ou os transformantes são transformados com um construto de ácido nucleico que confere expressão de uma transposase, de forma transiente ou estável.

Em alguns casos (aproximadamente 10%), o transposon salta para fora do genoma da célula hospedeira, uma vez que a transformação ocorreu com sucesso, e é perdido.

Em um número adicional de casos, o transposon salta para uma localização diferente.

Nestes casos, o gene marcador deve ser eliminado por meio de cruzamentos.

Em microbiologia, foram desenvolvidas técnicas que possibilitam, ou facilitam, a detecção de tais eventos.

Um outro método vantajoso se baseia no que é conhecido como sistemas de recombinação; cuja vantagem é que a eliminação por cruzamento pode ser dispensada. O sistema deste tipo mais conhecido é o sistema Cre / lox. Cre1 é uma recombinase que remove as sequências localizadas entre as sequências loxP. Se o gene marcador estiver integrado entre as sequências loxP, ele será removido assim que a transformação ocorrer com sucesso, pela expressão da recombinase. Outros sistemas de recombinação são o sistema HIN / HIX, FLP / FRT e REP / STB (Tribble e outros, J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255 a 22267; Velmurugan e outros, J. Cell Biol., 149, 2000: 553 a 566). É possível uma integração sítio-específica no genoma da planta das sequências de ácido nucleico de acordo com a invenção.

[0092] Outro aspecto da invenção refere-se a uma planta sem proteína CCR de ocorrência natural funcional, compreendendo ainda a molécula de ácido nucleico ou vetor da invenção para codificar a proteína CCR de planta mutante da invenção, ou compreendendo a proteína CCR mutante da invenção, caracterizada adicionalmente pelo fato de que o tamanho e crescimento da planta são pelo menos comparáveis ao crescimento normal de ocorrência natural. Com ‘ausência de proteína CCR de ocorrência natural funcional’, como descrito neste documento, entende-se que a dita planta não tem nenhuma ou tem muito pouca, abaixo de 5%, atividade da proteína CCR endógena envolvida na síntese de lignina, em comparação com a atividade da proteína CCR de ocorrência natural. Tal planta sem atividade de proteína CCR de ocorrência natural funcional pode ser obtida via nocaute de CCR, ou via uma mutação de ocorrência natural, ou via RNAi eficaz de CCR na dita planta, ou via outro método de mutagênese (como mutantes de inserção). Em uma modalidade preferencial, a dita planta é estável na falta desta atividade da proteína CCR endógena. A planta como no presente documento descrito, sem a dita proteína CCR de ocorrência natural funcional e compreendendo ainda a molécula de ácido nucleico ou vetor codificando a proteína CCR de planta mutante da invenção, resultará em um fenótipo típico para plantas deficientes em ccr (coloração de xilema vermelho, menores quantidades de lignina, maior eficiência de sacarificação) e, surpreendentemente, mantém o crescimento normal da planta. A inferioridade na produtividade que é tipicamente observada em plantas nocaute ccr completo ou plantas com outras características de lignina, é de fato complementada nesta planta da invenção pela introdução da dita proteína CCR de planta mutante, que é capaz de restaurar defeitos de crescimento a um nível que as plantas podem crescer normalmente, embora não produzam quantidades normais de lignina. Na verdade, essa proteína CCR de planta mutante expressa na dita planta contribuirá para um nível de atividade de CCR que é diferente da atividade da proteína CCR de ocorrência natural e é diferente de um nocaute de ccr total, mas equilibrado (provavelmente com uma atividade alterada e / ou reduzida até 50%) para permitir o fenótipo vantajoso e os efeitos presentes na dita planta.

[0093] Em outra modalidade, a dita planta no presente documento descrita tem pelo menos um alelo ccr nocaute, e compreende ainda a molécula de ácido nucleico ou vetor da invenção codificando a proteína CCR de planta mutante, ou compreendendo a proteína CCR de planta mutante da invenção, com o crescimento da planta sendo comparável ao controle ou crescimento de ocorrência natural. Considera-se no presente documento que tal planta com pelo menos um alelo ccr nocaute, pode ainda ter outro alelo ccr que não codifica uma proteína CCR de ocorrência natural, mas codifica por si mesma a proteína CCR mutante. Também considera-se no presente documento que tal planta com pelo menos um alelo ccr nocaute, não seja mais capaz de atividade da proteína CCR de ocorrência natural, ou seja, todos os alelos ccr podem ser nocauteados ou alelos ccr adicionais podem afetar o nível de atividade de CCR em comparação com a atividade de CCR de ocorrência natural. A dita planta com pelo menos um ccr nocaute, mas em vez com todos os seus alelos ccr nocauteados, exigirá a introdução (por exemplo, via transformação de planta) de uma molécula de ácido nucleico ou vetor da invenção, codificando uma proteína CCR de planta mutante, capaz de restaurar o crescimento da planta a um nível normal, mantendo a característica de lignina típica da deficiência de ccr. Além disso, a dita planta com pelo menos um alelo nocaute de ccr também pode conter outros alelos mutantes de ccr, resultando em uma proteína CCR mutante expressa a partir dos ditos alelos mutantes de CCR na dita planta com atividade de CCR reduzida ou alterada em comparação com a proteína CCR de ocorrência natural.

[0094] Plantas modificadas com lignina, ou seja, plantas com diferentes quantidades ou composições de lignina, que mostram a maior melhora na eficiência de sacarificação, tipicamente sofrem de fenótipos indesejados, incluindo penalizações de produtividade de sementes e biomassa, chamado nanismo induzido por modificação de lignina (Chen e Dixon, 2007; Shadle e outros, 2007; Bonawitz e Chapple, 2013; Van Acker e outros, 2013, 2014; Vanholme e outros, 2013b). O dito fenótipo anão de plantas modificadas com lignina pode ser causado pela perda de integridade da parede celular do vaso, o que, por sua vez, resulta na incapacidade da planta de transportar nutrientes e água de forma eficiente das raízes para as partes aéreas. Como uma consequência, ocorre um colapso das células dos vasos enfraquecidos sob a pressão negativa gerada pela transpiração, chamada de fenótipo irregular do xilema (irx) (Bonawitz e Chapple, 2013). Esses vasos irregulares foram relatados para diferentes espécies de plantas (Arabidopsis [Arabidopsis thaliana], álamo [Populus tremula x Populus alba] e tabaco [Nicotiana tabacum]) perturbadas na expressão dos genes da biossíntese de lignina fenilalanina amônia-liase (PAL), cinamato 4-hidroxilase (C4H), 4-

coumarato: coenzima A ligase (4CL), hidroxicinamoil-coenzima A shikimate / quinato hidroxicinamoil transferase (HCT), p-coumarato 3- hidroxilase (C3H), cafeoil shikimate esterase (CSE), cafeoil-coenzima A O-metiltransferase (CCoAOMT) e CinamoilCoenzima A redutase (CCR). Além disso, uma série de mutantes de biossíntese de celulose e hemicelulose anãos também exibem o fenótipo irx, descrevendo outro tipo de características que podem ser restauradas pela introdução de uma proteína CCR mutante dentro da dita planta perturbada.

Portanto, essas deficiências de genes, dentre outras (por exemplo, também cinamil álcool desidrogenase (CAD)), são exemplos não limitantes de características alternativas com o potencial de levar a plantas anãs que são consideradas na invenção.

Finalmente, em B. napus, os genes foram identificados como envolvidos na biossíntese de lignina que também contribuem para o acamamento (resistência) (por exemplo, glicosil hidrolase, CYT1, um fator de transcrição ERF SHINE1, e um fator de transcrição LIM DAR6), o que sugere ainda que um planta com características de lignina resultando em nanismo, pode se beneficiar para adquirir melhor resistência ao acamamento em certas espécies de plantas através da introdução de um mutante ou alelo fraco da dita característica de lignina defeituosa, ou alternativamente, pela proteína CCR mutante da invenção.

Finalmente, as características de acamamento são frequentemente utilizadas para reduzir a altura das plantas, mas isso obviamente pode ser acompanhado por características prejudiciais, tal como perda de produtividade e susceptibilidade a doenças (Wei e outros, 2017). Outra modalidade refere-se a uma planta com quantidades reduzidas de lignina ou composição de lignina alterada em comparação com uma planta de controle ou de ocorrência natural, compreendendo ainda a molécula de ácido nucleico ou vetor da invenção, ou proteína CCR mutante da invenção, de modo que a dita planta seja caracterizada pelo fato de que o crescimento da planta é comparável a uma planta de controle ou de ocorrência natural. Outra modalidade refere-se a uma planta com eficiência de sacarificação aumentada e / ou quantidades ou composição de lignina reduzida ou alterada em comparação com uma planta de controle ou de ocorrência natural, compreendendo ainda a molécula de ácido nucleico ou vetor da invenção, ou proteína CCR mutante da invenção, de modo que a dita planta é caracterizada pelo fato de que o crescimento da planta é comparável a uma planta de controle ou de ocorrência natural. De fato, as ditas plantas são consideradas uma planta sem atividade da proteína CCR endógena, induzindo nanismo, que é subsequentemente complementado (em seu fenótipo de crescimento) pela introdução da proteína CCR mutante da invenção, para chegar à dita planta com crescimento e tamanho comparáveis como uma planta de controle ou planta de ocorrência natural, mas ainda mantendo a característica de lignina. Outra modalidade considera as ditas plantas que têm outros defeitos de biossíntese de lignina diferentes das deficiências de ccr, induzindo nanismo, em que a dita planta é então caracterizada adicionalmente pelo fato de que compreende a proteína CCR de planta mutante da invenção, opcionalmente codificada pelo ácido nucleico introduzido ou vetor da invenção, para restaurar o defeito de crescimento da dita planta anã aos níveis normais, enquanto o fenótipo ou característica de lignina é mantido na dita planta.

[0095] O termo "crescimento da planta" refere-se à taxa de crescimento e tamanho correspondentes de uma planta em certas condições / tratamentos, por exemplo, com uma característica de lignina alterada ou deficiência de ccr, em comparação com a planta de ocorrência natural correspondente. Uma taxa de crescimento aumentada pode ser refletida ou confere uma produção aumentada de biomassa da planta inteira, ou uma produção aumentada de biomassa das partes aéreas de uma planta, ou por uma produção aumentada de biomassa das partes subterrâneas de uma planta, ou por uma produção aumentada de biomassa de partes de uma planta, como caules, folhas, flores, frutos e / ou sementes.

Um crescimento prolongado compreende a sobrevivência e / ou o crescimento contínuo da planta, no momento em que o organismo de ocorrência natural não transformado apresenta sintomas visuais de deficiência e / ou morte.

Tais características relacionadas à produtividade de uma planta compreendem, sem limitação, o aumento da capacidade de produtividade intrínseca de uma planta, eficiência de uso de nutrientes melhorada e / ou tolerância aumentada ao estresse, em particular tolerância aumentada ao estresse abiótico.

A capacidade de produtividade intrínseca de uma planta pode ser, por exemplo, manifestada melhorando a produtividade específica (intrínseca) da semente (por exemplo, em termos de aumento do tamanho da semente / grão, aumento do número de espigas, aumento do número de sementes por espiga, melhora do enchimento de sementes, melhora da composição das sementes, melhoras no embrião e / ou endosperma, ou similares); modificação e melhora dos mecanismos inerentes de crescimento e desenvolvimento de uma planta (tal como altura da planta, taxa de crescimento da planta, número da vagens, posição da vagem na planta, número de entrenós, incidência de quebra da vagem, eficiência de nodulação e fixação de nitrogênio, eficiência de assimilação de carbono, melhora do vigor da muda / vigor precoce, melhora da eficiência da germinação (sob condições estressadas ou não estressadas), melhora na arquitetura da planta, modificações do ciclo celular, modificações da fotossíntese, várias modificações da via de sinalização, modificação da regulação transcricional, modificação da regulação translacional, modificação das atividades enzimáticas e similares); e / ou similares.

O termo "produtividade da planta", conforme usado no presente documento,

geralmente refere-se a um produto mensurável de uma planta, particularmente uma colheita.

A produtividade e o aumento da produtividade (em comparação com uma planta inicial não transformada ou planta mutante ou planta de ocorrência natural) podem ser medidos de várias maneiras, e entende-se que um versado na técnica será capaz de aplicar o significado correto em vista das modalidades particulares, a cultura particular em questão e a finalidade ou aplicação específica em questão.

De acordo com a invenção, alterações em diferentes características fenotípicas, tal como a lignina, podem reduzir, igualar ou melhorar a produtividade em comparação com a ocorrência natural.

De preferência, a produtividade é igual ou melhorada.

Por exemplo, e sem limitação, parâmetros tal como desenvolvimento de órgão floral, iniciação de raiz, biomassa da raiz, número de sementes, peso das sementes, índice de colheita, formação de folha, fototropismo, dominância apical e desenvolvimento de fruto, são medidas adequadas de produtividade alterada. "Produtividade da colheita" é definida no presente documento como o número de alqueires de produto agrícola relevante (tal como grãos, forragens ou sementes) colhidos por acre.

A produtividade da colheita é impactada por estresses abióticos, tal como seca, calor, salinidade e estresse por frio, e pelo tamanho (biomassa) da planta.

A produtividade de uma planta pode depender da planta / colheita específica de interesse, bem como de sua aplicação pretendida (tal como produção de alimentos, produção de rações, produção de alimentos processados, biocombustível, produção de biogás ou álcool ou similares) de interesse em cada caso particular.

Assim, em uma modalidade, a produtividade pode ser calculada como índice de colheita (expresso como uma razão do peso das respectivas partes colhíveis dividido pela biomassa total), peso das partes colhíveis por área (acre, metro quadrado ou similar); e similares.

O índice de colheita é a razão entre a biomassa produzida e a biomassa cumulativa total na colheita.

O índice de colheita é relativamente estável em muitas condições ambientais e, portanto, é possível uma correlação robusta entre o tamanho da planta e a produtividade de grãos. As medidas do tamanho da planta no desenvolvimento precoce, sob condições padronizadas em uma câmara de crescimento ou estufa, são práticas padrão para medir as vantagens potenciais de produtividade conferidas pela presença de um transgene ou característica alterada. Consequentemente, a produtividade de uma planta pode ser alterada por um ou mais dos fenótipos ou características relacionadas à produtividade. Por exemplo, a produtividade refere-se à produtividade de biomassa, por exemplo, à produtividade de biomassa em peso seco e / ou produtividade de biomassa em peso fresco. A produtividade de biomassa refere-se às partes aéreas ou subterrâneas de uma planta, dependendo das circunstâncias específicas (condições de teste, cultura específica de interesse, aplicação de interesse e similares). Em uma modalidade, a produtividade de biomassa refere-se às partes aéreas e subterrâneas. A produtividade de biomassa pode ser calculada como peso fresco, peso seco ou uma base ajustada de umidade. A produtividade de biomassa pode ser calculada por planta ou em relação a uma área específica (por exemplo, produtividade de biomassa por acre / metro quadrado / ou similares).

[0096] A planta, conforme descrito neste documento, refere-se a uma planta que é particularmente útil e inclui, em particular, plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas, incluindo forragem ou leguminosas forrageiras, plantas ornamentais, mais particularmente a dita planta é uma cultura, ou um cereal, ou uma planta ou árvore lenhosa. Em uma modalidade específica, a invenção refere-se a uma planta lenhosa que é uma espécie de álamo, pinheiro ou eucalipto. Alternativamente, a planta no presente documento descrita, em particular, refere-se a arbustos selecionados a partir da lista que compreende Acacia spp.,

Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (por exemplo, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (por exemplo, Brassica napus, Brassica rapa ssp. [canola, oilseed rape, turnip rape]), B. luminifera, Cadaba farinosa, Camellia spp., Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Ceratodon purpureus, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (por exemplo, Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (por exemplo, Glycine max, Soja hispida or Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (por exemplo, Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hevea brasiliensis, Hibiscus spp., Hordeum spp. (por exemplo, Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Indigofera tinctoria, Jatropha curcas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Leucaena spp., Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (por exemplo, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (por exemplo, Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Picea abies, Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (por exemplo, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium or Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por exemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum or Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre outros.

[0097] Para certas modalidades, a dita planta, conforme descrito neste documento, refere-se a uma semente ou célula de planta derivada da dita planta.

[0098] Em uma modalidade, um alelo ccr é nocauteado na dita planta, enquanto o outro é mutado similar ao do álamo ccr2 12. Mais especificamente, o alelo de P. alba é mutado no álamo híbrido P. tremula x P. alba, ou alternativamente o alelo de P. tremula está mutado. Em uma modalidade, é suficiente que a planta álamo seja deficiente ou reduzida em sua atividade de CCR2, e a introdução de uma sequência de ácido nucleico CCR2 mutante permite produzir a proteína CCR2 mutante dentro da dita planta, para obter o efeito da invenção. Além disso, outra modalidade refere-se a plantas que não o álamo, tal como plantas lenhosas (pinheiro, eucalipto, seringueira, etc.) ou colheitas (milho, trigo, soja, etc.) que são deficientes em atividade de CCR endógena, por exemplo, através de nocaute de ccr, e compreende ainda uma proteína CCR mutante da invenção, ou uma proteína CCR mutante que compreende uma região de pelo menos 50% de identidade de aminoácidos com a SEQ ID NO: 1, para obter o fenótipo vantajoso da planta da invenção. Essa proteína CCR mutante não será idêntica à sequência de aminoácidos da proteína CCR endógena da dita planta, mas conterá mutações com um efeito similar ao das plantas ccr2 12 e / ou que fornecem um alelo fraco, com uma atividade de CCR na faixa de atividade da proteína mutante produzida em ccr2 12.

[0099] Um nocaute de alelos CCR pode ser introduzido por meio da introdução de uma mutação de deslocamento de quadro, resultando em um códon de terminação precoce. A tecnologia CRISPR / Cas permite essas mutações direcionadas usando gRNAs. Nos álamos híbridos P. tremula x P. alba, por exemplo, os alelos CCR2 diferem em 3 pb nucleotídeos, mas apenas em 1 aminoácido, e a diferença na sequência de nucleotídeos permite, assim, atingir mutações bialélicas. Para triar as sequências de proteína CCR mutantes adicionais que resultam no mesmo efeito que a proteína mutante CCR da invenção, ou seja, fenótipo CCR de lignina inferior e sacarificação aumentada, enquanto mantém o crescimento normal da planta, uma tela CRISPR / Cas de nocaute pode ser projetada usando uma série de gRNAs diferentes, seguido por transformação e cultivo no solo, para eventualmente medir e comparar o crescimento da planta primária e medições de biomassa, além de análise de coloração do xilema, quantificação de lignina e sacarificação.

[0100] O verdadeiro potencial comercial e o valor para os propósitos de biorrefino das ditas proteínas CCR mutantes expressas nas ditas plantas com fenótipos de lignina inferiores e crescimento normal são totalmente descritos através da caracterização de álamos de 2 metros de altura. Nessas plantas altas, o grau de redução da lignina e as propriedades da biomassa são mais claros (ver exemplos). Além da análise da parede celular e dos ensaios de sacarificação, a atividade total de CCR2 do xilema, bem como um perfil dos metabólitos em tais plantas, confirmam as vantagens e o impacto da atividade de CCR2 reduzida. Conforme descrito neste documento, a atividade de CCR pode ser determinada usando proteína CCR produzida de forma recombinante em um ensaio bioquímico in vitro, ou por meio de ensaios de alimentação de células, e / ou pode ser investigada no xilema para descrever ou identificar se a atividade de CCR que é necessária para evitar penalizações da produtividade estão presentes nessas plantas. Nesse aspecto, feruloil-CoA é incubado como um substrato de CCR com extratos de proteína de xilema purificados e a abundância de coniferaldeído (produto) e ácido ferúlico (derivado de feruloil-CoA, que tipicamente se acumula em caso de deficiência de CCR) é especificamente medida. Alternativamente, o perfil de metabólito é considerado nas plantas nocaute para CCR que produzem uma proteína CCR mutante, para fornecer evidências de grandes deslocamentos no grupo de metabólitos, como foi previamente descrito por Vanholme e outros (2012) e De Meester e outros (2018). Por exemplo, os ácidos ferúlico, vanílico, sinápico e siríngico (derivados) se acumulam, enquanto a abundância de oligolignóis (ou produtos de acoplamento de monolignol) é reduzida.

[0101] Deve ser entendido que embora modalidades particulares, configurações específicas, bem como materiais e / ou moléculas,

tenham sido discutidos neste documento para células e métodos projetados de acordo com a presente invenção, várias alterações ou modificações na forma e detalhes podem ser feitas sem abandonar o escopo e o espírito desta invenção. Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar melhor as modalidades particulares e não devem ser considerados limitantes do pedido. O pedido é limitado apenas pelas reivindicações.

EXEMPLOS Exemplo 1. Nocaute de CCR2 em álamo usando o sistema CRISPR / Cas9.

[0102] Modificou-se o teor de lignina em álamo (Populus tremula x Populus alba) através de nocaute estável de cinamoil-CoA redutase2 (CCR2) usando o sistema CRISPR / Cas9. Para mutar CCR2 em Populus tremula x P. alba via CRISPR / Cas9, um gRNA foi projetado direcionado ao terceiro éxon de ambos os alelos CCR2 (Tabela 1). Este gRNA foi clonado no vetor p201N-Cas9 expondo um gene marcador selecionável por canamicina. Após a transformação mediada por Agrobacterium, oito brotos independentes que puderam ser gerados sobreviveram em meio seletivo para canamicina. O sequenciamento da região amplificada por PCR direcionada pelo gRNA confirmou que sete brotos carregavam modificações bialélicas de deslocamento do quadro de leitura no gene CCR2 (Tabela 1). Do total de 14 alelos CCR2 presentes nesses brotos, sete tiveram uma inserção de 1 pb, três tiveram uma deleção de 1 pb, enquanto os outros 4 alelos tiveram deleções entre 7 e 27 pb. Dos oito brotos regenerados, sete linhagens de álamo ccr2 eram severamente anãs e mal conseguiram sobreviver nas condições úmidas da cultura in vitro (Figura 1). Os alelos CCR2 destas linhagens continham mutações bialélicas de deslocamento do quadro de leitura (ccr2 6, 7, 8, 14, 15 e 17) ou uma combinação de uma mutação monoalélica de deslocamento do quadro de leitura e uma grande deleção (ccr2 13) (Tabela 1). Todas essas mutações de deslocamento do quadro de leitura introduziram códons de terminação prematuros nas sequências de CCR2.

[0103] Curiosamente, ccr2 12 continha uma mutação de deslocamento do quadro de leitura (inserção de 1 bp) no alelo de Populus tremula, embora tivesse uma deleção de 3 bp no alelo de Populus alba (Tabela 1). A deleção de 3 bp ocorreu em 2 códons, resultando em uma alteração de aminoácido correspondente a uma substituição de uma Isoleucina e uma Alanina por uma Treonina na sequência da proteína (Tabela 1, Figura 4 A). Tabela 1: Informação de sequência do lócus CCR2 de álamos ccr2.

SEQ ID Linhagem Sequência Alvo (GN19NGG) Indel NO Linhagens ccr2 (com mutações bialélicas de deslocamento do quadro de leitura) GCAGTGAACGGGACCAAAAATGTGATCATTTGCGGCGG +1 42 ccr2 6 GCAGTGAACGGGACCAAAAATGTGATCA.--------- -14 43 GCAGTGAACGGGACCAAAAATGTGATC-.TTGCGGCGG -1 44 ccr2 7 GCAGTGAACGGGACCAAAAATGTGAT--------GCGG -7 45 GCAGTGAACGGGACCAAAAATGTGATCAATTGCGGCGG +1 46 ccr2 8 GCAGTGAACGGGACCAAAAATGTGATCAATTGCGGCGG +1 47 GCAGTGAACGGGACCAAAAATGTGATCAATTGCGGCGG +1 48 ccr2 13 GCAGTGAACGGGACCAAAAAT-------.--------- -27 49 GCAGTGAACGGGACCAAAAATGTGATCAATTGCGGCGG +1 50 ccr2 14 GCAGTGAACGGGACCAAAAATGTGATC-.TTGCGGCGG -1 51 GCAGTGAACGGGACCAAAAATGTGATCAATTGCGGCGG +1 52 ccr2 15 GCAGTGAACGGGACCAAAAATGTGATC-.TTGCGGCGG -1 53 GCAGTGAACGGGACCAAAAATGTGATCACTTGCGGCGG +1 54 ccr2 17 GCAGTGAACGGGACCAAAAA--------.TTGCGGCGG -8 55 Linhagem ccr2 (com uma mutação monoalélica de deslocamento do quadro de leitura em 1 alelo e um indel de 3 bp no outro alelo) GCAGTGAACGGGACCAAAAATGTGATCAATTGCGGCGG +1 56 ccr2 12 GCAGTGAACGGGACCAAAAATGTGATCA.---CGGCGG -3 57 Ocorrência GCAGTGAACGGGACCAAAAATGTGATCA.TTGCGGCGG 0 58 natural GCAGTGAACGGGACCAAAAATGTGATCA.TTGCGGCGG 0 59

Sequências alvo do construto CRISPR / Cas9 de ocorrência natural e linhagens transgênicas. Ambos os alelos e os padrões indel são mostrados. O gRNA (sublinhado na Tabela 1; e nas SEQ ID NOs 6 e 7) e as sequências do motivo adjacente protoespaçador (PAM; texto em negrito) são destacados para a ocorrência natural.

Exemplo 2. Álamos ccr2 contendo mutações bialélicas de deslocamento do quadro de leitura têm um teor de lignina reduzido, vasos colapsados e um fenótipo anão.

[0104] Os 7 brotos que carregavam as mutações bialélicas de deslocamento do quadro de leitura (ccr2 6, ccr2 7, ccr2 8, ccr2 13, ccr2 14, ccr2 15, ccr2 17) juntamente com seus controles de ocorrência natural, foram micropropagados e cultivados em meio MS por quatro meses. Quando comparados à ocorrência natural, os caules e as folhas dos mutantes ccr2 eram significativamente menores (Figura 1). No entanto, os caules ccr2 eram visualmente mais espessos e suas folhas eram verdes mais escuras quando comparadas às de ocorrência natural (Figura 1). Quando transferidos para o solo, apenas 2 de 7 álamos ccr2 se recuperaram, enquanto quase todas as plantas de ocorrência natural sobreviveram. Os cinco álamos ccr2 que não sobreviveram à transferência morreram em 2 semanas como consequência de bolor, queda de folhas e / ou necrose do caule. Em contraste com as plantas de ocorrência natural, que podiam crescer em condições normais de estufa, os mutantes ccr2 sobreviventes tinham que ser mantidos sob uma cúpula para criar condições muito úmidas para evitar que morressem. Após quatro meses em suas respectivas condições, os tipos de ocorrência natural tinham caules de cerca de 2 m de altura com folhas grandes, enquanto os mutantes ccr2 sobreviventes tinham caules de cerca de 5 cm de altura com folhas pequenas (Figura 2). Uma vez que mutantes ccr2 carregando as mutações bialélicas de deslocamento do quadro de leitura não podiam / quase não sobreviveram na estufa, todas as análises adicionais foram realizadas em plantas que foram cultivadas por quatro meses em meio MS (após a propagação). Para examinar a estrutura dos vasos e estudar o padrão de lignificação, seções transversais do caule foram tratadas com etanol, azul de toluidina, coloração de Mäule e Wiesner ou visualizadas por autofluorescência (Figura 3). O azul de toluidina é um corante policromático e pode ser usado para tingir polissacarídeos (roxo) e lignina (azul) diferencialmente. A coloração e autofluorescência de Mäule e Wiesner representam especificamente a imagem da lignina. Mais especificamente, o reagente Mäule cora a lignina G de marrom e a lignina S de vermelho, enquanto o reagente de Wiesner cora os cinamaldeídos presentes na lignina de rosa (Pradhan Mitra and Loque, 2014). Após a remoção da casca, a coloração vermelha típica do xilema foi observada em mutantes ccr2. As seções de caule tratadas com etanol descreveram que essa coloração vermelha estava associada à parede celular das células do xilema em mutantes ccr2. Embora essa coloração tenha interferido nas colorações da lignina, ambos os caules corados com Wiesner quanto Mäule mostraram uma redução geral na deposição de lignina nas linhagens de ccr2 quando comparados à ocorrência natural.

[0105] Como visto na coloração com azul de toluidina e autofluorescência de lignina, o tecido do xilema de ocorrência natural continha grandes vasos abertos e estava fortemente lignificado. Nos mutantes ccr2 (contendo mutações bialélicas de deslocamento do quadro de leitura), os vasos tinham formato irregular e colapsaram. Finalmente, nas seções coradas com azul de toluidina, nenhuma estrutura celular era visível nos vasos e fibras de ocorrência natural. Em contraste, estruturas azuis em forma de círculo apareceram dentro das células do xilema de ccr2 após a coloração com azul de toluidina, o que pode indicar a presença de depósitos fenólicos ou conteúdo celular residual.

[0106] Em seguida, a quantidade de lignina e a composição de mutantes ccr2 (contendo mutações bialélicas de deslocamento do quadro de leitura) foram determinadas (Tabela 2). Depois de crescer por quatro meses em meio MS, as plantas de ocorrência natural atingiram alturas de cerca de 15 cm, enquanto os mutantes ccr2 tinham alturas entre 2 e 6 cm, tornando uma comparação simples entre esses genótipos difícil; ccr2 pode ter características de ‘madeira jovem’ (por causa de sua altura reduzida, o que pode ser uma indicação de um atraso no desenvolvimento) ou ‘madeira velha’ (porque os caules de ccr2 eram mais grossos em comparação com os de ocorrência natural). Para corrigir isso, os segmentos de caule de ocorrência natural basal (‘madeira velha’) e apical (‘madeira jovem’) foram analisados separadamente, enquanto os caules ccr2 foram analisados na íntegra.

Similar à microscopia, os caules foram colhidos após serem cultivados por quatro meses em meio MS.

Após o descascamento, os caules foram secos ao ar.

Em seguida, os compostos solúveis foram removidos através da aplicação de uma extração sequencial para produzir resíduo de parede celular sem extrato (CWR) (Van Acker e outros, 2013). Nenhuma diferença significativa foi encontrada entre a parte basal e apical do caule de ocorrência natural em % CWR, quantidade e composição de lignina (Tabela 2). No entanto, os mutantes ccr2 tiveram, em média, 14% menos CWR do que os de ocorrência natural.

A quantidade de lignina AcBr, determinada de forma espectrofotométrica, foi reduzida em 26% em ccr2 quando comparada a de ocorrência natural.

Em seguida, a composição da lignina foi analisada por meio de tioacidólise, que permite a quantificação de H, G, S e outras unidades menores que estão ligadas por ligações interunidades β-O-4 no polímero de lignina.

A lignina de ccr2 liberou substancialmente menos monômeros (H + G + S) do que a lignina de amostras de ocorrência natural.

Isso indica que a lignina do mutante ccr2 tem menos ligações interunidades β-O-4 e, portanto, é enriquecida em ligações interunidades carbono-carbono (principalmente β-5, β-β). Os monômeros H foram dificilmente detectáveis na ocorrência natural e constituíram apenas cerca de 1,4 a 1,5% do total de unidades liberadas de tioacidólise identificadas.

Em contraste, o mutante ccr2 mostrou um aumento relativo nas unidades H liberadas por tioacidólise em mais de três vezes.

Além disso, a razão S / G foi diminuída para o mutante ccr2 quando comparado à de ocorrência natural.

A incorporação de ácido ferúlico (FA), que é um menor constituinte conhecido da lignina, é indicada na tioacidólise pela presença de três marcadores: dois estão ligados por meio de estruturas β – O – 4 convencionais (Unidades β – O – 4-FA- I e β – O – 4-FA-II), enquanto a terceira, derivada do acoplamento bis-β – O – 4 de FA, resulta em uma cadeia lateral truncada (Ralph e outros, 2008). De acordo com os resultados relatados precedentemente para plantas deficientes em CCR, a abundância relativa de unidades I e II de FA ligadas a β-O-4 foi aumentada nos álamos mutantes ccr2 quando em comparação com os níveis nos de ocorrência natural (Leplé e outros, 2007; Mir Derikvand e outros, 2008; Ralph e outros, 2008; Van Acker e outros, 2014). Tabela 2: Características da parede celular de mutantes ccr2 portadores de mutações bialélicas de deslocamento do quadro de leitura.

O resíduo da parede celular (CWR) (expresso como % em peso seco) foi determinado de forma gravimétrica após uma extração sequencial. O teor de lignina foi determinado com o ensaio AcBr e expresso como % do CWR. A composição de lignina foi determinada com tioacidólise. A soma das unidades H, G e S é expressa em lignina AcBr μmol g-1. As proporções relativas das diferentes unidades de lignina foram calculadas com base no rendimento total de tioacidólise (incluindo as unidades menores de lignina não convencionais). S / G foi calculado com base nos valores absolutos de S e G (expressos em μmol g-1 de lignina AcBr). Todos os valores são dados como média ± desvio padrão. Os grupos de significância representam diferenças significativas no nível de significância de 0,05 (teste t ajustado de Dunnett- Hsu; n = 5 para cada grupo).

[0107] Em conclusão, as linhagens ccr2 que carregavam mutações bialélicas de deslocamento do quadro de leitura tiveram uma redução de 26% no teor de lignina - brometo de acetila e exibiram o fenótipo de xilema vermelho, mas também sofreram de vasos colapsados e severas penalizações da produtividade. Exemplo 3. Álamo ccr2 12 tem uma coloração vermelha do xilema e nenhum defeito de crescimento óbvio

[0108] Em contraste com os mutantes ccr2 bialélicos anões, uma linhagem ccr2 carregava uma mutação de deslocamento do quadro de leitura em um alelo CCR2, enquanto no outro alelo CCR2 ocorreu uma mutação de -3bp que resultou em uma modificação de dois aminoácidos, ccr2 12 (Tabela 1, Figura 4), que resultou em uma quantidade reduzida de lignina (avaliada por seu fenótipo de xilema vermelho), sem exibir penalizações da produtividade óbvias quando cultivadas em cultura de tecidos ou no solo. Como mencionado antes, o gRNA usado é direcionado para o terceiro éxon de ambos os alelos CCR2 presentes no genoma do álamo. Todas as oito plantas examinadas carregavam mutações em ambos os alelos CCR2 (Tabela 1). Em ccr2 12, a inserção de 1 bp em um alelo resultou em um códon de terminação prematuro e, muito provavelmente, um nocaute total desse alelo CCR2. No entanto, a deleção de 3 bp no outro alelo resultou em 1 substituição de aminoácido e 1 deleção de aminoácido na proteína correspondente, enquanto os outros aminoácidos permaneceram inalterados (Figura 4A). Surpreendentemente, quando cultivado em condições in vitro, não foram observadas diferenças na altura entre ccr2 12 e a ocorrência natural (Figura 4B). Após a propagação e transferência para o solo, nenhuma das onze plantas ccr2 12 exibiu penalizações da produtividade óbvias, indicando que o alelo carregando a deleção de 3 bp ainda está codificando para uma proteína com atividade de CCR2 (reduzida / alterada). Quando as árvores foram colhidas após atingirem alturas de aproximadamente 1,20 m, foi observada a coloração vermelha típica do xilema (Figura 4C). A partir dos 15 cm restantes da parte basal do caule, novos brotos se desenvolveram. Após vinte semanas de crescimento, nenhuma diferença significativa na altura da planta foi observada entre a ocorrência natural e o ccr2 12 (Figura 4D-E). Além disso, a massa do caule (peso fresco), peso seco, altura e diâmetro foram iguais entre a ocorrência natural e os álamos ccr2 12 (Tabela 3). Tabela 3: Medições de biomassa de álamos ccr2 12. Linhagem Massa Massa Peso Seco Altura (cm) Diâmetro com descascada (g) (mm) casca (g) (g) Ocorr. Nat. 87,6 ± 7,2 57,4 ± 4,5 18,85 ± 1,69 207,40 ± 4,29 11,35 ± 0,29 ccr2 12 87,0 ± 5,9 57,0 ± 3,9 17,61 ± 0,51 198,18 ± 1,29 11,03 ± 0,09 As medições foram realizadas em álamos cultivados por 20 semanas em estufa (altura média ~ 2 m). O diâmetro do caule foi determinado 10 cm acima do nível do solo. O peso fresco do caule (sem as folhas) foi determinado com e sem casca. Após secagem dos caules por 2 semanas, o peso seco foi determinado. Não foram encontradas diferenças significativas na altura, diâmetro, peso fresco e seco entre as linhagens de ocorrência natural e as linhagens ccr2 12 no nível de significância de 0,05 (teste t de Student bicaudal). Os dados representam médias de 10 réplicas biológicas para WT, e 11 réplicas biológicas para ccr2 12 ± erro padrão.

Exemplo 4. ccr2 12 tem quantidade e composição de lignina alteradas

[0109] Para avaliar a composição da biomassa lignocelulósica de ccr2 12, o teor e a composição de lignina, juntamente com a quantidade de celulose, do material do caule seco foram determinados (Tabela 4). Primeiro, os compostos solúveis foram removidos dos caules aplicando uma extração sequencial para produzir resíduo de parede celular (CWR). Os álamos ccr2 12 tiveram uma quantidade de CWR igual a WT.

Em segundo lugar, a fração de lignina nestes CWRs preparados foi determinada através do método de Klason e de brometo de acetila.

A quantidade total de lignina de ccr2 12 foi reduzida em 10% quando comparada com WT.

Terceiro, a composição de lignina foi analisada via 2D HSQC NMR.

Usando essa técnica, foram encontrados deslocamentos nas quantidades relativas de unidades de lignina aromática e tipos de ligação interunidades quando o ccr2 12 foi comparado com WT.

Mais especificamente, em ccr2 12, a quantidade relativa de unidades S diminuiu, enquanto a de unidades G aumentou em comparação com WT.

Além disso, enquanto a frequência relativa de unidades H permaneceu inalterada, a de p-hidroxibenzoatos aumentou em ccr2 12 em comparação com WT.

Além disso, a lignina de ccr2 12 teve uma frequência aumentada de ligações de β-aril éter, enquanto teve uma frequência diminuída de ligações de resinol.

Em quarto lugar, o teor de celulose foi analisado por meio do ensaio de Updegraff espectrofotométrico, que mostrou que o teor de celulose cristalina de ccr2 12 não diferia significativamente do de WT.

Tabela 4. Composição da parede celular de plantas de ocorrência natural e ccr2 12. Ocorrência ccr2 12 natural média ± média ± stdev stdev CWR (% peso seco) 84,2 ± 13,8 88,6 ± 0,6 Quantidade de lignina - Klason (% CWR) 31,1 ± 1,5 27,8 ± 0,9**

- Lignina - Klason insolúvel em ácido (% CWR) 29,4 ± 1,5 26,0 ± 0,9** - Lignina - Klason solúvel em ácido (% CWR) 1,7 ± 0,1 1,8 ± 0,1** Quantidade de lignina – brometo de acetila (% CWR) 17,1 ± 1,3 15,4 ± 0,7** Unidades aromáticas (%) - %S 61,7 ± 0,7 57,6 ± 1,6* - %G 38,0 ± 0,6 42,3 ± 1,5* - %H 0,3 ± 0,1 0,1 ± 0,1 - % pBA 6,9 ± 0,4 12,4 ± 0,7** Ligações Interunidades (%) - β-aril éter 82,4 ± 1,8 87,8 ± 1,1* - Fenil coumarano 3,1 ± 1,0 3,9 ± 1,5 - Resinol 14,4 ± 1,5 8,2 ± 1,1** Celulose (% CWR) 39,6 ± 4,2 39,5 ± 4,1 O resíduo da parede celular (CWR) foi determinado como a fração de material obtida após as lavagens em relação ao peso seco original (WT, n = 10; ccr2 12, n = 11). O teor de lignina foi determinado pelo método Klason e brometo de acetila e expresso como uma porcentagem de CWR (WT, n = 10; ccr2 12, n = 11). A composição de lignina foi determinada na lignina enzimática por 2D HSQC NMR (WT e ccr2 12, n = 3). O teor de celulose cristalina foi determinado pelo método Updegraff e expresso como uma porcentagem de CWR (WT, n = 10; ccr2 12, n = 11). ** P < 0,01, * P < 0,05, teste t de Student bicaudal; stdev, desvio padrão.

Exemplo 5. A linhagem ccr2 12 tem até 50% de aumento na eficiência de sacarificação em comparação com a de ocorrência natural.

[0110] A análise fenotípica descreveu que o teor de lignina da linhagem ccr2 12 é reduzido em comparação com as plantas de ocorrência natural (Figura 4C). A análise da parede celular confirmou que o teor de lignina de ccr2 12 foi reduzido em 10% quando comparado ao de WT (Tabela 4). Como a quantidade de lignina tem um efeito negativo na eficiência de sacarificação, o potencial de sacarificação de ccr2 12 (cultivado até atingir alturas de 1,20 m e 2 m) após tratamento ácido, alcalino ou nenhum pré-tratamento foi investigado.

[0111] Para plantas de 1,2 m de altura, a liberação de glicose expressa como % de resíduo da parede celular (% CWR) foi medida após 2 h e 48 h, sem ou com pré-tratamento (ácido ou alcalino), e no caso de mutantes ccr2 12, a porcentagem de aumento de rendimento de glicose foi pelo menos 30% maior em comparação com a de ocorrência natural para o pré-tratamento com álcali, e pelo menos 50% maior em comparação com a ocorrência natural para o pré-tratamento com ácido (Figura 5).

[0112] Para plantas de 2 m de altura, o rendimento de glicose expresso como % CWR de ccr2 12 foi muito maior do que o de WT. No ponto final do ensaio de sacarificação, o rendimento de glicose de ccr2 12 após nenhum pré-tratamento ácido e alcalino foi aumentado em 35%, 53% e 35%, respectivamente, quando comparado com WT (Figura 7).

[0113] Portanto, com esses resultados consistentes, pode-se concluir que a linhagem ccr2 12 melhorou a eficiência de sacarificação, resultando em uma característica de lignina valiosa, e isso sem qualquer inferioridade de produtividade. Exemplo 6. Os álamos ccr2 12 têm uma quantidade reduzida de lignina como consequência da alteração de aminoácidos que ocorre no respectivo alelo CCR2 de P. alba, e não devido a haplo- insuficiência.

[0114] Em ccr2 12, o alelo de P. tremula CCR2 contém uma mutação de deslocamento do quadro de leitura que resulta na introdução de um códon de terminação precoce, causando o nocaute total desse alelo. Em caso de haplo-insuficiência, as linhagens ccr2 12 têm uma quantidade reduzida de lignina (em grande parte) como consequência da mutação de deslocamento do quadro de leitura presente no alelo de P. tremula CCR2. No entanto, o alelo de P. alba CCR2 de ccr2 12 contém uma mutação que leva a uma pequena alteração de aminoácidos que potencialmente influencia a atividade de sua respectiva proteína CCR2. Portanto, no caso de haplo-suficiência do alelo WT de P. alba CCR2, a redução da quantidade de lignina no ccr2 12 é consequência da redução da atividade causada pela alteração de aminoácidos na proteína de P. alba CCR2.

[0115] Para testar o estado haplo-(in)suficiente dos alelos CCR2, foram geradas linhagens monoalélicas de CCR2 nocaute. Mais especificamente, um gRNA foi projetado direcionado especificamente para o quarto éxon de P. tremula ou o alelo de P. alba CCR2. O gRNA foi clonado no vetor p201N-Cas9 contendo um gene marcador selecionável por canamicina. Após a transformação mediada por Agrobacterium, vários brotos independentes que puderam ser regenerados sobreviveram em meio seletivo para canamicina. O sequenciamento da região amplificada por PCR direcionada pelo gRNA confirmou que a maioria dos brotos apresentava mutação monoalélica (Tabela 6), enquanto alguns apresentavam mutações bialélicas. Similar aos álamos bialélicos nocaute ccr2 gerados com o gRNA direcionado para o terceiro éxon do gene CCR2 (Figura 1 e 2, e Tabela 1), os álamos bialélicos nocaute ccr2 gerados com o gRNA direcionado para o quarto éxon do gene CCR2 também foram severamente diminuídos (Tabela 7 e Figura 8). Tabela 6. Informação de sequência do lócus CCR2 de linhagens monoalélicas de CCR2 nocaute.

Tabela 6 continuação

Sequências alvo do construto CRISPR / Cas9 de ocorrência natural e linhagens transgênicas.

Ambos os alelos e os padrões indel são mostrados.

O gRNA está sublinhado.

Tabela 7. Informação de sequência do lócus CCR2 de linhagens bialélicas de CCR2 nocaute.

Sequências alvo do construto CRISPR / Cas9 de ocorrência natural e linhagens transgênicas. Ambos os alelos e os padrões indel são mostrados. O gRNA está sublinhado.

[0116] Subsequentemente, após crescer por várias semanas em cultura de tecidos, o WT, os álamos monoalélicos CCR2 nocaute e os álamos ccr2 12 foram cultivados na estufa por 11 semanas. Após este período de crescimento, as plantas monoalélicas CCR2 nocaute e ccr2 12 foram iguais ao WT em altura do caule, diâmetro, peso fresco e peso seco (Tabela 8, Figura 9). Depois de descascar os caules colhidos, a coloração vermelha do xilema estava presente apenas em mutantes ccr2 12, embora estivesse ausente nas plantas WT e monoalélicas CCR2 nocaute (Figura 10). Este último já sugere que a quantidade de lignina nas plantas monoalélicas CCR2 nocaute será similar à de WT. Tabela 8. Análise de biomassa de WT, plantas monoalélicas CCR2 nocaute e ccr2 12. Peso Fresco Peso Seco Diâmetro Linhagem Altura (cm) (g) (g) (mm) Ocorrência natural 59,3 ± 2,7 a 4,9 ± 0,5 a 1,2± 0,2 a 6,0 ± 0,0 a P. tremula CCR2 KO 53,9 ± 12,7 a 3,5 ± 2,4 a 0,9± 0,6 a 5,0 ± 1,2 a P. alba CCR2 KO 62,7 ± 7,9 a 5,5 ± 1,8 a 1,3± 0,5 a 6,2 ± 0,9 a ccr2 12 53,0 ± 4,2 a 4,0 ± 1,3 a 0,9± 0,3 a 5,5 ± 0,6 a As plantas foram cultivadas por 11 semanas na estufa. Na hora da colheita, foram medidos a altura, a massa fresca e o diâmetro do caule. Após a secagem dos caules por 5 dias, foi determinado o peso seco. Letras diferentes representam diferenças significativas no nível de significância de 0,05 (teste t de Student ajustado por Scheffe). Os dados representam médias de 7 réplicas biológicas ± desvio padrão.

[0117] Para validar isso, o teor de lignina do material do caule seco foi determinado. Primeiro, os compostos solúveis foram removidos dos caules aplicando uma extração sequencial para produzir resíduo de parede celular (CWR). Todas as linhagens examinadas tiveram uma quantidade igual de CWR (Tabela 9). Em segundo lugar, a fração de lignina nestes CWRs preparados foi determinada através do método de brometo de acetila. Em linha com o fenótipo de coloração do xilema

(Figura 10), a quantidade de lignina - brometo de acetila (% CWR) nas plantas monoalélicas CCR2 nocaute é igual a WT, enquanto que nas linhagens ccr2 12 é reduzida em ~ 15% quando comparada com WT. Tabela 9. Determinação da quantidade de lignina em plantas WT, monoalélicas CCR2 nocaute, ccr2 12, e ccr2 116. Quantidade de lignina Linhagem CWR (% peso seco) – brometo de acetila (%CWR) Ocorrência natural 70,63 ± 4,31 a 16,51 ± 1,19 a P. tremula CCR2 KO 73,67 ± 2,51 a 16,43 ± 1,05 a P. alba CCR2 KO 75,15 ± 2,28 a 16,13 ± 0,64 a ccr2 12 74,44 ± 7,48 a 13,97 ± 0,82 b O resíduo da parede celular (CWR) foi determinado como a fração de material obtida após as lavagens em relação ao peso seco original. O teor de lignina foi determinado pelo método do brometo de acetila e expresso como porcentagem de CWR. Letras diferentes representam diferenças significativas no nível de significância de 0,05 (teste t de Student ajustado por Scheffe). Para todas as linhagens, n = 7.

[0118] Tomados em conjunto, o fato de que os alelos monoalélicos CCR2 ko (ko / wt) não resultam em um fenótipo de lignina similar ao das linhagens mutantes ccr2 12 (ko / mutante) suporta a conclusão de que a característica de lignina de ccr2 12 acompanhada de seu crescimento normal da planta é causada pela presença da mutação no alelo de P. alba CCR2 e não é resultado de haplo-insuficiência do alelo de P. alba CCR2. Exemplo 7. A edição de gene no motivo conservado de CCR2 de álamo delineia adicionalmente os resíduos alvo para características de lignina interessantes.

[0119] Em ccr2 12, a sequência da proteína de P. alba CCR2 difere em apenas dois aminoácidos da sequência da proteína WT. Mais especificamente, um resíduo de isoleucina e alanina são substituídos por um resíduo de treonina (Figura 4A). Como uma consequência, os álamos ccr2 12 apresentam uma quantidade reduzida de lignina e um grande aumento na eficiência de sacarificação quando comparados com WT (Tabela 4, Figura 7). Além disso, o nanismo induzido pela característica de lignina ou penalização de produtividade não está presente nesses mutantes, o que é de grande benefício para seu valor comercial.

[0120] Usando o mesmo vetor (e, portanto, o mesmo gRNA direcionado à mesma região) para gerar ccr2 12, uma linhagem de ccr2 similar foi gerada, chamada ccr2 116. Nesta linhagem, o alelo de P. alba CCR2 contém uma mutação de deslocamento do quadro de leitura (deleção de 4 bp) resultando em um nocaute total desse alelo (Tabela 10). No entanto, o alelo de P. tremula CCR2 de ccr2 116 contém uma deleção de 3 pb resultando na deleção de um resíduo de isoleucina (Figura 11). Curiosamente, o último é o mesmo resíduo de isoleucina que também está mutado em ccr2 12, embora em um alelo CCR2 diferente. Embora também ccr2 116 não sofra de penalização de produtividade, neste estágio inicial de crescimento onde ccr2 12 mostrou a coloração vermelha deficiente em CCR típica do xilema, este não é o caso para ccr2 116, sugerindo que a quantidade de lignina não é reduzida em ccr2 116 (Figura 11B). Para validar isso, a quantidade de lignina em uma amostra disponível de ccr2 116 foi determinada por meio do método de brometo de acetila. A quantidade de lignina por % CWR de ccr2 116 foi determinada como sendo 17,5%, o que está dentro de um desvio padrão da média de 16,51% de ocorrência natural (Tabela 9). Estes resultados sugerem que as alterações de aminoácidos que ocorrem no alelo de P. alba CCR2 de ccr2 12, que compreende a deleção de uma alanina muito conservada que não é alterada em ccr2 116, altera o motivo estrutural para levar a uma atividade de CCR2 alterada (e diminuindo assim a quantidade de lignina nas respectivas árvores), enquanto ainda age de forma suficientemente como ocorrência natural para manter seu crescimento e desenvolvimento normal da estrutura da planta.

Tabela 10. Informação de sequência do lócus CCR2 de ccr2 116

Sequências alvo do construto CRISPR / Cas9 de ocorrência natural e linhagens transgênicas.

Ambos os alelos e os padrões indel são mostrados.

O gRNA está sublinhado.

Exemplo 8. Atividade da proteína CCR2 mutante e de ocorrência natural recombinante em levedura.

[0121] Com base na quantidade de lignina em ccr2 12 (ver Exemplo 4) e nas linhagens monoalélicas ccr2 nocaute (Exemplo 6), é fornecido que o mutante P. alba CCR2 nas linhagens ccr2 12 codifica uma enzima com uma atividade de CCR alterada ou inferior em comparação com a enzima codificada por WT P. alba CCR2. Para validar isso, ensaios de alimentação com levedura foram realizados nos quais a atividade de WT e da proteína CCR2 de P. alba mutante foi investigada. Como o substrato de CCR2, feruloil-CoA, não estava disponível para alimentar as culturas de levedura, teve-se que modificar adicionalmente as culturas de levedura para expressar 4-Coumarato:CoA Ligase (4CL), que pode converter o ácido ferúlico no substrato de feruloil-CoA desejado (Figura 12). Posteriormente, o CCR2 converte este feruloil- CoA em seu produto coniferaldeído (Figura 12).

[0122] A atividade das respectivas proteínas CCR2 foi avaliada com base na produção de coniferaldeído. Inicialmente, foi investigado quais picos eram diagnósticos para a produção de coniferaldeído em culturas de leveduras. Para este fim, analisou-se os compostos adquiridos alimentando culturas de levedura expressando CCR2 de P. alba expressando 4CL e expressando 4CL e WT com ácido ferúlico. Nos cromatogramas das culturas de levedura que expressam 4CL, nenhum pico de coniferaldeído (relacionado) pode ser encontrado (Figura 13A). No entanto, nos cromatogramas originando as culturas de levedura que expressam CCR2P. alba expressando 4CL e WT, um pico identificado como coniferaldeído pode ser observado (Figura 13A: (1)). Além disso, foram encontrados dois outros picos (Figura 13A: (2) e (3)). Como esses dois picos também estavam presentes nos cromatogramas originários de levedura que expressa 4CL alimentado com coniferaldeído (Figura 13B), pode-se concluir que o coniferaldeído é metabolizado pelas células de levedura nesses dois picos. Portanto, os picos (2) e (3) podem ser usados adicionalmente como marcadores de diagnóstico para a presença de coniferaldeído.

[0123] Em seguida, comparou-se a atividade da proteína CCR2 de P. alba WT e mutada em ensaios de alimentação de levedura subsequentes. Para este fim, culturas de levedura expressando 4CL e o gene CCR2 de P. alba WT ou mutado foram alimentadas com ácido ferúlico. No cromatograma dos compostos originários da cultura de levedura que expressam a proteína CCR2 de P. alba WT, foram detectados o coniferaldeído e dois picos do marcador (Figura 13C: (1), (2) e (3)). No cromatograma originário da cultura de levedura que expressa a proteína CCR2 de P. alba mutada, o coniferaldeído e dois picos do marcador estavam ausentes (Figura 13C). Com base nesta análise, concluiu-se que nenhuma atividade enzimática detectável estava presente para a proteína CCR2 mutante de P. alba, como presente nas células de levedura. A proteína mutante expressa de forma heteróloga pode ser instável. No entanto, os fenótipos observados e a observação nas linhagens monoalélicas de álamo ko demonstram que a proteína CCR2 mutante expressa in planta terá uma atividade alterada ou reduzida em comparação com a da proteína CCR2 de P. alba WT, mas não uma atividade nula, uma vez que isso levaria ao nanismo, como nos mutantes ko duplo. Potencialmente, seu ambiente específico de planta envolvendo outras proteínas em interação permite essa alteração sutil. Discussão

[0124] Efeito da deficiência de CCR2 em álamos ccr2 portadores de mutações bialélicas de deslocamento do quadro de leitura

[0125] No álamo, a família do gene CCR contém 9 membros (Shi e outros, 2010). No entanto, apenas o CCR2 é altamente expresso na diferenciação das células do xilema, onde presumivelmente está envolvido na lignificação (Lacombe e outros, 1997; Shi e outros, 2010). Os álamos ccr2 carregando mutações bialélicas de deslocamento do quadro de leitura geradas via CRISPR / Cas9 eram severamente anões (Figura 2) e embora pudessem ser mantidos em cultura de tecidos e sobreviver à propagação in vitro, a maioria deles morreu após a transferência para o solo. A repressão de CCR2 usando construtos senso e antissenso também resultou em plantas atrofiadas em 5% dos regenerantes (Leplé e outros, 2007). Estas últimas foram provavelmente as plantas com a maior redução na expressão de CCR2 e puderam ser mantidas por até 7 meses em cultura de tecidos, mas morreram nas etapas de propagação e aclimatação in vitro. Portanto, para uma análise mais aprofundada dos álamos com repressão de CCR2, foram escolhidas árvores que não apresentavam defeitos de crescimento na estufa. Uma seleção de linhagens também foi plantada em testes de campo. No entanto, o crescimento desses álamos com repressão de CCR2 cultivados em campo foi afetado, sugerindo instabilidade da repressão de CCR2 (Leplé e outros, 2007; Van Acker e outros, 2014).

[0126] Em álamos ccr2 com mutações bialélicas de deslocamento do quadro de leitura, o xilema tinha uma coloração vermelha uniformemente distribuída e continha vasos colapsados. Em álamos com repressão de CCR2 cultivados em estufa e em campo, o fenótipo do xilema vermelho frequentemente parecia irregular, como consequência dos níveis desiguais de silenciamento de genes em áreas vermelhas e brancas (Van Acker e outros, 2014). Apenas as áreas vermelhas do caule de álamos com repressão de CCR2 tiveram quantidades diminuídas de lignina e também continham vasos irregulares (Leplé e outros, 2007; Van Acker e outros, 2014). Após a propagação vegetativa dessas linhagens, uma grande variabilidade no fenótipo vermelho foi observada entre as diferentes plantas propagadas. Isso exemplifica uma das vantagens do CRISPR / Cas9 sobre as abordagens senso e antissenso mais antigas para silenciar genes; a atividade de CCR em álamos ccr2 está estável em todas as células.

[0127] A lignina solúvel em brometo de acetila como uma porcentagem de CWR nos álamos ccr2 portadores de mutações bialélicas de deslocamento do quadro de leitura foi diminuída em 26% quando comparada à de ocorrência natural. No entanto, acredita-se que essa diminuição na quantidade de lignina é uma subestimação provavelmente como consequência de quantidades aumentadas de substâncias absorvedoras de UV que também são detectadas neste método baseado em espectrofotometria para quantificar a lignina, assim como foi observado para álamos com repressão de CCR2 (Van Acker e outros, 2014). No presente documento, a lignina solúvel em brometo de acetila total (por % CWR) não diminuiu (em 3 linhagens) ou diminuiu apenas modestamente (em 1 linhagem, até 12%). Em contraste, o teor total de lignina - Klason (por % CWR) foi significativamente reduzido em 5 a 24% nessas linhagens com repressão de CCR2. Infelizmente, devido a limitações técnicas, as determinações de lignina - Klason dos álamos ccr2 não foram viáveis. Os álamos ccr2 com mutações bialélicas de deslocamento do quadro de leitura continham limites mais condensados e tinham uma razão S para G mais baixa quando comparados com a ocorrência natural. Essas características são indicativas de um atraso no programa de lignificação e também são, em menor grau, observadas nas áreas vermelhas do caule de álamos com repressão de CCR2 (Laskar e outros, 2006; Leplé e outros, 2007; Van Acker e outros, 2013; De Meester e outros, 2018). Em seguida, os álamos ccr2 incorporaram quantidades elevadas de ácido ferúlico em suas ligninas. Da mesma forma, níveis aumentados de ácido ferúlico também foram observados nas ligninas dos álamos com repressão de CCR2, onde eles poderiam ter contribuído para o processamento aprimorado observado para essas amostras de madeira (Leplé e outros,

2007; Van Acker e outros, 2014). Finalmente, os álamos ccr2 tinham uma quantidade aumentada de unidades H liberadas por tioacidólise. Este aumento não foi observado em álamos com repressão de CCR2, mas também foi observado em Arabidopsis ccr1. Neste último, a transcrição de outros genes CCR foi aumentada possivelmente redirecionando o fluxo parcialmente para a formação de unidades H, como também foi sugerido para alfafa (Lee e outros, 2011; Van Acker e outros, 2013). Também em álamos ccr2, os membros da família do gene CCR podem assumir a função do gene CCR2 mutado. No entanto, essa redundância foi insuficiente para produzir quantidades suficientes de lignina para evitar o colapso vascular e produzir uma planta viável. Engenharia de baixa lignina sem comprometer a biomassa por meio do ajuste fino da atividade de CCR

[0128] Neste achado, identificou-se uma maneira alternativa de reduzir de forma estável a quantidade de lignificação total da planta, alterando e / ou reduzindo (e não nocaute) a atividade do gene CCR2 por meio da mutação da sequência de codificação correspondente usando CRISPR / Cas9. Como as plantas editadas por CRISPR / Cas9 têm uma chance razoável de serem permitidas para cultivo sem regulamentação, essa abordagem é altamente desejável (Waltz, 2018). Além disso, a mutação presente em ccr2 12 fornece um excelente exemplo de uma estratégia elegante para equilibrar a redução / alteração da atividade de CCR, resultando em uma característica de lignina sem problemas de produtividade. Por meio da engenharia de uma mutação de deslocamento do quadro de leitura em um alelo, tendo 1 substituição de aminoácido e 1 deleção de aminoácido no outro alelo, a atividade total de CCR2 da planta foi significativamente reduzida, também evidenciada pela coloração vermelha do xilema, sem levar a penalizações de produtividade óbvias. A análise da biomassa confirmou que essas linhagens não sofrem nenhum tipo de perturbação de crescimento (até 2 metros de crescimento). E, finalmente, a eficiência da sacarificação se mostrou aumentar significativamente, utilizando um pré-tratamento, tornando-se muito promissor quanto à sua relevância como uma característica para a biorrefinaria. Métodos Material de Planta e Construção de Vetor

[0129] Para introduzir mutações bialélicas em CCR2, uma lista de 30 protoespaçadores com o motivo N19GG específico para os alelos CCR2 de álamo P. tremula x P. alba foi extraída do banco de dados Aspen (Xue e outros, 2015; Zhou e outros, 2015; http://aspendb.uga.edu/). Em seguida, os possíveis protoespaçadores foram analisados com base em sua posição nos alelos CCR2 e as possíveis regiões similares ao alvo por meio do banco de dados Aspen (Xue e outros, 2015; Zhou e outros, 2015). Além disso, os seguintes requisitos foram considerados: (i) conteúdo GC, e (ii) ausência de uma sequência TTTTT. Com base nesses parâmetros, o protoespaçador mais adequado foi escolhido: GAAAAATGTGATCATTGCGGCGG (SEQ ID NO: 64), em que o primeiro nucleotídeo foi alterado para um G (precedente a C) para atender às necessidades do promotor MtU6. A clonagem do RNA guia (gRNA) no vetor p201N-Cas9 foi feita conforme descrito precedentemente (Jacobs e outros, 2015). O p201N Cas9 (Addgene plasmid # 59175) e o pUC gRNA Shuttle (Addgene plasmid # 47024) foram um presente de Wayne Parrott (Universidade da Geórgia, Athens, Geórgia). Para a geração das linhagens ccr2 6, 7, 8, 12, 13, 14, 15 e 17, foi utilizado o vetor p201NCas9: gRNA_CCR2 resultante. Para o controle do vetor vazio, o vetor p201N-Cas9, sem quaisquer inserções, foi usado para a transformação. Os clones de expressão foram todos transferidos para Agrobacterium tumefaciens cepa C58C1 660 PMP90 por eletroporação e colônias positivas foram selecionadas por PCR. A transformação mediada por Agrobacterium de P. tremula ×

P. alba 717-1B4 foi realizada de acordo com Leplé e outros (1992).

[0130] Para a geração da linhagem ccr2 116, foi utilizado o bombardeamento biolístico. Para este fim, o DNA do plasmídeo p201NCas9: gRNA_CCR2 foi revestido em partículas de ouro (0,6 µm de diâmetro, Bio-Rad) seguindo o manual de instruções da Bio-Rad com pequenas modificações. Em resumo, sob vórtice contínuo e na seguinte ordem, 3 µg de DNA de plasmídeo (1 µg / µL), 50 µL de CaCl2 2,5 M e 1,7 µL de espermidina a 0,1 M foram adicionados a alíquotas de 50 µL de partículas de ouro (3 mg). O vórtice foi continuado por 3 minutos, seguido por centrifugação de 1 minuto a 1000 rpm em uma microcentrífuga. O sobrenadante foi removido e as microesferas foram lavadas com 250 µL de etanol a 100% antes de serem ressuspensas em 50 µL de etanol a 100%. As micropartículas revestidas com DNA foram bombardeadas em calos de álamo com 17 dias de idade. O bombardeamento biolístico foi realizado usando um sistema de bombardeamento de partículas PDS1000 / He (Bio-Rad) com uma distância alvo de 6 cm da tela de parada e uma pressão de hélio de 1100 psi. Após o bombardeamento, o tecido caloso foi transferido para meio de regeneração M3 sem agentes seletivos (Leplé e outros 1992) e descansou por 24h no escuro. Após a recuperação, o tecido foi transferido para meio de seleção M3K (500 mg / L de canamicina) e colocado a 37°C por 48 h no escuro. Após o tratamento seletivo, o tecido foi transferido para meio de regeneração M3 sem agentes seletivos. Após 6 semanas de cultivo na luz, micro-aglomerados verdes começaram a aparecer, os quais foram separados manualmente do calo-mãe e subcultivados em meio de regeneração M3 sem agentes seletivos, permitindo o desenvolvimento de brotos.

[0131] Para introduzir mutações monoalélicas em CCR2, gRNAs específicos (direcionados ao alelo CCR2 de P. tremula ou P. alba) foram selecionados com base nos critérios descritos acima. Os protoespaçadores mais adequados escolhidos no presente documento foram: GGAACAAGCTGCATGGGATA (SEQ ID NO: 66) para direcionar especificamente o alelo CCR2 de P. tremula e GTGGTATTGCTATGGAAAGG (SEQ ID NO: 67) para direcionar especificamente o alelo CCR2 de P. alba. A clonagem do gRNA no vetor p201N-Cas9, a subsequente transformação em Agrobacterium tumefaciens e transformação do álamo foram realizadas como descrito acima. Crescimento e Colheita de plantas, e a Análise da Biomassa

[0132] Todas as plantas transgênicas e seu controle de ocorrência natural foram propagadas e (primeiro) cultivadas por quatro meses em meio Murashige e Skoog (½ MS) de meia força em condições de dias longos (fotoperíodo de 16 h de luz / 8 h de escuridão, 21°C, 55% de umidade).

[0133] Em um primeiro lote de linhagens ccr2-12 e controle WT, sete linhagens ccr2 (ccr2 6, 7, 8, 13, 14, 15 e 17) com mutações bialélicas de deslocamento do quadro de leitura e um comportamento de crescimento similar foram tratadas como um grupo em comparação com controles WT. Para microscopia, caules frescos foram usados. Para a análise da parede celular, os caules colhidos foram descascados e secos durante três semanas em temperatura ambiente. Depois de crescer por quatro meses em ½ MS, as plantas foram transferidas para o solo e cultivadas por 20 semanas na estufa. Para a análise dos parâmetros de biomassa, as plantas WT (n = 10) e ccr2 12 (n = 11) foram cultivadas sob fotoperíodo de 16 h de luz / 8 h de escuridão a ± 21°C.

[0134] Quando as árvores atingiram alturas de aproximadamente 1,20 m, o pedaço do caule variando de 15 a 25 cm em relação ao fundo do caule foi colhido para ensaios de sacarificação. Nesta altura, o fenótipo do xilema vermelho foi observado nas linhagens ccr2 12. A parte basal restante do caule desenvolveu novos brotos e as árvores foram medidas semanalmente até atingirem a altura de 2 metros, após o que foi determinado o diâmetro dos caules. No final do período de crescimento, foi determinado o diâmetro dos caules. Em seguida, os caules (10 cm acima do nível do solo) foram colhidos, seguido da determinação de seus pesos fresco e seco. Para análise da parede celular e sacarificação, os 50 cm inferiores do caule colhido foram descascados, secos ao ar e moídos em um moinho de esferas.

[0135] Em um segundo lote de linhagens de ccr2 12, plantas monoalélicas CCR2 nocaute (KO) e controles WT, as plantas cultivadas in vitro foram transferidas para o solo e cultivadas por 11 semanas na estufa. Para a análise dos parâmetros de biomassa, plantas WT (n = 7), plantas CCR2 monoalélicas de P. tremula KO (n = 7), CCR2 monoalélicas de P. alba KO (n = 7) e ccr2 12 (n = 7) foram cultivadas sob um fotoperíodo de 16 h de luz / 8 h de escuridão a ± 21° C. A altura das árvores foi medida semanalmente até atingirem ± 60 centímetros de altura. No final do período de crescimento, foi determinado o diâmetro dos caules. Em seguida, os caules foram colhidos (5 cm acima do nível do solo), seguido da determinação de seus pesos fresco e seco. Para a análise de brometo de acetila, o caule colhido foi descascado, seco ao ar e moído em moinho de esferas. Microscopia de Luz e Fluorescência

[0136] Para as linhagens ccr2 e seu controle de ocorrência natural, os 4 cm inferiores foram incorporados em 7% (p / v) de agarose e fatias de 100 µm de espessura foram feitas usando um vibratome (Campden Instruments, Loughborough, Reino Unido). As seções foram fotografadas em quatro condições diferentes: (i) após incubação por 1 h em etanol 100%, (ii e iii) após incubação com reagentes de Mäule e Wiesner (conforme descrito por Sundin e outros (2014)), (iv) via autofluorescência. Para (i), (ii) e (iii), as imagens foram adquiridas usando um microscópio Zeiss Axioskop 2 com objetiva EC Plan- Neofluar 20X (0,5 seco). A autofluorescência de lignina (iv) foi fotografada usando o microscópio Zeiss LSM 780 com uma objetiva Plan-Apochromat 10X (0,45 M27). O sinal de fluorescência para lignina foi obtido usando 350 nm para excitação e o comprimento de onda de emissão variando de 407 a 479 nm. Caracterização da Parede Celular

[0137] Para determinar a quantidade de lignina e celulose, 120 mg de pó moído foram usados para preparar o resíduo da parede celular (CWR), conforme descrito precedentemente por Van Acker e outros (2013). O teor de lignina foi determinado pelo protocolo de Klason conforme descrito por De Meester e outros (2018) e o protocolo de brometo de acetila conforme descrito por Van Acker e outros (2013). Para a determinação da composição de lignina via NMR, 200 mg de material moído foram analisados conforme descrito por Oyarce e outros (2018). Para determinar a quantidade de celulose, foi utilizado o método Updegraff (Updegraff e outros, 1969). Ensaios de Sacarificação

[0138] Para medir a liberação de glicose (como % resíduo da parede celular (% CWR)), as amostras foram sacarificadas sem pré- tratamento, com pré-tratamento ácido (0,4 M H2SO4) ou com pré- tratamento alcalino (62,5 mM NaOH). A sacarificação foi realizada conforme descrito por Van Acker e outros (2016) em 10 mg de material de caule moído e seco. As medições foram realizadas após 2 h e 48 h de sacarificação de caules de ocorrência natural de 3 meses de idade e ccr2 12 (aprox. 1,2 m; Figura 5). Em um outro experimento, caules de ocorrência natural de 2 metros de altura e ccr2 12 (Figura 7) foram amostras em que a atividade da mistura de enzimas diluídas 10x foi de 0,14 FPU / mL, e para o pré-tratamento alcalino, o material do caule foi tratado com 1 mL de NaOH a 0,25% (em volume) a 90°C por 3 h enquanto sob agitação a 750 rpm. No caso do pré-tratamento ácido, o material do caule foi tratado com 1 mL de HCl a 1 M a 80° C por 2 h sob agitação a 750 rpm. Ensaios de Alimentação de Levedura

[0139] A levedura W303-1A foi transformada através do método descrito por Gietz e Woods (2006). No total, foram feitas três cepas diferentes contendo: (1) pAG426GAL: R1-ccdb-R2 (controle de vetor vazio) + pAG426GAL: 4CL, (2) pAG426GAL: 4CL + pAG426GAL: WT_P. alba _CCR2, e (3) pAG426GAL: 4CL + pAG426GAL: mutante_P. alba _CCR2. O vetor pAG426GAL foi adquirido a partir de Addgene (Plasmídeo # 14155). As sequências dos genes Malus domestica 4CL, CCR2 de P. alba WT e CCR2 mutante de P. alba, códon otimizado para levedura e flanqueado pelos sítios AttL1 e AttL2, foram clonados no vetor pEN207. Para a síntese dos vetores de expressão, os respectivos clones de entrada (pEN207-L1-4CL-L2, pEN207-L1-WT_P. alba_CCR2-L2 ou pEN207-L1-mutant_P. alba_CCR2-L2) foram clonados no vetor de destino pAG426GAL: R1-ccdb-R2 usando LR Clonase (Invitrogen).

[0140] Para a indução da cultura de levedura para expressão gênica, 5 ml de meio SD-Ura-Trp foram inoculados com a respectiva cepa e incubados durante a noite a 30°C. Após centrifugação por 5’ a 4000 rpm, o sobrenadante foi descartado. O pelete foi ressuspenso em 1 ml de água MQ estéril e centrifugado por 5’ a 4000 rpm. Após descartar o sobrenadante, o pelete foi ressuspenso em 10 ml de meio SD Gal/Raf-Ura-Trp em um tubo falcon, agitado brevemente em vórtice e incubado durante a noite a 300 rpm.

[0141] Para alimentar a levedura, 500 μl de ácido ferúlico a 20 mM ou 500 μl de coniferaldeído a 20 mM foram adicionados a cada tubo falcon e incubados por 2 dias a 30° C e 300 rpm. Em seguida, 1 mL de cada cultura de levedura foi colhido e extraído três vezes com 500 µL de acetato de etila. As amostras foram evaporadas, derivatizadas com 10 µL de piridina e 50 µL de MSTFA e carregadas no GC-MS. Listagem de Sequências:

[0142] > SEQ ID NO: 1: domínio conservado de CCR2 de Populus alba (compreendendo a assinatura de CCR e NADP e resíduos de sítio ativo do domínio FR_SDR_e como indicado nas sequências de domínio correspondentes na Figura 6; posição 99-100 em negrito) (193 aa; como do aa16 ao aa 208 da SEQ ID NO: 3)

CVTGAGGFIASWMVKLLLDKGYTVRGTARNPADPKNSHLRELEGAQ ERLTLCKADLLDYESLKEAIQGCDGVFHTASPVTDDPEEMVEPAVNG TKNVIIAAAEAKVRRVVFTSSIGAVYMDPNKGPDVVIDESCWSDLEFC KNTKNWYCYGKAVAEQAAWDMAKEKGVDLVVVNPVLVLGPLLQPT VNASIVH

[0143] Proteínas CCR2 de ocorrência natura de híbridos de P. tremula x P. alba mostram somente 1 diferença AA (negrito):

[0144] > SEQ ID NO: 2: Sequência de proteína CCR2 de Populus tremula (338 aa)

MPVDASSLSGQGQTICVTGAGGFIASWMVKLLLDKGYTVRGTARNP ADPKNSHLRELEGAQERLTLCKADLLDYESLKEAIQGCDGVFHTASP VTDDPEEMVEPAVNGTKNVIIAAAEAKVRRVVFTSSIGAVYMDPNKG PDVVIDESCWSDLEFCKNTKNWYCYGKAVAEQAAWDMAKEKGVDL VVVNPVLVLGPLLQPTVNASIVHILKYLTGSAKTYANSVQAYVHVRDV ALAHILVFETPSASGRYLCSESVLHRGEVVEILAKFFPEYPIPTKCSDE KNPRKQPYKFSNQKLRDLGFEFTPVKQCLYETVKSLQERGHLPIPKQ AAEESVKIQ

[0145] > SEQ ID NO: 3: Sequência de proteína CCR2 de Populus alba (338 aa)

MPVDASSLSGQGQTICVTGAGGFIASWMVKLLLDKGYTVRGTARNP ADPKNSHLRELEGAQERLTLCKADLLDYESLKEAIQGCDGVFHTASP VTDDPEEMVEPAVNGTKNVIIAAAEAKVRRVVFTSSIGAVYMDPNKG PDVVIDESCWSDLEFCKNTKNWYCYGKAVAEQAAWDMAKEKGVDL VVVNPVLVLGPLLQPTVNASIVHILKYLTGSAKTYANSVQAYVHVRDV ALAHILVFETPSASGRYLCSESVLHRGEVVEILAKFFPEYPIPTKCSDE KNPRKQPYKFSNQKLRDLGFEFTPVKQCLYETVKSLQERGHLPIPKQ AAEESLKIQ

[0146] Proteína CCR2 mutante alélica fraca (como presente no alelo de P.alba no ccr2 12)

[0147] >SEQ ID NO: 4: Sequência de proteína CCR2 mutante de Populus alba (337 aa)

MPVDASSLSGQGQTICVTGAGGFIASWMVKLLLDKGYTVRGTARNP ADPKNSHLRELEGAQERLTLCKADLLDYESLKEAIQGCDGVFHTASP VTDDPEEMVEPAVNGTKNVITAAEAKVRRVVFTSSIGAVYMDPNKGP DVVIDESCWSDLEFCKNTKNWYCYGKAVAEQAAWDMAKEKGVDLV VVNPVLVLGPLLQPTVNASIVHILKYLTGSAKTYANSVQAYVHVRDVA LAHILVFETPSASGRYLCSESVLHRGEVVEILAKFFPEYPIPTKCSDEK NPRKQPYKFSNQKLRDLGFEFTPVKQCLYETVKSLQERGHLPIPKQA AEESLKIQ

[0148] >SEQ ID NO: 5: Sequência de proteína CCR2 mutante de Populus tremula (337 aa)

MPVDASSLSGQGQTICVTGAGGFIASWMVKLLLDKGYTVRGTARNP ADPKNSHLRELEGAQERLTLCKADLLDYESLKEAIQGCDGVFHTASP VTDDPEEMVEPAVNGTKNVITAAEAKVRRVVFTSSIGAVYMDPNKGP DVVIDESCWSDLEFCKNTKNWYCYGKAVAEQAAWDMAKEKGVDLV VVNPVLVLGPLLQPTVNASIVHILKYLTGSAKTYANSVQAYVHVRDVA LAHILVFETPSASGRYLCSESVLHRGEVVEILAKFFPEYPIPTKCSDEK NPRKQPYKFSNQKLRDLGFEFTPVKQCLYETVKSLQERGHLPIPKQA AEESVKIQ

[0149] Sequências alélicas de CCR2 genômica de ocorrência natural de P. tremula x P. alba

[0150] > SEQ ID NO: 6: Sequência de nucleotídeos genômica de

CCR2 de P. alba [Potri.003G181400 sPta717alba_v2_gene_model.fa] (2904 bps) (gRNA sobrepondo nucleotídeos sublinhados)

GTAACATCCACTTTTTAAGCCAAGATAAGAAGAAAAGACATCTCCT CTCCTCTTTCTCCCTGTCTGTTCTCCACTTTCCCAGTCACCAAACT CGTATACATATAATTACATTTGTCCAAATATAACAACATGCCGGTT GATGCTTCATCTCTTTCAGGCCAAGGCCAAACTATCTGTGTCACC GGGGCTGGTGGTTTCATTGCTTCTTGGATGGTTAAACTTCTTTTAG ATAAAGGTTACACTGTTAGAGGAACTGCGAGGAACCCAGGTTAGT TTATGGTACTTAAGCACTTTTTTTTTAAAAGATTGTGTTGTTTAATTA ATTCAATGGTAGTAGTAATGTTTATGGGTTGTTTTTCTGTTCTTATA TATAAATATATACAGCTGATCCCAAGAATTCTCATTTGAGGGAGCT TGAAGGAGCTCAAGAAAGATTAACTTTATGCAAAGCTGATCTTCTT GATTATGAGTCTCTTAAAGAGGCTATTCAAGGGTGTGATGGTGTTT TCCACACTGCTTCTCCCGTCACAGATGATCCGGTATGCTTCCCTTT TCCCTTTGTTTTCCAGTCATTAAAAGATTTGGATCTGAGAATACTAT CAAGAAAATAAAATAAAATAAAAAACTCACACAGCTAATTTTAGCAC AAATGTCACTAACTCACGGTAGGCTTGACCGTTCTGCACCAACAA ATTCACTTTGTAGTTGGTGGGTGGAGGGATCAGTTGGGGCCCACC CCACCTAAAACTTTCGGCAGTGGAATTTCTAATTATAGACGGGTCA CTCGAAATTAATAAAAATATTACACGGTAATTAATGGTGGTGGTTTT GATGAGATGCTTTTCTTGACAATAATTAAAGGAAGAAATGGTGGAG CCAGCAGTGAACGGGACCAAAAATGTGATCATTGCGGCGGCTGA GGCCAAAGTCCGACGAGTGGTGTTCACGTCCTCAATTGGTGCTGT GTACATGGATCCCAATAAGGGCCCAGATGTTGTCATTGATGAATC TTGCTGGAGTGATCTTGAATTCTGCAAGAACACCAAGGTATCTAAT TAATTAAATGCCAAGTTTTCCTTCTTGTGGACCAGTCATATTTCCTA GCTAACACCTGAACCAATAAATGCTGTGCAATTGAGATGTCAAAGA ACTTTCATGTATATTTCTTAGACATTTGGCAGGTATAGCTTGCCCG TTCTGTGTTAAGTTGCCTTATTATAATTGAAAATTCACTTAACAAAA AATTGAACGAGTCACATCTTTTCTAACCCCGTTCTGGTAGCTTTCC ATTGATTCGATTCATACCTAACCTGAGAGTAATGGATTGAAATGAA ATGGAATTGCAGAATTGGTATTGCTATGGAAAGGCGGTGGCAGAA CAAGCTGCGTGGGATATGGCTAAGGAGAAAGGGGTGGACCTAGT GGTGGTTAACCCAGTGCTGGTGCTCGGACCATTGTTGCAGCCCA CTGTCAATGCTAGCATCGTTCACATCCTCAAGTACCTCACCGGCT CAGCCAAGACATATGCTAACTCTGTTCAAGCTTATGTGCATGTTAG GGATGTGGCACTAGCCCACATTTTAGTCTTTGAGACGCCTTCCGC CTCCGGCCGTTACCTTTGCTCTGAGAGCGTTCTCCACCGTGGAGA GGTGGTGGAAATCCTTGCAAAGTTCTTCCCCGAGTACCCCATCCC TACCAAGTAAGTAATTATTATTTTGAAGAATTTCATGGAGTAATTAC TCAATAAAAGGGTAGTTGGCCGAGTAACAGGCGACACAAATGCAT TAAACGTTAGGACATGCACTTATGATTAGTCACTCAAAAAAACTAC CATCAAAATTGAAAGAAAACCTGGGAATGGCATTTTGAAAATGGCA AAACAAATAAATATGATCCTGCTTTTGAATGACCCAAAGGATGAAA TTGTGGTGTGCGGCGGTTGTTGTACCAGCTTTGACTTGTATTAATC CGAACCAAAAATCAATGAACAATCCATTCTCCTATGAGTCCTCACC AACCCCATTGTCTGGCAAGTCGGGACCAAAATGAGTTTCTCTACC AACCCAAGTTATGATTGGACACTGCACAAAATTATTGGAAGAGTAT TGGGCCCGCCCTGCTCCTTCATCTCATACAATTATATGCTAAATTC ATCTCTCTAAATGTGATTTGCTCAAGATTAGACAAGTGGAAGGAAT ATTCCTAGTTGGTTTGCTACTTGCTAGGTCATAAGAAACAGTTTTG TAATGTATTTGCAGGTGCTCAGATGAGAAGAACCCAAGAAAACAA CCTTACAAGTTCTCAAACCAGAAGCTAAGGGATCTGGGCTTCGAA TTCACACCAGTGAAGCAGTGTCTGTATGAAACTGTTAAGAGCTTG CAGGAAAGGGGTCACCTTCCAATCCCAAAACAAGCTGCAGAAGAG TCTCTGAAGATTCAATAAGGCCTCTTGGAACTATTTATTAGGATAC ATTTCCATATCCCAAGTTTGGATCGCAAATGCTAGGGAAAAGAGCT TATTAAAGAATGTCAATGTGCAGGTGTTTTAGTATTTTACATGAAGA ACTCTGATTATCCTTGTGTTTATATTAATTTTCTTCAAGTGAGTGTC TTACACTTGTATTCGTGGCTGTCTAAGTTTATCCAATTTCAATATCG AAGAGGAACAGTTCTATGTCTTACACAAGAGCATCAACTTTGACCA CACAACTGGCATATGCTTTATTCAATTTAATTGGAGACCTTAACCT ACATGATAGGTACGCAAATTTCAATCAAGGGAATCCACCAGATATG ATGTTGACGCCATGTATAATCAGAAGATGATTGTATGTTGGTGGAA TAATCATCCTTGTGATATTCAAGTAAGAAAACAAACTCAACAACTAT TTAAATAAATAAAAAA

[0151] > SEQ ID NO: 7: Sequência de nucleotídeos genômica de CCR2 de P. tremula [Potri.003G181400 sPta717tremula_v2_gene_model.fa] (2894 bps) (gRNA sobrepondo nucleotídeos sublinhados)

GTAACATCCACTTTTTAAGCCAAGATAAGAAGAAAAGACATCTCCT CTCCTCTCTCTTTCTGTCTGTTCTCCACTTTCCCAGTCACCAAACT CGTAAACATATAATTACATTTATCCAAATATAACAACATGCCTGTTG ATGCTTCATCACTTTCAGGCCAAGGCCAAACTATCTGTGTCACCG GGGCTGGTGGTTTCATTGCTTCTTGGATGGTTAAACTTCTTTTAGA TAAAGGTTACACTGTTAGAGGAACTGCGAGGAACCCAGGTTAGTT AATGGTACTTAAGCACTTTTTTTAAAAGATTGTGTTGTTTAATTAAT TCAATGGTAGTAGTAATGTTATGGGTTGTTTTTCTGTTCTTATATAT AAATATATACAGCTGATCCCAAGAATTCTCATTTGAGGGAGCTTGA AGGAGCTCAAGAAAGATTAACTTTATGCAAAGCTGATCTTCTTGAT TATGAGTCTCTTAAAGAGGCTATTCAAGGGTGTGATGGTGTTTTCC ACACTGCTTCTCCTGTCACAGATGATCCGGTATGCTTCCTTTTTCC CTTTGCTTTCCAGTCATTAAAAGATTTGGATCTGAGAATATCAAGA AAAAAAATAATCAAAATAAACTCACACAGCTTATTTTAGCACACATG TCACTAACTCACGGTAGGCTTGACCGTTCTGCACCAACAAATTCA CTTTGTAGTTGGTGGGTGGAGGGATCAATTGGGGCCCACCCCAC CTAAAACTTTCGGCAGTGAAATTTCTAATTATAGACGGGTCACTCG AAATTAATAAAATATTACATGGTAATTAATGGTGGTGGTTTTGATGA GATGCTTTTGTTGACAATAATTAAAGGAAGAAATGGTGGAGCCAG CAGTGAACGGGACCAAAAATGTGATCATTGCGGCGGCTGAGGCC AAAGTCCGACGAGTGGTGTTCACGTCCTCAATTGGTGCTGTGTAC ATGGATCCCAATAAGGGCCCAGATGTTGTCATTGATGAATCTTGCT GGAGTGATCTTGAATTCTGCAAGAACACCAAGGTATCTAATTAATT AAATGCCAAGTTTTCCTTCTTGTCGACTAGTCATATTTTCCAAGCTA ACACCTGAACCAATAAATGCTGTGCAATTGAGATGTCAAAGAATTT TCATACATATTTCTTAGACATTTGGTAGGTATAGCTAACCCGTTCTT TGTCAAGTTGCCTTATTATAATTGAAAATTCACTTTAAAAAAAAATC AACGAGTTGCATCTTATCTAACCCCGTTCTGGTAGCTGTCCATTGA TTCGATTCATACCTAACCTGAGAGTAATGGATTGAAATGAAATGGA ATTGCAGAATTGGTATTGCTATGGAAAGGCTGTGGCAGAACAAGC TGCATGGGATATGGCTAAGGAGAAAGGGGTGGACCTAGTGGTGG TTAACCCAGTGCTGGTGCTCGGACCATTGTTGCAGCCCACTGTCA ATGCTAGCATCGTTCACATCCTCAAGTACCTCACCGGCTCAGCCA AGACATATGCTAACTCTGTTCAAGCTTATGTGCATGTTAGGGATGT GGCACTAGCCCACATTTTAGTCTTTGAGACGCCTTCCGCCTCCGG CCGTTACCTCTGCTCTGAGAGCGTTCTCCACCGTGGAGAGGTGGT GGAAATCCTTGCAAAGTTCTTCCCCGAGTACCCCATCCCTACCAA GTAAGTAACTATTATTTTGAAGAATTTCATGGAGTAATTACTCAATA AAAGGGTAGTTGACCGAGTAACAGGCGACACAAATGCATTAAACG TTAGGACATGCACTTATGATTAGTCACTCAAAAAAACTACAATCAA AATTGAAAGAAAACCTGGGAATGGCATTTTGAAAATGGCGAAACA AATAAATATGATCCCGCTTTTGAATGACCCAAAGGATGAAATTGTG GTGTGCGGCGGTTGTTGTACCAGCTTTGACTTGTATTAATCTGAAC CAAAAATCATGAACAATCCATTCTCCTATGAGTCCTCACCAACCCC ATTGTCTGCCAAGTCGGGACCAAAATGAGTTTCTCTACCAACCCA AGTTATGATTGGACACTGCACAAAATTATTGGAAGAGTATTGGGCC CGCCCTGCTCCTTCATCTCATACAATTATATGCTAAATTCATCTCTC TAAATGTGATTTGCTCAAGATTAGACAAGTGGAAGGAATATTCCTA GTTGGGTTGCTACTTGCTAGGTCATAAGAAACAGTTCTGTAATGTA TTTGCAGGTGCTCAGATGAGAAGAACCCAAGAAAACAACCTTACA AGTTCTCAAACCAGAAGCTAAGGGATCTGGGCTTCGAATTCACAC CAGTGAAGCAGTGTCTGTATGAAACTGTTAAGAGCTTGCAGGAAA GGGGTCACCTTCCAATCCCAAAACAAGCTGCAGAAGAGTCTGTGA AGATTCAATAAGGCCTCTTGGAACTATTTATTAGGATACAGTTCCA TACCCCAAGTTTGGATCGCAAATGCTAGGGAAAAGAGCTTATTAAA GAATGTCAATGTGCAGGTGTTTTAGTATTTTACATGAAGAACTCTG ATTATCCTTGTGCTTATATTAATTTTCTTCAAGTGAGTGTCTTACAC TTGTATTTGTGGTTGTCTAAGTTTATCCAATTTCAATATCAAAGAGG AACAGTTCTATGTCTTACACAAGAGCATCAACATTGACCACACAAC TGGCATATGCTTTATTCAATTTAATTGGAGACCTTAACCTACATGAT AGGTACGCAAATTTCAATCAAGGGAATCCACCAGATATGATGTTGA CGCCATGTATAATCAGAAGATGATTGTATATTGGTGGAATAATCAT CCTTGTGATATTCAAGTAAGAAAACAAACTCAACAACTATTTAAATA AATAAA

[0152] Conforme mostrado no alinhamento da Figura 6, as sequências de aminoácidos das proteínas CCR de uma série de espécies de plantas são fornecidas no presente documento:

[0153] > SEQ ID NO: 8: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Isatis tinctoria (ADC40029)

[0154] > SEQ ID NO: 9: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Arabidopsis thaliana (NP_173047)

[0155] > SEQ ID NO: 10: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Brassica napus (AEK27166)

[0156] > SEQ ID NO: 11: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Pinus taeda (AAL47684)

[0157] > SEQ ID NO: 12: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Pinus massoniana (ACE76870)

[0158] > SEQ ID NO: 13: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Picea abies (CAK18610)

[0159] > SEQ ID NO: 14: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Leucaena leucocephala (ABL01801.3)

[0160] > SEQ ID NO: 15: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Leucaena leucocephala (EU195224)

[0161] > SEQ ID NO: 16: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Eucalyptus saligna (AF297877_1)

[0162] > SEQ ID NO: 17: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Eucalyptus urophylla (CBG37721)

[0163] > SEQ ID NO: 18: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Eucalyptus cordata (AAT74875)

[0164] > SEQ ID NO: 19: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Eucalyptus gunnii (CAA56103)

[0165] > SEQ ID NO: 20: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Eucalyptus globulus (AAT74876)

[0166] > SEQ ID NO: 21: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Eucalyptus pilularis (ACZ59064)

[0167] > SEQ ID NO: 22: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Populus trichocarpa (CAC07424)

[0168] > SEQ ID NO: 23: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Populus tomentosa (ACE95172)

[0169] > SEQ ID NO: 24: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Hevea brasiliensis (ADU64758)

[0170] > SEQ ID NO: 25: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Gossypium hirsutum (ACQ59094)

[0171] > SEQ ID NO: 26: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Hibiscus cannabinus (ADK24219)

[0172] > SEQ ID NO: 27: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Betula luminifera (ACJ38670)

[0173] > SEQ ID NO: 28: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Solanum lycopersicum (AAY41879)

[0174] > SEQ ID NO: 29: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Solanum tuberosum (AAN71761)

[0175] > SEQ ID NO: 30: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Codonopsis lanceolate (BAE48787)

[0176] > SEQ ID NO: 31: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Vaccinium corymbosum (ACI14382)

[0177] > SEQ ID NO: 32: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Fragaria x ananassa (AAP46143)

[0178] > SEQ ID NO: 33: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Hordeum vulgare (AAN71760)

[0179] > SEQ ID NO: 34: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Triticum aestivum (ABE01883)

[0180] > SEQ ID NO: 35: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Saccharum officinarum (CAA13176)

[0181] > SEQ ID NO: 36: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Zea Mays (ACG33996)

[0182] > SEQ ID NO: 37: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Panicum virgatum (ACZ74584)

[0183] > SEQ ID NO: 38: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Cenchrus purpureus (ADY39751)

[0184] > SEQ ID NO: 39: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Camellia oleifera (ACQ41893)

[0185] > SEQ ID NO: 40: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Acacia auriculiformis x Acacia mangium (ADQ53455)

[0186] > SEQ ID NO: 41: sequência de aminoácidos de CCR a partir de Jatropha curcas (ACS32301)

[0187] Como mostrado na Tabela 1, várias linhagens ccr mutantes foram obtidas após a edição de álamo híbrido de P. alba x P. tremula, usando a sequência de gRNA (sublinhada na Tabela 1 e em SEQ ID NO: 6 e 7, que representam as sequências genômicas de CCR2 de P. alba e P. tremula, resp.). As SEQ ID Nos (SEQ ID NO: 42-57)

correspondentes às sequências de nucleotídeos de ambos os alelos mutantes de ccr2 como presentes nas linhagens ccr2 mutantes de álamo da Tabela 1 são indicadas na Tabela 1, e substituindo os nucleotídeos 880-916 na SEQ ID NO: 6, e / ou substituindo os nucleotídeos 873-909 na SEQ ID NO: 7, e / ou as sequências da SEQ ID NO: 58-59.

[0188] Como mostrado na Tabela 6, várias linhagens ccr mutantes monoalélicas ko foram obtidas após a edição de álamo híbrido de P. alba x P. tremula, usando a sequência de gRNA (sublinhada na Tabela 6 em SEQ ID NO: 68 e 78). As SEQ ID NOs (SEQ ID NO: 70-76) correspondentes às sequências de nucleotídeos dos alelos mutantes de P. alba ko de ccr2 como presentes nas linhagens ccr2 mutantes de álamo da Tabela 6 são indicadas, e substituindo os nucleotídeos 1349- 1371 em SEQ ID NO: 6). As SEQ ID NOs 79-85 correspondentes às sequências de nucleotídeos dos alelos mutantes de ccr2 de P. tremula ko como presentes nas linhagens ccr2 mutantes de álamo da Tabela 6 são indicadas, e substituindo os nucleotídeos 1370-1392 na SEQ ID NO:

7.

[0189] Como mostrado na Tabela 7, as linhagens ccr mutantes bialélicas foram obtidas após a edição de álamo híbrido de P. alba x P. tremula, usando a sequência de gRNA (sublinhada na Tabela 7). As SEQ ID NOs: 88-89 correspondentes às sequências de nucleotídeos de ambos os alelos mutantes de ccr2 como presentes na linhagem ccr2 mutante de álamo T2_1 da Tabela 6 são indicadas, e substituindo os nucleotídeos 1376-1398 na SEQ ID NO: 6, e substituindo os nucleotídeos 1369-1391 na SEQ ID NO: 7.

[0190] Como mostrado na Tabela 10, a linhagem ccr2 116 bialélica mutante foi obtida após a edição de álamo híbrido de P. alba x P. tremula, usando a sequência de gRNA (sublinhada na Tabela 10). As SEQ ID NOs: 91-92 correspondentes às sequências de nucleotídeos de ambos os alelos mutantes da linhagem ccr2 116 da Tabela 10 são indicadas, e substituindo os nucleotídeos 865-932 na SEQ ID NO: 6, e substituindo os nucleotídeos 859-925 na SEQ ID NO: 7.

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Claims (16)

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ácido nucleico codificando uma proteína de planta mutante cinamoil-coA redutase (CCR) que é mutada no domínio conservado representado na SEQ ID NO: 1, ou em um domínio conservado de pelo menos 50% de identidade de aminoácidos com a SEQ ID NO: 1, caracterizada pelo fato de que a mutação compreende uma deleção de pelo menos um aminoácido da(s) posição(ões) 98 a 100 do dito domínio conservado conforme representado na SEQ ID NO: 1 ou em um domínio conservado de pelo menos 50% de identidade de aminoácidos com a SEQ ID NO: 1.

2. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o resíduo de aminoácido da posição 98, 99 ou 100, conforme representado na SEQ ID NO: 1, ou em um domínio conservado de pelo menos 50% de identidade de aminoácido com a SEQ ID NO: 1, é deletado.

3. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a dita proteína CCR de planta mutante codificada compreende adicionalmente uma substituição do resíduo de aminoácido na posição 99 ou 100 do dito domínio representado na SEQ ID NO: 1, ou do dito domínio conservado de pelo menos 50% de identidade de aminoácidos com a SEQ ID NO: 1.

4. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a dita substituição do resíduo na posição 99 ou 100 é um resíduo de aminoácido polar.

5. Vetor de expressão, compreendendo a molécula de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é para expressão em uma célula de planta.

6. Proteína CCR de planta mutante, caracterizada pelo fato de que é codificada pela molécula de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou pelo vetor de expressão como definido na reivindicação 5.

7. Planta sem proteína CCR funcional de ocorrência natural, compreendendo ainda a molécula de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, o vetor como definido na reivindicação 5, ou a proteína CCR de planta mutante como definida na reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o crescimento da planta é pelo menos comparável a uma planta de controle.

8. Planta com pelo menos um alelo ccr nocaute, compreendendo ainda a molécula de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, o vetor como definido na reivindicação 5, ou a proteína CCR de planta mutante como definida na reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o crescimento da planta é pelo menos comparável a uma planta de controle.

9. Planta, de acordo com a reivindicações 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que as quantidades de lignina são menores em comparação com uma planta de controle.

10. Planta, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo fato de que a eficiência de sacarificação é maior em comparação com uma planta de controle.

11. Planta, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizada pelo fato de que a dita planta é uma cultura, uma planta de cereal, ou uma planta lenhosa.

12. Semente ou célula de planta, caracterizada pelo fato de que é derivada da planta como definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 11.

13. Método para produzir uma planta com crescimento restaurado e uma característica de lignina, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. introduzir a molécula de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, o vetor de expressão como definido na reivindicação 5 ou a proteína CCR de planta mutante como definida na reivindicação 6, na dita planta com crescimento anormal ou em suas células de planta; e b. incubar e isolar uma planta regenerada a partir da dita planta, e c. identificar as plantas com crescimento normal restaurado.

14. Método para identificar proteínas de biossíntese de lignina de plantas mutantes capazes de restaurar o crescimento em uma planta anã, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. introduzir uma mutação em uma planta que tem pelo menos um alelo nocaute em um gene de biossíntese de lignina, de modo a induzir pelo menos uma mutação em um segundo alelo do dito gene de biossíntese de lignina da dita planta, b. triar as plantas com fenótipo de crescimento normal, c. identificar a natureza da mutação no dito alelo de biossíntese de lignina mutante da planta.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o gene de biossíntese de lignina é CCR.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que a mutação na etapa a) é introduzida via edição de gene.