BR112020019484A2 - Constructos polipeptídicos de lisina-peptídeo antimicrobiano (amp), lisinas, polinucleotídeos isolados codificando as mesmas e seus usos - Google Patents

Constructos polipeptídicos de lisina-peptídeo antimicrobiano (amp), lisinas, polinucleotídeos isolados codificando as mesmas e seus usos Download PDF

Info

Publication number
BR112020019484A2
BR112020019484A2 BR112020019484-0A BR112020019484A BR112020019484A2 BR 112020019484 A2 BR112020019484 A2 BR 112020019484A2 BR 112020019484 A BR112020019484 A BR 112020019484A BR 112020019484 A2 BR112020019484 A2 BR 112020019484A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
seq
lysine
polypeptide
activity
aeruginosa
Prior art date
Application number
BR112020019484-0A
Other languages
English (en)
Inventor
Raymond Schuch
Original Assignee
Contrafect Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Contrafect Corporation filed Critical Contrafect Corporation
Publication of BR112020019484A2 publication Critical patent/BR112020019484A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/162—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4723—Cationic antimicrobial peptides, e.g. defensins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01017—Lysozyme (3.2.1.17)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/00022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

a presente invenção é direcionada a constructos polipeptídicos de lisina-amp, polipeptídeos isolados de lisina, e composições farmacêuticas compreendendo os peptídeos isolados e/ou constructos polipeptídicos de lisina - amp. são também fornecidos aqui métodos de uso de constructos polipeptídicos de lisina - amp, polipeptídeos de lisina isolados e composições farmacêuticas. além disso, são descritos aqui polinuleotídeos isolados codificando os constructos polipeptídicos de lisina - amp e polipeptídeos isolados de lisina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “CONSTRUCTOS POLIPEPTÍDICOS DE LISINA-PEPTÍDEO ANTIMICROBIANO (AMP), LISINAS, POLINUCLEOTÍDEOS ISOLADOS CODIFICANDO AS MESMAS E SEUS USOS.”
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício de, e depende da data de depósito de, Pedido provisório US 62/722,793, depositado em 24 de agosto de 2018, Pedido provisório US 62/650,235, que foi depositado em 29 de março de 2018, e Pedido provisório US 62/721,969, que foi depositado em 23 de agosto de 2018, cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente em format ASCII e é pelo presente incorporado por referência em sua íntegra. A referida cópia ASCII, criada em 29 de março de 2019, é denominada 0341_0003-PCT_SL.txt e tem bytes de tamanho.
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] A presente invenção se refere ao campo de agentes bacterianos e mais especificamente a polipeptídeos tendo atividade de lisina contra bactérias Gram-negativas e o uso destes agentes na morte de bactérias Gram-negativas e combate da infecção bacteriana e contaminação.
ANTECEDENTES
[004] Bactérias gram-negativas, em particular, membros do gênero Pseudomonas e o patógeno resistente a múltiplos fármacos emegente Acinetobacter baumannii, são uma causa importante de infecções invasivas sérias e potencialmente desafiadoras da vida. A infecção por Pseudomonas apresenta um principal problema em ferimentos por queimadura, ferimentos crônicos, distúrbio pulmonar obstrutivo crônico (COPD), fibrose cística, crescimento de superfície em biomateriais implantados, e dentro da superfície hospitalar e suprimentos de água onde ela se apresenta como um hospedeiro de ameaças para pacientes vulneráveis.
[005] Uma vez estabelecida em um paciente, P. aeruginosa pode ser especialmente difícil de tratar. O genoma codifica um hospedeiro de genes de resistência, incluindo bombas de efluxo de múltiplos fármacos e enzimas que conferem resistência a beta-lactam e antibióticos de aminoglicosídeo, fazendo terapia contra este patógeno Gram-negativo particularmente desafio devido à ausência de novos produtos terapêuticos antimicrobianos. Este desafio é compost pela capacidade do P. aeruginosa se desenvolver emu ma biopelícula, o que pode realçar sua capacidade de causar infecções protegendo as bactérias da defesa do hospedeiro e quimioterapia.
[006] No ambiente da saúde, a incidência de cepas resistentes a fármaco de Pseudomonas aeruginosa está crescendo. Em um estudo observacional de infecções da corrente sanguínea associadas a cuidados com a saúde (BSIs) em hospitais comunitários, P. aeruginosa foi um dos quatro patógenos resistentes a múltiplos fármacos (MDR), contribuindo para uma mortalidade hospitalar total de 18%. Adicionalmente, surtos de MDR P. aeruginosa são bem documentados. Resultados ruins estão associados com cepas MDR de P. aeruginosa que frequentemente requerem tratamento com fármacos de último recurso, tal como colistina.
[007] Para atender às necessidades de novos antimicrobianos com novos mecanismos, os pesquisadores estão investigando uma variedade de fármacos e produtos biológicos. Uma dessas classes de agentes antimicrobianos inclui lisinas. As lisinas são hidrolases de peptidoglicano de parede celular, que atuam como "tesouras moleculares" para degradar a malha de peptidoglicano responsável por manter a forma celular e por suportar a pressão osmótica interna. A degradação do peptidoglicano resulta em lise osmótica. Entretanto, as lisinas, tipicamente, não têm sido eficazes contra bactérias Gram- negativas, pelo menos em parte, devido à presença de outra membrana (MO), que está ausente em bactérias Gram-positivas e que limita o acesso ao peptidoglicano subjacente. Também foram desenvolvidas lisinas modificadas (“artilisinas”). Esses agentes, que contêm lisinas fundidas a domínios α-helicoidais específicos com características policatiônicas, anfipáticas e hidrofóbicas, são capazes de translocar através do OM. Entretanto, artilisinas tipicamente exibem baixa atividade in vivo.
[008] Embora publicações recentes tenham descrito novas lisinas que podem ser usadas contra bactérias Gram-negativas com vários níveis de eficácia in vivo, permanece uma necessidade médica contínua de antibacterianos adicionais que retêm a atividade em matrizes de sangue humano para atingir MDR P. aeruginosa e outra Gram - bactéria negativa para o tratamento de infecções invasivas.
SUMÁRIO
[009] O presente pedido é direcionado a novas construções de polipeptídicos compreendendo lisinas e peptídeos antimicrobianos (AMP) que podem ser usados, por exemplo, para tratar infecções bacterianas, incluindo infecções causadas por bactéria Gram-negativa, particularmente bactérias Gram-negativas resistente a múltiplos fármacos, incluindo, mas não se limitando a Pseudomonas aeruginosa. Lisinas recentemente identificadas e suas variantes, bem como variantes de outras lisinas também são fornecidas. Conforme aqui descrito, as construções de polipeptídeo de AMP-lisina, lisinas recentemente obtidas e lisinas variantes podem ser incluídas em composições farmacêuticas que podem ser usadas, por exemplo, para tratar infecções bacterianas. Também são fornecidos aqui, inter alia,
métodos para usar as construções de polipeptídeo de AMP-lisina, lisinas recentemente identificadas e lisinas variantes para o tratamento de infecções bacterianas, aumentando a eficácia dos antibióticos e, geralmente, inibindo o crescimento, reduzindo a população ou matando bactérias Gram-negativas, tal como P. aeruginosa. Polipeptídeos variantes de lisina e polinucleotídeos que codificam as construções e variantes de lisina também são fornecidos.
[0010] Em um aspecto, a presente invenção é direcionada a uma construção de polipeptídeo de AMP-lisina compreendendo: (a) um primeiro componente compreendendo a sequência de polipeptídeo de: (i) uma lisina selecionada do grupo que consiste em GN76 (SEQ ID NO: 203), GN4 (SEQ ID NO: 74), GN146 (SEQ ID NO: 78), GN14 (SEQ ID NO: 124), GN37 (SEQ ID NO: 84) opcionalmente com uma única mutação de aumento de pI, GN316 (SEQ ID NO: 22) opcionalmente com uma única mutação de ponto, lisina Pap2_gp17 (SEQ ID NO: 96), GN329 (SEQ ID NO: 26), GN424 (SEQ ID NO: 56), GN202 (SEQ ID NO: 118), GN425 (SEQ ID NO: 58), GN428 (SEQ ID NO: 60), GN431 (SEQ ID NO: 64), GN486 (SEQ ID NO: 66), GN333 (SEQ ID NO: 28), GN485 (SEQ ID NO: 68), GN123 (SEQ ID NO: 173) e GN121 (SEQ ID NO: 175); ou (ii) um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de polipeptídeo de pelo menos uma de SEQ ID NOS: 203, 74, 78, 124, 84, 22, 96, 26, 56, 118, 58, 60, 64, 66, 28, 68, 173 ou 175; ou (iii) um fragmento ativo da lisina; e (b) um segundo componente compreendendo a sequência de polipeptídeo de: (i) pelo menos um peptídeo antimicrobiano (AMP) selecionado do grupo que consiste em Chp1 (SEQ ID NO: 133), Chp2 (SEQ ID NO: 70), CPAR39 (SEQ ID NO: 135), Chp3 (SEQ ID NO: 137), Chp4 (SEQ ID NO: 102), Chp6 (SEQ ID NO: 106), Chp7 (SEQ ID NO: 139), Chp8 (SEQ ID NO: 141), Chp9 (SEQ ID NO: 143), Chp10 (SEQ ID
NO: 145), Chp11 (SEQ ID NO: 147), Chp12 (SEQ ID NO: 149), Gkh1 (SEQ ID NO: 151), Gkh2 (SEQ ID NO: 90), Unp1 (SEQ ID NO: 153), Ecp1 (SEQ ID NO: 155), Ecp2 (SEQ ID NO: 104), Tma1 (SEQ ID NO: 157), Osp1 (SEQ ID NO: 108), Unp2 (SEQ ID NO: 159), Unp3 (SEQ ID NO: 161), Gkh3 (SEQ ID NO: 163), Unp5 (SEQ ID NO: 165), Unp6 (SEQ ID NO: 167), Spi1 (SEQ ID NO: 169), Spi2 (SEQ ID NO: 171), Ecp3 (SEQ ID NO: 177), Ecp4 (SEQ ID NO: 179), ALCES1 (SEQ ID NO: 181), AVQ206 (SEQ ID NO: 183), AVQ244 (SEQ ID NO: 185), CDL907 (SEQ ID NO: 187), AGT915 (SEQ ID NO: 189), HH3930 (SEQ ID NO: 191), Fen7875 (SEQ ID NO: 193), SBR77 (SEQ ID NO: 195), Bdp1 (SEQ ID NO: 197), LVP1 (SEQ ID NO: 199), Lvp2 (SEQ ID NO: 201), um fragmento de esculentina (SEQ ID NO: 80), RI12 (SEQ ID NO: 88), TI15 (SEQ ID NO: 94), RI18 (SEQ ID NO: 92), FIRL (SEQ ID NO: 114), um fragmento de proteína de ligação a LPS (SEQ ID NO: 76), RR12whidro (SEQ ID NO: 110), derivado de peptídeo RI18 (SEQ ID NO: 131) e peptídeo catiônico (SEQ ID NO: 120) ou (ii) um polipeptídeo tendo atividade de AMP, em que o polipeptídeo é pelo menos 80% idêntico a pelo menos uma de SEQ ID NOS: 133, 70, 135, 137, 102, 106, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 90, 153, 155, 104, 157, 108, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 80, 88, 94, 92, 114, 76, 110, 131 e 120, em que a construção de polipeptídeo de AMP-lisina compreende pelo menos uma atividade selecionada de inibição de crescimento bacteriano de P. aeruginosa, reduzir uma população bacteriana de P. aeruginosa e/ou matando P. aeruginosa na ausência e/ou presença de soro humano.
[0011] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um polipeptídeo isolado compreendendo uma lisina selecionada do grupo que consiste em lisina GN217 (SEQ ID NO: 8), lisina GN394 (SEQ ID NO: 48), lisina GN396 (SEQ ID NO: 50), lisina GN408 (SEQ ID NO: 52), lisina GN418 (SEQ ID NO: 54), e GN486 (SEQ ID NO: 66) ou um fragmento ativo do mesmo, em que a lisina ou fragmento ativo do mesmo inibe o crescimento bacteriano de P. aeruginosa, reduz a população bacteriana de P. aeruginosa e/ou mata P. aeruginosa na ausência e/ou presença de soro humano.
[0012] A presente invenção é também direcionada a um polinucleotídeo isolado compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificando uma construção de polipeptídeo de peptídeo antimicrobiano-lisina (AMP), a molécula de ácido nucleico compreendendo: (a) uma primeira molécula de ácido nucleico codificando um primeiro componente compreendendo: (i) uma lisina selecionada do grupo que consiste em GN76 (SEQ ID NO: 203), GN4 (SEQ ID NO: 74), GN146 (SEQ ID NO: 78), GN14 (SEQ ID NO: 124), GN37 (SEQ ID NO: 84) opcionalmente com uma única mutação de aumento de pI, GN316 (SEQ ID NO: 22) opcionalmente com uma única mutação de ponto, lisina Pap2_gp17 (SEQ ID NO: 96), GN329 (SEQ ID NO: 26), GN424 (SEQ ID NO: 56), GN202 (SEQ ID NO: 118), GN425 (SEQ ID NO: 58), GN428 (SEQ ID NO: 60), GN431 (SEQ ID NO: 64), GN486 (SEQ ID NO: 66), GN333 (SEQ ID NO: 28), GN485 (SEQ ID NO: 68), GN123 (SEQ ID NO: 173) e GN121 (SEQ ID NO: 175); ou (ii) um polipeptídeo com atividade de lisina, em que o polipeptídeo é pelo menos 80% idêntico a pelo menos uma de SEQ ID NOS: 203, 74, 78, 124, 84, 22, 96, 26, 56, 118, 58, 60, 64, 66, 28, 68, 173 ou 175; ou (iii) um fragmento ativo da lisina; e (b) uma segunda molécula de ácido nucleico que codifica um segundo componente compreendendo: (i) pelo menos um peptídeo antimicrobiano (AMP) selecionado do grupo que consiste em Chp1 (SEQ ID NO: 133), Chp2 (SEQ ID NO: 70), CPAR39 (SEQ ID NO: 135), Chp3 (SEQ ID NO: 137), Chp4 (SEQ ID NO: 102), Chp6 (SEQ ID NO: 106), Chp7 (SEQ ID NO: 139), Chp8 (SEQ ID NO: 141), Chp9 (SEQ ID
NO: 143), Chp10 (SEQ ID NO: 145), Chp11 (SEQ ID NO: 147), Chp12 (SEQ ID NO: 149), Gkh1 (SEQ ID NO: 151), Gkh2 (SEQ ID NO: 90), Unp1 (SEQ ID NO: 153), Ecp1 (SEQ ID NO: 155), Ecp2 (SEQ ID NO: 104), Tma1 (SEQ ID NO: 157), Osp1 (SEQ ID NO: 108), Unp2 (SEQ ID NO: 159), Unp3 (SEQ ID NO: 161), Gkh3 (SEQ ID NO: 163), Unp5 (SEQ ID NO: 165), Unp6 (SEQ ID NO: 167), Spi1 (SEQ ID NO: 169), Spi2 (SEQ ID NO: 171), Ecp3 (SEQ ID NO: 177), Ecp4 (SEQ ID NO: 179), ALCES1 (SEQ ID NO: 181), AVQ206 (SEQ ID NO: 183), AVQ244 (SEQ ID NO: 185), CDL907 (SEQ ID NO: 187), AGT915 (SEQ ID NO: 189), HH3930 (SEQ ID NO: 191), Fen7875 (SEQ ID NO: 193), SBR77 (SEQ ID NO: 195), Bdp1 (SEQ ID NO: 197), LVP1 (SEQ ID NO: 199), Lvp2 (SEQ ID NO: 201), um fragmento de esculentina (SEQ ID NO: 80), RI12 (SEQ ID NO: 88), TI15 (SEQ ID NO: 94), RI18 (SEQ ID NO: 92), FIRL (SEQ ID NO: 114), um fragmento de proteína de ligação a LPS (SEQ ID NO: 76), RR12whidro (SEQ ID NO: 110), derivado de peptídeo RI18 (SEQ ID NO: 131) e peptídeo catiônico (SEQ ID NO: 120) ou (ii) um polipeptídeo tendo atividade de AMP, em que o polipeptídeo é pelo menos 80% idêntico a pelo menos uma de SEQ ID NOS: 133, 70, 135, 137, 102, 106, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 90, 153, 155, 104, 157, 108, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 80, 88, 94, 92, 114, 76, 110, 131 e 120, em que a construção de polipeptídeo de AMP-lisina compreende pelo menos uma atividade selecionada de inibição de crescimento bacteriano de P. aeruginosa, reduzindo a população bacteriana de P. aeruginosa e/ou matando P. aeruginosa na ausência e/ou presença de soro humano.
[0013] Ainda em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a uma sequência de polinucleotídeo isolada compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificando uma lisina selecionada do grupo que consiste em lisina GN217 (SEQ ID NO: 8), lisina GN394 (SEQ ID
NO: 48), lisina GN396 (SEQ ID NO: 50), lisina GN408 (SEQ ID NO: 52), lisina GN418 (SEQ ID NO: 54), e GN486 (SEQ ID NO: 66) ou um fragmento ativo da mesma, em que a lisina ou fragmento ativo da mesma inibe o crescimento bacteriano de P. aeruginosa, reduz a população bacteriana de P. aeruginosa e/ou mata P. aeruginosa na ausência e/ou presença de soro humano.
[0014] Em um aspecto, a presente invenção é direcionada a uma composição farmacêutica compreendendo uma lisina isolada e/ou um constructo polipeptídico lisina-peptídeo antimicrobiano (AMP) e um veículo farmaceuticamente aceitável,
[0015] em que a lisina isolada compreende pelo menos um dos: (i) GN121 (SEQ ID NO: 175), GN123 (SEQ ID NO: 173), GN217 (SEQ ID NO:8), GN316 variante (SEQ ID NO: 24), GN316 (SEQ ID NO: 22), GN329 (SEQ ID NO: 26), GN333 (SEQ ID NO: 28), GN394 (SEQ ID NO: 48), GN396 (SEQ ID NO:50), GN408 (SEQ ID NO: 52), GN418 (SEQ ID NO:54), GN424 (SEQ ID NO: 56), GN425 (SEQ ID NO:58), GN428 (SEQ ID NO: 60), GN431 (SEQ ID NO: 64), GN486 (SEQ ID NO: 66), GN485 (SEQ ID NO: 68), lisina PaP2_gp17 (SEQ ID NO: 96), (ii) um fragmento ativo da mesma, ou (iii) um polipeptídeo com atividade de lisina e pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de polipeptídeo de pelo menos uma de SEQ ID NOS:175, 173, 8, 24, 22, 26, 28, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 64, 66, 68, ou 96;
[0016] em que a construção de polipeptídeo de AMP-lisina compreende: (a) um primeiro componente compreendendo a sequência de polipeptídeo de: (i) uma lisina selecionada do grupo que consiste em GN76 (SEQ ID NO: 203), GN4 (SEQ ID NO: 74), GN146 (SEQ ID NO: 78), GN14 (SEQ ID NO: 124), GN37 (SEQ ID NO: 84) opcionalmente com uma única mutação de aumento de pI, GN316 (SEQ ID NO: 22) opcionalmente com uma única mutação de ponto, lisina Pap2_gp17 (SEQ ID NO: 96), GN329 (SEQ ID NO: 26), GN424 (SEQ ID NO: 56),
GN202 (SEQ ID NO: 118), GN425 (SEQ ID NO: 58), GN428 (SEQ ID NO: 60), GN431 (SEQ ID NO: 64), GN486 (SEQ ID NO: 66), GN333 (SEQ ID NO: 28), GN485 (SEQ ID NO: 68), GN123 (SEQ ID NO: 173) e GN121 (SEQ ID NO: 175); ou (ii) um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de polipeptídeo de pelo menos uma de SEQ ID NOS: 203, 74, 78, 124, 84, 22, 96, 26, 56, 118, 58, 60, 64, 66, 28, 68, 173 ou 175; ou (iii) um fragmento ativo da lisina; e (b) um segundo componente compreendendo a sequência de polipeptídeo de :(i) pelo menos um peptídeo antimicrobiano (AMP) selecionado do grupo que consiste em Chp1 (SEQ ID NO: 133), Chp2 (SEQ ID NO: 70), CPAR39 (SEQ ID NO: 135), Chp3 (SEQ ID NO: 137), Chp4 (SEQ ID NO: 102), Chp6 (SEQ ID NO: 106), Chp7 (SEQ ID NO: 139), Chp8 (SEQ ID NO: 141), Chp9 (SEQ ID NO: 143), Chp10 (SEQ ID NO: 145), Chp11 (SEQ ID NO: 147), Chp12 (SEQ ID NO: 149), Gkh1 (SEQ ID NO: 151), Gkh2 (SEQ ID NO: 90), Unp1 (SEQ ID NO: 153), Ecp1 (SEQ ID NO: 155), Ecp2 (SEQ ID NO: 104), Tma1 (SEQ ID NO: 157), Osp1 (SEQ ID NO: 108), Unp2 (SEQ ID NO: 159), Unp3 (SEQ ID NO: 161), Gkh3 (SEQ ID NO: 163), Unp5 (SEQ ID NO: 165), Unp6 (SEQ ID NO: 167), Spi1 (SEQ ID NO: 169), Spi2 (SEQ ID NO: 171), Ecp3 (SEQ ID NO: 177), Ecp4 (SEQ ID NO: 179), ALCES1 (SEQ ID NO: 181), AVQ206 (SEQ ID NO: 183), AVQ244 (SEQ ID NO: 185), CDL907 (SEQ ID NO: 187), AGT915 (SEQ ID NO: 189), HH3930 (SEQ ID NO: 191), Fen7875 (SEQ ID NO: 193), SBR77 (SEQ ID NO: 195), Bdp1 (SEQ ID NO: 197), LVP1 (SEQ ID NO: 199), Lvp2 (SEQ ID NO: 201), um fragmento de esculentina (SEQ ID NO: 80), RI12 (SEQ ID NO: 88), TI15 (SEQ ID NO: 94), RI18 (SEQ ID NO: 92), FIRL (SEQ ID NO: 114), um fragmento de proteína de ligação a LPS (SEQ ID NO: 76), RR12whidro (SEQ ID NO: 110), derivado de peptídeo RI18 (SEQ ID NO: 131) e peptídeo catiônico (SEQ ID NO: 120) ou (ii) um polipeptídeo tendo atividade de AMP, em que o polipeptídeo é pelo menos 80% idêntico a pelo menos uma de SEQ ID NOS: 133, 70, 135, 137, 102, 106, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 90, 153, 155, 104, 157, 108, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 80, 88, 94, 92, 114, 76, 110, 131 e 120, em que a composição farmacêutica compreende pelo menos uma atividade selecionada de inibição de crescimento bacteriano de P. aeruginosa, reduzindo a população bacteriana de P. aeruginosa e/ou matando P. aeruginosa na ausência e/ou presença de soro humano P.
[0017] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método de tratamento de uma infecção bacteriana causada por uma bactéria Gram-negativa, em que a bactéria Gram-negativa compreende P. aeruginosa e opcionalmente uma ou mais espécies adicionais de bactérias Gram-negativas, cujo método compreende: administração a um indivíduo diagnosticado com, em risco ou exibindo sintomas de uma infecção bacteriana, de uma composição farmacêutica como aqui descrito.
[0018] Ainda em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método de prevenção ou tratamento de uma infecção bacteriana compreendendo: coadministrar a um indivíduo diagnosticado com, em risco de, ou exibindo sintomas de uma infecção bacteriana, uma combinação de uma primeira quantidade efetiva de uma composição farmacêutica como aqui descrito, e uma segunda quantidade efetiva de um antibiótico adequado para o tratamento de uma infecção bacteriana Gram-negativa.
[0019] Em um aspecto, a presente invenção é direcionada a um método para aumentar a eficácia de um antibiótico adequado para o tratamento de uma infecção bacteriana Gram-negativa, compreendendo: coadministrar o antibiótico em combinação com uma composição contendo uma quantidade eficaz de uma lisina isolada e/ou um constructo polipeptídico de lisina-peptídeo antimicrobiano (AMP),
[0020] em que a lisina isolada compreende pelo menos uma de: (i) GN121 (SEQ ID NO: 175), GN123 (SEQ ID NO: 173), GN217 (SEQ ID NO:8), GN316 variante (SEQ ID NO: 24), GN316 (SEQ ID NO: 22), GN329 (SEQ ID NO: 26), GN333 (SEQ ID NO: 28), GN394 (SEQ ID NO: 48), GN396 (SEQ ID NO:50), GN408 (SEQ ID NO: 52), GN418 (SEQ ID NO:54), GN424 (SEQ ID NO: 56), GN425 (SEQ ID NO:58), GN428 (SEQ ID NO: 60), GN431 (SEQ ID NO: 64), GN486 (SEQ ID NO: 66), GN485 (SEQ ID NO: 68), lisina PaP2_gp17 (SEQ ID NO: 96), ou (ii) um fragmento ativo da mesma, ou (iii) um polipeptídeo com atividade de lisina e pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de polipeptídeo de pelo menos uma de SEQ ID NOS:175, 173, 8, 24, 22, 26, 28, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 64, 66, 68, ou 96;
[0021] em que a construção de polipeptídeo de AMP-lisina compreende: (a) um primeiro componente compreendendo a sequência de polipeptídeo de: (i) uma lisina selecionada do grupo que consiste em GN76 (SEQ ID NO: 203), GN4 (SEQ ID NO: 74), GN146 (SEQ ID NO: 78), GN14 (SEQ ID NO: 124), GN37 (SEQ ID NO: 84) opcionalmente com uma única mutação de aumento de pI, GN316 (SEQ ID NO: 22) opcionalmente com uma única mutação de ponto, lisina Pap2_gp17 (SEQ ID NO: 96), GN329 (SEQ ID NO: 26), GN424 (SEQ ID NO: 56), GN202 (SEQ ID NO: 118), GN425 (SEQ ID NO: 58), GN428 (SEQ ID NO: 60), GN431 (SEQ ID NO: 64), GN486 (SEQ ID NO: 66), GN333 (SEQ ID NO: 28), GN485 (SEQ ID NO: 68), GN123 (SEQ ID NO: 173) e GN121 (SEQ ID NO: 175); ou (ii) um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de polipeptídeo de pelo menos uma de SEQ ID NOS: 203, 74, 78, 124, 84, 22, 26, 56, 118, 58, 60, 64, 66, 28, 68, 173 ou 175; ou (iii) um fragmento ativo da lisina; e (b) um segundo componente compreendendo a sequência de polipeptídeo de: (i) pelo menos um peptídeo antimicrobiano (AMP) selecionado do grupo que consiste em
Chp1 (SEQ ID NO: 133), Chp2 (SEQ ID NO: 70), CPAR39 (SEQ ID NO: 135), Chp3 (SEQ ID NO: 137), Chp4 (SEQ ID NO: 102), Chp6 (SEQ ID NO: 106), Chp7 (SEQ ID NO: 139), Chp8 (SEQ ID NO: 141), Chp9 (SEQ ID NO: 143), Chp10 (SEQ ID NO: 145), Chp11 (SEQ ID NO: 147), Chp12 (SEQ ID NO: 149), Gkh1 (SEQ ID NO: 151), Gkh2 (SEQ ID NO: 90), Unp1 (SEQ ID NO: 153), Ecp1 (SEQ ID NO: 155), Ecp2 (SEQ ID NO: 104), Tma1 (SEQ ID NO: 157), Osp1 (SEQ ID NO: 108), Unp2 (SEQ ID NO: 159), Unp3 (SEQ ID NO: 161), Gkh3 (SEQ ID NO: 163), Unp5 (SEQ ID NO: 165), Unp6 (SEQ ID NO: 167), Spi1 (SEQ ID NO: 169), Spi2 (SEQ ID NO: 171), Ecp3 (SEQ ID NO: 177), Ecp4 (SEQ ID NO: 179), ALCES1 (SEQ ID NO: 181), AVQ206 (SEQ ID NO: 183), AVQ244 (SEQ ID NO: 185), CDL907 (SEQ ID NO: 187), AGT915 (SEQ ID NO: 189), HH3930 (SEQ ID NO: 191), Fen7875 (SEQ ID NO: 193), SBR77 (SEQ ID NO: 195), Bdp1 (SEQ ID NO: 197), LVP1 (SEQ ID NO: 199), Lvp2 (SEQ ID NO: 201), um fragmento de esculentina (SEQ ID NO: 80), RI12 (SEQ ID NO: 88), TI15 (SEQ ID NO: 94), RI18 (SEQ ID NO: 92), FIRL (SEQ ID NO: 114), um fragmento de proteína de ligação a LPS (SEQ ID NO: 76), RR12whidro (SEQ ID NO: 110), derivado de peptídeo RI18 (SEQ ID NO: 131) e peptídeo catiônico (SEQ ID NO: 120) ou (ii) um polipeptídeo tendo atividade de AMP, em que o polipeptídeo é pelo menos 80% idêntico a pelo menos uma de SEQ ID NOS: 133, 70, 135, 137, 102, 106, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 90, 153, 155, 104, 157, 108, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 80, 88, 94, 92, 114, 76, 110, 131 e 120, em que a composição compreende pelo menos uma atividade selecionada de inibição de crescimento bacteriano de P. aeruginosa, reduzindo a população bacteriana de P. aeruginosa e/ou matando P. aeruginosa na ausência e/ou presença de soro humano, e em que a administração da combinação é mais efetiva em inibir o crescimento, ou reduzir a população, ou matar as bactérias Gram-negativas na presença ou ausência ou ambos na presença e ausência de soro humano do que a administração do antibiótico ou de uma construção de lisina ou polipeptídeo de AMP-lisina individualmente.
[0022] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método de inibir o crescimento, ou reduzir a população, ou matar pelo menos uma espécie de bactéria Gram-negativa, em que a pelo menos uma espécie de bactéria Gram-negativa é P. aeruginosa e opcionalmente uma ou mais espécies adicionais de bactérias Gram- negativas, cujo método compreende: contatar a bactéria com uma composição contendo uma quantidade eficaz de uma lisina isolada e/ou uma construção de polipeptídeo lisina-peptídeo antimicrobiano (AMP),
[0023] em que a lisina isolada compreende pelo menos uma de: (i) GN121 (SEQ ID NO: 175), GN123 (SEQ ID NO: 173), GN217 (SEQ ID NO:8), GN316 variante (SEQ ID NO: 24), GN316 (SEQ ID NO: 22), GN329 (SEQ ID NO: 26), GN333 (SEQ ID NO: 28), GN394 (SEQ ID NO: 48), GN396 (SEQ ID NO:50), GN408 (SEQ ID NO: 52), GN418 (SEQ ID NO:54), GN424 (SEQ ID NO: 56), GN425 (SEQ ID NO:58), GN428 (SEQ ID NO: 60), GN431 (SEQ ID NO: 64), GN486 (SEQ ID NO: 66), GN485 (SEQ ID NO: 68), lisina PaP2_gp17 (SEQ ID NO: 96), ou (ii) um fragmento ativo da mesma, ou (iii) um polipeptídeo com atividade de lisina e pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de polipeptídeo de pelo menos uma de SEQ ID NOS:175, 173, 8, 24, 22, 26, 28, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 64, 66, 68, ou 96;
[0024] em que a construção de polipeptídeo de AMP-lisina compreende: (a) um primeiro componente compreendendo a sequência de polipeptídeo de: (i) uma lisina selecionada do grupo que consiste em GN76 (SEQ ID NO: 203), GN4 (SEQ ID NO: 74), GN146 (SEQ ID NO: 78), GN14 (SEQ ID NO: 124), GN37 (SEQ ID NO: 84) opcionalmente com uma única mutação de aumento de pI, GN316 (SEQ ID NO: 22) opcionalmente com uma única mutação de ponto, lisina Pap2_gp17
(SEQ ID NO: 96), GN329 (SEQ ID NO: 26), GN424 (SEQ ID NO: 56), GN202 (SEQ ID NO: 118), GN425 (SEQ ID NO: 58), GN428 (SEQ ID NO: 60), GN431 (SEQ ID NO: 64), GN486 (SEQ ID NO: 66), GN333 (SEQ ID NO: 28), GN485 (SEQ ID NO: 68), GN123 (SEQ ID NO: 173) e GN121 (SEQ ID NO:175); ou (ii) um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de polipeptídeo de pelo menos uma de SEQ ID NOS: 203, 74, 78, 124, 84, 22, 96, 26, 56, 118, 58, 60, 64, 66, 28, 68, 173 ou 175; ou (iii) um fragmento ativo da lisina; e (b) um segundo componente compreendendo a sequência de polipeptídeo de: (i) pelo menos um peptídeo antimicrobiano (AMP) selecionado do grupo que consiste em Chp1 (SEQ ID NO: 133), Chp2 (SEQ ID NO: 70), CPAR39 (SEQ ID NO: 135), Chp3 (SEQ ID NO: 137), Chp4 (SEQ ID NO: 102), Chp6 (SEQ ID NO: 106), Chp7 (SEQ ID NO: 139), Chp8 (SEQ ID NO: 141), Chp9 (SEQ ID NO: 143), Chp10 (SEQ ID NO: 145), Chp11 (SEQ ID NO: 147), Chp12 (SEQ ID NO: 149), Gkh1 (SEQ ID NO: 151), Gkh2 (SEQ ID NO: 90), Unp1 (SEQ ID NO: 153), Ecp1 (SEQ ID NO: 155), Ecp2 (SEQ ID NO: 104), Tma1 (SEQ ID NO: 157), Osp1 (SEQ ID NO: 108), Unp2 (SEQ ID NO: 159), Unp3 (SEQ ID NO: 161), Gkh3 (SEQ ID NO: 163), Unp5 (SEQ ID NO: 165), Unp6 (SEQ ID NO: 167), Spi1 (SEQ ID NO: 169), Spi2 (SEQ ID NO: 171), Ecp3 (SEQ ID NO: 177), Ecp4 (SEQ ID NO: 179), ALCES1 (SEQ ID NO: 181), AVQ206 (SEQ ID NO: 183), AVQ244 (SEQ ID NO: 185), CDL907 (SEQ ID NO: 187), AGT915 (SEQ ID NO: 189), HH3930 (SEQ ID NO: 191), Fen7875 (SEQ ID NO: 193), SBR77 (SEQ ID NO: 195), Bdp1 (SEQ ID NO: 197), LVP1 (SEQ ID NO: 199), Lvp2 (SEQ ID NO: 201), um fragmento de esculentina (SEQ ID NO: 80), RI12 (SEQ ID NO: 88), TI15 (SEQ ID NO: 94), RI18 (SEQ ID NO: 92), FIRL (SEQ ID NO: 114), um fragmento de proteína de ligação a LPS (SEQ ID NO: 76), RR12whidro (SEQ ID NO: 110), derivado de peptídeo RI18 (SEQ ID NO: 131) e peptídeo catiônico (SEQ ID NO: 120) ou (ii) um polipeptídeo tendo atividade de AMP, em que o polipeptídeo é pelo menos 80% idêntico a pelo menos uma de SEQ ID NOS: 133, 70, 135, 137, 102, 106, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 90, 153, 155, 104, 157, 108, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 80, 88, 94, 92, 114, 76, 110, 131 e 120, e em que a composição compreende pelo menos uma atividade selecionada de inibição de crescimento bacteriano de P. aeruginosa, reduzindo a população bacteriana de P. aeruginosa e/ou matando P. aeruginosa na ausência e/ou presença de soro humano.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0025] FIG. 1 representa modelos tridimensionais previstos por I- Tasser para estruturas de membros da família de peptídeos de fago clamídia (Chp) Chp1, Chp 2, Chp4, Chp5, Chp6, Chp7, Ecp1, Ecp2 e Osp1. O peptídeo efetor imunológico inato humano LL-37 é incluído para comparação. Estruturas helicoidais alfa são evidentes, e o terminal superior é geralmente o N-terminal.
DESCRIÇÃO DETALHADA Definições
[0026] Como aqui usado, os seguintes termos e cognatos terão os seguintes significados, a menos que o contexto indique claramente o contrário:
[0027] “Transportador” se refere a um solvente, aditivo, excipiente, meio de dispersão, agente solubilizante, revestimento, conservante, agente isotônico e retardador de absorção, tensoativo, propelente, diluente, veículo e similares, com o qual um composto ativo é administrado. Tais transportadores podem ser líquidos estéreis, tal como água, soluções salinas, soluções aquosas de dextrose, soluções aquosas de glicerol e óleos, incluindo aqueles de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim, e similares.
[0028] “Transportador farmaceuticamente aceitável” se refere a todos e quaisquer solventes, aditivos, excipientes, meios de dispersão, agentes solubilizantes, revestimentos, conservantes, agentes isotônicos e retardadores de absorção, tensoativos, propelentes, diluentes, veículos e similares, que sejam fisiologicamente compatíveis. O(s) transportador(es) devem ser "aceitáveis" no sentido de não serem deletérios ao indivíduo a ser tratado em quantidades tipicamente utilizadas em fármacos. Transportadores farmaceuticamente aceitáveis são compatíveis com os outros ingredientes da composição sem tornar a composição inadequada para seu propósito pretendido. Além disso, transportadores farmaceuticamente aceitáveis são adequados para uso com indivíduos como aqui fornecido, sem efeitos colaterais adversos indevidos (como toxicidade, irritação e resposta alérgica). Os efeitos colaterais são “indevidos” quando seu risco supera o benefício fornecido pela composição. Exemplos não limitativos de transportadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem qualquer um dos transportadores farmacêuticos padrões, como soluções salinas tamponadas com fosfato, água e emulsões, como emulsões de óleo/água e microemulsões. Transportadores farmacêuticos adequados são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences por E.W. Martin, 18ª Edição. O transportador farmaceuticamente aceitável pode ser um transportador que não existe na natureza.
[0029] “Bactericida” ou “atividade bactericida” se refere à propriedade de causar a morte de bactérias ou capacidade de matar bactérias em uma extensão de pelo menos 3-log10 (99,9%) ou melhor redução entre uma população inicial de bactérias em um período de 18 a 24 horas.
[0030] “Bacteriostático” ou “atividade bacteriostática” se refere à propriedade de inibir o crescimento bacteriano, incluindo a inibição do crescimento de células bacterianas, causando assim uma redução de
2-log10 (99%) ou melhor e até pouco menos de 3-log entre uma população inicial de bactérias em um período de 18 a 24 horas.
[0031] “Antibacteriano” se refere tanto a agentes bacteriostáticos quanto bactericidas.
[0032] “Antibiótico” se refere a um composto com propriedades que têm um efeito negativo sobre as bactérias, como letalidade ou redução do crescimento. Um antibiótico pode ter um efeito negativo em bactérias Gram-positivas, bactérias Gram-negativas ou ambas. A título de exemplo, um antibiótico pode afetar a biossíntese de peptidoglicano da parede celular, integridade da membrana celular ou síntese de DNA ou proteína em bactérias. Exemplos não limitativos de antibióticos ativos contra bactérias Gram-negativas incluem cefalosporinas, tais como ceftriaxona-cefotaxima, ceftazidima, cefepima, cefoperazona e ceftobiprole; fluoroquinolonas, tal como ciprofloxacina e levofloxacina; aminoglicosídeos, tal como gentamicina, tobramicina e amicacina; piperacilina, ticarcilina, imipenema, meropenema, doripenema, penicilinas de amplo espectro com ou sem inibidores de beta-lactamase, rifampicina, polimixina B e colistina.
[0033] “Resistente ao fármaco” geralmente se refere a uma bactéria que é resistente à atividade antibacteriana de um fármaco. Quando usado de certas maneiras, a resistência aos fármacos pode referir-se especificamente à resistência aos antibióticos. Em alguns casos, uma bactéria que geralmente é suscetível a um determinado antibiótico pode desenvolver resistência ao antibiótico, tornando-se, assim, um micróbio ou cepa resistente a fármacos. Um patógeno “resistente a múltiplos fármacos” (“MDR”) é aquele que desenvolveu resistência a pelo menos duas classes de fármacos antimicrobianos, cada uma usada como monoterapia. Por exemplo, certas cepas de S. aureus foram consideradas resistentes a vários antibióticos incluindo meticilina e/ou vancomicina (Ameaças resistentes a antibióticos nos
Estados Unidos, 2013, Departamento de Saúde e Serviços dos EUA, Centros de Controle e Prevenção de Doenças). Um especialista na técnica pode facilmente determinar se uma bactéria é resistente a fármacos usando técnicas de laboratório de rotina que determinam a suscetibilidade ou resistência de uma bactéria a um fármaco ou antibiótico.
[0034] “Valor efetivo” se refere a uma quantidade que, quando aplicada ou administrada em uma frequência ou regime de dosagem apropriado, é suficiente para prevenir, reduzir, inibir ou eliminar o crescimento bacteriano ou carga bacteriana ou para prevenir, reduzir ou melhorar o início, gravidade, duração ou progressão do distúrbio a ser tratado (por exemplo, crescimento ou infecção de patógeno bacteriano Gram-negativo), prevenir o avanço do distúrbio a ser tratado, causar a regressão do distúrbio a ser tratado ou aumentar ou melhorar o(s) efeito(s) profilático(s) ou terapêutico(s) de outra terapia, como terapia antibiótica ou bacteriostática.
[0035] “Coadministrador” se refere à administração de dois agentes, tal como uma lisina ou polipeptídeo de AMP-lisina e um antibiótico ou qualquer outro agente antibacteriano, de maneira sequencial, bem como a administração desses agentes de uma maneira substancialmente simultânea, como em uma única mistura/composição ou em doses dadas separadamente, mas ainda assim administradas substancialmente simultaneamente ao indivíduo, por exemplo, em momentos diferentes no mesmo dia ou período de 24 horas. Essa coadministração de dois agentes, como uma lisina ou polipeptídeo de AMP-lisina com um ou mais agentes antibacterianos adicionais pode ser fornecida como um tratamento contínuo com duração de até dias, semanas ou meses. Adicionalmente, dependendo do uso, a coadministração não precisa ser contínua ou coextensiva. Por exemplo, se o uso fosse como um agente antibacteriano tópico para tratar, por exemplo, uma úlcera bacteriana ou uma úlcera diabética infectada, alisina ou polipeptídeo de AMP-lisina pode ser administrado apenas inicialmente dentro de 24 horas de um antibiótico adicional e, em seguida, o uso de antibiótico adicional pode continuar sem administração adicional de lisina ou polipeptídeo de AMP-lisina.
[0036] “Indivíduo” se refere a um mamífero, uma planta, um animal inferior, um organismo de uma única célula ou uma cultura de células. Por exemplo, o termo “indivíduo” pretende incluir organismos, por exemplo, procariotas e eucariotas, que são suscetíveis a ou afetados por infecções bacterianas, por exemplo, infecções bacterianas Gram- positivas ou Gram-negativas. Exemplos de indivíduos incluem mamíferos, por exemplo, humanos, cães, vacas, cavalos, porcos, ovelhas, cabras, gatos, camundongos, coelhos, ratos e animais transgênicos não humanos. Em certas modalidades, o indivíduo é um ser humano, por exemplo, um ser humano que sofre, está em risco de sofrer ou é suscetível à infecção por bactérias Gram-negativas, seja essa infecção sistêmica, tópica ou de outra forma concentrada ou confinada a um órgão específico ou tecido.
[0037] “Polipeptídeo” é usado aqui alternadamente com o termo "peptídeo" ou "proteína" e se refere a um polímero feito a partir de resíduos de aminoácidos e geralmente tendo pelo menos cerca de 30 resíduos de aminoácidos. O termo inclui não apenas polipeptídeo na forma isolada, mas também fragmentos ativos e derivados dos mesmos. O termo "polipeptídeo" também abrange proteínas de fusão ou polipeptídeos de fusão compreendendo uma lisina ou AMP como aqui descrito e mantendo, por exemplo, uma função lítica. Dependendo do contexto, um polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de ocorrência natural ou um polipeptídeo recombinante, projetado ou produzido sinteticamente. Um polipeptídeo de lisina particular, por exemplo, pode ser, por exemplo, derivado ou removido de uma proteína nativa por clivagem enzimática ou química, ou pode ser preparado usando técnicas convencionais de síntese de peptídeos (por exemplo, síntese de fase sólida) ou técnicas de biologia molecular (tais como os divulgados em Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)) ou podem ser estrategicamente truncados ou segmentados produzindo fragmentos ativos, mantendo, por exemplo, atividade lítica contra a mesma ou pelo menos uma bactéria alvo comum.
[0038] "Polipeptídeo de fusão" se refere a um produto de expressão resultante da fusão de dois ou mais segmentos de ácido nucleico, resultando em um produto de expressão fundido tipicamente tendo dois ou mais domínios ou segmentos, que normalmente têm propriedades ou funcionalidades diferentes. Em um sentido mais particular, o termo "polipeptídeo de fusão" também pode se referir a um polipeptídeo ou peptídeo compreendendo dois ou mais polipeptídeos ou peptídeos heterólogos ligados covalentemente, seja diretamente ou por meio de um ligante de aminoácido ou peptídeo. Os polipeptídeos que formam o polipeptídeo de fusão são tipicamente ligados ao C-terminal ao N-terminal, embora eles também possam ser ligados ao C-terminal ao C-terminal, N-terminal ao N-terminal, ou N-terminal ao C-terminal. O termo "polipeptídeo de fusão" pode ser usado alternadamente com o termo "proteína de fusão". A expressão aberta "um polipeptídeo compreendendo" uma certa estrutura inclui moléculas maiores do que a estrutura recitada, como polipeptídeos de fusão.
[0039] “Heterólogo” se refere a nucleotídeo, peptídeo, ou sequência de polipeptídeos que não são naturalmente contíguos. Por exemplo, no contexto da presente invenção, o termo "heterólogo" pode ser usado para descrever uma combinação ou fusão de dois ou mais peptídeos e/ou polipeptídeos em que o peptídeo ou polipeptídeo de fusão não é normalmente encontrado na natureza, como, por exemplo,
uma lisina ou fragmento ativo desta e um peptídeo antimicrobiano, incluindo um catiônico e/ou um peptídeo policatiônico, um peptídeo anfipático, um peptídeo de sushi (Ding et al. Cell Mol Life Sci., 65 (7-8): 1202-19 (2008)), um peptídeo defensina (Ganz, T. Nature Reviews Immunology 3, 710-720 (2003)), um peptídeo hidrofóbico, que pode ter atividade lítica aumentada.
[0040] “Fragmento ativo” se refere a uma porção de um polipeptídeo que retém uma ou mais funções ou atividades biológicas do polipeptídeo isolado do qual o fragmento foi retirado, por exemplo, atividade bactericida contra uma ou mais bactérias Gram-negativas.
[0041] “Peptídeo anfipático” se refere a um peptídeo possuindo grupos funcionais hidrofílicos e hidrofóbicos. Em certas modalidades, a estrutura secundária pode colocar resíduos de aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos em lados opostos (por exemplo, lado interno vs lado externo quando o peptídeo está em um solvente, como a água) de um peptídeo anfipático. Esses peptídeos podem, em certas modalidades, adotar uma estrutura secundária helicoidal, como uma estrutura secundária alfa-helicoidal.
[0042] “Peptídeo catiônico” se refere a um peptídeo com uma elevada percentagem de resíduos de aminoácidos carregados positivamente. Em certas modalidades, um peptídeo catiônico tem valor de pKa igual ou superior a 8,0. O termo "peptídeo catiônico" no contexto da presente invenção também abrange peptídeos policatiônicos que são peptídeos produzidos sinteticamente compostos de resíduos de aminoácidos carregados positivamente principalmente, tais como resíduos de lisina (Lys) e/ou arginina (Arg). Os resíduos de aminoácidos que não possuem carga positiva podem ser resíduos de aminoácidos com carga neutra, resíduos de aminoácidos com carga negativa e/ou resíduos de aminoácidos hidrofóbicos.
[0043] "Grupo hidrofóbico" se refere a um grupo químico, como uma cadeia lateral de aminoácido que tem baixa ou nenhuma afinidade por moléculas de água, mas maior afinidade por moléculas de óleo. As substâncias hidrofóbicas tendem a ter baixa ou nenhuma solubilidade em água ou fases aquosas e são tipicamente apolares, mas tendem a ter maior solubilidade em fases oleosas. Exemplos de aminoácidos hidrofóbicos incluem glicina (Gly), alanina (Ala), valina (Val), Leucina (Leu), isoleucina (Ile), prolina (Pro), fenilalanina (Phe), metionina (Met) e triptofano (Trp).
[0044] “Aumento” se refere a um grau de atividade de um agente, como a atividade antimicrobiana, que é maior do que seria de outra forma. "Aumentar" compreende efeitos aditivos e sinérgicos (superaditivos).
[0045] “Sinérgico” ou “superaditivo” se refere a um efeito benéfico provocado por duas substâncias em combinação que excede a soma dos efeitos dos dois agentes trabalhando independentemente. Em certas modalidades, o efeito sinérgico ou superaditivo significativamente, isto é, estatisticamente significativamente, excede a soma dos efeitos dos dois agentes trabalhando independentemente. Um ou ambos os ingredientes ativos podem ser empregados em um nível sublimiar, isto é, um nível no qual se a substância ativa for empregada individualmente não produz nenhum ou um efeito muito limitado. O efeito pode ser medido por ensaios como o ensaio de tabuleiro, descrito aqui.
[0046] “Tratamento” se refere a qualquer processo, ação, aplicação, terapia ou similar, em que um indivíduo, tal como um ser humano, é submetido à assistência médica com o objetivo de curar um distúrbio, erradicar um patógeno ou melhorar a condição do indivíduo, diretamente ou indiretamente. O tratamento também se refere à redução da incidência, alívio dos sintomas, eliminação da recorrência, prevenção da recorrência, prevenção da incidência, redução do risco de incidência,
melhora dos sintomas, melhora do prognóstico ou combinações dos mesmos. "Tratamento" pode ainda abranger a redução da população, taxa de crescimento ou virulência de uma bactéria no indivíduo e, assim, controlar ou reduzir uma infecção bacteriana em um indivíduo ou contaminação bacteriana de um órgão, tecido ou ambiente. Assim, o "tratamento" que reduz a incidência pode, por exemplo, ser efetivo para inibir o crescimento de pelo menos uma bactéria Gram-negativa em um meio particular, seja um indivíduo ou um ambiente. Por outro lado, “tratamento” de uma infecção já estabelecida se refere a inibir o crescimento, reduzir a população, matar, incluindo erradicar, uma bactéria Gram-negativa responsável por uma infecção ou contaminação.
[0047] “Prevenção” se refere à prevenção da incidência, recorrência, disseminação, início ou estabelecimento de um distúrbio, tal como uma infecção bacteriana. Não se pretende que a presente invenção seja limitada à prevenção completa ou à prevenção do estabelecimento de uma infecção. Em algumas modalidades, o início é retardado ou a gravidade de uma doença contraída subsequentemente ou a chance de contraí-la é reduzida e esses constituem exemplos de prevenção.
[0048] “Doenças contraídas” referem-se a doenças que se manifestam com sintomas clínicos ou subclínicos, como a detecção de febre, sepse ou bacteremia, bem como doenças que podem ser detectadas pelo crescimento de um patógeno bacteriano (por exemplo, em cultura) quando os sintomas associados a tal patologia ainda não foram manifestados.
[0049] O termo "derivado" no contexto de um peptídeo ou polipeptídeo ou fragmentos ativos dos mesmos se destina a abranger, por exemplo, um polipeptídeo modificado para conter uma ou mais frações químicas diferentes de um aminoácido que não impacta ou destrói substancialmente adversamente a atividade do polipeptídeo (por exemplo, atividade lítica). A porção química pode ser ligada covalentemente ao peptídeo, por exemplo, por meio de um resíduo de aminoácido do terminal amino, um resíduo de aminoácido do terminal carbóxi ou em um resíduo de aminoácido interno.
Essas modificações podem ser naturais ou não naturais.
Em certas modalidades, uma modificação não natural pode incluir a adição de um grupo protetor ou de cobertura em uma fração reativa, adição de um marcador detectável, tal como anticorpo e/ou marcador fluorescente, adição ou modificação de glicosilação ou adição de um grupo de volume tal como PEG (peguilação) e outras alterações conhecidas pelos versados na técnica.
Em certas modalidades, a modificação não natural pode ser uma modificação de capeamento, como acetilações N-terminais e amidações C-terminais.
Grupos de proteção exemplares que podem ser adicionados a polipeptídeos de lisina ou AMPs incluem, mas não estão limitados a, t-Boc e Fmoc.
As proteínas de marcação fluorescente comumente usadas, tal como, mas não se limitando a, proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente vermelha (RFP), proteína fluorescente ciana (CFP), proteína fluorescente amarela (YFP) e mCherry, são proteínas compactas que podem ser ligadas covalentemente ou não covalentemente a um polipeptídeo ou fundido a um polipeptídeo sem interferir com as funções normais das proteínas celulares.
Em certas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína fluorescente pode ser inserido a montante ou a jusante da sequência de polinucleotídeo AMP ou lisina.
Isso irá produzir uma proteína de fusão (por exemplo, lisina Polipeptídeo::GFP) que não interfere na função celular ou função de um polipeptídeo ao qual está ligada.
A conjugação de polietilenoglicol (PEG) com proteínas tem sido usada como um método para estender a meia-vida de circulação de muitas proteínas farmacêuticas.
Assim, no contexto de derivados de polipeptídeos, tal como derivados de polipeptídeos de lisina, o termo "derivado" abrange polipeptídeos, tal como polipeptídeos de lisina, quimicamente modificados por ligação covalente de uma ou mais moléculas de PEG. Prevê-se que os polipeptídeos de lisina, como as lisinas peguiladas, exibirão meia-vida de circulação prolongada em comparação com os polipeptídeos não peguilados, enquanto retêm a atividade biológica e terapêutica.
[0050] “Percentagem de identidade de sequência de aminoácidos” se refere ao percentual de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata idêntica aos resíduos de aminoácidos da sequência de polipeptídeo referência, tal como uma sequência de polipeptídeo de lisina, após alinhar as sequências e introduzir lacunas, se necessário, para atingir o máximo de percentagem de identidade de sequência e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. O alinhamento para fins de determinação da identidade percentual da sequência de aminoácidos pode ser alcançado de várias maneiras que estão dentro da habilidade na técnica, por exemplo, usando software disponível publicamente, como BLAST ou software disponível comercialmente, por exemplo, da DNASTAR. Duas ou mais sequências de polipeptídeos podem ser de 0 a 100% idênticas, ou qualquer valor inteiro entre elas. No contexto da presente invenção, dois polipeptídeos são "substancialmente idênticos" quando pelo menos 80% dos resíduos de aminoácidos (tal como pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 92,5%, pelo menos cerca de 95% , pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99%) são idênticos. O termo "percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos", conforme descrito neste documento, também se aplica a peptídeos. Assim, o termo "substancialmente idêntico" abrangerá variantes mutadas, truncadas, fundidas ou de outra forma modificadas em sequência de lisinpolipeptídeos e peptídeos e AMPs aqui descritos, e seus fragmentos ativos, bem como polipeptídeos com identidade de sequência substancial (por exemplo, em pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92,5%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade medida, por exemplo, por um ou mais métodos referenciados acima) em comparação com o polipeptídeo de referência (tipo selvagem ou outro intacto).
[0051] Como aqui usado, duas sequências de aminoácidos são "substancialmente homólogas" quando pelo menos cerca de 80% dos resíduos de aminoácidos (tal como pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 92,5%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99%) são idênticos ou representam substituições conservativas. As sequências dos polipeptídeos da presente invenção são substancialmente homólogas quando um ou mais, tais como até 10%, até 15% ou até 20% dos aminoácidos do polipeptídeo, tais como lisina, AMP, e/ou polipeptídeos de fusão aqui descritos, são substituídos por uma substituição de aminoácido similar ou conservativo, e em que os peptídeos resultantes têm pelo menos uma atividade (por exemplo, efeito antibacteriano) e/ou especificidades bacterianas do polipeptídeo de referência, como a lisina, AMP, e/ou polipeptídeos de fusão aqui descritos.
[0052] Como aqui usado, uma "substituição de aminoácido conservativo" é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral com uma carga semelhante. As famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais com encargos semelhantes foram definidas no artigo. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).
[0053] "Composição inalável" se refere a composições farmacêuticas da presente invenção que são formuladas para entrega direta ao trato respiratório durante ou em conjunto com respiração de rotina ou assistida (por exemplo, por administração intratraqueobrônquica, pulmonar, e/ou nasal), incluindo, mas não limitado a, formulações atomizadas, nebulizadas, pó seco, e/ou aerossol.
[0054] “Biopelícula” se refere a bactérias que se ligam a superfícies e se agregam em uma matriz polimérica hidratada que pode ser composta por componentes derivados de bactérias e/ou hospedeiros. Um biopelícula é um agregado de micro-organismos em que as células aderem umas às outras em uma superfície biótica ou abiótica. Essas células aderentes são frequentemente incorporadas em uma matriz composta por, mas não limitada a, substância polimérica extracelular (EPS). Biopelícula EPS, também conhecido como lodo (embora nem tudo descrito como lodo seja um biopelícula) ou placa, é um conglomerado polimérico geralmente composto de DNA extracelular, proteínas e polissacarídeos.
[0055] "Adequado" no contexto de um antibiótico sendo adequado para uso contra certas bactérias se refere a um antibiótico que foi considerado efetivo contra essas bactérias, mesmo que a resistência se desenvolva subsequentemente.
[0056] “Membrana externa” ou “OM” se refere a uma característica de bactérias Gram-negativas. A membrana externa é composta por uma bicamada lipídica com um folheto interno de fosfolipídeos e um folheto anfifílico externo consistindo em grande parte de lipopolissacarídeo (LPS). O LPS tem três seções principais: um fosfolipídio hexa-acilado à base de glucosamina denominado lipídio A, um núcleo de polissacarídeo e uma cadeia polissacarídica externa estendida chamada O-antígeno. O OM apresenta um contínuo não fluido estabilizado por três interações principais, incluindo: i) a ligação ávida das moléculas de LPS umas às outras, especialmente se cátions estiverem presentes para neutralizar os grupos fosfato; ii) o empacotamento apertado de cadeias acila amplamente saturadas; e iii) empilhamento hidrofóbico da porção do lipídeo A. A estrutura resultante é uma barreira para moléculas hidrofóbicas e hidrofílicas. Abaixo do OM, o peptidoglicano forma uma camada fina que é muito sensível à clivagem hidrolítica - ao contrário do peptidoglicano das bactérias Gram- negativas que tem 30 a 100 nanômetros (nm) de espessura e consiste em até 40 camadas, o peptidoglicano de bactérias Gram-negativas a bactéria tem apenas 2 a 3 nm de espessura e consiste em apenas 1 a 3 camadas.
POLIPEPTÍDEOS Lisinas, lisinas variantes, fragmentos ativos das mesmas ou derivados
[0057] A presente invenção é direcionada a polipeptídeos isolados compreendendo lisinas, lisinas variantes, seus fragmentos ativos ou derivados. Em algumas modalidades, os polipeptídeos isolados compreendendo as lisinas, lisinas variantes, fragmentos ativos das mesmas ou derivados são combinados com peptídeos antimicrobianos ("AMPs") para formar uma construção de polipeptídeo de AMP-lisina, em que a construção de polipeptídeo de AMP-lisina tem atividade de lisina. Como aqui usado "Atividade de lisina" abrange a capacidade de uma lisina de matar bactérias (por exemplo, P. aeruginosa), reduzir a população de bactérias ou inibir o crescimento bacteriano (por exemplo, ao penetrar na membrana externa de uma bactéria Gram-negativa), opcionalmente na presença de soro humano. A atividade da lisina também abrange a capacidade de remover ou reduzir um biopelícula e/ou a capacidade de reduzir a concentração inibitória mínima (CIM) de um antibiótico, opcionalmente na presença de soro humano.
[0058] Em algumas modalidades, os presentes polipeptídeos isolados compreendendo lisinas, lisinas variantes, seus fragmentos ativos ou derivados são capazes de penetrar na membrana externa de bactérias Gram-negativas. Sem serem limitados pela teoria, após a penetração da membrana externa, os presentes polipeptídeos isolados compreendendo lisinas, lisinas variantes, seus fragmentos ativos ou derivados podem degradar o peptidoglicano, um importante componente estrutural da parede celular bacteriana, resultando em, por exemplo, lise celular ou dano não letal que inibe o crescimento bacteriano. Em algumas modalidades, os presentes polipeptídeos isolados compreendendo lisinas, lisinas variantes, fragmentos ativos das mesmas ou derivados divulgados aqui contêm domínios N- e/ou C- terminal de α-hélice carregados positivamente (e anfipáticos) que facilitam a ligação à membrana externa aniônica de uma bactéria Gram- negativa para o efeito translocação para o peptidoglicano sub- adjacente.
[0059] A capacidade de uma lisina de penetrar na membrana externa de uma bactéria Gram-negativa pode ser avaliada por qualquer método conhecido na técnica, tal como descrito em WO 2017/049233, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Por exemplo, a lisina pode ser incubada com bactérias Gram-negativas e um composto hidrofóbico. A maioria das bactérias Gram-negativas são fortemente resistentes a compostos hidrofóbicos, devido à presença da membrana externa e, portanto, não permitem a captação de agentes hidrofóbicos como 1-N-fenilnaftilamina (NPN), cristal violeta ou Ácido 8- anilino-1-naftalenossulfônico (ANS). NPN, por exemplo, fluoresce fortemente em condições hidrofóbicas e fracamente em condições aquosas. Consequentemente, a fluorescência NPN pode ser usada como uma medição da permeabilidade da membrana externa.
[0060] Mais particularmente, a capacidade de uma lisina de penetrar uma parede externa pode ser avaliada incubando, por exemplo, NPN com uma bactéria Gram-negativa, por exemplo, P. aeruginosa cepa PA01, na presença da lisina a ser testada quanto à atividade. Uma maior indução de fluorescência em comparação com a fluorescência emitida na ausência de uma lisina (controle negativo) indica penetração na membrana externa. Além disso, a indução de fluorescência pode ser comparada à de agentes permeabilizantes estabelecidos, como EDTA (tetra-acetato de etileno diamina) ou um antibiótico, como um antibiótico de último recurso usado no tratamento de P. aeruginosa, ou seja, Polimixina B (PMB) para avaliar o nível de permeabilidade da membrana externa.
[0061] Em algumas modalidades, os presentes polipeptídeos isolados compreendendo lisinas, lisinas variantes, seus fragmentos ativos ou derivados exibem atividade de lisina na presença e/ou ausência de soro humano. Métodos adequados para avaliar a atividade de uma lisina em soro humano são conhecidos na técnica e descritos nos exemplos. Resumidamente, um valor de MIC (isto é, a concentração mínima de peptídeo suficiente para suprimir pelo menos 80% do crescimento bacteriano em comparação com o controle) pode ser determinado para uma lisina e comparado com, por exemplo, uma lisina parental ou composto inativo no soro humano, por exemplo, lisozima do fago T4 ou artilisina GN126. A lisozima do fago T4 está disponível comercialmente, por exemplo, da Sigma-Aldrich, Inc. GN126 corresponde a Art-175, que é descrito na literatura e é obtido por fusão de AMP SMAP-29 a GN lisina KZ144. Ver Briers et al. 2014, Antimicrob, Agents Chemother. 58:3774-3784, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0062] Mais particularmente, os valores de MIC para uma lisina podem ser determinados contra, por exemplo, o laboratório P. aeruginosa cepa PA01, por exemplo, caldo Mueller-Hinton, caldo Mueller-Hinton suplementado com soro humano, CAA como aqui descrito, que inclui concentrações fisiológicas de sal e CAA suplementado com soro humano. O uso de PA01 permite o teste na presença de concentrações séricas elevadas, uma vez que, ao contrário da maioria dos isolados clínicos, PA01 é insensível à atividade antibacteriana de matrizes de sangue humano.
[0063] Em algumas modalidades, os presentes polipeptídeos isolados compreendendo lisinas, lisinas variantes, seus fragmentos ativos ou derivados são capazes de reduzir um biopelícula. Métodos para avaliar a Concentração Mínima de Erradicação de Biopelícula (MBEC) de uma lisina ou AMP podem ser determinados usando uma variação do método MIC de microdiluição de caldo com modificações (Ver Ceri et al. 1999. J. Clin Microbial. 37:1771-1776, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade e Schuch et al., 2017, Antimicrob. Agents Chemother. 61, páginas 1 a 18, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.) Neste método, colônias frescas de, por exemplo, uma cepa de P. aeruginosa, como ATCC 17647, são suspensas em meio, por exemplo, solução de tampão de fosfato (PBS) diluída, por exemplo, 1:100 em TSBg (caldo de soja tríptica suplementado com glicose a 0,2%), adicionado, por exemplo, alíquotas de 0,15 mL, a um dispositivo de biopelícula Calgary (placa de 96 cavidades com tampa contendo 96 pinos de policarbonato; lnnovotech Inc.) e incubado, por exemplo, 24 horas a 37 °C. Os biopelículas são então lavados e tratados com, por exemplo, uma série de diluição de 2 vezes da lisina em TSBg, por exemplo, 37°C por 24 horas. Após o tratamento, as cavidades são lavadas, secadas ao ar, por exemplo, 37°C e manchadas com, por exemplo, 0,05% de violeta de cristal por 10 minutos. Após manchamento, os biopelículas são descolorados, por exemplo, com ácido acético 33% e o OD600 de, por exemplo, violeta de cristal extraído é determinado. O MBEC de cada amostra é a concentração mínima de lisina necessária para remover > 95% da biomassa do biopelícula avaliada por quantificação de violeta de cristal.
[0064] Em algumas modalidades, os presentes polipeptídeos isolados compreendendo lisinas, lisinas variantes, seus fragmentos ativos ou derivados reduzem a concentração inibitória mínima (MIC) de um antibiótico necessário para inibir bactérias na presença e/ou ausência de soro humano. Qualquer método conhecido para avaliar MIC pode ser usado. Em algumas modalidades, um ensaio de tabuleiro é usado para determinar o efeito de uma lisina na concentração de antibióticos. O ensaio de tabuleiro é baseado em uma modificação do método CLSI para determinação de MIC por microdiluição em caldo (Ver Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), CLSI. 2015. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Padrão aprovado - 10ª edição. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade e Ceri et al. 1999. J. Clin. Microbiol. 37: 1771-1776, que também é aqui incorporado por referência em sua totalidade).
[0065] Os tabuleiros são construídos primeiro preparando colunas, por exemplo, uma placa de microtitulação de polipropileno de 96 cavidades, em que cada cavidade tem a mesma quantidade de antibiótico diluído 2 vezes ao longo do eixo horizontal. Em uma placa separada, fileiras comparáveis são preparadas em que cada cavidade tem a mesma quantidade de lisina diluída, por exemplo, 2 vezes ao longo do eixo vertical. As diluições de lisina e antibiótico são então combinadas, de modo que cada coluna tenha uma quantidade constante de antibiótico e diluições dobradas de lisina, enquanto cada linha tem uma quantidade constante de lisina e diluições dobradas de antibiótico. Cada cavidade, portanto, tem uma combinação única de lisina e antibiótico. As bactérias são adicionadas às combinações de fármacos em concentrações de 1x10 5 CFU/mL em CAA, por exemplo, com ou sem soro humano. A MIC de cada fármaco, sozinha e em combinação, é então registrada após, por exemplo, 16 horas a 37°C em ar ambiente. As concentrações inibitórias fracionárias de soma (∑FICs) são calculadas para cada fármaco e o valor mínimo de ∑FIC (∑FICmin) é usado para determinar o efeito da combinação lisina/antibiótico.
[0066] Em algumas modalidades, as presentes lisinas e construções de polipeptídeo de AMP-lisina são capazes de sinergizar com antibióticos, como imipenem e meropenema, e conduzir a ressensibilização de bactérias gram-negativas incluindo organismos MDR, tal como P. aeruginosa resistente a carbapenema. Tal ressensibilização pode ser determinada combinando as presentes lisinas ou construção de polipeptídeo de AMP-lisina com um antibiótico em um ensaio de tabuleiro, como aqui descrito. Bactérias resistentes a antibióticos, como P. aeruginosa resistente a carbapenema, são adicionadas a uma combinação de construção de lisina ou polipeptídeo de AMP-lisina. Geralmente a ressensibilização ocorre em combinações sinérgicas em que os valores de MIC do antibiótico caem abaixo dos pontos de corte estabelecidos, por exemplo, um valor de MIC de <2 para bactérias sensíveis a antibióticos, um valor de MIC de 4 para bactérias sensíveis a intermediários e um valor de MIC> 8 para bactérias resistentes a antibióticos, por exemplo, isolados resistentes a carbapenema. Ver Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), CLSI. 2019. M100 Performance Standards for Antimicrobial
Susceptibility Testing; 29ª Edição. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA.
[0067] Em algumas modalidades, os presentes polipeptídeos isolados compreendendo lisinas, lisinas variantes, seus fragmentos ativos ou derivados apresentam baixa toxicidade contra eritrócitos. Qualquer metodologia conhecida na técnica pode ser usada para avaliar o potencial de atividade hemolítica dos presentes polipeptídeos isolados compreendendo lisinas, lisinas variantes, fragmentos ativos das mesmas ou derivados.
[0068] Exemplos de lisinas adequadas da presente invenção, particularmente para uso com as construções de polipeptídeo de AMP- lisina aqui descritos, incluem a lisina GN316 obtida de Klebsiella fago 0507-KN2-1 (Sequência de Referência NCBI: YP_008531963.1, SEQ ID NO: 22), lisina PaP2_gp17 obtida a partir de Pseudomonas fago (Sequência de Referência NCBI: YP_024745.1, SEQ ID NO: 96), GN333 obtido de Delftia sp. (Sequência de Referência NCBI: WP_016064791.1, SEQ ID NO: 28), GN424 obtido de Burkholderia pseudomultivorans (Sequência de Referência NCBI: WP_060250996.1, SEQ ID NO: 56), lisina GN425 obtida de Pseudomonas flexibilis(Sequência de Referência NCBI: WP_039605935.1, SEQ ID NO: 58), GN428 obtido de Escherichia vírus CBA120 (Sequência de Referência NCBI: YP_004957781.1, SEQ ID NO: 60), GN431 obtido de Dickeya fago phiD3 (Sequência de Referência NCBI: AIM51349.1, SEQ ID NO: 64), GN485 obtido de Erwinia sp. Leaf5 (Sequência de Referência NCBI: WP_056233282.1, SEQ ID NO: 68) e GN123 obtido de Pseudomonas fago PhiPA3 (Sequência de Referência NCBI: YP_009217242.1, SEQ ID O: 175).
[0069] As lisinas descritas acima foram identificadas por técnicas de bioinformática. Embora algumas das sequências identificadas tenham sido anotadas como proteínas de ligação a peptidoglicanos putativos,
nenhuma função foi previamente atribuída definitivamente a polipeptídeos com essas sequências. Os inventores reconheceram surpreendentemente que as sequências identificadas acima são adequadas para uso como agentes antibacterianos, em particular, contra bactérias Gram-negativas, conforme descrito nos exemplos.
[0070] Exemplos adicionais de lisinas adequadas da presente invenção, particularmente aquelas para uso com as presentes construções de polipeptídeo de AMP-lisina, incluem a lisina GN76 obtida de Acinetobacter fago vB_AbaP_CEB1 (Sequência de Referência NCBI ALC76575.1, SEQ ID NO: 203 GenBank: ALC76575.1), a lisina GN4 obtida de Pseudomonas fago PAJU2 (Sequência de Referência NCBI YP 002284361.1, SEQ ID NO: 74), a lisina GN14 obtida de Pseudomonas fago Lull (Sequência de Referência NCBI YP
006382555.1, SEQ ID NO: 124) e a lisina GN37 obtida de Micavibrio aeruginosavorus (Sequência de Referência NCBI WP _014102102.1, SEQ ID NO: 84). Cada uma das lisinas anteriores também é divulgada no documento WO 2017/049233, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0071] Em algumas modalidades, os presentes polipeptídeos isolados compreendem uma variante de lisina, por exemplo, uma lisina contendo uma ou mais inserções, deleções e/ou substituições de aminoácidos em comparação a um polipeptídeo de lisina de referência, por exemplo, uma lisina de ocorrência natural ou uma lisina parental, que por sua vez é uma lisina variante. Em algumas formas, uma sequência de polipeptídeo isolada compreendendo uma lisina variante, seu fragmento ativo ou derivado tem pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98% ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência com a referência de lisina e/ou fragmento ativo da mesma aqui descrito.
[0072] As variantes de lisina da presente invenção normalmente retêm uma ou mais atividades funcionais ou biológicas de uma lisina de referência. Em algumas modalidades, a modificação melhora a atividade antibacteriana da lisina. Tipicamente, a variante lisina melhorou a atividade antibacteriana in vitro (por exemplo, em tampão e/ou meio) em comparação com a lisina de referência. Em outras modalidades, a variante de lisina melhorou a atividade antibacteriana in vivo (por exemplo, em um modelo de infecção animal). Em algumas modalidades, a modificação melhora a atividade antibacteriana da lisina na ausência e/ou presença de soro humano.
[0073] As lisinas variantes adequadas, particularmente aquelas para uso nas presentes construções de polipeptídeo de AMP-lisina, incluem a lisina GN146 (SEQ ID NO: 78), lisina GN156 (SEQ ID NO: 126), lisina GN202 (SEQ ID NO: 118) e lisina GN121 (SEQ ID NO: 175). Cada uma das lisinas anteriores também é divulgada no Pedido Provisório Norte-Americano No. 62.597.577, que foi protocolado em 12 de dezembro de 2017 e no Pedido Provisório Norte-Americano No. 62/721.969, que foi depositado em 23 de agosto de 2018, e é aqui incorporado por referência em sua totalidade. As lisinas descritas no Pedido provisório Norte-Americano No. 62/721.969, tipicamente, são modificadas em referência à sua contraparte natural para aumentar a atividade da lisina no soro, por exemplo, pela introdução de substituições de aminoácidos e/ou introdução de fragmentos de aminoácidos de peptídeos antimicrobianos maiores. Por exemplo, a sequência de aminiácido GPRRPRRPGRRAPV (resíduos 1 a 14 de SEQ ID NO: 126) descritos por Daniels e Scepartz, 2007, J. Am. Chem. Soc. 129:14578-14579, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade, é introduzido, por exemplo, no terminal N de GN4 (SEQ ID NO: 74), para gerar GN156 (SEQ ID NO: 126), uma construção de polipeptídeo de AMP-lisina de ocorrência não natural.
[0074] Em algumas modalidades, as lisinas variantes são obtidas modificando uma lisina de referência para incluir uma modificação que resulta em uma alteração no ponto isoelétrico geral (pI) da lisina, isto é, o pH no qual uma molécula tem uma carga neutra líquida, por exemplo, incorporando uma única mutação de crescimento de PI, tal como uma única mutação de ponto, em uma lisina de referência. Polipeptídeos de lisina de referência adequados incluem uma lisina selecionada do grupo que consiste em GN76 (SEQ ID NO: 203), GN4 (SEQ ID NO: 74), GN146 (SEQ ID NO: 78), GN14 (SEQ ID NO: 124), GN37 (SEQ ID NO:84) GN316 (SEQ ID NO: 22) lisina Pap2_gp17 (SEQ ID NO: 96), GN329 (SEQ ID NO: 26), GN424 (SEQ ID NO: 56), GN202 (SEQ ID NO: 118), GN425 (SEQ ID NO: 58), GN428 (SEQ ID NO: 60), GN431 (SEQ ID NO: 64), GN486 (SEQ ID NO: 66), GN333 (SEQ ID NO: 28) GN485 (SEQ ID NO: 68)GN123 (SEQ ID NO: 173) e GN121 (SEQ ID NO: 175). Em certas modalidades, a variante de lisina tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência para um polipeptídeo de lisina de referência tendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 203, 74, 78, 124, 84, 22, 96, 26, 56, 118, 58, 60, 64, 66, 28, 68, 173 e 175.
[0075] Por exemplo, a lisina GN37 (SEQ ID NO: 84) pode ser modificado para aumentar o pI introduzindo a substituição de aminoácido, R79H, para gerar a lisina GN217 (SEQ ID NO: 8). Nesta modalidade, a potência da lisina GN217 (SEQ ID NO: 8) é aumentada tanto na presença quanto na ausência de soro humano em comparação com aquela da lisina de referência, GN37 (SEQ ID NO: 84), conforme descrito nos exemplos.
[0076] Outros exemplos de mutações modificadoras de pI adequadas incluem a introdução de uma substituição de aminoácido, tal como K218D, K228D, R85H e/ou K22D em uma lisina de referência,
como GN316 (SEQ ID NO: 22), para gerar, por exemplo, a lisina GN394 (SEQ ID NO: 48), a lisina GN396 (SEQ ID NO: 50), a lisina GN408 (SEQ ID NO: 52) e a lisina GN418 (SEQ ID NO: 54), respectivamente. Em algumas modalidades, as mutações modificadoras de pI anteriores melhoram a atividade antibacteriana da lisina na ausência e/ou presença de soro humano, conforme exemplificado neste documento.
[0077] Em algumas modalidades, as variantes de lisina da presente invenção são tipicamente projetadas para reter um domínio α-hélice, a presença ou ausência de que pode ser prontamente determinada usando vários programas de software, tais como Jpred4 (compio.dundee.ac.uk/jpred), Helical Wheel (hael.net/helical.htm), HeliQuest (zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/) e PEP-FOLD 3 (bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/services/PEP-FOLD3).
[0078] Em algumas modalidades, o domínio α-hélice está localizado no terminal C de uma lisina. Em outras modalidades, o domínio α-hélice está localizado no terminal N de uma lisina. Mais tipicamente, o domínio α-hélice está localizado no terminal C. O domínio de α-hélice das lisinas da presente invenção varia em tamanho entre cerca de 20 e 40 aminoácidos, mais tipicamente entre cerca de 15 e 33 resíduos de aminoácidos. Por exemplo, o domínio α-hélice GN14, que está localizado no terminal N, contém 15 aminoácidos (resíduos de 66 a 80 de SEQ ID NO: 124). O domínio α-hélice GN37, que está localizado no terminal C, contém 14 aminoácidos (resíduos 113 a 126 de SEQ ID NO: 84). O domínio α-hélice GN4, que também está localizado no terminal C, contém 25 aminoácidos (resíduos 116 a 140 de SEQ ID NO: 74).
[0079] Em algumas modalidades, as lisinas variantes, seus fragmentos ativos ou seus derivados divulgados aqui são modificados para incluir um marcador de purificação, por exemplo, GSHHHHHHG (SEQ ID NO: 100). O marcador de purificação pode ser inserido em qualquer lugar dentro da lisina, normalmente entre o primeiro e o segundo aminoácido. Por exemplo, o marcador de purificação pode ser inserido entre a primeira metionina e a primeira alanina no terminal N da lisina GN316 (SEQ ID NO: 22) para obter uma lisina GN316 variante (SEQ ID NO: 24) sem afetar adversamente a atividade. Em outras modalidades, o marcador de purificação pode ser inserido entre a primeira metionina e a primeira glicina no terminal N da lisina GN156 (SEQ ID NO: 156) para obter a variante GN486 (SEQ ID NO: 66).
[0080] As variantes de lisina podem ser formadas por qualquer método conhecido na técnica e conforme descrito em WO WO 2017/049233, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade, por exemplo, modificando qualquer uma das lisinas, fragmentos ativos das mesmas e derivados aqui descritos através de mutagênese dirigida ou por meio de mutações em hospedeiros que produzem as presentes lisinas que retêm uma ou mais das funções biológicas, conforme aqui descrito. As presentes variantes de lisina podem ser truncadas, quiméricas, embaralhadas ou "naturais" e podem estar em combinação conforme descrito, por exemplo, na Patente Norte Americana nº
5.604.109, que é incorporada aqui em sua totalidade por referência.
[0081] Por exemplo, alguém versado na técnica pode razoavelmente fazer e testar substituições ou remanejamentos para, por exemplo, o domínio α-hélice ou regiões fora do domínio α-hélice. As comparações de sequências com o banco de dados Genbank podem ser feitas com, por exemplo, uma sequência de aminoácidos completa conforme aqui descrito, por exemplo, para identificar aminoácidos para substituição.
[0082] As mutações podem ser feitas nas sequências de aminoácidos ou nas sequências de ácido nucleico que codificam os polipeptídeos e lisinas, fragmentos ativos ou derivados, de modo que um códon particular seja alterado para um códon que codifica para um aminoácido diferente, um aminoácido é substituído por outro aminoácido, ou um ou mais aminoácidos são deletados.
[0083] Essa mutação geralmente é feita fazendo o menor número possível de alterações de nucleotídeos. Uma mutação de substituição deste tipo pode ser feita para alterar um aminoácido na proteína resultante de uma maneira não conservativa (por exemplo, alterando o códon de um aminoácido pertencente a um agrupamento de aminoácidos tendo um tamanho ou característica particular para um aminoácido pertencente a outro agrupamento) ou de forma conservativa (por exemplo, alterando o códon de um aminoácido pertencente a um agrupamento de aminoácidos tendo um tamanho ou característica particular para um aminoácido pertencente ao mesmo agrupamento). Essa mudança conservativa geralmente leva a menos mudança na estrutura e função da proteína resultante. Uma mudança não conservativa tem mais probabilidade de alterar a estrutura, atividade ou função da proteína resultante. A presente invenção deve ser considerada como incluindo sequências contendo alterações conservativas que não alteram significativamente a atividade ou características de ligação da proteína resultante. Assim, alguém versado na técnica, com base em uma revisão da sequência de lisinas aqui fornecida e em seu conhecimento e nas informações públicas disponíveis para outros polipeptídeos de lisina, pode fazer alterações ou substituições de aminoácidos na sequência de polipeptídeo de lisina. As alterações de aminoácidos podem ser feitas para substituir ou substituir um ou mais, um ou alguns, um ou vários, um a cinco, um a dez, ou qualquer outro número de aminoácidos na sequência da(s) lisina(s) fornecida(s) aqui para gerar mutantes ou variantes dos mesmos. Tais mutantes ou variantes dos mesmos podem ser previstos quanto à função ou testados quanto à função ou capacidade para atividade antibacteriana, como aqui descrito, contra, por exemplo, P. aeruginosa, e/ou por ter atividade comparável à lisina(s) como descrito e particularmente fornecido aqui. Assim, as alterações feitas na sequência de lisina e mutantes ou variantes aqui descritos podem ser testadas usando os ensaios e métodos conhecidos na técnica e aqui descritos. Alguém versado na técnica, com base na estrutura de domínio da(s) lisina(s) deste documento pode prever um ou mais, um ou vários aminoácidos adequados para substituição ou troca e/ou um ou mais aminoácidos que não são adequados para substituição ou troca, incluindo substituições conservativas ou não conservativas razoáveis.
[0084] Em algumas modalidades, os presentes polipeptídeos isolados compreendem fragmentos ativos de lisinas ou derivados. O termo "fragmento ativo" se refere a uma porção de uma lisina de comprimento total, que retém uma ou mais atividades biológicas da lisina de referência. Assim, como aqui usado, um fragmento ativo de uma lisina ou lisina variante inibe o crescimento, ou reduz a população, ou mata P. aeruginosa e opcionalmente pelo menos uma espécie de bactéria Gram-negativa conforme descrito neste documento na ausência ou presença de, ou na ausência e na presença de soro humano. Fragmentos ativos de lisinas adequados incluem, mas não estão limitados, àqueles descritos em WO2017/049233, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Os fragmentos de lisina ativos tipicamente retêm um domínio de α-hélice. Exemplos de fragmentos de lisina ativos incluem aqueles da lisina GN4 (SEQ ID NO: 74) estabelecidos em SEQ ID NOS: 127-130.
[0085] Em algumas modalidades, a lisina, lisina variante, fragmento ativo deste ou derivado incluído nos presentes polipeptídeos isolados é selecionado do grupo que consiste em GN217 (SEQ ID NO:8), GN316 variante (SEQ ID NO: 24) GN316 (SEQ ID NO: 22), GN329 (SEQ ID NO: 26), GN333 (SEQ ID NO: 28), GN394 (SEQ ID NO: 48), GN396 (SEQ ID NO:50), GN408 (SEQ ID NO: 52), (SEQ ID NO:54 ), GN424 (SEQ ID NO: 56), GN425 (SEQ ID NO:58 ), GN428 (SEQ ID NO: 60),
GN431 (SEQ ID NO: 64), GN486 (SEQ ID NO: 66), GN485 (SEQ ID NO:68), Lisina PaP2_gp17 (SEQ ID NO: 96)GN123 (SEQ ID NO: 173) e GN121 (SEQ ID NO: 175) ou um fragmento ativo do mesmo, em que a lisina ou fragmento ativo da mesma inibe o crescimento, ou reduz a população, ou mata P. aeruginosa e opcionalmente pelo menos uma outra espécie de bactéria Gram-negativa como aqui descrito na ausência ou presença de, ou em tanto na ausência quanto na presença de soro humano. Em algumas modalidades, a lisina ou seu fragmento ativo contém pelo menos uma substituição, deleção ou inserção de aminoácido em relação a pelo menos uma de SEQ ID NOS: 8, 24, 22, 26, 28, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 64, 66, 68, 96, 173 ou 175. Em certas modalidades, pelo menos uma substituição de aminoácido é uma substituição de aminoácido conservadora.
[0086] Em algumas modalidades, a lisina da descrição é selecionada do grupo que consiste em GN329 (SEQ ID NO: 26), GN333 (SEQ ID NO: 28), GN424 (SEQ ID NO: 56), GN425 (SEQ ID NO:58), GN428 (SEQ ID NO: 60), GN431 (SEQ ID NO: 64), GN485 (SEQ ID NO: 68) e lisina PaP2_gp17 (SEQ ID NO: 96) ou um fragmento ativo do mesmo, em que a lisina ou fragmento ativo do mesmo inibe o crescimento, ou reduz a população, ou mata P. aeruginosa e opcionalmente pelo menos uma outra espécie de bactéria Gram- negativa como aqui descrito na ausência ou presença de, ou em tanto na ausência quanto na presença de soro humano. Em algumas modalidades, a lisina, fragmento ativo ou derivados da mesma contém pelo menos uma substituição, deleção ou modificação de inserção em relação à SEQ ID NOS: 26, 28, 56, 58, 60, 64, 68 ou 96. Em certas modalidades, pelo menos uma substituição de aminoácido é uma substituição de aminoácido conservativa.
[0087] Em algumas modalidades, a sequência de polipeptídeo isolada compreende uma lisina selecionada do grupo que consiste em lisina GN217 (SEQ ID NO: 8), lisina GN394 (SEQ ID NO: 48), lisina GN396 (SEQ ID NO: 50), lisina GN408 (SEQ ID NO: 52), lisina GN418 (SEQ ID NO: 54) e GN486 (SEQ ID NO: 66) ou um fragmento ativo do mesmo, em que a lisina ou fragmento ativo da mesma inibe o crescimento, ou reduz a população, ou mata P. aeruginosa e opcionalmente pelo menos uma outra espécie de bactéria Gram- negativa como aqui descrito na ausência ou presença de, ou tanto na ausência quanto na presença de soro humano. Em algumas modalidades, a lisina ou fragmento ativo da mesma contém pelo menos uma substituição, exclusão ou modificação de inserção em relação à SEQ ID NOS: 8, 48, 50, 52, 54 ou 66. Em certas modalidades, o pelo menos um aminoácido substituição é uma substituição conservativa de aminoácidos. Peptídeos Antimicrobianos
[0088] Em algumas modalidades, os polipeptídeos da presente invenção compreendem construções polipeptídeo de lisina-Anti- Peptídeo Microbial (AMP). Os construções de polipeptídeo de AMP- lisina compreendem um polipeptídeo isolado compreendendo uma lisina, lisina variante, fragmento ativo desta ou derivados descritos neste documento e um peptídeo antimicrobiano ou fragmento deste. O termo "peptídeo antimicrobiano" (AMP) como aqui usado se refere a um membro de uma ampla gama de peptídeos codificados por genes curtos (geralmente de 3 a 50 aminoácidos de comprimento), normalmente antibióticos, que podem ser encontrados em praticamente todos os organismos. O termo abrange peptídeos helicoidais, peptídeos de folha β e aqueles que exibem estruturas em espiral aleatórias amplamente desordenadas. Os AMPs incluem defensinas, catelicidinas, peptídeos de sushi, peptídeo catiônicos, peptídeos policatiônicos, peptídeos anfipáticos, peptídeos hidrofóbicos e/ou peptídeos similares a AMP, por exemplo, peptídeos de amurina como aqui descritos. Fragmentos de
AMPs, variantes de AMP e derivados de AMPs também são abrangidos por este termo.
[0089] O termo "atividade de AMP", como aqui usado, abrange a capacidade de um AMP ou fragmento do mesmo de matar bactérias, reduzir a população de bactérias ou inibir o crescimento bacteriano, por exemplo, penetrando na membrana externa de uma bactéria Gram- negativa na presença e/ou ausência de soro humano. Normalmente, a translocação dos AMPs é conduzida por uma interação eletrostática primária com a porção de lipopolissacarídeo da membrana externa seguida pelo deslocamento do cátion, desorganização da membrana e aberturas transitórias e, em alguns casos, internalização do AMP.
[0090] A atividade do AMP também abrange a capacidade de um AMP ou fragmento deste de reduzir a concentração inibitória mínima (MIC) de um antibiótico na presença e/ou ausência de soro humano. Métodos adequados para avaliar a capacidade dos AMPs e seus fragmentos para penetrar na membrana externa de bactérias Gram- negativas e determinar uma redução na MIC de um antibiótico na presença e ausência de soro são conhecidos na técnica e incluem os métodos descritos acima para as presentes lisinas, derivados e fragmentos ativos das mesmas.
[0091] Em algumas modalidades, os AMPs atuais são AMPs variantes com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98% ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência com qualquer um dos AMPs aqui descritos, em que o AMP variante do mesmo retém uma atividade de AMP.
[0092] Em algumas modalidades, os presentes AMPs compreendem um domínio helicoidal, como um domínio α-helicoidal. Em algumas modalidades, o domínio α-helicoidal abrange a maior parte da molécula. Veja, por exemplo, Chp1 e Chp4 da FIG. 1. Em outras modalidades, o domínio α-hélice é interrompido (por exemplo, Chp2) ou truncado (por exemplo, Chp6 e Osp1). O domínio de α-hélice dos AMPs presentes, tais como os Chps, aqui descritos variam em tamanho entre cerca de 3 a 32 aminoácidos, mais tipicamente entre cerca de 10 e 25 resíduos de aminoácidos. Geralmente, os domínios helicoidais são necessários para a atividade e normalmente devem ser retidos quando fundidos a um C- ou N-terminal de uma lisina.
[0093] Normalmente, os peptídeos helicoidais exibem características anfipáticas e contêm uma proporção substancial (por exemplo, 50%) de resíduos hidrofóbicos, frequentemente aparecendo em padrões repetidos. Com a formação de uma estrutura α-helicoidal, os resíduos hidrofílicos normalmente terminam no mesmo lado da hélice, resultando em uma anfifilicidade dependente da conformação. Frequentemente, esses peptídeos não são estruturados em um ambiente aquoso, mas adotam uma conformação helicoidal ao encontrar membranas lipídicas. Os peptídeos pertencentes a este grupo normalmente exibem uma carga global positiva variando de +2 a +11 e geralmente matam micróbios, tal como bactérias Gram-negativas, criando defeitos de membrana, levando a uma perda de gradientes em eletrólitos, substâncias de sinal e outros fatores.
[0094] Em algumas modalidades, os AMPs presentes são peptídeos "semelhantes a AMP", incluindo agentes líticos de fago referidos neste documento como peptídeos de fago clamídia (Chp) ou peptídeos de amurina. Os peptídeos de amurina da presente invenção são distinguíveis de amurinas. Como é conhecido na técnica, as amurinas, que são obtidas a partir de fagos ssDNA ou ssRNA (Microviridae e Leviviridae, respectivamente), são proteínas de membrana integrais com uma estrutura de domínio putativo incluindo um dipeptídeo LS interno imediatamente precedido por um trecho de 10 a 17 resíduos hidrofóbicos. Exemplos de amurinas incluem a proteína E amurina do fago <pX174 (Família Microviridae, gênero Microvints), que é uma proteína de membrana de 91 aminoácidos que causa lise ao inibir a translocase bacteriana Mra Y, uma enzima essencial embutida na membrana que catalisa a formação do precursor da mureína, Lipídio I; a proteína do capsídeo A2 de fago Q ~ (Família Leviviridae, gênero Allolevivirus), que é uma proteína estrutural de 420 aminoácidos que causa lise interferindo na atividade de MurA e desregulando o processo de biossíntese de peptidoglicano; a proteína L amurina do fago MS2 (Família Levivirdae, gênero Levivirus), que é uma proteína de membrana integral de 75 aminoácidos que causa lise usando um mecanismo que requer a atividade da chaperona DnaJ do hospedeiro. Normalmente, as amurinas não podem ser purificadas e não são adequadas para uso como terapêutica antibacteriana.
[0095] Em contraste com as amurinas, os peptídeos de amurina da presente invenção são pequenos peptídeos catiônicos com estruturas α-helicoidais preditas semelhantes às dos AMPs obtidos do sistema imunológico inato de uma variedade de vertebrados (mas com sequências de aminoácidos diferentes dos AMPs). Os peptídeos de amurina são encontrados principalmente em microvírus de clamídia e, em menor extensão, em outros membros relacionados da subfamília Gokushovirinae. Os peptídeos de amurina de uma variedade de fagos Microviridae exibem 30 a 100% de identidade entre si e não têm homologia com outros peptídeos. Ao contrário das amurinas de Microviridae, que têm alvos citoplasmáticos no aparelho biossintético da parede celular e, consequentemente, não podem ser facilmente acessados por proteínas aplicadas externamente, os presentes peptídeos de amurina podem ser usados em forma purificada para exercer atividade bactericida "de fora".
[0096] Peptídeos de amurina adequados para uso nas presentes construções de polipeptídeo de AMP-lisina incluem aqueles descritos em Pedido provisório Norte-americano No. 62/650.235, que foi depositado em 29 de março de 2018, e que é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, os peptídeos de amurina, como os agentes líticos derivados do fago de clamídia (Chp), podem ser usados. Esses agentes líticos derivados de Chp incluem Chp1 (Sequência de Referência NCBI: NP_044319.1, SEQ ID NO: 133), Chp2 (Sequência de Referência NCBI: NP_0546521.1, SEQ ID NO: 70), CPAR39 (Sequência de Referência NCBI: NP_063898.1, SEQ ID NO: 135), Chp3 (Sequência de Referência NCBI: YP_022484.1, SEQ ID NO: 137), Chp4 (Sequência de Referência NCBI: YP_338243.1, SEQ ID NO: 102), Chp6 (Sequência de Referência NCBI: NP_510878.1, SEQ ID NO: 106), Chp7 (Sequência de Referência NCBI: CRH73061.1, SEQ ID NO: 139), Chp8 (Sequência de Referência NCBI: CRH64983.1, SEQ ID NO: 141), Chp9 (Sequência de Referência NCBI: CRH84960.1, SEQ ID NO: 143), Chp10 (Sequência de Referência NCBI: CRH73061.1, SEQ ID NO: 145), Chp11 (Sequência de Referência NCBI: CRH59954.1, SEQ ID NO: 147) e Chp12 (Sequência de Referência NCBI: CRH59965.1, SEQ ID NO: 149).
[0097] Membros da família Chp adicionais adequados incluem Gkh1 (Sequência de Referência NCBI: YP_008798245.1, SEQ ID NO: 151), Gkh2 (Sequência de Referência NCBI: YP_009160382.1, SEQ ID NO: 90), Unp1 (Sequência de Referência NCBI: CDL66944.1, SEQ ID NO: 153), Ecp1 (Sequência de Referência NCBI: WP_100756432.1, SEQ ID NO: 155), Ecp2 (Sequência de Referência NCBI: OAC1404.1, SEQ ID NO: 104), Tma1 (Sequência de Referência NCBI: SHG47122.1, SEQ ID NO: 157), Osp1 (Sequência de Referência NCBI: SFP13761.1, SEQ ID NO: 108), Unp2 (Sequência de Referência NCBI: CDL65918.1, SEQ ID NO: 159), Unp3 (Sequência de Referência NCBI: CDL65808.1, SEQ ID NO: 161), Gkh3 (Sequência de Referência NCBI: AGT39941.1, SEQ ID NO: 163), Unp5 (Sequência de Referência NCBI: AGT39924.1,
SEQ ID NO: 165), Unp6 (Sequência de Referência NCBI: AGT39915.1, SEQ ID NO: 167), Spi1 (Sequência de Referência NCBI: NP_598337.1, SEQ ID NO: 169) e Spi2 (Sequência de Referência NCBI: NP_598336.1, SEQ ID NO: 171), Ecp3 (Sequência de Referência NCBI: WP_105269219.1, SEQ ID NO: 177), Ecp4 (Sequência de Referência NCBI: WP_105466506.1, SEQ ID NO: 179), ALCES1 (Sequência de Referência NCBI: AXB22573.1, SEQ ID NO: 181), AVQ206 (Sequência de Referência NCBI: AVQ10236.1, SEQ ID NO: 183), AVQ244 (Sequência de Referência NCBI: AVQ10244.1, SEQ ID NO: 185), CDL907 (Sequência de Referência NCBI: CDL65907.1, SEQ ID NO: 187), AGT915(Sequência de Referência NCBI: AGT39915.1, SEQ ID NO: 189), HH3930 (Sequência de Referência NCBI: CCH66548.1, SEQ ID NO: 191), Fen7875 (Sequência de Referência NCBI: YP_009160399.1, SEQ ID NO: 193), SBR77 (Sequência de Referência NCBI: AOT25441, SEQ ID NO: 195), Bdp1 Sequência de Referência NCBI: NP_073546.1, SEQ ID NO: 197), LVP1 (Sequência de Referência NCBI: NP_042306.1, SEQ ID NO: 199) e Lvp2 (Sequência de Referência NCBI: NP_085469.1, SEQ ID NO: 201).
[0098] Mais tipicamente, os AMPs são selecionados a partir de um ou mais dos seguintes peptídeos de amurina, Chp2 (SEQ ID NO: 70), Gkh2 (SEQ ID NO: 90), Chp4 (SEQ ID NO: 102), Ecp2 (SEQ ID NO: 104), Chp6(SEQ ID NO: 106) e Osp1 (SEQ ID NO: 108).
[0099] Em algumas modalidades, os peptídeos de amurina são modificados para produzir peptídeos de amurina variantes. Conforme aqui descrito, os peptídeos de amurina tipicamente compreendem um domínio helicoidal, tal como um domínio α-helicoidal. Normalmente, os peptídeos de amurina variantes retêm o domínio α-helicoidal. A retenção do domínio α-helicoidal em qualquer variante do peptídeo amurina é tipicamente identificada com precisão usando vários programas de software, tais como Jpred4 (compio.dundee.ac.uk/jpred),
Helical Wheel (hael.net/helical.htm), HeliQuest (zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/) e PEP-FOLD 3 (bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/services/PEP-FOLD3). Em algumas modalidades, as variantes do peptídeo de amurina são modificadas pela conversão (=) de resíduos carregados, tal como arginina e lisina, dentro do peptídeo de amurina em uma forma de aminoácido "D". A utilidade das conversões para a forma D é descrita na literatura, por exemplo, Manabe et al., Sci. Rep., 2017, páginas 1 a 10, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Os AMPs variantes podem ser preparados de acordo com qualquer método conhecido na arte, incluindo como descrito acima para as lisinas, variantes, fragmentos ativos dos mesmos e derivados.
[00100] Em algumas modalidades, os AMPs para uso nas construções de polipeptídeo de AMP-lisina da presente invenção incluem um fragmento de um AMP maior que retém a atividade antibacteriana. Por exemplo, em certas modalidades, a porção AMP de uma construção de polipeptídeo de AMP-lisina pode incluir um fragmento de peptídeo antimicrobiano mieloide porcino-36 (“PMAP-36”, SEQ ID NO: 136) que retém a atividade antibacteriana. PMAP-36 é um AMP relacionado à catelicidina deduzido de cDNA mieloide porcino com uma conformação α-helicoidal anfipática no N-terminal. Consequentemente, fragmentos de PMAP-36 adequados são tipicamente selecionados a partir do N-terminal para obter fragmentos que retêm a atividade antibacteriana. Em algumas modalidades, o fragmento PMAP-36 da presente invenção inclui o aminoácido hidrofóbico (Trp) na posição 23. Em outras modalidades, a bobina C- terminal aleatória é omitida do fragmento PMAP-36 para reduzir ou eliminar a hemólise que pode ser causada por PMAP-36. Outras características dos fragmentos de PMAP-36 são descritas, por exemplo, em Lyu et al., Scientific Reports, 2016, 6, páginas 1 a 12, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[00101] Particularmente fragmentos de PMAP-36 desejáveis incluem RI12 (SEQ ID NO: 88), RI18 (SEQ ID NO: 92) e TI15 (SEQ ID NO: 94). Outros fragmentos de AMP adequados incluem aqueles da Esculentina (Sequência de Referência NCBI: P40843.1), como o fragmento estabelecido na SEQ ID NO: 80 e isoforma 2 do fator antilipopolissacarídeo (Sequência de Referência NCBI: AFU61125.1), tal como o fragmento estabelecido na SEQ ID NO: 76.
[00102] Em algumas modalidades, os AMPs da presente invenção incluem peptídeos sintéticos. Em algumas modalidades, o peptídeo sintético reduz a concentração inibitória mínima (MIC) de um antibiótico, o que impede o crescimento visível da bactéria, mas não exibe atividade antibacteriana. Um peptídeo sintético particularmente desejável para uso com as construções de polipeptídeo de AMP-lisina da presente invenção inclui o peptídeomimético FIRL (SEQ ID NO:114). Sem estar limitado pela teoria, FIRL (SEQ ID NO: 114), que está relacionado a uma sequência de uma proteína envolvida na biogênese da proteína da membrana externa, BamD, parece aumentar a permeabilidade da membrana externa aos antibióticos. Mais informações sobre o mecanismo proposto podem ser encontradas, por exemplo, em Mori et al., Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2012,67:2173-2181, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[00103] Outros peptídeos sintéticos úteis para sensibilizar bactérias gram-negativas a antibióticos, que podem ser incorporados a uma construção de polipeptídeo de AMP-lisina da presente invenção inclui o peptídeo catiônico KFFKFFKFFK (SEQ ID NO: 120) descrito em Vaara e Porro, Antimicrobial agents and Chemotherapy, 1996, 1801 a 1805, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[00104] Em algumas modalidades, os peptídeos sintéticos são resistentes a sais e inativação de soro conforme descrito, por exemplo,
em Monhanram et al., Biopolymers, 2016,106: 345-346, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Sal particularmente desejável e peptídeos sintéticos resistentes ao soro incluem RR12Whidro (SEQ ID NO: 110) e derivado de peptídeo RI18 (SEQ ID NO: 133). Componentes de estabilização de estrutura
[00105] Em algumas modalidades, as construções de polipeptídeo de AMP-lisina da presente invenção incluem ainda pelo menos um componente estabilizador de estrutura para manter pelo menos uma porção da estrutura do primeiro e/ou segundo componente na construção, por exemplo, a lisina e/ou AMP, substancialmente o mesmo que na lisina não conjugada e/ou AMP. Em algumas modalidades, a estrutura de estabilização é um ligante. Normalmente, o referido pelo menos um componente de estabilização da estrutura, tal como um ligante, permite que a lisina e o AMP preservem substancialmente a estrutura tridimensional da primeira e/ou segunda moléculas de proteína, de modo que pelo menos uma atividade biológica da lisina e/ou AMP é retida.
[00106] Ligantes adequados para conectar dois polipeptídeos são conhecidos na técnica. Em certas modalidades, o ligante é um peptídeo, tal como um peptídeo compreendendo resíduos de glicina e serina. Ligantes adequados específicos incluem, mas não estão limitados a, um ligante TAGGTAGG (SEQ ID NO: 72), um ligante IGEM GGSGSGSGSGSP(BBa_K1485002) (SEQ ID NO: 82). GGGSGGGGSGGGS(BBA_K1486037), (SEQ ID NO: 86), ou um ligante como descrito em Briers et al., mBio, 2014, 5:e01379-14, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade, isto é, AGAGAGAGAGAGAGAGAS (SEQ ID NO: 122).
[00107] Em algumas modalidades, o componente estabilizador da estrutura é uma porção de peptídeo, por exemplo, uma porção de RPP ou PP. Essas porções de peptídeo podem ser incluídas nas presentes construções de polipeptídeo de AMP-lisina para auxiliar na manutenção da estrutura das porções de proteína lisina e/ou AMP. Por exemplo, o aminoácido RPP ou PP pode ser inserido no terminal C ou terminal N de um ligante, por exemplo, no terminal N do ligante BBA_K1486037 (RPPGGGSGGGGSGGGS resíduos 126 a 141 de SEQ ID NO: 12), no terminal N do ligante BBA_K1486037 (PPGGGSGGGGSGGGS, resíduos 144 a 158 de SEQ ID NO: 16), no terminal N do ligante TAGGTAGG (SEQ ID NO: 72), tal como representado nos resíduos 137 a 144 de SEQ ID NO: 18) ou no terminal C do ligante BBA_K1486037 (GGGSGGGGSGGGSPP, resíduos 135 a 149 de SEQ ID NO: 20).
[00108] Em outras modalidades, os peptídeos MIDR (SEQ ID NO: 112) e/ou NPTH (SEQ ID NO: 116) são incluídos na construção para auxiliar na manutenção da estrutura das porções de proteína lisina e/ou AMP. Por exemplo, em algumas modalidades uma estrutura AMP, como FIRL (SEQ ID NO: 114), é mantida pela adição de MIDR (SEQ ID NO: 112) e/ou NPTH (SEQ ID NO: 116) como retratado nos resíduos 1 a 12 de SEQ ID NO: 46 (MIDRFIRLNPTH) e resíduos 1 a 26 de SEQ ID NO:
44. Exemplos de construções de polipeptídeo de lisina-AMP
[00109] Em algumas modalidades, a construção de lisina-AMP compreende: (a) um primeiro componente compreendendo (i) pelo menos uma lisina selecionada do grupo que consiste em GN76 (SEQ ID NO: 203), GN4 (SEQ ID NO: 74), GN146 (SEQ ID NO: 78), GN14 (SEQ ID NO: 124), GN37 (SEQ ID NO: 84) opcionalmente com uma única mutação de aumento de pI, GN316 (SEQ ID NO: 22) opcionalmente com uma única mutação de ponto, lisina Pap2_gp17 (SEQ ID NO: 96), GN329 (SEQ ID NO: 26), GN424 (SEQ ID NO: 56), GN202 (SEQ ID NO: 118), GN425 (SEQ ID NO: 58), GN428 (SEQ ID NO: 60), GN431 (SEQ ID NO: 64), GN486 (SEQ ID NO: 66), GN333 (SEQ ID NO: 28), GN485
(SEQ ID NO: 68), GN123 (SEQ ID NO: 173) e GN121 (SEQ ID NO: 175) ou (ii) um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de polipeptídeo de qualquer de SEQ ID NOs: 203, 74, 78, 124, 84, 22, 96, 26, 56, 118, 58, 60, 64, 66, 28, 68, 173 ou 175; ou (iii) um fragmento ativo da lisina, dito fragmento incluindo mutações de ponto único e/ou mutações crescentes de pI único, se houver;(b) um segundo componente compreendendo (i) pelo menos um peptídeo antimicrobiano (AMP) selecionado do grupo que consiste em Chp1 (SEQ ID NO: 133), Chp2 (SEQ ID NO: 70), CPAR39 (SEQ ID NO: 135), Chp3 (SEQ ID NO: 137), Chp4 (SEQ ID NO: 102), Chp6 (SEQ ID NO: 106), Chp7 (SEQ ID NO: 139), Chp8 (SEQ ID NO: 141), Chp9 (SEQ ID NO: 143), Chp10 (SEQ ID NO: 145), Chp11 (SEQ ID NO: 147), Chp12 (SEQ ID NO: 149), Gkh1 (SEQ ID NO: 151), Gkh2 (SEQ ID NO: 90), Unp1 (SEQ ID NO: 153), Ecp1 (SEQ ID NO: 155), Ecp2 (SEQ ID NO: 104), Tma1 (SEQ ID NO: 157), Osp1 (SEQ ID NO: 108), Unp2 (SEQ ID NO: 159), Unp3 (SEQ ID NO: 161), Gkh3 (SEQ ID NO: 163), Unp5 (SEQ ID NO: 165), Unp6 (SEQ ID NO: 167), Spi1 (SEQ ID NO: 169), Spi2 (SEQ ID NO: 171), Ecp3 (SEQ ID NO: 177), Ecp4 (SEQ ID NO: 179), ALCES1 (SEQ ID NO: 181), AVQ206 (SEQ ID NO: 183), AVQ244 (SEQ ID NO: 185), CDL907 (SEQ ID NO: 187), AGT915 (SEQ ID NO: 189), HH3930 (SEQ ID NO: 191), Fen7875 (SEQ ID NO: 193), SBR77 (SEQ ID NO: 195), Bdp1 (SEQ ID NO: 197), LVP1 (SEQ ID NO: 199), Lvp2 (SEQ ID NO: 201), um fragmento de esculentina (SEQ ID NO: 80), RI12 (SEQ ID NO: 88), TI15 (SEQ ID NO: 94), RI18 (SEQ ID NO: 92), FIRL (SEQ ID NO: 114), um fragmento de proteína de ligação a LPS (SEQ ID NO: 76), RR12whidro (SEQ ID NO: 110), derivado de peptídeo RI18 (SEQ ID NO: 131) e peptídeo catiônico (SEQ ID NO: 120) ou (ii) um polipeptídeo tendo atividade de AMP, em que o polipeptídeo é pelo menos 80% idêntico a pelo menos uma de SEQ ID NOS: 133, 70, 135, 137, 102, 106, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 90, 153, 155, 104, 157, 108, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 80, 88, 94, 92, 114, 76, 110, 131 e 120.
[00110] Normalmente, qualquer uma das variantes de AMP que compartilhe pelo menos 80% de identidade ou mais com o AMP descrito ou seus fragmentos retêm sua estrutura alfa-helicoidal e quaisquer resíduos associados à atividade. Por exemplo, como observado acima, os fragmentos de PMAP-36 (SEQ ID NO: 136) normalmente retêm o aminoácido hidrofóbico (Trp) na posição 23.
[00111] Em algumas modalidades, GN37 (SEQ ID NO: 84) compreende uma única mutação de crescimento de PI, em que o GN37 (SEQ ID NO: 84) com a única mutação de aumento de PI é GN217 (SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, GN316 (SEQ ID NO: 22) compreende uma única mutação de ponto, em que o GN37 (SEQ ID NO: 84) com a única mutação de ponto é GN396 (SEQ ID NO: 50), GN408 (SEQ ID NO: 52), GN418 (SEQ ID NO: 54) e/ou GN394 (SEQ ID NO: 48).
[00112] Em algumas modalidades, a construção também compreende pelo menos um componente de estabilização da estrutura. Em algumas modalidades, o referido pelo menos um componente de estabilização da estrutura é um ligante de peptídeo, tal como um peptídeo compreendendo resíduos de glicina e serina. Em certas modalidades, o ligante de peptídeo é selecionado do grupo que consiste em TAGGTAGG (SEQ ID NO: 72), IGEM (BBa_K1485002) (SEQ ID NO: 82), PPTAGGTAGG (SEQ ID NO: 98), IGEM +PP (resíduos 44-58 de SEQ ID NO: 16) e AGAGAGAGAGAGAGAGAS (SEQ ID NO: 122).
[00113] Em algumas modalidades, a construção de polipeptídeo de
AMP-lisina é selecionada de pelo menos uma de lisina GN168 (SEQ ID NO: 2), lisina GN176 (SEQ ID NO: 4), lisina GN178 (SEQ ID NO: 6), lisina GN218 (SEQ ID NO: 10), lisina GN223 (SEQ ID NO: 12), lisina GN239 (SEQ ID NO: 14), lisina GN243 (SEQ ID NO: 16), lisina GN280 (SEQ ID NO: 18), lisina GN281 (SEQ ID NO: 20), lisina GN349 (SEQ ID NO: 30), lisina GN351 (SEQ ID NO: 32), lisina GN352 (SEQ ID NO: 34), lisina GN353 (SEQ ID NO: 36), lisina GN357 (SEQ ID NO: 38), lisina GN359 (SEQ ID NO: 40), lisina GN369 (SEQ ID NO: 42), lisina GN370 (SEQ ID NO: 44), lisina GN371 (SEQ ID NO: 46) ou lisina GN93 (SEQ ID NO: 62) ou um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de polipeptídeo de pelo menos uma de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, ou 62.
[00114] Mais particularmente, em algumas modalidades, a construção do polipeptídeo de AMP-lisina compreende um polipeptídeo de amurina Chp2 (SEQ ID NO: 70) e um ligante TAGGTAGG (SEQ ID NO: 72) introduzido N-terminalmente na lisina GN4 (SEQ ID NO: 74) para gerar a lisina GN168 (SEQ ID NÃO: 2) ou um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2.
[00115] Em algumas modalidades, a construção de polipeptídeo de AMP-lisina codificada compreende um fragmento de proteína de ligação a LPS (SEQ ID NO: 76) e um ligante TAGGTAGG (SEQ ID NO: 72) introduzido N-terminalmente na lisina GN146 (SEQ ID NO: 78) para gerar a lisina GN176 (SEQ ID NO: 4) ou um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 4.
[00116] Em algumas modalidades, a construção de polipeptídeo de AMP-lisina compreende um fragmento de esculentina (SEQ ID NO: 80) e um ligante IGEM (SEQ ID NO: 82) introduzido N-terminalmente na lisina GN146 (SEQ ID NO: 78) para gerar a lisina GN178 (SEQ ID NO: 6) ou um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 6.
[00117] Em algumas modalidades, a construção de polipeptídeo de AMP-lisina codificada compreende um ligante IGEM (SEQ ID NO: 86) e um peptídeo antimicrobiano RI12 (SEQ ID NO: 88) introduzido C- terminalmente na lisina GN37 (SEQ ID NO: 84) para gerar a lisina GN218 (SEQ ID NO: 10) ou um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 10.
[00118] Em algumas modalidades, a construção de polipeptídeo de AMP-lisina compreende uma porção RPP, um ligante IGEM (SEQ ID NO: 86), e o peptídeo de amurina antimicrobiano Gkh2 (SEQ ID NO: 90) introduzido C-terminalmente na lisina GN37 (SEQ ID NO: 84) para gerar a lisina GN223 (SEQ ID NO: 12) ou um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98% ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO:
12.
[00119] Em algumas modalidades, a construção de polipeptídeo de AMP-lisina compreende um ligante IGEM (SEQ ID NO: 86) e um peptídeo RI18 (SEQ ID NO: 92) introduzido C-terminalmente na lisina GN37 (SEQ ID NO: 84) para gerar a lisina GN239 (SEQ ID NO: 14) ou um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 14.
[00120] Em algumas modalidades, a construção de polipeptídeo de AMP-lisina compreende uma porção de aminoácido PP, um ligante IGEM (SEQ ID NO: 86) e um peptídeo TI15 (SEQ ID NO: 94), introduzidos C-terminalmente na lisina GN37 (SEQ ID NO: 84) para gerar a lisina GN243 (SEQ ID NO: 16) ou um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 16.
[00121] Em algumas modalidades, a construção de polipeptídeo de AMP-lisina compreende um peptídeo antimicrobiano RI18 (SEQ ID NO: 92), um ligante com a sequência de aminoácidos PPTAGGTAGG (SEQ ID NO: 98) e um peptídeo antimicrobiano TI15 (SEQ ID NO: 94) introduzido C-terminalmente em uma lisina PaP2_gp17 (SEQ ID NO: 96) para gerar a lisina GN280 (SEQ ID NO: 18) ou um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 18.
[00122] Em algumas modalidades, a construção de polipeptídeo de AMP-lisina compreende um peptídeo RI18 (SEQ ID NO: 92), um ligante IGEM (SEQ ID NO: 86), uma fração de aminoácido PP (adicionado para manter a estrutura da lisina e/ou do AMP) e um peptídeo TI15 (SEQ ID NO : 94) introduzido C terminalmente para uma lisina PaP2_gp17 (SEQ
ID NO: 96) para gerar lisina GN281 (SEQ ID NO: 20) ou um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 20.
[00123] Em algumas modalidades, a construção de polipeptídeo de AMP-lisina compreende um ligante possuindo a sequência de aminoácidos TAGGTAGG (SEQ ID NO: 72), e um peptídeo amurina Chp4 (SEQ ID NO: 102) introduzido C-terminalmente na lisina GN316 (SEQ ID NO: 22) para gerar a lisina GN349 (SEQ ID NO: 30) ou um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 30.
[00124] Em algumas modalidades, a construção de polipeptídeo de AMP-lisina compreende um ligante com a sequência de aminoácidos TAGGTAGG (SEQ ID NO: 72), e um peptídeo amurina Ecp2 (SEQ ID NO: 104), introduzido C-terminalmente na lisina GN316 (SEQ ID NO: 22) para gerar a lisina GN351 (SEQ ID NO: 32) ou um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 32.
[00125] Em algumas modalidades, a construção de polipeptídeo de AMP-lisina compreende um ligante tendo a sequência de aminoácidos TAGGTAGG (SEQ ID NO: 72) e um peptídeo de amurina Chp7 (SEQ ID NO: 139) introduzido no C-terminalmente na lisina GN316 (SEQ ID NO: 22) para gerar a lisina GN352 (SEQ ID NO: 34) ou um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 34.
[00126] Em algumas modalidades, a construção de polipeptídeo de AMP-lisina compreende um ligante tendo a sequência de aminoácidos TAGGTAGG (SEQ ID NO: 72) e um peptídeo de amurina Osp1 (SEQ ID NO: 108), introduzidos C-terminalmente na lisina GN316 (SEQ ID NO: 22) para gerar a lisina GN353 (SEQ ID NO: 36) ou um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 36.
[00127] Em algumas modalidades, a construção de polipeptídeo de AMP-lisina compreende um ligante tendo a sequência de aminoácidos TAGGTAGG (SEQ ID NO: 72) e um RR12Whidro (SEQ ID NO: 110) introduzidos C-terminalmente na lisina GN316(SEQ ID NO: 22) para gerar a lisina GN357 (SEQ ID NO: 38) ou um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 38.
[00128] Em algumas modalidades, a construção de polipeptídeo de AMP-lisina compreende um ligante tendo a sequência de aminoácidos TAGGTAGG (SEQ ID NO: 72) e um derivado de peptídeo TI15 de PMAP-36 (SEQ ID NO: 94), introduzidos C-terminalmente na lisina GN316 (SEQ ID NO: 22) para gerara lisina GN359 (SEQ ID NO: 40) ou um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 40.
[00129] Em algumas modalidades, a construção de polipeptídeo de
AMP-lisina compreende RR18 (SEQ ID NO: 92), introduzido C- terminalmente na lisina GN316 (SEQ ID NO: 22) para gerar a lisina GN369 (SEQ ID NO: 42) ou um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 42.
[00130] Em algumas modalidades, a construção de polipeptídeo de AMP-lisina compreende uma fração MIDR (SEQ ID NO: 112), uma fração FIRL (SEQ ID NO: 114) e uma fração NPTH (SEQ ID NO: 116) introduzida N-terminalmente na lisina GN202 (SEQ ID NO: 118) para gerar o GN370 lisina (SEQ ID NO: 44) ou um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 44.
[00131] Em algumas modalidades, a construção de polipeptídeo de AMP-lisina compreende uma fração MIDR (SEQ ID NO: 112), FIRL (SEQ ID NO: 114) e uma fração NPTH (SEQ ID NO: 116) introduzida C- terminalmente na lisina GN146 (SEQ ID NO: 78) para gerar a lisina GN371(SEQ ID NO: 46) ou um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 46.
[00132] Em algumas modalidades, a construção de polipeptídeo de AMP-lisina compreende a peptídeo catiônico (SEQ ID NO: 120) e um domínio de ligação (SEQ ID NO: 122) introduzido N-terminalmente na lisina GN14 (SEQ ID NO: 124) para gerar a lisina GN93 (SEQ ID NO: 62) ou um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos
99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 62.
[00133] A Tabela 1, abaixo, descreve exemplos específicos das lisinas e construções de lisina-AMP aqui descritas. A porção AMP da construção está sublinhada duas vezes para GN168 (SEQ ID NO: 2), GN176 (SEQ ID NO: 4), GN178 (SEQ ID NO: 6), GN370 (SEQ ID NO: 44), GN371 (SEQ ID NO: 46) e GN93 (SEQ ID NO: 62). Para todas as outras construções, os sublinhados duplos correspondem a uma lisina. Os componentes de estabilização da estrutura, como ligantes, estão em itálico. O marcador de purificação para GN486 (SEQ ID NO: 66) está em itálico e em negrito. Mutações de ponto único estão em negrito. Tabela 1 GN # Sequência de Polipeptídeo GN168 MRLKMARRRYRLPRRRSRRLFSRTALRMHPRNRLRRIMR
GGIRFTAGGTAGGRTSQRGIDLIKSFEGLRLSAYQDSVGV WTIGYGTTRGVTRYMTITVEQAERMLSNDIQRFEPELDRL AKVPLNQNQWDALMSFVYNLGAANLASSTLLDLLNKGDY
QGAADQFPHWVNAGGKRLDGLVKRRAAERALFLEPLS (SEQ ID NO: 2) GN176 MSFNVTPKFKRWQLYFRGRMWTAGGTAGGRTSQRGIDL
IKSFEGLRLSAYQDSVGVWTIGYGTTRGVTRYMTITVEQA ERMLSNDIQRFEPELDRLAKVPLNQNQWDALMSFVYNLG
AANLASSTLLDLLNKGDYQGAADQFPHWVNAGGKRLDGL VKRRAAERALFLEPLS (SEQ ID NO: 4) GN178 MPPIFSKLAGKKIKNLLISGLKGGSGSGSGSGSPRTSQRGI
DLIKSFEGLRLSAYQDSVGVWTIGYGTTRGVTRYMTITVE QAERMLSNDIQRFEPELDRLAKVPLNQNQWDALMSFVYN
LGAANLASSTLLDLLNKGDYQGAADQFPHWVNAGGKRLD GLVKRRAAERALFLEPLS (SEQ ID NO: 6)
GN # Sequência de Polipeptídeo GN217 MTYTLSKRSLDNLKGVHPDLVAVVHRAIQLTPVDFAVIEGL
RSVSRQKELVAAGASKTMNSRHLTGHAVDLAAYVNGIHW
DWPLYDAIAVAVKAAAKELGVAIVWGGDWTTFKDGPHFE LDRSKYR (SEQ ID NO: 8) GN218 MTYTLSKRSLDNLKGVHPDLVAVVHRAIQLTPVDFAVIEGL
RSVSRQKELVAAGASKTMNSRHLTGHAVDLAAYVNGIRW
DWPLYDAIAVAVKAAAKELGVAIVWGGDWTTFKDGPHFE LDRSKYGGGSGGGGSGGGSRLKKIGKVLKWI (SEQ ID NO: 10) GN223 MTYTLSKRSLDNLKGVHPDLVAVVHRAIQLTPVDFAVIEGL
RSVSRQKELVAAGASKTMNSRHLTGHAVDLAAYVNGIRW DWPLYDAIAVAVKAAAKELGVAIVWGGDWTTFKDGPHFE
LDRSKYRPPGGGSGGGGSGGGSSKKASRKSFTKGAVKV HKKNVPTRVPMRGGIRL (SEQ ID NO: 12) GN239 MTYTLSKRSLDNLKGVHPDLVAVVHRAIQLTPVDFAVIEGL
RSVSRQKELVAAGASKTMNSRHLTGHAVDLAAYVNGIRW DWPLYDAIAVAVKAAAKELGVAIVWGGDWTTFKDGPHFE
LDRSKYGGGSGGGGSGGGSRKKTRKRLKKIGKVLKWI (SEQ ID NO: 14) GN243 MTYTLSKRSLDNLKGVHPDLVAVVHRAIQLTPVDFAVIEGL
RSVSRQKELVAAGASKTMNSRHLTGHAVDLAAYVNGIRW DWPLYDAIAVAVKAAAKELGVAIVWGGDWTTFKDGPHFE
LDRSKYRKKTRKRLKKIGKVLKWIPPGGGSGGGGSGGGS TRKRLKKIGKVLKWI (SEQ ID NO: 16) GN280 MKLSEKRALFTQLLAQLILWAGTQDRVSVALDQVKRTQAE
ADANAKSGAGIRNSLHLLGLAGDLILYKDGKYMDKSEDYK FLGDYWKSLHPLCRWGGDFKSRPDGNHFSLEHEGVQRK
KTRKRLKKIGKVLKWIPPTAGGTAGGTRKRLKKIGKVLKWI (SEQ ID NO: 18)
GN # Sequência de Polipeptídeo GN281 MKLSEKRALFTQLLAQLILWAGTQDRVSVALDQVKRTQAE
ADANAKSGAGIRNSLHLLGLAGDLILYKDGKYMDKSEDYK FLGDYWKSLHPLCRWGGDFKSRPDGNHFSLEHEGVQRK
KTRKRLKKIGKVLKWIGGGSGGGGSGGGSPPTRKRLKKI GKVLKWI (SEQ ID NO: 20) GN316 MAILKIGSKGLEVKNLQTSLNKIGFNLVADGIFGKATDNAV
RAVQAGAGLVVDGIAGPKTMYAIRNAGESHQDHLTEADLI DAARELSVDLASIKAVNQVESRGTGFTKSGKIKTLFERHIM YKKLNAKFGQAKANALAQLYPTLVNAKAGGYTGGDAELE RLHGAIAIDKDCAYESASYGLFQIMGFNCVICGYDNAEEM
FNDFLTGERAQLMAFVKFIKADANLWKALKDKNWAEFAR RYNGPAYAQNQYDTKLAAAYKSFS(SEQ ID NO: 22) GN329 MITDREYQQAAEMLGVDVPAIKAVTKVEAPVGGFQPTGE
PTILYERHQMYRQLQAKGLPTEGHPPDLVNKVAGGYGKY SEQHAKLARAVKIDRDSALESCSWGMFQIMGYHWKLMG
YPTLQAFVNAMYASEGAQMDAFCRFIKAQPTTHAALKAH DWAKFARLYNGPGYAKNKYDVKLEKAYAEASG (SEQ ID NO: 26) GN333 MALTEQDFQSAADDLGVDVASVKAVTKVESRGSGFLLSG
VPKILFERHWMFKLLKRKLGRDPEINDVCNPKAGGYLGG QAEHERLDKAVKMDRDCALQSASWGLFQIMGFHWEALG
YASVQAFVNAQYASEGSQLNTFVRFIKTNPAIHKALKSKD WAEFARRYNGPDYKKNNYDVKLAEAYQSFK (SEQ ID NO: 28)
GN # Sequência de Polipeptídeo GN349 MAILKIGSKGLEVKNLQTSLNKIGFNLVADGIFGKATDNAV
RAVQAGAGLVVDGIAGPKTMYAIRNAGESHQDHLTEADLI DAARELSVDLASIKAVNQVESRGTGFTKSGKIKTLFERHIM YKKLNAKFGQAKANALAQLYPTLVNAKAGGYTGGDAELE RLHGAIAIDKDCAYESASYGLFQIMGFNCVICGYDNAEEM FNDFLTGERAQLMAFVKFIKADANLWKALKDKNWAEFAR
RYNGPAYAQNQYDTKLAAAYKSFSTAGGTAGGARRYRL SRRRSRRLFSRTALRMHRRNRLRRIMRGGIRF (SEQ ID NO: 30) GN351 MAILKIGSKGLEVKNLQTSLNKIGFNLVADGIFGKATDNAV
RAVQAGAGLVVDGIAGPKTMYAIRNAGESHQDHLTEADLI DAARELSVDLASIKAVNQVESRGTGFTKSGKIKTLFERHIM YKKLNAKFGQAKANALAQLYPTLVNAKAGGYTGGDAELE RLHGAIAIDKDCAYESASYGLFQIMGFNCVICGYDNAEEM FNDFLTGERAQLMAFVKFIKADANLWKALKDKNWAEFAR
RYNGPAYAQNQYDTKLAAAYKSFSTAGGTAGGARSRRR MSKRSSRRSFRKYAKSHKKNFKARSMRGGIRL (SEQ ID NO:32 ) GN352 MAILKIGSKGLEVKNLQTSLNKIGFNLVADGIFGKATDNAV
RAVQAGAGLVVDGIAGPKTMYAIRNAGESHQDHLTEADLI DAARELSVDLASIKAVNQVESRGTGFTKSGKIKTLFERHIM YKKLNAKFGQAKANALAQLYPTLVNAKAGGYTGGDAELE RLHGAIAIDKDCAYESASYGLFQIMGFNCVICGYDNAEEM FNDFLTGERAQLMAFVKFIKADANLWKALKDKNWAEFAR
RYNGPAYAQNQYDTKLAAAYKSFSTAGGTAGGKRRKMT RKGSKRLFTATADKTKSINTAPPPMRGGIRL (SEQ ID NO: 34)
GN # Sequência de Polipeptídeo GN353 MAILKIGSKGLEVKNLQTSLNKIGFNLVADGIFGKATDNAV
RAVQAGAGLVVDGIAGPKTMYAIRNAGESHQDHLTEADLI DAARELSVDLASIKAVNQVESRGTGFTKSGKIKTLFERHIM YKKLNAKFGQAKANALAQLYPTLVNAKAGGYTGGDAELE RLHGAIAIDKDCAYESASYGLFQIMGFNCVICGYDNAEEM FNDFLTGERAQLMAFVKFIKADANLWKALKDKNWAEFAR
RYNGPAYAQNQYDTKLAAAYKSFSTAGGTAGGRKRMSK RVDKKVFRRTAASAKKINIDPKIYRGGIRL (SEQ ID NO: 36) GN357 MAILKIGSKGLEVKNLQTSLNKIGFNLVADGIFGKATDNAV
RAVQAGAGLVVDGIAGPKTMYAIRNAGESHQDHLTEADLI DAARELSVDLASIKAVNQVESRGTGFTKSGKIKTLFERHIM YKKLNAKFGQAKANALAQLYPTLVNAKAGGYTGGDAELE RLHGAIAIDKDCAYESASYGLFQIMGFNCVICGYDNAEEM FNDFLTGERAQLMAFVKFIKADANLWKALKDKNWAEFAR
RYNGPAYAQNQYDTKLAAAYKSFSTAGGTAGGRRLIRLW LRLLR (SEQ ID NO: 38) GN359 MAILKIGSKGLEVKNLQTSLNKIGFNLVADGIFGKATDNAV
RAVQAGAGLVVDGIAGPKTMYAIRNAGESHQDHLTEADLI DAARELSVDLASIKAVNQVESRGTGFTKSGKIKTLFERHIM YKKLNAKFGQAKANALAQLYPTLVNAKAGGYTGGDAELE RLHGAIAIDKDCAYESASYGLFQIMGFNCVICGYDNAEEM FNDFLTGERAQLMAFVKFIKADANLWKALKDKNWAEFAR
RYNGPAYAQNQYDTKLAAAYKSFSTAGGTAGGTRKRLKK IGKVLKWI (SEQ ID NO: 40)
GN # Sequência de Polipeptídeo GN369 MAILKIGSKGLEVKNLQTSLNKIGFNLVADGIFGKATDNAV
RAVQAGAGLVVDGIAGPKTMYAIRNAGESHQDHLTEADLI DAARELSVDLASIKAVNQVESRGTGFTKSGKIKTLFERHIM YKKLNAKFGQAKANALAQLYPTLVNAKAGGYTGGDAELE RLHGAIAIDKDCAYESASYGLFQIMGFNCVICGYDNAEEM FNDFLTGERAQLMAFVKFIKADANLWKALKDKNWAEFAR
RYNGPAYAQNQYDTKLAAAYKSFSRKKTRKRLKKIGKVLK WI(SEQ ID NO: 42) GN370 MIDRFIRLNPTHGPRRPRRPGRRAPVRTSQRGIDLIKSFE
GLRLSAYQDSVGVWTIGYGTTRGVTRYMTITVEQAERML SNDIQRFEPELDRLAKVPLNQNQWDALMSFVYNLGAANL
ASSTLLDLLNKGDYQGAADQFPHWVNAGGKRLDGLVKR RAAERALFLEPLS(SEQ ID NO: 44) GN371 MIDRFIRLNPTHRTSQRGIDLIKSFEGLRLSAYQDSVGVWT
IGYGTTRGVTRYMTITVEQAERMLSNDIQRFEPELDRLAK
VPLNQNQWDALMSFVYNLGAANLASSTLLDLLNKGDYQG AADQFPHWVNAGGKRLDGLVKRRAAERALFLEPLS(SEQ ID NO: 46 ) GN394 MAILKIGSKGLEVKNLQTSLNKIGFNLVADGIFGKATDNAV
RAVQAGAGLVVDGIAGPKTMYAIRNAGESHQDHLTEADLI DAARELSVDLASIKAVNQVESRGTGFTKSGKIKTLFERHIM YKKLNAKFGQAKANALAQLYPTLVNAKAGGYTGGDAELE RLHGAIAIDKDCAYESASYGLFQIMGFNCVICGYDNAEEM
FNDFLTGERAQLMAFVDFIKADANLWKALKDKNWAEFAR RYNGPAYAQNQYDTKLAAAYKSFS (SEQ ID NO: 48)
GN # Sequência de Polipeptídeo GN396 MAILKIGSKGLEVKNLQTSLNKIGFNLVADGIFGKATDNAV
RAVQAGAGLVVDGIAGPKTMYAIRNAGESHQDHLTEADLI DAARELSVDLASIKAVNQVESRGTGFTKSGKIKTLFERHIM YKKLNAKFGQAKANALAQLYPTLVNAKAGGYTGGDAELE RLHGAIAIDKDCAYESASYGLFQIMGFNCVICGYDNAEEM
FNDFLTGERAQLMAFVKFIKADANLWDALKDKNWAEFAR RYNGPAYAQNQYDTKLAAAYKSFS (SEQ ID NO: 50) GN408 MAILKIGSKGLEVKNLQTSLNKIGFNLVADGIFGKATDNAV
RAVQAGAGLVVDGIAGPKTMYAIRNAGESHQDHLTEADLI DAAHELSVDLASIKAVNQVESRGTGFTKSGKIKTLFERHIM YKKLNAKFGQAKANALAQLYPTLVNAKAGGYTGGDAELE RLHGAIAIDKDCAYESASYGLFQIMGFNCVICGYDNAEEM
FNDFLTGERAQLMAFVKFIKADANLWKALKDKNWAEFAR RYNGPAYAQNQYDTKLAAAYKSFS(SEQ ID NO: 52 ) GN418 MAILKIGSKGLEVKNLQTSLNDIGFNLVADGIFGKATDNAV
RAVQAGAGLVVDGIAGPKTMYAIRNAGESHQDHLTEADLI DAARELSVDLASIKAVNQVESRGTGFTKSGKIKTLFERHIM YKKLNAKFGQAKANALAQLYPTLVNAKAGGYTGGDAELE RLHGAIAIDKDCAYESASYGLFQIMGFNCVICGYDNAEEM
FNDFLTGERAQLMAFVKFIKADANLWKALKDKNWAEFAR RYNGPAYAQNQYDTKLAAAYKSFS (SEQ ID NO: 54 ) GN424 MNTLRFNSRGAEVGVLQQRLVRAGYPIDVTHLYDEATEQ
AVKALQAAAGIVVDGIAGPNTYAVLSAGQRDRKHLTEADI ARAADKLGVSPACVRAVNEVESRGSGFLADGRPVILFER HVMYNRLVAAKRAVDAASAAQRFPNVVSAKPGGYQGGA AEYVRLDTAARIDAAIAYESASWGAFQVMGYHWERLGYS
SIDEFVARMETSEGEQLDAFVRFVAADSSLRTALKNRKW AAFAKGYNGPDYARNLYDAKLAQAYERYAGTKAAA (SEQ ID NO: 56 )
GN # Sequência de Polipeptídeo GN425 MTLRLDDVGLDVLHLQKRLNELGANPRLLPDGQFGEVTE
RAVRAFQQRAGLVVDGVAGPKTMAALSGHSTSRLLGQR DLQRAADRLGVPLASVMALNAVESRGEGFAANGRPVILF ERHVMHERLQVNGLSEAEADALAARHPGLVSRRPGGYV GDTAEHQRLANARLLHDTAALESASWGLFQVMGYHWQA LGYDTTQDFTERMARHEAEHLEAFVRFIEADPALHKALKG
RKWAEFARRYNGPAYARNLYDVKLARAFEQFSDALQAAA (SEQ ID NO: 58 ) GN428 MAILKLGNRGSEVKALQQSLNKIGFSLTADGIFGKATENAV
KSVQAGAGLVIDGIAGPKTFYAIRNAGDAHQEHLTEADLV DAARELGVELASMKAVNQVESRGTGFTKTGKIKTLFERHI MYKKVTAKFGQARANALYQLYPTLVNPNSGGYIGGDAEL ERLQGAIALDEDCAYESASYGLFQIMGFNCQICGYSNAKE
MFTDFLTGERAHLLAFVKFIKADANMWKALKNKNWAEFA RRYNGPAYAKNQYDTKLAAAYKSFC (SEQ ID NO: 60) GN93 MKFFKFFKFFKAGAGAGAGAGAGAGAGASNNELPWVAE
ARKYIGLREDTSKTSHNPKLLAMLDRMGEFSNESRAWWH DDETPWCGLFVGYCLGVAGRYVVREWYRARAWEAPQLT KLDRPAYGALVTFTRSGGGHVGFIVGKDARGNLMVLGGN
QSNAVSIAPFAVSRVTGYFWPSFWRNKTAVKSVPFEERY SLPLLKSNGELSTNEA(SEQ ID NO: 62 ) GN431 MAILKLGNRGTEVKALQDSLNKIGFTLVADGIFGKATENAV
KTVQAGAGLVIDGIVGPKTSYAIRNAGEAHQDHLTEADLIE AANQLGVDLASVKAVNQVESRGTGFTKSGKIKTLFERHIM YKKLMAKFGQARANAMGQMYPTLVSPVAGGYTGGDAEL DRLHAAINIDEDCAYESASYGLFQIMGFNCQVCGYANAKE
MFNDFLTGERAHLMAFVKFIKADAKLWQALKDKNWAEFA RRYNGPAYTKNQYDTKLAAAYNSFN (SEQ ID NO: 64 )
GN # Sequência de Polipeptídeo GN486 MGSHHHHHHGGPRRPRRPGRRAPVRTSQRGIDLIKSFE
GLRLSAYQDSVGVWTIGYGTTRGVTRYMTITVEQAERML SNDIQRFEPELDRLAKVPLNQNQWDALMSFVYNLGAANL
ASSTLLKLLNKGDYQGAADQFPRWVNAGGKRLDGLVKR RAAERALFLEPLS (SEQ ID NO:66 )
MPGLSGFIRNADTPVTSLGSAGHVHVPEGPLIRINPDCLL GN485 GTPFKFFKFFKFFKFFKFFKFFKFFKNECVLL (SEQ IDNO: 68)
[00134] Em algumas modalidades, as construções de lisinas e/ou polipeptídeo de lisina-AMP da presente invenção são modificados quimicamente. Uma modificação química inclui, mas não está limitada a, adição de frações químicas, criação de novas ligações e remoção de frações químicas. As modificações químicas podem ocorrer em qualquer lugar em uma construção de lisina e/ou polipeptídeo de lisina- AMP, incluindo as cadeias laterais de aminoácido, bem como os terminais amino ou carboxila. Por exemplo, em certas modalidades, a construção de lisina ou polipeptídeo de AMP-lisina compreende uma modificação de acetilação N-terminal. Em certas modalidades, a construção de lisina ou polipeptídeo de AMP-lisina compreende uma modificação de amidação C-terminal. Tal modificação pode estar presente em mais de um sítio em uma construção de lisina e/ou polipeptídeo de lisina-AMP.
[00135] Além disso, um ou mais grupos laterais, ou grupos terminais de uma construção de lisina e/ou polipeptídeo de lisina-AMP podem ser protegidos por grupos de proteção conhecidos por aqueles versados na técnica.
[00136] Em algumas modalidades, as lisinas e/ou construções de polipeptídeo de AMP-lisina são conjugados com uma porção de realce da duração. Em algumas modalidades, a porção de realce da duração é polietilenoglicol. O polietilenoglicol ("PEG") foi usado para obter polipeptídeos terapêuticos de duração aumentada (Zalipsky, S., Bioconjugate Chemistry, 6:150-165 (1995); Mehvar, R., J.Pharm. Pharmaceut. Sci., 3:125-136 (2000), que é aqui incorporado por referência em sua totalidade). A cadeia principal de PEG, (CH2CH2-0- )n, em que n é um numero de monômeros repetidos, é flexível e anfifílico. Quando fixadas a outra entidade química, como uma construção de lisina e/ou polipeptídeo de lisina-AMP, as cadeias poliméricas de PEG podem proteger tais polipeptídeos da resposta imune e outros mecanismos de depuração. Como resultado, a peguilação pode levar a uma maior eficácia e segurança, otimizando a farmacocinética, aumentando a biodisponibilidade e diminuindo a imunogenicidade e a quantidade de dosagem e/ou frequência.
POLINUCLEOTÍDEOS
[00137] Em um aspecto, a presente invenção é direcionada a um polinucleotídeo isolado compreendendo uma molécula de ácido nucleico que codifica uma lisina, uma lisina variante, um fragmento ativo desta ou derivado como aqui descrito. Em algumas modalidades, a sequência polinucleotídica isolada é uma sequência de DNA. Em outras modalidades, o polinucleotídeo isolado é uma sequência de cDNA.
[00138] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência com uma lisina, uma lisina variante, um fragmento ativo desta ou derivado como aqui descrito, em que o polipeptídeo codificado inibe o crescimento, ou reduz a população, ou mata P. aeruginosa e opcionalmente pelo menos uma outra espécie de bactéria Gram-negativa, conforme descrito aqui, na ausência ou presença de, ou na ausência e presença de, soro humano.
[00139] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende uma molécula de ácido nucleico codificando a lisina selecionada de GN217 (SEQ ID NO: 8), GN316 variante (SEQ ID NO: 24)GN316 (SEQ ID NO: 22), GN329 (SEQ ID NO: 26), GN333 (SEQ ID NO: 28), GN394 (SEQ ID NO: 48), GN396 (SEQ ID NO: 50 ), GN408 (SEQ ID NO: 52), GN418 (SEQ ID NO: 54), GN424 (SEQ ID NO: 56), GN425 (SEQ ID NO:58), GN428 (SEQ ID NO: 60), GN431 (SEQ ID NO: 64), GN486 (SEQ ID NO: 66), GN485 (SEQ ID NO: 68), lisina PaP2_gp17 (SEQ ID NO: 96),GN123 (SEQ ID NO: 173) ou GN121 (SEQ ID NO: 175) ou uma variante ou um fragmento ativo do mesmo ou derivado, em que a variante lisina ou um fragmento ativo do mesmo ou derivado codificado pelo polinucleotídeo isolado inibe o crescimento, ou reduz a população, ou mata P. aeruginosa e opcionalmente pelo menos uma outra espécie de Bactérias gram-negativas na ausência ou presença de, ou na ausência e presença de, soro humano. Em certas modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende uma molécula de ácido nucleico codificando uma lisina, variante ou fragmento ativo do mesmo ou derivado que contém pelo menos uma modificação em relação a pelo menos uma de SEQ ID NOS: 8, 24, 22, 26, 28, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 64, 66, 68, 96, 173 e 175 tal como pelo menos uma substituição, inserção ou deleção de aminoácido. Em certas modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende uma sequência de acido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 7, 23, 21, 25, 27, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 63, 65, 67 95, 172 e 174 respectivamente, seus complementos ou uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para uma de SEQ ID NOS: 7, 23, 21, 25, 27, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 63, 65, 67 95,
172 e 174, ou seus complementos, em que o polipeptídeo codificado inibe o crescimento, ou reduz a população, ou mata P. aeruginosa e opcionalmente pelo menos uma outra espécie de bactéria Gram- negativa na ausência ou presença de, ou na ausência e presença de, soro humano.
[00140] Em algumas modalidades, o polincleotídeo isolado compreende uma molécula de ácido nucleico codificando a lisina seleciona de pelo menos uma de lisina GN217 (SEQ ID NO: 8), lisina GN394 (SEQ ID NO: 48), lisina GN396 (SEQ ID NO: 50), lisina GN408 (SEQ ID NO: 52), lisina GN418 (SEQ ID NO: 54) e GN486 (SEQ ID NO: 66) ou uma variante ou um fragmento ativo ou derivado desta. Em certas modalidades, o polinucleotídeo compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 7, 47, 49, 51, 53, e 65 ou seus complementos ou uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para uma de SEQ ID NOS: 77, 47, 49, 51, 53, ou 65, ou seus complementos, em que o polipeptídeo codificado inibe o crescimento, ou reduz a população, ou mata P. aeruginosa e opcionalmente pelo menos uma outra espécie de bactéria Gram-negativa na ausência ou presença de, ou na ausência e presença de, soro humano.
[00141] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende uma molécula de ácido nucleico codificando uma lisina selecionada de pelo menos um de GN316 (SEQ ID NO: 22), GN329 (SEQ ID NO: 26), GN333 (SEQ ID NO: 28), GN424 (SEQ ID NO: 56), GN425 (SEQ ID NO:58), GN428 (SEQ ID NO: 60), GN431 (SEQ ID NO: 64), GN485 (SEQ ID NO: 68) ou uma variante ou um fragmento ativo ou derivado da mesma, em que o polipeptídeo codificado inibe o crescimento, ou reduz a população, ou mata P. aeruginosa e opcionalmente pelo menos uma outra espécie de bactéria Gram- negativa na ausência ou presença de, ou tanto na ausência como na presença de soro humano. Em certas modalidades, a variante, seu fragmento ativo ou derivado contém pelo menos uma modificação em relação a pelo menos uma de SEQ ID NOS: 22, 26, 28, 56, 58, 60, 64 ou 68, tal como pelo menos uma substituição, inserção ou deleção de aminoácido. Em certas modalidades, o polinucleotídeo compreende uma sequência de ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 21, 25, 27, 55, 57, 59, 63 e 67, seus complementos ou uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para one de SEQ ID NOS: 21, 25, 27, 55, 57, 59, 63 ou 67, ou seus complementos, em que o polipeptídeo codificado inibe o crescimento, ou reduz a população, ou mata P. aeruginosa e opcionalmente pelo menos uma outra espécie de bactéria Gram- negativa na ausência ou presença de, ou na ausência e presença de , soro humano.
[00142] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um polinucleotídeo isolado compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificando uma construção de polipeptídeo de AMP-lisina compreendendo: (a) uma primeira molécula de ácido nucleico codificando um primeiro componente compreendendo: (i) uma lisina selecionada do grupo que consiste em GN76 (SEQ ID NO: 203), GN4 (SEQ ID NO: 74), GN146 (SEQ ID NO: 78), GN14 (SEQ ID NO: 124), GN37 (SEQ ID NO: 84) opcionalmente com uma única mutação de aumento de pI, GN316 (SEQ ID NO: 22) opcionalmente com uma única mutação de ponto, lisina Pap2_gp17 (SEQ ID NO: 96), GN329 (SEQ ID NO: 26), GN424 (SEQ ID NO: 56), GN202 (SEQ ID NO: 118), GN425 (SEQ ID NO: 58),
GN428 (SEQ ID NO: 60), GN431 (SEQ ID NO: 64), GN486 (SEQ ID NO: 66), GN333 (SEQ ID NO: 28), e GN485 (SEQ ID NO: 68), GN123 (SEQ ID NO: 173) e GN121 (SEQ ID NO: 175); ou (ii) um polipeptídeo com atividade de lisina, em que o polipeptídeo é pelo menos 80% idêntico a pelo menos uma de SEQ ID NOS: 203, 74, 78, 124, 84, 22, 96, 26, 56, 118, 58, 60, 64, 66, 28, 68, 173 ou 175; ou (iii) um fragmento ativo da lisina; (b) uma segunda molécula de ácido nucleico que codifica um segundo componente compreendendo: (i) pelo menos um peptídeo antimicrobiano (AMP) selecionado do grupo que consiste em Chp1 (SEQ ID NO: 133), Chp2 (SEQ ID NO: 70), CPAR39 (SEQ ID NO: 135), Chp3 (SEQ ID NO: 137), Chp4 (SEQ ID NO: 102), Chp6 (SEQ ID NO: 106), Chp7 (SEQ ID NO: 139), Chp8 (SEQ ID NO: 141), Chp9 (SEQ ID NO: 143), Chp10 (SEQ ID NO: 145), Chp11 (SEQ ID NO: 147), Chp12 (SEQ ID NO: 149), Gkh1 (SEQ ID NO: 151), Gkh2 (SEQ ID NO: 90), Unp1 (SEQ ID NO: 153), Ecp1 (SEQ ID NO: 155), Ecp2 (SEQ ID NO: 104), Tma1 (SEQ ID NO: 157), Osp1 (SEQ ID NO: 108), Unp2 (SEQ ID NO: 159), Unp3 (SEQ ID NO: 161), Gkh3 (SEQ ID NO: 163), Unp5 (SEQ ID NO: 165), Unp6 (SEQ ID NO: 167), Spi1 (SEQ ID NO: 169), Spi2 (SEQ ID NO: 171), Ecp3 (SEQ ID NO: 177), Ecp4 (SEQ ID NO: 179), ALCES1 (SEQ ID NO: 181), AVQ206 (SEQ ID NO: 183), AVQ244 (SEQ ID NO: 185), CDL907 (SEQ ID NO: 187), AGT915 (SEQ ID NO: 189), HH3930 (SEQ ID NO: 191), Fen7875 (SEQ ID NO: 193), SBR77 (SEQ ID NO: 195), Bdp1 (SEQ ID NO: 197), LVP1 (SEQ ID NO: 199), Lvp2 (SEQ ID NO: 201), um fragmento de esculentina (SEQ ID NO: 80), RI12 (SEQ ID NO: 88), TI15 (SEQ ID NO: 94), RI18 (SEQ ID NO: 92), FIRL (SEQ ID NO: 114), um fragmento de proteína de ligação a LPS (SEQ ID NO: 76), RR12whidro (SEQ ID NO: 110), derivado de peptídeo RI18 (SEQ ID NO: 131) e peptídeo catiônico (SEQ ID NO: 120) ou (ii) um polipeptídeo tendo atividade de AMP, em que o polipeptídeo é pelo menos 80% idêntico a pelo menos uma de SEQ ID NOS: 133, 70, 135, 137, 102, 106, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 90, 153, 155, 104, 157, 108, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 80, 88, 94, 92, 114, 76, 110, 131 e 120.
[00143] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos isolados da presente invenção compreendem uma molécula de ácido nucleico codificando um primeiro componente de uma construção de lisina-AMP, em que o primeiro componente é selecionado do grupo que consiste em GN394 (SEQ ID NO: 48), GN396 (SEQ ID NO: 50), GN408 (SEQ ID NO: 52) e GN418 (SEQ ID NO: 54).
[00144] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos isolados da presente invenção compreendem uma molécula de ácido nucleico codificando um segundo componente de uma construção de lisina-AMP em que o segundo componente é selecionado do grupo que consiste em Chp1 (SEQ ID NO: 133), Chp2 (SEQ ID NO: 70), CPAR39 (SEQ ID NO: 135), Chp3 (SEQ ID NO: 137), Chp4 (SEQ ID NO: 102), Chp6 (SEQ ID NO: 106), Chp7 (SEQ ID NO: 139), Chp8 (SEQ ID NO: 141), Chp9 (SEQ ID NO: 143), Chp10 (SEQ ID NO: 145), Chp11 (SEQ ID NO: 147), Chp12 (SEQ ID NO: 149), Gkh1 (SEQ ID NO: 151), Gkh2 (SEQ ID NO: 90), Unp1 (SEQ ID NO: 153), Ecp1 (SEQ ID NO: 155), Ecp2 (SEQ ID NO: 104), Tma1 (SEQ ID NO: 157), Osp1 (SEQ ID NO: 108), Unp2 (SEQ ID NO: 159), Unp3 (SEQ ID NO: 161), Gkh3 (SEQ ID NO: 163), Unp5 (SEQ ID NO: 165), Unp6 (SEQ ID NO: 167), Spi1 (SEQ ID NO: 169), Spi2 (SEQ ID NO: 171), Ecp3 (SEQ ID NO: 177), Ecp4 (SEQ ID NO: 179), ALCES1 (SEQ ID NO: 181), AVQ206 (SEQ ID NO: 183), AVQ244 (SEQ ID NO: 185), CDL907 (SEQ ID NO: 187), AGT915 (SEQ ID NO: 189), HH3930 (SEQ ID NO: 191), Fen7875 (SEQ ID NO: 193), SBR77 (SEQ ID NO: 195), Bdp1 (SEQ ID NO: 197), LVP1 (SEQ ID NO: 199), Lvp2 (SEQ ID NO: 201), um fragmento de esculentina (SEQ ID NO: 80),
RI12 (SEQ ID NO: 88), TI15 (SEQ ID NO: 94), RI18 (SEQ ID NO: 92), FIRL (SEQ ID NO: 114), um fragmento de proteína de ligação a LPS (SEQ ID NO: 76), RR12whidro (SEQ ID NO: 110), derivado de peptídeo RI18 (SEQ ID NO: 131) e peptídeo catiônico (SEQ ID NO: 120) ou (ii) um polipeptídeo tendo atividade de AMP, em que o polipeptídeo é pelo menos 80% idêntico a pelo menos uma de SEQ ID NOS: 133, 70, 135, 137, 102, 106, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 90, 153, 155, 104, 157, 108, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 80, 88, 94, 92, 114, 76, 110, 131 e 120.
[00145] Em algumas modalidades, polinucleotídeos isolados da presente invenção também compreendem uma molécula de ácido nucleico codificando pelo menos um componente de estabilização da estrutura de uma construção de polipeptídeo de AMP-lisina para manter pelo menos uma porção da estrutura do primeiro e/ou segundo componente na construção substancialmente a mesma que na lisina não conjugada e/ou AMP. Em algumas modalidades, os presentes polinucleotídeos isolados compreendem uma molécula de ácido nucleico codificando pelo menos um componente de estabilização da estrutura, em que o referido pelo menos um componente de estabilização da estrutura é um peptídeo, tal como um peptídeo compreendendo resíduos de glicina e/ou serina. Em uma modalidade, o peptídeo é selecionado do grupo que consiste em TAGGTAGG (SEQ ID NO: 72), IGEM (BBa_K1485002) (SEQ ID NO: 82), PPTAGGTAGG (SEQ ID NO: 98), IGEM +PP (resíduos 44-58 de SEQ ID NO: 16) e AGAGAGAGAGAGAGAGAS (SEQ ID NO: 122).
[00146] Mais particularmente, em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende uma molécula de ácido nucleico codificando uma construção de polipeptídeo de AMP-lisina, em que a construção de polipeptídeo de AMP-lisina é a GN168 lisina (SEQ ID NO:
2) ou um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2.
[00147] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificando a lisina GN168 compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, um complemento da mesma ou uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 1, ou um complemento da mesma.
[00148] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende uma molécula de ácido nucleico codificando uma construção de polipeptídeo de AMP-lisina, em que a construção de polipeptídeo de AMP-lisina é a lisina GN176 (SEQ ID NO: 4) ou uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 4.
[00149] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificando a lisina GN176 compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3, um complemento da mesma ou uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 3, ou um complemento da mesma.
[00150] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende uma molécula de ácido nucleico codificando uma construção de polipeptídeo de AMP-lisina, em que a construção de polipeptídeo de AMP-lisina é a lisina GN178 (SEQ ID NO: 6) ou uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 6.
[00151] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificando a lisina GN178 compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5, um complemento da mesma ou uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 5, ou um complemento da mesma.
[00152] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende uma molécula de ácido nucleico codificando uma construção de polipeptídeo de AMP-lisina, em que a construção de polipeptídeo de AMP-lisina é a lisina GN218 (SEQ ID NO: 10) ou uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 10.
[00153] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificando a lisina GN218 compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9, um complemento da mesma ou uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 9, ou um complemento da mesma.
[00154] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende uma molécula de ácido nucleico codificando uma construção de polipeptídeo de AMP-lisina, em que a construção de polipeptídeo de AMP-lisina é a lisina GN223 (SEQ ID NO: 12) ou uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98% ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 12.
[00155] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificando a lisina GN223 compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, um complemento da mesma ou uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98% ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 11, ou um complemento da mesma.
[00156] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende uma molécula de ácido nucleico codificando uma construção de polipeptídeo de AMP-lisina, em que a construção de polipeptídeo de AMP-lisina é a lisina GN239 (SEQ ID NO: 14) ou uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 14.
[00157] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificando o lisina GN239 compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 13, um complemento da mesma ou uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 13, ou um complemento da mesma.
[00158] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende uma molécula de ácido nucleico codificando uma construção de polipeptídeo de AMP-lisina, em que a construção de polipeptídeo de AMP-lisina é a lisina GN243 (SEQ ID NO: 16) ou uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 16.
[00159] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificando o GN243 lisina compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 15, um complemento da mesma ou uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 15, ou um complemento da mesma.
[00160] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende uma molécula de ácido nucleico codificando uma construção de polipeptídeo de AMP-lisina, em que a construção de polipeptídeo de AMP-lisina é a lisina GN280 (SEQ ID NO: 18) ou uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%,
ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 18.
[00161] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificando a lisina GN280 compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 17, um complemento da mesma ou uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 17, ou um complemento da mesma.
[00162] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende uma molécula de ácido nucleico codificando uma construção de polipeptídeo de AMP-lisina, em que a construção de polipeptídeo de AMP-lisina é a lisina GN281 (SEQ ID NO: 20) ou uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 20.
[00163] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificando a lisina GN281 compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 19, um complemento da mesma ou uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 19, ou um complemento da mesma.
[00164] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende uma molécula de ácido nucleico codificando uma construção de polipeptídeo de AMP-lisina, em que a construção de polipeptídeo de AMP-lisina é a lisina GN349 (SEQ ID NO: 30) ou uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 30.
[00165] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificando a lisina GN349 compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 29, um complemento da mesma ou uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 29, ou um complemento da mesma.
[00166] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende uma molécula de ácido nucleico codificando uma construção de polipeptídeo de AMP-lisina, em que a construção de polipeptídeo de AMP-lisina é a lisina GN351 (SEQ ID NO: 32) ou uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 32.
[00167] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificando a lisina GN351 compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 31, um complemento da mesma ou uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 31, ou um complemento da mesma.
[00168] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende uma molécula de ácido nucleico codificando uma construção de polipeptídeo de AMP-lisina, em que a construção de polipeptídeo de AMP-lisina é a lisina GN352 (SEQ ID NO: 34) ou uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 34.
[00169] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificando a lisina GN352 compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 33, um complemento da mesma ou uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 33, ou um complemento da mesma.
[00170] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende uma molécula de ácido nucleico codificando uma construção de polipeptídeo de AMP-lisina, em que a construção de polipeptídeo de AMP-lisina é a lisina GN353 (SEQ ID NO: 36) ou uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 36.
[00171] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificando a lisina GN353 compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 35, um complemento da mesma ou uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 35, ou um complemento da mesma.
[00172] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende uma molécula de ácido nucleico codificando uma construção de polipeptídeo de AMP-lisina, em que a construção de polipeptídeo de AMP-lisina é a lisina GN357 (SEQ ID NO: 38) ou uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 38.
[00173] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificando a lisina GN357 compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 37, um complemento da mesma ou uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 37, ou um complemento da mesma.
[00174] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende uma molécula de ácido nucleico codificando uma construção de polipeptídeo de AMP-lisina, em que a construção de polipeptídeo de AMP-lisina é a lisina GN359 (SEQ ID NO: 40) ou uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID
NO: 40.
[00175] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificando a lisina GN359 compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 39, um complemento da mesma ou uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 39, ou um complemento da mesma.
[00176] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende uma molécula de ácido nucleico codificando uma construção de polipeptídeo de AMP-lisina, em que a construção de polipeptídeo de AMP-lisina é a lisina GN369 (SEQ ID NO: 42) ou uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 42.
[00177] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificando a lisina GN369 compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 41, um complemento da mesma ou uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 41, ou um complemento da mesma.
[00178] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende uma molécula de ácido nucleico codificando uma construção de polipeptídeo de AMP-lisina, em que a construção de polipeptídeo de AMP-lisina é a lisina GN370 (SEQ ID NO: 44) ou uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 44.
[00179] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificando a lisina GN370 compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 43, um complemento da mesma ou uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 43, ou um complemento da mesma.
[00180] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende uma molécula de ácido nucleico codificando uma construção de polipeptídeo de AMP-lisina, em que a construção de polipeptídeo de AMP-lisina é a lisina GN371 (SEQ ID NO: 46) ou uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 46.
[00181] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificando a lisina GN371 compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 45, um complemento da mesma ou uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 45, ou um complemento da mesma.
[00182] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende uma molécula de ácido nucleico codificando uma construção de polipeptídeo de AMP-lisina, em que a construção de polipeptídeo de AMP-lisina é a lisina GN93 (SEQ ID NO: 62) ou uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 62.
[00183] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificando a lisina GN93 compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 61, um complemento da mesma ou uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de lisina e tendo pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 61, ou um complemento da mesma. Vetores e Células Hospedeiras
[00184] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada para um vetor compreendendo um polinucleotídeo isolado compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificando qualquer uma das lisina- polipeptídeos AMP, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados divulgados aqui ou uma sequência complementar dos presentes polinucleotídeos isolados. Em algumas modalidades, o vetor é um plasmídeo ou cosmídeo. Em outras modalidades, o vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao vetor viral. Em algumas modalidades, o vetor pode replicar autonomamente em uma célula hospedeira na qual ele é introduzido. Em algumas modalidades, o vetor pode ser integrado no genoma de uma célula hospedeira após introdução na célula hospedeira e, assim, ser replicado junto com o genoma do hospedeiro.
[00185] Em algumas modalidades, vetores particulares, referidos aqui como "vetores de expressão recombinantes" ou "vetores de expressão", podem direcionar a expressão de genes aos quais eles estão operacionalmente ligados. Uma sequência de polinucleotídeo é "operacionalmente ligada" quando ela é colocada em um relacionamento funcional com outra sequência de nucleotídeo. Por exemplo, uma sequência de DNA promotora ou reguladora é dita ser "operacionalmente ligada" a uma sequência de DNA que codifica para um RNA e/ou uma proteína se as duas sequências são operacionalmente ligadas, ou situadas de modo que a sequência de DNA promotora ou reguladora afete o nível de expressão da sequência de DNA de codificação ou estrutural. Sequências de DNA operacionalmente ligadas são tipicamente, mas não necessariamente, contíguas.
[00186] Geralmente, qualquer sistema ou vetor adequado para manter, propagar ou expressar um polipeptídeo em um hospedeiro pode ser usado para expressão das presentes lisina-polipeptídeos AMP, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados. A sequência de DNA/polinucleotídeo apropriada pode ser inserida no sistema de expressão por qualquer uma de uma variedade de técnicas bem conhecidas e de rotina, tal como, por exemplo, aquelas apresentadas em Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ª Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (2001). Adicionalmente, marcadores podem também ser adicionados às lisina- polipeptídeos AMP, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados da presente invenção para fornecer métodos convenientes de isolamento, por exemplo, c-myc, biotina, poli- His, etc. Kits para tais sistemas de expressão estão comercialmente disponíveis.
[00187] Uma ampla variedade de combinações de hospedeiro/vetor de expressão pode ser empregada na expressão das sequências de polinucleotídeo codificando as presentes lisina-polipeptídeos AMP, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados. Grandes números de vetores adequados são conhecidos por aqueles versados na técnica, e estão comercialmente disponíveis. Exemplos de vetores adequados são fornecidos, por exemplo, em Sambrook et al, eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ª Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (2001). Tais vetores incluem, entre outros, vetores cromossômicos, episômicos e derivados de vírus, por exemplo, vetores derivados de plasmídeos bacterianos, de bacteriófago, de transposons, de epissomas de levedura, de elementos de inserção, de elementos cromossômicos de levedura, de vírus, tais como baculovírus, vírus papova, tal como SV40, vírus vaccinia, adenovírus, vírus da varíola aviária, vírus da pseudo-raiva e retrovírus e vetores derivados de combinações dos mesmos, tais como aqueles derivados de plasmídeos e elementos genéticos de bacteriófago, tais como cosmídeos e fagemídeos.
[00188] Além disso, os vetores podem fornecer a expressão constitutiva ou induzível das lisina-polipeptídeos AMP, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados da presente invenção. Vetores adequados incluem, mas não são limitados a derivados de SV40 e plasmídeos bacterianos conhecidos, por exemplo, plasmídeos de E. coli colEl, pCRl, pBR322, pMB9 e seus derivados, plasmídeos tais como RP4, pBAD24 e pBAD-TOPO; DNAS de fago, por exemplo, os numerosos derivados de fago A, por exemplo, NM989, e outro DNA de fago, por exemplo, M13 e DNA de fago de cadeia simples filamentoso; plasmídeos de levedura tais como o plasmídeo 2 D ou derivados dos mesmos; vetores úteis em células eucarióticas, tais como vetores úteis em células de inseto ou mamífero;
vetores derivados de combinações de plasmídeos e DNAs de fago, tais como plasmídeos que foram modificados para empregar DNA de fago ou outras sequências de controle de expressão; e similares. Muitos dos vetores mencionados acima estão comercialmente disponíveis de fornecedores tais como New England Biolabs Inc., Addgene, Takara Bio Inc., ThermoFisher Scientific Inc., etc.
[00189] Adicionalmente, vetores podem compreender vários elementos reguladores (incluindo promotor, sítio de ligação de ribossomo, terminador, realçador, vários cis-elementos para controle do nível de expressão) em que o vetor é construído de acordo com a célula hospedeira. Qualquer uma de uma ampla variedade de sequências de controle de expressão (sequências que controlam a expressão de uma sequência de polinucleotídeo operacionalmente ligada a elas) pode ser usada nestes vetores para expressar as sequências de polinucleotídeo codificando os polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados dos mesmos da presente invenção. Sequências de controle úteis incluem, mas não são limitadas a: os primeiros ou últimos promotores de SV40, CMV, vaccinia, polioma ou adenovírus, o sistema lac, o sistema trp, o sistema TAC, o sistema TRC, o sistema LTR, o principal operador e regiões promotoras de fago A, as regiões de controle de proteína de revestimento fd, o promotor para 3-fosfoglicerato cinase ou outras enzimas glicolíticas, os promotores de fosfatase ácida (por exemplo, Pho5), os promotores dos fatores de levedura de pareamento, promotor de E. coli para expressão em bactérias, e outras sequências promotoras conhecidas por controlar a expressão de genes de células procarióticas ou eucarióticas ou seus vírus, e várias combinações dos mesmos. Tipicamente, as sequências de polinucleotídeo codificando os polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados são operacionalmente ligadas a um promotor heterólogo ou elemento regulador.
[00190] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada para uma célula hospedeira compreendendo qualquer um dos vetores divulgados aqui incluindo os vetores de expressão compreendendo as sequências de polinucleotídeo codificando os polipeptídeos de AMP- lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados da presente invenção. Uma ampla variedade de células hospedeiras são úteis em expressar os presentes polipeptídeos. Exemplos não limitantes de células hospedeiras adequadas para expressão dos presentes polipeptídeos incluem hospedeiros eucarióticos e procarióticos bem conhecidos, tais como cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, fungos tais como leveduras, e células animais, tais como células CHO, Rl.l, B-W e L-M, células renais de Macaco Verde Africano (por exemplo, COS 1, COS 7, BSCl, BSC40, e BMT10), células de inseto (por exemplo, Sf9), e células humanas e células de planta em cultura de tecido. Enquanto o hospedeiro de expressão pode ser qualquer célula hospedeira de expressão conhecida, em uma modalidade típica o hospedeiro de expressão é um das cepas de E. coli. Estas incluem, mas não são limitadas a cepas de E. coli comercialmente disponíveis tais como Top10 (Thermo Fisher Scientific, Inc.), DH5a (Thermo Fisher Scientific, Inc.), XLI-Blue (Agilent Technologies, Inc.), SCSllO (Agilent Technologies, Inc.), JM109 (Promega, Inc.), LMG194 (ATCC), e BL21 (Thermo Fisher Scientific, Inc.).
[00191] Existem diversas vantagens no uso de E. coli como um sistema hospedeiro incluindo: cinética de crescimento rápido, onde sob as condições ambientais ideais, seu tempo de duplicação é de cerca de 20 min (Sezonov et al., J. Bacterial. 189 8746-8749 (2007)), culturas de alta densidade facilmente alcançadas, transformação fácil e rápida com DNA exógeno, etc. Detalhes a respeito de expressão de proteína em E.
coli, incluindo seleção de plasmídeo bem como seleção de cepa são discutidos em detalhes por Rosano, G. e Ceccarelli, E., Front Microbial., 5: 172 (2014).
[00192] Expressão eficiente dos presentes polipeptídeos de AMP- lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados depende de uma variedade de fatores tais como sinais de expressão ideais (tanto no nível da transcrição quanto da tradução), reduplicação de proteína correta, e características de crescimento celular. Quanto aos métodos para construção do vetor e métodos para transdução do vetor recombinante construído na célula hospedeira, métodos convencionais conhecidos na técnica podem ser utilizados. Embora seja entendido que nem todos os vetores, sequências de controle de expressão e hospedeiros funcionarão igualmente bem para expressar as sequências de polinucleotídeo codificando polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados da presente invenção, aquele versado na técnica será capaz de selecionar os vetores, sequências de controle de expressão, e hospedeiros apropriados sem experimentação indevida para alcançar a expressão desejada sem se afastar do escopo desta divulgação.
[00193] Em algumas modalidades, os presentes inventores encontraram uma correlação entre o nível de expressão e atividade do polipeptídeo expressado; em sistemas de expressão de E. coli em particular, níveis moderados de expressão (por exemplo, entre cerca de 1 e 10 mg/litro) produziram polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados com níveis mais altos de atividade do que aqueles que foram expressados em níveis mais altos em E. coli (por exemplo, entre cerca de 20 e cerca de 100 mg/litro), os últimos tendo, às vezes produzido polipeptídeos totalmente inativos.
[00194] Polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados da presente invenção podem ser recuperados e purificados de culturas de células recombinantes por métodos bem conhecidos incluindo sulfato de amônio ou precipitação de etanol, extração de ácido, cromatografia de troca de ânion ou cátion, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxilapatita, e cromatografia de lectina. Cromatografia líquida de alta eficiência pode ser empregada para purificação de polipeptídeo de lisina.
[00195] Alternativamente, o sistema de vetor usado para a produção de polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados da presente invenção pode ser um sistema de expressão livre de célula. Vários sistemas de expressão livres de célula estão comercialmente disponíveis, incluindo, mas não são limitados àqueles disponíveis de Promega, LifeTechnologies, Clonetech, etc.
[00196] Como indicado acima, existe uma variedade de escolhas quando se trata de produção e purificação de proteína. Exemplos de métodos e estratégias adequados a serem considerados em produção e purificação de proteína são fornecidos em WO 2017/049233, que é aqui incorporado por referência em sua íntegra e também fornecidos em Structural Genomics Consortium et al., Nat. Methods., 5(2): 135-146 (2008). Composições Farmacêuticas
[00197] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada para uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados como descrito aqui e um transportador farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades,
a presente composição farmacêutica compreende pelo menos uma atividade selecionada de inibição do crescimento bacteriano de P. aeruginosa, redução de uma população bacteriana de P. aeruginosa e/ou morte do P. aeruginosa na ausência e/ou presença de soro humano.
[00198] Em algumas modalidades, as presentes composições farmacêuticas também compreendem um ou mais antibióticos adequados para o tratamento de bactérias Gram-negativas. Antibióticos típicos incluem um ou mais de ceftazidima, cefepima, cefoperazona, ceftobiprol, ciprofloxacina, levofloxacina, aminoglicosídeos, imipenema, meropenema, doripenema, gentamicina, tobramicina, amicacina, piperacilina, ticarcilina, penicilina, rifampicina, polimixina B, e colistina. Antibióticos adequados adicionais são descritos na Tabela 3.
[00199] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é uma solução, uma suspensão, uma emulsão, um pó inalável, um aerossol, ou um spray. As composições farmacêuticas da presente invenção podem tomar a forma de soluções, suspensões, emulsão, comprimidos, pílulas, péletes, cápsulas, cápsulas contendo líquidos, pós, formulações de liberação controlada, supositórios, emulsões de aplicações de tampão, aerossóis, sprays, suspensões, pastilhas, trociscos, balas, injetáveis, gomas de mascar, pomadas, esfregaços, adesivos de liberação prolongada, lenços absorventes de líquido e combinações dos mesmos.
[00200] Administração das composições farmacêuticas da presente invenção pode ser tópica, ou seja, a composição farmacêutica ser aplicada diretamente onde sua ação é desejada (por exemplo, diretamente em uma ferida). As composições tópicas da presente invenção podem também compreender um transportador farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitável, tal como um transportador dermatologicamente ou oticamente aceitável. Tais transportadores, no caso de transportadores dermatologicamente aceitáveis, são preferivelmente compatíveis com pele, unhas, membranas mucosas, tecidos e/ou cabelo, e podem incluir qualquer transportador dermatológico convencionalmente usado que atenda a esses requisitos. No caso de transportadores oticamente aceitáveis, o transportador é preferivelmente compatível com todas as partes do ouvido. Tais transportadores podem ser prontamente selecionados por aquele versado na técnica.
[00201] Transportadores para administração tópica da lisina, fragmento ativo da mesma e/ou construção de polipeptídeo de lisina- AMP da presente invenção incluem, mas não são limitados a, compostos de óleo mineral, petróleo líquido, petróleo branco, propileno glicol, polioxietileno e/ou polioxipropileno, cera emulsificante, monoestearato de sorbitano, polisorbato 60, cera de cetil ésteres, álcool cetearílico, 2-octildodecanol, álcool benzílico, e água. Em formulação de pomadas de pele, os componentes ativos da presente invenção podem ser formulados em uma base de hidrocarboneto oleaginosa, uma base de absorção anidrosa, uma base de absorção de água-em-óleo, uma base removível com água de óleo em água e/ou uma base solúvel em água. Em formulação de composições óticas, os componentes ativos da presente invenção podem ser formulação em uma suspensão polimérica aquosa incluindo tais transportadores como dextranos, polietileno glicóis, polivinilpirrolidona, géis de polissacarídeos, Gelrite®, polímeros celulósicos como hidroxipropil metilcelulose, e polímeros contendo carbóxi tais como polímeros ou copolímeros de ácido acrílico, bem como outros demulcentes poliméricos.
[00202] As composições tópicas de acordo com a presente invenção podem estar em qualquer forma adequada para aplicação tópica, incluindo soluções aquosas, aquosas-alcoólicas ou oleosas, loção ou dispersões de soro, géis aquosos, anidrosos ou oleosos, emulsões obtidas por dispersão de uma fase gordurosa em uma fase aquosa (OAV ou óleo em água) ou, inversamente, (W/O ou água em óleo), microemulsões ou alternativamente microcápsulas, micropartículas ou dispersões de vesícula lipídica de tipo iônico e/ou não iônico, cremes, loções, géis, espumas (que geralmente irão exigir um recipiente pressurizado, um aplicador adequado, um emulsificante e um propelente inerte), essências, leites, suspensões, ou emplastros. Composições tópicas da presente invenção podem também conter adjuvantes tais como agentes gelificantes hidrofílicos ou lipofílicos, agentes ativos hidrofílicos ou lipofílicos, agentes conservantes, antioxidantes, solventes, fragrâncias, cargas, protetores solares, absorventes de odor e corantes. Em outro aspecto, as composições tópicas podem ser administradas em conjunto com dispositivos tais como emplastros transdérmicos, curativos, compressas, bandagens, matrizes e bandagens capazes de aderir ou de outra forma associadas à pele ou outro tecido de um indivíduo, sendo capazes de liberar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais peptídeos antibacterianos de acordo com a presente invenção.
[00203] Em uma modalidade, as composições tópicas da presente invenção adicionalmente compreendem um ou mais componentes usados para tratar queimaduras tópicas. Tais componentes tipicamente incluem, mas não são limitados a, um hidrogel de propileno glicol; uma combinação de um glicol, um derivado de celulose e um sal de alumínio solúvel em água; um antisséptico; um antibiótico; e um corticosteróide. Umectantes (tais como ésteres de cera sólida ou líquida), promotores de absorção (tais como argilas hidrofílicas, ou amidos), agentes de aumento de viscosidade, e agentes protetores de pele podem também ser adicionados. Formulações tópicas podem estar na forma de enxágues tais como enxaguante bucal. Veja, por exemplo, WO2004/004650.
[00204] Em algumas modalidades, administração das composições farmacêuticas da presente invenção pode ser sistêmica. Administração sistêmica pode ser entérica ou oral, ou seja, uma substância é fornecida por meio do trato digestivo, parenteral, ou seja, uma substância é fornecida por outras vias que não o trato digestivo tais como por injeção ou inalação. Portanto, os polipeptídeos incluindo polipeptídeos de AMP- lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados da presente invenção podem ser administrados a um indivíduo oralmente, parenteralmente, por inação, topicamente, retalmente, nasalmente, bucalmente ou por meio de um reservatório implantado ou por qualquer outro método conhecido. os polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados da presente invenção podem também ser administrados por meio de formas de dosagem de liberação controlada.
[00205] Para administração oral, os polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados da presente invenção podem ser formulados em preparações sólidas ou líquidas, por exemplo, comprimidos, cápsulas, pós, soluções, suspensões e dispersões. A lisina, fragmento ativo da mesma e/ou construções de polipeptídeo de AMP-lisina podem ser formulados com excipientes tais como, por exemplo, lactose, sacarose, amido de milho, gelatina, amido de batata, ácido algínico e/ou estearato de magnésio.
[00206] Para preparar composições tais como comprimidos e pílulas, polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados da presente invenção são misturados com um excipiente farmacêutico para formar uma composição de pré-formulação sólida. Se desejado, comprimidos podem ser revestidos de açúcar ou com revestimento entérico por técnicas padrão. Os comprimidos ou pílulas podem ser revestidos ou de outro modo compostos para fornecer uma forma de dosagem proporcionando a vantagem de ação prolongada. Por exemplo, o comprimido ou pílula pode incluir um componente de dosagem interna e um de dosagem externa, o último estando na forma de um envelope sobre o primeiro. Os dois componentes de dosagem podem ser separados por uma camada entérica, que serve para resistir a desintegração no estômago e permitir que o componente interno passe intacto no duodeno ou seja retardado em liberação. Uma variedade de materiais pode ser usada para tais camadas ou revestimentos entéricos, tais como materiais incluindo vários ácidos poliméricos e misturas de ácidos poliméricos com tais materiais como goma-laca, álcool cetílico, e acetato de celulose.
[00207] As composições farmacêuticas da presente invenção podem também ser administradas por injeção. Por exemplo, as composições farmacêuticas podem ser administradas intramuscularmente, intratecalmente, subdermalmente, subcutaneamente, ou intravenosamente para tratar infecções por bactérias Gram-negativas, mais especificamente aquelas causadas por P. aeruginosa. O transportador farmaceuticamente aceitável pode ser compreendido por água destilada, uma solução salina, albumina, um soro, ou quaisquer combinações dos mesmos. Adicionalmente, composições farmacêuticas de injeções parenterais podem compreender soluções tamponadas de pH, adjuvantes (por exemplo, conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes), formulações lipossomais, nanopartículas, dispersões, suspensões ou emulsões bem como pós estéreis para reconstituição em soluções injetáveis estéreis ou dispersões pouco antes do uso.
[00208] Em casos onde injeção parenteral é o modo escolhido de administração, uma formulação isotônica é preferivelmente usada. Geralmente, aditivos para isotonicidade podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol, e lactose. Em alguns casos, soluções isotônicas tais como solução salina tamponada de fosfato são preferidas. Estabilizadores podem incluir gelatina e albumina. Um agente de vasoconstrição pode ser adicionado à formulação. As preparações farmacêuticas de acordo com este tipo de aplicação são fornecidas estéreis e livres de pirogênio.
[00209] Em outra modalidade, as composições farmacêuticas da presente invenção são composições inaláveis. Em algumas modalidades, as presentes composições farmacêuticas são vantajosamente formuladas como um pó seco, inalável. Em modalidades específicas, as presentes composições farmacêuticas podem também ser formuladas com um propelente para liberação aerossol. Exemplos de propelentes adequados incluem, mas não são limitados a: diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dicloro- tetrafluoroetano e dióxido de carbono. Em certas modalidades, as formulações podem ser nebulizadas.
[00210] Um tensoativo pode ser adicionado a uma composição farmacêutica inalável da presente invenção de modo a diminuir a superfície e tensão interfacial entre os medicamentos e o propelente. O tensoativo pode ser qualquer composto não tóxico, adequado que é não reativo com os presentes polipeptídeos.
[00211] Exemplos de tensoativos adequados incluem, mas não são limitados a: ácido oleico; trioleato de sorbitano; cloreto de cetil pirdínio; lecitina de soja; monolaurato de polioxietileno(20) sorbitano; éter estearílico de polioxietileno (10); éter oleílico de polioxietileno (2); copolímeros bloqueadores de polioxipropileno-polioxietileno etileno diamina; monoestearato de polioxietileno(20) sorbitano; monooleato de polioxietileno(20) sorbitano; copolímeros bloqueadores de polioxipropileno-polioxietileno; etoxilato de óleo de rícino; e combinações dos mesmos.
[00212] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas inaláveis incluem excipientes. Exemplos de excipientes adequados incluem, mas não são limitados a: lactose, amido, diésteres de propileno glicol de ácidos graxos de cadeia média; ésteres triglicerídeos de ácidos graxos de cadeia média, cadeias curtas, ou cadeias longas, ou qualquer combinação dos mesmos; perfluorodimetilciclobutano; perfluorociclobutano; polietileno glicol; mentol; lauroglicol; monoetiléter de dietileno glicol; glicerídeos poliglicolizados de ácidos graxos de cadeia média; álcoois; óleo de eucalipto; ácidos graxos de cadeia curta; e combinações dos mesmos.
[00213] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas da presente invenção compreendem formulações nasais. Formulações nasais incluem, por exemplo, sprays nasais, gotas nasais, pomadas nasais, lavagens nasais, injeções nasais, tampas nasais, sprays brônquicos e inaladores, ou indiretamente por meio do uso de pastilhas para a garganta, enxaguantes bucais ou gargarejos, ou por meio do uso de pomadas aplicadas nas narinas ou no rosto ou qualquer combinação destes e métodos similares de aplicação.
[00214] Em outra modalidade, as composições farmacêuticas da presente invenção compreendem um agente complementar, incluindo um ou mais agentes antimicrobianos e/ou um ou mais antibióticos convencionais. De modo a acelerar o tratamento da infecção, ou aumentar o efeito antibacteriano, o agente terapêutico contendo os polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados da presente invenção pode também incluir pelo menos um agente complementar que pode também potencializar a atividade bactericida do peptídeo. O agente complementar pode ser um ou mais antibióticos usados para tratar bactérias Gram-negativas. Em uma modalidade, o agente complementar é um agente antibiótico ou antimicrobiano usado para o tratamento de infecções causadas por P. aeruginosa.
[00215] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser apresentadas em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por quaisquer métodos bem conhecidos na técnica. A quantidade de ingredientes ativos que podem ser combinados com um material transportador para produzir uma forma de dosagem única irá variar dependendo do hospedeiro sendo tratado, a duração de exposição do recipiente à bactéria infecciosa, o tamanho e o peso do indivíduo, e o modo particular de administração. A quantidade de ingredientes ativos que podem ser combinados com um material transportador para produzir uma forma de dosagem única irá geralmente ser aquela quantidade de cada composto que produz um efeito terapêutico. Geralmente, de cem por cento, a quantidade total irá variar de cerca de 1 por cento a cerca de noventa e nove por cento de ingredientes ativos, preferivelmente de cerca de 5 por cento a cerca de 70 por cento, mais preferivelmente de cerca de 10 por cento a cerca de 30 por cento. Dosagem e Administração
[00216] Dosagens administradas dependem de vários fatores incluindo a atividade de infecção sendo tratada, a idade, saúde e condição física geral do indivíduo a ser tratado, a atividade de um polipeptídeo de AMP-lisina particular, polipeptídeo de lisina, variante, fragmento ativo dos mesmos ou derivados, a natureza e atividade do antibiótico, se houver com os quais um polipeptídeo de AMP-lisina, polipeptídeo de lisina, variante, fragmento ativo dos mesmos ou derivados de acordo com a presente invenção estão sendo pareados e o efeito combinado de tal pareamento. Geralmente, quantidades eficazes do presente polipeptídeo de AMP-lisina, polipeptídeo de lisina, variante, fragmento ativo dos mesmos ou derivados a serem administradas deverão estar dentro da faixa de 1 a 50 mg/kg (ou 1 a 50 mcg/mL) administradas 1 a 4 vezes ao dia durante um período de até
14 dias. O antibiótico se um também foi usado será administrado em regimes de dosagem padrão ou em quantidades baixas em vista da sinergia. Todas as tais dosagens e regimes, entretanto, (sejam da polipeptídeo de AMP-lisina, polipeptídeo de lisina, variante, fragmento ativo dos mesmos ou derivados ou qualquer antibiótico administrado em conjunto com eles) são submetidas a otimização. Dosagens ótimas podem ser determinadas realizando experimentos de eficácia piloto in vitro e in vivo como está dentro da habilidade da técnica, mas levando em conta a presente invenção.
[00217] Deve ser contemplado que os presentes polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados fornecem um efeito bactericida e, quando usados em pequenas quantidades, efeito bacteriostático, e são ativos contra uma faixa de bactérias resistentes à antibiótico e não estão associados com resistência de evolução. Com base na presente invenção, em uma configuração clínica, os presentes polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados são uma alternativa potente (ou aditivo ou componente) de composições para tratar infecções decorrentes de bactérias resistentes à fármaco e múltiplos fármacos sozinhas ou junto com antibióticos (até mesmo antibióticos aos quais se desenvolveu resistência). Mecanismos de resistências existentes a bactérias Gram-negativas não devem afetar sensibilidade à atividade lítica dos presentes polipeptídeos.
[00218] Em algumas modalidades, tempo de exposição às presentes polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados pode influenciar a concentração desejada de unidades de polipeptídeo ativo por mL. Transportadores que são classificados como transportadores de liberação "longa" ou "lenta" (tais como, por exemplo, certos sprays nasais ou pastilhas) podem possuir ou fornecer uma concentração mais baixa de unidades de polipeptídeo por mL, mas durante um longo período de tempo, enquanto um transportador de liberação "curta" ou "rápida" (tal como, por exemplo, um gargarejo) pode possuir ou fornecer unidades de polipeptídeo de alta concentração (mcg) por mL, mas durante um curto período de tempo. Existem circunstâncias onde pode ser necessário ter uma dosagem unitária/mL muito mais alta ou uma dosagem unitária/mL inferior.
[00219] Para qualquer polipeptídeo da presente invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente em ensaios de cultura de células ou em modelos animais, geralmente camundongos, coelhos, cães ou porcos. O modelo animal pode também ser usado para alcançar uma faixa de concentração desejável e via de administração. Informação obtida pode então ser usada para determinar as doses eficazes, bem como vias de administração em humanos. Dosagem e administração podem ser também ajustadas para fornecer níveis suficientes do ingrediente ativo ou para manter o efeito desejado. Fatores adicionais que podem ser levados em conta incluem a severidade do estado de doença, idade, peso e gênero do paciente; dieta, duração desejada de tratamento, método de administração, tempo e frequência de administração, combinações de fármaco, sensibilidades de reação, e tolerância/resposta à terapia e o diagnóstico do médico assistente.
[00220] Um regime de tratamento pode envolver administração diária (por exemplo, uma vez, duas vezes, três vezes, etc. ao dia), dia sim, dia não (por exemplo, uma vez, duas vezes, três vezes, etc. dia sim, dia não), semi-semanalmente, semanalmente, uma vez a cada duas semanas, uma vez por mês, etc. Em uma modalidade, tratamento pode ser fornecido como uma infusão contínua. Doses unitárias podem ser administradas em múltiplas ocasiões. Intervalos podem também ser irregulares como indicado por monitoramento de sintomas clínicos.
Alternativamente, a dose unitária pode ser administrada como uma formulação de liberação controlada, nesse caso, é necessária uma administração menos frequente. Dosagem e frequência podem variar dependendo do paciente. Deve ser entendido por aquele versado na técnica que tais diretrizes irão ser ajustadas para administração localizada, por exemplo, intranasal, inalação, retal, etc. ou para administração sistêmica, por exemplo, oral, retal (por exemplo, por meio de enema), i.m. (intramuscular), i.p. (intraperitoneal), i.v. (intravenosa), s.c. (subcutânea), transuretral, e similares. Métodos
[00221] Os polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados da presente invenção podem ser usados in vivo, por exemplo, para tratar infecções bacterianas devido à bactérias Gram-negativas, tais como P.aeruginosa, em um indivíduo, bem como in vitro, por exemplo, para reduzir o nível de contaminação bacteriana em, por exemplo, uma superfície, por exemplo, de um dispositivo médico.
[00222] Por exemplo, em algumas modalidades, os presentes polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados podem ser usados para a prevenção, controle, rompimento, e tratamento de biopelícula bacteriana formada por bactérias Gram-negativas tais como P. aeruginosa. Formação de biopelícula ocorre quando células microbianas aderem umas às outras e são incorporadas em uma matriz de substância polimérica extracelular (EPS) em uma superfície. O crescimento de micróbios em tal ambiente protegido que é enriquecido com biomacromoléculas (por exemplo, polissacarídeos, ácidos nucleicos e proteínas) e nutrientes permite aumentar a interferência microbiana e aumentar a virulência. Biopelícula pode se desenvolver em qualquer ambiente de suporte incluindo superfícies vivas e não vivas tais como os tampões de muco do pulmão com CF, cateteres contaminados, lentes de contato, etc (Sharma et al. Biologicals, 42(1):1- 7 (2014), que é aqui incorporado por referência em sua íntegra). Portanto, em uma modalidade, os polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados da presente invenção podem ser usados para a prevenção, controle, rompimento, e tratamento de infecções bacterianas devido à bactérias Gram-negativas, tais como P.aeruginosa, quando as bactérias são protegidas por um biopelícula bacteriano.
[00223] Em um aspecto, a presente invenção é direcionada para um método de tratar uma infecção bacteriana causada por P. aeruginosa e opcionalmente uma ou mais espécies adicionais de bactérias Gram- negativas como descrito aqui, compreendendo administrar a um indivíduo diagnosticado com, em risco de, ou exibindo sintomas de infecção bacteriana, uma composição farmacêutica como aqui descrita.
[00224] Os termos “infecção” e “infecção bacteriana” se destinam a incluir infecções do trato respiratório (RTIs), tais como infecções do trato respiratório em pacientes tendo fibrose cística (CF), infecções do trato respiratório inferior, tais como exacerbação aguda de bronquite crônica (ACEB), sinusite aguda, pneumonia adquirida na comunidade (CAP), pneumonia adquirida em hospital (HAP) e infecções do trato respiratório nosocomial; doenças sexualmente transmissíveis, tais como cervicite gonocócica e uretrite gonocócica; infecções do trato urinário; otite média aguda; sepse incluindo septicemia neonatal e sepse relacionada com o cateter; e osteomielite. Infecções causadas por bactérias resistentes a fármaco e bactérias resistentes a múltiplos fármacos são também contempladas.
[00225] Exemplos não limitantes de infecções causadas por P. aeruginosa incluem: A) infecções nosocomiais: 1. Infecções do trato respiratório especialmente em pacientes com fibrose cística e pacientes com ventilação mecânica; 2. Bacteremia e sepse; 3. Infecções de feridas, particularmente aquelas de vítimas de queimadura; 4. Infecções do trato urinário; 5. Infecções pós-cirúrgicas em dispositivos invasivos;
6. Endocardite por administração intravenosa de soluções de fármaco contaminadas; 7. Infecções em pacientes com síndrome da imunodeficiência adquirida, quimioterapia de câncer, terapia esteroide, malignidades hematológicas, transplante de órgão, terapia de substituição renal, e outras condições com neutropenia severa. B) Infecções adquiridas na comunidade: 1. infecções do trato respiratório adquiridas em comunidade; 2. Meningite; 3. Foliculite e infecções do canal auditivo causadas por água contaminada; 4. Otite externa maligna nos idosos e diabéticos; 5. Osteomielite do calcâneo em crianças; 6. Infecções oculares comumente associadas à lentes de contato contaminadas; 7. Infecções de pele tais como infecções de unha em pessoas cujas mãos são frequentemente expostas à água; 8. Infecções do trato gastrointestinal; e 9. Infecções do sistema musculoesquelético.
[00226] As uma ou mais espécies adicionais de bactérias Gram- negativas dos presentes métodos podem incluir qualquer uma das espécies adicionais de bactérias Gram-negativas como descrito aqui. Tipicamente, as espécies adicionais de bactérias Gram-negativas são selecionadas de um ou mais de Acinetobacter baumannii, Acinetobacter haemolyticus, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aeromonas hidrophila, Bacteroides spp., tais como, Bacteroides fragilis, Bacteroides theataioatamicron, Bacteroides distasonis, Bacteroides ovatus, Bacteroides vulgatus, Bartonella Quintana, Bordetella pertussis, Brucella spp., tais como, Brucella melitensis, Burkholderia spp, tais como, Burkholderia cepacia, Burkholderia pseudomallei, e Burkholderia mallei, Fusobacterium, Prevotella corporis, Prevotella intermedia, Prevotella endodontalis, Porphyromonas asaccharolytica, Campylobacter jejuni, Campylobacter fetus, Campylobacter coli,
Chlamydia spp., tais como Chlamydia pneumoniae e Chlamydia trachomatis, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Coxiella burnetii, Edwarsiella spp., tais como, Edwarsiella tarda, Eikenella corrodens, Enterobacter spp., tais como, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, e Enterobacter agglomerans, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Helicobacter pylori, Kingella kingae, Klebsiella spp., tais como, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella rhinoscleromatis, e Klebsiella ozaenae, Legionella penumophila, Moraxella spp., tais como, Moraxella catarrhalis, Morganella spp., tais como, Morganella morganii, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, P. aeruginosa, Pasteurella multocida, Plesiomonas shigelloides, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus penneri, Proteus myxofaciens, Providencia spp., tais como, Providencia stuartii, Providencia rettgeri, Providencia alcalifaciens, Pseudomonas fluorescens, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella paratyphi, Serratia spp., tais como, Serratia marcescens, Shigella spp., tais como, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, e Shigella dysenteriae, Stenotrophomonas maltophilia, Streptobacillus moniliformis, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio alginolyticus, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Ricketsia prowazekii, Coxiella burnetii, Ehrlichia chafeensis e/ou Bartonella hensenae.
[00227] Mais tipicamente, pelo menos uma de outras espécies de bactérias Gram-negativas é selecionada de um ou mais de Acinetobacter baumannii, Bordetella pertussis, Burkholderia cepacia, Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae,
Legionella penumophila, Moraxella catarrhalis, Morganella morganii, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pasteurella multocida, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Salmonella typhi, Serratia marcescens, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, Stenotrophomonas maltophilia, Vibrio cholerae, e/ou Chlamydia pneumoniae.
[00228] Ainda mais tipicamente, pelo menos uma de outras espécies de bactérias Gram-negativas é selecionada de um ou mais de Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Shigella spp., Escherichia coli, Acinetobacter baumanii, Klebsiella pneumonia, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitides, Serratia spp. Proteus mirabilis, Morganella morganii, Providencia spp., Edwardsiella spp., Yersinia spp., Haemophilus influenza, Bartonella quintana, Brucella spp., Bordetella pertussis, Burkholderia spp., Moraxella spp., Francisella tularensis, Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Bacteroides spp., Enterobacter spp., e/ou Chlamydia spp.
[00229] Ainda mais tipicamente, uma ou mais espécies adicionais de bactérias Gram-negativas são Klebsiella spp., Enterobacter spp., Escherichia coli, Citrobacter freundii, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis, e/ou Franciscella tulerensis.
[00230] Em algumas modalidades, infecção com bactérias Gram- negativas resulta em uma infecção localizada, tal como uma infecção bacteriana tópica, por exemplo, uma ferida na pele. Em outras modalidades, a infecção bacteriana é uma infecção bacteriana patogênica sistêmica. Patógenos Gram-negativos comuns e infecções associadas são listadas na Tabela 2 da presente invenção. Estes são destinados a servir como exemplos das infecções bacterianas que podem ser tratadas, atenuadas ou prevenidas com as presentes lisinas, fragmentos ativos das mesmas e construções de polipeptídeo de AMP- lisina e não se destinam a ser limitantes.
Tabela 2. Bactérias Gram-negativas medicamente relevantes e doenças associadas.
Salmonella typhimurium Infecções gastrointestinais (GI) – salmonelose Shigella spp. shigelose
Escherichia coli Infecções do trato urinário (UTis)
Acinetobacter baumanii Infecções de ferida
Pseudomonas aeruginosa infecções da corrente sanguínea e pneumonia Klebsiella pneumoniae UTis, e infecções da corrente sanguínea
Neisseria gonorrhoeae Doença sexualmente transmissível (STD) - gonorreia Neisseria meningitides Meningite
Serratia spp.
Contaminações de cateter, UTis, e pneumonia
Proteus mirabilis UTIs Morganella spp.
UTIs Providencia spp.
UTIs Edwardsiella spp UTIs Salmonella typhi Infecções GI - febre tifoide Yersinia pestis Peste bubônica e pneumônica
Yersinia enterocolitica Infecções GI
Yersinia pseudotuberculosis Infecções GI Haemophilus influenza Meningite Bartonella Quintana Febre das trincheiras Brucella spp. Brucelose Bordetella pertussis Respiratório - Tosse convulsa Burkholderia spp. Respiratório Moraxella spp. Respiratório Francisella tularensis Tularemia Legionella pneumophila Respiratório - Doença dos Legionários Coxiella burnetii Febre Q Bacteroides spp. Infecções abdominais Enterobacter spp. UTis e respiratório Chlamydia spp. STDs, respiratório, e ocular
[00231] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados da presente invenção são usados para tratar um indivíduo em risco de adquirir uma infecção devido à P. aeruginosa e/ou outra bactéria Gram-negativa. Indivíduos em risco de adquirir a P. aeruginosa ou outra infecção bacteriana Gram-negativa incluem, por exemplo, pacientes com fibrose cística, pacientes neutropênicos, pacientes com enterocolite necrosante, vítimas de queimadura, pacientes com infecções de ferida, e, mais geralmente, pacientes em um ambiente hospitalar, em pacientes cirúrgicos particulares e pacientes sendo tratados usando um dispositivo médico implantável tal como um cateter, por exemplo, um cateter venoso central, um dispositivo Hickman, ou dispositivos cardíacos eletrofisiológico, por exemplo, marca-passos e desfibriladores implantáveis. Outro grupo de pacientes em risco de infecção com bactérias Gram-negativas incluindo P. aeruginosa inclui sem limitação pacientes com próteses implantadas tais como uma substituição total da articulação (por exemplo, substituição total do joelho ou quadril).
[00232] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada para um método de prevenir ou tratar uma infecção bacteriana compreendendo co-administrar a um indivíduo diagnosticado com, em risco de, ou exibindo sintomas de uma infecção bacteriana, uma combinação de uma primeira quantidade eficaz da composição contendo uma quantidade eficaz de um polipeptídeo de AMP-lisina, polipeptídeo de lisina, variante, fragmento ativo dos mesmos ou derivados como descrito aqui, e uma segunda quantidade eficaz de um antibiótico adequado para o tratamento de infecção bacteriana Gram- negativa.
[00233] Os polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados da presente invenção podem ser co-administrados com antibióticos de tratamento padrão ou com antibióticos de último recurso, individualmente ou em várias combinações como dentro da habilidade da técnica. Antibióticos tradicionais usados contra P. aeruginosa são descritos na Tabela 3. Antibióticos para outras bactérias Gram-negativas, tais como Klebsiella spp., Enterobacter spp., Escherichia coli, Citrobacter freundii, Salmonellatyphimurium, Yersinia pestis, e Franciscella tulerensis, são similares àqueles fornecidos na Tabela 3 para P. aeruginosa. Tabela 3. Antibióticos usados para o tratamento de Pseudomonas aeruginosa Classe Agente Penicilinas Ticarcilina-clavulanato Piperacilina-tazobactam Cefalosporinas Ceftazidima Cefepima Cefoperazona Monobactamas Aztreonam Flouroquinolonas Ciprofloxacina Levofloxacina Carbapenêmicos Imipenem Meropenem Doripenem Aminoglicosídeos Gentamicina Tobramicina Amicacina Polimixinas Colistina Polimixina B
[00234] Em modalidades mais específicas, o antibiótico é selecionado de um ou mais de ceftazidima, cefepima, cefoperazona,
ceftobiprol, ciprofloxacina, levofloxacina, aminoglicosídeos, imipenema, meropenema, doripenema, gentamicina, tobramicina, amicacina, piperacilina, ticarcilina, penicilina, rifampicina, polimixina B e colistina.
[00235] Combinação de polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados da presente invenção com antibióticos fornece um regime antibacteriano eficaz. Em algumas modalidades, co-administração de polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados da presente invenção com um ou mais antibióticos pode ser realizada em doses e quantidades reduzidas dos polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados ou o antibiótico ou ambos, e/ou frequência e/ou duração de tratamento reduzidos com atividade bactericida e atividade bacteriostática aumentada, risco reduzido de resistência a antibióticos e com risco reduzido de efeitos colaterais renais neurológicos deletérios (tais como aqueles associados ao uso de colistina ou polimixina B). Estudos anteriores mostraram que dose cumulativa total de colistina está associada a danos renais, sugerindo que a diminuição na dosagem ou encurtamento da duração do tratamento usando a terapia de combinação com polipeptídeos de AMP- lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados poderiam diminuir a incidência de nefrotoxicidade (Spapen et al. Ann IntensiveCare. 1: 14 (2011), que é aqui incorporado por referência em sua íntegra). Como aqui usado o termo “dose reduzida” se refere à dose de um ingrediente ativo na combinação em comparação com monoterapia com o mesmo ingrediente ativo. Em algumas modalidades, a dose das lisinas, fragmentos ativos dos mesmos e construções de polipeptídeo de AMP-lisina ou o antibiótico em uma combinação pode ser sub-ideal ou ainda subliminar em comparação com a respectiva monoterapia.
[00236] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método para aumentar atividade antibiótica de um ou mais antibióticos contra bactérias Gram-negativas em comparação com a atividade de referidos antibióticos usados sozinhos por administração a um indivíduo de um ou mais polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados aqui descritos, junto com um antibiótico de interesse. A combinação é eficaz contra as bactérias e permite resistência contra o antibiótico a ser superado e/ou o antibiótico a ser empregado em doses inferiores, diminuir efeitos colaterais indesejáveis, tais como os efeitos nefrotóxicos e neurotóxicos de polimixina B.
[00237] Os polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados opcionalmente em conjunto com antibióticos da presente invenção podem também ser combinados com agentes permeabilizantes adicionais da membrana externa das bactérias Gram-negativas, incluindo, mas não limitados a quelantes de metal, tais como, por exemplo, EDTA, TRIS, ácido lático, lactoferrina, polimixinas, ácido cítrico (Vaara M. Microbial Rev. 56(3):395-441 (1992), que é aqui incorporado por referência em sua totalidade).
[00238] Em ainda outro aspecto, a presente invenção é direcionada para um método de inibição do crescimento, ou redução da população, ou morte de pelo menos uma espécie de bactéria Gram-negativa, o método compreendendo contatar a bactéria com uma composição contendo uma quantidade eficaz de polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados como descrito aqui, em que os polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados inibem o crescimento, ou reduzem a população, ou matam P. aeruginosa e opcionalmente pelo menos outra espécie de bactéria
Gram-negativa.
[00239] Em algumas modalidades, inibição do crescimento, ou redução da população, ou morte de pelo menos uma espécie de bactéria Gram-negativa compreende contatar bactéria com as lisinas, fragmentos ativos das mesmas e/ou construções de polipeptídeo de AMP-lisina como descrito aqui, em que as bactérias estão presentes em uma superfície de, por exemplo, dispositivos médicos, pisos, escadas, paredes e bancadas em hospitais e outros edifícios e superfícies de equipamentos relacionados à saúde ou de uso público em salas de cirurgia, salas de emergência, quartos de hospital, clínicas e banheiros e similares.
[00240] Exemplos de dispositivos médicos que podem ser protegidos usando os polipeptídeos de AMP-lisina, polipeptídeos de lisina, variantes, fragmentos ativos dos mesmos ou derivados descritos aqui incluem, mas não são limitados a tubos e outros dispositivos médicos de superfície, como cateteres urinários, cateteres de extração de mucosa, cateteres de sucção, cânulas umbilicais, lentes de contato, dispositivos intrauterinos, dispositivos intravaginais e intraintestinais, tubos endotraqueais, broncoscópios, próteses dentárias e dispositivos ortodônticos, instrumentos cirúrgicos, instrumentos dentários, tubos, linhas de água dentais, tecidos, papel, tiras indicadoras (por exemplo, tiras indicadoras de papel ou tiras indicadoras de plástico), adesivos (por exemplo, adesivos de hidrogel, adesivos termofusíveis, ou adesivos com base em solvente), bandagens, curativos de tecido ou dispositivos de cura e emplastros oclusivos, e quaisquer outros dispositivos de superfície usados no campo médico. Os dispositivos podem incluir eletrodos, próteses externas, fitas de fixação, bandagens de compressão, e monitores de vários tipos. Dispositivos médicos podem também incluir qualquer dispositivo que pode ser colocado no sítio de inserção ou implante tal como a pele próxima ao sítio de inserção ou implante, e que pode incluir pelo menos uma superfície que é suscetível à colonização por bactérias Gram-negativas.
EXEMPLOS Exemplo 1. Atividade de construções de lisinas e polipeptídeo de AMP-lisina em meio suplementado com soro humano. Materiais e Métodos
[00241] Bactérias Gram-negativas, por exemplo, P. aeruginosa, foram cultivadas e testadas em meio de casaminoácido (CAA) (5 g/L de casaminoácidos, Ameresco/VWR; 5,2 mM de K2HPO4, Sigma-Aldrich; 1 mM de MgSO4, Sigma-Aldrich), CAA suplementado com 150 mM de NaCl ou CAA suplementado com 2,5% de soro humano (Tipo AB, macho, agrupado; Sigma-Aldrich). Determinação de Concentrações Inibitórias Mínimas (MIC)
[00242] Valores de MIC foram determinados usando uma modificação método de referência de microdiluição do caldo padrão definido pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), CLSI.
2015. Métodos para Testes de Suscetibilidade Antimicrobiana à Diluição para Bactérias que Crescem Aerobicamente; Padrão aprovado-10ª edição. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA. A modificação foi com base na substituição de Caldo Mueller Hinton com meio de CAA (com e sem NaCl) ou CAA suplementado com 2,5% de soro humano. MIC é a concentração mínima de peptídeo suficiente para suprimir em pelo menos 80% do crescimento bacteriano em comparação a controle. Resultados
[00243] Os resultados destes experimentos são resumidos na Tabela 4 abaixo. Tabela 4 também fornece o peso molecular e ponto isoelétrico dos presentes polipeptídeos. Ao comparar as sequências e componentes dos vários polipeptídeos, o efeito de uma modificação estrutural particular no ponto isoelétrico (pI mais alto favorece a penetração da membrana externa) e atividade (como avaliado por MIC) podem ser determinados.
[00244] Por exemplo, os efeitos das mutações de ponto único em GN316 (SEQ ID NO: 22) podem ser vistos. GN394 (SEQ ID NO: 48) tem um pI mais baixo e uma atividade elevada em CAA, mas uma atividade mais baixa em CAA com soro humano. A redução de atividade em soro humano é menor para GN396 (SEQ ID NO: 50), enquanto GN408 (SEQ ID NO: 52) é substancialmente mais potente tanto na presença quanto na ausência de soro humano. Por outro lado, GN418 (SEQ ID NO: 54) perde atividade em meio de CAA não suplementado, mas ganha potência na presença de soro humano.
[00245] A mutação de ponto único em GN217 (SEQ ID NO: 8) melhora sua potência sobre GN37 tanto na ausência quanto na presença de soro humano. As modificações para GN37 (SEQ ID NO: 84) produzindo GN218 (SEQ ID NO: 10), GN223 (SEQ ID NO: 12), GN239 (SEQ ID NO: 14) e GN243(SEQ ID NO: 16) resultam em atividade muito forte na presença de soro humano. Observações similares podem ser feitas com base na comparação da sequência e componentes de outros polipeptídeos. Exemplo 2. Sinergia entre antibióticos e construções de lisinas ou polipeptídeo de AMP-lisina.
[00246] Sinergia entre GN76 (SEQ ID NO: 203), GN121 (SEQ ID NO: 175), GN123 (SEQ ID NO: 173), GN351 (SEQ ID NO: 32), GN370 (SEQ ID NO: 44) e GN428 (SEQ ID NO: 60) e 12 antibióticos diferentes foram examinados em ensaios de tabuleiro usando meio de CAA, suplementado com soro humano como descrito aqui, usando a cepa clínica resistente à carbapenem WC-452. Valores de índice de concentração de inibidor fracional (FICI) foram determinados para todas as combinações; valores de < 0,5 indicam sinergia.
[00247] Como indicado na Tabela 5, abaixo, as lisinas acima mencionadas e construções lisina-AMP são sinérgicas em uma ampla gama de antibióticos. Para imipenema, a sinergia é consistente com ressensibilização ao antibiótico carbapenema. Exemplo 3. Ressensibilização de cepas clínicas resistentes ao carbapenema usando antibióticos em conjunto com lisinas.
[00248] A capacidade de GN121 (SEQ ID NO: 175) ou GN123 (SEQ ID NO: 173) para ressensibilizar ao carbapenema cepas de P. aeruginosa resistentes ao carbapenema, foi avaliada pela combinação de cada uma das lisinas acima mencionadas com dois carbapenemas, isto é, imipenema (IPM) ou meropenema (MEM). Até sete isolados resistentes aos carbapenemas foram avaliados. A ressensibilização ocorre em combinações sinérgicas na qual os valores de MIC de carbapenema caem nos pontos de interrupção estabelecidos abaixo, por exemplo, um valor de MIC de < 2 para isolados sensíveis ao carbapenema, um valor de MIC de 4 para isolados de carbapenema intermediariamente sensíveis e um valor de MIC de > 8 para isolados resistentes ao carbapenema. Veja Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), CLSI. 2019. M100 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 29ª Edição. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA.
[00249] Como indicado nas Tabelas 6 a 9, condições sinérgicas com GN123 (SEQ ID NO: 173) ou GN121 (SEQ ID NO: 175) demonstraram reduções de MICS de IPM e MEM para valores de ponto de interrupção abaixo para cada um dos sete carbapenemas examinados. Estas observações são consistentes com ressensibilização. Exemplo 4. Ressensibilização de cepas clínicas resistentes ao carbapenema usando antibióticos em conjunto com construções adicionais de lisinas ou lisina-AMP.
[00250] A capacidade de GN351 (SEQ ID NO: 32), GN370 (SEQ ID NO: 44) ou GN428 (SEQ ID NO: 60) para ressensibilizar ao carbapanema cepas clínicas resistentes ao carbapenema foi avaliada combinando cada uma das construções de lisinas ou polipeptídeo de AMP-lisina acima mencionadas com IPM ou MEM. WC-452, um isolado resistente a carbapenema, foi avaliado. Como notado no Exemplo 3, acima, ressensibilização ocorre em combinações sinérgicas nas quais os valores de MIC de carbapenem caem abaixo dos pontos de interrupção anteriormente descritos.
[00251] Como indicado na Tabela 10, condições sinérgicas com GN351 (SEQ ID NO: 32), GN370 (SEQ ID NO: 44) ou GN428 (SEQ ID NO: 60) demonstraram reduções de MICS de IPM e MEM para abaixo dos valores de ponto de interrupção para WC-452. Estas observações são consistentes com ressensibilização.
[00252] Os resultados nos Exemplos 3 e 4 indicam que as construções de lisinas e polipeptídeo de AMP-lisina descritas aqui podem ressensibilizar P. aeruginosa aos antibióticos de carbapenema, levando MICs para abaixo dos valores de ponto de interrupção in vitro. Esta nova capacidade de construções de lisinas e polipeptídeo de AMP- lisina de ressensibilizar cepas resistentes aos antibióticos convencionais indica o benefício destes biológicos como terapêuticos para combater e reverter resistência antimicrobiana. Tabela 4. Sensibilidade de construções de lisinas ou polipeptídeo de AMP-lisina em soro humano MIC (mg/mL) CAA MIC CAA/HuS GN # MW pI (mg/mL) MIC (mg/mL) GN168 (SEQ ID NO: 2) 22299,78 11,6 8 N.D. GN176 (SEQ ID NO: 4) 19370 9,8 8 N.D. GN178 (SEQ ID NO: 6) 19290,04 9,7 8 4 GN217 (SEQ ID NO: 8) 13879,91 9,4 4 0,125 GN218 (SEQ ID NO: 10) 16038,43 9,8 8 1 GN223 (SEQ ID NO: 12) 18570,35 10,3 32 2 GN239 (SEQ ID NO: 14) 16836,42 10,2 4 0,25
MIC (mg/mL) CAA MIC CAA/HuS GN # MW pI (mg/mL) MIC (mg/mL) GN243 (SEQ ID NO; 16) 18880,02 10,5 32 0,5 GN280 (SEQ ID NO: 18) 17928,9 10,2 4 0,5 GN281 (SEQ ID NO: 20) 18188,07 10,2 2 0,5 GN316 (SEQ ID NO: 22) 28672,72 8,7 16 0,125 GN329 (SEQ ID NO: 26) 20810,83 8,9 4 0,25 GN333 (SEQ ID NO: 28) 20918,79 8,9 8 0,06 GN349 (SEQ ID NO: 30) 34169,19 9,5 16 1 GN351 (SEQ ID NO: 32) 33866,76 9,9 8 0,125 GN352 (SEQ ID NO: 34) 33398,27 8,9 4 0,5 GN353 (SEQ ID NO: 36) 33485,42 8,9 4 0,25 GN357 (SEQ ID NO: 38) 30891,39 9,3 16 0,25 GN359 (SEQ ID NO: 40) 31094,67 8,7 8 0,25 GN369 (SEQ ID NO: 42) 30934,63 8,8 8 0,0625 GN370 (SEQ ID NO: 44) 19140,86 10,7 16 4 GN371 (SEQ ID NO: 46) 17530,95 8,7 >32 0,5 GN394 (SEQ ID NO: 48) 28659,62 7,5 8 0,5 GN396 (SEQ ID NO: 50) 28659,62 7,5 8 0,25 GN408 (SEQ ID NO: 52) 28653,66 7,8 2 0,125 GN418 (SEQ ID NO: 54) 28659,62 7,5 32 0,06 GN424 (SEQ ID NO: 56) 29118,75 8,4 ND ND GN425 (SEQ ID NO: 58) 29895,81 7,5 2 0,25 GN428 (SEQ ID NO: 60) 28814,89 8,9 8 0,125 GN93 (SEQ ID NO: 62) 22959,07 9,6 128 8 GN431 (SEQ ID NO: 64) 28715,73 8,5 8 0,0625 GN486 (SEQ ID NO: 66) 17,8 10,6 2 0,125 GN485 (SEQ ID NO: 68) 8,312 9,8 n.d. n.d.
Tabela 5. Sinergia entre antibióticos e construções de lisinas ou polipeptídeo de AMP-lisina GN121(SE GN351(SE GN370(SE GN76 (SEQ GN123(SEQ GN428(SEQ Q ID NO: Q ID NO: Q ID NO: Antibiótico ID NO: ID NO: 173) ID NO: 60) 175) 32) 44) 203)(MIC) (MIC) (MIC) (MIC) (MIC) (MIC) Amicacina 0,281 0,375 0,250 0,250 0,125 0,281 Azitromicina 0,156 0,188 0,125 0,125 0,188 0,250 Aztreonam 0,281 0,625 0,375 0,125 0,188 0,156 Ciprofloxacina 0,281 0,313 0,375 0,375 0,281 0,125
GN121(SE GN351(SE GN370(SE GN76 (SEQ GN123(SEQ GN428(SEQ Q ID NO: Q ID NO: Q ID NO: Antibiótico ID NO: ID NO: 173) ID NO: 60) 175) 32) 44) 203)(MIC) (MIC) (MIC) (MIC) (MIC) (MIC) Colistina 0,250 0,046 0,188 0,046 0,046 0,094 Fosfomicina 0,125 0,375 0,250 0,500 0,375 0,313 Gentamicina 0,313 0,375 0,375 0,125 0,250 0,250 Imipenem 0,254 0,375 0,188 0,156 0,094 0,188 Meropenem 0,375 0,313 0,125 0,188 0,125 0,188 Piperacilina 0,375 0,375 0,500 0,281 0,125 0,375 Rifampicina 0,281 0,313 0,156 0,250 0,250 0,500 Tobramicina 0,281 0,188 0,188 0,153 0,188 0,188
Tabela 6. Ressensibilização bacteriana Gram-negativa usando uma combinação de IMIPENEM e GN123 (SEQ ID NO: 173) MIC de IMIPENEM (µg/mL) GN123 (µg/mL)
Isolado Sozinho Combinação Sozinho Combinação FICI PA19 32 (R) 0,5 (S) 8 0,125 0,03
Análise de isolados de CARBAPENEMR adicionais: PA20 16 (R) 1(S) 16 2 0,188 PA21 32 (R) 0,5(S) 8 1 0,141 PA22 16 (R) 2(S) 16 1 0,188 PA23 8 (R) 0,25(S) 8 2 0,281 PA24 32 (R) 2(S) 16 2 0,188 WC-452 16 (R) 1(S) 16 2 0,188
(R) = resistente (S)= sensível Tabela 7. Ressensibilização bacteriana Gram-negativa usando uma combinação de MEROPENEM e GN123 (SEQ ID NO: 173) MIC de MEROPENEM GN123 (µg/mL) (µg/mL) Isolado Sozinho Combinação Sozinho Combinação FICI PA19 32 (R) 0,5 (S) 8 0,25 0,046 PA20 16 (R) 0,5 (S) 16 1 0,094 PA21 32 (R) 1 (S) 8 1 0,156 PA22 16 (R) 1(S) 16 1 0,125
MIC de MEROPENEM GN123 (µg/mL) (µg/mL) Isolado Sozinho Combinação Sozinho Combinação FICI PA23 16 (R) 0,5 (S) 8 1 0,156 PA24 32 (R) 2 (S) 16 0,5 0,094 WC-452 16 (R) 1 (S) 16 1 0,125
(R) = resistente (S)= sensível Tabela 8. Ressensibilização bacteriana Gram-negativa usando uma combinação de IMIPENEM e GN121(SEQ ID NO: 175) MIC de Imipenem GN121 (µg/mL) (µg/mL) Isolado Sozinha Combinação Sozinho Combinação FICI PA19 32 (R) 1 (S) 1 0,125 0,155 PA20 16 (R) 0,5 (S) 1 0,25 0,265 PA21 32 (R) 1 (S) 1 0,125 0,155 PA22 32 (R) 2 (S) 2 0,25 0,188 PA23 16 (R) 0,125 (S) 1 0,25 0,257 PA24 32 (R) 1(S) 1 0,125 0,155
(R) = resistente (S)= sensível Tabela 9. Ressensibilização bacteriana Gram-negativa usando uma combinação de MEROPENEM e GN121(SEQ ID NO: 175) Meropenem MIC GN121 (µg/mL) (µg/mL) Isolado Sozinho Combinação Sozinho Combinação FICI PA19 32 (R) 1 2 0,5 0,281 PA20 16 (R) 1 2 0,5 0,313 PA21 32 (R) 2 1 0,125 0,188 PA22 16 (R) 1 1 0,25 0,313 PA23 16 (R) 2 2 0,5 0,375 PA24 32 (R) 1 1 0,125 0,156 WC-452 16 (R) 1 1 0,06 0,123
(R) = resistente; (S)= sensível Tabela 10. Ressensibilização bacteriana Gram-negativa usando combinações de MEM ou IPM e GN351 (SEQ ID NO: 32), GN370 (SEQ ID NO: 44), ou GN428 (SEQ ID NO: 60) Combinações MIC de Antibiótico MIC de vs.
WC-452 Lisina Sozinho Combinação Sozinho Combinação FICI IPM+GN351 16 (R) 0,5 (S) 1 0,125 0,156 IPM+GN370 16 (R) 0,5 (S) 2 0,125 0,094 IPM+GN428 16 (R) 1(S) 2 0,25 0,188 MEM+GN351 16 (R) 1(S) 1 0,125 0,188 MEM+GN370 16 (R) 0,5(S) 2 0,125 0,125 MEM+GN428 16 (R) 1(S) 2 0,25 0,188

Claims (41)

REIVINDICAÇÕES
1. Constructo polipeptídico de lisina-AMP, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um primeiro componente compreendendo a sequência de polipeptídeo de: (i) uma lisina selecionada do grupo que consiste em GN76 (SEQ ID NO: 203), GN4 (SEQ ID NO: 74), GN146 (SEQ ID NO: 78), GN14 (SEQ ID NO: 124), GN37 (SEQ ID NO: 84) opcionalmente com uma única mutação de aumento de pI, GN76 (SEQ ID NO: 203), GN316 (SEQ ID NO: 22) opcionalmente com uma única mutação de ponto, lisina Pap2_gp17 (SEQ ID NO: 96), GN329 (SEQ ID NO: 26), GN424 (SEQ ID NO: 56), GN202 (SEQ ID NO: 118), GN425 (SEQ ID NO: 58), GN428 (SEQ ID NO: 60), GN431 (SEQ ID NO: 64), GN486 (SEQ ID NO: 66), GN333 (SEQ ID NO: 28), GN485 (SEQ ID NO: 68), GN123 (SEQ ID NO: 173) e GN121 (SEQ ID NO: 175);ou (ii) um polipeptídeo apresentando atividade de lisina e apresentando pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de polipeptídeo de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 203, 74, 78, 124, 84, 22, 96, 26, 56, 118, 58, 60, 64, 66, 28, 68, 173 ou 175; ou (iii) um fragmento ativo da lisina; e (b) um segundo componente compreendendo a sequência de polipeptídeo de: (i) pelo menos um peptídeo antimicrobiano (AMP) selecionado do grupo que consiste em Chp1 (SEQ ID NO: 133), Chp2 (SEQ ID NO: 70), CPAR39 (SEQ ID NO: 135), Chp3 (SEQ ID NO: 137), Chp4 (SEQ ID NO: 102), Chp6 (SEQ ID NO: 106), Chp7 (SEQ ID NO: 139), Chp8 (SEQ ID NO: 141), Chp9 (SEQ ID NO: 143), Chp10 (SEQ ID NO: 145), Chp11 (SEQ ID NO: 147), Chp12 (SEQ ID NO: 149), Gkh1 (SEQ ID NO: 151), Gkh2 (SEQ ID NO: 90), Unp1 (SEQ ID NO: 153),
Ecp1 (SEQ ID NO: 155), Ecp2 (SEQ ID NO: 104), Tma1 (SEQ ID NO: 157), Osp1 (SEQ ID NO: 108), Unp2 (SEQ ID NO: 159), Unp3 (SEQ ID NO: 161), Gkh3 (SEQ ID NO: 163), Unp5 (SEQ ID NO: 165), Unp6 (SEQ ID NO: 167), Spi1 (SEQ ID NO: 169), Spi2 (SEQ ID NO: 171), Ecp3 (SEQ ID NO: 177), Ecp4 (SEQ ID NO: 179), ALCES1 (SEQ ID NO: 181), AVQ206 (SEQ ID NO: 183), AVQ244 (SEQ ID NO: 185), CDL907 (SEQ ID NO: 187), AGT915 (SEQ ID NO: 189), HH3930 (SEQ ID NO: 191), Fen7875 (SEQ ID NO: 193), SBR77 (SEQ ID NO: 195), Bdp1 (SEQ ID NO: 197), LVP1 (SEQ ID NO: 199), Lvp2 (SEQ ID NO: 201), um fragmento de esculentina (SEQ ID NO: 80), RI12 (SEQ ID NO: 88), TI15 (SEQ ID NO: 94), RI18 (SEQ ID NO: 92), FIRL (SEQ ID NO: 114), um fragmento de proteína de ligação a LPS (SEQ ID NO: 76), RR12whydro (SEQ ID NO: 110), derivado de peptídeo RI18 (SEQ ID NO: 131) e peptídeo catiônico (SEQ ID NO: 120) ou (ii) um polipeptídeo apresentando atividade de AMP, em que o polipeptídeo é pelo menos 80% idêntico a pelo menos uma das SEQ ID NOS: 133, 70, 135, 137, 102, 106, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 90, 153, 155, 104, 157, 108, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 80, 88, 94, 92, 114, 76, 110, 131 e 120, em que o constructo polipeptídico de lisina-AMP compreende pelo menos uma atividade selecionada dentre inibição do crescimento bacteriano de P. aeruginosa, redução de uma população bacteriana de P. aeruginosa e/ou morte do P. aeruginosa na ausência e/ou presença de soro humano.
2. Constructo polipeptídico de lisina-AMP, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro componente é selecionado do grupo que consiste em GN394 (SEQ ID NO: 48), GN396 (SEQ ID NO: 50), GN408 (SEQ ID NO: 52) e GN418 (SEQ ID NO: 54).
3. Constructo polipeptídico de lisina-AMP, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a construção também compreende pelo menos um componente de estabilização da estrutura para manter pelo menos uma porção da estrutura do primeiro e/ou segundo componente na construção substancialmente igual a uma lisina não conjugada e/ou AMP.
4. Constructo polipeptídico de lisina-AMP, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o referido pelo menos um componente de estabilização da estrutura é um peptídeo.
5. Constructo polipeptídico de lisina-AMP, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é selecionado do grupo que consiste em TAGGTAGG (SEQ ID NO: 72), IGEM (BBa_K1485002) (SEQ ID NO: 82), PPTAGGTAGG (SEQ ID NO: 98), IGEM +PP (resíduos 44-58 de SEQ ID NO: 16) e AGAGAGAGAGAGAGAGAS (SEQ ID NO: 122).
6. Constructo polipeptídico de lisina-AMP, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a GN37 lisina (SEQ ID NO:84) compreende uma única mutação de crescimento de PI e em que o GN316 (SEQ ID NO: 22) compreende uma única mutação de ponto, em que o GN37 (SEQ ID NO: 84) com a única mutação de aumento de PI é GN217 (SEQ ID NO: 8) e em que o GN316 (SEQ ID NO: 22) com a única mutação de ponto é selecionado do grupo que consiste em GN396 (SEQ ID NO: 50), GN408 (SEQ ID NO: 52), GN418 (SEQ ID NO: 54) e GN394 (SEQ ID NO: 48).
7. Constructo polipeptídico de lisina-AMP, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende (i) uma sequência de polipeptídeo selecionada do grupo que consiste em GN168 (SEQ ID NO: 2), GN176 (SEQ ID NO: 4), GN178 (SEQ ID NO: 6)GN218 (SEQ ID NO: 10), GN223 (SEQ ID NO: 12), GN239 (SEQ ID NO: 14), GN243 (SEQ ID NO: 16), GN280 (SEQ
ID NO: 18), GN281 (SEQ ID NO: 20), GN349 (SEQ ID NO: 30), GN351 (SEQ ID NO: 32), GN352 (SEQ ID NO: 34), GN353 (SEQ ID NO: 36), GN357 (SEQ ID NO: 38), GN359 (SEQ ID NO: 40), GN369 (SEQ ID NO: 42), GN370 (SEQ ID NO: 44), GN371 (SEQ ID NO: 46), GN428 (SEQ ID NO: 60), e GN93 (SEQ ID NO: 62), ou (ii) um polipeptídeo apresentando atividade de lisina e pelo menos 80% de identidade com pelo menos uma das SEQ ID NOS: 2, 4 ,6, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 60 e 62.
8. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma lisina selecionada do grupo que consiste em GN217 lisina (SEQ ID NO: 8), GN394 lisina (SEQ ID NO: 48), GN396 lisina (SEQ ID NO: 50), GN408 lisina (SEQ ID NO: 52), GN418 lisina (SEQ ID NO: 54), e GN486 (SEQ ID NO: 66) ou um fragmento ativo das mesmas, em que a lisina ou fragmento ativo da mesma compreende pelo menos uma atividade selecionada dentre inibição de de crescimento bacteriano de P. aeruginosa, redução de uma população bacteriana de P. aeruginosa e/ou morte do P. aeruginosa na ausência e/ou presença de soro humano.
9. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico codificando um constructo polipeptídico de lisina-AMP, a molécula de ácido nucleico compreendendo: (a) uma primeira molécula de ácido nucleico codificando um primeiro componente compreendendo: (i) uma lisina selecionada do grupo que consiste em GN76 (SEQ ID NO: 203), GN4 (SEQ ID NO: 74), GN146 (SEQ ID NO: 78), GN14 (SEQ ID NO: 124), GN37 (SEQ ID NO: 84) opcionalmente com uma única mutação de aumento de pI, GN316 (SEQ ID NO: 22) opcionalmente com uma única mutação de ponto, lisina Pap2_gp17 (SEQ ID NO: 96), GN329 (SEQ ID NO: 26), GN424 (SEQ ID NO: 56),
GN202 (SEQ ID NO: 118), GN425 (SEQ ID NO: 58), GN428 (SEQ ID NO: 60), GN431 (SEQ ID NO: 64), GN486 (SEQ ID NO: 66), GN333 (SEQ ID NO: 28), GN485 (SEQ ID NO: 68), GN123 (SEQ ID NO: 173) e GN121 (SEQ ID NO: 175); ou (ii) um polipeptídeo apresentando atividade de lisina, em que o polipeptídeo é pelo menos 80% idêntico a pelo menos uma das SEQ ID NOS: 203, 74, 78, 124, 84, 22, 96, 26, 56, 118, 58, 60, 64, 66,28, 68, 173 ou 175; ou (iii) um fragmento ativo da lisina; (b) uma segunda molécula de ácido nucleico codificando um segundo componente compreendendo a sequência de polipeptídeo de: (i) pelo menos um peptídeo antimicrobiano (AMP) selecionado do grupo que consiste em Chp1 (SEQ ID NO: 133), Chp2 (SEQ ID NO: 70), CPAR39 (SEQ ID NO: 135), Chp3 (SEQ ID NO: 137), Chp4 (SEQ ID NO: 102), Chp6 (SEQ ID NO: 106), Chp7 (SEQ ID NO: 139), Chp8 (SEQ ID NO: 141), Chp9 (SEQ ID NO: 143), Chp10 (SEQ ID NO: 145), Chp11 (SEQ ID NO: 147), Chp12 (SEQ ID NO: 149), Gkh1 (SEQ ID NO: 151), Gkh2 (SEQ ID NO: 90), Unp1 (SEQ ID NO: 153), Ecp1 (SEQ ID NO: 155), Ecp2 (SEQ ID NO: 104), Tma1 (SEQ ID NO: 157), Osp1 (SEQ ID NO: 108), Unp2 (SEQ ID NO: 159), Unp3 (SEQ ID NO: 161), Gkh3 (SEQ ID NO: 163), Unp5 (SEQ ID NO: 165), Unp6 (SEQ ID NO: 167), Spi1 (SEQ ID NO: 169), Spi2 (SEQ ID NO: 171), Ecp3 (SEQ ID NO: 177), Ecp4 (SEQ ID NO: 179), ALCES1 (SEQ ID NO: 181), AVQ206 (SEQ ID NO: 183), AVQ244 (SEQ ID NO: 185), CDL907 (SEQ ID NO: 187), AGT915 (SEQ ID NO: 189), HH3930 (SEQ ID NO: 191), Fen7875 (SEQ ID NO: 193), SBR77 (SEQ ID NO: 195), Bdp1 (SEQ ID NO: 197), LVP1 (SEQ ID NO: 199), Lvp2 (SEQ ID NO: 201), um fragmento de esculentina (SEQ ID NO: 80), RI12 (SEQ ID NO: 88), TI15 (SEQ ID NO: 94), RI18 (SEQ ID NO: 92), FIRL (SEQ ID NO: 114), um fragmento de proteína de ligação a LPS (SEQ ID NO: 76), RR12whydro
(SEQ ID NO: 110), derivado de peptídeo RI18 (SEQ ID NO: 131) e peptídeo catiônico (SEQ ID NO: 120) ou (ii) um polipeptídeo apresentando atividade de AMP, em que o polipeptídeo é pelo menos 80% idêntico a pelo menos uma das SEQ ID NOS: 133, 70, 135, 137, 102, 106, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 90, 153, 155, 104, 157, 108, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 80, 88, 94, 92, 114, 76, 110, 131 e 120, em que o constructo polipeptídico de lisina-AMP compreende pelo menos uma atividade selecionada dentre inibição do crescimento bacteriano de P. aeruginosa, redução de uma população bacteriana de P. aeruginosa e/ou morte do P. aeruginosa na ausência e/ou presença de soro humano.
10. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico ainda compreende (c) uma terceira molécula de ácido nucleico codificando um terceiro componente compreendendo pelo menos um componente de estabilização da estrutura, em que o pelo menos um componente de estabilização da estrutura mantém pelo menos uma porção da estrutura do primeiro e/ou segundo componente na construção substancialmente igual a uma lisina não conjugada e/ou AMP.
11. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um componente de estabilização da estrutura compreende um peptídeo.
12. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é selecionado do grupo que consiste em TAGGTAGG (SEQ ID NO: 72), IGEM (BBa_K1485002) (SEQ ID NO: 82), PPTAGGTAGG (SEQ ID NO: 98), IGEM +PP (resíduos 44-58 de SEQ ID NO: 16) e AGAGAGAGAGAGAGAGAS (SEQ ID NO: 122).
13. Polinucleotídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que o GN37 (SEQ ID NO:84) compreende uma única mutação de crescimento de PI e em que o GN316 (SEQ ID NO: 22) compreende uma única mutação de ponto, em que o GN37 (SEQ ID NO: 84) com a única mutação de aumento de PI é GN217 (SEQ ID NO: 8) e em que o GN316 (SEQ ID NO: 22) com a única mutação de ponto é selecionado do grupo que consiste em GN396 (SEQ ID NO: 50), GN408 (SEQ ID NO: 52), GN418 (SEQ ID NO: 54) e GN394 (SEQ ID NO: 48).
14. Polinucleotídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico codificando o constructo polipeptídico de lisina-AMP é (i) selecionado do grupo que consiste em GN168 (SEQ ID NO: 2), GN176 (SEQ ID NO: 4), GN178 (SEQ ID NO: 6), GN218 (SEQ ID NO: 10), GN223 (SEQ ID NO: 12), GN239(SEQ ID NO: 14), GN243(SEQ ID NO: 16), GN280 (SEQ ID NO: 18), GN281 (SEQ ID NO: 20), GN349 (SEQ ID NO: 30), GN351 (SEQ ID NO: 32), GN352 (SEQ ID NO: 34), GN353 (SEQ ID NO: 36), GN357(SEQ ID NO: 38), GN359 lisina (SEQ ID NO: 40), GN369 lisina (SEQ ID NO: 42), GN370 lisina (SEQ ID NO: 44), GN371 lisina (SEQ ID NO: 46) e GN93 lisina (SEQ ID NO: 62); ou (ii) uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo apresentando atividade de lisina e apresentando pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, ou 62.
15. Sequência de polinucleotídeo isolado, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico codificando a lisina selecionada do grupo que consiste em GN217 lisina (SEQ ID NO: 8), GN394 lisina (SEQ ID NO: 48), GN396 lisina (SEQ ID NO: 50),
GN408 lisina (SEQ ID NO: 52), GN418 lisina (SEQ ID NO: 54), e GN486 (SEQ ID NO: 66) ou um fragmento ativo das mesmas, em que a lisina ou fragmento ativo da mesma inibe o crescimento bacteriano de P. aeruginosa, reduz uma população bacteriana de P. aeruginosa e/ou mata P. aeruginosa na ausência e/ou presença de soro humano.
16. Polinucleotídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 15, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo isolado compreende DNA.
17. Polinucleotídeo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 15, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo isolado compreende cDNA.
18. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de polinucleotídeo isolado, como definida em qualquer uma das reivindicações 9 a 17.
19. Vetor recombinante, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a sequência de polinucleotídeo isolado é operativamente ligada a um promotor heterólogo.
20. Vetor recombinante, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que o vetor recombinante é um vetor de expressão recombinante.
21. Célula hospedeira isolada, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor recombinante, como definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 20.
22. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma lisina isolada e/ou um constructo polipeptídico de lisina - peptídeo antimicrobiano (AMP) e um veículo farmaceuticamente aceitável em que a lisina isolada compreende pelo menos um dentre: (i) GN121 (SEQ ID NO: 175), GN123 (SEQ ID NO: 173), GN217 (SEQ ID NO: 8), variante de GN316 (SEQ ID NO: 24), GN316
(SEQ ID NO: 22), GN329 (SEQ ID NO: 26), GN333 (SEQ ID NO: 28), GN394 (SEQ ID NO: 48), GN396 (SEQ ID NO: 50), GN408 (SEQ ID NO: 52), GN418 (SEQ ID NO: 54), GN424 (SEQ ID NO: 56), GN425 (SEQ ID NO:58), GN428 (SEQ ID NO: 60), GN431 (SEQ ID NO: 64), GN486 (SEQ ID NO: 66), GN485 (SEQ ID NO: 68), lisina PaP2_gp17 (SEQ ID NO: 96), (ii) um fragmento ativo do mesmo, ou (iii) um polipeptídeo apresentando atividade de lisina e pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de polipeptídeo de pelo menos uma das SEQ ID NOS:175, 173, 8, 24, 22, 26, 28, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 64, 66, 68,ou 96; em que o constructo polipeptídico de lisina-AMP compreende: (a) um primeiro componente compreendendo a sequência de polipeptídeo de: (i) uma lisina selecionada do grupo que consiste em GN76 (SEQ ID NO: 203), GN4 (SEQ ID NO: 74), GN146 (SEQ ID NO: 78), GN14 (SEQ ID NO: 124), GN37 (SEQ ID NO: 84) opcionalmente com uma única mutação de aumento de pI, GN316 (SEQ ID NO: 22) opcionalmente com uma única mutação de ponto, lisina Pap2_gp17 (SEQ ID NO: 96), GN329 (SEQ ID NO: 26), GN424 (SEQ ID NO: 56), GN202 (SEQ ID NO: 118), GN425 (SEQ ID NO: 58), GN428 (SEQ ID NO: 60), GN431 (SEQ ID NO: 64), GN486 (SEQ ID NO: 66), GN333 (SEQ ID NO: 28), GN485 (SEQ ID NO: 68), GN123 (SEQ ID NO: 173) e GN121 (SEQ ID NO: 175); ou (ii) um polipeptídeo apresentando atividade de lisina e apresentando pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de polipeptídeo de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 203, 74, 78, 124, 84, 22, 26, 56, 118, 58, 60, 64, 66, 28, 68, 173 ou 175; ou (iii) um fragmento ativo da lisina; e
(b) um segundo componente compreendendo a sequência de polipeptídeo de: (i) pelo menos um peptídeo antimicrobiano (AMP) selecionado do grupo que consiste em Chp1 (SEQ ID NO: 133), Chp2 (SEQ ID NO: 70), CPAR39 (SEQ ID NO: 135), Chp3 (SEQ ID NO: 137), Chp4 (SEQ ID NO: 102), Chp6 (SEQ ID NO: 106), Chp7 (SEQ ID NO: 139), Chp8 (SEQ ID NO: 141), Chp9 (SEQ ID NO: 143), Chp10 (SEQ ID NO: 145), Chp11 (SEQ ID NO: 147), Chp12 (SEQ ID NO: 149), Gkh1 (SEQ ID NO: 151), Gkh2 (SEQ ID NO: 90), Unp1 (SEQ ID NO: 153), Ecp1 (SEQ ID NO: 155), Ecp2 (SEQ ID NO: 104), Tma1 (SEQ ID NO: 157), Osp1 (SEQ ID NO: 108), Unp2 (SEQ ID NO: 159), Unp3 (SEQ ID NO: 161), Gkh3 (SEQ ID NO: 163), Unp5 (SEQ ID NO: 165), Unp6 (SEQ ID NO: 167), Spi1 (SEQ ID NO: 169), Spi2 (SEQ ID NO: 171), Ecp3 (SEQ ID NO: 177), Ecp4 (SEQ ID NO: 179), ALCES1 (SEQ ID NO: 181), AVQ206 (SEQ ID NO: 183), AVQ244 (SEQ ID NO: 185), CDL907 (SEQ ID NO: 187), AGT915 (SEQ ID NO: 189), HH3930 (SEQ ID NO: 191), Fen7875 (SEQ ID NO: 193), SBR77 (SEQ ID NO: 195), Bdp1 (SEQ ID NO: 197), LVP1 (SEQ ID NO: 199), Lvp2 (SEQ ID NO: 201), um fragmento de esculentina (SEQ ID NO: 80), RI12 (SEQ ID NO: 88), TI15 (SEQ ID NO: 94), RI18 (SEQ ID NO: 92), FIRL (SEQ ID NO: 114), um fragmento de proteína de ligação a LPS (SEQ ID NO: 76), RR12whydro (SEQ ID NO: 110), derivado de peptídeo RI18 (SEQ ID NO: 131) e peptídeo catiônico (SEQ ID NO: 120) ou (ii) um polipeptídeo tendo atividade de AMP, em que o polipeptídeo é pelo menos 80% idêntico a pelo menos uma das SEQ ID NOS: 133, 70, 135, 137, 102, 106, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 90, 153, 155, 104, 157, 108, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 80, 88, 94, 92, 114, 76, 110, 131 e 120, em que a composição farmacêutica inibe o crescimento bacteriano de P. aeruginosa, reduz uma população bacteriana de P.
aeruginosa e/ou mata P. aeruginosa na ausência e/ou presença de soro humano.
23. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o constructo polipeptídico de lisina-AMP também compreende pelo menos um componente de estabilização da estrutura para manter pelo menos uma porção da estrutura do primeiro e/ou segundo componente na construção substancialmente igual àquela na lisina não conjugada e/ou AMP.
24. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um componente de estabilização da estrutura é um peptídeo.
25. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o peptídeo é selecionado do grupo que consiste em TAGGTAGG (SEQ ID NO: 72), IGEM (BBa_K1485002) (SEQ ID NO: 82), PPTAGGTAGG (SEQ ID NO: 98), IGEM +PP (resíduos 44-58 de SEQ ID NO: 16) e AGAGAGAGAGAGAGAGAS (SEQ ID NO: 122).
26. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 25, caracterizada pelo fato de que a lisina é selecionada do grupo que consiste em GN316 (SEQ ID NO: 22), GN329 (SEQ ID NO: 26), GN333 (SEQ ID NO: 28), GN424 (SEQ ID NO: 56), GN425 (SEQ ID NO:58), GN428 (SEQ ID NO: 60), GN431 (SEQ ID NO: 64), GN485 (SEQ ID NO: 68), PaP2_gp17 lisina (SEQ ID NO: 96) e um fragmento ativo da mesma.
27. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a lisina ou fragmento ativo da mesma compreende pelo menos uma substituição de aminoácido relativa às SEQ ID NOS: 22, 26, 28, 56, 58, 60, 64,68 ou 96.
28. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 27, caracterizada pelo fato de que o constructo polipeptídico de lisina-AMP compreende a sequência de polipeptídeo selecionada de pelo menos um dentre GN168 (SEQ ID NO: 2), GN176 (SEQ ID NO: 4), GN178 (SEQ ID NO: 6)GN218 (SEQ ID NO: 10), GN223 (SEQ ID NO: 12), GN239 (SEQ ID NO: 14), GN243 (SEQ ID NO: 16), GN280 (SEQ ID NO: 18), GN281 (SEQ ID NO: 20), GN349 (SEQ ID NO: 30), GN351 (SEQ ID NO: 32), GN352 (SEQ ID NO: 34), GN353 (SEQ ID NO: 36), GN357 (SEQ ID NO: 38), GN359 (SEQ ID NO: 40), GN369 (SEQ ID NO: 42), GN370 (SEQ ID NO: 44), GN371 (SEQ ID NO: 46), GN428 (SEQ ID NO: 60), GN93 (SEQ ID NO: 62), ou a sequência de polipeptídeo apresentando atividade de lisina e pelo menos 80% de identidade para pelo menos uma das SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 60 e 62.
29. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 28, caracterizada pelo fato de que é formulada como uma solução, uma suspensão, uma emulsão, um pó inalável, um aerossol, ou um spray.
30. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 29, caracterizada pelo fato de que composição farmacêutica ainda compreende um antibiótico adequado para o tratamento de bactérias Gram-negativas.
31. Método de tratamento de uma infecção bacteriana causada por uma bactéria Gram-negativa, caracterizado pelo fato de que a bactéria Gram-negativa compreende P. aeruginosa e opcionalmente uma ou mais espécies adicionais de bactérias Gram- negativas, em que o método compreende: administrar a um indivíduo diagnosticado com, em risco de, ou apresentando sintomas de uma infecção bacteriana, uma composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindicações 22 a 30.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a infecção bacteriana é uma infecção bacteriana patogênica tópica ou sistêmica.
33. Método para a prevenção ou tratamento de uma infecção bacteriana, caracterizado pelo fato de que compreende: coadministrar a um indivíduo diagnosticado com, em risco e, ou exibindo sintomas de uma infecção bacteriana, uma combinação de uma primeira quantidade eficaz de uma composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindicações 22 a 29, e uma segunda quantidade eficaz de um antibiótico adequado para o tratamento de uma infecção bateriana Gram-negativa.
34. Método para aumentar a eficácia de um antibiótico adequado para o tratamento de uma infecção bateriana Gram-negativa, caracterizado pelo fato de que compreende: coadministrar o antibiótico em combinação com uma composição contendo uma quantidade eficaz de uma lisina isolada e/ou um constructo polipeptídico de lisina-peptídeo antimicrobiano (AMP), em que a lisina isolada compreende pelo menos um dentre: (i) GN121 (SEQ ID NO: 175), GN123 (SEQ ID NO: 173), GN217 (SEQ ID NO: 8), variante de GN316 (SEQ ID NO: 24), GN316 (SEQ ID NO: 22), GN329 (SEQ ID NO: 26), GN333 (SEQ ID NO: 28), GN394 (SEQ ID NO: 48), GN396 (SEQ ID NO: 50), GN408 (SEQ ID NO: 52), GN418 (SEQ ID NO: 54), GN424 (SEQ ID NO: 56), GN425 (SEQ ID NO:58), GN428 (SEQ ID NO: 60), GN431 (SEQ ID NO: 64), GN486 (SEQ ID NO: 66), GN485 (SEQ ID NO: 68), lisina PaP2_gp17 (SEQ ID NO: 96), ou (ii) um fragmento ativo da mesma, ou (iii) um polipeptídeo apresentando atividade de lisina e pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de polipeptídeo de pelo menos uma das SEQ ID NOS:175, 173, 8, 24, 22,
26, 28, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 64, 66, 68,ou 96; em que o constructo polipeptídico de lisina-AMP compreende: (a) um primeiro componente compreendendo a sequência de polipeptídeo de: (i) uma lisina selecionada do grupo que consiste em GN76 (SEQ ID NO: 203), GN4 (SEQ ID NO: 74), GN146 (SEQ ID NO: 78), GN14 (SEQ ID NO: 124), GN37 (SEQ ID NO: 84) opcionalmente com uma única mutação de aumento de pI, GN316 (SEQ ID NO: 22) opcionalmente com uma única mutação de ponto, lisina Pap2_gp17 (SEQ ID NO: 96), GN329 (SEQ ID NO: 26), GN424 (SEQ ID NO: 56), GN202 (SEQ ID NO: 118), GN425 (SEQ ID NO: 58), GN428 (SEQ ID NO: 60), GN431 (SEQ ID NO: 64), GN486 (SEQ ID NO: 66), GN333 (SEQ ID NO: 28), GN485 (SEQ ID NO: 68), GN123 (SEQ ID NO: 173) e GN121 (SEQ ID NO: 175); ou (ii) um polipeptídeo apresentando atividade de lisina e apreentando pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de polipeptídeo de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 203, 74, 78, 124, 84, 22, 96, 26, 56, 118, 58, 60, 64, 66, 28, 68, 173 ou 175; ou (iii) um fragmento ativo da lisina; e (b) um segundo componente compreendendo a sequência de polipeptídeo de: (i) pelo menos um peptídeo antimicrobiano (AMP) selecionado do grupo que consiste em Chp1 (SEQ ID NO: 133), Chp2 (SEQ ID NO: 70), CPAR39 (SEQ ID NO: 135), Chp3 (SEQ ID NO: 137), Chp4 (SEQ ID NO: 102), Chp6 (SEQ ID NO: 106), Chp7 (SEQ ID NO: 139), Chp8 (SEQ ID NO: 141), Chp9 (SEQ ID NO: 143), Chp10 (SEQ ID NO: 145), Chp11 (SEQ ID NO: 147), Chp12 (SEQ ID NO: 149), Gkh1 (SEQ ID NO: 151), Gkh2 (SEQ ID NO: 90), Unp1 (SEQ ID NO: 153),
Ecp1 (SEQ ID NO: 155), Ecp2 (SEQ ID NO: 104), Tma1 (SEQ ID NO: 157), Osp1 (SEQ ID NO: 108), Unp2 (SEQ ID NO: 159), Unp3 (SEQ ID NO: 161), Gkh3 (SEQ ID NO: 163), Unp5 (SEQ ID NO: 165), Unp6 (SEQ ID NO: 167), Spi1 (SEQ ID NO: 169), Spi2 (SEQ ID NO: 171), Ecp3 (SEQ ID NO: 177), Ecp4 (SEQ ID NO: 179), ALCES1 (SEQ ID NO: 181), AVQ206 (SEQ ID NO: 183), AVQ244 (SEQ ID NO: 185), CDL907 (SEQ ID NO: 187), AGT915 (SEQ ID NO: 189), HH3930 (SEQ ID NO: 191), Fen7875 (SEQ ID NO: 193), SBR77 (SEQ ID NO: 195), Bdp1 (SEQ ID NO: 197), LVP1 (SEQ ID NO: 199), Lvp2 (SEQ ID NO: 201), um fragmento de esculentina (SEQ ID NO: 80), RI12 (SEQ ID NO: 88), TI15 (SEQ ID NO: 94), RI18 (SEQ ID NO: 92), FIRL (SEQ ID NO: 114), um fragmento de proteína de ligação a LPS (SEQ ID NO: 76), RR12whydro (SEQ ID NO: 110), derivado de peptídeo RI18 (SEQ ID NO: 131) e peptídeo catiônico (SEQ ID NO: 120) ou (ii) um polipeptídeo apresentando atividade de AMP, em que o polipeptídeo é pelo menos 80% idêntico a pelo menos uma das SEQ ID NOS: 133, 70, 135, 137, 102, 106, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 90, 153, 155, 104, 157, 108, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 80, 88, 94, 92, 114, 76, 110, 131 e 120, em que a composição compreende pelo menos uma atividade selecionada dentre inibição do crescimento bacteriano de P. aeruginosa, redução de uma população bacteriana de P. aeruginosa e/ou morte do P. aeruginosa na ausência e/ou presença de soro humano, e em que administração da combinação é mais eficaz na inibição do crescimento, ou redução da população, ou morte das bactérias Gram-negativas na presença ou ausência ou tanto na presença quanto na ausência de soro humano do que a administração ou do antibiótico ou da construção de lisina ou polipeptídeo de AMP-
lisina individualmente.
35. Método de inibição do crescimento, ou redução da população, ou morte de pelo menos uma espécie de bactérias Gram- negativas, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas é P. aeruginosa e opcionalmente uma ou mais espécies adicionais bactérias Gram-negativas, em que método compreende: contatar a bactéria com uma composição contendo uma quantidade eficaz de uma lisina isolada e/ou um constructo polipeptídico de lisina -peptídeo antimicrobiano (AMP), em que a lisina isolada compreende pelo menos um de: (i) GN121 (SEQ ID NO: 175), GN123 (SEQ ID NO: 173), GN217 (SEQ ID NO: 8), variante de GN316 (SEQ ID NO: 24), GN316 (SEQ ID NO: 22), GN329 (SEQ ID NO: 26), GN333 (SEQ ID NO: 28), GN394 (SEQ ID NO: 48), GN396 (SEQ ID NO: 50), GN408 (SEQ ID NO: 52), GN418 (SEQ ID NO: 54), GN424 (SEQ ID NO: 56), GN425 (SEQ ID NO:58), GN428 (SEQ ID NO: 60), GN431 (SEQ ID NO: 64), GN486 (SEQ ID NO: 66), GN485 (SEQ ID NO: 68), lisina PaP2_gp17 (SEQ ID NO: 96), ou (ii) um fragmento ativo da mesma, ou (iii) um polipeptídeo apresentando atividade de lisina e pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de polipeptídeo de pelo menos uma das SEQ ID NOS:175, 173, 8, 24, 22, 26, 28, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 64, 66, 68,ou 96; em que o constructo polipeptídico de lisina-AMP compreende: (a) um primeiro componente compreendendo a sequência de polipeptídeo de: (i) uma lisina selecionada do grupo que consiste em GN76 (SEQ ID NO: 203), GN4 (SEQ ID NO: 74), GN146 (SEQ ID NO: 78),
GN14 (SEQ ID NO: 124), GN37 (SEQ ID NO: 84) opcionalmente com uma única mutação de aumento de pI, GN316 (SEQ ID NO: 22) opcionalmente com uma única mutação de ponto, lisina Pap2_gp17 (SEQ ID NO: 96), GN329 (SEQ ID NO: 26), GN424 (SEQ ID NO: 56), GN202 (SEQ ID NO: 118), GN425 (SEQ ID NO: 58), GN428 (SEQ ID NO: 60), GN431 (SEQ ID NO: 64), GN486 (SEQ ID NO: 66), GN333 (SEQ ID NO: 28), GN485 (SEQ ID NO: 68), GN123 (SEQ ID NO: 173) e GN121 (SEQ ID NO: 175); ou (ii) um polipeptídeo apresenta atividade de lisina e apresenta pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de polipeptídeo de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 203, 74, 78, 124, 84, 22, 96, 26, 56, 118, 58, 60, 64, 66, 28, 68, 173 ou 175; ou (iii) um fragmento ativo da lisina; e (b) um segundo componente compreendendo a sequência de polipeptídeo de: (i) pelo menos um peptídeo antimicrobiano (AMP) selecionado do grupo que consiste em Chp1 (SEQ ID NO: 133), Chp2 (SEQ ID NO: 70), CPAR39 (SEQ ID NO: 135), Chp3 (SEQ ID NO: 137), Chp4 (SEQ ID NO: 102), Chp6 (SEQ ID NO: 106), Chp7 (SEQ ID NO: 139), Chp8 (SEQ ID NO: 141), Chp9 (SEQ ID NO: 143), Chp10 (SEQ ID NO: 145), Chp11 (SEQ ID NO: 147), Chp12 (SEQ ID NO: 149), Gkh1 (SEQ ID NO: 151), Gkh2 (SEQ ID NO: 90), Unp1 (SEQ ID NO: 153), Ecp1 (SEQ ID NO: 155), Ecp2 (SEQ ID NO: 104), Tma1 (SEQ ID NO: 157), Osp1 (SEQ ID NO: 108), Unp2 (SEQ ID NO: 159), Unp3 (SEQ ID NO: 161), Gkh3 (SEQ ID NO: 163), Unp5 (SEQ ID NO: 165), Unp6 (SEQ ID NO: 167), Spi1 (SEQ ID NO: 169), Spi2 (SEQ ID NO: 171), Ecp3 (SEQ ID NO: 177), Ecp4 (SEQ ID NO: 179), ALCES1 (SEQ ID NO: 181), AVQ206 (SEQ ID NO: 183), AVQ244 (SEQ ID NO: 185), CDL907 (SEQ ID NO: 187), AGT915 (SEQ ID NO: 189), HH3930 (SEQ ID NO: 191), Fen7875 (SEQ ID NO: 193), SBR77 (SEQ ID NO: 195), Bdp1 (SEQ ID
NO: 197), LVP1 (SEQ ID NO: 199), Lvp2 (SEQ ID NO: 201), um fragmento de esculentina (SEQ ID NO: 80), RI12 (SEQ ID NO: 88), TI15 (SEQ ID NO: 94), RI18 (SEQ ID NO: 92), FIRL (SEQ ID NO: 114), um fragmento de proteína de ligação a LPS (SEQ ID NO: 76), RR12whydro (SEQ ID NO: 110), derivado de peptídeo RI18 (SEQ ID NO: 131) e peptídeo catiônico (SEQ ID NO: 120) ou (ii) um polipeptídeo tendo atividade de AMP, em que o polipeptídeo é pelo menos 80% idêntico a pelo menos uma das SEQ ID NOS: 133, 70, 135, 137, 102, 106, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 90, 153, 155, 104, 157, 108, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 80, 88, 94, 92, 114, 76, 110, 131 e 120, e em que a composição compreende pelo menos uma atividade selecionada dentre inibição do crescimento bacteriano de P. aeruginosa, redução de uma população bacteriana de P. aeruginosa e/ou morte do P. aeruginosa na ausência e/ou presença de soro humano.
36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31, 32 e 35, caracterizado pelo fato de que as referidas uma ou mais espécies adicionais bactérias Gram-negativas são selecionadas do grupo que consiste em Klebsiella spp., Enterobacter spp., Escherichia coli, Citrobacter freundii, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis, e Franciscella tulerensis.
37. Método, de acordo com a reivindicação 33 ou 34 ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o antibiótico é selecionado de um ou mais dentre ceftazidima, cefepima, cefoperazona, ceftobiprol, ciprofloxacino, levofloxacino, aminoglicosídeos, imipenema, meropenema, doripenema, gentamicina, tobramicina, amicacina, piperacilina, ticarcilina, penicilina, rifampicina, polimixina B, e colistina.
38. Constructo polipeptídico de lisina-AMP, o polipeptídeo isolado, o polinucleotídeo isolado, o vetor recombinante, a célula hospedeira, a composição farmacêutica ou os métodos de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma atividade ainda compreende inibir o crescimento, ou reduzir a população de pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas além da P. aeruginosa.
39. Constructo polipeptídico de lisina-AMP, o polipeptídeo isolado, o polinucleotídeo isolado, o vetor recombinante, a célula hospedeira, a composição farmacêutica ou o método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma espécie de bactérias Gram-negativas além da P. aeruginosa é selecionada do grupo que consiste em Klebsiella spp., Enterobacter spp., Escherichia coli, Citrobacter freundii, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis, e Franciscella tulerensis.
40. Constructo polipeptídico de lisina-AMP, o polipeptídeo isolado, o polinucleotídeo isolado, o vetor recombinante, a célula hospedeira, a composição farmacêutica ou o método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de queo constructo polipeptídico de lisina-AMP ou o polipeptídeo isolado ressensibiliza P. aeruginosa a um antibiótico.
41. Constructo polipeptídico de lisina-AMP, o polipeptídeo isolado, o polinucleotídeo isolado, o vetor recombinante, a célula hospedeira, a composição farmacêutica ou os métodos, de acordo com a reivindicação 40, caracterizados pelo fato de que o antibiótico é um carbapenema.
BR112020019484-0A 2018-03-29 2019-03-29 Constructos polipeptídicos de lisina-peptídeo antimicrobiano (amp), lisinas, polinucleotídeos isolados codificando as mesmas e seus usos BR112020019484A2 (pt)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862650235P 2018-03-29 2018-03-29
US62/650,235 2018-03-29
US201862721969P 2018-08-23 2018-08-23
US62/721,969 2018-08-23
US201862722793P 2018-08-24 2018-08-24
US62/722,793 2018-08-24
PCT/US2019/024912 WO2019191633A2 (en) 2018-03-29 2019-03-29 Lysin-antimicrobial peptide (amp) polypeptide constructs, lysins, isolated polynucleotides encoding same and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020019484A2 true BR112020019484A2 (pt) 2021-01-12

Family

ID=68060804

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020019484-0A BR112020019484A2 (pt) 2018-03-29 2019-03-29 Constructos polipeptídicos de lisina-peptídeo antimicrobiano (amp), lisinas, polinucleotídeos isolados codificando as mesmas e seus usos

Country Status (11)

Country Link
US (2) US11773140B2 (pt)
EP (1) EP3775192A4 (pt)
JP (1) JP2021519083A (pt)
KR (1) KR20200136980A (pt)
CN (1) CN112368376A (pt)
AU (1) AU2019245369A1 (pt)
BR (1) BR112020019484A2 (pt)
CA (1) CA3095484A1 (pt)
IL (1) IL277119A (pt)
MX (1) MX2020010075A (pt)
WO (1) WO2019191633A2 (pt)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112016030580B1 (pt) * 2014-06-26 2023-12-19 The Rockefeller University Polipeptídeo de lisina e fragmento de polipeptídeo com atividade para matar bactérias gram-negativas
CN112368376A (zh) 2018-03-29 2021-02-12 康特拉费克特公司 溶素-抗微生物肽(amp)多肽构建体、溶素、其分离的编码多核苷酸及其用途
CN112368010A (zh) * 2018-03-29 2021-02-12 康特拉费克特公司 抗微生物的、细菌噬菌体来源的多肽及其针对革兰氏阴性细菌的用途
US10988520B2 (en) * 2018-03-29 2021-04-27 Contrafect Corporation Lysin-antimicrobial peptide (AMP) polypeptide constructs, lysins, isolated polynucleotides encoding same and uses thereof
BR112021019430A2 (pt) * 2019-04-05 2021-11-30 Contrafect Corp Lisinas e seus derivados com atividade bactericida contra pseudomonas aeruginosa, na presença de soro humano
CN114401735A (zh) * 2019-07-05 2022-04-26 康特拉费克特公司 抗微生物的、细菌噬菌体来源的多肽及其针对革兰氏阴性和抗酸细菌的用途
EP4058468A4 (en) * 2019-11-14 2024-04-10 Contrafect Corp POLYPEPTIDE CONSTRUCTIONS OF ANTIMICROBIAL PEPTIDE LYSINE (AMP), LYSINES, ISOLATED POLYNUCLEOTIDES ENCODING THEREFOR AND USES THEREOF
WO2021211303A1 (en) * 2020-04-14 2021-10-21 Contrafect Corporation Antiviral, bacteriophage-derived polypeptides and their use against viruses
US20210324359A1 (en) * 2020-04-17 2021-10-21 Contrafect Corporation Use of gram-negative lysin-antimicrobial peptide (amp) polypeptide constructs in treating endocarditis
WO2022204280A1 (en) * 2021-03-26 2022-09-29 Contrafect Corporation Amurins lysins, and lysin-antimicrobial peptide (amp) constructs active against gram-negative bacteria
WO2022236088A1 (en) * 2021-05-06 2022-11-10 Bioharmony Therapeutics Inc. Lysin polypeptide compositions and methods of use

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2393224C2 (ru) 2004-11-12 2010-06-27 Новозимс Эдениум Байотек А/С Полипептиды с противомикробной активностью и кодирующие их полинуклеотиды
SG176783A1 (en) 2009-06-16 2012-01-30 Univ Tokai Anti-gram-negative bacteria agent
KR101701890B1 (ko) 2009-06-26 2017-02-02 뤼산도 아게 항균제
KR20170024129A (ko) * 2009-06-26 2017-03-06 카톨리에케 유니버시테이트 루벤 항균제
MX2012002216A (es) 2009-08-24 2012-04-10 Univ Leuven Kath Nueva endolisina obpgplys.
EP2468856A1 (en) 2010-12-23 2012-06-27 Lysando Aktiengesellschaft Antimicrobial Agents
WO2012145573A2 (en) 2011-04-21 2012-10-26 Universiteit Utrecht Holding Bv Streptococcus bacteriophage lysins for treatment of gram positive bacteria in companion animals and livestock
EP2702070B1 (en) * 2011-04-27 2015-09-30 Lysando AG New antimicrobial agents
WO2012159774A1 (en) 2011-05-26 2012-11-29 Dsm Ip Assets B.V. Novel listeria bacteriophage p825n and uses thereof
US8790639B2 (en) 2012-03-28 2014-07-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Enhanced antimicrobial lytic activity of a chimeric Ply187 endolysin
KR101391332B1 (ko) 2012-05-18 2014-05-07 연세대학교 산학협력단 카바페넴 제제에 내성을 보이는 아시네토박터 속의 균을 용균하는 박테리오파아지
US9388400B2 (en) * 2012-06-29 2016-07-12 Lysando Ag Composition for use in mycobacteria diagnosis
CN102861324A (zh) * 2012-10-17 2013-01-09 重庆市第三人民医院 治疗耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌感染的生物试剂
BR112016030580B1 (pt) 2014-06-26 2023-12-19 The Rockefeller University Polipeptídeo de lisina e fragmento de polipeptídeo com atividade para matar bactérias gram-negativas
RU2728682C2 (ru) 2015-09-17 2020-07-31 Контрафект Корпорейшн Применение лизина для восстановления/увеличения антибактериальной активности антибиотиков в присутствии легочного сурфактанта, который ингибирует указанные антибиотики
KR102000120B1 (ko) 2017-01-26 2019-07-15 주식회사 코미팜 이유 자돈의 대장균증을 예방하기 위한 재조합 p22 라이소자임 - pmap36 융합 단백질을 이용한 장내독소형 대장균(etec) 고스트 백신 조성물
AU2018384790A1 (en) 2017-12-12 2020-07-30 Contrafect Corporation Identification of lysins and derivatives thereof with bacterial activity against pseudomonas aeruginosa
US10988520B2 (en) 2018-03-29 2021-04-27 Contrafect Corporation Lysin-antimicrobial peptide (AMP) polypeptide constructs, lysins, isolated polynucleotides encoding same and uses thereof
CN112368010A (zh) 2018-03-29 2021-02-12 康特拉费克特公司 抗微生物的、细菌噬菌体来源的多肽及其针对革兰氏阴性细菌的用途
CN112368376A (zh) 2018-03-29 2021-02-12 康特拉费克特公司 溶素-抗微生物肽(amp)多肽构建体、溶素、其分离的编码多核苷酸及其用途
KR20210049023A (ko) * 2018-08-23 2021-05-04 콘트라펙트 코포레이션 리신-항미생물 펩타이드(amp) 폴리펩타이드 작제물, 리신, 이를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 및 이의 용도
US20210324359A1 (en) * 2020-04-17 2021-10-21 Contrafect Corporation Use of gram-negative lysin-antimicrobial peptide (amp) polypeptide constructs in treating endocarditis

Also Published As

Publication number Publication date
US20210047374A1 (en) 2021-02-18
US20240018192A1 (en) 2024-01-18
MX2020010075A (es) 2021-01-08
CN112368376A (zh) 2021-02-12
WO2019191633A2 (en) 2019-10-03
US11773140B2 (en) 2023-10-03
CA3095484A1 (en) 2019-10-03
EP3775192A2 (en) 2021-02-17
RU2020129467A (ru) 2022-05-04
KR20200136980A (ko) 2020-12-08
WO2019191633A3 (en) 2019-11-07
EP3775192A4 (en) 2022-06-01
AU2019245369A1 (en) 2020-10-29
IL277119A (en) 2020-10-29
JP2021519083A (ja) 2021-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11773140B2 (en) Gram-negative lysin-antimicrobial peptide (AMP) polypeptide constructs, lysins, isolated polynucleotides encoding same and uses thereof in human serum
US20210147498A1 (en) Use of gram-negative lysin-antimicrobial peptide (amp) polypeptide constructs in pulmonary surfactant and biofilms
US10988520B2 (en) Lysin-antimicrobial peptide (AMP) polypeptide constructs, lysins, isolated polynucleotides encoding same and uses thereof
US20210324359A1 (en) Use of gram-negative lysin-antimicrobial peptide (amp) polypeptide constructs in treating endocarditis
US20210330738A1 (en) Antimicrobial, bacteriophage-derived polypeptides and their use against gram-negative bacteria
US20220411473A1 (en) Lysin-antimicrobial peptide (amp) polypeptide constructs, lysins, isolated polynucleotides encoding same and uses thereof
EP3993821A1 (en) Antimicrobial, bacteriophage-derived polypeptides and their use against gram-negative and acid-fast bacteria
CA3095473A1 (en) Lysin-antimicrobial peptide (amp) polypeptide constructs, lysins, isolated polynucleotides encoding same and uses thereof
RU2803121C2 (ru) Полипептидные конструкции лизин-противомикробный пептид (amp), лизины, выделенные полинуклеотиды, кодирующие их, а также варианты их применения
EP4314020A1 (en) Amurins lysins, and lysin-antimicrobial peptide (amp) constructs active against gram-negative bacteria

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]