BR112020019496A2

BR112020019496A2 - Método para expandir linfócitos infiltrando os tumores, população de linfócitos infiltrando os tumores, composição de crioconservação, e, bolsas de infusão e de armazenamento

Info

Publication number: BR112020019496A2
Application number: BR112020019496-4A
Authority: BR
Inventors: Seth Wardell; James Bender
Original assignee: Iovance Biotherapeutics, Inc.
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2021-01-12
Also published as: EP4386080A2; IL277592A; EP3775165A1; SG11202009170UA; MX2020010264A; AU2018415814A1; KR20200138329A; EA202092319A1; CA3094957A1; CN112513254A; WO2019190579A1; EP3775165B1

Abstract

a presente invenção provê métodos melhorados e/ou encurtados para expandir tils e produzir populações terapêuticas de tils, incluindo novos métodos para expansão de populações de til em um sistema fechado que levam a eficácia melhorada, fenótipo melhorado, e aumentada saúde metabólica dos tils em um período de tempo mais curto, enquanto permitindo uma contaminação microbiana reduzida, assim como custos diminuídos. tais tils encontram uso em regimes de tratamento terapêutico.

Description

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MÉTODO PARA EXPANDIR LINFÓCITOS INFILTRANDO OS TUMORES, POPULAÇÃO DE LINFÓCITOS INFILTRANDO OS TUMORES, COMPOSIÇÃO DE CRIOCONSERVAÇÃO, E, BOLSAS DE INFUSÃO E DE ARMAZENAMENTO REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade para Pedido de Patente US No. 15/940.901, depositado em 29 de março de 2018, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Tratamento de cânceres refratários e volumosos usando transferência adoptiva de linfócitos infiltrando os tumores (TILs) representa uma abordagem poderosa para terapia para pacientes com prognósticos ruins. Gattinoni, et al., Nat. Rev. Imunol. 2006, 6, 383-393. Um grande número de TILs são requeridos para uma imunoterapia de sucesso, e um processo robusto e confiável é necessário para comercialização. Isto tem sido um desafio a alcançar devido a questões técnicas, logísticas e regulatórias com a expansão celular. Expansão de TILs com base em IL-2 seguido por um “processo de expansão rápida” (REP) se tornou um método preferido para expansão de TILs devido à sua velocidade e eficiência. Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39; Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41; Dudley, et al., J. Imunother. 2003, 26, 332-42. REP pode resultar em uma expansão de 1.000 vezes de TILs durante um período de 14 dias, embora requeira um grande excesso (por exemplo, 200 vezes) de células mononucleares de sangue periférico irradiadas alogênicas (PBMCs, também conhecidas como células mononucleares (MNCs)), com frequência de múltiplos doadores, como células alimentadoras, assim como anticorpo anti- CD3 (OKT3) e altas doses de IL-2. Dudley, et al., J. Imunother. 2003, 26, 332-42. TILs que tinham sofrido um procedimento REP produziram terapia

2 / 557 com célula adotiva com sucesso, após a imunossupressão do hospedeiro em pacientes com melanoma. Os parâmetros de aceitação de infusão atuais em leituras da composição de TILs (por exemplo, positividade para CD28, CD8, ou CD4) e em expansão em vezes e viabilidade do produto REP.

[003] Os atuais processos de fabricação de TILs são limitados por comprimento, custo, preocupações de esterilidade e outros fatores aqui descritos, de modo que o potencial de comercializar tais processos é severamente limitado e, por essas e outras razões, no presente momento, nenhum processo comercial se tornou disponível. Existe uma necessidade urgente de prover processos de fabricação de TILs e terapias com base nesses processos que sejam apropriados para fabricação em escala comercial e aprovação regulatória para uso em pacientes humanos em vários centros clínicos.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[004] A presente invenção provê métodos melhorados e/ou encurtados para expandir TILs e produzir populações terapêuticas de TILs.

[005] A presente invenção provê um método para expandir linfócitos infiltrando os tumores (TILs) em uma população terapêutica de TILs compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs a partir de um tumor resseccionado de um paciente por processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em fragmentos múltiplos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor em um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2 e opcionalmente OKT-3 para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3-14 dias para obter a segunda população de TILs,

3 / 557 em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura do sistema; (d) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, opcionalmente OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7-14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; (e) coletar a população terapêutica de TILs obtida a partir da etapa (d), em que a transição de etapa (d) para etapa (e) ocorre sem abertura do sistema; e (f) transferir a população de TILs coletada da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (e) a (f) ocorre sem abertura do sistema.

[006] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a etapa de crioconservar a bolsa de infusão compreendendo a população de TILs coletada em etapa (f) usando um processo de crioconservação.

[007] Em algumas modalidades, o processo de crioconservação é realizado usando uma razão 1:1 de população de TILs coletada para o meio de crioconservação.

[008] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos são células mononucleares de sangue periférico (PBMCs). Em algumas modalidades, as PBMCs são irradiadas e alogênicas. Em algumas modalidades, as PBMCs são adicionadas à cultura celular em qualquer um de

4 / 557 dias 9 até 14 em etapa (d). Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos são células apresentadoras de antígenos artificiais.

[009] Em algumas modalidades, a coleta em etapa (e) é realizada usando um sistema de processamento de células à base de membrana.

[0010] Em algumas modalidades, a coleta em etapa (e) é realizada usando um sistema de processamento de células LOVO.

[0011] Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 4 a cerca de 50 fragmentos, em que cada fragmento tem um volume de cerca de 27 mm3.

[0012] Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 30 a cerca de 60 fragmentos com um volume total de cerca de 1300 mm3 a cerca de 1500 mm3.

[0013] Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 50 fragmentos com um volume total de cerca de 1350 mm3.

[0014] Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 50 fragmentos com uma massa total de cerca de 1 grama a cerca de 1,5 gramas.

[0015] Em algumas modalidades, o meio de cultura celular é provido em um recipiente selecionado a partir do grupo consistindo em um recipiente G e um Xuri cellbag.

[0016] Em algumas modalidades, o meio de cultura celular em etapa (d) compreende adicionalmente IL-15 e/ou IL-21.

[0017] Em algumas modalidades, a concentração de IL-2 é cerca de

10.000 IU/mL a cerca de 5.000 IU/mL.

[0018] Em algumas modalidades, a concentração de IL-15 é cerca de 500 IU/mL a cerca de 100 IU/mL.

[0019] Em algumas modalidades, a concentração de IL-21 é cerca de

5 / 557 20 IU/mL a cerca de 0,5 IU/mL.

[0020] Em algumas modalidades, a bolsa de infusão em etapa (f) é uma bolsa de infusão contendo HypoThermosol.

[0021] Em algumas modalidades, o meio de crioconservação compreende dimetil sulfóxido (DMSO). Em algumas modalidades, o meio de crioconservação compreende 7% a 10% dimetil sulfóxido (DMSO).

[0022] Em algumas modalidades, o primeiro período em etapa (c) e o segundo período em etapa (e) são cada individualmente realizados dentro de um período de 10 dias, 11 dias, ou 12 dias.

[0023] Em algumas modalidades, o primeiro período em etapa (c) e o segundo período em etapa (e) são cada individualmente realizados dentro de um período de 11 dias.

[0024] Em algumas modalidades, etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 22 dias.

[0025] Em algumas modalidades, etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 20 dias a cerca de 22 dias.

[0026] Em algumas modalidades, etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 15 dias a cerca de 20 dias.

[0027] Em algumas modalidades, etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 20 dias.

[0028] Em algumas modalidades, etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 15 dias.

[0029] Em algumas modalidades, etapas (a) até (f) são realizadas em 22 dias ou menos.

[0030] Em algumas modalidades, etapas (a) até (f) são realizadas em 20 dias ou menos.

[0031] Em algumas modalidades, etapas (a) até (f) são realizadas em 15 dias ou menos.

[0032] Em algumas modalidades, etapas (a) até (f) são realizadas em

6 / 557 10 dias ou menos.

[0033] Em algumas modalidades, etapas (a) até (f) e crioconservação são realizadas em 22 dias ou menos.

[0034] Em algumas modalidades, a população terapêutica de TILs coletados em etapa (e) compreende TILs suficientes para uma dosagem terapeuticamente eficaz dos TILs.

[0035] Em algumas modalidades, o número de TILs suficientes para uma dosagem terapeuticamente eficaz é de cerca de 2,3×1010 a cerca de 13,7×1010.

[0036] Em algumas modalidades, etapas (b) até (e) são realizadas em um recipiente único, em que realização das etapas (b) até (e) em um recipiente único resulta em um aumento em rendimento de TILs por tumor resseccionado como comparado com realização das etapas (b) até (e) em mais do que um recipiente.

[0037] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos são adicionadas aos TILs durante o segundo período em etapa (d) sem abertura do sistema.

[0038] Em algumas modalidades, a terceira população de TILs em etapa (d) proporciona eficácia aumentada, produção aumentada de interferon- gama, policlonalidade aumentada, IP-10 médio aumentado, e/ou MCP-1 médio aumentado quando administrados a um indivíduo.

[0039] Em algumas modalidades, a terceira população de TILs em etapa (d) provê pelo menos uma produção de cinco vezes ou mais de interferon-gama quando administrados a um indivíduo.

[0040] Em algumas modalidades, a terceira população de TILs em etapa (d) é uma população terapêutica de TILs que compreende uma subpopulação aumentada de células T efetoras e/ou células T de memória central com relação à segunda população de TILs, em que as células T efetoras e/ou células T de memória central na população terapêutica de TILs

7 / 557 exibem uma ou mais características selecionadas a partir do grupo consistindo em expressão de CD27+, expressão de CD28+, telômeros mais longos, expressão aumentada de CD57, e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras, e/ou células T de memória central obtidas a partir da segunda população de células.

[0041] Em algumas modalidades, as células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas a partir da terceira população de TILs exibem expressão aumentada de CD57 e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas a partir da segunda população de células.

[0042] Em algumas modalidades, o risco de contaminação microbiana é reduzido como comparado com um sistema aberto.

[0043] Em algumas modalidades, os TILs da etapa (g) são infundidos em um paciente.

[0044] Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 4 fragmentos.

[0045] A presente invenção também provê um método para tratar um indivíduo com câncer, o método compreendendo administrar linfócitos infiltrando os tumores expandidos (TILs) compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs a partir de um tumor resseccionado de um indivíduo por processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em fragmentos múltiplos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor em um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2 e opcionalmente OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3-14 dias para obter a segunda população de TILs,

8 / 557 em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura do sistema; (d) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, opcionalmente OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7-14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; (e) coletar a população terapêutica de TILs obtida a partir da etapa (d), em que a transição de etapa (d) para etapa (e) ocorre sem abertura do sistema; e (f) transferir a população de TILs coletada da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (e) a (f) ocorre sem abertura do sistema; (g) opcionalmente crioconservar a bolsa de infusão compreendendo a população de TILs coletada da etapa (f) usando um processo de crioconservação; e (h) administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz da terceira população de TILs da bolsa de infusão em etapa (g) para o paciente.

[0046] Em algumas modalidades, a população terapêutica de TILs coletados em etapa (e) compreende TILs suficientes para administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz dos TILs em etapa (h).

[0047] Em algumas modalidades, o número de TILs suficientes para administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz em etapa (h) é de cerca de 2,3×1010 a cerca de 13,7×1010.

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[0048] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos (APCs) são PBMCs.

[0049] Em algumas modalidades, as PBMCs são adicionadas à cultura celular em qualquer um de dias 9 até 14 em etapa (d).

[0050] Em algumas modalidades, antes de administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz de células de TIL em etapa (h), um regime de linfodepleção não mieloablativo foi administrado ao paciente.

[0051] Em algumas modalidades, o regime de linfodepleção não mieloablativo compreende as etapas de administração de ciclofosfamida a uma dose de 60 mg/m2/dia durante dois dias seguido por administração de fludarabina a uma dose de 25 mg/m2/dia durante cinco dias.

[0052] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a etapa de tratar o paciente com um regime de IL-2 em dose elevada começando no dia após administração das células de TIL ao paciente em etapa (h).

[0053] Em algumas modalidades, o regime de IL-2 em dose elevada compreende 600.000 ou 720.000 IU/kg administrados como uma infusão intravenosa de bolus de 15 minutos a cada oito horas até tolerância.

[0054] Em algumas modalidades, a terceira população de TILs em etapa (d) é uma população terapêutica de TILs que compreende uma subpopulação aumentada de células T efetoras e/ou células T de memória central com relação à segunda população de TILs, em que as células T efetoras e/ou células T de memória central na população terapêutica de TILs exibem uma ou mais características selecionadas a partir do grupo consistindo em expressão de CD27+, expressão de CD28+, telômeros mais longos, expressão aumentada de CD57, e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras, e/ou células T de memória central obtidas a partir da segunda população de células.

[0055] Em algumas modalidades, as células T efetoras e/ou células T

10 / 557 de memória central na população terapêutica de TILs exibem expressão aumentada de CD57 e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas a partir da segunda população de células.

[0056] Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir do grupo consistindo em melanoma, câncer ovariano, câncer cervical, câncer de pulmão não de célula pequena (NSCLC), câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer causado por vírus de papiloma humano, câncer de cabeça e pescoço (incluindo carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço (HNSCC)), câncer renal, e carcinoma de célula renal.

[0057] Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir do grupo consistindo em melanoma, HNSCC, câncer cervical, e NSCLC.

[0058] Em algumas modalidades, o câncer é melanoma.

[0059] Em algumas modalidades, o câncer é HNSCC.

[0060] Em algumas modalidades, o câncer é um câncer cervical.

[0061] Em algumas modalidades, o câncer é NSCLC.

[0062] A presente invenção também provê métodos para expandir linfócitos infiltrando os tumores (TILs) em uma população terapêutica de TILs compreendendo: (a) adicionar fragmentos processados de tumor a partir de um tumor resseccionado de um paciente em um sistema fechado para obter uma primeira população de TILs; (b) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2 e opcionalmente OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3-14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em

11 / 557 número do que a primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (a) para etapa (b) ocorre sem abertura do sistema; (c) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, opcionalmente OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7-14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura do sistema; (d) coletar a população terapêutica de TILs obtida a partir da etapa (c), em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; e (e) transferir a população de TILs coletada da etapa (d) para uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (d) a (e) ocorre sem abertura do sistema.

[0063] Em algumas modalidades, a população terapêutica de TILs coletados em etapa (d) compreende TILs suficientes para uma dosagem terapeuticamente eficaz dos TILs.

[0064] Em algumas modalidades, o número de TILs suficientes para uma dosagem terapeuticamente eficaz é de cerca de 2,3×1010 a cerca de 13,7×1010.

[0065] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a etapa de crioconservar a bolsa de infusão compreendendo a população de TILs coletada usando um processo de crioconservação.

[0066] Em algumas modalidades, o processo de crioconservação é realizado usando uma razão 1:1 de população de TILs coletada para o meio de crioconservação.

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[0067] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos são células mononucleares de sangue periférico (PBMCs).

[0068] Em algumas modalidades, as PBMCs são irradiadas e alogênicas.

[0069] Método de acordo com a reivindicação 68, em que as PBMCs são adicionadas à cultura celular em qualquer um de dias 9 até 14 em etapa (c).

[0070] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos são células apresentadoras de antígenos artificiais.

[0071] Em algumas modalidades, a coleta em etapa (d) é realizada usando um sistema LOVO de processamento de Células.

[0072] Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 4 a cerca de 50 fragmentos, em que cada fragmento tem um volume de cerca de 27 mm3.

[0073] Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 30 a cerca de 60 fragmentos com um volume total de cerca de 1300 mm3 a cerca de 1500 mm3.

[0074] Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 50 fragmentos com um volume total de cerca de 1350 mm3.

[0075] Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 50 fragmentos com uma massa total de cerca de 1 grama a cerca de 1,5 gramas.

[0076] Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 4 fragmentos.

[0077] Em algumas modalidades, o segundo meio de cultura de células é provido em um recipiente selecionado a partir do grupo consistindo em um recipiente G e um Xuri cellbag.

[0078] Em algumas modalidades, a bolsa de infusão em etapa (e) é

13 / 557 uma bolsa de infusão contendo HypoThermosol.

[0079] Em algumas modalidades, o primeiro período em etapa (b) e o segundo período em etapa (c) são cada individualmente realizados dentro de um período de 10 dias, 11 dias, ou 12 dias.

[0080] Em algumas modalidades, o primeiro período em etapa (b) e o segundo período em etapa (c) são cada individualmente realizados dentro de um período de 11 dias.

[0081] Em algumas modalidades, etapas (a) até (e) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 22 dias.

[0082] Em algumas modalidades, etapas (a) até (e) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 20 dias.

[0083] Em algumas modalidades, etapas (a) até (e) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 15 dias.

[0084] Em algumas modalidades, etapas (a) até (e) são realizadas em 22 dias ou menos.

[0085] Em algumas modalidades, etapas (a) até (e) e crioconservação são realizadas em 22 dias ou menos.

[0086] Em algumas modalidades, etapas (b) até (e) são realizadas em um recipiente único, em que realização das etapas (b) até (e) em um recipiente único resulta em um aumento em rendimento de TILs por tumor resseccionado como comparado com realização das etapas (b) até (e) em mais do que um recipiente.

[0087] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos são adicionadas aos TILs durante o segundo período em etapa (c) sem abertura do sistema.

[0088] Em algumas modalidades, a terceira população de TILs em etapa (d) é uma população terapêutica de TILs que compreende uma subpopulação aumentada de células T efetoras e/ou células T de memória central com relação à segunda população de TILs, em que as células T

14 / 557 efetoras e/ou células T de memória central obtidas na população terapêutica de TILs exibem uma ou mais características selecionadas a partir do grupo consistindo em expressão de CD27+, expressão de CD28+, telômeros mais longos, expressão aumentada de CD57, e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras, e/ou células T de memória central obtidas a partir da segunda população de células.

[0089] Em algumas modalidades, as células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas na população terapêutica de TILs exibem expressão aumentada de CD57 e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras, e/ou células T de memória central obtidas a partir da segunda população de células.

[0090] Em algumas modalidades, o risco de contaminação microbiana é reduzido como comparado com um sistema aberto.

[0091] Em algumas modalidades, os TILs da etapa (e) são infundidos em um paciente.

[0092] Em algumas modalidades, o recipiente fechado compreende um biorreator único.

[0093] Em algumas modalidades, o recipiente fechado compreende um G-REX-10.

[0094] Em algumas modalidades, o recipiente fechado compreende um G-REX -100.

[0095] Em algumas modalidades, em etapa (d) as células apresentadoras de antígenos (APCs) são adicionadas à cultura celular da segunda população de TILs a uma razão APC:TIL de 25:1 a 100:1.

[0096] Em algumas modalidades, a cultura celular tem uma razão de 2,5×109 APCs a 100×106 TILs.

[0097] Em algumas modalidades, em etapa (c) as células apresentadoras de antígenos (APCs) são adicionadas à cultura celular da segunda população de TILs a uma razão APC:TIL de 25:1 a 100:1.

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[0098] Em algumas modalidades, a cultura celular tem razão de 2,5×109 APCs a 100×106 TILs.

[0099] A presente invenção também provê uma população de TILs expandidos para uso no tratamento de um indivíduo com câncer, em que a população de TILs expandidos é uma terceira população de TILs obtenível por um método compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs a partir de um tumor resseccionado de um indivíduo por processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em fragmentos múltiplos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor em um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2 para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3- 14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura do sistema; (d) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, opcionalmente OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7-14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; (e) coletar a população terapêutica de TILs obtida a partir da

16 / 557 etapa (d), em que a transição de etapa (d) para etapa (e) ocorre sem abertura do sistema; e (f) transferir a população de TILs coletada da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (e) a (f) ocorre sem abertura do sistema; e (g) opcionalmente crioconservar a bolsa de infusão compreendendo a população de TILs coletada da etapa (f) usando um processo de crioconservação.

[00100] Em algumas modalidades, uma população de TILs é para uso para tratar um indivíduo com câncer de acordo com métodos descritos acima e aqui, em que o método compreende adicionalmente uma ou mais das características enumeradas acima e aqui. Em algumas modalidades a população de TILs é para uso no tratamento de um indivíduo com câncer de acordo com os métodos descritos acima e aqui, em que o método compreende adicionalmente uma ou mais das características mencionadas acima e aqui. .

[00101] A presente invenção provê um método para expandir linfócitos infiltrando os tumores (TILs) em uma população terapêutica de TILs compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor resseccionado de um paciente por processamento de uma amostra de tumor obtida a partir do paciente em fragmentos de tumor múltiplos; (b) adicionar os fragmentos de tumor em um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2, e opcionalmente OKT-3, opcionalmente um agonista de superfamília de receptor de fator de necrose de tumor (TNFRSF), para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3-14 dias para obter a segunda

17 / 557 população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura do sistema; (d) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, opcionalmente OKT-3, opcionalmente um agonista de superfamília de receptor de fator de necrose de tumor (TNFRSF), e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7-14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; (e) coletar a população terapêutica de TILs obtida a partir da etapa (d), em que a transição de etapa (d) para etapa (e) ocorre sem abertura do sistema; e (f) transferir a população de TILs coletada da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (e) para (f) ocorre sem abertura do sistema.

[00102] A presente invenção provê um método para tratamento de um indivíduo com câncer, o método compreendendo administrar linfócitos infiltrando os tumores expandidos (TILs) compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor resseccionado a partir de um indivíduo por processamento de uma amostra de tumor obtida a partir do paciente em fragmentos de tumor múltiplos; (b) adicionar os fragmentos de tumor em um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2, e opcionalmente OKT-3, opcionalmente um agonista de superfamília de

18 / 557 receptor de fator de necrose de tumor (TNFRSF), para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3-14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura do sistema; (d) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, opcionalmente OKT-3, opcionalmente um agonista de superfamília de receptor de fator de necrose de tumor (TNFRSF), e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7-14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; (e) coletar a população terapêutica de TILs obtida a partir da etapa (d), em que a transição de etapa (d) para etapa (e) ocorre sem abertura do sistema; e (f) transferir a população de TILs coletada da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (e) para (f) ocorre sem abertura do sistema; (g) opcionalmente crioconservar a bolsa de infusão compreendendo a população de TILs coletada de etapa (f) usando um processo de crioconservação; e (h) administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz da terceira população de TILs a partir da bolsa de infusão em etapa (g) para o paciente.

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[00103] Em algumas modalidades, o agonista da superfamília de receptor de fator de necrose de tumor (TNFRSF) é um anticorpo 4-1BB. Em algumas modalidades, o agonista de TNFRSF é um agonista de 4-1BB, e o agonista de 4-1BB é selecionado dentre o grupo consistindo em urelumab, utomilumab, EU-101, uma proteína de fusão, e fragmentos, derivados, variantes, biossimilares, e combinações dos mesmos.

[00104] A presente invenção também provê uma composição de crioconservação compreendendo uma população de TILs como descrito acima e aqui, um meio crioprotetor compreendendo dimetilsulfóxido (DMSO), e uma solução de eletrólitos.

[00105] Em algumas modalidades, a composição de crioconservação compreende adicionalmente um ou mais estabilizadores e um ou mais fatores de crescimento de linfócitos. Em algumas modalidades, o ou ou mais estabilizadores compreendem albumina sérica humana (HSA) e o ou ou mais fatores de crescimento de linfócitos compreendem IL-2. Em algumas modalidades, a composição opcionalmente compreende OKT-3.

[00106] Em algumas modalidades, o DMSO e a solução de eletrólitos estão presentes em uma razão de cerca de 1.1:1 a cerca de 1:1.1. Em algumas modalidades, o DMSO e a solução de eletrólitos estão presentes em uma razão de cerca de 1:1.

[00107] Em algumas modalidades, 100 mL da composição de crioconservação compreendem a população de TILs em uma quantidade de cerca de 1 × 106 a cerca de 9 × 1014, o meio crioprotetor compreendendo DMSO em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL, a solução de eletrólitos em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL, HSA em uma quantidade de cerca de 0,1 g a cerca de 1.0 g, e IL-2 em uma quantidade de cerca de 0,001 mg a cerca de 0.005 mg.

[00108] Em algumas modalidades, 100 mL da composição de crioconservação compreendem a população de TILs em uma quantidade de

20 / 557 cerca de 1 × 107 a cerca de 1 × 1011; o meio crioprotetor em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL, em que o meio crioprotetor compreende cerca de 10% DMSO; a solução de eletrólitos em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL; HSA em uma quantidade de cerca de 0,3 g a cerca de 0,7 g; e IL-2 em uma quantidade de cerca de 0,001 mg a cerca de 0,003 mg.

[00109] Em algumas modalidades, 100 mL da composição de crioconservação consiste essencialmente na população de TILs em uma quantidade de cerca de 1 × 107 a cerca de 1 × 1011; o meio crioprotetor em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL, em que o meio crioprotetor consiste essencialmente em cerca de 10% DMSO; a solução de eletrólitos em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL; HSA em uma quantidade de cerca de 0,3 g a cerca de 0,7 g; e IL-2 em uma quantidade de cerca de 0,001 mg a cerca de 0,003 mg.

[00110] Em algumas modalidades, a composição é para uso no tratamento de um indivíduo com câncer.

[00111] A presente invenção também provê uma composição de crioconservação compreendendo uma população de TILs, um meio crioprotetor compreendendo dimetilsulfóxido (DMSO), e uma solução de eletrólitos, em que 100 mL da composição compreende a população de TILs em uma quantidade de cerca de 1 × 107 a cerca de 1 × 1011; o meio crioprotetor em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL, em que o meio crioprotetor compreende cerca de 10% DMSO; a solução de eletrólitos em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL; HSA em uma quantidade de cerca de 0,3 g a cerca de 0,7 g; e IL-2 em uma quantidade de cerca de 0,001 mg a cerca de 0,003 mg.

[00112] A presente invenção também provê uma composição de crioconservação consistindo essencialmente em uma população de TILs, um meio crioprotetor compreendendo dimetilsulfóxido (DMSO), e uma solução

21 / 557 de eletrólitos, em que 100 mL da composição consiste essencialmente na população de TILs em uma quantidade de cerca de 1 × 107 a cerca de 1 × 1011; o meio crioprotetor em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL, em que o meio crioprotetor consiste essencialmente em cerca de 10% DMSO; a solução de eletrólitos em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL; HSA em uma quantidade de cerca de 0,3 g a cerca de 0,7 g; e IL-2 em uma quantidade de cerca de 0,001 mg a cerca de 0,003 mg.

[00113] A presente invenção também provê uma bolsa de infusão compreendendo uma composição de crioconservação como descrito acima e aqui.

[00114] Em algumas modalidades, a bolsa de infusão é uma bolsa de infusão contendo HypoThermosol.

[00115] A presente invenção também provê uma bolsa de armazenamento compreendendo uma composição de crioconservação como descrito acima e aqui.

[00116] Em algumas modalidades, a bolsa de armazenamento de reivindicação 54, em que a bolsa de armazenamento é uma bolsa de congelamento CryoStore CS750..

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00117] Figura 1: Mostra um diagrama de uma modalidade de processo 2A, um processo de 22 dias para fabricação de TILs.

[00118] Figura 2: Mostra uma comparação entre o processo 1C e uma modalidade do processo 2A para fabricação de TILs.

[00119] Figura 3: Mostra a linha de tempo do processo 1C.

[00120] Figura 4: Mostra o processo de uma modalidade de terapia com TILs usando processo 2A para fabricação de TILs, incluindo etapas de administração e co-terapia, para contagens celulares superiores.

[00121] Figura 5: Mostra o processo de uma modalidade de terapia com TILs usando processo 2A para fabricação de TILs, incluindo etapas de

22 / 557 administração e co-terapia, para contagens celulares inferiores.

[00122] Figura 6: Mostra um esquema detalhado para uma modalidade do processo 2A.

[00123] Figura 7: Mostra caracterização de TILs preparados usando uma modalidade do processo 2A por comparação de expressão de interferon- gama (IFN-γ) entre TILs frescos e TILs descongelados.

[00124] Figura 8: Mostra caracterização de TILs preparados usando uma modalidade do processo 2A por exame de expressão de CD3 em TILs frescos versus TILs descongelados.

[00125] Figura 9: Mostra caracterização de TILs preparados usando uma modalidade do processo 2A por exame da recuperação em TILs frescos versus TILs descongelados.

[00126] Figura 10: Mostra caracterização de TILs preparados usando uma modalidade do processo 2A por exame da viabilidade de TILs frescos versus TILs descongelados.

[00127] Figura 11A-11C: Retrata as etapas principais de uma modalidade de processo 2A incluindo as etapas de crioconservação.

[00128] Figura 12: Retrata contagens celulares obtidas a partir do processo 1C e uma modalidade do processo 2A.

[00129] Figura 13: Retrata viabilidade celular percentual obtida a partir do processo 1C e uma modalidade do processo 2A.

[00130] Figura 14: Retrata porcentagens de células CD45 e CD3 (isto é, células T) medidas por citometria de fluxo para TILs obtidos para o processo 1C e uma modalidade do processo 2A.

[00131] Figura 15: Retrata liberação de IFN-γ obtida para o processo 1C e modalidades do processo 2A, como medida por um teste diferente do usado para gerar os dados em Figuras 80 e 98.

[00132] Figura 16: Retrata liberação de IFN-γ obtida para o processo 1C e modalidades do processo 2A, como medido por um teste diferente do

23 / 557 usado para gerar os dados em Figuras 80 e 98.

[00133] Figura 17: Retrata porcentagens de células TCR a/b e NK obtidas a partir do processo 1C e uma modalidade do processo 2A.

[00134] Figura 18: Retrata porcentagens de células CD8+ e CD4+ medidas por citometria de fluxo para TILs obtidos pelo processo 1C e uma modalidade do processo 2A, assim como a razão entre cada subconjunto.

[00135] Figura 19: Retrata porcentagens de subconjuntos de memória medidos por citometria de fluxo para TILs obtidos a partir do processo 1C e uma modalidade do processo 2A.

[00136] Figura 20: Retrata porcentagens de expressão de PD-1, LAG- 3, e TIM-3 por citometria de fluxo para TILs obtidos a partir do processo 1C e uma modalidade do processo 2A.

[00137] Figura 21: Retrata porcentagens de expressão de 4-1BB, CD69, e KLRG1 por citometria de fluxo para TILs obtidos a partir do processo 1C e uma modalidade do processo 2A.

[00138] Figura 22: Retrata porcentagens de expressão de TIGIT por citometria de fluxo para TILs obtidos a partir do processo 1C e uma modalidade do processo 2A.

[00139] Figura 23: Retrata porcentagens de expressão de CD27 e CD28 por citometria de fluxo para TILs obtidos a partir do processo 1C e uma modalidade do processo 2A.

[00140] Figura 24: Retrata os resultados de análise de comprimento de telômero Flow-FISH.

[00141] Figura 25: Retrata os resultados de análise de comprimento de telômero Flow-FISH (após remoção de um ponto de dados ‘fora da curva’).

[00142] Figura 26: Retrata o projeto da experiência clínica incluindo coortes tratados com processo 1C e uma modalidade de processo 2A.

[00143] Figura 27: Gráfico de Processo 2A exemplar apresentando uma visão geral de Etapas A até F.

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[00144] Figura 28A-28C: Fluxograma de processo de Processo 2A.

[00145] Figura 29: Fluxograma de processo em plano de colheita de dados do Processo 2A

[00146] Figura 30: Viabilidade de TILs frescos versus descongelados

[00147] Figura 31: Expansão de TILs frescos e descongelados em cultura re-REP

[00148] Figura 32: Valores laboratoriais normais de metabólitos do sangue.

[00149] Figura 33A-33B: Análise de metabólitos de TILs pré-REP de processo 2A.

[00150] Figura 34: Quantificação de IL-2 em cultura celular de TILs pré-REP de processo 2A.

[00151] Figura 35: Liberação de citocinas citotóxicas IFN-γ quando de estimulação anti-CD3, anti-CD28 e anti-4-1BB de TILs.

[00152] Figura 36: Liberação de Granzyme B após estimulação anti- CD3, anti-CD28, e anti-4-1BB de TILs.

[00153] Figura 37A-37B: TCR αβ+ TIL. A maioria das células T CD3+ humanas expressam os receptores formados por cadeias α e β que reconhecem antígenos em um modo limitado a MHC. A) Exceto em M1061, o produto de TILs frescos e descongelados tinha 80% ou mais TILs expressando TCR αβ+. Ambos TILs frescos e descongelados tinham expressão comparável de TCR αβ (valor p – 0,9582). Mesmo embora uma diminuição em TILs expressando TCR αβ+ após re-REP ter sido observada, esta diminuição não foi significante dentro de TILs re-REP (p = 0,24). B) Notou-se uma diminuição de 9,2% e 15,7% em TILs frescos re-REP e TILs descongelados expressando TCR αβ em comparação com TILs frescos e descongelados, respectivamente.

[00154] Figura 38A-38B: TCRαβ-CD56+. Células Natural Killer (NK) e NKT infiltrando o tumor também têm a capacidade de lisar células faltando

25 / 557 a expressão de MHC assim como antígeno de lipídeos apresentados a CD1 e para prover citocinas imunorregulatórias. No entanto, uma infiltração de células NK intensa é associada com doença avançada e iria facilitar o desenvolvimento de câncer. Figura A mostra que, em todos os casos, exceto em M1063, ocorre uma modesta, embora não significante, diminuição em população de NK em TILs descongelados comparado com TILs frescos, (p = 0,27). Nenhuma diferença significante foi observada entre a população de TILs re-REP (p = 0,88). TILs frescos, TILs frescos re-REP, e TILs descongelados re-REP demonstram expressão similar de CD56 como mostrado em Figura B. Produtos de TILs descongelados tinham menos células expressando NK (1,9 ± 1,3) do que TILs frescos (3,0 ± 2,2) possivelmente como um resultado do procedimento de crio-congelamento.

[00155] Figura 39A-39B: Células CD4+. Nenhuma diferença substancial na população de CD4 foi observada em condições individuais. Figura A representa a população média de CD4 em cada condição. A tabela em Figura B mostra os valores SD e SEM. Se nota uma leve diminuição na população de CD4 na população fresca re-REP que é principalmente devido a uma diminuição em CD4 na população fresca re-REP em EP11001T.

[00156] Figura 40A-40B: Células CD8+. A) em todos, exceto EP11001T, ambos TILs frescos e descongelados mostraram comparáveis populações de CD8+ (p=0,10, nenhuma diferença significante). Na maioria das experiências, ocorreu uma leve diminuição em TILs expressando CD8+ em produtos de TILs frescos re-REP (exceções foram M1061T e M1065T). Houve aproximadamente uma diminuição de 10-30% na população de CD8+ nos TILs descongelados re-REP. Comparação dos TILs re-REP de ambos TILs frescos e descongelados mostrou um diferença significante (p = 0,03, teste t de Student). Figura B mostra os valores médios de TILs expressando CD8+ em todas as condições. Ambos TILs frescos e descongelados mostram resultados similares. No entanto, houve uma diminuição de 10,8% na

26 / 557 população de CD8+ nos produtos de TILs descongelados re-REP em comparação com os TILs frescos re-REP.

[00157] Figura 41A-41B: Células CD4+CD154+. CD154, também conhecida como CD40L é um marcador para células T ativadas. Figura A: Nenhuma diferença substancial na população de CD4+CD154+ foi observada nas condições diferentes, no entanto, uma diminuição de 34,1% foi observada em CD4+ TILs frescos re-REP EP11001T. Expressão de CD154 não foi medida em M1061T e M1062T como estas experiências foram realizadas antes do painel de fenótipo estendido estar em posição. Figura B: A leve diminuição em condição de TILs descongelados poderia ser atribuída a CD154 não medido em M1061T e M1062T. Todas as condições mostram expressão de CD154 muito comparável na população de CD4 sugerindo células T CD4+ ativadas.

[00158] Figura 42A-42B: Células CD8+CD154+. Marcador de ativação CD154 expressado em TILs DE CD8+ também foi analisado. A) No todo, a expressão de CD154 foi menor na população de CD8+ no produto de TILs frescos e descongelados. Não é surpreendente como CD154 é expressado principalmente nas células T CD4+ ativadas. Em casos onde a expressão de CD154 foi medida em ambos os produtos de TILs frescos e descongelados, ou nenhuma diferença ou um aumento na expressão de CD154 foram observados nos produtos de TILs descongelados. O teste t de Student mostrou que não houve nenhuma diferença significante entre as duas condições. Um aumento na expressão de CD154 em descongelados re-REP em comparação com frescos re-REP foi mostrado em todas as experiências (p = 0,02). B) Um aumento em expressão de CD154 foi observado em ambos os produtos de TILs descongelados e TILs descongelados re-REP em comparação com suas contrapartes. Os TILs descongelados re-REP mostraram um aumento de 29,1% em expressão de CD154 comparado com os TILs frescos re-REP.

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[00159] Figura 43A-43B: Células CD4+CD69+. CD69 é o marcador de ativação inicial em células T após estimulação ou ativação. A) Em todos os TILs exceto em EP11001T, ambos re-REPs frescos e descongelados mostraram um aumento modesto em expressão de CD69, possivelmente devido à duração de re-REP (7 dias em vez de 11 dias). Nenhuma diferença foi observada entre TILs frescos e descongelados (p = 0,89). Uma diferença entre re-REPs frescos e descongelados também não foi observada (p = 0,82). B) Um aumento menor em expressão de CD69 é observado nos produtos de TILs re-REP. (Nota: Nenhuma coloração de CD69 foi realizada para os produtos de TILs descongelados M1061T ou M1062T. a expressão de CD69 de produtos de TILs frescos M1061T foi 33,9%).

[00160] Figura 44A-44B: Células CD8+CD69+. Como observado para a população de CD4+, Figura A mostra um aumento na expressão de CD69 nos TILs re-REP de CD8+. A expressão de CD69 não mostrou nenhuma diferença significante entre os TILs frescos e descongelados (p = 0,68) ou os TILs frescos e descongelados re-REP (p = 0,76). Figura B afirma a observação de que se tem um aumento modesto na expressão de CD69 no produto de TILs re-REP.

[00161] Figura 45A-45B: Células CD4+CD137+. CD137 (4-11313) é um receptor co-estimulatório de células T induzido quando da ativação TCR. Ele é ativado em células T de CD4+ e CD8+. A) expressão de CD137 mostrou um aumento profundo da população de TILs re-REP após 7 dias de estimulação. No entanto, nenhuma diferença entre os TILs frescos e descongelados ou TILs frescos e descongelados re-REP foi observada (p < 0,05 em ambos os casos (Figura B configura esta observação). Também, os TILs descongelados mostraram uma modesta diminuição em expressão de CD137. O aumento em expressão de CD137 em TILs re-REP poderia ser atribuído ao segundo ciclo de estimulação de re-REPs de 7 dias.

[00162] Figura 46A-46B: Células CD8+CD137+. A) população CD8+

28 / 557 mostrou um aumento global no produto re-REP. B) Produto fresco re-REP teve um aumento de 33,4% em expressão de CD8+CD137+ em comparação com produtos de TILs frescos. Produto descongelado re-REP também mostrou um aumento de 33,15% em expressão de CD137 na população de CD8+ comparado com TILs descongelados. Nenhuma diferença significante foi observada entre TILs frescos e descongelados re-REP. Uma observação similar pode ser vista comparando os produtos de TILs frescos com os TILs descongelados. Este aumento em expressão de CD137 pode ser devido ao segundo ciclo de ativação de re-REP. (Note-se que somente 6 TILs foram usados para a análise como expressão de CD137 não foi medida para 3 das experiências.)

[00163] Figura 47A-47B: Células CD4+CM. População de memória central (CM) é definida por expressão de CD45RA- (negativa) e CCR7+ (positiva). A) Um aumento em população de CM nas condições de re-REP foi observado. M1063T e M1064T mostraram um diminuição na expressão de CM na população de CD4+ obtida a partir de TILs descongelados em comparação com produtos TILs frescos. Nem os produtos de TILs frescos ou descongelados (p = 0,1658) nem TILs frescos re-REP e descongelados re- REP (p = 0,5535) mostraram uma diferença significante em população de CM. B) Um aumento de 14,4% e 15,4% na população CM foi observado em TILs frescos e descongelados re-REP em comparação com TILs frescos e descongelados, respectivamente.

[00164] Figura 48A-48B: Células CD8+CM. A) Na população de CD8+, um aumento dramático em expressão de CM no produto de TILs frescos foi visto, uma observação não presente no produto de TIL. Este aumento não afetou a significância (p = 0,3086), sugerindo nenhuma diferença entre os TILs frescos e descongelados. Uma tendência similar foi vista no produto de TILs re-REPs também. Figura 48B) Um aumento global em população de CM nos TILs frescos foi observado em comparação com os

29 / 557 TILs descongelados. Os números mostram que TILs frescos e TIL de re-REP tinham somente uma diferença de ~2%; os TILs frescos mostraram um desvio padrão muito elevado que poderia ser atribuído a M1064T; excluindo a expressão de CM em M1064T resultou em uma expressão de CM muito similar entre o produto de TILs frescos e descongelados (não mostrado).

[00165] Figura 49A-49B: Células CD4+EM. População de memória efetora (EM) é definida pela falta de expressão de CCR7 e CD45RA. A) Como esperado a população de CD4+ de TILs frescos e descongelados teve um nível elevado de fenótipo de memória efetora. Uma diminuição drástica na expressão de memória efetora foi encontrada em população de TIL de re- REP M1056T. Também, 5 outras experiências mostraram uma diminuição no fenótipo de fenótipo de memória efetora em ambos TILs frescos e descongelados re-REP. B) Ambos os TILs frescos e descongelados mostraram expressão similar de fenótipo de memória efetora. Comparação de TILs frescos re-REP e frescos mostraram uma diminuição por 16% no último. Uma diminuição similar foi observada nos TILs descongelados re-REP (9%) quando comparados com os TILs descongelados.

[00166] Figura 50A-50B: Células CD8+EM. A) Um padrão similar de memória efetora aumentada nos TILs frescos também foi visto na população de CD8+. Uma exceção foi notada em M1064T em que TILs frescos somente teve um perfil de 20% de memória efetora; isto é devido a 73% destes TILs tendo um fenótipo de CM como descrito em A e B. Todas as amostras mostrando uma diminuição na população de memória efetora em seus TILs de CD4+ do produto de re-REP seguiram a mesma tendência em seus TILs de CD8+. B) Diferente da população de TILs de CD4+, TILs de CD8+ mostraram um fenótipo de memória efetora similar em produtos re-REPs frescos e descongelados. (Note-se que o desvio padrão elevado nos TILs frescos e descongelados, que são devido à população de memória efetora baixa em M1064T fresco e a nenhuma expressão em amostras de TILs

30 / 557 descongelados de M1061T).

[00167] Figura 51A-51B: Células CD4+CD28+. Expressão de CD28 correlaciona com TILs jovens diminuindo com idade. A) Embora um aumento no CM população tenha sido observado no TIL de re-REP, um diminuição na expressão de CD28 foi vista como uma tendência sugerindo o estado de CM sozinha não poderia determinar o declínio de TIL. A diminuição em expressão de CD28 foi observada no produto de re-REP, exceto para CD4+ TIL M1061T. B) A diminuição de 8,89% nos TILs frescos e 5,71% nos descongelados foi vista comparado com produto de TILs frescos e descongelados, respectivamente.

[00168] Figura 52A-52B: Células CD8+CD28+. A) Expressão de CD28 expressão nos TILs de população CD8+ foi maior nos TILs frescos e descongelados do que no produto de re-REP. Na maioria dos casos, TILs descongelados re-REP mostrou uma diminuição drástica quando comparado com TILs descongelados e TILs frescos re-REP. No entanto, teste t de Student não mostrou nenhuma diferença significante entre TILs frescos e descongelados (p = 0,3668) e também entre os produtos de re-REPs frescos e descongelados (p -=0.7940). B) Como visto na população de TIL CD4+, houve um diminuição em populações de CD8+CD28+ frescas re-REP (21,5%) e descongelados re-REP (18,2%) quando comparado suas contrapartes não re-estimuladas.

[00169] Figura 53A-53B: Células CD4+PD-1+. A expressão de PD-1 em TIL é correlacionada com células T reativas a antígenos e exauridas. I Assim, não é surpreendente que um fenótipo exaurido é observado em TIL que sofreu REP durante 11 dias. A) Este fenótipo exaurido foi ou mantido ou aumentado (eespecíficoamente, EP11001T e M1056T) nos produtos de TILs descongelados. Nenhuma diferença significante entre produto de TILs frescos e descongelados foi vista (p = 0,9809). Uma tendência similar foi mostrada no fresco comparado com TILs descongelados re-REP (p = 0,0912). B) O

31 / 557 produto fresco de re-REP mostrou uma modesta diminuição em expressão de PD-1 na população de TILs CD4+. Todas as outras condições mantiveram um padrão comparável de expressão de PD-1. A diminuição ou nenhuma mudança na expressão de PD-1 foi observada no produto fresco de re-REP comparado com todas as outras condições. Um aumento na expressão de PD- 1 foi visto em M1062T, M1063T (CD4+) e EP11001T (CD8+) no produto descongelado de re-REP. Todos os outros produtos descongelados re-REP mostraram resultados comparáveis ao produto descongelado.

[00170] Figura 54A-54B: Células CD8+PD-1+. A) População de CD8+ a partir do produto de TILs frescos mostrou um fenótipo mais exaurido associado com expressão de PD-1 aumentada. Uma exceção foi observada em EP11001T onde os produtos de TILs descongelados de CD8+ tiveram um aumento modesto na expressão de PD-1 comparado com produto de TILs frescos. Houve uma diferença pequena, embora não significante, na expressão de PD-1 nos TILs frescos comparado com TILs descongelados (p = 0,3144). B) Produto de TIL fresco mostrou um leve aumento, mas não significante, na expressão de PD-1 comparado com TILs descongelados (6,74%, ou 1,2 vezes maior do que TILs descongelados) sugerindo que o produto de TILs descongelados foi comparável com base no padrão do fenótipo.

[00171] Figura 55A-55B: Células CD4+LAG3+. Células T exauridas expressam níveis elevados de receptor inibitório LAG3 junto com PD-1. A) Os TILs descongelados de CD4+ mostraram níveis levemente maiores, mas não significantes, de expressão de LAG3 em comparação com TILs frescos (p = 0,52). Uma exceção foi observada em M1063T. Em experiências onde a expressão de LAG3 nos TILs frescos de CD4+ e TILs frescos re-REP foi medida, um diminuição em expressão de LAG3+ foi observada nas amostras frescas de re-REP comparadas com TILs frescos. B) No todo, notou-se uma modesta diminuição na expressão de LAG3 em produto de TILs frescos re- REP. Favor notar que para a Figura B ser consistente, M1061T, M1062T e

32 / 557 M1064T foram excluídos como a expressão de LAG3 não foi medida no produto fresco.

[00172] Figura 56A-56B: Células CD8+LAG3+. A) TIL expressando CD8+ LAG3+mostrou uma modesta diminuição nas experiências, com a exceção de M1063T, em que uma diminuição marcada em expressão de LAG3 foi vista nos TILs frescos re-REP. No todo, TILs descongelados re- REP mostraram aumento significante de 1,5 vezes, comparado com TILs frescos re-REP para a expressão de LAG3 (p = 0,0154). No entanto, nenhuma diferença significante foi observada entre produtos de TILs frescos e de TILs descongelados (p = 0,0884). B) Uma diminuição aproximada de 30% em expressão de LAG3 nos TILs frescos re-REP CD8+ foi observada em comparação com produto de TILs descongelados. Ambos TILs frescos e descongelados foram comparáveis aos TILs descongelados mostrando um aumento modesto. (Nesta figura, M1061T, M1062T e M1064T foram omitidos, como a expressão de LAG3 não foi medida em ambas as amostras de TILs frescos ou frescos re-REP.)

[00173] Figura 57A-57B: Células CD4+TIM-3+. A) Como observado previamente no caso de PD-1 e LAG3, uma diminuição em expressão de TIM-3 foi vista em TILs frescos re-REP comparado com TILs descongelados re-REP. Mesmo assim, nenhuma diferença significante existiu entre TILs frescos e descongelados de reREP (p = 0,2007). B) Não foram observadas mudanças principais na expressão de TIM-3 dentre os produtos de TILs frescos, descongelados e descongelado de re-REP. Uma modesta diminuição de 9,2% em expressão de TIM-3 foi observada em TILs frescos re-REP em comparação com produto descongelado de re-REP.

[00174] Figura 58A-58B: Células CD8+TIM-3+. A) Uma tendência similar em expressão de TIM-3 que foi vista na de população CD4+ também foi vista nos TILs de CD8+. TIL fresco de re-REP tinha o fenótipo menos exaurido com baixa expressão de TIM-3, mostrando um diferença significante

33 / 557 em comparação com TILs descongelados re-REP (p = 0,0147). Comparação de PD-1, LAG3 e TIM-3 sugere que os TILs frescos re-REP tem um fenótipo menos exaustivo com fenótipo CM aumentado. B) Em comparação com produtos de TILs descongelados re-REP, TILs frescos re-REP mostraram uma significante diminuição de 22% em expressão de TIM-3. Ambos TILs frescos e descongelados mostram uma expressão similar de padrões de TIM-3.

[00175] Figura 59: Potencial citotóxico de TIL contra linhagem de célula alvo P815.

[00176] Figura 60A-60F: Perfil de respiração metabólica de TILs frescos, TILs frescos re-REP, e TILs descongelados re-REP. OCR basal (A), SRC Overt (B), SRC2DG (C), SRC Covert (D), ECAR basal (E), e reserva glicolítica (F).

[00177] Figura 61A-61B: Tecnologia Flow-FISH foi usada para medir comprimento médio de repetição de telômeros em 9 produtos de TILs descongelados pós-REP – Processo 2A. A) Dados representam o comprimento do telômero medido por qPCR comparando TIL a células 1301. B) Dados mostram o comprimento do telômero medido por teste FlowFish de TIL comparado com células 1301. Dados usados para gráficos são dados em um formato de Tabela (Tabelas 25) na seção de apêndice 10. No todo, houve uma similaridade grosseira nos padrões dos resultados dos dois testes de comprimento do telômero, mas experiências irão continuar para determinar que método reflete mais precisamente o comprimento real do telômero do TIL. Esta técnica deve ser aplicada a amostras clínicas futuras para determinar uma relação entre comprimento do telômero e resposta do paciente a terapia com TILs.

[00178] Figura 62A-62B: Seleção de provedor de meio livre de soro (Substituição de soro). Cada fragmento foram cultivado em cavidade única de placa de 24 cavidades G-Rex 24 em quadruplicatas. Em Dia 11, REPs foram iniciados usando 45 TILs com 106 alimentadoras para imitar o processo 2A.

34 / 557 A) Gráfico de barras mostrando contagem média de células viáveis registradas em Dia 11 (pré-REP) para cada condição. B) Gráfico de barras exibindo contagem média de células viáveis registrada em Dia 22 (pós-REP). Valor P foi calculado usando teste ‘t’ de Student. * P <0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, respectivamente.

[00179] Figura 63A-63B: Seleção de provedor de meio livre de soro (soro lisado de plaquetas). Cada fragmento foi cultivado em cavidade única de placa de 24 cavidades G-Rex em triplicatas. Em Dia 11, REPs foram iniciados usando 45 TILs com 106 alimentadoras para imitar o processo 2A. A) Gráfico de barras mostrando contagem média de células viáveis registrada em Dia 11 (pré-REP) para cada condição. B) Gráfico de barras exibindo contagem média de células viáveis registradas em Dia 22 (pós-REP). Valor P foi calculado usando teste ‘t’ de Student. * P <0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 respectivamente. ‘#’ Sem suficientes fragmentos de tumor.

[00180] Figura 64A-64B: Comparar a eficácia de CTS Optimizer com condição padrão usando processo em mini-escala 2A (G-Rex 5M). Dois fragmentos / G-Rex 5M foram cultivados em triplicatas, REPs foram iniciados usando 26 TIL com alimentadoras 506 para imitir o processo 2A. A barra apresentada acima foi a contagem média de células viáveis obtidas em Dia 11 (A) ou Dia 22 (B).

[00181] Figura 65A-65C: Sumário de pré- e pós-expansão de TILs extrapolada comparando condição padrão e CTS Optimizer. A) pré-REP. B) pós-REP. C) Sumário de expansão de TILs extrapolada para ciclo de escala completa (Padrão versus CTS Optimizer +SR).

[00182] Figura 66: CD8+ foi ligado a células vivas. 7 dos 9 tumores mostram um aumento em populações absolutas de CD8+ com a condição CTS+SR.

[00183] Figura 67: Comparabilidade com interferon-gama. Interferon- gama ELISA (Quantikine). Produção de IFN-y foi medida usando kit

35 / 557 Quantikine ELISA por R&D systems. CTS+SR produziu quantidades comparáveis de IFN-y quando comparado com a condição padrão do requerente.

[00184] Figura 68: Esquema de uma modalidade exemplar do protocolo de expansão rápida (REP). Na chegada, o tumor é fragmentado, colocado em frascos G-Rex com IL-2 para expansão de TILs (expansão pré- REP), durante 11 dias. Para os estudos de coquetel triplo, IL-2/IL-15/IL-21 é adicionado no início do pré-REP. Para o protocolo de expansão rápida (REP), TILs são cultivados com alimentadoras e OKT3 para expansão REP por um adicional de 11 dias.

[00185] Figura 69A-69B: TILs derivados de melanoma (n=4), e pulmão (n=7) foram avaliados fenotipicamente para células CD4+ e CD8+ usando citometria de fluxo após pré-REP. Os valores *P-representam a diferença entre IL-2 e IL-12/IL-15/IL-21 nas células CD8+ usando teste t de Student não pareado.

[00186] Figura 70A-70B: TILs derivados de melanoma (n=4), e pulmão (n=7) foram avaliados fenotipicamente para CD27+ e CD28+ nas células CD4+ e CD8+ usando citometria de fluxo após pré-REP.

[00187] Figura 71A-71C: TILs foram avaliados fenotipicamente para subconjuntos de efetoras/de memória (CD45RA e CCR7) nas células CD8+ e CD4+ (dados não mostrados) em melanoma (n=4) (A) e pulmão (n=8) (B). CXCR3 expressão foi avaliado em melanoma e pulmão. Toda a expressão fenotípica foi avaliada usando citometria de fluxo após pré-REP. TCM=memória central, TSCM= memória de célula-tronco, TEMRA (células T efetoras), TEM=memória efetora.

[00188] Figura 72A-72C: TILs derivados de (A) melanoma (n=4) e (B) pulmão (n=5) foram avaliados para expressão de CD107a+ em resposta a estimulação PMA durante 4 horas nas células CD4+ e CD8+, por citometria de fluxo. (C) TILs pré-REP (n=5) foram estimulados durante 24 horas com

36 / 557 OKT3 solúvel (30ng/ml) e os sobrenadantes avaliados para IFNγ por ELISA.

[00189] Figura 73A-73B: O repertório de TCRvβ (24 especificidades) foi avaliado nos TILs derivados de melanoma (A) e pulmão (B) usando o kit Beckman Coulter para citometria de fluxo.

[00190] Figura 74: Processo de fabricação exemplar de TILs crioconservados (~22 dias).

[00191] Figura 75A-75B: Em Dia 22, o produto de células reduzido em volume é reunido e amostrado para determinar desempenho da cultura antes de lavagem e formulação. Amostras são analisadas no contador de células automatizado NC-200 como previamente descrito. Densidade celular viável total é determinada pela média grande de contagens em duplicata de 4 amostras independentes. O processo de Geração 2 (Gen 2) produz um produto de TIL de dose similar a Geração 1 (Gen 1; a média de Gen 1 = 4,10×1010 ± 2,92×1010, média de Gen 2 = 3,12×1010 ± 2,19×1010). B) Expansão de vezes é calculada para a fase REP como o dividendo da densidade celular viável final sobre a densidade de semeadura de TILs viáveis inicial. Os produtos de TILs de Gen 2 têm uma expansão de vezes menor com relação a Gen 1 (média de Gen 1 =1,40×103 ± 9,86×102, média de Gen 2 = 5,11×102 ± 2,95×102).

[00192] Figura 76: Produtos de fármacos formulados frescos foram testados para identificar por citometria de fluxo para liberação. Os processos Gen 1 e Gen 2 produzem culturas de células T de alta pureza, como definido por fenótipo positivo duplo CD45, CD3 (Gen1 # ± SD, Gen 2 # ± SD). Valor P foi calculado usando teste ‘t’ de Mann-Whitney.

[00193] Figura 77A-77B: Frascos de tipo satélite crioconservados de produto de fármaco formulado foram descongelados e testados para fenótipo estendido por citometria de fluxo como previamente descrito. Os produtos de Gen 1 e Gen 2 expressam razões similares de subtipos de células T de CD8 para CD4. Valor P foi calculado usando teste ‘t’ de Mann-Whitney.

[00194] Figura 78A-78B: Frascos de tipo satélite crioconservados de

37 / 557 produto de fármaco formulado foram descongelados e testados para fenótipo estendido por citometria de fluxo como previamente descrito. Os produtos de Gen 1 e Gen 2 expressam níveis similares de molécula coestimulatórias CD27 e CD28 em subconjuntos de células T. Valor P foi calculado usando teste ‘t’ de Mann-Whitney. Moléculas coestimulatórias tal como CD27 e CD28 são requeridas para prover sinalização secundária e terciária necessária para proliferação celular de efetores quando do envolvimento do receptor de células T.

[00195] Figura 79: Tecnologia Flow-FISH foi usada para medir o comprimento médio da repetição de telômeros, como previamente descrito. O valor acima de RTL indica que a fluorescência média do telômero por cromossoma/genoma em Gen 1 (uma modalidade de processo 1C) é # % ± SD%, e Gen 2 é #% ± SD% da fluorescência do telômero por cromossoma/genoma na linhagem celular de controle (1301 Linhagem celular de leucemia). Dados indicam que os produtos de Gen 2 têm, em média, comprimentos dos telômeros pelo menos comparáveis ao dos produtos de Gen

1. Comprimento do telômero é uma medição substituta do comprimento de cultura celular ex vivo.

[00196] Figura 80: Os produtos de Gen 2 (uma modalidade do processo 2A) de fármacos exibem uma aumentada capacidade de produzir IFN-γ com relação a produtos de fármacos Gen 1. A capacidade do produto de fármaco de ser reativado e secretar citocina é uma medição substituta de função in-vivo quando da ligação de TCR ao antígeno cognato no contexto de HLA.

[00197] Figura 81A-81B: Diversidade de receptor de células T: RNA de 10x106 TILs de produtos de fármacos de Gen 1 (uma modalidade do processo 1C) e Gen 2 (uma modalidade do processo 2A) foi testado para determinar o número total e frequência de sequências de CDR3 únicas presentes em cada produto. A) O número total de sequências de CDR3 únicas

38 / 557 presentes em cada produto (Gen 1 n=#, média ± SD, Gen 2 n =#, média ± SD). B) Sequências de CDR3 únicas foram indexadas com relação a frequência em cada produto para dar uma pontuação representativa da diversidade relativa de receptores de células T no produto. Os produtos de TILs de ambos os processos são compostos de populações policlonais de células T com diferentes especificidades e avidez de antígenos. A amplitude do repertório de células T totais pode ser indicativa do número de epítopos acionáveis em células de tumor.

[00198] Figura 82: Mostra um diagrama de uma modalidade de processo 2A, um processo de 22 dias para fabricação de TILs.

[00199] Figura 83: Tabela de comparação de etapas A até F de modalidades exemplares de processo 1C e processo 2A.

[00200] Figura 84: Comparação detalhada de uma modalidade de processo 1C e uma modalidade de processo 2A.

[00201] Figura 85: Esquema detalhado de uma modalidade de um processo de terapia com TILs.

[00202] Figuras 86A-86C: Caracterização fenotípica de produtos TILs usando teste de citometria de fluxo de 10 cores. (A) Porcentagem de subconjuntos de células T e não de células T é definida por CD45+CD3+ e CD45-slinfócitos) /CD45+CD3- (linfócitos não de células T), respectivamente. No todo, >99% dos produtos TILs testados consistiam de células T (CD45+CD3+). Mostrada é uma média de produtos TILs (n=10). (B) Porcentagem de dois subconjuntos de células T incluindo CD45+CD3+CD8+ (círculo aberto azul) e CD45+CD3+CD4+ (círculo aberto rosa). Nenhuma diferença estatística em porcentagem de ambos os subconjuntos é observada usando o teste T não pareado de student (P=0,68). (C) A população não de células T foi caracterizada para quatro diferentes subconjuntos incluindo: 1) não linfócitos (CD45-), 2) células NK (CD45+CD3-CD16+/56+), 3) células B (CD45+CD19+), e 4) células não NK/B (CD45+CD3-CD16-CD56-CD19-).

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[00203] Figuras 87A- 87B: Caracterização de subconjuntos de células T em populações de células CD45+CD3+CD4+ e CD45+CD3+CD8+. Subconjuntos de células T Naïve, memória central (TCM), memória efetora (TEF), e memória efetora RA+(EMRA) foram definidos usando CD45RA e CCR7. Figuras mostram representativos subconjuntos de células T de 10 produtos TILs finais ambas as populações de células CD4+ (A), e CD8+ (B). Subconjunto de células T de memória efetora (círculo aberto azul) é uma população principal (>93%) em ambos subconjuntos CD4+ e CD8+ de produto de TIL final. Abaixo de 7% das células dos produtos de TILs é do subconjunto de memória central (círculo aberto rosa). Os subconjuntos EMRA (círculo aberto cinza) e naïve (círculo aberto preto) são raramente detectados em produto de TIL (<0,02%). Os valores p representam a diferença entre EM e CM usando teste T não pareado de student.

[00204] Figuras 88A-88B: Detecção de expressão de MCSP e EpCAM em células de tumor de melanoma. Linhagens celulares de tumor de melanoma (WM35, 526, e 888), linhagens celulares de melanoma derivadas do paciente (1028, 1032, e 1041), e uma linhagem celular de carcinoma de adenoma colorretal (HT29 como um controle negativo) foram caracterizadas por coloração para marcadores MCSP (proteoglicano sulfato de condroitina associado com melanoma) e EpCAM (molécula de adesão celular epitelial). (A) Média de 90% de células de tumor de melanoma expressam MCSP. (B) EpCAM expressão não foi detectada em linhagens celulares de tumor de melanoma como comparado com controle positivo HT29, uma linhagem celular de tumor EpCAM+.

[00205] Figuras 89A-89B: Detecção de controles de contaminação (spiked) para a determinação da precisão da detecção de tumores. O teste foi realizado contaminando quantidades conhecidas de células tumorais em suspensões de PBMC (n = 10). As células tumorais de melanoma MCSP+526 foram diluídas nas razões de 1:10, 1: 100 e 1: 1.000, depois misturadas com

40 / 557 PBMCs e coloridas com anticorpos anti-MCSP e anti-CD45 e corante vivo/morto e analisadas por citometria de fluxo. (A) Aproximadamente 3000, 300 e 30 células foram detectadas na diluição de 1:10, 1: 100 e 1: 1000, respectivamente. (B) Uma média (AV) e desvio padrão (DP) das células adquiridas em cada condição foram usados para definir os limites de referência superior e inferior

[00206] Figuras 90A-90B: Estudo de repetitividade dos limites superior e inferior em controles contaminados (spiked). Três experimentos independentes foram realizados em triplicata para determinar a repetitividade do teste de espalhamento. (A) O número de células tumorais detectadas por MCSP+ estava consistentemente dentro dos limites de referência superior e inferior. (B) O gráfico de regressão linear demonstra a correlação entre as células MCSP+ e as diluições de espalhamento (R2 = 0,99) com a linha sólida preta mostrando o melhor ajuste. As linhas tracejadas verde e cinza representam os limites de previsão de 95% na curva padrão e nas amostras (Exp # 1 a 3), respectivamente.

[00207] Figuras 91A-91B: Detecção de tumor de melanoma residual em produtos TILs. Os produtos de TILs foram avaliados para contaminação residual de tumor usando o teste desenvolvido (n=15). (A e B) O número mediano e a porcentagem de eventos detectáveis de MCSP+ foi 2 e 0,0002%, respectivamente.

[00208] Figura 92: Avaliação de potência de produtos de TILs após a ativação de células T. A secreção de IFNγ após re-estimulação com anti- CD3/CD28/CD137 em produtos de TIL avaliados por ELISA em duplicata (n=5). Secreção de IFNγ para os produtos de TILs foi significativamente maior que os controles não estimulados usando teste de classificação assinada de Wilcoxon (P=0,02), e consistentemente >1000 pg/ml. Secreção de IFNγ >200 pg/ml é considerada como sendo potente. O valor p <0,05 é considerado estatisticamente significante.

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[00209] Figura 93: Representação de uma modalidade de um processo de fabricação de TILs crioconservados (22 dias).

[00210] Figura 94: Tabela de melhoras do processo de Gen 1 até Gen

2.

[00211] Figuras 95A-95C: Células viáveis totais, taxa de crescimento, e viabilidade. Em Dia 22, o produto de células reduzido em volume é reunido e amostrado para determinar desempenho da cultura antes de lavagem e formulação. (A) Amostras são analisadas no contador de células automatizado NC-200 como previamente descrito. Densidade celular viável total é determinada pela média grande de contagens em duplicata de 4 amostras independentes. O processo de Gen 2 provê um produto de TIL de dose similar a Gen 1 (média de Gen 1 = 4,10x1010 ± 2,8x1010, média de Gen 2 = 4,12x1010 ± 2,5x1010). (B) A taxa de crescimento é calculada para a fase REP como gr = ln(N(t)/N(0))/t. (C) A viabilidade celular foi avaliada de 9 lotes de desenvolvimento de processo usando Cellometer K2, como previamente descrito. Nenhuma diminuição significante em viabilidade celular foi observada após um ciclo único de congelamento-descongelamento do produto formulado. Redução de meio em viabilidade quando do descongelamento e amostragem é 2,19%.

[00212] Figuras 96A-96C: Produtos de Gen 2 são culturas altamente puras de células T que expressam moléculas co-estimulatórias em níveis comparáveis a Gen 1. (A) produtos de fármacos formulados frescos foram testados para identificar por citometria de fluxo para liberação. Processo de Gen 1 e Gen 2 produzem culturas de alta pureza de células T como definido por CD45+,CD3+ (duplo positivo) fenótipo. (B & C) frascos tipo satélite crioconservados de produto de fármaco formulado foram descongelados e testados para fenótipo estendido por citometria de fluxo como previamente descrito. Produtos de Gen 1 e Gen 2 expressam níveis similares de moléculas co-estimulatórias CD27 e CD28 em subconjuntos de células T. As moléculas

42 / 557 coestimulatórias tal como CD27 e CD28 são requeridas para prover sinalização secundária e terciária necessária para proliferação celular de efetor quando do envolvimento do receptor de células T. Valor P foi calculado usando teste ‘t’ de Mann-Whitney.

[00213] Figura 97: Produtos de Gen 2 exibem comprimento similar dos telômeros. No entanto, algumas populações de TILs podem tender para um telômero relativo mais longo.

[00214] Figura 98: Os produtos de fármacos de Gen 2 secretam IFNγ em resposta a envolvimento de CD3, CD28, e CD137.

[00215] Figuras 99A-99B: Diversidade de receptor de células T. (A) Sequências de CDR3 únicas foram indexadas com relação a frequência em cada produto para dar uma pontuação representativa da diversidade global de receptores de células T no produto. (B) O número total médio de sequências de CDR3 únicas presentes em cada produto de infusão.

[00216] Figura 100: Uma modalidade de um processo de fabricação de TILs da presente invenção.

[00217] Figura 101: Intensificação em expansão durante o pré-REP com IL-2/IL-15/IL-21 em múltiplas histologias de tumor.

[00218] Figuras 102A-102B: IL-2/IL-15/IL-21 intensificou a porcentagem de células CD8+ em carcinoma de pulmão, mas não em melanoma. TILs derivados de (A) melanoma (n=4), e (B) pulmão (n=7) foram avaliados fenotipicamente para células CD4+ e CD8+ usando citometria de fluxo após pré-REP.

[00219] Figuras 103A-103B: Expressão de CD27 foi levemente melhorada em células CD8+ em culturas tratadas com IL-2/IL-15/IL-21. TILs derivados de (A) melanoma (n=4), e (B) pulmão (n=7) foram avaliados fenotipicamente para CD27+ e CD28+ nas células CD4+ e CD8+ usando citometria de fluxo após pré-REP.

[00220] Figuras 104A-104B: Os subconjuntos de células T foram

43 / 557 inalterados com a adição de IL-15/IL-21. TILs foram avaliados fenotipicamente para subconjuntos de efetor/memória (CD45RA e CCR7) em células CD8+ e CD4+ (dados não mostrados) de (A) melanoma (n=4), e (B) pulmão (n=8) via citometria de fluxo após pré-REP.

[00221] Figuras 105A-105C: Capacidade funcional de TIL foi intensificada de modo diferente com IL-2/IL-15/IL-21. TILs derivados de (A) melanoma (n=4) e (B) pulmão (n=5) foram avaliados para a expressão de CD107a+ em resposta a estimulação com PMA durante 4 horas nas células CD4+ e CD8+, por citometria de fluxo. (C) TILs pré-REP derivados de melanoma e pulmão foram estimulados por 24 horas com anticorpo anti-CD3 solúvel e os sobrenadantes avaliados para IFNγ por ELISA.

[00222] Figuras 106A-106B: O repertório de TCRvβ (24 especificidades) foi avaliado em TILs derivados de um tumor de (A) melanoma e (B) pulmão usando o kit Beckman Coulter para citometria de fluxo.

[00223] Figura 107: Esquema de processo de fabricação de LN-144 crioconservado de Gen 2.

[00224] Figura 108: Esquema de projeto de estudo de experiência clínica fase 2 de centro múltiplo de TILs crioconservados novos administrados a pacientes com melanoma metastático.

[00225] Figura 109: Tabela ilustrando as características de paciente de comparação de Coorte 1 (ASCO 2017) versus Coorte 2.

[00226] Figura 110: Tabela ilustrando eventos adversos emergentes do tratamento (≥ 30%).

[00227] Figura 111: Eficácia do produto de infusão e terapia com TILs.

[00228] Figura 112: Estado clínico de pacientes avaliáveis em resposta com SD ou uma resposta melhor.

[00229] Figura 113: Mudança percentual em soma de diâmetros.

[00230] Figura 114: Um aumento de nível de HMGB1 foi observado

44 / 557 no tratamento com TIL.

[00231] Figura 115: Um aumento no biomarcador IL-10 foi observado após infusão de LN-144.

[00232] Figura 116: Características de paciente atualizadas para Coorte 2 da experiência clínica em fase 2 em melanoma metastático a partir do segundo corte de dados (N = 17 pacientes).

[00233] Figura 117: Eventos adversos emergentes de tratamento para Coorte 2 (≥ 30%) a partir do segundo corte de dados (N = 17 pacientes).

[00234] Figura 118: Tempo para resposta para pacientes avaliáveis (doença estável ou melhor) em Coorte 2 a partir do segundo corte de dados (N = 17 pacientes). Dos 10 pacientes no conjunto de eficácia, um paciente (Paciente 10) não foi avaliável devido a uma morte relacionada com melanoma antes da primeira avaliação de tumor não representada na figura.

[00235] Figura 119: Dados de eficácia atualizados para Coorte 2 a partir do segundo corte de dados (N = 17 pacientes). O número médio de TILs infundidos é 34 × 109. O número mediano de terapias anteriores foi de 4.5. Pacientes com uma mutação BRAF responderem, assim como pacientes com BRAF tipo selvagem (a * refere-se a pacientes com uma mutação BRAF). Um paciente (Paciente 10) um paciente (Paciente 10) não foi avaliável devido a uma morte relacionada com melanoma antes da primeira avaliação de tumor mas ainda foi considerado no conjunto de eficácia. Abreviaturas: PR, resposta parcial; SD, doença estável; PD, doença progressiva.

[00236] Figura 120: Dados de eficácia atualizados para pacientes avaliáveis de Coorte 2 do segundo corte de dados (N = 17 pacientes). O * indica um paciente não avaliável que não alcançou a primeira avaliação. Todos os pacientes avaliáveis em eficácia tinha recebido anteriormente terapias com inibidor de ponto de verificação anti-PD-1 e anti-CTLA-4.

[00237] Figura 121: Tomografia computadorizada representativa de um paciente (003-015) com um PR de Coorte 2, segundo corte de dados.

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[00238] Figura 122: Correlação de indução de IFN-γ por produto de TIL antes de infusão com redução clínica em tamanho do tumor em Dia 42 após infusão de TIL.

[00239] Figura 123: Níveis de IP-10 (CXCL10) (pg/mL, log10) pré- e pós-infusão de uma modalidade de produto TIL Gen 2. IP-10 é um marcador de adesão celular e endereçamento.

[00240] Figura 124: Níveis de IP-10 (CXCL10) (pg/mL, log10) pré- e pós-infusão de uma modalidade de produto TIL Gen 1.

[00241] Figura 125: Níveis de MCP-1 (pg/mL, log10) pré- e pós- infusão de uma modalidade de produto TIL Gen 2. MCP-1 é um marcador de adesão celular e endereçamento (homing).

[00242] Figura 126: Níveis de MCP-1 (pg/mL, log10) pré- e pós- infusão de uma modalidade de produto TIL Gen 1.

[00243] Figura 127: Dados dos estudos de Fase 2 em carcinoma cervical e carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço (HNSCC). SD = doença estável. PR = doença progressiva. PR = resposta parcial.

[00244] Figura 128: Mostra um diagrama de uma modalidade de processo 2A, um processo de 22 dias para a fabricação de TIL.

[00245] Figura 129: Mostra um esquema da solda estéril (ver, Nota de Processo 5.11 em Exemplo 30) do oacote de transferência de suspensão de TILs para o fundo (linha única) de um filtro de sangue por gravidade. Figura 130: Mostra um esquema da solda estéril (ver, Nota de Processo 5.11 em Exemplo 30) a linha de remoção de meio vermelho do GRex100MCS para o pacote de transferência “Sobrenadante”. Figura 131: Mostra um esquema da solda (ver, Nota de Processo 5.11 em Exemplo 30) 4S-4M60 para uma conexão de celulas CC2, substituindo uma espícula única do aparelho de conexão de células (B) com a extremidade de espícula 4 do coletor 4S-4M60 a (G).

[00246] Figura 132: Mostra um esquema da solda (ver, Nota de

46 / 557 Processo 5.11 em Exemplo 30) transferência de fluido repetidor fixada em uma das extremidade do luer macho de 4S-4M60.

[00247] Figura 133: Mostra um esquema da solda estéril (ver, Nota de Processo 5.11 em Exemplo 30) a extremidade longa de terminal do filtro de sangue por gravidade para a bolsa de fonte LOVO.

[00248] Figura 134: Mostra um esquema da solda estéril (ver, Nota de Processo 5.11em Exemplo 30) one das duas linhas de fonte do filtro para a bolsa de colta da “suspensão de TILs pooled”.

[00249] Figura 135: Mostra um esquema da solda estéril (ver, Nota de Processo 5.11 em Exemplo 30) a 4S-4M60 para um contador de células CC2 substituindo uma espícula única do aparelho de conexão de células (B) com a estremidade de espícula 4 do coletor 4S-4M60 a (G).

[00250] Figura 136: Mostra um esquema da solda estéril (ver, Nota de Processo 5.11 em Exemplo 30) como criobolsas CS750 para a interface de tubos preparada na Etapa 8.14.8, substituindo uma das quatro extremidades de luer macho (E) com cada bolsa.

[00251] Figura 137: Mostra um esquema da solda (ver, Nota de Processo 5.11 em Exemplo 30) das bolsas CS-10 para espículas do 4S-4M60.

[00252] Figura 138: Mostra um esquema da solda (ver, Nota de Processo 5.11 em Exemplo 30) para a bolsa de “TIL formulada” para a espícula restante (A) no aparelho preparada na Etapa 8.14.10.

[00253] Figura 139: Mostra um diagrama da selagem térmica (ver, Nota de Processo 5.12 em Exemplo 30) at F, removendo a bolsa de retito vazia e as bolsas de CS-10.

[00254] Figura 140: Mostra estruturas I-A e I-B, os cilindros se referem a domínios de ligação de polipeptídeos individuais. Estruturas I-A e I-B compreendem três domínios de ligação de TNFRSF linearmente ligados derivados de, por exemplo, 4-1BBL ou um anticorpo que se liga a 4-1BB, que duplica para formar uma proteína trivalente, que é então ligada a uma segunda

47 / 557 proteína trivalente através de IgG1-Fc (incluindo domínios CH3 e CH2) é então usado para ligar as duas proteínas trivalentes juntas através de ligações dissulfeto (ovais alongados estreitos), estabilizando a estrutura e fornecendo agonistas capazes de reunir juntos os domínios de sinalização intracelulares dos seis receptores e proteínas de sinalização para formar um complexo de sinalização.

[00255] Figura 141: Apresenta um gráfico mostrando o esboço das 3 fases do experimento, como discutido em Exemplo 21.

BREVE DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[00256] SEQ ID NO:1 é a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de muromonab.

[00257] SEQ ID NO:2 é a sequência de aminoácidos da cadeia leve de muromonab.

[00258] SEQ ID NO:3 é a sequência de aminoácidos de uma proteína IL-2 recombinante humana.

[00259] SEQ ID NO:4 é a sequência de aminoácidos de aldesleucina.

[00260] SEQ ID NO:5 é a sequência de aminoácidos de uma proteína IL-4 recombinante humana.

[00261] SEQ ID NO:6 é a sequência de aminoácidos de uma proteína IL-7 recombinante humana.

[00262] SEQ ID NO:7 é a sequência de aminoácidos de uma proteína IL-15 recombinante humana.

[00263] SEQ ID NO:8 é a sequência de aminoácidos de uma proteína IL-21 recombinante humana.

[00264] SEQ ID NO:9 é a sequência de aminoácido de 4-1BB humano.

[00265] SEQ ID NO:10 é a sequência de aminoácido de 4-1BB murino.

[00266] SEQ ID NO:11 é a cadeia pesada para o agonista de anticorpo monoclonal 4-1BB utomilumab (PF-05082566).

48 / 557

[00267] SEQ ID NO:12 é a cadeia leve para o agonista de anticorpo monoclonal 4-1BB utomilumab (PF-05082566).

[00268] SEQ ID NO:13 é a região variável de cadeia pesada (VH) para o agonista de anticorpo monoclonal 4-1BB utomilumab (PF-05082566).

[00269] SEQ ID NO:14 é a região variável de cadeia leve (VL) para o agonista de anticorpo monoclonal 4-1BB utomilumab (PF-05082566).

[00270] SEQ ID NO:15 é a CDRl de cadeia pesada para o agonista de anticorpo monoclonal 4-1BB utomilumab (PF-05082566).

[00271] ]SEQ ID NO:16 é a CDR2 de cadeia pesada para o agonista de anticorpo monoclonal 4-1BB utomilumab (PF-05082566).

[00272] SEQ ID NO:17 é a CDR3 de cadeia pesada para o agonista de anticorpo monoclonal 4-1BB utomilumab (PF-05082566).

[00273] SEQ ID NO:18 é a CDR1 de cadeia leve para o agonista de anticorpo monoclonal 4-1BB utomilumab (PF-05082566).

[00274] SEQ ID NO:19 é a CDR2 de cadeia leve para o agonista de anticorpo monoclonal 4-1BB utomilumab (PF-05082566).

[00275] SEQ ID NO:20 é a CDR3 de cadeia leve para o agonista de anticorpo monoclonal 4-1BB utomilumab (PF-05082566).

[00276] SEQ ID NO:21 é a cadeia pesada para o agonista de anticorpo monoclonal 4-1BB urelumab (BMS-663513).

[00277] SEQ ID NO:22 é a cadeia leve para o agonista de anticorpo monoclonal 4-1BB urelumab (BMS-663513).

[00278] SEQ ID NO:23 é a região variável de cadeia pesada (VH) para o agonista de anticorpo monoclonal 4-1BB urelumab (BMS-663513).

[00279] SEQ ID NO:24 é a região variável de cadeia leve (VL) para o agonista de anticorpo monoclonal 4-1BB urelumab (BMS-663513).

[00280] SEQ ID NO:25 é a CDR1 de cadeia pesada para o agonista de anticorpo monoclonal 4-1BB urelumab (BMS-663513).

[00281] SEQ ID NO:26 é a CDR2 de cadeia pesada para o agonista de

49 / 557 anticorpo monoclonal 4-1BB urelumab (BMS-663513).

[00282] SEQ ID NO:27 é a CDR3 de cadeia pesada para o agonista de anticorpo monoclonal 4-1BB urelumab (BMS-663513).

[00283] SEQ ID NO:28 é a CDR1 de cadeia leve para o agonista de anticorpo monoclonal 4-1BB urelumab (BMS-663513).

[00284] SEQ ID NO:29 é a CDR2 de cadeia leve para o agonista de anticorpo monoclonal 4-1BB urelumab (BMS-663513).

[00285] SEQ ID NO:30 é a CDR3 de cadeia leve para o agonista de anticorpo monoclonal 4-1BB urelumab (BMS-663513).

[00286] SEQ ID NO:46 é a sequência de aminoácido do ligando de 4- 1BB (4-1BBL).

[00287] SEQ ID NO:47 é uma porção solúvel do polipeptídeo 4-1BBL.

[00288] SEQ ID NO:48 é uma região variável de cadeia pesada (VH) para o anticorpo de agonista de 4-1BB 4B4-1-1 versão 1.

[00289] SEQ ID NO:49 é uma região variável de cadeia leve (VL) para o anticorpo de agonista de 4-1BB 4B4-1-1 versão 1.

[00290] SEQ ID NO:50 é uma região variável de cadeia pesada (VH) para o anticorpo de agonista de 4-1BB 4B4-1-1 versão 2.

[00291] SEQ ID NO:51 é uma região variável de cadeia leve (VL) para o anticorpo de agonista de 4-1BB 4B4-1-1 versão 2.

[00292] SEQ ID NO:52 é uma região variável de cadeia pesada (VH) para o anticorpo de agonista de 4-1BB H39E3-2.

[00293] SEQ ID NO:53 é uma região variável de cadeia leve (VL) para o anticorpo de agonista de 4-1BB H39E3-2.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Introdução

[00294] A terapia com células adotivas utilizando TILs cultivados ex vivo pelo protocolo de expansão rápida (REP) produziu terapia com células adotivas bem-sucedida após imunossupressão do hospedeiro em pacientes

50 / 557 com melanoma. Os parâmetros de aceitação de infusão atuais dependem de leituras da composição de TILs (por exemplo, CD28, CD8 ou CD4) e nas duplicações numéricas de expansão e viabilidade do produto REP.

[00295] Os protocolos atuais de REP provêem poucas informações sobre a saúde dos TILs que serão infundidos no paciente. As células T sofrem uma mudança metabólica profunda durante o curso de sua maturação de células T de naïve para efetoras (ver Chang, et al., Nat. Immunol. 2016, 17, 364, aqui expressamente incorporado em sua totalidade, e em particular para a discussão e marcadores do metabolismo anaeróbico e aeróbico). Por exemplo, células T naïve dependem da respiração mitocondrial para produzir ATP, enquanto células T efetoras maduras e saudáveis, como TILs, são altamente glicolíticas, confiando na glicólise aeróbica para prover os substratos bioenergéticos necessários para proliferação, migração, ativação e eficácia antitumoral.

[00296] Trabalhos anteriores relatam que é desejável limitar a glicólise e promover o metabolismo mitocondrial em TILs antes da transferência, pois as células que dependem fortemente da glicólise sofrerão privação de nutrientes na transferência adotiva, o que resulta na morte da maioria das células transferidas. Assim, a técnica ensina que a promoção do metabolismo mitocondrial pode promover a longevidade in vivo e, de fato, sugere o uso de inibidores da glicólise antes da indução da resposta imune. Ver Chang et al. (Chang, et al., Nat. Imunol. 2016, 17(364), A presente invenção é dirigida adicionalmente, em algumas modalidades, a métodos para avaliar e quantificar este aumento em saúde metabólica. Assim, a presente invenção provê métodos de testar a saúde relativa de uma população de TILs usando uma ou mais avaliações gerais de metabolismo, incluindo, mas não limitado a, taxas e quantidades de glicólise, fosforilação oxidativa, capacidade respiratória de reposição (SRC), e reserva glicolítica.

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[00297] Além disso, a presente invenção é dirigida adicionalmente, em algumas modalidades, a métodos para avaliar e quantificar este aumento em saúde metabólica. Assim, a presente invenção provê métodos de testar a saúde relativa de uma população de TILs usando uma ou mais avalições gerais de metabolismo, incluindo, mas não limitado a, taxas e quantidades de glicólise, fosforilação oxidativa, capacidade respiratória de reposição (SRC), e reserva glicolítica.

[00298] Além disso, avalições adicionais opcionais incluem, mas não são limitados a, produção de ATP, massa mitocondrial e absorção de glicose. II. Definições

[00299] Salvo definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado que é comumente entendido por um versado na técnica à qual esta invenção pertence. Todas as patentes e publicações aqui referidas são incorporadas por referência em sua totalidade.

[00300] O termo “in vivo” refere-se a um evento que ocorre no corpo de um indivíduo.

[00301] O termo “in vitro” refere-se a um evento que ocorre fora do corpo de um indivíduo. Os ensaios in vitro abrangem testes baseados em células nos quais são empregadas células vivas ou mortas e também podem abranger um teste sem células no qual não são empregadas células intactas.

[00302] O termo “ex vivo” refere-se a um evento que envolve o tratamento ou a realização de um procedimento em uma célula, tecido e/ou órgão que foi removido do corpo de um indivíduo. Adequadamente, a célula, tecido e/ou órgão podem ser devolvidos ao corpo do indivíduo em um método de cirurgia ou tratamento.

[00303] O termo “expansão rápida” significa um aumento no número de TILs específicos de antígenos de pelo menos cerca de 3 vezes (ou 4-, 5-, 6- , 7-, 8-, ou 9 vezes) durante um período de uma semana, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10 vezes (ou 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80-, ou 90

52 / 557 vezes) durante um período de uma semana, ou o mais preferivelmente pelo menos cerca de 100 vezes durante um período de uma semana. Vários protocolos de expansão rápida são apresentados abaixo.

[00304] Por “linfócitos infiltrando os tumores” ou “TILs” significa-se aqui uma população de células originalmente obtida como glóbulos brancos que deixaram a corrente sanguínea de um indivíduo e migraram em um tumor. TILs incluem, mas não são limitados a, células T citotóxicas CD8+ (linfócitos), Células T CD4+ Th1 e Th17, células killer naturais, células dendríticas e macrófagos M1. TILs incluem ambos TILs primários e secundários. “TILs primários” são os que são obtidos de amostras de tecido de pacientes como esboçado aqui (às vezes referidos como “recentemente coletados”), e “TILs secundários” são quaisquer populações de células TILs que foram expandidas ou proliferadas, como discutido aqui, incluindo, mas não limitadas TILs em bruto e TILs expandidos (“TILs REP” ou “TILs pós- REP”). As populações de células de TILs podem incluir TILs geneticamente modificados.

[00305] Por “população de células” (incluindo TILs) aqui significa um número de células que compartilham traços comuns. Em geral, populações geralmente estão na faixa de 1 X 106 a 1 X 1010 em número, com diferentes populações de TILs compreendendo diferentes números. Por exemplo, o crescimento inicial de TILs primários na presença de IL-2 resulta em uma população bruta de TILs de grosseiramente 1 × 108 células. A expansão REP é geralmente feita para prover populações de 1,5 × 109 a 1,5 × 1010 células para infusão.

[00306] Por “TILs crioconservados” aqui significa que TILs, ou primários, em volume, ou expandidos (TILs REP), são tratados e armazenados na faixa de cerca de -150°C a -60°C. Os métodos gerais para crioconservação são também descritos em algum ponto aqui, incluindo nos Exemplos. Para clareza, “TILs crioconservados” são distinguíveis de amostras

53 / 557 de tecido congelado que podem ser usadas como uma Fonte de TILs primários.

[00307] Por “TILs crioconservados descongelados” aqui significa uma população de TILs que foi previamente crioconservada e, então, tratada para retornar a temperatura ambiente ou maior, incluindo mas não limitado a temperaturas da cultura celular ou temperaturas em que TILs podem ser administrados a um paciente.

[00308] TILs podem ser geralmente definidos bioquimicamente, usando marcadores de superfície celular, ou funcionalmente, por sua capacidade de infiltrar tumores e efetuar tratamento. TILs podem ser geralmente categorizados por expressão de um ou mais das seguintes biomarcadores: CD4, CD8, TCR αβ, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1, e CD25. Adicionalmente e alternativamente, TILs podem ser funcionalmente definidos por sua capacidade de infiltrar tumores sólidos quando da re-introdução em um paciente.

[00309] O termo “meios de crioconservação” ou “meio de crioconservação” refere-se a qualquer meio que pode ser usado para a crioconservação de células. Tais meios podem incluir meios compreendendo 7% a 10% DMSO. Os meios exemplares incluem CryoStor CS10, Hyperthermasol, assim como combinações dos mesmos. O termo “CS10” refere-se a um meio de crioconservação que é obtido de Stemcell Technologies ou Biolife Soluções. O meio CS10 pode ser mencionado por seu nome comercial “CryoStor® CS10”. O meio CS10 é um meio livre de soro, e livre de componente animal que compreende DMSO.

[00310] O termo “célula T de memória central” refere-se a um subconjunto de células T que, no humano, são CD45R0+ e constitutivamente expressam CCR7 (CCR7hi) e CD62L (CD62hi). O fenótipo de superfície de células T de memória central também inclui TCR, CD3, CD127 (IL-7R), e IL-15R. Fatores de transcrição para células T de memória central incluem

54 / 557 BCL-6, BCL-6B, MBD2, e BMI1. As células T de memória central primariamente secretam IL-2 e CD40L como moléculas efetoras após o gatilho TCR. As células T de memória central são predominantes no compartimento CD4 no sangue, e no humano são proporcionalmente enriquecidas nos linfonodos e amígdalas.

[00311] O termo “célula T de memória efetora” refere-se a um subconjunto de células T de humanos ou mamíferos que, como as células T de memória central, são CD45R0+, mas que perderam a expressão constitutiva de CCR7 (CCR7lo) e são heterogêneas ou baixas para expressão de CD62L (CD62Llo). O fenótipo de superfície de células T de memória central também inclui TCR, CD3, CD127 (IL-7R), e IL-15R. Fatores de transcrição para células T de memória central incluem BLIMP1. As células T de memória efetora rapidamente secretam níveis elevados de citocinas inflamatórias após a estimulação antigênica, incluindo interferon-γ, IL-4, e IL-5. As células T de memória efetora são predominantes no compartimento CD8 no sangue, e nos humanos são proporcionalmente enriquecidas no pulmão, fígado, e intestino. As células T efetoras de memória CD8+ carregam grandes quantidades de perforina.

[00312] O termo “sistema fechado” refere-se a um sistema que é fechado para o ambiente externo. Qualquer sistema fechado apropriado para métodos de cultura celular pode ser empregado com os métodos da presente invenção. Os sistemas fechados incluem, por exemplo, mas não são limitados a, Gs de recipiente fechado Gs. Uma vez que um segmento de tumor é adicionado ao sistema fechado, o sistema não é aberto para o ambiente externo até os TILs estarem prontos para serem administrados ao paciente.

[00313] Os termos “fragmentando”, “fragmento”, e “fragmentado”, como usado aqui para descrever processos para romper um tumor, incluem métodos de fragmentação mecânica, tal como triturar, emendar, dividir e fatiar tecido tumoral, assim como qualquer outro método para romper a

55 / 557 estrutura física de um tecido tumoral.

[00314] Os termos “células mononucleares de sangue periférico” e “PBMCs” refere-se a uma célula de sangue periférico tendo um núcleo redondo, incluindo linfócitos (células T, células B, células NK ) e monócitos. Preferivelmente, as células mononucleares de sangue periférico são células mononucleares de sangue periférico irradiadas alogênicas. PBMCs são um tipo de célula apresentadora de antígenos.

[00315] O termo “anticorpo anti-CD3” refere-se a um anticorpo ou variante do mesmo, por exemplo, um anticorpo monoclonal e incluindo anticorpos humano, humanizado, quimérico ou murino que são dirigidos contra o receptor CD3 no receptor de antígeno de células T de células T maduras. Anticorpos anti-CD3 incluem OKT-3, também conhecido como muromonab. Anticorpos anti-CD3 também incluem o clone UHCT1, também conhecido como T3 e CD3ε. Outros anticorpos anti-CD3 incluem, por exemplo, otelixizumab, teplizumab, e visilizumab.

[00316] O termo “OKT-3” (também referido aqui como “OKT3”) refere-se a um anticorpo monoclonal ou biossimilar ou variante do mesmo, incluindo anticorpos humano, humanizado, quimérico, ou murino, dirigidos contra o receptor CD3 no receptor de antígeno de células T de células T maduras, e inclui formas comercialmente disponíveis, como OKT-3 (30 ng/mL, MACS GMP CD3 puro, Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA) e muromonab ou variantes, substituições de aminoácidos conservativas, glicoformas, ou biossimilares dos mesmos. As sequências de aminoácidos das cadeias pesada e leve de muromonab são dadas em Tabela 1 (SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2). Um hibridoma capaz de produzir OKT-3 é depositado com o American Type Culture Collection e designado com o número de acesso ATCC CRL 8001. Um hibridoma capaz de produzir OKT-3 é também depositado com European Collection of Authenticated Cell Culturas (ECACC) e designado com o número de catálogo 86022706.

56 / 557 TABELA 1. Sequências de aminoácidos de muromonab. Identificador Sequência (Símbolos de aminoácidos de uma letra) SEQ ID NO:1 QVQLQQSGAE LARPGASVKM SCKASGYTFT RYTMHWVKQR Muromonab cadeia PGQGLEWIGY INPSRGYTNY 60 pesada NQKFKDKATL TTDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARYY DDHYCLDYWG QGTTLTVSSA 120

KTTAPSVYPL APVCGGTTGS SVTLGCLVKG YFPEPVTLTW NSGSLSSGVH TFPAVLQSDL 180

YTLSSSVTVT SSTWPSQSIT CNVAHPASST KVDKKIEPRP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 240

PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN 300

STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE 360

LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW 420 QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 450 SEQ ID NO:2 QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSASSSVS YMNWYQQKSG Muromonab cadeia TSPKRWIYDT SKLASGVPAH 60 leve FRGSGSGTSY SLTISGMEAE DAATYYCQQW SSNPFTFGSG TKLEINRADT APTVSIFPPS 120

SEQLTSGGAS VVCFLNNFYP KDINVKWKID GSERQNGVLN SWTDQDSKDS TYSMSSTLTL 180 TKDEYERHNS YTCEATHKTS TSPIVKSFNR NEC 213

[00317] O termo “IL-2” (também referido aqui como “IL2”) refere-se a fator de crescimento de células T conhecido como interleucina-2, e inclui todas as formas de IL-2 incluindo formas de humanos e mamíferos, substituições de aminoácidos conservativas, glicoformas, biossimilares, e variantes dos mesmos. IL-2 é descrito, por exemplo, em Nelson, J. Imunol. 2004, 172, 3983-88 e Malek, Annu. Rev. Imunol. 2008, 26, 453-79, cujas descrições são incorporadas por referência aqui. A sequência de aminoácido de IL-2 humana recombinante apropriada para uso na invenção é dada em Tabela 2 (SEQ ID NO:3). Por exemplo, o termo IL-2 engloba formas humanas, recombinantes de IL-2, tal como aldesleucina (PROLEUKIN, comercialmente disponível de múltiplos provedores em 22 milhões de IU por frascos de uso único), assim como a forma de IL-2 recombinante comercialmente provida por CellGenix, Inc., Portsmouth, NH, USA (CELLGRO GMP) ou ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (Número de Catálogo CYT-209-b) e outros equivalentes comerciais de outros provedores. Aldesleucina (des-alanil-1, serina-125 IL-2 humana) é uma forma recombinante humana não glicosilada de IL-2 com um peso molecular

57 / 557 de aproximadamente 15 kDa. A sequência de aminoácido de aldesleucina apropriada para uso na invenção é dada em Tabela 2 (SEQ ID NO:4). O termo IL-2 também engloba formas peguiladas de IL-2, como descrito aqui, incluindo o profármaco de IL2 pré-peguilado NKTR-214, disponível de Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, USA. NKTR-214 e IL-2 peguilada apropriada para uso na invenção é descrita em Publicação de Pedido de Patente US No. US 2014/0328791 A1 e Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 2012/065086 Al, cujas descrições são incorporadas por referência aqui. As formas alternativas de IL-2 conjugada, apropriada para uso na invenção, são descritas em Patentes US Nos.

4.766.106, 5.206.344, 5.089.261 e 4902.502, cujas descrições são incorporadas por referência aqui. Formulações de IL-2 apropriadas para uso na invenção são descritas em Patente US No. 6.706.289, cuja descrição é incorporada por referência aqui. TABELA 2. Sequências de aminoácidos de interleucinas. Identificador Sequência (Símbolos de aminoácidos de uma letra) SEQ ID NO:3 MAPTSSSTKK TQLQLEHLLL DLQMILNGIN NYKNPKLTRM IL-2 humana LTFKFYMPKK ATELKHLQCL 60 recombinante (rhIL- EEELKPLEEV LNLAQSKNFH LRPRDLISNI NVIVLELKGS 2) ETTFMCEYAD ETATIVEFLN 120 RWITFCQSII STLT 134 SEQ ID NO:4 PTSSSTKKTQ LQLEHLLLDL QMILNGINNY KNPKLTRMLT Aldesleucina FKFYMPKKAT ELKHLQCLEE 60

ELKPLEEVLN LAQSKNFHLR PRDLISNINV IVLELKGSET TFMCEYADET ATIVEFLNRW 120 ITFSQSIIST LT 132 SEQ ID NO:5 MHKCDITLQE IIKTLNSLTE QKTLCTELTV TDIFAASKNT recombinante TEKETFCRAA TVLRQFYSHH 60 humana IL-4 EKDTRCLGAT AQQFHRHKQL IRFLKRLDRN LWGLAGLNSC (rhIL-4) PVKEANQSTL ENFLERLKTI 120 MREKYSKCSS 130 SEQ ID NO:6 MDCDIEGKDG KQYESVLMVS IDQLLDSMKE IGSNCLNNEF IL-7 humana NFFKRHICDA NKEGMFLFRA 60 recombinante ARKLRQFLKM NSTGDFDLHL LKVSEGTTIL LNCTGQVKGR (rhIL-7) KPAALGEAQP TKSLEENKSL 120 KEQKKLNDLC FLKRLLQEIK TCWNKILMGT KEH 153 SEQ ID NO:7 MNWVNVISDL KKIEDLIQSM HIDATLYTES DVHPSCKVTA recombinante MKCFLLELQV ISLESGDASI 60 humana IL-15 HDTVENLIIL ANNSLSSNGN VTESGCKECE ELEEKNIKEF (rhIL-15) LQSFVHIVQM FINTS 115 SEQ ID NO:8 MQDRHMIRMR QLIDIVDQLK NYVNDLVPEF LPAPEDVETN IL-21 humana CEWSAFSCFQ KAQLKSANTG 60 recombinante NNERIINVSI KKLKRKPPST NAGRRQKHRL TCPSCDSYEK (rhIL-21) KPPKEFLERF KSLLQKMIHQ 120 HLSSRTHGSE DS 132

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[00318] O termo “IL-4” (também referido aqui como “IL4”) refere-se a citocina conhecida como interleucina 4, que é produzida por células T Th2 e por eosinófilos, basófilos, e células-tronco. IL-4 regula a diferenciação de células T auxiliares naïve (células Th0) a células T Th2. Steinke e Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70. Quando da ativação por IL-4, as células T Th2 subsequentemente produzem IL-4 adicional em um circuito de realimentação positivo. IL-4 também estimula B proliferação celular e expressão de MHC de classe II, e induz comutação de classe para expressão de IgE e IgG1 de células B. IL-4 humana recombinante apropriada para uso na invenção é comercialmente disponível de múltiplos provedores, incluindo ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (Número de Catálogo CYT-211) e ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (proteína IL-15 recombinante humana Número de Catálogo Gibco CTP0043). A sequência de aminoácido de IL-4 humana recombinante apropriada para uso na invenção é dada em Tabela 2 (SEQ ID NO:5).

[00319] O termo “IL-7” (também referido aqui como “IL7”) refere-se a uma citocina glicosilada derivada de tecido, conhecida como interleucina 7, que pode ser obtida a partir de células estromais e epiteliais, assim como de células dendríticas. Fry e Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904. IL-7 pode estimular o desenvolvimento de células T. IL-7 se liga ao receptor de IL-7, um heterodímero consistindo em receptor de IL-7 alfa e receptor de cadeia gama comum, que está em uma série de sinais importante para o desenvolvimento de células T dentro do timo e sobrevivência dentro da periferia. IL-7 humana recombinante apropriada para uso na invenção é comercialmente disponível de múltiplos provedores, incluindo ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (Número de Catálogo CYT-254) e ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (proteína IL-15 humana recombinante, Número de Catálogo Gibco PHC0071). A sequência de aminoácido de IL-7 humana recombinante apropriada para uso na invenção é

59 / 557 dada em Tabela 2 (SEQ ID NO:6).

[00320] O termo “IL-15” (também referido aqui como “IL15”) refere- se a fator de crescimento de células T conhecido como interleucina-15, e inclui todas as formas de IL-2 incluindo formas de humanos e mamíferos, substituições de aminoácidos conservativas, glicoformas, biossimilares, e variantes dos mesmos. IL-15 é descrita, por exemplo, em Fehniger e Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32, cuja descrição é incorporada por referência aqui. IL-15 compartilha as subunidades de receptor de sinalização β e γ com IL-2. IL-15 recombinante humana é uma cadeia de polipeptídeo única, não glicosilada, contendo 114 aminoácidos (e uma metionina N-terminal) com uma massa molecular de 12,8 kDa. IL-15 recombinante humana é comercialmente disponível de múltiplos provedores, incluindo ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (Número de Catálogo CYT-230- b) e ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (proteína IL-15 humana recombinante, Número de Catálogo 34-8159-82). A sequência de aminoácidos de IL-15 recombinante humana apropriada para uso na invenção é dada em Tabela 2 (SEQ ID NO:7).

[00321] O termo “IL-21” (também referido aqui como “IL21”) refere- se a proteína citocina pleiotrópica conhecida como interleucina-21, e inclui todas as formas de IL-21 incluindo formas de humanos e mamíferos, substituições de aminoácidos conservativas, glicoformas, biossimilares, e variantes dos mesmos. IL-21 é descrita, por exemplo, em Spolski e Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95, cuja descrição é incorporada por referência aqui. IL-21 é primariamente produzida por células T killer naturais e células T humanas ativadas CD4+. IL-21 humana recombinante é uma cadeia única de polipeptídeo não glicosilado contendo 132 aminoácidos com uma massa molecular de 15,4 kDa. IL-21 humana recombinante é comercialmente disponível de múltiplos provedores, incluindo ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (Número de Catálogo CYT-408-

60 / 557 b) e ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (proteína de IL-21 recombinante humana, Número de Catálogo 14-8219-80). A sequência de aminoácido de IL-21 humana recombinante apropriada para uso na invenção é dada em Tabela 2 (SEQ ID NO:8).

[00322] Quando “uma quantidade eficaz anti-tumor”, “uma quantidade eficaz inibindo tumor”, ou “quantidade terapêutica” é indicada, a quantidade precisa das composições da presente invenção a serem administradas pode ser determinada por um médico com consideração a diferenças individuais em idade, peso, tamanho do tumor, extensão de infecção ou metástase, e condição do paciente (indivíduo). Pode ser geralmente afirmado que uma composição farmacêutica compreendendo os linfócitos infiltrando os tumores (por exemplo, TILs secundários ou linfócitos citotóxicos geneticamente modificados) descritos aqui pode ser administrada a uma dosagem de 104 a 1011 células/kg peso corporal (por exemplo, 105 a 106, 105 a 1010, 105 a 1011, 106 a 1010, 106 a 1011, 107 a 1011, 107 a 1010, 108 a 1011, 108 a 1010, 109 a 1011, ou 109 a 1010 células/kg peso corporal), incluindo todos os valores inteiros dentro destas faixas. As composições de linfócitos infiltrando os tumores (incluindo, em alguns casos, linfócitos citotóxicos geneticamente modificados) também podem ser administradas múltiplas vezes nestas dosagens. Os linfócitos infiltrando os tumores (incluindo, em alguns casos, geneticamente) podem ser administrados usando técnicas de infusão que são comumente conhecidas em imunoterapia (ver, por exemplo, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988). A dosagem ótima e o regime de tratamento para um paciente particular podem ser prontamente determinados por um versado na técnica de medicina por monitoramento do paciente para sinais de doença e ajuste do tratamento, consequentemente.

[00323] O termo “malignidade hematológica” refere-se a cânceres e tumores mamíferos dos tecidos hematopoiéticos e linfóides, incluindo, entre outros, tecidos do sangue, medula óssea, linfonodos e sistema linfático. As

61 / 557 neoplasias hematológicas também são chamadas de “tumores líquidos”. As neoplasias hematológicas incluem, mas não são limitadas a, leucemia linfoblástica aguda (ALL), linfoma linfocítico crônico (CLL), linfoma linfocítico pequeno (SLL), leucemia mielóide aguda (AML), leucemia mielóide crônica (CML), leucemia monocítica aguda (AMoL), linfoma de Hodgkin e linfomas não de Hodgkin. O termo “malignidade hematológica das células B” refere-se a malignidades hematológicas que afetam as células B.

[00324] O termo “tumor sólido” refere-se a uma massa anormal de tecido que geralmente não contém cistos ou áreas líquidas. Tumores sólidos podem ser benignos ou malignos. O termo “câncer de tumor sólido” refere-se a tumores sólidos malignos, neoplásicos, ou cancerosos. Cânceres de tumores sólidos incluem, mas não são limitados a, sarcomas, carcinomas, e linfomas, tal como cânceres do pulmão, mama, próstata, cólon, reto, e bexiga. A estrutura de tecido de tumores sólidos inclui compartimentos de tecido interdependente incluindo a parênquima (células de câncer) e as células estromais de suporte, em que as células de câncer são dispersas e que podem prover um microambiente de suporte.

[00325] O termo “tumor líquido” refere-se a uma massa anormal de células que é de natureza fluida. Os cânceres de tumor líquido incluem, mas não são limitados a, leucemias, mielomas, e linfomas, assim como outras malignidades hematológicas. TILs obtidos de tumores líquidos também podem ser referidos aqui como linfócitos infiltrando na medula (MILs).

[00326] O termo “microambiente”, como usado aqui, pode fazer referência a um microambiente do tumor sólido ou hematológico como um todo ou como um subconjunto individual de células dentro do microambiente. O microambiente do tumor, como usado aqui, refere-se a uma mistura complexa de “células, fatores solúveis, moléculas de sinalização, matrizes extracelulares, e sugestões mecânicas que promovem a transformação neoplásica, suportam o crescimento do tumor, e invasão, protegem o tumor da

62 / 557 imunidade do hospedeiro, adotam resistência terapêutica e provêem nichos para as metástases dominantes prosperar”, como descrito em Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473. Embora os tumores expressem antígenos que seriam reconhecidos por células T, a depuração (clearance) do tumor pelo sistema imune é rara devido à supressão imune pelo microambiente.

[00327] Em uma modalidade, a invenção inclui um método de tratar um câncer com uma população de TILs, em que um paciente é pré-tratado com quimioterapia não mieloablativa antes de um infusão de TILs, de acordo com a invenção. Em algumas modalidades, uma população de TILs podem ser provida, em que um paciente é pré-tratado com quimioterapia não mieloablativa antes de um infusão de TILs de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, a quimioterapia não mieloablativa é ciclofosfamida 60 mg/kg/d durante 2 dias (dias 27 e 26 antes de infusão de TIL) e fludarabina 25 mg/m2/d durante 5 dias (dias 27 a 23 antes de infusão de TIL). Em uma modalidade, após quimioterapia não mieloablativa e infusão de TIL (em dia 0) de acordo com a invenção, o paciente recebe uma infusão intravenosa de IL-2 intravenosamente a 720.000 IU/kg a cada 8 horas para tolerância fisiológica.

[00328] Descobertas experimentais indicam que a linfodepleção antes de transferência adotiva de linfócitos T específicos de tumor desempenha um papel chave na intensificação da eficácia do tratamento por eliminação de células T regulatórias e elementos competidores do sistema imune (“poças de citocinas”). Consequentemente, algumas modalidades da invenção utilizam uma etapa de linfodepleção (às vezes também referida como “condicionamento imunossupressivo”) no paciente antes da introdução dos rTILs da invenção.

[00329] Os termos “co-administração”, “co-administrando”, “administrado em combinação com”, “administrando em combinação com”, “simultâneo”, e “concorrente”, como usados aqui, englobam a administração

63 / 557 de dois ou mais ingredientes farmacêuticos ativos (em uma modalidade preferida da presente invenção, por exemplo, pelo menos um agonista de canal de potássio em combinação com uma pluralidade de TILs) a um indivíduo de modo que ambos os ingredientes farmacêuticos ativos e/ou seus metabólitos estão presentes no indivíduo ao mesmo tempo. Co-administração inclui administração simultânea em composições separadas, administração em diferentes vezes em composições separadas, ou administração em uma composição em que dois ou mais ingredientes farmacêuticos ativos estão presentes. A administração simultânea em composições separadas e administração em uma composição em que ambos agentes estão presentes são preferidas.

[00330] O termo “quantidade eficaz” ou “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se à quantidade de um composto ou combinação de compostos como aqui descrito que é suficiente para efetuar a aplicação pretendida, incluindo, mas não limitado a, tratamento de doenças. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode variar dependendo da aplicação pretendida (in vitro ou in vivo) ou do indivíduo e da condição de doença a ser tratada (por exemplo, o peso, a idade e o sexo do indivíduo), a gravidade da condição da doença ou o modo de administração. O termo também se aplica a uma dose que induz uma resposta particular nas células alvo (por exemplo, a redução da adesão plaquetária e/ou migração celular). A dose específica variará de acordo com os compostos particulares escolhidos, o regime de dosagem a ser seguido, se o composto é administrado em combinação com outros compostos, o tempo de administração, o tecido ao qual é administrado e o sistema de liberação física no qual o composto é carreado.

[00331] Os termos “tratamento”, “tratando”, “tratar”, e similares, referem-se à obtenção de desejado efeito farmacológico e/ou fisiológico. O efeito pode profilático em termos de prevenção total ou parcial de uma doença ou sintoma da mesma e/ou pode ser terapêutico em termos de cura parcial ou

64 / 557 completa de uma doença e/ou efeito adverso atribuível à doença. “Tratamento”, como usado aqui, abrange qualquer tratamento de uma doença em um mamífero, particularmente em humanos, e inclui: (a) impedir que a doença ocorra em um indivíduo que pode estar predisposto à doença, mas ainda não foi diagnosticado como tendo a mesma; (b) inibir a doença, isto é, interromper seu desenvolvimento ou progressão; e (c) aliviar a doença, isto é, causar regressão da doença e/ou aliviar um ou mais sintomas da doença. “Tratamento” também se destina a abranger a liberação de um agente, a fim de proporcionar um efeito farmacológico, mesmo na ausência de uma doença ou condição. Por exemplo, “tratamento” abrange a liberação de uma composição que pode elicitar uma resposta imune ou conferir imunidade na ausência de uma condição de doença, por exemplo, no caso de uma vacina.

[00332] O termo “heterólogo” quando usado com referência a porções de um ácido nucleico ou proteína indica que o ácido nucleico ou proteína compreende duas ou mais subsequências que não são encontradas na mesma relação entre si na natureza. Por exemplo, o ácido nucleico é tipicamente produzido de forma recombinante, tendo duas ou mais sequências de genes não relacionados dispostas para formar um novo ácido nucleico funcional, por exemplo, um promotor de uma Fonte e uma região de codificação de outra Fonte ou regiões de codificação Fontes diferentes. Similarmente, uma proteína heteróloga indica que a proteína compreende duas ou mais subsequências que não são encontradas na mesma relação entre si na natureza (por exemplo, uma proteína de fusão).

[00333] Os termos “identidade de sequência”, “identidade percentual”, e “identidade percentual de sequência” (ou sinônimos dos mesmos, por exemplo, “99% idêntico”) no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou polipeptídeos, refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou têm uma porcentagem especificada de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos que são iguais, quando comparados e alinhados (introduzindo

65 / 557 lacunas, se necessário) para uma máxima correspondência, não considerando quaisquer substituições de aminoácidos conservativas como parte da identidade de sequência. A identidade percentual pode ser medida usando software de comparação de sequência ou algoritmos ou por inspeção visual. Vários algoritmos e software são conhecidos na técnica que podem ser usados para obter alinhamentos de sequências de aminoácidos ou nucleotídeos. Os programas apropriados para determinar a porcentagem de identidade de sequências incluem por exemplo a suite BLAST de programas disponíveis do site da web do U.S. Government’s National Center for Biotechnology Informação BLAST. Comparações entre as duas sequências podem ser realizadas usando ou o algoritmo BLASTN ou BLASTP. BLASTN é usado para comparar as sequências de ácido nucleico, enquanto BLASTP é usado para comparar as sequências de aminoácidos. ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California) ou MegAlign, disponível de DNASTAR, são programas de software adicionais publicamente disponíveis que podem ser usados para alinhar sequências. Um versado na técnica pode determinar parâmetros apropriados para o alinhamento máximo por um particular software de alinhamento. Em algumas modalidades, os parâmetros de default do software de alinhamento são usados.

[00334] Como usado aqui, o termo “variante” engloba mas é não limitado a anticorpos ou proteínas de fusão que compreendem uma sequência de aminoácido que difere da sequência de aminoácidos de um anticorpo de referência, por meio de uma ou mais substituições, deleções e/ou adições em certas posições dentro de ou adjacentes a uma sequência de aminoácidos do anticorpo de referência. A variante pode compreender uma ou mais substituições conservativas em sua sequência de aminoácidos, como comparado com a sequência de aminoácidos de um anticorpo de referência. As substituições conservativas podem envolver, por exemplo, a substituição de aminoácidos similarmente carregados ou não carregados. A variante retém

66 / 557 a capacidade para se ligar eespecíficoamente ao antígeno do anticorpo de referência. O termo variante também inclui anticorpos peguilados ou proteínas.

[00335] Por “linfócitos infiltrando os tumores” ou “TILs” aqui significa uma população de células originalmente obtida como células de sangue brancas que tinham deixado a corrente sanguínea de um indivíduo e migrado para um tumor. TILs incluem, mas não são limitados a, células T citotóxicas CD8+ (linfócitos), Células T CD4+ Th1 e Th17, células killer naturais, células dendríticas e macrófagos M1. TILs incluem ambos TILs primários e secundários. “TILs primários” são os que são obtidos de amostras de tecido de pacientes como esboçado aqui (às vezes referidos como “recentemente coletados”), e “TILs secundários” são quaisquer populações de células de TILs que foram expandidas ou proliferadas, como discutido aqui, incluindo, mas não limitado a TILs em bruto, TILs expandidos (“TILs REP”) assim como “TILs de reREP” como discutido aqui. TILs de reREP podem incluir, por exemplo, TILs de segunda expansão ou TILs de segunda expansão adicional (tal como, por exemplo, os descritos em Etapa D de Figura 27, incluindo TILs referidos como TILs de reREP).

[00336] TILs geralmente podem ser definidos ou bioquimicamente, usando marcadores de superfície celular, ou funcionalmente, por sua capacidade para infiltrar tumores e efetuar o tratamento. TILs podem ser geralmente categorizados por expressarem um ou mais das seguintes biomarcadores: CD4, CD8, TCR αβ, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1, e CD25. Adicionalmente, e alternativamente, TILs podem ser funcionalmente definidos por sua capacidade para infiltrar tumores sólidos quando da reintrodução em um paciente. TILs podem ser ainda caracterizados por potência – por exemplo, TILs podem ser considerado potentes se, por exemplo, liberação de interferon (IFN) é maior que cerca de 50 pg/mL, maior que cerca de 100 pg/mL, maior que cerca de 150 pg/mL, ou maior que cerca

67 / 557 de 200 pg/mL.

[00337] Os termos “carreador farmaceuticamente aceitável” ou “excipiente farmaceuticamente aceitáveis” são destinados a incluir qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores de absorção e ingredientes inertes. O uso de tais carreadores farmaceuticamente aceitáveis ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis para ingredientes farmacêuticos ativos é bem conhecido na técnica. Exceto no caso em que qualquer carreador farmaceuticamente aceitável ou excipiente farmaceuticamente aceitável convencional ser incompatível com o ingrediente farmacêutico ativo, seu uso nas composições terapêuticas da invenção é contemplado. Os ingredientes farmacêuticos ativos adicionais, tal como outros fármacos, também podem ser incorporados nas composições e métodos descritos.

[00338] Os termos “cerca de” e “aproximadamente” têm significado dentro de uma faixa estatisticamente significativo de um valor. Essa faixa pode estar dentro de uma ordem de grandeza, preferivelmente dentro de 50%, mais preferivelmente dentro de 20%, mais preferivelmente ainda dentro de 10%, e ainda mais preferivelmente dentro de 5% de um dado valor ou faixa. A variação permitida abrangida pelos termos “cerca de” ou “aproximadamente” depende do sistema específico em estudo e pode ser facilmente apreciada por um versado na técnica. Além disso, como usado aqui, os termos “cerca de” e “aproximadamente” significam que dimensões, tamanhos, formulações, parâmetros, formas e outras quantidades e características não são e não precisam ser exatas, mas podem ser aproximadas e/ou maiores ou menores, conforme desejado, refletindo tolerâncias, fatores de conversão, arredondamento, erro de medição e similares, e outros fatores conhecidos dos versados na técnica. Em geral, uma dimensão, tamanho, formulação, parâmetro, forma ou outra quantidade ou característica é “de cerca de” ou “aproximada”, seja ou não expressamente declarada como tal.

68 / 557 Note-se que modalidades de tamanhos, formas e dimensões muito diferentes podem empregar as disposições descritas.

[00339] Os termos de transição “compreendendo”, “consistindo essencialmente em” e “consistindo em”, quando usados nas reivindicações anexas, na forma original e emendada, definem o escopo da reivindicação em relação a quais elementos ou etapas adicionais não recitados da reivindicação, se houver, são excluídos do escopo da(s) reivindicação(ões). O termo “compreendendo” pretende ser inclusivo ou em aberto e não exclui nenhum elemento, método, etapa ou material adicional e não recitado. O termo “consistindo em” exclui qualquer elemento, etapa ou material que não seja o especificado na reivindicação e, neste último caso, impurezas comuns associadas ao(s) material(is) especificado(s). O termo “consistindo essencialmente em” limita o escopo de uma reivindicação aos elementos, etapas ou material(ais) especificados e àqueles que não afetam materialmente a(s) característica(s) básica(s) e nova(s) da invenção reivindicada. Todas as composições, métodos e kits aqui descritos que incorporam a presente invenção podem, em modalidades alternativas, ser mais eespecíficoamente definidos por qualquer um dos termos de transição “compreendendo”, “consistindo essencialmente em” e “consistindo em”. AGONISTAS DE 4-1BB (CD137)

[00340] Em uma modalidade, o agonista de TNFRSF é um agonista de 4-1BB (CD137). O agonista de 4-1BB pode ser qualquer molécula de ligação de 4-1BB conhecida na arte. A molécula de ligação de 4-1BB pode ser um anticorpo monoclonal ou proteína de fusão capaz de se ligar a um 4-1BB humano ou de mamífero. O agonista de moléculas de ligação de 4-1BBs ou 4- 1BB pode compreender uma cadeia pesada de imunoglobulina de qualquer isotipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina. O agonista de molécula de ligação de 4-1BB ou 4-1BB pode

69 / 557 ter tanto uma cadeia pesada como uma cadeia leve.

Como usado aqui, o termo molécula de ligação também inclui anticorpos (incluindo anticorpos de comprimento completo), anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento completo), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), anticorpos humanos, humanizados ou quiméricos e fragmentos de anticorpo, por exemplo, fragmentos Fab, fragmentos F(ab′), fragmentos produzidos pela biblioteca de expressão de Fab, fragmentos de ligação a epítopos de qualquer um dos acima, e formas modificadas de anticorpos, por exemplo, moléculas de scFv que se ligam a 4-1BB.

Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é uma proteína de ligação a antígeno que é um anticorpo completamente humano.

Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é uma proteína de ligação a antígeno que é um anticorpo humanizado.

Em algumas modalidades, agonistas de 4-1BB para uso nos métodos e composições atualmente descritos incluem anticorpos anti-4-1BB, anticorpos anti-4-1BB humanos, anticorpos anti-4-1BB camundongo, anticorpos anti-4-1BB mamíferos, anticorpos monoclonais anti-4-1BB, anticorpos policlonais anti-4-1BB, anticorpos anti- 4-1BB quiméricos, adnectinas anti-4-1BB, anticorpos de domínio anti-4-1BB, fragmentos anti-4-1BB de cadeia única, fragmentos anti-4-1BB de cadeia pesada, fragmentos anti-4-1BB de cadeia leve, proteínas de fusão anti-4-1BB, e fragmentos, derivados, conjugados, variantes, ou biossimilares dos mesmos. anticorpos anti-4-1BB agonísticos são conhecidos como induzindo fortes respostas imunes.

Lee, et al., PLOS One 2013, 8, e69677. Em uma modalidade preferida, o agonista de 4-1BB é um anticorpo monoclonal agonístico, anti-4-1BB, humanizado ou completamente humano (isto é, um anticorpo derivado de uma linhagem de célula única). Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é EU-101 (Eutilex Co.

Ltd.), utomilumab, ou urelumab, ou um fragmento, derivado, conjugado, variante, ou biossimilar do mesmo.

Em uma modalidade preferida, o agonista de 4-1BB é utomilumab ou urelumab,

70 / 557 ou um fragmento, derivado, conjugado, variante, ou biossimilar do mesmo.

[00341] Em uma modalidade preferida, o agonista de 4-1BB ou molécula de ligação a 4-1BB também pode ser uma proteína de fusão. Em uma modalidade preferida, um agonista de 4-1BB multimérico, tal como um agonista trimérico ou hexamérico de 4-1BB (com três ou seis domínios de ligação de ligando), podem induzir agrupamento do receptor (4-1BBL) superior e formação de complexo de sinalização celular interno comparado a um anticorpo monoclonal agonístico, que tipicamente possui dois domínios de ligação de ligando. As proteínas de fusão triméricas (trivalentes) ou hexaméricas (ou hexavalentes) ou maiores compreendendo três domínios de ligação de TNFRSF e IgG1-Fc e opcionalmente ligando adicionalmente duas ou mais destas proteínas de fusão são descritos, por exemplo, em Gieffers, et al., Mol. Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47.

[00342] Anticorpos de 4-1BB agonísticos e proteínas de fusão são conhecidas como induzindo fortes respostas imunes. Em uma modalidade preferida, o agonista de 4-1BB é um anticorpo monoclonal ou proteína de fusão que se liga especificamente ao antígeno de 4-1BB em um modo suficiente para reduzir toxicidade. Em algumas modalidades, o agonista de 4- 1BB é um anticorpo monoclonal 4-1BB agonístico ou proteína de fusão que anula a toxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), por exemplo citotoxicidade celular NK. Em algumas modalidades, o agonista de 4-1BB é um anticorpo monoclonal 4-1BB agonístico ou proteína de fusão que anula a fagocitose de células dependente de anticorpo (ADCP). Em algumas modalidades, o agonista de 4-1BB é um anticorpo monoclonal de 4-1BB agonístico ou proteína de fusão que anular a citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Em algumas modalidades, o agonista de 4-1BB é um anticorpo monoclonal agonístico de 4-1BB ou proteína de fusão que anula a funcionalidade de região Fc.

[00343] Em algumas modalidades, os agonistas de 4-1BB são

71 / 557 caracterizados por ligação a um 4-1BB humano (SEQ ID NO:9) com elevadas afinidade e atividade agonística. Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é a molécula de ligação que se liga a 4-1BB humano (SEQ ID NO:9). Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é a molécula de ligação que se liga a 4-1BB murino (SEQ ID NO:10). As sequências de aminoácidos de antígeno de 4- 1BB ao qual um agonista de 4-1BB ou molécula de ligação se liga são resumidas em Tabela 3. TABELA 3. Sequências de aminoácidos de antígenos de 4-1BB. Identificador Sequência (símbolos de aminoácido de uma letra) SEQ ID NO:9 MGNSCYNIVA TLLLVLNFER TRSLQDPCSN CPAGTFCDNN RNQICSPCPP human 4-1BB, NSFSSAGGQR 60 superfamília de TCDICRQCKG VFRTRKECSS TSNAECDCTP GFHCLGAGCS receptor de MCEQDCKQGQ ELTKKGCKDC 120 fator de necrose CFGTFNDQKR GICRPWTNCS LDGKSVLVNG TKERDVVCGP de tumor, SPADLSPGAS SVTPPAPARE 180 member 9 PGHSPQIISF FLALTSTALL FLLFFLTLRF SVVKRGRKKL LYIFKQPFMR (Homo sapiens) PVQTTQEEDG 240 CSCRFPEEEE GGCEL 255 SEQ ID NO:10 MGNNCYNVVV IVLLLVGCEK VGAVQNSCDN CQPGTFCRKY murine 4-1BB, NPVCKSCPPS TFSSIGGQPN 60 superfamília de CNICRVCAGY FRFKKFCSST HNAECECIEG FHCLGPQCTR CEKDCRPGQE receptor de LTKQGCKTCS 120 fator de necrose LGTFNDQNGT GVCRPWTNCS LDGRSVLKTG TTEKDVVCGP de tumor, PVVSFSPSTT ISVTPEGGPG 180 member 9 (Mus GHSLQVLTLF LALTSALLLA LIFITLLFSV LKWIRKKFPH IFKQPFKKTT musculus) GAAQEEDACS 240 CRCPQEEEGG GGGYEL 256

[00344] Em algumas modalidades, as composições, processos e métodos descritos incluem um agonista de 4-1BB que se liga a 4-1BB humano ou murino com um KD de cerca de 100 pM ou menor. se liga a 4- 1BB humano ou murino com um KD de cerca de 90 pM ou menor. se liga a 4- 1BB humano ou murino com um KD de cerca de 80 pM ou menor. se liga a 4- 1BB humano ou murino com um KD de cerca de 70 pM ou menor. se liga a 4- 1BB humano ou murino com um KD de cerca de 60 pM ou menor. se liga a 4- 1BB humano ou murino com um KD de cerca de 50 pM ou menor. se liga a 4- 1BB humano ou murino com um KD de cerca de 40 pM ou menor, ou se liga a 4-1BB humano ou murino com um KD de cerca de 30 pM ou menor.

[00345] Em algumas modalidades, as composições, processos e métodos descritos incluem um agonista de 4-1BB que se liga a um 4-1BB

72 / 557 humano ou murino com um kassoc de cerca de 7,5 × 105 1/M·s ou mais rápido. Se liga a um 4-1BB humano ou murino com um kassoc de cerca de 7,5 × 105 1/M·s ou mais rápido. Se liga a um 4-1BB humano ou murino com um kassoc de cerca de 8 × 105 l/M·s ou mais rápido. Se liga a um 4-1BB humano ou murino com um kassoc de cerca de 8,5 × 105 1/M·s ou mais rápido. Se liga a um 4-1BB humano ou murino com um kassoc de cerca de 9 × 105 1/M·s ou mais rápido. Se liga a um 4-1BB humano ou murino com um kassoc de cerca de 9,5 × 105 1/M·s ou mais rápido, ou se liga a um 4-1BB humano ou murino com um kassoc de cerca de 1 × 106 1/M·s ou mais rápido.

[00346] Em algumas modalidades, as composições, processos e métodos descritos incluem um agonista de 4-1BB que se liga a um 4-1BB humano ou murino com um kdissoc de cerca de 2 × 10-5 1/s ou mais lento. Se liga a um 4-1BB humano ou murino com um kdissoc de cerca de 2,1 × 10-5 1/s ou mais lento. Se liga a um 4-1BB humano ou murino com um kdissoc de cerca de 2,2 × 10-5 1/s ou mais lento. Se liga a um 4-1BB humano ou murino com um kdissoc de cerca de 2,3 × 10-5 1/s ou mais lento. Se liga a um 4-1BB humano ou murino com um kdissoc de cerca de 2,4 × 10-5 1/s ou mais lento. Se liga a um 4-1BB humano ou murino com um kdissoc de cerca de 2,5 × 10-5 1/s ou mais lento. Se liga a um 4-1BB humano ou murino com um kdissoc de cerca de 2,6 × 10-5 1/s ou mais lento ou se liga a um 4-1BB humano ou murino com um kdissoc de cerca de 2,7 × 10-5 1/s ou mais lento. Se liga a um 4-1BB humano ou murino com um kdissoc de cerca de 2,8 × 10-5 1/s ou mais lento. Se liga a um 4-1BB humano ou murino com um kdissoc de cerca de 2,9 × 10-5 1/s ou mais lento, ou se liga a um 4-1BB humano ou murino com um kdissoc de cerca de 3 × 10-5 1/s ou mais lento.

[00347] Em algumas modalidades, as composições, processos e métodos descritos incluem um agonista de 4-1BB que se liga a um 4-1BB humano ou murino com um IC50 de cerca de 10 nM ou menor. Se liga a um 4- 1BB humano ou murino com um IC50 de cerca de 9 nM ou menor. Se liga a

73 / 557 um 4-1BB humano ou murino com um IC50 de cerca de 8 nM ou menor. Se liga a um 4-1BB humano ou murino com um IC50 de cerca de 7 nM ou menor. Se liga a um 4-1BB humano ou murino com um IC50 de cerca de 6 nM ou menor. Se liga a um 4-1BB humano ou murino com um IC50 de cerca de 5 nM ou menor. Se liga a um 4-1BB humano ou murino com um IC50 de cerca de 4 nM ou menor. Se liga a um 4-1BB humano ou murino com um IC50 de cerca de 3 nM ou menor. Se liga a um 4-1BB humano ou murino com um IC50 de cerca de 2 nM ou menor, ou se liga a um 4-1BB humano ou murino com um IC50 de cerca de 1 nM ou menor.

[00348] Em uma modalidade preferida, o agonista de 4-1BB é utomilumab, também conhecido como PF-05082566 ou MOR-7480, ou um fragmento, derivado, variante ou biossimilar do mesmo. Utomilumab é disponível de Pfizer, Inc. Utomilumab é uma imunoglobulina G2-lambda, anti-[Homo sapiens TNFRSF9 (membro da superfamília de receptor de fator de necrose de tumor (TNFR) 9, 4-1BB, ILA de antígeno de células T, CD137)], anticorpo monoclonal (completamente humano) de Homo sapiens. As sequências de aminoácidos de utomilumab são especificadas na Tabela 4. Utomilumab compreende sítios de glicosilação a Asn59 e Asn292; pontes de dissulfeto intracadeia de cadeia pesada em posições 22-96 (VH-VL), 143-199 (CH1-CL), 256-316 (CH2) e 362-420 (CH3); pontes de dissulfeto intracadeia de cadeia leve em posições 22’-87’ (VH-VL) e 136’-195’ (CH1-CL); pontes de dissulfeto intracadeia de cadeia pesada-cadeia pesada em posições IgG2A de isoforma 218-218, 219-219, 222-222, e 225-225, em posições IgG2A/B de isoforma 218-130, 219-219, 222-222, e 225-225, e em posições IgG2B de isoforma 219-130 (2), 222-222, e 225-225; e pontes de dissulfeto intracadeia de cadeia pesada-cadeia leve em posições IgG2A de isoforma 130-213’ (2), posições IgG2A/B de isoforma 218-213’ e 130-213’, e em posições IgG2B de isoforma 218-213’ (2). A preparação e propriedades de utomilumab e suas variantes e fragmentos são descritos em Patente US Nos. 8.821.867;

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8.337.850; e 9.468.678, e Publicaçao de Pedido de Patente Internacional No. WO 2012/032433 A1, as descrições de cada sendo incorporadas por referência aqui. Características pré-clínicas de utomilumab são descritas em Fisher, et al., Cancer Immunolog. & Immunother. 2012, 61, 1721-33. As análises clínicas anteriores de utomilumab em várias indicações de tumores hematológicos e sólidos incluem U.S. National Institutes of Health clínicastrials.gov, com identificadores NCT02444793, NCT01307267, NCT02315066, e NCT02554812.

[00349] Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende uma cadeia pesada dada por SEQ ID NO:11 e uma cadeia leve dada por SEQ ID NO:12. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende cadeias pesadas e leves tendo as sequências mostradas em SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12, respectivamente, ou fragmentos de ligação ao antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variáveis de cadeia única (scFv), variantes, ou conjugados dos mesmos. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende cadeias pesadas e leves que são cada pelo menos 99% idênticas com as sequências mostradas em SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende cadeias pesadas e leves que são cada pelo menos 98% idênticas com as sequências mostradas em SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende cadeias pesadas e leves que são cada pelo menos 97% idênticas com as sequências mostradas em SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende cadeias pesadas e leves que são cada pelo menos 96% idênticas com as sequências mostradas em SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende cadeias pesadas e leves que são cada pelo menos 95% idênticas com as sequências mostradas em SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12, respectivamente.

[00350] Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB compreende as

75 / 557 CDRs de cadeia pesada e leve ou regiões variáveis (VRs) de utomilumab. Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada do agonista de 4-1BB (VH) compreende a sequência mostrada em SEQ ID NO:13, e a região variável de cadeia leve do agonista de 4-1BB (VL) compreende a sequência mostrada em SEQ ID NO:14, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende regiões VH e VL que são cada pelo menos 99% idênticas com as sequências mostradas em SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende regiões VH e VL que são cada pelo menos 98% idênticas com as sequências mostradas em SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende regiões VH e VL que são cada pelo menos 97% idênticas com as sequências mostradas em SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende regiões VH e VL que são cada pelo menos 96% idênticas com as sequências mostradas em SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende regiões VH e VL que são cada pelo menos 95% idênticas com as sequências mostradas em SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende um anticorpo de scFv compreendendo regiões VH e VL que são cada pelo menos 99% idênticas com as sequências mostradas em SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14.

[00351] Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende domínios de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada tendo as sequências especificadas em SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, e SEQ ID NO:17, respectivamente, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas, e domínios CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve tendo as sequências especificadas em SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, e SEQ ID NO:20, respectivamente, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas.

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[00352] Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é um agonista de 4- 1BB de anticorpo monoclonal biossimilar aprovado por autoridades reguladoras de fármacos com referência a utomilumab. Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal biossimilar compreende um anticorpo de 4-1BB compreendendo uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 97% identidade de sequência, por exemplo, 97%, 98%, 99% ou 100% identidade de sequência, para uma sequência de aminoácido de um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência e que compreende uma ou mais modificações pós-traducionais como comparado com o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é utomilumab. Em algumas modalidades, a uma ou mais modificações pós-traducionais são selecionadas dentre uma ou mais de: glicosilação, oxidação, deamidação, e truncação. Em algumas modalidades, o biossimilar é um anticorpo de agonista de 4-1BB autorizado ou submetido para autorização, em que o anticorpo de agonista de 4-1BB é provido em uma formulação que difere das formulações de um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é utomilumab. O anticorpo de agonista de 4-1BB pode ser autorizado por uma autoridade reguladora de fármacos com o FDA U.S. e/ou o EMA da União Europeia. Em algumas modalidades, o biossimilar é fornecido como uma composição que compreende adicionalmente um ou mais excipientes, em que o um ou mais excipientes são iguais ou diferentes dos excipientes constituídos em um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é utomilumab. Em algumas modalidades, o biossimilar é fornecido como uma composição que compreende adicionalmente um ou mais excipientes, em que o um ou mais excipientes são iguais ou diferentes dos excipientes constituídos em um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência,

77 / 557 em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é utomilumab. TABELA 4. Sequências de aminoácido para anticorpos de agonista de 4-1BB relacionados com utomilumab. Identificador Sequência (Símbolos de Aminoácido de Uma Letra) SEQ ID NO:11 EVQLVQSGAE VKKPGESLRI SCKGSGYSFS TYWISWVRQM cadeia pesada PGKGLEWMGK IYPGDSYTNY 60 para utomilumab SPSFQGQVTI SADKSISTAY LQWSSLKASD TAMYYCARGY GIFDYWGQGT LVTVSSASTK 120

GPSVFPLAPC SRSTSESTAA LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP AVLQSSGLYS 180

LSSVVTVPSS NFGTQTYTCN VDHKPSNTKV DKTVERKCCV ECPPCPAPPV AGPSVFLFPP 240

KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVQF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTFRVVSV 300

LTVVHQDWLN GKEYKCKVSN KGLPAPIEKT ISKTKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL 360

TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PMLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC 420 SVMHEALHNH YTQKSLSLSP G 441 SEQ ID NO:12 SYELTQPPSV SVSPGQTASI TCSGDNIGDQ YAHWYQQKPG cadeia leve para QSPVLVIYQD KNRPSGIPER 60 utomilumab FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCATY TGFGSLAVFG GGTKLTVLGQ PKAAPSVTLF 120

PPSSEELQAN KATLVCLISD FYPGAVTVAW KADSSPVKAG VETTTPSKQS NNKYAASSYL 180 SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP TECS 214 SEQ ID NO:13 EVQLVQSGAE VKKPGESLRI SCKGSGYSFS TYWISWVRQM região variável PGKGLEWMG KIYPGDSYTN 60 de cadeia pesada YSPSFQGQVT ISADKSISTA YLQWSSLKAS DTAMYYCARG para utomilumab YGIFDYWGQ GTLVTVSS 118 SEQ ID NO:14 SYELTQPPSV SVSPGQTASI TCSGDNIGDQ YAHWYQQKPG região variável QSPVLVIYQD KNRPSGIPER 60 de cadeia leve FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCATY TGFGSLAVFG GGTKLTVL para utomilumab 108 SEQ ID NO:15 STYWIS 6 CDR1 de cadeia pesada para utomilumab SEQ ID NO:16 KIYPGDSYTN YSPSFQG 17 CDR2 de cadeia pesada para utomilumab SEQ ID NO:17 RGYGIFDY 8 CDR3 de cadeia pesada para utomilumab SEQ ID NO:18 SGDNIGDQYA H 11 CDR1 de cadeia leve para utomilumab SEQ ID NO:19 QDKNRPS 7 CDR2 de cadeia leve para utomilumab

78 / 557 SEQ ID NO:20 ATYTGFGSLA V 11 CDR3 de cadeia leve para utomilumab

[00353] Em uma modalidade preferida, o agonista de 4-1BB é o anticorpo monoclonal urelumab, também conhecido como BMS-663513 e 20H4.9.h4a, ou um fragmento, derivado, variante ou biossimilar do mesmo. Urelumab é disponível de Bristol-Myers Squibb, Inc., e Creative Biolabs, Inc. Urelumab é uma imunoglobulina G4-kappa, anti-[Homo sapiens TNFRSF9 (membro da superfamília de receptor de fator de necrose de tumor 9, 4-1BB, ILA de antígeno de células T, CD137)], anticorpo monoclonal de Homo sapiens (completamente humano). As sequências de aminoácidos de urelumab são especificadas na Tabela 5. Urelumab compreende N-sítios de glicosilação em posições 298 (e 298’’); pontes de dissulfeto intracadeia de cadeia pesada em posições 22-95 (VH-VL), 148-204 (CH1-CL), 262-322 (CH2) e 368-426 (CH3) (e em posições 22’’-95’’, 148’’-204’’, 262’’-322’’, e 368’’- 426’’); pontes de dissulfeto intracadeia de cadeia leve em posições 23’-88’ (VH-VL) e 136’-196’ (CH1-CL) (e em posições 23’’’-88’’’ e 136’’’-196’’’); pontes de dissulfeto intracadeia de cadeia pesada-cadeia pesada em posições 227-227’’ e 230-230’’; e pontes de dissulfeto intracadeia de cadeia pesada- cadeia leve em 135-216’ e 135’’-216’’’. A preparação e propriedades de urelumab e suas variantes e fragmentos são descritas em Patente US Nos.

7.288.638 e 8.962.804, cujas descrições são incorporadas por referência aqui . As características preclínicas e clínicas e urelumab são descritas em Segal, et al., Clin. Cancer Res. 2016, disponível em http:/dx.doi.org/ 10.1158/1078-

0432.CCR-16-1272. As análises clínicas atuais de urelumab em várias indicações de tumor hematológico e sólido incluem U.S. National Institutes of Health clínicastrials.gov identificadores NCT01775631, NCT02110082, NCT02253992, e NCT01471210.

[00354] Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende uma cadeia pesada dada por SEQ ID NO:21 e uma cadeia leve dada por SEQ ID

79 / 557 NO:22. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende cadeias pesadas e leves tendo as sequências mostradas em SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:22, respectivamente, ou fragmentos de ligação ao antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variáveis de cadeia única (scFv), variantes, ou conjugados dos mesmos. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende cadeias pesadas e leves que são cada pelo menos 99% idênticas com as sequências mostradas em SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:22, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende cadeias pesadas e leves que são cada pelo menos 98% idênticas com as sequências mostradas em SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:22, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende cadeias pesadas e leves que são cada pelo menos 97% idênticas com as sequências mostradas em SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:22, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende cadeias pesadas e leves que são cada pelo menos 96% idênticas com as sequências mostradas em SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:22, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende cadeias pesadas e leves que são cada pelo menos 95% idênticas com as sequências mostradas em SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:22, respectivamente.

[00355] Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB compreende as CDRs de cadeia pesada e leve ou regiões variáveis (VRs) de urelumab. Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada de agonista de 4-1BB (VH) compreende a sequência mostrada em SEQ ID NO:23, e a região variável de cadeia leve do agonista de 4-1BB (VL) compreende a sequência mostrada em SEQ ID NO:24, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende regiões VH e VL que são cada pelo menos 99% idênticas com as sequências mostradas em SEQ ID NO:23 e SEQ ID NO:24, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende regiões VH e VL que são cada pelo menos 98% idênticas com as sequências mostradas em SEQ ID NO:23 e SEQ ID

80 / 557 NO:24, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende regiões VH e VL que são cada pelo menos 97% idênticas com as sequências mostradas em SEQ ID NO:23 e SEQ ID NO:24, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende regiões VH e VL que são cada pelo menos 96% idênticas com as sequências mostradas em SEQ ID NO:23 e SEQ ID NO:24, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende regiões VH e VL que são cada pelo menos 95% idênticas com as sequências mostradas em SEQ ID NO:23 e SEQ ID NO:24, respectivamente. Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende um anticorpo scFv compreendendo regiões VH e VL que são cada pelo menos 99% idênticas com as sequências mostradas em SEQ ID NO:23 e SEQ ID NO:24.

[00356] Em uma modalidade, um agonista de 4-1BB compreende domínios de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada tendo as sequências especificadas em SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, e SEQ ID NO:27, respectivamente, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas, e domínios de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve tendo as sequências especificadas em SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, e SEQ ID NO:30, respectivamente, e substituições de aminoácidos conservativas das mesmas.

[00357] Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é um agonista de 4- 1BB de anticorpo monoclonal biossimilar aprovado por autoridades reguladoras de fármacos com referência a urelumab. Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal biossimilar compreende um anticorpo 4-1BB compreendendo uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 97% identidade de sequência, por exemplo, 97%, 98%, 99% ou 100% identidade de sequência, para uma sequência de aminoácido de um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência e que compreende uma ou mais modificações pós-traducionais como comparado com o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de

81 / 557 referência ou produto biológico de referência é urelumab. Em algumas modalidades, a uma ou mais modificações pós-traducionais são selecionadas dentre um ou mais de: glicosilação, oxidação, deamidação, e truncação. Em algumas modalidades, o biossimilar é um anticorpo de agonista de 4-1BB autorizado ou submetido para autorização, em que o anticorpo de agonista de 4-1BB é fornecido em uma formulação que difere das formulações de um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é urelumab. O anticorpo de agonista de 4-1BB pode ser autorizado por uma autoridade reguladora de fármacos tal como a FDA U.S. e/ou EMA da União Europeia. Em algumas modalidades, o biossimilar é fornecido como uma composição que compreende adicionalmente um ou mais excipientes, em que o um ou mais excipientes são iguais ou diferentes dos excipientes constítuídos em um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é urelumab. Em algumas modalidades, o biossimilar é fornecido como uma composição que compreende adicionalmente um ou mais excipientes, em que o um ou mais excipientes são iguais ou diferentes dos excipientes constítuídos em um produto medicinal de referência ou produto biológico de referência, em que o produto medicinal de referência ou produto biológico de referência é urelumab. TABELA 5. Sequências de aminoácido para anticorpos de agonista de 4-1BB relacionados com urelumab. Identificador Sequência (Símbolos de Aminoácido de Uma Letra) SEQ ID NO:21 QVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVYGGSFS GYYWSWIRQS cadeia pesada PEKGLEWIGE INHGGYVTYN 60 para urelumab PSLESRVTIS VDTSKNQFSL KLSSVTAADT AVYYCARDYG PGNYDWYFDL WGRGTLVTVS 120

SASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS 180

SGLYSLSSVV TVPSSSLGTK TYTCNVDHKP SNTKVDKRVE SKYGPPCPPC PAPEFLGGPS 240

VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST 300

YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMT 360

82 / 557

KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE 420 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK 448 SEQ ID NO:22 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD cadeia leve para ASNRATGIPA 60 urelumab RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPPALTF CGGTKVEIKR TVAAPSVFIF 120

PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST 180 LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC 216 SEQ ID NO:23 MKHLWFFLLL VAAPRWVLSQ VQLQQWGAGL LKPSETLSLT cadeia pesada CAVYGGSFSG YYWSWIRQSP 60 variável para EKGLEWIGEI NHGGYVTYNP SLESRVTISV DTSKNQFSLK LSSVTAADTA urelumab VYYCARDYGP 120 SEQ ID NO:24 MEAPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS cadeia leve SYLAWYQQKP 60 variável para GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ urelumab 110 SEQ ID NO:25 GYYWS 5 CDR1 de cadeia pesada para urelumab SEQ ID NO:26 EINHGGYVTY NPSLES 16 CDR2 de cadeia pesada para urelumab SEQ ID NO:27 DYGPGNYDWY FDL 13 CDR3 de cadeia pesada para urelumab SEQ ID NO:28 RASQSVSSYL A 11 CDR1 de cadeia leve para urelumab SEQ ID NO:29 DASNRAT 7 CDR2 de cadeia leve para urelumab SEQ ID NO:30 QQRSDWPPAL T 11 CDR3 de cadeia leve para urelumab

[00358] Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é selecionado dentre o grupo consistindo em 1D8, 3Elor, 4B4 (BioLegend 309809), H4- 1BB-M127 (BD Pharmingen 552532), BBK2 (Thermo Fisher MS621PABX), 145501 (Leinco Technologies B591), o anticorpo produzido por linhagem celular depositada como ATCC No. HB-11248 e divulgada em Patente US No. 6,974,863, 5F4 (BioLegend 31 1503), C65-485 (BD Pharmingen 559446), anticorpos divulgados em Publicação de Pedido de Patente US No. US 2005/0095244, anticorpos divulgados em Patente US No. 7.288.638 (tal como 20H4.9-IgGl (BMS-663031)), anticorpos divulgados em Patente US

83 / 557 No. 6.887.673 (tal como 4E9 ou BMS-554271), anticorpos divulgados em Patente US No. 7.214.493, anticorpos divulgados em Patente US No.

6.303.121, anticorpos divulgados em Patente US No. 6.569.997, anticorpos divulgados em Patente US No. 6.905.685 (tal como 4E9 ou BMS-554271), anticorpos divulgados em Patente US No. 6.362.325 (tal como 1D8 ou BMS- 469492; 3H3 ou BMS-469497; ou 3El), anticorpos divulgados em Patente US No. 6.974.863 (tal como 53A2); anticorpos divulgados em Patente US No.

6.210.669 (tal como 1D8, 3B8, ou 3El), anticorpos descritos em Patente US No. 5.928.893, anticorpos divulgados em Patente US No. 6.303.121, anticorpos divulgados em Patente US No. 6.569.997, anticorpos divulgados em Publicação de Pedido de Patente Internacional Nos. WO 2012/177788, WO 2015/119923, e WO 2010/042433, e fragmentos, derivados, conjugados, variantes, ou biossimilares dos mesmos, em que a divulgação de cada uma das patentes ou publicações de pedidos de patentes acima é incorporada por referência aqui.

[00359] Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é uma proteína de fusão com agonista de 4-1Bbic, descrito Publicação de Pedido de Patente Internacional Nos. WO 2008/025516 A1, WO 2009/007120 A1, WO 2010/003766 A1, WO 2010/010051 A1, e WO 2010/078966 A1; Publicação de Pedido de Patente US Nos. US 2011/0027218 A1, US 2015/0126709 A1, US 2011/0111494 A1, US 2015/0110734 A1, e US 2015/0126710 A1; e Patentes US Nos. 9.359.420, 9.340.599, 8.921.519, e 8.450.460, cujas descrições são incorporadas por referência aqui .

[00360] Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é uma proteína de fusão com agonista de 4-1BBic como mostrado em Estrutura I-A (proteína de fusão de fragmento de anticorpo Fc C-terminal) ou Estrutura I-B (proteína de fusão de fragmento de anticorpo Fc N-terminal), ou um fragmento, derivado, conjugado, variante, ou biossimilar dos mesmos.

[00361] Em estruturas I-A e I-B, os cilindros referem-se a domínios de

84 / 557 ligação de polipeptídeo individuais (ver, Figura 140). Estruturas I-A e I-B compreendem três domínios de ligação de TNFRSF linearmente ligados derivados de por exemplo, 4-1BBL ou um anticorpo que se liga 4-1BB, que duplica para formar uma proteína trivalente, que é então ligada a uma segunda proteína trivalente através de IgG1-Fc (incluindo domínios CH3 e CH2) é então usada para ligar duas das proteínas trivalentes juntas através de ligações dissulfeto (ovais alongados pequenos), estabilizando a estrutura e fornecendo agonistas capazes de unir juntos os domínios de sinalização intracelular dos seis receptores e proteínas de sinalização para formar um complexo de sinalização. Os domínios de ligação de TNFRSF denotados como cilindros podem ser domínios scFv compreendendo, por exemplo, uma cadeia VH e uma VL conectadas por um ligador que pode compreender os resíduos e sequências Gly e Ser para flexibilidade, assim como Glu e Lys para solubilidade. Qualquer projeto de domínio de scFv pode ser usado, tal como os descritos em de Marco, Microbial Cell Factories, 2011, 10, 44; Ahmad, et al., Clin. & Dev. Immunol. 2012, 980250; Monnier, et al., Antibodies, 2013, 2, 193-208; ou em referências incorporadas em algum ponto aqui. As estruturas de proteína de fusão desta forma descritas em Patentes US Nos.

9.359.420, 9.340.599, 8.921.519, e 8.450.460, cujas descrições são incorporadas por referência aqui .

[00362] Sequências de aminoácido para os outros domínios de polipeptídeo de estrutura I-A são dadas em Tabela 6. O domínio Fc preferivelmente compreende um domínio constante completo (aminoácidos 17-230 de SEQ ID NO:31) o domínio de dobradiça completo (aminoácidos 1- 16 de SEQ ID NO:31) ou uma porção do domínio de dobradiça (por exemplo, aminoácidos 4-16 de SEQ ID NO:31). Os ligadores preferidos para conectar um Fc-anticorpo C-terminal podem ser selecionados dentre modalidades dadas em SEQ ID NO:32 a SEQ ID NO:41, incluindo ligadores apropriados para fusão de polipeptídeos adicionais.

85 / 557 TABELA 6. Sequências de aminoácido para proteínas de fusão de TNFRSF, incluindo proteínas de fusão 4-1BB, com um projeto de proteína de fusão de fragmento de anticorpo Fc C-terminal (estrutura I-A). Identificador Sequência (Símbolos de Aminoácido de Uma Letra) SEQ ID NO:31 KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP domínio Fc EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW 60

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS 120

KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 180

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 230 SEQ ID NO:32 GGPGSSKSCD KTHTCPPCPA PE 22 ligador SEQ ID NO:33 GGSGSSKSCD KTHTCPPCPA PE 22 ligador SEQ ID NO:34 GGPGSSSSSS SKSCDKTHTC PPCPAPE 27 ligador SEQ ID NO:35 GGSGSSSSSS SKSCDKTHTC PPCPAPE 27 ligador SEQ ID NO:36 GGPGSSSSSS SSSKSCDKTH TCPPCPAPE 29 ligador SEQ ID NO:37 GGSGSSSSSS SSSKSCDKTH TCPPCPAPE 29 ligador SEQ ID NO:38 GGPGSSGSGS SDKTHTCPPC PAPE 24 ligador SEQ ID NO:39 GGPGSSGSGS DKTHTCPPCP APE 23 ligador SEQ ID NO:40 GGPSSSGSDK THTCPPCPAP E 21 ligador SEQ ID NO:41 GGSSSSSSSS GSDKTHTCPP CPAPE 25 ligador

[00363] Sequências de aminoácido para os outros domínios de polipeptídeo de estrutura I-B são dadas emTabela 7. Se um fragmento de anticorpo Fc é fusionado no N-término de uma proteína de fusão de TNRFSF como em estrutura I-B, a sequência do módulo Fc é preferivelmente a mostrada em SEQ ID NO:42, e as sequências de ligador são preferivelmente selecionadas dentre as modalidades especificadas em SED ID NO:43 a SEQ ID NO:45. TABELA 7. Sequências de aminoácido para proteínas de fusão de TNFRSF, incluindo proteínas de fusão de 4-1BB, com projeto de proteína de fusão de fragmento de anticorpo Fc N-terminal (estrutura I-B). Identificador Sequência (Símbolos de Aminoácido de Uma Letra) SEQ ID NO:42 METDTLLLWV LLLWVPAGNG DKTHTCPPCP APELLGGPSV domínio Fc FLFPPKPKDT LMISRTPEVT 60

CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK 120

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CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 180

WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS 240 LSLSPG 246 SEQ ID NO:43 SGSGSGSGSG S 11 ligador SEQ ID NO:44 SSSSSSGSGS GS 12 ligador SEQ ID NO:45 SSSSSSGSGS GSGSGS 16 ligador

[00364] Em uma modalidade, uma proteína de fusão com agonista de 4-1BB de acordo com as estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios de ligação de 4-1BB selecionados dentre um grupo consistindo em cadeia pesada variável e cadeia leve variável de utomilumab, a cadeia pesada variável e cadeia leve variável de urelumab, a cadeia pesada variável e cadeia leve variável de utomilumab, a cadeia pesada variável e cadeia leve variável selecionadas dentre cadeias pesadas variáveis e cadeias leves variáveis descritas em Tabela 8, qualquer combinação da cadeia pesada variável e cadeia leve variável dos acima, e fragmentos, derivados, conjugados, variantes, e biossimilares as mesmas.

[00365] Em uma modalidade, uma proteína de fusão com agonista de 4-1BB de acordo com estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios de ligação de 4-1BB compreendendo uma sequência de 4-1BBL. Em uma modalidade, uma proteína de fusão com agonista de 4-1BB de acordo com estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios de ligação de 4-1BB compreendendo uma sequência de acordo com SEQ ID NO:46. Em uma modalidade, uma proteína de fusão com agonista de 4-1BB de acordo com estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios de ligação de 4-1BB compreendendo uma sequência de 4-1BBL solúvel. Em uma modalidade, uma proteína de fusão com agonista de 4-1BB de acordo com estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios de ligação de 4- 1BB compreendendo uma sequência de acordo com SEQ ID NO:47.

[00366] Em uma modalidade, uma proteína de fusão com agonista de 4-1BB de acordo com estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais

87 / 557 domínios de ligação de 4-1BB que é um domínio scFv compreendendo regiões VH e VL que são cada pelo menos 95% idênticas com as sequências mostradas em SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14, respectivamente, em que os domínios VH e VL são conectados por um ligador. Em uma modalidade, uma proteína de fusão com agonista de 4-1BB de acordo com estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios de ligação de 4-1BB qie é um domínio de scFv compreendendo regiões VH e VL que são cada pelo menos 95% idênticas com as sequências mostradas em SEQ ID NO:23 e SEQ ID NO:24, respectivamente, em que os de domínios VH e VL são conectados por um ligador. Em uma modalidade, uma proteína de fusão com agonista de 4-1BB de acordo com estruturas I-A ou I-B compreende um ou mais domínios de ligação de 4-1BB que é um domínio de scFv compreendendo regiões VH e VL que são cada pelo menos 95% idênticas às sequências de VH de VL dadas Tabela 8, em que os domínios de VH e VL são conectados por um ligador. TABELA 8. Domínios de polipeptídeo adicionais utilizáveis como domínios de ligação de 4-1BB em proteínas de fusão ou como agonista scFv de anticorpos 4-1BB. Identificador Sequência (Símbolos de Aminoácido de Uma Letra) SEQ ID NO:46 MEYASDASLD PEAPWPPAPR ARACRVLPWA LVAGLLLLLL 4-1BBL LAAACAVFLA CPWAVSGARA 60

SPGSAASPRL REGPELSPDD PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL 120

TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA 180

LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV 240 TPEIPAGLPS PRSE 254 SEQ ID NO:47 LRQGMFAQLV AQNVLLIDGP LSWYSDPGLA GVSLTGGLSY 4-1BBL KEDTKELVVA KAGVYYVFFQ 60 domínio LELRRVVAGE GSGSVSLALH LQPLRSAAGA AALALTVDLP PASSEARNSA solúvel FGFQGRLLHL 120

SAGQRLGVHL HTEARARHAW QLTQGATVLG LFRVTPEIPA GLPSPRSE 168 SEQ ID NO:48 QVQLQQPGAE LVKPGASVKL SCKASGYTFS SYWMHWVKQR cadeia pesada PGQVLEWIGE INPGNGHTNY 60 variável para NEKFKSKATL TVDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARSF TTARGFAYWG 4B4-1-1 QGTLVTVS 118 versão 1 SEQ ID NO:49 DIVMTQSPAT QSVTPGDRVS LSCRASQTIS DYLHWYQQKS HESPRLLIKY cadeia leve ASQSISGIPS 60 variável para RFSGSGSGSD FTLSINSVEP EDVGVYYCQD GHSFPPTFGG GTKLEIK 107 4B4-1-1 versão 1

88 / 557 SEQ ID NO:50 QVQLQQPGAE LVKPGASVKL SCKASGYTFS SYWMHWVKQR cadeia pesada PGQVLEWIGE INPGNGHTNY 60 variável para NEKFKSKATL TVDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARSF TTARGFAYWG 4B4-1-1 QGTLVTVSA 119 versão 2 SEQ ID NO:51 DIVMTQSPAT QSVTPGDRVS LSCRASQTIS DYLHWYQQKS HESPRLLIKY cadeia leve ASQSISGIPS 60 variável para RFSGSGSGSD FTLSINSVEP EDVGVYYCQD GHSFPPTFGG GTKLEIKR 108 4B4-1-1 versão 2 SEQ ID NO:52 MDWTWRILFL VAAATGAHSE VQLVESGGGL VQPGGSLRLS cadeia pesada CAASGFTFSD YWMSWVRQAP 60 variável para GKGLEWVADI KNDGSYTNYA PSLTNRFTIS RDNAKNSLYL QMNSLRAEDT H39E3-2 AVYYCARELT 120 SEQ ID NO:53 MEAPAQLLFL LLLWLPDTTG DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKSSQSLL cadeia leve SSGNQKNYL 60 variável para WYQQKPGQPP KLLIYYASTR QSGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA H39E3-2 110

[00367] Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é um agonista de 4- 1BBic polipeptídeo de fusão de cadeia única compreendendo (i) a first domínio de ligação de 4-1BB solúvel, (ii) um primeiro ligador de peptídeo, (iii) um segundo domínio de ligação de 4-1BB solúvel, (iv) um segundo ligador de peptídeo, e (v) um terceiro domínio de ligação de 4-1BB solúvel, compreendendo adicionalmente um domínio adicional na extremidade N- terminal e/ou C-terminal, e em que o domínio adicional é um domínio de fragmento Fab ou Fc. Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é um polipeptídeo de fusão de cadeia única com agonista de 4-1BBic compreendendo (i) um primeiro domínio de ligação de 4-1BB solúvel, (ii) um primeiro ligador de peptídeo, (iii) um segundo domínio de ligação de 4-1BB solúvel, (iv) um segundo ligador de peptídeo, e (v) um terceiro domínio de ligação de 4-1BB solúvel, adicionalmente compreendendo um domínio adicional na extremidade N-terminal e/ou C-terminal, em que o domínio adicional é domínio de fragmento Fab ou Fc, em que cada um dos domínios solúveis de 4-1BB falta uma região de hasta (que contribui para a trimerização e fornece uma certa distância para a membrana celular, mas não faz parte do domínio de ligação de 4-1BB) e o primeiro e o segundo ligadores de peptídeo independentmente tem um comprimento de 3-8 aminoácidos.

[00368] Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é um polipeptídeo de fusão de cadeia única com agonista de 4-1BBic compreendendo (i) um

89 / 557 primeiro domínio de citocina da superfamília de fator de necrose de tumor solúvel (TNF), (ii) um primeiro ligador de peptídeo, (iii) um segundo domínio de citocina da superfamília de TNF solúvel, (iv) um segundo ligador de peptídeo, e (v) um terceiro domínio de citocina da superfamília de TNF solúvel, em que cada um dos domínios de citocina da superfamília de TNF solúvel é desprovido de uma região de haste e o primeiro eo segundo ligadores de peptídeo têm, independentemente, um comprimento de 3-8 aminoiácidos, e em que cada domínio de citocina da superfamília de TNF é um domínio de ligação de 4-1BB.

[00369] Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é um anticorpo scFv de agonista de 4-1BBic compreendendo qualquer um dos domínios VH acima ligados a qualquer um dos domínios VL acima.

[00370] Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é anticorpo de agonista 4-1BB de BPS Bioscience, número de catálogo 79097-2, comercialmente disponível de BPS Bioscience, San Diego, CA, USA. Em uma modalidade, o agonista de 4-1BB é anticorpo de agonista 4-1BB de Creative Biolabs número de catálogo MOM-18179, comercialmente disponível de Creative Biolabs, Shirley, NY, USA. III. Processo de fabricação de TILs

[00371] Um processo de TIL exemplar, conhecido como processo 2A contendo algumas destas características é retratado na Figura 1, e algumas das vantagens desta modalidade da presente invenção sobre o processo 1C são descritas em Figura 2, assim como Figura 84. Processo 1C é mostrado para comparação em Figura 3. Duas linhas de tempo alternativas para terapia com TILs com base em processo 2A são mostradas em Figura 4 (maiores contagens celulares) e Figura 5 (menores contagens celulares). Uma modalidade de processo 2A é mostrada em Figura 6 assim como Figura 27. Figuras 83 e 84 provêem adicionalmente um processo 2A exemplar comparado com um processo 1C exemplar.

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[00372] Como discutido aqui, a presente invenção pode incluir uma etapa relacionada com a re-estimulação de TILs crioconservados para aumentar sua atividade metabólica e assim a saúde relativa antes de transplante em um paciente, e métodos de testar a referida saúde metabólica. Como geralmente esboçado aqui, TILs são geralmente retirados de uma amostra do paciente e manipulados para expandir seu número antes de transplante em um paciente. Em algumas modalidades, os TILs podem ser opcionalmente geneticamente manipulados, como discutido abaixo.

[00373] Em algumas modalidades, os TILs podem ser crioconservados. Uma vez descongelados, eles também podem ser reestimulados para aumentar seu metabolismo antes de infusão em um paciente.

[00374] Em algumas modalidades, a primeira expansão (incluindo processos referidos como o pré-REP assim como processos mostrados em Figura 27 como Etapa A) é encurtada a 3 a 14 dias e a segunda expansão (incluindo processos referidos como a REP, assim como processos mostrados em Figura 27 como Etapa B) é diminuída a 7 a 14 dias, como discutido em detalhes abaixo assim como nos exemplos e figuras. Em algumas modalidades, a primeira expansão (por exemplo, uma expansão descrita como Etapa B em Figura 27) é encurtada a 11 dias e a segunda expansão (por exemplo, uma expansão como descrita em Etapa D em Figura 27) é encurtada a 11 dias, como discutido nos Exemplos e mostrado em Figuras 4, 5 e 27. Em algumas modalidades, a combinação da primeira expansão e segunda expansão (por exemplo, expansões descritas como Etapa B e Etapa D em Figura 27) é encurtada a 22 dias, como discutido em detalhes abaixo e nos exemplos e figuras.

[00375] As designações de “Etapa” A, B, C, etc., abaixo são em referência a Figura 27 e em referência a algumas modalidades descritas aqui. A ordem das Etapas abaixo e em Figura 27 é exemplar e qualquer combinação ou ordem de etapas, assim como etapas adicionais, repetição de

91 / 557 etapas ou omissão de etapas é contemplado pelo presente pedido e os métodos divulgados aqui. A. ETAPA A: Obter amostra de tumor do paciente

[00376] Em geral, TILs são inicialmente obtidos de uma amostra de tumor do paciente (“TILs primários”) e, então, expandidos em uma maior população para manipulação adicional, como descrito aqui, opcionalmente crioconservados, reestimulados como esboçado aqui e opcionalmente avaliados para fenótipo e parâmetros metabólicos como uma indicação da saúde dos TILs.

[00377] Uma amostra de tumor do paciente pode ser obtida usando métodos conhecidos na técnica, geralmente via ressecção cirúrgica, biópsia por agulha ou outros meios para obter uma amostra que contenha uma mistura de tumor e células TIL. Em geral, a amostra de tumor pode ser de qualquer tumor sólido, incluindo tumores primários, tumores invasivos ou tumores metastáticos. A amostra de tumor também pode ser um tumor líquido, como um tumor obtido de uma malignidade hematológica. O tumor sólido pode ser de qualquer tipo de câncer, incluindo, sem limitação, mama, pancreático, próstata, colorretal, pulmão, cérebro, rim, estômago e pele (incluindo, mas sem limitação, carcinoma de célula escamosa, carcinoma basocelular e melanoma). Em algumas modalidades, TILs úteis são obtidos a partir de tumores malignos de melanoma, já que estes foram relatados como tendo níveis particularmente elevados de TILs.

[00378] O termo “tumor sólido” refere-se a uma massa anormal de tecido que geralmente não contém cistos ou áreas líquidas. Tumores sólidos podem ser benignos ou malignos. O termo “câncer de tumor sólido” refere-se a tumores sólidos malignos, neoplásicos, ou cancerosos. Os canceres de tumores sólidos incluem, mas não são limitados a, sarcomas, carcinomas, e linfomas, tal como cânceres do pulmão, mama, câncer de mama triplo negativo, próstata, cólon, reto, e bexiga. Em algumas modalidades, o câncer é

92 / 557 selecionado de câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço (incluindo, por exemplo, carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço (HNSCC)) glioblastoma, câncer ovariano, sarcoma, câncer pancreático, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de mama triplo negativo, e carcinoma de pulmão não de célula pequena. A estrutura do tecido de tumores sólidos inclui compartimentos de tecidos interdependentes incluindo a parenquima (células de câncer) e as células estromais de suporte em que as células de câncer são dispersas e que podem prover um microambiente de suporte.

[00379] O termo “malignidade hematológica” refere-se a cânceres e tumores de mamíferos dos tecidos hematopoiéticos e linfóides, incluindo, entre outros, tecidos do sangue, medula óssea, linfonodos e sistema linfático. As neoplasias hematológicas também são chamadas de “tumores líquidos”. As neoplasias hematológicas incluem, entre outras, leucemia linfoblástica aguda (ALL), linfoma linfocítico crônico (CLL), linfoma linfocítico pequeno (SLL), leucemia mielóide aguda (AML), leucemia mielóide crônica (CML), leucemia monocítica aguda (AMoL), linfoma de Hodgkin e linfomas não- Hodgkin. O termo “malignidade hematológica das células B” refere-se a malignidades hematológicas que afetam as células B.

[00380] Uma vez obtida, a amostra de tumor é geralmente fragmentada usando dissecção afiada em pedaços pequenos entre 1 a cerca de 8 mm3, com de cerca de 2-3 mm3 sendo particularmente utilizável. Os TILs são cultivados a partir destes fragmentos usando digestos de tumor enzimáticos. Tais digestos de tumor podem ser produzidos por incubação em meio enzimático (por exemplo, Tampão Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, 2 mM glutamato, 10 mcg/mL gentamicina, 30 unidades/mL de DNase e 1,0 mg/mL de colagenase), seguido por dissociação mecânica (por exemplo, usando um dissociador de tecido). Os digestos de tumor podem ser produzidos colocando o tumor em meio enzimático e mecanicamente dissociando o tumor durante aproximadamente 1 minuto, seguido por incubação durante 30 minutos a

93 / 557 37°C em 5% CO2, seguido por repetidos ciclos de dissociação mecânica e incubação sob as condições acima até somente pedaços de tecido pequenos estarem presentes. No final deste processo, se a suspensão celular contiver um grande número de células de sangue vermelhas ou células mortas, uma separação de gradiente de densidade, usando polissacarídeo hidrofílico ramificado FICOLL, pode ser realizada para remover estas células. Alternativos métodos conhecidos na técnica podem ser usados, tal como os descritos em Publicação de Pedido de Patente US No. 2012/0244133 A1, cuja descrição é incorporada por referência aqui. Qualquer um dos métodos acima pode ser usado em qualquer uma das modalidades descritas aqui para os métodos de expandir TILs ou métodos de tratar um câncer.

[00381] Em geral, a suspensão de células coletadas é chamada de “população celular primária” ou população de células “recém-coletadas”.

[00382] Em algumas modalidades, a fragmentação inclui fragmentação física, incluindo, por exemplo, dissecção, bem como digestão. Em algumas modalidades, a fragmentação é fragmentação física. Em algumas modalidades, a fragmentação é dissecção. Em algumas modalidades, a fragmentação é por digestão. Em algumas modalidades, os TILs podem ser cultivados inicialmente a partir de digestões enzimáticas de tumores e fragmentos de tumores obtidos de pacientes. Em uma modalidade, os TILs podem ser cultivados inicialmente a partir de digestões enzimáticas de tumores e fragmentos de tumores obtidos de pacientes.

[00383] Em algumas modalidades, onde o tumor é um tumor sólido, o tumor sofre fragmentação física após a amostra de tumor ser obtida em, por exemplo, Etapa A (como apresentado em Figura 27). Em algumas modalidades, a fragmentação ocorre antes da crioconservação. Em algumas modalidades, a fragmentação ocorre após crioconservação. Em algumas modalidades, a fragmentação ocorre após obter o tumor e na ausência de qualquer crioconservação. Em algumas modalidades, o tumor é fragmentado e

94 / 557 10, 20, 30, 40 ou mais fragmentos ou pedaços são colocados em cada recipiente para uma primeira expansão. Em algumas modalidades, o tumor é fragmentado e 30 ou 40 fragmentos ou pedaços são colocados em cada recipiente para a primeira expansão. Em algumas modalidades, o tumor é fragmentado e 40 fragmentos ou pedaços são colocados em cada recipiente para a primeira expansão. Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 4 a cerca de 50 fragmentos, em que cada fragmento tem um volume de cerca de 27 mm3. Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 30 a cerca de 60 fragmentos com um volume total de cerca de 1300 mm3 a cerca de 1500 mm3. Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 50 fragmentos com um volume total de cerca de 1350 mm3. Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 50 fragmentos com uma massa total de cerca de 1 grama a cerca de 1,5 gramas. Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 4 fragmentos.

[00384] Em algumas modalidades, os TILs são obtidos a partir de fragmentos de tumor. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor é obtido por dissecção afiada. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor tem entre cerca de 1 mm3 e 10 mm3. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor tem entre cerca de 1 mm3 e 8 mm3. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor tem cerca de 1 mm3. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor tem cerca de 2 mm3. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor tem cerca de 3 mm3. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor tem cerca de 4 mm3. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor tem cerca de 5 mm3. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor tem cerca de 6 mm3. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor tem cerca de 7 mm3. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor tem cerca de 8 mm3. Em algumas modalidades, o fragmento de tumor tem cerca de 9 mm3. Em algumas modalidades, o

95 / 557 fragmento de tumor tem cerca de 10 mm3. Em algumas modalidades, os tumores têm 1-4 mm x 1-4 mm x 1-4 mm. Em algumas modalidades, os tumores têm 1 mm x 1 mm x 1 mm. Em algumas modalidades, os tumores têm 2 mm x 2 mm x 2 mm. Em algumas modalidades, os tumores têm 3 mm x 3 mm x 3 mm. Em algumas modalidades, os tumores têm 4 mm x 4 mm x 4 mm.

[00385] Em algumas modalidades, os tumores foram resseccionados a fim de minimizar a quantidade de tecidos hemorrágicos, necróticos e/ou gordurosos em cada pedaço. Em algumas modalidades, os tumores foram resseccionados a fim de minimizar a quantidade de tecido hemorrágico em cada pedaço. Em algumas modalidades, os tumores foram resseccionados a fim de minimizar a quantidade de tecido necrótico em cada pedaço. Em algumas modalidades, os tumores foram resseccionados a fim de minimizar a quantidade de tecido gorduroso em cada pedaço.

[00386] Em algumas modalidades, a fragmentação do tumor é realizada a fim de manter a estrutura interna do tumor. Em algumas modalidades, a fragmentação do tumor é realizada em realizar o movimento de serrar com um bisturi. Em algumas modalidades, os TILs são obtidos a partir de digestos de tumor. Em algumas modalidades, digestos de tumor foram gerados por incubação em meio enzimático, por exemplo mas não limitado a RPMI 1640, 2 mM GlutaMAX, 10 mg/mL gentamicina, 30 U/mL DNase, e 1,0 mg/mL colagenase, seguido por dissociação mecânica (GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Após colocar o tumor em meio enzimático, o tumor pode ser mecanicamente dissociado durante aproximadamente 1 minuto. A solução pode ser então incubada durante 30 minutos a 37°C em 5% CO2 e então mecanicamente rompida novamente por aproximadamente 1 minuto. Após ser incubada novamente por 30 minutos a 37°C em 5% CO2, o tumor pode ser mecanicamente rompido uma terceira vez por aproximadamente 1 minuto. Em algumas modalidades, após a terceira

96 / 557 ruptura mecânica, se pedaços grandes de tecido estiverem presentes, 1 ou 2 dissociações mecânicas adicionais foram aplicadas à amostra, com ou sem 30 minutos de incubação adicionais a 37°C em 5% CO2. Em algumas modalidades, no final da incubação final, se a suspensão de células contiver um grande número de células de sangue vermelhas células mortas, uma separação de gradiente de densidade, usando Ficoll, pode ser realizada para remover estas células.

[00387] Em algumas modalidades, a suspensão de células coletadas antes da primeira etapa de expansão é chama um “população de células primárias” ou uma população de células “recentemente coletadas”.

[00388] Em algumas modalidades, células podem ser opcionalmente congeladas após a colheita da amostra e armazenadas congeladas para entrar na expansão descrita em Etapa B, que é descrita em detalhes adicionais abaixo, assim como exemplificadas em Figura 27. B. ETAPA B: Primeira Expansão

1. TILs jovens

[00389] Em algumas modalidades, os presentes métodos possibilitam a obtenção de TILs jovens, que são capazes de aumentar os ciclos de replicação quando da administração a um indivíduo/paciente e como tal podem proporcionar benefícios terapêuticos sobre os TILs mais velhos (isto é, TILs que que tinham ainda sofrido mais ciclos de replicação antes da administração a um indivíduo/paciente). As características de TILs jovens foram descritas na literatura, por exemplo Donia, at al., Scandinavian Journal of Imunology, 75:157–167 (2012); Dudley et al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010); Huang et al., J Imunother, 28(3):258–267 (2005); Besser et al., Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013); Besser et al., J Imunother 32:415–423 (2009); Robbins, et al., J Imunol 2004; 173:7125-7130; Shen et al., J Imunother, 30:123–129 (2007); Zhou, et al., J Imunother, 28:53–62 (2005); e Tran, et al., J Imunother, 31:742–751 (2008), todos sendo incorporados aqui por

97 / 557 referência em suas totalidades.

[00390] Os receptores de antígenos diversos de linfócitos T e B são produzidos por recombinação somática de um número limitado, porém grande, de segmentos de genes. Estes segmentos de genes: V (variável), D (diversidade), J (junção), e C (constante), determinam a especificidade de ligação e aplicações a jusante de imunoglobulinas e receptores de células T(TCRs). A presente invenção provê um método para gerar TILs que exibem e aumentam a diversidade do repertório de células T. Em algumas modalidades, os TILs obtidos pelo presente método exibem um aumento na diversidade do repertório de células T. Em algumas modalidades, os TILs obtidos pelo presente método exibem um aumento na diversidade do repertório de células T como comparado com TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, os TILs obtidos pelo presente método exibem um aumento na diversidade do repertório de células T como comparado com TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando métodos referidos como processo 1C, como exemplificado em Figura 83. Em algumas modalidades, os TILs obtidos na primeira expansão exibem um aumento na diversidade do repertório de células T. Em algumas modalidades, o aumento em diversidade é um aumento na diversidade de imunoglobulina e/ou na diversidade de receptor de células T. Em algumas modalidades, a diversidade é na imunoglobulina e na cadeia pesada da imunoglobulina. Em algumas modalidades, a diversidade é na imunoglobulina e na cadeia leve da imunoglobulina. Em algumas modalidades, a diversidade é no receptor de células T. Em algumas modalidades, a diversidade é em um dos receptores de células T selecionado a partir do grupo consistindo em receptores alfa, beta, gama, e delta. Em algumas modalidades, nota-se um aumento na expressão de receptor de células T (TCR) alfa e/ou beta. Em algumas modalidades, nota-se

98 / 557 um aumento na expressão de receptor alfa de células T (TCR). Em algumas modalidades, existe um aumento na expressão de receptor beta de células T (TCR). Em algumas modalidades, nota-se um aumento na expressão de TCRab (isto é, TCRα/β).

[00391] Após dissecção ou digestão de fragmentos de tumor, por exemplo como descrito em Etapa A de Figura 27, as células resultantes são cultivadas em soro contendo IL-2 sob condições que favorecem o crescimento de TILs sobre tumor e outras células. Em algumas modalidades, os digestos de tumor são incubados em cavidades de 2 mL em meio compreendendo soro AB inativado humano com 6000 IU/mL de IL-2. Esta população de células primárias é cultivada durante um período de dias, geralmente de 3 a 14 dias, resultando em uma população bruta de TILs, geralmente cerca de 1 × 108 células TILs em bruto. Em algumas modalidades, esta população de células primárias é cultivada durante um período de 7 a 14 dias, resultando em uma população bruta de TILs, geralmente cerca de 1 × 108 células TILs em bruto. Em algumas modalidades, esta população de células primárias é cultivada durante um período de 10 a 14 dias, resultando em um população bruta de TILs, geralmente cerca de 1 × 108 células TILs em bruto. Em algumas modalidades, esta população de células primárias é cultivada durante um período de cerca de 11 dias, resultando em um população bruta de TILs, geralmente cerca de 1 × 108 células TILs em bruto.

[00392] Em uma modalidade preferida, expansão de TILs podem ser realizada usando uma etapa de expansão em volume inicial de TILs (por exemplo, tal como descrito em Etapa B de Figura 27, que podem incluir processos referidos como pré-REP) como descrito abaixo e aqui, seguido por uma segunda expansão (Etapa D, incluindo processos referidos como etapas de protocolo de expansão rápida (REP) ) como descrito abaixo sob Etapa D e aqui, seguido por crioconservação opcional, e seguido por uma segunda Etapa D (incluindo processos referidos como etapas de re-estimulação REP) como

99 / 557 descrito abaixo e aqui. Os TILs obtidos a partir deste processo podem ser opcionalmente caracterizados para características fenotípicas e parâmetros metabólicos, como descrito aqui.

[00393] Em modalidades onde as culturas de TIL são iniciadas em placas de 24 cavidades, por exemplo, usando agrupamento de cultura celular em 24 cavidades Costar, em fundo plano (Corning Incorporated, Corning, NY, cada cavidade pode ser semeada com 1 × 106 células de digesto de tumor ou um fragmento de tumor em 2 mL de meio completo (CM) com IL-2 (6000 IU/mL; Chiron Corp., Emeryville, CA). Em algumas modalidades, o fragmento de tumor tem entre cerca de 1 mm3 e 10 mm3.

[00394] Em algumas modalidades, o meio de cultura da primeira expansão é referido como “CM”, uma abreviatura para meio de cultura. Em algumas modalidades, CM para Etapa B consiste em RPMI 1640 com GlutaMAX, suplementado com soro Ab humano a 10%, 25 mM Hepes, e 10 mg/mL gentamicina. Em modalidades onde as culturas são iniciadas e frascos permeáveis a gás com uma capacidade de 40 mL e um fundo de silício permeável a gás de 10 cm2 (por exemplo, G-Rex10; Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN) (Fig. 1), cada frasco foi carregado com 10–40 × 106 células viáveis de digesto de tumor ou 5–30 fragmentos de tumor em 10–40 mL de CM com IL-2. Ambos G-Rex10 e a placa de 24 cavidades foram incubados em uma incubadora umidificada a 37°C em 5% CO2 e 5 dias após início da cultura, metade do meio foi removido e substituído com CM fresco e IL-2 e após dia 5, metade do meio foi mudado a cada 2–3 dias.

[00395] Após a preparação dos fragmentos de tumor, as células resultantes (isto é, fragmentos) são cultivadas em soro contendo IL-2 sob condições que favorecem o crescimento de TILs sobre células de tumor e outras. Em algumas modalidades, os digestos de tumor são incubados em cavidades de 2 mL em meio compreendendo soro AB inativado humano (ou, em alguns casos, como esboçado aqui, na presença de uma população APC de

100 / 557 células) com 6000 IU/mL de IL-2. Esta população de células primárias é cultivada durante um período de dias, geralmente de 10 a 14 dias, resultando em uma população bruta de TILs, geralmente cerca de 1×108 TILs celulares brutos. Em algumas modalidades, o meio de crescimento durante a primeira expansão compreende IL-2 ou uma variante do mesmo. Em algumas modalidades, a IL é IL-2 humana recombinante (rhIL-2). Em algumas modalidades, a solução de estocar de IL-2 tem uma atividade específica de 20-30×106 IU/mg para um frasco de 1 mg. Em algumas modalidades, a solução de estocar de IL-2 tem uma atividade específica de 20×106 IU/mg para um frasco de 1 mg. Em algumas modalidades, a solução de estocar de IL-2 tem uma atividade específica de 25×106 IU/mg para um frasco de 1 mg. Em algumas modalidades, a solução de estocar de IL-2 tem uma atividade específica de 30×106 IU/mg para um frasco de 1 mg. Em algumas modalidades, a solução de estocar de IL-2 tem uma concentração final de 4- 8×106 IU/mg de IL-2. Em algumas modalidades, a solução de estocar de IL-2 tem uma concentração final de 5-7×106 IU/mg de IL-2. Em algumas modalidades, a solução de estocar de IL-2 tem uma concentração final de 6×106 IU/mg de IL-2. Em algumas modalidades, a solução de estocar de IL-2 é preparada como descrito em Exemplo 4. Em algumas modalidades, o meio de cultura da primeira expansão compreende cerca de 10.000 IU/mL de IL-2, cerca de 9.000 IU/mL de IL-2, cerca de 8.000 IU/mL de IL-2, cerca de 7.000 IU/mL de IL-2, cerca de 6000 IU/mL de IL-2 ou cerca de 5.000 IU/mL de IL-

2. Em algumas modalidades, o meio de cultura da primeira expansão compreende cerca de 9.000 IU/mL de IL-2 a cerca de 5.000 IU/mL de IL-2. Em algumas modalidades, o meio de cultura da primeira expansão compreende cerca de 8.000 IU/mL de IL-2 a cerca de 6.000 IU/mL de IL-2. Em algumas modalidades, o meio de cultura da primeira expansão compreende cerca de 7.000 IU/mL de IL-2 a cerca de 6.000 IU/mL de IL-2. Em algumas modalidades, o meio de cultura da primeira expansão

101 / 557 compreende cerca de 6.000 IU/mL de IL-2. Em uma modalidade, o meio de cultura celular compreende adicionalmente IL-2. Em algumas modalidades, o meio de cultura celular compreende cerca de 3000 IU/mL de IL-2. Em uma modalidade, o meio de cultura celular compreende adicionalmente IL-2. Em uma modalidade preferida, o meio de cultura celular compreende cerca de 3000 IU/mL de IL-2. Em uma modalidade, o meio de cultura celular compreende cerca de 1000 IU/mL, cerca de 1500 IU/mL, cerca de 2000 IU/mL, cerca de 2500 IU/mL, cerca de 3000 IU/mL, cerca de 3500 IU/mL, cerca de 4000 IU/mL, cerca de 4500 IU/mL, cerca de 5000 IU/mL, cerca de 5500 IU/mL, cerca de 6000 IU/mL, cerca de 6500 IU/mL, cerca de 7000 IU/mL, cerca de 7500 IU/mL, ou cerca de 8000 IU/mL de IL-2. Em uma modalidade, o meio de cultura celular compreende entre 1000 e 2000 IU/mL, entre 2000 e 3000 IU/mL, entre 3000 e 4000 IU/mL, entre 4000 e 5000 IU/mL, entre 5000 e 6000 IU/mL, entre 6000 e 7000 IU/mL, entre 7000 e 8000 IU/mL, ou cerca de 8000 IU/mL de IL-2.

[00396] Em algumas modalidades, o meio de cultura da primeira expansão compreende cerca de 500 IU/mL de IL-15, cerca de 400 IU/mL de IL-15, cerca de 300 IU/mL de IL-15, cerca de 200 IU/mL de IL-15, cerca de 180 IU/mL de IL-15, cerca de 160 IU/mL de IL-15, cerca de 140 IU/mL de IL-15, cerca de 120 IU/mL de IL-15, ou cerca de 100 IU/mL de IL-15. Em algumas modalidades, o meio de cultura da primeira expansão compreende cerca de 500 IU/mL de IL-15 a cerca de 100 IU/mL de IL-15. Em algumas modalidades, o meio de cultura da primeira expansão compreende cerca de 400 IU/mL de IL-15 a cerca de 100 IU/mL de IL-15. Em algumas modalidades, o meio de cultura da primeira expansão compreende cerca de 300 IU/mL de IL-15 a cerca de 100 IU/mL de IL-15. Em algumas modalidades, o meio de cultura da primeira expansão compreende cerca de 200 IU/mL de IL-15. Em algumas modalidades, o meio de cultura celular compreende cerca de 180 IU/mL de IL-15. Em uma modalidade, o meio de

102 / 557 cultura celular compreende adicionalmente IL-15. Em uma modalidade preferida, o meio de cultura celular compreende cerca de 180 IU/mL de IL-

15.

[00397] Em algumas modalidades, meio de cultura da primeira expansão compreende cerca de 20 IU/mL de IL-21, cerca de 15 IU/mL de IL- 21, cerca de 12 IU/mL de IL-21, cerca de 10 IU/mL de IL-21, cerca de 5 IU/mL de IL-21, cerca de 4 IU/mL de IL-21, cerca de 3 IU/mL de IL-21, cerca de 2 IU/mL de IL-21, cerca de 1 IU/mL de IL-21, ou cerca de 0,5 IU/mL de IL-21. Em algumas modalidades, o meio de cultura da primeira expansão compreende cerca de 20 IU/mL de IL-21 a cerca de 0,5 IU/mL de IL-21. Em algumas modalidades, o meio de cultura da primeira expansão compreende cerca de 15 IU/mL de IL-21 a cerca de 0,5 IU/mL de IL-21. Em algumas modalidades, o meio de cultura da primeira expansão compreende cerca de 12 IU/mL de IL-21 a cerca de 0,5 IU/mL de IL-21. Em algumas modalidades, o meio de cultura da primeira expansão compreende cerca de 10 IU/mL de IL-21 a cerca de 0,5 IU/mL de IL-21. Em algumas modalidades, o meio de cultura da primeira expansão compreende cerca de 5 IU/mL de IL-21 a cerca de 1 IU/mL de IL-21. Em algumas modalidades, o meio de cultura da primeira expansão compreende cerca de 2 IU/mL de IL-21. Em algumas modalidades, o meio de cultura celular compreende cerca de 1 IU/mL de IL-

21. Em algumas modalidades, o meio de cultura celular compreende cerca de 0,5 IU/mL de IL-21. Em uma modalidade, o meio de cultura celular compreende adicionalmente IL-21. Em uma modalidade preferida, o meio de cultura celular compreende cerca de 1 IU/mL de IL-21.

[00398] Em uma modalidade, o meio de cultura celular compreende anticorpo OKT-3. Em algumas modalidades, o meio de cultura celular compreende cerca de 30 ng/mL de anticorpo OKT-3. Em uma modalidade, o meio de cultura celular compreende cerca de 0,1 ng/mL, cerca de 0,5 ng/mL, cerca de 1 ng/mL, cerca de 2,5 ng/mL, cerca de 5 ng/mL, cerca de 7,5 ng/mL,

103 / 557 cerca de 10 ng/mL, cerca de 15 ng/mL, cerca de 20 ng/mL, cerca de 25 ng/mL, cerca de 30 ng/mL, cerca de 35 ng/mL, cerca de 40 ng/mL, cerca de 50 ng/mL, cerca de 60 ng/mL, cerca de 70 ng/mL, cerca de 80 ng/mL, cerca de 90 ng/mL, cerca de 100 ng/mL, cerca de 200 ng/mL, cerca de 500 ng/mL, e cerca de 1 µg/mL de anticorpo OKT-3. Em uma modalidade, o meio de cultura celular compreende entre 0,1 ng/mL e 1 ng/mL, entre 1 ng/mL e 5 ng/mL, entre 5 ng/mL e 10 ng/mL, entre 10 ng/mL e 20 ng/mL, entre 20 ng/mL e 30 ng/mL, entre 30 ng/mL e 40 ng/mL, entre 40 ng/mL e 50 ng/mL, e entre 50 ng/mL e 100 ng/mL of anticorpo OKT-3. Em algumas modalidades, o meio de cultura celular não compreende anticorpo OKT-3.

[00399] Em algumas modalidades, o meio de cultura celular compreende um ou mais agonistas de TNFRSF em um meio de cultura celular. Em algumas modalidades, o agonista de TNFRSF compreende um agonista de 4-1BB. Em algumas modalidades, o agonista de TNFRSF é um agonista de 4-1BB, e o agonista de 4-1BB é selecionado dentre o grupo consistindo em urelumab, utomilumab, EU-101, uma proteína de fusão, e fragmentos, derivados, variantes, biossimilares, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o agonista de TNFRSF é adicionado a uma concentração suficiente para obter uma concentração no meio de cultura celular de entre 0,1 µg/mL e 100 µg/mL. Em algumas modalidades, o agonista de TNFRSF é adicionado a uma concentração suficiente para obter uma concentração no meio de cultura celular de entre 20 µg/mL e 40 µg/mL.

[00400] Em algumas modalidades, além do um ou mais agonistas de TNFRSFs, o meio de cultura celular adicionalmente compreende IL-2 a uma concentração inicial de cerca de 3000 IU/mL e anticorpo OKT-3 a uma concentração inicial de cerca de 30 ng/mL, e em que o um ou mais agonistas de TNFRSF compreendem um agonista de 4-1BB.

[00401] Em algumas modalidades, o meio de cultura da primeira expansão é referido como “CM”, um abreviatura para meio de cultura. Em

104 / 557 algumas modalidades, ele é referido como CM1 (meio de cultura 1). Em algumas modalidades, CM consiste em RPMI 1640 com GlutaMAX, suplementado com soro Ab humano a 10%, 25 mM Hepes, e 10 mg/mL gentamicina. Em modalidades onde as culturas são iniciadas em frascos permeáveis a gás com uma capacidade de 40 mL e um fundo de silício permeável a gás de 10cm2 (por exemplo, G-Rex10; Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN) (Fig. 1), cada frasco foi carregado com 10–40x 106 células viáveis de digesto de tumor ou 5–30 fragmentos de tumor em 10–40mL de CM com IL-2. Ambos G-Rex10 e a placa de 24 cavidades foram incubados em uma incubadora umidificada a 37°C em 5% CO2 e 5 dias após início da cultura, metade do meio foi removido e substituído com CM fresco e IL-2 e após dia 5, metade do meio foi mudado a cada 2–3 dias. Em algumas modalidades, o CM é o CM1 descrito nos Exemplos, ver, Exemplo 5. Em algumas modalidades, a primeira expansão ocorre em um meio de cultura inicial de células ou um primeiro meio de cultura de células. Em algumas modalidades, o meio de cultura de células inicial ou o primeiro meio de cultura de células compreende IL-2.

[00402] Em algumas modalidades, o processo da primeira expansão (incluindo processos tal como, por exemplo, os descritos em Etapa B de Figura 27, que podem incluir os às vezes referidos como o pré-REP) é encurtado em 3-14 dias, como discutido nos exemplos e figuras. Em algumas modalidades, a primeira expansão (incluindo processos tal como, por exemplo, os descritos em Etapa B de Figura 27, que podem incluir os às vezes referidos como o pré-REP) é encurtada a 7 a 14 dias, como discutido nos Exemplos e mostrado em Figuras 4 e 5, assim como incluindo, por exemplo, uma expansão como descrita em Etapa B de Figura 27. Em algumas modalidades, a primeira expansão de Etapa B é encurtada a 10-14 dias, como discutido nos Exemplos e mostrado em Figuras 4 e 5. Em algumas modalidades, a primeira expansão é encurtada a 11 dias, como discutido nos

105 / 557 Exemplos e mostrado em Figuras 4 e 5, assim como incluindo, por exemplo, uma expansão como descrita em Etapa B de Figura 27.

[00403] Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode prosseguir durante 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, ou 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode prosseguir durante 1 dia a 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode prosseguir durante 2 dias a 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode prosseguir durante 3 dias a 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode prosseguir durante 4 dias a 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode prosseguir durante 5 dias a 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode prosseguir durante 6 dias a 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode prosseguir durante 7 dias a 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode prosseguir durante 8 dias a 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode prosseguir durante 9 dias a 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode prosseguir durante 10 dias a 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode prosseguir durante 11 dias a 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode prosseguir durante 12 dias a 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode prosseguir durante 13 dias a 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode prosseguir durante 14 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode prosseguir durante 1 dia a 11 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode prosseguir durante 2 dias a 11 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode prosseguir durante 3 dias a 11 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode prosseguir durante 4 dias a 11 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode

106 / 557 prosseguir durante 5 dias a 11 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode prosseguir durante 6 dias a 11 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode prosseguir durante 7 dias a 11 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode prosseguir durante 8 dias a 11 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode prosseguir durante 9 dias a 11 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode prosseguir durante 10 dias a 11 dias. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode prosseguir durante 11 dias.

[00404] Em algumas modalidades, uma combinação de IL-2, IL-7, IL- 15, e/ou IL-21 é empregada como uma combinação durante a primeira expansão. Em algumas modalidades, IL-2, IL-7, IL-15, e/ou IL-21 assim como quaisquer combinações das mesmas podem ser incluídas durante a primeira expansão, incluindo, por exemplo, durante um processo de Etapa B de acordo com Figura 27, assim como descrito aqui. Em algumas modalidades, uma combinação de IL-2, IL-15, e IL-21 é empregada como uma combinação durante a primeira expansão. Em algumas modalidades, IL- 2, IL-15, e IL-21 assim como quaisquer combinações das mesmas podem ser incluídas durante processos de Etapa B de acordo com Figura 27 e como descrito aqui.

[00405] Em algumas modalidades, a primeira expansão (incluindo processos referidos como pré-REP; por exemplo, Etapa B de acordo com Figura 27) processo é encurtada a 3 a 14 dias, como discutido nos exemplos e figuras. Em algumas modalidades, a primeira expansão de Etapa B é encurtada a 7 a 14 dias, como discutido nos Exemplos e mostrado em Figuras 4 e 5. Em algumas modalidades, a primeira expansão de Etapa B é encurtada a 10 a 14 dias, como discutido nos Exemplos e mostrado em Figuras 4, 5, e

27. Em algumas modalidades, a primeira expansão é encurtada a 11 dias, como discutido nos Exemplos e mostrado em Figuras 4, 5, e 27.

107 / 557

[00406] Em algumas modalidades, a primeira expansão, por exemplo, Etapa B de acordo com Figura 27, é realizada em um biorreator de sistema fechado. Em algumas modalidades, um sistema fechado é empregado para a expansão de TILs, como descrito aqui. Em algumas modalidades, um biorreator único é empregado. Em algumas modalidades, o biorreator único empregado é, por exemplo, um G-REX -10 ou um G-REX -100. Em algumas modalidades, o biorreator de sistema fechado é um biorreator único. C. ETAPA C: Transição da primeira expansão para a segunda expansão

[00407] Em alguns casos, a população bruta de TILs obtida a partir da primeira expansão, incluindo, por exemplo, a população de TILs obtida a partir de, por exemplo, Etapa B como indicado em Figura 27, pode ser crioconservada imediatamente, usando os protocolos discutidos aqui abaixo. Alternativamente, a população de TILs obtida a partir da primeira expansão, referida como a segunda população de TILs, pode ser submetida a uma segunda expansão (que pode incluir expansões às vezes referidas como REP) e, então, crioconservada como discutido abaixo. Similarmente, no caso em que os TILs geneticamente modificados serão usados em terapia, a primeira população de TILs (às vezes referida como a população bruta de TILs) ou a segunda população de TILs (que em algumas modalidades pode incluir populações referidas como populações de TILs REP) pode ser submetida a modificações genéticas para tratamentos apropriados antes de expansão ou após a primeira expansão e antes da segunda expansão.

[00408] Em algumas modalidades, os TILs obtidos a partir da primeira expansão (por exemplo, da Etapa B como indicado em Figura 27) são armazenados até serem fenotipados para seleção. Em algumas modalidades, os TILs obtidos a partir da primeira expansão (por exemplo, de Etapa B como indicado em Figura 27) não são armazenados e prosseguem diretamente para a segunda expansão. Em algumas modalidades, os TILs obtidos a partir da primeira expansão não são crioconservados após a primeira expansão e antes

108 / 557 da segunda expansão. Em algumas modalidades, a transição da primeira expansão para a segunda expansão ocorre a cerca de 3 dias, 4, dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, ou 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre a cerca de 3 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre a cerca de 4 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre a cerca de 4 dias a 10 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre a cerca de 7 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre a cerca de 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.

[00409] Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre a 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, ou 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 1 dia a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a primeira expansão de TILs pode prosseguir durante 2 dias a 14 dias. Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 3 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 4 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 5 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição a partir da

109 / 557 primeira expansão para a segunda expansão ocorre 6 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.

Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 7 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.

Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 8 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.

Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 9 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.

Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 10 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.

Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 11 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.

Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 12 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.

Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 13 dias a 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.

Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 14 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.

Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 1 dia a 11 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.

Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 2 dias a 11 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.

Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 3 dias a 11 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.

Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 4 dias a 11 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.

Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 5 dias a 11 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.

Em algumas modalidades,

110 / 557 a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 6 dias a 11 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 7 dias a 11 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 8 dias a 11 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 9 dias a 11 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 10 dias a 11 dias a partir de quando a fragmentação ocorre. Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão ocorre 11 dias a partir de quando a fragmentação ocorre.

[00410] Em algumas modalidades, os TILs não são armazenados após a primeira expansão e antes da segunda expansão, e os TILs prosseguem diretamente para a segunda expansão (por exemplo, em algumas modalidades, não ocorre armazenamento durante a transição da Etapa B para a Etapa D como mostrado em Figura 27). Em algumas modalidades, a transição ocorre em sistema fechado, como descrito aqui. Em algumas modalidades, os TILs da primeira expansão, a segunda população de TILs, prossegue diretamente para a segunda expansão sem período de transição.

[00411] Em algumas modalidades, a transição a partir da primeira expansão para a segunda expansão, por exemplo, Etapa C de acordo com Figura 27, é realizada em um biorreator de sistema fechado. Em algumas modalidades, um sistema fechado é empregado para a expansão de TILs, como descrito aqui. Em algumas modalidades, um biorreator único é empregado. Em algumas modalidades, o biorreator único empregado é, por exemplo, um G-REX -10 ou um G-REX -100. Em algumas modalidades, o biorreator de sistema fechado é um biorreator único.

111 / 557 D. ETAPA D: Segunda Expansão

[00412] Em algumas modalidades, a população de TILs celulares é expandida em número após a colheita e o processamento em bruto inicial, por exemplo, após Etapa A e Etapa B, e a transição referida como Etapa C, como indicado em Figura 27). Esta expansão adicional é referida aqui como a segunda expansão, que pode incluir processos de expansão geralmente referidos na técnica como um processo de expansão rápida (REP; assim como processos como indicado em Etapa D de Figura 27). A segunda expansão é geralmente alcançada usando um meio de cultura compreendendo um número de componentes, incluindo células alimentadoras, uma Fonte de citocinas, e um anticorpo anti-CD3, em um recipiente permeável a gás.

[00413] Em algumas modalidades, a segunda expansão ou segunda expansão de TILs (que pode incluir expansões às vezes referidas como REP; assim como processos como indicado em Etapa D de Figura 27) de TILs podem ser realizados usando qualquer um dos frascos ou recipientes de TILs conhecidos dos versados na técnica. Em algumas modalidades, a segunda expansão de TILs pode prosseguir durante 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, ou 14 dias. Em algumas modalidades, a segunda expansão de TILs pode prosseguir durante cerca de 7 dias a cerca de 14 dias. Em algumas modalidades, a segunda expansão de TILs pode prosseguir durante cerca de 8 dias a cerca de 14 dias. Em algumas modalidades, a segunda expansão de TILs pode prosseguir durante cerca de 9 dias a cerca de 14 dias. Em algumas modalidades, a segunda expansão de TILs pode prosseguir durante cerca de 10 dias a cerca de 14 dias. Em algumas modalidades, a segunda expansão de TILs pode prosseguir durante cerca de 11 dias a cerca de 14 dias. Em algumas modalidades, a segunda expansão de TILs pode prosseguir durante cerca de 12 dias a cerca de 14 dias. Em algumas modalidades, a segunda expansão de TILs pode prosseguir durante cerca de 13 dias a cerca de 14 dias. Em algumas modalidades, a segunda expansão de

112 / 557 TILs pode prosseguir durante cerca de 14 dias.

[00414] Em uma modalidade, a segunda expansão pode ser realizada em um recipiente permeável a gás usando os métodos da presente descrição (incluindo, por exemplo, expansões referidas como REP; assim como processos como indicado em Etapa D de Figura 27). Por exemplo, TILs podem ser rapidamente expandidos usando estimulação não específica de receptor de células T na presença de interleucina-2 (IL-2) ou interleucina-15 (IL-15). O estímulo não específico de receptor de células T pode incluir, por exemplo, um anticorpo anti-CD3, tal como cerca de 30 ng/ml de OKT3, um anticorpo monoclonal anti-CD3 camundongo (comercialmente disponível de Ortho-McNeil, Raritan, NJ ou Miltenyi Biotech, Auburn, CA) ou UHCT-1 (comercialmente disponível de BioLegend, San Diego, CA, USA). TILs podem ser expandidos para induzir estimulação adicional dos TILs in vitro incluindo um ou mais antígenos durante a segunda expansão, incluindo porções antigênicas dos mesmos, tal como epítopo(s), do câncer, que pode ser opcionalmente expressado a partir de um vetor, tal como um peptídeo de ligação de antígeno de leucócito humano A2 (HLA-A2), por exemplo, 0,3 μΜ MART-1 :26-35 (27 L) ou gpl 00:209-217 (210M), opcionalmente na presença de um fator de crescimento de células T, tal como 300 IU/mL IL-2 ou IL-15. Outros antígenos apropriados podem incluir, por exemplo, NY- ESO-1, TRP-1, TRP-2, antígeno de câncer tirosinas, MAGE-A3, SSX-2, e VEGFR2, ou porções antigênicas dos mesmos. TILs também podem ser rapidamente expandidos por re-estimulação com o mesmo antígeno(s) do câncer pulsado sobre as células apresentadoras de antígenos expressando HLA-A2. Alternativamente, os TILs podem ser re-estimulados adicionalmente com, por exemplo, exemplo, linfócitos autólogos irradiados ou com linfócitos alogênicas HLA-A2+ l irradiados e IL-2. Em algumas modalidades, a re-estimulação ocorre como parte da segunda expansão. Em algumas modalidades, a segunda expansão ocorre na presença de linfócitos

113 / 557 autólogos irradiados ou com linfócitos alogênicas HLA-A2+ l irradiados e IL-

2.

[00415] Em uma modalidade, o meio de cultura celular compreende adicionalmente IL-2. Em algumas modalidades, o meio de cultura celular compreende cerca de 3000 IU/mL de IL-2. Em uma modalidade, o meio de cultura celular compreende cerca de 1000 IU/mL, cerca de 1500 IU/mL, cerca de 2000 IU/mL, cerca de 2500 IU/mL, cerca de 3000 IU/mL, cerca de 3500 IU/mL, cerca de 4000 IU/mL, cerca de 4500 IU/mL, cerca de 5000 IU/mL, cerca de 5500 IU/mL, cerca de 6000 IU/mL, cerca de 6500 IU/mL, cerca de 7000 IU/mL, cerca de 7500 IU/mL, ou cerca de 8000 IU/mL de IL-2. Em uma modalidade, o meio de cultura celular compreende entre 1000 e 2000 IU/mL, entre 2000 e 3000 IU/mL, entre 3000 e 4000 IU/mL, entre 4000 e 5000 IU/mL, entre 5000 e 6000 IU/mL, entre 6000 e 7000 IU/mL, entre 7000 e 8000 IU/mL, ou entre 8000 IU/mL de IL-2.

[00416] Em uma modalidade, o meio de cultura celular compreende anticorpo OKT3. Em algumas modalidades, o meio de cultura celular compreende cerca de 30 ng/mL de anticorpo OKT-3. Em uma modalidade, o meio de cultura celular compreende cerca de 0,1 ng/mL, cerca de 0,5 ng/mL, cerca de 1 ng/mL, cerca de 2,5 ng/mL, cerca de 5 ng/mL, cerca de 7,5 ng/mL, cerca de 10 ng/mL, cerca de 15 ng/mL, cerca de 20 ng/mL, cerca de 25 ng/mL, cerca de 30 ng/mL, cerca de 35 ng/mL, cerca de 40 ng/mL, cerca de 50 ng/mL, cerca de 60 ng/mL, cerca de 70 ng/mL, cerca de 80 ng/mL, cerca de 90 ng/mL, cerca de 100 ng/mL, cerca de 200 ng/mL, cerca de 500 ng/mL, e cerca de 1 µg/mL de anticorpo OKT-3. Em uma modalidade, o meio de cultura celular compreende entre 0,1 ng/mL e 1 ng/mL, entre 1 ng/mL e 5 ng/mL, entre 5 ng/mL e 10 ng/mL, entre 10 ng/mL e 20 ng/mL, entre 20 ng/mL e 30 ng/mL, entre 30 ng/mL e 40 ng/mL, entre 40 ng/mL e 50 ng/mL, e entre 50 ng/mL e 100 ng/mL de anticorpo OKT-3. Em algumas modalidades, o meio de cultura celular não compreende anticorpo OKT-3.

114 / 557

[00417] Em algumas modalidades, o meio de cultura celular compreende um ou mais agonistas de TNFRSF em um meio de cultura celular. Em algumas modalidades, o agonista de TNFRSF compreende um agonista de 4-1BB. Em algumas modalidades, o agonista de TNFRSF é um agonista de 4-1BB, e o agonista de 4-1BB é selecionado dentre o grupo consistindo em urelumab, utomilumab, EU-101, uma proteína de fusão, e fragmentos, derivados, variantes, biossimilares, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o agonista de TNFRSF é adicionado a uma concentração suficiente para obter uma concentração no meio de cultura celular de entre 0,1 µg/mL e 100 µg/mL. Em algumas modalidades, o agonista de TNFRSF é adicionado a uma concentração suficiente para obter uma concentração no meio de cultura celular de entre 20 µg/mL e 40 µg/mL.

[00418] Em algumas modalidades, além do um ou mais agonistas de TNFRSFs, o meio de cultura celular adicionalmente compreende IL-2 a uma concentração inicial de cerca de 3000 IU/mL e anticorpo OKT-3 a uma concentração inicial de cerca de 30 ng/mL, e em que o um ou mais agonistas de TNFRSF compreende um agonista de 4-1BB.

[00419] Em algumas modalidades, uma combinação de IL-2, IL-7, IL- 15, e/ou IL-21 é empregada como uma combinação durante a segunda expansão. Em algumas modalidades, IL-2, IL-7, IL-15, e/ou IL-21 assim como quaisquer combinações das mesmas podem ser incluídas durante a segunda expansão, incluindo, por exemplo, durante um processo de Etapa D de acordo com Figura 27, assim como descrito aqui. Em algumas modalidades, uma combinação de IL-2, IL-15, e IL-21 é empregada como uma combinação durante a segunda expansão. Em algumas modalidades, IL- 2, IL-15, e IL-21 assim como quaisquer combinações das mesmas podem ser incluídas durante processo da Etapa D de acordo com Figura 27 e como descrito aqui.

[00420] Em algumas modalidades, a segunda expansão pode ser

115 / 557 conduzida em um meio de cultura de células suplementado compreendendo IL-2, OKT-3, células alimentadoras apresentadoras de antígeno, e opcionalmente um agonista de TNFRSF. Em algumas modalidades, a segunda expansão ocorre em um meio de cultura celular suplementado. Em algumas modalidades, o meio de cultura celular suplementado compreende IL-2, OKT- 3, e células alimentadoras apresentadoras de antígeno. Em algumas modalidades, o segundo meio de cultura de células compreende IL-2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs; também referidas como células alimentadoras apresentadoras de antígeno). Em algumas modalidades, a segunda expansão ocorre em um meio de cultura celular compreendendo IL- 2, OKT-3, e células alimentadoras apresentadoras de antígeno (isto é, células apresentadoras de antígenos).

[00421] Em algumas modalidades, o meio de cultura da segunda expansão compreende cerca de 500 IU/mL de IL-15, cerca de 400 IU/mL de IL-15, cerca de 300 IU/mL de IL-15, cerca de 200 IU/mL de IL-15, cerca de 180 IU/mL de IL-15, cerca de 160 IU/mL de IL-15, cerca de 140 IU/mL de IL-15, cerca de 120 IU/mL de IL-15, ou cerca de 100 IU/mL de IL-15. Em algumas modalidades, o meio de cultura da segunda expansão compreende cerca de 500 IU/mL de IL-15 a cerca de 100 IU/mL de IL-15. Em algumas modalidades, o meio de cultura da segunda expansão compreende cerca de 400 IU/mL de IL-15 a cerca de 100 IU/mL de IL-15. Em algumas modalidades, o meio de cultura da segunda expansão compreende cerca de 300 IU/mL de IL-15 a cerca de 100 IU/mL de IL-15. Em algumas modalidades, o meio de cultura da segunda expansão compreende cerca de 200 IU/mL de IL-15. Em algumas modalidades, o meio de cultura celular compreende cerca de 180 IU/mL de IL-15. Em uma modalidade, o meio de cultura celular compreende adicionalmente IL-15. Em uma modalidade preferida, o meio de cultura celular compreende cerca de 180 IU/mL de IL-

15.

116 / 557

[00422] Em algumas modalidades, o meio de cultura da segunda expansão compreende cerca de 20 IU/mL de IL-21, cerca de 15 IU/mL de IL- 21, cerca de 12 IU/mL de IL-21, cerca de 10 IU/mL de IL-21, cerca de 5 IU/mL de IL-21, cerca de 4 IU/mL de IL-21, cerca de 3 IU/mL de IL-21, cerca de 2 IU/mL de IL-21, cerca de 1 IU/mL de IL-21, ou cerca de 0,5 IU/mL de IL-21. Em algumas modalidades, o meio de cultura da segunda expansão compreende cerca de 20 IU/mL de IL-21 a cerca de 0,5 IU/mL de IL-21. Em algumas modalidades, o meio de cultura da segunda expansão compreende cerca de 15 IU/mL de IL-21 a cerca de 0,5 IU/mL de IL-21. Em algumas modalidades, o meio de cultura da segunda expansão compreende cerca de 12 IU/mL de IL-21 a cerca de 0,5 IU/mL de IL-21. Em algumas modalidades, o meio de cultura da segunda expansão compreende cerca de 10 IU/mL de IL-21 a cerca de 0,5 IU/mL de IL-21. Em algumas modalidades, o meio de cultura da segunda expansão compreende cerca de 5 IU/mL de IL-21 a cerca de 1 IU/mL de IL-21. Em algumas modalidades, o meio de cultura da segunda expansão compreende cerca de 2 IU/mL de IL-21. Em algumas modalidades, o meio de cultura celular compreende cerca de 1 IU/mL de IL-

[00423] Em algumas modalidades as células alimentadoras apresentadoras de antígeno (APCs) são PBMCs. Em uma modalidade, a razão de TILs para PBMCs e/ou células apresentadoras de antígenos na expansão rápida e/ou na segunda expansão é cerca de 1 a 25, cerca de 1 a 50, cerca de 1 a 100, cerca de 1 a 125, cerca de 1 a 150, cerca de 1 a 175, cerca de 1 a 200, cerca de 1 a 225, cerca de 1 a 250, cerca de 1 a 275, cerca de 1 a 300, cerca de 1 a 325, cerca de 1 a 350, cerca de 1 a 375, cerca de 1 a 400, ou cerca de 1 a

500. Em uma modalidade, a razão de TILs para PBMCs na expansão rápida

117 / 557 e/ou na segunda expansão está entre 1 a 50 e 1 a 300. Em uma modalidade, a razão de TILs para PBMCs na expansão rápida e/ou na segunda expansão está entre 1 a 100 e 1 a 200.

[00424] Em uma modalidade, REP e/ou a segunda expansão é realizada em frascos com os TILs brutos sendo misturados com um excesso de 100 ou 200 vezes de células alimentadoras inativadas, 30 mg/mL de anticorpo anti-CD3 OKT3 e 3000 IU/mL IL-2 em 150 ml de meio. Substituição de meio é feita (geralmente 2/3 substituição de meios via respiração com fresco media) até as células serem transferidas a um câmara de crescimento alternativo. Câmaras de crescimento alternativo incluem os frascos G-REX e recipientes permeáveis a gás como mais amplamente discutido abaixo.

[00425] Em algumas modalidades, a segunda expansão (que pode incluir processos referidos como o processo REP) é encurtada a 7-14 dias, como discutido nos exemplos e figuras. Em algumas modalidades, a segunda expansão é encurtada a 11 dias.

[00426] Em uma modalidade, REP e/ou a segunda expansão podem ser realizados usando frascos T-175 e bolsas permeáveis a gás como previamente descrito (Tran, et al., J. Imunother. 2008, 31, 742-51; Dudley, et al., J. Imunother. 2003, 26, 332-42) ou materiais para cultura permeáveis a gás (frascos G-Rex). Em algumas modalidades, a segunda expansão (incluindo expansões referidas como expansões rápidas) é realizado em frascos T-175, e cerca de 1 x 106 TILs suspensos em 150 mL de meio podem ser adicionados a cada frasco T-175. Os TILs podem ser cultivados em uma mistura 1 a 1 de meios CM e AIM-V, suplementados com 3000 IU por mL de IL-2 e 30 ng por ml de anti-CD3. Os frascos T-175 podem ser incubados a 37°C em 5% CO2. Metade dos meios pode ser trocada no dia 5 usando meio 50/50 com 3000 IU por mL de IL-2. Em algumas modalidades, em dia 7 células de dois frascos T- 175 podem ser combinadas em uma bolsa de 3 L e 300 mL de AIM V com

118 / 557 5% soro AB humano e 3000 IU por mL de IL-2 foram adicionados a 300 ml de suspensão de TILs. O número de células em cada bolsa foi contado a cada dia ou dois, e meio fresco foi adicionado para manter a contagem celular entre 0,5 e 2,0 x 106 células/mL.

[00427] Em uma modalidade, a segunda expansão (que pode incluir expansões referidas como REP, assim como as referidas em Etapa D de Figura 27) pode ser realizada em frascos permeáveis a gás de 500 mL de capacidade com fundos de silício permeável a gás de 100 cm (G-Rex 100, comercialmente disponível de Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA), 5 × 106 ou 10 × 106 TIL podem ser cultivados com PBMCs em 400 mL de meio 50/50, suplementado com 5% soro AB humano, 3000 IU por mL de IL-2 e 30 ng por ml de anti-CD3 (OKT3). Os frascos G- Rex 100 podem ser incubados a 37°C em 5% CO2. No dia 5, 250 mL de sobrenadante podem ser removidos e colocados em frascos de centrífuga e centrifugados a 1500 rpm (491 × g) durante 10 minutos. Os grânulos de TIL podem ser re-colocados em suspensão com 150 mL de meio fresco com 5% soro AB humano, 3000 IU por mL de IL-2, e adicionados de volta aos frascos originais G-Rex 100 100. Quando TILs são expandidos em série em frascos G-Rex 100, em dia 7, os TILs em cada frasco G-Rex 100 podem ser colocados em suspensão em 300 mL de meios presentes em cada frasco e a suspensão de células pode ser dividida em 3 alíquotas de 100 mL que podem ser usadas para semear 3 frascos G-Rex 100. Então, 150 mL de AIM-V com 5% soro AB humano e 3000 IU por mL de IL-2 podem ser adicionados a cada frasco. Os frascos G-Rex 100 podem ser incubados a 37°C em 5% CO2 e após 4 dias 150 mL de AIM-V com 3000 IU por mL de IL-2 podem ser adicionados a cada frasco G-REX 100. As células pode ser coletados em dia 14 de cultura.

[00428] Em uma modalidade, a segunda expansão (incluindo expansões referidas como REP) é realizada em frascos com os TILs brutos

119 / 557 sendo misturados com um excesso de 100 ou 200 vezes de células alimentadoras inativadas, 30 mg/mL anticorpo anti-CD3 OKT3 e 3000 IU/mL IL-2 em 150 ml de meio. Em algumas modalidades, substituição de meio é feita até as células serem transferidas para uma câmara de crescimento alternativo. Em algumas modalidades, 2/3 do meio são substituídos por respiração com meio fresco. Em algumas modalidades, câmaras de crescimento alternativo incluem frascos G-REX e recipientes permeáveis a gás como mais amplamente discutido abaixo.

[00429] Em uma modalidade, a segunda expansão (incluindo expansões referidas como REP) é realizada e compreende adicionalmente uma etapa em que TILs são selecionados para reatividade superior ao tumor. Qualquer método de seleção conhecido na técnica pode ser usado. Por exemplo, os métodos descritos em Publicação de Pedido de Patente US No. 2016/0010058 A1, cujas divulgações são incorporadas aqui por referência, podem ser usados para seleção de TILs para uma reatividade superior do tumor.

[00430] Opcionalmente, um teste de viabilidade celular pode ser realizado após a segunda expansão (incluindo expansões referidas como expansão REP), usando testes padrão conhecidos na técnica. Por exemplo, um teste de exclusão por azul tripano pode ser feito em uma amostra dos TILs brutos, que seletivamente marca células mortas e permite uma avaliação da viabilidade. Em algumas modalidades, as amostras de TIL podem ser contadas e viabilidade determinada usando um contador de células automatizado Cellometer K2 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). Em algumas modalidades, viabilidade é determinada de acordo com o protocolo do citômetro de fluxo e contador de células automatizado Cellometer K2 Image descrito, por exemplo, em Exemplo 15.

[00431] Em algumas modalidades, a segunda expansão (incluindo expansões referidas como REP) de TIL pode ser realizada usando frascos T-

120 / 557 175 e bolsas permeáveis a gás, como previamente descrito (Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008, J Imunother., 31:742–751, e Dudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003, J Imunother., 26:332–342) ou frascos G-Rex permeáveis a gás. Em algumas modalidades, a segunda expansão é realizada usando frascos. Em algumas modalidades, a segunda expansão é realizada usando frascos G-Rex permeáveis a gás. Em algumas modalidades, a segunda expansão é realizada em frascos T-175, e cerca de 1 x 106 TIL são colocados em suspensão em cerca de 150 mL de meio e este é adicionado a cada frasco T-175. Os TILs são cultivados com PBMC alogênicas irradiadas (50 Gy) como células “alimentadoras” a uma razão de 1 a 100 e as células foram cultivadas em uma mistura 1 a 1 de CM e meio AIM-V (meio 50/50), suplementado com 3000 IU/mL de IL-2 e 30 ng/mL de anti-CD3. Os frascos T-175 são incubados a 37°C em 5% CO2. Em algumas modalidades, metade do meio é mudada em dia 5 usando meio 50/50 com 3000 IU/mL de IL-2. Em algumas modalidades, em dia 7, células de 2 frascos T-175 são combinadas em uma bolsa de 3 L e 300 mL de AIM-V com 5% soro AB humano e 3000 IU/mL de IL-2 são adicionados a 300 mL de suspensão de TILs. O número de células em cada bolsa pode ser contada a cada dia ou dois, e meio fresco pode ser adicionado para manter a contagem celular entre cerca de 0,5 e cerca de 2,0 x 106 células/mL.

[00432] Em algumas modalidades, a segunda expansão (incluindo expansões referidas como REP) é realizada em frascos de 500 mL de capacidade com fundos de silício permeável a gás de 100 cm2 (G-Rex 100, Wilson Wolf) (Fig. 1), cerca de 5x106 ou 10x106 TIL são cultivados com PBMCs irradiadas alogênicas a uma razão de 1 a 100 em 400 mL de meio 50/50, suplementado com 3000 IU/mL de IL-2 e 30 ng/ mL de anti-CD3. Os frascos G-Rex 100 são incubados a 37°C em 5% CO2. Em algumas modalidades, em dia 5, 250mL de sobrenadante são removidos e colocados em garrafas de centrífuga e centrifugados a 1500 rpm (491g) durante 10

121 / 557 minutos. Os grânulos TIL podem ser então recolocados em suspensão com 150 mL de meio fresco 50/50 com 3000 IU/ mL de IL-2 e adicionado de volta aos frascos originais G-Rex 100. Em modalidades onde TILs são expandidos em série em frascos G-Rex 100, em dia 7, os TILs em cada G-Rex 100 são colocados em suspensão em 300 mL de meio presente em cada frasco e a suspensão de células foi dividida em três alíquotas de 100 mL que são usadas para semear 3 frascos G-Rex 100. Então, 150 mL de AIM-V com 5% soro AB humano e 3000 IU/mL de IL-2 são adicionados a cada frasco. Os frascos G- Rex 100 são incubados a 37°C em 5% CO2 e após 4 dias 150 mL de AIM-V com 3000 IU/mL de IL-2 são adicionados a cada frasco G-Rex 100. As células são coletados em dia 14 de cultura.

[00433] Os receptores de antígenos diversos de linfócitos T e B são produzidos por recombinação somática de um número limitado, mas grande, de segmentos de genes. Estes segmentos de genes: V (variável), D (diversidade), J (junção), e C (constante), determinam a especificidade de ligação e aplicações a jusante de imunoglobulinas e receptores de células T(TCRs). A presente invenção provê um método para gerar TILs que exibem e aumentam a diversidade do repertório de células T. Em algumas modalidades, os TILs obtidos pelo presente método exibem um aumento no diversidade do repertório de células T. Em algumas modalidades, os TILs obtidos na segunda expansão exibem um aumento na diversidade do repertório de células T. Em algumas modalidades, o aumento em diversidade é um aumento na diversidade de imunoglobulina e/ou na diversidade de receptor de células T. Em algumas modalidades, a diversidade é na imunoglobulina e na cadeia pesada de imunoglobulina. Em algumas modalidades, a diversidade é na imunoglobulina e na cadeia leve da imunoglobulina. Em algumas modalidades, a diversidade é no receptor de células T. Em algumas modalidades, a diversidade é em um dos receptores de células T selecionado a partir do grupo consistindo em receptores alfa, beta,

122 / 557 gama, e delta. Em algumas modalidades, nota-se um aumento na expressão de receptor de células T (TCR) alfa e/ou beta. Em algumas modalidades, nota-se um aumento na expressão de receptor alfa de células T (TCR). Em algumas modalidades, nota-se um aumento na expressão de receptor beta de células T (TCR). Em algumas modalidades, nota-se um aumento na expressão de TCRab (isto é, TCRα/β).

[00434] Em algumas modalidades, o meio de cultura da segunda expansão (por exemplo, às vezes referido como CM2 ou o segundo meio de cultura de células), compreende IL-2, OKT-3, assim como as células alimentadoras apresentadoras de antígeno (APCs), como discutido em maiores detalhes abaixo.

[00435] Em algumas modalidades, a segunda expansão, por exemplo, Etapa D de acordo com Figura 27, é realizada em um biorreator de sistema fechado. Em algumas modalidades, um sistema fechado é empregado para a expansão de TILs, como descrito aqui. Em algumas modalidades, um biorreator único é empregado. Em algumas modalidades, o biorreator único empregado é, por exemplo, um G-REX -10 ou um G-REX -100. Em algumas modalidades, o biorreator de sistema fechado é um biorreator único.

1. Células alimentadoras e células apresentadoras de antígenos

[00436] Em uma modalidade, os procedimentos da segunda expansão descritos aqui (por exemplo, incluindo expansão tal como descrito em Etapa D da Figura 27, assim como os referidos como REP) requerem um excesso de células alimentadoras durante a expansão REP de TILs e/ou durante a segunda expansão. Em muitas modalidades, as células alimentadoras são células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) obtidas de unidades padrão de sangue total de doadores de sangue saudáveis. As PBMCs são obtidas usando métodos padrão tal como separação de gradiente Ficoll-Paque.

[00437] Em geral, as PBMCs alogênicas são inativadas, ou via irradiação ou tratamento com calor, e usados nos procedimentos REP, como

123 / 557 descrito nos exemplos, em particular exemplo 14, que provê um protocolo exemplar para avaliar a incompetência de replicação de irradiar PBMCs alogênicas.

[00438] Em algumas modalidades, PBMCs são consideradas incompetentes em replicação e aceitas para uso nos procedimentos de expansão de TILs descritos aqui se o número total de células viáveis em dia 14 for menor do que o número de células viáveis inicial colocado em cultura em dia 0 do REP e/ou dia 0 da segunda expansão (isto é, o dia de início da segunda expansão). Ver, por exemplo, Exemplo 14.

[00439] Em algumas modalidades, PBMCs são consideradas incompetentes em replicação e aceitas para uso nos procedimentos de expansão de TILs descritos aqui se o número total de células viáveis, cultivadas na presença de OKT3 e IL-2, em dia 7 e dia 14, não tiver aumentado do número de células viáveis inicial colocadas em cultura em dia 0 do REP e/ou dia 0 da segunda expansão (isto é, o dia de início da segunda expansão). Em algumas modalidades, as PBMCs são cultivadas na presença de 30 ng/ml de anticorpo OKT3 e 3000 IU/ml IL-2. Ver, por exemplo, Exemplo 13.

[00440] Em algumas modalidades, PBMCs são consideradas incompetentes em replicação e aceitas para uso nos procedimentos de expansão de TILs descritos aqui se o número total de células viáveis, cultivadas na presença de OKT3 e IL-2, em dia 7 e dia 14 não tiver aumentado do número de células viáveis inicial colocadas em cultura em dia 0 do REP e/ou dia 0 da segunda expansão (isto é, o dia de início da segunda expansão). Em algumas modalidades, as PBMCs são cultivadas na presença de 5-60 ng/ml de anticorpo OKT3 e 1000-6000 IU/ml IL-2. Em algumas modalidades, as PBMCs são cultivadas na presença de 10-50 ng/ml de anticorpo OKT3 e 2000-5000 IU/ml IL-2. Em algumas modalidades, as PBMCs são cultivadas na presença de 20-40 ng/ml de anticorpo OKT3 e

124 / 557 2000-4000 IU/ml IL-2. Em algumas modalidades, as PBMCs são cultivadas na presença de 25-35 ng/ml de anticorpo OKT3 e 2500-3500 IU/ml IL-2.

[00441] Em algumas modalidades, as células alimentadoras apresentadoras de antígeno são PBMCs. Em algumas modalidades, as células alimentadoras apresentadoras de antígeno são células alimentadoras apresentadoras de antígeno artificiais. Em uma modalidade, a razão de TILs para células alimentadoras apresentadoras de antígeno na segunda expansão é cerca de 1 a 25, cerca de 1 a 50, cerca de 1 a 100, cerca de 1 a 125, cerca de 1 a 150, cerca de 1 a 175, cerca de 1 a 200, cerca de 1 a 225, cerca de 1 a 250, cerca de 1 a 275, cerca de 1 a 300, cerca de 1 a 325, cerca de 1 a 350, cerca de 1 a 375, cerca de 1 a 400, ou cerca de 1 a 500. Em uma modalidade, a razão de TILs para células alimentadoras apresentadoras de antígeno na segunda expansão está entre 1 a 50 e 1 a 300. Em uma modalidade, a razão de TILs para células alimentadoras apresentadoras de antígeno na segunda expansão está entre 1 a 100 e 1 a 200.

[00442] Em uma modalidade, os procedimentos da segunda expansão descritos aqui requerem uma razão de cerca de 2,5x109 células alimentadoras a cerca de 100x106 TILs. Em outra modalidade, os procedimentos da segunda expansão descritos aqui requerem uma razão de cerca de 2,5x109 células alimentadoras a cerca de 50x106 TILs. Em ainda outra modalidade, os procedimentos da segunda expansão descritos aqui requerem cerca de 2,5x109 células alimentadoras a cerca de 25x106 TILs.

[00443] Em uma modalidade, os procedimentos da segunda expansão descritos aqui requerem um excesso de células alimentadoras durante a segunda expansão. Em muitas modalidades, as células alimentadoras são células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) obtidas a partir de unidades padrão de sangue total doadores de sangue saudáveis. As PBMCs são obtidas usando métodos padrão tal como separação de gradiente Ficoll- Paque. Em uma modalidade, células apresentadoras de antígeno (aAPC)

125 / 557 artificiais são usadas em vez de PBMCs.

[00444] Em geral, as PBMCs alogênicas são inativadas, ou via irradiação ou tratamento com calor, e usadas nos procedimentos de expansão de TILs descritos aqui, incluindo os procedimentos exemplares descritos em Figuras 4, 5, e 27.

[00445] Em uma modalidade, células apresentadoras de antígenos artificiais são usadas na segunda expansão como uma substituição para, ou em combinação com, PBMCs.

2. Citocinas

[00446] Os métodos de expansão descritos aqui geralmente usam meio de cultura com doses elevadas de uma citocina, em particular IL-2, como é conhecido na técnica.

[00447] Alternativamente, usando combinações de citocinas para a expansão rápida e ou segunda expansão de TILs é adicionalmente possível, com combinações de duas ou mais de IL-2, IL-15 e IL-21 como é geralmente descrito em Publicação Internacional No. WO 2015/189356 e Publicação Internacional No. WO 2015/189357, aqui expressamente incorporadas por referência em sua totalidade. Assim, combinações possíveis incluem IL-2 e IL-15, IL-2 e IL-21, IL-15 e IL-21 e IL-2, IL-15 e IL-21, com a última encontrando uso particular em muitas modalidades. O uso de combinações de citocinas eespecíficoamente favorece a geração de linfócitos, e em particular células T como descrito aqui.

3. Anticorpos Anti-CD3

[00448] Em algumas modalidades, os meios de cultura usados em métodos de expansão descritos aqui (incluindo os referidos como REP, ver por exemplo, Figura 27) também incluem um anticorpo anti-CD3. Um anticorpo anti-CD3 em combinação com IL-2 induz a ativação de células T e divisão celular em uma população de TILs. Este efeito pode ser visto com anticorpos de comprimento completo, assim como fragmentos Fab e F(ab’)2,

126 / 557 com os primeiros sendo geralmente preferidos; ver, por exemplo, Tsoukas et al., J. Imunol. 1985, 135, 1719, aqui incorporado por referência em sua totalidade.

[00449] Como será apreciado pelos especialistas, existe um número de anticorpos CD3 anti-humanos apropriados que encontram uso na invenção, incluindo anticorpos monoclonais e policlonais CD3 anti-humanos e de vários mamíferos, incluindo, mas não limitados a, anticorpos murinos, humanos, primatas, ratos, e caninos. Em modalidades particulares, o anticorpo OKT3 anti-CD3 é usado (comercialmente disponível de Ortho-McNeil, Raritan, NJ ou Miltenyi Biotech, Auburn, CA). E. ETAPA E: Colheita de TILs

[00450] Após a segunda etapa de expansão, células podem ser coletadas. Em algumas modalidades, os TILs são coletados após uma, duas, três, quatro ou mais etapas de expansão, por exemplo, como apresentado em Figura 27. Em algumas modalidades os TILs são coletados após duas etapas de expansão, por exemplo como apresentado em Figura 27.

[00451] TILs podem ser coletados em qualquer modo estéril e apropriado, incluindo, por exemplo, por centrifugação. Métodos para a colheita de TIL são bem conhecidos na técnica e qualquer um de tais métodos pode ser empregado com o presente processo. Em algumas modalidades, TILs são coletados usando um sistema automatizados.

[00452] Coletores de células e/ou sistemas de processamento de células são comercialmente disponíveis de várias Fontes, incluindo, por exemplo, Fresenius Kabi, Tomtec Life Science, Perkin Elmer, e Inotech Biosystems International, Inc. Qualquer coletor com base em células pode ser empregado com os presentes métodos. Em algumas modalidades, o coletor de células e/ou sistemas de processamento de células é um coletor de células com base em membranas. Em algumas modalidades, a colheita das células é via um sistema de processamento de células, tal como o sistema LOVO (fabricado

127 / 557 por Fresenius Kabi). O termo “sistema de processamento de células LOVO” também se refere a qualquer instrumento ou dispositivo fabricado por qualquer provedor que pode bombear uma solução compreendendo células através de uma membrana ou filtro, tal como uma membrana giratória ou filtro giratório em um meio estéril ou de e/ou sistema fechado, permitindo o fluxo contínuo e o processamento das células para remover o meio de sobrenadante ou cultura celular sem granulação. Em algumas modalidades, o coletor de células e/ou sistema de processamento de células pode realizar a separação de células, lavagem, troca de fluidos, concentração, e/ou outras etapas de processamento de células em um sistema fechado estéril.

[00453] Em algumas modalidades, a colheita, por exemplo, Etapa E de acordo com Figura 27, é realizada a partir de um biorreator de sistema fechado. Em algumas modalidades, um sistema fechado é empregado para a expansão de TILs, como descrito aqui. Em algumas modalidades, um biorreator único é empregado. Em algumas modalidades, o biorreator único empregado é, por exemplo, um G-REX-10 ou um G-REX-100. Em algumas modalidades, o biorreator de sistema fechado é um biorreator único.

[00454] Em algumas modalidades, Etapa E de acordo com Figura 27, é realizada de acordo com os processos descritos em Exemplo 30. Em algumas modalidades, o sistema fechado é acessado via seringa sob condições estéreis a fim de manter a esterilidade e a natureza fechada do sistema. Em algumas modalidades, um sistema fechado, como descrito em Exemplo 30, é empregado.

[00455] Em algumas modalidades, TILs são coletados de acordo com os metodos descritos em Exemplo 30. Em algumas modalidades, TILs entre dias 1 e 11 são coletados usando os métodos como descritos em Seção 8,5 (referidos como dia 11 de coleta de TILs em Exemplo 30). Em algumas modalidades, TILs entre dias 12 e 22 são coletados usando os métodos como descritos em seção 8.12 ((referidos como dia 22 de coleta de TILs em

128 / 557 Exemplo 30). F. ETAPA F: Formulação final/Transferência para bolsa de infusão

[00456] Após as Etapas A até E como dadas em uma ordem exemplar em Figura 27 e como esboçado em detalhes acima e aqui estarem completas, células são transferidas para um recipiente para uso em administração a um paciente. Em algumas modalidades, uma vez que um número terapeuticamente suficiente de TILs é obtido usando os métodos de expansão descritos acima, eles são transferidos para um recipiente para uso em administração a um paciente.

[00457] Em uma modalidade, TILs expandidos usando APCs da presente descrição são administrados a um paciente como uma composição farmacêutica. Em uma modalidade, a composição farmacêutica é uma suspensão de TILs em um tampão estéril. TILs expandidos usando PBMCs da presente descrição pode ser administrado por qualquer apropriado route como conhecido na técnica. Em algumas modalidades, as células T são administradas como um única infusão intra-arterial ou intravenosa, que preferivelmente dura aproximadamente 30 a 60 minutos. Outras vias apropriadas de administração incluem intraperitoneal, intratecal, e intralinfática.

1. Composições farmacêuticas, dosagens, e regimes de dosagem

[00458] Em uma modalidade, TILs expandidos usando os métodos da presente descrição são administrados a um paciente como uma composição farmacêutica. Em uma modalidade, a composição farmacêutica é uma suspensão de TILs em um tampão estéril. TILs expandidos usando PBMCs da presente descrição podem ser administrados por qualquer via apropriada como conhecido na técnica. Em algumas modalidades, as células T são administradas como uma única infusão intra-arterial ou intravenosa, que preferivelmente dura aproximadamente 30 a 60 minutos. Outras vias de administração apropriadas incluem administração intraperitoneal, intratecal e

129 / 557 intralinfática.

[00459] Qualquer dose apropriada de TILs podem ser administrada. Em algumas modalidades, de cerca de 2,3×1010 a cerca de 13,7×1010 TILs são administrados, com uma média em torno de 7,8×1010 TILs, particularmente se o câncer é melanoma. Em uma modalidade, cerca de 1,2×1010 a cerca de 4,3×1010 de TILs são administrados. Em algumas modalidades, cerca de 3×1010 a cerca de 12×1010 TILs são administrados. Em algumas modalidades, cerca de 4×1010 a cerca de 10×1010 TILs são administrados. Em algumas modalidades, cerca de 5×1010 a cerca de 8×1010 TILs são administrados. Em algumas modalidades, cerca de 6×1010 a cerca de 8×1010 TILs são administrados. Em algumas modalidades, cerca de 7×1010 a cerca de 8×1010 TILs são administrados. Em algumas modalidades, a dosagem terapeuticamente eficaz é cerca de 2,3×1010 a cerca de 13,7×1010. Em algumas modalidades, a dosagem terapeuticamente eficaz é cerca de 7,8×1010 TILs, particularmente se o câncer é melanoma. Em algumas modalidades, a dosagem terapeuticamente eficaz é cerca de 1,2×1010 a cerca de 4,3×1010 de TILs. Em algumas modalidades, a dosagem terapeuticamente eficaz é cerca de 3×1010 a cerca de 12×1010 TILs. Em algumas modalidades, a dosagem terapeuticamente eficaz é cerca de 4×1010 a cerca de 10×1010 TILs. Em algumas modalidades, a dosagem terapeuticamente eficaz é cerca de 5×1010 a cerca de 8×1010 TILs. Em algumas modalidades, a dosagem terapeuticamente eficaz é cerca de 6×1010 a cerca de 8×1010 TILs. Em algumas modalidades, a dosagem terapeuticamente eficaz é cerca de 7×1010 a cerca de 8×1010 TILs.

[00460] Em algumas modalidades, o número dos TILs providos nas composições farmacêuticas da invenção é cerca de 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010,

130 / 557 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 7×1013, 8×1013, e 9×1013. Em uma modalidade, o número dos TILs providos nas composições farmacêuticas da invenção está na faixa de 1×106 a 5×106, 5×106 a 1×107, 1×107 a 5×107, 5×107 a 1×108, 1×108 a 5×108, 5×108 a 1×109, 1×109 a 5×109, 5×109 a 1×1010, 1×1010 a 5×1010, 5×1010 a 1×1011, 5×1011 a 1×1012, 1×1012 a 5×1012, e 5×1012 a 1×1013.

[00461] Em algumas modalidades, a concentração dos TILs providos nas composições farmacêuticas da invenção é menor que, por exemplo, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, 0,09%, 0,08%, 0,07%, 0,06%, 0,05%, 0,04%, 0,03%, 0,02%, 0,01%, 0,009%, 0,008%, 0,007%, 0,006%, 0,005%, 0,004%, 0,003%, 0,002%, 0,001%, 0,0009%, 0,0008%, 0,0007%, 0,0006%, 0,0005%, 0,0004%, 0,0003%, 0,0002% ou 0,0001% p/p, p/v ou v/v da composição farmacêutica.

[00462] Em algumas modalidades, a concentração dos TILs providos nas composições farmacêuticas da invenção é maior que 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19,75%, 19,50%, 19,25% 19%, 18,75%, 18,50%, 18,25%, 18%, 17,75%, 17,50%, 17,25% 17%, 16,75%, 16,50%, 16,25% 16%, 15,75%, 15,50%, 15,25% 15%, 14,75%, 14,50%, 14,25% 14%, 13,75%, 13,50%, 13,25% 13%, 12,75%, 12,50%, 12,25% 12%, 11,75%, 11,50%, 11,25% 11%, 10,75%, 10,50%, 10,25% 10%, 9,75%, 9,50%, 9,25% 9%, 8,75%, 8,50%, 8,25% 8%, 7,75%, 7,50%, 7,25% 7%, 6,75%, 6,50%, 6,25% 6%, 5,75%, 5,50%, 5,25% 5%, 4,75%, 4,50%, 4,25%, 4%, 3,75%, 3,50%, 3,25%, 3%, 2,75%, 2,50%, 2,25%, 2%, 1,75%, 1,50%, 125%, 1%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, 0,09%, 0,08%, 0,07%, 0,06%, 0,05%, 0,04%, 0,03%, 0,02%, 0,01%, 0,009%, 0,008%, 0,007%, 0,006%, 0,005%, 0,004%,

131 / 557 0,003%, 0,002%, 0,001%, 0,0009%, 0,0008%, 0,0007%, 0,0006%, 0,0005%, 0,0004%, 0,0003%, 0,0002% ou 0,0001% p/p, p/v, ou v/v da composição farmacêutica.

[00463] Em algumas modalidades, a concentração dos TILs providos nas composições farmacêuticas da invenção está na faixa de cerca de 0,0001% a cerca de 50%, cerca de 0,001% a cerca de 40%, cerca de 0,01% a cerca de 30%, cerca de 0,02% a cerca de 29%, cerca de 0,03% a cerca de 28%, cerca de 0,04% a cerca de 27%, cerca de 0,05% a cerca de 26%, cerca de 0,06% a cerca de 25%, cerca de 0,07% a cerca de 24%, cerca de 0,08% a cerca de 23%, cerca de 0,09% a cerca de 22%, cerca de 0,1% a cerca de 21%, cerca de 0,2% a cerca de 20%, cerca de 0,3% a cerca de 19%, cerca de 0,4% a cerca de 18%, cerca de 0,5% a cerca de 17%, cerca de 0,6% a cerca de 16%, cerca de 0,7% a cerca de 15%, cerca de 0,8% a cerca de 14%, cerca de 0,9% a cerca de 12% ou cerca de 1% a cerca de 10% p/p, p/v ou v/v da composição farmacêutica.

[00464] Em algumas modalidades, a concentração dos TILs providos nas composições farmacêuticas da invenção está na faixa de cerca de 0,001% a cerca de 10%, cerca de 0,01% a cerca de 5%, cerca de 0,02% a cerca de 4,5%, cerca de 0,03% a cerca de 4%, cerca de 0,04% a cerca de 3.5%, cerca de 0,05% a cerca de 3%, cerca de 0,06% a cerca de 2,5%, cerca de 0,07% a cerca de 2%, cerca de 0,08% a cerca de 1.5%, cerca de 0,09% a cerca de 1%, cerca de 0,1% a cerca de 0,9% p/p, p/v ou v/v da composição farmacêutica.

[00465] Em algumas modalidades, a quantidade dos TILs providos nas composições farmacêuticas da invenção é igual a ou menor que 10 g, 9,5 g, 9,0 g, 8,5 g, 8,0 g, 7,5 g, 7,0 g, 6,5 g, 6,0 g, 5,5 g, 5,0 g, 4,5 g, 4,0 g, 3,5 g, 3,0 g, 2,5 g, 2,0 g, 1,5 g, 1,0 g, 0,95 g, 0,9 g, 0,85 g, 0,8 g, 0,75 g, 0,7 g, 0,65 g, 0,6 g, 0,55 g, 0,5 g, 0,45 g, 0,4 g, 0,35 g, 0,3 g, 0,25 g, 0,2 g, 0,15 g, 0,1 g, 0,09 g, 0,08 g, 0,07 g, 0,06 g, 0,05 g, 0,04 g, 0,03 g, 0,02 g, 0,01 g, 0,009 g, 0,008 g, 0,007 g, 0,006 g, 0,005 g, 0,004 g, 0,003 g, 0,002 g, 0,001 g, 0,0009

132 / 557 g, 0,0008 g, 0,0007 g, 0,0006 g, 0,0005 g, 0,0004 g, 0,0003 g, 0,0002 g, ou 0,0001 g.

[00466] Em algumas modalidades, a quantidade dos TILs providos nas composições farmacêuticas da invenção é maior que 0,0001 g, 0,0002 g, 0,0003 g, 0,0004 g, 0,0005 g, 0,0006 g, 0,0007 g, 0,0008 g, 0,0009 g, 0,001 g, 0,0015 g, 0,002 g, 0,0025 g, 0,003 g, 0,0035 g, 0,004 g, 0,0045 g, 0,005 g, 0,0055 g, 0,006 g, 0,0065 g, 0,007 g, 0,0075 g, 0,008 g, 0,0085 g, 0,009 g, 0,0095 g, 0,01 g, 0,015 g, 0,02 g, 0,025 g, 0,03 g, 0,035 g, 0,04 g, 0,045 g, 0,05 g, 0,055 g, 0,06 g, 0,065 g, 0,07 g, 0,075 g, 0,08 g, 0,085 g, 0,09 g, 0,095 g, 0,1 g, 0,15 g, 0,2 g, 0,25 g, 0,3 g, 0,35 g, 0,4 g, 0,45 g, 0,5 g, 0,55 g, 0,6 g, 0,65 g, 0,7 g, 0,75 g, 0,8 g, 0,85 g, 0,9 g, 0,95 g, 1 g, 1,5 g, 2 g, 2,5, 3 g, 3,5, 4 g, 4,5 g, 5 g, 5,5 g, 6 g, 6,5 g, 7 g, 7,5 g, 8 g, 8,5 g, 9 g, 9,5 g, ou 10 g.

[00467] Os TILs providos nas composições farmacêuticas da invenção são eficazes em uma ampla faixa de dosagem. A dosagem exata irá depender da via de administração, a forma em que o composto é administrado, o gênero e a idade do indivíduo a ser tratado, o peso corporal do indivíduo a ser tratado, e a preferência e experiência do médico atendente. As dosagens clinicamente estabelecidas dos TILs também podem ser usadas, se apropriado. As quantidades das composições farmacêuticas administradas usando os métodos aqui, tal como as dosagens de TILs, serão dependentes do humano ou mamífero sendo tratado, da severidade do distúrbio ou condição, da taxa de administração, da disposição dos ingredientes farmacêuticos ativos e dos critérios do médico prescrevendo o tratamento.

[00468] Em algumas modalidades, TILs podem ser administrados em uma dose única. Tal administração pode ser por injeção, por exemplo, injeção intravenosa. Em algumas modalidades, TILs podem ser administrados em doses múltiplas. Dosagem pode ser uma vez, duas vezes três vezes, quatro vezes, cinco vezes, seis vezes, ou mais do que seis vezes por ano. Dosagem pode ser uma vez por mês, uma vez a cada duas semanas, uma vez por

133 / 557 semana ou uma vez a cada dois dias. Administração de TILs pode continuar desde que necessária.

[00469] Em algumas modalidades, uma dosagem eficaz de TILs é cerca de 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 7×1013, 8×1013, e 9×1013. Em algumas modalidades, uma dosagem eficaz de TILs está na faixa de 1×106 a 5×106, 5×106 a 1×107, 1×107 a 5×107, 5×107 a 1×108, 1×108 a 5×108, 5×108 a 1×109, 1×109 a 5×109, 5×109 a 1×1010, 1×1010 a 5×1010, 5×1010 a 1×1011, 5×1011 a 1×1012, 1×1012 a 5×1012, e 5×1012 a 1×1013.

[00470] Em algumas modalidades, uma dosagem eficaz de TILs está na faixa de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 4,3 mg/kg, cerca de 0,15 mg/kg a cerca de 3,6 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg a cerca de 3,2 mg/kg, cerca de 0,35 mg/kg a cerca de 2,85 mg/kg, cerca de 0,15 mg/kg a cerca de 2,85 mg/kg, cerca de 0,3 mg a cerca de 2,15 mg/kg, cerca de 0,45 mg/kg a cerca de 1,7 mg/kg, cerca de 0,15 mg/kg a cerca de 1,3 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg a cerca de 1,15 mg/kg, cerca de 0,45 mg/kg a cerca de 1 mg/kg, cerca de 0,55 mg/kg a cerca de 0,85 mg/kg, cerca de 0,65 mg/kg a cerca de 0,8 mg/kg, cerca de 0,7 mg/kg a cerca de 0,75 mg/kg, cerca de 0,7 mg/kg a cerca de 2,15 mg/kg, cerca de 0,85 mg/kg a cerca de 2 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 1,85 mg/kg, cerca de 1,15 mg/kg a cerca de 1,7 mg/kg, cerca de 1,3 mg/kg mg a cerca de 1,6 mg/kg, cerca de 1,35 mg/kg a cerca de 1,5 mg/kg, cerca de 2,15 mg/kg a cerca de 3,6 mg/kg, cerca de 2,3 mg/kg a cerca de 3,4 mg/kg, cerca de 2,4 mg/kg a cerca de 3,3 mg/kg, cerca de 2,6 mg/kg a cerca de 3,15 mg/kg, cerca

134 / 557 de 2,7 mg/kg a cerca de 3 mg/kg, cerca de 2,8 mg/kg a cerca de 3 mg/kg, ou cerca de 2,85 mg/kg a cerca de 2,95 mg/kg.

[00471] Em algumas modalidades, uma dosagem eficaz de TILs está na faixa de cerca de 1 mg a cerca de 500 mg, cerca de 10 mg a cerca de 300 mg, cerca de 20 mg a cerca de 250 mg, cerca de 25 mg a cerca de 200 mg, cerca de 1 mg a cerca de 50 mg, cerca de 5 mg a cerca de 45 mg, cerca de 10 mg a cerca de 40 mg, cerca de 15 mg a cerca de 35 mg, cerca de 20 mg a cerca de 30 mg, cerca de 23 mg a cerca de 28 mg, cerca de 50 mg a cerca de 150 mg, cerca de 60 mg a cerca de 140 mg, cerca de 70 mg a cerca de 130 mg, cerca de 80 mg a cerca de 120 mg, cerca de 90 mg a cerca de 110 mg, ou cerca de 95 mg a cerca de 105 mg, cerca de 98 mg a cerca de 102 mg, cerca de 150 mg a cerca de 250 mg, cerca de 160 mg a cerca de 240 mg, cerca de 170 mg a cerca de 230 mg, cerca de 180 mg a cerca de 220 mg, cerca de 190 mg a cerca de 210 mg, cerca de 195 mg a cerca de 205 mg, ou cerca de 198 a cerca de 207 mg.

[00472] Uma quantidade eficaz dos TILs podem ser administrada em doses únicas ou múltiplas por qualquer um dos modos aceitáveis de administração de agentes tendo utilidades similares, incluindo vias intranasal e transdérmica, por injeção intra-arterial, intravenosamente, intraperitonealmente, parenteralmente, intramuscularmente, subcutaneamente, topicamente, por transplante ou por inalação. G. Análises de viabilidade celular opcional

[00473] Opcionalmente, um teste de viabilidade celular pode ser realizado após a primeira expansão de Etapa B, usando testes padronizados conhecidos na técnica. Por exemplo, um teste de exclusão por azul tripano pode ser feito em uma amostra dos TILs em bruto, que seletivamente marca células mortas e permite uma avaliação da viabilidade. Outros testes para uso no teste de viabilidade podem incluir mas não são limitados a teste de azul Alamar e o teste MTT.

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1. Contagens celulares, viabilidade, citometria de fluxo

[00474] Em algumas modalidades, contagens celulares e/ou viabilidade são medidas. A expressão de marcadores tal, como mas não limitado a, CD3, CD4, CD8, e CD56, assim como qualquer outros divulgados ou descritos aqui, pode ser medida por citometria de fluxo com anticorpos, por exemplo mas não limitado aos comercialmente disponível de BD Bio-sciences (BD Biosciences, San Jose, CA) usando um citômetro de fluxo FACSCantoTM (BD Biosciences). As células pode ser contadas manualmente usando um c-chip hemacitômetro descartável (VWR, Batavia, IL) e viabilidade pode ser avaliada usando qualquer método conhecidos na técnica, incluindo mas não limitado a coloração azul tripano.

[00475] Em algumas modalidades, os TILs são analisados para porcentagens de população de células CD3+. Em algumas modalidades, os TILs para uso no tratamento são analisados para porcentagens de população de células CD3+. Em algumas modalidades, os TILs são TILs CD3+/CD45+. Em algumas modalidades, a porcentagem de CD3+ está entre cerca de 70% e cerca de 99,9%. Em algumas modalidades, a porcentagem de CD3+ está entre cerca de 74% e cerca de 99,9%. Em algumas modalidades, a porcentagem de CD3+ está entre cerca de 74% e cerca de 99,9%. Em algumas modalidades, a porcentagem de CD3+ está entre cerca de 74% e cerca de 97,1%. Em algumas modalidades, a porcentagem de CD3+ está entre cerca de 80% e cerca de 99,9%. Em algumas modalidades, a porcentagem de CD3+ está entre cerca de 85% e cerca de 99,9%. Em algumas modalidades, a porcentagem de CD3+ está entre cerca de 90% e cerca de 99,9%. Em algumas modalidades, a porcentagem de CD3+ está entre cerca de 85% e cerca de 95%. Em algumas modalidades, a porcentagem de CD3+ está entre cerca de 80% e cerca de 95%. Em algumas modalidades, a porcentagem de CD3+ está entre cerca de 95% e cerca de 99,9%. Em algumas modalidades, a porcentagem de CD3+/CD45+ está entre cerca de 70% e cerca de 99,9%. Em algumas

136 / 557 modalidades, a porcentagem de CD3+/CD45+ está entre cerca de 74% e cerca de 99,9%. Em algumas modalidades, a porcentagem de CD3+/CD45+ está entre cerca de 74% e cerca de 99,9%. Em algumas modalidades, a porcentagem de CD3+/CD45+ está entre cerca de 74% e cerca de 97,1%. Em algumas modalidades, a porcentagem de CD3+/CD45+ está entre cerca de 80% e cerca de 99,9%. Em algumas modalidades, a porcentagem de CD3+/CD45+ está entre cerca de 85% e cerca de 99,9%. Em algumas modalidades, a porcentagem de CD3+/CD45+ está entre cerca de 90% e cerca de 99,9%. Em algumas modalidades, a porcentagem de CD3+/CD45+ está entre cerca de 85% e cerca de 95%. Em algumas modalidades, a porcentagem de CD3+/CD45+ está entre cerca de 80% e cerca de 95%. Em algumas modalidades, a porcentagem de CD3+/CD45+ está entre cerca de 95% e cerca de 99,9%.

[00476] Em alguns casos, a população bruta de TILs pode ser crioconservada imediatamente, usando os protocolos discutidos abaixo. Alternativamente, a população bruta de TILs podem ser submetida a REP e, então, crioconservada como discutido abaixo. Similarmente, no caso no caso em que TILs geneticamente modificados serão usados em terapia, as populações em bruto ou REP podem ser submetidas a modificações genéticas para tratamentos apropriados.

2. Culturas celulares

[00477] Em uma modalidade, um método para expandir TILs pode incluir usar cerca de 5.000 mL a cerca de 25.000 mL de meio celular, cerca de

5.000 mL a cerca de 10.000 mL de meio celular, ou cerca de 5,800 mL a cerca de 8,700 mL de meio celular. Em uma modalidade, expandir o número de TILs não usa mais do que um tipo de meio de cultura de células. Qualquer meio de cultura apropriado de células pode ser usado, por exemplo, meio celular AIM-V (L-glutamina, 50 μM sulfato de estreptomicina, e 10 μM sulfato de gentamicina) ou meio de cultura de células (Invitrogen, Carlsbad

137 / 557 CA). Neste aspecto, os métodos inventivos com vantagem reduzem a quantidade de meio e o número de tipos de meios requeridos para expandir o número de TIL. Em uma modalidade, expandir o número de TIL pode compreender adicionar meios frescos de cultura celular às células (também referidos como alimentar as células) não mais frequentemente do que a cada terceiro ou quarto dia. Expandir o número de células em um recipiente permeável a gás simplifica os procedimentos necessários para expandir o número de células por redução da frequência de alimentação necessária para expandir as células.

[00478] Em uma modalidade, o meio celular no primeiro e/ou segundo recipiente permeável a gás é não filtrado. O uso de meio celular não filtrado pode simplificar os procedimentos necessários para expandir o número de células. Em uma modalidade, o meio celular no primeiro e/ou segundo recipiente permeável a gás é carente de beta-mercaptoetanol (BME).

[00479] Em uma modalidade, a duração do método compreendendo obter uma amostra de tecido tumoral do mamífero; cultivar a amostra de tecido tumoral em um primeiro recipiente permeável a gás contendo meio celular no mesmo; obter TILs a partir da amostra de tecido tumoral; expandir o número de TILs em um segundo recipiente permeável a gás contendo meio celular no mesmo usando aAPCs durante uma duração de cerca de 14 a cerca de 42 dias, por exemplo, cerca de 28 dias.

[00480] Em uma modalidade, TILs são expandidos em recipientes permeáveis a gás. Recipientes permeáveis a gás têm sido usados para expandir TILs usando PBMCs usando métodos, composições, e dispositivos conhecidos na técnica, incluindo os descritos em Publicação de Pedido de Patente US No. 2005/0106717 A1, cujas divulgações são incorporadas aqui por referência. Em uma modalidade, TILs são expandidos em bolsas permeáveis a gás. Em uma modalidade, TILs são expandidos usando um sistema de expansão celular que expande TILs em bolsas permeáveis a gás,

138 / 557 tal como os sistemas de expansão celular “Xuri Cell Expansion System W25” (GE Healthcare). Em uma modalidade, TILs são expandidos usando um sistema de expansão celular que expande TILs em bolsas permeáveis a gás, tal como o sistema de biorreator WAVE, também conhecido como Xuri Cell Expansion System W5 (GE Healthcare). Em uma modalidade, o sistema de expansão celular inclui uma bolsa de células permeável a gás com um volume selecionado do grupo consistindo em cerca de 100 mL, cerca de 200 mL, cerca de 300 mL, cerca de 400 mL, cerca de 500 mL, cerca de 600 mL, cerca de 700 mL, cerca de 800 mL, cerca de 900 mL, cerca de 1 L, cerca de 2 L, cerca de 3 L, cerca de 4 L, cerca de 5 L, cerca de 6 L, cerca de 7 L, cerca de 8 L, cerca de 9 L, e cerca de 10 L.

Em uma modalidade, TILs podem ser expandidos em frascos G-Rex (comercialmente disponível de Wilson Wolf Manufacturing). Tais modalidades permitem às populações celulares se expandir cerca de 5x105 células/cm2 a entre 10x106 e 30x106 células/cm2. Em uma modalidade, esta expansão é conduzida sem adicionar meios frescos de cultura celular às células (também referidos como alimentando as células). Em uma modalidade, isto ocorre sem alimentação, de cerca de 10 cm no frasco G-Rex.

Em uma modalidade isto ocorre sem alimentação, desde que o meio resida a uma altura de cerca de 10 cm no frasco G-Rex.

Em uma modalidade isto ocorre sem alimentação, mas com a adição de uma ou mais citocinas.

Em uma modalidade, a citocina pode ser adicionada como um bolus sem qualquer necessidade de misturar a citocina com o meio.

Tais recipientes, dispositivos, e métodos são conhecidos na técnica e tem sido usados para expandir TILs, e incluem os descritos em Publicação de Pedido de Patente US No.

US 2014/0377739A1, Publicação Internacional No.

WO 2014/210036 A1, Publicação de Pedido de Patente US No. 2013/0115617 A1, Publicação Internacional No.

WO 2013/188427 A1, Publicação de Pedido de Patente US No.

US 2011/0136228 A1, Patente US No.

US 8.809.050 B2, Publicação Internacional No.

WO 2011/072088 A2, Publicação de Pedido de Patente US

139 / 557 No. US 2016/0208216 A1, Publicação de Pedido de Patente US No. US 2012/0244133 A1, Publicação Internacional No. WO 2012/129201 A1, Publicação de Pedido de Patente US No. US 2013/0102075 A1, Patente US No. US 8.956.860 B2, Publicação Internacional No. WO 2013/173835 A1, Publicação de Pedido de Patente US No. US 2015/0175966 A1, cujas divulgações são incorporadas aqui por referência. Tais processos são também descritos em Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292. Optional Genetic Engineering of TILs (Engenharia Genética Opcional de TILs).

[00481] Em algumas modalidades, os TILs são opcionalmente geneticamente engenheirados para incluir adicionais funcionalidades, incluindo, mas não limitado a, um receptor de células T de alta afinidade (TCR), por exemplo, um TCR alvejado em um antígeno associado com tumor tal como MAGE-1, HER2, ou NY-ESO-1, ou um receptor de antígeno quimérico (CAR) que se liga a uma molécula de superfície celular associada a um tumor (por exemplo, mesotelina) ou molécula de superfície celular restringida em linhagem (por exemplo, CD19). H. Crioconservação opcional de TILs

[00482] Como discutido acima, e exemplificado em Etapas A até E como apresentado em Figura 27, crioconservação pode ocorrer em numerosos pontos em toda o processo de expansão de TILs. Em algumas modalidades, a população expandida de TILs após a segunda expansão (como provido por exemplo, de acordo com Etapa D de Figura 27) pode ser crioconservada. Crioconservação pode ser geralmente alcançada por colocação de uma população de TILs em uma solução de congelamento, por exemplo, 85% soro AB inativado complemento e 15% dimetil sulfóxido (DMSO). As células em solução são colocadas em frascos criogênicos e armazenadas durante 24 horas a -80°C, com opcional transferência para congeladores de nitrogênio gasoso para crioconservação. Ver Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-

986. Em algumas modalidades, os TILs são crioconservados em 5% DMSO.

140 / 557 Em algumas modalidades, os TILs são crioconservados em meios de cultura celular mais 5% DMSO. Em algumas modalidades, os TILs são crioconservados de acordo com os métodos dados em Exemplos 8 e 9.

[00483] Quando apropriado, as células são removidas do congelador e descongeladas em um banho de água a 37°C até aproximadamente 4/5 do solução ser descongelado. As células são geralmente recolocadas em suspensão em meios completos e opcionalmente lavadas uma ou mais vezes. Em algumas modalidades, os TILs descongelados pode ser contados e avaliados para viabilidade como é conhecido na técnica. I. Características fenotípicas de TILs expandidos

[00484] Em algumas modalidades, os TILs são analisados para expressão de numerosos marcadores de fenótipo após expansão, incluindo os descritos aqui e nos Exemplos. Em uma modalidade, expressão de um ou mais marcadores fenotípicos é examinada. Em algumas modalidades, as características fenotípicas dos TILs são analisadas após a primeira expansão em Etapa B. Em algumas modalidades, as características fenotípicas dos TILs são analisadas durante a transição em Etapa C. Em algumas modalidades, as características fenotípicas dos TILs são analisadas durante a transição de acordo com Etapa C e após crioconservação. Em algumas modalidades, as características fenotípicas dos TILs são analisadas após a segunda expansão de acordo com Etapa D. Em algumas modalidades, as características fenotípicas dos TILs são analisadas após duas ou mais expansões de acordo com Etapa D. Em algumas modalidades, o marcador é selecionado a partir do grupo consistindo em TCRab (isto é, TCRα/β), CD57, CD28, CD4, CD27, CD56, CD8a, CD45RA, CD8a, CCR7, CD4, CD3, CD38, e HLA-DR. Em algumas modalidades, o marcador é selecionado a partir do grupo consistindo em TCRab (isto é, TCRα/β), CD57, CD28, CD4, CD27, CD56, e CD8a. Em uma modalidade, o marcador é selecionado a partir do grupo consistindo em CD45RA, CD8a, CCR7, CD4, CD3, CD38, e HLA-DR. Em algumas

141 / 557 modalidades, expressão de um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze ou quatorze marcadores é examinada. Em algumas modalidades, a expressão de um ou mais marcadores de cada grupo é examinada. Em algumas modalidades, uma ou mais expressão de HLA-DR, CD38, e CD69 é mantida (isto é, não exibem uma diferença estatisticamente significante) em TILs frescos como comparado com TILs descongelados. Em algumas modalidades, o estado de ativação de TILs é mantido nos TILs descongelados.

[00485] Em uma modalidade, expressão de um ou mais marcadores regulatórios é medida. Em algumas modalidades, o marcador regulatório é selecionado a partir do grupo consistindo em CD137, CD8a, Lag3, CD4, CD3, PD-1, TIM-3, CD69, CD8a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1, e CD154. Em algumas modalidades, o marcador regulatório é selecionado a partir do grupo consistindo em CD137, CD8a, Lag3, CD4, CD3, PD-1, e TIM-3. Em algumas modalidades, o marcador regulatório é selecionado a partir do grupo consistindo em CD69, CD8a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1, e CD154. Em algumas modalidades, expressão de molécula regulatória é diminuída em TILs descongelados como comparado com TILs frescos. Em algumas modalidades, expressão de moléculas regulatórias LAG-3 e TIM-3 é diminuída em TILs descongelados como comparado com TILs frescos. Em algumas modalidades, não se nota nenhuma diferença significante em expressão de CD4, CD8, NK, TCRαβ. Em algumas modalidades, não se nota nenhuma diferença significante em expressão de CD4, CD8, NK, TCRαβ, e/ou marcadores de memória em TILs frescos como comparado com TILs descongelados. Em algumas modalidades, não se tem nenhuma diferença significante em expressão CD4, CD8, NK, TCRαβ entre os TILs produzidos pelos métodos aqui providos, como exemplificado por exemplo em Figura 27, e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27.

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[00486] Em algumas modalidades, nenhuma seleção da primeira população de TILs, segunda população de TILs, terceira população de TILs, população de TILs coletados, e/ou a população de TILs terapêuticos com base em expressão de CD4, CD8, e/ou NK, TCRαβ é realizada durante qualquer uma das etapas, incluindo as discutidas acima ou como providas, por exemplo, em Figura 27. Em algumas modalidades, nenhuma seleção da primeira população de TILs com base em CD4, CD8, e/ou NK, TCRαβ é realizada. Em algumas modalidades, nenhuma seleção da segunda população de TILs com base em expressão de CD4, CD8, e/ou NK, TCRαβ é realizada. Em algumas modalidades, nenhuma seleção da terceira população de TILs com base em expressão de CD4, CD8, e/ou NK, TCRαβ é realizada. Em algumas modalidades, nenhuma seleção da população coletada de TILs com base em expressão de CD4, CD8, e/ou NK, TCRαβ é realizada. Em algumas modalidades, nenhuma seleção da população terapêutica de TILs com base em expressão de CD4, CD8, e/ou NK, TCRαβ é realizada.

[00487] Em uma modalidade, nenhuma seleção da primeira população de TILs, segunda população de TILs, terceira população de TILs, ou população de TILs coletadas com base em expressão de CD4, CD8, e/ou NK, TCRαβ é realizada durante qualquer uma das etapas (a) a (f) do método para expandir linfócitos infiltrando os tumores (TILs) em uma população terapêutica de TILs compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs a partir de um tumor resseccionado de um paciente por processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em fragmentos múltiplos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor em um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2 para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície

143 / 557 permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3- 14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura do sistema; (d) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7-14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs que compreende uma subpopulação aumentada de células T efetoras e/ou células T de memória central com relação à segunda população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; (e) coletar a população terapêutica de TILs obtida a partir da etapa (d), em que a transição de etapa (d) para etapa (e) ocorre sem abertura do sistema; e (f) transferir a população de TILs coletada da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (e) a (f) ocorre sem abertura do sistema.

[00488] Em uma modalidade, nenhuma seleção da primeira população de TILs, segunda população de TILs, terceira população de TILs, ou população de TILs coletada com base em expressão de CD4, CD8, e/ou NK, TCRαβ é realizada durante qualquer uma das etapas (a) a (h) do método para tratar um indivíduo com câncer, o método compreendendo administrar linfócitos infiltrando os tumores expandidos (TILs) compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs a partir de um tumor

144 / 557 resseccionado de um indivíduo por processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em fragmentos múltiplos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor em um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2 para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3- 14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura do sistema; (d) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7-14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs que compreende uma subpopulação aumentada de células T efetoras e/ou células T de memória central com relação à segunda população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; (e) coletar a população terapêutica de TILs obtida a partir da etapa (d), em que a transição de etapa (d) para etapa (e) ocorre sem abertura do sistema; e (f) transferir a população de TILs coletada da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (e) a (f) ocorre sem abertura do sistema;

145 / 557 (g) opcionalmente crioconservar a bolsa de infusão compreendendo a população de TILs coletada da etapa (f) usando um processo de crioconservação; e (h) administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz da terceira população de TILs da bolsa de infusão em etapa (g) para o paciente.

[00489] Em algumas modalidades, o marcador de memória é selecionado a partir do grupo consistindo em CCR7 e CD62L

[00490] Em algumas modalidades, a viabilidade dos TILs frescos como comparado com os TILs descongelados é pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98%. Em algumas modalidades, a viabilidade de ambos os TILs frescos e descongelados é maior que 70%, maior que 75%, maior que 80%, maior que 85%, maior que 90%, maior que 95%, ou maior que 98%. Em algumas modalidades, a viabilidade de ambos o produto fresco e o descongelado é maior que 80%, maior que 81%, maior que 82%, maior que 83%, maior que 84%, maior que 85%, maior que 86%, maior que 87%, maior que 88%, maior que 89%, ou maior que 90%. Em algumas modalidades, a viabilidade de ambos os produtos fresco e descongelado é maior que 86%.

[00491] Em uma modalidade, TILs re-estimulados também podem ser avaliados para liberação de citocinas, usando testes de liberação de citocinas. Em algumas modalidades, TILs podem ser avaliados para secreção de interferon-7 (IFN-7) em resposta a estimulação ou com OKT3 ou co-cultura com digesto de tumor autólogo. Por exemplo, em modalidades empregando estimulação com OKT3, TILs são lavados extensivamente, e cavidades duplicadas são preparadas com 1 x 105 células em 0,2 mL de CM em placas de fundo plano de 96 cavidades pré-revestidas com 0,1 ou 1,0 µg/mL de OKT3 diluído em solução salina tamponada com fosfato. Após incubação durante a noite, os sobrenadantes são coletados e IFN-7 no sobrenadante é medido por ELISA (Pierce/Endogen, Woburn, MA). Para o teste de co-

146 / 557 cultura, 1 x 105 TILs celulares são colocados em uma placa com 96 cavidades com células de tumor autólogas. (razão 1:1). Após uma incubação de 24 h, sobrenadantes são coletados e liberação de IFN-7 pode ser quantificada, por exemplo por ELISA.

[00492] Análise citométrica de fluxo de biomarcadores de superfície celular: amostras de TILs foram divididas em alíquotas durante análise citométrica de fluxo de marcadores de superfície celular, ver, por exemplo, Exemplos 7, 8, e 9.

[00493] Em algumas modalidades, os TILs estão sendo avaliados para vários marcadores regulatórios. Em algumas modalidades, o marcador regulatório é selecionado a partir do grupo consistindo em TCR α/β, CD56, CD27, CD28, CD57, CD45RA, CD45RO, CD25, CD127, CD95, IL-2R-, CCR7, CD62L, KLRG1, e CD122. Em algumas modalidades, o marcador regulatório é TCR α/β. Em algumas modalidades, o marcador regulatório é CD56. Em algumas modalidades, o marcador regulatório é CD27. Em algumas modalidades, o marcador regulatório é CD28. Em algumas modalidades, o marcador regulatório é CD57. Em algumas modalidades, o marcador regulatório é CD45RA. Em algumas modalidades, o marcador regulatório é CD45RO. Em algumas modalidades, o marcador regulatório é CD25. Em algumas modalidades, o marcador regulatório é CD127. Em algumas modalidades, o marcador regulatório é CD95. Em algumas modalidades, o marcador regulatório é IL-2R-. Em algumas modalidades, o marcador regulatório é CCR7. Em algumas modalidades, o marcador regulatório é CD62L. Em algumas modalidades, o marcador regulatório é KLRG1. Em algumas modalidades, o marcador regulatório é CD122.

[00494] Em uma modalidade, os TILs expandidos são analisados para expressão de numerosos marcadores de fenótipo, incluindo os descritos aqui e nos Exemplos. Em uma modalidade, expressão de um ou mais marcadores fenotípicos é examinada. Em algumas modalidades, o marcador é selecionado

147 / 557 a partir do grupo consistindo em TCRab (isto é, TCRα/β), CD57, CD28, CD4, CD27, CD56, CD8a, CD45RA, CD8a, CCR7, CD4, CD3, CD38, e HLA-DR. Em algumas modalidades, o marcador é selecionado a partir do grupo consistindo em TCRab (isto é, TCRα/β), CD57, CD28, CD4, CD27, CD56, e CD8a. Em uma modalidade, o marcador é selecionado a partir do grupo consistindo em CD45RA, CD8a, CCR7, CD4, CD3, CD38, e HLA-DR. Em algumas modalidades, expressão de um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze ou quatorze marcadores é examinada. Em algumas modalidades, a expressão de um ou mais marcadores de cada grupo é examinada. Em algumas modalidades, uma ou mais dentre expressão de HLA-DR, de CD38, e de CD69 é mantida (isto é, não exibe uma diferença estatisticamente significante) em TILs frescos como comparado com TILs descongelados. Em algumas modalidades, o estado de ativação de TILs é mantido nos TILs descongelados.

[00495] Em uma modalidade, expressão de um ou mais marcadores regulatórios é medida. Em algumas modalidades, o marcador regulatório é selecionado a partir do grupo consistindo em CD137, CD8a, Lag3, CD4, CD3, PD1, TIM-3, CD69, CD8a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1, e CD154. Em algumas modalidades, o marcador regulatório é selecionado a partir do grupo consistindo em CD137, CD8a, Lag3, CD4, CD3, PD1, e TIM-3. Em algumas modalidades, o marcador regulatório é selecionado a partir do grupo consistindo em CD69, CD8a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1, e CD154. Em algumas modalidades, expressão de molécula regulatória é diminuída em TILs descongelados como comparado com TILs frescos. Em algumas modalidades, expressão de moléculas regulatórias LAG-3 e TIM-3 é diminuída em TILs descongelados como comparado com TILs frescos. Em algumas modalidades, não há nenhuma diferença significante em expressão de CD4, CD8, NK, TCRαβ. Em algumas modalidades, não há nenhuma diferença significante em expressão de CD4, CD8, NK, TCRαβ, e/ou

148 / 557 marcadores de memória em TILs frescos como comparado com TILs descongelados.

[00496] Em algumas modalidades o marcador de memória é selecionado a partir do grupo consistindo em CCR7 e CD62L.

[00497] Em algumas modalidades, a viabilidade dos TILs frescos como comparado com os TILs descongelados é pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98%. Em algumas modalidades, a viabilidade de ambos os TILs frescos e descongelados é maior que 70%, maior que 75%, maior que 80%, maior que 85%, maior que 90%, maior que 95%, ou maior que 98%. Em algumas modalidades, a viabilidade de ambos os produtos fresco e descongelado é maior que 80%, maior que 81%, maior que 82%, maior que 83%, maior que 84%, maior que 85%, maior que 86%, maior que 87%, maior que 88%, maior que 89%, ou maior que 90%. Em algumas modalidades, a viabilidade de ambos os produtos fresco e descongelado é maior que 86%.

[00498] Em uma modalidade, TILs re-estimulados também podem ser avaliados para a liberação de citocinas, usando testes de liberação de citocinas. Em algumas modalidades, TILs podem ser avaliados para secreção de interferon-7 (IFN-7) em resposta a estimulação ou com OKT3 ou co- cultura com digesto de tumor autólogo. Por exemplo, em modalidades empregando estimulação com OKT3, TILs são lavados extensivamente, e cavidades duplicadas são preparadas com 1 x 105 células em 0,2 mL CM em placas de fundo plano de 96 cavidades pré-revestidas com 0,1 ou 1,0 µg/mL de OKT3 diluído em solução salina tamponada com fosfato. Após a incubação durante a noite, os sobrenadantes são coletados e IFN-7 no sobrenadante é medido por ELISA (Pierce/Endogen, Woburn, MA). Para o teste de co-cultura, 1 x 105 células de TILs são colocadas em uma placa com 96 cavidades com células de tumor autólogas. (razão 1:1). Após uma incubação de 24 horas, sobrenadantes são coletados e a liberação de IFN-7

149 / 557 pode ser quantificada, por exemplo por ELISA.

[00499] Em algumas modalidades, a caracterização fenotípica é examinada após a crioconservação. J. Saúde metabólica de TILs expandidos

[00500] Os TILs re-estimulados são caracterizados por intensificação significante de glicólise basal como comparado com ou TILs recentemente coletados e/ou TILs pós-descongelados. Em uma modalidade, nenhuma seleção da primeira população de TILs, segunda população de TILs, terceira população de TILs, população de TILs coletada, e/ou a população de TILs terapêuticos com base em expressão de CD8 é realizada durante qualquer uma das etapas, incluindo as discutidas acima ou como providas, por exemplo, em Figura 27. Em algumas modalidades, nenhuma seleção da primeira população de TILs com base em expressão de CD8 é realizada. Em algumas modalidades, nenhuma seleção da segunda população de TILs com base em expressão de CD8 é realizada. Em algumas modalidades, nenhuma seleção da terceira população de TILs com base em expressão de CD8 é realizada. Em algumas modalidades, nenhuma seleção da população de TILs coletados com base em expressão de CD8 é realizada. Em algumas modalidades, nenhuma seleção da população terapêutica de TILs com base em expressão de CD8 é realizada.

[00501] Em uma modalidade, nenhuma seleção da primeira população de TILs, segunda população de TILs, terceira população de TILs, ou população de TILs coletados com base em expressão de CD8 é realizada durante qualquer uma das etapas (a) a (f) do método para expandir linfócitos infiltrando os tumores (TILs) em uma população terapêutica de TILs compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs a partir de um tumor resseccionado de um paciente por processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em fragmentos múltiplos de tumor;

150 / 557 (b) adicionar os fragmentos de tumor em um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2 para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3- 14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura do sistema; (d) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7-14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs que compreende uma subpopulação aumentada de células T efetoras e/ou células T de memória central com relação à segunda população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; (e) coletar a população terapêutica de TILs obtida a partir da etapa (d), em que a transição de etapa (d) para etapa (e) ocorre sem abertura do sistema; e (f) transferir a população de TILs coletada da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (e) a (f) ocorre sem abertura do sistema.

[00502] Em uma modalidade, nenhuma seleção da primeira população de TILs, segunda população de TILs, terceira população de TILs, ou

151 / 557 população de TILs coletada com base em expressão de CD8 é realizada durante qualquer uma das etapas (a) a (h) do método para tratar um indivíduo com câncer, o método compreendendo administrar linfócitos infiltrando os tumores expandidos (TILs) compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs a partir de um tumor resseccionado de um indivíduo por processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em fragmentos múltiplos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor em um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2 para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3- 14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura do sistema; (d) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7-14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs que compreende uma subpopulação aumentada de células T efetoras e/ou células T de memória central com relação à segunda população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; (e) coletar a população terapêutica de TILs obtida a partir da

152 / 557 etapa (d), em que a transição de etapa (d) para etapa (e) ocorre sem abertura do sistema; e (f) transferir a população de TILs coletada da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (e) a (f) ocorre sem abertura do sistema; (g) opcionalmente crioconservar a bolsa de infusão compreendendo a população de TILs coletada da etapa (f) usando um processo de crioconservação; e (h) administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz da terceira população de TILs da bolsa de infusão em etapa (g) para o paciente.

[00503] Os TILs preparados pelos métodos descritos aqui são caracterizados por intensificação significante de glicólise basal como comparado com, por exemplo, TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em uma modalidade, nenhuma seleção da primeira população de TILs, segunda população de TILs, terceira população de TILs, população de TILs coletada, e/ou a população de TILs terapêuticos com base em expressão de CD8 é realizada durante qualquer uma das etapas, incluindo os discutidos acima ou como providos, por exemplo, em Figura 27. Em algumas modalidades, nenhuma seleção da primeira população de TILs com base em expressão de CD8 é realizada. Em algumas modalidades, nenhuma seleção da segunda população de TILs com base em expressão de CD8 é realizada. Em algumas modalidades, nenhuma seleção da terceira população de TILs com base em expressão de CD8 é realizado. Em algumas modalidades, no seleção do coletados população de TILs com base em expressão de CD8 é realizada. Em algumas modalidades, nenhuma seleção da população terapêutica de TILs com base em expressão de CD8 é realizada. Em uma modalidade, nenhuma seleção da primeira população de TILs, segunda população de TILs, terceira

153 / 557 população de TILs, ou população de TILs coletada com base em expressão de CD8 é realizado durante qualquer uma das etapas (a) a (h).

[00504] Capacidade respiratória de reposição (SRC) e reserva glicolítica podem ser avaliadas para TILs expandidos com diferentes métodos da presente descrição. O teste de tensão Seahorse XF Cell Mito mede a função mitocondrial diretamente medindo a taxa de consumo de oxigênio (OCR) de células, usando moduladores de respiração que alvejam componentes da cadeia de transporte de elétrons na mitocondria. Os compostos de teste (oligomicina, FCCP, e uma mistura de rotenona e antimicina A, descrita abaixo) são injetados em série para medir a Produção de ATP, respiração máxima, e respiração não mitocondrial, respectivamente. Vazamento de prótons e capacidade respiratória de reposição são então calculados usando estes parâmetros e respiração basal. Cada modulador alveja um componente específico da cadeia de transporte de elétrons. Oligomicina inibe a ATP sintase (complexo V) e a diminuição em OCR após injeção de oligomicina está correlacionada com a respiração mitocondrial associada com produção celular de ATP. Carbonil cianida-4 (trifluorometoxi) fenil hidrazona (FCCP) é um agente de não acoplamento que colapsa o gradiente de prótons e interrompe o potencial da membrana mitocondrial potencial. Como um resultado, fluxo de elétrons através da cadeia de transporte de elétrons não é inibido e oxigênio é consumido ao máximo pelo complexo IV. OCR estimulado por FCCP pode ser então usado para calcular a capacidade respiratória de reposição, definida como a diferença entre respiração máxima e respiração basal. Capacidade respiratória de reposição (SRC) é uma medição da capacidade da célula para responder a uma demanda de energia aumentada. A terceira injeção é uma mistura de rotenona, um inibidor de complexo I, e antimicina A, um inibidor de complexo III. Esta combinação interrompe a respiração mitocondrial e permite o cálculo de respiração não mitocondrial acionada por processos fora da mitocondria. Em algumas

154 / 557 modalidades, a comparação é com, por exemplo, TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27.

[00505] Em algumas modalidades, o teste metabólico é respiração basal. Em geral, TILs de segunda expansão têm uma taxa de respiração basal que é pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%¸ pelo menos 75%, pelo menos 80%¸ pelo menos 85%¸ pelo menos 90%¸ pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, a taxa de respiração basal é de cerca de 50% a cerca de 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, a taxa de respiração basal é de cerca de 60% a cerca de 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, a taxa de respiração basal é de cerca de 70% a cerca de 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, a taxa de respiração basal é de cerca de 80% a cerca de 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, a taxa de respiração basal é de cerca de 90% a cerca de 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou

155 / 557 TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, a taxa de respiração basal é de cerca de 95% a cerca de 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, os TILs de segunda expansão ou TILs de segunda expansão adicional (tal como, por exemplo, os descritos em Etapa D de Figura 27, incluindo TILs referidos como TILs de reREP) têm uma taxa de respiração basal que não é estatisticamente significativamente diferente da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, a comparação é para, por exemplo, TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27.

[00506] Em algumas modalidades, o teste metabólico é capacidade respiratória de reposição. Em geral, os TILs de segunda expansão ou TILs de segunda expansão adicional (tal como, por exemplo, os descritos em Etapa D de Figura 27, incluindo TILs referidos como TILs de reREP) têm uma capacidade respiratória de reposição que é pelo menos é pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%¸ pelo menos 75%, pelo menos 80%¸ pelo menos 85%¸ pelo menos 90%¸ pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, a capacidade respiratória de reposição é de cerca de 50% a cerca de 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados. Em

156 / 557 algumas modalidades, a capacidade respiratória de reposição é de cerca de 50% a cerca de 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, a capacidade respiratória de reposição é de cerca de 60% a cerca de 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, a capacidade respiratória de reposição é de cerca de 70% a cerca de 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, a capacidade respiratória de reposição é de cerca de 80% a cerca de 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados.

Em algumas modalidades, a capacidade respiratória de reposição é de cerca de 90% a cerca de 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, a capacidade respiratória de reposição é de cerca de 95% a cerca de 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, os TILs de segunda expansão ou TILs de segunda expansão adicional (tal como, por exemplo, os descritos em Etapa D de Figura 27, incluindo TILs referidos como TILs de reREP) têm uma capacidade respiratória de reposição que não é, de modo estatisticamente significante, diferente de uma taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui

157 / 557 incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27.

[00507] Em geral, TILs de segunda expansão ou TILs de segunda expansão adicional (tal como, por exemplo, os descritos em Etapa D de Figura 27, incluindo TILs referidos como TILs de reREP) têm uma capacidade respiratória de reposição que é pelo menos é pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%¸ pelo menos 75%, pelo menos 80%¸ pelo menos 85%¸ pelo menos 90%¸ pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, o teste metabólico medida é reserva glicolítica. Em algumas modalidades, o teste metabólico é capacidade respiratória de reposição. Para medir metabolismo celular (respiratório), células foram tratadas com inibidores de respiração mitocondrial e glicólise para determinar um perfil metabólico para os TILs consistindo das seguintes medidas: fosforilação oxidativa de linha de base (como medido por OCR), capacidade respiratória de reposição, atividade glicolítica de linha de base (como medido por ECAR), e reserva glicolítica. Perfis metabólicos foram realizados usando o ensaio de combinação de teste de tensão mitocondrial/glicólise Seahorse (incluindo o kit comercialmente disponível de Agilent®), que permite determinação da capacidade das células de realizar a glicólise quando do bloqueio da Produção de ATP mitocondrial. Em algumas modalidades, células são privadas de glicose, então, glicose é injetada, seguido por um agente de tensão. Em algumas modalidades, o agente de tensão é selecionado a partir do grupo consistindo em oligomicina, FCCP, rotenona, antimicina A e/ou 2- deoxiglucose (2-DG), assim como combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, oligomicina é adicionada 10 mM. Em algumas modalidades, FCCP é adicionado a 10 mM. Em algumas modalidades, rotenona a

158 / 557 adicionada a 2,5 mM.

Em algumas modalidades, antimicina A é adicionada a 2,5 mM.

Em algumas modalidades, 2-deoxiglucose (2-DG) é adicionada a 500 mM.

Em algumas modalidades, capacidade glicolítica, reserva glicolítica, e/ou acidificação não glicolítica são medidas.

Em geral, TILs têm um reserva glicolítica que é pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%¸ pelo menos 75%, pelo menos 80%¸ pelo menos 85%¸ pelo menos 90%¸ pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, a reserva glicolítica é de cerca de 50% a cerca de 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, a reserva glicolítica é de cerca de 60% a cerca de 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, a reserva glicolítica é de cerca de 70% a cerca de 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, a reserva glicolítica é de cerca de 80% a cerca de 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, a reserva glicolítica é de cerca de 90% a cerca de 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos

159 / 557 diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, a reserva glicolítica é de cerca de 95% a cerca de 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27.

[00508] Em algumas modalidades, o teste metabólico é glicólise basal. Em algumas modalidades, TILs de segunda expansão ou TILs de segunda expansão adicional (tal como, por exemplo, os descritos em Etapa D de Figura 27, incluindo TILs referidos como TILs de reREP) têm um aumento em glicólise basal de pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos seis vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos oito vezes, pelo menos nove vezes, ou pelo menos dez vezes, como comparado com TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, os TILs de segunda expansão ou TILs de segunda expansão adicional (tal como, por exemplo, os descritos em Etapa D de Figura 27, incluindo TILs referidos como TILs de reREP) têm um aumento em glicólise basal de cerca de duas vezes a cerca de dez vezes, como comparado com TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, os TILs de segunda expansão ou TILs de segunda expansão adicional (tal como, por exemplo, os descritos em Etapa D de Figura 27, incluindo TILs referidos como TILs de reREP) têm um aumento em glicólise basal de cerca de duas vezes a cerca de oito vezes, como comparado com TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas

160 / 557 modalidades, TILs de segunda expansão ou TILs de segunda expansão adicional (tal como, por exemplo, os descritos em Etapa D de Figura 27, incluindo TILs referidos como TILs de reREP) têm um aumento em glicólise basal de cerca de três vezes a cerca de sete vezes, como comparado com TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, os TILs de segunda expansão ou TILs de segunda expansão adicional (tal como, por exemplo, os descritos em Etapa D de Figura 27, incluindo TILs referidos como TILs de reREP) têm um aumento em glicólise basal de cerca de duas vezes a cerca de quatro vezes, como comparado com TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, os TILs de segunda expansão ou TILs de segunda expansão adicional (tal como, por exemplo, os descritos em Etapa D de Figura 27, incluindo TILs referidos como TILs de reREP) têm um aumento em glicólise basal de cerca de duas vezes a cerca de três vezes, como comparado com TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27.

[00509] Em geral, os TILs de segunda expansão ou TILs de segunda expansão adicional (tal como, por exemplo, os descritos em Etapa D de Figura 27, incluindo TILs referidos como TILs de reREP) têm um reserva glicolítica que é pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%¸ pelo menos 75%, pelo menos 80%¸ pelo menos 85%¸ pelo menos 90%¸ pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos

161 / 557 corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, a reserva glicolítica é de cerca de 50% a cerca de 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados. Em algumas modalidades, a reserva glicolítica é de cerca de 60% a cerca de 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, a reserva glicolítica é de cerca de 70% a cerca de 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, a reserva glicolítica é de cerca de 80% a cerca de 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, a reserva glicolítica é de cerca de 90% a cerca de 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, a reserva glicolítica é de cerca de 95% a cerca de 99% da taxa de respiração basal de TILs recentemente coletados.

[00510] Produção de Granzyme B: Granzyme B é outra medição da capacidade de TIL para matar as células alvo. Os sobrenadantes do meio re- estimulados, como descrito acima, usando anticorpos para CD3, CD28, e CD137/4-1BB foram também avaliados para seus níveis de Granzyme B usando o kit denominado Human Granzyme B DuoSet ELISA Kit (R & D Sistemas, Minneapolis, MN) de acordo com as instruções do fabricante. Em algumas modalidades, os TILs de segunda expansão ou TILs de segunda expansão adicional (tal como, por exemplo, os descritos em Etapa D de

162 / 557 Figura 27, incluindo TILs referidos como TILs de reREP) apresentam uma aumentada produção de Granzyme B. Em algumas modalidades, os TILs de segunda expansão ou TILs de segunda expansão adicional (tal como, por exemplo, os descritos em Etapa D de Figura 27, incluindo TILs referidos como TILs de reREP) apresentam uma aumentada atividade citotóxica.

[00511] Em algumas modalidades, comprimento do telômero pode ser usado como uma medição de viabilidade celular e/ou função celular. Em algumas modalidades, os telômeros são surpreendentemente do mesmo comprimento nos TILs produzidos pela presente invenção, como comparados com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Medição de comprimento do telômero: Diversos métodos foram usados para medir o comprimento de telômeros em preparações citológicas e DNA genômico. A análise do fragmento de restrição de telômero (TRF) é o padrão ouro para medir o comprimento do telômero (de Lange et al., 1990). No entanto, uma limitação principal de TRF é a exigência de uma grande quantidade de DNA (1,5 ^g). Duas técnicas amplamente usadas para a medição do comprimento dos telômeros ou seja, fluorescência in situ hibridação (FISH; Agilent Technologies, Santa Clara, CA) e PCR quantitativa podem ser empregadas com a presente invenção. Em algumas modalidades, não ocorre mudança no comprimento do telômero entre os TILs inicialmente coletados em Etapa A e os TILs expandidos a partir de, por exemplo, Etapa D como apresentado em Figura 27.

[00512] Em algumas modalidades, a saúde dos TILs é medida por secreção IFN-gama (IFN-γ). Em algumas modalidades, secreção de IFN-γ é indicativa de TILs ativos. Em algumas modalidades, um teste de potência para a produção de IFN-γ é empregado. A produção de IFN-γ é outra medição do potencial citotóxico. A produção de IFN-γ pode ser medida por determinação dos níveis de citocina IFN-γ nos meios de TIL estimulados com

163 / 557 anticorpos para CD3, CD28, e CD137/4-1BB. Os níveis de IFN-γ nos meios a partir destes TIL estimulados podem ser determinados usando a medição da liberação de IFN-γ. Em algumas modalidades, um aumento em produção de IFN-γ em, por exemplo, Etapa D, como apresentado em Figura 27, os TILs como comparados com os TILs inicialmente coletados em, por exemplo, Etapa A, como apresentado em Figura 27, é indicativo de um aumento em potencial citotóxico dos TILs de Etapa D. Em algumas modalidades, secreção de IFN-γ é aumentada uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes, ou cinco vezes, ou mais. Em algumas modalidades, secreção de IFN-γ é aumentada uma vez. Em algumas modalidades, secreção de IFN-γ é aumentada duas vezes. Em algumas modalidades, secreção de IFN-γ é aumentada três vezes. Em algumas modalidades, secreção de IFN-γ é aumentada quatro vezes. Em algumas modalidades, secreção de IFN-γ é aumentada cinco vezes. Em algumas modalidades, IFN-γ é medido usando um kit Quantikine ELISA. Em algumas modalidades, IFN-γ é medido em TILs ex vivo. Em algumas modalidades, IFN-γ é medido em TILs ex vivo, incluindo TILs produzidos pelos métodos da presente invenção, incluindo, por exemplo, Figura 27 métodos, assim como TILs recentemente coletados ou os TILs produzidos por outros métodos, tal como os apresentados, por exemplo, em Figura 83 (tal como, por exemplo, TILs de processo 1C).

[00513] Em algumas modalidades, o potencial citotóxico de TIL para lisar as células alvo foi avaliado usando um teste de co-cultura de TIL com a linhagem de células bioluminescente, P815 (Clone G6), de acordo com um teste de lise redirigido bioluminescente (teste de potência) para teste de TILs que mede a citotoxicidade de TILs em um modo dependente de dose altamente sensível.

[00514] Em algumas modalidades, os presentes métodos provêem um teste para avaliar viabilidade de TILs, usando os métodos como descritos acima. Em algumas modalidades, os TILs são expandidos como discutido

164 / 557 acima, incluindo, por exemplo, como apresentado em Figura 27. Em algumas modalidades, os TILs são crioconservados antes de serem avaliados para viabilidade. Em algumas modalidades, a avaliação da viabilidade inclui descongelar os TILs antes de realizar uma primeira expansão, uma segunda expansão, e uma segunda expansão adicional. Em algumas modalidades, os presentes métodos provêem um teste para avaliar proliferação celular, toxicidade celular, morte celular e/ou outros termos relacionados com a viabilidade da população de TILs. Viabilidade pode ser medida por qualquer um dos testes metabólicos de TILs, descritos acima, assim como quaisquer métodos conhecidos para avaliar a viabilidade celular que são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, os presentes métodos provêem como teste para avaliação da proliferação celular, toxicidade celular, morte celular, e/ou outros termos relacionados com a viabilidade dos TILs expandidos usando os métodos descritos aqui, incluindo os exemplificados em Figura 27.

[00515] A presente invenção também provê métodos de teste para determinar a viabilidade de TILs. Em algumas modalidades, os TILs têm uma viabilidade como comparados com TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, os TILs têm uma aumentada viabilidade, como comparados com TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. A presente descrição provê métodos para testar TILs para viabilidade por expansão de linfócitos infiltrando os tumores (TILs) em uma população maior de TILs compreendendo: (i) obter uma primeira população de TILs que que tinha sido previamente expandida; (ii) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira

165 / 557 população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2 para produzir uma segunda população de TILs; e (iii) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é pelo menos 100 vezes maior em número do que a segunda população de TILs, e em que a segunda expansão é realizada durante pelo menos 14 dias a fim de obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs compreende uma subpopulação aumentada de células T efetoras e/ou células T de memória central com relação à segunda população de TILs, e em que a terceira população é testada adicional para viabilidade.

[00516] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente: (iv) realizar uma segunda expansão adicional por suplementação do meio de cultura celular da terceira população de TILs com IL-2 adicional, OKT-3 adicional e APCs adicionais, em que a segunda expansão adicional é realizada durante pelo menos 14 dias para obter um maior população de TILs do que a obtida em etapa (iii), em que a maior população de TILs compreende uma subpopulação aumentada de células T efetoras e/ou células T de memória central com relação à terceira população de TILs, e em que a terceira população é testada adicionalmente para viabilidade.

[00517] Em algumas modalidades, antes da etapa (i), as células são crioconservadas.

[00518] Em algumas modalidades, as células são descongeladas antes de realizar etapa (i).

[00519] Em algumas modalidades, etapa (iv) é repetida uma a quatro vezes a fim de obter TILs suficientes para análise.

166 / 557

[00520] Em algumas modalidades, etapas (i) até (iii) ou (iv) são realizadas dentro de um período de cerca de 40 dias a cerca de 50 dias.

[00521] Em algumas modalidades, etapas (i) até (iii) ou (iv) são realizadas dentro de um período de cerca de 42 dias a cerca de 48 dias.

[00522] Em algumas modalidades, etapas (i) até (iii) ou (iv) são realizadas dentro de um período de cerca de 42 dias a cerca de 45 dias.

[00523] Em algumas modalidades, etapas (i) até (iii) ou (iv) são realizados de dentro de cerca de 44 dias.

[00524] Em algumas modalidades, as células de etapas (iii) ou (iv) expressam CD4, CD8, e TCR α β em níveis similares a células recentemente coletadas.

[00525] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos são células mononucleares de sangue periférico (PBMCs).

[00526] Em algumas modalidades, as PBMCs são adicionadas à cultura celular em qualquer um de dias 9 até 17 em etapa (iii).

[00527] Em algumas modalidades, as células T efetoras e/ou células T de memória central na população maior de TILs em etapa (iv) exibem uma ou mais características selecionadas a partir do grupo consistindo em expressão de CD27, expressão de CD28, telômeros mais longos, expressão aumentada de CD57, e expressão diminuída de CD56, com relação a células T efetoras, e/ou células T de memória central na terceira população de células.

[00528] Em algumas modalidades, as células T efetoras e/ou células T de memória central exibem expressão aumentada de CD57 e expressão diminuída de CD56.

[00529] Em algumas modalidades, as APCs são APCs artificiais (aAPCs).

[00530] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a etapa de transduzir a primeira população de TILs com um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleico codificando um

167 / 557 receptor de células T de alta afinidade.

[00531] Em algumas modalidades, a etapa de transduzir ocorre antes da etapa (i).

[00532] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a etapa de transduzir a primeira população de TILs com um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleico codificando um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo um anticorpo de fragmento variável de cadeia única fusionado com pelo menos um endodomínio de uma molécula sinalizando célula T.

[00533] Em algumas modalidades, a etapa de transduzir ocorre antes da etapa (i).

[00534] Em algumas modalidades, os TILs são testados para viabilidade.

[00535] Em algumas modalidades, os TILs são testados para viabilidade após crioconservação.

[00536] Em algumas modalidades, os TILs são testados para viabilidade após crioconservação e após etapa (iv).

[00537] Os receptores de antígenos diversos de linfócitos T e B são produzidos por recombinação somática de um número limitado, porém grande, de segmentos de genes. Estes segmentos de genes: V (variável), D (diversidade), J (junção), e C (constante), determinam a especificidade de ligação e aplicações a jusante de imunoglobulinas e receptores de células T(TCRs). A presente invenção provê um método para gerar TILs que exibem e aumentam a diversidade do repertório de células T (às vezes referidos como policlonalidade). Em algumas modalidades, o aumento em diversidade do repertório de células T é como comparado com TILs recentemente coletados e/ou TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, os TILs obtidos pelo presente método exibem um

168 / 557 aumento no diversidade do repertório de células T. Em algumas modalidades, os TILs obtidos na primeira expansão exibem um aumento na diversidade do repertório de células T. Em algumas modalidades, o aumento em diversidade é um aumento na diversidade de imunoglobulina e/ou na diversidade de receptor de células T. Em algumas modalidades, a diversidade na imunoglobulina é na imunoglobulina de cadeia pesada. Em algumas modalidades, a diversidade é na imunoglobulina e é na cadeia leve de imunoglobulina. Em algumas modalidades, a diversidade é no receptor de células T. Em algumas modalidades, a diversidade é em um dos receptores de células T selecionado a partir do grupo consistindo em receptores alfa, beta, gama, e delta. Em algumas modalidades, nota-se um aumento na expressão de receptor de células T (TCR) alfa e/ou beta. Em algumas modalidades, nota-se um aumento na expressão de receptor alfa de células T (TCR). Em algumas modalidades, nota-se um aumento na expressão de receptor beta de células T (TCR). Em algumas modalidades, nota-se um aumento na expressão de TCRab (isto é, TCRα/β).

[00538] De acordo com a presente descrição, um método para testar TILs para viabilidade e/ou uso adicional compreende administração a um indivíduo. Em algumas modalidades, o método para testar linfócitos infiltrando os tumores (TILs) compreende: (i) obter uma primeira população de TILs; (ii) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2 para produzir uma segunda população de TILs; e (iii) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a segunda população de TILs;

169 / 557 (iv) coletar, lavar e crioconservar a terceira população de TILs; (v) armazenar os TILs crioconservados em uma temperatura criogênica; (vi) descongelar a terceira população de TILs para prover uma terceira população de TILs descongelados; e (vii) realizar uma segunda expansão adicional de uma porção da terceira população descongelada de TILs por suplementação do meio de cultura celular da terceira população com IL-2, OKT-3, e APCs durante um período de expansão adicional (às vezes referido como um período de reREP) de pelo menos 3 dias, em que a terceira expansão é realizada para obter uma quarta população de TILs, em que o número de TILs na quarta população de TILs é comparado com o número de TILs na terceira população de TILs para obter uma razão; (viii) determinar com base na razão em etapa (vii) se a população de TILs descongelados é apropriada para administração a um paciente; (ix) administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz da terceira população de TILs descongelados ao paciente quando a razão do número de TILs na quarta população de TILs para o número de TILs na terceira população de TILs é determinado como sendo maior que 5:1 em etapa (viii).

[00539] Em algumas modalidades, o período de expansão adicional (às vezes referido como um período de reREP) é realizado até a razão do número de TILs na quarta população de TILs para o número de TILs na terceira população de TILs é maior que 50:1.

[00540] Em algumas modalidades, o número de TILs suficientes para uma dosagem terapeuticamente eficaz é de cerca de 2,3×1010 a cerca de 13,7×1010.

[00541] Em algumas modalidades, etapas (i) até (vii) são realizadas

170 / 557 dentro de um período de cerca de 40 dias a cerca de 50 dias. Em algumas modalidades, etapas (i) até (vii) são realizadas dentro de um período de cerca de 42 dias a cerca de 48 dias. Em algumas modalidades, etapas (i) até (vii) são realizadas dentro de um período de cerca de 42 dias a cerca de 45 dias. Em algumas modalidades, etapas (i) até (vii) são realizados dentro de cerca de 44 dias.

[00542] Em algumas modalidades, as células de etapas (iii) ou (vii) expressam CD4, CD8, e TCR α β em níveis similares às células recentemente coletadas. Em algumas modalidades, as células são TILs.

[00543] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos são células mononucleares de sangue periférico (PBMCs). Em algumas modalidades, as PBMCs são adicionadas à cultura celular em qualquer um de dias 9 até 17 em etapa (iii).

[00544] Em algumas modalidades, as células T efetoras e/ou células T de memória central na população maior de TILs em etapas (iii) ou (vii) exibem uma ou mais características selecionadas a partir do grupo consistindo em expressão de CD27, expressão de CD28, telômeros mais longos, expressão aumentada de CD57, e expressão diminuída de CD56, com relação a células T efetoras, e/ou células T de memória central na terceira população de células.

[00545] Em algumas modalidades, as células T efetoras e/ou células T de memória central exibem expressão aumentada de CD57 e expressão diminuída de CD56.

[00546] Em algumas modalidades, as APCs são APCs artificiais (aAPCs).

[00547] Em algumas modalidades, a etapa de transduzir a primeira população de TILs com um vetor de expressão compreende um ácido nucleico codificando um receptor de células T de alta afinidade.

[00548] Em algumas modalidades, a etapa de transduzir ocorre antes

171 / 557 da etapa (i).

[00549] Em algumas modalidades, a etapa de transduzir a primeira população de TILs com um vetor de expressão compreende um ácido nucleico codificando um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo um anticorpo de fragmento variável de cadeia única fusionado com pelo menos um endodomínio de uma molécula sinalizando célula T.

[00550] Em algumas modalidades, a etapa de transduzir ocorre antes da etapa (i).

[00551] Em algumas modalidades, os TILs são testados para viabilidade após etapa (vii).

[00552] A presente descrição também provê métodos adicionais para testar TILs. Em algumas modalidades, a invenção provê um método para testar TILs compreendendo: (i) obter uma porção de uma primeira população de TILs crioconservados; (ii) descongelar a porção da primeira população de TILs crioconservados; (iii) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs) durante um período adicional de expansão (às vezes referido como um período de reREP) de pelo menos 3 dias, para produzir uma segunda população de TILs, em que a porção da primeira população de TILs é comparada com a segunda população de TILs para obter uma razão do número de TILs, em que a razão do número de TILs na segunda população de TILs para o número de TILs na porção da primeira população de TILs é maior que 5:1; (iv) determinar com base na razão em etapa (iii) se a primeira população de TILs é apropriado para uso em administração terapêutica a um

172 / 557 paciente; (v) determinar se a primeira população de TILs é apropriada para uso em administração terapêutica quando a razão do número de TILs na segunda população de TILs para o número de TILs na primeira população de TILs é determinada como sendo maior que 5:1 em etapa (iv).

[00553] Em algumas modalidades, a razão do número de TILs na segunda população de TILs para o número de TILs na porção da primeira população de TILs é maior que 50:1.

[00554] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente realizar a expansão da primeira população completa de TILs crioconservados da etapa (i) de acordo com os métodos como descritos em qualquer uma das modalidades aqui providos.

[00555] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente administrar a primeira população completa de TILs crioconservados da etapa (i) para o paciente. K. Sistemas fechados para a fabricação de TILs

[00556] A presente invenção provê o uso de sistemas fechados durante o processo de cultivo de TILs. Tais sistema fechados permitem evitar e/ou reduzir a contaminação microbiana, permitem o uso de menos frascos, e permitem reduções nos custos. Em algumas modalidades, o sistema fechado usa dois recipientes.

[00557] Tais sistemas fechados são bem conhecidos na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, em http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm e https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulator yInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm..

[00558] Em algumas modalidades, os sistemas fechados incluem sistemas de trava luer e selagem térmica como descritos, por exemplo, no Exemplo 30. Em algumas modalidades, o sistema fechado é acessado via

173 / 557 seringas sob condições estéreis a fim de manter a esterilidade e a natureza fechada do sistema. Em algumas modalidades, um sistema fechado, como descrito em Exemplo 30, é empregado. Em algumas modalidades, os TILs são formulados em um recipiente de formulação de produto final de acordo com o método descrito em Exemplo 30, seção 8.14 “Formulação final e enchimento”.

[00559] Como provido no website do FDA, sistemas fechados com métodos estéreis são conhecidos e bem descritos. Ver, https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulator yInformação/Guidances/Blood/ucm076779.htm, como mencionado acima e apresentado em parte pertinente abaixo. Introdução

[00560] Os dispositivos de conexão estéreis (STCDs) produzem soldas estéreis entre duas peças de tubos compatíveis. Este procedimento permite a conexão estéril de uma variedade de recipientes e diâmetros de tubos. Esta orientação descreve práticas e procedimentos recomendados para o uso desses dispositivos. Esta orientação não trata dos dados ou informações que um fabricante de um dispositivo de conexão estéril deve enviar ao FDA para obter aprovação ou autorização para comercialização. Também é importante observar que o uso de um dispositivo de conexão estéril aprovado ou liberado para fins não autorizados na rotulagem pode levar o dispositivo a ser considerado adulterado e com marcação incorreta nos termos da Lei Federal de Alimentos, Medicamentos e Cosméticos dos Estados Unidos.

1. Recomendações de FDA

[00561] Os fabricantes de produtos derivados de sangue que propõem usar rotineiramente um STCD aprovado pela FDA devem incorporar informações com relação a esse uso nos manuais de procedimento operacional padrão (POP) para cada produto derivado de sangue. Essas entradas devem incluir manutenção de registros, rastreamento de produtos, controle de

174 / 557 qualidade da solda de tubos, número de lote de software e descartáveis (incluindo a (s) Fonte (s) de elementos a serem adicionados). Os procedimentos de controle de qualidade devem incluir um teste da integridade de cada solda.

2. Aplicações do STCD

[00562] O usuário deve estar ciente de que o uso do dispositivo pode criar um novo produto ou modificar significativamente a configuração de um produto regulamentado cuja segurança e eficácia não foram demonstradas. Para aqueles “novos produtos” sujeitos a licenciamento, pedidos de licença ou adendos de pedidos, devem ser submetidos ao FDA, além do envio de um SOP. Em geral, o agrupamento pool ou mistura que envolve componentes celulares representa uma mudança no produto que requer submeter e aprovar uma pedido de licença ou adendo de pedido. Tais pedidos e adendos devem conter dados e descrições dos procedimentos de fabricação que demonstrem que o “novo produto” é seguro e eficaz para o uso pretendido durante o período de datação proposto.

[00563] Os comentários a seguir são providos como orientação sobre os usos mais comuns de um STCD aprovado ou liberado por FDA: L. Adicionar uma agulha nova ou menor a um conjunto de colheita de sangue

[00564] O uso do STCD para adicionar uma agulha antes do início de um procedimento (coleta de sangue total, aférese das plaquetas ou colheita de plasma Fonte) não é considerado para abrir um sistema funcionalmente fechado. Se uma agulha for adicionada durante um procedimento, somente um STCD aprovado para soldar tubos cheios de líquido deve ser usado. Se o teste de integridade da solda for satisfatório, não é considerado o uso de um STCD para abrir um sistema funcionalmente fechado.

[00565] Aféreses das plaquetas preparadas em um sistema aberto devem ser rotuladas com uma data de validade de 24 horas e produtos de aféreses das plaquetas preparadas em um sistema funcionalmente fechado

175 / 557 devem ser rotuladas com uma data de validade de cinco dias 7, 1988). (Ver Revised Guideline for Collection of Platelets, Pheresis, 7 de outubro de 1988).

[00566] A fonte e as eespecíficoações dos tubos e agulhas adicionados devem ser abordadas no SOP e nos registros do hemocentro. O uso do STCD para adicionar agulhas não representa uma grande mudança na fabricação para a qual os estabelecimentos licenciados precisam de pré-aprovação. M. Usando o STCD para preparar componentes

[00567] Quando o STCD é usado para fixar bolsas adicionais de preparação de componentes, os registros devem ser mantidos adequadamente, identificando a origem das embalagens de transferência e a verificação apropriada do número da unidade de sangue e ABO/Rh. Todo o sangue e seus componentes devem ser adequadamente rotulados (21 CFR 606.121). Exemplos:

[00568] • Adicionar um quarta bolsa a um pacote triplo de colheita de sangue total para a produção de AHF crioprecipitado a partir de plasma congelado fresco.

[00569] • Conexão de uma solução aditiva a uma unidade de glóbulos vermelhos.

[00570] • Adição de um filtro em linha que foi liberado pelo FDA para uso na fabricação de componentes.

[00571] • Adição de um terceiro recipiente de armazenamento a uma interface de tubos de aférese de plaquetas.

[00572] • Para os usos mencionados acima, os procedimentos devem ser desenvolvidos e os registros devem ser mantidos, mas os licenciados não precisam ter a aprovação da FDA para instituir os procedimentos.

1. Usando o STCD para reunir produtos de sangue

[00573] Uso apropriado de um STCD para reunir (pool) plaquetas preparadas a partir da colheita de sangue total pode evitar a contaminação potencial das entradas de orifícios e pontas comumente usados. A reunião

176 / 557 realizada imediatamente antes da transfusão é um exemplo desse uso apropriado. As plaquetas reunidas devem ser administradas não mais de 4 horas após a reunião (ver 21 CFR 606.122(l)(2)).

[00574] No entanto, a reunião e o armazenamento subsequente podem aumentar o risco em comparação com a administração de unidades doadoras aleatórias; se uma unidade contaminada for reunida com outras e armazenada antes da administração, o inóculo bacteriano total administrado pode ser aumentado como resultado da replicação no volume adicional. Consequentemente, o uso proposto de um STCD para reunir e armazenar plaquetas por mais de 4 horas deve ser suportado por dados que abordem de modo satisfatório se esta reunião (pool) está associada a um risco aumentado.

[00575] Esse pool de plaquetas constitui a fabricação de um novo produto.

[00576] A reunião ou mistura que envolve plaquetas é considerada a fabricação de um novo produto que requer a submissão e aprovação de um pedido de licença ou adendo do pedido, se o período de armazenamento exceder quatro horas.

2. Usando o STCD para preparar uma alíquota para uso pediátrico e unidades divididas

[00577] As unidades pediátricas e as unidades divididas para sangue total, células de sangue vermelhas e plasma congelado fresco preparado com um STCD não serão consideradas como sendo um novo produto para o qual é necessário um adendo de pedido de licença biológica (BLA), desde que sejam atendidas as seguintes condições: O fabricante deve ter uma licença biológica aprovada ou suplemento de licença, para o produto original (isto é, não dividido), incluindo a aprovação para cada anticoagulante usado.

[00578] Os rótulos devem ser enviados para revisão e aprovação antes da distribuição. Uma anotação deve ser feita sob a seção de comentários do

177 / 557 Formulário 2567 de FDA, Transmissão de etiquetas e circulares.

[00579] Recipientes de produto final aprovados para armazenamento do componente sendo preparado devem ser usados.

[00580] As plaquetas fabricadas sob licença devem conter pelo menos 5,5 X (10)10 plaquetas (21 CFR 640.24 (c)). As aféreses de plaquetas, fabricadas sob licença, devem conter pelo menos 3,0 X (10)11 plaquetas (ver a Diretriz revisada para a colheita de aféreses de plaquetas, de 7 de outubro de 1988).

[00581] Os procedimentos a serem seguidos com relação ao uso de um STCD para preparar produtos divididos das coletas de sangue total e do plasma e plaquetas preparados por procedimentos automatizados de hemaférese devem incluir descrições de: • como a interface de tubos de aférese ou recipiente de coletar será modificado com um STCD liberado pelo FDA; • o volume mínimo dos produtos de plasma dividido ou sangue total; • o volume e concentração de plaquetas dos produtos divididos de aférese de plaquetas; • tempo de armazenamento do produto. O produto deve estar em um recipiente aprovado e deve ser consistente com o tempo de armazenamento no rótulo de tal recipiente; • método(s) a serem usados para rotular e rastrear os produtos divididos nos registros do hemocentro.

[00582] NOTA: Procedimentos para rotular as alíquotas devem ser claramente descritos nos registros do procedimento desde que sejam adequados para permitir o rastreamento e recall de todos os componentes, se necessário.

3. Usando um STCD para conectar linhas adicionais salinas ou anticoagulantes durante uma procedimento automatizado de aférese de

178 / 557 plasma

[00583] Procedimentos devem ser desenvolvidos e registros mantidos de modo consistente com as instruções dos instrumentos do fabricante para uso, mas os licenciados não precisam da aprovação do FDA a fim de instituir os procedimentos.

4. Usando o STCD para fixar soluções de processamento

[00584] Quando usando um STCD para fixar os recipientes com soluções de processamento para produtos lavados ou congelados de células vermelhas do sangue, o período de datação para os resultantes produtos é de 24 horas, salvo se dados forem providos na forma de pedidos de licença ou suplementos de pedidos para o CBER para sustentar um período de datação mais longo (21 CFR 610,53(c)). Isenções ou modificações devem ser aprovadas por escrito pelo Diretor, CBER (21 CFR 610.53(d)).

5. Usando um STCD para adicionar um filtro de redução de leucócitos autorizado pelo FDA

[00585] Alguns filtros de redução de leucócitos não são integralmente fixados aos sistemas de colheita de sangue total. Procedimentos para uso de um STCD para filtração de pré-armazenamento devem ser consistentes com as recomendações dos fabricantes para uso.

[00586] Redução de leucócitos antes da publicação constitui uma mudança de fabricação importante. Assim, para novos produtos reduzidos em leucócitos preparados usando um STCD, fabricantes devem submeter aplicações de licenças biológicas (21 CFR 601.2) ou suplementos de aplicação de aprovação anterior ao FDA (21 CFR 601,12).

[00587] Usando um STCD para remover amostras de recipientes de produtos de sangue para teste (por exemplo, usando um STCD para obter uma amostra de plaquetas de um recipiente de Plaquetas ou Plaquetas, Aférese para compatibilidade cruzada).

[00588] Se o volume e/ou contagem celular do produto após retirada da

179 / 557 amostra diferir do que é dito no rótulo original ou na circular de informações, o rótulo no produto deve ser modificado para refletir o novo volume e/ou contagem celular. Por exemplo, amostras podem não ser removidas que reduzem a contagem de plaquetas de uma unidade de plaquetas a menos do que 5,5 x (10)10 plaquetas (21 CFR 640.24 (c)).

6. Informação adicional das diretrizes do FDA

[00589] A diretriz do FDA apresenta uma diretriz geral, assim como informação específica e exemplos com relação às eespecíficoações de aplicações para submeter aplicações e suplementos de aplicação ao FDA se dirigindo ao uso de um STCD. Se surgirem outras questões sobre o uso apropriado de um STCD, as questões devem ser dirigidas ao Office of Blood Research and Review, Center for Biologics Avaliation and Research.

[00590] Em algumas modalidades, o sistema fechado usa um recipiente do momento em que os fragmentos de tumor são obtidos até os TILs estarem prontos para administração ao paciente ou crioconservação. Em algumas modalidades quando dois recipientes são usados, o primeiro recipiente é um recipiente fechado G e uma população de TILs é centrifugada e transferida para uma bolsa de infusão sem abertura do primeiro recipiente fechado G. Em algumas modalidades, quando dois recipientes são usados, a bolsa de infusão é uma bolsa de infusão contendo HypoThermosol. Um sistema fechado ou sistema fechado de cultura celular de TILs é caracterizado em que, uma vez que a amostra de tumor e/ou fragmentos de tumor foram adicionados, o sistema é firmemente selado do exterior para formar um ambiente fechado livre da invasão de bactérias, fungos e/ou qualquer outra contaminação microbiana.

[00591] Em algumas modalidades, a redução em contaminação microbiana é entre cerca de 5% e cerca de 100%. Em algumas modalidades, a redução em contaminação microbiana é entre cerca de 5% e cerca de 95%. Em algumas modalidades, a redução em contaminação microbiana é entre

180 / 557 cerca de 5% e cerca de 90%. Em algumas modalidades, a redução em contaminação microbiana é entre cerca de 10% e cerca de 90%. Em algumas modalidades, a redução em contaminação microbiana é entre cerca de 15% e cerca de 85%. Em algumas modalidades, a redução em contaminação microbiana é cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou cerca de 100%.

[00592] O sistema fechado permite o crescimento de TIL na ausência e/ou com uma redução significante em contaminação microbiana.

[00593] Além disso, o pH, a pressão parcial de dióxido de carbono e a pressão parcial de oxigênio do ambiente de cultura de células TIL variam conforme as células são cultivadas. Consequentemente, apesar de um meio apropriado para a cultura de células ser circulado, o ambiente fechado ainda precisa ser constantemente mantido como um ambiente ideal para a proliferação de TILs. Para este fim, é desejável que os fatores físicos de pH, pressão parcial de dióxido de carbono e pressão parcial de oxigênio no líquido de cultura do ambiente fechado sejam monitorados por meio de um sensor, sinal do qual é usado para controlar um trocador de gás instalado na entrada do ambiente de cultura e a pressão parcial do gás do ambiente fechado ser ajustada em tempo real de acordo com as mudanças no líquido da cultura, a fim de otimizar o ambiente de cultura de células. Em algumas modalidades, a presente invenção provê um sistema de cultura de células fechado que incorpora na entrada ao ambiente fechado um trocador de gás equipado com um dispositivo de monitoramento que mede o pH, pressão parcial de dióxido de carbono e pressão parcial de oxigênio do ambiente fechado e otimiza o ambiente de cultura de células ajustando automaticamente as concentrações de gás com base nos sinais do dispositivo de monitoramento.

181 / 557

[00594] Em algumas modalidades, a pressão dentro do ambiente fechado é controlada continuamente ou intermitentemente. Ou seja, a pressão no ambiente fechado pode ser variada por meio de um dispositivo de manutenção de pressão, por exemplo, garantindo assim que o espaço seja apropriado para o crescimento de TILs em um estado de pressão positiva ou promovendo a exsudação de fluido em um estado de pressão negativa e promovendo assim a proliferação celular. Além disso, aplicando pressão negativa de forma intermitente, é possível substituir de modo uniforme e eficiente o líquido circulante no ambiente fechado por meio de um encolhimento temporário no volume do ambiente fechado.

[00595] Em algumas modalidades, componentes de cultura ótimos para a proliferação dos TILs podem ser substituídos ou adicionado, e incluindo fatores tal como IL-2 e/ou OKT3, assim como combinação, podem ser adicionados. C. Culturas celulares

[00596] Em uma modalidade, um método para expandir TILs, incluindo os discutidos acima, assim como exemplificados em Figura 27, pode incluir usar cerca de 5.000 mL a cerca de 25.000 mL de meio celular, cerca de 5.000 mL a cerca de 10.000 mL de meio celular, ou cerca de 5,800 mL a cerca de 8,700 mL de meio celular. Em algumas modalidades, o meio é um meio livre de soro, como descrito, por exemplo, em Exemplo 21. Em algumas modalidades, o meio na primeira expansão é livre de soro. Em algumas modalidades, o meio na segunda expansão é livre de soro. Em algumas modalidades, o meio na primeira expansão e o segundo são ambos livres de soro. Em uma modalidade, expandir o número de TILs não usa mais do que um tipo de meio de cultura de células. Qualquer meio de cultura apropriado de células pode ser usado, por exemplo, meio celular AIM-V (L- glutamina, 50 μM sulfato de estreptomicina, e 10 μM sulfato de gentamicina) meio de cultura de células (Invitrogen, Carlsbad CA). A este respeito, os

182 / 557 métodos inventivos reduzem com vantagem a quantidade de meio e o número de tipos de meios requeridos para expandir o número de TIL. Em uma modalidade, expandir o número de TIL pode compreender alimentar as células não mais frequentemente do que a cada terceiro ou quarto dia. Expandir o número de células em um recipiente permeável a gás simplifica os procedimentos necessários para expandir o número de células por redução da frequência de alimentação necessária para expandir as células.

[00597] Em uma modalidade, o meio celular no primeiro e/ou segundo recipiente permeável a gás é não filtrado. O uso de meio celular não filtrado pode simplificar os procedimentos necessários para expandir o número de células. Em uma modalidade, o meio celular no primeiro e/ou segundo recipiente permeável a gás carece de beta-mercaptoetanol (BME).

[00598] Em uma modalidade, a duração do método compreende obter uma amostra de tecido tumoral a partir do mamífero; cultivar a amostra de tecido tumoral em um primeiro recipiente permeável a gás contendo meio celular no mesmo; obter TILs a partir da amostra de tecido tumoral; expandir o número de TILs em um segundo recipiente permeável a gás contendo meio celular durante uma duração de cerca de 7 a 14 dias, por exemplo, cerca de 11 dias. Em algumas modalidades pré-REP é cerca de 7 a 14 dias, por exemplo, cerca de 11 dias. Em algumas modalidades, REP é cerca de 7 a 14 dias, por exemplo, cerca de 11 dias.

[00599] Em uma modalidade, TILs são expandidos em recipientes permeáveis a gás. Recipientes permeáveis a gás tem sido usados para expandir TILs usando PBMCs usando métodos, composições, e dispositivos conhecidos na técnica, incluindo os descritos em Publicação de Pedido de Patente US No. 2005/0106717 A1, cujas divulgações são incorporadas aqui por referência. Em uma modalidade, TILs são expandidos em bolsas permeáveis a gás. Em uma modalidade, TILs são expandidos usando um sistema de expansão celular que expande TILs em bolsas permeáveis a gás,

183 / 557 tal como o sistema Xuri Cell Expansion W25 (GE Healthcare). Em uma modalidade, TILs são expandidos usando um sistema de expansão celular que expande TILs em bolsas permeáveis a gás, tal como o sistema de biorreator WAVE, também conhecido como o Xuri Cell Expansion System W5 (GE Healthcare). Em uma modalidade, o sistema de expansão celular inclui uma bolsa de células permeável a gás com um volume selecionado do grupo consistindo em cerca de 100 mL, cerca de 200 mL, cerca de 300 mL, cerca de 400 mL, cerca de 500 mL, cerca de 600 mL, cerca de 700 mL, cerca de 800 mL, cerca de 900 mL, cerca de 1 L, cerca de 2 L, cerca de 3 L, cerca de 4 L, cerca de 5 L, cerca de 6 L, cerca de 7 L, cerca de 8 L, cerca de 9 L, e cerca de 10 L.

[00600] Em uma modalidade, TILs podem ser expandidos em frascos G-Rex (comercialmente disponíveis de Wilson Wolf Manufacturing). Tais modalidades deixam as populações celulares se expandir em cerca de 5x105 células/cm2 a entre 10x106 e 30x106 células/cm2. Em uma modalidade isto é sem alimentação. Em uma modalidade, isto é sem alimentação desde que meio permaneça a uma altura de cerca de 10 cm no frasco G-Rex. Em uma modalidade isto é sem alimentação mas com a adição de uma ou mais citocinas. Em uma modalidade, a citocina pode ser adicionada como um bolus sem qualquer necessidade de misturar a citocina com o meio. Tais recipientes, dispositivos, e métodos são conhecidos na técnica e foram usados para expandir TILs, e incluem os descritos em Publicação de Pedido de Patente US No. US 2014/0377739A1, Publicação Internacional No. WO 2014/210036 A1, Publicação de Pedido de Patente US No. 2013/0115617 A1, Publicação Internacional No. WO 2013/188427 A1, Publicação de Pedido de Patente US No. US 2011/0136228 A1, Patente US No. US 8.809.050 B2, Publicação Internacional No. WO 2011/072088 A2, Publicação de Pedido de Patente US No. US 2016/0208216 A1, Publicação de Pedido de Patente US No. US 2012/0244133 A1, Publicação Internacional No. WO 2012/129201 A1,

184 / 557 Publicação de Pedido de Patente US No. US 2013/0102075 A1, Patente US No. US 8.956.860 B2, Publicação Internacional No. WO 2013/173835 A1, Publicação de Pedido de Patente US No. US 2015/0175966 A1, cujas divulgações são incorporadas aqui por referência. Tais processos são também descritos em Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292. D. Engenharia Genética Opcional de TILs

[00601] Em algumas modalidades, os TILs são opcionalmente geneticamente engenheirados para incluir funcionalidades adicionais, incluindo, mas não limitados a, um receptor de células T de alta afinidade (TCR), por exemplo, um TCR alvejado em um antígeno associado com tumor tal como MAGE-1, HER2, ou NY-ESO-1, ou um receptor de antígeno quimérico (CAR) que se liga a uma molécula de superfície celular associada a um tumor (por exemplo, mesotelina) ou molécula de superfície celular restringida em linhagem (por exemplo, CD19). E. Crioconservação opcional de TILs

[00602] Ou a população bruta de TILs ou a população expandida de TILs podem ser opcionalmente crioconservada. Em algumas modalidades, crioconservação ocorre na população de TILs terapêuticos. Em algumas modalidades, crioconservação ocorre nos TILs coletados após a segunda expansão. Em algumas modalidades, crioconservação ocorre nos TILs em Etapa F exemplar de Figura 27. Em algumas modalidades, os TILs são crioconservados na bolsa de infusão. Em algumas modalidades, os TILs são crioconservada antes de colocação em uma bolsa de infusão. Em algumas modalidades, os TILs são crioconservados e não colocados em uma bolsa de infusão. Em algumas modalidades, crioconservação é realizada usando um meio de crioconservação. Em algumas modalidades, o meio de crioconservação contém dimetil sulfóxido (DMSO). Isto é geralmente alcançado colocando a população de TILs em uma solução de congelamento, por exemplo 85% de complemento de soro AB inativado e 15% dimetil

185 / 557 sulfóxido (DMSO). As células em solução são colocadas em frascos criogênicos e armazenadas durante 24 horas a -80°C, com transferência opcional para congeladores de nitrogênio gasoso para crioconservação. Ver, Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986.

[00603] Quando apropriado, as células são removidas do congelador e descongeladas em um banho d’água a 37°C até aproximadamente 4/5 da solução ser descongelado. As células são geralmente recolocados em suspensão em meios completos e opcionalmente lavadas uma ou mais vezes. Em algumas modalidades, os TILs descongelados podem ser contados e avaliados para viabilidade, como é conhecido na técnica.

[00604] Em uma modalidade preferida, uma população de TILs é crioconservada usando meio de crioconservação CS10 (CryoStor 10, BioLife Soluções). Em uma modalidade preferida, uma população de TILs é crioconservada usando um meio de crioconservação contendo dimetil sulfóxido (DMSO). Em uma modalidade preferida, uma população de TILs é crioconservada usando uma razão 1:1 (vol:vol) de CS10 e meio de cultura celular. Em uma modalidade preferida, uma população de TILs é crioconservada usando cerca de uma razão 1:1 (vol:vol) de CS10 e meios de cultura celular, compreendendo ainda IL-2 adicional.

[00605] Como discutido acima em Etapas A até E, crioconservação pode ocorrer em numerosos pontos durante todo o processo de expansão de TILs. Em algumas modalidades, a população bruta de TILs após a primeira expansão de acordo com Etapa B ou a população expandida de TILs após a uma ou mais segundas expansões, de acordo com Etapa D, pode ser crioconservada. Crioconservação pode ser geralmente alcançada colocando a população de TILs em uma solução de congelamento, por exemplo, 85% soro AB inativado complemento e 15% dimetil sulfóxido (DMSO). As células em solução são colocadas em frascos criogênicos e armazenadas durante 24 horas a -80°C, com transferência opcional para congeladores de nitrogênio gasoso

186 / 557 para crioconservação. Ver Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-

986.

[00606] Quando apropriado, as células são removidas do congelador e descongeladas em um banho d’água a 37°C até aproximadamente 4/5 do solução serem descongelados. As células são geralmente recolocadas em suspensão em meios completos e opcionalmente lavadas uma ou mais vezes. Em algumas modalidades, os TILs descongelados pode ser contados e avaliados para viabilidade, como é conhecido na técnica.

[00607] Em alguns casos, a população de TILs de Etapa B pode ser crioconservada imediatamente, usando os protocolos discutidos abaixo. Alternativamente, a população bruta de TILs podem ser submetida à Etapa C e Etapa D e, então, crioconservada após Etapa D. Similarmente, no caso em que TILs geneticamente modificados serão usados em terapia, as populações de TILs de Etapa B ou Etapa D podem ser submetidas a modificações genéticas para os apropriados tratamentos. F. Análises de viabilidade celular opcional

[00608] Opcionalmente, um teste de viabilidade celular pode ser realizado após a primeira expansão (às vezes referida como a expansão em volume inicial), usando testes padronizados conhecidos na técnica. Por exemplo, um teste de exclusão por azul tripano pode ser feito em uma amostra do TILs em bruto, que seletivamente marca as células mortas e permite uma avaliação da viabilidade. Outros testes para uso em teste de viabilidade podem incluir mas não são limitados ao teste de azul Alamar; e o teste MTT.

1. Contagens celulares, viabilidade, citometria de fluxo

[00609] Em algumas modalidades, contagens celulares e/ou viabilidade são medidas. A expressão de marcadores tal como mas não limitados a CD3, CD4, CD8, e CD56, assim como quaisquer outros divulgados ou descritos aqui, pode ser medida por citometria de fluxo com anticorpos, por exemplo mas não limitados aos comercialmente disponíveis de BD Bio-sciences (BD

187 / 557 Biosciences, San Jose, CA) usando um citômetro de fluxo FACSCantoTM (BD Biosciences). As células pode ser contados manualmente usando um hemacitômetro de c-chip descartável (VWR, Batavia, IL) e viabilidade pode ser avaliada usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo mas não limitado a coloração com azul tripano.

[00610] Em alguns casos, a população bruta de TILs podem ser crioconservados imediatamente, usando os protocolos discutidos abaixo. Alternativamente, a população bruta de TILs podem ser submetida a REP e, então, crioconservada como discutido abaixo. Similarmente, no caso onde TILs geneticamente modificados serão usados em terapia, as populações brutas de TILs ou REP TILs podem ser submetidas a modificações genéticas para os tratamentos apropriados.

2. Culturas celulares

[00611] Em uma modalidade, um método para expandir TILs pode incluir usar cerca de 5.000 mL a cerca de 25.000 mL de meio celular, cerca de

5.000 mL a cerca de 10.000 mL de meio celular, ou cerca de 5.800 mL a cerca de 8,700 mL de meio celular. Em uma modalidade, expandir o número de TILs não usa mais do que um tipo de meio de cultura de células. Qualquer meio de cultura de células apropriado pode ser usado, por exemplo, meio de cultura de células, o meio celular AIM-V (L-glutamina, 50 μM sulfato de estreptomicina, e 10 μM sulfato de gentamicina) (Invitrogen, Carlsbad CA). A este respeito, os métodos inventivos com vantagem reduzem a quantidade de meio e o número de tipos de meios requeridos para expandir o número de TILs. Em uma modalidade, expandir o número de TIL pode compreender alimentar as células não mais frequentemente do que a cada terceiro ou quarto dia. Expandir o número de células em um recipiente permeável a gás simplifica o procedimentos necessário para expandir o número de células por redução da frequência de alimentação necessária para expandir as células.

[00612] Em uma modalidade, o meio celular no primeiro e/ou segundo

188 / 557 recipiente permeável a gás é não filtrado. O uso de meio celular não filtrado pode simplificar os procedimentos necessários para expandir o número de células. Em uma modalidade, o meio celular no primeiro e/ou segundo recipiente permeável a gás carece de beta-mercaptoetanol (BME).

[00613] Em uma modalidade, a duração do método compreende obter uma amostra de tecido tumoral a partir do mamífero; cultivar a amostra de tecido tumoral em um primeiro recipiente permeável a gás contendo meio celular no mesmo; obter TILs a partir da amostra de tecido tumoral; expandir o número de TILs em um segundo recipiente permeável a gás contendo meio celular no mesmo usando aAPCs por uma duração de cerca de 14 a cerca de 42 dias, por exemplo, cerca de 28 dias.

[00614] Em uma modalidade, TILs são expandidos em recipientes permeáveis a gás. Recipientes permeáveis a gás tem sido usados para expandir TILs usando PBMCs, que usam métodos, composições, e dispositivos conhecidos na técnica, incluindo os descritos em Publicação de Pedido de Patente US No. 2005/0106717 A1, cujas divulgações são incorporadas aqui por referência. Em uma modalidade, TILs são expandidos em bolsas permeáveis a gás. Em uma modalidade, TILs são expandidos usando um sistema de expansão celular que expande TILs em bolsas permeáveis a gás, tal como o sistema Xuri Cell Expansion W25 (GE Healthcare). Em uma modalidade, TILs são expandidos usando um sistema de expansão celular que expande TILs em bolsas permeáveis a gás, tal como o sistema biorreator WAVE, também conhecido como o Xuri Cell Expansion System W5 (GE Healthcare). Em uma modalidade, o sistema de expansão celular inclui uma bolsa de células permeável a gás com um volume selecionado do grupo consistindo em cerca de 100 mL, cerca de 200 mL, cerca de 300 mL, cerca de 400 mL, cerca de 500 mL, cerca de 600 mL, cerca de 700 mL, cerca de 800 mL, cerca de 900 mL, cerca de 1 L, cerca de 2 L, cerca de 3 L, cerca de 4 L, cerca de 5 L, cerca de 6 L, cerca de 7 L, cerca de 8

189 / 557 L, cerca de 9 L, e cerca de 10 L.

[00615] Em uma modalidade, TILs podem ser expandidos em frascos G-Rex (comercialmente disponíveis de Wilson Wolf Manufacturing). Tais modalidades deixam as populações celulares se expandir cerca de 5x105 células/cm2 a entre 10x106 e 30x106 células/cm2. Em uma modalidade isto é sem alimentação. Em uma modalidade, isto é sem alimentação desde que meio permaneça a uma altura de cerca de 10 cm no frasco G-Rex. Em uma modalidade isto é sem alimentação mas com a adição de uma ou mais citocinas. Em uma modalidade, a citocina pode ser adicionada como um bolus sem qualquer necessidade de misturar a citocina com o meio. Tais recipientes, dispositivos, e métodos são conhecidos na técnica e tem sido usados para expandir TILs, e incluem os descritos em Publicação de Pedido de Patente US No. US 2014/0377739A1, Publicação Internacional No. WO 2014/210036 A1, Publicação de Pedido de Patente US No. 2013/0115617 A1, Publicação Internacional No. WO 2013/188427 A1, Publicação de Pedido de Patente US No. US 2011/0136228 A1, Patente US No. US 8.809.050 B2, Publicação Internacional No. WO 2011/072088 A2, Publicação de Pedido de Patente US No. US 2016/0208216 A1, Publicação de Pedido de Patente US No. US 2012/0244133 A1, Publicação Internacional No. WO 2012/129201 A1, Publicação de Pedido de Patente US No. US 2013/0102075 A1, Patente US No. US 8,956,860 B2, Publicação Internacional No. WO 2013/173835 A1, Publicação de Pedido de Patente US No. US 2015/0175966 A1, cujas divulgações são incorporadas aqui por referência. Tais processos são também descritos em Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292. Engenharia Genética Opcional de TILs.

[00616] Em algumas modalidades, os TILs são opcionalmente geneticamente engenheirados para incluir funcionalidades adicionais, incluindo, mas não limitados a, um receptor de células T de alta afinidade (TCR), por exemplo, um TCR alvejado em um antígeno associado com tumor

190 / 557 tal como MAGE-1, HER2, ou NY-ESO-1, ou um receptor de antígeno quimérico (CAR) que se liga a uma molécula de superfície celular associada a um tumor (por exemplo, mesotelina) ou molécula de superfície celular restringida em linhagem (por exemplo, CD19). IV. Métodos para Tratar Pacientes

[00617] Métodos de tratamento começam com a coleção de TIL inicial e cultura de TILs. Tais métodos foram ambos descritos na técnica por, por exemplo, Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35(3):283-292, incorporado por referência aqui em sua totalidade. Modalidades dos métodos de tratamento são descritas em todas as seções abaixo, incluindo os Exemplos.

[00618] Os TILs expandidos produzidos de acordo com métodos descritos aqui, incluindo, por exemplo, como descrito em Etapas A até F acima ou de acordo com Etapas A até F acima (também como mostrado, por exemplo, em Figura 27) encontram uso particular nos tratamento de pacientes com câncer (por exemplo, como descrito em Goff, et al., J. Clinical Oncology, 2016, 34(20):2389-239, assim como o conteúdo suplementar; incorporado por referência aqui em sua totalidade. Em algumas modalidades, TILs foram cultivados a partir de depósitos resseccionados de melanoma metastático como previamente descrito (ver, Dudley, et al., J Imunother., 2003, 26:332-342; incorporado por referência aqui em sua totalidade). Tumor fresco pode ser dissecado sob condições estéreis. Uma amostra representativa pode ser coletada para análise patológica formal. Os fragmentos únicos de 2 mm3 a 3 mm3 podem ser usados. Em algumas modalidades, 5, 10, 15, 20, 25 ou 30 amostras por paciente são obtidas. Em algumas modalidades, 20, 25, ou 30 amostras por paciente são obtidas. Em algumas modalidades, 20, 22, 24, 26, ou 28 amostras por paciente são obtidas. Em algumas modalidades, 24 amostras por paciente são obtidas. Amostras podem ser colocadas em cavidades individuais de uma placa de 24 cavidades, mantidas em meio de crescimento com dose elevada de IL-2 (6.000 IU/mL), e monitoradas para

191 / 557 destruição de tumor e/ou proliferação de TIL. Qualquer tumor com células viáveis restantes após processamento pode ser enzimaticamente diferido em uma suspensão de célula única e crioconservado, como descrito aqui.

[00619] Em algumas modalidades, TIL cultivado com sucesso pode ser amostrado para análise do fenótipo (CD3, CD4, CD8, e CD56) e testado contra tumor autólogo quando disponível. TIL pode ser considerado reativo se co-cultura noturna de níveis de interferon-gama (IFN-γ) ˃ 200 pg/mL e duas vezes o fundo. (Goff, et al., J Imunother., 2010, 33:840-847; incorporado por referência aqui em sua totalidade). Em algumas modalidades, culturas com evidência de reatividade autóloga ou padrões de crescimento suficiente podem ser selecionadas para uma segunda expansão (por exemplo, uma segunda expansão como provido em de acordo com Etapa D de Figura 27), incluindo segundas expansões que são às vezes referidas como expansão rápida (REP). Em algumas modalidades, TILs expandidos com elevada reatividade autóloga (por exemplo, elevada proliferação durante uma segunda expansão), são selecionados para uma segunda expansão adicional. Em algumas modalidades, TILs com elevada reatividade autóloga (por exemplo, elevada proliferação durante segunda expansão como provido em Etapa D de Figura 27), são selecionados para uma segunda expansão adicional de acordo com Etapa D de Figura 27.

[00620] Em algumas modalidades, o paciente não é movimentado diretamente para a ACT (transferência de célula adotiva), por exemplo, Em algumas modalidades, após colheita do tumor e/ou uma primeira expansão, as células não são utilizadas imediatamente. Em tais modalidades, TILs podem ser crioconservados e descongelados 2 dias antes da administração a um paciente. Em tais modalidades, TILs podem ser crioconservados e descongelados 1 dia antes da administração a um paciente. Em algumas modalidades, os TILs podem ser crioconservados e descongelados imediatamente antes da administração a um paciente.

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[00621] Os fenótipos celulares de amostras crioconservadas de bolsa de infusão de TIL podem ser analisados por citometria de fluxo (por exemplo, FlowJo) para marcadores de superfície CD3, CD4, CD8, CCR7, e CD45RA (BD BioSciences), assim como por qualquer um dos métodos descritos aqui. As citocinas no soro foram medidas usando técnicas padrão de teste imunossorvente ligado a enzima. Um aumento de IFN-g no soro foi definido como ˃100 pg/mL e maior que 4 de 3 níveis de linha de base.

[00622] Em algumas modalidades, os TILs produzidos pelos métodos aqui providos, por exemplo os exemplificados em Figura 27, proporcionam uma melhora surpreendente na eficácia clínica dos TILs. Em algumas modalidades, os TILs produzidos pelos métodos aqui providos, por exemplo os exemplificados em Figura 27, exibem eficácia clínica aumentada como comparado com TILs produzidos por métodos diferentes dos descritos aqui, incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos exemplificados em Figura 27. Em algumas modalidades, os métodos diferentes dos descritos aqui incluem métodos referidos como processo 1C e/ou Geração 1 (Gen 1). Em algumas modalidades, a eficácia aumentada é medida por DCR, ORR, e/ou outras respostas clínicas. Em algumas modalidades, os TILs produzidos pelos métodos aqui providos, por exemplo, os exemplificados em Figura 27, exibem um tempo similar de resposta e perfil de segurança comparado com TILs produzidos por métodos diferentes dos descritos aqui, incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos exemplificados em Figura 27, por exemplo o processo de Gen 1.

[00623] Em algumas modalidades, IFN-gama (IFN-γ) é indicativo da eficácia do tratamento e/ou eficácia clínica aumentada. Em algumas modalidades, IFN-γ no sangue de indivíduos tratados com TILs é indicativo de TILs ativos. Em algumas modalidades, um teste de potência para produção de IFN-γ é empregado. A produção de IFN-γ é outra medição do potencial citotóxico. A produção de IFN-γ pode ser medida por determinação dos níveis

193 / 557 de IFN-γ de citocinas no sangue, soro, ou TILs ex vivo de um indivíduo tratado com TILs preparados pelos métodos da presente invenção, incluindo os como descrito, por exemplo, em Figura 27. Em algumas modalidades, um aumento em IFN-γ é indicativo de eficácia do tratamento em um paciente tratado com os TILs produzidos pelos métodos da presente invenção.

Em algumas modalidades, IFN-γ é aumentada uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes, ou cinco vezes ou mais como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, secreção de IFN-γ é aumentada uma vez como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, secreção de IFN-γ é aumentada duas vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, secreção de IFN-γ é aumentada três vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, secreção de IFN-γ é aumentada quatro vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, secreção de IFN-γ é aumentada cinco vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com

194 / 557 TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, IFN-γ é medido usando um kit Quantikine ELISA. Em algumas modalidades, IFN-γ é medido em TILs ex vivo de um indivíduo tratado com TILs preparados pelos métodos da presente invenção, incluindo os como descritos, por exemplo, em Figura 27. Em algumas modalidades, IFN-γ é medido em sangue de um indivíduo tratado com TILs preparados pelos métodos da presente invenção, incluindo os como descritos, por exemplo, em Figura 27. Em algumas modalidades, IFN-γ é medido em TILs de soro de um indivíduo tratado com TILs preparados pelos métodos da presente invenção, incluindo os como descritos, por exemplo, em Figura 27.

[00624] Em algumas modalidades, um maior IP-10 médio é indicativo de eficácia do tratamento e/ou eficácia clínica aumentada. Em algumas modalidades, maior IP-10 médio no sangue de indivíduos tratados com TILs é indicativo de TILs ativos. A produção de IP-10 pode ser medida por determinação dos níveis do IP-10 no sangue de um indivíduo tratado com TILs preparados pelos métodos da presente invenção, incluindo os como descritos, por exemplo, em Figura 27. Em algumas modalidades, maior IP-10 médio é indicativo de eficácia do tratamento em um paciente tratado com os TILs produzidos pelos métodos da presente invenção. Em algumas modalidades, maior IP-10 médio correlaciona com um aumento de uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes, ou cinco vezes ou mais como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, maior IP-10 médio correlaciona com um aumento de uma vez, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos

195 / 557 diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, maior IP-10 médio correlaciona com um aumento de duas vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, maior IP-10 médio correlaciona com um aumento de três vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, maior IP-10 médio correlaciona com um aumento de quatro vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, maior IP-10 médio correlaciona com um aumento de cinco vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, IP-10 é medido no sangue de um indivíduo tratado com TILs preparados pelos métodos da presente invenção, incluindo os como descritos, por exemplo, em Figura 27. Em algumas modalidades, IP-10 é medido em TILs soro de um indivíduo tratado com TILs preparados pelos métodos da presente invenção, incluindo os como descritos, por exemplo, em Figura 27.

[00625] Em algumas modalidades, maior MCP-1 médio é indicativo de eficácia do tratamento e/ou eficácia clínica aumentada. Em algumas modalidades, maior MCP-1 médio no sangue de indivíduos tratados com TILs é indicativo de TILs ativos. A produção de MCP-1 pode ser medida por determinação dos níveis do MCP-1 no sangue de um indivíduo tratado com

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TILs preparados pelos métodos da presente invenção, incluindo os como descritos, por exemplo, em Figura 27. Em algumas modalidades, maior MCP- 1 médio é indicativo de eficácia do tratamento em um paciente tratado com os TILs produzidos pelos métodos da presente invenção.

Em algumas modalidades, maior MCP-1 médio correlaciona com um aumento de uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes, ou cinco vezes ou mais como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, maior MCP-1 médio correlaciona com um aumento de uma vez, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, maior MCP-1 médio correlaciona com um aumento de duas vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, maior MCP-1 médio correlaciona com um aumento de três vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, maior MCP-1 médio correlaciona com um aumento de quatro vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, maior MCP-1 médio correlaciona com um aumento de cinco vezes, como comparado com um paciente não

197 / 557 tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, MCP-1 é medido no sangue de um indivíduo tratado com TILs preparados pelos métodos da presente invenção, incluindo os como descritos, por exemplo, em Figura 27. Em algumas modalidades, MCP-1 é medido em TILs de soro de indivíduo tratado com TILs preparado pelos métodos da presente invenção, incluindo os como descritos, por exemplo, em Figura 27.

[00626] Em algumas modalidades, os TILs preparados pelos métodos da presente invenção, incluindo os como descritos, por exemplo, em Figura 27, exibem policlonalidade aumentada como comparado com TILs produzidos por outros métodos, incluindo os não exemplificados em Figura 27, tal como, por exemplo, métodos referidos como métodos de processo 1C. Em algumas modalidades, policlonalidade melhorada de modo significante e/ou policlonalidade aumentada é indicativo de eficácia do tratamento e/ou eficácia clínica aumentada. Em algumas modalidades, policlonalidade refere- se à diversidade do repertório de células T. Em algumas modalidades, um aumento em policlonalidade pode ser indicativo de eficácia do tratamento com relação a administração dos TILs produzidos pelos métodos da presente invenção. Em algumas modalidades, policlonalidade é aumentada uma vez, duas vezes, dez vezes, 100 vezes, 500 vezes, ou 1000 vezes, como comparado com TILs preparados usando métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, policlonalidade é aumentada uma vez como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, policlonalidade é aumentada duas vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um

198 / 557 paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, policlonalidade é aumentada dez vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, policlonalidade é aumentada 100 vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, policlonalidade é aumentada 500 vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, policlonalidade é aumentada 1000 vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27.

[00627] Medições de eficácia podem incluir as medições da taxa de controle de doença (DCR), assim como taxa de resposta global (ORR), como conhecido na técnica, assim como descrito nos Exemplos aqui providos, incluindo Exemplo 28.

1. Métodos de tratamento de cânceres e outras doenças

[00628] As composições e métodos descritos aqui podem ser usados em um método para tratar doenças. Em uma modalidade, eles são para uso no tratamento de distúrbios hiperproliferativos. Eles também podem ser usados no tratamento de outros distúrbios como descrito aqui e nos seguintes parágrafos.

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[00629] Em algumas modalidades, o distúrbio hiperproliferativo é câncer. Em algumas modalidades, o distúrbio hiperproliferativo é um câncer de tumor sólido. Em algumas modalidades, o câncer de tumor sólido é selecionado a partir do grupo consistindo em melanoma, câncer ovariano, câncer cervical, câncer de pulmão não de célula pequena (NSCLC), câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer causado por vírus de papiloma humano, câncer de cabeça e pescoço (incluindo carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço (HNSCC)), câncer renal, e carcinoma de célula renal. Em algumas modalidades, o distúrbio hiperproliferativo é uma malignidade hematológica. Em algumas modalidades, o câncer de tumor sólido é selecionado a partir do grupo consistindo em leucemia linfocítica crônica, leucemia linfoblástica aguda, linfoma difuso de grandes células B, linfoma não de Hodgkin, linfoma de Hodgkin, linfoma folicular e linfoma de células do manto.

[00630] Em uma modalidade, a invenção inclui um método de tratar um câncer com uma população de TILs, em que um paciente é pré-tratado com quimioterapia não mieloablativa antes de uma infusão de TILs de acordo com a presente descrição. Em uma modalidade, a quimioterapia não mieloablativa é ciclofosfamida 60 mg/kg/d durante 2 dias (dias 27 e 26 antes de infusão de TIL) e fludarabina 25 mg/m2/d durante 5 dias (dias 27 a 23 antes de infusão de TIL). Em uma modalidade, após quimioterapia não mieloablativa e infusão de TIL (em dia 0) de acordo com a presente descrição, o paciente recebe uma infusão intravenosa de IL-2 intravenosamente a

720.000 IU/kg a cada 8 horas para tolerância fisiológica.

[00631] Eficácia dos compostos e combinações de compostos descritos aqui no tratamento, prevenção e/ou controle das doenças ou distúrbios indicados pode ser testada usando vários modelos conhecidos na técnica, que provêem guia para o tratamento de doença humana. Por exemplo, modelos para determinar a eficácia de tratamentos para câncer ovariano são descritos,

200 / 557 por exemplo, em Mullany, et al., Endocrinology 2012, 153, 1585-92; e Fong, et al., J. Ovarian Res. 2009, 2, 12. Modelos para determinar eficácia de tratamentos para câncer pancreático são descritos em Herreros-Villanueva, et al., World J. Gastroenterol. 2012, 18, 1286-1294. Modelos para determinar eficácia de tratamentos para câncer de mama são descritos, por exemplo, em Fantozzi, Breast Cancer Res. 2006, 8, 212. Modelos para determinar eficácia de tratamentos para melanoma são descritos, por exemplo, em Damsky, et al., Pigment Cell & Melanoma Res. 2010, 23, 853–859. Modelos para determinar eficácia de tratamentos para câncer de pulmão são descritos, por exemplo, em Meuwissen, et al., Genes & Development, 2005, 19, 643-664. Modelos para determinar eficácia de tratamentos para câncer de pulmão são descritos, por exemplo, em Kim, Clin. Exp. Otorhinolaryngol. 2009, 2, 55-60; e Sano, Head Neck Oncol. 2009, 1, 32.

[00632] Em algumas modalidades, IFN-gama (IFN-γ) é indicativo de eficácia do tratamento para o tratamento de distúrbio hiperproliferativos. Em algumas modalidades, IFN-γ no sangue de indivíduos tratados com TILs é indicativo de TILs ativos. Em algumas modalidades, um teste de potência para produção de IFN-γ é empregado. Produção de IFN-γ é outra medição do potencial citotóxico. Produção de IFN-γ pode ser medida por determinação dos níveis de IFN-γ de citocinas no sangue de um indivíduo tratado com TILs preparados pelos métodos da presente invenção, incluindo os como descritos, por exemplo, em Figura 27. Em algumas modalidades, os TILs obtidos pelo presente método provêem IFN-γ aumentado no sangue de indivíduos tratados com os TILs do presente método como comparado com indivíduos tratados com TILs preparados usando métodos referidos como processo 1C, como exemplificado em Figura 83. Em algumas modalidades, um aumento em IFN- γ é indicativo de eficácia do tratamento em um paciente tratado com os TILs produzidos pelos métodos da presente invenção. Em algumas modalidades, IFN-γ é aumentado uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes, ou cinco

201 / 557 vezes ou mais como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, secreção de IFN-γ é aumentada uma vez como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, secreção de IFN-γ é aumentada duas vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, secreção de IFN-γ é aumentada três vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, secreção de IFN-γ é aumentada quatro vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, secreção de IFN-γ é aumentada cinco vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, IFN-γ é medido usando um kit Quantikine ELISA.

Em algumas modalidades, IFN-γ é medido usando um kit Quantikine ELISA.

Em algumas modalidades, IFN-γ é medido em TILs ex vivo de um paciente tratado com os TILs produzidos pelos métodos da presente invenção.

Em

202 / 557 algumas modalidades, IFN-γ é medida no sangue de um paciente tratado com os TILs produzidos pelos métodos da presente invenção. Em algumas modalidades, IFN-γ é medido no soro de um paciente tratado com os TILs produzidos pelos métodos da presente invenção.

[00633] Em algumas modalidades, maior IP-10 médio é indicativo de eficácia do tratamento e/ou eficácia clínica aumentada para o tratamento de distúrbio hiperproliferativo. Em algumas modalidades, maior IP-10 médio no sangue de indivíduos tratados com TILs é indicativo de TILs ativos. Em algumas modalidades, os TILs obtidos pelo presente método provêem um maior IP-10 médio no sangue de indivíduos tratados com os TILs do presente método como comparado com indivíduos tratados com TILs preparados usando métodos referidos como processo 1C, como exemplificado em Figura

83. Produção de IP-10 pode ser medida por determinação dos níveis do IP-10 no sangue de um indivíduo tratado com TILs preparados pelos métodos da presente invenção, incluindo os como descritos, por exemplo, em Figura 27. Em algumas modalidades, maior IP-10 médio é indicativo de eficácia do tratamento em um paciente tratado com os TILs produzidos pelos métodos da presente invenção. Em algumas modalidades, maior IP-10 médio correlaciona com um aumento de uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes, ou cinco vezes ou mais como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, maior IP-10 médio correlaciona com um aumento de uma vez, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, maior IP-10 médio correlaciona com um aumento de duas vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como

203 / 557 comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, maior IP-10 médio correlaciona com um aumento de três vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, maior IP-10 médio correlaciona com um aumento de quatro vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, maior IP-10 médio correlaciona com um aumento de cinco vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27.

[00634] Em algumas modalidades, maior MCP-1 médio é indicativo de eficácia do tratamento e/ou eficácia clínica aumentada para tratamento de distúrbio hiperproliferativo. Em algumas modalidades, maior MCP-1 médio no sangue de indivíduos tratados com TILs é indicativo de TILs ativos. Em algumas modalidades, os TILs obtidos pelo presente método provêem maior MCP-1 médio no sangue de indivíduos tratados com os TILs do presente método como comparado com indivíduos tratados com TILs preparados usando métodos referidos como processo 1C, como exemplificado em Figura

83. Produção de MCP-1 pode ser medida por determinação dos níveis do MCP-1 no sangue de um indivíduo tratado com TILs preparados pelos métodos da presente invenção, incluindo os como descritos, por exemplo, em Figura 27. Em algumas modalidades, maior MCP-1 médio é indicativo de eficácia do tratamento em um paciente tratado com os TILs produzidos pelos

204 / 557 métodos da presente invenção.

Em algumas modalidades, maior MCP-1 médio correlaciona com um aumento de uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes, ou cinco vezes ou mais como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, maior MCP-1 médio correlaciona com um aumento de uma vez, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, maior MCP-1 médio correlaciona com um aumento de duas vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, maior MCP-1 médio correlaciona com um aumento de três vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, maior MCP-1 médio correlaciona com um aumento de quatro vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, maior MCP-1 médio correlaciona com um aumento de cinco vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27.

205 / 557

[00635] Em algumas modalidades, os TILs preparados pelos métodos da presente invenção, incluindo os como descritos, por exemplo, em Figura 27, exibem policlonalidade aumentada como comparado com TILs produzidos por outros métodos, incluindo os não exemplificados em Figura 27, tal como por exemplo, métodos referidos como processo 1C métodos. Em algumas modalidades, policlonalidade melhorada de modo significante e/ou policlonalidade aumentada é indicativo de eficácia do tratamento e/ou eficácia clínica aumentada para tratamento de câncer. Em algumas modalidades, policlonalidade refere-se à diversidade do repertório de células T. Em algumas modalidades, um aumento em policlonalidade pode ser indicativo de eficácia do tratamento com relação a administração dos TILs produzidos pelos métodos da presente invenção. Em algumas modalidades, policlonalidade é aumentada uma vez, duas vezes, dez vezes, 100 vezes, 500 vezes, ou 1000 vezes, como comparado com TILs preparados usando métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, policlonalidade é aumentada uma vez como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, policlonalidade é aumentada duas vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, policlonalidade é aumentada dez vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, policlonalidade é aumentada 100 vezes, como

206 / 557 comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, policlonalidade é aumentada 500 vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27. Em algumas modalidades, policlonalidade é aumentada 1000 vezes, como comparado com um paciente não tratado e/ou como comparado com um paciente tratado com TILs preparados usando outros métodos diferentes dos providos aqui incluindo, por exemplo, métodos diferentes dos corporificados em Figura 27.

2. Métodos de co-administração

[00636] Em algumas modalidades, os TILs produzidos como descrito aqui, incluindo, por exemplo, TILs derivados de um método descrito em Etapas A até F de Figura 27, podem ser administrados em combinação com um ou mais reguladores dos pontos de verificação (checkpoints) imunes, tal como os anticorpos descritos abaixo. Por exemplo, anticorpos que alvejam PD-1 e que podem ser co-administrados com os TILs da presente invenção incluem, por exemplo, mas não são limitados a nivolumab (BMS-936558, Bristol-Myers Squibb; Opdivo®), pembrolizumab (lambrolizumab, MK03475 ou MK-3475, Merck; Keytruda®), anticorpo anti-PD-1 humanizado JS001 (ShangHai JunShi), anticorpo monoclonal anti-PD-1 TSR-042 (Tesaro, Inc.), Pidilizumab (anti-PD-1 mAb CT-011, Medivation), anticorpo anti-PD-1 monoclonal BGB-A317 (BeiGene), e/ou anticorpo anti-PD-1 SHR-1210 (ShangHai HengRui), anticorpo monoclonal humano REGN2810 (Regeneron), anticorpo monoclonal humano MDX-1106 (Bristol-Myers Squibb), e/ou anticorpo IgG4 anti-PD-1 humanizado PDR001 (Novartis). Em algumas modalidades, o anticorpo PD-1 é de clone: RMP1-14 (IgG de rato) -

207 / 557 BioXcell cat# BP0146. Outros anticorpos apropriados, apropriados para uso em métodos de co-administração com TILs produzidos de acordo com Etapas A até F como descrito aqui são anticorpos anti-PD-1 divulgados em Patente US No. 8.008.449, aqui incorporada por referência. Em algumas modalidades, o anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo se liga eespecíficoamente a PD-L1 e inibe sua interação com PD-1, assim aumentando a atividade imune. Quaisquer anticorpos conhecidos na arte que ligam a PD-L1 e rompem a interação entre PD-1 e PD-L1, e estimulam um resposta imune anti-tumor, são apropriados para uso em métodos de co- administração com TILs produzidos de acordo com Etapas A até F como descrito aqui. Por exemplo, anticorpos que alvejam PD-L1 e estão em experiências clínicas, incluem BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb) e MPDL3280A (Genentech). Outros anticorpos apropriados que alvejam PD-Ll são divulgados em Patente US No. 7.943.743, aqui incorporada por referência. Deve ser entendido por um versado na arte que quaisquer anticorpos que ligam a PD-1 ou PD-L1, rompe a interação PD-1/PD-L1, e estimulam uma resposta imune anti-tumor, são apropriados para uso em métodos de co-administração com TILs produzidos de acordo com Etapas A até F, como descrito aqui. Em algumas modalidades, o indivíduo administrado com a combinação de TILs produzidos de acordo com Etapas A até F é co administrado com um anticorpo anti-PD-1 quando o paciente tem um tipo de câncer que é refratária à administração do anticorpo anti-PD-1 sozinho. Em algumas modalidades, o paciente é administrado com TILs em combinação e anti-PD-1 quando o paciente tem melanoma refratário. Em algumas modalidades, o paciente é administrado com TILs em combinação com e anti-PD-1 quando o paciente tem um carcinoma de pulmão não de célula pequena (NSCLC).

3. Pré-condicionamento de pacientes com linfodepleção opcional

[00637] Em uma modalidade, a invenção inclui um método de tratar

208 / 557 um câncer com uma população de TILs, em que um paciente é pré-tratado com quimioterapia não mieloablativa antes de uma infusão de TILs de acordo com a presente descrição. Em uma modalidade, a invenção inclui uma população de TILs para uso no tratamento de câncer em um paciente que foi pré-tratado com quimioterapia não mieloablativa. Em uma modalidade, uma população de TILs é para administração por infusão. Em uma modalidade, a quimioterapia não mieloablativa é ciclofosfamida 60 mg/kg/d durante 2 dias (dias 27 e 26 antes de infusão de TIL) e fludarabina 25 mg/m2/d durante 5 dias (dias 27 a 23 antes de infusão de TIL). Em uma modalidade, após quimioterapia não mieloablativa e infusão de TIL (no dia 0) de acordo com a presente descrição, o paciente recebe uma infusão intravenosa de IL-2 (aldesleucina, comercialmente disponível como PROLEUKIN) intravenosamente a 720.000 IU/kg a cada 8 horas para tolerância fisiológica. Em algumas modalidades, uma população de TILs é para uso no tratamento de câncer em combinação com IL-2, em que IL-2 é administrada após uma população de TILs.

[00638] Descobertas experimentais indicam que a linfodepleção antes da transferência adotiva de linfócitos T específicos de um tumor desempenha um papel fundamental no aumento da eficácia do tratamento, eliminando células T reguladoras e elementos concorrentes do sistema imune ('sumidouros de citocinas'). Por conseguinte, algumas modalidades da invenção utilizam uma etapa de linfodepleção (às vezes também referida como “condicionamento imunossupressor”) no paciente antes da introdução dos TILs da invenção.

[00639] Em geral, linfodepleção é obtida usando administração de fludarabina ou ciclofosfamida (a forma ativa sendo referida como mafosfamida) e combinações dos mesmos. Tais métodos são descritos em Gassner, et al., Cancer Imunol. Imunother. 2011, 60, 75–85, Muranski, et al., Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668–681, Dudley, et al., J. Clin. Oncol.

209 / 557 2008, 26, 5233-5239, e Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346–2357, todos sendo incorporados por referência aqui em suas totalidades.

[00640] Em algumas modalidades, a fludarabina é administrada a uma concentração de 0,5 μg/mL -10 μg/mL fludarabina. Em algumas modalidades, a fludarabina é administrada a uma concentração de 1 μg/mL fludarabina. Em algumas modalidades, o tratamento com fludarabina é administrado durante 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, ou 7 dias ou mais. Em algumas modalidades, a fludarabina é administrada uma dosagem de 10 mg/kg/dia, 15 mg/kg/dia, 20 mg/kg/dia¸ 25 mg/kg/dia, 30 mg/kg/dia, 35 mg/kg/dia, 40 mg/kg/dia, ou 45 mg/kg/dia. Em algumas modalidades, a fludarabina tratamento é administrada durante 2-7 dias a 35 mg/kg/dia. Em algumas modalidades, o tratamento com fludarabina é administrado durante 4-5 dias a 35 mg/kg/dia. Em algumas modalidades, o tratamento com fludarabina é administrado durante 4-5 dias a 25 mg/kg/dia.

[00641] Em algumas modalidades, a mafosfamida, a forma ativa de ciclofosfamida, é obtido a uma concentração de 0,5 μg/mL -10 μg/mL por administração de ciclofosfamida. Em algumas modalidades, mafosfamida, a forma ativa de ciclofosfamida, é obtida a uma concentração de 1 μg/mL por administração de ciclofosfamida. Em algumas modalidades, o tratamento com ciclofosfamida é administrado durante 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, ou 7 dias ou mais. Em algumas modalidades, a ciclofosfamida é administrada a uma dosagem de 100 mg/m2/dia, 150 mg/m2/dia, 175 mg/m2/dia¸ 200 mg/m2/dia, 225 mg/m2/dia, 250 mg/m2/dia, 275 mg/m2/dia, ou 300 mg/m2/dia. Em algumas modalidades, a ciclofosfamida é administrada intravenosamente (isto é, i.v.) Em algumas modalidades, o tratamento com ciclofosfamida é administrado durante 2-7 dias a 35 mg/kg/dia. Em algumas modalidades, o tratamento com ciclofosfamida é administrado durante 4-5 dias a 250 mg/m2/dia i.v. Em algumas modalidades, o tratamento com ciclofosfamida é administrado

210 / 557 durante 4 dias a 250 mg/m2/dia i.v.

[00642] Em algumas modalidades, linfodepleção é realizada por administração da fludarabina e da ciclofosfamida juntas a um paciente. Em algumas modalidades, fludarabina é administrada a 25 mg/m2/dia i.v. e ciclofosfamida é administrada a 250 mg/m2/dia i.v. durante 4 dias.

[00643] Em uma modalidade, a linfodepleção é realizada por administração de ciclofosfamida a uma dose de 60 mg/m2/dia durante dois dias seguido por administração de fludarabina a uma dose de 25 mg/m2/dia durante cinco dias.

4. Regimes de IL-2

[00644] Em uma modalidade, o regime de IL-2 compreende um regime de IL-2 em dose elevada, em que o regime de IL-2 em dose elevada compreende aldesleucina, ou um biossimilar ou variante do mesmo, administrada intravenosamente começando no dia após administração de uma porção terapeuticamente eficaz da população terapêutica de TILs, em que a aldesleucina ou um biossimilar ou variante do mesmo é administrado a uma dose de 0,037 mg/kg ou 0,044 mg/kg IU/kg (massa corporal do paciente) usando infusão intravenosa de 15 minutos de bolus a cada oito horas até tolerância, por um máximo de 14 doses. Após 9 dias de repouso, este esquema pode ser repetido para mais 14 doses, para um máximo de 28 doses no total.

[00645] Em uma modalidade, o regime de IL-2 compreende um regime de IL-2 decrescendo. Regimes de IL-2 decrescendo foram descritos em O’Day, et al., J. Clin. Oncol. 1999, 17, 2752-61 e Eton, et al., Cancer 2000, 88, 1703-9, cujas divulgações são incorporadas aqui por referência. Em uma modalidade, um regime de IL-2 decrescendo compreende 18 × 106 IU/m2 administrado intravenosamente durante 6 horas, seguido por 18 × 106 IU/m2 administrado intravenosamente durante 12 horas, seguido por 18 × 106 IU/m2 administrado intravenosamente durante 24 horas, seguido por 4,5 × 106 IU/m2 administrado intravenosamente durante 72 horas. Este ciclo de tratamento

211 / 557 pode ser repetido a cada 28 dias para um máximo de quatro ciclos. Em uma modalidade, um regime de IL-2 decrescendo compreende 18.000.000 IU/m2 em dia 1, 9.000.000 IU/m2 em dia 2, e 4.500.000 IU/m2 em dias 3 e 4.

[00646] Em uma modalidade, o regime de IL-2 compreende administração de IL-2 peguilada a cada 1, 2, 4, 6, 7, 14 ou 21 dias a uma dose de 0,10 mg/dia a 50 mg/dia.

5. Transferência de células adotivas

[00647] Transferência de célula adotivas (ACT) é uma forma muito eficaz de imunoterapia e envolve a transferência de células imunes com atividade antitumoral em pacientes com câncer. ACT é uma abordagem de tratamento que envolve a identificação, in vitro, de linfócitos com atividade antitumoral, a expansão in vitro destas células em grandes números e sua infusão no hospedeiro portando câncer. Linfócitos usados para transferência adotiva podem ser derivados do estroma de tumores resseccionados (linfócitos infiltrando os tumores ou TILs). TILs para ACT podem ser preparados como descrito aqui. Em algumas modalidades, os TILs são preparados, por exemplo, de acordo com um método como descrito em Figura

27. Eles também podem ser derivados ou de sangue se eles são geneticamente engenheirados para expressar receptores antitumorais de células T(TCRs) ou de receptores de antígenos quiméricos (CARs), enriquecidos com culturas misturadas linfócitos células de tumor (MLTCs), ou clonados usando células apresentadoras de antígenos autólogas e peptídeos derivados do tumor. ACT em que os linfócitos se originam do hospedeiro portando câncer a serem infundidos é chamado ACT autólogo. Publicação US No. 2011/0052530 refere-se a um método para realizar a terapia de célula adotiva para promover a regressão do câncer, primariamente para tratamento de pacientes sofrendo de melanoma metastático, que é incorporada por referência em sua totalidade para estes métodos. Em algumas modalidades, TILs podem ser administrados como descrito aqui. Em algumas modalidades, TILs podem ser administrados

212 / 557 em um dose única. Tal administração pode ser por injeção, por exemplo, injeção intravenosa. Em algumas modalidades, TILs e/ou citotóxicas linfócitos podem ser administrados em múltiplas doses. Dosagem pode ser uma vez, duas vezes três vezes, quatro vezes, cinco vezes, seis vezes, ou mais do que seis vezes por ano. Dosagem pode ser uma vez por mês, uma vez a cada duas semanas, uma vez por semana, ou uma vez a cada dois dias. Administração de TILs e/ou linfócitos citotóxicos pode continuar na medida do necessário.

6. Modalidades de tratamento exemplares

[00648] Em algumas modalidades, a presente descrição provê um método de tratar um câncer com uma população de linfócitos infiltrando os tumores (TILs) compreendendo as etapas de (a) obter uma primeira população de TILs a partir de um tumor resseccionado de um paciente; (b) realizar uma expansão inicial da primeira população de TILs em um primeiro meio de cultura de células para obter uma segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 5 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que o primeiro meio de cultura de células compreende IL-2; (c) realizar uma expansão rápida da segunda população de TILs usando uma população de células apresentadoras de antígenos artificiais mielóides (aAPCs mielóides) em um segundo meio de cultura de células para obter uma terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a segunda população de TILs após 7 dias a partir do início da expansão rápida; e em que o segundo meio de cultura de células compreende IL-2 e OKT-3; (d) administrar uma porção terapeuticamente eficaz da terceira população de TILs a um paciente com o câncer. Em algumas modalidades, a presente descrição compreende uma população de linfócitos infiltrando os tumores (TILs) para uso no tratamento de câncer, em que uma população de TILs é obtenível por um método compreendendo as etapas de (b) realizar uma expansão inicial de uma

213 / 557 primeira população de TILs obtida a partir de um tumor resseccionado de um paciente em um primeiro meio de cultura de células para obter uma segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 5 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que o primeiro meio de cultura de células compreende IL-2; (c) realizar uma expansão rápida da segunda população de TILs usando uma população de células apresentadoras de antígenos artificiais mielóides (aAPCs mielóides) em um segundo meio de cultura de células para obter uma terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a segunda população de TILs após 7 dias a partir do início da expansão rápida; e em que o segundo meio de cultura de células compreende IL-2 e OKT-3; (d) administrar uma porção terapeuticamente eficaz da terceira população de TILs a um paciente com o câncer.

Em algumas modalidades, o método compreende uma primeira etapa (a) de obter a primeira população de TILs a partir de um tumor resseccionado de um paciente.

Em algumas modalidades, o IL-2 está presente em uma concentração inicial de cerca de 3000 IU/mL e anticorpo OKT-3 está presente em uma concentração inicial de cerca de 30 ng/mL no segundo meio de cultura de células.

Em algumas modalidades, primeira expansão é realizado por um período não maior que 14 dias.

Em algumas modalidades, a primeira expansão é realizada usando um recipiente permeável a gás.

Em algumas modalidades, a segunda expansão é realizada usando um recipiente permeável a gás.

Em algumas modalidades, a razão da segunda população de TILs para uma população de aAPCs na expansão rápida está entre 1 a 80 e 1 a 400. Em algumas modalidades, a razão da segunda população de TILs para uma população de aAPCs na expansão rápida é cerca de 1 a 300. Em algumas modalidades, o câncer para tratamento é selecionado a partir do grupo consistindo em melanoma, câncer ovariano, câncer cervical, câncer de pulmão não de célula pequena (NSCLC), câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer

214 / 557 de mama, câncer causado por vírus de papiloma humano, câncer de cabeça e pescoço (incluindo carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço (HNSCC)), câncer renal, e carcinoma de célula renal. Em algumas modalidades, o câncer para tratamento é selecionado a partir do grupo consistindo em melanoma, câncer ovariano, e câncer cervical. Em algumas modalidades, o câncer para tratamento é melanoma. Em algumas modalidades, o câncer para tratamento é câncer ovariano. Em algumas modalidades, o câncer para tratamento é câncer cervical. Em algumas modalidades, o método de tratar câncer compreende adicionalmente a etapa de tratar o paciente com um regime de linfodepleção não mieloablativo antes de administrar a terceira população de TILs ao paciente. Em algumas modalidades, o regime de linfodepleção não mieloablativo compreende as etapas de administração de ciclofosfamida a uma dose de 60 mg/m2/dia durante dois dias seguido por administração de fludarabina a uma dose de 25 mg/m2/dia durante cinco dias. Em algumas modalidades, o regime de IL-2 em dose elevada compreende 600.000 ou 720.000 IU/kg de aldesleucina, ou um biossimilar ou variante da mesma, administrados como uma infusão intravenosa de bolus de 15 minutos a cada oito horas até tolerância. V. Modalidades Exemplares

[00649] Em algumas modalidades, a presente invenção provê um método para tratar um indivíduo com câncer, o método compreendendo administrar linfócitos infiltrando os tumores expandidos (TILs) compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs a partir de um tumor resseccionado de um indivíduo por processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em fragmentos múltiplos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor em um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2 para

215 / 557 produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 11 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura do sistema; (d) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 11 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; (e) coletar a população terapêutica de TILs obtida a partir da etapa (d), em que a transição de etapa (d) para etapa (e) ocorre sem abertura do sistema; e (f) transferir a população de TILs coletada da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (e) a (f) ocorre sem abertura do sistema; (g) crioconservar a bolsa de infusão compreendendo a população de TILs coletada da etapa (f) usando um processo de crioconservação; e (h) administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz da terceira população de TILs da bolsa de infusão em etapa (g) para o paciente.

[00650] Em alguma modalidade, o processo de crioconservação compreende crioconservação em um meio compreendendo DMSO. Em

216 / 557 algumas modalidades, o meio de crioconservação compreende 7% a 10% DMSO. Em algumas modalidades, o meio de crioconservação é CS10.

[00651] Em algumas modalidades, a população terapêutica de TILs coletados em etapa (e) compreende TILs suficientes para administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz dos TILs em etapa (h).

[00652] Em algumas modalidades, o número de TILs suficientes para administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz em etapa (h) é de cerca de 2,3×1010 a cerca de 13,7×1010.

[00653] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos (APCs) são PBMCs.

[00654] Em algumas modalidades, as PBMCs são adicionadas à cultura celular em qualquer um de dias 9 até 11 em etapa (d).

[00655] Em algumas modalidades, antes de administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz de células de TIL em etapa (h), um regime de linfodepleção não mieloablativo foi administrado ao paciente.

[00656] Em algumas modalidades, o regime de linfodepleção não mieloablativo compreende as etapas de administração de ciclofosfamida a uma dose de 60 mg/m2/dia durante dois dias seguido por administração de fludarabina a uma dose de 25 mg/m2/dia durante cinco dias.

[00657] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a etapa de tratar o paciente com um regime de IL-2 em dose elevada começando no dia após administração das células de TIL ao paciente em etapa (h).

[00658] Em algumas modalidades, o regime de IL-2 em dose elevada compreende 600.000 ou 720.000 IU/kg administrados como uma infusão intravenosa de bolus de 15 minutos a cada oito horas até tolerância.

[00659] Em algumas modalidades, a terceira população de TILs em etapa (d) proporciona eficácia aumentada, aumentado interferon-gama (IFN- γ) produção, policlonalidade aumentada, IP-10 médio aumentado, e/ou MCP-

217 / 557 1 médio aumentado quando administrados a um indivíduo. Em algumas modalidades, o aumento em IFN-γ, IP-10 médio aumentado, e/ou MCP-1 médio aumentado é medida no sangue do indivíduo tratados com os TILs.

[00660] Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir do grupo consistindo em melanoma, câncer ovariano, câncer cervical, câncer de pulmão não de célula pequena (NSCLC), câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer causado por vírus de papiloma humano, câncer de cabeça e pescoço (incluindo carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço (HNSCC)), câncer renal, e carcinoma de célula renal. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir do grupo consistindo em melanoma, HNSCC, câncer cervical, e NSCLC. Em algumas modalidades, o câncer é melanoma. Em algumas modalidades, o câncer é HNSCC. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer cervical. Em algumas modalidades, o câncer é NSCLC.

[00661] Em uma modalidade, a invenção provê um método para expandir linfócitos infiltrando os tumores (TILs).

[00662] A presente invenção provê um método para expandir linfócitos infiltrando os tumores (TILs) compreendendo: (a) obter uma amostra de tumor de um paciente, em que referida amostra de tumor compreende uma primeira população de TILs; (b) processar referida amostra de tumor em fragmentos múltiplos de tumor; (c) adicionar referidos fragmentos de tumor em um recipiente fechado; (d) realizar uma expansão inicial de referida primeira população de TILs em um primeiro meio de cultura de células para obter uma segunda população de TILs, em que referido primeiro meio de cultura de células compreende IL-2, em que referida expansão inicial é realizada em referido recipiente fechado provendo pelo menos 100 cm2 de área de superfície permeável a gás, em que referida expansão inicial é realizada dentro de um primeiro período de cerca de 7-14 dias para obter uma segunda população de TILs, em que referida segunda população de TILs é

218 / 557 pelo menos 50 vezes maior em número do que referida primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; (e) expandir referida segunda população de TILs em um segundo meio de cultura de células, em que referido segundo meio de cultura de células compreende IL-2, OKT-3, e células mononucleares de sangue periférico (PBMCs, também conhecidas como células mononucleares (MNCs)), em que referida expansão é realizada dentro de um segundo período de cerca de 7-14 dias para obter uma terceira população de TILs, em que referida terceira população de TILs exibe uma subpopulação aumentada de células T efetoras e/ou células T de memória central com relação à segunda população de TILs, em que referida expansão é realizada em um recipiente fechado provendo pelo menos 500 cm2 de área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (d) para etapa (e) ocorre sem abertura do sistema; (f) coletar referida terceira população de TILs obtida a partir da etapa (e), em que a transição de etapa (e) para etapa (f) ocorre sem abertura do sistema; e (g) transferir referida população de TILs coletada da etapa (f) para uma bolsa de infusão, em que referida transferência da etapa (f) a (g) ocorre sem abertura do sistema. Em algumas modalidades, o método é um método in vitro ou um ex vivo.

[00663] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a coleta em etapa (f), via um sistema de processamento de células, tal como o sistema LOVO fabricado por Fresenius Kabi. O termo “sistema de processamento de células LOVO” também se refere a qualquer instrumento ou dispositivo fabricado por qualquer provedor que possa bombear uma solução compreendendo células através de uma membrana ou filtro tal como um membrana giratória ou filtro giratório em um ambiente estéril e/ou sistema fechado, permitindo o fluxo contínuo e processamento das células para remover sobrenadante ou meios de cultura celular sem granulação. Em alguns casos, o sistema de processamento de células pode

219 / 557 realizar separação de células, lavagem, troca de fluidos, concentração, e/ou outras etapas de processamento de células em um sistema fechado estéril.

[00664] Em algumas modalidades, o recipiente fechado é selecionado a partir do grupo consistindo em um recipiente G e um Xuri cellbag.

[00665] Em algumas modalidades, a bolsa de infusão em etapa (g) é uma bolsa de infusão contendo HypoThermosol.

[00666] Em algumas modalidades, o primeiro período em etapa (d) e referido segundo período em etapa (e) são cada individualmente realizados dentro de um período de 10 dias, 11 dias, ou 12 dias.

[00667] Em algumas modalidades, o primeiro período em etapa (d) e referido segundo período em etapa (e) são cada individualmente realizados dentro de um período de 11 dias.

[00668] Em algumas modalidades, etapas (a) até (g) são realizadas dentro de um período de cerca de 25 dias a cerca de 30 dias.

[00669] Em algumas modalidades, etapas (a) até (g) são realizadas dentro de um período de cerca de 20 dias a cerca de 25 dias.

[00670] Em algumas modalidades, etapas (a) até (g) são realizadas dentro de um período de cerca de 20 dias a cerca de 22 dias.

[00671] Em algumas modalidades, etapas (a) até (g) são realizadas em 22 dias ou menos.

[00672] Em algumas modalidades, etapas (c) até (f) são realizadas em um recipiente único, em que realização das etapas (c) até (f) em um recipiente único resulta em um aumento em rendimento de TIL por tumor resseccionado como comparado com realização das etapas (c) até (f) em mais do que um recipiente.

[00673] Em algumas modalidades, as PBMCs são adicionadas aos TILs durante o segundo período em etapa (e) sem abertura do sistema.

[00674] Em algumas modalidades, as células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas a partir da referida terceira população de TILs

220 / 557 exibem uma ou mais características selecionadas a partir do grupo consistindo em expressão de CD27+, expressão de CD28+, telômeros mais longos, expressão aumentada de CD57, e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas a partir da referida segunda população de células.

[00675] Em algumas modalidades, as células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas a partir da referida terceira população de TILs exibem expressão aumentada de CD57 e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas a partir de referida segunda população de células.

[00676] Em algumas modalidades, o risco de contaminação microbiana é reduzido como comparado com um sistema aberto.

[00677] Em algumas modalidades, os TILs da etapa (g) são infundidos em um paciente.

[00678] A presente invenção também provê um método de tratar câncer em um paciente com uma população de linfócitos infiltrando os tumores (TILs) compreendendo as etapas de: (a) obter uma amostra de tumor de um paciente, em que referida amostra de tumor compreende uma primeira população de TILs; (b) processar referida amostra de tumor em fragmentos múltiplos de tumor; (c) adicionar referidos fragmentos de tumor em um recipiente fechado; (d) realizar uma expansão inicial de referida primeira população de TILs em um primeiro meio de cultura de células para obter uma segunda população de TILs, em que referido primeiro meio de cultura de células compreende IL-2, em que referida expansão inicial é realizada em referido recipiente fechado provendo pelo menos 100 cm2 de área de superfície permeável a gás, em que referida expansão inicial é realizada dentro de um primeiro período de cerca de 7-14 dias para obter uma segunda população de TILs, em que referida segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que referida primeira população de TILs, e em

221 / 557 que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; (e) expandir referida segunda população de TILs em um segundo meio de cultura de células, em que referido segundo meio de cultura de células compreende IL-2, OKT-3, e células mononucleares de sangue periférico (PBMCs), em que referida expansão é realizada dentro de um segundo período de cerca de 7-14 dias para obter uma terceira população de TILs, em que referida terceira população de TILs exibe uma subpopulação aumentada de células T efetoras e/ou células T de memória central com relação à segunda população de TILs, em que referida expansão é realizada em um recipiente fechado provendo pelo menos 500 cm2 de área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (d) para etapa (e) ocorre sem abertura do sistema; (f) coletar referida terceira população de TILs obtida a partir da etapa (e), em que a transição de etapa (e) para etapa (f) ocorre sem abertura do sistema; (g) transferir referida população de TILs coletada da etapa (f) para uma bolsa de infusão, em que referida transferência da etapa (f) a (g) ocorre sem abertura do sistema; e (h) administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de células de TILs da referida bolsa de infusão em etapa (g) para o referido paciente.

[00679] Em algumas modalidades, a presente invenção também compreende uma população de linfócitos infiltrando os tumores (TILs) para uso no tratamento de câncer, em que uma população de TILs é obtenível a partir de um método compreendendo as etapas de: (b) processar uma amostra de tumor obtido de um paciente em que referida amostra de tumor compreende uma primeira população de TILs em fragmentos múltiplos de tumor; (c) adicionar referidos fragmentos de tumor em um recipiente fechado; (d) realizar uma expansão inicial de referida primeira população de TILs em um primeiro meio de cultura de células para obter uma segunda população de TILs, em que referido primeiro meio de cultura de células compreende IL-2, em que referida expansão inicial é realizada em referido recipiente fechado

222 / 557 provendo pelo menos 100 cm2 de área de superfície permeável a gás, em que referida expansão inicial é realizada dentro de um primeiro período de cerca de 7-14 dias para obter uma segunda população de TILs, em que referida segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que referida primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; (e) expandir referida segunda população de TILs em um segundo meio de cultura de células, em que referido segundo meio de cultura de células compreende IL-2, OKT-3, e células mononucleares de sangue periférico (PBMCs), em que referida expansão é realizada dentro de um segundo período de cerca de 7-14 dias para obter uma terceira população de TILs, em que referida terceira população de TILs exibe uma subpopulação aumentada de células T efetoras e/ou células T de memória central com relação à segunda população de TILs, em que referida expansão é realizada em um recipiente fechado provendo pelo menos 500 cm2 de área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (d) para etapa (e) ocorre sem abertura do sistema; (f) coletar referida terceira população de TILs obtida a partir da etapa (e), em que a transição de etapa (e) para etapa (f) ocorre sem abertura do sistema; (g) transferir referida população de TILs coletada da etapa (f) para uma bolsa de infusão, em que referida transferência da etapa (f) a (g) ocorre sem abertura do sistema. Em algumas modalidades, o método compreende uma primeira etapa (a) de obter a amostra de tumor a partir um paciente, em que referida amostra de tumor compreende a primeira população de TILs. Em algumas modalidades, uma população de TILs é para administração da referida bolsa de infusão em etapa (g) em uma quantidade terapeuticamente eficaz.

[00680] Em algumas modalidades, antes de administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de células de TIL em etapa (h), um regime de linfodepleção não mieloablativo foi administrado ao referido paciente. Em algumas modalidades, uma população de TILs é para administração a um

223 / 557 paciente que tinha sofrido um regime de linfodepleção não mieloablativo.

[00681] Em algumas modalidades, o regime de linfodepleção não mieloablativo compreende as etapas de administração de ciclofosfamida a uma dose de 60 mg/m2/dia durante dois dias seguido por administração de fludarabina a uma dose de 25 mg/m2/dia durante cinco dias.

[00682] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a etapa de tratar referido paciente com um regime de IL-2 em dose elevada começando no dia após administração de referidas células TILs ao referido paciente em etapa (h). Em algumas modalidades, uma população de TILs é para administração antes de um regime de IL-2 em dose elevada. Em algumas modalidades, uma população de TILs é para administração um dia antes do início do regime de IL-2 em dose elevada.

[00683] Em algumas modalidades, o regime de IL-2 em dose elevada compreende 600.000 ou 720.000 IU/kg administrados como uma infusão intravenosa de bolus de 15 minutos a cada oito horas até tolerância.

[00684] Em algumas modalidades, as células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas a partir de referida terceira população de TILs exibem uma ou mais características selecionadas a partir do grupo consistindo em expressão de CD27+, expressão de CD28+, telômeros mais longos, expressão aumentada de CD57, e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas a partir de referida segunda população de células.

[00685] Em algumas modalidades, as células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas a partir de referida terceira população de TILs exibem expressão aumentada de CD57 e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas a partir de referida segunda população de células.

[00686] A presente invenção também provê um método para expandir linfócitos infiltrando os tumores (TILs) compreendendo as etapas de (a)

224 / 557 adicionar fragmentos processados de tumor em um sistema fechado; (b) realizar uma primeira expansão de referida primeira população de TILs em um primeiro meio de cultura de células para obter uma segunda população de TILs, em que referido primeiro meio de cultura de células compreende IL-2, em que referida primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície permeável a gás, em que referida primeira expansão é realizada dentro de um primeiro período de cerca de 3-14 dias para obter uma segunda população de TILs, em que referida segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que referida primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (a) para etapa (b) ocorre sem abertura do sistema; (c) expandir referida segunda população de TILs em um segundo meio de cultura de células, em que referido segundo meio de cultura de células compreende IL-2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos, em que referida expansão é realizada dentro de um segundo período de cerca de 7-14 dias para obter uma terceira população de TILs, em que referida terceira população de TILs exibe uma subpopulação aumentada de células T efetoras e/ou células T de memória central com relação à segunda população de TILs, em que referida expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura do sistema; (d) coletar referida terceira população de TILs obtida a partir da etapa (c), em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; e (e) transferir referida população de TILs coletada da etapa (d) para uma bolsa de infusão, em que referida transferência da etapa (d) a (e) ocorre sem abertura do sistema.

[00687] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a etapa de crioconservar a bolsa de infusão compreendendo a população de TILs coletada usando um processo de crioconservação. Em algumas modalidades, o processo de crioconservação é realizado usando uma

225 / 557 razão 1:1 de população de TILs coletada para meio CS10.

[00688] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos são células mononucleares de sangue periférico (PBMCs). Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos são células apresentadoras de antígenos artificiais.

[00689] Em algumas modalidades, a coleta em etapa (d) é realizada usando um sistema de processamento de células LOVO.

[00690] Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 50 fragmentos, em que cada fragmento tem um volume de cerca de 27 mm3. Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 30 a cerca de 60 fragmentos com um volume total de cerca de 1300 mm3 a cerca de 1500 mm3. Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 50 fragmentos com um volume total de cerca de 1350 mm3. Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 50 fragmentos com uma massa total de cerca de 1 grama a cerca de 1,5 gramas.

[00691] Em algumas modalidades, o segundo meio de cultura de células é provido em um recipiente selecionado a partir do grupo consistindo em um recipiente G e um Xuri cellbag.

[00692] Em algumas modalidades, a bolsa de infusão em etapa (e) é uma bolsa de infusão contendo HypoThermosol.

[00693] Em algumas modalidades, o primeiro período em etapa (b) e referido segundo período em etapa (c) são cada individualmente realizados dentro de um período de 10 dias, 11 dias, ou 12 dias. Em algumas modalidades, o primeiro período em etapa (b) e referido segundo período em etapa (c) são cada individualmente realizados dentro de um período de 11 dias.

[00694] Em algumas modalidades, as etapas (a) até (e) são realizadas dentro de um período de cerca de 25 dias a cerca de 30 dias. Em algumas

226 / 557 modalidades, as etapas (a) até (e) são realizadas dentro de um período de cerca de 20 dias a cerca de 25 dias. Em algumas modalidades, as etapas (a) até (e) são realizadas dentro de um período de cerca de 20 dias a cerca de 22 dias. Em algumas modalidades, as etapas (a) até (e) são realizadas em 22 dias ou menos. Em algumas modalidades, as etapas (a) até (e) e crioconservação são realizadas em 22 dias ou menos.

[00695] Em algumas modalidades, as etapas (b) até (e) são realizadas em um sistema fechado único, em que realização das etapas (b) até (e) em um recipiente único resulta em um aumento em rendimento de TILs por tumor resseccionado como comparado com realização das etapas (b) até (e) em mais do que um recipiente.

[00696] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos são adicionadas aos TILs durante o segundo período em etapa (c) sem abertura do sistema.

[00697] Em algumas modalidades, as células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas a partir de referida terceira população de TILs exibem uma ou mais características selecionadas a partir do grupo consistindo em expressão de CD27+, expressão de CD28+, telômeros mais longos, expressão aumentada de CD57, e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas a partir de referida segunda população de células.

[00698] Em algumas modalidades, as células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas a partir de referida terceira população de TILs exibem expressão aumentada de CD57 e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas a partir de referida segunda população de células.

[00699] Em algumas modalidades, o risco de contaminação microbiana é reduzido como comparado com um sistema aberto.

[00700] Em algumas modalidades, os TILs da etapa (e) são infundidos

227 / 557 em um paciente.

[00701] Em algumas modalidades, o recipiente fechado compreende um biorreator único. Em algumas modalidades, o recipiente fechado compreende um G-REX-10. Em algumas modalidades, o recipiente fechado compreende um G-REX-100. Em algumas modalidades, o recipiente fechado compreende um G-Rex 500. Em algumas modalidades, o recipiente fechado compreende uma bolsa permeável a gás de biorreator Xuri ou Wave.

[00702] Em algumas modalidades, a presente descrição provê um método para expandir linfócitos infiltrando os tumores (TILs) em uma população terapêutica de TILs compreendendo: (b) adicionar fragmentos de tumor em um sistema fechado em que os fragmentos do tumor compreendem uma primeira população de TILs; (c) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2 para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3- 14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura do sistema; (d) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7-14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs que compreende uma subpopulação aumentada de células T efetoras e/ou células T de memória central com relação à segunda população de TILs, em que a segunda

228 / 557 expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; (e) coletar a população terapêutica de TILs obtida a partir da etapa (d), em que a transição de etapa (d) para etapa (e) ocorre sem abertura do sistema; e (f) transferir a população de TILs coletada da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (e) a (f) ocorre sem abertura do sistema.

[00703] Em algumas modalidades, o método também compreende como uma primeira etapa: (a) obter uma primeira população de TILs a partir de um tumor resseccionado de um paciente por processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em fragmentos múltiplos de tumor.

[00704] Em uma modalidade, o método é um método in vitro ou um ex vivo.

[00705] Em algumas modalidades, a presente descrição provê um método para expandir linfócitos infiltrando os tumores (TILs) em uma população terapêutica de TILs compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs a partir de um tumor resseccionado de um paciente por processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em fragmentos múltiplos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor em um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2 para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3- 14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população

229 / 557 de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura do sistema; (d) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7-14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs que compreende uma subpopulação aumentada de células T efetoras e/ou células T de memória central com relação à segunda população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; (e) coletar a população terapêutica de TILs obtida a partir da etapa (d), em que a transição de etapa (d) para etapa (e) ocorre sem abertura do sistema; e (f) transferir a população de TILs coletada da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (e) a (f) ocorre sem abertura do sistema.

[00706] Em uma modalidade, o método é um método in vitro ou um ex vivo.

[00707] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a etapa de crioconservar a bolsa de infusão compreendendo a população de TILs coletada em etapa (f) usando um processo de crioconservação.

[00708] Em algumas modalidades, o processo de crioconservação é realizado usando uma razão 1:1 de população de TILs coletada para o meio de crioconservação. Em algumas modalidades, o meio de crioconservação

230 / 557 compreende dimetil sulfóxido. Em algumas modalidades, o meio de crioconservação é selecionado a partir do grupo consistindo em Cryostor CS10, HypoThermasol, ou uma combinação dos mesmos.

[00709] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos são células mononucleares de sangue periférico (PBMCs).

[00710] Em algumas modalidades, as PBMCs são irradiadas e alogênicas.

[00711] Em algumas modalidades, as PBMCs são adicionadas à cultura celular em qualquer um de dias 9 até 14 em etapa (d).

[00712] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos são células apresentadoras de antígenos artificiais.

[00713] Em algumas modalidades, a coleta em etapa (e) é realizada usando um sistema de processamento de células LOVO.

[00714] Em algumas modalidades, os fragmentos de tumores são fragmentos múltiplos e compreendem cerca de 4 a cerca de 50 fragmentos, em que cada fragmento tem um volume de cerca de 27 mm3. Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 30 a cerca de 60 fragmentos com um volume total de cerca de 1300 mm3 a cerca de 1500 mm3. Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 50 fragmentos com um volume total de cerca de 1350 mm3. Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 50 fragmentos com uma massa total de cerca de 1 grama a cerca de 1,5 gramas.

[00715] Em algumas modalidades, o meio de cultura celular é provido em um recipiente selecionado a partir do grupo consistindo em um recipiente G e um Xuri cellbag.

[00716] Em algumas modalidades, a bolsa de infusão em etapa (f) é uma bolsa de infusão contendo HypoThermosol.

[00717] Em algumas modalidades, o primeiro período em etapa (c) e o segundo período em etapa (e) são cada individualmente realizados dentro de

231 / 557 um período de 10 dias, 11 dias, ou 12 dias. Em algumas modalidades, o primeiro período em etapa (c) e o segundo período em etapa (e) são cada individualmente realizados dentro de um período de 11 dias. Em algumas modalidades, etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 25 dias a cerca de 30 dias. Em algumas modalidades, etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 20 dias a cerca de 25 dias. Em algumas modalidades, etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 20 dias a cerca de 22 dias. Em algumas modalidades, etapas (a) até (f) são realizadas em 22 dias ou menos. Em algumas modalidades, etapas (a) até (f) e crioconservação são realizadas em 22 dias ou menos.

[00718] Em algumas modalidades, a população terapêutica de TILs coletados em etapa (e) compreende TILs suficientes para uma dosagem terapeuticamente eficaz dos TILs. Em algumas modalidades, o número de TILs suficientes para uma dosagem terapeuticamente eficaz é de cerca de 2,3×1010 a cerca de 13,7×1010.

[00719] Em algumas modalidades, etapas (b) até (e) são realizadas em um recipiente único, em que realização das etapas (b) até (e) em um recipiente único resulta em um aumento em rendimento de TIL por tumor resseccionado como comparado com realização das etapas (b) até (e) em mais do que um recipiente.

[00720] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos são adicionadas aos TILs durante o segundo período em etapa (d) sem abertura do sistema.

[00721] Em algumas modalidades, as células T efetoras e/ou células T de memória central na população terapêutica de TILs exibem uma ou mais características selecionadas a partir do grupo consistindo em expressão de CD27+, expressão de CD28+, telômeros mais longos, expressão aumentada de CD57, e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras, e/ou células T de memória central obtidas a partir da segunda população de

232 / 557 células.

[00722] Em algumas modalidades, as células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas a partir da terceira população de TILs exibem expressão aumentada de CD57 e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas a partir da segunda população de células.

[00723] Em algumas modalidades, o risco de contaminação microbiana é reduzido como comparado com um sistema aberto.

[00724] Em algumas modalidades, os TILs da etapa (f) são infundidos em um paciente.

[00725] Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 4 fragmentos. Em algumas modalidades, os 4 fragmentos são colocados em um G-REX -100. Em algumas modalidades, os 4 fragmentos tem cerca de 0,5 cm de diâmetro. Em algumas modalidades, os 4 fragmentos são colocados em um G-REX -100. Em algumas modalidades, os 4 fragmentos têm cerca de 0,1 cm, 0,2 cm, 0,3 cm, 0,4 cm, 0,5 cm, 0,6 cm, 0,7 cm, 0,8 cm, 0,9 cm, ou 1 cm de diâmetro. Em algumas modalidades, os 4 fragmentos têm cerca de 0,1 cm, 0,2 cm, 0,3 cm, 0,4 cm, 0,5 cm, 0,6 cm, 0,7 cm, 0,8 cm, 0,9 cm, ou 1 cm de diâmetro e são colocados em um G-REX -

100. Em algumas modalidades, os 4 fragmentos têm cerca de 0,1 cm, 0,2 cm, 0,3 cm, 0,4 cm, 0,5 cm, 0,6 cm, 0,7 cm, 0,8 cm, 0,9 cm, ou 1 cm de diâmetro e são colocados em um recipiente com um volume equivalente a um G-REX -

100. Em algumas modalidades, os 4 fragmentos têm cerca de 0,5 cm de diâmetro e são colocados em um G-REX -100. Em algumas modalidades, os 4 fragmentos têm cerca de 0,5 cm de diâmetro e são colocados em um recipiente com um volume equivalente a um G-REX -100.

[00726] Outros detalhes de etapas (a), (b), (c), (d), (e) e (f) são providos aqui abaixo, incluindo, por exemplo, mas não limitadas às modalidades descritas sob os cabeçalhos “ETAPA A: Obter amostra de tumor

233 / 557 do paciente”, “ETAPA B: Primeira expansão”, “ETAPA C: Transição da primeira expansão para a segunda expansão”, “ETAPA D: Segunda expansão”, “ETAPA E: Coletar TILs e “ETAPA F: Formulação Final/ Transferência para bolsa de infusão”.

[00727] Em algumas modalidades, a presente descrição provê métodos para tratar um indivíduo com câncer, o método compreendendo administrar linfócitos infiltrando os tumores expandidos (TILs) compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs a partir de um tumor resseccionado de um indivíduo por processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em fragmentos múltiplos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor em um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2 para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3- 14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura do sistema; (d) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7-14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs que compreende uma subpopulação aumentada de células T efetoras e/ou células T de memória central com relação à segunda população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área

234 / 557 de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; (e) coletar a população terapêutica de TILs obtida a partir da etapa (d), em que a transição de etapa (d) para etapa (e) ocorre sem abertura do sistema; e (f) transferir a população de TILs coletada da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (e) a (f) ocorre sem abertura do sistema; (g) opcionalmente crioconservar a bolsa de infusão compreendendo a população de TILs coletada da etapa (f) usando um processo de crioconservação; e (h) administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz da terceira população de TILs da bolsa de infusão em etapa (g) para o paciente.

[00728] Em algumas modalidades, a invenção provê um população terapêutica de linfócitos infiltrando os tumores (TILs) para uso no tratamento de câncer, em que uma população é obtenível a partir de um método compreendendo as etapas de: (b) adicionar fragmentos de tumor em um sistema fechado em que os fragmentos do tumor compreendem uma primeira população de TILs; (c) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2 para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3- 14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura do sistema; (d) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio

235 / 557 de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7-14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs que compreende uma subpopulação aumentada de células T efetoras e/ou células T de memória central com relação à segunda população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; (e) coletar a população terapêutica de TILs obtida a partir da etapa (d), em que a transição de etapa (d) para etapa (e) ocorre sem abertura do sistema; e (f) transferir a população de TILs coletada da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (e) a (f) ocorre sem abertura do sistema; e (g) opcionalmente crioconservar a bolsa de infusão compreendendo a população de TILs coletada da etapa (f) usando um processo de crioconservação.

[00729] Em algumas modalidades, uma população é obtenível por um método também compreendendo como uma primeira etapa: (a) obter uma primeira população de TILs a partir de um tumor resseccionado de um paciente por processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em fragmentos múltiplos de tumor.

[00730] Em uma modalidade, o método é um método in vitro ou um ex vivo.

[00731] Em algumas modalidades, qualquer uma das etapas (a) a (f) compreende uma ou mais características divulgadas aqui, por exemplo uma ou mais características divulgadas sob os cabeçalhos “ETAPA A: Obter

236 / 557 amostra de tumor do paciente”, “ETAPA B: Primeira expansão”, “ETAPA C: Transição da primeira expansão para a segunda expansão”, “ETAPA D: Segunda expansão”, “ETAPA E: Coletar TILs e “ETAPA F: Final Formulação/ Transferir para bolsa de infusão”.

[00732] Em algumas modalidades, etapa (g) compreende uma ou mais características divulgadas aqui, por exemplo uma ou mais características divulgadas sob o cabeçalho “ETAPA H: Crioconservação opcional de TILs”. Em algumas modalidades, etapa (h) compreende uma ou mais características divulgadas aqui, por exemplo uma ou mais características divulgadas sob o cabeçalho “ETAPA F:1 Composições farmacêuticas, dosagens e regimes de dosagem”.

[00733] Em algumas modalidades, a população terapêutica de TILs coletados em etapa (e) compreende TILs suficientes para administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz dos TILs em etapa (h).

[00734] Em algumas modalidades, o número de TILs suficientes para administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz em etapa (h) é de cerca de 2,3×1010 a cerca de 13,7×1010.

[00735] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos (APCs) são PBMCs.

[00736] Em algumas modalidades, as PBMCs são adicionadas à cultura celular em qualquer um de dias 9 até 14 em etapa (d).

[00737] Em algumas modalidades, antes de administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz de células de TIL em etapa (h), um regime de linfodepleção não mieloablativo foi administrado ao paciente.

[00738] Em algumas modalidades, é provida uma população terapêutica de linfócitos infiltrando os tumores (TILs) para uso no tratamento de câncer e em combinação com um regime de linfodepleção não mieloablativo. Em algumas modalidades, o regime de linfodepleção não mieloablativo é administrado antes de administrar a população terapêutica de

237 / 557 linfócitos infiltrando os tumores (TILs).

[00739] Em algumas modalidades, o regime de linfodepleção não mieloablativo compreende as etapas de administração de ciclofosfamida a uma dose de 60 mg/m2/dia durante dois dias seguido por administração de fludarabina a uma dose de 25 mg/m2/dia durante cinco dias.

[00740] Em algumas modalidades, a etapa de tratar o paciente com um regime de IL-2 em dose elevada começando no dia após administração das células de TIL ao paciente em etapa (h).

[00741] Em algumas modalidades, é provida uma população terapêutica de linfócitos infiltrando os tumores (TILs) para uso no tratamento de câncer e em combinação com regime de IL-2 em dose elevada. Em algumas modalidades, o regime de IL-2 em dose elevada começa no dia após administração da população terapêutica de células de TIL.

[00742] Em algumas modalidades, o regime de IL-2 em dose elevada compreende 600.000 ou 720.000 IU/kg administrados como uma infusão intravenosa de bolus de 15 minutos a cada oito horas até tolerância.

[00743] Em algumas modalidades, as células T efetoras e/ou células T de memória central na população terapêutica de TILs exibem uma ou mais características selecionadas a partir do grupo consistindo em expressão de CD27+, expressão de CD28+, telômeros mais longos, expressão aumentada de CD57, e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras, e/ou células T de memória central obtidas a partir da segunda população de células.

[00744] Em algumas modalidades, as células T efetoras e/ou células T de memória central na população terapêutica de TILs exibem expressão aumentada de CD57 e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas a partir da segunda população de células.

[00745] A presente descrição também provê métodos para expandir

238 / 557 linfócitos infiltrando os tumores (TILs) em uma população terapêutica de TILs compreendendo: (a) adicionar fragmentos processados de tumor a partir de um tumor resseccionado de um paciente em um sistema fechado para obter uma primeira população de TILs; (b) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2 para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3- 14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (a) para etapa (b) ocorre sem abertura do sistema; (c) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7-14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs que compreende uma subpopulação aumentada de células T efetoras e/ou células T de memória central com relação à segunda população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura do sistema; (d) coletar a população terapêutica de TILs obtida a partir da etapa (c), em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; e (e) transferir a população de TILs coletada da etapa (d) para

239 / 557 uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (d) a (e) ocorre sem abertura do sistema.

[00746] Em algumas modalidades, a população terapêutica de TILs coletados em etapa (d) compreende TILs suficientes para uma dosagem terapeuticamente eficaz dos TILs.

[00747] Em algumas modalidades, o número de TILs suficientes para uma dosagem terapeuticamente eficaz é de cerca de 2,3×1010 a cerca de 13,7×1010.

[00748] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a etapa de crioconservar a bolsa de infusão compreendendo a população de TILs coletada usando um processo de crioconservação.

[00749] Em algumas modalidades, o processo de crioconservação é realizado usando uma razão 1:1 de população de TILs coletada para meio CS10.

[00750] Em algumas modalidades, a presente descrição provê métodos para tratar um indivíduo com câncer, o método compreendendo administrar linfócitos infiltrando os tumores expandidos (TILs) compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs a partir de um tumor resseccionado de um indivíduo por processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em fragmentos múltiplos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor em um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2 para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3- 14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura

240 / 557 do sistema; (d) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7-14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs que compreende uma subpopulação aumentada de células T efetoras e/ou células T de memória central com relação à segunda população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; (e) coletar a população terapêutica de TILs obtida a partir da etapa (d), em que a transição de etapa (d) para etapa (e) ocorre sem abertura do sistema; e (f) transferir a população de TILs coletada da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (e) a (f) ocorre sem abertura do sistema; (g) opcionalmente crioconservar a bolsa de infusão compreendendo a população de TILs coletada da etapa (f) usando um processo de crioconservação; e (h) administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz da terceira população de TILs da bolsa de infusão em etapa (g) para o paciente, em que nenhuma seleção de população de TILs é realizada durante qualquer uma das etapas (a) a (h). Em uma modalidade, nenhuma seleção da segunda população de TILs (a população pré-REP) com base em fenótipo é realizada antes de realizar a segunda expansão de etapa (d). Em uma modalidade, nenhuma seleção da primeira população de TILs, segunda população de TILs, terceira população de TILs, ou população de TILs

241 / 557 coletadas com base em expressão de CD8 é realizada durante qualquer uma das etapas (a) a (h).

[00751] Em algumas modalidades, a presente descrição provê métodos para tratar um indivíduo com câncer, o método compreendendo administrar linfócitos infiltrando os tumores expandidos (TILs) compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs a partir de um tumor resseccionado de um indivíduo por processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em fragmentos múltiplos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor em um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2 para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3- 14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura do sistema; (d) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7-14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs que compreende uma subpopulação aumentada de células T efetoras e/ou células T de memória central com relação à segunda população de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema;

242 / 557 (e) coletar a população terapêutica de TILs obtida a partir da etapa (d), em que a transição de etapa (d) para etapa (e) ocorre sem abertura do sistema; e (f) transferir a população de TILs coletada da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (e) a (f) ocorre sem abertura do sistema; (g) crioconservar a bolsa de infusão compreendendo a população de TILs coletada da etapa (f) usando um processo de crioconservação, em que o processo de crioconservação compreende misturar um meio de crioconservação com a população de TILs coletada; (h) administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz da terceira população de TILs da bolsa de infusão em etapa (g) para o paciente, em que nenhuma seleção de população de TILs é realizada durante qualquer uma das etapas (a) a (h). Em uma modalidade, nenhuma seleção da segunda população de TILs (por exemplo, a população pré-REP) com base em fenótipo é realizada antes de realizar a segunda expansão de etapa (d). Em uma modalidade, nenhuma seleção da primeira população de TILs, segunda população de TILs, terceira população de TILs, ou população de TILs coletadas com base em expressão de CD8 é realizada durante qualquer uma das etapas (a) a (h). Em algumas modalidades, o regime de linfodepleção não mieloablativo é administrado antes de administrar a população de TILs coletada. Em algumas modalidades, o regime de linfodepleção não mieloablativo compreende as etapas de administração de ciclofosfamida a uma dose de 60 mg/m2/dia durante dois dias seguido por administração de fludarabina a uma dose de 25 mg/m2/dia durante cinco dias.

[00752] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos são células mononucleares de sangue periférico (PBMCs). Em algumas modalidades, as PBMCs são irradiadas e alogênicas. Em algumas modalidades, as PBMCs são adicionadas à cultura celular em qualquer um de

243 / 557 dias 9 até 14 em etapa (c).

[00753] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos são células apresentadoras de antígenos artificiais.

[00754] Em algumas modalidades, a coleta em etapa (d) é realizada usando um sistema de processamento de células LOVO.

[00755] Em algumas modalidades, o método compreende a coleta em etapa (d) via um sistema de processamento de células LOVO, tal como o sistema LOVO fabricado por Fresenius Kabi. O termo “sistema de processamento de células LOVO” também refere-se a qualquer instrumento ou dispositivo que possa bombear uma solução compreendendo células através de uma membrana ou filtro, tal como uma membrana giratória ou filtro giratório em um meio estéril e/ou sistema fechado, permitindo o fluxo contínuo e processamento das células para remover sobrenadante ou meios de cultura celular sem granulação. Em alguns casos, o sistema de processamento de células pode realizar separação de células, lavagem, troca de fluidos, concentração, e/ou outras etapas de processamento de células em um sistema fechado estéril.

[00756] Em algumas modalidades, os fragmentos de tumor são fragmentos múltiplos e compreendem cerca de 4 a cerca de 50 fragmentos, em que cada fragmento tem um volume de cerca de 27 mm3. Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 30 a cerca de 60 fragmentos com um volume total de cerca de 1300 mm3 a cerca de 1500 mm3. Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 50 fragmentos com um volume total de cerca de 1350 mm3. Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 50 fragmentos com uma massa total de cerca de 1 grama a cerca de 1,5 gramas.

[00757] Em algumas modalidades, os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 4 fragmentos. Em algumas modalidades, os 4 fragmentos são colocados em um G-REX-100. Em algumas modalidades, os 4

244 / 557 fragmentos têm cerca de 0,1 cm, 0,2 cm, 0,3 cm, 0,4 cm, 0,5 cm, 0,6 cm, 0,7 cm, 0,8 cm, 0,9 cm, ou 1 cm de diâmetro. Em algumas modalidades, os 4 fragmentos têm cerca de 0,1 cm, 0,2 cm, 0,3 cm, 0,4 cm, 0,5 cm, 0,6 cm, 0,7 cm, 0,8 cm, 0,9 cm, ou 1 cm de diâmetro e são colocados em um G-REX-100. Em algumas modalidades, os 4 fragmentos têm cerca de 0,1 cm, 0,2 cm, 0,3 cm, 0,4 cm, 0,5 cm, 0,6 cm, 0,7 cm, 0,8 cm, 0,9 cm, ou 1 cm de diâmetro e são colocados em um recipiente com um volume equivalente a um G-REX-

100. Em algumas modalidades, os 4 fragmentos têm cerca de 0,5 cm de diâmetro e são colocados em um G-REX-100. Em algumas modalidades, os 4 fragmentos têm cerca de 0,5 cm de diâmetro e são colocados em um recipiente com um volume equivalente a um G-REX-100.

[00758] Em algumas modalidades, o meio de cultura celular é provido em um recipiente selecionado a partir do grupo consistindo em um recipiente G e um Xuri cellbag.

[00759] Em algumas modalidades, a bolsa de infusão em etapa (e) é uma bolsa de infusão contendo HypoThermosol.

[00760] Em algumas modalidades, o primeiro período em etapa (b) e o segundo período em etapa (c) são cada individualmente realizados dentro de um período de 10 dias, 11 dias, ou 12 dias. Em algumas modalidades, o primeiro período em etapa (b) e o segundo período em etapa (c) são cada individualmente realizados dentro de um período de 11 dias. Em algumas modalidades, etapas (a) até (e) são realizadas dentro de um período de cerca de 25 dias a cerca de 30 dias. Em algumas modalidades, etapas (a) até (e) são realizadas dentro de um período de cerca de 20 dias a cerca de 25 dias. Em algumas modalidades, etapas (a) até (e) são realizadas dentro de um período de cerca de 20 dias a cerca de 22 dias. Em algumas modalidades, etapas (a) até (e) são realizadas em 22 dias ou menos. Em algumas modalidades, etapas (a) até (e) e crioconservação são realizadas em 22 dias ou menos.

[00761] Em algumas modalidades, etapas (b) até (e) são realizadas em

245 / 557 um recipiente único, em que realização das etapas (b) até (e) em um recipiente único resulta em um aumento em rendimento de TIL por tumor resseccionado como comparado com realização das etapas (b) até (e) em mais do que um recipiente.

[00762] Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígenos são adicionadas aos TILs durante o segundo período em etapa (c) sem abertura do sistema.

[00763] Em algumas modalidades, as células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas na população terapêutica de TILs exibem uma ou mais características selecionadas a partir do grupo consistindo em expressão de CD27+, expressão de CD28+, telômeros mais longos, expressão aumentada de CD57, e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras, e/ou células T de memória central obtidas a partir da segunda população de células.

[00764] Em algumas modalidades, as células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas na população terapêutica de TILs exibem expressão aumentada de CD57 e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras, e/ou células T de memória central obtidas a partir da segunda população de células.

[00765] Em algumas modalidades, o risco de contaminação microbiana é reduzido como comparado com um sistema aberto.

[00766] Em algumas modalidades, os TILs da etapa (e) são infundidos em um paciente.

[00767] Em algumas modalidades, o recipiente fechado compreende um biorreator único. Em algumas modalidades, o recipiente fechado compreende um G-REX-10. Em algumas modalidades, o recipiente fechado compreende um G-REX-100. VI. Modalidades Exemplares adicionais

[00768] 1. Um método para expandir linfócitos infiltrando os tumores

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(TILs) em uma população terapêutica de TILs compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor resseccionado de um paciente por processamento de uma amostra de tumor obtida a partir do paciente em fragmentos de tumor múltiplos; (b) adicionar os fragmentos de tumor em um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2, e opcionalmente OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3-14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura do sistema; (d) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, opcionalmente OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7-14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; (e) coletar a população terapêutica de TILs obtida a partir da etapa (d), em que a transição de etapa (d) para etapa (e) ocorre sem abertura do sistema; e (f) transferir a população de TILs coletada da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (e) para (f) ocorre sem abertura do sistema.

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[00769] 2. O método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo adicionalmente a etapa de crioconservar a bolsa de infusão compreendendo a população de TILs coletada em etapa (f) usando um processo de crioconservação.

[00770] 3. O método de acordo com a reivindicação 1, em que o processo de crioconservação é realizado usando uma razão 1:1 de população de TILs coletada para meio de crioconservação.

[00771] 4. O método de acordo com a reivindicação 1, em que as células apresentadoras de antígenos são células mononucleares de sangue periférico (PBMCs).

[00772] 5. O método de acordo com a reivindicação 4, em que as PBMCs são irradiadas e alogênicas.

[00773] 6. O método de acordo com a reivindicação 4, em que as PBMCs são adicionadas à cultura celular em qualquer um de dias 9 até 14 em etapa (d).

[00774] 7. O método de acordo com a reivindicação 1, em que as células apresentadoras de antígenos são células apresentadoras de antígenos artificiais.

[00775] 8. O método de acordo com a reivindicação 1, em que a coleta em etapa (e) é realizada usando um sistema de processamento de células à base de membrana.

[00776] 9. O método de acordo com a reivindicação 1, em que a coleta em etapa (e) é realizada usando um sistema de processamento de células LOVO.

[00777] 10. O método de acordo com a reivindicação 1, em que os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 4 a cerca de 50 fragmentos, em que cada fragmento tem um volume de cerca de 27 mm3.

[00778] 11. O método de acordo com a reivindicação 1, em que os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 30 a cerca de 60 fragmentos

248 / 557 com um volume total de cerca de 1300 mm3 a cerca de 1500 mm3.

[00779] 12. O método de acordo com a reivindicação 9, em que os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 50 fragmentos com um volume total de cerca de 1350 mm3.

[00780] 13. O método de acordo com a reivindicação 1, em que os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 50 fragmentos com uma massa total de cerca de 1 grama a cerca de 1,5 gramas.

[00781] 14. O método de acordo com a reivindicação 1, em que o meio de cultura celular é provido em um recipiente selecionado a partir do grupo consistindo em um recipiente G e um Xuri cellbag.

[00782] 15. O método de acordo com a reivindicação 1, em que o meio de cultura celular em etapa (d) compreende adicionalmente IL-15 e/ou IL-21.

[00783] 16. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a concentração de IL-2 é cerca de 10.000 IU/mL a cerca de 5.000 IU/mL.

[00784] 17. O método de acordo com a reivindicação 15, em que a concentração de IL-15 é cerca de 500 IU/mL a cerca de 100 IU/mL.

[00785] 18. O método de acordo com a reivindicação 1, em que a concentração de IL-21 é cerca de 20 IU/mL a cerca de 0,5 IU/mL.

[00786] 19. O método de acordo com a reivindicação 1, em que a bolsa de infusão em etapa (f) é uma bolsa de infusão contendo HypoThermosol.

[00787] 20. O método de acordo com a reivindicação 3, em que o meio de crioconservação compreende dimetilsulfóxido (DMSO).

[00788] 21. O método de acordo com a reivindicação 17, em que em que o meio de crioconservação compreende 7% a 10% DMSO.

[00789] 22. O método de acordo com a reivindicação 1, em que o primeiro período em etapa (c) e o segundo período em etapa (e) são cada individualmente realizados dentro de um período de 10 dias, 11 dias, ou 12 dias.

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[00790] 23. O método de acordo com a reivindicação 1, em que o primeiro período em etapa (c) e o segundo período em etapa (e) são cada individualmente realizados dentro de um período de 11 dias.

[00791] 24. O método de acordo com a reivindicação 1, em que etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 22 dias.

[00792] 25. O método de acordo com a reivindicação 1, em que etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 20 dias a cerca de 22 dias.

[00793] 26. O método de acordo com a reivindicação 1, em que etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 15 dias a cerca de 20 dias.

[00794] 27. O método de acordo com a reivindicação 1, em que etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 20 dias.

[00795] 28. O método de acordo com a reivindicação 1, em que etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 15 dias.

[00796] 29. O método de acordo com a reivindicação 1, em que etapas (a) até (f) são realizadas em 22 dias ou menos.

[00797] 30. O método de acordo com a reivindicação 1, em que etapas (a) até (f) são realizadas em 20 dias ou menos.

[00798] 31. O método de acordo com a reivindicação 1, em que etapas (a) até (f) são realizadas em 15 dias ou menos.

[00799] 32. O método de acordo com a reivindicação 1, em que etapas (a) até (f) são realizadas em 10 dias ou menos.

[00800] 33. O método de acordo com a reivindicação 2, em que etapas (a) até (f) e crioconservação são realizadas em 22 dias ou menos.

[00801] 34. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações

250 / 557 1 a 33, em que a população terapêutica de TILs coletada em etapa (e) compreende TILs suficientes para uma dosagem terapeuticamente eficaz dos TILs.

[00802] 35. O método de acordo com a reivindicação 34, em que o número de TILs suficientes para uma dosagem terapeuticamente eficaz é de cerca de 2,3×1010 a cerca de 13,7×1010.

[00803] 36. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, em que etapas (b) até (e) são realizadas em um recipiente único, em que realizar etapas (b) até (e) em um recipiente único resulta em um aumento em rendimento de TIL por tumor resseccionado como comparado com realização das etapas (b) até (e) em mais do que um recipiente.

[00804] 37. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, em que as células apresentadoras de antígenos são adicionadas aos TILs durante o segundo período em etapa (d) sem abertura do sistema.

[00805] 38. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, em que a terceira população de TILs em etapa (d) proporciona uma eficácia aumentada, produção de interferon-gama aumentada, policlonalidade aumentada, IP-10 médio aumentado, e/ou MCP-1 médio aumentado quando administrada a um individuo.

[00806] 39. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, em que a terceira população de TILs em etapa (d) proporciona pelo menos uma produção de interferon-gama de cinco vezes ou maior quando administrada a um individuo.

[00807] 40. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39, em que a terceira população de TILs em etapa (d) é uma população terapêutica de TILs que compreende uma subpopulação aumentada de células T efetoras e/ou células T de memória central com relação à segunda população de TILs, em que as células T efetoras e/ou células T de memória central na população terapêutica de TILs exibem uma ou mais características

251 / 557 selecionadas a partir do grupo consistindo em expressão de CD27+, expressão de CD28+, telômeros mais longos, expressão aumentada de CD57, e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras, e/ou células T de memória central obtidas a partir da segunda população de células.

[00808] 41. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, em que as células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas a partir da terceira população de TILs exibem expressão aumentada de CD57 e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas a partir da segunda população de células.

[00809] 42. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, em que o risco de contaminação microbiana é reduzido como comparado com um sistema aberto.

[00810] 43. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42, em que os TILs de etapa (g) são infundidos em um paciente.

[00811] 44. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, em que os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 4 fragmentos.

[00812] 45. Um método para tratamento de um indivíduo com câncer, o método compreendendo administrar linfócitos infiltrando os tumores expandidos (TILs) compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor resseccionado a partir de um indivíduo por processamento de uma amostra de tumor obtida a partir do paciente em fragmentos de tumor múltiplos; (b) adicionar os fragmentos de tumor em um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2, e opcionalmente OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3-14 dias para obter a segunda população de TILs,

252 / 557 em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura do sistema; (d) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, opcionalmente OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7-14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; (e) coletar a população terapêutica de TILs obtida a partir da etapa (d), em que a transição de etapa (d) para etapa (e) ocorre sem abertura do sistema; e (f) transferir a população de TILs coletada da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (e) para (f) ocorre sem abertura do sistema; (g) opcionalmente crioconservar a bolsa de infusão compreendendo a população de TILs coletada de etapa (f) usando um processo de crioconservação; e (h) administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz da terceira população de TILs a partir da bolsa de infusão em etapa (g) para o paciente.

[00813] 46. O método de acordo com a reivindicação 45, em que a população terapêutica de TILs coletada em etapa (e) compreende TILs suficientes para administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz dos TILs em etapa (h).

[00814] 47. O método de acordo com a reivindicação 46, em que o

253 / 557 número de TILs suficientes para administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz em etapa (h) é de cerca de 2,3×1010 a cerca de 13,7×1010.

[00815] 48. O método de acordo com a reivindicação 47, em que as células apresentadoras de antígenos (APCs) são PBMCs.

[00816] 49. O método de acordo com a reivindicação 48, em que as PBMCs são adicionadas à cultura celular em qualquer um de dias 9 até 14 em etapa (d).

[00817] 50. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 49, em que antes de administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz de células de TILs em etapa (h), um regime de linfodepleção não mieloablativo foi administrado para o paciente.

[00818] 51. O método de acordo com a reivindicação 50, em que o regime de linfodepleção não mieloablativo compreende as etapas de administração de ciclofosfamida a uma dose de 60 mg/m2/dia durante dois dias seguido por administração de fludarabine a uma dose de 25 mg/m2/dia durante cinco dias.

[00819] 52. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 51, compreendendo adicionalmente a etapa de tratar o paciente com um regime de IL-2 de dose elevada iniciando no dia após administração das células de TILs para o paciente em etapa (h).

[00820] 53. O método de acordo com a reivindicação 52, em que o regime de IL-2 de dose elevada compreende 600.000 ou 720.000 IU/kg administrados como uma infusão intravenosa de bolus de 15 minutos a cada oito horas até tolerância.

[00821] 54. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a terceira população de TILs em etapa (d) é uma população terapêutica de TILs que compreende uma subpopulação aumentada de células T efetoras e/ou células T de memória central com relação à segunda população de TILs, em que as células T efetoras e/ou células T de

254 / 557 memória central na população terapêutica de TILs exibem uma ou mais características selecionadas a partir do grupo consistindo em expressão de CD27+, expressão de CD28+, telômeros mais longos, expressão aumentada de CD57, e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras, e/ou células T de memória central obtidas a partir da segunda população de células.

[00822] 55. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que as células T efetoras e/ou células T de memória central na população terapêutica de TILs exibem expressão aumentada de CD57 e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas a partir da segunda população de células.

[00823] 56. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o câncer é selecionado dentre o grupo consistindo em melanoma, câncer ovariano, câncer cervical, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer causado por vírus papiloma humano, câncer de cabeça e pescoço (incluindo carcinoma de célula escamosa de cabeça e pescoço (HNSCC)), câncer renal, e carcinoma de célula renal.

[00824] 57. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o câncer é selecionado dentre o grupo consistindo em melanoma, HNSCC, cânceres cervicais, e NSCLC.

[00825] 58. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o câncer é melanoma.

[00826] 59. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o câncer é HNSCC.

[00827] 60. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o câncer é um câncer cervical.

[00828] 61. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o câncer é NSCLC.

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[00829] 62. Um método para expandir linfócitos infiltrando os tumores (TILs) em uma população terapêutica de TILs compreendendo: (a) adicionar fragmentos de tumor processados de um tumor resseccionado de um paciente em um sistema fechado para obter uma primeira população de TILs; (b) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2, e opcionalmente OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3-14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (a) para etapa (b) ocorre sem abertura do sistema; (c) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, opcionalmente OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7-14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura do sistema; (d) coletar a população terapêutica de TILs obtida a partir da etapa (c), em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; e (e) transferir a população de TILs coletada da etapa (d) para uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (d) para (e) ocorre sem abertura do sistema.

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[00830] 63. O método de acordo com a reivindicação 62, em que a população terapêutica de TILs coletada em etapa (d) compreende TILs suficientes para uma dosagem terapeuticamente eficaz dos TILs.

[00831] 64. O método de acordo com a reivindicação 63, onde o número de TILs suficientes para uma dosagem terapeuticamente eficaz é de cerca de 2,3×1010 a cerca de 13,7×1010.

[00832] 65. O método de acordo com a reivindicação 64, compreendendo adicionalmente a etapa de crioconservar a bolsa de infusão compreendendo a população de TILs coletada usando um processo de crioconservação.

[00833] 66. O método de acordo com a reivindicação 65, em que o processo de crioconservação é realizado usando uma razão 1:1 de população de TILs coletada para meio de crioconservação.

[00834] 67. O método de acordo com a reivindicação 62, em que as células apresentadoras de antígenos são células mononucleares de sangue periférico (PBMCs).

[00835] 68. O método de acordo com a reivindicação 67, em que as PBMCs são irradiadas e alogênicas.

[00836] 69. O método de acordo com a reivindicação 68, em que as PBMCs são adicionadas à cultura celular em qualquer um de dias 9 até 14 em etapa (c).

[00837] 70. O método de acordo com a reivindicação 62, em que as células apresentadoras de antígenos são células apresentadoras de antígenos artificiais.

[00838] 71. O método de acordo com a reivindicação 62, em que a coleta em etapa (d) é realizada usando um sistema de processamento de células LOVO.

[00839] 72. O método de acordo com a reivindicação 62, em que os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 4 a cerca de 50 fragmentos, em

257 / 557 que cada fragmento tem um volume de cerca de 27 mm3.

[00840] 73. O método de acordo com a reivindicação 62, em que os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 30 a cerca de 60 fragmentos com um volume total de cerca de 1300 mm3 a cerca de 1500 mm3.

[00841] 74. O método de acordo com a reivindicação 63, em que os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 50 fragmentos com um volume total de cerca de 1350 mm3.

[00842] 75. O método de acordo com a reivindicação 62, em que os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 50 fragmentos com uma massa total de cerca de 1 grama a cerca de 1,5 gramas.

[00843] 76. O método de acordo com a reivindicação 62, em que os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 4 fragmentos.

[00844] 77. O método de acordo com a reivindicação 62, em que o segundo meio de cultura celular é provido em um recipiente selecionado a partir do grupo consistindo em um recipiente G e um Xuri cellbag.

[00845] 78. O método de acordo com a reivindicação 62, em que a bolsa de infusão em etapa (e) é uma bolsa de infusão contendo HypoThermosol.

[00846] 79. O método de acordo com a reivindicação 62, em que o primeiro período em etapa (b) e o segundo período em etapa (c) são cada individualmente realizados dentro de um período de 10 dias, 11 dias, ou 12 dias.

[00847] 80. O método de acordo com a reivindicação 62, em que o primeiro período em etapa (b) e o segundo período em etapa (c) são cada individualmente realizados dentro de um período de 11 dias.

[00848] 81. O método de acordo com a reivindicação 62, em que etapas (a) até (e) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 22 dias.

[00849] 82. O método de acordo com a reivindicação 62, em que

258 / 557 etapas (a) até (e) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 20 dias.

[00850] 83. O método de acordo com a reivindicação 62, em que etapas (a) até (e) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 15 dias.

[00851] 84. O método de acordo com a reivindicação 62, em que etapas (a) até (e) são realizadas em 22 dias ou menos.

[00852] 85. O método de acordo com a reivindicação 65, em que etapas (a) até (e) e crioconservação são realizadas em 22 dias ou menos.

[00853] 86. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 85, em que etapas (b) até (e) são realizadas em um recipiente único, em que realizar etapas (b) até (e) em um recipiente único resulta em um aumento em rendimento de TIL por tumor resseccionado como comparado com realização das etapas (b) até (e) em mais do que um recipiente.

[00854] 87. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 86, em que as células apresentadoras de antígenos são adicionadas aos TILs durante o segundo período em etapa (c) sem abertura do sistema.

[00855] 88. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 87, em que a terceira população de TILs em etapa (d) é uma população terapêutica de TILs que compreende uma subpopulação aumentada de células T efetoras e/ou células T de memória central com relação à segunda população de TILs, em que as células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas na população terapêutica de TILs exibem uma ou mais características selecionadas a partir do grupo consistindo em expressão de CD27+, expressão de CD28+, telômeros mais longos, expressão aumentada de CD57, e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras, e/ou células T de memória central obtidas a partir da segunda população de células.

[00856] 89. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações

259 / 557 62 a 88, em que as células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas na população terapêutica de TILs exibem expressão aumentada de CD57 e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras, e/ou células T de memória central obtidas a partir da segunda população de células.

[00857] 90. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 89, em que o risco de contaminação microbiana é é reduzido como comparado com um sistema aberto.

[00858] 91. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 90, em que os TILs de etapa (e) são infundidos em um paciente.

[00859] 92. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes em que o recipiente fechado compreende um único biorreator.

[00860] 93. O método de acordo com a reivindicação 92, em que o recipiente fechado compreende um G-REX-10.

[00861] 94. O método de acordo com a reivindicação 92, em que o recipiente fechado compreende um G-REX -100.

[00862] 95. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 61, em que em etapa (d) as células apresentadoras de antígenos (APCs) são adicionadas à cultura celular da segunda população de TILs em uma razão de APC:TIL de 25:1 a 100:1.

[00863] 96. O método de acordo com a reivindicação 95, em que a cultura celular tem uma razão de 2,5×109 APCs a 100×106 TILs.

[00864] 97. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 94, em que em etapa (c) as células apresentadoras de antígenos (APCs) são adicionadas à cultura celular da segunda população de TILs em uma razão de APC:TIL de 25:1 a 100:1.

[00865] 98. O método de acordo com a reivindicação 97, em que a cultura celular tem razão de 2,5×109 APCs a 100×106 TILs.

[00866] 99. A população de TILs expandidos para uso no tratamento

260 / 557 de um indivíduo com câncer, em que a população de TILs expandidos é uma terceira população de TILs obtenível por um método compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor resseccionado a partir de um indivíduo por processamento de uma amostra de tumor obtida a partir do paciente em fragmentos de tumor múltiplos; (b) adicionar os fragmentos de tumor em um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2, e opcionalmente OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3-14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura do sistema; (d) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, opcionalmente OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7-14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; (e) coletar a população terapêutica de TILs obtida a partir da etapa (d), em que a transição de etapa (d) para etapa (e) ocorre sem abertura do sistema; e (f) transferir a população de TILs coletada da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (e) para (f) ocorre sem

261 / 557 abertura do sistema; e (g) opcionalmente crioconservar a bolsa de infusão compreendendo a população de TILs coletada de etapa (f) usando um processo de crioconservação.

[00867] 100. A população de TILs para uso para tratar um indivíduo com câncer de acordo com reivindicação 99, em que o método compreende adicionalmente uma ou mais das características mencionadas em qualquer uma das reivindicações 1 a 99.

[00868] 101. Um método para expandir linfócitos infiltrando os tumores (TILs) em uma população terapêutica de TILs compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor resseccionado de um paciente por processamento de uma amostra de tumor obtida a partir do paciente em fragmentos de tumor múltiplos; (b) adicionar os fragmentos de tumor em um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2, opcionalmente OKT-3, e opcionalmente um agonista de superfamília de receptor de fator de necrose de tumor (TNFRSF), para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3-14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura do sistema; (d) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, opcionalmente OKT-3, e opcionalmente um agonista de superfamília de receptor de fator de necrose de tumor (TNFRSF), e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a

262 / 557 segunda expansão é realizada durante cerca de 7-14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; (e) coletar a população terapêutica de TILs obtida a partir da etapa (d), em que a transição de etapa (d) para etapa (e) ocorre sem abertura do sistema; e (f) transferir a população de TILs coletada da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (e) para (f) ocorre sem abertura do sistema.

[00869] 102. O método de acordo com a reivindicação 101, compreendendo adicionalmente a etapa de crioconservar a bolsa de infusão compreendendo a população de TILs coletada em etapa (f) usando um processo de crioconservação.

[00870] 103. O método de acordo com a reivindicação 101, em que o processo de crioconservação é realizado usando uma razão 1:1 de população de TILs coletada para meio de crioconservação.

[00871] 104. O método de acordo com a reivindicação 101, em que as células apresentadoras de antígenos são células mononucleares de sangue periférico (PBMCs).

[00872] 105. O método de acordo com a reivindicação 104, em que as PBMCs são irradiadas e alogênicas.

[00873] 106. O método de acordo com a reivindicação 104, em que as PBMCs são adicionadas à cultura celular em qualquer um de dias 9 até 14 em etapa (d).

[00874] 107. O método de acordo com a reivindicação 101, em que as células apresentadoras de antígenos são células apresentadoras de antígenos artificiais.

263 / 557

[00875] 108. O método de acordo com a reivindicação 101, em que a coleta em etapa (e) é realizada usando um sistema de processamento de células à base de membrana.

[00876] 109. O método de acordo com a reivindicação 101, em que a coleta em etapa (e) é realizada usando um sistema de processamento de células LOVO.

[00877] 110. O método de acordo com a reivindicação 101, em que os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 4 a cerca de 50 fragmentos, em que cada fragmento tem um volume de cerca de 27 mm3.

[00878] 111. O método de acordo com a reivindicação 101, em que os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 30 a cerca de 60 fragmentos com um volume total de cerca de 1300 mm3 a cerca de 1500 mm3.

[00879] 112. O método de acordo com a reivindicação 109, em que os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 50 fragmentos com um volume total de cerca de 1350 mm3.

[00880] 113. O método de acordo com a reivindicação 101, em que os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 50 fragmentos com uma massa total de cerca de 1 grama a cerca de 1,5 gramas.

[00881] 114. O método de acordo com a reivindicação 101, em que o meio de cultura celular é provido em um recipiente selecionado a partir do grupo consistindo em um recipiente G e a Xuri cellbag.

[00882] 115. O método de acordo com a reivindicação 101, em que o meio de cultura celular em etapa (d) compreende adicionalmente IL-15 e/ou IL-21.

[00883] 116. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 a 115, em que a concentração de IL-2 é cerca de 10.000 IU/mL a cerca de 5.000 IU/mL.

[00884] 117. O método de acordo com a reivindicação 115, em que a concentração de IL-15 é cerca de 500 IU/mL a cerca de 100 IU/mL.

264 / 557

[00885] 118. O método de acordo com a reivindicação 101, em que a concentração de IL-21 é cerca de 20 IU/mL a cerca de 0,5 IU/mL.

[00886] 119. O método de acordo com a reivindicação 101, em que a bolsa de infusão em etapa (f) é uma bolsa de infusão contendo HypoThermosol.

[00887] 120. O método de acordo com a reivindicação 103, em que o meio de crioconservação compreende dimetilsulfóxido (DMSO).

[00888] 121. O método de acordo com a reivindicação 117, em que o meio de crioconservação compreende 7% a 10% DMSO.

[00889] 122. O método de acordo com a reivindicação 101, em que o primeiro período em etapa (c) e o segundo período em etapa (e) são cada individualmente realizados dentro de um período de 10 dias, 11 dias, ou 12 dias.

[00890] 123. O método de acordo com a reivindicação 101, em que o primeiro período em etapa (c) e o segundo período em etapa (e) são cada individualmente realizados dentro de um período de 11 dias.

[00891] 124. O método de acordo com a reivindicação 101, em que etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 22 dias.

[00892] 125. O método de acordo com a reivindicação 101, em que etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 20 dias a cerca de 22 dias.

[00893] 126. O método de acordo com a reivindicação 101, em que etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 15 dias a cerca de 20 dias.

[00894] 127. O método de acordo com a reivindicação 101, em que etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 20 dias.

[00895] 128. O método de acordo com a reivindicação 101, em que

265 / 557 etapas (a) até (f) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 15 dias.

[00896] 129. O método de acordo com a reivindicação 101, em que etapas (a) até (f) são realizadas em 22 dias ou menos.

[00897] 130. O método de acordo com a reivindicação 101, em que etapas (a) até (f) são realizadas em 20 dias ou menos.

[00898] 131. O método de acordo com a reivindicação 101, em que etapas (a) até (f) são realizadas em 15 dias ou menos.

[00899] 132. O método de acordo com a reivindicação 101, em que etapas (a) até (f) são realizadas em 10 dias ou menos.

[00900] 133. O método de acordo com a reivindicação 102, em que etapas (a) até (f) e crioconservação são realizadas em 22 dias ou menos.

[00901] 134. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 a 133, em que a população terapêutica de TILs coletada em etapa (e) compreende TILs suficientes para uma dosagem terapeuticamente eficaz dos TILs.

[00902] 135. O método de acordo com a reivindicação 134, em que o número de TILs suficientes para uma dosagem terapeuticamente eficaz é de cerca de 2,3×1010 a cerca de 13,7×1010.

[00903] 136. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 a 135, em que etapas (b) até (e) são realizadas em um recipiente único, em que realizar etapas (b) até (e) em um recipiente único resulta em um aumento em rendimento de TIL por tumor resseccionado como comparado com realização das etapas (b) até (e) em mais do que um recipiente.

[00904] 137. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 a 136, em que o agonista de superfamília de receptor de fator de necrose de tumor (TNFRSF) é um anticorpo 4-1BB.

[00905] 138. O método de acordo com qualquer uma das

266 / 557 reivindicações 101 a 137, em que as células apresentadoras de antígenos são adicionadas aos TILs durante o segundo período em etapa (d) sem abertura do sistema.

[00906] 139. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 a 138, em que a terceira população de TILs em etapa (d) proporciona uma eficácia aumentada, produção de interferon-gama aumentada, policlonalidade aumentada, IP-10 médio aumentado, e/ou MCP-1 médio aumentado quando administrada a um individuo.

[00907] 140. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 a 139, em que a terceira população de TILs em etapa (d) provê para pelo menos uma produção de interferon-gama de cinco vezes ou mais quando administrada a um individuo.

[00908] 141. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 a 140, em que a terceira população de TILs em etapa (d) é uma população terapêutica de TILs que compreende uma subpopulação aumentada de células T efetoras e/ou células T de memória central com relação à segunda população de TILs, em que as células T efetoras e/ou células T de memória central na população terapêutica de TILs exibem uma ou mais características selecionadas a partir do grupo consistindo em expressão de CD27+, expressão de CD28+, telômeros mais longos, expressão aumentada de CD57, e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras, e/ou células T de memória central obtidas a partir da segunda população de células.

[00909] 142. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 a 141, em que as células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas a partir da terceira população de TILs exibem expressão aumentada de CD57 e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas a partir da segunda população de células.

267 / 557

[00910] 143. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 a 142, em que o risco de contaminação microbiana é é reduzido como comparado com um sistema aberto.

[00911] 144. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 a 143, em que os TILs de etapa (g) são infundidos em um paciente.

[00912] 145. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 a 144, em que os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 4 fragmentos.

[00913] 146. Um método para tratamento de um indivíduo com câncer, o método compreendendo administrar linfócitos infiltrando os tumores expandidos (TILs) compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs de um tumor resseccionado a partir de um indivíduo por processamento de uma amostra de tumor obtida a partir do paciente em fragmentos de tumor múltiplos; (b) adicionar os fragmentos de tumor em um sistema fechado; (c) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2, opcionalmente OKT-3, e opcionalmente um agonista de superfamília de receptor de fator de necrose de tumor (TNFRSF), para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície permeável a gás, em que a primeira expansão é realizada durante cerca de 3-14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura do sistema; (d) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, opcionalmente OKT-3, e opcionalmente um agonista de superfamília de

268 / 557 receptor de fator de necrose de tumor (TNFRSF), e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizada durante cerca de 7-14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; (e) coletar a população terapêutica de TILs obtida a partir da etapa (d), em que a transição de etapa (d) para etapa (e) ocorre sem abertura do sistema; e (f) transferir a população de TILs coletada da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (e) para (f) ocorre sem abertura do sistema; (g) opcionalmente crioconservar a bolsa de infusão compreendendo a população de TILs coletada de etapa (f) usando um processo de crioconservação; e (h) administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz da terceira população de TILs a partir da bolsa de infusão em etapa (g) para o paciente.

[00914] 147. O método de acordo com a reivindicação 146, em que a população terapêutica de TILs coletada em etapa (e) compreende TILs suficientes para administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz dos TILs em etapa (h).

[00915] 148. O método de acordo com a reivindicação 147, em que o número de TILs suficientes para administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz em etapa (h) é de cerca de 2,3×1010 a cerca de 13,7×1010.

[00916] 149. O método de acordo com a reivindicação 148, em que as células apresentadoras de antígenos (APCs) são PBMCs.

[00917] 150. O método de acordo com a reivindicação 149, em que as

269 / 557 PBMCs são adicionadas à cultura celular em qualquer um de dias 9 até 14 em etapa (d).

[00918] 151. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 146 a 150, em que o agonista de superfamília de receptor de fator de necrose de tumor (TNFRSF) é um anticorpo 4-1BB.

[00919] 152. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 146 a 151, em que antes de administrar uma dosagem terapeuticamente eficaz de células de TILs em etapa (h), um regime de linfodepleção não mieloablativo foi administrado para o paciente.

[00920] 153. O método de acordo com a reivindicação 152, em que o regime de linfodepleção não mieloablativo compreende as etapas de administração de ciclofosfamida a uma dose de 60 mg/m2/dia durante dois dias seguido por administração de fludarabine a uma dose de 25 mg/m2/dia durante cinco dias.

[00921] 154. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 146 a 153, compreendendo adicionalmente a etapa de tratar o paciente com um regime de IL-2 de dose elevada iniciando no dia após administração das células de TILs para o paciente em etapa (h).

[00922] 155. O método de acordo com a reivindicação 154, em que o regime de IL-2 de dose elevada compreende 600.000 ou 720.000 IU/kg administrados como uma infusão intravenosa de bolus de 15 minutos a cada oito horas até tolerência.

[00923] 156. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 146 a 155, em que a terceira população de TILs em etapa (d) é uma população terapêutica de TILs que compreende uma subpopulação aumentada de células T efetoras e/ou células T de memória central com relação à segunda população de TILs, em que as células T efetoras e/ou células T de memória central na população terapêutica de TILs exibem uma ou mais características selecionadas a partir do grupo consistindo em

270 / 557 expressão de CD27+, expressão de CD28+, telômeros mais longos, expressão aumentada de CD57, e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras, e/ou células T de memória central obtidas a partir da segunda população de células.

[00924] 157. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 146 a 156, em que as células T efetoras e/ou células T de memória central na população terapêutica de TILs exibem expressão aumentada de CD57 e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas a partir da segunda população de células.

[00925] 158. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 146 a 157, em que o câncer é selecionado dentre o grupo consistindo em melanoma, câncer ovariano, câncer cervical, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer causado por vírus papiloma humano, câncer de cabeça e pescoço (incluindo carcinoma de célula escamosa de cabeça e pescoço (HNSCC)), câncer renal, e carcinoma de célula renal.

[00926] 159. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 146 a 158, em que o câncer é selecionado dentre o grupo consistindo em melanoma, HNSCC, canceres cervicais, e NSCLC.

[00927] 160. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 146 a 159, em que o câncer é melanoma.

[00928] 161. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 146 a 160, em que o câncer é HNSCC.

[00929] 162. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 146 a 161, em que o câncer é um câncer cervical.

[00930] 163. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 146 a 162, em que o câncer é NSCLC.

[00931] 164. Uma composição de crioconservação compreendendo a

271 / 557 população de TILs de acordo com qualquer uma das reivindicaçõe precedentes, um meio de crioconservação compreendendo dimetilsulfóxido (DMSO), e uma solução de eletrólitos.

[00932] 165. A composição de crioconservação de acordo com reivindicação 164, compreendendo adicionalmente um ou mais estabilizadores e um ou mais fatores de crescimento de linfócitos.

[00933] 166. A composição de crioconservação de acordo com reivindicação 165, em que o ou ou mais estabilizadores compreendem albumina sérica humana (HSA) e o ou ou mais fatores de crescimento de linfócitos compreendem IL-2.

[00934] 167. A composição de crioconservação de acordo com reivindicação 166, em que a composição opcionalmente compreende OKT-3.

[00935] 168. A composição de crioconservação de acordo com reivindicação 164, em que o meio crioprotetor compreendendo DMSO e a solução de eletrólitos estão presentes em uma razão de cerca de 1,1:1 a cerca de 1:1,1.

[00936] 169. A composição de crioconservação de acordo com reivindicação 168, em que o meio crioprotetor compreendendo DMSO e a solução de eletrólitos estão presentes em uma razão de cerca de 1:1.

[00937] 170. A composição de crioconservação de acordo com reivindicação 164, em que 100 mL da composição compreendem a população de TILs em uma quantidade de cerca de 1 × 106 a cerca de 9 × 1014; o meio crioprotetor compreendendo DMSO em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL, a solução de eletrólitos em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL; HSA em uma quantidade de cerca de 0,1 g a cerca de 1,0 g; e IL-2 em uma quantidade de cerca de 0,001 mg a cerca de 0,005 mg.

[00938] 171. A composição de crioconservação de acordo com reivindicação 164, em que 100 mL da composição compreende a população de TILs em uma quantidade de cerca de 1 × 107 a cerca de 1 × 1011; o meio

272 / 557 crioprotetor em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL, em que o meio crioprotetor compreende cerca de 10% DMSO; a solução de eletrólitos em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL; HSA em uma quantidade de cerca de 0,3 g a cerca de 0,7 g; e IL-2 em uma quantidade de cerca de 0,001 mg a cerca de 0,003 mg.

[00939] 172. A composição de crioconservação de acordo com reivindicação 164, em que 100 mL da composição consiste essencialmente na população de TILs em uma quantidade de cerca de 1 × 107 a cerca de 1 × 1011; o meio crioprotetor em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL, em que o meio crioprotetor consiste essencialmente em cerca de 10% DMSO; a solução de eletrólitos em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL; HSA em uma quantidade de cerca de 0,3 g a cerca de 0,7 g; e IL-2 em uma quantidade de cerca de 0,001 mg a cerca de 0,003 mg.

[00940] 173. A composição de crioconservação de acordo com reivindicação 164, em que a composição é para uso no tratamento de um indivíduo com câncer.

[00941] 174. Uma composição de crioconservação compreendendo a população de TILs, um meio crioprotetor compreendendo dimetilsulfóxido (DMSO), e uma solução de eletrólitos, em que 100 mL da composição compreende m a população de TILs em uma quantidade de cerca de 1 × 107 a cerca de 1 × 1011; o meio crioprotetor em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL, em que o meio crioprotetor compreende cerca de 10% DMSO; a solução de eletrólitos em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL; HSA em uma quantidade de cerca de 0,3 g a cerca de 0,7 g; e IL-2 em uma quantidade de cerca de 0,001 mg a cerca de 0,003 mg.

[00942] 175. Uma composição de crioconservação consistindo essencialmente na população de TILs, um meio crioprotetor compreendendo dimetilsulfóxido (DMSO), e uma solução de eletrólitos, em que 100 mL da composição consiste essencialmente na população de TILs em uma

273 / 557 quantidade de cerca de 1 × 107 a cerca de 1 × 1011; o meio crioprotetor em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL, em que o meio crioprotetor consiste essencialmente em cerca de 10% DMSO; a solução de eletrólitos em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL; HSA em uma quantidade de cerca de 0,3 g a cerca de 0,7 g; e IL-2 em uma quantidade de cerca de 0,001 mg a cerca de 0,003 mg.

[00943] 176. Uma bolsa de infusão compreendendo uma composição de crioconservação de acordo com qualquer uma das reivindicações 164 a

175.

[00944] 177. A bolsa de infusão of reivindicação 176, em que a bolsa de infusão é uma bolsa de infusão contendo HypoThermosol.

[00945] 178. Uma bolsa de armazenamento compreendendo uma composição de crioconservação de acordo com qualquer uma das reivindicações 164 a 175.

[00946] 179. A bolsa de armazenamento de reivindicação 178, em que a bolsa de armazenamento é uma bolsa de congelamento CryoStore CS750.

EXEMPLOS

[00947] As modalidades aqui incluídas são agora descritas com referência aos exemplos a seguir. Estes exemplos são dados apenas para fins ilustrativos e a invenção aqui incluída não deve, de forma alguma, ser interpretada como sendo limitada a esses exemplos, mas, ao contrário, deve ser interpretada para englobar toda e qualquer variação que se torne evidente como um resultado dos ensinamentos aqui apresentados. EXEMPLO 1: TESTES DE SISTEMA FECHADO

[00948] Como discutido aqui, protocolos e testes foram desenvolvidos para gerar TILs a partir de tumores de pacientes em um sistema fechado.

[00949] Este exemplo descreve um novo procedimento abreviado para gerar números clinicamente relevantes de TILs a partir de tecido tumoral resseccionado dos pacientes em dispositivos G-REX e crioconservação do

274 / 557 produto final da célula. Aspectos adicionais deste procedimento são descritos nos Exemplos 2 a 8. Definições/Abreviaturas

[00950] BSC - Armário com segurança biológica ºC – graus Celsius CO2 – Dióxido de carbono CD3 – Agrupamento de diferenciação 3 CM1 – Meio completo 1 CM2 – Meio completo 2 TIWB – Tampão de lavagem de isolamento de tumor CM4 – Meio completo 4 CRF – Congelador de taxa de controle EtOH - etanol GMP – Boas práticas de fabricação IL-2, rIL-2 –Interleucina-2, Interleucina 2 humana recombinante IU – Unidade internacional L - Litro LN2 – Nitrogênio líquido mL - mililitro µl - microlitro mM - milimolar µm - micrômetro NA – Não aplicável PBMC – Célula mononuclear de sangue periférico PPE – Equipamento de proteção pessoal pré-REP – Culturas iniciais de TILs se originando de fragmentos de tumor REP – Protocolo de expansão rápida

275 / 557 TIL – Linfócitos infiltrando os tumores TIWB – Tampão de lavagem de isolamento de TILs SOP – Procedimento de operação padrão Procedimento

1. Avançar preparação: Dia 0 (Realizar até 36 horas previamente)

[00951] 1.1. Preparar tampão de lavagem de isolamento de TILs (TIWB) por suplementação de 500 mL solução de sal equilibrada de Hanks com 50 µg/mL Gentamicina. A 10 mg/mL solução de carga de gentamicina, transferir 2,5 mL para HBSS. Para 50 mg/mL de solução de carga, transferir 0,5 mL para HBSS.

[00952] 1.2. Preparar meio CM1 com GlutaMaxTM por LAB-005 “Preparação de meio para pré-REP e REP” para instruções de CM2”. Armazenar a 4°C até 24 horas. Deixar aquecer a 37⁰C durante pelo menos 1 hora antes de uso.

[00953] 1.3. Remover alíquota(s) de IL-2 do congelador a -20°C e colocar alíquota(s) em refrigerador a 2-8°C.

2. Recebimento do tecido tumoral

[00954] 2.1. Manter toda a documentação recebida com tecido tumoral e obter fotos do recipiente de transporte e do tecido tumoral.

[00955] 2.2 Se o TempTale for provido impresso e salvo o documento associado; salvar em PDF.

[00956] 2.3 Remover a amostra de tumor e recipiente secundário (bolsa com zíper) do transportador e armazenar a 4°C até estar pronto para o processamento.

[00957] 2.4 Enviar o tumor não utilizado no HypoThermasol ou como fragmentos congelados em CryoStor CS10 (ambos disponíveis comercialmente de BioLife Soluções, Inc.).

3. Processamento de tumor para TIL

[00958] 3.1. Transferir de modo asséptico os seguintes materiais para

276 / 557 BSC, como necessário, e rotular de acordo com Tabela 3 abaixo. TABELA 3. Materiais para isolamento de tumor. Item Quantidade Rotulagem em processo mínima Tumor 1 N/A Placa de Petri, 150 mm 1 Dissecção Placa de Petri, 100 mm 4 Lavagem 1, 2, 3, 4 Placa de Petri, 100 mm 1 Tecido desfavorável Placa de 6 cavidades 2 Rótulo na tampa – “Fragmentos de tumor” Fundo da placa – “Tecido favorável” Régua 2 N/A Tampão de lavagem 1 N/A Fórceps 1 N/A Fórceps longo 1 N/A Bisturí Como N/A necessário

[00959] 3.2. Rotular os círculos das placas de fragmentos de tumor com as letras A-J.

[00960] 3.3. Rotular as partes de baixo das cavidades das placas de tecidos favoráveis com as letras A – J.

[00961] 3.4. Transferir 5 mL gentamicina para o frasco HBSS. Rotular o TIWB.

[00962] 3.5. Girar para misturar.

[00963] 3.6. Pipetar 50 mL TIWB a cada dos seguintes:

1. Placa de lavagem 1

2. Placa de lavagem 2

3. Placa de lavagem 3

4. Placa de lavagem 4

[00964] 3.7. Pipetar 2 mL TIWB em cavidades A-J da placa de tecido favorável.

[00965] 3.8. Cobrir as placas de tecidos favoráveis (fundo da placa de 6 cavidades) com as correspondentes placas de fragmentos de tumor (tampa da placa de 6 cavidades).

[00966] 3.9. Usando fórceps longos, remover os tumor(es) do frasco de espécimes e transferir para a placa de lavagem 1.

[00967] 3.10. Incubar o tumor em temperatura ambiente na placa de

277 / 557 lavagem 1 durante 3 minutos.

[00968] 3.11. Durante a incubação, rotular novamente o frasco de espécimes “Bioburden” e armazenar a 2-8°C até submeter a controle de qualidade para teste.

[00969] 3.12. Descartar os fórceps longos e usar fórceps curtos para outras manipulações.

[00970] 3.13. Usando fórceps, transferir o tumor para a placa de lavagem 2.

[00971] 3.14. Incubar o tumor em temperatura ambiente na placa de lavagem 2 durante 3 minutos.

[00972] 3.15. Usando fórceps, transferir o tumor para o placa de lavagem 3.

[00973] 3.16. Incubar o tumor em ambiente na placa de lavagem 3 durante 3 minutos.

[00974] 3.17. Remover as placas de fragmento de tumor (tampa da placa de 6 cavidades) das placas de tecidos favoráveis (fundo da placa de 6 cavidades) e colocar as placas de fragmentos de tumor com o lado de cima para baixo na superfície de BSC.

[00975] 3.18. Usando uma pipeta de transferência, adicionar aproximadamente 4 gotas individuais, regularmente espaçadas, de TIWB para cada círculo das placas de fragmentos de tumor.

[00976] 3.19. Colocar uma régua debaixo da placa de dissecação.

[00977] 3.20. Usando fórceps transferir o tumor para a placa de dissecação.

[00978] 3.21. Usando a régua sob a placa de dissecação, medir e registrar o comprimento do tumor.

[00979] 3.22. Para tumores maiores que 1 cm, adicionais placas de tecidos favoráveis foram feitos.

[00980] 3.23. Realizar uma inicial dissecção dos pedaços de tumor em

278 / 557 placa de dissecação em 10 pedaços intermediários e cuidado foi tomado para conservar a estrutura do tumor de cada pedaço intermediário.

[00981] 3.24. Transferir quaisquer pedaços intermediários de tumor não sendo ativamente dissecados em fragmentos para a placa de lavagem 4 para assegurar que o tecido permaneceu hidratado durante todo o procedimento de dissecção.

[00982] 3.25. Trabalhando com um pedaço intermediário de tumor de cada vez, cuidadosamente fatiar o tumor em fragmentos de até 3x3x3 mm na placa de dissecação, usando a régua debaixo da placa para referência. Quando bisturi se torna cego, substituir por um novo bisturi.

[00983] 3.26. Continuar dissecando os fragmentos a partir de pedaço intermediário de tumor até todo o tecido nos pedaço intermediário ter sido avaliado.

[00984] 3.27. Selecionar fragmentos favoráveis e usar uma pipeta de transferência transferindo até 4 fragmentos favoráveis nas gotas de TIWB em um círculo nos placas de fragmentos de tumor.

[00985] 3.28. Usando uma pipeta de transferência, transferir quaisquer restantes favoráveis fragmentos a partir de pedaço de tumor, quando disponível, para a cavidade correspondente na placa de tecido favorável.

[00986] 3.29. Usando uma pipeta de transferência, transferir tanto quanto possível do tecido desfavorável e produto residual para a placa de tecido desfavorável para limpar a placa de dissecção. Tecido desfavorável foi indicado por tecido adiposo amarelo ou tecido necrótico.

[00987] 3.30. Continuar processamento por repetição de etapas 7.3.25-

7.3.30 para os restantes pedaços intermediários de tumor, trabalhando um pedaço intermediário de cada vez até todo o tumor ter sido processado.

[00988] 3.31. Se menos do que 4 fragmentos de tumor foram disponíveis no correspondente círculo de placas de fragmentos de tumor, foi aceitável usar fragmentos de uma cavidade não correspondente da placa de

279 / 557 tecido favorável como disponível para obter o objetivo de 40 fragmentos. Quando menos do que 40 fragmentos, 10-40 foram colocados em um frasco G-Rex 100M único.

4. Semear frasco G-Rex 100M

[00989] 4.1. Assepticamente transferir os seguintes materiais para BSC, como necessário, e rotular de acordo com a tabela 4 abaixo. TABELA 4. Materiais adicionais para semear os frascos. Item Quantidade mínima Rótulo em Processo frasco G-Rex 100M Como necessário Lote# CM1 quente Como necessário Lote# Alíquotas de IL-2 Como necessário Lote#

[00990] 4.2. Suplementar cada litro de CM1 com 1 mL de solução de estocar de IL-2 (6 × 106 IU/mL).

[00991] 4.3. Colocar 1000 mL de CM1 pré-aquecido contendo 6.000 IU/mL de IL-2 em cada biorreator G-REX 100M necessário como determinado por Tabela 5 abaixo.

[00992] 4.4. Usando uma pipeta de transferência, transferir o número apropriado de fragmentos de tumor para cada frasco G-Rex 100M, distribuindo fragmentos por Tabela 5.

[00993] 4.5. Quando um ou mais fragmentos de tumor transferidos para o frasco G-Rex 100M flutua, obter um adicional tumor fragmento se disponível da placa de tecido favorável e transferir o mesmo para o frasco G- Rex 100M.

[00994] 4.6. Registrar o número total de fragmentos adicionados a cada frasco.

[00995] 4.7. Descartar a placa de tecido desfavorável.

[00996] 4.8. Colocar cada biorreator G–REX 100M em 37°C, 5% CO2 incubador.

[00997] 4.9. Quando mais do que 40 fragmentos estão disponíveis:

4.9.1. Quando >41 fragmentos foram obtidos, colocar 1000 mL de CM1 pré-aquecido completo em um segundo biorreator G-REX 100M.

280 / 557 TABELA 5. Número de biorreatores G-REX necessários. Número de G-REX Número de CM1 necessário Fragmentos G-REX 1-40 G-REX 100M 1 1000 mL 41-80 distribuídos G-REX 100M 2 2000 mL entre frascos >80 Congelar fragmentos em CS10 após 15 minuto pré-incubação

5. Avançar preparação: Dia 11 (Preparar até 24 horas previamente)

[00998] 5.1. Preparar 6 L de CM2 com GlutaMax. Usar procedimentos de laboratório de referência para “Preparação de meio para pré-REP e REP” por instruções CM2”. Aquecer a 37°C 1 hora antes de uso.

[00999] 5.2. Descongelar alíquotas de IL-2: Remover alíquotas de IL-2 do congelador e colocar a 4°C.

6. Coletar TIL (Dia 11)

[001000] 6.1. Cuidadosamente remover os frascos G-REX -100M de incubadora e colocar em BSC2. Cuidado para não perturbar as células no fundo do frasco.

[001001] 6.2. Usando GatherRex ou bomba peristáltica, aspirar ~900 mL de sobrenadante de cultura celular de frasco(s).

[001002] 6.3. Recolocar em suspensão TIL por agitando suavemente o frasco. Observar que todas as células foram liberadas a partir de membrana.

[001003] 6.4. Usando bomba peristáltica ou GatherRex, transferir a residual suspensão de células em um pacote de transferência de sangue de tamanho apropriado (300-1000mL). Com cuidado não permitir que os fragmentos sejam transferidos para o pacote de transferência de sangue.

[001004] 6.5. Contaminar um pacote de transferência com um conjunto de transferência de plasma de 4” (assegurar que o grampo esteja fechado).

[001005] 6.6. Massagear o pacote para assegurar que a suspensão de células bem misturada e usar uma seringa de 3 mL, remover 1 mL de suspensão de TILs para contagens celulares. Prender o tubo e conectar novamente o conector luer fêmea com uma nova tampa estéril.

281 / 557

[001006] 6.7. Colocar o pacote de transferência em uma bolsa plástica com fecho zíper e substituir na incubadora até ficar pronto para uso.

7. Preparação do meio

[001007] 7.1. Deixar o meio aquecer a 37°C durante >1h.

[001008] 7.2. Adicionar 3 mL de 6x106 IU/mL carga rhIL-2 a 6 L CM2 para alcançar uma concentração final de 3.000 IU/mL rhIL-2. Rotular como “CM2 completo”.

[001009] 7.3. Soldar de modo estéril um conjunto de transferência de plasma 4” com conector luer fêmea a um pacote de transferência de 1L.

[001010] 7.4. Transferir 500mL CM2 completo a um pacote de transferência de 1L. Destacar conjunto de transferência de fluido ou seringa e fixar um tampão luer estéril ao orifício do conector luer fêmea.

[001011] 7.5. Pregar o pacote com um acoplador no local da amostra.

[001012] 7.6. Usando uma seringa de 1,0mL, com agulha, recuar 150 µL de 1 mg/mL anti-CD3 (clone OKT3) e transferir para um “CM2 completo” de 500 mL através do acoplador do local de amostra. Recuar de volta a seringa para assegurar que todo o reagente foi lavado a partir da linha. Armazenar a 37°C até uso.

8. Preparação do frasco

[001013] 8.1. Transferir 4,5L “CM2 completo” a um frasco G-REX - 500M usando as graduações no frasco para referência.

[001014] 8.2. Colocar frasco em incubadora a 37°C até ficar pronto.

9. Descongelar alimentadoras irradiadas

[001015] 9.1. Utilizar 5,0 × 109 alimentadoras irradiadas alogênicas de dois ou mais doadores para uso.

[001016] 9.2. Remover alimentadoras de congelador LN2 e colocar em uma bolsa de transporte de risco biológico.

[001017] 9.3. Com bolsas de alimentadoras na bolsa de transporte de risco biológico, descongelar alimentadoras em incubadora a 37°C ou banho.

282 / 557 Manter bolsas estáticas e submersas. Remover alimentadoras do banho quando quase completamente descongelados, mas ainda frias.

[001018] 9.4. Pulverizar ou varrer bolsas de alimentadoras com 70% EtOH e colocar em BSC2. Adicionar cada bolsa de alimentadoras diretamente para o G-Rex 500M aberto para assegurar número suficiente de células irradiadas (5x109 células, +/- 20%).

[001019] 9.5. Fechar ambos os grampos em um conector tipo Y fenwal com trava luer macho.

[001020] 9.6. Pregar cada bolsa de alimentadoras com uma perna do conector Y.

[001021] 9.7. Remover pacote de transferência de 1L com 500 mL “CM2 completo” + OKT3 e transferir BSC.

[001022] 9.8. Assepticamente fixar uma seringa de 60mL a um torneira de 3 vias, e assepticamente fixar um pacote de transferência para a extremidade macho da torneira.

[001023] 9.9. Assepticamente fixar o conector Y à torneira de 3 vias.

[001024] 9.10. Aspirar o conteúdo completo da bolsa de alimentadoras na seringa, registrar o volume, e distribuir 5,0 × 109 alimentadoras irradiadas alogênicas em um pacote de transferência.

[001025] 9.11. Grampear e destacar pacote de transferência do aparelho, e travar o conector luer fêmea com um novo tampão luer estéril.

[001026] 9.12. Usando uma agulha e seringa de 3 mL, retirar 1 mL para contagens celulares a partir de acoplador do local de amostra.

[001027] 9.13. Quando +/- 10% do número de células alvo (5,0 × 109) foi alcançado com >70% viabilidade, prosseguir.

[001028] 9.14. Quando menos do que 90% do número de células alvo (5,0 × 109) foi alcançado com >70% viabilidade, descongelar outra bolsa e repetir 7.9.4-7.9.12. Quando mais do que 110% do número de células alvo foram obtidos, calcular o volume apropriado requerido para a dose de células

283 / 557 desejada e prosseguir.

10. Co-cultura de TIL e alimentadoras em frascos G-REX 500M

[001029] 10.1. Remover o frasco G-REX 500M contendo meio preparado a partir de incubadora e colocar no BSC2.

[001030] 10.2. Fixar pacote de transferência da alimentadora para G- REX -500M e deixar conteúdo da bolsa drenar em 500M.

[001031] 10.3. Remover suspensão de TIL a partir de incubadora e colocar no BSC.

[001032] 10.4. Calcular volume de suspensão de TILs a adicionar para obter 200 × 106 células viáveis totais. (TVC/mL) / 200 x 106 = mL

[001033] 10.5. Quando TILs estavam entre 5-200 × 106 células viáveis totais, adicionar todo o TIL (volume total) para o G-REX -500M. Quando a contagem de TIL foi maior que 200 × 106 células viáveis totais, adicionar volume calculado necessário para 200 × 106 TIL serem distribuídos a um individual G-REX -500M. Restantes TILs foram centrifugados e congelados em pelo menos dois criofrascos em até 108/mL em CS10, rotulados com identificação e data, e os TILs congelados.

[001034] 10.6. Colocar o G-REX -500M em uma incubadora a 37°C, 5% CO2 durante 5 dias.

11. Avançar preparação: Dia 16-18

[001035] 11.1. Aquecer 1 bolsa de 10L de AIM V para culturas iniciadas com menos do que 2 TILs 50 × 106 aquecidos para os iniciados com mais do que 50 × 106 TIL a 37°C pelo menos 1 h ou até pronto para uso.

12. Realizar a contagem celular de TILs: Dia 16-18

[001036] 12.1. Remover frasco G-REX -500M da incubadora e colocar em BSC2. Cuidado para não perturbar a cultura celular no fundo do frasco.

[001037] 12.2. Assepticamente remover 4 L de meios de cultura celular a partir de frasco G-REX -500M e colocar em um recipiente estéril.

284 / 557

[001038] 12.3. Agitar o G-REX -500M até todos os TILs terem sido recolocados em suspensão a partir de membrana.

[001039] 12.4. Usando GatherRex ou bomba peristáltica, transferir suspensão de células a um 2L pacote de transferência. Reter o frasco de 500M para uso posterior. Selar o orifício com o acoplador do local de amostra para evitar perda de TILs.

[001040] 12,5 Pregar o pacote de transferência com um acoplador do local da amostra e usar uma seringa de 3mL e agulha para remover amostras independentes de 2×1 mL para uma contagem celular.

[001041] 12.6. Calcular o número total de frascos requeridos durante subcultura de acordo com a seguinte fórmula. Arredondar as frações. células viáveis totais / 1,0 x109 = frasco #

13. Preparar CM4

[001042] 13.1. Preparar uma bolsa de 10L AIM-V para cada um de dois frascos de 500M necessários. Aquecer meio adicional, como necessário.

[001043] 13.2. Para cada 10 L de AIM-V necessário, adicionar 100 mL de GlutaMAX para obter CM4.

[001044] 13.3. Suplementar meio CM4 com rhIL-2 para uma concentração final de 3.000 IU/mL rhIL-2.

14. Dividir a cultura celular

[001045] 14.1. Usando as graduações no frasco, encher por gravidade cada G-REX -500M a 5 L.

[001046] 14.2. Distribuir uniformemente o volume de TILs entre o número calculado de G-REX -500Ms.

[001047] 14.3. Colocar frascos em uma incubadora a 37°C e 5% de CO2 até coleta em Dia 22 REP.

15. Avançar preparação: Dia 22-24

[001048] 15.1. Preparar 2L de tampão de lavagem a 1% HSA por adição de 40mL de 25% HSA a cada uma das duas bolsas de 1L de PlasmaLyte A

285 / 557

7.4. Reunir em uma bolsa auxiliar LOVO.

[001049] 15.2. Suplementar 200 mL CS10 com IL-2 @ 600 IU/mL.

[001050] 15.3. Pre-resfriar quatro vasilhas de alumínio de 750 mL para congelador a 4°C.

16. Coletar TIL: Dia 22-24

[001051] 16.1. Remover os frascos G-REX -500M a partir de incubadora a 37°C e colocar no BSC2. Cuidado para não perturbar a cultura celular no fundo do frasco.

[001052] 16.2. Aspirar e descartar 4,5 L de sobrenadante de cultura celular de cada frasco.

[001053] 16.3. Girar o frasco G-REX -500M para completamente colocar em suspensão o TIL.

[001054] 16.4. Pesar a bolsa de bioprocesso de 3-5 L antes de uso.

[001055] 16.5. Usando GatherRex ou bomba peristáltica, coletar TIL na bolsa de bioprocesso.

[001056] 16.6. Misturar a bolsa bem e usar uma seringa de 3mL, tomar amostras de 2 × 2 mL a partir do orifício da seringa para contagem das células.

[001057] 16.7. Pesar a bolsa e verificar a diferença entre o peso inicial e o final. Usar os seguintes cálculos para determinar o volume de suspensão de células. Peso líquido de suspensão de células (mL) / 1,03 = volume (mL)

17. Filtrar TIL e preparar a bolsa Fonte LOVO

[001058] 17.1. Colocar a bolsa contendo cultura celular no BSC2.

[001059] 17.2. Colocar um filtro de sangue de 170 µm no BSC2 e fechar todos os grampos.

[001060] 17.3. Soldar de modo estéril uma bolsa Fonte do filtro para a suspensão de células.

[001061] 17.4. Pesar uma nova bolsa de bioprocesso de tamanho

286 / 557 apropriado (referido como a bolsa Fonte LOVO).

[001062] 17.5. Soldar de modo estéril a extremidade terminal do filtro para a bolsa LOVO.

[001063] 17.6. Elevar a suspensão de células pendurando as células em suporte de soro IV para estabelecer uma transferência de fluxo por gravidade das células.

[001064] Nota: (não deixar a bolsa pendurar do aparelho de filtração.)

[001065] 17.7. Abrir todos os grampos necessários e deixar TIL drenar a partir da bolsa de suspensão de células através do filtro e para a bolsa LOVO.

[001066] 17.8.Uma vez que todas as células foram transferidas para a bolsa Fonte LOVO, fechar todos os grampos e vedar os tubos da bolsa Fonte LOVO para remover o filtro.

[001067] 17.9. Pesar a bolsa Fonte LOVO e calcular o volume.

[001068] 17.10. A bolsa Fonte LOVO está pronta para o LOVO.

[001069] 17.11. Remover a bolsa de produto final LOVO do kit descartável para vedar o tubo perto da bolsa.

18. Formular TIL 1:1 em CS10 frio suplementado com 600 IU/mL rhIL-2

[001070] 18.1. Calcular número requerido de criobolsas necessário. (volume de produto de células x 2 ) / 100 = número de bolsas requeridas (arredondado)

[001071] 18.2. Calcular o volume a distribuir em cada bolsa. (volume de produto de células x 2) / número de bolsas requeridas = volume a adicionar a cada bolsa

[001072] 18.3. Assepticamente transferir os seguintes materiais em Tabela 6 para o BSC. TABELA 6. Materiais para a crioconservação de TIL. Quantidade Rótulo em processo Item mínima Produto de células 1 Lote# Cassete de alumínio do congelador (750 1 n/a ml) Como CS10 frio + IL-2 @600IU/mL Lote# necessário

287 / 557 dispositivo CC1 Cell Connect 1 n/a criobolsas de 750 mL calculado alíquotas 1- maior# seringa de 100 mL #criobolsas +1 n/a torneira de 3 vias 1 n/a Criofrascos 5 frascos tipo satélite crio-produto de TILs

19. Formulação de TILs

[001073] 19.1. Fechar todos os grampos em Cell Connect CC1.

[001074] 19.2. Ao dispositivo de conexão de células, fixar assepticamente o produto final LOVO, travar a bolsa luer de CS10 e o número apropriado de criobolsas. Recolocar a seringa de 60 mL com uma de 100 mL.

[001075] 19.3. A quantidade de CS10 volume necessário foi equivalente ao volume do bolsa de produto final LOVO.

[001076] 19.4. Abrir a via da torneira e destravar a linha entre a bolsa de produto final LOVO e seringa de modo a puxar CS10 para dentro da seringa, retravar a via CS10. Destravar a via para a bolsa de células para empurrar h CS10 dentro da bolsa de produto final LOVO. Usar a seringa para medir o volume adicionado à bolsa de produto final LOVO. Repetir como necessário usando uma nova seringa até a quantidade desejada de CS10 ser transferida.

[001077] 19.5. Misturar a bolsa de produto final LOVO por inversão.

[001078] 19.6. Substituir a seringa de 100 mL.

[001079] 19.7. Abrir os grampos nas criobolsas de 750 mL uma de cada vez.

[001080] 19.8. Abrir somente os grampos que estão diretamente associados com o produto formulado e a criobolsa em uso.

[001081] 19.9. Usar a seringa de 100 mL para medir o volume de produto formulado levando à criobolsa.

[001082] 19.10. Transferir 100 mL de produto formulado em cada criobolsa.

[001083] 19.11. Após adição de cada bolsa, puxar de volta a seringa para remover todas as bolhas de ar das criobolsas e fechar de novo o grampo na linha associada.

[001084] 19.12. Na bolsa final, puxar de volta um retido de 10 mL para

288 / 557 teste QC.

[001085] 19.13. Selar cada criobolsa, deixando um pequeno tubo, como possível.

[001086] 19.14. Remover a seringa contendo a amostra retida e transferir para um tubo cônico de 50mL; transferir 1,5 ml em criofrascos individuais e congelar em um congelador de taxa controlada.

[001087] 19.15. Transferir bolsas vedadas a 4°C enquanto os rótulos foram preparados.

[001088] 19.16. Rotular cada criobolsa com descrição do produto, nome e data, volume, contagem celular e viabilidade.

[001089] 19.17. Colocar cada criobolsa em vasilhas de alumínio pré- resfriadas no congelador.

20. Crioconservação de TIL usando congelador de taxa de controle (CRF)

[001090] 20.1. Seguir procedimento padrão para o congelador de taxa controlada.

[001091] 20.2. Após usar CRF, armazenar criobolsas em nitrogênio líquido(LN2).

[001092] 21. Determinar resultados esperados e medir os critérios de aceitação. EXEMPLO 2: Processo realizado em 8 tumores de paciente

[001093] O processo de Exemplo 1 foi realizado usando 8 tumores de pacientes para produzir 8 bateladas de TILs. Boa recuperação da cultura, viabilidade, contagens celulares, liberação de CD3+ (indicando a % de teor de células T) e IFN-gama (IFN-g ou IFN-γ) foram obtidos, como mostrado em Tabela 7 abaixo e em Figura 7 até Figura 10. TABELA 7. Resultados de teste de identidade, potência, e viabilidade/recuperação do processo de Exemplo 1.

289 / 557 EXEMPLO 3: ESCALABILIDADE DE PROCESSOS MODIFICADORES DE TILs

[001094] Os estudos aqui apresentados foram realizados em um laboratório de desenvolvimento de processos (PD) e, posteriormente, um estudo de qualificação de processos (PQ) utilizando ciclos de engenharia foi realizado no conjunto de salas limpas GMP em uma instalação de fabricação. Três ciclos de PQ/engenharia foram concluídos na sala limpa das instalações de GMP de acordo com um protocolo de qualificação e um registro de lote com base nos estudos de PD aqui apresentados. Os critérios de aceitação para os ciclos de engenharia foram definidos prospectivamente. O estudo de PQ é resumido adicionalmente abaixo, e os resultados dos testes obtidos para os lotes de engenharia são dados nas seções a seguir.

[001095] O número de células geradas a partir de culturas de protocolo de pré-expansão rápida (pré-REP) frequentemente excedia 100 × 106 células viáveis. Além disso, a inclusão de um ciclo de congelamento e descongelamento entre as etapas de cultura pré-REP e REP reduziu o rendimento viável das células. Ao eliminar a etapa de crioconservação em processo, a REP poderia ser iniciada de modo confiável e regular com um número aumentado de TILs. Essa mudança permitiu diminuir a duração da

290 / 557 REP em uma quantidade proporcional de tempo de duplicação de células para aproximadamente 11 dias sem impactar a dose de células. Além disso, o tempo de cultura reduzido, da ativação até a coleta, resulta em um produto menos diferenciado e potencialmente melhor, capaz de persistir in vivo (Tran 2008).

[001096] O estudo de PD validou o início da cultura REP com até 200 × 106 células com um número fixo de células alimentadoras. O momento ideal para a coleta da cultura REP foi então avaliado durante 9 a 14 dias. As culturas foram semeadas nas razões alimentador para TIL na faixa de 100:1 a 25:1. A otimização do tempo de coleta foi determinada medindo a contagem total de células, viabilidade, imunofenótipo, consumo de meio, análise de metabólitos, análise de interleucina-2 (IL-2) e as análises funcionais descritas abaixo.

[001097] A imunofenotipagem de células no final da cultura REP foi avaliada com base nos marcadores listados na Tabela 8 abaixo. O estado de ativação e diferenciação fenotípica das células foi avaliado. Não foram observadas diferenças estatísticas no fenótipo entre nenhuma das condições experimentais. TABELA 8. Marcadores de ativação e diferenciação testados em culturas de otimização de processo. Alvo Rótulo para detecção Clone Painel 1 TCRab (isto é, TCRα/β) PE/Cy7 IP26 CD57 PerCP-Cy5.5 HNK-1 CD28 PE CD28,2 CD4 FITC OKT4 CD27 APC-H7 M-T271 CD56 APC N901 CD8a PB RPA-T8 Painel 2 CD45RA PE/Cy7 HI100 CD3 PerCP/Cy5.5 SP34-2 CCR7 PE 150503 CD8 FITC HIT8 CD4 APC/Cy7 OKT4 CD38 APC HB-7 HLA-DR PB L243 Painel 3 CD137 PE/Cy7 4B4-1 CD3 PerCP/Cy5.5 SP34-2

291 / 557 Alvo Rótulo para detecção Clone Lag3 PE 3DS223H CD8 FITC HIT8 CD4 APCCy7 OKT4 PD1 APC EH12,2H7 Tim-3 BV421 F38-2E2 Abreviaturas: PE/Cy7=Ficoeritrina: Cy-7 Conjugado em tandem; PerCP-Cy5.5= complexo peridinina- clorofila-proteína: conjugado CY5.5; PE=Ficoeritrina; FITC= conjugado isotiocianato de fluoresceína; APC-H7=Aloficocianina:H7 Conjugado em tandem; APC=Aloficocianina; PB=Pacific Blue™

[001098] Consumo de meio e produção de metabólitos permaneceu dentro de limites toleráveis para todas as condições testadas; e os níveis de IL-2 permaneceram maiores que 150 IU/mL de sobrenadante de cultura (dados não mostrados).

[001099] Morte de células tumorais por células T é entendida como sendo mediada por ativação do receptor de células T nas células T efetoras em resposta a peptídeos apresentados sobre a superfície de células de tumor. Células T ex vivo expandidas devem reter a capacidade de serem ativadas e proliferar em resposta a ativação TCR se elas devem persistir in vivo quando da infusão e mediar a regressão do tumor.

[001100] Para avaliar a ativação potencial das células cultivadas, TILs coletados em diferentes pontos de tempo foram reativados com PBMCs irradiadas alogênicas carregadas com OKT3. As culturas de TILs foram coletadas após 7 dias e testadas para expansão de vezes. Os resultados deste estudo são resumidos em Tabela 9. TABELA 9. Sumário de Resultados: Proliferação de TIL pós-REP quando de nova cultura com PBMCs irradiadas alogênicas OKT3 carregadas. Valor P Coletar Dia Vezes expansão SD (Teste ‘t’ Student) Experimento 1 Dia 9 43 6,088 NA Dia 10 48 3,105 NA Dia 11 71 11,137 0,135 Dia 14 60 6.995 Experimento 2 Dia 9 44 6,276 NA Dia 10 27 4,762 NA Dia 11 72 18,795 0,045 Dia 14 41 7,050 Experimento 3 Dia 9 54 5,810 NA Dia 10 54 9,468 NA Dia 11 65 1,674 0,071 Dia 14 50 8,541

292 / 557

[001101] Este estudo demonstrou que o potencial de ativação dos TILs nesse teste aumentou a cada dia de cultura até o dia 11 (dias de coleta 9 a 11). As células coletadas no dia 11 do processo modificado tiveram desempenho semelhante ao controle de TIL mantido em cultura por 14 dias, similar ao processo atual.

[001102] Esses estudos demonstraram a escalabilidade do processo de TILs modificados e estabeleceram uma faixa aceitável de taxas de semeadura de TILs para células alimentadoras. Além disso, as características de crescimento persistiram até o dia 14 da cultura, enquanto as condições de cultura permaneceram ótimas até o dia 11. As condições testadas não mostraram efeito mensurável no fenótipo de TILs. As células coletadas no dia 11 da cultura REP demonstraram a melhor capacidade de responder à reativação enquanto as condições da cultura celular permaneceram dentro das tolerâncias. Essas alterações foram adotadas e validadas em grande escala, com a divisão da cultura ocorrendo no dia 5 e a coleta no dia 11.

[001103] Os ciclos de engenharia foram implementados nas instalações de desenvolvimento de processos, a fim de obter experiência na fabricação e teste do produto TILs antes da fabricação GMP de produto de TIL autólogo para administração aos pacientes. O procedimento de fabricação usado para os ciclos de engenharia estava na mesma escala que o usado na fabricação do produtos TILs de GMP. A experiência no crescimento de TILs a partir de vários tipos de tumores, incluindo metástases de melanoma, carcinoma de célula escamosa de cabeça e pescoço (HNSCC), mama, carcinoma cervical e câncer de pulmão determinou que a dissecção e crescimento de TILs a partir de amostras de tumores metastáticos são semelhantes para esses tipos de câncer. (Sethuraman 2016, JITC P42). Como o isolamento inicial dos fragmentos tumorais e o crescimento de linfócitos parecem ser similares entre as histologias tumorais, estes ciclos de engenharia são suficientes para qualificar o processo para a produção de TILs a partir de tumores HNSCC,

293 / 557 cervicais e de melanoma.

[001104] A Tabela 10 mostra a Fonte e as características das amostras de tumor usadas para os ciclos de engenharia. TABELA 10. Amostras de tumores testado para ciclos de engenharia. Amostra de tumor Ciclo de engenharia 1 Ciclo de engenharia 2 Ciclo de engenharia 3 Paciente ID 1001185 600-D455 40231 Fonte Biotheme Research BioOptions Moffitt Tecido Pulmão, esquerdo Mama, ERPR+Her2- Melanoma Data processado 5 Jan, 2017 12 jan, 2017 26 Jan, 2017

[001105] Teste de liberação dos três ciclos de engenharia de TIL na instalação de desenvolvimento de processo foi completado (Tabela 11) como descrito abaixo. Produto foi testado em Dia 16 e Dia 22. Secreção de IFN-γ também foi determinada para os três ciclos de engenharia (Tabela 12) como detalhado em algum ponto abaixo. TABELA 11. Resultados do teste de liberação de produto para os ciclos de engenharia na instalação de desenvolvimento de processo. Parâmetro Método de Critérios de Ciclos de engenharia teste aceitação Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3 Dia 16 Esterilidade* BacTAlert Sem Sem Sem Sem crescimento crescimento crescimento crescimento Micoplasma PCR Negativo de Negativo Negativo Negativo divisão Dia 7 Dia 22 Viabilidade (%) AOPI ≥ 70% 82,3% 85,13% 84.6% Células viáveis AOPI Relatar 2,6 x 1010 1 x 1010 1,4 x 1011 totais resultados Esterilidade Gram- Negativo Negativo Negativo Negativo coloração Esterilidade BacT/Alert Sem Negativo Negativo Pendente Produto final* crescimento % CD45+CD3+ citometria de ≥ 90% 99,3% 96,3% 99,8% fluxo Endotoxina EndoSafe ≤ 0,7 EU/mL <0,5 EU/mL <0,5 EU/mL <0,5 EU/mL Micoplasma PCR Negativo Negativo Negativo Negativo Produto final Aparência Inspecção Bolsa intacta Bolsa intacta, Bolsa intacta, Bolsa intacta, visual sem grumos sem grumos sem grumos sem grumos visíveis visíveis visíveis visíveis * Resultados finais de esterilidade para Dia 16 e Dia 22 não são disponíveis até depois da liberação final do produto para expedição. Os resultados de gram-coloração de Dia 22 são usados para a liberação da expedição com esterilidade.

TABELA 12. Caracterização funcional adicional: Medição de secreção de IFN-γ.

294 / 557 Resultados Ciclo de engenharia Caracterização funcional Método esperados Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3 Estimulação IFN-γ com anti- >2 desvios padrão 3085 +/- 2363 +/- CD3, CD28, CD137 (pg/milhão ELISA sobre os não pendente 182 437 células) estimulados IFN-γ não-estimulados ELISA Não aplicável 34 +/- 5 27 +/- 10 pendente (pg/milhão células)

[001106] Em conclusão, os dados a partir dos ciclos de engenharia demonstram que o produto de fármaco TILs pode ser fabricado para a finalidade de administração autóloga para os pacientes. EXEMPLO 4: Linfodepleção

[001107] As contagens de células podem ser obtidas no dia 7 e antes da conclusão da linfodepleção. O produto final da célula incluiu até aproximadamente 150 × 109 células viáveis formuladas em um mínimo de 50% de HypoThermosol ™ em Plasma-Lyte A™ (volume /volume) e até 0,5% de HSA (compatível para infusão humana) contendo 300 UI/mL IL2. O produto final estava disponível para administração em um dos dois volumes para infusão: 1) 250 mL (em uma bolsa de infusão de capacidade de 300 mL) quando o total de TILs coletados for ≤ 75 × 109

OU 2) 500 mL (em uma bolsa de infusão de capacidade de 600 mL) quando o total de TILs coletados for <150 × 109

[001108] O número total de células que podem ser geradas para o produto final de infusão de TIL para cada paciente devido à variação de paciente para paciente nas taxas de expansão de células T durante a etapa REP não pode ser previsto. Um limite mais baixo de células nos dias 3, 4, 5, 6, 7 de REP de 3 a 14 dias é estabelecido com base no número mínimo de células necessárias para tomar uma decisão de linfodepletar o paciente usando o regime de quimioterapia com ciclofosfamida mais fludarabina. Depois de ter começado a linfodepleção com base nesse número mínimo de células, os requerentes estão comprometidos em tratar o paciente com o número disponível de TILs que foi gerado no REP em qualquer um dos dias 3 a 14 e,

295 / 557 em muitos casos, no dia 7. O limite superior da faixa para infusão (células viáveis de 150 × 109) é baseado no limite superior publicado conhecido, infundido com segurança, onde uma resposta clínica foi alcançada. Radvanyi et al, Clin Cancer Res 2012, 18, 6758-6770. EXEMPLO 5: Processo 2A – Dia 0

[001109] Este exemplo descreve o protocolo detalhado do dia 0 para o processo 2A descrito em Exemplos 1 a 4. Preparação.

[001110] 1. Confirmar meio de lavagem de tumor, CM1, e IL-2 estão dentro do prazo de validade.

[001111] 2. Colocar CM1 (meio de células 1) em incubador. Método.

[001112] 1. Limpar o armário de segurança biológica (BSC).

[001113] 2. Estabelecer as placas de vigilância em processo e deixar em armário de segurança biológica durante 1-2 horas durante procedimento.

[001114] 3. Colocar o meio de TILs CM1 no armário de segurança biológica.

[001115] 4. Preparar meios de TILs CM1 contendo 6000 IU/mL IL-2:

4.1 1L CM1

4.2 1ml IL-2 (6.000.000 IU/mL)

4.3 Colocar 25ml de CM1+IL2 em tubos cônicos de 50ml a ser usado para fragmentos quando adicionando a G-REX

4.4 Colocar em incubadora a 37°C para pré-aquecer

[001116] 5. Limpar o pacote G-REX 100MCS com álcool a 70% e colocar em armário de segurança biológica. Fechar todos os grampos exceto linha de filtro.

[001117] 6. Realizar calibração da bomba Acácia.

[001118] 7. Fixar a linha vermelha do frasco G-REX 100MCS à linha de saída da partida da bomba Acacia.

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[001119] 8. Fixar bomba pneumática na linha de entrada da bomba e colocar frasco com meio. Liberar os grampos para iniciar a bomba.

[001120] 9. Bombear os restantes 975 ml de CM1 pré-aquecido contendo 6.000 IU/ml de IL-2 em cada biorreator G-REX 100MCS.

[001121] 10. Aquecer a linha vermelha de vedação, desconectar da partida da bomba.

[001122] 11. Colocar rótulo em G-REX.

[001123] 12. Colocar G-REX 100MCS em incubadora até necessário. Dissecação de tecido

[001124] 1. Registrar o tempo de início para o processamento de tumor.

[001125] 2. Transferir meio de lavagem de tumor para BSC.

[001126] 3. Colocar 5 placas de petri de 100 mm em armário de segurança biológica, 3 para lavagens, 1 para manutenção e 1 para tecido não favorável. Rotular placas consequentemente. Tecido desfavorável foi indicado por tecido adipose amarelo ou tecido necrótico.

[001127] 4. Colocar três placas de 6 cavidades em armário de segurança biológica.

[001128] 5. Pipetar 3-5 mL de meio de lavagem de tumor em cada cavidade de uma placa seis cavidades para pedaços de tumor em excesso.

[001129] 6. Pipetar 50 mL de meio de lavagem de tumor para lavar os placas 1-3 e placa de manutenção.

[001130] 7. Colocar dois placas de 150 mm de dissecção no armário de segurança biológica.

[001131] 8. Colocar 3 tubos cônicos estéreis de 50 mL no BSC.

[001132] 9. Rotular um como fórceps do meio de lavagem de tumor, o segundo como bisturi do meio de lavagem de tumor, e o terceiro para meio de lavagem de tumor usado para as gotas da tampa.

[001133] 10. Adicionar 5-20 mL de meio de lavagem de tumor para cada tubo cônico. Os fórceps e bisturis foram imersos no meio de lavagem de

297 / 557 tumor como necessário para o processo de lavagem e dissecção do tumor.

[001134] 11. Colocar bisturi e fórceps em tubos apropriados.

[001135] 12. Usando fórceps longos, remover o(s) tumor(es) a partir de frasco de espécimes e transferir para a placa de lavagem 1.

[001136] 13. Incubar o tumor em ambiente na placa de lavagem 1 durante ≥3 minutos.

[001137] 14. Durante a incubação, re-rotular o frasco de espécimes “Biocarga” e armazenar a 2-8°C até a coleta final ou outro teste de esterilidade ser requerido.

[001138] 15. Usando fórceps, transferir o tumor para o placa de lavagem

2.

[001139] 16. Incubar o tumor em ambiente na placa de lavagem 2 durante ≥3 minutos.

[001140] 17. Durante a incubação, usar uma pipeta de transferência, adicionar aproximadamente 4 gotas individuais, regularmente espaçadas, de meio de lavagem de tumor para cada círculo das tampas da placa de 6 cavidades designadas coma placas de fragmentos de tumor.

[001141] 18. Usando fórceps, transferir o tumor para o placa de lavagem

3.

[001142] 19. Incubar o tumor em ambiente na placa de lavagem 3 durante ≥3 minutos.

[001143] 20. A tampa da placa de 150 mm foi usada para dissecção. Colocar uma régua debaixo.

[001144] 21. Usando fórceps, transferir o tumor para o placa de dissecação, medir e registrar o comprimento do tumor.

[001145] 22. Tirar uma fotografia do tumor.

[001146] 23. Realizar uma dissecção inicial dos pedaços de tumor no placa de dissecação em pedaços intermediários cuidando para conservar a estrutura do tumor de cada pedaço intermediário.

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[001147] 24. Transferir quaisquer pedaços intermediários de tumor não sendo ativamente dissecados em fragmentos para o disco de manutenção de tecido para assegurar que o tecido permaneceu hidratado durante todo o procedimento de dissecção.

[001148] 25. Trabalhar com um pedaço intermediário de tumor de cada vez, cuidadosamente fatiar o tumor em fragmentos de aproximadamente 3×3×3 mm na placa de dissecação, usando a régua debaixo da placa para referência.

[001149] 26. Continuar dissecando os fragmentos a partir de pedaço intermediário de tumor até todo o tecido no pedaço intermediário ter sido avaliado.

[001150] 27. Selecionar fragmentos favoráveis e usar uma pipeta de transferência, transferir até 4 fragmentos favoráveis nas gotas do meio de lavagem em um círculo nos fragmentos da placa de tumor. Usando uma pipeta de transferência, bisturi ou fórceps, transferir, tanto quanto possível do tecido desfavorável e produto residual para a placa de tecido desfavorável para depurar a placa de dissecção. Todo o tecido restante foi colocado em uma das cavidades da placa de seis cavidades. (Tecido desfavorável foi indicado por tecido adiposo amarelo ou tecido necrótico.)

[001151] 28. Continuar processamento por repetição de etapa 23- 26 para os restantes pedaços intermediários de tumor, trabalhando um pedaço intermediário de cada vez até todo o tumor ter sido processado. (Obtido com um bisturi ou fórceps novo, como necessário, a ser decidido pelo técnico de processamento).

[001152] 29. Mover as placas com fragmento para a parte de trás da coifa.

[001153] 30. Usando pipeta de transferência, o bisturi, ou o fórceps, transferir até 50 dos melhores fragmentos de tumor para o tubo cônico de 50 mL rotulado com fragmentos de tumor contendo o CM1.

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[001154] 31. Remover flutuadores do tubo cônico de 50 mL com pipeta de transferência. Registrar número de fragmentos e flutuadores.

[001155] 32. Remover todos os itens desnecessários da coifa, reter as placas de tecidos favoráveis se eles contiverem fragmentos extra. Limpar a coifa com pano com álcool.

[001156] 33. Remover G-REX 100MCS do incubador, limpar com álcool a 70% e colocar em armário de segurança biológica.

[001157] 34. Girar os tubos cônicos com fragmentos de tumor e despejar o conteúdo no tubo de 50ml no frasco G-Rex 100MCS.

[001158] 35. Se um ou mais fragmentos de tumor transferidos para o frasco G-Rex 100M flutuar, obter um fragmento de tumor adicional quando disponível da placa de tecido favorável e transferir o mesmo para o frasco G- Rex 100M.

[001159] 36. Registrar # de incubador(s) e número total de fragmentos adicionado para cada frasco.

[001160] 37. Colocar o biorreator G–REX 100M em incubadora a 37°C, 5% CO2.

[001161] 38. Qualquer tumor não usado foi colocado em 100 mL de HypoThermosol e enviado para o laboratório.

[001162] 39. Registrar o tempo de parada do processamento do tumor.

[001163] 40. Descartar quaisquer meios completos de TILs não usados contendo IL-2 e quaisquer alíquotas não usadas de IL-2.

[001164] 41. Limpar o armário de segurança biológica.

[001165] 42. Colocar a amostra de carga biológica nas condições apropriadas de armazenamento.

[001166] 43. Registrar dados.

[001167] 44. Salvar a fotografia como uma amostra de arquivo com a data do processo de ID#Tumor para o arquivo preparado do paciente.

[001168] 45. Encomendar e assegurar a entrega de placas de

300 / 557 sedimentação para o laboratório de microbiologia. EXEMPLO 6: Processo 2A – Dia 11

[001169] Este exemplo descreve o protocolo detalhado do dia 11 para o processo 2A descrito em Exemplos 1 a 4.

[001170] Preparação anterior.

[001171] 1. Dia antes processamento:

1.1 CM2 pode ser preparado no dia antes processamento ocorrer. Colocar a 4°C.

[001172] 2. Dia de processamento.

[001173] 2.1. Preparar a interface de tubos de células alimentadoras.

[001174] 2.1.1 Fechar todos os grampos em um CC2 e conjuntos de conector 45-4M60.

[001175] 2.1.2 Soldar de modo estéril as 4 pontas da interface de tubos 4S-4M60 na linha de pontas em CC2 e removendo a ponta.

[001176] 2.1.3 Colocar de lado o pool de células alimentadoras.

[001177] 2.2 Preparar 5 mL de meio de crioconservação por CTF- FORM-318 e colocar a 4°C até necessário. Limpar a sala de monitoramento ambiental - Pré-Processamento

[001178] 1. Registrar informação sala limpa.

[001179] 2. Armários de segurança biológica (BSC) foram limpos com panos muito saturados com álcool ou pulverização de álcool.

[001180] 3. Verificar contagens de partículas por 10 minutos antes começar processamento.

[001181] 4. Configurar placas de vigilância em processo e deixar em armário de segurança biológica durante 1-2 horas durante procedimento.

[001182] Preparar frasco G-Rex 500MCS:

1. Usando seringa de 10 mL, assepticamente transferir 0,5mL de IL-2 (carga é 6 × 106 IU/mL) para cada litro de CM2 (meio celular 2) na bolsa de bioprocesso através de um conector luer fêmea estéril não usado.

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[001183] 2. Usar ar em excesso na seringa para limpar a linha, retirar algum meio a partir da bolsa e expelir de volta na parte de trás. Isto assegura que todo a IL-2 foi misturada com o meio. Misturar bem.

[001184] 3. Abrir embalagem exterior e colocar G-Rex 500MCS no BSC. Fechar todos os grampos no dispositivo exceto linha de filtro grande.

[001185] 4. Soldar de modo estéril a linha de colheita vermelha a partir de G-Rex 500MCS para a linha de saída da tubulação da bomba.

[001186] 5. Conectar conector luer fêmea da bolsa de bioprocesso ao conector luer macho da partida da bomba.

[001187] 6. Pendurar a bolsa de bioprocesso no suporte de soro IV, abrir os grampos e bombear 4,5 Litros do Meio CM2 no G-Rex 500MCS. Limpar a linha, grampear e termosselar.

[001188] 7. Reter a linha da bomba para o meio. Ela foi usada quando preparando as células alimentadoras.

[001189] 8. Colocar G-Rex 500MCS no incubador. Preparar células alimentadoras irradiadas

[001190] 1. Selar e remover a(s) ponta(s) de IL TP. Grampear ambas as linhas.

[001191] 2. Registrar o peso seco de um pacote de transferência de 1L (TP).

[001192] 3. Soldar de modo estéril o pacote de transferência de 1L para a partida da bomba Acacia ~12” da bolsa.

[001193] 4. A outra extremidade da tubulação da bomba foi ainda conectada ao Labtainer de 10 L.

[001194] 5. Bombear 500mL CM2 por peso no TP.

[001195] 6. Fechar grampo e selar próximo da junta de solda.

[001196] 7. Colocar em incubador.

[001197] 8. Verificar e desconectar bolsas de células alimentadoras.

[001198] 9. Registrar lote de alimentadoras usado.

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[001199] 10. Limpar bolsas com álcool.

[001200] 11. Colocar em bolsas com zip.

[001201] 12. Descongelar células alimentadoras em banho d’água a 37°C (+/- 1°C). Registrar temperatura de banho d’água.

[001202] 13. Remover e secar com gaze.

[001203] 14. Passar células alimentadoras através de passagem para sala de preparação.

[001204] 15. Transferir para BSC em Sala Limpa.

[001205] 16. Usar a interface de tubos de células alimentadoras previamente preparadas, soldar o 1L TP com meio para uma das linhas não usadas no lado do orifício de amostra da torneira de 3 vias tão próximo como possível da junção de vedação soltando tão pouca tubulação quanto possível.

[001206] 17. Colocar interface de tubos das células alimentadoras em BSC.

[001207] 18. Prender cada uma das 3 bolsas de alimentadoras com a ponta a partir da interface de tubos no único orifício da bolsa de alimentadoras.

[001208] 19. Girar a válvula da torneira de modo que 1L TP está na posição “OFF”.

[001209] 20. Trabalhar com uma bolsa de cada vez, abrir os grampos na linha da bolsa de alimentadora, expelir ar da seringa e retirar o conteúdo da bolsa de alimentadora na seringa. Expelir ar da seringa ajudando na recuperação das células. Fechar grampo da bolsa de alimentadora.

[001210] 21. Registrar o volume recuperado de células alimentadoras descongeladas em cada bolsa.

[001211] 22. Girar a válvula da torneira de modo que a bolsa de alimentadoras esteja em posição “OFF”

[001212] 23. Abrir o grampo no TP e distribuir o conteúdo da seringa no TP.

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[001213] 24. Assegurar que a linha está limpa e re-grampear o TP. Pode ser necessário retirar algum ar da seringa de TP para uso na limpeza da linha.

[001214] 25. Misturar bem as células.

[001215] 26. Fechar grampo na bolsa de alimentadoras.

[001216] 27. Girar a torneira de modo que o orifício da seringa esteja em posição “OFF”. Desconectar a seringa de 60mL a partir da torneira.

[001217] 28. Substituir por nova seringa para cada bolsa de alimentadora.

[001218] 29. Deixar seringa após a bolsa final.

[001219] 30. Misturar bem formulação final das alimentadoras.

[001220] 31. Girar torneira para que a suspensão da célula alimentadoras fique na posição “OFF”.

[001221] 32. Misturar bem as células e usar uma seringa de 5 mL e orifício sem agulha, lavar o orifício com alguma solução celular para garantir uma amostragem precisa e remover 1 ml de células, colocar em um tubo rotulado para contagem.

[001222] 33. Repetir com a segunda seringa. Estas duas amostras independentes tiveram uma única contagem de células realizada.

[001223] 34. Girar a torneira para que a suspensão do alimentadoras esteja na posição “ABRIR” e usar a seringa de 60 ml conectada ao ar expelido da interface de tubos no TP para limpar a linha.

[001224] 35. Remover a seringa e cobrir o orifício luer com uma nova tampa estéril.

[001225] 36. Aquecer a vedação de TP próximo à junta de solda, remover a interface de tubos.

[001226] 37. Registrar a massa do pacote de transferência com suspensão de células e calcular o volume da suspensão de células.

[001227] 38. Colocar na incubadora.

[001228] 39. Realizar contagem de células única com a amostra da

304 / 557 célula alimentadoras e registrar os dados e anexar os dados brutos da contagem ao registro do lote.

[001229] 40. Documentar o programa de contagem Cellometer.

[001230] 41. Verificar que a diluição correta foi inserida no Cellometer.

[001231] 42. Calcular a densidade celular total viável no pacote de transferência das alimentadoras.

[001232] 43. Se a contagem de células for <5 x109, descongelar mais células, contar e adicionar às células alimentadoras.

[001233] 44. Re-pesar a bolsa de alimentadoras e calcular o volume.

[001234] 45. Calcular o volume de células a serem removidas. Adição de alimentadoras a G-REX

[001235] 1. Soldar de modo estéril um conjunto de transferência 4” para TP alimentadoras.

[001236] 2. No BSC, fixar uma seringa de tamanho apropriado ao luer fêmea soldado ao pacote de transferência das alimentadoras.

[001237] 3. Misturar bem as células e remover o volume calculado na etapa 40 ou 41 para obter 5,0x 109 células. Descartar as células desnecessárias.

[001238] 4. Usar uma seringa de 1 ml e agulha 18G, retirar 0,150 ml de OKT3, remover a agulha e transferir para TP de alimentadoras através do luer fêmea.

[001239] 5. Enxaguar o tubo e seringa com célula alimentadora e misturar bem a bolsa. Limpar a linha com ar da seringa.

[001240] 6. Remover o G-Rex 500MCS da incubadora, limpar com um pano embebido em álcool e colocar ao lado do SCD.

[001241] 7. Soldar de modo estéril a bolsa de alimentadoras na linha vermelha no G-Rex 500MCS. Destravar a linha e deixar as células alimentadoras fluirem no frasco por gravidade.

[001242] 8. Certifique-se de que a linha tenha sido completamente

305 / 557 limpa, então termosselar, perto da solda original, e remover a bolsa de alimentadoras.

[001243] 9. Devolver o G-Rex 500MCS à incubadora e registrar o tempo Preparar TIL: iniciação do tempo de registro de colheita de TILs

[001244] 1. Remover cuidadosamente o G-Rex 100MCS da incubadora e fechar todos os grampos, exceto a linha de filtro grande.

[001245] 2. Soldar um pacote de transferência de 1L na linha vermelha no G-REX 100MCS.

[001246] 3. Fechar o grampo em um 300 ml TP. Termosselar a ~ 30 cm da bolsa, removendo a ponta. Registrar o peso seco/massa.

[001247] 4. Soldar de modo estéril o pacote de transferência de 300 ml na linha de coleta de células no 100MCS próximo à termosselagem. Fechar a linha.

[001248] 5. Soltar todos os grampos levando ao 1L TP.

[001249] 6. Usar o GatheRex transferido ~ 900mL do sobrenadante da cultura para o pacote de transferência de 1L. Gatherex parou quando o ar entrou na linha. Grampear a linha e termosselar.

[001250] 7. Agitar o frasco até que todas as células tenham sido destacadas da membrana. Verificar a membrana para garantir que todas as células estejam destacadas.

[001251] 8. Inclinar o frasco longe da tubulação de coleta e permitir que os fragmentos de tumor se depositassem ao longo da borda.

[001252] 9. Lentamente inclinar o frasco em direção à tubulação de coleta, para que os fragmentos permaneçam no lado oposto do frasco.

[001253] 10. Usando o GatheRex, transferir a suspensão residual de células para o pacote transferido de 300 ml, evitando fragmentos de tumor.

[001254] 11. Verificar novamente se todas as células foram removidas da membrana.

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[001255] 12. Se necessário, lavar novamente liberando grampos no GatheRex e permitir que algum meio escoe para o frasco G-Rex 100MCS por gravidade.

[001256] 13. Bater vigorosamente o frasco para liberar células e bombear para TP 300 ml.

[001257] 14. Após completar a coleta, fechar a linha vermelha e termosselar.

[001258] 15. Aquecer a vedação da linha de coleta, deixando aproximadamente o mesmo comprimento de tubo que quando o peso seco foi registrado.

[001259] 16. Registrar a massa (incluindo massa seca) dos TP 300 ml contendo a suspensão de células e calcular o volume da suspensão de células.

[001260] 17. No BSC, contaminar TP 300 ml com um conjunto transferido de plasma de 4”. Misturar bem as células. Assepticamente, fixar uma seringa de 5 ml, extrair 1 ml, colocar em frasco criogênico. Repetir com a segunda seringa. Estas foram usadas para contagem de células, viabilidade.

[001261] 18. Prender de novo e substituir a tampa luer por uma nova tampa estéril.

[001262] 19. Colocar na incubadora e registrar o tempo na incubadora.

[001263] 20. Realizar uma única contagem de células em cada amostra e registrar os dados e anexar a contagem de dados brutos ao registro do lote.

[001264] 21. Documentar o programa de contagem do Cellometer.

[001265] 22. Verificar se a diluição correta foi inserida no Cellometer.

[001266] 23. Se necessário, ajustar a densidade total de TILs viáveis para ≤ 2x108 células viáveis.

[001267] 24. Calcular o volume para remover ou anotar o ajuste não necessário.

[001268] 25. No BSC, assepticamente fixar uma seringa de tamanho apropriado ao 300mL TP.

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[001269] 26. Se necessário, remover o volume calculado de células calculadas na tabela “Calcular volume a remover”.

[001270] 27. Grampear e termosselar os 300 ml TP.

[001271] 28. Transferir o excesso de células para um tubo cônico de tamanho adequado e colocar na incubadora com a tampa solta para posterior crioconservação.

[001272] 29. Remover o G-Rex 500MCS da incubadora e colocar ao lado do SCD.

[001273] 30. Soldar de modo estéril 300 ml TP na linha de entrada da bomba Acacia.

[001274] 31. Soldar de modo estéril a linha vermelha do G-Rex 500MCS na linha de saída da bomba Acacia.

[001275] 32. Bombear as células para o frasco.

[001276] 33. Verificar se a linha foi completamente limpa e termosselar a linha vermelha perto da solda original.

[001277] 34. Verificar se todos os grampos no G-Rex 500MCS estavam fechados, exceto a grande linha de filtro.

[001278] 35. Devolver o G-Rex 500MCS à incubadora e registrar o tempo colocado na incubadora G-Rex.

[001279] 36. Solicitar e garantir a entrega de placas de sedimentação ao laboratório de microbiologia. Crioconservação do excesso

[001280] Quantidade calculada de meio de congelamento para adicionar às células: TABELA 13: Concentração de célula alvo foi 1 x 108/ml A. Total de células removidas (da etapa 15) mL B. concentração de células alvo 1 x 108 células/mL Volume de meio de congelamento a adicionar (A/B) mL

[001281] 37. Girar o TIL a 400 x g por 5 minutos a 20°C com freio total e aceleração total.

[001282] 38. Aspirar assepticamente o sobrenadante.

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[001283] 39. Bater levemente no fundo do tubo para recolocar em suspensão as células no fluido restante.

[001284] 40. Enquanto batendo levemente no tubo, adicionar lentamente o meio de congelamento preparado.

[001285] 41. Dividir em alíquota sem tubos criogênicos de tamanho apropriado e registrar o tempo de células colocadas em -80°C. EXEMPLO 7: Processo 2A – Dia 16

[001286] Este exemplo descreve o protocolo detalhado do dia 16 para o processo 2A descrito em Exemplos 1 a 4. Monitoramento ambiental – Sala Limpa - Pré-Processamento.

[001287] 1. Armários de segurança biológicas foram limpos com panos muito saturados com álcool ou pulverização de álcool.

[001288] 2. Verificar contagens de partículas para 10 minutos antes começar processamento.

[001289] 3. Configurar placas de vigilância em processo e deixar em armário de segurança biológica por 1-2 hora durante procedimento. Coletar e contar TILs.

[001290] 1. Aquecer uma bolsa de 10 L de CM4 para culturas iniciadas com menos de 50x106 TIL em uma incubadora a 37°C por pelo menos 30 minutos ou até estar pronto para uso.

[001291] 2. No BSC, fixar assepticamente um conjunto de extensão Baxter a uma bolsa Labtainer de 10 litros.

[001292] 3. Remover o frasco G-Rex 500MCS da incubadora e colocar o mesmo na bancada adjacente ao GatheRex. Verificar se todos os grampos estavam fechados, exceto a linha de filtro grande. Mover o grampo na linha de conexão rápida perto da junção “T”.

[001293] 4. Soldar de modo estéril um Labtainer 10L na linha vermelha de colheita no G-Rex 500MCS através do tubo soldável na extensão Baxter.

[001294] 5. Termosselar um pacote de transferência de 2 L 2” abaixo do

309 / 557 “Y removendo a ponta e registrar o peso seco. Soldar de modo estéril 2L TP na linha de coleta limpa no G-Rex 500MCS.

[001295] 6. Colocar o G-Rex 500MCS em uma superfície nivelada.

[001296] 7. Soltar todos os grampos que levam ao Labtainer de 10L e usar o GatheRex, transferir ~ 4L do sobrenadante da cultura para o Labtainer 10L.

[001297] 8. Coletar de acordo com as instruções de colheita apropriadas do GatheRex.

[001298] 9. Grampear a linha vermelha e registrar o tempo em que a colheita do TIL foi iniciada.

[001299] 10. Parar GatheRex quando ar entrou na linha. Grampear a linha vermelha.

[001300] 11. Após a remoção do sobrenadante, agitar o frasco até que todas as células tenham sido destacadas da membrana. Inclinar o frasco para garantir que a mangueira estivesse na borda do frasco.

[001301] 12. Liberar todos os grampos que levam ao 2L TP e usando o GatheRex, transferir a suspensão de células residuais para o 2L TP, mantendo a borda inclinada até que todas as células serem coletadas.

[001302] 13. Inspecionar a membrana para células aderentes.

[001303] 14. Se necessário, lavar novamente liberando grampos na linha vermelha e permitir que algum meio escoe para o frasco por gravidade.

[001304] 15. Fechar a linha vermelha e a termosselagem tripla.

[001305] 16. Agitar vigorosamente o frasco para liberar as células.

[001306] 17. Adicionar células a 2L TP.

[001307] 18. Termosselar o pacote de transferência de 2 L, deixando aproximadamente o mesmo comprimento de tubo que quando o peso seco foi registrado.

[001308] 19. Reter o G-Rex 500MCS, ele foi reutilizado na divisão.

[001309] 20. Registrar a massa do pacote de transferência com

310 / 557 suspensão de células e calcular o volume da suspensão de células.

[001310] 21. Determinar o volume da suspensão de células, incluindo massa seca.

[001311] 22. Esterilizar um conjunto de transferência 4”, na bolsa de suspensão de células.

[001312] 23. No BSC, misturar as células suavemente e com a seringa de 20 cm3, retirar 11ml e dividir em alíquotas, como mostrado na Tabela 14: TABELA 14. Parâmetros de teste Teste Volume amostra Vaso Contagem celular e 2- 2mL amostras Criofrascos viabilidade Criofrasco armazenado a 4°C até completar o Micoplasma 1 mL teste Inocular 0,5mL em cada um dos frascos de Esterilidade 1 mL cultura aneróbica e aeróbica Contagem de células não usadas (Crioconservadas Fluxo 2 – 2mL para teste de lote futuro Restante de células Descartadas

[001313] 24. Termosselar. Fechar a conexão luer retendo o grampo

[001314] 25. Rotular e colocar a suspensão de células na incubadora e registrar o tempo colocado na incubadora.

[001315] 26. Calcular novo volume.

[001316] 27. Registrar Volume em 2 L pacote de transferência com base em volume de suspensão de células e volume removido durante QC (11 mL).

[001317] 28. Inocular e encomendar teste de esterilidade.

[001318] 29. Armazenar a amostra de micoplasma a 4 ͦ C na prateleira para teste pendente de micoplasma.

[001319] 30. Colocar à parte até TIL ser semeado. Contagem celular:

[001320] Realizar contagens celulares únicas e registrar os dados e anexar os dados brutos da contagem ao registro do lote. Documentar a diluição. Documentar o programa de contagem Cellometer. Verificar se a diluição correta foi introduzida no Cellometer. Método continuou:

311 / 557

[001321] 31. Calcular o número total de frascos requeridos durante a subcultura.

[001322] **Re-usar o vaso original e arredondar para cima as frações de vasos adicionais. Adição de IL-2 a CM

[001323] 1. Colocar bolsa de10L de Aim V com Glutamax no BSC.

[001324] 2. Prender a bolsa de meio com um conjunto de transferência de plasma 4”.

[001325] 3. Fixar uma agulha18G a um seringa de 10 mL e retirar 5mL de IL-2 na seringa (concentração final é 3000 IU/ml).

[001326] 4. Remover a agulha e assepticamente fixar seringa no conjunto de transferência de plasma e distribuir IL-2 na bolsa.

[001327] 5. Varrer a linha com ar, retirar algum meio e distribuir na bolsa. Isto assegura que toda a IL-2 está no meio.

[001328] 6. Repetir para as bolsas restantes de Aim V. Preparar frascos de G-REX500MCS

[001329] 1. Determinar quantidade de CM4 a ser adicionada aos frascos. Registrar o volume de células adicionadas por frasco e volume de CM4 5000mL-A.

[001330] 2. Fechar todos os grampos, exceto a linha de filtro grande.

[001331] 3. Soldar de modo estéril a linha de entrada da bomba Acacia ao conjunto de transferência de plasma de 4” na bolsa de meio que contém CM4.

[001332] 4. Soldar de modo estéril a linha de saída da bomba para o G- Rex 500MCS através da linha vermelha de coleta

[001333] 5. Bombear uma quantidade determinada de CM4 no G-Rex 500MCS usando linhas no frasco como guia.

[001334] 6. Termosselar a linha vermelha do G-Rex 500MCS.

[001335] 7. Repetir as etapas 4-6 para cada frasco. Vários frascos

312 / 557 podem ser cheios ao mesmo tempo usando enchimento por gravidade ou várias bombas. Um conector em “Y” pode ser soldado na linha de saída da bomba e os dois braços soldados em dois frascos G-Rex 500MCS enchendo os dois ao mesmo tempo.

[001336] 8. Colocar frascos a 37°C, 5% de CO2. Semear frascos com TIL

[001337] 1. Fechar todos os grampos no G-Rex 500MCS, exceto na linha de filtro grande

[001338] 2. Soldar de modo estéril a bolsa de produto de células para a linha de entrada da bomba Acacia.

[001339] 3. Soldar de modo estéril a outra extremidade da bomba na linha vermelha no G-Rex 500MCS.

[001340] 4. Colocar partida na bomba.

[001341] 5. Colocar a bolsa do produto de células na balança analítica e registrar o tempo de TIL adicionado ao frasco G-REX.

[001342] 6. Zerar a balança.

[001343] 7. Desconectar as linhas e bombear o volume necessário de células para o G-Rex 500MCS em peso, assumindo 1g = 1mL.

[001344] 8. Virar a bolsa celular de cabeça para baixo e bombear ar para limpar a linha. Termosselar a linha vermelha do G-Rex 500MCS. Colocar frasco na incubadora.

[001345] 9. Soldar de modo estéril da linha de saída da bomba para o próximo G-Rex 500MCS através da linha vermelha de coleta

[001346] 10. Misturar bem as células.

[001347] 11. Repetir a transferência de células para todos os frascos.

[001348] 12. Colocar frascos a 37°C, 5% de CO2 e registrar o tempo de TIL adicionado ao frasco G_REX.

[001349] 13. Solicitar o teste de placas de sedimentação ao laboratório de microbiologia.

313 / 557

[001350] 14. Registrar os números de acesso.

[001351] 15. Solicitar testes quanto à esterilidade aeróbica e anaeróbica.

[001352] 16. Garantir entrega de placas e frascos ao laboratório de microbiologia. Crioconservação de células em excesso ou fluxo:

[001353] 1. Calcular quantidade de meio de congelamento necessário: a. concentração da célula alvo foi de 1x108 / ml; registrar o total de células removidas. A concentração de células alvo foi de 1x108 células/mL. Calcular volume total de meio de congelamento a ser adicionado.

[001354] 2. Preparar meios de conservação criogênica e colocar a 40°C até ser necessário.

[001355] 3. Girar TILs a 400 x g por 5 minutos a 20°C com freio total e aceleração total.

[001356] 4. Aspirar sobrenadante assepticamente.

[001357] 5. Bater levemente no fundo do tubo para recolocar em suspensão as células no fluido restante.

[001358] 6. Enquanto batendo levemente no tubo, adicionar lentamente o meio de congelamento preparado.

[001359] 7. Dividir em alíquotas os tubos criogênicos rotulados, de tamanho apropriado.

[001360] 8. Colocar o frasco em um aparelho Mr. Frosty ou equivalente e colocar em um congelador a -80°C.

[001361] 9. Dentro de 72 horas, transferir para o local de armazenamento permanente e documentar e registrar a data e hora de colocação -80°C. EXEMPLO 8: Processo 2A – Dia 22

[001362] Este exemplo descreve o protocolo detalhado do dia 22 para o processo 2A descrito em Exemplos 1 a 4.

[001363] Resultados de esterilidade em processo - Documento Negativo

314 / 557

[001364] Antes de começar a colheita, obtida no Dia 16, obter os resultados preliminares de esterilidade do Laboratório de Microbiologia. Contatar o Diretor ou Encarregado do laboratório para verificar instruções adicionais se os resultados forem positivos. Monitoramento ambiental - Sala Limpa - Pré-processamento

[001365] 1. Verificar contagens de partículas para 10 minutos antes começar processamento.

[001366] 2. Armários de segurança biológica foram limpos com panos muito saturados com álcool ou pulverização de álcool.

[001367] 3. Configurar placas de vigilância em processo e deixar em armário de segurança biológica por 1-2 hora durante procedimento. Preparação avançada

[001368] 1. No BSC, fixar assepticamente um conjunto de extensão Baxter a uma bolsa de 10L para laboratório ou equivalente. Etiquetar bolsa de filtrado LOVO.

[001369] 2. Colocar três bolsas de 1L de PlasmaLyte A no BSC

[001370] 3. Preparar o pool e rotular as bolsas de PlasmaLyte A com 1% de HSA:

3.1 Fechar todos os grampos em um conjunto de conectores 4S-4M60 e prender em cada uma das bolsas PlasmaLyte.

[001371] 3.2 Soldar uma das extremidades macho do 4S-4M60 na linha de entrada da partida da bomba Acacia.

[001372] 3.3 Soldar a linha de saída da partida da bomba em uma bolsa de coleta de 3 litros. Fechar todos os grampos na bolsa de 3L, exceto a linha a bombear.

[001373] 3.4 Bombear os 3 litros de Plasmalyte na bolsa de 3 litros. Se necessário, remover o ar da bolsa de 3 litros invertendo a bomba.

[001374] 3,5 Fechar todos os grampos, exceto a linha com luer fêmea.

[001375] 3.6 Usando duas seringas de 100 mL e agulhas 16-18G,

315 / 557 carregar 120 mL de HSA a 25%. Seringas com tampas vermelhas.

[001376] 3.7 Fixar uma seringa ao luer fêmea na bolsa de 3 litros e transferir HSA para a bolsa PlasmaLyte de 3L. Misturar bem.

[001377] 3.8 Repetir com a segunda seringa.

[001378] 3.9 Misturar bem.

[001379] 3.10 Fechar todos os grampos.

[001380] 3.11 Usando uma seringa de 10 ml, remover 5 mL de PlasmaLyte com 1% de HSA do orifício sem agulha na bolsa de 3 litros.

[001381] 3.12 Tampar a seringa tampada e manter em BSC para diluição de IL-2.

[001382] 3.13 Fechar todos os grampos.

[001383] 3.14 Termosselar removendo a linha luer fêmea da partida da bomba.

[001384] 3.15 Rotular tampão de lavagem LOVO e datar Expirar dentro de 24 horas em temperatura ambiente. Preparação de IL-2

[001385] 1. Distribuir Plasmalyte/1%HSA da seringa de 5 mL em um tubo cônico estéril de 50 ml rotulado.

[001386] 2. Adicionar 0,05mL de carga de IL-2 no tubo contendo PlasmaLyte.

[001387] 3. Rotular IL-2 6X104

[001388] 4. Tampar, rotular e armazenar a 2-8°C. Registrar volumes. Preparação de células

[001389] 1. Fechar todas os grampos em uma bolsa de 10 L de laboratório. Fixar o conjunto de extensão Baxter na bolsa de 10 litros via conexão luer.

[001390] 2. Remover os frascos G-REX 500M de 37°C

[001391] 3. Soldar de modo estéril a linha vermelha de remoção de meio do G-Rex 500MCS até o conjunto de extensão na bolsa de bioprocesso de

316 / 557 10L.

[001392] 4. Soldar de modo estéril a linha de remoção de células limpa do G-Rex 500MCS para uma bolsa de coleta de 3L e identificar como “suspensão de células reunida”.

[001393] 5. Desconectar a linha vermelha e bolsa 10 litros.

[001394] 6. Usar a bomba GatheRex, o volume reduzido no primeiro frasco. Nota: Se uma bolha de ar for detectada, a bomba poderá parar prematuramente. Se a redução total do volume não foi concluída, reativar a bomba GatheRex.

[001395] 7. Fechar o grampo na bolsa de sobrenadante e na linha vermelha.

[001396] 8. Agitar o frasco G-REX 500M até que o TIL seja recolocado em suspensão completamente, enquanto evitando respingos ou formação de espuma. Verificar se todas as células foram desalojadas da membrana.

[001397] 9. Abrir grampos na linha transparente e bolsa de células de 3L.

[001398] 10. Inclinar o frasco G-Rex de modo que a suspensão de células seja reunida na lateral do frasco, onde o canudo de coleta está localizado.

[001399] 11. Iniciar o GatherRex para coletar a suspensão de células.

[001400] Nota: Se o canudo de coleta de células não estava na junção da parede e da membrana inferior, bater o frasco enquanto inclinando em ângulo de 45⁰ geralmente era suficiente para posicionar o canudo corretamente.

[001401] 12. Assegurar que todas as células foram removidas do frasco.

[001402] 13. Se as células permanecerem no frasco, adicionar 100 ml de sobrenadante de volta ao frasco, agitar e coletar na bolsa de suspensão celular.

[001403] 14. Fechar o grampo na linha na bolsa de coleta de células. Soltar os grampos no GatheRex.

[001404] 15. Termosselar linha limpa do G-Rex 500MCS.

317 / 557

[001405] 16. Termosselar linha vermelha do G-Rex 500MCS.

[001406] 17. Repetir as etapas de 3 a 16 para frascos adicionais.

[001407] 18. Foi necessário substituir a bolsa de 10L de sobrenadante, conforme necessário, após cada segundo frasco.

[001408] 19. GatherRex múltiplo pode ser usado.

[001409] 20. Documentar o número de G-Rex 500MCS processado.

[001410] 21. Termosselar a bolsa de coleta de células. Registrar o número de G-REX coletado.

[001411] 22. Com um marcador, fazer uma marca ~ 2” de um dos conectores luer femininos em uma nova bolsa de coleta de 3 litros.

[001412] 23. Termosselar e remover o luer fêmea logo abaixo da marca.

[001413] 24. Rotular como bolsa Fonte LOVO.

[001414] 25. Registrar o peso seco.

[001415] 26. Fechar todos os grampos de um filtro de sangue de 170 µm.

[001416] 27. Soldar de modo estéril a extremidade do terminal do filtro na bolsa Fonte LOVO logo abaixo da marca.

[001417] 28. Soldar de modo estéril uma linha Fonte do filtro na bolsa contendo a suspensão de células.

[001418] 29. Elevar a suspensão de células pendurando células em suporte de soro IV para iniciar a transferência de fluxo por gravidade das células. (Nota: não permitir que a bolsa Fonte fique pendurada no aparelho de filtração.)

[001419] 30. Abrir todos os grampos necessários e permitir que TILs drenem da bolsa de suspensão de células através do filtro e na bolsa Fonte LOVO.

[001420] 31. Depois que todas as células foram transferidas para a bolsa Fonte LOVO, fechar todos os grampos, termosselar logo acima da marca e destacar para remover o filtro.

318 / 557

[001421] 32. Misturar bem a bolsa e usar uma duas seringas de 3 ml, retirar 2 amostras independentes de 2 mL do orifício de amostra da seringa para contagem e viabilidade de células.

[001422] 33. Pesar a bolsa e determinar a diferença entre o peso inicial e o peso final.

[001423] 34. Registrar os dados e local na incubadora, incluindo massa seca. Contagem celular.

[001424] Realizar uma contagem celular única cada amostra e registrar dados e anexar dados brutos de contagem no registro dos lotes. Documentar o programa de contagem Cellometer. Verificar se a diluição correta foi inserida no Cellometer. Determinar o número total de células nucleadas. Determinar número de TNC para remover e reter = 1,5 X 1011 células para processamento LOVO. Colocar células removidas em recipiente de tamanho apropriado para descarte. Colheita LOVO

[001425] O Labtainer de 10L com conjunto de extensão Baxter na preparação anterior foi a bolsa de filtrado de substituição soldada no kit LOVO depois. Ligar o LOVO e seguir as exibições na tela. Verificar as escalas de peso e sensor de pressão

[001426] Para avaliar o perfil de operação do instrumento:

1. Tocar o botão de informação.

[001427] 2. Tocar a guia de configurações do instrumento.

[001428] 3. Tocar o botão do perfil de operação do instrumento.

[001429] 4. O perfil de operação do instrumento é exibido. Verificar as escalas de peso

[001430] 1. Verificar se não há nada pendurado em nenhuma das balanças e verificar a leitura de cada balança.

[001431] 2. Se alguma das balanças for lida fora de uma faixa de 0 +/- 2

319 / 557 g, executar a calibração da balança como descrito no manual de calibração da balança do fabricante.

[001432] 3. Se todas as balanças estavam em tolerância, sem pendurar peso, continuar pendurando um peso de 1 kg em cada balança (nº 1-4) e revisar a leitura.

[001433] 4. Se qualquer uma das balanças for lida fora de uma faixa de 1000 +/- 10 g quando um peso de 1 kg foi suspenso, realizar a calibração da balança como descrito no Manual do Operador da LOVO do fabricante. Verificar o sensor de pressão

[001434] 1. Revisar a leitura do sensor de pressão na tela Perfil de operação do instrumento.

[001435] 2. N /A: Se a leitura do sensor de pressão estiver fora de 0 +/- 10 mmHg, armazenar uma nova configuração de pressão atmosférica no Modo de Serviço, conforme descrito no Manual do Operador da LOVO do fabricante.

[001436] a. Tocar no botão de verificação na tela Perfil de operação do instrumento.

[001437] b. Tocar no botão de verificação na guia Configurações do instrumento.

[001438] 3. Se a calibração da balança foi realizada ou um novo ajuste de pressão atmosférica foi armazenado, repita as seções relevantes.

[001439] Para iniciar o procedimento, selecionar o protocolo “TIL G- Rex Colheita” a partir do menu drop-down na Tela de seleção de protocolo e pressionar Start.

[001440] 1. A tela de configuração do procedimento é exibida.

[001441] 2. Tocar no botão Informações das soluções.

[001442] 3. A tela Solução 1 é exibida. Revisar o tipo de tampão de lavagem necessário para a Solução 1. (Se possível, ler PlasmaLyte.)

[001443] 4. Tocar no botão Next para avançar para a tela Solução 2.

320 / 557 Analisar o tipo de tampão de lavagem necessário para a Solução 2. (Se possível, ler “NONE”, indicando que o protocolo foi configurado para usar apenas um tipo de tampão de lavagem, que era o PlasmaLyte)

[001444] 5. Tocar no botão de verificação na tela de informações da solução 2 para retornar à tela de configuração de procedimentos.

[001445] 6. Tocar no botão Informações do procedimento.

[001446] 7. A tela de informações do procedimento é exibida.

[001447] 8. Tocar no campo de entrada ID do usuário. Um teclado será exibido. Introduzir as iniciais do técnico e do verificador. Tocar no botão para aceitar a entrada.

[001448] 9. Tocar no campo de entrada ID da Fonte. Um teclado será exibido. Introduzir o lote do produto #. Tocar no botão para aceitar a entrada.

[001449] 10. Tocar no campo de entrada ID do procedimento. Um teclado será exibido. Introduzir “TIL Colheita”. Tocar no botão para aceitar a entrada.

[001450] 11. Se houver notas extras para registrar, tocar no campo de entrada Nota do procedimento. Um teclado é exibido. Introduzir quaisquer notas. Tocar no botão para aceitar a entrada.

[001451] NOTA: O campo de entrada Nota do procedimento é opcional e pode ser deixado em branco.

[001452] 12. Tocar no botão de verificação na tela de informações do procedimento para retornar à tela de configuração do procedimento.

[001453] 13. Verificar que uma “verificação” é exibida no botão Informações do procedimento. Se nenhuma “verificação” for exibida, tocar no botão Informações do procedimento novamente e garantir que os campos ID do usuário, ID da Fonte e ID do procedimento tenham todos entradas.

[001454] 14. Tocar no botão de configuração de parâmetros.

[001455] 15. A tela Informações sobre procedimentos gerais é exibida.

[001456] 16. Tocar no campo de entrada Volume da Fonte (mL). Um

321 / 557 teclado numérico é exibido. Introduzir o volume calculado de suspensão de células (mL) da Tabela 1

[001457] 17. Tocar no botão para aceitar a entrada.

[001458] 18. Tocar no campo de entrada PCV Fonte (%). A tela TILs (viáveis + mortos) é exibida.

[001459] 19. Tocar no campo de entrada Concentração de células. Um teclado numérico é exibido. Introduzir a concentração celular total/mL da Tabela 14 no produto Fonte em unidades de “x 106 / mL”. A entrada pode variar de 00,0 a 99,9. Tocar no botão para aceitar a entrada e retornar à tela de informações sobre procedimentos gerais. NOTA: Depois que a Concentração de células foi aceita, o campo de entrada PCV Fonte (%) na tela Informações sobre procedimentos gerais exibia a % de PCV calculada pelo LOVO, com base na entrada de Concentração de células feita pelo operador.

[001460] 20. Na tela Procedimento geral, tocar no botão Avançar para avançar para a tela 4 de 8, a tela Volume final do produto (volume de retenção). Nota: As telas 2 e 3 não tinham campos de entrada para o operador preencher.

[001461] 21. A tela Volume do produto final (volume de retido) é exibida.

[001462] 22. Usando o valor células nucleadas totais (TNC) da Tabela 15, determinar o volume alvo do produto final na tabela abaixo (Tabela 16). Inserir o volume final do produto (mL) associado com esta faixa de células durante a configuração do procedimento LOVO. TABELA 15. Determinação de volume alvo de produto final Produto final (Retido) Faixa de células Volume para alvo (mL) 0 < Total células (viáveis + mortas) ≤ 7.1E10 150 7,1E10 < Total células (viáveis + mortas) ≤ 1.1E11 200 1,1E11 < Total células (viáveis + mortas) ≤ 1.5E11 250 TABELA 16. Volume alvo do produto Total células nucleadas (TNC) Volume alvo do produto Final (Retido) (mL) x106

322 / 557

[001463] 23. Para alvejar o volume especificado da Tabela 16, tocar no campo de entrada Volume final do produto (mL). Um teclado numérico é exibido. Introduzir o volume final desejado do produto em unidade de mL. Tocar no botão para aceitar a entrada.

[001464] 24. Tocar na tela Volume final do produto (volume de retido) para retornar à tela Configuração do procedimento. Nota: As telas 5 a 8 não tinham campos de entrada para o operador preencher.

[001465] 25. Verificar que uma “Verificação” é exibida no botão Configuração de parâmetros. Se nenhuma “verificação” for exibida, tocar no botão Informações do procedimento novamente e verificar se o Volume Fonte e o PCV Fonte na página 1 têm entradas. Também garantir que a caixa de seleção de Volume de produto final mínimo alvo foi verificada OU o campo Volume final do produto (mL) tem uma entrada na página 4.

[001466] 26. Tocar no botão Estimativa no canto superior direito da tela.

[001467] 27. A tela Resumo da estimativa é exibida. Valores suficientes e precisos confirmados para o tampão de lavagem Fonte e plasma.

[001468] 28. Carregar o kit descartável: Seguir as instruções na tela para carregar o kit selecionando o botão de ajuda “(?)”.

[001469] 29. Anotar os volumes exibidos para o Filtrado e a Solução 1 (ler PlasmaLyte)

[001470] 30. Anotar os volumes exibidos para o Filtrado e a Solução 1 (ler PlasmaLyte).

[001471] 31. Para obter instruções sobre como carregar o kit descartável, tocar no botão de ajuda ou seguir as instruções no manual do operador para obter instruções detalhadas.

[001472] 32. Quando o kit descartável LOVO padrão for carregado, tocar no botão Avançar. A tela Informações e localização do recipiente é exibida. Remover a bolsa do filtrado da balança nº 3.

[001473] 33. Para este protocolo, o recipiente de Filtrado era novo e fora

323 / 557 de escala.

[001474] 34. Se o recipiente de Filtrado já tiver sido mostrado como Novo e Fora de Escala, nenhuma alteração foi feita.

[001475] 35. Se o tipo de recipiente de Filtrado foi mostrado como Original, tocar no botão Original para alternar para Novo.

[001476] 36. Se a localização do Filtrado foi mostrada como “em escala”, tocar no botão em escala para alternar para fora da escala.

[001477] 37. Se o volume do Filtrado a ser gerado for ≤ 2500 mL, o Local do Recipiente do Filtrado será mostrado como em Escala. Para obter consistência entre os ciclos, o Local do Recipiente do Filtrado foi alterado para ‘fora da escala’ e o tipo de recipiente para “novo”.

[001478] 38. Tocar no botão em escala para alternar para fora de escala. Fixar o conjunto de transferência. Usar a técnica de soldagem estéril para substituir o recipiente de filtrado do kit descartável LOVO por uma bolsa de 10 L. Abrir a solda.

[001479] 39. Colocar o recipiente de filtrado na bancada. NÃO pendurar a bolsa do filtrado na balança de pesagem nº 3. A balança de pesagem nº 3 estava vazia durante o procedimento.

[001480] 40. Abrir quaisquer grampos de plástico na tubulação que leva ao recipiente de filtrado. NOTA: Se a tubulação foi removida do grampo F durante a soldagem, substituir o mesmo.

[001481] 41. Tocar no campo de entrada de Capacidade do recipiente de filtrado. Um teclado numérico é exibido. Entrar a nova capacidade total de Filtrado (10.000 mL). Tocar no botão “verificar” para aceitar a entrada.

[001482] 42. Usar a técnica de soldagem estéril para substituir o recipiente de filtrado do kit descartável LOVO por uma bolsa de 10 L. Abrir a solda. Nota: Se a tubulação foi removida do grampo F durante a soldagem, substituir a mesma.

[001483] 43. Colocar o novo recipiente de Filtrado na bancada. NÃO

324 / 557 pendurar a bolsa do filtrado na balança nº 3. A balança de pesagem nº 3 estava vazia durante o procedimento.

[001484] 44. Abrir qualquer grampo de plástico na tubulação que leva ao recipiente do filtrado.

[001485] 45. Para o recipiente do Retido, a tela exibia Original e Em escala.

[001486] 46. Nenhuma alteração foi feita no recipiente do Retido.

[001487] 47. Quando todas as alterações foram feitas no recipiente do Filtrado, e as informações apropriadas foram inseridas, tocar no botão Avançar.

[001488] 48. As verificações de secagem do kit descartável são exibidas. Verificar se o kit foi carregado corretamente e pressione o botão Sim.

[001489] 49. Todos os grampos mecânicos do LOVO fecharam automaticamente e a tela Verificando a instalação do kit descartável é exibida. O LOVO passou por uma série de etapas de pressurização para verificar o kit.

[001490] 50. Depois que a verificação do kit descartável passou com sucesso, a tela Conectar soluções foi exibida.

[001491] 51. 3L foi o volume de lavagem. Introduzir este valor na tela.

[001492] 52. Usar a técnica de soldagem estéril para prender a bolsa de 3 L de PlasmaLyte à tubulação passando pelo grampo 1. Abrir a solda.

[001493] 53. Pendurar a bolsa PlasmaLyte em um suporte para soro IV.

[001494] 54. Abrir todos os grampos plásticos na tubulação que levam à bolsa PlasmaLyte.

[001495] 55. Verificar que a entrada Volume da solução é 3000mL. Isso foi inserido anteriormente.

[001496] 56. Tocar no botão Avançar. O Kit inicial descartável é exibido. Verificar que o PlasmaLyte estava conectado e todas as soldas e grampos de plástico na tubulação levando ao PlasmaLyte estavam abertas e, em seguida, tocar no botão Sim. NOTA: Como apenas um tipo de tampão de

325 / 557 lavagem (PlasmaLyte) foi usado durante o procedimento LOVO, nenhuma solução foi conectada à tubulação que passava pelo grampo 2. O grampo Roberts nesse tubo permaneceu fechado durante o procedimento.

[001497] 57. Iniciar o kit descartável inicial e a tela do kit descartável de início é exibida. Observar visualmente que o PlasmaLyte se move através da tubulação conectada à bolsa do PlasmaLyte. Se nenhum fluido estiver se movendo, pressionar o botão Pausar na tela e determinar se um grampo ou solda ainda está fechado. Depois que o problema foi resolvido, pressionar o botão Continuar na tela para reiniciar o kit descartável inicial.

[001498] 58. Quando o kit descartável inicial terminar com êxito, a tela Conectar Fonte é exibida.

[001499] 59. Para esse protocolo, o recipiente Fonte era novo e fora de escala.

[001500] 60. Se o recipiente Fonte já foi mostrado como novo e fora de escala, nenhuma alteração foi feita.

[001501] 61. Se o local Fonte foi mostrado como Em escala, tocar no botão Em escala para alternar para Fora de escala.

[001502] 62. Tocar no campo de entrada Capacidade da Fonte (mL). Um teclado numérico é exibido. Entrar a capacidade do recipiente que continha o produto Fonte. Tocar no botão de verificação para aceitar a entrada. Nota: A entrada Capacidade da Fonte foi usada para garantir que a bolsa Fonte pudesse conter a solução adicional que foi adicionada à bolsa durante a fase inicial da Fonte.

[001503] 63. Usar a técnica de soldagem estéril para prender o recipiente Fonte à tubulação que passa pelo grampo S. Abrir a solda. Remover a tubulação do grampo, conforme necessário.

[001504] 64. Certificar-se de substituir o tubo Fonte no grampo S.

[001505] 65. Tocar no botão Avançar. A sobreposição Source Prime exibida. Verificou-se que a Fonte estava conectada ao kit descartável e

326 / 557 qualquer solda e braçadeiras de plástico na tubulação que levava à Fonte inicial estavam abertas e depois tocar no botão Sim.

[001506] 66. Iniciar a Fonte e exibir a tela Fonte inicial. Observar visualmente que PlasmaLyte estava se movendo através da tubulação conectada à bolsa Fonte. Se nenhum fluido estiver se movendo, pressionar o botão Pausar na tela e determinar se um grampo ou solda ainda está fechado. Depois que o problema for resolvido, pressionar o botão Continuar na tela para reiniciar a Fonte inicial.

[001507] 67. Quando a Fonte inicial for concluído com êxito, a tela Iniciar procedimento é exibida.

[001508] 68. Pressionar o botão Iniciar. A tela de pausa “Pré-lavagem ciclo 1” aparece, com as instruções para “Revestir IP, misturar Fonte”.

[001509] 69. Pré-revestir a bolsa IP.

[001510] 70. Antes de pressionar o botão Iniciar, remover a bolsa IP da balança nº 2 (também pode remover a tubulação da guia de tubulação do orifício superior IP) e inverter manualmente para permitir que o tampão de lavagem seja adicionado durante a etapa inicial do kit descartável para revestir todo as superfícies internas da bolsa.

[001511] 71. Re- pendurar a bolsa IP na balança nº 2 (rótulo na bolsa voltado para a esquerda). Substituir a tubulação do orifício superior na guia da tubulação, se tiver sido removida.

[001512] 72. Misturar a bolsa Fonte.

[001513] 73. Antes de pressionar o botão Iniciar, remover a bolsa Fonte da balança nº 1 e inverter a mesma várias vezes para criar uma suspensão celular homogênea.

[001514] 74. Re-pendurar a bolsa Fonte na balança nº 1 ou no suporte para soro IV. Certificar-se de que a bolsa não esteja balançando.

[001515] 75. Pressionar o botão Iniciar.

[001516] 76. LOVO começou a processar o fluido da bolsa Fonte e a

327 / 557 tela do ciclo de lavagem 1 é exibida.

[001517] Durante o procedimento LOVO, o sistema parou automaticamente para permitir ao operador interagir com diferentes bolsas. Telas diferentes foram exibidas durante diferentes pausas. Seguir as instruções correspondentes para cada tela. Pausa para enxágue de Fonte

[001518] Após drenar a bolsa Fonte, o LOVO adicionou um tampão de lavagem à bolsa Fonte para enxaguar a bolsa. Depois que o volume configurado de tampão de lavagem foi adicionado à bolsa Fonte, o LOVO fez uma pausa automaticamente e exibiu a tela de Pausa de enxague de Fonte.

[001519] Quando a tela de Pausa de enxague de Fonte é exibida, o operador:

1. Removeu a bolsa Fonte da balança nº 1.

[001520] 1. Inverteu a bolsa Fonte várias vezes para permitir que o tampão de lavagem tocasse todo o interior da bolsa.

[001521] 2. Voltou a pendurar a bolsa Fonte na balança nº 1. Verifique se a bolsa Source não está oscilando na balança #1.

[001522] 3. Pressionou o botão Continuar.

[001523] O LOVO processou o fluido de enxágue a partir da bolsa Fonte, então continuou com o procedimento automatizado. Misturar bolsa IP na pausa

[001524] Para preparar as células para outra passagem pelo centrifugador, a bolsa IP foi diluída com tampão de lavagem. Depois de adicionar o tampão de lavagem à bolsa IP, o LOVO fez uma pausa automaticamente e exibiu a tela de pausa “Misturar bolsa IP”.

[001525] Quando a tela de pausa “Misturar bolsa IP” é exibida, o operador:

[001526] 1. Removeu a bolsa IP da balança nº 2. Também pode remover a tubulação do guia de tubulação do orifício superior do IP.

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[001527] 2. Inverteu a bolsa IP várias vezes para misturar completamente a suspensão de células.

[001528] 3. Voltou a pendurar a bolsa IP na balança # 2. Também substituiu o tubo de orifício superior IP na guia de tubo, se ele foi removido. Verificar se a bolsa IP não está oscilando na balança #2.

[001529] 4. Pressionou o botão Continuar. O LOVO começou a processar o fluido da bolsa IP. Pausar manipular os cantos do IP

[001530] Durante o ciclo final de lavagem do procedimento LOVO, as células foram bombeadas da bolsa IP, através do centrifugador e para a bolsa de retido (Produto Final). Quando a bolsa IP estava vazia, 10 mL de tampões de lavagem foram adicionados ao orifício inferior da bolsa IP para enxaguar a bolsa. Depois de adicionar o fluido de lavagem, o LOVO fez uma pausa automaticamente e exibiu a tela de pausa “Manipular os cantos IP”.

[001531] Quando a tela de pausa “Massage IP corner” é exibida, o operador:

1. NÃO removeu a bolsa IP da balança nº 2.

[001532] 2. Com a bolsa IP ainda pendurada na balança nº 2, manipular os cantos da bolsa para colocar as células residuais em suspensão.

[001533] 3. Verificar se a bolsa IP não está oscilando na balança nº 2.

[001534] 4. Pressionar o botão Continuar.

[001535] 5. O LOVO começou a bombear o líquido de lavagem da bolsa IP.

[001536] No final do procedimento LOVO, a tela Remover produtos é exibida. Quando esta tela era exibida, todas as bolsas do kit LOVO podiam ser manipuladas.

[001537] Nota: Não tocar em nenhuma bolsa até que a tela Remover produtos seja exibida.

[001538] Colocar um hemostato na tubulação muito perto do orifício na

329 / 557 bolsa de Retido para impedir que a suspensão de células sedimente na tubulação e termosselar de modo triplo abaixo do hemostato.

[001539] Remover a bolsa de retido quebrando o selo do meio e transferir para o BSC. Seguir as instruções na tela Remover produtos

[001540] Tocar no botão Avançar. Todos os grampos mecânicos LOVO foram abertos e a tela Remover kit é exibida.

[001541] Seguir as instruções na tela Remover kit. Quando concluído, prosseguir.

[001542] Tocar no botão Avançar. Todos os grampos mecânicos LOVO fecharam e a tela Resumo dos resultados foi exibida. Registrar os dados na tela de resumo dos resultados na Tabela 17. Fechar todas as bombas e suporte filtrado. TABELA 17. Tabela de resumo dos resultados do LOVO Tempo Tempo Tempo Volume Volume Volume Volume Solução decorrido Processamento pausa Fonte (mL) Retido (mL) Filtrado 1 (mL) Processamento fonte decorrido (mL) (parêntese #) (parêntese #) A. B. C. D. E. F. G.

[001543] Tocar o próximo botão. Exibir a tela Seleção de Protocolo. Procedimento de desligamento do LOVO

[001544] 1. Verificar que todos os grampos estejam fechados e que o suporte do filtro esteja na posição vertical.

[001545] 2. Tocar no botão PARADA na frente do LOVO.

[001546] 3. Sobreposição de decisão do botão PARADA é exibida.

[001547] 4. Sobreposição de confirmação de desligamento é exibida.

[001548] 5. Tocar no botão Sim. A tela Desligando é exibida.

[001549] 6. Após alguns segundos, a tela Desligar é exibida. Quando esta tela foi exibida, desligar o LOVO usando o interruptor na parte traseira esquerda do instrumento.

[00742] Registrar volume final do produto formulado em uma tabela.

[001550] Calcular quantidade de IL-2 requerida da tabela de produto

330 / 557 A. Calcular quantidade de IL-2 necessária durante produto final. (300 IU/ml de IL-2 produto final): Volume produto final (ml) [Volume de produto formulado de células de tabela de volume de produto formulado final ]x 300IU/ml = IU de IL-2 requerido _______________ml X 300 IU = ______________IU de IL-2 requerido B. IU IL-2 requerida ÷ diluição de carga de trabalho (Concentração de 6x104 IU/mL) preparada em etapa de preparação de IL-2 = volume (ml) de IL-2 para adicionar ao produto final. _____________ IU de IL-2 requerida de acima] ÷ 60.000 IU/ml = __________ ml IL-2 carga de trabalho Determinar o número de criobolsas e reter o volume

[001551] Marcar no volume alvo e reter a tabela abaixo do número de bolsas de crioconservação e do volume de amostra de retenção para o produto.

[001552] Cálculo de volume/bolsa alvo: (Volume final formulado - ajuste de volume devido a não obter 100% de recuperação = 10 mL) / # bolsas.

[001553] Preparar células com 1:1 (vol: vol) CS10 (CryoStor 10, BioLife Soluções) e IL-2.

1. Montar o aparelho de conexão

[001554] 1.1 Soldar de modo estéril as criobolsas CS750 no aparelho CC2 Cell Connect, substituindo uma das extremidades luer macho distais de cada bolsa.

[001555] 1.2 Reter os grampos na posição fechada.

[001556] 1.3 Rotular as bolsas 1-4.

2. Preparar células com IL-2 e aparelho conectado.

[001557] 2.1 No BSC, prender a bolsa do produto de células com um conjunto de transferência de plasma de 4 “ com conector luer fêmea. Verificar se o grampo estava fechado no conjunto de transferência.

[001558] 2.2 Com uma seringa de tamanho apropriado, retirar o volume de diluição de trabalho de IL-2 determinado na Tabela Final do Produto.

[001559] 2.3 Distribuir no produto LOVO.

[001560] 2.4 Soldar de modo estéril a bolsa de produto LOVO na linha de ponta CC2 única, removendo a ponta.

[001561] 2,5 Colocar as células e o aparelho na bolsa de transporte e colocar a 2-8°C por ≤ 15 min.

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3. Adicionar CS10

[001562] 3.1 No BSC fixar a torneira de 3 vias ao luer macho na bolsa de CS10 frio.

[001563] 3.2 Fixar a seringa de tamanho apropriado ao luer fêmea da torneira.

[001564] 3.3 Desconectar a bolsa e retirar a quantidade de CS10 determinada na tabela “Volume final do produto formulado”.

[001565] 3.4 Remover a seringa e tampa vermelha.

[001566] 3,5 Repetir se forem necessárias várias seringas.

[001567] 3.6 Remover as células/aparelho CC2 do refrigerador de 2-8°C e colocar no BSC.

[001568] 3.7 Fixar a primeira seringa contendo CS10 no luer médio da torneira. Girar a torneira para que a linha das bolsas CS750 esteja na posição “Desligada”.

[001569] 3.8 Lentamente e com mistura suave, adicionar CS10 (1:1, vol: vol) às células.

[001570] 3.9 Repetir para seringas adicionais de CS10. Adição de produto de células formulado em criobolsas

[001571] 1. Substituir seringa por seringa de tamanho apropriado para o volume de células a serem colocadas em cada bolsa criogênica.

[001572] 2. Misturar o produto de células.

[001573] 3. Abrir o grampo que leva ao bolsa de produtos de células e puxar o volume apropriado.

[001574] 4. Girar a torneira para que o bolsa do produto de células esteja na posição “DESLIGADO” e distribua o conteúdo da seringa na criobolsa nº

1. Limpar a linha com ar da seringa. Registrar o volume final do produto

[001575] 1. Usando um orifício sem agulha e uma seringa de tamanho apropriado, retirar a quantidade de retenção determinada anteriormente.

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[001576] 2. Colocar o retido em um tubo cônico de 50 mL rotulado como “Reter”.

[001577] 3. Usando a seringa acoplada à interface de tubos, remover todo o ar da bolsa puxando as células para cerca de 2,54 cm além da bolsa na tubulação. Grampear e termosselar. Colocar a 2-8°C.

[001578] 4. Girar a torneira para que as criobolsas estejam na posição “Desligada”.

[001579] 5. Misturar as células na bolsa de produtos de células e repetir as etapas de 3 a 8 para as bolsas restantes do CS750, usando uma nova seringa na torneira e uma nova seringa para obter o retido de células.

[001580] 6. Retidos devem ser retirados para processamento quando o produto estiver no CRF.

[001581] Procedimento em congelador com taxa controlada (CRF) (ver também Exemplo 9)

[001582] 1. Ligar o CRF (CryoMed Controlled Rate Freezer, Modelo 7454) e o laptop associado.

[001583] 2. Conectar ao computador usando conta e senha.

[001584] 3. Abrir ícone do congelador de taxa controlada, localizado na área de trabalho.

[001585] 4. Clicar no botão Executar na tela principal.

[001586] 5. Clicar em Abrir perfil, clicar em Abrir.

[001587] 6. Digitar o Nome do arquivo de Executar, seguido pela data neste formato: runMMDDYYYY.

[001588] 7. Inserir a etiqueta de dados como a data sem traços como MMDDYYY.

[001589] 8. Fechar porta para o CRF.

[001590] 9. Clicar em Iniciar Ciclo.

[001591] 10. Selecionar COM 6 no menu suspenso.

[001592] 11. Clicar em Ok. Esperar cerca de 30 segundos.

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[001593] 12. Quando “Download do perfil” aparecer, clicar em OK. Clicar em Salvar. (Ver Exemplo 9 para obter detalhes do perfil de congelamento de taxa controlada.)

[001594] 13. Esperar para pressionar o botão verde até que as amostras estarem no CRF. O congelador foi mantido a 4°C até estar pronto para adicionar os mesmos.

[001595] 14. Adicionar amostras ao CRF.

[001596] 15. Aguardar até que CRF retornar a 4°C. Quando a temperatura foi atingida, clicar no botão verde para continuar. Este programa iniciado vai para a próxima etapa do programa.

[001597] 16. Realizar uma inspeção visual das criobolsas para o seguinte (Nota: não inspecionar super- ou sub-enchimento): integridade do recipiente, integridade do orifício, integridade da vedação, presença de aglomerados de células e presença de partículas.

[001598] 17. Colocar etiquetas aprovadas em cada bolsa.

[001599] 18. Verificar etiqueta de produto final, incluindo: Número do lote, nome do produto, data do fabricante, volume do produto, outros aditivos, temperatura de armazenamento e validade.

[001600] 19. Colocar cada criobolsa (com etiqueta) em uma bolsa de cobertura.

[001601] 20. Termosselar.

[001602] 21. Colocar em um cassete frio.

[001603] 22. Repetir para cada bolsa.

[001604] 23. Colocar as criobolsas rotuladas em cassetes pré- condicionados e transferir para o CRF.

[001605] 24. Distribuir uniformemente os cassetes na prateleira no CRF.

[001606] 25. Aplicar o termopar de fita no cassete central ou colocar a bolsa fictícia na posição central.

[001607] 26. Fechar a porta do CRF.

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[001608] 27. Quando a temperatura da câmara atingir 4°C +/- 1,5°C, pressionar “Executar” no software de Interface do PC.

[001609] 28. Registrar o tempo e a temperatura da câmara em que o produto é transferido para o CRF. Processamento de amostra de controle de qualidade

[001610] 1. Transferir assepticamente os seguintes materiais para o BSC, conforme necessário, e rotular de acordo com a tabela abaixo:

2. Utilizar uma nova pipeta para pipetar o seguinte: QC e tabela de retenção

[001611] 3. Entregar para QC: 1- tubo de contagem de células, 1 - tubo de endotoxina, 1 - tubo de micoplasma, 1- tubo de Gram -coloração, 1- tubo de reestimulação de tubo e 1 - tubo de fluxo ao QC para testes imediatos. Os tubos restantes duplicados foram colocados no congelador de taxa controlada.

[001612] 4. Entrar em contato com o supervisor de CQ notificando os testes necessários.

[001613] 5. Ver Tabela 18 para instruções de teste e armazenamento. TABELA 18. Instruções de teste e armazenamento. Teste Vaso Contagem celular e Criofrascos viabilidade Micoplasma Criofrasco armazenado a 4°C até completar teste. Inocular 0,5 mL em um frasco de cultura anaeróbica e 0,5mL em um frasco de Esterilidade cultura aeróbica. Gram-coloração Criofrasco armazenado a 4°C até completar teste. Endotoxina Criofrasco armazenado a 4°C até completar teste. Fluxo Criofrasco armazenado a 4°C até completar teste. Crioconservar para futuro teste: Consiste em 5 frasco satélite, 1 – tubo de Retenção pós- contagem celular,1- tubo de endotoxina, 1- tubo de micoplasma, 1- tubo de formulação gram-coloração, e 1- tubo de fluxo para QC para teste imediato. Amostra é entregue em temperatura ambiente e teste deve ser iniciado dentro Re-estimulação de 30 minutos dos resultados da contagem celular.

Contagem de células

[001614] Realizar uma contagem única de células em cada amostra e gravar os dados e anexar a contagem de dados brutos ao registro de lote. Documentar o programa de contagem do Cellometer. Verificar que a diluição correta foi inserida no Cellometer.

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[001615] Crioconservação de células de retenção pós-formulação:

[001616] 1. Colocar frasco no CRF. Calcular quantidade de IL-2 requerida da tabela de produto

[001617] 2. Mover para o local de armazenamento após a conclusão do congelamento e registrar data e hora no CFR. Registrar data e hora movidas para LN2. Teste de microbiologia

[001618] 1. Solicitar o teste de placas de sedimentação ao laboratório de microbiologia.

[001619] 2. Registrar os números de acesso.

[001620] 3. Solicitar testes para esterilidade aeróbica e anaeróbica.

[001621] 4. Assegurar entrega de pratos e garrafas ao laboratório de microbiologia. Pós-crioconservação de bolsas de produtos de células

[001622] 1. Parar o freezer após a conclusão do ciclo. Ciclo pode ser interrompida clicando no botão Parar ou pressionando a tecla Voltar no teclado do congelador.

[001623] 2. Remover as criobolsas do cassete

[001624] 3. Transferir cassetes para a fase de vapor LN2.

[001625] 4. Local de armazenamento gravado.

[001626] 5. Inserir comentários adicionais quando a janela de entrada de texto for aberta novamente. Essa janela apareceu independentemente do método de parada de Ciclo.

[001627] 6. Imprimir o relatório de perfil e anexar ao registro do lote rotulado com o número do lote para o ciclo.

[001628] 7. Finalizar o Modo Quente e fechar a tela Executar com o botão Sair. EXEMPLO 9: Processo de Crioconservação

[001629] Este exemplo descreve o método e processo de

336 / 557 crioconservação para TILs preparados com o procedimento fechado abreviado descrito acima em Exemplo 8 usando o congelador de taxa controlada CryoMed, Modelo 7454 (Thermo Scientific).

[001630] O equipamento usado, além do descrito em Exemplo 9, é como a seguir: prateleira de suporte do cassete de alumínio (compatível com bolsas de congelador CS750), cassetes de crioarmazenamento para bolsas de 750 mL, tanque de nitrogênio líquido de baixa pressão (22 psi), refrigerador, sensor de termoplar (tipo de fita para bolsas), e bolsas de congelamento CryoStore CS750 (OriGen Scientific).

[001631] O processo de congelamento provê uma taxa de 0,5°C a partir da nucleação a -20°C e 1°C por minuto de taxa de resfriamento até temperatura final de -80°C. Os parâmetros do programa são como a seguir: Etapa 1 – esperar a 4°C; Etapa 2: 1,0o C/min (temperatura da amostra) a -4°C; Etapa 3: 20,0°C/min (temperatura da câmara) a -45°C; Etapa 4: 10,0°C/min (temperatura da câmara) a -10,0°C; Etapa 5: 0,5°C/min (temperatura da câmara) a -20°C; e Etapa 6: 1,0°C/min (temperatura da amostra) a -80°C.

[001632] A representação do procedimento deste exemplo em conjunto com o processo de Exemplos 1 a 8 é mostrado em Figura 11. EXEMPLO 10: Caracterização de Processo 2A TILs

[001633] Este exemplo descreve a caracterização de TILs preparados com o procedimento fechado abreviado descrito acima. Em resumo, o procedimento fechado abreviado (processo 2A, descrito em Exemplos 1 a 9) tem vantagens sobre os processos de fabricação de TILs anteriores dados em Tabela 19. Vantagens para o pré-REP podem incluir: fragmentos aumentados de tumor por frasco, tempo de cultura encurtado, número reduzido de etapas, e/ou podendo conduzir a um sistema fechado. Vantagens para a transição de pré-REP para REP podem incluir: processo pré-REP-para-REP encurtado, número reduzido de etapas, seleção de fenotipagem eliminada, e/ou podem conduzir a sistema fechado. Vantagens para a REP podem incluir: número

337 / 557 reduzido de etapas, duração mais curta de REP, transferência em sistema fechado de TIL entre frascos, e/ou trocas de meio de sistema fechado. Vantagens para a coleta podem incluir: número reduzido de etapas, lavagem automatizada de células, sistema fechado, e perda reduzida de produto durante lavagem. Vantagens para a formulação final e/ou produto podem incluir flexibilidade de expedição. TABELA 19. Comparação de processo 1C exemplar e uma modalidade de processo 2A. Etapa de Processo 1C - Modalidade Processo 2A - Modalidade processo 40 fragmentos por 1 frasco G-REX - 4 fragmentos por 10 frascosG-REX -10 100M pré-REP 1-21 dias de duração 11 dias de duração TILs pré-REP são congelados até fenotipados durante seleção então TILs pré-REP diretamente se move para Transição de descongelados para prosseguir para a REP REP em dia 11 pré-REP para (~dia 30)

REP REP requer >40×106 TIL REP requer 25-200×106 TIL 6 frascos G-REX -100M em REP dia 0 1 frasco G-REX -500M em dia 11 5×106 TIL e 5×108 PBMC alimentadoras 25-200×106 TIL e 5x109 PBMC por frasco em REP dia 0 alimentadoras em dia 11

REP Dividir em ≤ 6 frascos G-REX -500M Dividir em 18-36 frascos em REP dia 7 em dia 16 14 dias de duração 11 dias de duração TILs coletados no sistema de lavagem de Colheita TILs coletados via centrifugação células automatizado LOVO' Produtos crioconservados em Produto fresco em Hypothermosol PlasmaLyte-A + 1% HSA e CS10 Formulação armazenado em LN2 final Bolsa única de infusão alíquotas múltiplas estabilidade de expedição limitada estabilidade de expedição mais longa Tempo estimado 43-55 dias 22 dias processo global

[001634] Um total de 9 experiências foram realizados usando TILs derivados de 9 tumores descritos em Tabela 20. Todos os dados mostrados aqui foram medidos a partir de produto de TILs descongelado e congelado a partir do processo 1C e uma modalidade de processo 2A. TABELA 20. Descrição de doadores de tumor, datas de processamento e

338 / 557 locais de processamento. Tumor ID Tipo de tecido Fonte Tecido M1061 Melanoma grupo MT Primário – pé lateral esquerdo M1062 Melanoma Moffitt N/A M1063 Melanoma grupo MT Metastático C - virilha direita M1064 Melanoma grupo MT Metastático C – tornozelo esquerdo M1065 Melanoma Bio Options Metastático- linfonodo axilar EP11001 ER+PR+ grupo MT Primário - carcinoma dutal invasivo da mama esquerda M1056* Melanoma Moffitt N/A M1058* Melanoma grupo MT Metastático - Stage IIB couro cabeludo direito M1023* Melanoma Atlantic Primário – axila direita Health

[001635] Os procedimentos descritos aqui para processo 2A foram usados para produzir os TILs para caracterização nesse exemplo. Brevemente, para a REP, em Dia 11, um frasco G-REX -500M contendo 5 L de CM2 suplementado com 3000 IU/ml rhil-2, 30ng/mL anti-CD3 (Clone OKT3) e 5 × 109 células PBMC alimentadoras irradiadas alogênicas foram preparadas. TILs coletados a partir de pré-REP em frasco G-REX -100M após redução de volume foram contados e semeados no frasco G-REX -500M a uma densidade na faixa entre 5 × 106 e 200 × 106 células. O frasco foi então colocado em uma incubadora de cultura de tecido umidificada a 37°C, e 5% CO2, durante cinco dias. Em Dia 16, volume do frasco G-REX -500M foi reduzido, TILs foram contados e sua viabilidade determinada. Neste ponto, os TILs foram expandidos em múltiplos frasco G-REX -500Ms (até um máximo de seis frascos), cada com uma densidade de semeadura de 1 × 109 TILs/frasco. Todos os frascos foram então colocados em incubadores de cultura de tecido umidificado a 37°C, e 5% CO2, por mais seis dias. Em Dia 22, o dia de colheita, cada frasco foi reduzido em volume por 90%, as células foram reunidas em pools e filtradas através um filtro de sangue de 170 µm, e, então, coletadas em uma bolsa de 3 L Origin EV3000 ou equivalente em preparação para lavagem automatizada usando LOVO. TILs foram lavados usando o sistema de processamento de células automatizado LOVO que substitui 99,99% de meios de cultura celular com um tampão de lavagem consistindo em PlasmaLyte-A suplementado com 1% HSA. O LOVO opera

339 / 557 usando tecnologia de membrana de filtração giratória que recupera acima de 92% do TIL enquanto virtualmente eliminando componentes residuais da cultura de tecido, incluindo soro, fatores de crescimento, e citocinas, assim como outros resíduos e particulados. Após completar a lavagem, um contagem celular foi realizada para determinar a expansão dos TILs e sua viabilidade quando da coleta. CS10 foi adicionado aos TLs lavados em uma razão 1:1 volume:volume para obter a formulação final de Processo 2A. O produto final formulado foi dividido em alíquotas em bolsas de crioarmazenamento, vedadas, e colocadas em cassetes de alumínio pré- resfriados. Bolsas de crioarmazenamento contendo TILs foram então congeladas usando um congelador de taxa controlada CryoMed (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) de acordo com os procedimentos descrito aqui, incluindo em Exemplo 9.

[001636] Contagens celulares e viabilidade percentual para os nove ciclos foram comparados em Figuras 12 e 13.

[001637] Os marcadores de superfície celular mostrando os seguintes resultados foram analisados usando citometria de fluxo (citômetro de fluxo Canto II, Becton, Dickinson, e Co., Franklin Lakes, NJ, USA) usando reagentes apropriados comercialmente disponíveis. Resultados para marcadores de interesse são mostrados em Figura 14 até Figura 23.

[001638] Diversos métodos foram usados para medir o comprimento de telômeros em preparações citológicas e DNA genômico. A análise do fragmento de restrição de telômero (TRF) é o padrão ouro para medir comprimento do telômero (de Lange et al., 1990). No entanto, a maior limitação de TRF é a exigência de uma grande quantidade de DNA (1,5 µg). Aqui, duas técnicas amplamente usadas para a medição de comprimento dos telômeros foram aplicadas, ou seja, hibridização com fluorescência in situ (FISH) e PCR quantitativo.

[001639] Flow-FISH foi realizado usando o kit Dako (K532711-8 RUO

340 / 557

Code K5327 Telomere PNA Kit/FITC para citometria de fluxo, PNA FISH Kit/FITC.

Flow, 20 testes) e as instruções do fabricante foram seguidas para medir o comprimento médio de repetição de telômero.

Brevemente, as células foram coloridas na superfície com CD3 APC durante 20 minutos a 4°C, seguido por GAM Alexa 546 durante 20 minutos.

O completo antígeno- anticorpo foi então reticulado com 2 mM reticulador químico BS3 (Fisher Scientific). A sonda PNA-telômero ligando em uma população padrão de células T com telômeros longos, linhagem celular de leucemia Jurkat 1301 T (1301 células) foi usada como um padrão de referência interna em cada teste.

TILs individuais foram contados após incubação anticorpo e misturados com 1301 células (ATCC) a uma razão celular 1:1. 5 × 105 TILs foram misturados com 5 × 105 células 1301. A hibridização in situ foi realizada em solução de hibridização (70% formamida, 1% BSA, 20mM Tris pH 7,0) em duplicata e na presença e ausência de uma sonda de telômero PNA conjugada a FITC (Panagene), FITC-00-CCC-TAA-CCC-TAA-CCC-TAA, complementar à sequência de repetição de telômero a uma concentração final de 60nM.

Após adição da sonda telômero PNA, células foram incubados durante 10 minutos a 81°C em um banho de água com agitação.

As células foram então colocados no escuro a temperatura ambiente durante a noite.

Na próxima manhã, sonda de telômero em excesso foi removida por lavagem 2 vezes com PBS pré- aquecido a 40°C.

Após as lavagens, DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA) foi adicionado a uma concentração final de 75 ng/mL.

A coloração de DNA com DAPI foi usada para reunir as células na população G0/G1. A análise da amostra foi realizada usando citômetro de fluxo do requerente (BD Canto II, Mountain View, CA). A fluorescência do telômero da amostra de teste foi expressada como uma porcentagem da fluorescência (fl) das células 1301 pela seguinte fórmula: comprimento relativo do telômero = [(média FITC fl células de teste com sonda- média FITC fl células de teste sem sonda) × índice DNA células 1301 × 100] / [(média FITC fl células 1301 com sonda –

341 / 557 média FITC fl células 1301 sem sonda) × célula de teste de índice de DNA.

[001640] qPCR em tempo real também foi usado para medir comprimento relativo do telômero (Nucleic Acids Res. 2002 May 15; 30(10): e47., 20, Leukemia, 2013, 27, 897–906). Brevemente, a razão de número de cópias de repetição de telômero número de cópias de gene único (T/S) foi determinada usando um ciclador térmico BioRad PCR (Hercules, CA) em um formato de 96 cavidades. Dez ng de DNA genômico foram usados para a reação de PCR de telômero ou hemoglobina (hgb) e os iniciadores usados foram os seguintes: iniciador Tel-1b (CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT), iniciador Tel-2b (GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT), iniciador hgb1 (GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC), e iniciador hgb2 (CACCAACTTCATCCACGTTCACC). Todas as amostras foram analisadas por ambas as reações de telômero e hemoglobina, e a análise foi realizada em triplicata na mesma placa. Além das amostras de teste, cada placa com 96 cavidades continha uma curva padrão de cinco pontos 0,08 ng a 250 ng usando DNA genômico isolado da linhagem celular 1301. A razão T/S (-dCt) para cada amostra foi calculada por subtraindo o valor do ciclo limiar de hemoglobina mediano (Ct) a partir de valor de telômero mediano Ct. A razão relativa T/S (-ddCt) foi determinada subtraindo a razão T/S do ponto da curva padrão de 10,0 ng a partir da razão T/S de cada amostra desconhecida.

[001641] Resultados Flow-FISH são mostrados em Figuras 24 e 25, e nenhuma diferença significante foi observada entre processo 1C e processo 2A, sugerindo as propriedades surpreendentes dos TILs produzidos por processo 2A não foram não previsíveis a partir da idade dos TILs apenas.

[001642] Em conclusão processo 2A produziu um produto potente de TILs com um fenótipo “jovem” como definido por níveis elevados de moléculas co-estimulatórias, baixos níveis de marcadores de exaustão, e uma capacidade aumentada para secretar citocina quando de reativação. A

342 / 557 plataforma de expansão abreviada de 22 dias permite a geração rápida de doses em escala clínica de TILs para pacientes em necessidade urgente de terapia. O produto crioconservado de fármaco introduz eficiências logísticas críticas permitindo uma rápida fabricação e flexibilidade em distribuição. Este método de expansão supera barreiras tradicionais para a aplicação mais ampla de terapia com TILs. EXEMPLO 11: USo de coquetel de citocinas IL-2, IL-15, e IL-21

[001643] Este exemplo descreve o uso de citocinas IL-2, IL-15, e IL-21, que serve como um fator adicional de crescimento de células T, em combinação com o processo de TIL de Exemplos 1 a 10.

[001644] Usando o processo de Exemplos 1 a 10, TILs foram cultivados a partir de tumores colorretal, melanoma, cervical, mama negativo triplo, pulmão e renal em presença de IL-2 em um braço do experimento e, em vez de IL-2, uma combinação de IL-2, IL-15, e IL-21 em outro braço no início da cultura. Ao completar pré-REP, culturas foram avaliadas para expansão, fenótipo, função (CD107a+ e IFN-γ) e repertório TCR Vβ. IL-15 e IL-21 são descritas em algum ponto aqui e em Gruijl, et al., IL-21 promove a expansão de linfócitos infiltrando os tumores CD27+CD28+ com alto potencial citotóxico e baixa expansão colateral de células T regulatórias, Santegoets, S. J., J Transl Med., 2013, 11:37 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/).

[001645] Os resultados mostraram que expansão intensificada de TILs (>20%), em ambas células CD4+ e CD8+ tratadas com IL-2, IL-15, e IL-21, condições foram observadas em múltiplas histologias com relação a condições com apenas IL-2. Houve um desalinhamento (skewing) para uma população predominantemente CD8+ com um repertório de TCR Vβ desalinhado nos TILs obtidos a partir de culturas tratadas com IL-2, IL-15, e IL-21 com relação a culturas com IL-2 somente. IFN-γ e CD107a foram elevados em TILs tratados com IL-2, IL-15, e IL-21, em comparação com

343 / 557 TILs tratados somente com IL-2. EXEMPLO 12: Estudo Fase 2, de centro múltiplo, com três coortes em Melanoma

[001646] Este estudo Fase 2, de centro múltiplo, com três coortes é projetado para avaliar a segurança e eficácia de uma terapia com TILs fabricados de acordo com processo 1C (como descrito aqui) em pacientes com melanoma metastático. Coortes um e dois irão inscrever 30 pacientes cada e coorte três é um coorte de re-tratamento para uma segunda infusão de TIL em até dez pacientes. Os dois primeiros coortes são avaliados em dois diferentes processos de fabricação: processos 1C e uma modalidade de processo 2A (descrito em Exemplos 1 a 10, respectivamente. Pacientes em coorte um recebem TILs frescos, não crioconservados e pacientes em coorte dois recebem produto fabricado através do processo descrito em Exemplos 1 a 10, dando um produto crioconservado. O projeto de estudo é mostrado em FIG. 26. O estudo é um estudo Fase 2, de centro múltiplo, três coortes para avaliar a segurança e eficácia de TILs autólogos para tratamento de subpopulações de pacientes com melanoma metastático. Critérios de inclusão chave incluem: melanoma metastático mensurável e ≥ 1 lesão resseccionável para geração de TIL; pelo menos uma linha anterior de terapia sistemática; idade ≥ 18; e estado de desempenho ECOG de 0-1. Os coortes de tratamento incluem produto não crioconservado de TILs (preparados usando processo 1C), produto crioconservado de TILs (preparados usando uma modalidade de processo 2A), e retratamento com produto de TILs para pacientes sem resposta ou que progridem após resposta inicial. O ponto final primário é segurança e o ponto final secundário é eficácia, definido como taxa de resposta objetiva (ORR), taxa de remissão completa (CRR), sobrevivência livre de progressão (PFS), duração de resposta (DOR), e sobrevivência global (OS). EXEMPLO 13: QUALIFICANDO LOTES INDIVIDUAIS DE CÉLULAS

344 / 557 MONONUCLEARES PERIFÉRICAS GAMA-IRRADIADAS

[001647] Este Exemplo descreve um novo procedimento abreviado para qualificar lotes individuais de células mononucleares periféricas gama- irradiadas (PBMCs, também conhecidas como MNC) para uso como células alimentadoras alogênicas em métodos exemplares descritos aqui.

[001648] Cada lote de MNC alimentadoras irradiadas foi preparado a partir de um doador individual. Cada lote ou doador foi triado individualmente por sua capacidade para expandir TILs no REP na presença de anticorpo anti-CD3 purificado (clone OKT3) e interleucina-2 (IL-2). Além disso, cada lote de células alimentadoras foi testado sem a adição de TIL para verificar que a dose recebida de radiação gama foi suficiente para tornar as mesmas incompetentes em replicação. Definições/Abreviaturas

[001649] BSC – Armário com segurança biológica CD3 – Agrupamento de diferenciação 3; T-linfócitos proteína de marcador de superfície CF – Centrífugo CM2 – Meio completo para TIL # CMO – Organização de fabricação sob contrato CO2 –Dióxido de carbono EtOH – Álcool etílico GMP – Boas práticas de fabricação IL-2 – Interleucina 2 IU – Unidades internacionais LN2 – Nitrogênio líquido mini-REP – Mini-protocolo de expansão rápida ml – Mililitro MNC – Células mononucleares NA – Não aplicável

345 / 557 OKT3 – anticorpo MACS GMP CD3 puro (clone OKT3) PPE – Equipamento de proteção pessoal pré-REP – Pré-protocolo de expansão rápida QS – Quantum Satis; encher até esta quantidade REP – Protocolo de expansão rápida TIL – Linfócitos infiltrando os tumores T25 – frasco de cultura de tecido 25cm2 µg – Microgramas µL – Microlitro

PROCEDIMENTO Fundamentos

[001650] 7.1.1 Células alimentadoras MNC paradas no crescimento gama-irradiadas foram requeridas durante REP de TIL. Os receptores de membrana em MNCs alimentadoras ligam a anticorpo anti-CD3 (clone OKT3) e reticulam em TIL no frasco REP, estimulando a expansão de TILs. Lotes de alimentadoras foram preparados a partir de leucaférese de sangue total retirado de doadores individuais. O produto de leucaférese foi submetido a centrifugação sobre Ficoll-Hypaque, lavado, irradiado, e crioconservado sob condições de GMP.

[001651] 7.1.2 É importante que os pacientes que receberam terapia com TILs não sejam infundidos com células alimentadoras viáveis, porque isto pode resultar em doença enxerto-versus-hospedeiro Disease (GVHD). As células alimentadoras são, assim, paradas no crescimento por dosagem das células com gama-irradiação, resultando em rupturas do DNA fita dupla e a perda de viabilidade celular das células MNC quando da recultura. Critérios de avalição e configuração experimental

[001652] Lotes de alimentadoras foram avaliados em dois critérios: 1) sua capacidade para expandir TIL em co-cultura >100 vezes e 2) sua incompetência de replicação.

346 / 557

[001653] 7.2.2 Lotes de alimentadoras foram testados em formato mini- REP usando duas linhagens primárias TILs pré-REP cultivadas em frascos de cultura de tecido T25 verticais.

[001654] 7.2.3 Lotes de alimentadoras foram testados contra duas linhagens de TIL distintas, como cada linhagem de TIL é singular em sua capacidade para proliferar em resposta a ativação em um REP.

[001655] 7.2.4 Como um controle, um lote de células MNC irradiadas alimentadoras que tinha historicamente mostrado como atendendo aos critérios de 7.2.1 foi testado junto dos lotes de teste.

[001656] 7.2.5 Para assegurar que todos os lotes testados em um único experimento recebem teste equivalente, cargas suficientes das mesmas linhagens TILs pré-REP foram disponíveis para testar todas as condições e todos os lotes de alimentadoras.

[001657] 7.2.6 Para cada lote de células alimentadoras testado, houve um total de seis T25 frascos:

7.2.6.1 Linhagem TILs pré-REP #1 (2 frascos)

7.2.6.2 Linhagem TILs pré-REP #2 (2 frascos)

7.2.6.3 controle de alimentadora (2 frascos) NOTA: Frascos contendo linhagens de TIL #1 e #2 avaliaram a capacidade do lote de alimentadoras para expandir TIL. Os frascos de controles avaliaram a incompetência de replicação do lote de alimentadoras Protocolo experimental

7.3.1 Dia -2/3, Descongelar linhagens de TIL

7.3.1.1 Preparar meio CM2.

[001658] 7.3.1.2 Aquecer CM2 em banho d’água 37ºC.

[001659] 7.3.1.3 Preparar 40 ml de CM2 suplementado com 3000IU/ml IL-2. Manter quente até uso.

[001660] 7.3.1.4 Colocar 20 ml de CM2 pré-aquecido sem IL-2 em cada um de dois tubos cônicos de 50ml rotulados com nomes das linhagens de TIL

347 / 557 usadas.

[001661] 7.3.1,5 Remover as duas linhagens designadas TILs pré-REP do armazenamento de LN2 e transferir os frascos para a sala de cultura de tecido.

[001662] 7.3.1.6 Registrar identificação da linhagem de TIL.

[001663] 7.3.1.7 Descongelar os frascos colocando os mesmos dentro de uma bolsa de armazenamento com selada com zíper em um banho d’água 37ºC até uma pequena quantidade de gelo permanecer.

[001664] 7.3.1.8 Pulverizar ou varrer os frascos descongelados com 70% etanol e transferir os frascos para BSC.

[001665] 7.3.1.9 Usando uma pipeta estéril de transferência, imediatamente transferir o conteúdo do frasco em 20ml de CM2 no tubo cônico preparado, rotulado de 50ml.

[001666] 7.3.1.10 QS até 40ml usando CM2 sem IL-2 para lavagem das células.

[001667] 7.3.1.11 Centrifugar a 400 x CF por 5 minutos.

[001668] 7.3.1.12 Aspirar o sobrenadante e recolocar em suspensão em 5ml de CM2 quente suplementado com 3000 IU/ml IL-2.

[001669] 7.3.1.13 Remover alíquota pequena (20µl) em duplicata para contagem celular usando um contador de células automatizado. Registrar as contagens.

[001670] 7.3.1.14 Enquanto contando, colocar o tubo cônico de 50ml com células TIL em uma incubadora umidificada, a 37ºC, 5% CO2, com a tampa solta para permitir troca de gás.

[001671] 7.3.1.15 Determinar concentração de células e diluir TIL a 1 x 106 células/ml em CM2 suplementado com IL-2 a 3000 IU/ml.

[001672] 7.3.1.16 Cultivar em uma placa de 2ml/cavidade de uma placa de cultura de tecido de 24 cavidades, em quantas cavidades for necessário em uma incubadora a 37ºC umidificada, até o Dia 0 do mini-REP.

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[001673] 7.3.1.17 Cultivar as diferentes linhagens de TIL em placas de cultura de tecido de 24 cavidades separadas para evitar confusão e potencial contaminação cruzada.

[001674] 7.3.2 Dia 0, iniciar Mini-REP

[001675] 7.3.2.1 Preparar suficiente meio CM2 para o número de lotes de alimentadoras a ser testado. (Por exemplo, para testar 4 lotes de alimentadoras de uma vez, preparar 800ml de meio CM2).

[001676] 7.3.2.2 Dividir em alíquotas uma porção das CM2 preparados em 7.3.2.1 e suplementar com 3000 IU/ml IL-2 para a cultura das células. (Por exemplo, para testar 4 lotes de alimentadoras de uma vez, preparar 500ml de meio CM2 com 3000 IU/ml IL-2).

[001677] 7.3.2.3 O restante do CM2 sem IL-2 será usado para lavagem de células como descrito abaixo.

[001678] 7.3.2.4 Trabalhando com cada linhagem de TIL, separadamente para evitar contaminação cruzada, remover a placa de 24 cavidades com cultura de TILs a partir de incubadora e transferir para BSC.

[001679] 7.3.2,5 Usando uma pepita de transferência estéril ou 100- 1000µl pipetador e ponta, remover cerca de 1ml de meio de cada cavidade de TIL a ser usado e colocar em uma cavidade não usada da placa de 24 cavidades. Isto foi usado para lavagem das cavidades.

[001680] 7.3.2.6 Usando uma pepita de transferência estéril fresca ou 100-1000µl Pipettor e ponta, misturar o meio restante com TIL em cavidades para recolocar em suspensão as células e, então, transferir a suspensão de células a um tubo cônico de 50ml rotulado com o nome do TIL e registrar o volume.

[001681] 7.3.2.7 Lavar as cavidades com o meio reservado e transferir este volume para o mesmo tubo cônico de 50ml.

[001682] 7.3.2.8 Girar as células a 400 x CF para coletar o grânulo de células.

349 / 557

[001683] 7.3.2.9 Aspirar o meio sobrenadante e recolocar em suspensão o grânulo de células em 2-5ml de meio CM2 contendo 3000 IU/ml IL-2. volume a ser usado com base no número de cavidades coletadas e o tamanho do grânulo – volume deve ser suficiente para assegurar uma concentração de >1,3 x 106 células/ml.

[001684] 7.3.2.10 Usando uma pipeta sorológica, misturar a suspensão de células totalmente e registrar o volume.

[001685] 7.3.2.11 Remover 200µl para uma contagem celular usando um contador de células automatizado.

[001686] 7.3.2.12 Enquanto contando, colocar o tubo cônico de 50 mL com células TIL em uma incubadora a 5% CO2. 37ºC umidificada, com a tampa solta para permitir troca de gás.

[001687] 7.3.2.13 Registrar as contagens.

[001688] 7.3.2.14 Remover o tubo cônico de 50 mL contendo as células de TIL a partir de incubadora e recolocar em suspensão as células a uma concentração de 1,3 x106 células/ml em CM2 quente suplementado com 3000IU/ml IL-2. Retornar o tubo cônico de 50 mL para a incubadora com uma tampa solta.

[001689] 7.3.2.15 Se desejado, manter a placa original de 24 cavidades para nova cultura de qualquer TIL residual.

[001690] 7.3.2.16 Repetir as etapas 7.3.2.4 - 7.3.2.15 para a segunda linhagem de TIL.

[001691] 7.3.2.17 Logo antes de colocar em placas o TIL nos frascos T25 para o experimento, TILs foram diluídos 1:10 para uma concentração final de 1,3 x 105 células/ml como na etapa 7.3.2.35 abaixo. Preparar solução de trabalho MACS GMP CD3 pura (OKT3)

[001692] 7.3.2.18 Retirar a solução de carga de OKT3 (1mg/ml) do refrigerador a 4°C e colocar em BSC.

[001693] 7.3.2.19 Uma final concentração de 30ng/ml OKT3 foi usada

350 / 557 no meio do mini-REP.

[001694] 7.3.2.20 600ng de OKT3 foram necessários durante 20ml em cada frasco T25 do experimento; isto foi o equivalente de 60µl de uma solução de 10µg/ml para cada 20ml, ou 360µl para todos os 6 frascos testados para cada lote de alimentadoras.

[001695] 7.3.2.21 Para cada lote de alimentadoras testadas, obter 400µl de uma diluição 1:100 de 1mg/ml OKT3 para uma concentração de trabalho de 10µg/ml (por exemplo, para testar 4 lotes de alimentadoras de uma vez, obter 1600µl de uma diluição 1:100 de 1mg/ml OKT3: 16µl de 1mg/ml OKT3 + 1.584ml de meio CM2 com 3000IU/ml IL-2.) Preparar os frascos de T25

[001696] 7.3.2.22 Rotular cada frasco com o nome da linhagem de TIL testada, número de frasco replicado, e lote de alimentadoras, número, data, e iniciais do analista

[001697] 7.3.2.23 encher o frasco com o meio CM2 antes de preparar as células alimentadoras.

[001698] 7.3.2.24 Colocar frascos em incubadora a 37°C e 5% CO2, umidificada, para manter quente enquanto esperando adição dos restantes componentes.

[001699] 7.3.2.25 Uma vez as células alimentadoras foram preparadas, os componentes serão adicionados ao CM2 em cada frasco.

[001700] Preparar a solução de trabalho MACS GMP CD3 pura (OKT3). TABELA 21: Soluções

351 / 557 Preparar células alimentadoras

[001701] 7.3.2.26 Um mínimo de 78 x 106 células alimentadoras foi necessário por lote testado para este protocolo. Cada frasco de 1ml congelado por SDBB tinha 100 x 106 células viáveis quando do congelamento. Assumindo uma recuperação de 50% quando do descongelamento do armazenamento em LN2, foi recomendado descongelar pelo menos dois frascos de 1 ml de células alimentadoras por lote dando uma estimativa de 100 x 106 células viáveis para cada REP. Alternativamente, se provido em frascos de 1,8 ml, somente um frasco deu suficientes células alimentadoras.

[001702] 7.3.2.27 Antes do descongelamento das células alimentadoras, pré-aquecer aproximadamente 50ml de CM2 sem IL-2 para cada lote de alimentadoras a ser testado.

[001703] 7.3.2.28 Remover o lote designado de frascos de alimentadoras do armazenamento em LN2 colocar em bolsa zipper de armazenamento, e colocar em gelo. Transferir os frascos-ampolas para a sala de cultura de tecido.

[001704] 7.3.2.29 Descongelar os frascos-ampolas dentro da bolsa zipper de armazenamento fechada por imersão em um banho d’água a 37°C.

[001705] 7.3.2.30 Remover frascos-ampolas da bolsa zipper, pulverizar ou passar pano com 70% EtOH e transferir frascos-ampolas para BSC.

[001706] 7.3.2.31 Usando uma pipeta de transferência, imediatamente transferir o conteúdo dos frascos-ampolas de alimentadoras para 30ml de CM2 quente em um tubo cônico de 50ml. Lavar o frasco-ampola com um volume pequeno de CM2 para remover quaisquer células residuais no frasco- ampola.

[001707] 7.3.2.32 Centrifugar a 400 x CF durante 5 minutos.

[001708] 7.3.2.33 Aspirar o sobrenadante e recolocar em suspensão em 4ml CM2 quente mais 3000 IU/ml IL-2.

[001709] 7.3.2.34 Remover 200 µl for contagem celular usando o

352 / 557 contador de células automatizado. Registrar as contagens.

[001710] 7.3.2.34 Recolocar em suspensão as células a 1,3 x 107 células/ml em CM2 quente, mais 3000 IU/ml IL-2.

[001711] 7.3.2.34 Diluir as células de TIL a 1,3 x 106 células/ml a 1…3 x 105 células/ml. Trabalhar com cada linhagem de TILs independentemente para evitar contaminação cruzada. Configuração de Co-Cultura

[001712] 7.3.2.36 Diluir células TIL de 1,3 x 106 células/ml a 1,3 x 105 células/ml. Trabalhar com cada linhagem de TILs independentemente para evitar contaminação cruzada.

[001713] 7.3.2.36.1 Adicionar 4,5ml de meio CM2 a um tubo cônico de 15 ml.

[001714] 7.3.2.36.2 Remover células de TILs da incubadora e recolocar em suspensão na cavidade usando uma pipeta sorológica de 10 ml.

[001715] 7.3.2.36.3 Remover 0,5ml de células a partir de 1,3 x 106 células/ml de suspensão TIL e adicionar a 4,5ml de meio no tubo cônico de 15 ml. Retornar o frasco-ampola de carga de TILs para a incubadora.

[001716] 7.3.2.36.4 Misturar bem.

[001717] 7.3.2.36,5 Repetir etapas 7.3.2.36,1 – 7.3.2.36.4 para a segunda linhagem de TILs.

[001718] 7.3.2.36.6 Se testando mais do que um lote de alimentadoras de uma vez, diluir os TIL na menor concentração para cada lote de alimentadoras logo antes de colocar na placa os TILs.

[001719] 7.3.2.37 Transferir frascos com meio pré-aquecido para um único lote de alimentadoras a partir de incubadora para o BSC.

[001720] 7.3.2.38 Misturar as células alimentadoras por pipetar para cima e para baixo várias vezes com uma ponta de pipeta de 1ml e transferir 1 ml (1,3 x 107 células) para cada frasco para este lote de alimentadoras.

[001721] 7.3.2.39 Adicionar 60µl de carga de trabalho de OKT3

353 / 557 (10µg/ml) a cada frasco.

[001722] 7.3.2.40 Retornar os dois frascos de controle para a incubadora.

[001723] 7.3.2.41 Transferir 1 ml (1.3 x 105) de cada lote de TIL para o frasco T25 correspondentemente rotulados.

[001724] 7.3.2.42 Retornar os frascos para a incubadora e incubar voltado para cima. Não perturbar até o Dia 5.

[001725] 7.3.2.43 Repetir 7.3.2.36 – 7.3.2.42 para todos os lotes de alimentadoras testadas. Dia 5, Mudança de meio

[001726] 7.3.3.1 Preparar CM2 com 3000 IU/ml IL-2. 10ml é necessário para cada frasco

[001727] 7.3.3.2 Para evitar contaminação cruzada, manipular os frascos para um único lote de alimentadoras de cada vez. Remover frascos a partir de incubadora e transferir para BSC, cuidado foi tomado para não perturbar a camada de células no fundo do frasco.

[001728] 7.3.3.3 Repetir para todos os frascos incluindo frasco de controle.

[001729] 7.3.3.4 Com uma pipeta de 10ml, transferir 10ml de CM2quente com 3000 IU/ml IL-2 para cada frasco.

[001730] 7.3.3,5 Retornar os frascos para a incubadora e incubar voltado para cima até Dia 7. Repetir 7.3.3.1 - 7.3.3.6 para todos os lotes de alimentadoras testadas. Dia 7. Colheita

[001731] 7.3.4.1 Para evitar contaminação cruzada, manipular os frascos para um único lote de alimentadoras de cada vez.

[001732] 7.3.4.2 Remover frascos a partir de incubadora e transferir para e BSC, cuidado para não perturbar a camada de células no fundo do frasco.

354 / 557

[001733] 7.3.4.3 Sem perturbar as células crescendo no fundo dos frascos, remover 10ml de meio de cada frasco de teste e 15ml de meio de cada um dos frascos de controle.

[001734] 7.3.4.4 Usando uma pipeta sorológica de 10 ml, recolocar em suspensão as células no meio restante e misturar bem para romper qualquer grumo de células.

[001735] 7.3.4,5 Registrar os volumes para cada frasco.

[001736] 7.3.4.6 Após misturar completamente a suspensão de células por pipeta, remover 200µl para contagem celular.

[001737] 7.3.4.7 Contar TILs usando o procedimento de operação apropriado padrão em conjunto com o equipamento automático de contagem celular.

[001738] 7.3.4.8 Registrar contagens em Dia 7.

[001739] 7.3.4.9 Repetir 7.3.41 – 7.3.4.8 para todos os lotes de alimentadoras testadas.

[001740] 7.3.4.10 Os frascos de controles de alimentadoras foram avaliados para incompetência de replicação e frascos contendo TILs foram avaliados para as vezes de expansão de Dia 0 de acordo com os critérios listados em Tabela 21 (abaixo). Dia 7. Continuação de frascos de controle de alimentadoras para Dia 14

[001741] 7.3.5.1 Após completar as contagens do Dia 7 dos frascos de controle de alimentadoras, adicionar 15ml de meio 2 de CM fresco contendo 3000 IU/ml IL-2 para cada um dos frascos de controle.

[001742] 7.3.5.2 Retornar os frascos de controle para a incubadora e incubar em uma posição para cima até o Dia 14.

[001743] Dia 14. Estender a não proliferação de frascos de controle de alimentadoras

[001744] 7.3.6.1 Para evitar contaminação cruzada, manipular os frascos para um único lote de alimentadoras de cada vez.

355 / 557

[001745] 7.3.6.2 Remover frascos a partir de incubadora e transferir para BSC, cuidado foi tomado para não perturbar a camada de células no fundo do frasco.

[001746] 7.3.6.3 Sem perturbar as células crescendo no fundo dos frascos, remover aproximadamente 17ml de meio de cada um dos frascos de controle.

[001747] 7.3.6.4 Usando uma pipeta sorológica de 5ml, recolocar em suspensão as células no restante meio e misturar bem para romper qualquer grumo de células.

[001748] 7.3.6,5 Registrar os volumes para cada frasco.

[001749] 7.3.6.6 Após misturar completamente a suspensão de células por pipeta, remover 200µl para contagem celular.

[001750] 7.3.6.7 Contar os TILs usando o procedimento de operação apropriado padrão junto com o equipamento automático de contagem celular.

[001751] 7.3.6.8 Registrar as contagens.

[001752] 7.3.6.9 Repetir 7.3.4,1 – 7.3.4.8 para todos os lotes de alimentadoras testadas.

RESULTADOS E CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO Resultados

[001753] 10.1.1 A dose de gama irradiação foi suficiente para tornar as células alimentadoras incompetentes em replicação. Todos os lotes foram esperados como atendendo aos critérios de avaliação e também demonstraram uma redução no número viável total de células alimentadoras restantes em Dia 7 da cultura REP comparado com Dia 0.

[001754] 10.1.2 Todos os lotes de alimentadoras foram esperados como atendendo aos critérios de avaliação de 100 vezes expansão de crescimento de TILs por Dia 7 da cultura REP.

[001755] 10.1.3 Dia 14, contagens de frascos de controle de alimentadoras foram esperados como continuando a tendência não

356 / 557 proliferativa vista em Dia 7. Critérios de aceitação

[001756] 10.2.1 Os seguintes critérios de aceitação foram atendidos para cada linhagem de TILs em réplica testada para cada lote de células alimentadoras

[001757] 10.2.2 Aceitação foi duas vezes, como a seguir (mostrado na tabela abaixo). TABELA 22: Critérios de aceitação Teste Critérios de aceitação Irradiação de MNC/Replicação incompetente Nenhum crescimento observado em dias 7 e 14 Expansão de TILs Pelo menos uma expansão de 100 vezes para cada TIL (mínimo de 1,3 x 107 células viáveis

[001758] 10.2.2.1 Avaliar se a dose de radiação foi suficiente para tornar as células MNC alimentadoras incompetentes em replicação quando cultivadas na presença de 30ng/ml anticorpo OKT3 e 3000 IU/ml IL-2.

[001759] 10.2.2.1.1 A incompetência de replicação foi avaliada por contagem de células viáveis total (TVC) como determinado por contagem de células automatizada em Dia 7 e Dia 14 do REP.

[001760] 10.2.2.1.2 Critérios de aceitação foi “Sem crescimento”, significando o número total de células viáveis que não tinham aumentado em Dia 7 e Dia 14 a partir de número de células viáveis inicial colocadas em cultura em Dia 0 do REP.

[001761] 10.2.2.2 Avaliar a capacidade das células alimentadoras para suportar a expansão de TILs.

[001762] 10.2.2.2.1 Crescimento de TILs foi medido em termos de vezes de d expansão de células viáveis a partir do início da cultura em Dia 0 do REP até Dia 7 do REP.

[001763] 10.2.2.2.1 Em Dia 7, As culturas de TILs alcançaram um mínimo de 100 vezes de expansão, (isto é, maior que 100 vezes o número de células viáveis totais de TILs colocadas em cultura em REP Dia 0), como avaliado por contagem de células automatizada.

357 / 557

[001764] 10.2.2.3 Caso um lote deixe de atender aos dois critérios acima, o lote foi retestado de acordo com o plano de contigência mostrado em seção 10.3 abaixo.

[001765] 10.2.2.4 Após novo teste de um lote não aprovado, qualquer lote de MNC alimentadoras que não atendeu aos dois critérios de aceitação em ambos a avaliação original e o teste de contigência foi excluído.

[001766] 10.2.2,5 Qualquer um dos lotes de MNC alimentadoras que atendeu aos critérios de aceitação mas foram julgados como tendo baixo desempenho com relação à capacidade para expandir TIL com relação a outros lotes de alimentadoras anteriores testados em paralelo com as linhagens de TILs re-REP foram excluídos.

[001767] Teste de contingência de lotes de MNC alimentadoras que não atendem aos critérios de aceitação

10.3.1 No evento em que um lote MNC de alimentadoras não atendeu a ambos os critérios de aceitação mostrados em seção 10.2 acima, as seguintes etapas serão tomadas para testar de novo o lote para relacionar os erros simples do experimentador como sua causa.

[001768] 10.3.2 Se houver dois ou mais frascos satélite de teste restantes do lote, o lote foi testado novamente. Se havia um ou nenhum frasco satélite de teste restante do lote, o lote falhou de acordo com os critérios de aceitação listados na Seção 10.2 acima.

[001769] 10.3.3 Dois funcionários treinados, incluindo a pessoa original que avaliou o lote em questão, ambos testaram o lote ao mesmo tempo.

[001770] 10.3.4 Repetição das seções 7.2 - 7.3 foi realizada para reavaliar o lote em questão.

[001771] 10.3,5 Cada pessoa testou o lote em questão e também um lote de controle (conforme definido na Seção 7.2.4 acima).

[001772] 10.3.6 Para ser qualificado, o lote em questão e o lote de controle precisavam atingir os critérios de aceitação da Seção 10.2 para o

358 / 557 pessoal que fazia o teste de contingência.

[001773] 10.3.7 Ao atender a esses critérios, o lote foi liberado para uso de OCM, conforme descrito na Seção 10.2 acima. EXEMPLO 14: QUALIFICAÇÃO DE LOTES INDIVIDUAIS DE CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGUE PERIFÉRICO GAMA-

IRRADIADAS

[001774] Este Exemplo descreve um novo procedimento abreviado para qualificar lotes individuais de células mononucleares de sangue periférico gama-irradiadas (PBMC) para uso como células alimentadoras alogênicas nos métodos exemplares descritos aqui. Este exemplo provê um protocolo para a avaliação de lotes de células PBMC irradiadas para uso na produção de lotes clínicos de TILs. Cada lote de PBMCs irradiadas foi preparado a partir de um doador individual. Durante o curso de mais do que 100 protocolos de qualificação, foi mostrado que, em todos os cases, lotes de PBMC irradiadas do SDBB (San Diego Blood Bank) expandem TIL >100 vezes em Dia 7 de um REP. Este protocolo de qualificação modificado foi destinado a aplicar lotes de PBMC irradiadas de doador de SDBB que foram então ainda testados para verificar que a dose recebida de gama radiação foi suficiente tornar as mesmas incompetentes em replicação. Uma vez demonstrado que elas mantiveram incompetência de replicação durante o curso de 14 dias, os lotes de PBMC de doador foram considerados “qualificados” para uso para produzir lotes clínicos de TIL. Termos chave e definições

[001775] µg – Micrograma µl – Microlitro AIM-V – Armário com segurança biológica para meio de cultura de células comercialmente disponível BSC – Agrupamento de diferenciação CD – Meio completo para TIL #2

359 / 557 CM2 – CM2 suplementado com 3000 IU/ml IL-2 CM2IL2 – Organização de fabricação sob contrato CO2 – Dióxido de carbono EtOH – Etanol GMP – Boas práticas de fabricações Gy – Cinza IL – Interleucina IU – Unidades internacionais LN2 – Nitrogênio líquido MI – Mililitro NA – Não aplicável OKT3 – designação de anticorpo monoclonal anti-CD3 P20 – pipetador de 2-20µl P200 – pipetador de 20-200µl PBMC – células mononucleares de sangue periférico P1000 – pipetador de 100-1000µl PPE – Equipamento de proteção pessoal REP – Protocolo de expansão rápida SDBB – Hemocentro de San Diego TIL – Linfócitos infiltrando os tumores T25 – frasco de cultura de tecido de 25cm2 x g – “vezes gravidade” – medida de força centrífuga relativa Amostras incluem PBMCs irradiadas do doador (SDBB). Procedimentos Fundamentos

[001776] 7.1.1 PBMC paradas no crescimento e gama-irradiadas foram requeridas durante REP padrão corrente de TIL. Receptores de membrana nas PBMCs se ligam a anticorpo anti-CD3 (clone OKT3) e reticulam em TIL em cultura, estimulando os TILs a expandir. Os lotes de PBMC foram preparados

360 / 557 a partir de leucaférese de sangue total tomado de doadores individuais. O produto de leucaférese foi submetido a centrifugação sobre Ficoll-Hypaque, lavado, irradiado, e crioconservado sob condições de GMP.

[001777] É importante que pacientes que receberam terapia com TILs não sejam infundidos com PBMCs viáveis, pois isto poderia resultar em doença de enxerto-versus-hospedeiro (GVHD). PBMCs do doador são assim parados no crescimento por dosagem das células com gama-irradiação, resultando em rupturas de DNA fita dupla e a perda de viabilidade celular das PBMCs quando de recultura. Critérios de avaliação

[001778] 7.2.1 Critérios de avaliação para lotes de PBMC irradiadas incluíram sua incompetência de replicação. Configuração Experimental

[001779] 7.3.1 Lotes de alimentadoras foram testados em formato mini- REP como se eles fossem ser co-cultivados com TIL, usando frascos verticais de cultura tecido T25.

[001780] 7.3.1.1 Lote de controle: Um lote de PBMCs irradiadas, que tinha sido historicamente demonstrado como atendendo ao critério de 7.2.1, foi executado junto com os lotes experimentais como um controle.

[001781] 7.3.2 Para cada lote de PBMCs irradiadas do doador testado, frascos em duplicata foram usados. Protocolo Experimental

[001782] Todo o trabalho da cultura de tecido neste protocolo foi feito usando técnica estéril em um BSC. Dia 0

[001783] 7.4.1 Preparar ~90ml de meio CM2 para cada lote de PBMC doador a ser testado. Manter CM2 quente em banho d’água a 37°C.

[001784] 7.4.2 Descongelar uma alíquota de 6 x 106 IU/ml IL-2.

[001785] 7.4.3 Retornar o meio CM2 para o BSC, lavando com 70%

361 / 557 EtOH antes de colocar em estufa. Para cada lote de PBMC testado, remover cerca de 60ml de CM2 a uma garrafa estéril separada. Adicionar IL-2 a partir de solução de carga 6 x 106 IU/ml descongelada para este meio para uma concentração final de 3000 IU/ml. Rotular esta garrafa como “CM2/IL2” (ou similar) para distinguir o mesmo a partir de CM2 não suplementado.

[001786] 7.4.4 Rotular dois frascos de T25 para cada lote de PBMC a ser testado. Rótulo mínimo incluía:

7.4.4.1 Número do lote

7.4.4.2 Número do frasco (1 ou 2)

7.4.4.3 Data de início da cultura (Dia 0) Preparar OKT3

[001787] 7.4,5 Retirar a solução de carga de anti-CD3 (OKT3) a partir de refrigerador a 4°C e colocar no BSC.

[001788] 7.4.6 Uma concentração final de 30ng/ml OKT3 foi usada no meio do mini-REP.

[001789] 7.4.7 Preparar uma solução de trabalho de 10µg/ml de anti- CD3 (OKT3) a partir de 1mg/ml solução de carga. Colocar em refrigerador até necessário.

[001790] 7.4.7.1 Para cada lote de PBMC testado, preparar 150µl de diluição 1:100 da carga de anti-CD3 (OKT3).

[001791] Por exemplo, para testar 4 lotes de PBMC de uma vez, preparar 600µl de 10µg/ml anti-CD3 (OKT3) por adição de 6µl da solução de carga 1mg/ml a 594µl de CM2 suplementado com 3000 IU/ml IL-2. Preparar frascos

[001792] 7.4.8 Adicionar 19ml por frasco de CM2/IL-2 aos frascos T25 rotulados e colocados frascos em incubadora a 37°C, umidificada, 5% CO2 enquanto preparando as células Preparar PBMC irradiadas

[001793] 7.4.9 Trabalhar com cada lote de PBMC de doador

362 / 557 individualmente para evitar a contaminação cruzada potencial dos lotes.

[001794] 7.4.10 Recuperar frascos-ampolas de lotes de PBMC a serem testados do armazenamento de LN2. Estes foram colocados a -80°C ou mantidos em gelo seco antes de descongelamento.

[001795] 7.4.11 Colocar 30ml de CM2 (sem suplemento de IL-2) em tubos cônicos de 50ml para cada lote a ser descongelado. Rotular cada tubo com os diferentes números do lote do PBMC a ser descongelado. Tampar tubos firmemente e colocar em banho d’água a 37°C antes de uso. Como necessário, retornar os tubos cônicos de 50ml para o BSC, limpar com 70% EtOH antes de colocar na estufa.

[001796] 7.4.12 Remover um frasco-ampola de PBMC do armazenamento frio e colocar em uma prateleira de tubo flutuante em um 37°C banho d´água para descongelar. Deixar o descongelamento prosseguir até uma quantidade pequena de gelo permanecer no frasco-ampola.

[001797] 7.4.13 Pulverizar ou varrer o frasco-ampola descongelado com 70% EtOH e transferir para BSC.

[001798] 7.4.14 Usando uma pipeta de transferência estéril, imediatamente transferir o conteúdo do frasco-ampola em 30ml de CM2 no tubo cônico de 50 mL. Remover cerca de 1ml de meio a partir de tubo para enxaguar o frasco-ampola; retornar o enxague para o tubo cônico de 50 mL. Tampar firmemente e girar de modo suave para lavagem das células.

[001799] 7.4.15 Centrifugar a 400 x g durante 5min em temperatura ambiente.

[001800] 7.4.16 Aspirar o sobrenadante e recolocar em suspensão o grânulo de célula em 1ml de CM2/IL-2 quente usando uma ponta de pipeta de 1000µl. Alternadamente, antes de adicionar meio, recolocar em suspensão o grânulo de célula arrastando o tubo tampado ao longo de uma prateleira de tubo vazia. Após recolocar em suspensão o grânulo de célula, levar volume a 4ml usando meio CM2/IL-2. Registrar volume.

363 / 557

[001801] 7.4.17 Remover uma alíquota pequena (por exemplo, 100µl) para contagem celular usando um contador de células automatizado.

[001802] 7.4.17.1 Realizar as contagens em duplicata de acordo com o particular contador de células automatizado SOP. O mais provavelmente foi necessário realizar uma diluição das PBMC antes de realizar as contagens celulares. Uma diluição de partida recomendada foi 1:10, mas isto variou dependendo do tipo de contagem celular usado.

[001803] 7.4.17.2 Registrar as contagens.

[001804] 7.4.18 Ajustar a concentração de PBMC a 1,3 x 107 células/ml de acordo com a planilha em etapa 7.4.15,2 usando meio CM2/IL-2. Misturar bem girando suavemente ou aspirando suavemente para cima e para baixo usando uma pipeta sorológica. Configuração de frascos de cultura

[001805] 7.4.19 Retornar dois frascos T25 rotulados para BSC a partir de incubadora de cultura de tecido.

[001806] 7.4.20 Retornar o frasco-ampola de 10µg/ml de anti- CD3/OKT3 para BSC.

[001807] 7.4.21 Adicionar 1ml da suspensão de células PBMC 1,3 x 107 a cada frasco.

[001808] 7.4.22 Adicionar 60µl do 10µg/ml anti-CD3/OKT3 a cada frasco.

[001809] 7.4.23 Retornar frascos tampados para as incubadoras de cultura de tecido for 14 dias de crescimento sem perturbar.

[001810] 7.4.24 Colocar frasco-ampola com anti-CD3/OKT3 de volta no refrigerador até necessário para o próximo lote.

[001811] 7.4.25 Repetir etapas 7.4.9 – 7.4.24 para cada lote de PBMC a ser avaliado. Dia 14, Medição de não proliferação de PBMC

[001812] 7.4.26 Trabalhando com cada lote independentemente,

364 / 557 cuidadosamente retornar os frascos de T25 em duplicata para BSC.

[001813] 7.4.27 Para cada frasco, usando uma pipeta sorológica fresca de 10 ml, remover ~17ml de cada um dos frascos, então, cuidadosamente puxar os meios restantes para medir o volume restante nos frascos. Registrar volume.

[001814] 7.4.28 Misturar amostra bem pipetando para cima e para baixo usando a mesma pipeta sorológica.

[001815] 7.4.29 Remover uma amostra de 200µl de cada frasco para contagem.

[001816] 7.4.30 Contar células usando um contador de células automatizado.

[001817] 7.4.31 Repetir etapas 7.4.26 – 7.4.31 para cada lote de PBMC sendo avaliado.

RESULTADOS E CRITÉRIO DE ACEITAÇÃO Resultados

[001818] 10.1.1 A dose de gama irradiação foi esperada a ser suficiente para tornar as células alimentadoras incompetentes em replicação. Todos os lotes foram esperados atender aos critérios de avaliação, demonstrando uma redução no número viável total de células alimentadoras restantes em Dia 14 da cultura REP comparado com Dia 0. Critério de aceitação

[001819] 10.2.1 O seguinte foi atendido para cada lote de PBMCs irradiadas do doador testado:

10.2.2 “Sem crescimento” – significa que o número total de células viáveis em Dia 14 foi menor do que o número de células viáveis inicial colocado em cultura em Dia 0 do REP.

[001820] 10.2.3 Caso um lote deixe de atender ao critério acima, o lote foi retestado para o Procedimento de teste de contingência descrito na seção

10.4.

365 / 557

[001821] 10.2.4 Após novo teste de um lote não aprovado, qualquer lote de alimentadoras MNC que não atendeu ao critério de aceitação em ambos a avaliação original e o teste de contingência foi excluído.

[001822] Teste de contingência de lotes de PBMC que não atendem aos critérios de aceitação.

[001823] 10.4.1 No caso em que um lote de PBMCs irradiadas do doador não atende ao critério de aceitação acima, as seguintes etapas foram tomadas para testar de novo o lote para descartar um simples erro do experimentador como a causa de sua falha.

[001824] 10.4.2 Se estavam dois ou mais frascos satélites restantes do lote, então, o lote foi testado de novo. Se estava um ou nenhum dos frascos satélites restantes do lote, então, o lote foi desaprovado, de acordo com o critério de aceitação de seção 10.2 acima.

[001825] 10.4.3 Sempre que possível, dois funcionários treinados (preferivelmente incluindo a pessoa original que avaliou o lote em questão) realizaram o teste de dois frascos-ampolas separados independentemente. Este foi o método preferido de teste de contingência. Além dos frascos-ampolas separados de PBMC, os mesmos reagentes podem ser usados por ambas pessoas.

[001826] 10.4.3.1. Se dois funcionários não estavam disponíveis, uma pessoa fez o teste dos dois frascos-ampolas de PBMC para o lote desaprovado, trabalhando com cada frasco-ampola independentemente.

[001827] 10.4.4 Repetição de seção 7.4 “Protocolo Experimental” foi feita para reavaliar o lote em questão.

[001828] 10.4,5 Além do lote em questão, um lote de controle foi testado por cada pessoa realizando o teste de contingência.

[001829] 10.4.5.1 Se duas pessoas realizam o teste de contingência, ambas as pessoas testaram o lote de controle independentemente.

[001830] 10.4.5.2 Se somente uma pessoas é disponível para realizar o

366 / 557 teste de contingência, não foi necessário para o lote de controle ser realizado em duplicata.

[001831] 10.4.5.3 Para ser qualificado, um lote de PBMC passando pelo teste de contingência tinha tanto o lote de controle e ambas as réplicas do lote em questão para alcançar o critério de aceitação de Seção 10.2 para ser aprovado.

[001832] 10.4.5.4 Ao atender este critério, o lote foi então liberado durante uso de CMO, como mostrado em seção 10,2. EXEMPLO 15: CONTADOR DE CÉLULAS AUTOMÁTICO CITÔMETRO DE IMAGE CELLOMETER IC2

[001833] Este Exemplo descreve o procedimento para operação do contador de células automático citômetro de imagem Cellometer IC2K2 Image

1. Definições

[001834] µl Microlitro AOPI Laranja acridina propídio iodo BSC Armário com segurança biológica DPBS solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco ml Mililitro MNC Células mononucleares de sangue NA Não aplicável PBMC Células mononucleares de sangue periférico PPE Equipamento de proteção pessoal pré-REP Cultura TIL inicial antes protocolo de expansão rápida de cultura

[001835] REP Protocolo de expansão rápida TIL Linfócitos infiltrando os tumores

7. Procedimento

[001836] 7.1. Preparação suspensão de células

367 / 557

[001837] 7.1.1 Preparação de azul tripano

[001838] A concentração final de azul tripano foi 0,1%. O fabricante recomendou preparar uma solução de carga de 0,2%.

[001839] 7.1.1.1 Quando usando Azul tripano no Cellometer K2, diluir a carga (0,4 %) com PBS a 0,2 %.

[001840] 7.1.1.2 Filtrar o Azul tripano com um filtro de 0,2-0,4 microns e dividir em volumes pequenos em frascos tampados rotulados.

[001841] 7.1.2.3 Misturar a suspensão de células a 1:1 com 0,2 % azul tripano.

[001842] 7.1.2 Preparação de AOPI

[001843] 7.1.2.1 Quando usando AOPI no Cellometer K2, obter a solução de AOPI.

[001844] 7.1.2.2 Colorir a amostra a 1:1 com solução de AOPI.

[001845] NOTA: Quando contendo culturas de elevada concentração, diluir as amostras de células em meio de cultura de células antes da diluição final 1:1 com Azul tripano ou AOPI.

[001846] Usar a faixa sugerida do fabricante de contagem para determinar a melhor diluição a usar.

[001847] 7.2 Configuração do Cellometer K2

[001848] 7.2.1 Ligar o equipamento Cellometer K2.

[001849] 7.2.2 Selecionar o ícone do citômetro de imagem Cellometer no monitor associado do computador.

[001850] 7.2.3 Na tela principal do software, selecionar um dos Testes listados na caixa dropdown.

[001851] 7.2.3.1 Quando selecionando o teste apropriado, o tipo de célula e modo de imagem são preenchidos de modo automático.

[001852] 7.2.3.2 Sob a seção de “Amostra”, clicar em Definir usuário/ID de amostra para abrir outra tela para inserir a informação do operador para este espécime.

368 / 557

[001853] 7.2.3.2.1 Entrar “ID de usuário”. Isto irá consistir das três letras iniciais do usuário.

[001854] 7.2.3.2.2 Entrar “ID de amostra”. A ID de amostra é derivada de informação do espécime entrando.

[001855] 7.2.3.3 Configurar parâmetros de diluição.

[001856] 7.2.3.3.1 Se nenhuma outra diluição foi feita além da mistura de 1:1, o fator de diluição foi 2.

[001857] 7.2.3.3.2. Se uma diluição foi feita antes da mistura final 1:1, o fator de diluição foi 2 vezes o da diluição anterior.

[001858] 7.2.3.3.3 Atualizar o fator de diluição de acordo com a mistura usando a seção de diluição da tela. Clicar no ícone de lápis para trazer as telas de diálogo.

[001859] 7.2.3.3.3 Verificar que as seções de imagem Fl e imagem F2 são idênticas entre si.

[001860] 7.2.3.3,5 Clicar no botão “salvar” após configuração ter sido completada.

7.3 Contagem de células

[001861] 7.3.1 Remover o forro de plástico de ambos os lados de uma lâmina de câmara de contagem Cellometer (SD100) e colocar no topo de um pano limpo, sem felpas.

[001862] 7.3.2 Após preparar a suspensão de células, remover uma pequena alíquota do amostra e transferir a mesma para uma cavidade de uma placa ou tubo de cultura celular de múltiplas cavidades.

[001863] 7.3.3 Se diluindo a amostra, realizar a diluição usando meio de cultura de células.

[001864] 7.3.4 Adicionar 20 Ill de suspensão de células em uma cavidade de uma placa ou tubo de cultura celular de múltiplas cavidades.

[001865] 7.3,5 Adicionar 20 111 de azul tripano a 0,2% ou a solução de AOPI a 20111 de suspensão de células e misturar completamente a amostra.

369 / 557

[001866] 7.3.6 Medir 20 IA da 1:1 solução e transferir para um lado da câmara de contagem.

[001867] NOTA: Evitar tocar a área limpa da lâmina

[001868] 7.3.7. Se necessário, repetir a amostra no outro lado da lâmina.

7.3.8. Inserir a câmara na fenda da frente do Cellometer.

[001869] 7.3.8. Para a contagem de células AOP, clicar em “Visualização Fl” na tela principal para visualizar a imagem fluorescente verde (célula viva). Para a contagem com azul tripano, clicar em “visualização de campo brilhante”.

[001870] 7.3.9 Usando a roda de focalização, levar a imagem para o foco ótimo. As células tinham um centro brilhante e uma borda claramente definida.

[001871] 7.3.10 Clicar “Contagem” para começar o processo de contagem.

[001872] 7.3.11 Resultados foram exibidos em uma caixa pop-up de resultados da contagem na tela do computador, mostrando os resultados do processo de contagem. EXEMPLO 16: PREPARAÇÃO DE SOLUÇÃO DE CARGA DE IL-2 (CellGenix)

[001873] Este Exemplo descreve o processo de dissolver interleucina-2 humana recombinante liofilizada, purificada, em amostras de carga apropriadas para uso em protocolos adicionais de cultura de tecido, incluindo todos dentre os descritos no presente pedido e Exemplos, incluindo os que envolvem usar rhIL-2.

3. Definições/Abreviaturas

[001874] μL: microlitro BSC: Armário com segurança biológica BSL2: Nível de biossegurança 2 D-PBS: solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco

370 / 557 G: Calibre GMP: Bom processamento de fabricação HAc: Ácido acético HSA: Albumina sérica humana mL: Mililitro NA: Não aplicável PPE: Equipamento de proteção pessoal rhIL-2; IL-2: Interleucina-2 humana recombinante COA: Certificado de análise

6. Procedimento

[001875] 6.1 Preparar solução de ácido acético a 0,2% (HAc).

[001876] 6.1.1 Transferir 29mL água estéril a um tubo cônico de 50mL.

[001877] 6.1.2 Adicionar l mL 1N ácido acético ao tubo cônico de 50 mL.

[001878] 6.1.3 Misturar bem invertendo o tubo 2-3 vezes.

[001879] 6.1.4 Esterilizar a solução HAc por filtração usando um filtro Steriflip.

[001880] 6.1,5 Tampar, datar, e rotular a “solução ácido acético a 0,2% estéril”

[001881] 6.1.6 Solução perdeu a validade após 2 meses. Armazenar a temperatura ambiente.

6.2 Preparar 1% HSA em PBS.

[001882] 6.2.1 Adicionar 4mL de solução a 25% HSA de carga para 96mL PBS em uma unidade de filtro estéril de 150mL

[001883] 6.2.2 Filtrar solução.

[001884] 6.2.3 Tampar, datar e rotular a “solução a 1% HSA em PBS.”

[001885] 6.2.4 Solução perdeu validade após 2 meses. Armazenar a 4°C.

[001886] 6.3 Para cada frasco-ampola de rhIL-2 preparada, preencher formulários.

371 / 557

[001887] 6.4 Preparar a solução de carga de IL-2 (6 x 106 IU/mL concentração final)

[001888] 6.4.1 Cada lote de rh1L-2 foi diferente e requereu informação encontrada no Certificado de análise do fabricante (COA), tal como:

[001889] 6.4.1.1 Massa de rhIL-2 por frasco-ampola (mg)

[001890] 6.4.1.2 Atividade específica de rhIL-2 (IU/mg)

[001891] 6.4.1.3 Volume de reconstituição de 0,2% HAc recomendado (mL)

[001892] 6.4.2 Calcular o volume de 1% HSA requerido para lote de rhIL-2 por usando a equação abaixo:

[001893] Por exemplo, de acordo com CellGenix's rhIL-2 lote 10200121 COA, a atividade específica para o frasco-ampola de 1 mg é 25x106 lU/mg. É recomendado reconstituir o rhIL-2 em 2mL 0,2% HAc.

[001894] 6.4.3 Limpar a tampa de frasco-ampola de IL-2 com pano com álcool.

[001895] 6.4.4 Usando uma agulha 16G fixada a uma seringa de 3mL, injetar o volume recomendado de 0,2% HAc no frasco-ampola. Cuidado para não desalojar a tampa quando retirando a agulha.

[001896] 6.4,5 Inverter frasco-ampola 3 vezes e girar até todo o pó ser dissolvido.

[001897] 6.4.6 Cuidadosamente remover a tampa e colocar em um pano com álcool.

[001898] 6.4.7 Adicionar o volume calculado de 1% HSA para o frasco-

372 / 557 ampola.

[001899] 6.4.8 Tampar o frasco-ampola com a tampa de borracha

[001900] 6,5 Armazenamento de solução de rhIL-2

[001901] 6.5.1 Para o armazenamento a curto prazo (<72horas), armazenar o frasco-ampola a 4°C.

[001902] 6.5.2 Para armazenamento a longo prazo (>72horas), dividir em alíquotas o frasco-ampola em volumes menores e armazenar em criofrascos a -20°C até pronto para uso. Evitar ciclos de congelamento/descongelamento. Perde a validade 6 meses após a data de preparação.

[001903] 6.5.3 Os rótulos de Rh-IL-2 incluíram provedor e número de catálogo, número do lote, data de vencimento, iniciais do operador, concentração e volume de alíquota. EXEMPLO 17: PREPARAÇÃO DE MEIOS PARA PROCESSOS PRÉ-REP

E PROCESSOS REP

[001904] Este Exemplo descreve o procedimento para a preparação de meios de cultura de tecido para uso em protocolos envolvendo a cultura de linfócitos infiltrando os tumores (TIL) derivados de vários tipos de tumores incluindo, mas não limitados a, melanoma metastático, carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço (HNSCC), carcinoma ovariano, triple-negative carcinoma de mama triplo-negativo e adenocarcinoma de pulmão. Estes meios podem ser usados para a preparação de qualquer um dos TILs descritos no presente pedido e Exemplos.

3. Definição

[001905] µg micrograma µm micrômetro µM micromolar AIM-V® meio de cultura de tecido livre de soro (Thermo Fisher Scientific)

373 / 557 BSC Armário com segurança biológica CM1 Meio completo #1 CM2 Meio completo #2 CM3 Meio completo #3 CM4 Meio completo #4 IU ou U Unidades internacionais ml mililitro mM milimolar NA não aplicável PPE equipamento de proteção pessoal pré-REP Processo de pré-expansão rápida REP Processo de expansão rápida rhIL-2, IL-2 - Interleucina-2 recombinante humana RPMI1640 Meio do Roswell Park Memorial Institute, formulação 1640 SOP Procedimento de operação padrão TIL Linfócitos infiltrando os tumores

7. Procedimento

[001906] 7.1 Todos os procedimentos são feitos usando técnica estéril em um BSC (Classe II, Tipo A2).

[001907] 7.1.1 Pulverizar superfície de estufa com etanol a 70% antes de seu uso.

[001908] 7.1.2 Pulverizar todos os itens e reagentes com etanol a 70% antes de colocar os mesmos em estufa de cultura de tecido.

[001909] 7.2 Dividir em alíquotas de 200mM L-glutamina

[001910] 7.2.1 L-glutamina foi provida em volumes maiores do que o necessário durante a preparação de soro (por exemplo, 100m1 ou 500m1 volumes).

[001911] 7.2.2 Descongelar garrafa de L-glutamina em banho d’água a

374 / 557 37°C.

[001912] 7.2.3 Misturar L-glutamina bem após descongelamento, como ela precipita após o descongelamento. Assegurar que todos os precipitados tenham retornado à solução antes de divisão.

[001913] 7.2.4 Colocar alíquotas de 5-10m1 de L-glutamina em tubos cônicos estéreis de 15 ml.

[001914] 7.2,5 Rotular tubos com concentração, vendedor, número do lote, data da divisão e dada da validade.

[001915] 7.2.6 Tubos foram então armazenados a -20°C e puxados como necessário durante preparação do meio.

[001916] 7.3 Preparação de CM1

[001917] 7.3.1 Remover os seguintes reagentes do armazenamento frio e aquecer em um banho d’água a 37°C :

[001918] 7.3.1.1 RPMI1640

[001919] 7.3.1.2 Soro AB humano

[001920] 7.3.1.3 200mM L-glutamina

[001921] 7.3.2 Remover o BME do armazenamento a 4°C e colocar em estufa de cultura de tecido.

[001922] 7.3.3 Colocar a solução de carga de gentamicina em armazenamento em temperatura ambiente na estufa de cultura de tecido.

[001923] 7.3.4 Preparar meio CM1 de acordo com Tabela 23 abaixo por adição de cada um dos ingredientes na seção de topo de uma unidade de filtro de 0,2um apropriada para o volume a ser filtrado. TABELA 23. Preparação de CM1 Ingrediente Concentração Final Volume Final 500 ml Volume Final IL RPMI1640 NA 450 ml 900 m1 Soro AB humano, termo- 50 ml 100 ml inativado 10% 200mM L-glutamina 2 mM 5 ml 10 m1 55mM BME 55 µM 0,5 ml 1 ml 50mg/ml sulfato de 50 µg/ml 0,5 ml 1 ml gentamicina

[001924] 7.3,5 Rotular a garrafa de meio CM1 com seu nome, as iniciais

375 / 557 do preparador, a data em que foi filtrado /preparado, a data de validade de duas semanas e armazenar a 4°C até necessário durante cultura de tecido. O meio pode ser dividido garrafas de menor volume, como requerido.

[001925] 7.3.6 Quaisquer restantes RPMI1640, Soro AB humano, ou L- glutamina foram armazenados a 4°C até a próxima preparação de meio.

[001926] 7.3.7 Garrafa de armazenamento de BME foi retornada ao armazenamento de 4°C.

[001927] 7.3.8 Garrafa de armazenamento de gentamicina foi retornada para seu próprio local de armazenamento em RT.

[001928] 7.3.9 Devido à capacidade de tampão limitada do meio, CM1 foi descartado não mais do que duas semanas após a preparação, ou quando o indicador de pH vermelho do fenol mostrou uma mudança extrema em pH (colocação vermelho brilhante para rosa).

[001929] 7.3.10 No dia de uso, pré-aquecer quantidade requerida de CM1 em banho d´água a 37°C e adicionar 6000 IU/m1 IL-2.

[001930] 7.3.11 Suplementação adicional - como necessário

[001931] 7.3.11.1 CM1 suplementado com GlutaMAX®

[001932] 7.3.11.1.1. CM1 pode ser preparado substituindo 2mM G1utaMAXTM por 2mM glutamina (final concentração, ver Tabela 2.) Se isto foi feito, rotular a garrafa do meio como em Etapa 7.3,5 acima adicionando “2mM G1utaMAX” para evitar confusão com a formulação padrão de CM1.

[001933] 7.3.11.2 CM1 suplementado com antibiótico/antimicótico extra

[001934] 7.3.11.2.1 Algumas formulações de CM1 requereram antibiótico/antimicótico adicional para evitar contaminação de TILs pré-REP que cresceram de alguns tipos de tumor.

[001935] 7.3.11.2.2 Adicionar antibiótico/antimicótico às concentrações finais mostradas em Tabela 24 abaixo.

376 / 557

[001936] 7.3.11.2.3 Se isto foi feito, rotular a garrafa do meio como na Etapa 7.3.1 acima adicionando o nome(s) do(s) antibiótico/antimicótico adicional para evitar confusão com a formulação padrão de CM1. TABELA 24. Suplementação adicional de CM1, como necessário. Suplemento concentração de estoque Diluição Concentração final GlutaMAXTm 200mM 1:100 2mM Penicilina/estreptomicina 10.000 U/ml penicilina 1:100 100 U/ml penicilina 10,000µg/ml 100 μg/ml estreptomicina estreptomicina Anfotericina B 250µg/ml 1:100 2,5µg/ml

7.4 Preparação de CM2

[001937] 7.4.1 Remover CM1 preparado do refrigerador ou preparar CM1 fresco como para a Seção 7.3 acima.

[001938] 7.4.2 Remover AIM-V® do refrigerador.

[001939] 7.4.3 Preparar a quantidade de CM2 necessária por mistura de CM1 preparado com um volume igual de AIM-V® em um garrafa de meio estéril.

[001940] 7.4.4 Adicionar 3000 IU/ml IL-2 a meio CM2 no dia de uso.

[001941] 7.4,5 Obter uma quantidade suficiente de CM2 com 3000 IU/ml IL-2 no dia de uso.

[001942] 7.4.6 Rotular a garrafa de meio CM2 com seu nome, as iniciais do preparador, a data em que foi filtrado/preparado, data de validade de duas semanas e armazenar a 4°C até necessário durante cultura de tecido. O meio foi dividido em alíquotas em garrafas de volume menor, como requerido.

[001943] 7.4.7 Retornar qualquer CM2 sem IL-2 para o refrigerador onde pode ser armazenado durante até duas semanas, ou até o indicador de pH de vermelho fenol mostrar um deslocamento extremo em pH (coloração vermelho brilhante para rosa).

7.5 Preparação de CM3

[001944] 7.5.1 Preparar CM3 no dia em que foi requerido durante uso.

[001945] 7.5.2 CM3 foi o mesmo que meio AIM-V®, suplementado com 3000 IU/ml IL-2 no dia de uso.

377 / 557

[001946] 7.5.3 Preparar uma quantidade de CM3 suficiente para as necessidades experimentais por adição de solução de estoque de IL-2 diretamente na garrafa ou bolsa de AIM-V. Misturar bem por agitação suave. Rotular com “3000 IU/ml IL-2” imediatamente após adição ao AIM-V. Se tiver excesso de CM3, armazenar a 4°C com a garrafa rotulada com o nome do meio, as iniciais do preparador, a data em que o meio foi preparado, e sua data de validade (7 dias após preparação).

[001947] 7.5.4 Descartar meio suplementado com IL-2 após 7 dias armazenamento a 4°C.

7.6 Preparação de CM4

[001948] 7.6.1 CM4 foi igual a CM3, com o suplemento adicional de 2mM G1utaMAXTM (concentração final).

[001949] 7.6.2 Para cada 1L de CM3, adicionar 10m1 de 200mM G1utaMAXTM.

[001950] 7.6.2 Preparar uma quantidade de CM4 suficiente para as necessidades experimentais por adição de solução de estoque de IL-2 e solução de carga de G1utaMAXTM diretamente à garrafa ou bolsa de AIM- V. Misturar bem por agitação suave.

[001951] 7.6.3 Rotular garrafa com “3000 IL/nulo IL-2 e G1utaMAX” imediatamente após adição a AIM-V.

[001952] 7.6.4 Se tiver um excesso de CM4, armazenar o mesmo em garrafas a 4°C rotuladas com o nome do meio, “G1utaMAX”, as iniciais do preparador, a data em que o meio foi preparado, e sua data de validade (7 dias após preparação).

[001953] 7.6,5 Descartar meio suplementado com IL-2 após 7 dias armazenamento a 4°C. EXEMPLO 18: COLORAÇÃO de ANTÍGENO DE SUPERFÍCIE DE TILs de PÓS - REP

1. FINALIDADE

378 / 557

[001954] O Exemplo descreve o procedimento para a coloração na superfície celular de TIL pós-REPs por citometria de fluxo. Este procedimento pode ser aplicado a quaisquer TILs descritos no Pedido e nos Exemplos. TERMOS CHAVE e DEFINIÇÕES

[001955] α: Alfa β: Beta μl: Microlitro APC: Aloficocianina Ax647: Alex Fluor 647 BD: Becton Dickinson Company BSA: Albumina sérica bovina BSC: Armário com segurança biológica BV421: Violeta brilhante 421 CD: Agrupamento de diferenciação CST: Configuração e acompanhamento em citômetro Cy: Cianina DPBS: solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco FACS: Classificador de células ativado com fluorescência FBS: Soro bovino fetal FITC: Isotiocianato de fluoresceína FMO: Fluorescência menos um G: Grama H7: Análogo de Cy7 Ml: Mililitro PE: Ficoeritrina PerCP-Cy5.5: Proteínas Peridinina-Cloforila PPE: Equipamento de proteção pessoal REP: Protocolo de expansão rápida

379 / 557 SIT: Tubo de injeção de amostra TCR: Receptor de células T p/v: Peso para volume Anticorpos e colorações por citometria de fluxo TABELA 25: Coloração Aqua vivo/morto ThermoFisher Catálogo # L34966. Alvo Formato Clone Provedor Número de catálogo TCRab (isto é, PE/Cy7 IP26 BioLegend 306720 TCRα/β) CD57 PerCP-Cy5.5 HNK-1 BioLegend 359622 CD28 PE CD28,2 BioLegend 302908 CD4 FITC OKT4 eBioscience 11-0048-42 CD27 APC-H7 M-T271 BD Biosciences 560222 CD56 APC N901 Beckman Coulter IM2474U CD8a PB RPA-T8 BioLegend 301033 CD45R A PE-Cy7 HI100 BD Biosciences 560675 CD8a PerCP/Cy5.5 RPA-T8 BioLegend 301032 CCR7 PE 150503 BD Biosciences 560765 CD3 APC/Cy7 HIT3a BioLegend 300318 CD38 APC HB-7 BioLegend 356606 HLA-DR PB L243 BioLegend 307633 CD69 PE-Cy7 FN50 BD Biosciences 557745 TIGIT PE MBSA43 eBioscience 12-9500-42 KLRG1 Ax647 SA231A2 BioLegend 367704 CD154 BV421 TRAP1 BD Biosciences 563886 CD137 PE/Cy7 4B4-1 BioLegend 309818 Lag3 PE 3DS223H eBioscience 12-2239-42 PD1 APC EH12,2H 7 BioLegend 329908 Tim-3 BV421 F38-2E2 BioLegend 345008

7. PROCEDIMENTO

[001956] 7.1 Preparação de reagent

[001957] 7.1.1 Tampão de lavagem FACS

[001958] 7.1.1.1 Adicionar 2% (p/v) FBS termo-inativado a DPBS (adicionar 10ml FBS a 490mLs de 1X dPBS).

[001959] 7.1.1.2 Adicionar 0,1% (p/v) NaN3 (76,9ul a garrafa de 500mL)

[001960] 7.1.1.3 Solução foi armazenada 40°C. Descartar após 30 dias.

[001961] 7.1.2 Corante Aqua

[001962] 7.1.2.1 Adicionar 50μl de DMSO ao frasco-ampola de corante reativo.

[001963] 7.1.2.2 Misturar bem e confirmar visualmente que todo o corante tinha dissolvido.

380 / 557

[001964] 7.1.2.3 Corante que foi não usado para o procedimento foi dividido em alíquotas e congelado a 20°C até o próximo uso. Não congelar/descongelar uma segunda vez.

[001965] 7.1.3 Preparação de coquetel de anticorpos.

[001966] 7.1.3.1 Os coquetéis foram feitos em tubos de polipropileno como um tubo Eppendorf

[001967] 7.1.3.2 Coquetéis foram armazenados durante até 6 meses. TABELA 26: Painel de diferenciação 1 (DF1): Número de Alvo Formato Clone Provedor catálogo Título TCRab (isto é, PE/Cy7 IP26 BioLegend 306720 3 TCRα/β) CD57* PerCP-Cy5.5 HNK-1 BioLegend 359622 2 CD28* PE CD28,2 BioLegend 302908 2 CD4 FITC OKT4 eBioscience 11-0048-42 2 CD27* APC-H7 M-T271 BD Biosciences 560222 3 CD56 APC N901 Beckman IM2474U 3 Coulter CD8a PB RPA-T8 BioLegend 301033 2 Tampão FACS 33 TABELA 27: Painel de diferenciação 2 (DF2): Número de Alvo Formato Clone Provedor catálogo Título CD45RA* PE-Cy7 HI100 BD Biosciences 560675 1 CCD3 PerCP/Cy5.5 SP34-2 BD Biosciences 552852 2 CCCR7* PE 150503 BD Biosciences 560765 5 CCD8 FITC HIT8 BioLegend 300906 2 CCD4 APC/Cy7 OKT4 BioLegend 317418 2 CCD38* APC HB-7 BioLegend 356606 1 HHLA-DR PB L243 BioLegend 307633 2 Tampão FACS 35 TABELA 28: Painel de ativação de células T 1(Tact1) Número de Alvo Formato Clone Provedor catálogo Título CD137* PE/Cy7 4B4-1 BioLegend 309818 2 CD3 PerCP/Cy5.5 SP34-2 BD Biosciences 552852 2 Lag3* PE 3DS223H eBioscience 12-2239-42 5 CD8 FITC HIT8 BioLegend 300906 2 CD4 APCCy7 OKT4 BioLegend 317418 2 PD1* APC EH12,2H7 BioLegend 329908 2 Tim-3* BV421 F38-2E2 BioLegend 345008 2 Tampão FACS 33 TABELA 29: Painel de ativação de células T 2(Tact2) Número de Alvo Formato Clone Provedor catálogo Título CD69* PE-Cy7 FN50 BD Biosciences 557745 3 CD3 PerCP/Cy5.5 SP34-2 BD Biosciences 552852 2 TIGIT* PE MBSA43 eBioscience 12-9500-42 3

381 / 557 CD8 FITC HIT8 BioLegend 300906 2 CD4 APCCy7 OKT4 BioLegend 317418 2 KLRG1* Ax647 SA231A2 BioLegend 367704 1 CD154* BV421 TRAP1 BD Biosciences 563886 3 Tampão FACS 34

[001968] 7.2 Exigências do teste de citometria de fluxo

[001969] 7.2.1 Calibração de citômetro de fluxo

[001970] 7.2.1.1 O citômetro de fluxo foi calibrado no dia do teste usando contas de CST seguindo as instruções do fabricante.

[001971] 7.2.2 O operador assegurou que o citômetro de fluxo passou pela calibração, onde as verificações de desempenho e linha de base são válidas.

[001972] 7.2.2 Compensação/Controles de FMO

[001973] 7.2.2.1 As amostras de compensação de cor única foram preparadas usando as contas de compensação BD e o kit de contas de compensação reativas a amina ArCTM.

[001974] 7.2.2.2 Controle FMO, amostras contendo células foram coloridas com um coquetel de anticorpos menos o seguinte conjugado e anticorpo único, CD27, CD28, e CD57.

[001975] 7.2.3 Padronização de MFI

[001976] 7.2.3.1 Voltagens do citômetro foram determinadas diariamente com um controle de conta e valores alvo.

[001977] 7.3 Coloração da amostra

[001978] 7.3.1 Rotular tubo FACS com a Amostra ID-DF1, Amostra ID-DF2, Amostra ID-T1, Amostra ID-T2.

[001979] 7.3.2 Rotular um conjunto de controles FMO com CD27-APC- H7, CD28-PE, CD57-PerCPCy5.5, CD45RA-PECy7, CCR7-PE, CD38-APC, CD137-PE7, Lag3-PE, PD1 APC, Tim3-BV421, CD69-PE7, TIGIT-PE, KLRG1-Ax647, e CD154-BV421.

[001980] 7.3.3 Adicionar 0,5 a 2 milhões de células a cada tubo.

[001981] 7.3.4 QS a 3mLs de 1xPBS a cada tubo.

[001982] 7.3.5. Girar os tubos a 400 x g, elevar aceleração e frear por 5

382 / 557 minutos.

[001983] 7.3.6 Enquanto as amostras estavam centrifugando, preparar o corante Aqua de marcação de célula morta.

[001984] 7.3.7 Remover uma alíquota de Aqua a partir de congelador e diluir1/200 em PBS. Manter no escuro. Adicionar corante 2uL a 198uL DPBS.

[001985] 7.3.8 Decantar ou aspirar o sobrenadante da etapa 7.3.5.

[001986] 73.9 Adicionar 25uL de solução Aqua de acima para amostras e controles FMO.

[001987] 7.3.10 Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT) no escuro.

[001988] 7.3.11 Nota: se as células foram inicialmente armazenadas em um meio livre de proteína, então, uma etapa de bloqueio deve ser adicionada, tal como 5uL TruStain por 10 minutos a temperatura ambiente.

[001989] 7.3.12 Adicionar 50uL de coquetéis de anticorpo aos apropriados tubos.

[001990] 7.3.13 Agitar suporte do tubo para misturar.

[001991] 7.3.14 Incubar durante 15 minutos a RT no escuro.

[001992] 7.3.15 Registrar tempos de início e final. Adicionar 3mL de tampão de lavagem FACS.

[001993] 7.3.16 Girar tubos a 400 x g, aceleração elevada e frear durante 5 minutos.

[001994] 7.3.17 Quando centrifugação estava completa, decantar ou aspirar o sobrenadante.

[001995] 7.3.18 Recolocar em suspensão células deslizando os tubos ao longo de um suporte vazio.

[001996] 7.3.19 Adicionar 100uL de 1% ParaFormaldeído a cada tubo.

[001997] 7.3.20 Armazenar a 40C em escuro até pronto para coletar no Citômetro de fluxo.

383 / 557

[001998] Nota: Amostras podem ser armazenadas durante até 72 horas.

[001999] 7.4 L/D Controle de compensação Aqua.

[002000] 7.4.1 Rotular tubos FACS como controle compensação L/D Aqua.

[002001] 7.4.2 Adicionar uma gota de contas Arc ao tubo

[002002] 7.4.3 Adicionar 3µl de L/D Aqua diretamente nas contas.

[002003] 7.4.4. Incubar o tubos a temperatura ambiente no escuro durante 10 a 30min.

[002004] 7.4,5 Registrar tempo inicial e final de incubação na planilha

[002005] 7.4.6 Após incubação, adicionar 3ml de lavagem FACS a cada tubo.

[002006] 7.4.7 Girar os tubos a 400 x g, elevar a aceleração e frear, por 5 minutos.

[002007] 7.4.8 Decantar ou aspirar o sobrenadante.

[002008] 7.4.9 Recolocar em suspensão os tubos com 500µl de 1% PFA solução. Adicionar 1 gota de conta negativa. Colocar a 40°C no escuro até a colet.

[002009] 7,5 Coloração de controle de compensação.

[002010] 7.5.1 Rotular tubos FACS como mostrado na planilha de fenótipo de TIL pós-REP.

[002011] 7.5.2 Adicionar os anticorpos como mostrado na planilha de fenótipo de TIL pós-REP.

[002012] 7.5.3 Após incubação, adicionar 3mLs a tampão FACS a cada tubo.

[002013] 7.5.4 Girar os tubos a 500g, elevar aceleração e frear, durante 2 minutos.

[002014] 7,5,5 Decantar ou aspirar o sobrenadante.

[002015] 7.5.6 Recolocar em suspensão os tubos com 500µl de 1% PFA em PBS e armazenar a 2-80°C no escuro.

384 / 557

[002016] 7.6 Aquisição de dados

[002017] 7.6.1 Abrir software FACSDiva e login.

[002018] 7.6.2 No diálogo mismatch do citômetro clicar “Usar configurações CST”.

[002019] 7.6.3 Criar um novo experimento clicando em aba de “Experimento” e selecionando o gabarito “Fenótipo estendido”.

[002020] 7.6.4 Clicar duas vezes em experimento de valores alvo e ajustar as voltagens para alcançar os valores alvo determinados pelo operador de núcleo de fluxo.

[002021] 7.6,5 Copiar as configurações do instrumento e passar para o novo experimento.

[002022] 7.6.6 Criar um espécime para cada indivíduo e nomear de modo apropriado.

[002023] 7.6.7 Criar nomes para as amostras de acordo com os rótulos em seus tubos.

[002024] 7.6.8 Submeter a vórtice suave ou bater com o dedo antes de colocar o tubo no SIT.

[002025] 7.6.9 Adquirir os dados sob REGISTRO no quadro de aquisição.

[002026] 7.6.10 Girar as amostras a uma velocidade de menos do que 7,500 eventos por segundo.

[002027] 7.6.11 Coletar entre 50.000 a 100.000 eventos vivos excluindo os resíduos. EXEMPLO 19: VERIFICAÇÃO DE PROCESSO 2A -

DESENVOLVIMENTO DE PROCESSO

[002028] As experiências neste Exemplo foram concluídas para analisar o Processo 2A para a fabricação de TILs a partir de tumores de melanoma derivados de pacientes e um único câncer de mama, incluindo o crescimento de TILs de tumores em um procedimento pré-REP, seguido por um REP

385 / 557 modificado. Ênfase especial foi dada ao estabelecimento de um produto TIL congelado e uma comparação do desempenho do produto TIL congelado com o processo atual do produto TIL fresco (Processo 1C). Este relatório demonstrará que perfis similares são observados na avaliação de atributos críticos de qualidade frescos e descongelados (número de células, % de viabilidade, % de células T CD3 + e produção de interferon gama estimulado por contas (IFN-y)), bem como uma procedimento de fenótipos estendidos de re-estimulação (reREP), sendo ou não o mesmo produto TIL fresco ou congelado. Os dados apresentados para apoiar esta conclusão incluem proliferação, viabilidade, fenótipo, liberação de IFN-y, potência, comprimento dos telômeros e atividade metabólica. Os resultados caracterizam o Processo 2A, um processo pré-REP/REP encurtado, seguido pela crioconservação de TILs, bem como comparando o processo 2A com o processo 1C mais longo, conforme descrito aqui.

[002029] As descrições dos doadores de tumor, as datas de processamento e os locais de processamento podem ser encontrados na Tabela 1 abaixo (* indica que a REP foi iniciada usando uma linhagem de TILs pré- REP congelada): TABELA 30: Descrição de doadores de tumor, datas de processamento e locais de processamento. Tumor ID Tipo tecido Fonte Tecido M1061 Melanoma Grupo MT Primário — pé lateral esquerdo M1062 Melanoma Moffitt N/A M1063 Melanoma Grupo MT Metastático C- virilha direita M1064 Melanoma Grupo MT Metastático C-tornozelo esquerdo M1065 Melanoma Bio Metastático-linfonodo axilar Options EP11001 ER+PR+ Grupo MT Primário – carcinoma dutal invasivo da mama esquerda M1056* Melanoma Moffitt N/A M1058* Melanoma Grupo MT Metastático- Couro cabeludo direito Estágio IIB M1023* Melanoma Atlantic Primário- axila direita Health

3. INFORMAÇÃO DOS ANTECEDENTES

[002030] 3.1 LN-144 é um produto imunoterapêutico para o tratamento

386 / 557 de pacientes com melanoma metastático. O produto foi composto por linfócitos T com infiltração tumoral autóloga (TIL), obtidos de um paciente individual após ressecção cirúrgica de um tumor e expandidos ex vivo através da cultura de células de fragmentos tumorais cortados (pré-REP), seguido por expansão rápida de TILs na presença de alta dose de IL-2, anti-CD3 e APC co-estimulatório. Após pré-condicionamento não-mieloablativo da linfo- depleção, o paciente recebeu uma única infusão de seu TIL e subsequentes infusões intravenosas de aldesleucina (IL-2) a cada 8 horas, durante um máximo de 6 doses. Estudos envolvendo métodos alternativos de expansão dos TILs no estabelecimento de moléculas de padrão molecular associado a danos (DAMPs) dentro do microambiente tumoral (TNE) também demonstraram expansão eficaz de células T úteis para terapia (Donia 2014; Sommerville, 2012).

[002031] O Processo 1C que foi usado para a produção comercial de TILs envolve um esquema de produção que pode levar de ~ 45 a 55 dias para produzir um produto TIL infusível que é distribuído a um paciente imunodepletado dentro de 24 horas. A imunodepletação do paciente receptor deve ser cronometrada precisamente com a colheita do produto TIL atual. Atrasos na colheita ou na entrega do produto fresco podem impactar negativamente um paciente imunodepletado aguardando infusão. Processo 2A melhorou o processo 1C, diminuindo o tempo de produção e os materiais de fabricação, devido à diminuição das extensões de ambos os procedimentos pré-REP e REP. Além disso, Processo 2A aumentou flexibilidade do tempo de expedição do produto. As diferenças entre o Processo 1C e o Processo 2A no pré-REP, REP e colheita do processo (consulte a Tabela 2) incluem:

3.1.1 Frascos maiores com capacidade aumentada de fragmentos tumorais usados no procedimento pré-REP.

[002032] 3.1.2 Etapas que tornaram uso de sistema fechado ou passíveis de adaptação futura para um sistema fechado.

387 / 557

[002033] 3.1.3 Número reduzido de dias nos procedimentos tanto pré- REP como REP.

[002034] 3.1.4 Uma abordagem direta-para-REP, que eliminou a necessidade de fenotipar populações pré-REP antes de selecionar populações específicas de TILs pré-REP para prosseguir para REP.

[002035] 3.1,5 Uma co-cultura com um número predefinido de PBMC alogênico APC e irradiado em conjunto com anti-CD3 (clone OKT3) calculado para expansão suficiente de TIL.

[002036] 3.1.6 Um sistema automatizado de lavagem de células para a coleta.

[002037] 3.1.7 Uma formulação final baseada em CS10 que foi conservada criogenicamente antes da expedição. TABELA 31: Impacto de Processo 2A em Processo 1C. Etapa de Processo 1C Processo 2A Impacto processo ETAPA A: Após cirurgia, pode Após cirurgia, podem ser congelados Igual. Obter ser congelado após após colheita e antes Etapa B. amostra de colheita e antes Etapa tumor do B. Paciente fragmentação física fragmentação física fragmentos de tumor 4 fragmentos por 10 40 fragmentos por 1 frasco G-REX - aumentados por frasco ETAPA B: G-REX -10 frascos 100M Tempo de cultura Primeira duração 11-21 dias 11 dia duração (3 dias a 14 dias) encurtado expansão Meio de crescimento Meio de crescimento médio Número reduzido de etapas médio compreende IL- compreende IL-2 Passível de sistema fechado 2 Etapa B TILs são Etapa B TILs diretamente se Processo encurtado de pré- ETAPA C: congelados até movem para Etapa D em Etapa B REP-para-REP Transição da fenotipados durante dia 11 Número reduzido de etapas primeira seleção então Etapa D requer 25- seleção de fenotipagem expansão descongelados para 200x106 TIL eliminada para a prosseguir para Passível de sistema fechado segunda Etapa D (~dia 30) expansão Etapa D requer >40x106 TIL

388 / 557 Etapa de Processo 1C Processo 2A Impacto processo 6 frasco G-REX - 1 frasco G-REX -500M em Etapa B Número reduzido de etapas 100Ms em Etapa D dia 11 Durante REP mais curta dia 0 25-200x106 TIL e 5x109 células sistema de transferência 5x106 TIL e 5x108 alimentadoras apresentando fechado de TILs entre células antígenos em Etapa B dia 11 frascos alimentadoras Dividir para ≤ 6 G-REX - 500M Meio de sistema fechado apresentando frascos em dia 16 muda antígenos por frasco 11 dia duração para Etapa D ETAPA D: em Etapa D dia 0 Meio de crescimento médio Segunda Dividir em 18-36 compreende IL-2, OKT-3, e células expansão frascos em Etapa D apresentadoras de antígenos dia 7 14 dia duração para Etapa D Meio de crescimento médio compreende IL- 2, OKT-3, e células apresentadoras de antígenos Número reduzido de etapas Lavagem automatizada ETAPA E: TIL coletados via TIL coletados via sistema sistema fechado Coletar TILs centrifugação automatizado de lavagem LOVO Perda reduzida de produto durante lavagem ETAPA F: produto fresco em Produto crioconservado em Flexibilidade de expedição Formulação Hypothermosol PlasmaLyte-A + 1% HSA e CS10 Esquema flexível para final / bolsa de infusão armazenado em LN2 paciente Transferir única alíquotas múltiplas Teste de liberação mais para bolsa de estabilidade de estabilidade de expedição mais longa oportuno infusão expedição limitada Tempo de 43-55 dias de Etapa A 22 dias de Etapa A até Retorno mais rápido para o processo até Etapa E Etapa E paciente Estimado Limpeza total diminuída global Custo diminuído de bens

4. ABREVIATURAS µg micrograma µl microlitro µm micrômetro APC Células apresentando antígenos CD Agrupamento de diferenciação CM Memória central CM1, CM2, Cultura meio 1, 2 CO2 Dióxido de carbono CS10 CryoStor® CS10 meio de crioconservação (BioLife Solutions) Ct Ciclo de limiar de PCR DAMPs Dano associado com moléculas de padrão molecular dCt Diferença entre valor Ct de referência e valor Ct de teste ddCt Diferença entre dCt e 10ng valor Ct padrão ECAR Taxa de acidificação extracelular (medição glicólise) EM Memória efetora ER+/PR+ Receptor de estrogênio +/ Receptor de progesterona + GMP Boas práticas de fabricação HBSS solução de sal equilibrada de Hanks HSA Albumina sérica humana IFN-γ Interferon gama IL Interleucina IU Unidades internacionais LN2 Nitrogênio líquido

389 / 557 Ml mililitro Mm milimetro ND Não determinado Ng Nanograma ºC graus Celsius OCR taxa de consumo de oxigênio (medição de fosforilação oxidativa) OKT3 designação de clone de anticorpo monoclonalanti-CD3 PBMC Células mononucleares de sangue periféricas PD Desenvolvimento de processo REP Protocolo de expansão rápida Rh Recombinante humano SOP Procedimento de operação padrão T/S Razão de número de cópias de repetição de telômeros para número de cópias de gene único TIL Linfócito infiltrando os tumores VDJ Variável, diversidade, e junção de segmentos do receptor de células T Vα, Vβ Os segmentos de região variável de receptor de células T maduras no linfócito infiltrando os tumores predominant µg micrograma µl microlitro µm micrômetro APC Células apresentando antígeno CD Agrupamento de diferenciação CM Memória central CM1, CM2, Meios de cultura 1, 2 CO2 Dióxido de carbono CS10 CryoStor® CS10 meio de crioconservação (BioLife Solutions) Ct Ciclo de limiar PCR DAMPs Dano associado com moléculas de padrão molecular dCt Diferença entre valor Ct de referência e valor Ct de teste ddCt Diferença entre dCt e 10ng valor Ct padrão ECAR Taxa de acidificação extracelular (medição de glicólise) EM Memória efetora ER+/PR+ Receptor de estrogênio+/Receptor de progesterona + GMP Boas práticas de fabricações HBSS solução de sal equilibrada de Hanks HSA albumina sérica humana IFN-γ Interferon gama IL Interleucina IU Unidades internacionais LN2 Nitrogênio líquido Ml mililitro Mm milimetro ND Não determinado Ng Nanograma ºC graus Celsius OCR taxa de consumo de oxigênio (medição de fosforilação oxidativa) OKT3 designação de clone de anticorpo monoclonalanti-CD3 PBMC Células mononucleares de sangue periféricas PD Desenvolvimento de Processo REP Protocolo de expansão rápida Rh Recombinante humano SOP Procedimento de operação padrão T/S Razão de número de cópias de repetição de telômeros para número de cópias de gene único TIL Linfócito infiltrando os tumores VDJ Variável, diversidade, e junção de segmentos do receptor de células T Vα, Vβ Os segmentos de região variável de receptor de células T maduras no linfócito infiltrando os tumores predominante

5. DESENHO EXPERIMENTAL

390 / 557

5.1 Processo 2A

[002038] 5.1.1 Pre-REP: Na recepção, o tumor foi transferido a um armário com segurança biológica (Classe II, Tipo A2). Usando técnica estéril, o tumor é removido a partir de recipiente de expedição e lavado em HBSS contendo 50µg/mL gentamicina. O técnico corta em fatias o tumor em fragmentos de 40 x 3X3X3mm que são transferidos a um frasco G-REX - 100M contendo meio CM1 pré-aquecido suplementado com 6000 IU/mL rhIL-2. O frasco é colocado em uma incubadora de cultura de tecido a 37°C, 5% CO2, umidificado durante 11 dias. Se o tumor gerar mais do que 40 fragmentos, então, mais de um G-REX -100M pode ser configurado. As células são então coletadas e preparadas para a REP.

[002039] 5.1.2 REP: Em Dia 11, um frasco G-REX -500M contendo 5L de CM2 suplementado com 3000 IU/mL rhIL-2, 30ng/mL anti-CD3 (Clone OKT3) e 5 x 109 células PBMC alimentadoras irradiadas alogênicas é preparado. TILs coletados a partir de pré-REP em frasco G-REX -100M após redução de volume são contados e semeados no frasco G-REX -500M a uma densidade que pode estar na faixa entre 5 x 106 e 200 x 106 células. O frasco é então colocado em uma incubadora de cultura de tecido a 37°C, 5% CO2, umidificado durante cinco dias. Em Dia 16, volume do frasco G-REX -500M é reduzido, TILs são contados e sua viabilidade determinada. Neste ponto, os TILs são expandidos em múltiplos frascos G-REX -500Ms (até um máximo de seis frascos), cada com uma densidade de semeadura de 1 x 109 TIL/frasco. Todos os frascos são então colocados em incubadores de cultura de tecido a 37°C, 5% CO2, umidificados para um adicional de seis dias. Em Dia 22, o dia de colheita, cada frasco é reduzido em volume por 90%, as células são reunidas em poças e filtradas através um filtro de sangue de 170µm, e, então, coletadas em uma bolsa de 3L Origin EV3000 ou equivalente em preparação para lavagem automatizada usando LOVO.

[002040] 5.1.3 Colheita e formulação final: TILs são lavados usando o

391 / 557 sistema de processamento de células automatizado LOVO que substitui 9,99% de meios de cultura celular com um tampão de lavagem consistindo em PlasmaLyte-A suplementado com 1% HSA. O LOVO opera usando tecnologia de membrana de filtração giratória que recupera acima de 92% dos TILs enquanto virtualmente eliminando componentes residuais da cultura de tecido, incluindo soro, fatores de crescimento, e citocinas, assim como outros resíduos e particulados. Após completar a lavagem, um contagem celular é realizada para determinar a expansão dos TILs e sua viabilidade em colheita. CS10 é adicionado aos TILs lavados a uma razão 1:1 volume:volume para obter a formulação final de Processo 2A. O produto final formulado é dividido em alíquotas em bolsas de crioarmazenamento, selado, e colocado em cassetes de alumínio pré-resfriados. Bolsas de crioarmazenamento contendo TIL são então congeladas usando um Congelador de taxa controlada CryoMed (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) de acordo com Operação de Congelador de taxa controlada SOP LAB-018 Rev 000.

[002041] 5.2 Amostras de TILs: Quatro condições de TILs foram coletadas durante a comparação de caracterização.

[002042] 5.2.1 TIL coletado fresco (direto de PlasmaLyte-A com 1% tampão de lavagem HSA) TIL descongelado (direto de bolsa de produto final descongelado)

[002043] 5.2.2 TIL reREP de fenótipo estendido fresco (TIL coletado fresco cultivado durante 7-14 dias com IL-2, PBMC alimentadoras, e clone anti-CD3 OKT3)

[002044] 5.2.3 TIL de fenótipo estendido descongelado (TILs descongelados cultivados durante 7-14 dias com IL-2, PBMC alimentadoras, e clone anti-CD3 OKT3)

5.3 Visão geral do teste (Ver Figura 2)

[002045] 5.3.1 Teste pré-REP inclui avaliar a quantidade de IL-2 e analisar os metabólitos de cultura celular tal como glicose, ácido láctico, L-

392 / 557 glutamina e amônia em todo o pré-REP.

[002046] 5.3.1.1 Quantificação de IL-2 : meio foi periodicamente removido de cultura pré-REP e testado por ELISA para quantificação de IL-2. Seguir as instruções do fabricante para o Kit R&D Systems Human IL-2 Quantikine ELISA Kit

[002047] 5.3.1.2 Análise de metabólitos de cultura celular : meio foi periodicamente removido a cultura pré-REP e testado para os seguintes metabólitos: glicose, ácido láctico, L-glutamina e amônia. Seguir as instruções do manual do Roche Cedex Bioanalyzer.

[002048] 5.3.2 Teste REP incluiu testes estendidos tal como contagens celulares, % viabilidade, citométrica de fluxo análise de moléculas de superfície celular, potência (produção de IFN-γ ), teste de lise redirecionada bioluminescente, produção de granzyme B, metabolismo celular e medição do comprimento do telômero.

[002049] 5.3.2.1 Contagens celulares e viabilidade: as amostras de TILs foram contadas e viabilidade determinada usando um contador de células automatizado Cellometer K2 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA) de acordo com contador de células automatizado de citômetro SOP LAB-003 Rev 000 Cellometer K2 Image.

[002050] 5.3.2.2 Análise citométrica de fluxo de biomarcadores de superfície celular: amostras de TILs foram divididas em alíquotas durante análise citométrica de fluxo de marcadores de superfície celular usando o procedimento de Coloração de antígeno de superfície WRK LAB-041 Rev 000 de TILs pós-REP

[002051] 5.3.2.3 Teste de potência (produção de IFN-γ): Outra medição de potencial citotóxico foi medida por determinação dos níveis de citocina IFN-γ no meio de TILs estimulados com anticorpos para CD3, CD28, e CD137/4-1BB. Os níveis de IFN-γ em meio a partir destes TILs estimulados foram determinados usando a estimulação de TILs WRK LAB-016 Rev 000

393 / 557 para medir a liberação de IFN-γ

[002052] 5.3.2.4 Teste de lise redirecionada bioluminescente: O potencial citotóxico de TIL para lisar as células alvo foi avaliado usando um teste de co-cultura de TIL com a linhagem celular bioluminescente, P815 (Clone G6), de acordo com SOP descrito em teste de lise redirecionada bioluminescente WRK LAB-040 (teste de potência) para TIL

[002053] 5.3.2,5 Produção de Granzyme B : Granzyme B é outra medição da capacidade de TIL para matar as células alvo. Os sobrenadantes do meio re-estimulados como descrito em 5.2.5.3 foram também avaliados por seus níveis de Granzyme B usando o kit Human Granzyme B DuoSet ELISA Kit (R & D Systems, Minneapolis, MN) de acordo com as instruções do fabricante.

[002054] 5.3.2.6 Metabolismo celular (respiratório) : células foram tratadas com inibidores de respiração mitocondrial e glicólise para determinar um perfil metabólico para TIL consistindo das seguintes medições: linha de base de fosforilação oxidativa (como medido por OCR), capacidade respiratória de reposição, atividade glicolítica de linha de base (como medido por ECAR), e reserva glicolítica. Perfis metabólicos foram realizados usando o procedimento descrito em ensaio de combinação de teste de tensão mitocondrial/ glicólise Seahorse WRK LAB-029.

[002055] 5.3.2.7 Medição de comprimento do telômero: Diversos métodos foram usados para medir o comprimento de telômeros em preparações citológicas e DNA genômico. A análise do fragmento de restrição de telômero (TRF) é o padrão ouro para medir comprimento do telômero (de Lange et al., 1990). No entanto, a principal limitação de TRF é a exigência de uma grande quantidade de DNA (1,5 ^g). Duas técnicas amplamente usadas para a medição de comprimento do telômeros, ou seja, hibridização in situ fluorescência (FISH; Agilent Technologies, Santa Clara, CA) e PCR quantitativa.

394 / 557

[002056] 5.3.3 Amostras adicionais foram tomadas para os seguintes testes, e podem ser analisadas no futuro, como necessário:

5.3.3.1 Análises profundas de citocinas

5.3.3.2 Sequenciamento de TCR

6. RESULTADOS ALCANÇADOS

[002057] Um total de 9 experiências foram realizadas usando os TIL derivados dos tumores descritos em seção 2,3 o desenho experimental e condições de colheita em seção 5,1. TIL coletados usando Processo 2A foram submetidos aos testes de seção 5.3.2 com a finalidade de entender sua capacidade para expandir, sua viabilidade, fenótipo, potencial citotóxico, e perfil metabólico. Todas as medições foram tomadas para o produto TILs coletado fresco e o produto TILs descongelado congelados (Processo 2A).

6.1 Contagens celulares e viabilidade

[002058] 6.1.1 Contagens celulares foram tomadas no final do pré-REP, em Dia 5 ou 6 do REP (dia de expansão), e no final do REP, ambos antes de lavagem LOVO e após lavagem LOVO. As contagens celulares foram então usadas para determinar a expansão de TIL durante a REP e a recuperação de TIL após lavagem no LOVO. Após descongelar, as células foram contadas novamente para determinar a recuperação após descongelar (com base na concentração em que os TILs foram congelados) e a viabilidade após descongelamento antes de prosseguir com outro teste analítico. Tabela 3 resume todos os resultados nos nove ciclos do Processo 2A. TABELA 32: Contagens celulares, % viabilidade, e expansão de TIL dos ciclos de Processo 2A. M1062 M1064 EP11001 M1061T T M1063T T M1065T T M1056T M1058T M1023T Inóculo pré- 1,8 x 3,3 x 107 1 x 108 7,5 x 107 4,1 x 106 5,4 x 106 7 x 107 4,7 x 107 4,8 x 107 REP 108 Dia 5/6 3,6 x 1,3 x 109 4 x 109 3 x 109 6,6 x 108 2,8 x 109 4,0 x 1093,7 x 109 2,2 x 109 Contagem 109 expansão de vezes de Dia 0 898 590 470 130 1900 522 771 1400 850 a Dia 11 2,8 x 5,6 x 2,3 x 2,63 x 6,7 x Colheita 3,5 x 1010 7,8 x 109 5 x 1010 4,1 x 1010 1010 1010 1010 1010 1010

395 / 557 M1062 M1064 EP11001 M1061T T M1063T T M1065T T M1056T M1058T M1023T

LOVO Recuperação 100 68 100 100 92 95 100 90 99 (%) Bolsas de 2x 2x 3x 2x 2x crioarmazenam 3 x 30ml 2 x 100ml 2 x 65ml 2 x 100ml 100ml 50ml 100ml 100ml 100ml ento após descong. Recuperação 103 84 90 88 101 82 82 86 78 (%) após descong. Viabilidade 84,75 84,36 77,15 83,48 79,98 74,85 80,28 85,03 89,21 (%)

[002059] 6.1.2 O processo 2A SOP define o número inicial de TIL para um REP como uma faixa de 5 200 x 106 TIL. O intervalo de nove amostras TIL usadas para iniciar os REPs do Processo 2A foi de 4,1 x 106 (M1065T) - 1,8 x 108 (M1064T), com um número inicial médio de TIL de 6,58 x 107. Curiosamente, a REP colocou na placa o menor número de TIL expandidos ao mais alto nível na colheita de REP (faixa de expansão para todos os 9 REPs: 130-1900 vezes; expansão média 840 vezes). O número médio de TIL colhidos no final desses nove REPs do Processo 2A foi de 4,49 x 1010 (faixa 7,8 x 109 - 6,7 x 1010).

[002060] 6.1.3 Para estatísticas comparativas do Processo 1C, ver Seção de Química, Fabricação e Controles (CMC) do Investigational New Drug (IND) Application for LN144/LN-145.

[002061] 6.1.4 Processo 1C usa os manuais de manuseio e centrifugação para lavar o produto TIL. Isso consome tempo, mas o mais importante pode resultar na perda de até 25% do produto entre a colheita e a formulação final. O sistema LOVO de lavagem automática de células provê uma maneira de minimizar a perda de células e também introduz uma lavagem de sistema fechado que diminui o risco de contaminação do produto durante as etapas de lavagem. A recuperação do produto após a etapa de lavagem LOVO do protocolo e mostrou uma média de 93,8 ± 10,4% de recuperação do produto TIL entrando na etapa de lavagem. Essa estatística inclui o produto TIL para o M1062T, que teve uma recuperação do LOVO de 68%, durante a qual um erro do operador na operação do LOVO resultou na necessidade de

396 / 557 centrifugar a amostra e reiniciar o procedimento do LOVO (ver Seção 7, Desvios e discrepâncias) ) Isso representa uma melhoria altamente favorável na etapa de lavagem do Processo 1C no dia da colheita do REP.

[002062] 6.1,5 Recuperação de TIL após o descongelamento também é uma grande preocupação para um produto TIL congelado. Recuperação do produto foi determinada medindo o número de células recuperadas da bolsa após o descongelamento em comparação com o número de células colocadas em cada bolsa de congelamento antes da crioconservação. A faixa de recuperação do descongelamento foi de 78 a 103%, com uma recuperação média de 88,2 ± 8,6%.

[002063] 6.1.6 Embora exista uma diferença significativa na viabilidade das amostras antes ou depois do descongelamento, em média, há apenas uma perda de 2% na viabilidade após o descongelamento. A viabilidade do TIL entrando em crioconservação foi de 84,3 ± 4,7%, e o mesmo TIL após o descongelamento teve uma viabilidade de 82,1 ± 4,4% (p = 0,0742, teste t de Student pareado, não paramétrico). Os critérios de liberação para o novo produto clínico TIL Processo 1C requerem um mínimo de 70% de viabilidade. Independentemente de uma pequena perda de viabilidade após o descongelamento, todas os 9 ciclos do Processo 2A atenderam a este critério de liberação após o descongelamento do produto criogênico. Tabela 4 e Figura 3 mostram a viabilidade do TIL entrar em crioconservação (Fresco + CS10) e a viabilidade do TIL após descongelamento. TABELA 33: Comparação de viabilidade de produto fresco e descongelado. M1061T M1062T M1063T M1064 M1065T EP1100 M1056T M1058T M1023T T 1T Fresco + 88,05 84,45 82,05 86,75 76,35 77,9 84,8 87,5 90,5 CS10 Descong. 84,75 84,36 77,15 83,48 79,98 74,85 80,28 85,03 89,21

[002064] 6.2 Expansão de TILs re-REP. Além de examinar a capacidade do produto fresco para expandir em um REP, a capacidade de ambos o produto TILs frescos e descongelados para expandir quando de reestimulação com PBMC alimentadoras frescas irradiadas alogênicas APCs e anti-CD

397 / 557 fresco3 foi avaliado. Após 7 dias, estes produtos TILs re-estimulados foram analisados por sua capacidade para expandir de condições iniciais de cultura. Figura 4 e Tabela 5 mostram a expansão média de células TIL de re-REP após 7 dias de crescimento em cultura. Análise dos dados usando um teste t de Student pareado mostra que a capacidade do TIL para expandir em um re- REP não é significativamente diferentes se iniciando REP com produto de TILs frescos ou TILs descongelados (p = 0,81). TABELA 34: Comparação de expansão de TILs frescos e descongelados em cultura re-REP MM106 MM106 MM1063 MM1065 MM1 MM1 MM1064T EEP11001T MM1023T 1T 2T T T 056T 058T Fresco 139.67 264 227 60,12 24.67 268.83 176 316.3 202,33 3 Descong 177.33 110.33 220.67 177.6 220,2 302,5 114.7 190.6 73.82 . 7 7

[002065] 6.3 Metabólitos de cultura celular. Uma das principais premissas do Lion 2A era que menos transferências de tempo e processos de tecnologia levariam a economia de custos e limitação da variabilidade. Possíveis consequências adversas disso foram aumentos nos metabólitos indesejáveis e reduções nas fontes de nutrientes. Como mostrado na Figura 5, valores normais no sangue de eletrólitos (sódio e potássio), nutrientes (glutamina e glicose) e metabólitos (ácido lático e amônia) provêem uma faixa a ser considerada ao avaliar os resultados dos 11 dias anteriores a REP. Como mostrado na Figura 6, três TILs (M1061T, M1062T e M1064T) foram avaliados sequencialmente. Nesse cenário, o potássio e o sódio foram mantidos em níveis normais, a glicose estava em> 1,0g/L e glutamina> 0,3 mmol /L, bem acima dos valores normais do sangue. Como o esperado, o lactato subiu para 0,8g/L, cerca de 5X o nível encontrado no sangue normalmente e a amônia até 3mmol/L, como esperado das células rapidamente expandidas e também substancialmente mais alto do que o que é encontrado normalmente no sangue.

6.4 Quantificação de IL-2.

398 / 557

[002066] 6.4.1 O acionador principal da proliferação de TILs no pré- REP e além de glicose suplementar, glutamina e suficiente oxigenação, é a provisão de níveis elevados de rhIL-2. Após sua adição a meio contendo soro, os níveis de IL-2 foram medidos a 2-3,5x103 IU/ml, somente caindo a cerca de 1,0x103 IU/ml nos 11 dias de cultura. Isto está bem acima dos 30-100 IU/ml necessários para sustentar a proliferação de células T. Avaliação de concentração de IL-2s usando diferentes fontes de IL-2 (Prometheus, Akron, Cellgenix) está sendo atualmente testada em experiências separadas (QP-17- 010 : Qualificação de IL-2 de Cellgenix, Akron e Prometheus) em Lion Biotechnologies, Tampa. 6,5 Produção de IFN-γ

[002067] 6.5.1 Após 24h de estimulação de TIL com Dynabeads anti- CD3, CD28 e 4-1BB magnéticas como descrito em seções 5.3.5.3, sobrenadante de culturas foi coletado e analisado para IFN-γ usando kits ELISA. Todos os TIL re-estimulados produziram mais IFN-γ do que suas contrapartes não estimuladas, mostrando que a estimulação do TIL resultou em sua ativação. Figura 8 mostra a capacidade do quatro diferentes composições de TIL (TIL frescos re-REP, descongelados, frescos e descongelados re-REP) testados para liberação de IFN-γ no meio circundando quando da reestimulação.

[002068] Tabelas 6 e 7 mostram os valores médios de secreção de IFN-γ nos 9 ciclos do Processo 2A. a secreção de IFN-γ no meio circundante quando da reestimulação não é diferente entre os produtos TILs frescos e os TILs descongelados, crioconservados. Tabela 6 mostra que produto fresco produziu uma média de 4143 ± 2285 pg IFN-γ/106 TIL enquanto que o produto descongelado produziu 3910 ± 1487 pg IFN-γ/106 TIL (p = 0,55 usando teste t de Student pareado). Se normalizado para produto TILs total (Tabela 7), em média, TILs frescos estimulados produziram 86 ± 61 gramas IFN-γ, enquanto que TIL descongelados estimulados produziram 68 ± 40 gramas IFN-γ (p =

399 / 557 0,13). Estas descobertas indicam que ambos produtos TILs frescos e descongelados produzem IFN-γ e que não há diferença na capacidade de casar TILs frescos ou descongelados para produzir IFN-γ quando da estimulação com anti-CD3/anti-CD28/anti-4-1BB. TABELA 35: Secreção de IFN-γ em TILs frescos e descongelados (expressado como pg/106células/24hrs) M1061T M1062T M1063T M1064T M1065T EP11001T M1056T M105 M1023T 8T Fresco 4570 3921 5589 619 1363 4263 6065 2983 7918 Descong. 3158 3543 5478 1563 2127 5059 4216 4033 6010 Fresco re- 3638 1732 971 2676 2753 1461 2374 770 3512

REP Descong. re- 2970 2060 1273 1074 1744 2522 5042 4038 923

REP TABELA 36: Secreção de IFN-γ em TILs frescos e descongelados. Todos os valores estão em 1012(expressado como gramas/106células/24h) M1061T Fresco 67,1 78,4 99,6 8,4 4,8 66,1 157,0 109,0 187,0 Descong. 47,7 59,7 87,9 18,7 7,5 64,4 88,9 127,0 111,0

6.6 Produção de Granzyme B

[002069] 6.6.1 TILs foram estimulados com Dynabeads magnéticas anti-CD3, CD28 e 4-1BB por 24hr como descrito em 5.2.5.3, e sobrenadante de culturas foi coletado após 24hr e analisados os níveis de Granzyme B por ELISA. Todos os TILs re-estimulados produziram mais Granzyme B do que suas contrapartes não estimuladas, mostrando que a estimulação dos TILs resultou em sua ativação. Figura 9 mostra a capacidade dos TILs frescos, TILs frescos re-REP, e TILs descongelados re-REP de liberar Granzyme B no meio circundante quando da reestimulação com o coquetel de citocinas.

[002070] Todos os produtos mostraram produção de granzyme B na faixa de 9190 pg/106 células viáveis a 262000pg/106 células viáveis (Tabela 8). Tabela 6 mostra que produto fresco produziu uma média de 60644 + 42959, enquanto re-REPs frescos e descongelados produziram 93600 + 67558 e 103878 + 84515 respectivamente. Comparação entre os re-REP re-REPs frescos e descongelados mostrou que não há diferença na capacidade dos TILs obtidos a partir de ambas as condições (p = 0,7). Devido à faixa de

400 / 557 medição de Granzyme B no produto descongelado, não foram realizadas análises estatísticas usando os produtos TILs frescos. TABELA 37: Secreção de Granzyme B em TILs frescos, TIL fresco de reREP, e TIL descongelado de reREP (expressado como pg/106células/24h) M1061T M1062T M1063T M1064 M1065T EP1100 M1056T M1058T M1023T T 1T Fresco 10600 108000 49100 28400 24300 17900 120000 12900 79100 ReREP 216000 37700 42400 91800 192000 22200 97300 73800 69200 Fresco ReREP 262000 113000 35100 65600 48700 9190 147000 201000 53300 descon.

6.7 Análise citométrica de fluxo de biomarcadores de superfície celular

[002071] Perfil fenotípico de TILs: Quatro painéis de anticorpo foram padronizados em LION para caracterizar amplamente o perfil funcional de células T. Estes painéis foram usados para avaliar a imunofenotipagem de TILs frescos, TILs descongelados, TILs frescos re-REP, e TILs descongelados re-REP. Todos os dados usados para a representação nesta seção são também providos em um formato de tabela (Tabelas 14-24) na seção de apêndice 10.

6.8 Teste de lise redirecionada bioluminescente

[002072] 6.8.1 Para determinar a capacidade potencial do Processo 2A TIL para matar suas células de tumor alvo, os requerentes desenvolveram um teste de potência envolvendo a co-cultura de TIL com uma linhagem de células alvo P815 substituta bioluminescente, como descrito em seção 5.3.2.4. Uma co-cultura de 4 horas das diferentes composições de TIL com P815 na presença de estimulação anti-CD3 dá uma medição do potencial citotóxico das células de TILs expressado como unidades líticas LU50, o que pode ser definido como o número de TILs necessários para matar 50% das células alvo. Esta medição é então expressada como TILs LU50/106. Figura 32 abaixo mostra o potencial citotóxico do TIL a partir de produto fresco, e a partir de duas condições de TILs re-REP, frescos re-REP e descongelados re- REP.

[002073] 6.8.2 Comparação de fresco re-REP para descongelado re-REP

401 / 557 mostra que não se nota nenhuma diferença significante na capacidade de ambos TILs para matar uma célula alvo (p = 0,3126). Estes dados sustentam a conclusão de que não se tem diferença entre o produto fresco e descongelado em termos do potencial citotóxico do produto TIL. Uma comparação entre frescos foi realizada como o potencial citotóxico foi não medido imediatamente após descongelar TIL. Tabela 9 mostra as unidades líticas de TIL necessárias para matar 50% da linhagem de células alvo P815. TABELA 38: Unidades líticas produzidas por TIL contra linhagem de células alvo P815 Fresco Fresco reREP fresco descong. reREP M1061T 21,7 42,3 342 M1062T 5,9 17,0 20,9 M1063T 14,2 161 12,5 M10641 22,2 8,7 4,4 M10651 42,6 411 128_8 EP11001T 1,8 4,3 147 M1056T 25,0 16,6 18,2 M10513T 76,9 13,8 16,6 M1023T 30,8 25,6 30,4 avg ± sd 26,8 ± 22,5 20,6 ± 13,3 31,1 ± 37,6

6.9 Perfil de metabolismo celular de TIL

[002074] 6.9.1 Para avaliar a saúde metabólica de TIL pós-REP, os requerentes utilizaram os instrumentos do analisador de metabolismo Seahorse (XFp e XFe96) de Agilent Technologies (Santa Clara, CA) seguindo o protocolo apresentado em seção 5.3.2.6. Brevemente, por tratamento das células com inibidores que alvejam certos aspectos ou de fosforilação oxidativa ou glicólise, células são estressadas de tal modo para permitir a determinação de seu SRC e reserva glicolítica. Além disso, os níveis basais de ambos fosforilação oxidativa (OCR basal) e glicólise (ECAR basal) podem ser determinados. Finalmente, porque os inibidores de fosforilação oxidativa e glicólise são combinados no mesmo teste, uma reserva escondida de potencial de SRC pode ser discernida, que é somente aparente quando as células são tratadas com o inibidor competitivo de glicólise, 2-deoxiglucose (2-DG), (rotulado SRC2DG), resultando em um aumento em SRC que de outra forma permaneceria escondido. Esta capacidade respiratória extra foi rotulada como

402 / 557 “Covert” SRC. Tabela 9 mostra os perfis metabólicos do TILs frescos, TILs frescos re-REP, e TILs descongelados re-REP coletados, derivados do teste de estresse metabólico realizado nas células.

[002075] 6.9.2 Figuras 55A - F mostram os dados da Tabela 38 em forma gráfica. O produto fresco REP coletado mostra algumas diferenças estatísticas a partir de produtos frescos re-REP e descongelados re-REP. Isto não é surpreendente porque o produto re-REP foi reestimulado com PBMC APC fresco irradiado e anticorpo anti-CD3 fresco, ou imediatamente após a REP ou quando do descongelamento. No entanto, em todos os cases, não se nota nenhuma diferença significante entre o produto fresco e o descongelado quando ambos são re-estimulados em um procedimento re-REP (ver os valores p de Tabela 9). Isto indica que o processo de crioconservação não afeta de modo prejudicial o produto TIL. O mais notavelmente, para a fosforilação oxidativa, o produto de re-REPs tem maior SRC do que seus correspondentes produtos REP de colheita fresca. Para glicólise, o TIL de re- REP tem níveis basais estatisticamente significativamente maiores de glicólise e, inversamente, níveis estatisticamente menores de reserva glicolítica do que o produto fresco REP. É importante notar que isto poderia indicar que TIL de re-REP são mais altamente ativados do que os TILs recentemente coletados, como ativados, TILs saudáveis são relatados como possuindo níveis elevados de atividade glicolítica (Buck et al., JEM 212:1345-1360; 2015).

TABELA 39: Perfil metabólico de Processo 2A TIL p v. re- EP1100 p v.

REP Basal OCR, pmol/min M1061 M1062 M1063 Moff2 Moff3 Moff4 1T M1064 M1065 médio desvio fresco fresco PLLA 50,33 33,95 74,89 36,80 38,48 39,89 63,02 55,89 49,16 14,56 re-REP fresco 38,92 38,48 54,35 25,98 18,68 38,61 37,33 41,04 36,67 10,57 0,03 re-REP descongelado 39,25 43,28 60,05 30,68 57,90 59,08 27,85 52,58 32,82 44,83 12,90 0,48 0,11 Overt SRC, pmol/min PLLA 24,74 10,45 101,18 47,32 77,00 35,07 31,39 3,02 41,27 33,22 re-REP fresco 51,72 36,46 48,24 28,34 37,69 21,02 9,93 99,71 41,64 27,17 0,29 re-REP descongelado 47,38 40,40 121,86 26,04 37,32 86,47 58,45 89,59 56,45 62,66 30,75 0,16 0,12 SRC20G, pmol/min PLLA 14,01 5,72 35,98 29,97 74,62 24,42 31,39 20,70 29,60 20,67 re-REP fresco 81,80 78,82 52,73 38,69 92,37 42,35 -12,81 137,15 63,89 44,45 0,08 re-REP descongelado 76,97 77,72 177,48 48,27 56,57 69,05 74,14 130,76 85,89 88,54 40,59 0,00 0,25

403 / 557 Covert SRC, pmol/min PLLA 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 17,68 2,21 6,25 re-REP fresco 30,08 42,36 4,50 10,35 54,68 21,33 0,00 2,63 20,74 20,13 0,02 re-REP descongelado 29,59 37,32 55,62 22,23 19,25 0,00 15,68 41,16 29,44 27,81 16,10 0,01 0,52 Basal ECAR, mpH/min PLLA 53,44 27,55 136,33 48,72 89,80 62,29 108,38 72,07 74,82 35,20 re-REP fresco 96,48 96,63 171,47 102,87 145,19 153,97 35,60 147,02 118,65 44,19 0,10 re-REP descongelado 143,35 173,93 193,39 149,19 169,21 73,17 98,64 96,37 90,55 131,98 43,15 0,01 0,38 Reserva glicolítica, mpH/min PLLA 32,11 26,18 52,00 19,09 38,01 39,03 43,14 76,43 40,75 17,61 re-REP fresco 24,06 8,75 18,17 -8,28 -5,89 10,31 35,34 20,80 12,91 14,85 0,003 re-REP descongelado 15,50 -18,94 13,56 -6,78 11,45 54,84 -21,37 -12,66 -5,47 3,35 23,75 0,01 0,47

404 / 557

[002076] 6.9.3 Uma comparação direta de produtos frescos para produtos congelados usando o procedimento re-REP permitiu aos requerentes determinar que os ambos produtos TILs frescos e congelados, quando de condições idênticas de estimulação, resultam em perfis metabólicos que são estatisticamente indistintos. Ambos TILs frescos re-REP e descongelados re- REP têm níveis similares de respiração basal (Figura 60A, 36,7 ± 10,6 e 44,8 ± 12,9 pmol/min, respectivamente; p = 0,11) assim como SRC similar (overt) (Figura 60B, 41,6 ± 27,2 e 62,7 ± 30,8; p = 0,12). Quando do tratamento destas células re-REP com 2-DG, o inibidor competitivo para glicose, que resulta em uma de glicólise, os requerentes notaram que ambos TILs frescos e descongelados re-REP mostram uma capacidade respiratória de reposição “escondida” extra (SRC2DG; Covert SRC) que é principalmente baixa ou ausente na amostra de TIL coletado fresco (Figura 60C); somente uma amostra tinha níveis elevados de SRC2DG (Figura 60C) nos TIL fresco coletado, enquanto que, inversamente, somente uma das sete amostras testadas mostrou um a falta de Covert SRC quando de re-REP. Covert SRC (Figura 60D) para fresco re-REP estava na média de 20,7 ± 20,1 enquanto covert SRC (Figura 60D) para descongelados re-REP estava na faixa de 27,8 ± 16,1; p = 0,52).

[002077] 6.9.3 Uma comparação direta de produtos frescos para produtos congelados usando o procedimento re-REP permitiu aos requerentes determinar que os ambos produtos TILs frescos e congelados, quando de condições idênticas de estimulação, resultam em perfis metabólicos que são estatisticamente indistintos. Ambos TILs frescos re-REP e descongelados re- REP têm níveis similares de respiração basal (Figura 60A, 36,7 ± 10,6 e 44,8 ± 12,9 pmol/min, respectivamente; p = 0,11) assim como SRC similar (overt) (Figura 60B, 41,6 ± 27,2 e 62,7 ± 30,8; p = 0,12). Quando do tratamento destas células re-REP com 2-DG, o inibidor competitivo para glicose, que resulta em uma de glicólise, os requerentes notaram que ambos TILs frescos e

405 / 557 descongelados re-REP mostram uma capacidade respiratória de reposição “escondida” extra (SRC2DG; Covert SRC) que é principalmente baixa ou ausente na amostra de TIL coletado fresco (Figura 60C); somente uma amostra tinha níveis elevados de SRC2DG (Figura 60C) nos TIL fresco coletado, enquanto que, inversamente, somente uma das sete amostras testadas mostrou um a falta de Covert SRC quando de re-REP. Covert SRC (Figura 60D) para fresco re-REP estava na média de 20,7 ± 20,1 enquanto covert SRC (Figura 60D) para descongelados re-REP estava na faixa de 27,8 ± 16,1; p = 0,52).

[002078] 6.9.4 A leitura metabólica mais impressionante do TIL de fenótipo estendido (re-REP) é a dos níveis consistentemente elevados de glicólise basal das amostras de fenótipo estendido (re-REP). A glicólise basal (Figura 60E) é consistentemente elevada em amostras de re-REP, com média de 118,7 ± 44,2 mpH/min em fresco re-REP e 132,0 ± 43,2 mpH/min em descongelado re-REP. Estas amostras não são estatisticamente diferentes de cada outra (p = 0,38). No entanto, como mencionado acima, as amostras coletadas frescas não possuem tais níveis basais elevados de glicólise. Comparado com TIL fresco re-REP, esta diferença é substancial, mas não significante (p = 0,10); no entanto quando comparado com as amostras descongeladas re-REP, a diferença é significante (p 0,01). Estas células de re- REP são aparentemente fortemente dependentes de glicólise para suas necessidades de energia, como elas tem uma pequena reserva glicolítica restante quando estressadas nos testes metabólicos Seahorse (Figura 60F): média de TILs frescos re-REP 12,9 ± 14,9 mpH/min; TILs descongelados re- REP, 3,35 ± 23,8 mpH/min). Estes re-REPs não são diferentes de cada outro (p = 0,47) mas ambos são estatisticamente diferentes da reserva glicolítica encontrada em amostras de TIL coletado fresco, que está na média de 40,8 ± 17,6 mpH/min (p = 0,003 e 0,01 comparado com TILs frescos re-REP e descongelados re-REP, respectivamente). Outros estudos devem ser

406 / 557 conduzidos para determinar a causa atrás das diferenças, como notada em glicólise entre estas amostras de colheita fresca e de TILs re-REP.

6.10 Medição de comprimento do telômero

[002079] 6.10.1 Medição de Comprimento do telômero de TILs pós- REP por Flow Fish e qPCR.

[002080] 6.10.1.1. Flow-FISH foi realizado usando o kit Dako/Agilent Pathology Solutions (Telomere PNA Kit/FITC para citometria de fluxo) e as instruções do fabricante foram seguidas para medir o comprimento médio da repetição de telômero. 1301 A linhagem celular de células T de leucemia (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)) foi usada como um padrão de referência interna em cada teste. TILs individuais foram contados e misturados com células 1301 dá uma razão 1:1 célula. 2 X 106 TILs foram misturados com 2 X 106 células 1301. A hibridização in situ foi realizada em solução de hibridização (70% formamida, 1% BSA, 20mM Tris, pH 7,0) em duplicata e na presença e ausência de um a sonda de PNA telômero conjugada a FITC (FITC-00-CCCTAA-CCC-TAA-CCC-TAA) complementar à sequência de repetição de telômero a uma concentração final de 60nM. Após adição da sonda telômero PNA, células foram incubadas durante 10 minutos a 82°C em um bloco térmico. As células foram então colocadas no escuro em temperatura ambiente durante a noite. Na próxima manhã, a sonda de telômero em excesso foi removida por lavagem 2 vezes durante 10 minutos cada em um bloco a 40°C com solução de lavagem. Após as lavagens, DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA) foi adicionado a uma concentração final de 75ng/ml. A coloração de DNA com DAPI foi usada para reunir as células na população G0/G1. A análise da amostra foi realizada usando um citômetro de fluxo Yeti (Propel-Labs, Fort Collins, CO). A fluorescência do telômero da amostra de teste foi expressada como uma porcentagem da fluorescência (fl) das células 1301 pela seguinte fórmula: comprimento relativo do telômero = [(média células de teste FITC fl com sonda - média células de teste FITC fl

407 / 557 sem sonda) X índice de DNA de células 1301 X 100] / [(média de células 1301 FITC fl com sonda – média de células 1301 FITC fl sem sonda) X índice d eDNA de células de teste.

[002081] 6.10.1.2 qPCR: qPCR em tempo real foi usado para medir comprimento relativo do telômero. Brevemente, a razão do número de cópias de repetição de telômeros para número de cópias de gene único (T/S) foi determinada usando um ciclador térmico Bio--Rad PCR (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) em um formato de 96 cavidades. Dez nanogramas de DNA genômico foi usado para ou a reação PCR do telômero (Tel) ou da hemoglobina (hgb) e os iniciadores usados foram os seguintes: iniciador Tel-1b (CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT), Tel-2b primer (GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT), iniciador hgb1 (GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC), e iniciador hgb2 (CACCAACTTCATCCACGTTCACC). Todas as amostras foram analisadas por ambas as reações de telômero e hemoglobina, e a análise foi realizada em triplicata na mesma placa. Além das amostras de teste, cada placa com 96 cavidades continha uma curva padrão de cinco pontos de 0,08ng a 250ng usando DNA genômico isolado de células 1301. A razão T/S (-dCt) para cada amostra foi calculada subtraindo o valor do limiar de hemoglobina mediano (Ct) a partir do valor Ct de telômero mediano. A razão relativa T/S (-ddCt) foi determinada subtraindo a razão T/S do ponto da curva padrão de 10 ng a partir da razão T/S de cada amostra desconhecida.

[002082] 6.10.1.3 Resultados e discussão - Comprimento do telômero: Os telômeros são caps (sequências de nucleotídeos repetitivas) na extremidade dos cromossomas lineares que desempenham um papel crítico para facilitar a completa replicação do cromossoma. A medição do telômero é uma ferramenta emergente no estudo de tais condições como as doenças degenerativas, câncer, e envelhecimento. Estudos anteriores de NIH (J

408 / 557 Imunol. 2005, Nov 15;175(10):7046-52; Clin Cancer Res. 2011, Jul 1; 17(13): 4550– 4557) têm mostrados que o comprimento mais longo do telômero de TIL está associado com resposta clínica. Inversamente, o grupo Radvanyi não encontrou nenhuma diferença significante no comprimento dos telômeros de TIL entre respondentes e não respondentes (Clin Cancer Res; 18(24); 6758– 70). Até agora, não se tem nenhuma evidência para prover que o comprimento do telômero está associado com o comprimento de cultura de células T in vitro. É possível que TIL pós-REP cultivado por Processo 2A (cultura de 22 dias) terá um comprimento mais longo do telômero quando comparado com TIL cultivado por processo Processo 1C (cultura de 25-36 dias).

7. DISCREPÂNCIAS E DESVIOS

[002083] 7.1 Desvios do Processo

[002084] 7.1.1 M1061T: Células REP foram divididas em Dia 6 em frascos 4 G-Rex500M.

[002085] 7.1.2 M1062T: Células REP foram divididas em Dia 6 em frascos 4 G-Rex500M. Devido a um erro do operador no sistema de filtração LOVO, uma parada de emergência ocorreu durante o procedimento que requereu uma coleta manual dos TILs a partir de kit descartável. Os TILs foram filtrados com sucesso durante um segundo ciclo LOVO.

[002086] 7.1.3 M1063T: Sem desvios M1064T: Sem desvios

[002087] 7.4.4 M1065T: Células pré-REP estavam abaixo da eespecíficoação para contagem celular em Dia 11 (<5 x 106 células) mas foram continuadas no REP. Em REP Dia 6, as células foram contadas e colocadas de volta no G-Rex500M e alimentadas com 4,5L de meio fresco. Os TILs não foram expandidos neste dia devido a contagem celular insuficiente (<1 x 109 células em REP Dia 6).

[002088] 7.1,5 EP11001T: Sem desvios

[002089] 7.1.6 M1056T: As células pré-REP foram cultivada a LION em um frasco G-Rex 100 por até 21 dias. Os fragmentos de tumor foram

409 / 557 filtrados em pré-REP Dia 11 e os TILs foram congelados no dia da colheita em 100% CS10 a 30 x 106 células por frasco-ampola de 1,5 ml. TILs congelados foram descongelados em Moffitt PD em CM1 suplementado com 6000 IU/mL rhIL-2 e permaneceram durante 3 dias antes de iniciar Dia 0 do REP. Em REP Dia 6, TILs foram expandidos em 4 frascos que prosseguiram para colheita em REP Dia 11.

[002090] 7.1.7 M1058T: Células pré-REP foram cultivadas em LION em um frasco G-Rex 100 por até 21 dias. Os fragmentos de tumor foram filtrados em pré-REP Dia 11 e os TILs foram congelados no dia de colheita em 100% CS10 a 30 x 106 células por frasco-ampola de 1,5 ml. Os TILs congelados foram descongelados em Moffitt PD em CM1 suplementado com 6000 IU/mL rhIL-2 e permaneceram durante 3 dias antes de iniciar Dia 0 do REP. Em REP Dia 6, células foram divididas em 4 frascos que prosseguiram para colheita em REP Dia 11.

[002091] 7.1.8 M1023T: Células pré-REP foram cultivadas em LION em frascos G-Rex10 por até 21 dias. Os fragmentos de tumor foram filtrados em pré-REP Dia 11 e os TILs foram congelados em dia de colheita em 100% CS10 a 30 x 106 células por frasco-ampola de 1,5 ml. TILs congelados foram descongelados em Moffitt PD em CM1 suplementado com 6000 IU/mL rhIL- 2 e permaneceram durante 3 dias antes de iniciar Dia 0 do REP. Em REP Dia 6, células foram expandidas em 4 frascos que prosseguiram para colheita em REP Dia 11.

[002092] 7. 2 Desvios de teste

[002093] 7.2.1 A análise em profundidade de citocina e sequenciamento TCR não foram realizados.

8. CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES

[002094] 8.1 Desenvolvendo um processo mais robusto. O desafio da Lion era converter o Processo 1C anterior, que tinha um longo tempo de processamento, em um Processo Lion 2A potencialmente mais

410 / 557 comercializável, que utiliza refinamentos que resultam em menor tempo de processamento e uma formulação final crioconservada do produto TIL. Para este fim, nove ciclos de Desenvolvimento de Processo foram conduzidos para confirmar que os processos antigos e novos demonstraram rendimentos celulares comparáveis e potência e fenótipo TIL comparáveis. É digno de nota a complexidade acentuadamente reduzida do processo geral, resultando em uma redução de 50% na duração geral dos processos pré-REP e REP, mas ainda resultando em rendimentos comparáveis de TIL (7,8 x 109 - 67 x 109 células) comparados ao histórico Processo 1C de Lion atualmente praticado no fabricante contratado pelos requerentes. Isso foi atualizado recentemente para a apresentação da ASCO em junho de 2017 (média: 41,04 x 109 células com uma faixa de 1,2 a 96 x 109 células). Além disso, a Lion desenvolveu com sucesso um produto TIL com crioconservação que demonstrou uma recuperação pós-descongelamento de 78-103% com viabilidade> 70% de TIL, consistente com os atuais critérios de liberação do Processo 1C (ver Tabela 2).

[002095] 8.2 O papel da análise fenotípica estendida (Re-REP). A capacidade de proliferar em resposta à estimulação mitogênica (como nos re- REPs experimentais apresentados neste relatório) é um atributo crítico de qualidade do TIL. As experiências apresentadas aqui mostram que 8/9 produtos TIL descongelados foram capazes de expandir> 100 vezes em uma semana em comparação com 7/9 produtos TIL frescos correspondentes, suportando a comparabilidade do produto TIL descongelado com o produto TIL fresco (Tabela 2). Dois atributos adicionais de qualidade crítica de TIL são sua capacidade de liberar IFN-γ e/ou Granzyme B após a estimulação com citocinas (CD3/CD28/4-1BB). A estimulação com citocinas dos produtos frescos e descongelados resultou na liberação de IFN-γ superior a 2ng/106 célula/24 horas em 7/9 produtos frescos e todos os produtos descongelados (Figura 35) (ver seção 6.2 deste relatório). A liberação de Granzyme B

411 / 557 (Figura 36) foi observada em todos os 9 ciclos do processo. Os níveis de CD4 e CD8 (Figura 39 e Figura 40) demonstraram notável consistência interna entre produtos TIL frescos e descongelados. Além disso, a análise da capacidade do TIL de matar uma linhagem celular alvo de tumor substituto (P815, Figura 59) mostrou que o TIL fresco e descongelado possuía potencial citotóxico similar.

[002096] 8.3 Um teste de estresse metabólico de TIL revela bioenergética robusta. Uma análise dos perfis metabólicos de produtos TIL frescos e descongelados estimulados em um re-REP demonstrou que os TIL frescos e descongelados responderam de modo similar ao teste de estresse metabólico e não mostraram diferenças substanciais em um painel de características metabólicas (Tabela 39). Assim, o produto TIL de Processo 2A com crioconservação pode ser considerado comparável ao produto fresco de Processo 1C, com base nos quatro atributos de qualidade de identidade, potência, número de células e viabilidade apresentados neste relatório. Os testes comparando células frescas e descongeladas correspondentes foram bastante comparáveis em todos os testes descritos neste relatório.

[002097] 8.4 Critérios de aceitação: A heterogeneidade intrínseca dos produtos TIL com terapia personalizada para cada paciente reflete: (1) suas principais moléculas restritivas do complexo principal de histocompatibilidade (os produtos gênicos mais polimórficos da biologia humana); (2) a trajetória evolucionária única de tumores individuais que surgem no microambiente tumoral com instabilidade genômica e mutações únicas ‘motorista e passageiro’ individuais; e (3) a heterogeneidade conferida pela variação alélica, diversidade da região N e rearranjos de VDJ nos segmentos \/α e \/β que definem os receptores de células T usados para o reconhecimento de neoepítopos que compartilham antígenos de tumor- testículo e produtos codificados viralmente. Avaliação das variações adicionais que ocorrem como resultado de alterações no processo é, portanto,

412 / 557 uma tarefa assustadora e requer avaliação do maior número possível de parâmetros para assegurar, a si próprio, que a “comparabilidade” de um material intrinsecamente heterogêneo é possível. Isso foi realizado examinando fielmente vários critérios de aceitação para viabilidade e comparabilidade, como detalhado na Tabela 40 abaixo. TABELA 40: Critérios de aceitação para viabilidade e comparabilidade Ponto Parâmetro Método de teste Critérios de Critérios de aceitação amostragem aceitação p/ para comparabilidade viabilidade Dia 22 Células viáveis contador de ≥1.5x109 células Sem significância estatística totais células viáveis entre braços automatizado frescos e congelados com AOPI ReREP (valor p <0,05) % Viabilidade Contador de ≥70% viáveis Sem significância estatística células significância entre braços automatizado frescos e congelados com AOPI ReREP arms (valor p<0,05) Pureza citometria de ≥90% células T Sem significância estatística fluxo significância entre braços frescos e congelados ReREP (valor p<0,05) Sequenciamento N/A N/A

TCR Potência IFNI( ELISA ≥2x fundo e Sem significância estatística ≥400pg/1x106 significância entre braços células viáveis/ 24 frescos e congelados ReREP (valor p <0,05) Granzyme B ≥2x fundo N/A

ELISA Teste lise N/A N/A bioluminescente redirecionado Assay Respiração Teste estresse N/A N/A Seahorse Te

[002098] Com base nos critérios de viabilidade listados em Tabela 11, TIL será avaliado se ou não as exigências foram atendidas. Todos os critérios individuais foram atendidos para cada experimento e cada linhagem de TILs (n=9). O teste t de Student foi usado para análise estatística. O teste T de Student não paramétrico foi usado parao calcular o valor p para % viabilidade como as medidas de viabilidade não estarão em uma distribuição Gaussiana. ver, Tabela 41 abaixo. TABELA 41: Atendendo aos critérios de aceitação de viabilidade

413 / 557 Potência (IFNy Linhagem TIL Pureza (citometria de ELISA) Contagem celular % Viabilidade fluxo) pg/1 x106células /24h Fresco Descong. Fresco Descong. Fresco Descong. Fresco Descong. M1061T 6,48x109 6,66x109 88,05 84,93 95,3 91,5 4570 3158 M1062T 6,76x109 5,70x109 84,45 83,73 99,7 98,9 3921 3543 M1063T 14,9x109 13,5x109 82,05 77,15 98,7 99,6 5589 5478 M1064T 8,06x109 7,08x109 86,75 83,36 84,5 89,8 619 1563 M1065T 3,06x109 3,10x109 76,35 80,90 96,8 91,4 1363 2127 EP11001T 14,9x109 12,2x109 77,9 74,85 90,4 94,3 4263 5059 M1056T 13,1x109 10,7x109 84,8 80,20 94,2 94,1 6065 4216 M1058T 23,4x109 20,1x109 87,5 85,07 99 96,2 2983 4033 M1023T 18,4x109 144x109 90,5 89,52 96,5 98,8 7918 6010 Valor P 0,1132 0,0742 0,9855 0,5821 Significati vamente diferente Não Não Não Não

[002099] Com base nos critérios de aceitação listados em Tabela 40, TILs frescos e descongelados re-REP foram avaliados se ou não as exigências foram atendidas. (Viabilidade não registrada porque a duração de re-REP foi 7 dias e PBMC irradiadas residuais não puderam ser distintas de TIL.) Números em parênteses denotam os critérios que não foram atendidos. Com base em critérios de pureza medidos usando expressão CD3+, 6/9 produto de TILs frescos re-REP atenderam aos critérios estringentes de >90% (M1061, M1065 e EP11001 não) e 8/9 produtos descongelados foram aprovados nos critérios de aceitação mesmo após re-REP. O número baixo de TILs frescos re-REP CD3+ EP11001T pode ser atribuído a uma extrema regulação negativa de receptor de células T. Medição de TILs CD3+ como uma medição de pureza não foi determinada para TILs descongelados re-REP M1023T. Para esta composição de TILs, pureza foi estimada usando coloração TCRap e é denotada por um asterisco (*). O teste t de Student foi usado para a análise estatística. Ver Tabela 42 abaixo. TABELA 42: Atendendo aos critérios de aceitação de comparabilidade Linhagem TIL Pureza (citometria de Potência (IFNy ELISA) Contagem celular fluxo) pg/1x106células/24h Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Fresco Descong. Fresco Descong. Fresco Descong.

M1061T 1,40x106 1,77x106 (86,1) 99,3 3638 2970 M1062T 2,64x106 1,10x106 99,3 97,1 1732 2060 M1063T 2,27x106 2,21x106 99,2 97,4 971 1273

414 / 557 Linhagem TIL Pureza (citometria de Potência (IFNy ELISA) Contagem celular fluxo) pg/1x106células/24h Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Fresco Descong. Fresco Descong. Fresco Descong.

M1064T 1,76x106 1,15x106 83,8 37,8 2676 1074 6 M1065T 3,16x10 1,91x106 (78,1) (75,8) 2753 1744 6 EP11001T 2,02x10 0,738x106 (18,2) 85,4 1461 2522 6 M1056T 0,601x10 1,78x106 98,1 96,7 2374 5042 6 M1058T 0,740x10 2,20x106 98,4 99,2 770 4038 6 M1023T 2,69x10 3,03x106 97 39,9* 3512 923 Valor P 0,6815 0,3369 0,7680 Significativamente diferente No No No

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9. Tabelas adicionais TABELA 43 - Figura 39: células CD4+ ID Tumor M1061 M1062 M1063 M1064 M1065 EP11001 M1056 M1058 M1023 Fresco 4,85 34 10,5 41,7 64,9 64,7 4,15 12,3 8,38 Descongelado 5,68 33 11,3 49,5 61,7 62,6 3,46 17,9 7,6 Fresco 8,1 23,5 19,2 39/ 31,9 16,3 6,46 12,9 16,7 ReREP Descongelado 11 33 15,3 49,3 39,3 26,7 9,51 17,2 19,1 ReREP TABELA 44 - Figura 40: células CD8+ ID Tumor M1061 M1062 M1063 M1064 M1065 EP11001 M1056 M1058 M1023 Fresco 45,6 54,7 85,8 38,2 28,6 22,3 93,2 84 88,8 Descongelado 50,8 55,7 76,7 37 22,8 19 92,9 76,6 84,3 Fresco 63 48,3 72,4 37,9 47,8 5,87 90,3 74,5 74,4 ReREP Descongelado 66,3 46,7 47 21,6 19,1 9,23 82,8 63,7 64,3 ReREP TABELA 45 - Figura 41: células CD4+CD154+ e Figura 105: células CD8+CD154+ Célula T Marca M1061 M1062 M1063 M1064 dores Fresco Descong. Fresco Descong. Fresco Descong. Fresco Descong. CD4 CD154+ 78,6 nd nd nd 93,3 62,1 94 76,2 CD8 CD154+ 37,3 nd nd nd 85,8 19,9 89,3 61,1 Célula T Marca- M1061 M1062 M1063 M1064 dores Fresco Descong. Fresco Descong. Fresco Descong. Fresco Descong. Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP CD4 CD154+ 88,9 84 56 82,1 68,2 93,6 97 90,3 CD8 CD154+ 35,6 49 12,5 19 59,1 77,88 0,025 90,1 Célula Marca- M1065 EP11001 M1056 M1058 M1203

418 / 557 T dores Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong. . . . . CD4 CD154+ 91 87,2 79,1 83,1 89,3 92 90,1 92,6 77,9 66,9 CD8 CD154+ 17 20,3 40 36,9 23 27,6 40,5 52,1 17,9 13,7

Célula Marca- M1065 EP11001 M1056 M1058 M1203 T dores Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong.

Re-REP . Re- . Re-REP . Re- . Re- Re-REP Re-REP REP Re-REP Re-REP REP Re-REP REP CD4 CD154+ 0 91,6 52,1 87,1 77 86,4 92,7 85,1 90,7 81,3 CD8 CD154+ 0,00609 61,8 45,3 74,8 47,3 81,7 73,6 78,3 24,2 27,1

TABELA 46 - Figura 43: células CD4+CD69+ e Figura 17: células CD8+CD69+ Célula Marca- M1061 M1062 M1063 M1064 T dores Fresco Descong.

Fresco Descong.

CD4 CD69+ 33,9 nd nd nd 82,2 68,8 51,3 84,8 CD8 CD69+ 22,4 nd nd nd 83 78,3 67,8 78,6

Célula Marca- M1061 M1062 M1063 M1064 T dores Fresco Descong.

Fresco Descong.

Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP CD4 CD69+ 58,7 69,6 67,6 77,6 77,6 86,7 85,5 78,5 CD8 CD69+ 80,9 80 62,7 73,2 87,6 87,9 92,2 88,3

Célula Marca- M1065 EP11001 M1056 M1058 M1203 T dores Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong. . . . . CD4 CD69+ 82,7 84,4 78,7 58,3 83,9 84,9 89,7 644,6 33,8 38,7 CD8 CD69+ 78,9 72,3 69,5 54,5 80,3 86 68 77,8 41,3 48,8

Célula Marcado M1065 EP11001 M1056 M1058 M1203 T res Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong.

Re- . Re-REP . Re-REP . Re- . Re- Re-REP REP Re-REP Re-REP Re-REP REP Re-REP REP CD4 CD69+ 90,2 93,2 74,7 39,1 96,1 93,8 91,1 93,7 35,3 80,1 CD8 CD69+ 91,3 90,5 87,6 52,9 95,4 94,2 93,1 93,6 71,1 88,1

TABELA 47 - Figura 45: células CD4+CD137+ e Figura 19 células CD8+CD137+ Célula T Marca- M1061 M1062 M1063 M1064 dores Fresco Descong.

Fresco Descong.

CD4 CD137+ 19,8 nd nd nd 65,4 30,4 nd 1,31 CD8 CD137+ 19,8 nd nd nd 65,4 30,4 nd 1,31

Célula T Marca- M1061 M1062 M1063 M1064 dores Fresco Descong.

Fresco Descong.

Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP CD4 CD137+ 15,4 30,4 73 78,1 62,6 53,2 51,6 64,7 CD8 CD137+ 28,8 43,1 39,3 35,3 84,4 85,7 71,1 81

Célula Marca- M1065 EP11001 M1056 M1058 M1203 T dores Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong. . . . . CD4 CD137+ 524 7,26 7,78 5,4 4,28 3,65 6,89 4,6 4,28 9,67 CD8 CD137+ 3,23 7,26 7,78 5,4 4,28 3,65 6,89 4,6 4,28 9,67

419 / 557 Célula Marca- M1065 EP11001 M1056 M1058 M1203 T dores Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong.

Re- . Re-REP . Re-REP . Re- . Re- Re-REP REP Re-REP Re-REP Re-REP REP Re-REP REP CD4 CD137+ 31,1 24,6 65,1 47,8 221 18,6 61,6 56,9 49,8 50,8 CD8 CD137+ 50,9 33,8 57,3 54,6 77,3 78,8 76,9 87 58 50,3

TABELA 48 - Figura 47: células CD4+CM e Figura 21 células CD8+CM Célula T Marca- M1061 M1062 M1063 M1064 dores Fresco Descong.

Fresco Descong.

CD4 CM 1,08 n/d 0,59 0,29 10,4 2,08 14,4 0,13 CD8 CM 0,37 n/d 0,9 0,17 3,2 0,66 73,2 0,13

Célula T Marca- M1061 M1062 M1063 M1064 dores Fresco Descong.

Fresco Descong.

Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP CD4 CM 2,32 7,71 13,8 12,6 13,4 22,3 15,9 18,6 CD8 CM 1,85 9,38 6,48 14,2 15,7 25,7 24,2 25,8

Célula Marca- M1065 EP11001 M1056 M1058 M1203 T dores Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong . . . . . CD4 CM 0,42 0,53 0,48 1,17 1,83 1,5 1,36 1,8 2,45 1,79 CD8 CM 0,21 0,67 2,65 1,79 0,33 0,72 0,91 0,67 1,99 2,22

Célula Marca- M1065 EP11001 M1056 M1058 M1203 T dores Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong Re- . Re-REP . Re-REP . Re- . Re-REP . REP Re-REP Re-REP Re-REP REP Re-REP Re-REP CD4 CM 7,03 2,28 18,9 3,73 49,6 55,6 20,1 12,6 22,1 12,7 CD8 CM 5,05 1,6 11,4 3,37 25,8 26,4 21,6 19,8 11,1 7,59

TABELA 49 - Figura 49: células CD4+EM e Figura 23 células CD8+EM Célula T Marca- M1061 M1062 M1063 M1064 dores Fresco Descong.

Fresco Descong.

CD4 EM 90 n/d 98,3 98,9 83,9 97,2 84,1 99,8 CD8 EM 89,1 n/d 80,6 87,9 92,4 97,8 20,8 98,8

Célula T Marca- M1061 M1062 M1063 M1064 dores Fresco Descong.

Fresco Descong.

Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP CD4 EM 95,6 84,4 84,5 83,4 84,3 73,7 80,6 80,4 CD8 EM 97,2 87,9 90,8 82,3 82,5 72,2 74,5 73

Célula Marca- M1065 EP11001 M1056 M1058 M1203 T dores Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong . . . . . CD4 EM 99,4 99,4 96,7 97,4 97,1 97,8 97,4 97,6 9,62 95,3 CD8 EM 98,3 98,6 91,8 95,5 98,8 98,9 98,8 99,2 93,9 95,2

Célula Marca- M1065 EP11001 M1056 M1058 M1203 T dores Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong Re-REP . Re-REP . Re-REP . Re-REP . Re-REP . Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP CD4 EM 91,7 97 74,3 90,7 36,2 25,5 73,9 81,8 73,1 76,4 CD8 EM 91,5 96,1 83 90,8 73,2 71,9 77,1 78,2 84,1 85,1

TABELA 50 - Figura 51: células CD4+CD28+ e Figura 25 células

420 / 557 CD8+CD28+ Célula T Marca- M1061 M1062 M1063 M1064 dores Fresco Descong. Fresco Descong. Fresco Descong. Fresco Descong. CD4 CD28+ 4,6 5,85 33,2 37 10,5 11,2 31,9 27,6 CD8 CD28+ 30,1 34 24,5 23,1 83,8 49,3 22,5 15,5 Célula T Marca- M1061 M1062 M1063 M1064 dores Fresco Descong. Fresco Descong. Fresco Descong. Fresco Descong. Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP CD4 CD28+ 6,75 7,18 21,6 27,8 18,6 15 23 27,6 CD8 CD28+ 24,6 17,9 10 6,4 28,6 18,9 15,7 11 Célula Marca- M1065 EP11001 M1056 M1058 M1203 T dores Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong. Fresco Descong Fresco Descong . . . . CD4 CD28+ 41,7 38,2 63,2 59,8 3,97 3,29 12,2 17,5 8,27 7,48 CD8 CD28+ 13,4 8,52 14,5 12 53 54,4 56,5 62,1 76,5 80,8 Célula Marca- M1065 EP11001 M1056 M1058 M1203 T dores Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong. Fresco Descong Fresco Descong Re-REP . Re-REP . Re-REP Re-REP Re- . Re- . Re-REP Re-REP REP Re-REP REP Re-REP CD4 CD28+ 12,3 15,2 13,3 20 6,22 9,29 12,3 16,5 15,4 17,9 CD8 CD28+ 6,9 2,43 2,07 3,75 24 34 27 36,9 42 43,9 TABELA 51 - Figura 53: células CD4+PD-1+ e Figura 27 células CD8+PD- 1+ Cél Marca M1061 M1062 M1063 M1064 ula dores Fresco Descong. Fresco Descong. Fresco Descong. Fresco Descong.

T CD PD- 48,5 nd nd nd 77 40,6 nd 22,4 4 1+ CD PD- 37,1 nd nd nd 56 24,6 nd 14 8 1+ Cél Marca M1061 M1062 M1063 M1064 ula dores Fresco Descong. Fresco Descong. Fresco Descong. Fresco Descong. T Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP CD PD- 36,8 34,2 15,7 26,7 43,9 66 32,4 14,5 4 1+ CD PD- 40,4 35,3 6,3 6,21 18 20,4 35,6 23,2 8 1+ Célula Marca- M1065 EP11001 M1056 M1058 M1203 T dores Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong. Fresco Descong Fresco Descong . . . . CD4 PD-1+ 7,87 7,23 33,3 28,2 33,9 32,8 41,7 38 22,7 23,8 CD8 PD-1+ 1,61 0,72 19,2 12,5 23,8 24,7 78,4 59,8 42,6 36,1 Célula Marca- M1065 EP11001 M1056 M1058 M1203 T dores Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong. Fresco Descong Fresco Descong Re-REP . Re-REP . Re-REP Re-REP Re- . Re- . Re-REP Re-REP REP Re-REP REP Re-REP CD4 PD-1+ 22,4 15,5 40,9 33,4 56 51,3 40,3 32,5 18,9 27,3 CD8 PD-1+ 6,49 5,73 29,8 34,6 18,9 15,2 68,6 47 28,9 36,1 TABELA 52 - Figura 55: células CD4+LAG3+ e Figura 29 células

421 / 557

CD8+LAG3+ Célula T Marca- M1061 M1062 M1063 M1064 dores Fresco Descong.

Fresco Descong.

CD4 LAG3+ 16,8 nd nd nd 93,5 37,3 nd 6,8 CD8 LAG3+ 74 nd rid nd 98,4 81,5 nd 31,8

Célula T Marca- M1061 M1062 M1063 M1064 dores Fresco Descong.

Fresco Descong.

Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP CD4 LAG3+ 68,3 73,1 35,2 56,9 26,9 27,3 52,6 64 CD8 LAG3+ 98,3 98,7 97,1 97,7 89,6 85,1 92,8 94,7

Célula Marca- M1065 EP11001 M1056 M1058 M1203 T dores Fresco Descong Fresco Descong Fresco Descong.

Fresco Descong Fresco Descong. . . . CD4 LAG3+ 47,2 30,5 35,5 20,1 25 27,4 48,6 38 14,5 7,65 CD8 LAG3+ 85,3 38,7 89,6 64,2 83,4 81,9 93,2 66,3 90,3 71,1

Fresco Descong Fresco Descong.

Re-REP . Re-REP . Re-REP Re-REP Re- . Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP REP Re-REP CD4 LAG3+ 65,8 68,2 40,9 46 44,1 39,1 52,1 51 48,5 17,7 CD8 LAG3+ 95,4 97,8 92,4 92,5 97,5 98,4 98,2 98,3 97,7 78,1

TABELA 53 - Figura 57: células CD4+TIM-3+ e Figura 31 células CD8+TIM-3+ Célula T Marca- M1061 M1062 M1063 M1064 dores Fresco Descong.

Fresco Descong.

CD4 TIM3+ 89,7 nd nd nd 98,3 87,6 nd 43,2 CD8 TIM3+ 99 nd nd nd 99,4 88,1 nd 47

Célula T Marca- M1061 M1062 M1063 M1064 dores Fresco Descong.

Fresco Descong.

Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP CD4 TIM3+ 95,3 98 94,5 96,9 90,8 90,2 94,2 82,6 CD8 TIM3+ 98,9 98,9 97,3 96,7 97,1 97,7 98,2 95,7

Fresco Descong Fresco Descong. . . . CD4 TIM3+ 95 78,8 96,9 91,5 96,4 92,5 88,7 80,1 89,9 82,3 CD8 TIM3+ 96,9 50,6 98,8 83 98,3 92,9 96,5 73,6 98,2 88,5

Fresco Descong Fresco Descong.

Re-REP . Re-REP . Re-REP Re-REP Re- . Re-REP Re-REP Re-REP Re-REP REP Re-REP CD4 TIM3+ 91,1 95,4 94,3 98,7 74 75,4 86,5 87,3 94,4 90,6 CD8 TIM3+ 94,9 96,5 96,3 98,3 98 99 97,3 98,6 99 97,7

TABELA 54 - Figura 61: determinação qPCR e Flow-FISH de repetição do comprimento do telômero ID Tumor M1061 M1062 M1063 M1064 M1065 EP11001 M1056 M1058 M1023 qPCR 0,111878 0,135842 0,149685 0,179244 0,151774 0,137738 0,134904 0,124137 0,086569

422 / 557 Flow- 9,330236 1215041 8,782231 7,174627 8,961553 6112918 9,010615 7,944534 5,766692

FISH EXEMPLO 20: NOVOS LINFÓCITOS INFILTRANDO OS TUMORES CRIOCONSERVADOS (LN-144) ADMINISTRADOS A PACIENTES

COM MELANOMA METASTÁTICO

[002119] Novos linfócitos infiltrando os tumores crioconservados (LN- 144) administrados a pacientes com melanoma metastático demonstram eficácia e tolerabilidade em uma experiência clínica Fase 2 de centro múltiplo INTRODUÇÃO:

[002120] A segurança e eficácia de terapia de célula adotiva (ACT) com linfócitos infiltrando os tumores não crioconservados (TIL) foi estudada em centenas de pacientes com melanoma metastático. Esta experiência clínica de centro múltiplo foi iniciada com TILs centralmente fabricados (LN-144) como produtos de infusão não crioconservados e crioconservados. O novo processo de fabricação dos requerentes para LN-144 não crioconservado é usado em Coorte 1, e um LN-144 crioconservado, encurtado em 3 semanas, é usado em Coorte 2. O processo de fabricação de Coorte 2 oferece um processo significativamente mais curto, acoplado com um produto de TILs crioconservada que permite flexibilidade do cronograma do paciente e dosagem. O processo de fabricação mais curto reduz o tempo de espera para o paciente receber seu produto de TILs e crioconservação aumenta a conveniência para a logística e a entrega para os locais clínicos. MÉTODOS:

[002121] C-144-01 é um estudo prospectivo, de centro múltiplo avaliando pacientes com melanoma metastático que recebem LN-144. Após uma linfodepleção não mieloablativa com regime de precondicionamento Cy/Flu, pacientes recebem uma infusão única de LN-144 seguido pela administração de IL-2 (600.000 IU/kg) até 6 doses. Pacientes são avaliados para resposta objetiva como um ponto final primário de até 24 meses. RESULTADOS:

423 / 557

[002122] Os requerentes caracterizaram o LN-144 crioconservada administrado a um segundo coorte de pacientes, Coorte 2 (N=10) após a mesma pré- e pós-infusão de regime de tratamento com TIL como usado para Coorte 1.

[002123] Os pacientes de Coorte 2 foram pesadamente pré-tratados com número aumentado de linhagens anteriores com todos os pacientes tendo terapias anti-CTLA-4 e anti-PD-1, e carga de tumor maior (média SOD: 15,3, 10,9 cm para Coortes 2, 1). O número mediano de terapias sistêmicas anteriores é 4, 3 para Coortes 2, 1, respectivamente. Uma análise inicial de dados de segurança demonstra tolerabilidade comparável de LN-144 crioconservado. O perfil de segurança para pacientes de Coorte 1 recebendo o LN-144 não crioconservado continua a ser aceitável para esta população de pacientes em estágio tardio. Os TEAEs mais comuns observados em ambos coortes por frequência são náusea, anemia, neutropenia febril, contagem de neutrófilos diminuída, contagem de plaquetas diminuída. Uma revisão inicial dos dados de eficácia indica atividade anti-tumor, incluindo PR, para a terapia com TILs observada em pacientes tratados em Coorte 2. CONCLUSÕES:

[002124] Isto representa a primeira experiência clínica em uma configuração de centro múltiplo com TIL centralmente fabricado avaliando um novo processo para produto autólogo crioconservado com um processo significativamente mais curto (aproximadamente 3 semanas). Resultados preliminares indicam o LN-144 crioconservado como uma opção terapêutica segura e tolerável para pacientes com melanoma metastático que não tiveram sucesso em terapias múltiplas anteriores, incluindo inibidores de checkpoint. O LN-144 crioconservado provê maior flexibilidade para os pacientes e cuidadores e permite um tratamento mais imediato para os pacientes com tal necessidade médica elevada não atendida. NCT02360579. EXEMPLO 21: AVALIAÇÃO DE MEIO LIVRE DE SORO PARA USO NO

424 / 557 PROCESSO 2A

[002125] Este exemplo provê dados mostrando a avaliação da eficácia de meio livre de soro como um substituto para o meio padrão CM1, CM2, e CM4 que é atualmente usado no processo 2A. Este estudo testou a eficácia de meio livre de soro disponível (SFM) e alternativas livres de soro como uma substituição em três fases; Fase 1: Comparar a eficácia de expansão de TILs (n = 3) usando meio livre de soro padrão versus CTS Optimizer ou Prime T CDM ou Xvivo-20 livre de soro meio com ou sem substituição do soro ou lisado de plaquetas.

[002126] Fase 2: Testar a condição do meio livre de soro do candidato em processo 2A de mini-escala usando G-Rex 5M (n=3).

INFORMAÇÃO DE ANTECEDENTES

[002127] Embora a combinação de meio corrente, usada em culturas pré- e pós-REP ter sido demonstrada como eficaz, falhas em REP podem ter ocorrido com AIM-V. Se uma alternativa eficaz livre de soro for identificada, isto poderia tornar o processo mais direto e simples de ser realizado em CMOs por redução do número de tipos de meios usados de 3 para 1. Adicionalmente, SFM reduz a possibilidade de uma doença adventícia por eliminação do uso de soro humano. Este exemplo provê dados que mostraram suportes para o uso de meio livre de soro nos processos 2A.

ABREVIATURAS µl microlitro CM1,2,4 meios 1,2,4 completos meio livre de soro de Cell Therapy CTS OpTimizer SFM System OpTimizer g Gramas Hr Hora IFU Instruções para uso IL-2 Interleucina-2 Citocina Min Minuto mL Mililitro ºC graus Celsius pré-REP Protocolo de pré-expansão rápida REP Protocolo de expansão rápida RT Temperatura ambiente SR Substituto de soro TIL Linfócitos infiltrando os tumores

425 / 557

DESENHO DO EXPERIMENTO

[002128] Os pré-REPs e REPs foram iniciados como mencionado em LAB-008. Um estudo geral destas 3 fases de experimeno é mostrado na Figura 150.

[002129] Como mostrado na Figura 150, o projeto foi intimado a testar o meio livre de soro e suplemento em duas etapas.

[002130] Etapa 1. Seleção de provedor de meio livre de soro. pré-REP e pós-REP foram definidos para imitar processo 2A em G-Rex placa de 24 cavidades. pré-REPs foram iniciados por cultura de cada fragmento/cavidade de placa G-Rex de 24 cavidades em triplicatas ou quadruplicatas por condições. REPs foram iniciados em Dia 11 por cultura de 4 x 10e5 TIL/cavidade de G-Rex de 24 cavidades, divididos em Dia 16, colheita em Dia 22. CTS OpTimizer, X-Vivo 20, e Prime T-CDM foram usados como alternativas potenciais de meio livre de soro para uso nos pré-REP e REP. O substituto de soro CTS Immune SR (Life Technologies) ou soro de lisado de plaquetas (SDBB) foram adicionados a 3% a SFM. Cada uma das condições foram planejadas para testar com pelo menos 3 tumores em ambos pré-REP e pós-REP para imitar o processo 2A.

[002131] Etapa 2. Os candidatos identificados foram ainda testados em processos 2ª em mini-escala por protocolo (TP-17-007). Brevemente, pré- REPs foram iniciados por cultura de 2 fragmentos/em frasco G-Rex 5M em triplicatas por condição. REPs foram iniciados em Dia 11 usando 2 x 10e6/frasco G-Rex 5M, divididos em Dia 16, colheita em Dia 22.

[002132] Nota: Alguns tumores foram processados e definidos para medir múltiplos parâmetros em um experimento.

OBSERVAÇÕES

[002133] Foram observados resultados equivalentes ou estatisticamente melhores no crescimento de células quando comparando um meio livre de soro ao meio padrão usado no processo 2A

426 / 557

[002134] Foram observados fenótipo similar, produção de IFN-y, e análise de metabólitos a partir de TILs cultivados em meio livre de soro quando comparado com os TILs cultivados no meio padrão usado no processo 2A.

RESULTADOS

[002135] Testando a eficácia de meio livre de soro em expansão de TILs pré- e pós REP.

[002136] CTS Optimizer + SR (substituto de soro) mostraram uma expansão de TILs em pré-REP intensificada e expansão de TILs em REP comparável. CTS OpTimizer, X-Vivo 20, e Prime T-CDM foram adicionados com ou sem 3% CTS Immune CTS SR, e foram testados contra condição padrão. Em M1079 e L4026, condição CTS OpTimizer + CSR mostrou expansão de TILs em pré-REP significativamente intensificada (p <0,05) quando comparada com condições padrão (CM1, CM2, CM4) (Figura 62A). Inversamente, CTS Optimizer sem CSR não ajudou a expansão de TILs em pré-REP (Apêndice -1,2,3). CTS Optimizer + CSR mostraram expansão de TILs em pós-REP comparável nos dois tumores de 3 testados (Figura-2B). Uma grande quantidade de variação ocorreu em pre e pós-REP com as condições X-Vivo 20 e Prime T-CDM, enquanto CTS Optimizer foi relativamente consistente entre quadruplicatas. Além disso, lisado de plaquetas adicionado com SFM não intensificou a expansão de TILs em pré- REP e pós-REP quando comparado com os padrões (Figura 62A). Estas descobertas sugerindo que uma substituição de soro é certamente necessária para prover um crescimento comparável para o padrão dos requerentes, CTS optimizer +CSR, poder ser um candidato.

[002137] Testando a condição do candidato na mini-escala G-Rex 5M (ver Figura 64).

[002138] Análise fenotípica de TILs pós-REP. Ver Figura 66 e Tabela 56 abaixo.

427 / 557 TABELA 56: Desalinhamento de CD8 com CTS OpTimizer Média %CD8+ Padrão CTS M1078 11 34 M1079 29,3 43,85 M1080 33,67 54,37 L4020 0,02 0,17 EP11020 28,67 25,07 L4030 0,13 0,09 L4026 9,45 34,06 M1092 5,75 52,47 T6030 66 52,6 Comparabilidade com interferon-gama

[002139] Interferon-gama ELISA (Quantikine). Produção de IFN-y foi medida usando kit Quantikine ELISA por R&D systems. CTS+SR produziu quantidades comparáveis de IFN-y quando comparado com a condição padrão dos requerentes. Ver, Figura 67. EXEMPLO 22: FATOR DE CRESCIMENTO DE COQUETEL DE CÉLULAS-T IL-2/IL-15/IL-21 INTENSIFICA A EXPANSÃO E FUNÇÃO

EFETORA DE CÉLULAS INFILTRANDO OS TUMORES

[002140] Terapia de células T adotivas com linfócitos infiltrando os tumores (TIL) autólogos demonstrou eficácia clínica em pacientes com melanoma metastático e carcinoma cervical. Em alguns estudos, resultados clínicos melhores foram positivamente correlacionados com o número total de células infundidos e/ou porcentagem de células CD8+ T. Os regimes de produção mais correntes apenas utilizam IL-2 para promover o crescimento de TILs. A expansão de linfócitos intensificada foi relatada usando regimes contendo IL-15 e IL-21. Este estudo descreve os efeitos positivos de adicionar IL-15 e IL-21 ao protocolo de TILs de segunda geração IL-2 recentemente implementado na clínica. Materiais e Métodos

[002141] O processo de gerar TIL inclui um protocolo de pré-expansão rápida (pré-REP), em que fragmentos de tumor de tamanho de 1-3 mm3 são colocados em meio contendo IL-2. Durante pré-REP, TIL emigra para fora dos fragmentos de tumor e expande em resposta a estimulação com IL-2.

428 / 557

[002142] Para estimular adicionalmente o crescimento de TILs, TILs são expandidos através de um período de cultura secundário chamado o protocolo de expansão rápida (REP) que inclui PBMC alimentadoras irradiadas, IL-2 e anti-CD3. Neste estudo, um protocolo de expansão encurtada pré-REP e REP foi desenvolvido para expandir TIL enquanto mantendo atributos fenotípicos e funcionais do produto final TIL.

[002143] Este protocolo de produção de TILs encurtada foi usado para avaliar um impacto de IL-2 sozinho versus uma combinação de IL2/IL-15/IL-

21. Estes dois regimes de cultura foram comparados durante a produção de TIL cultivados a partir de tumores colorretal, melanoma, cervical, mama triplo negativo, pulmão e renal. Ao completar pré-REP, TILs cultivados foram avaliados para a expansão, fenótipo, função (CD107a+ e IFNγ) e repertório de TCR Vβ.

[002144] As culturas de re-REPs foram iniciadas usando o protocolo de IL-2 padrão (600 IU/ml), ou com IL-15 (180 IU/ml) e IL-21 (IU/ml) além de IL-2. As células foram avaliadas para expansão ao concluir pré-REP. A cultura foi classificada como tendo um aumento de expansão sobre as IL-2 se o crescimento global foi intensificado por pelo menos 20%. Os estudos fenotípicos e funcionais de melanoma e pulmão são apresentados aqui. Ver, Tabela 57 abaixo. TABELA 57: Intensificação em expansão durante pré-REP com IL-2/IL- 15/IL-21 em múltiplas indicações Histologia do tumor # de estudos de IL-2 # de estudos demonstrando versus intensificação >20% de crescimento IL-2/IL-15/IL-21 usando IL-2/IL-15/IL-21 (comparado com IL-2) Melanoma 5 1/5(20%) Pulmão 8 3/8 (38%) Colorretal 11 7/11 (63%) Cervical 1 1/1 (100%) Pancreático 2 2/2 (100%) Glioblastoma 1 1/1 (100%)

429 / 557 Mama triplo negativo 1 1/2 (50%)

[002145] Estes dados demonstram um rendimento de produto TIL aumentado quando TILs foram cultivados com IL-2/IL15/IL-21 como comparado com IL-2 sozinha, além de diferenças fenotípicas e funcionais em pulmão.

[002146] O efeito do coquetel triplo em expansão de TILs foi específico da indicação e se beneficiou da maioria dos tumores de baixo rendimento.

[002147] A razão de CD8+/CD4+ células T foi aumentada pelo tratamento em produto TIL NSCLC.

[002148] A atividade de células T apareceu intensificada pela adição de IL-15 e IL-21 a IL-2, como avaliado por níveis de expressão de CD107a em ambos melanoma e NSCLC.

[002149] Os dados aqui providos mostram que expansão de TILs usando um processo mais curto e mais robusto, tal como o processo 2A descrito aqui no pedido e outros exemplos, pode ser adaptado para englobar o coquetel de citocinas IL-2/IL-15/IL-21, assim provendo um meio para promover adicionalmente a expansão de TILs em indicações particularmente específicas.

[002150] As experiências em processo estão ainda avaliando os efeitos de IL-2/IL-15/IL-21 sobre a função de TILs.

[002151] As experiências adicionais irão avaliar o efeito do coquetel triplo durante REP (primeira expansão).

[002152] Esta observações são especialmente relevantes para a otimização e padronização dos regimes de cultura de TILs necessários para fabricação em larga escala de TILs com a ampla aplicabilidade e disponibilidade requeridas para uma terapia anticâncer dominante atual. EXEMPLO 23: UM TIL CRIOCONSERVADO GERADO COM UM

MÉTODO ABREVIADO Fundamentos

430 / 557

[002153] Este exemplo provê dados relacionados com produtos de linfócitos infiltrando os tumores (TIL) crioconservados para LN-144, gerados com um método apropriado abreviado para fabricação comercial de alta produção demonstrando atributos de qualidade favoráveis para a transferência de células adotivas (ACT).

[002154] Os métodos existentes para gerar TILs como produtos clínicos envolvem as intervenções de operador seguido por períodos estendidos de incubação para gerar um produto terapêutico. O processo de Geração 1 leva aproximadamente 6 semanas e produz um produto fresco. Para ocasionar a terapia com TILs para todos os pacientes que possam se beneficiar com seu potencial, um método de cultura abreviado de 22 dias, Geração 2, apropriado para a fabricação centralizada com um produto de fármaco crioconservado capaz de expedição para sítios clínicos distantes foi desenvolvido. Geração 2 representa um processo de produção de células flexível, robusto, fechado, e semi-automatizado que conduz a uma fabricação de alta produção em uma escala comercial. Os produtos de fármaco gerados por tal método têm atributos de qualidade comparáveis aos gerados por processo de Geração 1. Objetivos do estudo:

[002155] Os produtos de fármacos gerados por processos de Geração 1 (uma modalidade de processo 1C) e Geração 2 (uma modalidade de processo 2A) foram testados para determinar compatibilidade em termos dos seguintes atributos de qualidade: Dose e expansão em vezes.

[002156] Pureza das células T e proporções de subconjuntos de células T.

[002157] Expressão fenotípica de moléculas co-estimulatórias em subconjuntos de células T.

[002158] Comprimento médio relativo das repetições de telômero.

[002159] Capacidade para secretar citocina em resposta a reativação de

431 / 557 TCR.

[002160] Diversidade de receptor de células T. Visão geral do processo de terapia de TIL:

[002161] EXTRAÇÃO: TILs do paciente são removidos do microambiente supressivo do tumor (via ressecção cirúrgica de uma lesão)

[002162] EXPANSÃO: TIL expandidos exponencialmente em cultura com IL-2 para dar 109 – 1011 TILs, antes de infundir os mesmos no paciente

[002163] PREPARAÇÃO: Paciente recebe NMA-LD (linfodepleção não mieloablativa, ciclofosfamida: 60 mg/kg, IV x 2 doses e fludarabina: 25 mg/m2 x 5 doses) para eliminar microambiente potencialmente supressivo do tumor e maximizar o enxerto e a potência da terapia com TILs

[002164] INFUSÃO: Paciente é infundido com seus TILs expandidos (LN-144) e uma duração curta de IL-2 em alta dosagem (600.000 IU/kg para até 6 doses) para promover ativação, proliferação, e atividade citolítica anti- tumor de TIL TABELA 58: Sumário de aperfeiçoamentos no processo em fabricação de Geração 2 Etapa de Gen 1 Gen 2 Impacto processo ≤21 dias, múltiplos ≤11 dias, únido Encurta a cultura, reduz Cultura de biorreatores, múltiplas biorreator fechado intervenções, passível de fragmento s intervenções do sem intervenção automatização operador TILs expandidos em IL-2 crio conservados, Encurta processo por testados, seleção com ≤ 200×106 TIL bruto permitir semeadura Seleção de TILs base em fenótipo, dirigido para co- aumentada de co-cultura, descongelado, ≤ cultura reduz etapas, elimina 30×106 TIL para co- testes cultura Reduz intervenções do operador, sistema ≤ 36 Biorreatores, 14 ≤ 5 Biorreatores, 11 Expansão rápida fechado, encurta dias dias processo, passível de automatização

432 / 557 Fechada semi- Redução de volume automatizada, aberta manual e Reduz intervenções do Colheita/ redução de volume e colheita. Lavagem operador, automatizado, Lavagem colheita. Lavagem e manual e concentração mantém sistema fechado. concentração por centrifugação. automatizadas. Flexibilidade de produto expedição, cronograma produto hipodérmico Formulação crioconservado (≤ - do paciente, teste de fresco (2- 8⁰C) 150⁰C) liberação mais fácil, tentativas globais Recuperação para o Tempo de 38 dias tempo de 22 dias tempo do paciente, sala limpa fabricação processo processo completa, COGs Métodos analíticos e instrumentação:

[002165] Dose e Viabilidade: Produtos finais formulados foram amostrados e testados para células nucleadas totais, células viáveis totais, e viabilidade determinada por contra-coloração com acridina laranja / DAPI usando o contador de células automatizado NC-200.

[002166] Citometria de fluxo: Os produtos de fármacos formulados foram amostrados e testados para identificar por FACS. A porcentagem de células T foi determinada como a população de CD45, CD3, duplo positivo, de células viáveis. Os frascos-ampolas congelados, satélite ou sentinela, para cada processo foram descongelados e testados para marcadores fenotípicos estendidos incluindo CD3, CD4, CD8, CD27, e CD28.

[002167] Comprimento relativo médio de repetições de telômeros: Tecnologia Flow-FISH foi usada para medir comprimento médio de repetição de telômeros. Este teste foi completado como descrito no kit DAKO® Telomere PNA/FITC para protocolo de citometria de fluxo. Brevemente, 2x106 células de TILs foram combinadas com 2×106 células 1301 de leucemia. O DNA foi desnaturado a 82°C por 10 minutos e a sonda PNA- FITC foi hibridizada no escuro durante a noite em temperatura ambiente. Iodeto de propídio foi usado para identificar as células em fase G0/1.

[002168] Imunotestes: A capacidade do produto de fármaco para secretar citocina quando da reativação foi medida após a co-cultura com contas revestidas com mAb (Life Technologies, anti-CD3, anti-CD28 & anti-

433 / 557 CD137). Após 24 h de cultura, os sobrenadantes foram coletados congelados, descongelados, e testados por ELISA usando kit Quantikine IFNγ ELISA (R&D Systems) de acordo com as instruções do fabricante.

[002169] Diversidade de receptor de células T: RNA de produtos finais formulados foi isolado e submetido a um PCR multiplex com iniciadores específicos de VDJ. Sequências CDR3 expressadas dentro do produto de TILs foram amplificadas semi-quantitativamente para determinar a frequência e prevalências de clones de TILs únicos. Sequenciamento foi realizado sequenciador de bancada Illumina MiSeq. Os valores foram indexados para dar uma pontuação representativa da diversidade relativa de receptores de células T no produto. Resultados e Conclusões:

[002170] Resultados são dados em Figuras 75 até 81.

[002171] O processo de Geração 2 produz um produto de TILs com atributos comparáveis de qualidade com a Geração 1.

[002172] Geração 2 produz quantidades similares de produtos de TILs altamente puros que são compostos de proporções similares de subconjuntos de células T expressando níveis comparáveis de moléculas co-estimulatórias com relação a Gen 1.

[002173] TILs de Geração 2 exibem diversidade aumentada de receptores de TCR que, quando envolvidos, iniciam a secreção robusta de citocina.

[002174] O produto de fármaco crioconservado introduz eficiências logísticas críticas permitindo flexibilidade em distribuição.

[002175] Diferente dos processos anteriores, a plataforma de expansão de 22 dias abreviada da Geração 2 apresentou uma plataforma de fabricação de TILs escalonável e logisticamente possível que permite a geração rápida de doses em escala clínica para pacientes em necessidade urgente de terapia.

[002176] O protocolo de fabricação de TIls de Geração 2 se dirige a

434 / 557 muitas das barreiras que têm até agora impedido uma aplicação mais ampla da terapia com TILs. EXEMPLO 24: AVALIAÇÃO DE UMA FAIXA DE RAZÕES DE CÉLULAS ALIMENTADORAS ALOGÊNICAS: TIL DE 100:1 PARA 25:1

[002177] Este estudo testou a proliferação de TILs 25:1 e 50:1 contra o controle de 100:1 células alimentadoras alogênicas para TILs atualmente utilizado em Processo 1C.

[002178] Estudos publicados pela Divisão de Cirurgias no National Cancer Institute têm mostrado o limiar para a ativação ótima de TILs no frasco G-Rex 100 a 5×106 células alimentadoras alogênicas por cm2 no início do REP(1). Isto foi verificado através de uma modelagem matemática e, com o mesmo modelo, previu que, com uma camada de alimentadoras otimizadas por contato célula:célula por área unitária, a proporção de células alimentadoras alogênicas com relação a TIL pode ser diminuída a 25:1 com efeito mínimo sobre a ativação e expansão de TILs.

[002179] Este estudo estabeleceu uma densidade ótima de células alimentadoras por área unitária no início de REP, e validou a faixa efetiva de razões de alimentadoras alogênicas no início de REP necessária para a diminuição e normalizou a quantidade de células alimentadoras usadas por lote clínico. O estudo também validou a iniciação do REP com menos do que 200×106 TILs co-cultivados com um número fixo de células alimentadoras.

[002180] A. Volume de uma célula T (diâmetro de 10 µm): V = (4/3) πr3 =523,6 µm3 B. Volume de G-Rex 100 (M) com uma altura de 40 µm (4 células): V = (4/3) πr3 = 4×1012 µm3 C. Número de células requerido para encher a coluna B: 4×1012 µm3 / 523,6 µm3 = 7,6x108 µm3 * 0,64 = 4,86×108 D. Número de células que podem ser otimamente ativadas em espaço 4D: 4,86×108 / 24 = 20,25×106

435 / 557 E. Número de alimentadoras e TIL extrapolados para G-Rex 500: TIL: 100×106 e alimentadora: 2,5×109

[002181] Equação 1. Aproximação do número de células mononucleares requerido para prover uma geometria isoédrica para ativação de TIL em um cilindro com uma base de 100 cm2. O cálculo deriva do resultado experimental de ~5×108 para a ativação livre de células T que intimamente espelha os dados experimentais de NCI.(1) (C) O multiplicador (0,64) é a densidade de compactação aleatória para esferas equivalentes, como (2) calculado por Jaeger e Nagel em 1992 . (D) O divisor 24 é o número de esferas equivalentes que poderiam contatar um objeto similar em um espaço 4 dimensional “o número Newtoniano.”(3). Referências (1)

[002182] Jin, Jianjian, et.al., Simplified Method of the Growth of Human Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL) in Gas-Permeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment. J Immunother. 2012 Apr; 35(3): 283–

292. (2)

[002183] Jaeger HM, Nagel SR. Physics of the granular state. Science. 1992 Mar 20;255(5051):1523-31. (3)

[002184] O. R. Musin (2003). “The problem of the twenty-five spheres”. Russ. Math. Surv. 58 (4): 794–795. EXEMPLO 25: ESTUDOS DE ATRIBUTOS DE QUALIDADE CHAVE

PARA O PRODUTO DE TILS Fundamentos

[002185] Terapia com células T adotivas com linfócitos infiltrando os tumores (TIL) autólogos tem demonstrado eficácia clínica em pacientes com melanoma metastático e outros tumores1-3.

[002186] A maioria dos relatos dos estudos clínicos tem incluído análises exploratórias dos produtos de TILs infundidos com a intenção de identificar os atributos de qualidade tal como esterilidade, identidade, pureza,

436 / 557 e potência que seriam relacionados com a eficácia e/ou segurança do produto.4,5

[002187] Aqui, os requerentes apresentam a avaliação de três parâmetros chave do produto a partir de produto de TILs que podem contribuir para uma plataforma de controle de qualidade futura para uso na fabricação comercial de TILs. Visão geral do processo de terapia com TIL

[002188] 1. O tumor foi excisado a partir de paciente e transportado para a instalação de Fabricação GMP.

[002189] 2. Quando da chegada, o tumor é fragmentado e colocado em frascos com IL-2 para um protocolo de pré-expansão rápida (REP).

[002190] 3. TILs pré-REP foram propagados adicionalmente em um protocolo REP na presença de PBMCs irradiadas, anticorpo anti-CD3 (30 ng/mL), e IL-2 (3000 IU/mL).

[002191] 4. Os produtos de TILs foram avaliados para atributos de qualidade críticos incluindo: (1) Identificação (2) Pureza, e (3) Potência.

[002192] 5. Antes de infusão de TILs expandidos (LN-144), paciente recebeu um regime de linfodepleção não mieloablativo consistindo em ciclofosfamida e fludarabina. Após a infusão de TILs, pacientes receberam uma duração curta (até 6 doses) de alta dose IL-2 (600.000 IU/kg) para sustentar o crescimento e o enxerto de TILs transferidos. Objetivos do estudo

[002193] Objetivo: Caracterizar completamente os produtos de TILs para identidade, pureza, e potência, e assim (a) guiar a definição de atributos de qualidade críticos e (b) suportar o estabelecimento de critérios de liberação formais a serem implementados em produção comercial de produtos de TILs.

[002194] Estratégia: Desenvolver as seguintes metodologias analíticas para suportar a caracterização de produtos de TILs. Em particular, os seguintes métodos foram realizados: análise fenotípica por citometria de fluxo

437 / 557 para uma avaliação de identidade e pureza, teste de detecção de célula de tumor residual para uma medição de pureza, e teste de liberação de interferon- gama para avaliação de potência. Materiais e Métodos Identificação e pureza

[002195] Caracterização fenotípica: produtos TIL foram coloridos com anticorpos anti-CD45, anti-CD3, anti-CD8, anti-CD4, anti-CD45RA, anti CCR7, anti CD62L, anti-CD19, anti-CD16, e anti-CD56 e analisados por citometria de fluxo para a quantificação de subconjuntos de células T e não T. Pureza

[002196] Testes de detecção de tumor residual: produtos TILs foram coloridos com anticorpos anti-MCSP (proteoglicano sulfato de condroitina associado com melanoma) e anti-CD45, assim como um corante Aqua fixável vivo/morto, então, analisados por citometria de fluxo para a detecção de células de melanoma. Os controles de contaminação (spike) foram usados para avaliar a precisão da detecção de tumor e estabelecer critérios de ligação para a análise dos dados. Potência

[002197] Testes de liberação de IFNγ: produtos de TILs foram re- estimulados com contas revestidas com anti-CD3/CD28/CD137 durante 18 a 24 horas após o que sobrenadantes foram coletados para avaliação da secreção de IFNγ usando um teste ELISA. Resultados

[002198] Identidade: A maior parte (>99%) de produto de melanoma de TILs foi composta por células CD45+CD3+.

[002199] Figuras 86A-86C provêem caracterização fenotípica de produtos TILs usando teste de citometria de fluxo de 10 cores. (A) Porcentagem de células T e subconjuntos não de células T foi definida por CD45+CD3+ e CD45-(não linfócitos)/CD45+CD3- (não linfócito células T),

438 / 557 respectivamente. No todo, >99% dos produtos TILs testados consistiam de células T (CD45+CD3+). É mostrada uma média de produtos de TILs (n=10). (B) Porcentagem de dois subconjuntos de células T incluindo CD45+CD3+CD8+ (círculo aberto azul) e CD45+CD3+CD4+ (círculo aberto rosa). Nenhuma diferença estatística em porcentagem de ambos os subconjuntos foi observada usando teste t de student não pareado (P=0,68). (C) A população de células não T foi caracterizada para quatro diferentes subconjuntos incluindo: 1) não linfócitos (CD45-), 2) células NK (CD45+CD3-CD16+/56+), 3) células B (CD45+CD19+), e 4) células não NK/B (CD45+CD3-CD16-CD56-CD19-).

[002200] Identidade: A maior parte do produto de TILs de melanoma exibiu fenótipo de células T efetoras ou de memória, associadas com função citotóxica de células T.

[002201] Figuras 87A e 87B mostram a caracterização de subconjuntos de células T em populações CD45+CD3+CD4+ e CD45+CD3+CD8+. Subconjuntos de células T Naïve, memória central (TCM), memória efetora (TEF), e memória efetora RA+(EMRA) foram definidos usando CD45RA e CCR7. Figuras 87A e 87B mostram subconjuntos de células T representativos de 10 produtos finais de TILs em ambas as populações de células CD4+ (A), e CD8+ (B). O subconjunto de células efetoras e de memória (círculo aberto azul) foi uma população principal (>93%) em ambos os subconjuntos CD4+ e CD8+ de produto final de TILs. Menos do que 7% das células de produtos de TILs foram do subconjunto de memória central (círculo aberto rosa). Os subconjuntos EMRA (círculo aberto cinza) e naïve (círculo aberto preto) foram raramente detectados em produto de TILs (<0,02%). Os valores p representam a diferença entre EM e CM usando teste T de Student não pareado.

[002202] Pureza: MCSP representa um marcador de tumor de melanoma apropriado para o teste de pureza.

439 / 557

[002203] Figuras 88A e 88B mostram a detecção de expressão de MCSP e EpCAM em células de tumor de melanoma. As linhagens celulares de tumor de melanoma (WM35, 526, e 888), linhagens celulares de melanoma derivadas do paciente foram geradas de acordo com os métodos descritos aqui (1028, 1032, e 1041), e uma linhagem celular de carcinoma de adenoma colorretal (HT29 como um controle negativo) foram caracterizadas por coloração para marcadores MCSP (proteoglicano sulfato de condroitina associado com melanoma) e EpCAM (molécula de adesão celular epitelial). (A) Média de 90% de células de tumor de melanoma expressou MCSP. (B) Expressão de EpCAM não foi detectada em linhagens celulares de tumor de melanoma como comparado com HT29 de controle positivo, uma linhagem celular de tumor EpCAM+.

[002204] Pureza: Desenvolvimento de um teste com base em citometria de fluxo para detecção de células de tumor residuais em produtos de TILs.

[002205] Figuras 89A e 89B ilustram a detecção de controles de contaminação (spiked) para a determinação de precisão da detecção de tumor. O teste foi realizado colocando quantidades conhecidas de células de tumor em suspensões de PBMC (n=10). Células de tumor de melanoma MCSP+526 foram diluídas em razões de 1:10, 1:100, e 1:1,000, então, misturadas com PBMC e coloridas com anticorpos anti-MCSP e anti-CD45 e corantes vivo/morto e analisadas por citometria de fluxo. (A) Aproximadamente 3000, 300, e 30 células foram detectadas na diluição de 1:10, 1:100, e 1:1000, respectivamente. (B) Uma média (AV) e um desvio padrão (SD) de células adquiridas em cada condição foram usados para definir os limites de referência superior e inferior.

[002206] Pureza: Qualificação de teste de detecção de tumor residual usando controles de contaminação (spiked)

[002207] Figuras 90A e 90B mostram o estudo de capacidade de repetição dos limites superior e inferior em controles de contaminação

440 / 557 (spiked). Três experiências independentes foram realizadas em triplicata para determinar a capacidade de repetição do teste. (A) O número de células de tumor detectadas MCSP+ estavam consistentemente dentro da faixa de limites de referência superior e inferior. (B) O gráfico de regressão linear demonstra a correlação entre células MCSP+ e diluições (R2=0.99) com a linha sólida preta mostrando o melhor ajuste. As linhas rompidas verde e cinza representam os limites de previsão de 95% em curva padrão e amostras (Exp#1 a 3), respectivamente.

[002208] Pureza: os contaminantes da célula de tumor de melanoma estavam abaixo dos limites do teste de detecção em produto de TIL final.

[002209] Figuras 91A e 91B mostram a detecção de tumor residual melanoma em produtos de TILs. Os produtos TILs foram avaliados para a contaminação de tumor residual usando o teste desenvolvido (n=15). O número mediano e a porcentagem de eventos MCSP+ detectáveis foi 2 e 0,0002%, respectivamente.

[002210] Potência: secreção de IFNγ por TIL (consistentemente > 1000 pg/ml) demonstrou a função efetora de produto TIL.

[002211] Figura 92 mostra a avaliação de potência de produtos de TILs após a ativação com células T. A secreção de IFNγ após re-estimulação com anti-CD3/CD28/CD137 em produtos TILs avaliados por ELISA em duplicata (n=5). Secreção de IFNγ para os produtos de TILs foi significativamente maior que os controles não estimulados usando o teste de classificação assinado de Wilcoxon (P=0,02), e consistentemente >1000 pg/ml. Secreção de IFNγ >200 pg/ml foi considerada como sendo potente. O valor p <0,05 é considerado estatisticamente significante. Conclusão

[002212] Os parâmetros de produto chave de identidade, pureza, e potência de produtos de TILs foram avaliados. Os produtos de TILs fabricados de acordo com os métodos descritos aqui consistiam de mais do

441 / 557 que 99% de células T CD45+CD3+. A maior parte dos subconjuntos TILs de CD4+CD8+ exibiu um fenótipo efetora-memória, associado com a função de células T citotóxicas. O teste com base em citometria de fluxo para detectar as células contaminantes de tumor de melanoma em produto de TIL final foi desenvolvido e qualidade com sucesso. Aplicando este teste, células contaminantes de tumor de melanoma em produto de TIL final foram mostradas como estando abaixo dos limites de detecção do teste. A secreção de IFNγ por produto de TIL final após a re-estimulação anti- CD3/CD28/CD137 pode servir como um teste de potência para TILs comercialmente fabricados. Estes dados provêem para a base de uma plataforma de controle de qualidade que irá sustentar desenvolvimento adicional de atributos de críticos de qualidade para a produção comercial de produtos TILs. EXEMPLO 26: UM PRODUTO DE TIL CRIOCONSERVADO GERADO

COM UM MÉTODO ABREVIADO APROPRIADO PARA A FABRICAÇÃO COMERCIAL COM ALTA PRODUÇÃO EXIBE ATRIBUTOS DE QUALIDADE FAVORÁVEIS PARA A

TRANSFERÊNCIA DE CÉLULAS ADOTIVAS Fundamentos

[002213] Os métodos clássicos de geração de linfócitos infiltrando os tumores (TIL) para transferência de células adotivas (ACT) envolve etapas múltiplas ex vivo de incubação para dar um produto de infusão fresco (não crioconservado).

[002214] O processo de primeira geração (Gen 1) produziu uma dose de TILs frescos em aproximadamente 6 semanas. O processo de fabricação de TILs de segundo geração (Gen 2) que abrevia da duração da cultura ex vivo a 22 dias foi desenvolvido (Figura 93).

[002215] O processo Gen 2 é apropriado para a fabricação centralizada e produz uma infusão de produto de TILs crioconservados ocasiona

442 / 557 conveniência no esquema, logística e entrega para os locais das clínicas. A infusão de produtos de TILs crioconservados para LN-144 produzidos pelo processo Gen 2 apresenta atributos de qualidade comparáveis à infusão de produtos de TILs não crioconservados para os TILs gerados pelo método Gen

1. O método de fabricação de TILs Gen 2 representa um processo de produção de células flexível, robusto, fechado, e semi-automatizado que leva a uma fabricação de TILs em alta produção em uma escala comercial. Objetivo do estudo

[002216] Os produtos de infusão de TILs gerados por processos de fabricação Gen 1 e Gen 2 foram avaliados para determinar compatibilidade em termos dos seguintes atributos de qualidade: (1) Contagem celular (dose), viabilidade, taxa de crescimento de fase REP, (2) pureza e expressão fenotípica de células T de moléculas co-estimulatórias em subconjuntos de células T, (3) comprimento relativo médio de repetições de telômeros, (4) capacidade para secretar IFNγ em resposta a envolvimento de CD3, CD28, CD137, e (5) diversidade de receptores de células T presentes no produto final de infusão (Figura 94). Métodos analíticos e instrumentação

[002217] Contagem celular e viabilidade: Os produtos de infusão finais formulados foram amostrados e testados para células nucleadas totais, células viáveis totais, e viabilidade determinados por contra-coloração com acridina laranja/DAPI usando o contador de células automatizado NC-200. Lotes de desenvolvimento de processo foram testados no contador de viabilidade celular Nexcellom Cellometer K2 usando coloração fluorescente dual acridina laranja/propídio iodo.

[002218] Marcadores fenotípicos: Os produtos de infusão formulados foram amostrados e testados para identificar por coloração imunofluorescente. A porcentagem de células T foi determinada como a população de células viáveis CD45+,CD3+ (duplo positivo). Os frascos-ampolas congelados,

443 / 557 satélite ou sentinela, para cada processo foram descongelados e testados para marcadores fenotípicos estendidos incluindo CD3, CD4, CD8, CD27, e CD28. Os produtos de infusão frescos foram adquiridos nos marcadores fenotípicos BD FACS Canto II, e estendidos em produtos de infusão descongelados do analisador de células adquirido em Bio-Rad ZE5.

[002219] Comprimento médio relativo de repetições de telômeros: Tecnologia Flow-FISH foi usada para medir comprimento médio de repetição de telômeros. Este teste foi completado como descrito no kit DAKO® Telomere PNA /FITC para o protocolo de citometria de fluxo. Brevemente, 2,0×106 células de TILs foram combinadas com 2,0×106 células T de leucemia de linhagem celular humana (1301). O DNA foi desnaturado a 82°C durante 10 minutos e a sonda PNA-FITC foi hibridada no escuro durante a noite a temperatura ambiente. Iodeto de propídeo foi usado para identificar as células em fase G0/1.

[002220] Função imune: A capacidade do produto de infusão para secretar IFNγ quando da reativação foi medida após a co-cultura com contas revestidas com anticorpo (Life Technologies, anti-CD3, anti-CD28 & anti- CD137). Após 24 horas, os sobrenadantes de cultura foram coletados, congelados, descongelados, e testados por ELISA usando o kit Quantikine IFNγ ELISA (R&D systems) de acordo com as instruções do fabricante.

[002221] Diversidade de receptor de células T: RNA de produtos de infusão foi isolado e submetido a um PCR multiplex com iniciadores específicos para VDJ. As sequências de CDR3 expressadas dentro do produto de TILs foram semi-quantitativamente amplificadas e sequenciadas de modo profundo para determinar a frequência e prevalências de clones de TILs singulares. Sequenciamento foi realizado no sequenciador de bancada Illumina MiSeq. Os valores foram indexados para dar uma pontuação representativa da diversidade relativa de receptores de células T no produto. Resultados

444 / 557

[002222] Em Dia 22, o produto de células reduzido em volume foi reunido em pools e amostrado para determinar desempenho da cultura antes de lavagem e formulação. Figuras 95A-95C mostram células viáveis totais, taxa de crescimento, e viabilidade. (A) Amostras foram analisadas no contador de células automatizado NC-200 como previamente descrito. Densidade celular viável total é determinada por uma grande média de contagens em duplicata a partir de 4 amostras independentes. O processo de Gen 2 deu um produto de TIL de dose similar a Gen 1 (média de Gen 1 = 4,10×1010 ± 2,8×1010, média Gen 2 = 4,12×1010 ± 2,5×1010). (B) A taxa de crescimento foi calculada para a fase REP. (C) Viabilidade celular foi avaliada de 9 lotes de desenvolvimento de processo usando Cellometer K2 como previamente descrito. Nenhuma diminuição significante em viabilidade celular foi observada após um ciclo único de congelamento-descongelamento do produto formulado. Redução de meio em viabilidade quando do descongelamento e amostragem foi 2,19%.

[002223] Figuras 96A-96C mostram que os Produtos de Gen 2 são culturas altamente puras de células T que expressam moléculas co- estimulatórias em níveis comparáveis a Gen 1. (Figura 96A) Produtos de fármacos formulados frescos foram testados para identificar por citometria de fluxo para liberação. Processos de Gen 1 e Gen 2 produzem culturas de alta pureza de células T, como definido por fenótipo CD45+ CD3+ (duplo positivo). (Figuras 96B e 96C) Os frascos tipo satélite crioconservados de produto de fármaco formulado foram descongelados e testados para fenótipo estendido por citometria de fluxo, como previamente descrito. Produtos de Gen 1 e Gen 2 expressaram níveis similares de moléculas co-estimulatórias CD27 e CD28 em subconjuntos de células T. As moléculas coestimulatórias tal como CD27 e CD28 podem ser requeridas para prover sinalização secundária e terciária necessária para proliferação de células efetoras quando do envolvimento do receptor de células T. Valor P foi calculado usando teste

445 / 557 ‘t’ de Mann-Whitney.

[002224] Figura 97 mostra que os produtos de Gen 2 tenderam para comprimentos relativos dos telômeros mais longos. Tecnologia Flow-FISH foi usada para medir o comprimento médio da repetição de telômeros como previamente descrito. O valor de RTL indicou que a fluorescência média do telômero por cromossoma/genoma em Gen 1 foi 7,5 % ± 2,1%, e Gen 2 foi 8,4% ± 1,8% da fluorescência do telômero por cromossoma/genoma na linhagem celular de controle (1301 Linhagem celular de leucemia). Os dados indicam que os produtos de Gen 2 têm, em média, comprimento comparável dos telômeros para produtos de Gen 1. Comprimento do telômero é uma medição substituta do comprimento de cultura de células ex vivo.

[002225] Figura 98 mostra que produtos de fármacos de Gen 2secretam IFNγ em resposta ao envolvimento de CD3, CD28, e CD137. Os produtos de fármacos crioconservados foram descongelados e incubados com contas revestidas com anticorpos, como previamente descrito. Dados são expressados como uma quantidade de IFNγ produzidos por 5×105 células viáveis em 24h. Os produtos de fármacos de Gen 2 exibiram uma capacidade aumentada para produzir IFNγ quando da reativação com relação a produtos de fármacos de Gen 1. A capacidade do produto de fármaco de ser reativado e secretar citocina é uma medição substituta de função in-vivo quando da ligação de TCR para o antígeno cognato no contexto de HLA.

[002226] Figuras 99A e 99B mostram que os produtos de fármacos Gen 2 têm uma diversidade aumentada de receptores de células T únicos. A diversidade de receptor de células T foi avaliada como a seguir. RNA de 10x106 TIL de produtos de infusão de Gen 1 e Gen 2 foi testado para determinar o número total e frequência de sequências de CDR3 únicas presentes em cada produto. (Figura 99A) Sequências de CDR3 únicas foram indexadas com relação a frequência em cada produto para dar uma pontuação representativa da diversidade global de receptores de células T no produto.

446 / 557 (Figura 99B) mostra o número total médio de sequências de CDR3 únicas presentes em cada produto de infusão. Os produtos de TILs de ambos processos foram compostos de populações policlonais de células T com diferentes especificidades e avidez de antígenos. A amplitude do repertório de células T totais pode ser indicativa do número de epítopos acionáveis apresentados em células de tumor. Conclusões

[002227] O processo de fabricação Gen 2 produziu uma infusão de produto de TILs (LN-144) com atributos de qualidade comparáveis a Gen 1. Gen 2 produziu doses similares de TIL altamente puro. Subconjuntos de células T estavam em proporções similares e expressaram moléculas co- estimulatórias em níveis comparáveis com relação a Gen 1. TIL de Gen 2 tendeu para um comprimento do telômero mais longo relativo, proporcional com o período reduzido de cultura ex vivo. TIL de Gen 2 exibiu uma aumentada diversidade de receptores de TCR que, quando empregados, iniciaram uma robusta secreção de IFN-γ, uma medição de função de efetora citolítica. Assim, o de Gen 2 abreviou em 22-dias o processo fechado de expansão com produto de infusão crioconservado apresentando uma plataforma de fabricação de TIL escalonável e logisticamente possível que permite a geração rápida de doses em uma escala de clínica para pacientes com câncer em necessidade imediata de uma nova opção de terapia. Referências 1

[002228] Dudley, M. E. et al. Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma. J Clin Oncol 23, 2346-2357, doi:10.1200/JCO.2005.00.240 (2005). 2

[002229] Chandran, S. S. et al. Treatment of metastatic uveal melanoma with adoptive transfer of tumour-infiltrating lymphocytes: a single- centre, two-stage, single-arm, phase 2 study. Lancet Oncol,

447 / 557 doi:10.1016/S1470-2045(17)30251-6 (2017). 3

[002230] Stevanovic, S. et al. Complete regression of metastatic cervical cancer after treatment with human papillomavirus-targeted tumor- infiltrating T cells. J Clin Oncol 33, doi:10.1200/jco.2014.58.9093 (2015). 4

[002231] FDA Reviewers and Sponsors: Content and Review of Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs), 21 CFR 610.3(r),

2008. 5

[002232] Richards JO, Treisman J, Garlie N, Hanson JP, Oaks MK. Flow cytometry assessment of residual melanoma cells in tumor-infiltrating lymphocyte cultures. Cytometry A 2012; 81:374-81. EXEMPLO 27: O COQUETEL DE FATOR DE CRESCIMENTO DE CÉLULAS T IL-2/IL-15/IL-21 INTENSIFICOU A EXPANSÃO E

FUNÇÃO EFETORA DE CÉLULAS T INFILTRANDO TUMORES EM

UM NOVO PROCESSO DESCRITO AQUI Fundamentos

[002233] Terapia de células T adotivas com TILs autólogos demonstrou a eficácia clínica em pacientes com melanoma metastático e carcinoma cervical. Em alguns estudos, resultados clínicos melhores foram positivamente correlacionados com o número total de células infundidos e/ou porcentagem de células T CD8+. Os regimes de produção mais correntes apenas utilizam IL-2 para promover o crescimento de TILs. A expansão de linfócitos intensificada foi relatada usando regimes contendo IL-15 e IL-21. Este estudo descreve os efeitos positivos e sinergias de adicionar IL-15 e IL- 21 a modalidades de processo 2A e processos de fabricação de TILs de Geração 2. Geração de TIL usando um novo processo descrito aqui

[002234] O tumor é excisado a partir de paciente e transportado para a instalação de fabricação GMP ou um laboratório para fins de pesquisa. Na

448 / 557 chegada, o tumor foi fragmentado, e colocado em frascos com IL-2 para protocolo de pré-expansão rápida (pré-REP) durante 11 dias. Para os estudos de coquetel triplo, IL-2, IL-15, e IL-21 (IL-2/IL-15/IL-21) foram adicionados no início de pré-REP. Para o protocolo de expansão rápida (REP), TILs foram cultivados com alimentadoras e anticorpo anti-CD3 para um adicional de 11 dias (Figura 100). Materiais e Métodos

[002235] O processo de geração de TIL incluía um protocolo de pré- expansão rápida (pré-REP), em que fragmentos de tumor de 1-3 mm3 de tamanho foram colocados em meio contendo IL-2. Durante pré-REP, TILs emigraram dos fragmentos de tumor e expandiram em resposta ao estímulo com IL-2.

[002236] Para ainda estimular o crescimento de TILs, TILs foram expandidos através de um período de cultura secundário chamado o protocolo de expansão rápida (REP) que incluía PBMC alimentadoras irradiadas, IL-2 e anticorpo anti-CD3. O protocolo de expansão pré-REP e REP encurtado foi desenvolvido para expandir TIL enquanto mantendo os atributos fenotípicos e funcionais do produto de TIL final. Este protocolo de geração de TILs encurtada foi usado para avaliar um impacto de IL-2 sozinho versus uma combinação de IL2/IL-15/IL-21 adicionado à etapa pré-REP. Estes dois regimes de cultura foram comparados durante a geração de TILs cultivados a partir de tumores colorretal, melanoma, cervical, mama triplo negativo, pulmão e renal. Ao completar pré-REP, TILs cultivados foram avaliados para expansão, fenótipo, função (CD107a+ e IFNγ) e repertório TCR Vβ.

[002237] O estudo mostra intensificação em expansão durante pré-REP com IL-2/IL-15/IL-21 em múltiplas histologias de tumor. Culturas de pré- REPs foram iniciadas usando o protocolo padrão IL-2 (6000 IU/mL), ou com IL-15 (180 IU/mL) e IL-21 (1 IU/mL) além de IL-2 (Figura 101). As células foram avaliadas para expansão ao completar pré-REP. A cultura foi

449 / 557 classificada como tendo expansão aumentada sobre IL-2 se o crescimento global for intensificado por pelo menos 20%. Estudos fenotípicos e funcionais de melanoma e pulmão e são discutidos ainda nos seguintes parágrafos (texto em negrito na Figura 101).

[002238] IL-2/IL-15/IL-21 intensificou a porcentagem de células CD8+ em pulmão carcinoma, mas não em melanoma. Em Figuras 102A e 102B, TILs derivados de (A) melanoma (n=4), e (B) pulmão (n=7) foram avaliados fenotipicamente para células CD4+ e CD8+ usando citometria de fluxo após pré-REP. O valor p representa a diferença entre as condições IL-2 e IL-12/IL- 15/IL-21 usando o teste t de Student não pareado.

[002239] Expressão de CD27 foi levemente intensificada em células CD8+ em culturas tratadas com IL-2/IL-15/IL-21. Em Figuras 103A e 103B, TIL derivados de (A) melanoma (n=4), e (B) pulmão (n=7) foram avaliados fenotipicamente para células CD27+ e CD28+ no CD4+ e CD8+ usando citometria de fluxo após pré-REP. Expressão de CD27, um marcador celular associado com um fenótipo mais jovem que estava correlacionado com os resultados da terapia de células T adotivas, foi levemente intensificada em TILs CD8+ derivados de cultura com IL-2/IL-15/IL-21 versus IL-2 sozinha.

[002240] Os subconjuntos de células T não foram alterados com a adição de IL-15/IL-21. Em Figuras 104ª e 104B, TILs foram avaliados fenotipicamente para subconjuntos de efetoras/memória (CD45RA e CCR7) nas células CD8+ e CD4+ (dados não mostrados) de (A) melanoma (n=4), e (B) pulmão (n=8) via citometria de fluxo após pré-REP. TEM=memória efetora (CD45RA-, CCR7-), TCM=memória central (CD45RA-, CCR7+), TSCM= memória de célula-tronco (CD45RA+, CCR7+), TEMRA=células T efetoras (CD45RA+CCR7-).

[002241] A capacidade funcional de TIL foi diferencialmente intensificada com IL-2/IL-15/IL-21. Em Figuras 105A e 105B, TIL derivados de (A) melanoma (n=4) e (B) pulmão (n=5) foram avaliados para expressão

450 / 557 de CD107a+ em resposta a estímulo com PMA durante 4 horas nas células CD4+ e CD8+, por citometria de fluxo. (C) TILs pré-REP derivados de melanoma e pulmão foram estimulados durante 24 horas com anticorpo anti- CD3 solúvel e os sobrenadantes avaliados para IFNγ por ELISA.

[002242] A frequência relativa do repertório TCRvβ foi alterada em resposta a IL-2/IL-15/IL-21 em pulmão, mas não em melanoma. Em Figuras 106A e 106B, o repertório TCRvβ (24 especificidades) foi avaliado nos TILs derivados de um tumor de (A) melanoma e (B) pulmão usando o kit Beckman Coulter para citometria de fluxo. Sumário

[002243] Este trabalho demonstra a capacidade do coquetel de IL-2/IL- 15/IL-21 para intensificar os números de TILs comparados com IL-2 sozinho (>20%) no processo de Geração 2, além de impactar as características fenotípicas e funcionais.

[002244] O efeito do coquetel triplo sobre a expansão de TILs foi dependente da histologia. A razão de células T CD8+/CD4+ foi aumentada com a adição de IL-2/IL-15/IL-21 em tumores de pulmão. Adição de IL-15 e IL-21 intensificou a expressão de CD107a e produção de IFNγ em TILs derivados de tumores do pulmão. A adição de IL-2/IL-15/IL-21 alterou o repertório de TCRvβ no pulmão. O processo de expansão de TILs de Geração 2 foi usado para englobar o coquetel de citocinas IL-2/IL-15/IL-21, assim provendo um meio para adicionalmente promover a expansão de TILs em histologias de tumores específicos, tais como tumores de pulmão e colorretal. Estas observações são especialmente relevantes para a otimização e padronização de regimes de cultura de TILs necessários para a fabricação em larga escala de TILs com a ampla aplicabilidade e disponibilidade requeridas de uma terapia anticâncer de corrente dominante. EXEMPLO 28: NOVOS LINFÓCITOS INFILTRANDO OS TUMORES CRIOCONSERVADOS (LN-144) ADMINISTRADOS A PACIENTES

451 / 557

COM MELANOMA METASTÁTICO DEMONSTRARAM EFICÁCIA E TOLERABILIDADE EM UMA EXPERIÊNCIA CLÍNICA DE FASE 2 DE

MÚLTIPLOS CENTROS Fundamentos

[002245] A segurança e eficácia de terapia de células adotivas (ACT) utilizando linfócitos infiltrando os tumores (TIL) foi estudada em centenas de pacientes com melanoma metastático, e demonstrou taxas de resposta objetivas significativas e duráveis (ORR).1 Em uma experiência Fase 2 em processo, C-144-01 utilizando fabricação GMP centralizada de TIL, ambos os processos de fabricação de TILs não crioconservados Geração 1 (Gen 1) e crioconservados Geração 2 (Gen 2) TIL foram avaliados.

[002246] Gen 1 tem aproximadamente 5-6 semanas de duração de fabricação (administrado em estudo de Coorte 1 C-144-01), enquanto Gen 2 tem 22 dias de duração de fabricação (processo 2A, administrado em estudo de Coorte 2 C-144-01). Dados preliminares de Coorte 1 de pacientes infundidos com o produto fabricado LN-144 de Gen 1, encorajaram o tratamento de pacientes com melanoma metastático após-PD-1 como a terapia com TILs produziu respostas.2 Benefícios de Gen 2 incluíram: (A) redução no tempo que os pacientes e médicos esperam para infundir TILs no paciente; (B) crioconservação permite flexibilidade em cronogramas, distribuição e entrega; e (C) redução dos custos de fabricação. Dados preliminares de Coorte 2 são apresentados aqui. Figura 107 mostra uma modalidade do processo de fabricação de LN-144 crioconservado Gen 2 (processo 2A). Planejamento de estudo: Experiência C-144-01 Fase 2 em Melanoma Metastático

[002247] Fase 2, Múltiplos centros, Estudo de Coorte -3 para avaliar a eficácia e segurança de linfócitos infiltrando os tumores autólogos (LN‑144) para o tratamento de pacientes com melanoma metastático.

[002248] Critérios de inclusão chave: (1) melanoma metastático

452 / 557 mensurável e ≥ 1 lesão resseccionável para a geração de TILs; (2) Progressão em pelo menos uma linhagem anterior de terapia sistêmica; (3) Idade ≥ 18; e (4) ECOG PS 0-1.

[002249] Tratamento dos Coortes: (1) produto LN-144 não crioconservado; (2) produto LN-144 crioconservados; e (3) retratamento com LN-144 para pacientes sem resposta ou que progridem após resposta inicial. Figura 108 mostra o projeto de estudo.

[002250] Pontos finais: (1) Primário: Eficácia definida como ORR e (2) Secundário: segurança e eficácia. Métodos

[002251] Coorte 2 Conjunto de segurança: 13 pacientes que sofreram ressecção com a finalidade de geração de TIL e receberam qualquer componente do tratamento de estudo.

[002252] Coorte 2 Conjunto de eficácia: 9 pacientes que receberam o pré-condicionamento NMA-LD, infusão de LN-144e pelo menos uma dose de IL-2, e tiveram pelo menos uma avaliação de eficácia. 4 pacientes não tiveram uma avaliação de eficácia no momento do corte de dados.

[002253] Dados do biomarcador foram mostrados para todos os dados disponíveis lidos por volta da data do corte de dados. Resultados

[002254] Figura 109 provê uma tabela ilustrando a comparação das características dos pacientes de Coorte 1 (ASCO 2017) versus Coorte 2. Coorte 2 apresenta: 4 terapias anteriores medianas; todos os pacientes tinham recebido antes anti-PD-1 e anti-CTLA-4; e tinham uma maior carga de tumor refletida por maior soma de diâmetros (SOD) para lesões alvo e maior LDH médio na linha de base. Figura 110 provê uma tabela mostrando eventos adversos emergentes do tratamento (≥ 30%).

[002255] Para Coorte 2 (LN-144 crioconservado), as características do produto de infusão e terapia com TILs foram (1) número médio de células de

453 / 557 TIL infundidas: 37 × 109, e (2) número mediano de administrações de doses de IL-2 foi 4.5. Figura 111 mostra a eficácia do produto de infusão e terapia com TILs para Pacientes #1 a #8.

[002256] Figura 112 mostra o estado clínico de pacientes avaliáveis em resposta com doença estável (SD) ou uma resposta melhor. Uma resposta parcial (PR) para Paciente 6 não foi confirmada como o paciente ainda não tinha alcançado a segunda avaliação de eficácia. Um paciente (Paciente 9) faleceu antes da primeira avaliação (ainda considerado no conjunto de eficácia).

[002257] Dentre os 9 pacientes no conjunto de eficácia, um paciente (Paciente 9) foi não avaliável (NE) devido a morte relacionada com melanoma antes de primeira avaliação de tumor não representado na Figura

112. Respostas são vistas em pacientes tratados com Gen 2. A taxa de controle de doença (DCR) foi 78%. O tempo para resposta foi similar a Coorte 1. Um paciente (Paciente 3) com doença progressiva (PD) como melhor resposta não foi incluído no gráfico tipo ‘pista de natação’.

[002258] Figura 113 mostra a mudança percentual em soma de diâmetros. Paciente 9 não teve a pós-avaliação da doença LN-144 devido a morte relacionada com o melanoma antes de Dia 42. Dia -14: % mudança de soma de diâmetros da triagem para a linha de base (Dia -14). Dia -14 até Dia 126: % de mudança de SOD a partir da linha de base. Dia -14 = linha de base. Dia 0 = infusão de LN-144.

[002259] Quando do tratamento com TIL, um aumento de HMGB1 foi observado (Figura 114). Os níveis no plasma de HMGB1 foram medidos usando o kit HMGB1 ELISA (Tecan US, Inc). Dados mostrados representam a mudança em vezes nos níveis de HMGB1 pré- (Dia -7) e pós- (Dia 4 e Dia 14) infusão de LN-144 em pacientes de Coorte 1 e Coorte 2 (valores p foram calculados usando teste t pareado bicaudal com base em dados logarítmicos transformados). Os valores do tamanho da amostra (negrito e itálico) e médio

454 / 557 (itálico) são mostrados em parêntese para cada ponto de tempo. HMGB1 é secretado por células imunes ativadas e liberado por células de tumor danificadas. Os níveis de HMGB1 aumentados observados após tratamento com LN-144 são, assim, sugestivos de um mecanismo imune-mediado de atividade anti-tumor.

[002260] Os níveis de plasma IP-10 foram medidos usando teste Luminex. Dados mostrados em Figura 115 representam mudanças de vezes em níveis de IP-10 pré- (Dia -7) e pós- (Dia 4 e Dia 14) infusão de LN-144 em pacientes de Coorte 1 e Coorte 2 (valores p foram calculados usando teste t pareado bicaudal com base em dados logarítmicos transformados). Os valores do tamanho da amostra (negrito e itálico) e médio (itálico) são mostrados em parêntese para cada ponto de tempo. O aumento na infusão após-LN-144 em IP-10 está sendo monitorado para entender uma possível correlação com a persistência de TILs.

[002261] Os dados atualizados de Coorte 2 (n = 17 pacientes) são relatados em Figura 116 até Figura 121. Em comparação com Coorte 1 e uma modalidade do processo de Gen 1, que mostrou um DCR de 64% e uma taxa de resposta global (ORR) de 29% (N = 14), Coorte 2 e uma modalidade do processo Gen 2 mostraram um DCR de 80% e um ORR de 40% (N = 10). Conclusões

[002262] Resultados preliminares a partir de dados existentes demonstram seguranças comparáveis entre os produtos de TILs LN-144 Gen 1 e Gen 2. Administração de TILs fabricados com o processo de Gen 2 (processo 2A, como descrito aqui) leva a respostas clínicas surpreendentemente aumentadas vistas em pacientes com melanoma metastático com a doença avançada, todos tendo progredido em terapias anteriores anti-PD-1 e anti-CTLA-4. O DCR para coorte 2 foi 78%.

[002263] Os dados de biomarcador preliminares sustentam o mecanismo citolítico de ação proposto durante terapia com TILs.

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[002264] A modalidade do processo de fabricação Gen 2 descrito aqui leva 22 dias. Este processo encurta significativamente a duração de tempo que um paciente precisa esperar para receber seus TILs, oferece flexibilidade no esquema de tempo de dosagem dos pacientes, e leva a uma redução de custo de fabricação, enquanto proporcionando outras vantagens sobre as abordagens anteriores que permitem comercialização e registro junto às agências reguladoras de saúde. Os dados clínicos preliminares em melanoma metastático usando uma modalidade do processo de fabricação Gen 2 também indicam uma melhora surpreendente em eficácia clínica dos TILs, como medido por DCR, ORR, e outras respostas clínicas, com um tempo similar para resposta e perfil de segurança comparado com TILs fabricados usando o processo Gen 1. A eficácia inesperadamente melhorada do produto de Gen 2 de TILs é também demonstrada por um aumento de mais do que cinco vezes em produção de IFN-γ (Figura 98), que está correlacionado com eficácia melhorada em geral (Figura 122), policlonalidade melhorada de modo significante (Figura 99A e Figura 99B), e maior produção média de IP-10 e MCP-1 (Figura 123 até Figura 126). Surpreendentemente, apesar do processo muito mais curto de Gen 2, muitas outras características críticas do produto de TILs são similares às observadas usando processos mais tradicionais de fabricação, incluindo o comprimento relativo do telômero (Figura 97) e expressão de CD27 e CD28 (Figura 96B e Figura 96C). Referências 1

[002265] Goff, et al. Randomized, Prospective Evaluation Comparing Intensity of Lymphodepletion Before Adoptive Transfer of Tumor-Infiltrating Lymphocytes for Patients With Metastatic Melanoma. J Clin Oncol. 2016 Jul 10;34(20):2389-97. 2

[002266] Sarnaik A, Kluger H, Chesney J, et al. Efficacy of single administration of tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) in heavily pretreated patients with metastatic melanoma following checkpoint therapy. J Clin

456 / 557 Oncol. 2017; 35 [suppl; abstr 3045]. EXEMPLO 29: ESTUDOS DE FASE 2 HNSCC e Carcinoma cervical

[002267] Inscrição para o estudo de fase 2 do HNSCC (carcinoma escamoso de cabeça e pescoço; C-145-03). 13 pacientes consentiram no estudo, os TILs foram colhidos em 10 pacientes e, finalmente, 7 pacientes foram infundidos com mais 1 em andamento.

[002268] Inscrição no estudo de fase 2 do carcinoma cervical (C-145- 04). 8 pacientes consentiram no estudo, os TILs foram colhidos em 4 pacientes e, finalmente, 2 pacientes foram infundidos e mais 2 em processo.

[002269] Os dados iniciais do estudo em andamento são providos na Figura 127. Doença estável (SD) e resposta progressiva foram observadas em ambos os pacientes com HCNSCC e câncer cervical tratados com a terapia TIL em até 84 dias. EXEMPLO 30: PRODUÇÃO DE UMA TERAPIA DE CÉLULAS DE TILs

CRIOCONSERVADAS

[002270] Este exemplo descreve a fabricação de cGMP da Iovance Biotherapeutics, Inc. Processo de terapia de células de TILs em frascos G-Rex de acordo com as Boas Práticas de Tecido e as Boas Práticas de Fabricação atuais.

[002271] Este material será fabricado de acordo com as Normas de Boas Práticas de Fabricação do FDA dos Estados Unidos (21 CFR Parte 210, 211, 1270 e 1271) e os padrões de ICH Q7 aplicáveis para a Fase I até Material Comercial.

4.0 REFERÊNCIA DE PROCESSO Plano de expansão Dia Volume total Estimado estimado (após Atividade Critérios de alvo Recipientes antecipados (mL) semeadur a) ≤ 50 fragmentos desejáveis de Dissecção do G-Rex100MCS 1 0 tumor por G- ≤1000 tumor frasco Rex100MCS 5 – 200 x 106 células viáveis Semente de G-Rex500MCS 1 11 por G- ≤5000 REP frasco Rex500MCS

457 / 557 1 x 109 células viáveis por G- G-Rex500MCS ≤5 16 Divisão REP ≤25000 Rex500MCS frascos 22 Colheita Total disponível células 3-4 bolsas CS-750 ≤530

4.2 Volumes de Frasco: Volume/Frasco trabalho Tipo de frasco (mL) G-Rex100MCS 1000 G-Rex500MCS 5000

4.3 Procedimento de inspeção

[002272] 4.3.1 O pessoal de fabricação realizará 100% de inspeção do produto final bolsas durante o processo de enchimento.

[002273] 4.3.2 Preparar um recipiente rotulado “Inspeção de produto final reprovado”.

[002274] 4.3.3 Inspecionar os seguintes atributos rejeitáveis:

4.3.3.1 Partículas visíveis brutas (fibras, partículas não da mesma cor que a suspensão, etc.) (NOTA: Aglomerações celulares/de tecido não devem ser consideradas rejeitos de particulados).

[002275] 4.3.3.2 Defeitos na integridade da bolsa, tal como vazamentos em costuras/aberturas.

[002276] 4.3.3.3 Vedação incompleta do envoltório da bolsa.

[002277] 4.3.3.4 Vedação vazando.

[002278] 4.3.3.5 Sinal de grumos.

[002279] 4.3.4 Inspecionar os seguintes atributos de aparência aceitáveis:

4.3.4.1 Bolsa intacta

4.3.4.2 Sem sinais de grupos

4.3.5 Se nenhum atributo rejeitável for observado, devolva a bolsa do produto final ao lote.

[002280] 4.3.6 Se algum atributo rejeitável for observado, rotule a bolsa com uma etiqueta de “Produto rejeitado” e coloque a bolsa no recipiente de armazenamento “Rejeitado”.

[002281] 4.4 Diagrama de fluxo de processo (ver, Figura 128)

5.0 NOTAS DE PROCESSO

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[002282] 5.1 Impressões contendo os resultados finais dos dados relatados devem ser anexadas a este Registro de lote na área designada. Cada impressão deve ser etiquetada com o número do lote, número da etapa (se aplicável), iniciais e data. Se as impressões não estiverem disponíveis, as leituras devem ser registradas manualmente no lugar da impressão e com referência aos comentários na seção de comentários. Um segundo associado deve verificar os dados.

[002283] 5.2 As etapas do processo podem ser executadas simultaneamente ao obter materiais, durante a configuração, atividades pós- processo ou de outra forma observado na descrição da etapa.

[002284] 5.3 Ao longo de todo este Registro de lote, assumir 1,0 mL/L = 1,0 g/kg, salvo especificado de outra forma.

[002285] 5.4 Se um material/consumível crítico deve ser substituído na seção 7.1, um comentário será feito na seção 10.0 e os indivíduos apropriados contatados.

[002286] 5.5 Arredondar todos os dados para o décimo mais próximo de uma casa decimal (xx.x) ou dentro da tolerância do equipamento usado (exclui dados de impressão), salvo indicado de outra forma no registro do lote.

[002287] 5.6 Se o equipamento exigir calibração para mais de um parâmetro e essas datas de vencimento de calibração forem diferentes, a data de vencimento mais próxima será registrada.

[002288] 5.7 Todas as medições de CO2 registradas neste registro de lote serão lidas a partir de um analisador de CO2 de Vaisala em League Island

1. Todas as medições de CO2 registradas neste registro de lote serão lidas a partir do mostrador de LED no Centro Comercial 3.

[002289] 5.8 Todas as incubadoras para League Island 1 serão umidificadas. Todas as incubadoras do Centro Comercial 3 não serão umidificadas.

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[002290] 5.9 Uma vez aberto, os seguintes prazos de validade se aplicam a 2-8oC: Soro Humano, tipo AB (HI) Gemini, 1 mês; 2- mercaptoetanol, 1 mês. Sulfato de gentamicina, estoque de 50 mg/ml pode ser mantido em temperatura ambiente por 1 mês. Bolsas contendo 10L de meio AIM-V podem ser aquecidas em temperatura ambiente apenas uma vez por até 24 horas antes do uso.

[002291] 5.10 O Número do Recibo e o Número do Lote em Great Plains serão registrados na Seção 7.1 Materiais/Consumíveis Críticos, caso o Número do Lote WuXi AppTec não seja atribuído ao(s) material(s). A combinação do número do recibo e do número do lote substituirá o número do lote WuXi AppTec para novos materiais adquiridos no futuro, como parte da implementação e validação do sistema Great Plains.

[002292] 5.11 Quando usando o soldador TSCD para conexões, seguir as instruções impressas na parte frontal da máquina. Certifique-se de que a tubulação esteja inserida corretamente conforme indicado na máquina. Ao carregar a tubulação, certifique-se de que a tubulação seja inserida de forma que uma solda anterior não seja colocada sob as braçadeiras do soldador (quando possível). Também, certifique-se de que haja tubulação suficiente para as etapas após a soldagem. Uma pinça hemostática deve ser colocada em qualquer lado da tubulação antes de iniciar o processo de soldagem. Após a conclusão da soldagem, inspecionar a solda para garantir que esteja vedada e uniforme ao redor da tubulação. Apertar ou enrolar os dedos ao longo da conexão para abrir a solda e, então, remover as pinças hemostáticas.

[002293] 5.12 Antes de usar o Selador de Tubo Portátil SEBRA® a cada dia, limpar e inspecionar a cabeça de vedação para garantir o funcionamento apropriado. Ao usar o Selador de Tubo Portátil SEBRA® para separar a tubulação, criar três vedações próximas uma da outra. Certifique-se de que o exterior da tubulação esteja seco para evitar arco elétrico. Separar ou destacar a tubulação quebrando a vedação do meio, salvo seja instruído de outra forma.

460 / 557 Não aplicar forças opostas na tubulação para evitar a separação prematura da tubulação durante eventos de vedação. Não tente vedar novamente a vedação se a primeira tentativa não tiver êxito. Se necessário, realizar “soldas de teste” usando o selador portátil e avaliar o selador manual conforme necessário.

[002294] 5.13 Inspecionar minuciosamente todas as pinças e pinças hemostáticas em busca de falhas ou danos que possam resultar no comprometimento da capacidade de interromper o fluxo de modo adequado ou um potencial de danificar a tubulação.

[002295] 5.14 Se a notificação do contador Nucelocounter mostrar que as contagens 1 e/ou 2 estão acima da faixa de contagem ideal (5x104 - 5x106 antes de contabilizar a diluição), N/A o restante da página de contagem de células. Preparar outra amostra de solução de células, diluída com um fator de diluição apropriado ([novo fator de diluição] = [fator de diluição anterior] x [contagem de células relatada] ÷ [5x105]) para obter o VCD ou “Células Vivas” dentro da faixa ótima. Se as contagens de células 1 e/ou 2 estiverem abaixo da faixa ótima (muito diluída), o gerenciamento da área contatada, registrar as contagens de “células vivas” e prosseguir com os cálculos. Certifique-se de documentar as contagens de células fora da faixa ótima em uma nota de rodapé em qualquer situação.

[002296] 5.15 Ao registrar as informações da recepção do tumor, certifique-se de que o Horário de Remoção do Tumor do paciente seja convertido para o Horário Padrão do Leste (EST), caso ainda não tenha sido, registrado como tal no registro do Lote de Remessa de Tumor. O tempo decorrido entre a remoção do tumor do paciente e a recepção do tumor no laboratório deve ser calculado em EST.

[002297] 5.16 Durante a colheita do dia 22, dois GatherexTM podem ser usados para coletar o TIL dos frascos G-Rex500MCS. Ambas as unidades podem ser usadas para remover o sobrenadante e uma das duas unidades pode ser usada para coletar o TIL.

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[002298] 5.17 Durante todas as etapas de processamento, o número mínimo de pessoal permitido dentro da suíte de processamento de Grau B é dois e o número máximo é dez (incluindo pessoal de processamento ambiental).

[002299] 5.18 Ao dividir em alíquotas os reagentes do meio em volumes ≤1,0mL, enxaguar a pipeta após dispensar.

[002300] 5.19 Os frascos serão incubados novamente durante o aquecimento do meio e em qualquer outro caso quando não estiverem sendo processados ativamente. As etapas da incubação somente serão registradas no início e no final de cada seção, quando aplicável. Em dias não programados de processamento, os frascos podem ser observados apenas para fins informativos, conforme gerenciamento da área ou cliente, sem higienizar a sala ou monitorar o equipamento.

[002301] 5.20 Após a conclusão do processamento do Dia 0, Dissecção do Tumor, semeadura e incubação em frasco, todos os fragmentos e pedaços restantes do tumor devem ser descartados de forma apropriada.

6.0 EQUIPAMENTO

[002302] Lista de Equipamento: Dia 0 CM1 Preparação de meio /Preparação de lavagem do tumor/Dissecção do tumor: ● Calibre Magnehelic ● Armário de segurança biológica (BSC) ● Incubador ● Analisador de CO2 ● Micropipetador (100-1000µL) ● Auxiliar de pipeta ● Bomba de repetidor Baxa ● Selador de tubo Sebra ● Refrigerador a 2-8oC ● Congelador a -80ºC

462 / 557 ● Congelador a -20ºC ● Cronômetro

[002303] Lista de Equipamento: Preparação de CM2 /Dia 11 Semente de REP ● Calibre Magnehelic ● Armário de segurança biológica (BSC) ● Incubador ● Incubador ● Analisador de CO2 ● Banho seco ● Banho com água ● CytoTherm ● Soldador ● Gatherex ● NucleoCounter NC200 ● Bomba de repetidor Baxa ● Balança de selador de tubo Sebra

[002304] Lista de Equipamento: Preparação de CM2 /Dia 11 Semente de REP ● Centrífuga ● Micropipetador (100-1000µL) ● Auxiliar de pipeta ● Cronômetro ● Refrigerador a 2-8°C ● Congelador - 80°C ● Congelador de taxa controlada ● Congelador de armazenamento de LN2 (quarentena) ● Congelador a -20ºC

[002305] Lista de Equipamento: Preparação de CM4 /Dia 16

463 / 557 ● Calibre Magnehelic ● Armário de segurança biológica (BSC) ● Incubador ● Incubador ● Analisador de CO2 ● Soldador ● Soldador ● Gatherex ● NucleoCounter NC200 ● Bomba de repetidor Baxa ● Balança de selador de tubo Sebra ● Micropipetador (100-1000µL) ● Auxiliar de pipeta ● Refrigerador a 2-8°C ● Congelador a -80°C

[002306] Lista de Equipamento: Formulação Dia 22, Enchimento, Crioconservação ● Calibre Magnehelic ● Armário de segurança biológica (BSC) ● Incubador ● Incubador ● Analisador de CO2 ● Soldador ● Gatherex ● NucleoCounter NC200 ● Bomba de repetidor Baxa ● Balança de selador de tubo Sebra ● Micropipetador (20-200µL) Auxiliar de pipeta

[002307] Lista de Equipamento: Dia 22 Formulação, Enchimento,

464 / 557 Crioconservação ● Auxiliar de pipeta ● Refrigerador a 2-8°C ● Congelador a -80°C ● Congelador de taxa controlada ● Congelador de armazenamento de LN2 ● Congelador de armazenamento de LN2 (quarentena) ● Sistema de processamento celular LOVO

7.0 LISTA DE MATERIAIS

[002308] Materiais: Dia 0 Preparação de meio CM1 /Preparação de lavagem do tumor/Dissecação do tumor ● Bisturis descartáveis, estéreis ● pipetas sorológicas de 50 mL, estéreis ● pipeta de plástico sorológica de1 mL, estéril ● pipeta sorológica de 10 mL, estéril ● Tubo de centrífuga, 50mL, 28x114mm, base cônica, tampa de rosca, PP, estéril ● pipeta sorológica de 25 mL, estéril ● pipeta sorológica de 5 mL, estéril ● Série MF75, Filtro de cultura de tecido descartável, 1000 mL, um filtro PES, 0,2 µm, estéril ● Pipetas, sorológica 100 mL ● 2-mercaptoetanol 1000X, líquido, 55 mM em D-PBS ● Solução balanceada de sal de sódio de Hank (1X), líquido, sem cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio ● GlutaMAX 1-200 mM (100X), líquido ● Pontas de pipeta de barreira ART, 1000µL, embaladas individualmente, estéreis ● Disco de petri de 150mm, Extra-profundo, estéril

465 / 557 ● Placas de fixação ultra-baixa, 6 cavidades, área de crescimento de cavidade de 9,5cm2, PS, estéril ● Pipetas de transferência de múltiplos fins Thermo Scientific Samco. 7,7mL, estéril ● Conjunto de transferência de fluido de bomba repetidora ● Extremidade de trava Luer macho ● Fórceps de comprimento de 20,32 cm, estéril ● Sulfato de gentamicina, carga de 50mg/mL ● Fórceps descartável Scientific, 11,40 cm, aço inoxidável, estéril ● Disco de petri de 100 mm, estéril, extra-profundo ● Sistema de distribuição de líquido Pumpmatic ● Sulfato de gentamicina, carga de 50mg/mL ● Função dupla de tampa de seringa, vermelha ● RPMI-1640, garrafa de 1L ● Sistema fechado de frasco G-Rex 100M ● Réguas estéreis ● IL-2 reconstituído ● Amostra de tumor humano, cabeça e pescoço  N/A ● Amostra de tumor humano, cervical  N/A ● Soro humano GemCell AB, inativado por calor  N/A ● Amostra de tumor humano, Melanoma ● Soro humano GemCell AB, inativado por calor

[002309] Materiais: Preparação CM2 /Dia 11 Semente de REP ● Seringa Luer-Lok, agulha estéril de 60 mL 16G x 3,8 cm, estéril ● Pipetas sorológicas de 50 mL, estéril ● Pipeta sorológica de plástico de1 m, estéril ● Frascos-ampolas Cryotube Nunc com rosca interna, estéril

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● Pipeta sorológica, estéril de 10 mL ● Tubo de centrífuga, 15 mL ● Tubo de centrífuga, 50 mL ● Pipetas, sorológicas 100 mL ● Seringa, 1 cm3, estéril, Luer-Lok ● Seringa 3 mL, ponta Luer-Lok, estéril ● Pipeta sorológica de 5 mL, estéril ● Receptor de unidade de filtro série Nalgene *MF75*, 250mL, estéril ● Receptor de unidade de filtro série Nalgene MF75, 500mL, estéril ● Unidade de filtro descartável estéril de fluxo rápido Nalgene de 1000mL, 0,22 µm PES ● CryoStor CS-10 ● 2-mercaptoetanol 1000X, líquido, 55 mM em D-PBS ● GlutaMAX 1-200 mM (100X), líquido ● Pontas de pipeta estéril de barreira 1.000 µL ART, embalagem individual ● Cassetes VIA1 ● Recipiente de pacote de transferência, 1000 mL com acoplador, estéril ● pacote de transferência 300 mL com acoplador ● Chumaços de álcool estéril ● Conjunto de transferência de fluido de bomba repetidora ● Extremidades de trava Luer macho ● Garrafa de 1L CTS AIM V ● MACS GMP CD3 puro (OKT-3) ● Sulfato de gentamicina, carga de 50mg/mL ● Tubulação de 10,16 cm com pino de perfuração e adaptador

467 / 557 de seringa ● Seringa apenas Luer-Lok 10 mL ● Tubulação, Coletor Luer macho de quatro pontas ● Conjunto de administração de sangue por gravidade tipo HY sem local de injeção, filtro de sangue de 170µm ● Sistema de distribuição de líquido Pumpmatic ● Labtainer 10L bolsa com 3 aberturas ● Sulfato de gentamicina, carga de 50mg/mL Seringa de 100mL ● Bolsa de cultura de 3000mL ● Conector de células Origen CC2 ● Função dupla de tampa de seringa vermelha ● RPMI-1640, garrafa de 1L ● Sistema fechado G-Rex Frasco de 500M ● IL-2 reconstituído ● Células alimentadoras alogênicas irradiadas ● Células alimentadoras alogênicas irradiadas ● Soro humano, tipo AB(HI) Gemini ● Soro humano, tipo AB(HI) Gemini

[002310] Materiais: Preparação CM4 /Dia 16 ● Sering aLuer-Lok, 60 mL estéril ● Pipeta de plástico sorológica de 1 mL, estéril ● Frascos-ampolas Cyrotube Nunc com rosca interna, estéril ● Pipetas sorológicas de 10 mL, estéril ● Tubo de centrífuga, 15mL ● Tubo de centrífuga, 50 mL ● Pipetas, sorológicas 100 mL ● Seringa com Luer-Lock, estéril, 3mL ● Pipeta sorológica de 5 mL, estéril

468 / 557 ● Seringa somente Luer-Lok 10 mL ● Nalgene série *MF75* ● Receptor de unidade de filtro, 250mL, estéril ● GlutaMAX1-200 mM (100X), líquido ● Pontas de pipeta de barreira ART, 1000 µL, embaladas individualmente, estéril ● Cassetes VIA1

[002311] Materiais: CM4 Preparação/Dia 16 ● Recipiente de pacote de transferência, 1000 mL com acoplador, estéril Chumaços de álcool estéril ● Conjunto de transferência de fluido de bomba repetidora Extremidade de trava Luer macho ● CTS AIM-V 1000mL  N/A ● Tubulação de 10,16 cm de conjunto de transferência de plasma com adaptador Luer fêmea ● Seringa estéril de 30mL Luer-Lok ● Bolsa 10L CTS AIM V ● Sistema de distribuição de líquido Pumpmatic ● Bolsa com 3 aberturas de Labtainer 10L ● Função dupla de tampa de seringa Red ● Sistema fechado de frasco G-Rex500M ● IL-2 reconstituído

[002312] Materiais: Dia 22 Formulação, Enchimento, Crioconservação ● Seringa Luer-Lok, 60 mL Estéril ● Agulha 16G x 3,8 cm, estéril ● Pipetas sorológicas de 50 mL, estéril ● Frascos-ampolas Cryotubes Nunc com rosca interna, estéril ● Pipeta sorológica 10 mL, estéril ● Tubo de centrífuga, 15 mL

469 / 557

● Tubo de centrífuga, 50 mL ● Seringa, 1cm3 Estéril, Luer-Lok ● Seringa de 3 mL, ponta Luer-Lok, estéril ● Pipeta sorológica 25 mL, estéril ● Pipeta sorológica 5 mL, estéril ● Seringa apenas Luer-Lok 10 mL ● P-ipetas, sorológicas 100 mL ● Pontas de pipeta estéril de barreira, ART 200 µL embalagem individual ● Cassetes VIA1- • Injeção Plasma-Lyte A de 1L • Conjunto descartável de lavagem de células LOVO • Kit bolsa auxiliar LOVO • Chumaços de álcool estéril • Conjunto de transferência de fluido de bomba repetidora Extremidade de trava Luer macho • Garrafa de 1L CTS AIM V • Albumina humana a 25% • Tubulação de 10,16 cm de conjunto de transferência de plasma com adaptador Luer fêmea • Tubulação, Quatro coletores Luer macho • Administração de sangue por gravidade • Conjunto tipo Y sem local de injeção, filtro de sangue de 170µm • Sistema de distribuição de líquido Pumpmatic • Bolsa com 3 aberturas Labtainer 10L • Seringa de 100mL • Bolsa Cryo CS750 • Bolsa de cultura de 3L

470 / 557 • Conexão de células Origen CC2 • Função dupla de tampa de seringa Red • Cryostor CS10, bolsa de 100mL • Ponta de distribuição, Ventilada • IL-2 reconstituído

8.0 Processo

DESCRIÇÃO DE ETAPAS INFORMAÇÃO DE PROCESSO PRIMÁRIA

[002313] 8.1 Dia 0 Preparação de meio CM1

[002314] 8.1.1 Verificar higienização da sala, liberação de linhas, e materiais. Confirmar higienização da sala,

[002315] 8.1.2 Garantir conclusão da mesa de pré-processamento.

[002316] 8.1.3 Monitoramento ambiental. Antes do processamento, garantir que o monitoramento ambiental do processo foi iniciado.

[002317] 8.1.4 Preparar meio RPMI 1640. No BSC, usando uma pipeta de tamanho apropriado, remover 100,0 mL de 1000 mL de meio RPMI 1640 e colocar em um recipiente de tamanho apropriado rotulado “Resíduo”.

[002318] 8.1.5 No BSC adicionar reagentes à garrafa de meio RPMI

1640. Adicionar os seguintes reagentes à garrafa de meio RPMI 1640 como mostrado na tabela. Registrar volumes adicionados.

[002319] Adicionar quantidade por garrafa: soro AB humano inativado por calor (100,0 mL); GlutaMax (10,0 mL); Sulfato de gentamicina, 50 mg/mL (1,0 mL); 2-mercaptoetanol (1,0 mL)

[002320] 8.1.6 Meio misto. Tampar a garrafa de meio RPMI 1640 de Etapa 8.1,5 e girar o frasco para garantir que os reagentes foram misturados completamente.

[002321] 8.1.7 Filtrar meio RPMI. Filtrar meio RPMI 1640 de Etapa

8.1.6 através de unidade de filtro de 1L 0,22-micron.

[002322] 8.1.8 Rotular meio filtrado. Tampar assepticamente o meio filtrado e rotulado com os seguintes informação.

471 / 557

[002323] 8.1.9 Remover materiais desnecessários do BSC. Passar reagentes do meio do BSC, deixar Sulfato de gentamicina e HBSS em BSC para a preparação de meio de lavagem formulado em Seção8.2.

[002324] 8.1.10 Armazenar consumíveis não usados. Transferir quaisquer restantes reagentes abertos descongelados do meio para condições de armazenamento apropriadas ou descartar no lixo. NOTA: Atribuir a validade aberta apropriada para reagentes do meio por Nota de Processo 5.9 e rotular com número de lote de registro de batelada

[002325] 8.1.11 Descongelar alíquota de IL-2. Descongelar uma alíquota de 1.1 mL de IL-2 (6x106 IU/mL) (BR71424) até que o gelo tenha derretido. Registrar IL-2: Lote # e Validade (NOTA: Assegurar que o rótulo de IL-2 foi anexado).

[002326] 8.1.12 Transferir solução de carga de IL-2 para meio. No BSC, transferir 1,0 mL de solução de carga de IL-2 para a garrafa de meio CM1 Dia 0 preparada em Etapa 8.1.8. Adicionar 1 garrafa de meio CM1 Dia 0 e IL-2 (6x106 IU/mL) 1,0 mL.

[002327] 8.1.13 Misturar e rotular de novo. Tampar e agitar a garrafa para misturar meio contendo IL-2. Rotular de novo como “Meio completo CM1 Dia 0” e atribuir novo número de lote.

[002328] 8.1.14 Meio de amostra por plano de amostra. Remover 20,0 mL de meio usando uma pipeta de tamanho apropriada e distribuir em um tubo cônico de 50mL .

[002329] 8.1.15 Rotular e armazenar. Rotular amostra com rótulo de inventário de plano de amostra e armazenar amostra de “reter meio” a 2-8ºC até submeter a Login para testagem pelo Plano de Amostra.

[002330] 8.1.16 Assinar para Amostragem. Assegurar que a planilha de amostra do LIMS foi preenchida para a remoção da amostra.

[002331] 8.1.17 Preparar tubo cônico com “pedaços de tecido”. Em BSC, transferir 25,0 mL de “Meio completo CM1 Dia 0” (preparado em

472 / 557 Etapa 8.1.13) para o tubo cônico de 50 mL. Rotular o tubo como “Pedaços de Tecido” e número de lote de registro de batelada.

[002332] 8.1.18 Passar G-Rex100MCS em BSC. Passar assepticamente G-Rex100MCS (W3013130) no BSC.

[002333] 8.1.19 Preparar G-Rex100MCS. No BSC, fechar todas as pinças no G- Rex100MCS, deixando aberto a pinça do filtro de ventilação.

[002334] 8.1.20 Preparar G-Rex100MCS. Conectar a linha vermelha de frasco G-Rex100MCS para a extremidade de maior diâmetro do conjunto de transferência de fluido de bomba repetidora (W3009497) via conexão luer.

[002335] 8.1.21 Preparar bomba Baxa. Preparar a bomba Baxa próxima do BSC. Remover seção de tubulação de bomba do conjunto de transferência de fluido de bomba repetidora a partir BSC e instalar na bomba repetidora.

[002336] 8.1.22 Preparar para bombear meio. Dentro do BSC, remover a seringa do sistema de distribuição de líquido Pumpmatic (PLDS) (W3012720) e descartar. NOTA: Assegurar a garantia de não comprometer a esterilidade da pipeta de PLDS.

[002337] 8.1.23 Preparar para bombear meio. Conectar pipeta de PLDS na extremidade de diâmetro menor do conjunto de transferência de fluido de bomba repetidora via conexão luer e colocar ponta da pipeta em “Meio completo CM1 Dia 0” (preparado em Etapa 8.1.13) para aspiração.

[002338] Abrir todas os grampos entre o meio e G-Rex100MCS.

[002339] 8.1.24 Bombear meio CM1 completo em frasco G- Rex100MCS. Ajustar a velocidade da bomba para “alto” e “9” e bombear todo o meio completo CM1 Dia 0 no frasco G-Rex100MCS. Uma vez que todos os meios foram transferidos, limpar a linha e parar a bomba.

[002340] 8.1.25 Desconectar a bomba do frasco. Assegurar que todas os grampos foram fechados no frasco, exceto filtro de ventilação. Remover o conjunto de transferência de fluido de bomba repetidora da linha vermelha do meio, e colocar uma tampa vermelha (W3012845) sobre a linha vermelha do

473 / 557 meio.

[002341] 8.1.26 Aquecer a vedação. Remover o frasco G-Rex100MCS do BSC, aquecer a vedação (por Nota de Processo 5.12) fora da tampa vermelha da linha vermelha próxima do luer terminal.

[002342] 8.1.27 Rotular G-Rex100MCS. Rotular o frasco G- Rex100MCS com QA fornecido com o rótulo ‘Dia 0’ em processo. Fixar amostra de rótulo “Dia 0” abaixo.

[002343] 8.1.28 Monitorar Incubador. Parâmetros do incubador: Tela LED de temperatura: 37,0±2,0 ºC; Porcentagem de CO2: 5,0±1,5 %CO2

[002344] 8.1.29 Aquecer meio. Colocar o tubo cônico de 50mL rotulado “Fragmentos de Tecido” preparado em Etapa 8.1.17 e o G-Rex100MCS preparado em Etapa 8.1.27 em Incubador durante ≥ 30 minutos de aquecimento.

[002345] Registrar vezes de aquecimento abaixo. Registrar se tempo de aquecimento foi ≥ 30 minutos (Sim/Não). [Fragmentos de Tecido Cônico ou GRex100MCS]

[002346] 8.1.30 Rever Seção 8.1.

[002347] 8.2 Dia 0 Preparação de meio de lavagem de tumor

[002348] 8.2.1 Adicionar Gentamicina a HBSS. No BSC, adicionar 5,0 mL Gentamicina (W3009832 ou W3012735) a garrafa de 1 x 500 mL meio HBSS (W3013128). Registrar volumes. Adicionar por garrafa: HBSS (500,0 mL); Sulfato de gentamicina, 50 mg/ml (5,0 mL)

[002349] 8.2.2 Tampar a garrafa HBSS e agitar. Tampar HBSS contendo gentamicina preparada em Etapa 8.2.1 e agitar garrafa para assegurar que os reagentes sejam misturados completamente.

[002350] 8.2.3 Filtrar solução. Filtrar HBSS contendo gentamicina preparada em Etapa 8.2.1 através de uma unidade de filtro de 1L 0,22-micron (W1218810).

[002351] 8.2.4 Tampar assepticamente o meio filtrado e rotular. Tampar

474 / 557 assepticamente o meio filtrado e rotular com a seguinte informação. Prosseguir para SEÇÃO 8.3.

[002352] 8.2.5 Rever Seção 8.2.

[002353] 8.3 Processamento de tumor Dia 0

[002354] 8.3.1 Obter Tumor. Obter espécime de tumor de QAR e transferir na suite a 2-8ºC imediatamente para processamento. Assegurar que toda a informação necessária é gravada no registro de expedição do tumor do lote.

[002355] 8.3.2 Registrar informação do tumor.

[002356] 8.3.3 Fixar etiqueta no tumor. Anexar fixação do tumor. etiqueta de liberação de QAR abaixo. Anexar registro de expedição do tumor do lote como #5.

[002357] 8.3.4 Passar adiante os materiais necessários para dissecação de tumor no BSC.

[002358] 8.3.5 Abrir Materiais. Abrir todos os materiais dentro do BSC, garantindo não comprometer a esterilidade dos itens.

[002359] 8.3.6 Rotular Materiais. Rotular três tubos cônicos de 50ml: o primeiro como “Fórceps,” o segundo como “Bisturi,” e o terceiro como “Meio fresco de lavagem de tumor”. Rotular discos de petri 5 x 100 mm como “Lavagem 1,” “Lavagem 2,” “Lavagem 3,” “Fixação,” e “Desfavorável.” Rotular uma placa de 6 cavidades como “Fragmentos intermediários favoráveis.”

[002360] 8.3.7 Dividir em alíquotas meio de lavagem de tumor. Usando uma pipeta de tamanho apropriado, transferir 5,0 mL de “meio de lavagem de tumor” preparado em Etapa 8.2.4 em cada cavidade de uma placa de 6 cavidades para fragmentos de tumor intermediários favoráveis (30,0 mL total). NOTA: Os fórceps e bisturis foram armazenados em seus tubos cônicos de meio de lavagem de tumor respectivos, como necessário, durante a lavagem do tumor e processos de dissecação.

475 / 557

[002361] 8.3.8 Dividir em alíquotas meio de lavagem de tumor. Usando uma pipeta de tamanho apropriado, transferir 50,0 mL de “meio de lavagem de tumor” preparado em Etapa 8.2.4 em cada disco de Petri de 100 mm para “Lavagem 1,” “Lavagem 2,” “Lavagem 3,” e “Retenção” (200,0 mL no total).

[002362] 8.3.9 Dividir em alíquotas o meio de lavagem de tumor. Usando uma pipeta de tamanho apropriado, transferir 20,0 mL de “meio de lavagem de tumor” preparado em Etapa 8.2.4 em cada um dos tubos cônicos de 50 mL (60,0 mL total).

[002363] 8.3.10 Preparar tampas para pedaços de tumor. Remover assepticamente as tampas das duas placas de 6 cavidades. As tampas foram usadas para pedaços de tumor selecionados. NOTA: Em todo o processamento do tumor, NÃO houve cruzamento de placas de cultura de tecidos abertas e tampas.

[002364] 8.3.11 Passar o tumor no BSC. Passar assepticamente o tumor no BSC. Registrar tempo de início do processamento.

[002365] 8.3.12 Lavar tumor 1 usando fórceps de 20 cm (W3009771), remover o tumor da garrafa de espécime e transferir para o disco de “Lavagem 1” preparado em Etapa 8.3.8.

[002366] NOTA: Reter a solução na garrafa de espécime.

[002367] 8.3.13 Lavar tumor 1 usando fórceps, tempo de lavagem suave do tumor do cronômetro abaixo: espécime e deixar agitar durante ≥ 3 minutos. Registrar tempo de lavagem (MM:SS).

[002368] 8.3.14 Preparar amostra de Biocarga por Plano de amostra. Transferir 20,0 mL (ou volume disponível) de solução da garrafa de espécime de tumor em um tubo cônico de 50mL por plano de amostra.

[002369] 8.3.15 Rotular e armazenar amostra. Rotular com rótulo de inventário de plano de amostra e armazenar a amostra de biocarga coletada em Etapa 8.3.14 a 2-8ºC até ser submetida a teste.

[002370] 8.3.16 Assinar para amostragem. Assegurar que a planilha de

476 / 557 amostra do LIMS foi preenchida para a remoção da amostra.

[002371] 8.3.17 Lavagem de Tumor 2. Usando um novo conjunto de fórceps remover o tumor do disco de “Lavagem 1” e transferir para o disco de “Lavagem 2” preparado em Etapa 8.3.8.

[002372] 8.3.18 Lavagem de Tumor 2. Usando fórceps, lavar o espécime de tumor por agitação suave durante ≥ 3 minutos e deixar assentar. Registrar tempo.

[002373] 8.3.19 Preparar gotas de meio de lavagem de tumor para pedaços de tumor desejadas. Usando uma pipeta de transferência, colocar 4 gotas individuais de meio de lavagem de tumor do tubo cônico preparado em Etapa 8.3.9 em cada um dos 6 círculos sobre as tampas não viradas das placas de 6 cavidades (2 tampas). Colocar uma gota extra em dois círculos para um total de 50 gotas.

[002374] 8.3.20 Lavagem de tumor 3. Usando fórceps, remover o tumor do disco de “Lavagem 2” e transferir para o disco de “Lavagem 3” preparado em Etapa 8.3.8.

[002375] 8.3.21 Lavagem de tumor 3. Usando fórceps, lavar o espécime de tumor por agitação suave e deixar assentar durante ≥ 3 minutos. Registrar tempo.

[002376] 8.3.22 Preparar o disco de dissecação de tumor. Colocar uma régua sob 150 mm da tampa do disco.

[002377] 8.3.23 Transferir tumor para disco de dissecação. Usando fórceps, assepticamente transferir espécime de tumor para a tampa do disco de dissecação de 150 mm.

[002378] 8.3.24 Medir Tumor. Dispor todos os pedaços de espécime de tumor ponta a ponta e registrar comprimento global aproximado e número de fragmentos. Tirar uma foto clara de cada amostra de tumor.

[002379] 8.3.25 Avaliar Tumor. Avaliar o tumor for tecido necrótico/gorduroso. Avaliar se > 30% de área de tumor completa observada

477 / 557 como sendo tecido necrótico e/ou gorduroso; se afirmativo, contatar controle de área para assegurar que o tumor era de tamanho apropriado, então prosseguir para Etapa 8.3.26. Avaliar se < 30% de área de tumor completa foram observados como sendo tecido necrótico ou gorduroso; se afirmativo, prosseguir para Etapa 8.3.27 e dissecação de limpeza NÃO foi realizada.

[002380] 8.3.26 Se aplicável: Dissecação de limpeza. Se tumor era grande e se >30% de tecido exterior foi observado como sendo necrótico/gorduroso, realizar “dissecação de limpeza” removendo tecido necrótico/gorduroso enquanto conservando a estrutura interna do tumor usando uma combinação de Bisturi e/ou fórceps. NOTA: Para manter a estrutura interna do tumor, usar somente pressão de corte vertical. Não cortar em um movimento de serra com bisturi. NOTA: Tecido gorduroso, necrótico, e estranho foi colocado em um disco não favorável.

[002381] 8.3.27 Dissecar o tumor usando uma combinação de bisturi e/ou fórceps, cortar o espécime de tumor em fragmentos regulares de tamanho apropriado, (até 6 fragmentos intermediários). NOTA: Para manter a estrutura interna do tumor, usar somente pressão de corte vertical. Não cortar em um movimento de serra com bisturi NOTA: Assegurar de manter intermediários de fragmento não dissecados completamente submersos no “meio de lavagem de tumor” (preparado em Etapa 8.2.4).

[002382] 8.3.28 Transferir fragmento intermediários de tumor. Transferir cada fragmento intermediário para o disco de “fixação” de Etapa

8.3.8.

[002383] 8.3.29 Dissecar fragmentos de tumor. Manipular um fragmento intermediário de cada vez, dissecar o fragmento intermediário do tumor na placa de dissecação em pedaços de aproximadamente 3x3x3mm em tamanho, minimizando a quantidade de tecidos hemorrágicos, necróticos e/ou gordurosos em cada pedaço. NOTA: Para manter a estrutura interna do tumor, usar apenas pressão de corte vertical. Não cortar em um movimento de serra

478 / 557 com bisturi.

[002384] 8.3.30 Selecionar pedaços de tumor. Selecionar até oito (8) pedaços de tumor sem tecido hemorrágico, necrótico, e/ou gorduroso tecido. Usar a régua para referência. Continuar dissecação até 8 pedaços favoráveis terem sido obtidos, ou o fragmento intermediário ter sido dissecado. Transferir cada pedaço selecionado em uma das gotas de “meio de lavagem de tumor” preparado em Etapa 8.3.19.

[002385] 8.3.31 Armazenar fragmentos intermediários para evitar secagem. Após selecionar (8) pedaços do fragmento intermediário, colocar os restantes do fragmento intermediário em uma nova cavidade da placa de 6 cavidades de “Fragmentos intermediários favoráveis” preparada em Etapa

8.3.7. NOTA: tecido gorduroso ou necrótico foi colocado no disco de “Desfavorável” (preparado em etapa 8.3.6).

[002386] 8.3.32 Repetir dissecação de fragmento intermediário. Prosseguir para próximo fragmento intermediário, repetir Etapas 8.3.29-

8.3.31 até todos os fragmentos intermediários serem processados, obtendo bisturis e fórceps novos, como necessário.

[002387] 8.3.33 Determinar número de pedaços coletados. Se desejável que permaneça mais tecido, selecionar pedaços de tumor favoráveis adicionais da placa de 6 cavidades de “fragmentos intermediários favoráveis” para encher as gotas com um máximo de 50 pedaços. Registrar o número total de pedaços dissecados criados. NOTA: Garantir manter os fragmentos intermediários de tumor hidratados com meio de lavagem como necessário durante toda a dissecação. Registrar quantidade total de pedaços dissecados coletados.

[002388] 8.3.34 Remover tubo cônico do incubador. Remover o tubo cônico com “pedaços de tecido” de 50mL do incubador. Registrar tempo em Etapa 8.1.29. Assegurar tubo cônico foi aquecido durante ≥30 min.

[002389] 8.3.35 Preparar tubo cônico. Passar no tubo cônico “Pedaços

479 / 557 de Tecido” de 50mL em BSC, garantindo não comprometer a esterilidade das superfícies de processamento abertas.

[002390] 8.3.36 Transferir pedaços de tumor para o tubo cônico de 50mL. Usando a pipeta de transferência, bisturi, fórceps ou combinação, transferir os melhores 50 fragmentos de tumor selecionados das tampas de disco favorável para o tubo cônico de 50 mL “Pedaços de Tecido”.

[002391] NOTA: Se um pedaço de tumor foi deixado cair durante a transferência e restou tecido desejável, pedaços adicionais das cavidades de fragmento de tumor intermediário favorável foram adicionados. Registrar números de pedaços.

[002392] 8.3.37 Preparar BSC para G- REX100MCS. Remover todos os itens desnecessários de BSC para a semeadura do vaso, retendo as placas de tecido favorável se elas contiverem fragmentos extra.

[002393] 8.3.38 Remover G-REX100MCS do incubador. Remover G- Rex100MCS contendo meio do incubador. Completar Etapa 8.1.29.

[002394] 8.3.39 Passar frasco em BSC. Passar assepticamente o frasco G-Rex100MCS frasco no BSC. NOTA: Quando transferindo o frasco, não segurar na tampa ou no fundo do vaso. Transferir o vaso manipulando os lados. NOTA: Somente usar LENÇOS IPA quando manipulando os frascos G-Rex.

[002395] 8.3.40 Adicionar fragmentos de tumor ao frasco G- Rex100MCS. No BSC, levantar a tampa do frasco G-Rex100MCS, garantindo que a esterilidade da tubulação interna foi mantida.

[002396] Agitar o tubo cônico com pedaços de tumor para colocar em suspensão e rapidamente despejar os conteúdos no frasco G-Rex100MCS.

[002397] 8.3.41 Distribuir uniformemente os pedaços. Assegurar que os pedaços do tumor foram distribuídos uniformemente pela membrana do frasco. Inclinar suavemente o frasco para frente e para trás, se necessário, para distribuir uniformemente os pedaços do tumor.

480 / 557

[002398] 8.3.42 Registrar número total de fragmentos de tumor no vaso. Registrar número de fragmentos de tumor na membrana inferior do vaso e número de observados a flutuar no vaso. NOTA: Se o número de fragmentos semeados NÃO for equivalente ao número de coletados na Etapa 8.3.36H, contatar a Gerência de Área e documentar na Seção 10.0.

[002399] 8.3.43 Incubar frasco G-Rex Incubar G-Rex100MCS nos seguintes parâmetros: incubar frasco G-Rex : Tela LED de temperatura: 37,0±2,0 ºC; Porcentagem de CO2: 5,0±1,5 %CO2

[002400] 8.3.44 Calcular janela de incubação. Realizar cálculos para determinar o tempo apropriado para remover incubador G-Rex100MCS em Dia 11. Cálculos: Tempo de incubação; limite inferior = tempo de incubação + 252 horas; limite superior = tempo de incubação + 276 horas

[002401] 8.3.45 Monitoramento ambiental. Após o processamento, verificar se BSC e monitoramento do pessoal foram realizados.

[002402] 8.3.46 Descartar materiais. Armazenar o restante do meio não aquecido a 2-8°C e rotular. Após o processo estar completo, descartar qualquer meio aquecido restante e descongelar alíquotas de IL-2.

[002403] 8.3.47 Submeter amostra. Assegurar que todas as amostras Dia 0 foram submetidas a Login e transferir em LIMS.

[002404] 8.3.48 Rever Seção 8.3.

[002405] 8.4 Dia 11 – Preparação de meio

[002406] 8.4.1 Verificar sala, higienização, liberação de linha e materiais. Confirmar a higienização da sala, liberação da linha e que os materiais estão dentro do prazo de validade

[002407] 8.4.2 Mesa de pré-processamento. Lista de equipamentos: BSC; Balança; Selator de tubo Sebra;; Dispositivo de remoção de meio e recuperação de células GatherexTM; garantir que o cartaz fornecido pelo controle QA seja colocado no BSC apropriado; garantir que o número do lote do cartaz fornecido pelo controle QA e a exibição da ID do paciente

481 / 557 correspondam ao número do lote e à ID do paciente neste registro de batelada.

[002408] 8.4.3 Monitorar Incubador. Monitorar incubador. Parâmetros do incubador: Tela LED de temperatura: 37,0±2,0 ºC; Porcentagem de CO2: 5,0±1,5 % CO2. NOTA: Seção 8.4 pode ocorrer simultaneamente com seção

8.5.8.4.4 Aquecer meio. Aquecer garrafas 3x 1000 mL de meio RPMI 1640 (W3013112) e garrafas 3x 1000 mL de AIM-V (W3009501) em um Incubador durante ≥ 30 minutos. Registrar tempo. Meio: RPMI 1640 e AIM- V. NOTA: Colocar uma garrafa adicional de 1x1000 ml de meio AIM-V (W3009501) em temperatura ambiente para uso na Etapa 8.5.34. Rotular a garrafa “para diluições de contagem de células apenas” e o número de lote de registro de batelada.

[002409] 8.4.5 Monitoramento ambiental. Antes do processamento, assegurar que o monitoramento ambiental pré-processo foi realizados como por SOP-00344.

[002410] 8.4.6 Remover meio RPMI 1640 do incubador. Remover o meio RPMI 1640 quando o tempo foi alcançado. Registrar o final do tempo de incubação em Etapa 8.4.4. Assegurar que o meio foi aquecido durante ≥30 min.

[002411] 8.4.7 Preparar meio RPMI 1640. No BSC, remover 100,0 mL de cada uma das três garrafas de 1000 mL de meio RPMI 1640 pré-aquecido e colocar em um recipiente de tamanho apropriado rotulado “Resíduo”.

[002412] 8.4.8 Em BSC, adicionar reagentes à garrafa de meio RPMI

1640. No BSC adicionar os seguintes reagentes a cada uma das três garrafas de meio RPMI 1640. Registrar volumes adicionados a cada garrafa. Soro humano GemCell, inativado por calor Tipo AB (100,0 mL), GlutaMax (10,0 mL), Sulfato de gentamicina, 50 mg/ml (1,0 mL), 2-mercaptoetanol (1,0 mL)

[002413] 8.4.9 Filtrar o meio. Tampar as garrafas da Etapa 8.4.8 e agitar para assegurar que os reagentes foram misturados completamente. Filtrar cada

482 / 557 garrafa de meio através de uma unidade de filtro separada de 1L 0,22-micron

[002414] 8.4.10 Rotular meio filtrado. Tampar assepticamente o meio filtrado e rotular cada garrafa com meio CM1 Dia 11.

[002415] 8.4.11 Descongelar alíquota de IL-2. Descongelar alíquotas 3 x 1,1mL de IL-2 (6x106 IU/mL) (BR71424) até todo o gelo ter derretido. Registrar o lote de IL 2 # e validade.

[002416] NOTA: Assegurar que o rótulo do IL-2 foi fixado.

[002417] 8.4.12 Remover meio AIM-V do incubador. Remover as três garrafas de meio AIM-V do incubador. Registrar tempo de incubação final na Etapa 8.4.4. Assegurar que o meio foi aquecido durante ≥ 30 minutos.

[002418] 8.4.13 Adicionar IL-2 a AIM-V. No BSC, usando uma micropipeta, adicionar 3,0mL de IL-2 descongelado em uma garrafa de 1L de meio AIM-V pré-aquecido. Enxaguar a ponta da micropipeta com meio depois de distribuir IL-2. Usar uma nova micropipeta estéril para cada alíquota. Registrar o volume total adicionado. Rotular a garrafa como “AIM- V Contendo IL-2”.

[002419] 8.4.14 Transferir materiais. Assepticamente transferir uma bolsa Labtainer 10L e conjunto de transferência de bomba repetidora no BSC.

[002420] 8.4.15 Preparar bolsa de meio Labtainer de10L. Fechar todas as linhas na bolsa Labtainer de 10L. Anexar a extremidade de tubo de diâmetro maior do conjunto de transferência da bomba repetidora para a abertura fêmea do meio da bolsa Labtainer de 10L via conexão de trava luer.

[002421] 8.4.16 Preparar bomba Baxa. Escalonar a bomba Baxa próxima do BSC. Alimentar a tubulação do conjunto de transferência através de bomba Baxa situada fora do BSC. Ajustar a Bomba Baxa para “alto” e “9”.

[002422] 8.4.17 Preparar Bolsa de meio Labtainer de10L. Em BSC, remover seringa do sistema de distribuição de líquido Pumpmatic (PLDS) e descartar. NOTA: Assegurar a garantia de não comprometer a esterilidade da pipeta de PLDS.

483 / 557

[002423] 8.4.18 Preparar Bolsa de meio Labtainer de 10L. Conectar pipeta de PLDS para extremidade de menor diâmetro de conjunto de transferência de fluido de bomba repetidora via conexão luer e colocar a ponta da pipeta em garrafa de IL-2 contendo meio AIM-V (preparada em Etapa

8.4.13) para aspiração. Abrir todos os grampos entre garrafa de meio e Labtainer 10L.

[002424] 8.4.19 Bombear meio em Labtainer 10L. No BSC, usando o PLDS, transferir meio AIM-V pré-aquecido contendo IL-2 preparado em Etapa 8.4.13, assim como duas garrafas de AIM-V adicionais na bolsa Labtainer de 10L. Adicionar as três garrafas de meio CM1 filtrado Dia 11 para Etapa 8.4.10. Após adição de garrafa final, limpar a linha para a bolsa. NOTA: Parar a bomba entre adição de cada garrafa de meio.

[002425] 8.4.20 Remover Pumpmatic da bolsa Labtainer. Remover PLDS do conjunto de transferência e colocar uma tampa vermelha no luer da linha no BSC.

[002426] 8.4.21 Misturar meio. Massagear suavemente a bolsa para misturar.

[002427] 8.4.22 Rotular meio. No BSC, rotular a bolsa de meio com a seguinte informação. Data de validade foi de 24 horas a partir da data de preparação

[002428] 8.4.23 Meio de amostra por plano de amostra. No BSC, anexar a uma seringa de 60mL a abertura fêmea disponível da bolsa de “meio completo CM2 Dia 11” preparada em etapa 8.4.22. Remover 20.0mL de meio e colocar no tubo cônico de 50mL. Colocar uma tampa vermelha na abertura fêmea de bolsa de “meio completo CM2 Dia 11”

[002429] 8.4.24 Rotular e armazenar amostra. Rotular com rótulo de inventário de plano de amostra e armazenar a amostra de retenção de meio a 2-8ºC até submeter a Login para teste.

[002430] 8.4.25 Assinalar para amostragem. Assegurar que a planilha de

484 / 557 amostra do LIMS foi preenchida para a remoção da amostra.

[002431] 8.4.26 Vedar a linha do conjunto de transferência. Fora do BSC, termosselar (por Nota de Processo 5.12) a tampa vermelha na linha do conjunto de transferência, fechar a tampa vermelha. Manter o conjunto de transferência na bolsa.

[002432] 8.4.27 Preparar tubos de diluição de contagem de células no BSC, adicionar 4,5mL de meio AIM-V que foi rotulado com “para diluições de contagem de células” e número de lote para quatro tubos cônicos de 15mL. Rotular os tubos com o número de lote e número de tubo (1-4). Rotular 4 criofrascos-ampolas “Alimentadora” e número de frasco-ampola (1-4). Manter frascos-ampolas sob BSC a ser usado em Etapa 8.5.30.

[002433] 8.4.28 Transferir reagentes do BSC a 2-8°C. Transferir quaisquer restantes 2-mercaptoetanol, GlutaMax, e soro humano do BSC a 2- 8°C. Assegurar que todos os reagentes foram rotulados com o número de lote de registro de batelada, e a validade aberta apropriada por Nota de Processo

5.9.

[002434] 8.4.29 Preparar pacote de transferência de 1L. Fora do BSC, soldar (por Nota de Processo 5.11) o pacote de transferência de IL para o conjunto de transferência anexado à bolsa de “Meio CM2 dia 11 completo” preparada em etapa 8.4.22. Rotular pacote de transferência como “meio CM2 de células alimentadoras” e número de lote.

[002435] 8.4.30 Preparar pacote de transferência de IL. Fazer uma marca na tubulação na tubulação do pacote de transferência 1L alguma polegadas afastado da bolsa. Colocar o pacote de transferência vazio na graduação de modo que tubulação estava na graduação no ponto da marca.

[002436] 8.4.31 Tarar a graduação. Tarar a graduação e deixar o pacote de transferência vazio na graduação.

[002437] 8.4.32 Preparar pacote de transferência de células alimentadoras. Ajustar a bomba Baxa para “médio” e “4.” Bombear 500.0

485 / 557 ±5,0mL de meio “CM2 completo Dia 11” preparado em Etapa 8.4.22 no pacote de transferência de “meio CM2 de células “. Medir por peso e registrar o volume de meio CM2 completo adicionado ao pacote de transferência.

[002438] 8.4.33 Aquecer a linha de vedação. Uma vez cheia, aquecer a linha de vedação por Nota de Processo 5.12. Separar a Bolsa de meio CM2 dia 11 com conjunto de transferência do pacote de transferência de meio de célula alimentadora, manter a solda para pacote de transferência de 1L.

[002439] 8.4.34 Se aplicável: Incubar pacote de transferência de meio de célula alimentadora. Quando aplicável, colocar o pacote de transferência de “meio CM2 de células alimentadoras” em incubador até usar em Etapa 8.6.6.

[002440] 8.4.35 Incubar Meio CM2 dia 11 completo. Colocar “Meio CM2 dia 11 completo” preparado em Etapa 8.4.22 em Incubador até usar em Etapa 8.7.2.

[002441] 8.4.36 Rever Seção 8.4.

[002442] 8.5 Dia 11 - Colheita de TILs

[002443] 8.5.1 Tabela de reprocessamento. Monitorar incubador. Parâmetros do incubador: Tela LED de temperatura: 37,0±2,0 ºC; Porcentagem de CO2: 5,0±1,5 %CO2.

[002444] NOTA: Seção 8.5 pode estar funcionando simultaneamente com Seções 8.4 e 8.6.

[002445] 8.5.2 Remover G-Rex100MCS do incubador. Realizar verificação abaixo para assegurar parâmetros de incubação são atendidos antes da remoção de G-Rex100MCS do incubador. Limite inferior da Etapa

8.3.44 B. Limite superior da Etapa 8.3.44 C.

[002446] Registrar tempo de remoção do incubador. Determinar: Será

8.3.44 B ≤ tempo de remoção do incubador < Etapa 8.3.44 C? *CASO NEGATIVO, CONTATAR GERÊNCIA DE ÁREA. Cuidadosamente remover G-Rex100MCS do incubador e assegurar que todos os grampos foram fechados, exceto a linha de filtro grande. Registrar tempo de início do

486 / 557 processamento.

[002447] 8.5.3 Preparar pacote de transferência de 300mL. Rotular um pacote de transferência de 300ML como “suspensão de TILs”.

[002448] 8.5.4 Preparar pacote de transferência de 300mL. Soldar de modo estéril (por Nota de Processo 5.11) a transferência da suspensão de TILs (linha única) de um filtro de sangue por gravidade. Ver, por exemplo, Figura 129.

[002449] 8.5.5 Preparar pacote de transferência de 300mL. Colocar o pacote de transferência de 300 mL em uma balança e registrar o peso seco.

[002450] 8.5.6 Preparar pacote de transferência de IL. Rotular pacote de transferência de IL como “Sobrenadante” e Número de lote.

[002451] 8.5.7 Soldar pacote de transferências para G-Rex100MCS. Soldar de modo estéril (por Nota de Processo 5.11) a linha de remoção de meio vermelha do G-Rex100MCS com o pacote de transferência de “Sobrenadante”. Soldar de modo estéril a linha de remoção de células limpas do G-Rex100MCS para uma das duas linhas de pico no topo do filtro de sangue conectado à pacote de transferência de “suspensão de TILs” preparado em Etapa 8.5.4. Ver, por exemplo, Figura 130.

[002452] 8.5.8 Configuração de GatheRex. Colocar G-Rex100MCS no lado à esquerda do GatheRex e os pacotes de transferência de “Sobrenadante” e “suspensão de TILs” no lado à direita.

[002453] 8.5.9 Configuração de GatheRex. Instalar a linha de remoção de meio vermelha do G Rex100MCS para o grampo de topo (marcado com uma linha vermelha) e guias de tubulação no GatheRex. Instalar a linha de colheita limpa do G-Rex100MCS para o grampo de fundo (marcado com uma linha azul) e guias de tubulação no GatheRex.

[002454] 8.5.10 Configuração de GatheRex. Anexar a linha de gás a partir do GatheRex para o filtro estéril do frasco G-Rex100MCS. NOTA: Antes de remover o sobrenadante a partir do frasco G-Rex100MCS, assegurar

487 / 557 que todos os grampos das linhas de remoção de células foram fechados.

[002455] 8.5.11 Redução de volume de G-Rex100MCS. Transferir ~900 mL de sobrenadante de cultura a partir do G-Rex100MCS para o pacote de transferência de 1L visualmente inspecionar frasco de G-Rex100MCS para assegurar que o frasco está nivelado e meio foi reduzido para o final do tubo de imersão de aspiração. NOTA: Se o Gatherex parar prematuramente, ele foi reiniciado pressionando o botão com a seta apontando para a direita novamente.

[002456] 8.5.12 Preparar o frasco para colheita de TILs. Após remoção do sobrenadante, fechar todas as pinças para a linha vermelha.

[002457] 8.5.13 Início de Colheita de TILs. Registrar o tempo de partida da colheita de TILs.

[002458] 8.5.14 Início de colheita de TILs. Vigorosamente bater no frasco e agitar o meio para liberar as células. Realizar uma inspeção do frasco para assegurar que todas as células se soltaram. NOTA: Contatar gerência de área se células não se soltarem.

[002459] 8.5.15 Início de colheita de TILs. Inclinar o frasco para longe do tubo de coleta e permita que os pedaços do tumor se acomodem ao longo da borda. Inclinar lentamente o frasco em direção ao tubo de coleta, de forma que as peças permaneçam no lado oposto do frasco. NOTA: Se o canudo de coleta de células não estiver na junção da parede com a membrana inferior, bater o frasco enquanto inclinado em um ângulo de 450 é geralmente suficiente para posicionar corretamente o canudo.

[002460] 8.5.16 Coletar TILs. Liberar todos os grampos levando ao pacote de transferência de suspensão de TILs.

[002461] 8.5.17 Coletar TILs. Usando o GatheRex, transferir a suspensão de células através de filtro de sangue no pacote de transferência de 300 mL. NOTA: Garantir manter a borda inclinada até que todas as células e meio sejam coletados.

488 / 557

[002462] 8.5.18 Coletar TILs. Inspecionar membrana para células aderentes.

[002463] 8.5.19 Enxaguar membrana do frasco. Enxaguar o fundo do G- Rex100MCS. Cobrir ~ 1/4 da membrana de troca gasosa com meio de enxágue. NOTA: Se pedaços de tumor obstruírem a linha de coleta, pause a coleta pressionando o “X” na linha de coleta de células. Pressionar o botão “Soltar grampos” no Gatherex e pegar o pacote de transferência e apertar suavemente com pressão crescente até que o fragmento seja removido. Não aperte a bolsa com muita força, pois isso pode causar a ruptura da linha ou da bolsa. Retomar a coleta assim que a obstrução for removida.

[002464] 8.5.20 Fechar os grampos no G-Rex100MCS. Assegurar que todos os grampos estão fechados.

[002465] 8.5.21 Termosselar. Termosselar (por Nota de Processo 5.12) a suspensão de pacote de transferência de TILs tão próximo da solda como possível de modo que o comprimento global da tubulação permaneça aproximadamente igual.

[002466] 8.5.22 Termosselar. Termosselar o pacote de transferência de “Sobrenadante” por Nota de Processo 5.12. Manter linha suficiente para soldar.

[002467] 8.5.23 Calcular volume de suspensão de TILs. Registrar peso de suspensão de pacote de transferência de TILs e calcular o volume da suspensão de células.

[002468] 8.5.24 Preparar pacote de transferência de sobrenadante por Amostragem. Soldar (por Nota de Processo 5.11) um conjunto de transferência de plasma de 10,15 cm no pacote de transferência de “sobrenadante”, retendo a conexão luer no conjunto de transferência de plasma de 10,15 cm, e transferir no BSC.

[002469] 8.5.25 Preparar suspensão de pacote de transferência de TILs para amostragem. Soldar (por Nota de Processo 5.11) a conjunto de

489 / 557 transferência de plasma de 10,15 cm para o pacote de transferência de 300mL de “suspensão de TILs” , retido pela conexão luer no conjunto de transferência de plasma de 10,15 cm, e transferir no BSC.

[002470] 8.5.26 Puxar amostra Bac-T. No BSC, usando uma seringa apropriadamente dimensionada, puxar aproximadamente 20,0 mL de sobrenadante a partir do pacote de transferência de “sobrenadante” de 1L e distribuir em um tubo cônico estéril de 50mL Rotular “Bac-T.” Manter em BSC para uso em Etapa 8.5.27.

[002471] 8.5.27 Inocular BacT por Plano de amostra. Remover uma amostra de 1,0 mL a partir do tubo cônico de 50mL rotulado BacT preparado em Etapa 8.5.26 usando uma seringa apropriadamente dimensionada e inocular a garrafa anaeróbica. Registrar o tempo que a garrafa foi inoculada usando o espaço provido no rótulo da garrafa. Repetir o acima para a garrafa aeróbica. NOTA: Esta etapa pode ser realizada fora de sequência.

[002472] 8.5.28 Rotular e armazenar amostra. Rotular com rótulo de inventário de plano de amostra e armazenar a amostra de Bac-T em temperatura ambiente, proteger da luz, até submeter a Login para testagem pelo Plano de Amostra. NOTA: Não cobrir o código de barras no frasco com rótulo.

[002473] 8.5.29 Assinar para Amostragem. Assegurar que a planilha de amostra do LIMS foi preenchida para a remoção da amostra.

[002474] 8.5.30 Amostras de contagem de células de TILs. Rotular 4 criofrascos-ampolas com número de frasco-ampola (1-4).

[002475] Usando seringas de 3mL separadas, puxar amostras de contagem de células de 4x1,0mL do pacote de transferência de suspensão de TILs usando a conexão luer, e colocar em respectivos criofrascos-ampolas.

[002476] 8.5.31 Fechar a conexão luer. Colocar uma tampa vermelha (W3012845) na linha.

[002477] 8.5.32 Incubar TIL. Colocar pacote de transferência de TIL em

490 / 557 incubador até necessário.

[002478] 8.5.33 Realizar contagens de células. Realizar contagens de células e cálculos utilizando NC-200 e a nota de processo 5.14. Realizar contagens iniciais de células não diluídas.

[002479] 8.5.34 Registrar volumes de amostra de contagem de células. NOTA: Se nenhuma diluição for necessária, “Amostra [µL]” = 200, “Diluição [µL]” = 0.

[002480] 8.5.35 Determinar fator de multiplicação. volume de amostra de contagem de células totais: 8.5.34A + 8.5.34B. fator de multiplicação C ÷

8.5.34A.

[002481] 8.5.36 Selecionar protocolos e inserir fatores de multiplicação. Assegurar que o protocolo do “ensaio de contagem de células viáveis” tiver sido selecionado, todos os fatores de multiplicação, e volumes de amostra e diluente foram inseridos. NOTA: Se não for necessária diluição, inserir “Amostra [µL]” = 200, “Diluição [µL]” = 0

[002482] 8.5.37 Registrar nome de arquivo, viabilidade e contagens de células de Nucleoview

[002483] 8.5.38 Determinar a média de concentração de células viáveis e viabilidade das contagens de células realizadas. Viabilidade (8.5.37A +

8.5.37B) ÷ 2. Concentração de células viáveis (8.5.37C + 8.5.37D) ÷ 2

[002484] 8.5.39 Determinar Limite superior e inferior para contagens. Limite inferior: 8.5.38F x 0,9. Limite superior: 8.5.38F x 1,1

[002485] 8.5.40 Estavam ambas as contagens dentro de limites aceitáveis? Limite inferior: 8.5.37 C e D ≥ 8.5.39G. Limite superior: 8.5.37 C e D ≤ 8.5.39H. *Se um dos resultados foi “Não” realizar segundo conjunto de contagens em etapas 8.5.41 – 8.5.48*.

[002486] 8.5.41 Se aplicável: realizar contagens de células. Realizar contagens de células e cálculos utilizando NC-200 e Nota de Processo 5.14. NOTA: Diluição foi ajustada de acordo com e baseada na concentração

491 / 557 esperada de células. Realizar 8.5.42Se aplicável: Registrar volumes de amostra de contagem de células.

[002487] 8.5.43 Se aplicável: Determinar fator de multiplicação. Volume de amostra de contagem de células total: 8.5.42A + 8.5.42B. fator de multiplicação C ÷ 8.5.42AD

[002488] 8.5.44 Se aplicável: Selecionar protocolos e inserir fatores de multiplicação. Assegurar que o protocolo “ensaio de contagem de células viáveis” foi selecionado, todos os fatores de multiplicação, e volumes de amostra e diluente foram inseridos. NOTA: Se não for necessária diluição, inserir “Amostra [µL]” = 200, “Diluição [µL]” = 0.

[002489] 8.5.45 Se aplicável: Registrar contagens de células de Nucleoview

[002490] 8.5.46 Se aplicável: Determinar a média de concentração de células viáveis e viabilidade das contagens de células realizadas. Determinar em média a concentração de células viáveis.

[002491] 8.5.47 Se aplicável: Determinar limite superior e inferior para contagens. Limite inferior: 8.5.46F x 0,9. Limite superior: 8.5.46F x 1,1.

[002492] 8.5.48 Se aplicável: Estão as contagens dentro de limites aceitáveis? Limite inferior: 8.5.45 C e D ≥ 8.5.47G. Limite superior: 8.5.45 C e D ≤ 8.5.47H NOTA: Se um dos resultados for “Não”, continuar para Etapa

8.5.49 para determinar uma média.

[002493] 8.5.49 Se aplicável: Determinar uma concentração média de células viáveis a partir de todas as quatro contagens realizadas. Concentração média de células viáveis (A+B+C+D) ÷ 4 = AVERAGE

[002494] 8.5.50 Ajustar volume de suspensão de TILs . Calcular o volume ajustado de suspensão de TILs após remoção de amostras de contagem de células. Volume de células de TILs total da Etapa 8.5.23C (A). Volume de amostra de contagem de células removida (4,0 ml) (B). Ajustar volume de células de TILs total C=A-B.

492 / 557

[002495] 8.5.51 Calcular células de TILs viáveis totais. Concentração média de células viáveis *: 8.5.38 F* ou 8.5.46 F* ou *8.5.49E*; Volume total: 8.5.50; Total de células viáveis: C = A x B. *Círculo de referência de etapa usado para determinar concentração de células viáveis. NOTA: Se células de TILs viáveis totais for células < 5x106 contatar gerência de área e prosseguir para Etapa 8.7.1. Se células de TILs viáveis totais for > 5x106, prosseguir para Etapa 8.5.52.

[002496] 8.5.52 Cálculo para citometria de fluxo. Se a contagem de células viáveis de TIL total de Etapa 8.5.51C for ≥ 4,0x107, calcular o volume para obter células 1,0x107 para a amostra de citometria de fluxo. *Se se tem <4,0x107 células, N/A os campos restantes na tabela. Prosseguir para Etapa

8.7.1.As células viáveis totais requeridas para citometria de fluxo: 1,0x107 células. Volume de células requeridas para citometria de fluxo: Concentração de células viáveis de 8.5.51 dividido por 1,0x107 células A.

[002497] 8.5.53 Se aplicável: Remover TIL do incubador. Remover suspensão de TILs do incubador e registrar o tempo final de incubação em Etapa 8.5.32.

[002498] 8.5.54 Se aplicável: Remover a amostra de citometria de fluxo como pelo plano de amostra. Usando uma seringa apropriadamente dimensionada, remover o volume calculado (8.5.52 C) para a fenotipagem da amostra a partir do pacote de transferência de suspensão de TILs e colocar em um tubo cônico de 50mL.

[002499] 8.5.55 Se aplicável: Rotular e armazenar amostra de citometria de fluxo. Rotular com rótulo de inventário de plano de amostra e armazenar a amostra de citometria de fluxo a 2-8ºC até submeter a Login para teste por Plano de Amostragem.

[002500] 8.5.56 Assinar para Amostragem. Assegurar que a planilha da amostra de LIMS foi completada para remoção da amostra.

[002501] 8.5.57 Se aplicável: Recalcular o total de células viáveis e

493 / 557 fluxo de volume. Calcular o total de células viáveis restantes e volume restante após a remoção da amostra de citometria abaixo. Parâmetro Fórmula Resultado TIL viável total Etapa 8.5.51C A. células TIL removido para 1x107 células B. 1x107 células citometria de fluxo Total restante C=A-B C. células TIL viável Volume de TIL Etapa 8.5.50C D. mL Volume de TIL Etapa 8.5.52 C E. mL removido Volume restante de F=D-E F. mL

TIL

[002502] 8.5.58 Se aplicável: Calcular volume de TIL. Calcular o volume de suspensão de TIL igual a o 2,0x108 células viáveis. Volume de suspensão de TIL Células viáveis totais Concentraçaõ de células viáveis contendo requeridas de etapa 8.5.51A 2.0x108 células viáveis C=A÷B A. 2.0x108 cells B. cells/mL C. mL

[002503] 8.5.59 Se aplicável: Calcular volume TIL para remover. Calcular o volume em excesso de células TIL a remover. Volume total de suspensão de TIL Volume de suspensão contendo Volume de TIL em excesso para de eapa 8.5.57F 2.0x108 TIL de Etapa 8.5.58C remover A. mL B. mL C. mL

[002504] 8.5.60 Se aplicável: Remover TIL em excesso. No BSC, usando uma seringa apropriadamente dimensionada, remover o volume calculado (Etapa 8.5.59C) a partir do pacote de transferência de suspensão de TILs. NOTA: Não usar a seringa mais de uma vez. Usar seringas múltiplas se aplicável. Colocar em um recipiente estéril apropriadamente dimensionado e rotular com data, e número de lote. Colocar uma tampa vermelha na linha do pacote de transferência de “suspensão de TILs” .

[002505] 8.5.61 Se aplicável: Colocar TIL em incubador. Colocar suspensão de pacote de transferência de TILs no incubador até necessário. Registrar tempo.

[002506] 8.5.62 Se aplicável: Cálculos. Calcular o TIL em excesso total removido

[002507] Etapa 8.5.51A Volume de TIL para remover da Etapa 8.5.59C.

494 / 557 Calcular o TIL em excesso total removido. Concentração de células viávei de Volume de TIL a remover de TIL em excesso total removido Etapa 8.5.51A Etapa 8.5.59C C=AxB A. Células /mL B. mL C. Células

[002508] 8.5.63 Se aplicável: Cálculos. Calcular a quantidade de meio CS-10 a adicionar às células de TILs em excesso em Etapa 8.5.62C. Marcar a concentração de células para congelamento que é de 1,0 x 108 células/ml. TIL em excesso total removido da Concentraçaõ alvo a congelar Volume de CS-10 a adicionar Etapa 8.5.62C (mL) C=A÷B A. células B. 1,0x108células/mL C. mL

[002509] 8.5.64 Se aplicável: Centrifugar o excesso de TIL. Centrifugar a suspensão de células de TIL em excesso. Velocidade: 350 x g. tempo: 10:00 minutos. Temperatura: Ambiente Freio: total (9). Aceleração: Total (9).

[002510] 8.5.65 Se aplicável: Observar tubo cônico. Registrar observações: Grânulo observado? Sobrenadante foi limpo? *NOTA: Se uma resposta foi não, contatar Gerência de área.

[002511] 8.5.66 Se aplicável: Adicionar CS-10. Em BSC, assepticamente aspirar sobrenadante. Suavemente bater no fundo do tubo para recolocar em suspensão células no fluido restante.

[002512] 8.5.67 Se aplicável: Adicionar CS10. Lentamente adicionar o volume de CS10 calculado em Etapa 8.5.63C

[002513] 8.5.68 Se aplicável: Rotular frascos-ampolas. Rotular frascos- ampolas com rótulo fornecidos pelo controle QA. Fixar o rótulo da amostra.

[002514] 8.5.69 Se aplicável: Encher frascos-ampolas. Dividir em alíquotas de 1,0mL suspensão de células, em criofrascos-ampolas apropriadamente dimensionados. NOTA: Não encher mais do que 10 frascos- ampolas de TIL em excesso.

[002515] 8.5.70 Se aplicável: Encher Frascos-ampolas. Dividir em alíquotas o volume residual em criofrasco-ampola apropriadamente dimensionado por SOP-00242. Se volume for ≤0,5mL, adicionar CS10 ao frasco-ampola até volume ser 0,5mL.

495 / 557

[002516] 8.5.71 Se aplicável: Encher frascos-ampolas. Encher um frasco-ampola com 1,0mL de CS10 e rotular como “controle em branco”.

[002517] 8.5.72 Se aplicável: Registrar número de frascos-ampolas cheios. Registrar número de frascos-ampolas cheios abaixo, não incluindo controle em branco.

[002518] 8.5.73 Se aplicável: Monitoramento ambiental. Após processamento, verificar se BSC e monitoramento do pessoal foram realizados. Crioconservação de amostra de TILs

[002519] 8.5.74 Se aplicável: Calcular volume para crioconservação. Calcular o volume de células requerido para obter 1x107 células para crioconservação. TIL viável total requerido para Concentração de células viáveis Volume de células requerido crioconservação de Etapa 8.5.51A para crioconservação A. 1x107células B. Células/mL C. mL

[002520] 8.5.75 Se aplicável: Remover amostra para crioconservação. No BSC, usando a seringa apropriadamente dimensionada, remover o volume calculado (Etapa 8.5.74C) a partir do pacote de transferência de suspensão de TILs. Colocar em tubo cônico apropriadamente dimensionada e rotular como “células 1x107 de amostra de crioconservação,” datar, e colocar número de lote. Colocar uma tampa vermelha (W3012845) no pacote de transferência de suspensão de TILs.

[002521] 8.5.76 Se aplicável: Colocar TIL em incubador. Colocar pacote de transferência de suspensão de TILs em incubador até necessário.

[002522] 8.5.77 Se aplicável: Amostra de crioconservação. Centrifugar as “células 1x107 de amostra de crioconservação” de acordo com os seguintes parâmetros: Velocidade: 350 x g, tempo: 10:00 minutos, Temperatura: Ambiente, Freio: Total (9) Aceleração: Total (9). NOTA: Assegurar que unidades apropriadas sejam fixadas para velocidade e tempo na centrifuga.

496 / 557

[002523] 8.5.78 Se aplicável: Observar tubo cônico. Registrar observações: Grânulo observado? Sobrenadante está limpo? *NOTA: Se uma resposta for não, contatar Gerência de Área.

[002524] 8.5.79 Se aplicável: Adicionar CS-10. Em BSC, aspirar assepticamente o sobrenadante. Suavemente bater no fundo do tubo para recolocar em suspensão as células no fluido restante.

[002525] 8.5.80 Se aplicável: Adicionar CS-10. Lentamente adicionar 0,5mL de CS10. Registrar volume adicionado.

[002526] 8.5.81 Se aplicável: Rotular frasco-ampola. Rotular frasco- ampola com rótulo expedido pelo controle QA.

[002527] 8.5.82 Se aplicável: Encher Frascos-ampolas. Dividir em alíquotas o volume recolocado em suspensão em criofrasco-ampola rotulado.

[002528] 8.5.83 Se aplicável: Encher o controle em branco. Encher outro frasco-ampola com 0,5mL de CS10 e rotular como “controle em branco”.

[002529] 8.5.84 Se aplicável: Registrar número de frascos-ampolas cheios, não incluindo “controle em branco”. Crioconservar a amostra de frascos-ampolas. Encher a ~0,5mL

[002530] 8.5.85 Se aplicável: Monitoramento ambiental. Após processamento, verificar se BSC e monitoramento do pessoal foram realizados.

[002531] 8.5.86 Rever Seção 8.5

[002532] 8.6 Dia 11 - Células alimentadoras

[002533] 8.6.1 Obter células alimentadoras. Obter 3 bolsas de células alimentadoras com pelo menos dois números de lote diferentes do congelador de LN2. Manter células em gelo seco até estarem prontas para descongelar. NOTA: Seção 8.6 pode ser realizada simultaneamente com Seção 8.5.

[002534] 8.6.2 Obter células alimentadoras. Registrar informação de célula alimentadora. Confirmar que pelo menos dois lotes diferentes de

497 / 557 células alimentadoras foram obtidos.

[002535] 8.6.3 Preparar banho de água ou Cryotherm. Preparar banho de água ou Cytotherm para descongelar células alimentadoras.

[002536] 8.6.4 Descongelar células alimentadoras. Colocar as bolsas de célula alimentadora em bolsas com zíper individuais, com base em Número de lote, e descongelar em banho de água a 37,0 ± 2.0°C ou cytotherm durante ~3-5 minutos ou até gelo desaparecer. Registrar tempos de descongelamento abaixo do cronômetro.

[002537] 8.6.5 Preparação da interface de tubos das células alimentadoras. Soldar (de acordo com a Nota de Processo 5.11) 4S-4M60 a um aparelho CC2 Cell Connect (W3012820), substituindo uma única ponta do aparelho Cell Connect (B) pela extremidade de 4 pontas do coletor 4S- 4M60 em (G). Soldar de H a G (ver, por exemplo, a Figura 131).

[002538] 8.6.6 Se aplicável: Remover meio do incubador. Remover o meio CM2 do pacote de transferência de células alimentadoras preparado em Etapa 8.4.34 a partir do incubador.

[002539] 8.6.7 Fixar pacote de transferência de meio. Soldar (por Nota de Processo 5.11) o pacote de transferência do “meio CM2 de células alimentadoras” para um luer CC2. NOTA: A bolsa será fixada para o lado da interface de tubos com a abertura de injeção sem agulha.

[002540] 8.6.8 Transferir a interface de tubos. Transferir o conjunto contendo o meio CM2 completo dia 11 no BSC.

[002541] 8.6.9 Reunir células alimentadoras descongeladas. Dentro do BSC, puxar 10mL de ar na seringa de 100mL. Usar isto para substituir a seringa de 60mL no CC2.

[002542] 8.6.10 Reunir células alimentadoras descongeladas. Limpar cada abertura nas bolsas de célula alimentadora com um chumaço de álcool antes de remover a cobertura. Cravar as três bolsas de células alimentadoras usando três das pontas do CC2. NOTA: Manter pressão constante enquanto

498 / 557 girando a ponta em uma direção. Assegurar não perfurar o lado da abertura.

[002543] 8.6.11 Reunir células alimentadoras descongeladas. Abrir a torneira de modo que a linha a partir das bolsas de células alimentadoras esteja aberta e a linha para a abertura de injeção sem agulha esteja fechada.

[002544] 8.6.12 Reunir células alimentadoras descongeladas. Puxar o conteúdo das bolsas de células alimentadoras dentro da seringa. Todas as três bolsas drenadas de uma vez. Uma vez que as bolsas de células alimentadoras foram drenadas, enquanto mantendo pressão na seringa, grampear a linha para as bolsas de células alimentadoras.

[002545] 8.6.13 Registrar volume de células alimentadoras. Não soltar a seringa abaixo da seringa a partir da interface de tubos. Registrar o volume total de células alimentadoras na seringa.

[002546] 8.6.14 Adicionar células alimentadoras ao pacote de transferência. Girar a torneira de modo que a linha para a bolsa de células alimentadoras seja fechada e a linha para o meio pacote de transferência seja aberta. Assegurar que a linha do pacote de transferência de meio permaneça não grampeada.

[002547] 8.6.15 Adicionar células alimentadoras ao pacote de transferência. Distribuir as células alimentadoras a partir da seringa no pacote de transferência do “meio CM2 de células alimentadoras”. Prender a linha para o pacote de transferência contendo as células alimentadoras e deixar a seringa fixada na interface de tubos.

[002548] 8.6.16 Células alimentadoras reunidas misturadas. Massagear bolsa para misturar as células alimentadoras reunidas no pacote de transferência.

[002549] 8.6.17 Rotular pacote de transferência. Rotular bolsa como “suspensão de células alimentadoras” e Número de lote.

[002550] 8.6.18 Calcular volume total em pacote de transferência. Calcular o volume total de suspensão de célula alimentadora.

499 / 557

[002551] 8.6.19 Remover amostras de contagem de células. Usando uma seringa separada de 3mL para cada amostra, reunir amostras de contagem de células de 4x1,0mL do pacote de transferência de suspensão de células alimentadoras usando a abertura de injeção sem agulha. Dividir em alíquotas cada amostra nos criofrascos-ampolas rotulados em Etapa 8.4.27. NOTA: Limpar a abertura de injeção sem agulha com um chumaço de álcool estéril (W3009488) e misturar a suspensão de células alimentadoras entre cada amostragem para a contagens de células.

[002552] 8.6.20 Realizar contagens de células. Realizar contagens de células e cálculos utilizando NC-200 e Nota de Processo 5.14. Diluir amostras de contagem de células por adição de 0,5mL de suspensão de células em4,5mL de meio AIM-V rotulado com o número de lote e “para diluições de contagem de células”. Isto dará uma diluição de 1:10. Ajustar se necessário.

[002553] 8.6.21 Registrar contagem de células. Volumes de amostra

[002554] 8.6.22 Determinar fator de multiplicação Parâmetro Fórmula Resultado Contagem de células total

8.6.21A + 8.6.21B C. µL Volume de amostra Fator de multiplicação C ÷ 8.6.21A D.

[002555] 8.6.23 Selecionar protocolos e inserir fatores de multiplicação. Assegurar que o protocolo de “ensaio de contagem de células viáveis” foi selecionado, todos os fatores de multiplicação, e volumes de amostra e diluente foram inseridos.

[002556] 8.6.24 Registrar nome de arquivo, viabilidade e contagens de células do Nucleoview.

[002557] 8.6.25 Determinar a média de concentração de células viáveis e viabilidade das contagens de células realizadas. Parâmetro Fórmula Resultado viabilidade (8.6.24A + 8.6.24B) ÷ 2 E. % Concentração de célula (8.6.24C + 8.6.24D) ÷ 2 F. células/mL viável

[002558] 8.6.26 Determinar limite superior e inferior para contagens. Parâmetro Fórmula Resultado

500 / 557 Limite inferior 8.6.25F x 0,9 G. células/mL Limite superior 8.6.25F x 1.1 H. células/mL

[002559] 8.6.27 Estavam ambas as contagens dentro de limites aceitáveis? Parâmetro Fórmula Resultado (Sim/Não) Limite inferior 8.6.24 C e D ≥ 8.6.26G Limite superior 8.6.24 C e D ≤ 8.6.26H

[002560] NOTA: Se um dos resultados foi “Não”, realizar segundo conjunto de contagens em etapas 8.6.28 – 8.6.35.

[002561] 8.6.28 Se aplicável: Realizar contagens de células. Realizar contagens de células e cálculos utilizando NC-200 por SOP-00314 e Nota de Processo 5.14.

[002562] NOTA: Diluição pode ser ajustada de acordo com e baseada na concentração esperada de células.

[002563] 8.6.29 Se aplicável: Registrar contagem de células, volumes de amostra. NOTA: Se não for necessária diluição, inserir “Amostra [µL]” = 200, “Diluição [µL]” = 0.

[002564] 8.6.30 Se aplicável: Determinar fator de multiplicação. Parâmetro Fórmula Resultado Contagem de células total

8.6.29A + 8.6.29B C. mL Volume de amostra Fator de multiplicação C ÷ 8.6.29A D.

[002565] 8.6.31 Selecionar protocolos e inserir fatores de multiplicação. Assegurar que o protocolo “ensaio de contagem de células viáveis” foi selecionado, todos os fatores de multiplicação, e volumes de amostra e diluente foram inseridos. NOTA: Se não for necessária diluição, inserir “Amostra [µL]” = 200, “Diluição [µL]” = 0.

[002566] 8.6.32 Se aplicável: Registrar contagens de células de Nucleoview

[002567] 8.6.33 Se aplicável: Determinar a média de concentração de células viáveis e viabilidade das contagens de células realizadas. Parâmetro Fórmula Resultado viabilidade (8.6.32A + 8.6.32B) ÷ 2 E. %

501 / 557 Concentração de élula (8.6.32C + 8.6.32D) ÷ 2 F. células/mL viável

[002568] 8.6.34 Se aplicável: Determinar limite superior e inferior para contagens. Parâmetro Fórmula Resultado (Sim/Não) Limite inferior 8.6.33F x 0,9 G. células/mL Limite superior 8.6.33F x 1,1 H. células/mL

[002569] 8.6.35 Se aplicável: Estão as contagens dentro de limites aceitáveis? Parâmetro Fórmula Resultado (Sim/Não) Limite inferior 8.6.32 C e D ≥ 8.6.34G Limite superior 8.6.32 C e D ≤ 8.6.34H

[002570] NOTA: Se um resultado foi “Não,” continuar para etapa 8.6.36 para encontrar a concentração média total de células viáveis e prosseguir com cálculos.

[002571] 8.6.36 Se aplicável: Determinar uma concentração média de células viáveis de todas as quatro contagens realizadas.

[002572] 8.6.37 Ajustar volume de suspensão de células alimentadoras. Calcular o volume ajustado de suspensão de células alimentadoras após remoção de amostras de contagem de células. Volume total de células de Etapa 8.6.18C menos 4.0 ml removido.

[002573] 8.6.38 Calcular total de células alimentadoras viáveis. Parâmetro Fórmula Resultado

8.6.25 F* Concentração média de -ou- células viáveis 8.6.33 F* A. células/mL * -ou-

8.6.36 E* Total Volume 8.6.37 C B. mL Total de células viáveis AxB C. células

[002574] Se o total de células viáveis for < 5 x109, prosseguir para Etapa

8.6.39. Se total de células viáveis for ≥ 5 x109, prosseguir para Etapa 8.5.70.

[002575] 8.6.39 Se aplicável: Obter células alimentadoras adicionais. Obter uma bolsa de células alimentadoras adicionais do congelador LN2. Manter células em gelo seco até estarem prontas para descongelar.

[002576] 8.6.40 Se aplicável: Obter células alimentadoras adicionais. Registrar informação de célula alimentadora.

502 / 557

[002577] 8.6.41 Se aplicável: Descongelar células alimentadoras adicionais. Colocar a 4ª. bolsa de células alimentadoras em uma bolsa com zíper e descongelar em um banho de água a 37,0 ± 2,0°C ou cytotherm durante ~3-5 minutos ou até gelo ter desaparecido. Registrar tempo de descongelamento.

[002578] 8.6.42 Se aplicável: Reunir células alimentadoras adicionais. No BSC, puxar 10 mL de ar em uma nova seringa de 100mL. Usar isto para substituir a seringa na interface de tubos.

[002579] 8.6.43 Se aplicável: Reunir células alimentadoras adicionais. Limpar a abertura da bolsa de células alimentadoras com um chumaço de álcool antes de remover a cobertura. Cravar a bolsa de células alimentadoras usando uma das pontas restantes da interface de tubos preparada em Etapa

8.6.7 NOTA: Manter a pressão constante enquanto girando a ponta em uma direção. Assegurar não perfurar o lado da abertura.

[002580] 8.6.44 Se aplicável: Reunir células alimentadoras adicionais. Abrir a torneira de modo que a linha a partir da bolsa de células alimentadoras foi aberta e a linha para a abertura de injeção sem agulha foi fechada.

[002581] 8.6.45 Se aplicável: Reunir células alimentadoras adicionais. Puxar o conteúdo da bolsa de célula alimentadora dentro da seringa. Registrar volume.

[002582] 8.6.46 Se aplicável: Medir Volume. Medir o volume as células alimentadoras na seringa e registrar abaixo (B). Calcular o novo volume total de células alimentadoras. Volume de célula alimentadoras Volume de célula alimentadoras Volume de células de da alimentadoras Etapa 8.6.37C Etapa 8.6.45 total C=A+B A. mL B. mL C. mL

[002583] 8.6.47 Se aplicável: Adicionar células alimentadoras para o pacote de transferência. Girar a torneira de modo que a linha para a bolsa de células alimentadoras foi fechada e a linha para a “suspensão de células alimentadoras” pacote de transferência foi aberta. Assegurar a linha para o

503 / 557 pacote de transferência foi solta. Distribuir as células alimentadoras a partir da seringa no pacote de transferência de “suspensão de células alimentadoras”. Prender a linha para o pacote de transferência e deixar a seringa fixada na interface de tubos.

[002584] 8.6.48 Se aplicável: Adicionar células alimentadoras para o pacote de transferência. Massagear a bolsa para misturar as células alimentadoras reunidas no pacote de transferência de suspensão de células alimentadoras.

[002585] 8.6.49 Se aplicável: Preparar diluições. No BSC, adicionar 4,5mL de meio AIM-V que foi rotulado com “Para diluições de contagem de células” e número de lote para quatro tubos cônicos 15mL. Rotular os tubos com o número de lote e número de tubo (1-4). Rotular 4 criofrascos-ampolas “alimentadoras adicionais” e número de frasco-ampola (1-4).

[002586] 8.6.50 Se aplicável: Preparar contagens de células. Usando uma seringa separada de 3mL para cada amostra, remover amostras de 4 x 1,0mL de contagem de células do pacote de transferência de suspensão de células alimentadoras, usando a abertura de injeção sem agulha. Dividir em alíquotas cada amostra em criofrascos-ampolas rotulados em Etapa 8.6.49. NOTA: Limpar a abertura de injeção sem agulha com um chumaço de álcool estéril e misturar a suspensão de células alimentadoras entre cada amostragem para contagens de células.

[002587] 8.6.51 Se aplicável: Realizar contagens de células. Realizar contagens de células e cálculos utilizando NC-200 e Nota de Processo 5.14. Diluir amostras de contagem de células por adição de 0,5mL de suspensão de células em 4,5mL de meio AIM-V rotulado com o número de lote e “para diluições de contagem de células”. Isto dará uma diluição de 1:10. Ajustar se necessário.

[002588] 8.6.52 Se aplicável: Registrar volumes de amostra de contagem de células.

504 / 557

[002589] 8.6.53 Se aplicável: Determinar fator de multiplicação Parâmetro Fórmula Resultado Contagem de células total

8.6.52A + 8.6.52B C. µL Volume de amostra Fator de multiplicação C ÷ 8.6.52A D.

[002590] 8.6.54 Se aplicável: Selecionar protocolos e inserir fatores de multiplicação. Assegurar que o protocolo de “ensaio de contagem de células viáveis” foi selecionado, todos os fatores de multiplicação, e volumes de amostra e diluente foram inseridos.

[002591] 8.6.55 Se aplicável: Registrar nome de arquivo, viabilidade e contagens de células de Nucleoview.

[002592] 8.6.56 Se aplicável: Determine a média de concentração de células viáveis e viabilidade das contagens de células realizadas. Parâmetro Fórmula Resultado viabilidade (8.6.55A + 8.6.55B) ÷ 2 E. % Concentração de célula viável (8.6.55C + 8.6.55D) ÷ 2 F. células/mL

[002593] 8.6.57 Se aplicável: Determinar limite superior e inferior para contagens. Parâmetro Fórmula Resultado Limite inferior 8.6.56F x 0,9 G. células/mL Limite superior 8.6.56F x 1.1 H. células/mL

[002594] Estão ambas as contagens dentro de limites aceitáveis? NOTA: Se um dos resultados for “Não”, realizar segundo conjunto de contagens em Etapas 8.5.59 – 8.5.65

[002595] 8.6.59 Se aplicável: Realizar contagens de células. Realizar contagens de células e cálculos utilizando NC-200 e Nota de Processo 5.14. NOTA: Diluição pode ser ajustada de acordo com e baseada na concentração esperada de células.

[002596] 8.6.60 Se aplicável: Registrar volumes de amostra de contagem de células. NOTA: Se nenhuma diluição foi necessária, inserir “Amostra [µL]” = 200, “Diluição [µL]” = 0

[002597] 8.6.61 Se aplicável: Determinar fator de multiplicação.

505 / 557 Parâmetro Fórmula Resultado Contagem de células total

8.6.60A + 8.6.60B C. µL Volume de amostra Fator de multiplicação C ÷ 8.6.60A D.

[002598] 8.6.62 Se aplicável: Selecionar protocolos e inserir fatores de multiplicação. Assegurar que o protocolo de “ensaio de contagem de células viáveis” foi selecionado, todos os fatores de multiplicação, e volumes de amostra e diluente foram inseridos.

[002599] NOTA: Se nenhuma diluição foi necessária, inserir “Amostra [µL]” = 200, “Diluição [µL]” = 0

[002600] 8.6.63 Se aplicável: Registrar contagens de células de Nucleoview.

[002601] 8.6.64 Se aplicável: Determinar a média de concentração de células viáveis e viabilidade das contagens de células realizadas. Parâmetro Fórmula Resultado Viabilidade (8.6.63A + 8.6.63B) ÷ 2 E. % Concentrçaão de células (8.6.63C + 8.6.63D) ÷ 2 F. células/mL viáveis

[002602] 8.6.65 Se aplicável: Determinar limite superior e inferior para contagens Parâmetro Fórmula Resultado Limite inferior 8.6.64F x 0,9 G. células/mL Limite superior 8.6.64F x 1.1 H. células/mL

[002603] 8.6.66 Se aplicável: Estão as contagens dentro de limites aceitáveis? Parâmetro Fórmula Resultado (Sim/Não) Limite inferior 8.6.63 C e D ≥ 8.6.65G Limite superior 8.6.63 C e D ≤ 8.6.65H

[002604] NOTA: Se um resultado for “Não”, continuar para Etapa

8.6.67 para encontrar a concentração média total de células viáveis e prosseguir com cálculos.

[002605] 8.6.67 Se aplicável: Determinar uma concentração média de células viáveis de todas as quatro contagens realizadas.

[002606] 8.6.68 Se aplicável: Ajustar volume de suspensão de células alimentadoras. Calcular o volume ajustado de suspensão de células

506 / 557 alimentadoras após remoção de amostras de contagem de células. Volume total de células alimentadoras da Etapa 8.6.46C menos 4,0 mL removido.

[002607] 8.6.69 Se aplicável: Calcular células alimentadoras viáveis totais. Parâmetro Fórmula Resultado

8.6.56 F* -ou- Concentração média de

8.6.64 F* -ou- A. células/mL células viáveis*

8.6.67 E* Total Volume 8.6.68 C B. mL Total de células viáveis AxB C. células *Círculo de referência de etapa usada para determinar concentração de células viáveis.

[002608] 8.6.70 Calcular volume de células alimentadoras. Calcular o volume de suspensão de células alimentadoras que foi requerido para obter 5x109 células alimentadoras viáveis. Concentração de células viáveis Volume de células de alimentadoras Número de células Etapa 8.6.38A* ou = 5x109 alimentadoras requeridas Etapa 8.6.69A* células viáveis C=A÷B A. 5x109 Células viáveis B. células/mL C. mL *Círculo de etapa aplicável

[002609] 8.6.71 Calcular volume em excesso de célula alimentadora. Calcular o volume de células alimentadoras em excesso para remover. Arredondar o número inteiro mais próximo. Total Volume de células Volume de alimentadoras em pacote de Células alimentadoras em Volume de células alimentadoras = transferência excesso para 5x109 células viáveis de Etapa de remover células viáveis

8.6.70C Etapa 8.6.46C* ou C=A-B Etapa 8.6.68C* A. mL B. mL C. mL *Círculo de etapa aplicável

[002610] 8.6.72 Remover excesso de células alimentadoras. Em uma nova seringa de 100mL, puxar10mL de ar e fixar a seringa na interface de tubos.

[002611] 8.6.73 Remover células alimentadoras em excesso. Abrir a linha para o pacote de transferência de “suspensão de células alimentadoras”. Usando a seringa, puxar o volume de células alimentadoras calculado em Etapa 8.6.71C mais um adicional de 10.0mL a partir do pacote de transferência na seringa de 100mL. Fechar a linha para o pacote de

507 / 557 transferência de suspensão de células alimentadoras uma vez que o volume de células alimentadoras foi removido. Não remover a seringa final. NOTA: Uma vez que a seringa foi cheia, substituir a mesma com uma nova seringa. Múltiplas seringas podem ser usadas para remover o volume total. Com cada nova seringa, puxar para dentro 10mL de ar.

[002612] 8.6.74 Registrar volume. Registrar o volume total (incluindo os 10mL adicionais) de células alimentadoras removidas.

[002613] 8.6.75 Adicionar OKT3. No BSC, usando uma seringa de 1,0mL e agulha de 16G, puxar 0,15mL de OKT3.

[002614] 8.6.76 Adicionar OKT3. Remover assepticamente a agulha a partir da seringa e fixar a seringa para a abertura de injeção sem agulha. Injetar o OKT3.

[002615] 8.6.77 Adicionar OKT3. Abrir a torneira para o pacote de transferência de “suspensão de células alimentadoras” e adicionar 10mL de células alimentadoras removidas em Etapa 8.6.73 para varrer OKT3 através da linha.

[002616] 8.6.78 Adicionar OKT3. Girar a seringa com o lado de cima para baixo e empurrar ar através da mesma para limpar a linha para o pacote de transferência de suspensão de células alimentadoras.

[002617] 8.6.79 Adicionar OKT3. Deixar a suspensão de células alimentadoras restantes na seringa. Fechar todos os grampos e remover a interface de tubos a partir do BSC.

[002618] 8.6.80 Termosselar. Termosselar (por Nota de Processo 5.12) o pacote de transferência de suspensão de células alimentadoras, deixando suficiente tubulação para soldar. Descartar os tubos.

[002619] 8.6.81 Revisão da Seção 8.6

[002620] 8.7 Dia 11 G-Rex Enchimento e semeadura

[002621] 8.7.1 Configurar G-Rex500MCS. Para o BSC, remover um G- Rex500MCS da embalagem e inspecionar o frasco para qualquer rachadura

508 / 557 ou torção na tubulação. Assegurar que todos as conexões de luers e fechos luers estejam apertados. Fechar todos os grampos nas linhas de G- Rex500MCS, exceto a linha do filtro de ventilação. Usando um marcador, desenhar uma linha na gradação de 4,5L.

[002622] 8.7.2 Remover meio do incubador. Remover o “Meio CM2 dia 11 completo”, preparado em Etapa 8.4.35, do incubador.

[002623] 8.7.3 Preparar para bombear meio. Soldar (por Nota de Processo 5.11) a linha vermelha do G-Rex500MCS para o conjunto de transferência da bomba repetidora fixado para o meio CM2 dia 11 completo.

[002624] 8.7.4 Preparar para bombear meio. Pendurar a bolsa de “meio CM2 dia 11 completo” em um polo IV. Alimentar a tubulação da bomba através de bomba Baxa.

[002625] 8.7.5 Bombear meio em G-Rex500MCS. Fixar a bomba Baxa em “Alto” e “9”. Bombear 4,5L de meio no G-Rex500MCS, encher até a linha marcada no frasco em Etapa 8.7.1.

[002626] 8.7.6 Termosselar. Termosselar a linha vermelha (por Nota de Processo 5.12) do G-Rex500MCS próxima da solda criada em Etapa 8.7.3.

[002627] 8.7.7 Rotular frasco. Rotular o frasco com o anexo de amostra “Dia 11 QA fornecido no rótulo de “Dia 11” em processo.

[002628] 8.7.8 Se aplicável: Incubar frasco. Manter o frasco em incubador enquanto esperando para semear com TIL.

[002629] 8.7.9 Soldar o pacote de transferência da suspensão de células alimentadoras no frasco. Soldar de modo estéril (por Nota de Processo 5.11) a linha vermelha do G-Rex500MCS para o pacote de transferência de “suspensão de células alimentadoras”.

[002630] 8.7.10 Adicionar células alimentadoras para G-Rex500MCS. Abrir todos os grampos entre a suspensão de células alimentadoras e G- Rex500MCS e adicionar a suspensão de células alimentadoras ao frasco por alimentação por gravidade. Assegurar que a linha foi completamente limpa.

509 / 557

[002631] 8.7.11 Termosselar. Termosselar (por Nota de Processo 5.12) a linha vermelha próxima da solda criada em Etapa 8.7.9.

[002632] 8.7.12 Soldar a suspensão de pacote de transferência de TILs para o frasco. Soldar de modo estéril (por Nota de Processo 5.11) a linha vermelha do G-Rex500MCS para o pacote de transferência de “suspensão de TILs” .

[002633] 8.7.13 Adicionar TIL para o G-Rex500MCS. Abrir todos os grampos entre a suspensão de TILs e G-Rex500MCS e adicionar suspensão de TILs ao frasco por alimentação por gravidade. Assegurar que a linha foi completamente liberada.

[002634] 8.7.14 Termosselar. Termosselar (por Nota de Processo 5.12) a linha vermelha próxima da solda criada em Etapa 8.7.12 para remover a suspensão da bolsa de TILs.

[002635] 8.7.15 Incubar G-Rex500MCS. Verificar que todos os grampos no G- Rex500MCS foram fechados, exceto a linha de filtro grande e colocar no incubador. Parâmetros do incubador: Tela LED de temperatura: 37,0±2,0 ºC, Porcentagem de CO2: 5,0±1,5 %CO2.

[002636] 8.7.16 Calcular janela de incubação. Realizar cálculos para determinar o tempo apropriado para remover G-Rex500MCS do incubador em Dia 16. Tempo de incubação (Etapa 8.7.15). Limite inferior: Tempo de incubação + 108 horas. Limite superior: Tempo de incubação + 132 horas.

[002637] 8.7.17 Monitoramento ambiental. Após processamento, verificar se BSC e monitoramento do pessoal foram realizados.

[002638] 8.7.18 Submeter amostras. Submeter amostras a Login.

[002639] 8.7.19 Rever Seção 8.7

[002640] 8.8 Dia 11 crioconservação de TILs em excesso

[002641] 8.8.1 Se aplicável: congelar os frascos-ampolas com TILs em excesso. Verificar que o CRF foi fixado antes do congelamento. Realizar a Crioconservação.

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[002642] 8.8.2 Se aplicável: Iniciar CRF. Registrar o número total de frascos-ampolas colocados no CRF (não incluindo controle em branco). Verificar se o número de frascos-ampolas transferidos no CRF corresponde ao número total de frascos-ampolas preparados em Etapa 8.5.72 ou Etapa 8.5.84 ou Etapa 8.5.72C ou Etapa 8.5.84

[002643] 8.8.3 Se aplicável: Iniciar a porção automatizada do perfil de congelamento. Registrar o tempo de PARTIDA para o início da porção automatizada do perfil de congelamento.

[002644] 8.8.4 Se aplicável: Transferir frascos-ampolas do congelador de taxa controlada para o armazenamento apropriado. Ao completar o congelamento, transferir os frascos-ampolas do CRF para o recipiente de armazenamento apropriado.

[002645] 8.8.5 Se aplicável: Transferir frascos-ampolas para armazenamento apropriado. Registrar local de armazenamento em LN2.

[002646] 8.8.6 Rever Seção 8.8

[002647] 8.9 Dia 16 Preparação de meio

[002648] 8.9.1 Pré-aquecer o meio AIM-V. Remover três bolsas de meio CTS AIM V de 10L de 2-8°C pelo menos 12 horas antes de usar e colocar em temperatura ambiente protegida da luz. Verificar se cada bolsa está dentro da validade. Rotular cada bolsa com número de bolsa (1-3), número de lote, data, e “tempo de início do aquecimento HHMM”. Registrar tempo de início do aquecimento e data.

[002649] 8.9.2 Calcular o tempo em que o meio da etapa 8.9.1 foi aquecido. Calcular o tempo de aquecimento das bolsas de meios 1, 2, e 3 da etapa 8.9.1. Assegurar que todas as bolsas foram aquecidas durante uma duração entre 12 e 24 horas.

[002650] 8.9.3 Verificar higienização da sala, liberação de linhas, e materiais. Confirmar higienização da sala, liberação de linhas, e materiais.

[002651] 8.9.4 Garantir conclusão da mesa de pré-processamento.

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[002652] 8.9.5 Monitoramento ambiental. Antes do processamento, garantir que o monitoramento ambiental do processo foi iniciado.

[002653] 8.9.6 Configurar Labtainer 10L para sobrenadante. No BSC, fixar a extremidade de diâmetro maior do conjunto de transferência de bomba de fluido para uma das aberturas fêmeas de uma bolsa Labtainer de 10L usando os conectores luer.

[002654] 8.9.7 Configurar Labtainer 10L para rotular o sobrenadante como “Sobrenadante” e Número de lote.

[002655] 8.9.8 Configurar Labtainer 10L para sobrenadante. Assegurar que todos os grampos foram fechados antes de remover do BSC. NOTA: A bolsa de sobrenadante foi usada durante colheita de TILs (Seção 8.10), que pode ser realizada simultaneamente com preparação de meio.

[002656] 8.9.9 Descongelar IL-2. Descongelar alíquotas de 5x1,1mL de IL-2 (6x106 IU/mL) (BR71424) por bolsa de meio AIM V CTS até todo o gelo ter derretido. Registrar número de lote e validade de IL-2. Fixar os rótulos de IL-2.

[002657] 8.9.10 Dividir em alíquotas GlutaMax. Em BSC, dividir em alíquotas 100,0mL de Glutamax em receptor apropriadamente dimensionado. Registrar o volume adicionado para cada receptor

[002658] NOTA: Inicialmente preparar uma bolsa de meio AIM-V após a Etapa 8.9.10 - Etapa 8.9.28. As bolsas necessárias adicionais foram determinadas em Etapa 8.10.59.

[002659] 8.9.11 Rotular receptores. Rotular cada receptor como “GlutaMax.”

[002660] 8.9.12 Adicionar IL-2 para GlutaMax. Usando a micropipeta, adicionar 5,0mL de IL-2 a cada receptor de GlutaMax. Assegurar de enxaguar a ponta por Nota de Processo 5.18 e usar uma nova ponta de pipeta para cada mL adicionado. Registrar volume adicionado para cada receptor de Glutamax.

[002661] 8.9.13 Rotular receptores. Rotular cada receptor como

512 / 557 “GlutaMax + IL-2” e número do receptor.

[002662] 8.9.14 Preparar bolsa de meio AIM V CTS para formulação. Assegurar bolsa de meio AIM V 10L CTS (W3012717) foi aquecida a temperatura ambiente e proteger da luz durante 12-24 horas antes do uso. Registrar o tempo de incubação final em Etapa 8.9.2.

[002663] 8.9.15 Preparar bolsa de meio AIM V CTS para formulação. No BSC, fechar o grampo no conjunto de transferência de plasma de 10,15 cm, então conectar para a bolsa usando as aberturas das pontas. NOTA: Manter pressão constante enquanto girando a ponta em uma direção. Assegurar não perfurar o lado da abertura.

[002664] 8.9.16 Preparar bolsa de meio AIM V CTS para formulação. Conectar a extremidade de diâmetro maior de um conjunto de transferência de fluido de bomba repetidora para o conjunto de transferência de plasma de 10,15 cm via luer.

[002665] 8.9.17 Escalonar a bomba Baxa. Escalonar a bomba Baxa próxima do BSC. Remover a seção de tubulação de bomba de conjunto de transferência de fluido de bomba repetidora do BSC e instalar na bomba repetidora.

[002666] 8.9.18 Preparar para formular o meio. Em BSC, remover a seringa do sistema de distribuição de líquido Pumpmatic (PLDS) e descartar. NOTA: Assegurar a garantia de não comprometer a esterilidade da pipeta de PLDS.

[002667] 8.9.19 Preparar para formular o meio. Conectar pipeta de PLDS para extremidade de menor diâmetro de conjunto de transferência de fluido de bomba repetidora via conexão luer e colocar a ponta da pipeta em “GlutaMax + IL-2” preparado em Etapa 8.9.13 para aspiração Abrir todos os grampos entre o receptor e a bolsa de 10L.

[002668] 8.9.20 Bombear GlutaMax +IL-2 em bolsa. Ajustar a velocidade da bomba para “média” e “3” e bombear todo o “GlutaMax + IL-

513 / 557 2” em bolsa de meio AIM V 10L CTS. Uma vez que nenhuma solução permaneça, limpar a limpa e parar de bombear. Registrar o volume de GlutaMax contendo IL-2 adicionado a cada bolsa Aim V abaixo. Registrar.

[002669] 8.9.21 Remover PLDS. Assegurar que todos os grampos foram fechados, e remover a pipeta de PLDS a partir do conjunto de transferência de fluido de bomba repetidora. Remover conjunto de transferência de fluido de bomba repetidora e tampa vermelha do conjunto de transferência de plasma de 10,15 cm.

[002670] 8.9.22 Rotular bolsas. Rotular cada bolsa de “meio completo CM4 Dia 16” preparado.

[002671] 8.9.23 Remover o meio de retenção por plano de amostra. Usando uma seringa de 30mL, remover 20.0mL de “meio completo CM4 Dia 16” por fixação da seringa no conjunto de transferência de plasma de 10,15 cm e distribuir a amostra em um tubo cônico de 50mL.

[002672] NOTA: Somente remover a amostra do meio de retenção a partir da primeira bolsa de meio preparada. NOTA: Assegurar que o conjunto de transferência de plasma de 10,15 cm foi ou preso ou tampado com a tampa vermelha após remoção de seringa.

[002673] 8.9.24 Fixar novo conjunto de transferência de fluido de bomba repetidora. Fixar a extremidade de diâmetro maior de um novo conjunto de transferência de bomba de fluido no conjunto de transferência de plasma de 10,15 cm que foi conectado para a bolsa de “meio completo CM4 Dia 16”.

[002674] 8.9.25 Rotular e armazenar a amostra. Rotular com rótulo de inventário de plano de amostra e armazenar a amostra de retenção de meio a 2-8ºC até submeter a Login para testagem pelo Plano de Amostra.

[002675] 8.9.26 Assinar para Amostragem. Assegurar que a planilha de amostra do LIMS foi preenchida para a remoção da amostra.

[002676] 8.9.27 Monitorar incubador. Monitorar incubador. Se

514 / 557 aplicável, por Etapa 8.9.10, monitorar para bolsas adicionais preparadas. Parâmetros do incubador: tela LED de temperatura: 37,0±2,0 ºC, porcentagem de CO2: 5,0±1,5 %CO2.

[002677] 8.9.28 Aquecer meio CM4 completo Dia 16. Aquecer a primeira bolsa de meio CM4 completo Dia 16 em incubador durante ≥ 30 minutos até pronto para uso. Se aplicável, por Etapa 8.10.59, aquecer bolsas adicionais.

[002678] 8.9.29 Preparar Diluições. No BSC, adicionar 4,5mL de meio AIM-V que foi rotulado com registro de batelada, número de lote e “diluições de contagem de células” para cada tubo cônico de 4x15mL. Rotular os tubos cônicos com o número de lote e número de tubo (1-4). Rotular 4 criofrascos- ampolas com número de frasco-ampola (1-4).

[002679] Manter frascos-ampolas sob BSC a ser usado em Etapa

8.10.31.

[002680] 8.9.30 Rever Seção 8.9

[002681] 8.10 Dia 16 divisão de REP

[002682] 8.10.1 Mesa de pré-processamento.

[002683] 8.10.2 Monitorar o incubador. Monitorar o incubador. Parâmetros do incubador: Tela LED de temperatura: 37,0±2,0 ºC, porcentagem de CO2: 5,0±1,5 %CO2

8.10.3 Remover G-Rex500MCS do incubador. Realizar verificação abaixo para assegurar que os parâmetros de incubação sejam atendidos antes de remover G-Rex500MCS do incubador. Tempo de É 8.7.16B < tempo Limite inferior de remoção de remoção do Limite superior de Etapa 8.7.16B de Incubador < Etapa Etapa 8.7.16C (DDMMMYY Incubador 8.7.16C (DDMMMYY HHMM) HHMM) (DDMMMYY Sim/Não* HHMM)

[002684] Remover G-Rex500MCS a partir do incubador.

[002685] 8.10.4 Configurar pacote de transferência de 1L. Termosselar

515 / 557 um pacote de transferência de IL (W3006645) por Nota de Processo 5.12, deixando ~ 30,48cm de linha.

[002686] 8.10.5 Preparar pacote de transferência de 1L. Rotular pacote de transferência de 1L como suspensão de TILs.

[002687] 8.10.6 Pesar pacote de transferência de 1L Colocar pacote de transferência de 1L, incluindo a linha completa, em uma balança e registrar peso seco.

[002688] 8.10.7 Configuração de GatheRex. Soldar de modo estéril (por Nota de Processo 5.11) a linha de remoção de meio vermelha a partir do G- Rex500MCS para o conjunto de transferência de bomba repetidora na bolsa Labtainer 10L de “sobrenadante” preparada em Etapa 8.9.8. Soldar de modo estéril a linha de remoção de células limpas a partir do G-Rex500MCS para a suspensão de pacote de transferência de TILs preparada em Etapa 8.10.5.

[002689] 8.10.8 Configuração de GatheRex. Colocar frasco G- Rex500MCS no lado à esquerda do GatheRex. Colocar a bolsa Labtainer de sobrenadante e a suspensão de pacote de transferência de TILs no lado à direita.

[002690] 8.10.9 Configuração de GatheRex. Instalar a linha vermelha de remoção de meio a partir do G-Rex500MCS para o grampo de topo (marcado com uma linha vermelha) e guias de tubulação no GatheRex. Instalar a linha de colheita limpa a partir do G-Rex500MCS para o grampo de fundo (marcado com uma linha azul) e guias de tubulação no GatheRex.

[002691] 8.10.10 Configuração de GatheRex. Fixar a linha de gás a partir do GatheRex para o filtro estéril do G-Rex500 MCS. NOTA: Antes de remover o sobrenadante a partir do G-Rex500MCS, assegurar todos os grampos nas linhas de remoção de células foram fechados.

[002692] 8.10.11 Volume redução de G-Rex500MCS. Transferir ~4m5L de sobrenadante de cultura a partir do G-Rex500MCS para o Labtainer 10L por SOP-01777. Visualmente inspecionar G-Rex500MCS para assegurar

516 / 557 frasco no nível e meio foi reduzido para o final do tubo de imersão de aspiração. NOTA: Se o GatheRex parar prematuramente, ele pode ser reiniciado pressionando o botão com a seta apontando para a direita novamente.

[002693] 8.10.12 Preparar frasco para colheita de TILs. Após remoção do sobrenadante, fechar todas as pinças para a linha vermelha.

[002694] 8.10.13 Início de colheita de TILs. Registrar o tempo de início da colheita de TILs.

[002695] 8.10.14 Início de Colheita de TILs. Vigorosamente bater no frasco e agitar o meio para liberar as células. Realizar uma inspeção do frasco para assegurar que todas as células se soltaram. NOTA: Contatar gerência de área se as células não se soltarem.

[002696] 8.10.15 Início de Colheita de TILs. Inclinar o frasco para assegurar que a mangueira está na borda do frasco. Nota: Se o canudo de coleta de células não está na junção da parede e da membrana inferior, bater o frasco enquanto inclinado em um ângulo de 450 é geralmente suficiente para posicionar corretamente o canudo.

[002697] 8.10.16 Colheita de TILs. Liberar todos os grampos levando para o pacote de transferência de suspensão de TILs.

[002698] 8.10.17 Colheita de TILs. Usando o GatheRex transferir a suspensão de células no pacote de transferência de suspensão de TILs. NOTA: Certifique-se de manter a borda inclinada até todas as células e meio serem coletados.

[002699] 8.10.18 Colheita de TILs. Inspecionar a membrana para células aderentes.

[002700] 8.10.19 Enxaguar a membrana do frasco. Enxaguar o fundo do G-Rex500MCS. Cobrir ~1/4 com membrana de troca de gás com meio de enxague.

[002701] 8.10.20 Fechar os grampos no G-Rex500MCS. Assegurar que

517 / 557 todos os grampos estão fechados no G- Rex500MCS.

[002702] 8.10.21 Termosselar. Termosselar (por Nota de Processo 5.12) o pacote de transferência contendo o TIL tão próximo da solda como possível de modo que o comprimento da tubulação total permaneça aproximadamente igual.

[002703] 8.10.22 Termosselar. Termosselar o Labtainer 10L contendo o sobrenadante (por Nota de Processo 5.12) e passar no BSC para a coleta da amostra em Etapa 8.10.25.

[002704] 8.10.23 Calcular volume de suspensão de TILs. Registrar peso de pacote de transferência com suspensão de células e calcular o volume da suspensão.

[002705] 8.10.24 Preparar pacote de transferência para remoção da amostra. Soldar (por Nota de Processo 5.11) um conjunto de transferência de plasma de 10,16 cm para o pacote de transferência de suspensão de TILs da Etapa 8.10.21, deixando a extremidade de luer fêmea fixada tão próximo da bolsa como possível.

[002706] 8.10.25 Remover as amostras de teste do sobrenadante de células. No BSC, remover 10,0 mL de sobrenadante do Labtainer 10L usando abertura de luer fêmea e seringa apropriadamente dimensionada. Colocar em um tubo cônico de 15mL e rotular como “BacT”. Reter o tubo para amostra BacT em Etapa 8.10.28.

[002707] 8.10.26 Remover amostras de teste para o sobrenadante de células. Usando uma seringa separada, remover 10,0 mL de sobrenadante e colocar em um tubo cônico de 15mL. Reter o tubo para amostra de micoplasma para uso em Etapa 8.10.32. Rotular o tubo como “diluente de micoplasma”

[002708] 8.10.27 Fechar a bolsa de sobrenadante. Colocar uma tampa vermelha na abertura de luer para fechar a bolsa, e passar fora do BSC.

[002709] 8.10.28 Amostragem de teste de esterilidade & BacT. No BSC,

518 / 557 remover uma amostra de 1,0mL a partir do tubo cônico de 15 mL rotulado BacT preparado em Etapa 8.10.25 usando uma seringa apropriadamente dimensionada e inocular a garrafa anaeróbica. Repetir o acima para a garrafa aeróbica. NOTA: Esta etapa pode ser realizada fora de sequência.

[002710] 8.10.29 Rotular e armazenar amostras. Rotular com rótulo de inventário de plano de amostra e armazenar amostra de BacT em temperatura ambiente, protegida da luz, até submeter a Login para testagem pelo Plano de Amostra. NOTA: Não cobrir o código de barras no frasco com rótulo.

[002711] 8.10.30 Assinar para Amostragem. Assegurar que a planilha de amostra de LIMS está completa para a remoção da amostra.

[002712] 8.10.31 Remover contagem de células amostras. No BSC, usando seringas de 3mL separadas para cada amostra, remover amostras de contagem de células 4x1,0 mL do pacote de transferência de “suspensão de TILs” usando a conexão luer. Colocar amostras em criofrascos-ampolas preparados em Etapa 8.9.29.

[002713] 8.10.32 Remover amostras de micoplasma. Usando uma seringa de 3mL, remover 1,0 mL de suspensão de pacote de transferência de TILs e colocar em tubo cônico de 15 mL rotulado “diluente de micoplasma” preparado em Etapa 8.10.26.

[002714] 8.10.33 Rotular e armazenar amostra. Rotular com rótulo de inventário de plano de amostra e armazenar a amostra de micoplasma a 2-8ºC até submeter a Login para testagem pelo Plano de Amostra.

[002715] 8.10.34 Assinar para Amostragem. Assegurar que a planilha de amostra do LIMS foi preenchida para a remoção da amostra.

[002716] 8.10.35 Preparar pacote de transferência para semeadura. No BSC, fixar a extremidade da tubulação de diâmetro grande de um conjunto de transferência de fluido de bomba repetidora para o adaptador Luer no pacote de transferência contendo o TIL. Prender a linha próxima do pacote de transferência usando um hemostato. Colocar uma tampa vermelha sobre a

519 / 557 extremidade do conjunto de transferência.

[002717] 8.10.36 Colocar TIL em incubador. Remover suspensão de células a partir do BSC e colocar em incubador até necessário. Registrar o tempo.

[002718] 8.10.37 Realizar contagens de células. Realizar contagens de células e cálculos utilizando NC-200 e Nota de Processo 5.14. Diluir amostras de contagem de células inicialmente por adição de 0,5mL de suspensão de células em 4,5mL de meio AIM-V preparado em Etapa 8.9.29. Isto dá uma diluição de 1:10.

[002719] 8.10.38 Registrar volumes de amostra de contagem de células

8.10.39 Determinar fator de multiplicação. Parâmetro Fórmula Resultado Contagem de células total

8.10.38A + 8.10.38B C. µL Volume de amostra Fator de multiplicação C ÷ 8.10.38A D.

[002720] 8.10.40 Selecionar protocolos e inserir fatores de multiplicação. Assegurar que o protocolo de “ensaio de contagem de células viáveis” foi selecionado, todos os fatores de multiplicação, e volumes de amostra e diluente foram inseridos.

[002721] 8.10.41 Registrar nome de arquivo, viabilidade e contagens de células do Nucleoview.

[002722] 8.10.42 Determinar a média de concentração de células viáveis e viabilidade das contagens de células realizadas. Parâmetro Fórmula Resultado viabilidade (8.10.41A + 8.10.41B) ÷ 2 E. % Concentração de célula (8.10.41C + 8.10.41D) ÷ 2 F. células/mL viável

[002723] 8.10.43 Determinar limite superior e inferior para contagens. Parâmetro Fórmula Resultado Limite inferior 8.10.42F x 0,9 G. células/mL Limite superior 8.10.42F x 1.1 H. células/mL

[002724] 8.10.44 Estavam ambas as contagens dentro de limites aceitáveis?

520 / 557 Parâmetro Fórmula Resultado (Sim/Não) Limite inferior 8.10.41C e D ≥ 8.10.43G Limite superior 8.10.41 C e D ≤ 8.10.43H

[002725] 8.10.45 Se aplicável: Realizar contagens de células. Realizar contagens de células e cálculos utilizando NC-200 e Nota de Processo 5.14. NOTA: Diluição pode ser ajustada de acordo com e baseada na concentração esperada de células.

[002726] 8.10.46 Se aplicável: Registrar volumes de amostra de contagem de células. NOTA: Se nenhuma diluição foi necessária, inserir “Amostra [µL]” = 200, “Diluição [µL]” = 0

[002727] 8.10.47 Se aplicável: Determinar fator de multiplicação. Parâmetro Fórmula Resultado Contagem de células total

8.10.46A + 8.10.46B C. mL sample Volume Fator de multiplicação C ÷ 8.10.46A D.

[002728] 8.10.48 Se aplicável: Selecionar protocolos e inserir fatores de multiplicação. Assegurar que o protocolo de “ensaio de contagem de células viáveis” foi selecionado, todos os fatores de multiplicação, e volumes de amostra e diluente foram inseridos.

[002729] NOTA: Se não for necessária diluição, inserir “Amostra [µL]” = 200, “Diluição [µL]” = 0

[002730] 8.10.49 Se aplicável: Registrar contagens de células de Nucleoview

[002731] 8.10.50 Se aplicável: Determinar a média de concentração de células viáveis e viabilidade das contagens de células realizadas. Parâmetro Fórmula Resultado viabilidade (8.10.49A + 8.10.49B) ÷ 2 E. % Concentração de célula (8.10.49C + 8.10.49D) ÷ 2 F. células/mL viável

[002732] 8.10.51 Se aplicável: Determinar limite superior e inferior para contagens. Parâmetro Fórmula Resultado Limite inferior 8.10.50F x 0,9 G. células/mL Limite superior 8.10.50F x 1.1 H. células/mL

[002733] 8.10.52 Se aplicável: Estão as contagens dentro de limites

521 / 557 aceitáveis? Parâmetro Fórmula Resultado (Sim/Não) Limite inferior 8.10.49 C e D ≥ 8.10.51G Limite superior 8.10.49 C e D ≤ 8.10.51H

[002734] NOTA: Se um dos resultados é “Não”, continuar para Etapa

8.10.53 para determinar uma média de todas as contagens de células coletadas.

[002735] 8.10.53 Se aplicável: Determinar uma concentração média de células viáveis a partir de todas as quatro contagens realizadas.

[002736] 8.10.54 Ajustar volume de suspensão de TILs. Calcular o volume ajustado de suspensão de TILs após remoção de amostras de contagem de células. Volume de células de TILs total de Etapa 8.10.23C menos 5,0 mL removido para teste.

[002737] 8.10.55 Calcular células de TILs viáveis totais. Parâmetro Fórmula Resultado

8.10.42 F* -ou- Concentração média de

8.10.50 F* -ou- A. células/mL célujlas viáveis*

8.10.53E* Volume Total 8.10.54 C B. mL Total de células viáveis AxB C. células

[002738] 8.10.56 Calcular frascos para subcultura. Calcular o número total de frascos para semear. NOTA: Arredondar o número de frascos G- Rex500MCS para ver o número inteiro mais próximo Contagem total de células Células alvo requeridas por Número viáveis frasco de G-Rex500MCS de Etapa 8.10.55C B Frascos para semear A C= A÷B células 1,0x109 células/frasco frascos

[002739] NOTA: O número máximo de frascos G-Rex500MCS para semear foi cinco. Se o número calculado de frascos a semear exceder cinco, somente cinco foram semeados USANDO O VOLUME COMPLETO DE

SUSPENSÃO DE CÉLULAS DISPONÍVEL

[002740] 8.10.57 Calcular número de frascos para subcultura Critério Sim/Não Número de Frascos G-Rex500MCS para semear Etapa 8.10.56C ≤ 5 Se sim, semear o número de frascos calculado em Etapa 8.10.58.

522 / 557 Número de Frascos G-Rex500MCS para semear Etapa 8.10.56C > 5 Se sim, semear 5 frascos com TODAS as células disponíveis.

[002741] 8.10.58 Revisão de controle QA dos cálculos de contagem de células realizados em etapas 8.10.38 – 8.10.57.

[002742] 8.10.59 Determinar número de bolsas de meio adicionais necessárias. Calcular o número de bolsas de meio necessário em adição à bolsa preparada em Etapa 8.9.28. Número Número de Número de bolsas Número de de frascos para G- bolsas de meio preparadas em bolsas adicionais a Rex500MCS requeridas Etapa 8.9.22 preparar semear C D=B-C (Etapa 8.10.56C) B=A÷2*

A 1 *Arredondar o número de bolsas de meio requeridas para o próximo número inteiro.

[002743] 8.10.60 Se aplicável: Preparar meio adicional. Preparar uma bolsa de “meio CM4 Dia 16” 10L para cada dois frascos G-Rex-500M necessários calculados em Etapa 8.10.59D. Prosseguir para Etapa 8.10.62 e semear o primeiro frasco(s) GREX-500M enquanto meio adicional é preparado e aquecido.

[002744] 8.10.61 Se aplicável: Preparar bolsas de meio adicional. Preparar e aquecer o número calculado de bolsas adicionais de meio determinado em Etapa 8.10.59D, repetir Etapa 8.9.10 - Etapa 8.9.28.

[002745] 8.10.62 Encher G-Rex500MCS. Abrir um G-Rex500MCS na bancada e inspecionar quanto a rachaduras no vaso ou dobras na tubulação. Assegurar todos os luers de conexão e fechos foram apertados. Fazer uma marca na linha de 4500mL no lado fora do frasco com um marcador. Fechar todos os grampos no G- Rex500MCS, exceto a linha de filtro grande.

[002746] 8.10.63 Encher G-Rex500MCS. Soldar de modo estéril (por Nota de Processo 5.11) a linha vermelha de meio de um G-Rex500MCS para o conjunto de transferência de fluido da bolsa de meio preparada em Etapa

8.9.28.

[002747] 8.10.64 Preparar para bombear meio. Pendurar “meio CM4 Dia 16” em um polo IV. Alimentar da tubulação da bomba através de bomba

523 / 557 Baxa.

[002748] 8.10.65 Bombear meio em G-Rex500MCS. Fixar a bomba Baxa em “alto” e “9” e bombear 4500mL de meio no frasco. Bombear 4,5L de “meio CM4 Dia 16” no G-Rex500MCS, encher até a linha marcada no frasco em Etapa 8.10.62. Uma vez que 4,5L de meio foram transferidos, parar de bombear.

[002749] 8.10.66 Termosselar. Termosselar (por Nota de Processo 5.12) a linha vermelha de meio de G-Rex500MCS, próxima da solda criada em Etapa 8.10.63, remover a bolsa de meio.

[002750] 8.10.67 Repetir enchimento. Repetir Etapas 8.10.62-8.10.66 para cada frasco calculado em Etapa 8.10.56C à medida que o meio é aquecido e preparado para uso. NOTA: Frascos múltiplos podem ser cheios ao mesmo tempo usando enchimento por gravidade ou bombas múltiplas. NOTA: Encher somente dois frascos por bolsa de meio.

[002751] 8.10.68 Registrar e rotular frasco(s) cheios. Rotular cada frasco alfabeticamente até estar cheio e com QA fornecido nos rótulos de “Dia 16” em processo.

[002752] 8.10.69 Rotular amostra. Anexar o rótulo de amostra “Dia 16” abaixo.

[002753] 8.10.70 Se aplicável: Incubar frasco. Manter o frasco em incubador enquanto esperando para semear com TIL.

[002754] 8.10.71 Verificar número de frascos cheios. Registrar o número total de frascos cheios.

[002755] 8.10.72 Calcular volume de suspensão de células a adicionar. Calcular o volume alvo de suspensão de TILs a adicionar para os novos frascos G-Rex500MCS. Volume total de suspensão de Volume alvo de TIL suspensão de células a Número de frasco(s) cheios de Etapa transferir para cada frasco de Etapa 8.10.71

8.10.54C C= A÷B

A mL mL

524 / 557

[002756] 8.10.56C Se exceder cinco, somente cinco serão semeados, USANDO O VOLUME COMPLETO DE SUSPENSÃO DE CÉLULAS.

[002757] 8.10.73 Preparar frascos para semeadura. Remover G- Rex500MCS da Etapa 8.10.70 a partir do incubador.

[002758] 8.10.74 Preparar para bombear. Fechar todos os grampos no G-Rex500MCS exceto a linha de filtro grande. Alimentar a tubulação da bomba através de bomba Baxa.

[002759] 8.10.75 Remover TIL do incubador. Remover pacote de transferência de “suspensão de TILs” a partir do incubador e registrar tempo final de incubação em Etapa 8.10.36.

[002760] 8.10.76 Preparar suspensão de células para semeadura. Soldar de modo estéril (por Nota de Processo 5.11) pacote de transferência de “suspensão de TILs” da Etapa 8.10.75 para bombear linha de entrada.

[002761] 8.10.77 Tarar na balança. Colocar a bolsa de suspensão de TILs em uma balança. Iniciar a linha a partir da bolsa de suspensão de TILs para a solda usando da bomba Baxa fixada em “baixa” e “2”. Tarar a balança.

[002762] 8.10.78 Semear o frasco com suspensão de TILs. Fixar bomba Baxa em “média” e “5”. Bombear o volume de suspensão de TILs calculado em Etapa 8.10.72C em frasco. Registrar o volume de TIL Suspensão adicionada a cada frasco.

[002763] 8.10.79 Termosselar. Termosselar (por Nota de Processo 5.12) o pacote de transferência de “suspensão de TILs” , deixando suficiente tubulação para soldar no próximo frasco. Usar o extrator de linha para limpar a suspensão residual de TILs na linha do frasco G-Rex no vaso.

[002764] 8.10.80 Encher os frascos restantes. Entre cada frasco semeado, assegurar para misturar pacote de transferência de “suspensão de TILs” e repetir as Etapas 8.10.76-8.10.79 para semear todos os frascos restantes. Encher frasco(s) em ordem alfabética.

[002765] 8.10.81 Monitorar incubador. NOTA: Se frascos devem ser

525 / 557 divididos entre dois incubadores, assegurar de monitorar ambos. Parâmetros do incubador: tela LED de temperatura: 37,0±2,0 ºC, porcentagem de CO2: 5,0±1,5 %CO2.

[002766] 8.10.82 Incubar frascos. Registrar o tempo em que cada frasco é colocado no incubador.

[002767] 8.10.83 Calcular janela de incubação. Realizar cálculos abaixo para determinar a faixa de tempo range para remover G-Rex500MCS do incubador no Dia 22. Frasco 8.10.83A 8.10.83B 8.10.83C Tempo de incubação Limite inferior: Limite superior: (Etapa 8.10.82) Tempo de incubação Tempo de (DDMMMYY HHMM) + 132 horas incubação + 156 (DDMMMYY horas HHMM) (DDMMMYY HHMM)

[002768] 8.10.84 Monitoramento ambiental. Após processamento, verificar se BSC e monitoramento do pessoal foram realizados.

[002769] 8.10.85 Envio de amostra. Assegurar se todas as amostras Dia 16 foram submetidas a Login.

[002770] 8.10.86 Rever Seção 8.10.

[002771] 8.11 Dia 22 Lavar preparação de tampão

[002772] 8.11.1 Verificar higienização da sala, liberação de linhas, e materiais.

[002773] 8.11.2 Assegurar conclusão da lista de verificação de pré- processamento.

[002774] 8.11.3 Monitoramento ambiental. Antes do processamento, assegurar se o monitoramento ambiental pré-processo foi realizado.

[002775] 8.11.4 Preparar bolsa de 10 L Labtainer em BSC, fixar um conjunto de transferência de plasma de 10,15 cm em uma bolsa Labtainer 10L via conexão luer.

[002776] 8.11.5 Preparar rótulo de bolsa de 10 L Labtainer como “sobrenadante”, número de lote, e inicial/data.

[002777] 8.11.6 Preparar bolsa de 10 L Labtainer. Fechar todos os

526 / 557 grampos antes de transferir BSC. NOTA: Preparar uma bolsa de 10L Labtainer para cada dois frascos G-Rex500MCS a ser colhidos. NOTA: Bolsa(s) de sobrenadante foram usadas em Seção 8.12, que pode ser realizada simultaneamente com Seção 8.11.

[002778] 8.11.7 Soldar o conjunto de transferência de fluido. Fora do BSC, fechar todas as pinças em 4S-4M60. Soldar (por Nota de Processo 5.11) o conjunto de transferência de fluido repetidor para uma das extremidades luer macho de 4S-4M60. (Ver, por exemplo, Figura 132.)

[002779] 8.11.8 Passar os materiais no BSC. Passar Plasmalyte-A e Albumina humana a 25% no BSC. Passar o conjunto de 4S-4M60 e conjunto de transferência de fluido repetidor no BSC. Descrição do componente Quant. necessária Plasmalyte-A 3000,0 mL Albumina humana 25% 120,0 mL 4S-4M60 com conjunto de transferência 1 aparelho de fluido repetidor Etapa 8.11.7

[002780] 8.11.9 Bombear Plasmalyte em bolsa de 3000mL. Cravar três bolsas de Plasmalyte-A para o conjunto de conector 4S-4M60. NOTA: Limpar a cobertura da abertura com um chumaço de álcool (W3009488) antes de remover. NOTA: manter pressão constante enquanto girando a ponta em uma direção. Assegurar não perfurar o lado da abertura.

[002781] 8.11.10 Bombear Plasmalyte em bolsa de 3000mL. Conectar uma bolsa de coleta Origen 3000mL via conexão luer para a extremidade de diâmetro maior do conjunto de transferência da bomba repetidora.

[002782] 8.11.11 Bombear Plasmalyte em bolsa de 3000mL. Fechar os grampos nas linhas não usadas da bolsa Origen de 3000mL.

[002783] 8.11.12 Bombear Plasmalyte em bolsa de 3000mL. Escalonar a bomba Baxa próximo do BSC. Alimentar a tubulação do conjunto de transferência através de bomba Baxa situada fora do BSC. Configurar a bomba para “Alta” e “9”.

[002784] 8.11.13 Bombear Plasmalyte em bolsa de 3000mL. Abrir todos os grampos a partir do Plasmalyte-A para a bolsa de 3000mL Origen.

527 / 557

[002785] 8.11.14 Bombear Plasmalyte em bolsa de 3000mL. Bombear todo o Plasmalyte-A na bolsa de 3000 mL Origen. Uma vez que todo o Plasmalyte-A foi transferido, parar de bombear.

[002786] 8.11.15 Bombear Plasmalyte em bolsa de 3000mL. Se necessário, remover o ar da bolsa de 3000mL Origen revertendo a bomba e manipulando a posição da bolsa.

[002787] 8.11.16 Bombear Plasmalyte na bolsa de bolsa de 3000mL. Fechar todos os grampos. Remover a bolsa de 3000mL a partir do conjunto de transferência de fluido de bomba repetidora via conexão luer e colocar uma tampa vermelha (W3012845) na linha para a bolsa.

[002788] 8.11.17 Adicionar albumina humana a 25% para a bolsa de bolsa de 3000mL. Abrir mini-ponta ventilada. Sem comprometer a esterilidade da ponta, assegurar que a tampa azul está presa de modo seguro.

[002789] 8.11.18 Adicionar albumina humana 25% à bolsa de 3000mL. Cravar o septo da garrafa de albumina humana a 25% com a mini-ponta ventilada. NOTA: Assegurar a garantia de não comprometer a esterilidade da ponta.

[002790] 8.11.19 Adicionar albumina humana a 25% à bolsa de 3000mL. Repetir a Etapa 8.11.17 - Etapa 8.11.18 duas vezes por um total de três (3) garrafas de albumina humana 25%.

[002791] 8.11.20 Adicionar albumina humana a 25% à bolsa de 3000mL. Remover a tampa azul de uma mini-ponta ventilada e fixar uma seringa de 60mL para a garrafa de soro de albumina humano a 25%.

[002792] 8.11.21 Adicionar albumina humana 25% à bolsa de 3000mL. Puxar 60mL de soro de albumina humana a 25%. NOTA: Pode ser necessário usar mais do que uma garrafa de soro de albumina humana a 25%. Se necessário, desconectar a seringa a partir do mini-ponta ventilada e conectar a mesma à próxima mini-ponta ventilada na garrafa de soro de albumina humana a 25%. Não remover a mini-ponta ventilada a partir da garrafa de

528 / 557 soro de albumina humana a 25%.

[002793] 8.11.22 Adicionar albumina humana a 25% à bolsa de 3000mL. Uma vez que 60mL foram obtidos, remover a seringa a partir da mini-ponta ventilada.

[002794] 8.11.23 Adicionar albumina humana a 25% à bolsa de 3000mL. Fixar a seringa à abertura de injeção sem agulha em bolsa de 3000mL Origen cheia com Plasmalyte-A em Etapa 8.11.16. Dispensar toda a albumina humana a25%. NOTA: Limpar a abertura de injeção sem agulha com um chumaço de álcool antes de cada uso.

[002795] 8.11.24 Adicionar albumina humana a 25% à bolsa de 3000mL. Repetir a Etapa 8.11.20 - Etapa 8.11.23 para obter um volume final de 120,0 mL de albumina humana 25%.

[002796] 8.11.25 Misturar bolsa. Suavemente misturar a bolsa após toda a albumina humana 25% ser adicionada.

[002797] 8.11.26 Rotular bolsa. Rotular como “tampão de lavagem LOVO” e número de lote, e determinar uma validade de 24 horas.

[002798] 8.11.27 Preparar diluente IL-2. Usando uma seringa de 10mL, remover 5,0 mL de tampão de lavagem LOVO usando a abertura de injeção sem agulha na bolsa de tampão de lavagem LOVO. Dispensar o tampão de lavagem LOVO em um tubo cônico de 50mL e rotular como “ diluente IL-2” e o número de lote. NOTA: Limpar a abertura de injeção sem agulha com um chumaço de álcool antes de cada use.

[002799] 8.11.28 Dividir em alíquotas na bolsa de controle em branco CRF o tampão de lavagem LOVO. Usando a seringa de 100mL, puxar 70,0 mL de tampão de lavagem LOVO a partir da abertura de injeção sem agulha. NOTA: Limpar a abertura de injeção sem agulha com um chumaço de álcool antes de cada uso.

[002800] 8.11.29 Dividir em alíquotas na bolsa de controle em branco CRF o tampão de lavagem LOVO. Colocar uma tampa vermelha na seringa e

529 / 557 rotular como “bolsa de crio-controle em branco” e número de lote. NOTA: Manter a seringa em temperatura ambiente até necessário em Etapa 8.14.3

[002801] 8.11.30 Completar a preparação do tampão de lavagem. Fechar todos os grampos na bolsa de tampão de lavagem LOVO.

[002802] 8.11.31 Descongelar IL-2. Descongelar um 1,1mL de IL-2 (6x106 IU/mL) ), até todo o gelo derreter. Registrar o número de lote e validade de IL-2. NOTA: Assegurar que o rótulo de IL-2 seja fixado.

[002803] 8.11.32 IL-2 Preparação. Adicionar 50µL de carga de IL-2 (6x106 IU/mL) para o tubo cônico de 50mL Rotular “diluente IL-2.”

[002804] 8.11.33 IL-2 Preparação. Rotular de novo o tubo cônico como “IL-2 6x104”, a data, número de lote, e validade de 24 horas. Tampar e armazenar a 2-8˚C.

[002805] 8.11.34 Preparar crioconservação. Colocar 5 crio-cassetes a 2- 8°C para pré-condicionar os mesmos para a crioconservação de produto final.

[002806] 8.11.35 Preparar diluições de contagem de células. No BSC, adicionar 4,5mL de meio AIM-V que foi rotulado com número de lote e “para diluições de contagem de células” em 4 tubos cônicos de 15mL separados. Rotular os tubos com o número de lote de registro de batelada e número de tubo (1-4). Colocar de lado para uso em Etapa 8.12.34

[002807] 8.11.36 Preparar contagens de células. Rotular 4 criofrascos- ampolas com número de frasco-ampola (1-4). Manter frascos-ampolas sob BSC a ser usado em Etapa 8.12.33.

[002808] 8.11.37 Rever Seção 8.11

[002809] 8.12 Dia 22 Colheita de TILs

[002810] 8.12.1 Monitorar incubador. Monitorar o incubador. Parâmetros do incubador: tela LED de temperatura: 37 ± 2,0°C, porcentagem de CO2: 5%±1,5%. NOTA: Seção 8.12 pode ser realizada simultaneamente com Seção 8.11.

[002811] 8.12.2 Remover os frascos G-Rex500MCS do incubador.

530 / 557 Realizar verificação abaixo para assegurar que os parâmetros de incubação foram atendidos antes de remover G-Rex500MCS do incubador. Frasco Prate Limite inferior de Limite superior de Tempo de remoção Será 8.10.83F < tempo leira etapa 8.10.83D etapa 8.10.83C incubador de remoção do (DDMMMYY (DDMMMYY ((DDMMMYY incubador < Etapa HHMM) HHMM) HHMM) 8.10.83C Sim/Não*

[002812] NOTA: Esta etapa deve ser realizada à medida que cada frasco é removido a partir do incubador.

[002813] 8.12.3 Preparar bolsa de coleta de TIL. Rotular uma bolsa de coleta de 3000mL como “suspensão de TILs”, número de lote, e inicial/data.

[002814] 8.12.4 Vedar as conexões extra. Termosselar as duas conexões luer na bolsa de coleta próximo da extremidade de cada conexão por Nota de Processo 5.12.

[002815] 8.12.5 Configuração de GatheRex. Soldar de modo estéril (por Nota de Processo 5.11) a linha de remoção de meio vermelha a partir do G- Rex500MCS para a bolsa 10L Labtainer preparada em Etapa 8.11.5. NOTA: Fazer referência da Nota de Processo 5.16 para uso de dispositivos GatheRex múltiplos.

[002816] 8.12.6 Configuração de GatheRex. Soldar de modo estéril (por Nota de Processo 5.11) a linha de remoção de células limpas a partir do G- Rex500MCS para a bolsa de coleta de suspensão de TILs preparada em Etapa

8.12.3. NOTA: Fazer referência da Nota de Processo 5.16 para uso de dispositivos GatheRex múltiplos.

[002817] 8.12.7 Configuração de GatheRex. Colocar o frasco G- Rex500MCS no lado à esquerda do GatheRex. Colocar a bolsa de sobrenadante Labtainer e reunir a bolsa de coleta de suspensão de TILs no lado à direita.

[002818] 8.12.8 Configuração de GatheRex. Instalar a linha vermelha de remoção de meio a partir do G-Rex500MCS para o grampo de topo (marcado com uma linha vermelha) e guias de tubulação no GatheRex. Instalar a linha de colheita limpa a partir do G-Rex500MCS para o grampo de fundo

531 / 557 (marcado com uma linha azul) e guias de tubulação no GatheRex.

[002819] 8.12.9 Configuração de GatheRex. Fixar a linha de gás a partir do GatheRex no filtro estéril do G-Rex500MCS. NOTA: Antes de remover o sobrenadante a partir do G-Rex500MCS, assegurar que todos os grampos nas linhas de remoção de células foram fechados.

[002820] 8.12.10 Redução de volume. Transferir ~4,5L de sobrenadante a partir do G-Rex500MCS para a bolsa de sobrenadante. Visualmente inspecionar G-Rex500MCS para assegurar que o frasco está no nível e meio foi reduzido no final do tubo de imersão de aspiração. Repetir a etapa se necessário. NOTA: Se o GatheRex parar prematuramente, ele pode ser reiniciado pressionando o botão com a seta apontando para a direita novamente.

[002821] 8.12.11 Preparar frasco para colheita de TILs. Após remoção do sobrenadante, fechar todas as pinças para a linha vermelha.

[002822] 8.12.12 Iniciar a coleta de TIL. Registrar o tempo de início da colheita de TILs.

[002823] 8.12.13 Iniciar a coleta de TIL. Vigorosamente bater no frasco e agitar o meio para liberar as células. Realizar uma inspeção do frasco para assegurar que todas as células se soltaram. Colocar a bolsa de coleta de 3000mL de “suspensão de TILs” sobre panos secos em uma superfície plana. NOTA: Contatar gerência de área se células não se soltarem.

[002824] 8.12.14 Iniciar a coleta de TIL. Inclinar o frasco para assegurar que a mangueira está na borda do frasco. NOTA: Se a mangueira de coleta de células não está na junção da parede e na membrana de fundo, bater levemente no frasco enquanto inclinado em um ângulo de 45° é geralmente suficiente para posicionar de modo apropriado a mangueira.

[002825] 8.12.15 Colheita de TILs. Liberar todos os grampos levando para a bolsa de coleta de suspensão de TILs.

[002826] 8.12.16 Colheita de TILs. Usando o GatheRex, transferir a

532 / 557 suspensão de TILs na bolsa de coleta de 3000mL. NOTA: Manter a borda inclinada até que todas as células e meio foram coletados.

[002827] 8.12.17 Colheita de TILs. Inspecionar membrana para células aderentes.

[002828] 8.12.18 Enxaguar a membrana do frasco. Enxaguar o fundo do G-Rex500MCS. Cobrir ~1/4 de da membrana de troca de gás com meio de enxague.

[002829] 8.12.19 Fechar os grampos no G- Rex500MCS. Assegurar que todos os grampos estão fechados.

[002830] 8.12.20 Termosselar. Termosselar (por Nota de Processo 5.12) a bolsa de coleta contendo o TIL tão próximo da solda como possível de modo que o comprimento total da tubulação permaneça aproximadamente igual.

[002831] 8.12.21 Termosselar. Termosselar (por Nota de Processo 5.12) a bolsa de sobrenadante.

[002832] 8.12.22 Completar a colheita de frascos G-Rex 500 MCS restantes. Repetir Etapas 8.12.2 e 8.12.5 - 8.12.21, reunir todos os TILs na mesma bolsa de coleta.

[002833] NOTA: FOI NECESSÁRIO SUBSTITUIR A BOLSA DE COLETA DE SOBRENADANTE DE 10L APÓS CADA 2º. FRASCO. NOTA: Fazer referência à Nota de Processo 5.16 para uso de dispositivos GatheRex múltiplos.

[002834] 8.12.23 Preparar bolsa fonte LOVO. Obter uma nova bolsa de coleta de 3000mL. Rotular como “bolsa fonte LOVO”, número de lote, e Inicial/Data.

[002835] 8.12.24 Preparar bolsa fonte LOVO. Termosselar (por Nota de Processo 5.12) a tubulação na “bolsa fonte LOVO”, remover os luers fêmeas, deixando linha suficiente para soldar.

[002836] 8.12.25 Pesar a bolsa fonte LOVO. Colocar um caixote de

533 / 557 plástico apropriadamente dimensionado na balança e tarar. Colocar a bolsa fonte LOVO, incluindo aberturas e linhas no caixote e registrar o peso seco.

[002837] 8.12.26 Transferir suspensão de células em bolsa fonte LOVO. Fechar todos os grampos de um filtro de sangue de 170 µm por gravidade.

[002838] 8.12.27 Transferir suspensão de células em bolsa fonte LOVO. Soldar de modo estéril (por Nota de Processo 5.11) a extremidade terminal longa do filtro de sangue por gravidade para a bolsa fonte LOVO.

[002839] 8.12.28 Transferir suspensão de células em bolsa fonte LOVO. Soldar de modo estéril (por Nota de Processo 5.11) uma das duas linhas de fonte do filtro para a bolsa de coleta de “suspensão de TILs reunidos”.

[002840] 8.12.29 Transferir suspensão de células em bolsa fonte LOVO. Uma vez que a solda está completa, termosselar (por Nota de Processo 5.12) a linha não usada no filtro para remover a mesma.

[002841] 8.12.30 Transferir a suspensão de células em bolsa fonte LOVO. Abrir todos os grampos necessários e elevar a suspensão de TILs pendurando a bolsa de coleta em um polo IV para inibir a transferência de fluxo por gravidade de TIL através de filtro de sangue e na bolsa fonte LOVO. Suavemente girar ou amassar a bolsa de suspensão de TILs enquanto drenando a fim de manter TILs em suspensão uniforme.

[002842] Nota: Não deixar a bolsa fonte LOVO ficar pendurada a partir do aparelho de filtração. Depositar a bolsa fonte LOVO em panos secos sobre uma superfície plana.

[002843] 8.12.31 Fechar todos os grampos. Uma vez que todo o TIL foi transferido para a bolsa fonte LOVO, fechar todos os grampos.

[002844] 8.12.32 Termosselar. Termosselar (por Nota de Processo 5.12) tão próximo da solda como possível para remover filtro de sangue por gravidade.

[002845] 8.12.33 Remover contagens de células amostras. No BSC, usando seringas de 3mL separadas para cada amostra, remover amostras de

534 / 557 4x1,0mL de contagem de células a partir da bolsa fonte LOVO usando a abertura de injeção sem agulha. Colocar amostras nos criofrascos-ampolas preparados em Etapa 8.11.36. NOTA: Limpar a abertura de injeção sem agulha com um chumaço de álcool e misturar a bolsa fonte LOVO entre cada amostra.

[002846] 8.12.34 Realizar contagens de células. Realizar contagens de células e cálculos utilizando NC-200 e Nota de Processo 5.14. Diluir amostras de contagem de células inicialmente por adição de 0,5mL de suspensão de células em 4,5mL de meio AIM-V preparado em Etapa 8.11.35. Isto dá uma diluição de 1:10.

[002847] 8.12.35 Registrar volumes de amostra de contagem de células.

[002848] 8.12.36 Determinar fator de multiplicação Parâmetro Fórmula Resultado Contagem de células total

8.12.35A + 8.12.35B C. µL Volume de amostra Fator de multiplicação C ÷ 8.12.35A D.

[002849] 8.12.37 Selecionar protocolos e inserir fatores de multiplicação. Assegurar que o protocolo de “ensaio de contagem de células viáveis” foi selecionado, todos os fatores de multiplicação, e volumes de amostra e diluente foram inseridos. NOTA: Se não for necessária diluição, inserir “Amostra [µL]” = 200, “Diluição [µL]” = 0

[002850] 8.12.38 Registrar contagens de células de Nucleoview

[002851] 8.12.39 Determinar a viabilidade média, concentração de células viáveis, e concentração de células nucleadas totais das contagens de células realizadas. Parâmetro Fórmula Resultado (8.12.38A + 8.12.38B) viabilidade G. ÷2 Célula viável (8.12.38C + 8.12.38D) H. células/mL Concentração ÷2 Total Nucleated Cell (8.12.38E + 8.12.38F) ÷ I. células/mL Concentração 2

[002852] 8.12.40 Determinar limite superior e inferior para contagens Parâmetro Fórmula Resultado Limite inferior 8.12.39H x 0,9 J. células/mL

535 / 557 Limite superior 8.12.39I x 1.1 K. células/mL

[002853] 8.12.41 Estavam ambas as contagens dentro de limites aceitáveis? Parâmetro Fórmula Resultado (Sim/Não) Limite inferior 8.12.38C e D > 8.12.40J Limite superior 8.12.38C D < 8.12.40J

[002854] NOTA: Se um dos resultados foi “Não”, realizar segundo conjunto de contagens em etapas 8.12.42 – 8.12.49.

[002855] 8.12.42 Se aplicável: Realizar contagens de células. Realizar contagens de células e cálculos utilizando NC-200 e Nota de Processo 5.14. NOTA: Diluição pode ser ajustada de acordo com e baseada na concentração esperada de células.

[002856] 8.12.43 Se aplicável: Registrar volumes de amostra de contagem de células

[002857] 8.12.44 Se aplicável: Determinar fator de multiplicação Parâmetro Fórmula Resultado Contagem de células total

8.12.43A + 8.12.43B C. µL Volume DE AMOSTRA Fator de multiplicação C ÷ 8.12.43A D.

[002858] 8.12.45 Se aplicável: Selecionar protocolos e inserir fatores de multiplicação. Assegurar que o protocolo de “ensaio de contagem de células viáveis” foi selecionado, todos os fatores de multiplicação, e volumes de amostra e diluente foram inseridos.

[002859] NOTA: Se não for necessária diluição, inserir “Amostra [µL]” = 200, “Diluição [µL]” = 0

[002860] 8.12.46 Se aplicável: registrar contagens de células de Nucleoview

[002861] 8.12.47 Se aplicável: Determinar a viabilidade média, concentração de células viáveis e concentração de células nucleadas totais das contagens de células realizadas. Parâmetro Fórmula Resultado (8.12.46A + 8.12.46B) viabilidade G. ÷2 Célula viável (8.12.46C + 8.12.46D) H. células/mL Concentração ÷2

536 / 557 Total Nucleated Cell (8.12.46E + 8.12.46F) ÷ I. células/mL Concentração 2

[002862] 8.12.48 Se aplicável: Determinar limite superior e inferior para contagens Parâmetro Fórmula Resultado Limite inferior 8.12.47 H x 0,9 J. células/mL Limite superior 8.12.47 H x 1.1 K. células/mL

[002863] 8.12.49 Se aplicável: Estão as contagens dentro de limites aceitáveis? Parâmetro Fórmula Resultado (Sim/Não) Limite inferior 8.12.46 C e D ≥ 8.12.48J Limite superior 8.12.46 C e D ≤ 8.12.48K

[002864] NOTA: Se um dos resultados foi “Não”, continuar para Etapa

8.12.50 para determinar uma média

[002865] 8.12.50 Se aplicável: Determinar uma concentração média de células viáveis e concentração de células nucleadas totais média de todas as quatro contagens realizados.

[002866] 8.12.51 Revisão de controle QA de contagens de células. O pessoal de controle QA reviu os cálculos realizados em etapas 8.12.38 –

8.12.50.

[002867] 8.12.52 Pesar a bolsa fonte LOVO. Colocar um caixote de plástico apropriadamente dimensionada na balança e tarar. Colocar a bolsa fonte LOVO total no caixote e registrar o peso. Calcular o volume de suspensão de células.

[002868] 8.12.53 Calcular células de TILs viáveis totais. Parâmetro Fórmula Resultado

8.12.39 H* -ou- Concentração média de

8.12.47 H* A. células/mL células viáveis* -ou-

8.12.50 E* Volume Total 8.12.52 C B. mL Total de células viáveis AxB C. células Será C ≥ 1,5x109? Sim/Não** *Círculo na referência de etapa usada para determinar a concentração de células viáveis. **Se “Sim,” prosseguir. Se “Não,” contatar a gerência de área.

[002869] 8.12.54 Calcular células nucleadas totais.

537 / 557 Parâmetro Fórmula Resultado

8.12.39 I* -ou- Concentração de células

8.12.47 I* A. células/mL nucleadas totais médias* -ou-

8.12.50 J* Volume Total 8.5.52 C B. mL Células nucleadas totais AxB C. células * Círculo na referência de etapa usada para determinar a concentração de células nucleadas totais

[002870] 8.12.55 Preparar diluente de micoplasma. No BSC, remover 10,0 mL de uma bolsa de sobrenadante via abertura de amostra do luer e colocar em um tubo cônico de 15mL.

[002871] Rotular tubo cônico de 15mL com “diluente de micoplasma” e manter no BSC para uso em Etapa 8.14.69.

[002872] 8.12.56 Rever Seção 8.12

[002873] 8.13 LOVO

[002874] 8.13.1 Girar no LOVO usando o comutador à esquerda de trás do instrumento. NOTA: Etapas 8.13.1-8.13.13 podem realizadas simultaneamente com Seções 8.11-8.12.

[002875] 8.13.2 Verificar balanças e sensor de pressão.

[002876] 8.13.3 Certifique-se de que não há nada pendurado em qualquer balança e revise a leitura para cada balança. Registrar valores em Etapa 8.13.5. Nota: Se qualquer uma das leituras da balança estiver for a da faixa de 0 +/- 2 g, realizar calibração da balança.

[002877] 8.13.4 Se todas as balanças estiverem em tolerância com o peso pendurado, prosseguir para pendurar um peso de 1 kg em cada balança (#1-4) e rever a leitura. Registrar valores em Etapa 8.13.5.

[002878] 8.13.5 Balança verificada. Registrar os valores mostradas para cada balança. Se os valores estiverem na faixa, continuar o processamento. Se valores não estiverem na faixa, realizar a calibração.

[002879] 8.13.6 Rever a leitura do sensor de pressão na tela do perfil de operação do instrumento e registrar. A faixa aceitável para a leitura da pressão foi 0 +/- 10 mmHg. Se o valor mostrado estiver fora desta faixa, armazenar uma nova configuração de pressão atmosférica, pelas instruções da máquina.

538 / 557

[002880] 8.13.7 Repetir etapas. Se uma nova calibração da balança for realizada ou uma nova configuração de pressão atmosférica foi armazenada, repetir as Etapas 8.13.3 – 8.13.6.

[002881] 8.13.8 Iniciar o protocolo de “ colheita de TILs G-Rex” a partir do menu desdobrável

[002882] 8.13.9 A tela de Solução 1 exibiu: Tampão tipo leitura PlasmaLyte

[002883] 8.13.10-8.13.16 Seguir as novas instruções de tela sensível ao toque LOVO.

[002884] 8.13.17 Determinar o volume alvo final do produto.

[002885] NOTA: Usando o valor total de células nucleadas (TNC) de Etapa 8.12.54 C e o gráfico abaixo, determinar o volume alvo do produto. Registrar o volume de produto final (mL) Volume de produto final Faixa de células (retito) para alvo (mL) Células 0 < Total (Viável + Morta) 165 ≤ 7.1 X1010 Células 7,1X1010 < Total (Viável + Morta) 215 ≤ 1.1X1011 11 Células 1,1X10 < Total (Viável + Morta) 265 ≤ 1.5X1011

[002886] Nota: Se TVC de Etapa 8.12.53 C foi >1,5x1011, contatar Gerência de área.

[002887] 8.13.18 – 8.13.22 Seguir as indicações de tela sensível ao toque LOVO.

[002888] 8.13.23 Carregar o kit descartável. Antes de carregar o kit descartável, limpar a abertura do sensor de pressão com um pano com álcool seguido por um pano sem fiapos. Carregar o kit descartável. Seguir as instruções da tela no carregamento do kit descartável.

[002889] 8.13.24 Remover a bolsa do filtrado. Quando o kit descartável LOVO padrão foi carregado, tocar no Botão ‘1próximo’. A informação do recipiente e tela de localização são exibidas. Remover a bolsa de filtrado da balança.

539 / 557

[002890] 8.13.25 Assegurar que recipiente de filtrado era novo e fora de escala.

[002891] 8.13.26 Inserir capacidade do filtrado. Soldar de modo estéril a bolsa auxiliar LOVO sobre a linha do luer macho da bolsa de filtrado existente. Assegurar todos que os grampos estão abertos e o trajeto do fluido está limpo. Tocar o campo de entrada de capacidade do recipiente de filtrado. Aparece um teclado numérico. Inserir a nova capacidade de filtrado total (5.000mL). Tocar o botão para aceitar a entrada. NOTA: Volume de filtrado estimado não deve exceder 5000 mL.

[002892] 8.13.27 Colocar o recipiente de filtrado na bancada. NOTA: Se tubulação foi removido a partir do grampo F durante a solda, colocar a tubulação de volta no grampo. Colocar o novo recipiente de filtrado na bancada. NÂO pendurar a bolsa de filtrado na balança #3. A balança #3 estará vazia durante o procedimento.

[002893] 8.13.28 Seguir as instruções da tela sensível ao toque LOVO após as mudanças no recipiente do filtrado.

[002894] 8.13.29 Assegurar kit foi carregado de modo apropriado. A sobreposição de verificações a seco do kit descartável é exibida. Verifique se o kit foi carregado corretamente e se todos os grampos foram abertos. Verificar todos os tubos quanto a dobras ou outras obstruções e corrigir, se possível. Certifique-se de que o kit foi instalado corretamente e verifique todos as pinças de Robert. Pressionar o botão Sim. Todos os grampos mecânicos LOVO fecharam automaticamente e a tela “verificar a instalação do kit descartável” é exibida. O LOVO passou por uma série de etapas de pressurização para verificar o kit.

[002895] 8.13.30 Resultados da verificação do kit. Se a verificação do Kit for aprovada, prossiga para a próxima etapa. * Se não, uma segunda verificação do kit pode ser realizada após a conclusão das verificações. *Se não, verificar se há torções ou outras obstruções em todos os tubos e corrigir.

540 / 557 * Se não, assegurar que o kit foi instalado corretamente e verificar todas as pinças de Robert. Se a segunda verificação do kit falhar: contatar o gerenciamento da área e preparar instalação do novo kit na Seção 10.0. Repetir a Etapa 8.13.23-Etapa 8.13.30 se necessário.

[002896] 8.13.31 Fixar PlasmaLyte. A tela de soluções Connect exibiu. O valor de lavagem deve ser sempre 3000 mL. Inserir este valor na tela. Soldar de modo estéril a bolsa de PlasmaLyte de 3000mL para a tubulação passar através do grampo 1 por Nota de Processo 5.11. Pendurar a bolsa de PlasmaLyte em um polo IV colocando ambas as alças da bolsa de canto no gancho.

[002897] 8.13.32 Verificar que o PlasmaLyte foi fixado. Abrir quaisquer grampos de plástico. Verificar que o volume de entrada de solução foi 3000mL. Tocar o botão “Próximo”. A sobreposição do kit descartável Prime é exibida. Verificar que o PlasmaLyte foi fixado e quaisquer soldas e grampos de plástico na tubulação levando para a bolsa de PlasmaLyte foram abertos, então tocar o botão Sim.

[002898] 8.13.33 Observar que o PlasmaLyte está se movendo. Kit descartável Prime inicia e a tela do kit descartável Prime é exibida. Observar visualmente que PlasmaLyte se movendo através da tubulação está conectado à bolsa de PlasmaLyte. Se nenhum fluido está se movendo, pressionar o botão Pausa na tela e determinar se um grampo ou solda ainda está fechado. Uma vez resolvido o problema, pressionar o botão Iniciar na tela para iniciar o kit descartável Prime. Quando o kit descartável Prime acabou com sucesso, a tela de fonte Connect é exibida.

[002899] 8.13.34-8.13.35 Seguir as instruções da tela sensível ao toque LOVO.

[002900] 8.13.36 Fixar o recipiente fonte à tubulação. Soldar de modo estéril a bolsa fonte LOVO preparada em Etapa 8.12.31 para a tubulação passando através do Grampo S por Nota de Processo 5.11. Pode ser

541 / 557 necessário remover a tubulação a partir do grampo. Nota: Certifique-se de substituir a tubulação fonte no grampo S se removido.

[002901] 8.13.37 Pendurar o recipiente fonte. Pendurar o recipiente fonte no polo IV colocando as alças da bolsa no ganho. NÃO pendure a fonte na balança #1. Abrir todos os grampos para a bolsa fonte.

[002902] 8.13.38 Verificar se o recipiente foi fixado. Tocar o botão ‘1próximo’. A sobreposição de fonte Prime é exibida. Verificar que a fonte foi fixada no kit descartável, e que quaisquer soldas e grampos de plástico na tubulação levando para a fonte foram abertas. Tocar o botão Sim.

[002903] 8.13.39 Confirmar se PlasmaLyte está se movendo. Fonte Prime iniciada e a tela de Fonte Prime exibida. Observar visualmente que PlasmaLyte está se movendo através de tubulação fixada na bolsa fonte. Se nenhum fluido está se movendo, pressionar o botão Pausa na tela e determinar se um grampo ou sonda ainda está fechada. Uma vez resolvido o problema, pressionar o botão Iniciar na tela e iniciar a Fonte Prime.

[002904] 8.13.40 Iniciar a tela de Procedimento. Quando a fonte Prime acaba com sucesso, a tela de início do Procedimento é exibida. Pressionar Partida, a tela de pausa de “ciclo pré-Lavagem 1” aparece imediatamente após pressionar início.

[002905] 8.13.41 Inverter a bolsa de processo. Remover a bolsa de processo da balança #2 (também pode remover a tubulação a partir da guia de tubulação da abertura de topo em processo) e manualmente inverter a mesma para permitir que o tampão de lavagem seja adicionado durante a etapa de kit descartável Prime para revestir todas as superfícies interiores da bolsa. Re- pendurar a bolsa em processo na balança #2 (rótulo na bolsa estava voltado para a esquerda). Substituir a tubulação de abertura no topo na guia de tubulação, se ela foi removida.

[002906] 8.13.42 Inverter bolsa fonte. Antes de pressionar o botão de início, misturar a bolsa fonte sem remover a mesma a partir do polo IV por

542 / 557 massagem dos cantos da bolsa e agitação suave das células para criar uma suspensão homogênea de células. Pressionar o botão Iniciar. O fluido de processamento LOVO foi iniciado a partir da bolsa fonte e a tela de ciclo de lavagem 1 é exibida.

[002907] 8.13.43 Pausar o enxague da fonte. A tela de pausa da fonte enxague é exibida uma vez que o recipiente é adicionado na bolsa fonte. Sem remover a bolsa fonte do polo IV, massagear os cantos e misturar bem. Pressionar Prosseguir.

[002908] 8.13.44 Misturar em pausa da bolsa de processo. Preparar as células para outra passagem através do girador, a bolsa de processo foi diluída com tampão de lavagem. Após adicionar o tampão de lavagem para a bolsa em processo, o LOVO pausa automaticamente e exibe a tela de Pausa “Mistura da bolsa em processo”. Sem remover a bolsa da balança, misturar o produto bem apertando a bolsa. Pressionar prosseguir.

[002909] 8.13.45 Pausar massagear os cantos em processo. Quando a bolsa em processo está vazia, tampão de lavagem foi adicionado na abertura de fundo da bolsa em processo para enxaguar a bolsa. Após adicionar o fluido de enxague, LOVO pausado automaticamente e exibida a tela pausar ‘massagear cantos IP”. Quando a tela pausar ‘massagear cantos IP” é exibida, NÃO remover a bolsa da balança #2. Com a bolsa em processo ainda pendurada na balança #2, massagear os cantos da bolsa para levar as células residuais em suspensão. Assegurar que a bolsa não está balançando na balança e pressionar o botão Prosseguir.

[002910] 8.13.46 Esperar a tela Remover Produtos. No final do procedimento LOVO, a tela de Remover Produtos é exibida. Quando a tela aparece, todas as bolsas no kit LOVO podem ser manipuladas. Nota: Não toque as bolsas até a tela Remover Produtos ser exibida.

[002911] 8.13.47 Remover a bolsa de retido. Colocar um hemostato na tubulação muito próximo da abertura da bolsa de retido para impedir a

543 / 557 suspensão de células de assentar na tubulação. Termosselar (por Nota de Processo 5.12) abaixo do hemostato, certificando-se de manter linha suficiente para soldar em Etapa 8.13.48. Remover a bolsa de retido.

[002912] 8.13.48 Preparar bolsa de retido para formulação. Soldar (por Nota de Processo 5.11) a extremidade de trava luer fêmea de um conjunto de transferência de plasma de 10,16 cm para a bolsa de retido. Transferir a bolsa de retido para o BSC para uso em Etapa 8.14.11.

[002913] 8.13.49 Remover Produtos. Seguir as instruções na tela Remover Produtos. Fechar todos os grampos no kit LOVO para impedir movimento de fluido.

[002914] 8.13.50 Remover produtos. Tocar o botão ‘próximo’. Todos os grampos mecânicos do LOVO são abertos e a tela Remover kit exibida.

[002915] 8.13.51 Registrar dados. Seguir as instruções na tela Remover Kit. Tocar o botão “Próximo”. Todos os grampos mecânicos do LOVO fecham e a tela Sumário dos Resultados é exibida. Registrar os dados a partir da tela de sumário de resultados na tabela exatamente como são exibidos. Fechar todas as bombas e suporte de filtro. Remover o kit quando solicitado assim pelo LOVO. *NOTA: Todos os tempos registrados foram registrados diretamente a partir da tela de Sumário de Resultados LOVO em formato HH:MM:SS e formato (HH:MM:SS) quando aplicável.

[002916] 8.13.52-8.13.54 Seleção de Protocolo quando desligar LOVO. Seguir as instruções de tela LOVO.

[002917] 8.13.55 Rever Seção 8.13

[002918] 8.14 Formulação final e enchimento

[002919] 8.14.1 Marcar cálculo volume/bolsa. A partir da tabela abaixo, selecionar o número de bolsas CS750 a serem cheias, marcar o volume de enchimento por bolsa, volume removido a reter por bolsa, e marcar no final o volume por bolsa que correspondia ao volume de retido LOVO da Etapa

8.13.22.

544 / 557 Volume Volume volume previsto Número de Volume de Volume Volume alvo de de CS10 final de bolsas enchimento removido final por bolsa produto a adicionar ao produto a serem alvo pov a reter por LOVO produto formulado cheias bolsa bolsa 165mL 165mL 330mL 3 107mL 7mL 100mL 215mL 215mL 430mL 4 105mL 5mL 100mL 265mL 265mL 530mL 4 130mL 5mL 125mL

[002920] 8.14.2 Preparar controle CRF em branco. Calcular volume D de CS-10 e tampão de lavagem LOVO para formular a bolsa de controle em branco. Volume alvo final por Volume de tampão de Volume de controle em bolsa lavagem de controle em branco CS-10

8.14.1E branco LOVO B = A/2 (mL) A C=B mL mL mL

[002921] 8.14.3 Preparar controle CRF em branco. Fora do BSC, usar a seringa de tampão de lavagem LOVO preparada em Etapa 8.11.29, adicionar volume calculado em Etapa 8.14.2 B para uma bolsa vazia CS750 via conexão luer. Nota: A formulação da bolsa de controle em branco CS750 não precisa ser feita assepticamente.

[002922] 8.14.4 Preparar controle CRF em branco. Usando uma seringa apropriadamente dimensionada, adicionar o volume de CS-10 calculado em Etapa 8.14.2 para a mesma bolsa CS750 preparado em Etapa 8.14.3. Colocar uma tampa vermelha na bolsa CS750.

[002923] 8.14.5 Preparar controle CRF em branco. Remover tanto ar como possível a partir da bolsa CS-750 como possível. Termosselar (por Nota de Processo 5.12) a bolsa CS750 tão próximo da bolsa como possível, remover a tubulação.

[002924] 8.14.6 Preparar controle CRF em branco. Rotular a bolsa CS750 com “controle CRF em branco”, número de lote, e inicial/data. Colocar o controle CRF em branco em embalagens frias até ser colocado no CRF.

[002925] 8.14.7 Calcular volume de IL-2 requerido. Calcular o volume de IL-2 a adicionar para o produto final

545 / 557 Parâmetro Fórmula Resultado Volume de retido final Etapa 8.13.51 A. mL Volume formulado final B=Ax2 B. mL Concentração Final de IL-2 300 IU/mL C. 300 IU/mL desejada (IU/mL) IU de IL-2 requerido D=BxC D. IU Carga de trabalho de IL-2 de 6 x 104 IU/mL E. 6 x 104 IU/mL Etapa 8.11.33 Volume de IL-2 para adicionar ao produto final F=D÷E F. mL

[002926] 8.14.8 Montar o aparelho Connect. Soldar de modo estéril (por Nota de Processo 5.11) um 4S-4M60 a um dispositivo CC2 Cell Connect substituindo uma ponta única no aparelho Cell Connect (B) com a extremidade de quatro pontas do coletor 4S-4M60 em (G). (Ver, por exemplo, Figura 135.)

[002927] 8.14.9 Montar o aparelho Connect. Soldar de modo estéril (por Nota de Processo 5.11) as criobolsas CS750 para a interface de tubos preparada em Etapa 8.14.8, substituindo uma das quatro extremidades de luer macho (E) com cada bolsa. Fazer referência à Etapa 8.14.1 para determinar o número de bolsas necessário. (Ver, por exemplo, Figura 136.)

[002928] 8.14.10 Montar o aparelho Connect. Soldar (por Nota de Processo 5.11) bolsas CS-10 nas pontas do 4S-4M60. Manter CS-10 frio colocado as bolsas entre dois pacotes frios acondicionados a 2-8°C. (Ver, por exemplo, Figura 137.)

[002929] 8.14.11 Passar materiais no BSC. Item # ou Item Etapa Quantidade Referência conjunto de transferência de plasma de 1 10,15 cm Alíquota de IL-2 (6.0x104) 8.11.33 1 seringa de tamanho apropriado para

8.14.7F 1 adicionar IL2 bolsa de retido LOVO 8.13.48 1 Tampas vermelhas 5

[002930] 8.14.12 Preparar TIL com IL-2. Usando uma seringa apropriadamente dimensionada, remover a quantidade de IL-2 determinada em Etapa 8.14.7 a partir da alíquota de “IL-2 6x104”.

[002931] 8.14.13 Preparar TIL com IL-2. Conectar a seringa para a

546 / 557 bolsa de retido preparada em Etapa 8.13.48 via a conexão Luer e injetar IL-2.

[002932] 8.14.14 Preparar TIL com IL-2. Limpar a linha empurrando ar a partir da seringa através da linha.

[002933] 8.14.15 Rotular bolsa de TILs formulada. Fechar o grampo no conjunto de transferência e rotular a bolsa como “TIL formulado” e passar a bolsa para fora do BSC.

[002934] 8.14.16 Se aplicável: plano de amostra por amostra. Se ainda restar alíquota de “IL-2 6x104” preparada em etapa 8.11.33, remover um retido de amostra de ~5 mL de acordo com o plano de amostra usando uma seringa apropriadamente dimensionada e dispensar em um tubo cônico de 50 mL.

[002935] 8.14.17 Se aplicável: plano de amostra por amostra. Rotular com rótulo de inventário de plano de amostra e armazenar a 2-8ºC até submeter a Login para testagem pelo Plano de Amostra.

[002936] 8.14.18 Se aplicável: plano de amostra por amostra. Assegurar que a planilha de amostra LIMS foi preenchida para remoção da amostra.

[002937] 8.14.19 Adicionar a bolsa de TILs formulado para o aparelho. Uma vez que IL-2 foi adicionado, soldar (por Nota de Processo 5.11) a bolsa de “TILs formulados” para a ponta restante (A) no aparelho preparado em Etapa 8.14.10. (Ver, por exemplo, Figura 138.)

[002938] 8.14.20 Adicionar CS10. Passar o aparelho montado com TIL formulado anexado, bolsas CS-750, e CS-10 no BSC. NOTA: a bolsa CS-10 e todas as bolsas CS-750 foram colocadas entre dois pacotes frios pré- conditionados a 2-8˚C. Não colocar a bolsa com TIL formulado em pacotes frios.

[002939] 8.14.21 Adicionar CS10. Assegurar que todas os grampos foram fechadas no aparelho. Girar a torneira de modo que a seringa foi fechada.

[002940] 8.14.22 Comutar seringas. Puxar ~10mL de ar na seringa de

547 / 557 100mL e recolocar a seringa de 60mL no aparelho.

[002941] 8.14.23 Adicionar CS10. Girar a torneira de modo que a linha para as bolsas CS750 é fechada. Abrir os grampos para as bolsas CS-10 e empurrar o volume calculado em Etapa 8.14.1B em seringa. NOTA: Seringas múltiplas serão usadas para adicionar volume apropriado de CS-10. NOTA: Registrar volume de cada seringa em Etapa 8.14.26.

[002942] 8.14.24 Adicionar CS10. Fechar os grampos para CS-10 e abrir os grampos para a bolsa de TIL formulado e adicionar o CS-10. Nota: adicionar primeiro 10,0mL de CS10 em aproximadamente 10,0mL/minuto. Adicionar o restante de CS-10 em taxa aproximada de 1,0mL /s. Nota: seringas múltiplas foram usadas para adicionar volume apropriado de CS-10. Não re-utilizar a seringa uma vez que ela foi dispensada.

[002943] 8.14.25 Adicionar CS10. Registrar tempo. NOTA: O tempo alvo da primeira adição de CS-10 até o começo do congelamento é 30.

[002944] 8.14.26 Adicionar CS10. Registrar o volume de cada adição de CS10 e o volume total adicionado. O volume total corresponde ao volume calculado da Etapa 8.14.1B

[002945] 8.14.27 Adicionar CS10. Fechar todos os grampos para as bolsas CS10.

[002946] 8.14.28 Preparar bolsas CS-750. Girar a torneira de modo que a seringa foi aberta. Abrir os grampos para a bolsa de TIL formulado e puxar a suspensão parando logo antes da suspensão alcançar a torneira.

[002947] 8.14.29 Preparar as bolsas CS-750. Fechar os grampos para a bolsa de TIL formulado. Girar a torneira de modo que ela foi aberta para as bolsas de produto final CS750.

[002948] 8.14.30 Preparar bolsas CS-750. Usando uma nova seringa, remover tanto ar como possível a partir das bolsas de produto final CS750 puxando o ar para fora. Enquanto mantendo pressão no êmbolo da seringa, manter as bolsas fechadas.

548 / 557

[002949] 8.14.31 Preparar bolsas CS-750. Puxar ~20mL de ar em uma nova seringa de 100mL e conectar ao aparelho.

[002950] NOTA: Cada bolsa de produto final CS-750 deve estar entre dois pacotes frios de modo a manter a suspensão de TILs formulados fria.

[002951] 8.14.32 Dispensar as células. Girar a torneira de modo que a linha para as bolsas de produto final foi fechada. Puxar o volume calculado em Etapa 8.14.1 a partir da bolsa de TIL formulado na seringa. NOTA: seringas múltiplas podem ser usadas para obter o volume correto.

[002952] 8.14.33 Dispensar as células. Girar a torneira de modo que a linha para a bolsa de produto final foi fechada. Trabalhar com uma bolsa de produto final de cada vez, dispensar as células na bolsa de produto final. Registrar volume de células adicionado a cada bolsa CS750 em Etapa 8.14.35

[002953] 8.14.34 Dispensar as células. Limpar a linha com ar a partir da seringa de modo que as células estão rentes com o topo da abertura da ponta. Fechar o grampo na bolsa cheia. Repetir Etapa 8.14.29- Etapa 8.14.34 para cada bolsa de produto final, misturando suavemente a bolsa de TIL formulada entre cada uma.

[002954] 8.14.35 Dispensar as células. Registrar volume de TIL colocado em cada bolsa de produto final abaixo.

[002955] 8.14.36 Remover ar das bolsas de produto final e tomar o retido. Uma vez que a última bolsa de produto final foi cheia, fechar todos os grampos.

[002956] 8.14.37 Remover ar das bolsas de produto final e tomar o retido. Puxar 10mL de ar em uma nova seringa de 100mL e substituir a seringa no aparelho.

[002957] 8.14.38 Remover ar das bolsas de produto e tomar o retido. Manipulando uma única bolsa de cada vez, puxar todo o ar de cada bolsa de produto mais o volume de produto para retido determinado em Etapa 8.14.1 D. NOTA: Quando da remoção de volume de amostra, inverter a seringa e

549 / 557 usar ar para limpar a linha para a abertura de topo da bolsa de produto. Prender a linha para a bolsa uma vez que o volume de retido e ar foram removidos.

[002958] 8.14.39 Registrar volume removido. Registrar volume de retido removido de cada bolsa.

[002959] 8.14.40 Dispensar o retido. Dispensar o retido em um tubo cônico de 50mL e rotular o tubo como “retido” e número de lote. Repetir Etapa 8.14.37- Etapa 8.14.39 para cada bolsa.

[002960] 8.14.41 Preparar produto final para crioconservação. Com um hemostato, prender as linhas próximas das bolsas. Remover seringa e o luer de conexão da tampa vermelha no aparelho em que a seringa foi colocada. Passar o aparelho fora do BSC.

[002961] 8.14.42 Preparar produto final para crioconservação. Termosselar (por Nota de Processo 5.12) a F, remover a bolsa de retido vazio e as bolsas CS-10.

[002962] NOTA: Reter a conexão luer para a seringa no aparelho. Dispor o retido vazio e as bolsas CS-10. (Ver, por exemplo, Figura 139.)

[002963] 8.14.43 Realizar inspeção visual. NOTA: Etapa 8.14.43 – Etapa 8.14.46 pode ser realizada simultaneamente com Etapa 8.14.47- Etapa

8.14.68.

[002964] 8.14.44 Amostra de rótulo de produto final. Rotular as bolsas de produto final. Fixar o rótulo da amostra produto final abaixo.

[002965] 8.14.45 Preparar produto final para crioconservação. Manter as criobolsas em uma embalagem fria a 2-8°C até crioconservação.

[002966] 8.14.46 Preparar rótulos externos. Assegurar que os rótulos externos expedidos pelo controle QA que serão fixados aos rótulos dos cassetes combinem, correspondendo ao rótulo de produto final. Fixar os rótulos externos expedidos pelo controle QA nos cassetes. Fixar o rótulo de amostra externo abaixo:

550 / 557

8.14.47 Remover amostra de contagem de células. Usando uma pipeta de tamanho apropriado, remover 2,0 mL de retido removido em Etapa 8.14.38 e colocar em um tubo cônico de 15mL a ser usado para a contagens de células.

[002967] 8.14.48 Realizar contagens de células. Realizar contagens de células e cálculos utilizando o NC-200 por SOP-00314 e Nota de Processo

5.14. NOTA: Diluir somente uma amostra para diluição apropriada para verificar se a diluição é suficiente. Diluir amostras adicionais para fator de diluição apropriado e prosseguir com contagens.

[002968] 8.14.49 Registrar volumes de amostra de contagem de células. NOTA: Se não for necessária diluição, “Amostra [µL]” = 200, “Diluição [µL]” =0

[002969] 8.14.50 Determinar fator de multiplicação Parâmetro Fórmula Resultado Contagem de células total

8.14.49A + 8.14.49B C. µL Volume de amostra Fator de multiplicação C ÷ 8.14.49A D.

[002970] 8.14.51 Selecionar protocolos e inserir fatores de multiplicação. Assegurar que o protocolo de “ensaio de contagem de células viáveis” foi selecionado, todos os fatores de multiplicação, e volumes de amostra e diluente foram inseridos por SOP – 00314

[002971] NOTA: Se não for necessária diluição, inserir “Amostra [µL]” = 200, “Diluição [µL]” = 0

[002972] 8.14.52 Registrar nome de arquivo, viabilidade e contagens de células de Nucleoview.

[002973] 8.14.53 Determinar a média de concentração de células viáveis e viabilidade das contagens de células realizadas. Parâmetro Fórmula Resultado (8.14.52A + 8.14.52B) viabilidade E. % ÷2 Concentração de célula (8.14.52C + 8.14.52D) viável ÷2 F. células/mL

551 / 557

[002974] 8.14.54 Determinar limite superior e inferior para contagens. Parâmetro Fórmula Resultado Limite inferior 8.14.53F x 0,9 G. células/mL Limite superior 8.14.53F x 1.1 H. células/mL

[002975] 8.14.55 Estavam ambas as contagens dentro de limites aceitáveis? Parâmetro Fórmula Resultado (Sim/Não) Limite inferior 8.14.52 C e D ≥ 8.14.54G Limite superior 8.14.52 C e D ≤ 8.14.54H

[002976] NOTA: Se um resultado for “Não”, realizar o segundo conjunto de contagens em etapas 8.14.56 – 8.14.63

[002977] 8.14.56 Se aplicável: Realizar contagens de células. Realizar contagens de células e cálculos utilizando NC-200 por SOP-00314 e Nota de Processo 5.14. NOTA: Diluição pode ser ajustada de acordo com e baseada na concentração esperada de células.

[002978] 8.14.57 Se aplicável: Registrar volumes de amostra de contagem de células.

[002979] 8.14.58 Se aplicável: Determinar fator de multiplicação Parâmetro Fórmula Resultado Contagem de células total

8.14.57A + 8.14.57B C. mL Volume de amostra Fator de mutiplicação C ÷ 8.14.57A D.

[002980] 8.14.59 Se aplicável: Selecionar protocolos e inserir fatores de multiplicação. Assegurar que o protocolo de “ensaio de contagem de células viáveis” foi selecionado, todos os fatores de multiplicação, e volumes de amostra e diluente foram inseridos. NOTA: Se não for necessária diluição, inserir “Amostra [µL]” = 200, “Diluição [µL]” = 0

[002981] 8.14.60 Se aplicável: Registrar contagens de células de Nucleoview

[002982] 8.14.61 Se aplicável: Determinar a média de concentração de células viáveis e viabilidade das contagens de células realizadas. Parâmetro Fórmula Resultado (8.14.60A + 8.14.60B) viabilidade E. % ÷2 Concentração de células (8.14.60C + 8.14.60D) F. células/mL viáveis ÷2

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[002983] 8.14.62 Se aplicável: Determinar limite superior e inferior para contagens. Parâmetro Fórmula Resultado Limite inferior 8.14.61F x 0,9 G. células/mL Limite superior 8.14.61F x 1.1 H. células/mL

[002984] 8.14.63 Se aplicável: Estão as contagens dentro de limites aceitáveis? Parâmetro Fórmula Resultado (Sim/Não) Limite inferior 8.14.60 C e D ≥ 8.14.62G Limite superior 8.14.60 C e D ≤ 8.14.62H

[002985] NOTA: Se um dos resultados for “Não”, continuar para Etapa

8.14.64 para determinar uma média.

[002986] 8.14.64 Se aplicável: Determinar uma concentração média de células viáveis a partir de todas as quatro contagens realizadas.

[002987] 8.14.65 Calcular fluxo. Amostra de citometria. Realizar cálculo para assegurar suficiente concentração de células para amostragem de citometria de fluxo. Concentração de células viáveis É B ≤ 1,0 mL? de (Sim/Não**) Volume alvo requerido Etapa 8.14.53 F* para 6x107 TVC ou Etapa 8.14.61 F* B = 6x107 células/ A ou Etapa 8.14.64 E*

A células/mL mL *Círculo da referência de etapa usada para determinar a concentração de células viáveis **NOTA: Se “Não”, contatar gerência de área.

[002988] 8.14.66 Calcular IFN-γ. Realizar cálculo da amostra para assegurar uma concentração suficiente de células para a amostragem de IFN- γ. Concentração de célula viável É B ≤ 1,0 mL? de (Sim/Não**) Volume requerido para Etapa 8.14.53 F* 1,5x107 TVC mínimo ou Etapa 8.14.61 F* B = 1.5x107 células/A ou Etapa 8.14.64 E*

A células/mL mL *Círculo da referência de etapa usada para determinar concentração de células viáveis **NOTA: Se “Não”, contatar gerência de área.

[002989] 8.14.67 Registrar resultados. Completar formulários para submissão com as amostras.

553 / 557

[002990] 8.14.68 Termosselar. Uma vez que os volumes de amostra foram determinados, termosselar (por Nota de Processo 5.12) as bolsas de produto final tão próximo das bolsas como possível para remover do aparelho.

[002991] 8.14.69 Rotular e coletar amostras por Plano de amostra. Volume de Número de Amostra amostra para Tipo de recipiente Destino recipientes adicionar a cada Tubo cônico de 15 *Micoplasma 1 1,0 mL Login mL 2 mL criofrasco- Endotoxina 2 1,0 mL Login ampola 2 mL criofrasco- Coloração gram 1 1,0 mL Login ampola 2 mL criofrasco- IFN-g 1 1,0 mL Login ampola Citometria de fluxo 2 mL criofrasco- 1 1,0 mL Login ampola ** Esterilidade Bac-T 2 1,0 mL Frasco Bac-T Login 2 mL criofrasco- Reter QC 4 1,0 mL CRF ampola Frascos-ampolas 2 mL criofrasco- 10 0,5 mL CRF satélite ampola *NOTA: Para a amostra de micoplasma, adicionar volume da suspensão de células formuladas para o tubo cônico de 15mL rotulado “diluente de micoplasma” da Etapa 8.12.55. **NOTA: Prosseguir para Etapa 8.14.70 para inoculação Bac-T.

[002992] 8.14.70 Amostragem de teste de esterilidade & BacT. No BSC, remover a amostra de 1,0mL a partir da suspensão de células retida coletada em Etapa 8.14.38 usando uma seringa apropriadamente dimensionada e inocular a garrafa anaeróbica. Repetir o acima para a garrafa aeróbica. NOTA: Armazenar garrafas Bac-T em temperatura ambiente e proteger da luz.

[002993] 8.14.71 Rotular e armazenar amostras. Rotular todas as amostras com rótulo de inventário de plano de amostras e armazenar apropriadamente até transferir para Login. NOTA: Prosseguir para Seção 8.15 para a crioconservação de produto final e amostras.

[002994] 8.14.72 Assinar para amostragem. Assegurar que planilha de amostra LIMS é completada para remoção das amostras.

[002995] 8.14.73 Envio de amostra. Enviar todo Dia 22 amostras de teste para Login.

554 / 557

[002996] 8.14.74 Monitoramento ambiental. Após processamento, verificar se BSC e monitoramento do pessoal foram realizados.

[002997] 8.14.75 Rever Seção 8.14

[002998] 8.15 Crioconservação de produto final.

[002999] 8.15.1 Preparar congelador de taxa controlada. Verificar se CRF foi configurado antes do congelamento. Registrar equipamento CRF. Crioconservação é realizada.

[003000] 8.15.2 Configurar sondas CRF. Puncionar o septo na bolsa CRF de controle em branco. Inserir a sonda de temperatura de frasco-ampola de 6mL.

[003001] 8.15.3 Colocar produto final e amostras em CRF. Colocar bolsa de controle em branco em cassete pré-condicionado e transferir para o meio aproximado da prateleira do CRF. Transferir os cassetes de produto final em prateleira do CRF e frascos-ampolas na prateleira para frasco-ampola do CRF.

[003002] 8.15.4 Colocar produto final e amostras em CRF. Transferir as prateleiras de produto e prateleiras de frasco-ampola no CRF. Registrar o tempo em que o produto é transferido no CRF e a temperatura da câmara na Etapa 8.15.5. NOTA: Distribuir uniformemente os cassetes e frasco-ampola na prateleira no CRF, deixando tanto espaço como possível entre cada prateleira.

[003003] 8.15.5 Determinar o tempo necessário para alcançar 4 ºC ± 1,5 ºC e prosseguir com o ciclo do CRF. Uma vez que a temperatura da câmara alcançou 4 ºC ± 1,5 ºC, iniciar o ciclo. Registrar o tempo. Parâmetro Fórmula Valor Tempo em que produto final é transferido para CRF (HHMM) Temperatura em que produto final é transferido no do monitor ºC

CRF B. tempo de início de CRF (HHMM) Tempo decorrido a partir da formulação para início de CRF C = B – Etapa min

8.14.25A

[003004] 8.15.6 CRF completar a armazenar. Parar o CRF após completar o ciclo. Remover cassetes e frascos-ampolas do CRF. Transferir

555 / 557 cassetes e frascos-ampolas para LN2 fase vapor para armazenamento. Registrar local de armazenamento

SUMÁRIO DO PÓS PROCESSAMENTO

[003005] Pós processamento: Produto de fármaco final • (Dia 22) Determinação de células CD3+ no Dia 22 REP por citometria de fluxo • (Dia 22) Método de coloração Gram (GMP) • (Dia 22) Teste de endotoxina bacteriana por Ensaio Gel Clot LAL (GMP) • (Dia 16) Ensaio de esterilidade de BacT (GMP) • (Dia 16) Detecção do DNA de micoplasma por TD-PCR (GMP) • Atributos de aparência aceitáveis (Etapa 8.14.43) • (Dia 22) BacT Ensaio de esterilidade (GMP) • (Dia 22) Ensaio IFN-gama

[003006] Os exemplos apresentados acima são apresentados para dar aos versados na técnica uma divulgação e descrição completas de como fazer e usar as modalidades das composições, sistemas e métodos da invenção e não se destinam a limitar o escopo do que os inventores consideram sua invenção. As modificações dos modos acima descritos para a realização da invenção que são óbvias para os versados na técnicaversados na técnica devem estar dentro do escopo das reivindicações a seguir. Todas as patentes e publicações mencionadas no relatório são indicativas dos níveis de habilidade daqueles versados na técnica à qual a invenção pertence

[003007] Todos os títulos e designações de seção são usados apenas para fins de clareza e referência e não devem ser considerados limitativos de forma alguma. Por exemplo, aqueles versados na técnica apreciarão a utilidade de combinar vários aspectos de diferentes títulos de cabeçalhos e seções, como apropriado, de acordo com o espírito e o escopo da invenção

556 / 557 aqui descrita.

[003008] Todas as referências citadas aqui são incorporadas por referência aqui em sua totalidade e para todos os fins, na mesma medida como se cada publicação individual ou patente ou pedido de patente fosse eespecíficoamente e individualmente indicada para ser incorporada por referência em sua totalidade para todos os fins.

[003009] Muitas modificações e variações deste pedido podem ser feitas sem se afastar de seu espírito e escopo, como será evidente para os versados na técnica. As modalidades e exemplos específicos descritos aqui são oferecidos apenas a título de exemplo, e o pedido deve ser limitado apenas pelos termos das reivindicações em anexo, junto com o escopo completo de equivalentes ao qual as reivindicações são intituladas. Sequências:

[003010] SEQ ID NO:1 é a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de muromonab.

[003011] SEQ ID NO:2 é a sequência de aminoácidos da cadeia leve de muromonab.

[003012] SEQ ID NO:3 é a sequência de aminoácidos de uma proteína IL-2 humana recombinante.

[003013] SEQ ID NO:4 é a sequência de aminoácidos de aldesleucina.

[003014] SEQ ID NO:5 é a sequência de aminoácidos de uma proteína IL-4 recombinante humana.

[003015] SEQ ID NO:6 é a sequência de aminoácidos de uma proteína IL-7 humana recombinante.

[003016] SEQ ID NO:7 é a sequência de aminoácidos de uma proteína IL-15 recombinante humana.

[003017] SEQ ID NO:8 é a sequência de aminoácidos de uma proteína IL-21 humana recombinante. Sequências de aminoácidos de muromonab.

557 / 557 Identificador Sequência (Símbolos de aminoácidos de uma letra) SEQ ID NO:1 QVQLQQSGAE LARPGASVKM SCKASGYTFT RYTMHWVKQR Muromonab PGQGLEWIGY INPSRGYTNY 60 cadeia pesada NQKFKDKATL TTDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARYY DDHYCLDYWG QGTTLTVSSA 120

KTTAPSVYPL APVCGGTTGS SVTLGCLVKG YFPEPVTLTW NSGSLSSGVH TFPAVLQSDL 180

YTLSSSVTVT SSTWPSQSIT CNVAHPASST KVDKKIEPRP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 240

PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN 300

STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE 360

LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW 420 QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 450 SEQ ID NO:2 QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSASSSVS YMNWYQQKSG cadeia leve de TSPKRWIYDT SKLASGVPAH 60 muromonab FRGSGSGTSY SLTISGMEAE DAATYYCQQW SSNPFTFGSG TKLEINRADT APTVSIFPPS 120

SEQLTSGGAS VVCFLNNFYP KDINVKWKID GSERQNGVLN SWTDQDSKDS TYSMSSTLTL 180 TKDEYERHNS YTCEATHKTS TSPIVKSFNR NEC 213 Sequências de aminoácidos de interleucinas. Identificador Sequência (Símbolos de aminoácidos de uma letra) SEQ ID NO:3 MAPTSSSTKK TQLQLEHLLL DLQMILNGIN NYKNPKLTRM IL-2 humana LTFKFYMPKK ATELKHLQCL 60 recombinante EEELKPLEEV LNLAQSKNFH LRPRDLISNI NVIVLELKGS (rhIL-2) ETTFMCEYAD ETATIVEFLN 120 RWITFCQSII STLT 134 SEQ ID NO:4 PTSSSTKKTQ LQLEHLLLDL QMILNGINNY KNPKLTRMLT Aldesleucina FKFYMPKKAT ELKHLQCLEE 60

ELKPLEEVLN LAQSKNFHLR PRDLISNINV IVLELKGSET TFMCEYADET ATIVEFLNRW 120 ITFSQSIIST LT 132 SEQ ID NO:5 MHKCDITLQE IIKTLNSLTE QKTLCTELTV TDIFAASKNT IL-4 TEKETFCRAA TVLRQFYSHH 60 recombinante EKDTRCLGAT AQQFHRHKQL IRFLKRLDRN LWGLAGLNSC humana PVKEANQSTL ENFLERLKTI 120 (rhIL-4) MREKYSKCSS 130 SEQ ID NO:6 MDCDIEGKDG KQYESVLMVS IDQLLDSMKE IGSNCLNNEF IL-7 humana NFFKRHICDA NKEGMFLFRA 60 recombinante ARKLRQFLKM NSTGDFDLHL LKVSEGTTIL LNCTGQVKGR (rhIL-7) KPAALGEAQP TKSLEENKSL 120 KEQKKLNDLC FLKRLLQEIK TCWNKILMGT KEH 153 SEQ ID NO:7 MNWVNVISDL KKIEDLIQSM HIDATLYTES DVHPSCKVTA IL-15 MKCFLLELQV ISLESGDASI 60 recombinante HDTVENLIIL ANNSLSSNGN VTESGCKECE ELEEKNIKEF humana LQSFVHIVQM FINTS 115 (rhIL-15) SEQ ID NO:8 MQDRHMIRMR QLIDIVDQLK NYVNDLVPEF LPAPEDVETN IL-21 CEWSAFSCFQ KAQLKSANTG 60 recombinante NNERIINVSI KKLKRKPPST NAGRRQKHRL TCPSCDSYEK humana KPPKEFLERF KSLLQKMIHQ 120 (rhIL-21) HLSSRTHGSE DS 132

Claims

1 / 10 REIVINDICAÇÕES

1. Método para expandir linfócitos infiltrando os tumores (TILs) em uma população terapêutica de linfócitos infiltrando os tumores (TILs), caracterizado pelo fato de que compreende: (a) adicionar os fragmentos de tumor processados de um tumor resseccionado de um paciente em um sistema fechado para obter uma primeira população de TILs; (b) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2, e opcionalmente OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície permeável a gás, em que primeira expansão é realizada durante cerca de 3-14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (a) para etapa (b) ocorre sem abertura do sistema; (c) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, opcionalmente OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizado durante cerca de 7-14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura do sistema; (d) coletar a população terapêutica de TILs obtida a partir da etapa (c), em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; e (e) transferir a população de TILs coletada da etapa (d) para uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (d) a (e) ocorre sem

2 / 10 abertura do sistema.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a população terapêutica de TILs coletada na etapa (d) compreende TILs suficientes para uma dosagem terapeuticamente eficaz dos TILs.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o número de TILs suficiente para uma dosagem terapeuticamente eficaz é de cerca de 2,3×1010 a cerca de 13,7×1010.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de crioconservar a bolsa de infusão compreendendo a população de TILs coletada usando um processo de crioconservação.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o processo de crioconservação é realizado usando uma razão 1:1 de população de TILs coletada para o meio de crioconservação.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que as células apresentadoras de antígenos são células mononucleares de sangue periférico (PBMCs).

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que as PBMCs são irradiadas e alogênicas.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as PBMCs são adicionadas à cultura celular em qualquer um de dias 9 até 14 em etapa (c).

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células apresentadoras de antígenos são células apresentadoras de antígenos artificiais.

3 / 10

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a coleta em etapa (d) é realizado usando um sistema de processamento de células LOVO.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 4 a cerca de 50 fragmentos, em que cada fragmento tem um volume de cerca de 27 mm3.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 30 a cerca de 60 fragmentos com um volume total de cerca de 1300 mm3 a cerca de 1500 mm3.

13. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 50 fragmentos com volume total de cerca de 1350 mm3.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 50 fragmentos com uma massa total de cerca de 1 grama a cerca de 1,5 gramas.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os fragmentos múltiplos compreendem cerca de 4 fragmentos.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o segundo meio de cultura de células é provido em um recipiente selecionado a partir do grupo consistindo em um recipiente G e um Xuri cellbag.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a bolsa de infusão em etapa (e) é uma bolsa de infusão contendo HypoThermosol.

4 / 10

18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro período em etapa (b) e o segundo período em etapa (c) são cada individualmente realizados dentro de um período de 10 dias, 11 dias, ou 12 dias.

19. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro período em etapa (b) e o segundo período em etapa (c) são cada individualmente realizados dentro de um período de 11 dias.

20. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que etapas (a) até (e) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 22 dias.

21. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que etapas (a) até (e) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 20 dias.

22. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que etapas (a) até (e) são realizadas dentro de um período de cerca de 10 dias a cerca de 15 dias.

23. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que etapas (a) até (e) são realizadas em 22 dias ou menos.

24. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que etapas (a) até (e) e crioconservação são realizadas em 22 dias ou menos.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que etapas (b) até (e) são realizadas em um recipiente único, em que a realização das etapas (b) até (e) em um recipiente único resulta em um aumento em rendimento de TIL por tumor resseccionado como comparado com realização das etapas (b) até (e) em mais do que um recipiente.

5 / 10

26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que as células apresentadoras de antígenos são adicionadas aos TILs durante o segundo período em etapa (c) sem abertura do sistema.

27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que a terceira população de TILs em etapa (d) é uma população terapêutica de TILs que compreende uma subpopulação aumentada de células T efetoras e/ou células T de memória central com relação à segunda população de TILs, em que as células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas na população terapêutica de TILs exibem uma ou mais características selecionadas a partir do grupo consistindo em expressão de CD27+, expressão de CD28+, telômeros mais longos, expressão aumentada de CD57, e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras, e/ou células T de memória central obtidas a partir da segunda população de células.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que as células T efetoras e/ou células T de memória central obtidas na população terapêutica de TILs exibem expressão aumentada de CD57 e expressão diminuída de CD56 com relação a células T efetoras, e/ou células T de memória central obtidas a partir da segunda população de células.

29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que o risco de contaminação microbiana é reduzido como comparado com um sistema aberto.

30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que os TILs da etapa (e) são infundidos em um paciente.

6 / 10

31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o recipiente fechado compreende um biorreator único.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o recipiente fechado compreende um G-REX-10.

33. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o recipiente fechado compreende um G-REX-10.

34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que em etapa (d) as células apresentadoras de antígenos (APCs) são adicionadas à cultura celular da segunda população de TILs a uma razão de APC:TIL de 25:1 a 100:1.

35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a cultura celular tem uma razão de 2,5×109 APCs a 100×106 TILs.

36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que na etapa (d) as células apresentadoras de antígenos (APCs) são adicionadas à cultura celular da segunda população de TILs a uma razão de APC:TIL de 25:1 a 100:1.

37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a cultura celular tem razão de 2,5×109 APCs a 100×106 TILs.

38. População de linfócitos infiltrando os tumores (TILs) expandidos para uso no tratamento de um indivíduo com câncer, caracterizada pelo fato de que a população de TILs expandidos é uma terceira população de TILs obtenível por um método compreendendo: (a) obter uma primeira população de TILs a partir de um tumor resseccionado de um indivíduo por processamento de uma amostra de tumor obtida do paciente em fragmentos múltiplos de tumor; (b) adicionar os fragmentos de tumor em um sistema fechado;

7 / 10 (b) realizar uma primeira expansão por cultivo da primeira população de TILs em um meio de cultura celular compreendendo IL-2, e opcionalmente OKT-3, para produzir uma segunda população de TILs, em que a primeira expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma primeira área de superfície permeável a gás, em que primeira expansão é realizada durante cerca de 3-14 dias para obter a segunda população de TILs, em que a segunda população de TILs é pelo menos 50 vezes maior em número do que a primeira população de TILs, e em que a transição de etapa (a) para etapa (b) ocorre sem abertura do sistema; (c) realizar uma segunda expansão por suplementação do meio de cultura celular da segunda população de TILs com adicionais IL-2, opcionalmente OKT-3, e células apresentadoras de antígenos (APCs), para produzir uma terceira população de TILs, em que a segunda expansão é realizado durante cerca de 7-14 dias para obter a terceira população de TILs, em que a terceira população de TILs é uma população terapêutica de TILs, em que a segunda expansão é realizada em um recipiente fechado provendo uma segunda área de superfície permeável a gás, e em que a transição de etapa (b) para etapa (c) ocorre sem abertura do sistema; (d) coletar a população terapêutica de TILs obtida a partir da etapa (c), em que a transição de etapa (c) para etapa (d) ocorre sem abertura do sistema; e (e) transferir a população de TILs coletada da etapa (e) para uma bolsa de infusão, em que a transferência da etapa (e) a (f) ocorre sem abertura do sistema; e (g) opcionalmente crioconservar a bolsa de infusão compreendendo a população de TILs coletada da etapa (f) usando um processo de crioconservação.

39. População de linfócitos infiltrando os tumores (TILs) de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que o método para

8 / 10 produzir os TILs compreende adicionalmente uma ou mais das características como definidas nas reivindicações 1 a 37.

40. Composição de crioconservação, caracterizada pelo fato de que compreende a população de TILs como definida na reivindicação 38, um meio crioprotetor compreendendo dimetilsulfóxido (DMSO) e uma solução de eletrólito.

41. Composição de crioconservação de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um ou mais estabilizantes e um ou mais fatores de crescimento de linfócito.

42. Composição de crioconservação de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que o um ou mais estabilizantes compreendem albumina sérica humana (ASH) e o um ou mais fatores de crescimento de linfócito compreendem IL-2.

43. Composição de crioconservação de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que a composição compreende opcionalmente OKT-3.

44. Composição de crioconservação de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que o meio crioprotetor compreendendo DMSO e a solução de eletrólitos estão presentes em uma razão de cerca de 1,1:1 a cerca de 1:1,1.

45. Composição de crioconservação de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que o meio crioprotetor compreendendo DMSO e a solução de eletrólitos estão presentes em uma razão de cerca de 1:1.

46. Composição de crioconservação de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que 100 mL da composição compreende a população de TILs em uma quantidade de cerca de 1 × 106 a cerca de 9 × 1014; o meio crioprotetor compreendendo DMSO em uma

9 / 10 quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL, a solução de eletrólitos em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL; ASH em uma quantidade de cerca de 0,1 g a cerca de 1,0 g; e IL-2 em uma quantidade de cerca de 0,001 mg a cerca de 0,005 mg.

47. Composição de crioconservação de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que 100 mL da composição compreende a população de TILs em uma quantidade de cerca de 1 × 107 a cerca de 1 × 1011; o meio crioprotetor em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL, em que o meio crioprotetor compreende cerca de 10% de DMSO; a solução de eletrólitos em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL; ASH em uma quantidade de cerca de 0,3 g a cerca de 0,7 g; e IL-2 em uma quantidade de cerca de 0,001 mg a cerca de 0,003 mg.

48. Composição de crioconservação de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que 100 mL da composição consiste essencialmente na população de TILs em uma quantidade de cerca de 1 × 107 a cerca de 1 × 1011; o meio crioprotetor em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL, em que o meio crioprotetor consiste essencialmente em cerca de 10% de DMSO; a solução de eletrólitos em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL; ASH em uma quantidade de cerca de 0,3 g a cerca de 0,7 g; e IL-2 em uma quantidade de cerca de 0,001 mg a cerca de 0,003 mg.

49. Composição de crioconservação de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que a composição é para uso no tratamento de um indivíduo com câncer.

50. Composição de crioconservação, caracterizada pelo fato de que compreende uma população de TILs, um meio crioprotetor compreendendo dimetilsulfóxido (DMSO), e uma solução de eletrólitos, em que 100 mL da composição compreende a população de TILs em uma

10 / 10 quantidade de cerca de 1 × 107 a cerca de 1 × 1011; o meio crioprotetor em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL, em que o meio crioprotetor compreende cerca de 10% de DMSO; a solução de eletrólitos em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL; ASH em uma quantidade de cerca de 0,3 g a cerca de 0,7 g; e IL-2 em uma quantidade de cerca de 0,001 mg a cerca de 0,003 mg.

51. Composição de crioconservação, caracterizada pelo fato de que consiste essencialmente em uma população de TILs, um meio crioprotetor compreendendo dimetilsulfóxido (DMSO), e uma solução de eletrólitos, em que 100 mL da composição consiste essencialmente na população de TILs em uma quantidade de cerca de 1 × 107 a cerca de 1 × 1011; o meio crioprotetor em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL, em que o meio crioprotetor consiste essencialmente em cerca de cerca de 10% de DMSO; a solução de eletrólitos em uma quantidade de cerca de 30 mL a cerca de 70 mL; ASH em uma quantidade de cerca de 0,3 g a cerca de 0,7 g; e IL-2 em uma quantidade de cerca de 0,001 mg a cerca de 0,003 mg.

52. Bolsa de infusão, caracterizada pelo fato de que compreende uma composição de criopreservação como definida em qualquer uma das reivindicações 40 a 51.

53. Bolsa de infusão de acordo com a reivindicação 52, caracterizada pelo fato de que a bolsa de infusão é uma bolsa de infusão contendo HypoThermosol.

54. Bolsa de armazenamento, caracterizada pelo fato de que compreende uma composição de criopreservação como definida em qualquer uma das reivindicações 40 a 51.

55. Bolsa de armazenamento de acordo com a reivindicação 54, caracterizada pelo fato de que a bolsa de armazenamento é uma bolsas de congelamento CryoStore CS750.

Processo 2A – 22 dias processo – 2-3 dias de colheita/expedição Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 575/727 Durante a noite Fragmentos TILs brutos Diâmetro Fechado Excisar Fragmentos tumor

MP

MG

O

ÃOC 1/151 Cultura inicial de TILs

AÇ Dirigir para

RIC Protocolo de expansão rápida REP- Dia 11

AB

ÃOF

AÇ

TAL

INS Congelar e infundir Crioexpedidor Congelar LN2 Dia 22 Co-cultura TIL e esquematizado em alíquotas Colheita Fechado – dia 16 células alimentadoras Dividir Figura 1

Desenvolvimento de processo Etapa Processo corrente 1C Novo processo 2A Impacto Aumenta amostra de tumor/ 4 fragmentos/ 10 G-Rex 40 fragmentos -1G-Rex recipiente, encurta cultura, 10-21 dias 100 CS (x2?) 11 dias reduz etapas, passível de sistema fechado Pré-REP congelar > testar > Dirigir para REP- Encurta processo, reduz descongelar ~ dia 27 > 40e6TIL dia 11 < 200e6 etapas, elimina testes 36 G-Rex 100 ~dia 30 4-5 G-Rex 500CS- Reduz etapas, sistema >5e6TIL – dividir ~dia 36 TIL- dividir Dia 16 fechado REP mais curto Dia colheita ~43+ colheita LOVO – lavadora Reduz etapas, por centrifugação automatizada de células automatizado, sistema fechado Flexibilidade expedição, Produto fresco – bolsa Produto crioconservado – CS10 programação do paciente, de infusão única em LN2, alíquotas múltiplas teste de liberação mais fácil, experiências globais Tempo de processo Resposta para paciente, Tempo de processo limpeza completa da sala, dia 43+ dia 22 COGs Durante a noite Fragmentos TILs brutos >

MP

EG Cultura inicial de TILs (Pré-Rep) 1-3 semanas Congelar

OD

ÇÃ

ICA Protocolo de expansão rápida (REP) 2 semanas

BR Testar

FA Descongelar

ÃO

LAÇ

TA

INS Centrífuga G-Rex 100m (36 frascos) Co-cultura TIL e Bolsa de infusão células alimentadoras Expansão rápida para Figura 2

Linha de tempo – Processo 1C – processo corrente Liberação em: Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 577/727 tingimento Gram esterilidade dia 7 micoplasma dia 7 endotoxina dia 14

REP REP contagem de CD3 dia 14 dia 14 dia 7 colheita divisão (esterilidade, (esterilidade, micoplasma, contagem de contagem de CD3, célula de Alimentação tingimento Gram, Alimentação Início micoplasma) /Colheita Alimentação /Colheita Alimentação endotoxina) de REP /Colheita /Colheita Descongelar 3/151 Alimentação REP Reinfundir Cirurgia Envio testar Iniciação pré-REP pré-REP (fenótipo, esterilidade) Relatar para o sítio Quimio Linfodepleção Pré- REP Figura 3

Linha de tempo da terapia com TILs – v2A – dia 16 REP > 250e6

Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 578/727 Dia 6 contagem REP > 250e6 Liberação em: REP tingimento Gram REP Dia 11 esterilidade dia 6 Dia 6 colheita divisão micoplasma dia 6 (esterilidade, endotoxina dia 11 (esterilidade, micoplasma, contagem de contagem de CD3, contagem de CD3 dia 11 Início célula de tingimento Gram, de REP micoplasma) endotoxina) Cirurgia Reinfundir 4/151

Interleucina-2 Envio Pré-Rep Relatar Iniciação pré-REP Colheita para o sítio Quimio Linfodepleção

Pré- REP

Tempo de terapia total (operação --> infusão) = 25 dias

Figura 4

Linha de tempo da terapia com TILs – v2A – dia 16 REP > 250e6 Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 579/727 Dia 6 contagem REP > 250e6 Liberação em:

REP Dia 6 tingimento Gram divisão REP esterilidade dia 6 (esterilidade, Dia 11 micoplasma dia 6 contagem de colheita (esterilidade, micoplasma, endotoxina dia 11 célula de contagem de CD3, contagem de CD3 dia 11 Início micoplasma) tingimento Gram, endotoxina) de REP Cirurgia Reinfundir 5/151 Envio Pré-Rep Relatar Iniciação para o sítio pré-REP Colheita Quimio Linfodepleção Pré- REP Tempo de terapia total (operação --> infusão) = 31 dias Figura 5

Extração de tumor Dia 1 e expedição Dia 16 Redução volume até 500mL Chegada Dia 0 do tumor Filtrar TIL em 40 pacote de fragmentos transferência de tumor de IL Contagem celular/ viabilidade Conc. final

6.000 IU/mL IL-2 Prep. Tampão lavagem Sistema filtração Lavar membrana LOVO tampão Incubar 7 dias a 37 ºC, 5% CO2 Formulação (50%produto LOVO 50% CS10) Descongelar Lavar Alimentadoras Dia 7 alimentadoras alimentadoras uma vez em CM2 alogênicas irradiadas Alimentar Congelador taxa CRF – TILs em controlada (CRF) frasco Programa 6 GREX-500M Conc. final Conc. final Incubar Armazenamento a 9 dias longo prazo (LN2) Figura 6

Figura 7

Valor P

Sumário valor P Não Significativamente diferente? (P < 0,05) Valor P uni- ou bi-caudal? Bi-caudal

Número de pares Células

Novo Descongelado

Quão eficaz foi o pareamento?

Coeficiente de correlação (r)

Valor P (uni-caudal)

Sumário valor P Foi o pareamento significativamente eficaz?

Figura 8

Número de pares Concentração de células

Novo Descongelado

Quão eficaz foi o pareamento? Coeficiente de correlação (r) Valor P (uni-caudal) Sumário valor P Foi o pareamento significativamente eficaz? Sim

Figura 9

Sumário valor P Significativamente diferente? (P < 0,05) Não Valor P uni- ou bi-caudal? Bi-caudal

Número de pares

Recuperação de células frescas versus descongeladas Concentração

Novo Descongelado

Figura 10

Número de pares

Viabilidade Concentração de células

Novo Descongelado

Dia 0 - Tecido de tumor em Isolamento do tumor Meio de transporte de Gentamina + 2.5/ug/mL amostra de biocarga Anfotericina B

Sulfato de Isolamento gentamicina

Fragmentos de tumor

Semear S< 1X G-Rex 100MCS ≤ 50 fragmentos/ Amostra de 1L/frasco frasco tecido restante 1L/frasco

Dia 11 – Iniciação REP Remoção Amostra esterilidade meio gasto BacT – 10 ml meio gasto/ unidade coletada

Transferir para Contagem celular pacote de e viabilidade 10E06 TIL viáveis transferência 1L para fluir CD3/CD45

Células alimentadoras, Reduzir volume irradiadas, ≥ 2 doadoras, 3 bolsas excesso de TILs: volume variável bolsa

Descongelar alimentadoras Crioconservar excesso de TIL em Reunir Contagem alimentadoras - celular e células viáveis viabilidade 5E09 NC-200

Semear células alimentadoras/frasco

Processo REP PD PFD Página 1/3 Figura 11b Figura 11a

Figura 11a Dia 16 – Dividir cultura Amostra esterilidade BacT – meio gasto reunido 5 mL Amostragem de meio gasto & remoção Amostras de 1x G-Rex 500M meio gasto 25 mL Diluente amostra PCR de micoplasma - meio gasto reunido 10 ml (x2)

Transferir *Armazenar TILs reunidos suspensão de em incubador quando não células para Contagem celular necessários para pacote de TILs NC-200 amostragem ou semeadura transferência 1L*

Amostra PCR Sim Não micoplasma Remover amostras QC Células (x2)

Continuar processamento, Notificar cliente

Dividir & semear

≤ 5L/frasco # Frascos: TVC ÷(1 x 109 TVC/frasco) arredondar para o número inteiro mais próximo

Culturas REP

Figura 11c

Processo REP PD PFD Página 2/3

Figura 11B

Figura 11B Dia 22 – Colheita REP

Sobrenadante Reunir sobrenadante Diluente amostra Remoção meio gasto em bolsas PCR de ≤ 5x G-Rex 500MCS micoplasma bioprocesso de 10 L

Bolsa de cultura de células 3L (Origen EV3000 ou equivalente)

Contagem celular e viabilidade NC-200 4x 1mL amostra

Lavar tampão Redução de volume LOVO 2 ciclos – concentração 10:1 Formular 1:1 4000 RPM, 75mL/min Com CS10frio*

Adicionar IL-2

*Formular bolsa produto bruto Prep frasco satélite armazenada a 2-8 ºC entre etapas de processamento Remover amostras de teste de liberação Amostra frasco satélite de QC & ar (micoplasma, endotoxina, crioconservada Dividir em alíquotas criobolsas esterilidade, gram-coloração, contagem 10 x 0.5 mL/vial CS750 90-120 mL/bolsa celular, viabilidade, fluxo, INF-g, reter) (20 mL)

Enchimento Congelamento taxa manual 0,5 controlada pré-fixada perfil 6 mL/frasco

Inspecionar visualmente

Armazenar em fase vapor LN

Processo REP PD PFD Página 3/3 Expedição *

Figura 11c

Contagens celulares x109)

Figura 12

% de células viáveis

Figura 13

% Frequência de vivos

Figura 14

IFN-y (pg/1e6 células viáveis/24h)

Produto TIL 1C TIL interno – 2A TIL moffitt – 2A

Figura 15

IFN-y (pg/1e6 células viáveis/24h) Escala

Produto TIL 1C TIL interno – 2A TIL moffitt – 2A

Figura 16

% frequência de parental TCRa/b e NK: 1C vs. 2A

Figura 17

Subconjuntos CD8: 1C versus 2A Subconjuntos CD4: 1C versus 2A % Frequência de vivos

% Frequência de vivos

Razão CD8/CD4 1C versus 2A Razão CD8/CD4

Figura 18

Subconjuntos de memória CD4: 1C versus 2A

% Frequência de parental

Subconjuntos de memória CD8: 1C versus 2A % Frequência de parental

Figura 19

Expressão PD1 – 1C versus 2A Expressão LAG-3 – 1C versus 2A % Frequência de parental

% Frequência de parental

Expressão Tim-3 1C versus 2A % Frequência de parental

Figura 20

Expressão CD69: 1C versus 2A Expressão 41BB: 1C versus 2A % Frequência de parental

% Frequência de parental

Expressão KLRG1: 1C versus 2A % Frequência de parental

Figura 21

Expressão TIGIT: 1C versus 2A

% Frequência de parental

Figura 22

Expressão CD28: 1C versus 2A Expressão CD27: 1C versus 2A

% Frequência de parental % Frequência de parental

Figura 23

Comprimento relativo de telômeros (1301)

Processo 1C Processo 2A

Figura 24

Comprimento relativo de telômeros (1301)

Processo 1C Processo 2A

Figura 25

Figura 26

Coorte 1: Produto de TIL fresco, n = 30 Melanoma não resseccionável ou metastático progrediu após Antes da terapia Anti-PD-1 e, Coorte 3: Re-tratamento se mutante BRAF, com TIL, n = 30 após inibidor de BRAF

Coorte 2: Produto de TIL crioconservado, n = 30

Figura 27 Processo 2A: cerca de 22 dias das etapas A –E

1. ETAPA A Obter amostra de tumor do paciente

2. ETAPA B Fragmentação e primeira expansão 3 dias a 14 dias

3. ETAPA C Transição primeira expansão para segunda expansão Sem armazenamento e sistema fechado

4. ETAPA D Segunda expansão IL-2, OKT-3, e células alimentadoras apresentadoras a antígenos Sistema fechado

5. ETAPA E Coletar TILs de etapa D Sistema fechado

6. ETAPA F Formulação final e/ou transferência para bolsa de infusão (opcionalmente crioconservar)

Dia 0 – Tecido de tumor em Isolamento do tumor Meio de transporte de Gentamina + 2.5/ug/mL amostra de biocarga

Anfotericina B

Sulfato de Isolamento gentamicina

Fragmentos de tumor

Semear S < 1X G-Rex 100MCS Amostra de ≤ 50 fragmentos/ tecido restante 1L/frasco frasco 1L/frasco

Dia 11 – Iniciação REP Remoção Amostra esterilidade BacT – 10 ml meio gasto meio gasto/ unidade coletada

Contagem celular Transferir para e viabilidade 10E06 TIL viáveis pacote de transferência 1L para fluir CD3/CD45

Descongelar alimentadoras Crioconservar excesso de TIL

Reunir Contagem alimentadoras - celular e células viáveis viabilidade 5E09 NC-200

Semear células alimentadoras/frasco

Processo REP PD PFD Página 1/3 Figura 28b Figura 28a

Figura 28a

Dia 16 – Dividir cultura Amostra esterilidade BacT Meio gasto reunido 5 mL Amostragem de meio gasto Amostras de & remoção meio gasto 1X G-Rex 25 mL 500M Diluente amostra PCR de micoplasma Meio gasto reunido 10 ml (x2)

Transferir *Armazenar TILs reunidos suspensão de Contagem celular TILs em incubador quando não células para NC-200 necessários para pacote* de amostragem ou semeadura transferência 1L

Amostra PCR micoplasma Remover Sim Não 1 x 106 células (x2) amostras QC

Continuar processamento, Notificar cliente

Dividir & semear

#Frascos: TVC ÷(1 x 109 TVC/frasco) arredondar para o número inteiro mais próximo

Culturas REP

Figura 28c

Processo REP PD PFD Página 2/3

Figura 28b

Figura 28b Dia 22 – Colheita REP

Remoção meio Sobrenadante Reunir sobrenadante em bolsas Diluente amostra gasto ≤ 5x PCR G-Rex 500MCS bioprocesso de 10 L de micoplasma

Bolsa de cultura de células 3L (Origen EV3000 ou equivalente)

Contagem celular e viabilidade NC-200 4X 1mL amostra

Lavar tampão Redução de volume LOVO 2 ciclos, concentração 10:1 Formular 1:1 Com CS10 frio* 4000RPM, 75mL/min

Adicionar IL-2

*Formular bolsa produto bruto armazenada a 2-8º.C Prep frasco satélite entre etapas de processamento Remover amostras de teste de liberação de QC & ar Amostra frasco satélite (micoplasma, endotoxina, esterilidade, crioconservada gram-coloração, contagem celular, Dividir em alíquotas criobolsas 10 x 0.5mL/vial viabilidade, fluxo, INF-g, reter) CS750 90-120 mL/bolsa (20 mL)

Enchimento manual Congelamento taxa 0,5 mL/frasco controlada pré-fixada perfil 6

Inspecionar visualmente

Armazenar em fase vapor LN

Processo REP PD PFD

Página 3/3 Expedição *

Figura 28c

Tumor chega

Pré-REP Dia 0

Coleta de Análise IL-2 sobrenadante Estudos através metabólitos de pré-REP pré-REP dia 11/ REP dia 0

Coleta Análise sobrenadante citocina, ponto final Estudos metabólitos

Congelar células REP dia 11

Testes estendidos Análise REP fresco ReREP por 7 dias

Contagem celular/viabilidade, Análise fenótipo de fluxo, Testes teste de morte indireta, estendidos ReREP fresco Produção IFN g e Granzyme B, sequenciamento TCR, metabolismo celular

ReREP Descongelar células Testes Análise por 7 dias estendidos descongelamento ReREP

Figura 29

% células viáveis

Fresco + C510 Descongelado

Figura 30

Re-REP – Expansão de vezes

Fresco

Descongelado Expansão de vezes de TIL (dia 7)

Figura 31

Valores de sangue normais

Glicose

Glutamina

Sódio

Potássio

Ácido láctico

Amônia

Figura 32

Glicose

Glicose (g/L)

# de dias em pré-REP Lactato Lactato (g/L)

# de dias em pré-REP

Potássio (K+) K+ (mmol/L)

# de dias em pré-REP

Figura 33a

L-Glutamina

L-Glutamina (mmol/L)

# de dias em pré-REP

Amônia (NH3) NH3 (mmol/L)

# de dias em pré-REP

Sódio (NaCl) Sódio (mmol/L)

# de dias em pré-REP

Figura 33b

# de dias em pré-REP

Figura 34

Pg/1c6 células/24 h

Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP

Figura 35

Pg/1c6 células/24 h

Fresco Fresco ReREP Descongelado ReREP

Figura 36

Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 616/727 TIL fresco versus TIL fresco reREP versus TIL descongelado TIL descongelado reREP Teste T Valor P % frequência de vivos Sumário Significante Não Não 42/151 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP

TIL TIL TIL Descongelado Descongelado Fresco Fresco ReREP Fresco ReREP Média % frequência de vivos Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Figura 37 células Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 617/727 TIL fresco versus TIL fresco reREP versus TIL descongelado TIL descongelado reREP Teste T Valor P % frequência de vivos Sumário Significante Não Não 43/151 células Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP

TIL TIL TIL Descongelado Descongelado Fresco Fresco ReREP Fresco ReREP Média % frequência de vivos Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Figura 38

Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 618/727 TIL fresco versus TIL fresco reREP versus TIL descongelado TIL descongelado reREP Teste T Valor P % frequência de CD4 Sumário Significante Não Não 44/151 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP

TIL TIL TIL Descongelado Descongelado Fresco Fresco ReREP Fresco ReREP Média % frequência de CD4 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Figura 39

Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 619/727 TIL fresco versus TIL fresco reREP versus TIL descongelado TIL descongelado reREP Teste T Valor P % frequência de CD8 Sumário Significante Não Sim 45/151 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP

TIL TIL TIL Descongelado Descongelado Fresco Fresco ReREP Fresco ReREP Média % frequência de CD8 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Figura 40

Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 620/727 TIL fresco versus TIL fresco reREP versus TIL descongelado TIL descongelado reREP Teste T Valor P % frequência de CD4 Sumário Significante Não Não 46/151 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP

TIL TIL TIL Descongelado Descongelado Fresco Fresco ReREP Fresco ReREP Média % frequência de CD4 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Figura 41

Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 621/727 TIL fresco versus TIL fresco reREP versus TIL descongelado TIL descongelado reREP Teste T Valor P % frequência de CD8 Sumário Significante Não Não 47/151 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP

TIL TIL TIL Descongelado Descongelado Fresco Fresco ReREP Fresco ReREP Média % frequência de CD8 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Figura 42

Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 622/727 TIL fresco versus TIL fresco reREP versus TIL descongelado TIL descongelado reREP Teste T Valor P % frequência de CD4 Sumário Significante Não Não 48/151 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP

TIL TIL TIL Descongelado Descongelado Fresco Fresco ReREP Fresco ReREP Média % frequência de CD4 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Figura 43

Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 623/727 TIL fresco versus TIL fresco reREP versus TIL descongelado TIL descongelado reREP Teste T Valor P % frequência de CD8 Sumário Significante Não Não 49/151 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP

TIL TIL TIL Descongelado Descongelado Fresco Fresco ReREP Fresco ReREP Média % frequência de CD8 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Figura 44

Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 624/727 TIL fresco versus TIL fresco reREP versus TIL descongelado TIL descongelado reREP Teste T Valor P % frequência de CD4 Sumário Significante Não Não 50/151 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP

TIL TIL TIL Descongelado Descongelado Fresco Fresco ReREP Fresco ReREP Média % frequência de CD4 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Figura 45

Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 625/727 TIL fresco versus TIL fresco reREP versus TIL descongelado TIL descongelado reREP Teste T Valor P % frequência de CD8 Sumário Significante Não Não 51/151 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP

TIL TIL TIL Descongelado Descongelado Fresco Fresco ReREP Fresco ReREP Média % frequência de CD8 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Figura 46

Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 626/727 TIL fresco versus TIL fresco reREP versus TIL descongelado TIL descongelado reREP Teste T Valor P % frequência de CD4 Sumário Significante Não Não 52/151 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP

TIL TIL TIL Descongelado Descongelado Fresco Fresco ReREP Fresco ReREP Média % frequência de CD4 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Figura 47

Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 627/727 TIL fresco versus TIL fresco reREP versus TIL descongelado TIL descongelado reREP Teste T Valor P % frequência de CD8 Sumário Significante Não Não 53/151 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP

TIL TIL TIL Descongelado Descongelado Fresco Fresco ReREP Fresco ReREP % frequência de CD8 Média Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Figura 48

Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 628/727 TIL fresco versus TIL fresco reREP versus TIL descongelado TIL descongelado reREP Teste T Valor P % frequência de CD4 Sumário Significante Não Não 54/151 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP

TIL TIL TIL Descongelado Descongelado Fresco Fresco ReREP Fresco ReREP Média % frequência de CD4 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Figura 49

Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 629/727 TIL fresco versus TIL fresco reREP versus TIL descongelado TIL descongelado reREP Teste T Valor P % frequência de CD8 Sumário Significante Não Não 55/151 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP

TIL TIL TIL Descongelado Descongelado Fresco Fresco ReREP Fresco ReREP Média % frequência de CD8 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Figura 50

Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 630/727 TIL fresco versus TIL fresco reREP versus TIL descongelado TIL descongelado reREP Teste T Valor P % frequência de CD4 Sumário Significante Não Sim 56/151 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP

TIL TIL TIL Descongelado Descongelado Fresco Fresco ReREP Fresco ReREP Média % frequência de CD4 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Figura 51

Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 631/727 TIL fresco versus TIL fresco reREP versus TIL descongelado TIL descongelado reREP Teste T Valor P % frequência de CD8 Sumário Significante Não Não 57/151 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP

TIL TIL TIL Descongelado Descongelado Fresco Fresco ReREP Fresco ReREP Média % frequência de CD8 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Figura 52

Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 632/727 TIL fresco versus TIL fresco reREP versus TIL descongelado TIL descongelado reREP Teste T Valor P % frequência de CD4 Sumário Significante Não Não 58/151 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP

TIL TIL TIL Descongelado Descongelado Fresco Fresco ReREP Fresco ReREP Média % frequência de CD4 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Figura 53

Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 633/727 TIL fresco versus TIL fresco reREP versus TIL descongelado TIL descongelado reREP Teste T Valor P % frequência de CD8 Sumário Significante Não Não 59/151 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP

TIL TIL TIL Descongelado Descongelado Fresco Fresco ReREP Fresco ReREP % frequência de CD8 Média Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Figura 54

Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 634/727 TIL fresco versus TIL fresco reREP versus TIL descongelado TIL descongelado reREP Teste T Valor P % frequência de CD4 Sumário Significante Não Não 60/151 Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP

TIL TIL TIL Descongelado Descongelado Fresco Fresco ReREP Fresco ReREP % frequência de CD4 Média Fresco Descongelado Fresco ReREP Descongelado ReREP Figura 55

Fresco Descongelado ReREP Fresco ReREP Descongelado Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 635/727 TIL fresco versus TIL fresco reREP versus TIL descongelado TIL descongelado reREP Teste T Valor P Sumário % frequência de CD8 Significante Não Sim 61/151 Fresco Descongelado ReREP Fresco ReREP Descongelado

TIL TIL TIL fresco descon- TIL fresco descon- reREP gelado gelado reREP Média % frequência de CD8 Fresco Descongelado ReREP Fresco ReREP Descongelado Figura 56

Fresco Descongelado ReREP Fresco ReREP Descongelado Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 636/727 TIL fresco versus TIL fresco reREP versus TIL descongelado TIL descongelado reREP Teste T Valor P Sumário % frequência de CD4 Significante Não Não 62/151 Fresco Descongelado ReREP Fresco ReREP Descongelado

TIL TIL descon- TIL descon- TIL fresco fresco reREP gelado gelado reREP Média % frequência de CD4 Fresco Descongelado ReREP Fresco ReREP Descongelado Figura 57

Fresco Descongelado ReREP Fresco ReREP Descongelado Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 637/727 TIL fresco versus TIL fresco reREP versus TIL descongelado TIL descongelado reREP Teste T Valor P Sumário % frequência de CD8 Significante Não Sim 63/151 Fresco Descongelado ReREP Fresco ReREP Descongelado

TIL

TIL TIL TIL fresco descon- descon- fresco reREP gelado gelado reREP Média % frequência de CD8 Fresco Descongelado ReREP Fresco ReREP Descongelado Figura 58

Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 638/727 Teste P815

Fresco ReREP Fresco ReREP Descongelado 64/151

TIL fresco reREP versus TIL descongelado reREP Teste T Valor P Sumário Significante Não

Figura 59

Fresco ReREP Fresco ReREP Descongelado

OCR basal SRC Overt

SRC Covert

Reserva glicolítica ECAR basal Reserva glicolítica

Figura 60

Comprimento relativo de telômero Comprimento relativo de telômero

Figura 61

Figura 62

PréREP (dia 11) Padrão Contagem de células viáveis média

(4 fragmentos/condição) (4 fragmentos/condição) (8 fragmentos/condição)

PósREP (dia 22) Padrão Contagem de células viáveis média

(4 fragmentos/condição) (4 fragmentos/condição) (8 fragmentos/condição)

Figura 63

PréREP (dia 11) Contagem de células viáveis média

Padrão

(3 fragmentos/condição) (3 fragmentos/condição)

PósREP (dia 22) Padrão Contagem de células viáveis média

(3 fragmentos/condição) (3 fragmentos/condição)

Figura 64A

EP11020 (PréREP) 3 x 10 5

2 x 10 5

Contagem 5 de células 2 x 10 viáveis

1 x 10 5

5 x 10 4

0 Padrão CTS+SR XVIVO 20+PL CTS Xvivo 20

L4030 (PréREP) 5 x 10 7

4 x 10 7 Contagem de células viáveis 3 x 10 7

2 x 10 7

1 x 10 7

0 Padrão CTS+SR XVIVO 20+PL CTS Xvivo 20

Figura 64A continuação T6030 (PréREP) 6 x 10 7

4 x 10 7 Contagem de células viáveis

2 x 10 7

0 Padrão CTS+SR CTS

M1092 (PréREP) 8 x 10 7

6 x 10 7

Contagem de células viáveis 4 x 10 7

2 x 10 7

0 Padrão CTS+SR

Figura 64B EP11020 (PréREP) 6 x 10 8 4 x 10 8 Contagem de células viáveis 2 x 10 8 0 Padrão CTS+SR XVIVO 20+PL CTS Xvivo 20 T6030 (PréREP)

2.0 x 10 8

1.5 x 10 8 Contagem de células viáveis

1.0 x 10 8

5.0 x 10 7 0 Padrão CTS+SR CTS

Figura 64B continuação L4030 (PréREP)

5 x 10 8

4 x 10 8

3 x 10 8 Contagem de células viáveis 2 x 10 8

1 x 10 8

0 Padrão CTS+SR XVIVO 20+PL CTS Xvivo 20

M1092 (PréREP) 2 x 10 8

Contagem 1 x 10 8 de células viáveis

5 x 10 7

0 Padrão CTS+SR

Figura 65A & 65B

PréREP Células viáveis totais

Padrão

PósREP Células viáveis totais

Padrão

Figura 65C

Contagem de células pré-REP Contagem de células pós-REP

Padrão Padrão

Figura 66

Desalinhamento de CD8 % absoluta, células CD8+

Padrão

Condição do meio

Figura 67

Não estimulado

Estimulado (pg/mL/Células 5e5/24hrs)

Padrão Padrão Padrão

Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 651/727 ou

TILs brutos

Cultura de fragmento de tumor (pré-REP) 11 dias Dirigir para Excisar expansão 77/151 tumor Expansão rápida (REP) 11 dias rápida

Co-cultivar TILs e células alimentadoras

Figura 68

% de células vivas

Carcinoma do pulmão % de células vivas

Figura 69

% de células vivas

Carcinoma do pulmão % de células vivas

Figura 70

% de CD8+

Carcinoma do pulmão % de CD8+ % de CXCR3 (de CD8+)

Pulmão

Figura 71

Não estimulado

% de CD107a+

Carcinoma do pulmão

Não estimulado % de CD107a+

Não estimulado

Figura 72

% Vbeta (células T CD8+)

Figura 73

Carcinoma de pulmão % Vbeta (células T CD8+)

Figura 73

Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 658/727 Diâmetro ≤ Correio rápido (courier) Cortar em 4,0 cm do local da clínica para fragmentos Cultura TILs brutos ≤50 ex vivo CMO Fragmentos Excisar tumor Cultura de fragmento de tumor (pré-REP) 11 dias Dirigir Expansão rápida (REP) 11 dias para REP 84/151

INSTALAÇÕES DE

FABRICAÇÃO COM

GMP Terapia de pré-condicionamento de NMA-LD Colheita Descongelar, Correio Congelamento com taxa Escalonamento Co-cultura de TILs e infundir + rápido em controlada de produto de expansão ex vivo células alimentadoras administração IL-2 ‘crioexpedidor’ infusão de LN-144 do CMO para crioconservado em o local da clínica Figura 74

Figura 75

Vezes expansão Em colheita

Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 659/727 P = 0,205 85/151

Vezes expansão de TILs

Contagem de células viáveis Coorte 1 Coorte 2 Coorte 1 Coorte 2

Figura 76

% de frequência de vivos

Figura 77

Subconjuntos CD8: Gen 1 versus Gen 2 Subconjuntos CD4: Gen 1 versus Gen 2

Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 661/727 87/151

% de frequência de vivos

Figura 78

Expressão de CD27: Gen 1 versus Gen 2 Expressão de CD28: Gen 1 versus Gen 2

Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 662/727 % de frequência de parental % de frequência de parental 88/151

Figura 79

Comprimento relativo de telômeros (1301)

Figura 80

(Células viáveis 5e5) (24 h)

Escore de diversidade Figura 81

% de CDR3 único

Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 666/727 Biorreator Diâmetro ≤ Fragmentos de uso único 4,0 cm de 8 - 27 mm³ ≤50 fechado TILs brutos Fragmentos Excisar tumor Cultura de fragmento de tumor (pré-REP) 11 dias Dirigir para expansão 92/151 Expansão rápida (REP) 11 dias rápida

INSTALAÇÕES DE

FABRICAÇÃO COM

GMP Descongelar e Coleta/lavagem/ infundir + IL-2 formulação/divisão Progra- Programar Congelar LN2 alíquotas semi- mação Co-cultura de TILs ‘crioexpedidor’ em alíquotas automáticas e células alimentadoras Figura 82

Figura 83

Figura 84

Figura 85

Potência

Atributos de qualidade críticos chave Pureza Identidade

Não células T

Células T

Figura 86A

Células T de

Figura 86B

Não células T

Não células NK/B Não linfócitos

Células NK

Células B

Figura 86C

(% de subconjunto de células T CD3+ CD4+ (% de subconjunto de células T CD3+ CD8+

Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 672/727 98/151

Figura 87A

Figura 87B

(% de MCSP+)

Figura 88A controle de isotipo

Figura 88B

(Células MCSP+) 1 a 10 1 a 100 1 a 1000 Diluição Figura 89A

LIMITE LIMITE

SUPERIOR INFERIOR

DILUIÇÃO 1 a 10 1 a 100 1 a 1000 Figura 89B

FAIXA DILUIÇÃO (SUPERIOR- INFERIOR)

1 a 10

1 a 100

1 a 1000

Figura 90A (Número de MCSP+)

Diluição

Figura 90B

Número de eventos MCSP+

Limite de detecção

Produtos TILs

Figura 91A (Número de eventos MCSP+)

Limite de detecção

Produtos TILs

Figura 91B

Não estimulado Estimulado

Figura 92

Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 678/727 Fragmentação Cultura ex vivo

Excisar tumor

Cultura de Fragmento de Tumor (pré-REP) 11 dias Expansão Rápida (REP) 11 dias 104/151

Terapia de pré-condicionamento de NMA-LD Colheita Descongelar, Infusão de LN-144 Expansão Co-cultura de infundir + crioconservado em LN2 ex vivo TILs e células administração IL-2 alimentadoras

Figura 93

Figura 94

Figura 95A Contagem de Células Viáveis

Figura 95B Dias Taxa de Crescimento

Figura 95C

% de células viáveis Viabilidade

Fresco + CS10 Descongelado

Figura 96A % de Frequência de Vivos

Figura 96B

Expressão de CD27: Gen1 vs Gen2 % de Frequência de Parental

Figura 96C

Expressão de CD28: Gen1 vs Gen2 % de Frequência de Parental

Figura 97

Comprimento relativo de telômeros (1301)

Figura 98 (células viáveis 5e5) (24 h)

Figura 99A

Escore de diversidade

Figura 99B # de CDR3 único

Figura 100

Excisar tumor

PBMCs Irradiadas

Figura 101

Histologia do Tumor % de estudos demonstrando > 20% intensificação de crescimento usando IL-2-15/IL-21 (comparado com IL-2)

Pulmão Colorretal

Pancreático Glioblastoma Mama negativo triplo

Figura 102A

% de Células Vivas

Figura 102B

Carcinoma de Pulmão % de Células Vivas

Figura 103A

% de Células Vivas

Figura 10 3B Carcinoma de Pulmão % de Células Vivas

Figura 104A

% de CD8+

Figura 104B Carcinoma de Pulmão % de CD8+

Figura 105A

Não estimulado % de CD107a+

Figura 105B Carcinoma de Pulmão

Não estimulado % de CD107a+

Figura 105C

Não estimulado

Figura 106A

% Vbeta (células T CD8+)

Figura 106B Carcinoma de Pulmão

% Vbeta (células T CD8+)

Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 693/727 Fragmentação Cultura TILs Brutos ex vivo Excisar tumor

INSTALAÇÕES

DE FABRICAÇÃO COM GMP Cultura de Fragmento de Tumor (pré-REP) 11 dias Expansão Rápida (REP) 11 dias 119/151 Terapia de pré-condicionamento de NMA-LD Colheita Descongelar, Infusão de LN-144 Expansão Co-cultura de infundir + crioconservado em LN2 ex vivo TILs e células administração IL-2 alimentadoras Figura 93

Figura 108

Coorte 1: Melanoma não resseccionável ou Produto TIL não crioconservado Coorte 3: metastático n = 30 Progressão após Re-tratamento terapia Anti-PD-1 Coorte 2: com TILs anterior e, se mutante n=0 BRAF, após inibidor Produto TIL crioconservado de BRAF n = 30

Coorte histórico 1* Coorte 2

CARACTERÍSTICA Gênero, n (%) Masculino Feminino Idade Mediana Min, Máx Terapias anteriores n(%) Média # terapias sistêmicas anteriores Soma de lesão alvo de diâmetro (mm) Mediana (SD) Min, Máx Coorte histórico 1* Coorte 2

CARACTERÍSTICA Escore ECOG de linha base Estado BRAF, n (%) Sofreu Mutação Tipo Selvagem LDH linha base (U/L [SD]) 1-2 vezes ULN Min, Máx Número de lesões alvo e não alvo (em linha base) Média Figura 109

Coorte Histórico 1 Coorte 2 Qualquer Grau Grau Qualquer Grau Grau Grau Grau

TERMO PREFERIDO Número de pacientes relatando pelo um AE Tratamento-Emergente Náusea Contagem diminuída de plaquetas Anemia Contagem diminuída de neutrófilos Neutropenia febril Contagem diminuída de glóbulos brancos Tremores Diarreia Fatiga Vômitos Constipação Apetite diminuído Dor de cabeça Hipocalcemia Hipcalaemia Hipofosfatemia Hipotensão Contagem diminuída de linfócitos Congestão nasal Pirexia Tosse Edema periférico Prurido Notas: Eventos adversos são codificados pela versão 18.1 de MedDRA.

Pacientes com eventos múltiplos para um dado termo preferido são contados somente uma vez usando o grau máximo sob cada termo preferido.

Eventos são classificados por frequência decrescente de termo preferido sob SOC por qualquer grau.

Eventos adversos Tratamento-Emergente referem-se a todos AEs partindo de ou após a data da primeira dose de quimioterapia de pré-tratamento (Fludarabina e ciclofosfamida) até a última dose de IL2 + 30 dias.

Figura 110

Figura 111 Melhor Resposta Global Mudança de linha base (%)

Número do Paciente

Figura 112 Pacientes

Número do Paciente Resposta contínua

Tempo (meses) desde a primeira dose de linfodepleção

Mudança Percentual

Dia 0 Infusão de LN-144

Triagem Dia - 14 Dia 42 Dia 84 Dia 126 Visita

Figura 113

Dia - 7 Dia 4 Dia 14 Dia - 7 Dia 4 Dia 14

Coorte 1 Coorte 2

Figura 114

Dia - 7 Dia 4 Dia 14 Dia - 7 Dia 4 Dia 14

Coorte 1 Coorte 2

Figura 115

Coorte 2

CARACTERÍSTICA Gênero, n (%) Masculino Feminino Idade Mediana Min, Máx Terapias anteriores n(%) Média # terapias sistêmicas anteriores Soma de lesão alvo de diâmetro (mm) Mediana (SD) Min, Máx Coorte 2

CARACTERÍSTICA Escore ECOG de linha base Estado BRAF, n (%) Sofreu Mutação Tipo Selvagem Desconhecido LDH linha base (U/L [SD]) 1-2 vezes ULN >2 vezes ULN Número de lesões alvo e não alvo (em linha base) Média Coorte 2 tinha: 3,6 terapias medianas anteriores Carga de tumor elevada em linha base como refletida por soma de diâmetros de 140 mm para lesões alvo Figura 116

Coorte 2 (N = 17) Qualquer Grau 3/4 Grau 5 Grau (n (%) (n (%) TERMO PREFERIDO (n (%) Número de pacientes relatando pelo um AE Tratamento-Emergente Pirexia Anemia Contagem diminuída de neutrófilos Contagem diminuída de plaquetas Neutropenia febril Fatiga Tremores Náusea Contagem diminuída de glóbulos brancos Contagem diminuída de linfócitos Diarreia Apetite diminuído Notas: Pacientes com eventos múltiplos para um dado termo preferido são contados somente uma vez usando o grau máximo sob cada termo preferido. Eventos adversos Tratamento-Emergente referem-se a todos AEs partindo de ou após a data da primeira dose de quimioterapia de pré-tratamento (Fludarabina e ciclofosfamida) até a última dose de IL2 + 30 dias.

Figura 117

Figura 118 Número do Paciente

Início PR Acompanhamento em progresso sem PD Progressão

Tempo (meses) desde a infusão de Cy/Flu (linfodepleção)

Figura 119

Melhor Resposta Global % Mudança da linha base

Número do paciente

Figura 120 PACIENTES, N = 10

RESPOSTA Data de resposta objetiva Data de controle da doença Resposta parcial Doença estável Doença progressiva Não avaliável*

Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 706/727 Pré-Tratamento 132/151

Pós-tratamento 18 semanas inf. 18 sem: 3.7 cm 18 sem: 2.1 cm sup. 18 sem: 0 cm (eixo curto) / 18 sem: 2.3 cm

Figura 121

Figura 122

(Vezes indução)

Sem atividade Atividade

Dia - 7 Dia 1 Dia 4 Dia 14

Figura 123

Dia - 7 Dia 1 Dia 4 Dia 14

Figura 124

Dia - 7 Dia 1 Dia 4 Dia 14

Figura 125

Dia - 7 Dia 1 Dia 4 Dia 14

Figura 126

Carcinoma Cervical (C-145-04)

# CÉLULAS DIA DE DIA DE DIA DE RESPOSTA RESPOSTA INFUSÃO RESPOSTA 42 RESPOSTA 84 RESPOSTA 126 EM 6 MESES INFUNDIDAS EM 9 MESES

9-Ago-17

Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 712/727 SD (precisa 19-Set-17 de confirmação)

# CÉLULAS DIA DE DIA DE DIA DE RESPOSTA RESPOSTA INFUSÃO RESPOSTA 56 RESPOSTA 84 EM 4 MESES INFUNDIDAS RESPOSTA 28 EM 6 MESES

31-Mai-17 138/151

20-Jun-17 Faleceu

1-Ago-17

14-Set-17

Terapias anteriores medianas para HNSCC: 4 : todos tinham tido baixo anti-PD-1. Os dados referem-se a vivos e estão sujeitos a mudanças.

Figura 127

Petição 870200144610, de 16/11/2020, pág. 713/727 Congelar LN2- Dissecação G-Rex 100m com extra TILs Durante do tumor Fechado TILs em Excisar a noite volume Fragmentos tumor ão c aç bri Cultura inicial de TILs (Pre-Rep) < 2 semanas Dirigir 139/151 para REP

P e fa Protocolo de expansão rápida (REP) < 2 semanas

GM ão d m n I s co talaç Descongelar e infundir Congelar LN2- Crioexpedidor Fechado Co-cultura de TIL e em alíquotas esquematizado células alimentadoras

Figura 128

Figura 129

Figura 130

Figura 131 Soldar H em G

Figura 132

Figura 133

Figura 134

Soldar H em G

Figura 135

Figura 136

Figura 137

Figura 138 TIL formulado

Figura 139 TIL formulado

Estrutura I-A Estrutura I-B

Figura 140

Comparar a eficácia de 3 SFM com tumores: Seleção de ou provedor de SFM ou ou

Testar em mini- Testar o candidato em G-REX 5Ms (escala 1:100) escala Ciclos 2A

Figura 141