BR112020015121A2 - Métodos para tratar um indivíduo com um distúrbio ou doença mediada por receptor do tipo toll 2 e para inibir um ou mais agentes imunopotenciadores - Google Patents

Métodos para tratar um indivíduo com um distúrbio ou doença mediada por receptor do tipo toll 2 e para inibir um ou mais agentes imunopotenciadores Download PDF

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Abstract

métodos para tratar um indivíduo com um distúrbio ou doença mediada por receptor do tipo toll 2 e para inibir um ou mais agentes imunopotenciadores a descrição provê métodos e tratamentos de distúrbios e doenças mediadas por tlr2 que compreendem administrar um anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo que se liga a e inibe a atividade biológica de fosfolipídios oxidados.

Description

1 / 70
MÉTODOS PARA TRATAR UM INDIVÍDUO COM UM DISTÚRBIO OU DOENÇA MEDIADA POR RECEPTOR DO TIPO TOLL 2 E PARA
INIBIR UM OU MAIS AGENTES IMUNOPOTENCIADORES REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica a prioridade disposta no Título 35 do USC §119 do Pedido Provisório n° de série 62/623.276, depositado em 29 de janeiro de 2018, cuja descrição está incorporada ao presente documento a título de referência.
DIREITOS DE LICENÇA DO GOVERNO
[002] Esta invenção foi realizada com o apoio do governo sob o n° de concessão HL088093 atribuída pelo National Institutes of Health. O governo tem certos direitos sobre a invenção.
CAMPO DA TÉCNICA
[003] A descrição provê métodos e tratamentos de distúrbios e doenças mediadas por TLR2 que compreendem administrar um anticorpo, fragmento de anticorpo, ou polipeptídeo que se liga a e inibe a atividade biológica de um fosfolipídio oxidado.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[004] Acompanhando este depósito há uma Listagem de sequências intitulada “Sequence-Listing_ST25.txt”, criada em 29 de janeiro de 2019 e que tem 34.203 bytes de dados, formatada por máquina em IBM-PC, sistema operacional MS-Windows. A listagem de sequências está aqui incorporada a título de referência, em sua totalidade e para todas as finalidades.
FUNDAMENTOS
[005] Os fosfolipídios que contêm ácidos graxos poli-insaturados são altamente propensos à modificação por espécies reativas de oxigênio. Tais fosfolipídios tendem a se submeter à peroxidação de lipídios para formar fosfolipídios oxidados (OxPLs) que induzem citotoxicidade e apoptose e que
2 / 70 desempenham uma função significativa na inflamação. OxPLs têm sido mostrados como desempenhando uma função na transcrição de interleucina, comutação de fenótipo de células de músculo liso e mecanismos apoptóticos dos fosfolipídios modificados. Dessa forma, a peroxidação altera muito as propriedades físico-químicas de bicamadas lipídicas de membrana e, consequentemente, induz a sinalização dependendo da formação ou reorganização de domínios de membrana ou ligação molecular. As espécies distintas de OxPLs podem interagir com receptores e sítios de ligação específicos levando à ativação de vias de sinalização individuais.
[006] A aterosclerose coronariana humana é uma doença inflamatória crônica que ocorre devido a anormalidades lipídicas. A lipoproteína de baixa densidade oxidada pró-inflamatória (OxLDL) tem sido sugerida como uma ligação entre o acúmulo de lipídio e a inflamação nas paredes de vaso. Além disso, os níveis aumentados de produtos de oxidação de fosfolipídios foram detectados em órgãos e estados patológicos diferentes, incluindo vasos ateroscleróticos, pulmão inflamado, doença hepática não alcoólica, plasma de pacientes com doença das artérias coronárias, bem como em células apoptóticas, células infectadas por vírus e células estimuladas com agonistas inflamatórios. Foram realizados estudos sobre duas enzimas associadas a HDL: paraoxonase sérica (PON1) e PAF-acetil-hidrolase (PAF- AH); ambos as quais são responsáveis pela hidrólise de fosfolipídios oxidados de plasma, provendo assim evidência para sua função na aterosclerose. Um outro marcador importante de estresse oxidativo é a associação de OxPLs com a partícula de apolipoproteína B-100 (OxPLs/apoB) de LDL. Os níveis aumentados de OxPLs/apoB estão implicados na doença das artérias coronárias, na progressão de aterosclerose carotídea e femoral e na predição de eventos cardiovasculares.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[007] A descrição provê métodos e tratamentos de distúrbios e
3 / 70 doenças mediadas por TLR2 que compreendem administrar um anticorpo, fragmento de anticorpo, ou polipeptídeo que se liga a e inibe a atividade biológica de um fosfolipídio oxidado. Conforme mostrado nos estudos apresentados no presente documento, a neutralização de OxPL pela expressão endógena in vivo do anticorpo EO6 (com o uso do camundongo transgênico EO6-scFv) inibe consideravelmente a formação de aterosclerose caudada por agonismo de TLR2. As injeções do agonista de TLR2 PAM3CSK4 em camundongos Ldlr-/- alimentados com colesterol leva ao aprimoramento dramático de ateroesclerose. Um conjunto similar de injeções nos camundongos transgênicos EO6-scFv (no fundo Ldlr-/-) resultou em uma inibição significativa de formação de lesão. Em outros estudos, apresentados no presente documento, foi mostrado que a neutralização de OxPL pode proteger contra a progressão da doença em um modelo de camundongo acionado por TLR2 da doença de Kawasaki. A administração do patógeno Lactobacci1 us casei foi mostrada como causando doença semelhante a Kawasaki em camundongos, com ateroesclerose, arterite de artéria coronária e aneurismas abdominais intensificados resultantes. Isso é dependente de TLR2, à medida que a administração de L. Casei a camundongos deficientes de TLR-2 não tem efeito causador de doença. A expressão de IL-1 também foi fortemente associada à doença de Kawasaki. OxPL são também indutores potentes de inflamação e liberação de IL-1. A injeção de L. Casei nos camundongos transgênicos EO6 (no fundo Ldlr-/-) sob um protocolo idêntico resultou em reduções dramáticas não apenas em ateroesclerose, mas de grande relevância, em arterite coronária em comparação com injeções em camundongos Ldlr-/-. O anticorpo EO6 não se liga diretamente a L. Casei e, portanto, neutraliza presumidamente os efeitos inflamatórios de OxPL causados pelos efeitos inflamatórios associados ao agonismo mediado por TLR2.
[008] O desenvolvimento de arterite coronária e subsequentemente
4 / 70 aneurismas coronários são uma complicação fatal em crianças afetadas pela doença de Kawasaki, estimada ocorrer em até 25% das crianças, apesar da terapia atual, que é principalmente o tratamento com imunoglobulina intravenosa (IVIg) derivada de plasma humano purificado e agrupado e aspirina, que é uma terapia anti-inflamatória não específica generalizada. Devido à capacidade de qualquer anticorpo anti-OxPL para diminuir os processos inflamatórios, incluindo a diminuição na produção de IL-1B, bem como sua capacidade para conferir proteção no modelo de camundongo mediado por TLR2 da doença de Kawasaki, as injeções de anticorpo anti- OxPL equivalente humano ou humanizado modificado para aprimorar sua eficácia biológica poderiam, então, conferir proteção contra doenças associadas a TLR2, incluindo doença de Kawasaki. Uma vez que tais anticorpos anti-OxPL estão presentes no repertório de células B humanas, uma terapia recombinante alvejada poderia conferir benefício clínico para tal doença sem os efeitos colaterais de terapias derivadas de plasma ou imunossupressão.
[009] Os dados experimentais demonstram assim que a aterosclerose e arterite inflamatória causada por agonismo mediado por TLR2 in vivo em camundongos podem ser evitadas pela neutralização de OxPL. O agonismo de TLR2 tem sido implicado em inúmeras doenças bacterianas, é claro, mas também em uma variedade das chamadas doenças mediadas autoimunes, como lúpus, artrite reumatoide e outras. Em resumo, os dados demonstram que a neutralização de OxPL pelo uso de anticorpos, fragmentos de anticorpos ou outros domínios de ligação que alvejam o PC de OxPL pode melhorar ou prevenir muitas doenças que são acentuadas ou agravadas na progressão pela ativação de vias de sinalização mediadas por TLR 2. Em uma certa modalidade, a descrição provê um método para tratar um indivíduo com um distúrbio ou doença mediada por receptor do tipo Toll 2 (TLR2) que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um
5 / 70 anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo que se liga especificamente a em fosfolipídio oxidante (OxPL), em que o anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo inibe uma atividade biológica do OxPL.
Em uma modalidade adicional, o método compreende adicionalmente administrar ao indivíduo um agente terapêutico adicional que é útil para tratar um distúrbio ou doença mediada por TLR2. Os exemplos de distúrbios ou doenças mediadas por TLR2 incluem, porém sem limitação, doença de Kawasaki, diabetes tipo 2, artrite reumatoide, doença dermatológica, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, colite ulcerativa, doença de Graves, doença de Sjogren, doenças autoimunes da tiroide ou vasculite.
Em uma modalidade particular, o distúrbio ou doença mediada por TLR2 é doença de Kawasaki.
Em uma modalidade adicional, o método compreende adicionalmente administrar ao indivíduo imunoglobulina intravenosa (IVIG) e/ou salicilatos.
Em ainda uma outra modalidade, o indivíduo é um indivíduo humano que tem menos que cinco anos de idade.
Em uma outra modalidade, a atividade biológica do OxPL compreende ativação da via de apoptose de CD36-TLR2. Em ainda outra modalidade, o anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo é um fragmento variável de cadeia única (ScFv). Em uma certa modalidade, o anticorpo ou fragmento de anticorpo reconhece e se liga a um grupo principal de fosfocolina de um fosfolipídio oxidado, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende um domínio de cadeia pesada variável (VH) e/ou um domínio de cadeia leve variável (VL), e em que (a) o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos que inclui uma, duas ou três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NO:6 e sequência que são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% idênticas a SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7 e sequência que são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% idênticas a SEQ ID NO:7; e SEQ ID NO:8 e sequência que são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99.9% idênticas a SEQ ID NO:8; e (b) o domínio VL
6 / 70 compreende uma sequência de aminoácidos que inclui uma, duas ou três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NO:9 ou 12 e sequência que são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% idênticas a SEQ ID NO:9 ou 12; SEQ ID NO:10 e sequência que são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% idênticas a SEQ ID NO:10; e SEQ ID NO:11 e sequência que são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% idênticas a SEQ ID NO:11. Em uma modalidade adicional, o anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo é administrado de modo intravascular. Em ainda uma outra modalidade, o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos que inclui CDRs que compreendem SEQ ID NO:6, 7 e 8 e/ou o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos que inclui CDRs que compreendem SEQ ID NO:9, 10 e 11, ou SEQ ID NO:10, 11 e 12. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de anticorpo é selecionado do grupo que consiste em: (a) um anticorpo ou scFv com domínios de cadeia pesada e leve que compreendem as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NO:6, 7, 8, 9, 10 e 11; e (b) um anticorpo ou scFv com domínios de cadeia pesada e leve que compreendem as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NO:6, 7, 8, 10, 11 e 12. Em uma outra modalidade, os domínios de cadeia pesada e leve são ligados a uma região Fc ou FC2. Em ainda outra modalidade, o fragmento de anticorpo compreende um fragmento variável de cadeia única (“scFv”) que reconhece um grupo principal de fosfocolina de um fosfolipídio oxidado. Em uma modalidade particular, o scFv é solúvel sob condições fisiológicas. Outros agentes de ligação de OxPL que inibem a atividade biológica de OxPL podem ser usados (consultar, por exemplo, Publicação Internacional n° WO/2013/020995, que está aqui incorporada, por referência, para todas as finalidades).
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0010] As Figura 1A a 1B proveem (A) um diagrama do processo que
7 / 70 pode ser usado para produzir um fragmento variável de cadeia única (“scFv”). Conforme indicado, a mutagênese sítio-dirigida pode ser empregada para realizar a mutação do domínio variável da cadeia pesada (“VH”) de um anticorpo de imunoglobulina de cadeia dupla para aumentar a solubilidade de scFv (esquerda). As regiões de ligante, líder e efetor do scFv também são indicadas (direita). (B) Provê um mapa generalizado que demonstra o layout dos componentes genéticos que codificam o fragmento de anticorpo scFv EO6 (topo); e um mapa de vetor generalizado que indica a sequência de codificação para o fragmento de anticorpo EO6-scFv em relação a outros elementos de vetor que foi usado para gerar camundongos transgênicos (fundo).
[0011] A Figura 2 mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO:1) e aminoácidos (SEQ ID NO:2) e anotações do scFv.
[0012] A Figura 3 diagrama um modelo de camundongos in vivo para estudar as funções de scFv da descrição em camundongos alimentados com dieta de colesterol com alto teor de gordura e pró-inflamatória quando os camundongos são expostos a um agonista exógeno de receptor do tipo Toll (TLR2), Pam3CSK4 (PAM3).
[0013] As Figuras 4A a 4C mostram os efeitos na ingestão e massa corporal de camundongos com o uso do modelo in vivo descrito na Figura 3. (A) Nenhuma diferença significativa foi observada na ingestão de alimento por camundongos Ldlr-/- versus camundongos Ldlr-/- EO6scFv+/+ quando tratados com veículo. (B) Quando os camundongos foram tratados com Pam3, os camundongos Ldlr-/- tiveram menos ingestão de alimento em comparação com camundongos Ldlr-/- EO6scFv+/+. (C) Em 12 semanas, a massa corporal de camundongos Ldlr-/- EO6scFv+/+ foi significativamente maior que os camundongos Ldlr-/-. Nenhuma diferença significativa em massa corporal foi vista entre os camundongos Ldlr-/- EO6scFv+/+ e camundongos Ldlr-/- quando tratados com veículo na semana 12.
8 / 70
[0014] As Figuras 5A a 5B demonstram que não houve diferenças significativas em (A) colesterol ou (B) triglicerídeos em plasma sanguíneo de camundongos EO6scTg Ldlr-/- (LDLrKO (knock-out)) versus camundongos Ldlr-/-.
[0015] As Figuras 6A a 6B demonstram que não houve diferenças significativas em (A) perfil de colesterol de lipoproteína, ou (B) perfil de triglicerídeos de lipoproteína em plasma sanguíneo de camundongos Ldlr-/- EO6scFv+/+ versus camundongos Ldlr-/-, por exemplo, níveis de lipoproteína foram similares em ambos os camundongos.
[0016] As Figuras 7A a 7E indicam que houve menos ateroesclerose mensurável em camundongos Ldlr-/- EO6scFv+/+ versus camundongos Ldlr-/-. (A) A extensão de ateroesclerose aórtica total foi maior em camundongos Ldlr-/- versus camundongos Ldlr-/- EO6scFv+/+. (B) Houve especialmente uma extensão maior de ateroesclerose na aorta abdominal (abaixo do diafragma) nos camundongos Ldlr-/- versus camundongos Ldlr-/- EO6scFv+/+. (C) As Figuras (A) e (B) acima representam análise bidimensional por planimetria da extensão de ateroesclerose. O peso real de aortas dissecadas e limpas é uma integração melhor de ateroesclerose total à medida que o mesmo contém uma dimensão de espessura. O peso de aortas de camundongos Ldlr-/- foi significativamente maior que as aortas de camundongos Ldlr-/- EO6scFv+/+. (D) Quando controlado por massa corporal, a aorta por massa corporal de camundongos Ldlr-/- foi significativamente maior que a aorta por massa corporal de camundongos Ldlr-/- EO6scFv+/+. (E) A extensão de ateroesclerose na raiz da aorta não foi diferente entre os dois grupos.
[0017] As Figuras 8A a 8H proveem os resultados de PCR quantitativa (qPCR) considerando a expressão de gene inflamatório em tecido adiposo de camundongos Ldlr-/- EO6scFv+/+ versus camundongos Ldlr-/-. Em particular, a expressão de (A) ILlb, (B) IL6, (C) TNFα, (E) MCP1, (F) MIP1α, (G) MIP1β e (H) IL10 foi, no geral, menor para camundongos Ldlr-/-
9 / 70 EO6scFv+/+ versus camundongos Ldlr-/-, enquanto IL12 foi ligeiramente maior (D).
[0018] As Figuras 9A a 9G proveem os resultados de ensaios imunossorventes ligados a enzima (ELISAs) considerando os níveis de citocina medidos em extratos de tecido adiposo de camundongos Ldlr-/- EO6scFv+/+ versus camundongos Ldlr-/-. Em particular, os níveis de citocina medidos de (A) ILlb, (B) IL6, (C) TNFα, (D) MCP1, (E) MIP1α, (F) MIP1β e (G) IL10 espelharam os resultados de expressão de gene apresentados na Figura 8.
[0019] As Figuras 10A a 10H mostram que as células derivadas de medula óssea de Ldlr-/- EO6scFv+/+ quando diferenciadas para células M1 ou M2 de macrófago e estimuladas com PAM3 mostraram menos expressão de (A) ILlp, (B) IL6, (C) IL12, (D) TNFα, (E) MCP1, (F) MIP1α, (G) MIP1β e (H) RANTES em comparação com macrófagos diferenciados de camundongos Ldlr-/-. Os dados mostrados são a comparação entre células M1 derivadas de camundongos Ldlr-/-EO6scFv+/+ ou Ldlr-/-. Dados similares foram encontrados a partir de células M2, por exemplo, menos expressão de células M2 de Ldl_r_/_EO6scFv+/+ em comparação com Ldlr-/-, exceto pelo fato de que os níveis absolutos de expressão de citocina foram menores.
[0020] A Figura 11 mostra a expressão de gene robusta do EO6-scFv mRNA em tecidos adiposos diferentes derivados dos camundongos Ldlr-/- EO6scFv+/+. Isso é devido à infiltração de macrófago. Os macrófagos expressam o promotor apoE e, dessa forma, expressam o transgene EO6-scFv.
[0021] A Figura 12 provê imagens de microscópio de fluorescência que indicam que o tratamento de macrófagos (RAW264.7) com PAM3 induziu a produção de OxPL. Em virtude do fato de que os macrófagos de camundongos Ldlr-/- EO6scFv+/+ foram menos responsivos à estimulação de TLR2, e em virtude do fato de que os macrófagos expressam e secretam EO6- scFv na cultura, postulou-se que macrófagos estimulados por TLR2 geraram
10 / 70 OxPL, e que isso, por sua vez, ativou a expressão de gene inflamatória de maneira autócrina. Para testar essa hipótese, os macrófagos foram estimulados com PAM3: Painel esquerdo, tratamento com veículo; painel direito, tratamento com o agonista TLR2, PAM3. As culturas RAW264.7 foram incubadas com Pam3 (1 µg/ml) ou veículo de controle por 18 h, e a superfície manchada para OxPL com anticorpo EO6 IgM e conjugado de cabra anti- IgM-FITC ms. Isso demonstra que os macrófagos estimulados por TLR2 geram OxPL.
[0022] As Figuras 13A a 13F indicam que houve menos aterosclerose mensurável em camundongos Ldlr-/- EO6scFv+/+ RAG1-/- versus camundongos Ldlr-/- RAG1-/-. À medida que os camundongos RAG1 KO não têm células B ou T, todos os eventos de ateroesclerose relacionados a células imunológicas são diretamente atribuíveis à ação de macrófagos. Notavelmente, o nível absoluto de ateroesclerose dos camundongos Ldlr-/- RAGl-/- foi reduzido pela metade em comparação com camundongos Ldlr-/-. (A) Aortas abdominais isoladas de camundongos Ldlr-/- RAG1-/- (esquerda) e de camundongos Ldlr-/- EO6scFv+/+ RAG1-/- (direita). As aortas abdominais de camundongos Ldlr-/- EO6scFv+/+ RAG1-/- tiveram de modo demonstrativo menos lesões ateroscleróticas que os camundongos Ldlr-/-RAG1-/-. (B) O tamanho de lesão de seio aórtico foi significativamente menor para os camundongos Ldlr-/- EO6scFv+/+ RAG1-/- versus camundongos Ldlr-/- RAG1-/-. (C) Os camundongos Ldlr-/- RAG1 / tiveram uma porcentagem mais alta de lesões corporais totais versus camundongos Ldlr-/- EO6scFv+/+ RAG1-/-. (D) Os camundongos Ldlr-/- RAG1-/- tiveram uma porcentagem mais alta de lesões abdominais versus camundongos Ldlr-/- EO6scFv+/+ RAG1-/-. (E) O peso de aortas de camundongos Ldlr-/- RAG1-/- foi significativamente maior que das aortas de camundongos Ldlr-/- EO6scFv+/+ RAG1-/-. (F) Quando controlado para massa corporal, a aorta por massa corporal de camundongos Ldlr~f~ RAG1-/- foi significativamente maior que a aorta por massa corporal de camundongos
11 / 70 Ldlr-/- EO6scFv+/+ RAG1-/-. Em virtude de os camundongos RAG1 KO serem desprovidos tanto de células T como B, o principal tipo de célula imunológica que promove ateroesclerose nesses camundongos é o macrófago. Dessa forma, esses dados indicam que um mecanismo principal pelo qual os macrófagos contribuem para ateroesclerose nesse modelo induzido por TLR2 é devido a respostas de OxPL.
[0023] A Figura 14 apresenta imagens de crianças com doença de Kawasaki, e adicionalmente, aneurismas de artéria abdominal e coronária associados à doença de Kawasaki.
[0024] A Figura 15 apresenta um modelo de camundongo para estudar o impacto de LCWE, e dieta HFC em ateroesclerose em camundongos Ldlr-/-, camundongos Ldlr-/- EO6Tg, camundongos Ldlr-/- IK17Tg, camundongos TLR2-/- Ldlr-/-.
[0025] A Figura 16 apresenta análise en face de lesões da aorta em camundongos alimentados com dieta HFC durante 12 semanas e TLR2 ativado por LCWE. EO6scFv-Tg reduziu as lesões aórtica en face significativamente.
[0026] A Figura 17 provê a análise da área de lesão aórtica abdominal em diversos camundongos Ldlr-/- injetados com LCWE e alimentados com dieta HFC durante 12 semanas. Os dados são expressos como a porcentagem de ateroesclerose medida na aorta abdominal por manchamento de Sudan IV. EO6Tg e IK17Tg foram constatados como exercendo um efeito protetor estatisticamente significativo. TLR2 também foi constatado como diminuindo estatisticamente em comparação com os camundongos Ldlr-/- também.
[0027] A Figura 18 apresenta seções transversais de raízes da aorta de camundongos Ldlr-/- e de camundongos EO6-Tg Ldlr-/- tratados com LCWE. EO6scFv-Tg reduziu as lesões de raiz da aorta, tamanho de núcleo necrótico e principalmente no contexto de manifestações de doença de Kawasaki, arterite coronária. As setas apontam para as artérias coronárias na seção transversal.
12 / 70 A arterite extensiva (massa de célula grande) estava presente nos camundongos Ldlr-/-, mas ausente nos camundongos EO6-Tg Ldlr-/-.
[0028] A Figura 19 apresenta seções transversais adicionais de raízes da aorta de camundongos Ldlr-/- e de camundongos EO6-Tg Ldlr-/- tratados com LCWE. As setas apontam para as artérias coronárias na seção transversal. A arterite extensiva (massa de célula grande) estava presente nos camundongos Ldlr-/-, mas ausente nos camundongos EO6-Tg Ldlr-/-.
[0029] A Figura 20 apresenta seções transversais de raízes da aorta de camundongos Ldlr-/- TLR2-/- e de camundongos IK17-Tg+/+ Ldlr-/- tratados com LCWE. As setas apontam para as artérias coronárias na seção transversal. Tanto EO6scFv como IK17scFv diminuíram a arterite coronária. EO6 (Anti-OxPL), mas não IK17 (anti-MDA), reduziu as lesões de raiz da aorta.
[0030] A Figura 21 apresenta seções transversais adicionais de raízes da aorta de camundongos Ldlr-/- TLR2-/- e de camundongos IK17-Tg+/+ Ldlr-/- tratados com LCWE. As setas apontam para as artérias coronárias na seção transversal. A falta de arterite em artérias coronárias nos camundongos Ldlr-/- TLR2-/- indica a importância da ativação de TLR2 no modelo de camundongo de doença de Kawasaki.
[0031] A Figura 22 representa níveis de citocina inflamatória plasmática de camundongos de controle LDLr-/- e camundongos EO6-Tg LDLr-/- tratados com LCWE e alimentados com dietas HFC durante 12 semanas. As citocinas plasmáticas foram medidas por ensaios de citocina multiplex simultaneamente com o uso de kit de ensaio de citocina de camundongo Bio-Plex Pro (Bio-Rad Laboratories, EUA). Redução significativa (p < 0,04) em níveis séricos de proteína TNFα, RANTES, MCP- 1, CXCL1, IL-6 e IL-12 foi observada em camundongos EO6scFv-Tg LDLr-/- em comparação com os camundongos de controle.
DESCRIÇÃO DETALHADA
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[0032] Como usado no presente documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma”, "o" e “a” incluem referentes plurais a menos que o contexto estabeleça claramente o contrário. Dessa forma, por exemplo, a referência a um “fragmento variável de cadeia única” ou “scFv” inclui uma pluralidade de fragmentos variáveis de cadeia única e a referência a “fosfolipídio oxidado” inclui referência a um ou mais fosfolipídios oxidados e equivalentes dos mesmos conhecidos pelos versados na técnica, e assim por diante.
[0033] A menos que seja definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica a qual esta descrição pertence. Embora quaisquer métodos e reagentes similares ou equivalentes àqueles descritos no presente documento possam ser usados na prática dos métodos e composições descritos, os métodos e materiais exemplificadores são agora descritos.
[0034] Todas as publicações mencionadas no presente documento estão aqui incorporadas a título de referência na íntegra, com o objetivo de descrever e demonstrar as metodologias que são descritas nas publicações, que poderiam ser usadas em conexão com a descrição no presente documento. Além disso, em relação a qualquer termo que é apresentado em uma ou mais publicações que é similar ou idêntico a um termo que foi expressamente definido nesta descrição, a definição do termo como expressamente provido nesta descrição prevalecerá sobre todos os aspectos.
[0035] Além disso, o uso de “e” significa “e/ou”, exceto onde especificado em contrário. De modo similar, “compreender”, “compreende”, “compreendendo”, “incluir”, “inclui” e “incluindo” são intercambiáveis e não se destinam a ser limitadores.
[0036] Deve ser entendido adicionalmente que, onde as descrições de diversas modalidades usam o termo “compreendendo”, os versados na técnica
14 / 70 entenderiam que, em algumas instâncias específicas, uma modalidade pode ser descrita alternativamente com o uso da linguagem “consistindo essencialmente em” ou “consistindo em”.
[0037] Os termos “anticorpo” e “imunoglobulina” são usados de forma intercambiável no sentido mais amplo e incluem anticorpos monoclonais (por exemplo, anticorpos monoclonais intactos ou de comprimento total), anticorpos policlonais, anticorpos multivalentes, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos, contanto que exibam a atividade biológica desejada) e também podem incluir certos fragmentos de anticorpo. Um anticorpo pode ser humano, humanizado e/ou amadurecido por afinidade.
[0038] Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a classes diferentes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e diversas dessas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às classes diferentes de imunoglobulinas são chamados α, δ, ε, γ e µ, respectivamente. As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais de classes diferentes de imunoglobulinas são bem conhecidas.
[0039] “Fragmentos de anticorpo” compreendem apenas uma porção de um anticorpo intacto, em que a porção retém tipicamente pelo menos uma, mais comumente a maioria ou a totalidade das funções normalmente associadas a essa porção quando presente em um anticorpo intacto. Os exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Em uma modalidade, um fragmento de anticorpo compreende um sítio de ligação a antígeno do anticorpo intacto e, dessa forma, retém a capacidade de
15 / 70 se ligar ao antígeno. Em uma outra modalidade, um fragmento de anticorpo, por exemplo, aquele que compreende a região Fc, retém pelo menos uma das funções biológicas normalmente associadas à região Fc quando presente em um anticorpo intacto, como ligação a FcRn, modulação de meia-vida de anticorpo, função ADCC e ligação de complemento. Em uma modalidade, um fragmento de anticorpo é um anticorpo monovalente que tem uma meia-vida in vivo substancialmente similar a um anticorpo intacto. Por exemplo, tal fragmento de anticorpo pode compreender um braço de ligação a antígeno ligado a uma sequência Fc capaz de conferir estabilidade in vivo ao fragmento. Entretanto, deve ser reconhecido que uma meia-vida longa do anticorpo não é necessária para certa indicação (por exemplo, tratamentos de reperfusão/isquemia aguda).
[0040] Um “antígeno” é um antígeno predeterminado ao qual um anticorpo pode se ligar seletivamente. O antígeno alvo pode ser polipeptídeo, carboidrato, ácido nucleico, lipídio, hapteno ou outro composto de ocorrência natural ou sintético. Em uma modalidade da descrição, um antígeno é um OxPL.
[0041] O termo “anticorpo anti-OxPL” ou “um anticorpo que se liga ao OxPL” se refere a um anticorpo que é capaz de se ligar ao OxPL com afinidade suficiente, de modo que o anticorpo seja útil como um agente de diagnóstico e/ou terapêutico no alvejamento de OxPL. Em algumas modalidades da descrição, um anticorpo anti-OxPL tem uma especificidade e Kd de ligação igual ou similar ao anticorpo EO6 ou ao anticorpo QX5. Em ainda outra modalidade, o anticorpo anti-OxPL se liga ao grupo principal PC de OxPLs.
[0042] Um anticorpo de “bloqueio” ou um anticorpo “antagonista” é aquele que inibe ou reduz a atividade biológica do antígeno ao qual se liga. Certos anticorpos de bloqueio ou anticorpos antagonistas inibem substancial ou completamente a atividade biológica do antígeno.
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[0043] “Afinidade de ligação” se refere, no geral, à intensidade da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A não ser que indicado de outro modo, conforme usado no presente documento, “afinidade de ligação” se refere à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação a 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X para seu parceiro Y pode ser, no geral, representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos no presente documento. Os anticorpos de baixa afinidade se ligam, no geral, ao antígeno lentamente e tendem a dissociar prontamente, enquanto que os anticorpos de alta afinidade se ligam, no geral, ao antígeno mais rápido e tendem a permanecer ligados mais tempo. Uma variedade de métodos para medir a afinidade de ligação é conhecida na técnica, qualquer um dos quais pode ser usado para propósitos da presente invenção.
[0044] Uma “amostra biológica” abrange uma variedade de tipos de amostra obtidos de um indivíduo e pode ser usada em um teste de diagnóstico ou monitoramento. A definição abrange sangue e outras amostras líquidas de origem biológica, amostras de tecido sólido, como um espécime de biópsia ou culturas de tecidos ou células derivadas das mesmas, e a progênie das mesmas. A definição também inclui amostras que foram manipuladas de qualquer forma após sua aquisição, como por meio de tratamento com reagentes, solubilização ou enriquecimento para certos componentes, como proteínas ou polinucleotídeos, ou incorporação em uma matriz semissólida ou sólida para propósitos de corte. O termo “amostra biológica” abrange uma amostra clínica e também inclui células em cultura, sobrenadantes celulares, lisatos celulares, soro, plasma, fluido biológico e amostras de tecido. A fonte da amostra biológica pode ser tecido sólido a partir de uma amostra ou
17 / 70 biópsia ou aspirado de órgão ou tecido fresco, congelado e/ou preservado; sangue ou quaisquer constituintes de sangue; fluidos corporais, como líquido cefalorraquidiano, líquido amniótico, fluido peritoneal ou fluido intersticial; células a partir de qualquer momento da gestação ou desenvolvimento do indivíduo. Em algumas modalidades, a amostra biológica é obtida a partir de um tumor primário ou metastático. A amostra biológica pode conter compostos que não são naturalmente intermisturados com o tecido na natureza, como conservantes, anticoagulantes, tampões, fixadores, nutrientes, antibióticos ou similares.
[0045] O termo “diacorpos” se refere a fragmentos de anticorpo pequenos com dois sítios de ligação a antígeno, tais fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável da cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH-VL). Com o uso de um ligante que é curto demais para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de uma outra cadeia e criar dois sítios de ligação a antígeno. Os diacorpos são descritos mais completamente, por exemplo, no documento n° EP 404,097; WO 93/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 90: 6.444 a 6.448 (1993). Triacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson et al.r Nat. Med. 9: 129 a 134 (2003).
[0046] Um “distúrbio” ou “doença” é qualquer condição que se beneficiaria do tratamento com uma substância/molécula ou método da descrição. Isso inclui distúrbios ou doenças mediadas por TLR2, como a doença de Kawasaki.
[0047] Uma “quantidade eficaz” se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e durante períodos de tempo necessários, para obter o resultado profilático ou terapêutico desejado.
[0048] O termo “região Fc”, como usado no presente documento, se refere à região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo
18 / 70 regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes.
[0049] Uma “região Fc funcional” possui uma função efetora de uma região Fc de sequência nativa. Tais funções efetoras exigem, no geral, que a região Fc seja combinada com uma ligação ao domínio (por exemplo, um domínio variável de anticorpo) e podem ser avaliadas com o uso de usando diversos ensaios, como descrito, por exemplo, nas definições no presente documento.
[0050] Uma “região Fc de sequência nativa” compreende uma sequência de aminoácidos que é idêntica à sequência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza. As regiões Fc humanas de sequência nativa incluem uma região Fc de IgGl humana de sequência nativa (alotipos não A e A); região Fc de IgG2 humana de sequência nativa; região Fc de IgG3 humana de sequência nativa; e região Fc de IgG4 humana de sequência nativa, bem como variantes de ocorrência natural das mesmas.
[0051] “Receptor Fc” ou “FcR” descreve um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. Em algumas modalidades, um FcR é um FcR humano nativo. Em outras modalidades, um FcR é aquele que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e formas alternativamente submetidas a splicing desses receptores. Os receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um “receptor de ativação”) e FcyRIIB (um “receptor de inibição”), que têm sequências de aminoácidos similares que se diferem principalmente nos domínios citoplasmáticos dos mesmos. O receptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativação à base de tirosina de imunorreceptor (ITAM) em seu domínio citoplasmático. O receptor de inibição FcyRIIB contém um motivo de inibição à base de tirosina de imunorreceptor (ITIM) imunorreceptor em seu domínio citoplasmático (consultar, por exemplo, Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203 a 234 (1997)). Os FcRs são analisados, por exemplo, em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457 a 492 (1991);
19 / 70 Capel et al., Immunomethods 4: 25 a 34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330 a 341 (1995). Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são abrangidos pelo termo “FcR” no presente documento.
[0052] O receptor Fc também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternais para o feto (Guyer et al.r J. Immunol. 117: 587 (1976) e Kim et al.r J. Immunol. 24: 249 (1994)) e regulação da homeostase de imunoglobulinas. Os métodos para medir a ligação ao FcRn são conhecidos (consultar por exemplo, Ghetie e Ward., Immunol. Today 18(12): 592 a 598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7): 637 a 640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279 (8):
6.213 a 6.216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.).
[0053] A ligação ao FcRn humano in vivo e a meia-vida sérica de polipeptídeos de ligação de alta afinidade a FcRn humano podem ser analisadas, por exemplo, em camundongos transgênicos ou linhagens de células humanas transfectadas que expressam FcRn humano, ou em primatas aos quais os polipeptídeos com uma região Fc variante são administrados. O documento n° WO 2000/42072 (Presta) descreve variantes de anticorpo com ligação melhorada ou diminuída a FcRs. Consultar também, por exemplo, Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6.591 a 6.604 (2001).
[0054] “Fv” é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio de ligação e reconhecimento de completo. Em uma espécie de Fv de duas cadeias, essa região consiste em um dímero de um domínio variável de uma cadeia pesada e uma cadeia leve em associação estreita e não covalente. Em uma espécie de Fv de cadeia única, um domínio variável de uma cadeia pesada e uma cadeia leve pode ser covalentemente ligado por um ligante peptídico flexível, de modo que as cadeias leve e pesada possam se associar em uma estrutura “dimérica”análoga àquela em uma espécie Fv de duas cadeias. Isso é, nessa configuração, que as três HVRs de cada domínio
20 / 70 variável interagem para definir um sítio de ligação a antígeno sobre a superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis HVRs conferem especificidade de ligação a antígeno ao anticorpo. Entretanto, até um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende apenas três HVRs específicas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e se ligar ao antígeno, embora em uma afinidade mais baixa que o sítio de ligação inteiro.
[0055] O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CHI) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab’ se diferem de fragmentos Fab mediante a adição de alguns resíduos no terminal carbóxi do domínio CHI de cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça de anticorpo. Fab’-SH é a designação aqui para Fab’ em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes tem(têm) um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab’)2 foram produzidos originalmente como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas de dobradiça entre os mesmos. Também são conhecidos outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo.
[0056] A digestão de anticorpos por papaína produz dois fragmentos de ligação a antígeno idênticos, chamados fragmentos “Fab”, cada um com um único sítio de ligação a antígeno, e um fragmento residual “Fc”, cujo nome reflete sua capacidade de cristalizar rapidamente. O tratamento com pepsina rende um fragmento F(ab’)2 que tem dois sítios de combinação de antígeno e é ainda capaz de reticulação de antígeno.
[0057] Os resíduos “framework” ou “FR” são aqueles resíduos de domínio variável além dos resíduos de região hipervariável como definido no presente documento.
[0058] As formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Em uma modalidade, um anticorpo humanizado é uma imunoglobulina humana (anticorpo receptor) em que os
21 / 70 resíduos de uma HVR do receptor são substituídos por resíduos de uma HVR de uma espécie não humana (anticorpo doador), como camundongo, rato, coelho ou primata não humano que tem a especificidade, afinidade e/ou capacidade desejada. Em algumas instâncias, os resíduos de framework da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Adicionalmente, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações podem ser feitas para refinar adicionalmente o desempenho de anticorpo. No geral, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um e tipicamente dois domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os laços hipervariáveis correspondem àqueles de uma imunoglobulina não humana, e todas ou substancialmente todas as FR são aqueles de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, consultar, por exemplo, Jones et al., Nature 321: 522 a 525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323 a 329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593 a 596 (1992). Consultar também, por exemplo, Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105 a 115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1.035 a 1.038 (1995); Hurle e Gross, Curr. Op. Biotech, 5: 428 a 433 (1994); e patente n° U.S.
6.982.321 e 7.087.409.
[0059] Um “anticorpo humano” é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde àquele de um anticorpo produzido por um ser humano e/ou foi produzido com o uso de qualquer uma das técnicas para produzir anticorpos humanos, como descrito no presente documento. Essa definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação a antígeno não humano. Os
22 / 70 anticorpos humanos podem ser produzidos com o uso de diversas técnicas conhecidas na técnica, incluindo bibliotecas de exibição de fagos. Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991). Também estão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos os métodos descritos em Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, página 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86 a 95 (1991). Consultar também van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368 a 74 (2001). Os anticorpos humanos podem ser preparados mediante a administração do antígeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir tais anticorpos em resposta à provocação por antígeno, mas cujos loci endógenos foram desabilitados, por exemplo, xenocamundongos imunizados (consultar, por exemplo, patente n° U.S. 6.075.181 e 6.150.584). Consultar também, por exemplo, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 103: 3.557 a 3.562 (2006) em relação a anticorpos humanos gerados através de uma tecnologia de hibridoma de células B humanas. Deve ser importante notar que um “anticorpo humano” não inclui anticorpos de ocorrência natural produzidos por um ser humano, mas se refere, de preferência, a anticorpos que não contêm qualquer epítopo ou fragmento antigênico que um indivíduo humano não reconheceria como “estranho”.
[0060] “Células efetoras humanas” são leucócitos que expressam um ou mais FcRs e realizam funções efetoras. Em certas modalidades, as células expressam pelo menos FcyRIII e realizam função(funções) efetora(efetoras) de ADCC. Os exemplos de leucócitos humanos que medeiam o ADCC incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC), células natural killer (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos. As células efetoras podem ser isoladas de uma fonte nativa, por exemplo, a partir de sangue.
[0061] O termo “região hipervariável”, “HVR” ou “HV”, quando usado no presente documento, se refere às regiões de um domínio variável de
23 / 70 anticorpo que são hipervariáveis em sequência e/ou formam alças estruturalmente definidas. No geral, os anticorpos compreendem seis HVRs; três no domínio VH (H1, H2, H3) e três no domínio VL (L1, L2, L3). Nos anticorpos nativos, H3 e L3 exibem a maior diversidade das seis HVRs, e acredita-se que H3, em particular, desempenha uma função exclusiva ao conferir especificidade fina a anticorpos. Consultar, por exemplo, Xu et al., Immunity 13: 37 a 45 (2000); Johnson e Wu, in Methods in Molecular Biology 248: 1 a 25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003). De fato, os anticorpos camelídeos de ocorrência natural que consistem em apenas uma cadeia pesada são funcionais e estáveis na ausência de cadeia leve. Consultar, por exemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446 a 448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3: 733 a 736 (1996).
[0062] Um “indivíduo”, “sujeito” ou “paciente” é um vertebrado. Em certas modalidades, o vertebrado é um mamífero. Os mamíferos incluem, mas não se limitam a, animais de fazenda (como vacas), animais esportivos, animais de estimação (como gatos, cães e cavalos), primatas, camundongos e ratos. Em certas modalidades, um mamífero é um ser humano.
[0063] Um anticorpo “isolado” ou fragmento de anticorpo é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Os componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que interfeririam nos usos de diagnóstico ou terapêuticos para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteicos ou não proteicos. Em algumas modalidades, o anticorpo será purificado (1) a mais de 95% em peso do anticorpo, como determinado pelo método de Lowry e, tipicamente, mais de 99% em peso, (2) a um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácidos N-terminal ou interna através do uso de um sequenciador de copo giratório ou (3) à homogeneidade por SDS-PAGE sob condições de redução ou não redução com o uso de corante prata ou azul de Coomassie. Um anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ
24 / 70 dentro de células recombinantes, uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Normalmente, entretanto, um anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.
[0064] Uma molécula de ácido nucleico “isolada” é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está normalmente associada na fonte natural do ácido nucleico de anticorpo. Uma molécula de ácido nucleico isolada é diferente da forma ou ambiente em que é encontrada na natureza. As moléculas de ácido nucleico isoladas são, portanto, distinguidas da molécula de ácido nucleico, como existe nas células naturais. Entretanto, uma molécula de ácido nucleico isolada inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que normalmente expressam o anticorpo em que, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está em um local cromossômico diferente daquele das células naturais.
[0065] A palavra “identificação”, quando usada no presente documento, se refere a um composto ou composição que é conjugada ou fundida direta ou indiretamente a um reagente, como uma sonda de ácido nucleico ou um anticorpo, e facilita a detecção do reagente ao qual está conjugada ou fundida. A própria identificação pode ser detectável (por exemplo, identificações radioisótopas ou identificações fluorescentes) ou, no caso de uma identificação enzimática, pode catalisar alteração química de um composto ou composição de substrato que é detectável.
[0066] As “cadeias leves” de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de vertebrado podem ser atribuídas a um dentre dois tipos claramente distintos, chamados kappa (K) e lambda (A), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes.
[0067] O termo “anticorpo monoclonal", como usado no presente documento, se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de
25 / 70 anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto pelas mutações possíveis, por exemplo, mutações de ocorrência natural, que podem estar presentes em quantidades menores. Dessa forma, o termo modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos discretos. Em certas modalidades, tal anticorpo monoclonal inclui tipicamente um anticorpo que compreende uma sequência de polipeptídeos que se liga a um alvo, em que a sequência de polipeptídeos de ligação ao alvo foi obtida por um processo que inclui a seleção de uma única sequência de polipeptídeos de ligação ao alvo a partir de uma pluralidade de sequências de polipeptídeos. Por exemplo, o processo de seleção pode ser a seleção de um clone exclusivo a partir de uma pluralidade de clones, como um agrupamento de clones de hibridoma, clones de fago ou clones de DNA recombinante. Deve ser entendido que uma sequência de ligação ao alvo selecionada pode ser adicionalmente alterada, por exemplo, para melhorar a afinidade com o alvo, humanizar a sequência de ligação ao alvo, melhorar sua produção na cultura de células, reduzir sua imunogenicidade in vivo, criar um anticorpo multiespecífico, etc., e que um anticorpo que compreende a sequência de ligação ao alvo alterada também é um anticorpo monoclonal para os fins desta descrição. Em contraste com as preparações de anticorpo policlonal, que tipicamente incluem anticorpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante em um antígeno. Além de sua especificidade, as preparações de anticorpo monoclonal são vantajosas pelo fato de que são tipicamente não contaminadas por outras imunoglobulinas.
[0068] O termo modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como exigindo a
26 / 70 produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a descrição podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, o método de hibridoma (por exemplo, Kohler e Milstein, Nature, 256: 495 a 497 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253 a 260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a edição, 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 a 681 (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de DNA recombinante (consultar, por exemplo, patente no U.S. 4.816.567), tecnologias de exibição em fago (consultar, por exemplo, Clackson et al., Nature, 352: 624 a 628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581 a 597 (1992); Sidhu et al.r J. Mol. Biol. 338(2): 299 a 310 (2004); Lee et al.r J. Mol. Biol. 340(5):
1.073 a 1.093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 101(34): 12.467 a
12.472 (2004); e Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119 a 132 (2004), e tecnologias para a produção de anticorpos humanos ou semelhantes a humanos em animais que têm partes de ou todos os loci ou genes de imunoglobulina humana que codificam sequências de imunoglobulina humana (consultar, por exemplo, VIO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90: 2.551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255 a 258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7: 33 (1993); patente n° U.S. 5.545.807;
5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; e 5.661.016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779 a 783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856 a 859 (1994); Morrison, Nature 368: 812 a 813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845 a 851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); e Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65 a 93 (1995).
[0069] Os anticorpos monoclonais no presente documento incluem especificamente anticorpos “quiméricos” em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em
27 / 70 anticorpos derivados a partir de uma espécie particular ou que pertencem a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados a partir de uma outra espécie ou que pertencem a uma outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, contanto que exibam a atividade biológica desejada (consultar, por exemplo, patente no U.S. 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 81: 6.851 a
6.855 (1984)). Os anticorpos quiméricos incluem anticorpos em que a região de ligação a antígeno do anticorpo é derivada de um anticorpo produzido por meio, por exemplo, da imunização de macacos do gênero Macaca com o antígeno de interesse.
[0070] Um “polinucleotídeo” ou “ácido nucleico”, como usado no presente documento, se refere a polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento e inclui DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos ou bases modificadas e/ou seus análogos que podem ser incorporados em um polímero por DNA ou RNA polimerase, ou por uma reação sintética. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, como nucleotídeos metilados e seus análogos. Se estiver presente, a modificação para a estrutura nucleotídica pode ser conferida antes ou após a montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleotídeo pode ser adicionalmente modificado após a síntese, como por meio de conjugação com uma identificação. Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, “coberturas”, substituição de um ou mais nucleotídeos de ocorrência natural por um análogo, modificações internucleotídeos, como, por exemplo, aqueles com ligações não carregadas (por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aqueles que contêm porções químicas pendentes, como, por exemplo, proteínas (por
28 / 70 exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos de sinal, poli-L-lisina, etc.), aqueles que contêm intercaladores (por exemplo, acridina, psoraleno, etc.), aqueles que contêm quelantes (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidativos, etc.), aqueles que contêm alquiladores e aqueles com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), bem como formas não modificadas do(s) polinucleotídeo(s). Adicionalmente, qualquer um dos grupos hidroxila normalmente presentes nos açúcares pode ser substituído, por exemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos de proteção padrão ou ativados para preparar ligações adicionais a nucleotídeos adicionais, ou podem ser conjugados a suportes sólidos ou semissólidos.
O OH 5’ e 3’ terminal pode ser fosforilado ou substituído por aminas ou porções químicas de grupo de cobertura orgânico de 1 a 20 átomos de carbono.
Outras hidroxilas também podem ser derivatizadas para grupos de proteção padrão.
Os polinucleotídeos também podem conter formas análogas de açúcares ribose ou desoxirribose que são, no geral, conhecidas na técnica, incluindo, por exemplo, 2’-O-metil-, 2’-O-alila, 2’-fluoro- ou 2’-azido- ribose, análogos de açúcar carbocíclica, açúcares alfa-anoméricos, açúcares epiméricos, como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares piranose, açúcares furanose, sedo-heptuloses, análogos acrílicos e análogos de nucleosídeo básico como metil ribosídeo.
Uma ou mais ligações de fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos.
Esses grupos de ligação alternativos incluem, porém sem limitação, modalidades em que o fosfato é substituído por P(O)S (“tioato”), P(S)S (“ditioato”), “(O)NR2 (“amidato”), P(O)R, P(O)OR’, CO ou CH2 (“formacetal”), em que cada R ou R’ é independentemente H ou alquila (1-20 C) substituída ou não substituída (opcionalmente) que contém uma ligação de éter (--O--), arila, alcenila, cicloalquila, cicloalcenila ou araldila.
Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas.
A descrição anterior se aplica a todos os polinucleotídeos mencionados no presente documento, incluindo RNA e
29 / 70 DNA.
[0071] Os fragmentos de anticorpo “Fv de cadeia única” ou “scFv” compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. No geral, o polipeptídeo scFv compreende adicionalmente um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que possibilita que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação ao antígeno. A Figura 1 mostra uma estrutura de anticorpo e scFv. Para uma análise do scFv consulte Pluckthun, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, editores Rosenburg e Moore, Springer- Verlag, Nova Iorque, páginas 269 a 315 (1994).
[0072] O termo “substancialmente similar” ou “substancialmente igual”, como usado no presente documento, denota um grau de similaridade suficientemente alto entre dois valores numéricos (por exemplo, um associado a um anticorpo da descrição e o outro associado a um anticorpo de referência/comparador), de modo que um versado na técnica considere a diferença entre os dois valores como tendo pouca ou nenhuma significância biológica e/ou estatística dentro do contexto da característica biológica medida pelos valores (por exemplo, valores de Kd). A diferença entre os ditos dois valores é, por exemplo, menor que cerca de 50%, menor que cerca de 40%, menor que cerca de 30%, menor que cerca de 20% e/ou menor que cerca de 10% em função do valor de referência/comparador.
[0073] A frase “substancialmente reduzido” ou “substancialmente diferente”, como usado no presente documento, denota um grau de diferença suficientemente alto entre dois valores numéricos (no geral, um associado a uma molécula e o outro associado a uma molécula de referência/comparadora), de modo que um versado na técnica consideraria a diferença entre os dois valores como sendo de significância estatística dentro do contexto da característica biológica medida pelos ditos valores (por exemplo, valores de Kd). A diferença entre os ditos dois valores é, por
30 / 70 exemplo, maior que cerca de 10%, maior que cerca de 20%, maior que cerca de 30%, maior que cerca de 40% e/ou maior que cerca de 50% em função do valor para a molécula de referência/comparadora.
[0074] “Doenças e distúrbios relacionados a TLR2” inclui, porém sem limitação, doenças autoimunes, incluindo artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose sistêmica, síndrome de Sjogren, psoríase, esclerose múltipla e diabetes autoimune. As condições relacionadas a TLR (por exemplo, direta e/ou indiretamente associadas a TLRs como TLR2, etc.) podem incluir qualquer um ou mais dentre: diabetes, obesidade, sepse, doença inflamatória (por exemplo, doença de Crohn), distúrbios imunes, doença metabólica (por exemplo, condições associadas à síndrome metabólica), doença endócrina, aterosclerose, asma, doença cardiovascular, condições relacionadas ao sistema imunológico e/ou quaisquer outras condições adequadas. Por exemplo, a doença ou distúrbio mediado por TLR2 pode ser selecionado do grupo que consiste em doença de Kawasaki, diabetes tipo 2, artrite reumatoide, doença dermatológica, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, colite ulcerativa, doença de Graves, síndrome de Sjogren, doenças autoimunes da tiroide, vasculite e qualquer combinação dos mesmos.
[0075] Como usado no presente documento, “tratamento” se refere à intervenção clínica em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo ou célula a ser tratada e pode ser realizado para profilaxia ou durante o curso da patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem a prevenção da ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, diminuição da taxa de progressão de doença, melhora ou paliação do estado doentio e remissão ou prognóstico melhorado. Em algumas modalidades, um anticorpo (humanizado ou não humanizado), fragmento de anticorpo ou polipeptídeo da descrição ou um anticorpo humanizado da descrição são
31 / 70 usados para retardar o desenvolvimento de uma doença ou distúrbio.
[0076] O termo “variável” se refere ao fato de que certas porções dos domínios variáveis se diferem extensivamente em sequência entre os anticorpos e são usadas na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para seu antígeno particular. Entretanto, a variabilidade não está distribuída uniformemente pelos domínios variáveis de anticorpos. Está concentrado em três segmentos chamados regiões determinantes de complementaridade ou regiões hipervariáveis (CDRs ou HVRs, usadas de forma intercambiável no presente documento), tanto nos domínios variáveis de cadeia leve como de cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas de domínios variáveis são chamadas de framework (FR). Os domínios variáveis de cadeias pesada e leve nativas compreendem, cada uma, quatro regiões FR, adotando amplamente uma configuração de folha 3 conectada por três HVRs, que formam alças conectando e, em alguns casos, formando parte da estrutura de folha 3. As HVRs em cada cadeia são retidas juntas em estreita proximidade pelas regiões FR e, com as HVRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação a antígeno de anticorpos (consultar Rabat et al.r Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem diversas funções efetoras, como a participação do anticorpo na toxicidade celular dependente de anticorpo.
[0077] O termo “vetor”, como usado no presente documento, destina- se a se referir a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar um outro ácido nucleico ao qual foi ligada. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Um outro tipo de vetor é um vetor de fago. Um outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação
32 / 70 autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos que têm uma origem bacteriana de replicação e vetores de mamíferos epissomais). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira mediante a introdução na célula hospedeira e replicam juntamente com o genoma hospedeiro. Ademais, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes à qual os mesmos são ligados de modo operacional. Tais vetores são mencionados no presente documento como “vetores de expressão”. No geral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão muitas vezes sob a forma de plasmídeos.
[0078] Uma “região Fc variante” compreende uma sequência de aminoácidos que se difere daquela de uma região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido, tipicamente uma ou mais substituições de aminoácidos. Tipicamente, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácidos em comparação com uma região Fc de sequência nativa ou com a região Fc de um polipeptídeo parental, por exemplo de cerca de um a cerca de dez substituições de aminoácidos, e tipicamente de cerca de um a cerca de cinco substituições de aminoácidos em uma região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipeptídeo parental. A região Fc variante de uma descrição possui pelo menos cerca de 80% de homologia com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo parental, pelo menos cerca de 90% de homologia com a mesma e tipicamente pelo menos cerca de 95% de homologia com a mesma.
[0079] Os “fosfolipídios oxidados” (OxPL) se referem a fosfolipídios com um grupo principal de fosfocolina (PC). OxPL são altamente pró- inflamatórios e pró-aterogênicos. A fosforilcolina, um grupo principal polar de certos fosfolipídios, tem sido amplamente implicada em doenças cardiovasculares. As espécies reativas de oxigênio geradas durante a inflamação coronária fazem com que a oxidação da lipoproteína de baixa
33 / 70 densidade (LDL) gere LDL oxidada (oxLDL). De fato, as doenças cardiovasculares (CVD), como aterosclerose, angina instável ou síndrome coronária aguda, demonstraram estar associadas a níveis plasmáticos elevados de oxLDL. LDL é uma partícula de lipoproteína circulante que contém lipídios com um grupo principal polar de PC e proteínas, uma proteína apoB100.
[0080] Durante a oxidação de LDL, são gerados neo-epítopos que contêm PC que não estão presentes em LDL não modificada. A PC recém- exposta em oxLDL é reconhecida pelos receptores sequestrantes em macrófagos, como CD36, e a oxLDL envolta por macrófagos resultante prossegue em direção à formação de células espumosas pró-inflamatórias na parede do vaso. A LDL oxidada também é reconhecida por receptores nas superfícies celulares endoteliais e tem sido relatado como estimulando uma série de respostas, incluindo disfunção endotelial, apoptose e resposta de proteína não enovelada. Os neo-epítopos de PC também são expostos em LDL após a modificação com metabolitos de doenças reativas à fosfolipase A2 ou amina, como aldeídos gerados a partir da oxidação de proteínas glicadas. Essas partículas de LDL alternativamente modificadas também são fatores pró-inflamatórios em CVD. Os anticorpos em direção à fosforilcolina (PC) foram mostrados como se ligando a LDL oxidada ou de outro modo modificada e bloqueando a atividade pró-inflamatória de oxLDL em modelos in vivo ou estudos in vitro.
[0081] Os glicerofosfolipídios representam uma classe comum de lipídios importantes para a integridade de membranas celulares. A oxidação de ácidos graxos insaturados esterificados altera drasticamente as atividades biológicas de fosfolipídios. Além do comprometimento de sua função estrutural, a oxidação produz marcadores de fosfolipídios oxidados (OxPLs) do tipo “auto-modificado” que são reconhecidos por receptores solúveis e associados a células de imunidade inata, incluindo receptores sequestrantes,
34 / 70 anticorpos naturais (codificados por linhagem germinativa), e proteína C reativa, direcionando assim a remoção de células senescentes e apoptóticas ou lipoproteínas oxidadas. Além disso, as OxPLs adquirem atividades biológicas inovadoras não características de seus precursores não oxidados, incluindo a capacidade de regular respostas imunes inatas e adaptativas. Os efeitos de OxPLs descritos in vitro e in vivo sugerem sua relevância potencial em patologias diferentes, incluindo aterosclerose, inflamação aguda, lesão pulmonar e muitas outras condições.
[0082] Os glicerofosfolipídios compreendem uma classe abundante de lipídios que consiste em uma cadeia principal de glicerol, um grupo principal polar que contém fosfato e dois resíduos de ácidos graxos. Os ácidos graxos poli-insaturados ligados a PL (PUFAs) representam o alvo principal para a oxidação não enzimática ou enzimática que não está ligada à geração de energia metabólica. A fragmentação oxidativa de uma molécula de PL gera diversos produtos biologicamente ativos, incluindo fragmentos quimicamente reativos pequenos de PUFAs, como ácidos graxos oxidados não esterificados (por exemplo, hidroperóxidos e isoprostanos) e liso-fosfolipídios. Esses produtos demonstram múltiplas atividades biológicas. A evidência disponível sugere que a oxidação não enzimática de PL-PUFAs prossegue de acordo com os mesmos mecanismos básicos que a oxidação de PUFAs livres (não esterificados). Essa presunção é suportada pela identificação de classes similares de espécies moleculares geradas pela oxidação de PUFAs livres e ligados a PL que são descritos no presente documento. Em contraste com a oxidação não enzimática, a oxidação de PL-PUFAs por enzimas se difere significativamente da oxidação de PUFAs não esterificados. Embora os PUFAs livres possam ser oxidados por múltiplas enzimas que pertencem a famílias de proteínas diferentes e mediante a introdução de diversos grupos oxidados, apenas um grupo de lipoxigenases (12/15 lipoxigenases) aceita PL- PUFAs como substratos que produzem hidroperóxidos de PL. A oxidação e
35 / 70 rearranjos adicionais continuam sem a participação de enzimas e, portanto, a oxidação iniciada por mecanismos enzimáticos e não enzimáticos produz muitos produtos de oxidação de PL avançados similares.
[0083] O receptor do tipo Toll 2, também conhecido como TLR2, é uma proteína que em seres humanos é codificada pelo gene TLR2. TLR2 também foi designado como CD282 (agrupamentos de diferenciação 282). TLR2 desempenha uma função no sistema imunológico. O TLR2 é um receptor de proteína de membrana, que é expresso na superfície de certas células e reconhece substâncias estranhas e transmite sinais adequados às células do sistema imunológico. O TLR2 desempenha uma função fundamental no reconhecimento de patógenos e na ativação da imunidade inata. Os receptores do tipo Toll (TLRs) são altamente conservados de Drosophila para seres humanos e compartilham similaridades estruturais e funcionais. Reconhecem padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) que são expressos em agentes infecciosos e medeiam a produção de citocinas necessárias para o desenvolvimento de imunidade eficaz. Os diversos TLRs exibem padrões de expressão diferentes. Esse gene é expresso mais abundantemente em leucócitos de sangue periférico e medeia a resposta de hospedeiro a bactérias Gram-positivas e leveduras através da estimulação de NF-kB. O TLR2 detecta uma grande faixa de componentes microbianos, como ácido lipoteicoico derivado de gram-positivo, lipoproteínas bacterianas e zimosan. Dos 11 TLRs caracterizados, o TLR2 é exclusivo em virtude de sua capacidade de heterodimerizar com TLR1 ou TLR6, resultando em uma especificidade de ligante relativamente ampla.
[0084] O CD36, por ser um correceptor para TLR2, sugeriu que existe uma via pró-inflamatória entre os lipídios derivados de forma endógena e a ativação da imunidade inata. Os estudos constataram adicionalmente que a expressão e ativação de TLR2 diferentes aprimoradas ocorrem em áreas de fluxo sanguíneo perturbado, como as áreas de predileção de lesão dentro da
36 / 70 árvore aórtica e do coração. Dessa forma, a expressão de TLR2 pode promover aterosclerose em células que não são de origem BM, como células endoteliais e, dessa forma, pode contribuir para o fenótipo pró-inflamatório de células endoteliais ativadas.
[0085] Em camundongos (Ldlr-/-) deficientes de receptor de lipoproteína de baixa densidade suscetível à aterosclerose, a deficiência completa de TLR2 levou a uma redução em aterosclerose. A perda da expressão de TLR2 de células derivadas de BM, entretanto, não teve efeito na progressão da doença. Os dados sugerem que um agonista de TLR2 endógeno desconhecido influenciou a progressão de lesão mediante a ativação de TLR2 em células que não eram de origem celular BM. Como mostrado no presente documento, a administração intraperitoneal de um agonista de TLR2/TLR1 sintético, Pam3CSK4, aumentou a carga de doença dramaticamente em camundongos Ldlr-/-. Uma deficiência completa de TLR2 em camundongos Ldlr-/-, bem como uma deficiência de TLR2 apenas em células derivadas de BM em camundongos Ldlr-/-, atenuaram a aterosclerose mediada por Pam3CSK4, sugerindo uma função para a expressão de célula derivada de BM de TLR2 na transdução dos efeitos de um agonista de TLR2 exógeno.
[0086] OxPL pode ativar a sinalização celular através de vias mediadas por TLR2, resultando em sinalização celular pró-inflamatória. Além disso, a ativação mediada por OxPL do TLR2 pode levar à apoptose e morte celular quando realizada em associação com vias de sinalização que promovem o estresse ER. OxPL induz a sinalização de IL-8 a partir de células endoteliais e induz a sinalização de IL-1β e TNFα em macrófagos através de uma via de sinalização dependente de TLR2. Como demonstrado adicionalmente no presente documento, a ativação de macrófagos através do agonista de TLR2 sintético, PAM3CSK4, estimula diretamente os macrófagos para gerar OxPL. Também foi relatado que a ativação de TLR4 através de agonistas, como o LPS, também levará os macrófagos a gerarem OxPLs
37 / 70 (Popat et al., JCI, 2017). Em conjunto, os dados apresentados no presente documento demonstram que OxPL pode ativar diretamente macrófagos através de TLR2 (ou TLR4) para induzir a sinalização pró-inflamatória e/ou apoptose, e que, inversamente, a ativação de macrófagos através de sinalização de TLR2 ou TLR4 fará, por sua vez, com que os macrófagos produzam OxPL. Na última situação, quando os macrófagos são estimulados por agonistas de TLR2/4, o OxPL gerado localmente tem o potencial de amplificar e aprimorar a via inflamatória por efeitos auto-parácrinos. Dessa forma, os estudos apresentados no presente documento sugerem que OxPL pode tanto estimular diretamente as vias de TLR2, bem como agir de uma maneira parácrina para amplificar a sinalização de agonista de TLR2/4 pró- inflamatório. Essas ideias explicam porque a neutralização de OxPL com um anticorpo para o OxPL in vivo, em uma variedade de configurações inflamatórias, confere tais efeitos anti-inflamatórios profundos que se manifestam no desenvolvimento reduzido da doença.
[0087] Os dados sugerem que os anticorpos, ou fragmentos dos mesmos, que se ligam a OxPL, incluindo EO6, ou outros projetados para se ligar aos grupos principais de fosfocolina (PC) de fosfolipídios oxidados que contêm PC (OxPL), poderiam ser úteis para melhorar os efeitos deletérios de agonismo de TLR2 presente em ampla variedade de doenças. Esses incluem aterosclerose, doenças autoimunes e, especificamente, na doença de Kawasaki, uma doença de crianças de origem desconhecida na qual acredita- se que o agonismo mediado por TLR2 promova arterite coronária que leva a aneurismas coronários, calcificação coronária grave, fluxo sanguíneo coronário desordenado, trombose aguda e maior morbidade e morte. A doença também pode afetar adultos jovens quando os aneurismas coronários assintomáticos passam para trombose aguda, causando infarto agudo do miocárdio. A doença de Kawasaki também pode estar associada a miocardite, insuficiência cardíaca e necessidade de transplante cardíaco.
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[0088] Os anticorpos naturais inatos (NAbs) fornecem a primeira linha de defesa de hospedeiro contra epítopos específicos de oxidação comuns (OSE) em neo-epítopos endógenos (OxLDL e células apoptóticas) e epítopos exógenos de patógenos e mantêm a homeostase de hospedeiro. Os OSEs são bem conhecidos, formados em muitos tecidos inflamatórios, incluindo lesões ateroscleróticas, e são um dos principais alvos de NAbs de IgM. O protótipo de IgM NAb EO6 se liga ao grupo principal de fosfocolina (PC) em fosfolipídios oxidados (OxPL) e bloqueia a absorção de OxLDL por macrófagos. Um anticorpo natural de IgM murino para OxPL que se liga ao grupo principal de fosforilcolina (“PC”) de OxPL, mas não aos fosfolipídios não oxidados nativos (“PL”) foi clonado e caracterizado. Entretanto, os anticorpos como IgM Nab EO6 têm solubilidade limitada e não podem ser prontamente sintetizados.
[0089] O anticorpo EO6 parental é um anticorpo IgM murino que foi clonado e caracterizado e que é o assunto da Patente n° U.S. 6.225.070, que está incorporada ao presente documento a título de referência. A Publicação de Patente n° U.S. 20150376268A1 descreve um anticorpo de cadeia única completamente funcional e anticorpos humanizados que se ligam a OxPL. A mesma descreve as inúmeras alterações moleculares exclusivas para a sequência de DNA das regiões framework de anticorpo parental, cadeias pesada e leve e sequências ligantes que foram determinadas por ciclos repetidos de experimento, que resultaram no desenvolvimento de um EO6- scFv completamente funcional. Quando essa sequência foi inserida no vetor adequado, o scFc resultante é expresso em uma forma solúvel e possui todas as propriedades de ligação imunológica do progenitor em direção aos seus antígenos-alvo identificados, incluindo a capacidade de se ligar a um anticorpo anti-idiotípico exclusivo, AB1-2, cujos epítopos consistem tanto em cadeias pesadas como leves do anticorpo parental. A descrição deste pedido também fornece fragmentos de anticorpo variáveis de cadeia única (“scFv”),
39 / 70 VH, VL e regiões determinantes de complementaridade que se ligam seletivamente a fosfolipídios oxidados. Os scFvs da descrição são solúveis e podem ser prontamente sintetizados. A descrição da publicação de patente n° US 20150376268A1 está aqui incorporada, a título de referência, para todas as finalidades.
[0090] Nos estudos apresentados no presente documento, a neutralização de OxPL pela expressão endógena in vivo do anticorpo EO6 (com o uso do camundongo transgênico EO6-scFv) inibiu consideravelmente a formação de aterosclerose caudada por agonismo de TLR2. As injeções do agonista de TLR2 PAM3CSK4 em camundongos Ldlr-/- alimentados com colesterol levou ao aprimoramento dramático de ateroesclerose. Um conjunto similar de injeções nos camundongos transgênicos EO6-scFv (no fundo Ldlr-/- ) resultou em uma inibição significativa de formação de lesão.
[0091] Em outros estudos apresentados no presente documento, a neutralização de OxPL pode proteger contra um modelo de camundongo da doença de Kawasaki. A administração do patógeno Lactobaccilus casei foi mostrada como causando doença semelhante a Kawasaki em camundongos, com ateroesclerose, arterite de artéria coronária e aneurismas abdominais intensificados resultantes. Isso é dependente de TLR2, à medida que a administração de L. Casei a camundongos deficientes de TLR2 não teve efeito causador de doença. É importante ressaltar que a IL-1 demonstrou estar envolvida e, como observado, o OxPL também é um indutor potente de liberação de IL-1. A injeção de L. Casei nos camundongos transgênicos EO6 (no fundo Ldlr-/-) sob um protocolo idêntico resultou em reduções dramáticas não apenas em ateroesclerose, mas de grande relevância, em arterite coronária em comparação com injeções em camundongos Ldlr-/-. O anticorpo EO6 não se liga diretamente a L. Casei e, portanto, neutraliza o OxPL causado pelos efeitos inflamatórios associados ao agonismo mediado por TLR2. O desenvolvimento de arterite coronária e subsequentemente aneurismas
40 / 70 coronários tem sido uma complicação principal e temida em crianças que desenvolvem a doença de Kawasaki, e estima-se que ocorra em até 25% das crianças, apesar da terapia atual. Tipicamente, a doença de Kawasaki é tratada com imunoglobulina intravenosa (IVIG) derivada de plasma humano agrupado e purificado e aspirina (que é uma terapia anti-inflamatória generalizada, mas não específica). As injeções de anticorpo anti-OxPL equivalente humano ou humanizado, com alto teor de titulação, modificado para aprimorar sua eficácia biológica poderiam, então, conferir proteção sem quaisquer efeitos colaterais antecipados, à medida que tais anticorpos anti- OxPL estão presentes no repertório de células B humanas.
[0092] Os dados experimentais demonstram assim que a aterosclerose e arterite inflamatória causadas por agonismo mediado por TLR2 in vivo em camundongos podem ser evitadas pela neutralização de OxPL. O agonismo de TLR2 tem sido implicado em inúmeras doenças bacterianas, é claro, mas também em uma variedade das chamadas doenças mediadas autoimunes, como lúpus, artrite reumatoide e outras. Os dados demonstram que a neutralização de OxPL pelo uso de anticorpos que alvejam a PC de OxPL pode melhorar ou prevenir muitas doenças que são acentuadas ou influenciadas pela ativação de vias de sinalização mediadas por TLR2.
[0093] A descrição provê o uso de anticorpos, fragmentos de anticorpos e anticorpos humanizados que se ligam a OxPL e que, em algumas instâncias, têm a especificidade de ligação igual ou similar à do anticorpo EO6. Os fragmentos de anticorpo podem ser gerados por meios tradicionais, como digestão enzimática ou por técnicas recombinantes. Em certas circunstâncias, existem vantagens do uso de fragmentos de anticorpo, em vez de anticorpos inteiros. O tamanho menor dos fragmentos permite a rápida depuração e pode levar a um acesso melhor ao tecido. Em um ambiente agudo, a meia-vida de fragmentos de anticorpo não é crítica. Para uma análise de certos fragmentos de anticorpo, consulte Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:
41 / 70 129 a 134.
[0094] A descrição, embora provendo sequências de anticorpos específicas e fragmentos de sequência de anticorpos que têm atividade biológica, descreve adicionalmente que essas sequências podem ser usadas para gerar variantes melhoradas. Desta maneira, em algumas instâncias, um anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ter uma identidade percentual com as sequências da descrição.
[0095] Em algumas modalidades, a(s) modificação(ões) de sequência de aminoácidos dos anticorpos descritos no presente documento é(são) contemplada(s). Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. As variantes da sequência de aminoácidos do anticorpo podem ser preparadas mediante a introdução de alterações adequadas na sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo ou por síntese de peptídeo. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para chegar ao construto final, desde que o construto final possua as características desejadas. As alterações de aminoácidos podem ser introduzidas na sequência de aminoácidos de anticorpo em questão no momento em que a sequência é feita.
[0096] A descrição provê um anticorpo ou fragmento de anticorpo capaz de se ligar a OxPL ou fosforilcolina e/ou um conjugado de fosforilcolina, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende um domínio de cadeia pesada variável (VH) e/ou um domínio de cadeia leve variável (VL), e em que
[0097] (a) o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos que inclui uma, duas ou três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) selecionadas do grupo que consiste em:
[0098] SEQ ID NO:6 e sequência que são pelo menos 95%, 96%,
42 / 70 97%, 98%, 99% ou 99,9% idênticas a SEQ ID NO:6; 96% 97%
[0099] SEQ ID NO:7 e sequência que são pelo menos 95%, 98%, 99% ou 99,9% idênticas a SEQ ID NO:7; e 96% 97%
[00100] SEQ ID NO:8 e sequência que são pelo menos 95%, 98%, 99% ou 99,9% idênticas a SEQ ID NO:8;
[00101] (b) o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos que inclui uma, duas ou três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) selecionadas do grupo que consiste em:
[00102] SEQ ID NO:9 ou 12 e sequência que são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% idênticas a SEQ ID NO:9 ou 12;
[00103] SEQ ID NO:10 e sequência que são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% idênticas a SEQ ID NO:10; e
[00104] SEQ ID NO:11 e sequência que são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% idênticas a SEQ ID NO:11.
[00105] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende um domínio VH que compreende uma sequência de aminoácidos que inclui CDRs que compreendem SEQ ID NO:6, 7 e 8, e/ou o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos que inclui CDRs que compreendem SEQ ID NO:9, 10 e 11, ou SEQ ID NO:10, 11 e 12.
[00106] Em uma modalidade, a descrição provê um anticorpo ou um scFv selecionado do grupo que consiste em: (a) um anticorpo ou scFv com domínios de cadeia pesada e leve que compreendem as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NO:6, 7, 8, 9, 10 e 11; e (b) um anticorpo ou scFv com domínios de cadeia pesada e leve que compreendem as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NO:6, 7, 8, 10, 11 e 12. Em uma modalidade, (a) ou (b) é ligado a uma região Fc.
[00107] Em uma modalidade, a descrição provê um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia leve como apresentado na SEQ ID NO:2 do aminoácido 1 a cerca de 146. Em uma outra modalidade, a descrição
43 / 70 provê um anticorpo com uma região variável de cadeia leve humanizada que compreende a sequência da SEQ ID NO:4 do aminoácido 1 a cerca de 135. Em uma outra modalidade, a descrição provê um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de SEQ ID NO:2 de cerca de 162 a cerca de 269. Em uma outra modalidade, a descrição provê um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada humanizada que compreende uma sequência de SEQ ID NO:4 de cerca de 152 a cerca de 258.
[00108] Em uma outra modalidade, a descrição provê um anticorpo quimérico que compreende, por exemplo, uma VH e/ou VL murina e uma região Fc humana. Por exemplo, a SEQ ID NO:14 provê a sequência de um anticorpo quimérico da descrição. Na SEQ ID NO:14 os aminoácidos 1 a 33 compreendem uma sequência-líder de cadeia Ig kappa para secreção de anticorpo; os aminoácidos 34 a 146 compreendem uma região variável de cadeia leve EO6; os aminoácidos 147 a 161 provêm uma sequência ligante flexível; os aminoácidos 162 a 284 provêm uma região variável de cadeia pesada EO6 com uma mutação tripla de P201A, S224A e A225D em relação ao anticorpo EO6 murino do tipo selvagem; os aminoácidos 285 a 517 compreendem uma região Fc, na SEQ ID NO:14, a região Fc é um IgGl-Fc humano com uma modificação de C290S e H294Y para aumentar a atividade de ADCC. A SEQ ID NO:14 também provê um ligante adicional e sequência de etiqueta His, que, de acordo com um versado na técnica, são opcionais (por exemplo, SEQ ID NO:14 de aminoácido 518 a 528). A descrição também contempla e provê uma sequência de codificação para SEQ ID NO:14 que compreende SEQ ID NO:13. Um versado na técnica pode identificar prontamente a sequência de ácidos nucleicos que corresponde aos diversos domínios identificados acima. A descrição inclui também uma sequência de anticorpo quimérico que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% idêntica à SEQ ID NO:14 do aminoácido 1 a 284 ligada a uma região
44 / 70 Fc de uma imunoglobulina diferente (por exemplo, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, ou qualquer uma das subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2).
[00109] Em uma modalidade, a descrição provê um scFv que compreende um ligante entre a região variável de cadeia leve e a região variável de cadeia pesada. O ligante pode ser qualquer número de ligantes peptídicos comumente usados. Em uma modalidade, o ligante compreende uma unidade de repetição de GGGS (SEQ ID NO:5). A repetição de GGGS (SEQ ID NO:5) pode ser 2, 3, 4 ou mais vezes.
[00110] Em uma outra modalidade, a descrição compreende um scFv que compreende uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO:2 de aminoácido 1 a 146 ligada por um ligante peptídico a uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:2 do aminoácido 162 a cerca de 269. Em uma modalidade específica, o scFv compreende uma sequência de SEQ ID NO:2 do aminoácido 1 a 269. Em uma outra modalidade, a descrição provê um scFv que tem uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO:2 do aminoácido 1 a cerca de 269 ou 1 a cerca de 303. Em uma modalidade adicional, a descrição provê um scFv que tem uma sequência de polipeptídeos que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:2 do aminoácido 1 a cerca de 303 e que se liga seletivamente a um fosfolipídio oxidado.
[00111] Em ainda outras modalidades, os construtos de fusão que compreendem um primeiro domínio que compreende SEQ ID NO:2 de aminoácido 1 a cerca de 269 ou 1 a cerca de 303 ou uma variante do mesmo são ligados de modo operacional e um segundo domínio que compreende (i) uma identificação detectável ou (ii) um polipeptídeo de interesse. Um versado na técnica irá reconhecer que tais construtos de fusão podem ser gerados com o uso de técnicas de biologia molecular ou química que ligam uma sequência
45 / 70 de codificação que compreende uma sequência de SEQ ID NO:1 ou variante da mesma com uma sequência de codificação de, por exemplo, um polipeptídeo de interesse. As sequências de codificação e domínios podem ser separados por um ligante ou diretamente ligados.
[00112] Em uma outra modalidade, a descrição compreende um scFv que compreende uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO:4 de aminoácido 1 a 135 ligada por um ligante peptídico a uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:4 do aminoácido 152 a cerca de 258. Em uma modalidade específica, o scFv compreende uma sequência de SEQ ID NO:4 do aminoácido 1 a 258. Em uma outra modalidade, a descrição provê um scFv que tem uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO:4 do aminoácido 1 a cerca de 258 ou 1 a cerca de 263. Em uma modalidade adicional, a descrição provê um scFv que tem uma sequência de polipeptídeos que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:4 do aminoácido 1 a cerca de 258 e que se liga seletivamente a um fosfolipídio oxidado.
[00113] Em ainda outras modalidades, os construtos de fusão que compreendem um primeiro domínio que compreende SEQ ID NO:4 de aminoácido 1 a cerca de 258 ou 1 a cerca de 264 ou uma variante do mesmo são ligados de modo operacional e um segundo domínio que compreende (i) uma identificação detectável ou (ii) um polipeptídeo de interesse. Um versado na técnica irá reconhecer que tais construtos de fusão podem ser gerados com o uso de técnicas de biologia molecular ou química que ligam uma sequência de codificação que compreende uma sequência de SEQ ID NO:3 ou variante da mesma com uma sequência de codificação de, por exemplo, um polipeptídeo de interesse. As sequências de codificação e domínios podem ser separados por um ligante ou diretamente ligados.
[00114] As moléculas de ácido nucleico que codificam as sequências
46 / 70 de aminoácidos dos anticorpos, fragmentos de anticorpo e variantes do anticorpo são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Para preparar variantes, tais métodos incluem, porém sem limitação, isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes de sequência de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação por mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou sítio-dirigida), mutagênese de PCR, e mutagênese de cassete de uma variante preparada anteriormente ou uma versão não variante do anticorpo.
[00115] Em uma modalidade particular, a descrição provê um scFv murino que é codificado por uma sequência de polinucleotídeos de SEQ ID NO:1. Em uma modalidade adicional, a descrição provê um scFv que é codificado por uma sequência de polinucleotídeos que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1 e que produz um polipeptídeo que se liga seletivamente a fosfolipídios oxidados.
[00116] Em uma outra modalidade, a descrição provê um scFv que compreende um ligante entre a região variável de cadeia leve e a região variável de cadeia pesada. O ligante pode ser qualquer número de ligantes peptídicos comumente usados. Em uma modalidade, o ligante compreende uma unidade de repetição de GGGS (SEQ ID NO:5). A repetição de GGGS (SEQ ID NO:5) pode ser 2, 3, 4 ou mais vezes.
[00117] A descrição abrange também anticorpos humanizados. Diversos métodos para humanizar anticorpos não humanos são conhecidos na técnica. Por exemplo, um anticorpo humanizado pode ter um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos no mesmo a partir de uma fonte que é não humana. Esses resíduos de aminoácidos não humanos são muitas vezes denominados como resíduos de “importação”, que são tipicamente tomados de um domínio variável de “importação”. A humanização pode ser
47 / 70 essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al. (1986) Nature 321: 522 a 525; Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323 a 327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1.534 a 1.536), mediante a substituição de sequências de região hipervariável para as sequências correspondentes de um anticorpo humano. Desta maneira, tais anticorpos “humanizados” são anticorpos quiméricos (patente n° U.S. 4.816.567) em que substancialmente menos que um domínio variável humano intato foi substituído pela sequência correspondente a partir de uma espécie não humana. Em prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de região hipervariável e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedor.
[00118] A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leve como pesado, a serem usados na produção dos anticorpos humanizados pode ser importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o chamado método de “melhor ajuste”, a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é submetida à triagem em relação a biblioteca inteira de sequências de domínio variável humano. A sequência humana que é mais próxima àquela do roedor é, então, aceita como o framework humano para o anticorpo humanizado. Consultar, por exemplo, Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:
2.296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901. Um outro método usa um framework particular derivado da sequência consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. O mesmo framework pode ser usado para diversos anticorpos humanizados diferentes. Consultar, por exemplo, Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 89:
4.285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151: 2.623.
[00119] No geral, é adicionalmente desejável que os anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para alcançar esse objetivo, de acordo
48 / 70 com um método, os anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequências parentais e diversos produtos humanizados conceituais com o uso de modelos tridimensionais das sequências humanizadas e parentais. Os modelos de imunoglobulina tridimensionais estão comumente disponíveis e são familiares para aqueles versados na técnica. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e exibem estruturas de conformação tridimensional prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção dessas exibições permite a análise da função provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata se ligar ao seu antígeno. Dessa forma, os resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir do recipiente e sequências de importação de modo que a característica de anticorpo desejada, como afinidade aumentada para o(s) antígeno(s) alvo(s), seja alcançada. No geral, os resíduos de região hipervariável estão diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação a antígeno.
[00120] Em uma modalidade particular, a descrição provê um scFv humanizado que é codificado por uma sequência de polinucleotídeos de SEQ ID NO:3. Em uma modalidade adicional, a descrição provê um scFv humanizado que é codificado por uma sequência de polinucleotídeos que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 e que produz um polipeptídeo que se liga seletivamente a fosfolipídios oxidados.
[00121] A descrição provê adicionalmente um scFv descrito no presente documento que compreende adicionalmente uma região cristalizável de fragmento (“Fc”) de um anticorpo. Em uma modalidade particular, a região Fc é de um anticorpo humanizado ou humano. A região Fc é a região
49 / 70 de cauda de um anticorpo que interage com receptores de superfície celular chamados de receptores Fc e algumas proteínas do sistema complementar. Essa propriedade permite que os anticorpos ativem o sistema imunológico. Em isotipos de anticorpo IgG, IgA e IgD, a região Fc é composta de dois fragmentos de proteína idênticos, derivados do segundo e terceiro domínios constantes das duas cadeias pesadas do anticorpo; regiões Fc de IgM e IgE contêm três domínios constantes de cadeia pesada (domínios CH 2 a 4) em cada cadeia de polipeptídeo. As regiões Fc de IgGs contêm um sítio de N- glicosilação altamente conversado. A glicosilação do fragmento Fc é essencial para a atividade mediada por receptor Fc. Os N-glicanos fixados a esse sítio são predominantemente estruturas diantenárias fucosiladas em núcleo do tipo complexo. Além disso, pequenas quantidades desses N-glicanos também contêm GlcNAc bissecante e resíduos de ácido siálico α-2,6 ligados. A outra parte de um anticorpo, chamada região Fab, contém seções variáveis que definem o alvo específico que o anticorpo pode se ligar. O scFv da descrição é compreendido de elementos da região Fab. Em contrapartida, a região Fc de todos os anticorpos em uma classe é igual para cada espécie; a mesma é constante em vez de variável. A região Fc é, portanto, às vezes chamada de “região constante de fragmento”. Desta maneira, as sequências de polinucleotídeos e polipeptídeos que codificam as regiões Fc para inúmeras espécies já foram determinadas e seriam conhecidas por um versado na técnica. Em uma modalidade particular, a descrição provê uma sequência de polinucleotídeos de scFv descrita no presente documento que compreende adicionalmente uma sequência de polinucleotídeos que codifica uma região Fc do anticorpo IgG (por exemplo, de um anticorpo IgG humano). Em uma modalidade adicional, a descrição provê uma sequência de polipeptídeos de scFv descrita no presente documento que compreende adicionalmente uma sequência de polipeptídeos de uma região Fc de um anticorpo IgG.
[00122] Em uma modalidade particular, a descrição provê uma
50 / 70 sequência de polinucleotídeos de scFv descrita no presente documento que compreende adicionalmente uma sequência de polinucleotídeos que codifica uma região Fc de anticorpo IgG (por exemplo, de um anticorpo IgG humano). Em uma modalidade adicional, a descrição provê uma sequência de polipeptídeos de scFv descrita no presente documento que compreende adicionalmente uma sequência de polipeptídeos de uma região Fc de um anticorpo IgG. Em uma modalidade, a sequência de codificação para a região Fc compreende uma sequência conforme apresentado na SEQ ID NO:3 de cerca do nucleotídeo 790 a cerca do nucleotídeo 1518.
[00123] Em uma modalidade adicional, a descrição provê um vetor que compreende uma sequência de polinucleotídeos que codifica um scFv conforme apresentado acima com referência à SEQ ID NO:1 e 3, ou sequências que têm identidade de sequência de pelo menos 99%, pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75% ou pelo menos 70% de identidade com SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:3.
[00124] A descrição também provê um anticorpo humanizado que tem a especificidade de ligação de um anticorpo EO6. O anticorpo humanizado compreende (i) uma sequência conforme apresentado na SEQ ID NO:4 de aminoácido 1 a cerca de aminoácido 506 ou (ii) uma sequência que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,8% idêntica à SEQ ID NO:4 de aminoácido 1 a cerca de 506.
[00125] A descrição também provê um polinucleotídeo que codifica um anticorpo humanizado da descrição. O polinucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em (i) um polinucleotídeo que codifica a SEQ ID NO:4, (ii) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes para um polinucleotídeo que consiste em SEQ ID NO:3 e codifica um anticorpo humanizado que se liga a OxPL com uma especificidade substancialmente similar ao anticorpo EO6, (iii) um polinucleotídeo que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,
51 / 70 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,8% idêntico a SEQ ID NO:3 e que codifica um anticorpo que se liga a OxPL com uma especificidade substancialmente similar ao anticorpo EO6; (iv) um polinucleotídeo conforme apresentado na SEQ ID NO:3; (v) um polinucleotídeo de qualquer um dentre (i) a (iv) em que o polinucleotídeo compreende RNA.
[00126] As sequências de polinucleotídeos que codificam componentes de polipeptídeo do anticorpo ou fragmentos de anticorpo da descrição podem ser obtidas com o uso de técnicas recombinantes padrão. As sequências de polinucleotídeos desejadas podem ser isoladas e sequenciadas a partir de células que produzem anticorpo como células de hibridoma. Alternativamente, os polinucleotídeos podem ser sintetizados com o uso de sintetizador de nucleotídeo ou técnicas de PCR. Uma vez obtidas, as sequências que codificam os polipeptídeos são inseridas em um vetor recombinante capaz de replicar e expressar polinucleotídeos heterólogos em hospedeiros procarióticos. Muitos vetores que estão disponíveis e são conhecidos na técnica podem ser usados para o propósito da presente invenção. A seleção de um vetor adequado irá depender principalmente do tamanho dos ácidos nucleicos a serem inseridos no vetor e da célula hospedeira particular a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém diversos componentes, dependendo de sua função (amplificação ou expressão de polinucleotídeo heterólogo, ou ambos) e sua compatibilidade com a célula hospedeira particular na qual reside. Os componentes de vetor incluem, no geral, porém sem limitação: uma origem de replicação, um gene marcador de seleção, um promotor, um sítio de ligação a ribossoma (RBS), uma sequência de sinais, o inserto de ácido nucleico heterólogo e uma sequência de terminação de transcrição.
[00127] Em geral, os vetores plasmídeos que contêm replicon e sequências de controle que são derivadas de espécies compatíveis com a célula hospedeira são usados em conexão com esses hospedeiros. O vetor
52 / 70 normalmente carrega um sítio de replicação, bem como sequências de marcação que são capazes de prover seleção fenotípica em células transformadas. Por exemplo, E. Coli é tipicamente transformado com o uso de pBR322, um plasmídeo derivado de uma espécie de E. Coli. pBR322 contém genes que codificam resistência à ampicilina (Amp) e tetraciclina (Tet) e, dessa forma, provê um meio fácil para identificar células transformadas. pBR322, seus derivados, ou outros plasmídeos microbianos ou bacteriófago também pode conter, ou ser modificado para conter, promotores que podem ser usados pelo organismo microbiano para expressão de proteínas endógenas. Os exemplos de derivados de pBR322 usados para a expressão de anticorpos particulares são descritos em detalhes em Carter et al.r patente n° U.S.
5.648.237.
[00128] Além disso, os vetores de fago que contêm sequências de controle e replicon que são compatíveis com o micro-organismo hospedeiro podem ser usados como vetores de transformação em conexão com esses hospedeiros. Por exemplo, os vetores de bacteriófago podem ser usados na produção de um vetor recombinante que pode ser usado para transformar células hospedeiras suscetíveis, como E. Coli LE392.
[00129] O vetor de expressão da descrição pode compreender dois ou mais pares de promotor-cistron, que codificam cada um dos componentes do polipeptídeo. Um promotor é uma sequência reguladora não traduzida situada a montante (5’) de um cistron que modula sua expressão. Os promotores procarióticos tipicamente se incluem em duas classes, induzíveis e constitutivas. O promotor induzível é um promotor que inicia níveis aumentados de transcrição do cistron sob seu controle em resposta a alterações na condição de cultura, por exemplo, a presença ou ausência de um nutriente ou uma alteração de temperatura.
[00130] Um grande número de promotores reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais é bem conhecido. O promotor
53 / 70 selecionado pode ser operacionalmente ligado ao DNA de cistron que codifica a cadeia leve ou pesada mediante a remoção do promotor do DNA de fone através de digestão com enzima de restrição e mediante a inserção da sequência promotora isolada no vetor da invenção. Tanto a sequência promotora nativa como muitos promotores heterólogos podem ser usados para direcionar a amplificação e/ou expressão dos genes-alvo. Em algumas modalidades, são usados promotores heterólogos, à medida que permitem, no geral, transcrição maior e rendimentos mais altos de gene alvo expresso em comparação com o promotor de polipeptídeo alvo nativo.
[00131] Os promotores adequados para uso com hospedeiros procarióticos incluem o promotor PhoA, os sistemas promotores de 3- galactamase e lactose, um sistema promotor de triptofano (trp) e promotores híbridos, como o promotor tac ou trc. Entretanto, outros promotores que são funcionais em bactérias (como outros promotores de bactérias ou fagos conhecidos) também são adequados. Suas sequências de nucleotídeos foram publicadas, permitindo assim que um versado na técnica operacionalmente ligue as mesmas a cistrons que codificam as cadeias leve e pesada (Siebenlist et al.r (1980) Cell 20: 269) com o uso de ligantes ou adaptadores para fornecer quaisquer sites de restrição necessários.
[00132] Em uma outra modalidade, a produção das imunoglobulinas de acordo com a descrição pode ocorrer no citoplasma da célula hospedeira e, portanto, não exige a presença de sequências de sinal de secreção dentro de cada cistron. Sob esse aspecto, as cadeias leves e pesadas de imunoglobulina são expressas, enoveladas e montadas para formar imunoglobulinas funcionais dentro do citoplasma. Certas cepas hospedeiras (por exemplo, cepas de E. Coli trxB) provêm condições citoplasmáticas que são favoráveis para a formação de ligação de dissulfeto, permitindo assim o enovelamento e montagem adequada de subunidades de proteína expressa. Proba and Pluckthun Gene, 159: 203 (1995).
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[00133] As células hospedeiras procarióticas adequadas para expressar anticorpos da invenção incluem Archaebacteria e Eubacteria, como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos. Os exemplos de bactérias úteis incluem Escherichia (por exemplo, E. Coli), Bacilli (por exemplo, B. subtilis), Enterobacteria, espécies Pseudomonas (por exemplo, P. aeruginosa), Salmonella typhlmurlum, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla ou Paracoccus. Em uma modalidade, são usadas células gram-negativas. Em uma modalidade, as células de E. Coli são usadas como hospedeiros para a descrição. Os exemplos de cepas de E. Coli incluem a cepa W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), páginas 1.190 a 1.219; depósito ATCC n° 27.325) e derivados dos mesmos, incluindo a cepa 33D3 (patente n° U.S. 5.639.635). Outras cepas e derivados das mesmas, como E. Coli 294 (ATCC 31.446), E. Coli B, E. ColiX 1776 (ATCC 31.537) e E. Coli RV308 também são adequados. Esses exemplos são ilustrativos em vez de limitadores. Os métodos para a construção de derivados de qualquer uma das bactérias acima mencionadas que têm genótipos definidos são conhecidos na técnica e descritos em, por exemplo, Bass et al., Proteins, 8: 309 a 314 (1990). No geral, é necessário selecionar as bactérias adequadas levando em consideração a replicabilidade do replicon nas células de uma bactéria. Por exemplo, as espécies E. Coli, Serratia, ou Salmonella podem ser adequadamente usadas como o hospedeiro quando os plasmídeos bem conhecidos como pBR322, pBR325, pACYC177 ou pKN410 são usados para fornecer o replicon. Tipicamente, a célula hospedeira deve secretar quantidades mínimas de enzimas proteolíticas, e pode ser desejável que inibidores de protease adicionais sejam incorporados na cultura celular.
[00134] As células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão descritos acima e cultivadas em meio nutriente convencional modificado conforme adequado para induzir promotores, selecionar
55 / 70 transformantes ou amplificar os genes que codificam as sequências desejadas.
[00135] Transformação significa introduzir DNA no hospedeiro procariótico, de modo que o DNA seja replicável, como um elemento extracromossômico ou por um integrador cromossômico. Dependendo da célula hospedeira usada, a transformação é feita com o uso de técnicas padrão adequadas para tais células. O tratamento com cálcio que emprega cloreto de cálcio é, no geral, usado para células bacterianas que contêm barreiras de parede celular substanciais. Um outro método para transformação emprega polietilenoglicol/ DMSO. Ainda outra técnica usada é a eletroporação.
[00136] As células procarióticas usadas para produzir os polipeptídeos da descrição são cultivadas em meios conhecidos na técnica e adequados para a cultura das células hospedeiras selecionadas. Os exemplos de meios adequados incluem caldo de luria (LB) mais suplementos nutricionais necessários. Em algumas modalidades, os meios também contêm um agente de seleção, escolhido com base na construção do vetor de expressão, para permitir seletivamente o crescimento de células procarióticas que contêm o vetor de expressão. Por exemplo, a ampicilina é adicionada aos meios para crescimento de células que expressam o gene resistente à ampicilina.
[00137] Quaisquer suplementos necessários além de fontes de carbono, nitrogênio e fosfato inorgânico também podem ser incluídos em concentrações adequadas introduzidas isoladamente ou como uma mistura com um outro suplemento ou meio, como uma fonte de nitrogênio complexa. Opcionalmente, o meio de cultura pode conter um ou mais agentes de redução selecionados do grupo que consiste em glutationa, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol e ditiotreitol. As células hospedeiras procarióticas são cultivadas a temperaturas adequadas.
[00138] Em uma modalidade, os polipeptídeos expressos são secretados em e recuperados do periplasma das células hospedeiras. A recuperação de proteína tipicamente envolve a ruptura do micro-organismo,
56 / 70 no geral, por tal meio como choque osmótico, sonicação ou lise. Uma vez que as células são rompidas, os restos de células ou células inteiras podem ser removidos por centrifugação ou filtração. As proteínas podem ser adicionalmente purificadas, por exemplo, por cromatografia em resina de afinidade. Alternativamente, as proteínas podem ser transportadas para o meio de cultura e isoladas no mesmo. As células podem ser removidas da cultura e o sobrenadante de cultura sendo filtrado e concentrado para purificação adicional das proteínas produzidas. Os polipeptídeos expressos podem ser adicionalmente mais isolados e identificados com o uso de métodos comumente conhecidos, como eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e ensaio Western blot. A fermentação de grande escala ou pequena escala pode ser usada e pode ser otimizada com o uso de habilidades bem conhecidas na técnica.
[00139] Os métodos de purificação de proteína padrão conhecidos na técnica podem ser empregados. Os procedimentos a seguir são exemplificadores de procedimentos de purificação adequados: fracionamento em colunas de imunoafinidade ou de troca iônica, precipitação com etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica ou em uma resina de troca catiônica como DEAE, cromatofoco, SDS-PAGE, precipitação com sulfato de amônio, e filtração em gel.
[00140] A descrição provê adicionalmente um vetor de expressão que codifica um anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo descrito no presente documento que é transferido para um organismo hospedeiro adequado. O organismo hospedeiro adequado é um micro-organismo, levedura ou um sistema celular de mamífero. Tipicamente, o sistema celular de mamífero é derivado de monócitos (por exemplo, macrófagos, monócitos e neutrófilos), derivado de linfócitos (por exemplo, mieloma, hibridoma e uma célula B imortalizada normal), células parenquimatosas (por exemplo, hepatócitos) e não parenquimatosas (por exemplo, células estreladas).
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[00141] A descrição também provê composições ou formulações farmacêuticas que compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo da descrição. As composições ou formulações farmacêuticas podem compreender adicionalmente carreadores, excipientes, diluentes, solubilizantes, estabilizantes, tampões, modificadores de tonicidade, agentes de volume, intensificadores/redutores de viscosidade, tensoativos, agentes quelantes e adjuvantes.
[00142] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” de uma substância/molécula da descrição, agonista ou antagonista pode variar de acordo com fatores como o estado doentio, idade, sexo e peso do indivíduo e a capacidade da substância/molécula, agonista ou antagonista para elicitar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais da substância/molécula, agonista ou antagonista são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos.
[00143] Uma “quantidade profilaticamente eficaz” se refere a uma quantidade eficaz, a dosagens e durante períodos de tempo necessários, para obter o resultado profilático desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, uma vez que uma dose profilática é usada em indivíduos antes ou em um estágio anterior da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor que a quantidade terapeuticamente eficaz.
[00144] As formulações terapêuticas que compreendem um anticorpo ou fragmento do mesmo da descrição são preparadas para armazenamento mediante a mistura do anticorpo ou fragmento que tem o grau de pureza desejado com carreadores, excipientes ou estabilizantes fisiologicamente aceitáveis opcionais (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20a edição (2000), sob a forma de soluções aquosas, formulações liofilizadas ou outras formulações secas. Os carreadores, excipientes ou estabilizantes
58 / 70 aceitáveis são não tóxicos aos recebedores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões, como fosfato, citrato, histidna e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos, como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, como polivinilpirrolidona; aminoácidos, como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, como EDTA; açúcares, como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons formadores de sal, como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos ou polietileno glicol (PEG).
[00145] As composições farmacêuticas descritas no presente documento podem ser administradas parenteralmente por injeção, infusão ou implantação, para administração local ou sistêmica. A administração parenteral, como usado aqui, inclui administração intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraesternal, intracraniana, intramuscular, intrassinovial e subcutânea.
[00146] As composições farmacêuticas descritas no presente documento podem ser formuladas em quaisquer formas de dosagem que são adequadas para administração parenteral, incluindo soluções, suspensões, emulsões e formas sólidas adequadas para soluções ou suspensões em líquido antes da injeção. Tais formas de dosagem podem ser preparadas de acordo com métodos convencionais conhecidos pelos versados na técnica de ciência farmacêutica (consultar, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, supra).
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[00147] As composições farmacêuticas destinadas à administração parenteral podem incluir um ou mais excipientes e carreadores farmaceuticamente aceitáveis, incluindo, porém sem limitação, veículos aquosos, veículos miscíveis em água, veículos não aquosos, agentes antimicrobianos ou conservantes contra o crescimento de micro-organismos, estabilizantes, intensificadores de solubilidade, agentes isotônicos, agentes tamponantes, antioxidantes, anestésicos locais, agentes de suspensão e dispersão, agentes umectantes ou emulsificantes, agentes complexantes, agentes quelantes ou sequestrantes, crioprotetores, lioprotetores, agentes espessantes, agentes de ajuste de pH e gases inertes.
[00148] Os veículos aquosos adequados incluem, porém sem limitação, água, solução salina, solução salina fisiológica ou solução salina tamponada com fosfato (PBS), injeção de cloreto de sódio, injeção de Ringer, injeção de dextrose isotônica, injeção de água estéril, dextrose e injeção de Ringer lactada. Os veículos não aquosos adequados incluem, porém sem limitação, óleos fixos de origem vegetal, óleo de rícino, óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de oliva, óleo de amendoim, óleo de hortelã, óleo de girassol, óleo de gergelim, óleo de soja, óleos vegetais hidrogenados, óleo de soja hidrogenado e triglicerídeos de cadeia média de óleo de coco, e óleo de semente de palma. Os veículos miscíveis em água incluem, porém sem limitação, etanol, 1,3-butanodiol, polietilenoglicol líquido (por exemplo, polietilenoglicol 300 e polietilenoglicol 400), propilenoglicol, glicerina, N- metil-2-pirrolidona, dimetilacetamida e dimetilsulfóxido.
[00149] Em uma modalidade, as composições farmacêuticas descritas no presente documento são formuladas como soluções estéreis prontas para uso. Em uma outra modalidade, as composições farmacêuticas descritas no presente documento são formuladas como produtos solúveis secos estéreis, incluindo pós e comprimidos hipodérmicos, que, se necessário, podem ser reconstituídos com um veículo antes do uso. Em ainda outra modalidade, as
60 / 70 composições farmacêuticas são descritas como suspensões estéreis prontas para uso. Em ainda outra modalidade, as composições farmacêuticas são descritas como produtos insolúveis secos estéreis a serem reconstituídos com um veículo antes do uso. Em mais outra modalidade, as composições farmacêuticas são descritas como emulsões estéreis prontas para uso.
[00150] As composições farmacêuticas podem ser formuladas como uma suspensão, sólido, semissólido ou líquido tixotrópico, para administração como um depósito implantado. Em uma modalidade, as composições farmacêuticas descritas no presente documento são dispersas em uma matriz interna sólida, que é circundada por uma membrana polimérica externa que é insolúvel em fluidos corporais, mas permite que o ingrediente ativo nas composições farmacêuticas se difunda.
[00151] As matrizes internas adequadas incluem polimetilmetacrilato, polibutilmetacrilato, cloreto de polivinila plastificado ou não plastificado, náilon plastificado, polietilenotereftalato plastificado, borracha natural, poli- isopreno, poli-isobutileno, polibutadieno, polietileno, copolímeros de etileno- acetato de vinila, borrachas de silicone, polidimetil siloxanos, copolímeros de carbonato de silicone, polímeros hidrofílicos, como hidrogéis de ésteres de ácido acrílico e metacrílico, colágeno, álcool polivinílico reticulado e acetato de polivinila parcialmente hidrolisado reticulado.
[00152] As membranas poliméricas externas adequadas incluem copolímeros de polietileno, polipropileno, etileno/propileno, copolímeros de etileno/acrilato de etila, copolímeros de etileno/acetato de vinila, borrachas de silicone, polidimetil siloxanos, borracha de neoprene, polietileno clorado, cloreto de polivinila, copolímeros de cloreto de vinila com acetato de vinila, cloreto de vinilideno, etileno e propileno, tereftalato de polietileno de ionômero, borrachas de epicloridrina de borracha butílica, copolímero de etileno/álcool vinílico, terpolímero de etileno/acetato de vinila/álcool vinílico e copolímero de etileno/viniloxietanol.
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[00153] A formulação no presente documento também pode conter mais de um composto ativo conforme necessário para a indicação particular que é tratada, de preferência, aqueles com atividades complementares que não se afetam adversamente. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.
[00154] Os ingredientes ativos também podem ser presos em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsula de gelatina e microcápsula de poli(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de entrega de fármaco coloidal (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20a edição (2000).
[00155] As formulações a serem usadas para administração in vivo precisam ser estéreis. Isso é prontamente realizado por filtração através de membranas de filtração estéril.
[00156] As preparações de liberação sustentada podem ser preparadas. Os exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm a imunoglobulina da invenção, tais matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsula. Os exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2- hidroxietilmetacrilato) ou poli(vinil álcool)), polilactídeos (patente n° U.S.
3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e etil-L-glutamato, etileno- acetato de vinila não degradável, copolímeros de ácido lático-ácido glicólico degradável, como o LUPRON DEPOT (microesferas injetáveis compostas por copolímero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Embora polímeros como etileno-acetato de vinila e ácido lático-ácido glicólico permitam a liberação de moléculas durante mais
62 / 70 de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos. Quando as imunoglobulinas encapsuladas permanecem no corpo por um tempo longo, as mesmas podem desnaturar ou agregar como resultado da exposição à umidade a 37°C, resultando em uma perda de atividade biológica e possíveis alterações na imunogenicidade. As estratégias racionais podem ser planejadas para estabilização, dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se for descoberto que o mecanismo de agregação é a formação de ligação S--S intermolecular através da troca de tio-dissulfeto, a estabilização pode ser alcançada modificando resíduos de sulfidrila, liofilizando a partir de soluções ácidas, controlando o teor de umidade, usando aditivos adequados e desenvolvendo composições de matriz polimérica específicas.
[00157] Os anticorpos, fragmentos de anticorpo e polipeptídeos descritos no presente documento se ligam a OxPLs e bloqueiam seus efeitos pró-inflamatórios. É previsto que o uso in vivo de um anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo da descrição bloqueie os efeitos biológicos de OxPL em muitas situações diferentes. Por exemplo, foi demonstrado que os OxPLs são gerados por macrófagos e outras células através de um mecanismo mediado por TLR2. Esses OxPLs liberados podem causar efeitos vasoativos adversos em todo o corpo do paciente. A injeção/infusão aguda e/ou crônica de um anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo da descrição, portanto, poderia bloquear esses efeitos adversos e/ou alternativamente bloquear ou atenuar eventos inflamatórios similares, resultantes da ativação de TLR2. De modo semelhante, um anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo da descrição também pode ser infundido em um indivíduo a fim de bloquear efeitos pró-inflamatórios mediados por OxPLs gerados a partir de uma variedade de condições patológicas, como infecções virais ou bacterianas ou distúrbios autoimunes. Desta maneira, um anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo da descrição seria eficaz como agentes anti- inflamatórios em outras configurações inflamatórias sistêmicas mediadas pela
63 / 70 ativação de TLR2, como em artrite reumatoide. Desta maneira, um anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo da descrição pode ser usado em muitas configurações ou aplicações clínicas em que anti-inflamatórios e/ou agentes anti-ateroscleróticos precisam ser administrados temporalmente e/ou cronicamente.
[00158] A descrição provê métodos de tratamento com o uso de um anticorpo, fragmento de anticorpo e polipeptídeos da descrição para tratar um indivíduo com uma doença ou distúrbio mediado por TLR2. Em uma modalidade particular, a descrição provê o tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por TLR2 com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo da descrição. Os exemplos de distúrbios ou doenças mediadas por TLR2 incluem, porém sem limitação, doença de Kawasaki (Kang et al., Korean J Pediatr 60(7): 208 a 215 (2017)), diabetes tipo 2 (Sepehri et al., Ceil Mol Biol Lett 21: 2 (2016)), artrite reumatoide (McGarry et al., Arthritis Res Ther 17: 153 (2015)), doença dermatológica (Kang et al., Journal of American Academy of Dermatology, 54 (6): 951 a 983 (2006)), esclerose múltipla (Hossain et al., Oncotarget 6(34): 35.131 a 35.132 (2015)), lúpus eritematoso sistêmico (Liu et al., European Journal of Immunology, 45 (9): 2.683 a 2.693 (2015)), colite ulcerativa (Folova et al., Journal of Histochemistry & Cytochemistry 56(3): 267 a 274 (2008), Graves Disease (Peng et al., Front Immunol, 7: 578 (2016)), síndrome de Sjogren (Sisto et al., Clin Exp Med 17(3): 341 a 350 (2017), doenças autoimunes da tiroide (Peng et al., Front Immunol 7: 547 (2016) e vasculite (Summers et al., Arthritis Rheum 63 (4): 1.124 a 1.135 (2011)). Em uma modalidade particular, a descrição provê o tratamento de um indivíduo com doença de Kawasaki com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, fragmento de anticorpo ou um polipeptídeo da descrição.
[00159] Para uso nas aplicações terapêuticas descritas no presente
64 / 70 documento, kits e artigos de fabricação também são descritos no presente documento. Tais kits podem compreender um carreador, embalagem ou recipiente que é compartimentado para receber um ou mais recipientes, como frascos, tubos e similares, sendo que cada um dos recipientes compreende um dos elementos separados a serem usados em um método descrito no presente documento. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, como vidro ou plástico.
[00160] Por exemplo, o(s) recipiente(s) pode(m) compreender um ou mais anticorpos, fragmentos de anticorpo ou polipeptídeos descritos no presente documento, opcionalmente em uma composição ou em combinação com um outro agente, conforme descrito no presente documento. O(s) recipiente(s) tem(têm) opcionalmente uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que tem uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Tais kits compreendem opcionalmente um rótulo ou descrição de identificação ou instruções relacionadas ao seu uso nos métodos descritos no presente documento.
[00161] Um kit compreenderá tipicamente um ou mais recipientes adicionais, cada um com um ou mais de diversos materiais (como reagentes, opcionalmente na forma concentrada e/ou dispositivos) desejáveis a partir do ponto de vista comercial e do usuário para o uso de um composto descrito no presente documento. Os exemplos não limitadores de tais materiais incluem, porém sem limitação, tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas; rótulos de carreador, embalagem, recipiente, frasco e/ou tubo que listam o conteúdo e/ou instruções para uso e bulas com instruções para uso. Um conjunto de instruções também será geralmente incluído.
[00162] Um rótulo pode estar no ou associado ao recipiente. Um rótulo pode estar em um recipiente quando letras, números ou outros caracteres que
65 / 70 formam o rótulo são fixados, moldados ou gravados no próprio recipiente, um rótulo pode estar associado a um recipiente quando está presente dentro de um receptáculo ou carreador que também retém o recipiente, por exemplo, como uma bula. Um rótulo pode ser usado para indicar que o conteúdo deve ser usado para uma aplicação terapêutica específica. O rótulo também pode indicar instruções para o uso do conteúdo, como nos métodos descritos no presente documento. Esses outros agentes terapêuticos podem ser usados, por exemplo, nas quantidades indicadas no Guia de Referência para os Médicos (PDR - Physicians’ Desk Reference) ou como determinado de outro modo por um versado na técnica.
[00163] Os exemplos a seguir são destinados a ilustrar, mas não limitar, a descrição. Embora sejam típicos daqueles que poderiam ser usados, outros procedimentos conhecidos pelos versados na técnica podem ser usados alternativamente.
EXEMPLOS
[00164] Materiais. Padrões sintéticos 1,2-dinonanoil-sn-glicero-3- fosfocolina (DNPC), 1-palmitoil-2-(5-oxovaleroil)-sn-glicero-3-fosfocolina (POVPC), l-palmitoil-2-glutaroil-sn-glicero-3-fosfocolina (PGPC), l- Palmitoil-2-azelaoil-sn-glicero-3-fosfocolina (PAzPC), 1-palmitoil-2-(9- oxo)nonanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (PONPC) e o anticorpo natural murino IgM EO6, que é livre de LPS, foram obtidos junto à Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). 1-(palmitoil)-2-(5-ceto-6-octeno-dioil)-3-fosfocolina (KOdiAPC) e, l-palmitoil-2-(4-ceto-dodec-3-eno-dioil)-sn-glicero-3- fosfocolina (KDdiAPC) foram adquiridos junto à Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI). Todos os solventes foram do tipo HPLC.
[00165] Geração e caracterização de camundongos transgênicos EO6- scFv. A geração de camundongos C57BL/6 transgênicos que expressam o idiotipo T15/EO6 como um fragmento de anticorpo variável de cadeia simples chamado EO6-scFv-Tg. Em resumo, os cDNAs que codificam
66 / 70 regiões variáveis de EO6 das cadeias pesada e leve foram ligados a um peptídeo de 15 aminoácidos por PCR de sobreposição e clonados em um vetor de expressão pSecTag2A (Invitrogen) que contém uma sequência-líder de cadeia Ig kappa murina para secreção e c-myc e polyHis como etiquetas de epítopo. As células HEK293 foram transfectadas e as propriedades de ligação de EO6-scFv secretadas em sobrenadante de cultura foram mostradas como imitando aquelas do EO6 intacto. O mesmo construto foi então clonado no vetor de expressão específico de fígado pLiv7 e usado para gerar camundongos transgênicos (Tg) no fundo C57BL/6 que expressam o transgene EO6-scFv acionado pelo promotor apoE. A descendência foi submetida à triagem tanto quanto ao título de EO6-scFv plasmático como quanto à integração do transgene por amplificação de PCR do DNA de cauda. As linhagens fundadoras de EO6-scFv transgênicas foram criadas entre si para gerar camundongos transgênicos “homozigotos” e, por sua vez, foram cruzados em camundongos Ldl-/- no fundo C57BL/6. Todos os animais foram genotipados para EO6-scFv e Ldlr-/-, respectivamente, e o plasma analisado para confirmar a expressão do EO6-scFv por imunoensaio. O mRNA de EO6- scFv foi fortemente expresso no fígado, macrófagos peritoneais e baço e, em menor grau, no coração. Os níveis plasmáticos do EO6-scFv foram em média de 20 a 30 µg/ml nesses estudos.
[00166] Espectrometria de massa de OxPL. Os fosfolipídios que contêm PC foram extraídos de NNCM. O meio celular foi removido e as células foram lavadas com PBS. Cada poço foi raspado em 1 ml de solução de metanol/ácido acético (3% em v/v) que contém BHT a 0,01% e transferido para um tubo cônico de vidro de 10 ml e capeado sob N2 (g). Dez nanogramas de DNPC foram adicionados como padrão interno em cada amostra para propósitos de quantificação. Dois mililitros de hexano que contém BHT foram adicionados ao tubo, capeados sob N2 (g), submetidos a vórtice por cinco segundos e, então, centrifugados por 5 min a 3.500 rpm a 4°C. A
67 / 70 camada de hexano superior foi então extraída com o uso de uma pipeta de vidro Pasteur e descartada. A lavagem com hexano/BHT foi repetida três vezes, tampando sob N2 (g), submetendo a vórtice durante cinco segundos e centrifugando após cada lavagem. Após a lavagem final com hexano/BHT, 2 ml de clorofórmio que contém BHT e 750 µl de PBS foram adicionados ao tubo, então, submetidos a vórtice e centrifugados como descrito acima. A camada orgânica inferior foi removida com o uso de uma pipeta de vidro Pasteur e transferida para um tubo cônico de vidro de 15 ml limpo, onde a solução foi removida por aspiração com o uso de um evaporador de nitrogênio e, então, reconstituída em 300 µl de clorofórmio/metanol (2:1 em v/v) para armazenamento a -80°C.
[00167] A separação de OxPLs foi realizada com o uso de cromatografia de fase reversa (RP). Os corações extraídos foram reconstituídos em eluente RP que consiste em 60:40 acetonitrila:água, formiato de amônio 10 mM e ácido fórmico a 0,1% imediatamente antes da injeção. Trinta microlitros da amostra foram injetados em uma coluna de HPLC Ascentis Express C18 (15 cm x 2,1 mm, 2,7 µm; Supelco Analytical, Bellefonte, Pensilvânia, EUA) com separação por um sistema UFLC Prominence da Shimadzu Corporation (Canby, Oregon, EUA). A eluição foi realizada com o uso de um gradiente linear de solvente A (acetonitrila/água, 60:40 em v/v) e solvente B (isopropanol/acetonitrila, 90:10, v/v) com ambos os solventes contendo formiato de amônio 10 mM e ácido fórmico a 0,1%. A composição de fase móvel que foi usada é como exposto a seguir: solvente inicial B a 32% até 4,00 min; comutado para 45% de B; 5,00 min 52% de B; 8,00 min 58% de B; 11,00 min 66% de B; 14,00 min 70% de B; 18,00 min 75% de B; 21,00 min 97% de B; 25,00 min 97% de B; 25,10 min 32% de B. Uma taxa de fluxo de 260 µl/min foi usada para a análise, e a bandeja de amostras e o forno da coluna foram mantidos a 4 e 45°C, respectivamente.
[00168] A detecção de OxPL foi realizada por espectrometria de massa
68 / 70 no modo de polaridade positiva. As varreduras de MRM foram realizadas em 6 transições com o uso de um íon produto de 184,3 m/z, correspondendo à porção química de fosfocolina clivada. Seis padrões comercialmente disponíveis de PONPC, POVPC, PGPC, PAzPC, KOdiAPC e KDdiAPC foram injetados e as atribuições de pico precisas foram baseadas em tempos de retenção e transições de massa. As configurações de espectrometria de massa foram como exposto a seguir: gás cortina, 26 psi; gás de colisão, médio; tensão de aspersão de íons, 5.500 V; temperatura, 500,0°C; gás de fonte de íons 1, 40,0 psi; gás de fonte de íons 30,0 psi; potencial de desagregação, 125 V, potencial de entrada, 10 V; energia de colisão, 53 V; potencial de saída de célula de colisão, 9 V; e tempo de permanência, 50 ms. A calibração de massa externa foi realizada em intervalos regulares. Para quantificação, foram feitas curvas de calibração de monitoramento de reação múltipla (MRM) para cada um dos 6 padrões de OxPL comercialmente disponíveis e os picos foram normalizados com base em suas respostas relativas. Dez nanogramas de padrão interno foram adicionados a todas as amostras durante a extração. Um sistema de espectrômetro de massa com quadrupolo triplo 4000 QTRAP® com uma fonte de íons de eletrospray Turbo V da AB Sciex (Framingham, Massachusetts, EUA) foi acoplado ao sistema de cromatografia líquida.
[00169] Desenvolvimento de Aneurismas da Aorta Abdominal e Dilatação em Modelo de Camundongo de Vasculite KD Induzida por LCWE. A doença de Kawasaki causa arterite coronária persistente (CA) em crianças pequenas e é reconhecida como a principal causa de doença cardíaca adquirida em crianças no mundo desenvolvido atualmente. No modelo de animal, a CA induzida por extrato de parede celular de Lactobacillus casei (LCWE) em camundongos imita com precisão a patogênese de KD em seres humanos. O grupo B L. casei (ATCC 11578) foi cultivado em caldo Lactobacillus MRS, coletado por centrifugação durante a fase de crescimento
69 / 70 exponencial e lavado com PBS a pH 7,40. Após a coleta, as células foram tratadas de um dia para o outro com SDS a 4% e, então, incubadas sequencialmente com 250 ug/ml de RNase, DNasel e tripsina. O pélete final foi então sonicado (5 g de peso úmido embalado em 15 ml de PBS) por 2 h em uma configuração de pulso de 9 s de pulso/5 s de pausa na frequência de 20 kHz (Vibra Cell, Sonics & Materials Inc., Newtown, CT). Após 1 h de centrifugação a 20.000 x g, a concentração de sobrenadante foi determinada com base em seu teor de ramnose com o uso de um ensaio colorimétrico de ácido fenol-sulfúrico (Dubois et al. 1956). A concentração de endotoxina dessa preparação foi <1,5 pg/µg, como determinado pelo ensaio de lisado de amebócito Limulus (Associates of Cape Cod Inc., East Falmouth, MA).
[00170] Os camundongos C57/BL6 com quatro semanas de idade foram injetados com 250 ug de LCWE em PBS ou com solução salina sozinha. Os camundongos foram sacrificados em 4 pontos no tempo de 7, 14, 21 e 28 dias. As artérias abdominais e coronárias foram identificadas em seções seriais (7 µm), fixadas com formalina e manchadas com hematoxilina e eosina. Para a análise imunoistoquímica, as seções foram pré-tratadas com peróxido de hidrogênio a 0,3% em PBS por 30 min. Os anticorpos marcadores inflamatórios ou anticorpos de controle de isotipo foram aplicados em albumina sérica bovina a 0,5% em PBS a 1:100 por 1 h. As lâminas foram então lavadas e o anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano silvestre biotinilado (Vector Lab, Burlingame, CA) foi aplicado a 1:500 por 30 min, lavado e manchado com peroxidase de rábano conjugado com estreptavidina a 1:1.000 por 30 min. O manchamento imunoistoquímico foi detectado com o uso do kit SK-4100 DAB, como as instruções do fabricante (Vector Lab). Os dados mostraram que a formação de AAA induzida por LCWE e histologia inflamatória intensa em camundongos EO6-Tg foram significativamente reduzidas em comparação com os camundongos de controle (Figura 17 a Figura 21).
70 / 70
[00171] Ensaios de citocina inflamatória sérica. O kit de imunoensaio Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-Plex (Bio-Rad Laboratories, Inc.) foi usado para detectar citocinas diferentes simultaneamente no plasma de camundongos Ldlr-/- ou Ldlr-/- EO6scFv-Tg tratados com LCWE e colocados em dieta HFC durante 12 semanas. As medições e análises de dados de todos os ensaios foram realizadas com base no protocolo do sistema Bio-Plex em combinação com o software Bio-Plex Manager. Resultados são mostrados na Figura 10. Em comparação aos camundongos Ldlr-/- (n=7 a 10), os camundongos Ldl_r_/_EO6-scFv-Tg (n=7 a 10) mostraram que os níveis plasmáticos de certas citocinas/quimiocinas pró-inflamatórias (TNF-alfa, CCL2, CCL5, CXCL1, IL6 e IL12) foram significativamente diminuídos por ensaios Bioplex multiplex (Bio-Rad), indicando uma diminuição generalizada em inflamação sistêmica em camundongos EO6scFv-TG Ldlr-/-.
[00172] Diversas modalidades foram descritas no presente documento. Todavia, será compreendido que diversas modificações podem ser feitas sem que se desvie do espírito e escopo desta descrição. Consequentemente, outras modalidades são abrangidas pelo escopo das reivindicações a seguir.

Claims (24)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para tratar um indivíduo com um distúrbio ou doença mediada por receptor do tipo Toll 2 (TLR2), caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo que se liga especificamente a em fosfolipídio oxidante (OxPL), em que o anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo inibe uma atividade biológica do OxPL.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente administrar ao indivíduo um agente terapêutico adicional que é útil para tratar um distúrbio ou doença mediada por TLR2.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o distúrbio ou doença mediada por TLR2 é doença de Kawasaki, diabetes tipo 2, artrite reumatoide, doença dermatológica, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, colite ulcerativa, doença de Graves, síndrome de Sjogren, doenças autoimunes da tiroide ou vasculite.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o distúrbio ou doença mediada por TLR2 é doença de Kawasaki.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente administrar ao indivíduo imunoglobulina intravenosa (IVIG) e/ou salicilatos.
6. Método de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um indivíduo humano que tem menos que cinco anos de idade.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a atividade biológica do OxPL compreende ativação de via de apoptose de CD36-TLR2.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a
7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo é um fragmento variável de cadeia única (ScFv).
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo reconhece e se liga a um grupo principal de fosfocolina de um fosfolipídio oxidado, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende um domínio de cadeia pesada variável (VH) e/ou um domínio de cadeia leve variável (VL), e em que (a) o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos que inclui uma, duas ou três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NO:6 e sequência que são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% idênticas a SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7 e sequência que são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% idênticas a SEQ ID NO:7; e SEQ ID NO:8 e sequência que são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99.9% idênticas a SEQ ID NO:8; e (b) o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos que inclui uma, duas ou três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NO:9 ou 12 e sequência que são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% idênticas a SEQ ID NO:9 ou 12; SEQ ID NO:10 e sequência que são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% idênticas a SEQ ID NO:10; e SEQ ID NO:11 e sequência que são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% idênticas a SEQ ID NO:11.
10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo é administrado de modo intravascular.
11. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos que inclui CDRs que compreendem SEQ ID NO:6, 7 e 8, e/ou o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos que inclui CDRs que compreendem SEQ ID NO:9, 10 e 11, ou SEQ ID NO:10, 11 e 12.
12. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é selecionado do grupo que consiste em: (a) um anticorpo ou scFv com domínios de cadeia pesada e leve que compreendem as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NO:6, 7, 8, 9, 10 e 11; e (b) um anticorpo ou scFv com domínios de cadeia pesada e leve que compreendem as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NO:6, 7, 8, 10, 11 e 12.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizado pelo fato de que os domínios de cadeia pesada e leve são ligados a uma região Fc ou FC2.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 13, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo compreende um fragmento variável de cadeia única (“scFv”) que reconhece um grupo principal de fosfocolina de um fosfolipídio oxidado.
15. Método ou uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o scFv é solúvel sob condições fisiológicas.
16. Método para inibir um ou mais agentes imunopotenciadores selecionados do grupo que consiste em TNFα, CCL5, CCL2, CXCL1, IL-6 e IL12 caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo que se liga especificamente a um fosfolipídio oxidante (OxPL), em que o anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo inibe o nível do agente imunopotenciador no plasma de um indivíduo.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo é um fragmento variável de cadeia única (ScFv).
18. Método de acordo com a reivindicação 16 ou 17,
caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo reconhece e se liga a um grupo principal de fosfocolina de um fosfolipídio oxidado, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende um domínio de cadeia pesada variável (VH) e/ou um domínio de cadeia leve variável (VL), e em que (a) o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos que inclui uma, duas ou três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NO:6 e sequência que são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% idênticas a SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7 e sequência que são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% idênticas a SEQ ID NO:7; e SEQ ID NO:8 e sequência que são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99.9% idênticas a SEQ ID NO:8; e (b) o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos que inclui uma, duas ou três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NO:9 ou 12 e sequência que são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% idênticas a SEQ ID NO:9 ou 12; SEQ ID NO:10 e sequência que são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% idênticas a SEQ ID NO:10; e SEQ ID NO:11 e sequência que são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% idênticas a SEQ ID NO:11.
19. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo é administrado de modo intravascular.
20. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos que inclui CDRs que compreendem SEQ ID NO:6, 7 e 8, e/ou o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos que inclui CDRs que compreendem SEQ ID NO:9, 10 e 11, ou SEQ ID NO:10, 11 e 12.
21. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é selecionado do grupo que consiste em: (a) um anticorpo ou scFv com domínios de cadeia pesada e leve que compreendem as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NO:6, 7, 8, 9, 10 e 11; e (b) um anticorpo ou scFv com domínios de cadeia pesada e leve que compreendem as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NO:6, 7, 8, 10, 11 e 12.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, caracterizado pelo fato de que os domínios de cadeia pesada e leve são ligados a uma região Fc ou FC2.
23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo compreende um fragmento variável de cadeia única (“scFv”) que reconhece um grupo principal de fosfocolina de um fosfolipídio oxidado.
24. Método ou uso de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o scFv é solúvel sob condições fisiológicas.
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