CN111868084B

CN111868084B - 治疗tlr2介导的疾病和病症的疗法和方法

Info

Publication number: CN111868084B
Application number: CN201980020109.2A
Authority: CN
Inventors: 约瑟夫·L·魏茨滕; 索蒂里奥斯·齐米卡斯; X·阙
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2018-01-29
Filing date: 2019-01-29
Publication date: 2024-03-22
Anticipated expiration: 2039-01-29
Also published as: JP7445977B2; US20230357374A1; EP3746478A1; RU2020125162A; CA3089709A1; IL276042A; KR20200116104A; EP3746478A4; AU2019213045B2; WO2019148204A1; US11530259B2; US20210155679A1; CN111868084A; JP2021512859A; BR112020015121A2; SG11202006770PA; AU2019213045A1

Abstract

本公开提供了TLR2介导的疾病和病症的方法和治疗，包括施用结合并抑制氧化磷脂的生物学活性的抗体、抗体片段或多肽。

Description

治疗TLR2介导的疾病和病症的疗法和方法

相关申请的交叉引用

依据35 U.S.C§119，本申请要求于2018年1月29日提交的临时申请序列号62/623,276的优先权，该临时申请的公开通过引用纳入本文。

政府许可权

本发明是由美国国立卫生研究院授予的第HL088093资助的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

技术领域

本公开提供了TLR2介导的疾病和病症的方法和治疗，包括施用结合氧化磷脂并抑制其生物学活性的抗体、抗体片段或多肽。

通过引用纳入序列表

伴随该文件的是名为“序列表_ST25.txt”的序列表，其于2019年1月29日创建，并具有在IBM-PC,MS-Windows操作系统上机器格式化的34,203个字节的数据。出于所有目的，该序列表通过引用整体纳入本文。

背景技术

含有多不饱和脂肪酸的磷脂极易被活性氧修饰。这样的磷脂倾向于经历脂质过氧化以形成氧化磷脂(OxPL)，OxPL会诱导细胞毒性和细胞凋亡并且在炎症中起重要作用。OxPL已显示在白介素转录、平滑肌细胞表型转换和经修饰磷脂的凋亡机制中起作用。因此，过氧化极大地改变了膜脂质双层的物理化学性质，因此诱导取决于膜结构域的形成或重组或者分子结合的信号传递。不同OxPL种类可以与特异性结合位点和受体相互作用，从而导致各信号传递通路的激活。

人冠状动脉粥样硬化是由于脂质异常而发生的慢性炎性疾病。促炎性的氧化低密度脂蛋白(OxLDL)被认为是血管壁中的炎症与脂质积累之间的联系。此外，在不同的器官和病理状态中，包括在动脉粥样硬化血管、发炎肺部、非酒精性肝病、冠状动脉疾病患者的血浆以及凋亡细胞、病毒感染的细胞和炎性激动剂刺激的细胞中，已经发现磷脂的氧化产物的水平升高。已经对两种与HDL相关的酶进行了研究：血清对氧磷酶(PON1)和PAF-乙酰水解酶(PAF-AH)；两者都负责血浆氧化磷脂的水解，从而为它们在动脉粥样硬化中的作用提供了证据。氧化应激的另一个重要标志是OxPL与LDL的载脂蛋白B-100颗粒(OxPL/apoB)的关联。OxPL/apoB水平升高与冠状动脉疾病、颈动脉和股动脉粥样硬化的进展以及心血管事件的预测有关。

发明内容

本公开提供了TLR2介导的疾病和病症的方法和治疗，包括施用结合氧化磷脂并抑制其生物学活性的抗体、抗体片段或多肽。如本文所述的研究中所证实，通过体内内源表达的EO6抗体(使用EO6-scFv转基因小鼠)中和OxPL，大大抑制了由TLR2激动作用引起的动脉粥样硬化形成。将TLR2激动剂PAM3CSK4注射到胆固醇喂养的Ldlr^-/-小鼠中会导致动脉粥样硬化的明显增强。对EO6-scFv转基因小鼠(在Ldlr^-/-背景下)进行类似的一系列注射导致损伤形成的明显抑制。在本文给出的其他研究中，证明在TLR2驱动的川崎(Kawasaki)病小鼠模型中，中和OxPL可防止疾病进展。已经证明，施用病原体干酪乳杆菌(Lactobacciluscasei)可引起小鼠川崎样疾病，并导致动脉粥样硬化、冠状动脉动脉炎和腹部动脉瘤的增强。这是TLR2依赖性的，因为对TLR-2缺陷型小鼠施用干酪乳杆菌没有致病效果。IL-1表达也与川崎病密切相关。OxPL也是IL-1释放和炎症的有力诱导剂。与注射到Ldlr^-/-小鼠中相比，在相同的操作规程下将干酪乳杆菌注射到EO6转基因小鼠中(在Ldlr^-/-背景下)，不仅导致动脉粥样硬化显著减少，而且意义重大的是还会导致冠状动脉炎的显著减少。EO6抗体不直接与干酪乳杆菌结合，因此推测它可能会中和由与TLR2介导的激动相关的炎性作用引起的OxPL的炎性作用。

在患有川崎病的儿童中，冠状动脉炎和随后的冠状动脉瘤的发展是致命的并发症，尽管目前进行了治疗，但估计仍可在多达25％的儿童中出现，所述治疗主要是采用衍生自合并和纯化的人血浆的静脉内免疫球蛋白(IVIg)和阿司匹林的治疗，是一种通用的非特异性抗炎疗法。由于任何抗OxPL抗体都具有减少炎症过程的能力，包括减少IL-1B的产生的能力，以及在TLR2介导的川崎病小鼠模型中提供保护的能力，因此注射经过修饰以增强其生物有效性的人源化或人等价的抗-OxPL抗体可能会赋予针对TLR2相关疾病(包括川崎病)的保护。由于此类抗OxPL抗体存在于人B细胞库中，因此靶向重组治疗可为此类疾病带来临床益处，而不会产生免疫抑制或血浆衍生疗法的副作用。

因此，实验数据证明，通过中和OxPL可以预防小鼠体内由TLR2介导的激动作用引起的动脉粥样硬化和炎性动脉炎。当然，TLR2激动作用与多种细菌性疾病有关，但也与多种所谓的自身免疫介导的疾病例如狼疮、类风湿性关节炎等有关。总之，数据表明，通过使用靶向OxPL的PC的抗体、抗体片段或其他结合结构域来中和OxPL，可以缓解或预防通过激活TLR 2介导的信号传递通路加重或导致病情恶化的许多疾病。

在某些实施方案中，本公开提供了一种治疗患有toll样受体2(TLR2)介导的疾病或病症的受试者的方法，包括施用治疗有效量的特异性结合氧化磷脂(OxPL)的抗体、抗体片段或多肽，其中所述抗体、抗体片段或多肽抑制OxPL的生物学活性。在另一个实施方案中，该方法还包括向所述受试者施用可用于治疗TLR2介导的疾病或病症的另外的治疗剂。所述TLR2介导的疾病或病症的实例包括但不限于川崎病、2型糖尿病、类风湿性关节炎、皮肤病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、格雷夫斯病、干燥综合征、自身免疫性甲状腺疾病或血管炎。在一个具体的实施方案中，所述TLR2介导的疾病或病症是川崎病。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括向受试者施用静脉内免疫球蛋白(IVIG)和/或水杨酸盐。在另一个实施方案中，所述受试者是小于五岁的人类受试者。在另一个实施方案中，所述OxPL的生物学活性包括CD36-TLR2凋亡通路的激活。在另一个实施方案中，所述抗体、抗体片段或多肽是单链可变片段(ScFv)。在某个实施方案中，所述抗体或抗体片段识别并结合氧化磷脂的磷酸胆碱头基，其中所述抗体或抗体片段包含可变重链(V_H)结构域和/或可变轻链(V_L)结构域，并且其中(a)所述V_H结构域包含包括一个、两个或三个选自由以下组成的组的互补决定区(CDR)的氨基酸序列：SEQ ID NO：6和与SEQ ID NO：6至少95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同的序列；SEQ ID NO：7和与SEQ ID NO：7至少95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同的序列；以及SEQ ID NO：8和与SEQ ID NO：8至少95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同的序列；(b)所述VL结构域包含包括一个、两个或三个选自由以下组成的组的互补决定区(CDR)的氨基酸序列：SEQ ID NO：9或12和与SEQ ID NO：9或12至少95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同的序列；SEQ ID NO：10和与SEQ IDNO：10至少95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同的序列；SEQ ID NO：11和与SEQ IDNO：11至少95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同的序列。在另一个实施方案中，所述抗体、抗体片段或多肽经血管内施用。在又一个实施方案中，所述V_H结构域包含包括CDR的氨基酸序列，所述CDR包括SEQ ID NO：6、7和8，并且/或者所述V_L结构域包含包括CDR的氨基酸序列，所述CDR包括：SEQ ID NO：9、10和11，或SEQ ID NO：10、11和12。在另一个实施方案中，所述抗体或抗体片段选自由以下组成的组：(a)具有包含SEQ ID NO：6、7、8、9、10和11的互补决定区的重链和轻链结构域的抗体或scFv；(b)具有包含SEQ ID NO：6、7、8、10、11和12的重链和轻链结构域的抗体或scFv。在另一个实施方案中，所述重链和轻链结构域连接至Fc或FC2区。在另一个实施方案中，所述抗体片段包含识别氧化磷脂的磷酸胆碱头基的单链可变片段(“scFv”)。在一个具体的实施方案中，所述scFv在生理条件下是可溶的。可以使用抑制OxPL的生物学活性的其他OxPL结合剂(参见例如国际公开号WO/2013/020995，出于所有目的通过引用纳入本文)。

附图说明

图1A-B提供了(A)可用于产生单链可变片段(“scFv”)的过程图。如所指出的，可以采用定点诱变来突变双链免疫球蛋白抗体的重链的可变结构域(“V_H”)，以增加scFv的溶解性(左)。还指出了scFv的接头区、前导区和效应区(右)。(B)提供了一个通用图谱，其展示了编码scFv EO6抗体片段的基因组件的布局(顶部)；以及一个通用载体图谱，其指出与用于生成转基因小鼠的其他载体元件相关的EO6-scFv抗体片段的编码序列(底部)。

图2显示了scFv的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和氨基酸序列(SEQ ID NO：2)以及注释。

图3图示了体内小鼠模型，用于研究当促炎的和高脂肪胆固醇饮食喂养的小鼠暴露于Toll样受体(TLR2)的外源激动剂Pam3CSK₄(PAM3)时，本公开的scFv在该小鼠中的功能。

图4A-C显示了对使用图3中所述的体内模型的小鼠的摄入和体重的影响。(A)当用媒介物处理时，没有观察到Ldlr^-/-小鼠与Ldlr^-/-EO6scFv^+/+小鼠的食物摄入有明显差异。(B)当用Pam3处理小鼠时，与Ldlr^-/-EO6scFv^+/+小鼠相比，Ldlr^-/-小鼠的食物摄入较少。(C)在第12周，Ldlr^-/-EO6scFv^+/+小鼠的体重显著高于Ldlr^-/-小鼠。当用媒介物处理时，Ldlr^-/-EO6scFv^+/+小鼠和Ldlr^-/-小鼠之间的体重在第12周没有明显差异。

图5A-B证明EO6scTg Ldlr^-/-(LDLrKO(敲除))小鼠与Ldlr^-/-小鼠的血浆中(A)胆固醇或(B)甘油三酯没有明显差异。

图6A-B证明Ldlr^-/-EO6scFv^+/+小鼠与Ldlr^-/-小鼠的血浆中(A)脂蛋白胆固醇分布或(B)脂蛋白甘油三酸酯分布没有明显差异，例如，在两种小鼠中的脂蛋白水平相似。

图7A-E表明，与Ldlr^-/-小鼠相比，Ldlr^-/-EO6scFv^+/+小鼠中可测量的动脉粥样硬化更少。(A)与Ldlr^-/-EO6scFv^+/+小鼠相比，Ldlr^-/-小鼠的总主动脉动脉粥样硬化程度更大。(B)与Ldlr^-/-EO6scFv^+/+小鼠相比，Ldlr^-/-小鼠的腹主动脉(在膈膜下方)的动脉粥样硬化程度特别高。(C)上文的图(A)和(B)表示通过平面测量(planimimetry)动脉粥样硬化程度进行的二维分析。切下和清洁后的主动脉的实际重量是总动脉粥样硬化的更好整合，因为它包含厚度维度。Ldlr^-/-小鼠的主动脉重量显著高于Ldlr^-/-EO6scFv^+/+小鼠的主动脉。(D)当控制体重时，来自Ldlr^-/-小鼠的每单位体重的主动脉明显高于来自Ldlr^-/-EO6scFv^+/+小鼠的每单位体重的主动脉。(E)两组之间主动脉根部的动脉粥样硬化程度无差异。

图8A-H提供定量PCR(qPCR)的结果，该qPCR着眼于Ldlr^-/-EO6scFv^+/+小鼠与Ldlr^-/-小鼠的脂肪组织中的炎症基因表达。具体地，与Ldlr^-/-小鼠相比，Ldlr^-/-EO6scFv^+/+小鼠的(A)IL1b、(B)IL6、(C)TNFα、(E)MCP1、(F)MIP1α、(G)MIP1β和(H)IL10的表达普遍较低，而IL12略高(D)。

图9A-G提供了酶联免疫吸附测定(ELISA)的结果，该测试着眼于Ldlr^-/-EO6scFv^+/+小鼠与Ldlr^-/-小鼠的脂肪组织提取物中的细胞因子实测水平。具体地，细胞因子(A)IL1b、(B)IL6、(C)TNFα、(D)MCP1、(E)MIP1α、(F)MIP1β和(G)IL10的实测水平反映了图8中给出的基因表达水平。

图10A-H显示，来自Ldlr^-/-EO6scFv^+/+的骨髓来源细胞在分化为巨噬细胞M1或M2细胞并用PAM3刺激时，与来自Ldlr^-/-小鼠的分化巨噬细胞相比，显示较少的(A)IL1β、(B)IL6、(C)IL12、(D)TNFα、(E)MCP1、(F)MIP1α、(G)MIP1β和(H)RANTES表达。显示的数据是对源自Ldlr^-/-EO6scFv^+/+或Ldlr^-/-小鼠的M1细胞的比较。从M2细胞中发现了相似的数据，例如，与Ldlr^-/-相比，来自Ldlr^-/-EO6scFv^+/+的M2细胞的表达较少，但不同的是细胞因子表达的绝对水平较低。

图11EO6-scFv mRNA在来自Ldlr^-/-EO6scFv^+/+小鼠的不同脂肪组织中的稳健基因表达。这是由于巨噬细胞浸润。巨噬细胞表达apoE启动子，因此表达EO6-scFv转基因。

图12提供了荧光显微镜图像，表明用PAM3处理巨噬细胞(RAW264.7)诱导了OxPL的产生。因为来自Ldlr^-/-EO6scFv^+/+小鼠的巨噬细胞对TLR2刺激的反应较弱，并且因为巨噬细胞表达EO6-scFv并将其分泌到培养物中，所以推测TLR2刺激的巨噬细胞产生了OxPL，进而以自分泌的方式激活了炎症基因的表达。为了检验该推测，用PAM3刺激巨噬细胞。左图，使用媒介物处理；右图，使用TLR2激动剂PAM3处理。将RAW264.7培养物与Pam3(1μg/mL)或对照载体孵育18小时，并用EO6 IgM抗体和山羊抗ms IgM-FITC缀合物对OxPL进行表面染色。这证明TLR2刺激的巨噬细胞会产生OxPL。

图13A-F表明与Ldlr^-/-RAG1^-/-小鼠相比，Ldlr^-/-EO6scFv^+/+RAG1^-/-小鼠中可测量的动脉粥样硬化少。由于RAG1 KO小鼠没有B或T细胞，所有与免疫细胞有关的动脉粥样硬化事件都直接归因于巨噬细胞的作用。值得注意的是，与Ldlr^-/-小鼠相比，Ldlr^-/-RAG1^-/-小鼠的动脉粥样硬化的绝对水平降低了一半。(A)从Ldlr^-/-RAG1^-/-小鼠(左)和Ldlr^-/-EO6scFv^+/+RAG1^-/-小鼠(右)分离的腹主动脉。来自Ldlr^-/-EO6scFv^+/+RAG1^-/-小鼠的腹主动脉被证实具有比Ldlr^-/-RAG1^-/-小鼠更少的动脉粥样硬化病变。(B)与Ldlr^-/-RAG1^-/-小鼠相比，Ldlr^-/-EO6scFv^+/+RAG1^-/-小鼠的主动脉窦损伤大小明显较小。(C)与Ldlr^-/-EO6scFv^+/+RAG1^-/-小鼠相比，Ldlr^-/-RAG1^-/-小鼠具有更高的全身损伤百分比。(D)与Ldlr^-/-EO6scFv^+/+RAG1^-/-小鼠相比，Ldlr^-/-RAG1^-/-小鼠具有更高百分比的腹部损伤。(E)来自Ldlr^-/-RAG1^-/-小鼠的主动脉的重量显著高于来自Ldlr^-/-EO6scFv^+/+RAG1^-/-小鼠的主动脉。(F)当控制体重时，来自Ldlr^-/-RAG1^-/-小鼠的每单位体重的主动脉明显高于来自Ldlr^-/-EO6scFv^+/+RAG1^-/-小鼠的每单位体重的主动脉。由于RAG1 KO小鼠缺乏B细胞和T细胞，因此在这些小鼠中促进动脉粥样硬化的主要免疫细胞类型是免巨噬细胞。因此，这些数据表明巨噬细胞在该TLR2诱导的模型中促成动脉粥样硬化的主要机制是由于OxPL的应答。

图14给出了川崎病患儿以及与川崎病有关的冠状动脉和腹动脉动脉瘤的图像。

图15给出了研究LCWE和HFC饮食对Ldlr^-/-小鼠、Ldlr^-/-EO6Tg小鼠、Ldlr^-/-IK17Tg小鼠、TLR2^-/-Ldlr^-/-老鼠的动脉粥样硬化的影响的小鼠模型。

图16给出了喂养HFC饮食12周的小鼠中用LCWE激活的TLR2的主动脉损伤的enface分析。EO6scFv-Tg可显著减少en face主动脉损伤。

图17提供了对在注射LCWE并用HFC饮食喂养12周的各Ldlr^-/-小鼠中的腹主动脉损伤区域的分析。数据表示为通过苏丹IV染色在腹主动脉中测得的动脉粥样硬化百分比。发现EO6Tg和IK17Tg发挥统计学上有意义的保护作用。还发现与Ldlr^-/-小鼠相比，TLR2也有统计学水平的减少。

图18给出了用LCWE处理的Ldlr^-/-小鼠和EO6-Tg Ldlr^-/-小鼠的主动脉根的横截面。EO6scFv-Tg减少了主动脉根损伤、坏死核心大小，并且最重要的是减少了川崎病表现背景下的冠状动脉炎。箭头指向横截面中的冠状动脉。Ldlr^-/-小鼠中存在广泛的动脉炎(大的细胞质量)，而EO6-Tg Ldlr^-/-小鼠中却不存在。

图19给出了用LCWE处理的Ldlr^-/-小鼠和EO6-Tg Ldlr^-/-小鼠的主动脉根的其他横截面。箭头指向横截面中的冠状动脉。Ldlr^-/-小鼠中存在广泛的动脉炎(大的细胞质量)，而EO6-Tg Ldlr^-/-小鼠中却不存在。

图20给出了用LCWE处理的Ldlr^-/-TLR2^-/-小鼠和IK17-Tg^+/+Ldlr^-/-小鼠的主动脉根的横截面。箭头指向横截面中的冠状动脉。EO6scFv和IK17scFv降低了冠状动脉炎。EO6(Anti-OxPL)而不是IK17(anti-MDA)减少了主动脉根部损伤。

图21给出了用LCWE处理的Ldlr^-/-TLR2^-/-小鼠和IK17-Tg^+/+Ldlr^-/-小鼠的主动脉根的其他横截面。箭头指向横截面中的冠状动脉。Ldlr^-/-TLR2^-/-小鼠冠状动脉中缺乏动脉炎，这表明TLR2激活在川崎病的小鼠模型中的重要性。

图22描述了用LCWE处理并喂食HFC饮食12周的Ldlr^-/-对照小鼠和EO6-Tg Ldlr^-/-小鼠的血浆炎性细胞因子水平。使用Bio-Plex Pro小鼠细胞因子检测试剂盒(Bio-RadLaboratories，USA)通过多重细胞因子检测来同时测量血浆细胞因子。与对照小鼠相比，在EO6scFv-Tg Ldlr^-/-小鼠中观察到血清TNFa、RANTES、MCP-1、CXCL1、IL-6和IL-12蛋白水平显著降低(p<0.04)。

具体实施方式

如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式“a”、“an”和“该”包括复数指代对象，除非上下文另外明确指出。因此，例如，对“单链可变片段”或“scFv”的指代包括多个单链可变片段，对“氧化磷脂”的指代包括对本领域技术人员已知的一种或多种氧化磷脂及其等同物的指代。以此类推。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和试剂都可以用于所公开的方法和组合物的实践中，但是现在还是描述了示例性的方法和材料。

本文中提及的所有出版物均通过引用全文纳入本文，目的是描述和公开在出版物中描述的方法，该方法可与本文的描述结合使用。此外，关于在一份或者多份出版物中呈现的与本公开中已明确定义的术语相似或相同的任何术语，在任何情况下将以本公开中明确提供的术语定义为准。

此外，除非另有说明，否则“和”的使用表示“和/或”。类似地，各种语法形式的“包含”、“含有”和“包括”是可互换的，而不是限制性的。

将进一步理解的是，在各个实施方案的描述使用术语“包括/包含”的情况下，本领域技术人员将理解，在一些特定情况下，可以使用语言“基本上由……组成”或者“由……组成”来描述某个实施方案。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”在最广泛的意义上可以互换使用，包括单克隆抗体(例如全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体，只要其表现出所需的生物学活性)，还可以包括某些抗体片段。抗体可以是人的、人源化的和/或亲和力成熟的。

取决于其重链恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同类别。免疫球蛋白主要分为五类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。

“抗体片段”仅包含完整抗体的一部分，其中该部分通常保留至少一个、更通常地大多数或全部的通常与该部分存在于完整抗体中时相关的功能。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；双体抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；由抗体片段形成的多特异性抗体。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，因此保留了结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段(例如包含Fc区的抗体片段)保留通常与Fc区存在于完整抗体中时相关的至少一种生物学功能，例如FcRn结合、抗体半衰期调节、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是具有与完整抗体基本相似的体内半衰期的单价抗体。例如，这样的抗体片段可以包含连接至能够赋予该片段体内稳定性的Fc序列的在抗原结合臂。但是，应该认识到，对于某些适应症(例如急性缺血/再灌注治疗)，抗体的长半衰期不是必需的。

“抗原”是抗体可以选择性结合的预定抗原。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其他天然存在或合成的化合物。在本公开的一个实施方案中，抗原是OxPL。

术语“抗OxPL抗体”或“结合OxPL的抗体”是指能够以足够的亲和力结合OxPL的抗体，使得该抗体可在靶向OxPL中用作诊断剂和/或治疗剂。在本公开的一些实施方案中，抗OxPL抗体具有与EO6抗体或QX5抗体相同或相似的结合特异性和K_d。在又一个实施方案中，抗OxPL抗体结合OxPL的PC头基。

“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低其结合的抗原的生物学活性的抗体。某些阻断抗体或拮抗剂抗体基本地或完全地抑制抗原的生物学活性。

“结合亲和力”通常是指某个分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间1∶1相互作用的固有结合亲和力。分子X与其伴侣Y的亲和力通常可以用解离常数(K_d)表示。亲和力可以通过本领域已知的常用方法(包括本文所述的方法)来测量。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并趋于容易解离，而高亲和力抗体通常快速地结合抗原并趋于保持更长的结合时间。测量结合亲和力的多种方法是本领域已知的，其中的任何一种方法均可用于本发明的目的。

“生物样品”涵盖从个体获得的多种样品类型，并且可以用于诊断或监测测定中。该定义包括血液和生物学来源的其他液体样品、固体组织样品如活检标本或组织培养物或由其来源的细胞以及它们的后代。该定义还包括在采购后以任何方式处理过的样品，所述任何方式例如通过试剂处理、增溶或富集某些组分(例如蛋白质或多核苷酸)或包埋于半固体或固体基质中以进行切片的目的。术语“生物样品”涵盖临床样品，并且还包括培养中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物液和组织样品。生物样品的来源可以是来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检标本或抽吸物的实体组织；血液或任何血液成分；体液，例如脑脊髓液、羊水、腹膜液或间质液；受试者妊娠或发育中任何时候的细胞。在一些实施方案中，生物学样品获自原发性或转移性肿瘤。生物样品可以包含天然不与组织自然混合的化合物，例如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养素、抗生素等。

术语“双体抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段在同一多肽链中与轻链可变区/结构域(V_L)连接的重链可变区/结构域(V_H)(V_H-V_L)。通过使用太短以至于不允许同一条链上的这两个结构域之间配对的接头，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双体抗体在例如EP 404,097、WO 93/11161和Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中有更全面的描述。三体抗体(triabody)和四体抗体(tetrabody)也描述于Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)。

“病症”或“疾病”是将从采用本公开的物质/分子或方法的治疗中受益的任何病况。这包括TLR2介导的疾病或病症，例如川崎病。

“有效量”是指在必要的剂量和时间段有效达到期望的治疗或预防结果的量。

如本文所用，术语“Fc区”是指免疫球蛋白重链的C末端区，包括天然序列Fc区和变体Fc区。

“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的效应功能。此类效应功能通常需要将Fc区与对结构域(例如，抗体可变区/结构域)的结合联合，并且可以使用例如本文定义中公开的各种测定法来评估。

“天然序列Fc区”包括与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括：天然序列人IgG1 Fc区(非A同种型和A同种型)；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；天然序列人IgG4 Fc区及其天然存在的变体。

“Fc受体”或“FcR”描述与抗体的Fc区结合的受体。在一些实施方案中，FcR是天然人FcR。在其他实施方案中，FcR是与IgG抗体结合的受体(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括等位基因变体和这些受体的可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有相似的氨基酸序列，主要区别在于其胞质结构域。激活受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见例如Daeron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。例如，在Ravetch andKinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel et al.,Immunomethods 4:25-34(1994)；and de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中对FcR进行了综述。本文中的术语“FcR”涵盖其他FcR，包括将来要鉴定的那些。

Fc受体还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)and Kim et al.,J.Immunol.24:249(1994))和免疫球蛋白稳态的调节。测量与FcRn结合的方法是已知的(参见例如Ghetie and Ward.,Immunol.Today 18(12):592-598(1997)；Ghetie et al.,Nature Biotechnology,15(7):637-640(1997)；Hinton et al.,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216(2004)；WO 2004/92219(Hinton etal.)。

可以例如在表达人FcRn的转基因小鼠或转染的人细胞系中或在施用具有变体Fc区的多肽的灵长类动物中，测定与人FcRn的体内结合和人FcRn高亲和力结合多肽的血清半衰期。WO 2000/42072(Presta)描述了具有改善或减少的与FcR的结合的抗体变体。还参见例如Shields et al.,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。

“Fv”是包含完整的抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。在一个双链Fv类型中，该区域由一个重链可变区和一个轻链可变区紧密非共价结合的二聚体组成。在一个单链Fv类型中，一个重链可变区和一个轻链可变区可以通过柔性肽接头共价连接，这样轻链和重链可以以类似于双链Fv类型的“二聚体”结构结合。以此构型，每个可变区的三个HVR相互作用以在V_H-V_L二聚体的表面上界定抗原结合位点。六个HVR共同赋予抗体以抗原结合特异性。但是，即使单个可变区(或仅包含三个对抗原具有特异性的HVR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于整个结合位点。

Fab片段还包含轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab'片段与Fab片段的区别在于，在重链CH1区的羧基末端添加了一些残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH本文中是其中恒定区的半胱氨酸残基具有游离硫醇基的Fab′的名称。F(ab')₂抗体片段最初作为其间具有铰链半胱氨酸的成对的Fab'片段产生。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。

抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段，每个具有单个抗原结合位点)以及残余的“Fc”片段(其名称反映了其容易结晶的能力)。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍能够交联抗原的F(ab')₂片段。

“框架”或“FR”残基是除本文定义的高变区残基以外的那些可变区残基。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体，其包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列。在一个实施方案中，人源化抗体是下述的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自该受体HVR的残基被来自非人类物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的具有所需特异性、亲和力和/或能力的HVR的残基替代。在某些情况下，人免疫球蛋白的框架残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体中或在供体抗体中不存在的残基。可以进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个可变区，通常两个可变区，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变环，并且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的那些FR。人源化抗体还任选包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。有关进一步的细节，参见例如Jones et al.,Nature 321:522-525(1986)；Riechmannet al.,Nature 332:323-329(1988)；and Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可以参见例如Vaswani and Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle and Gross,Curr.Op.Biotech,5:428-433(1994)；以及美国专利No.6,982,321和7,087,409。

“人抗体”是一种所具有的氨基酸序列对应于由人产生的抗体的氨基酸序列和/或已使用本文公开的任何用于制备人抗体的技术制备的抗体。人抗体的该定义专门排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的各种技术来生产人抗体，包括噬菌体展示文库。Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。也可用于制备人单克隆抗体的是在Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；Boerner etal.,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)中描述的方法。另请参见van Dijk and van deWinkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。人抗体可以通过将抗原施用于已被修饰以响应抗原攻击而产生此类抗体但其内源基因座已被禁用的转基因动物例如免疫的异种小鼠来制备(参见例如美国专利号6,075,181和6,150,584)。关于通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体，还参见例如Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。重要的是应注意，“人抗体”不包括人产生的天然存在的抗体，而是指不包含人类受试者不会识别为“外源”的任何表位或抗原性片段的抗体。

“人类效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应功能的白细胞。在某些实施方案中，该细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性白细胞。效应细胞可以从天然来源例如血液中分离。

当在本文中使用时，术语“高变区”、“HVR”或“HV”是指抗体可变区的序列高度可变和/或形成在结构上被界定的环的区域。通常，抗体包含六个HVR：三个在V_H区中(H1、H2、H3)，三个在V_L区中(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3展示出六个HVR中的最大多样性，特别是H3被认为在赋予抗体精细特异性方面起着独特的作用。参见例如Xu et al.,Immunity13:37-45(2000)；Johnson and Wu,in Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo,ed.,Human Press,Totowa,N.J.,2003)。实际上，仅由重链组成的天然存在的骆驼科动物抗体在不存在轻链的情况下是有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Casterman et al.,Nature 363:446-448(1993)；Sheriff et al.,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。

“个体”、“受试者”或“患者”是脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于农场动物(例如牛)、竞技动物、宠物(例如猫、狗和马)、灵长类、小鼠和大鼠。在某些实施方案中，哺乳动物是人。

“分离的”抗体或抗体片段是已经从其天然环境的组分中鉴定出、分离出和/或回收的抗体或抗体片段。其自然环境的污染成分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的材料，可包括酶、激素和其他蛋白质溶质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，(1)将抗体纯化至以大于95重量％的抗体(通过Lowry方法测定)并且通常大于99重量％；(2)将抗体纯化至足以通过使用旋转杯测序仪(spinning cup sequenator)获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)将抗体纯化至均质(使用考马斯蓝或银染法通过在还原或非还原条件下的SDS-PAGE)。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为将不存在抗体天然环境的至少一种成分。然而，通常将通过至少一个纯化步骤来制备分离的抗体。

“分离的”核酸分子是从在抗体核酸的天然来源中通常与之相关的至少一种污染核酸分子中鉴定并分离的核酸分子。分离的核酸分子不同于天然存在的形式或情况。因此，分离的核酸分子不同于天然细胞中存在的核酸分子。然而，分离的核酸分子包括通常表达抗体的细胞中所包含的核酸分子，其中例如该核酸分子处于与天然细胞的染色体位置不同的染色体位置。

当在本文中使用时，单词“标记”是指与试剂例如核酸探针或抗体直接或间接缀合或融合并有助于检测与其缀合或融合的试剂的的化合物或组合物。标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化。

来自任何脊椎动物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以基于其恒定区的氨基酸序列被分配至被称为kappa(κ)和lambda(λ)的两个明显不同的类型之一。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能少量存在的可能的突变例如天然突变之外，构成该群体的各抗体是相同的。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征不是离散抗体的混合物。在某些实施方案中，这样的单克隆抗体通常包括包含结合靶标的多肽序列的抗体，其中所述靶标结合多肽序列是通过包括从多个多肽序列中选择单一靶标结合多肽序列的过程获得的。例如，选择过程可以是从多个克隆例如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特的克隆。应当理解，可以进一步改变选择的靶标结合序列，以例如提高对靶标的亲和力，使靶标结合序列人源化，提高其在细胞培养物中的产生，降低其在体内的免疫原性，形成多特异性抗体等等，并且为了本公开的目的，包含改变的靶标结合序列的抗体也是单克隆抗体。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体均针对抗原上的单一决定簇。除其特异性外，单克隆抗体制剂的优势还在于它们通常不受其他免疫球蛋白的污染。

修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，而不应解释为要求通过任何特定方法生产抗体。例如，根据本公开使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括例如杂交瘤方法(例如，Kohler and Milstein,Nature,256:495-97(1975)；Hongo et al.,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow et al.,Antibodies:ALaboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988)；Hammerling et al.,in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)),recombinant DNA methods(see,e.g.,U.S.Pat.No.4,816,567),phage-display technologies(see,e.g.,Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；and Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))、以及用于在动物中生产具有部分或者全部的人免疫球蛋白基因座或基因编码的人免疫球蛋白序列的人或人样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits et al.,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann et al.,Year in Immunol.7:33(1993)；U.S.Pat.Nos.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；and 5,661,016；Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg et al.,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild et al.,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996)；and Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。

本文的单克隆抗体特别包括下述“嵌合”抗体：其中重链和/或轻链的一部分与来源于一具体物种或属于一具体抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来源于另一物种或属于另一种抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们表现出所需的生物学活性(参见例如美国专利号4,816,567和Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。嵌合抗体包括这样的抗体，其中抗体的抗原结合区来源于通过例如用目的抗原免疫猕猴而产生的抗体。

如本文所用，“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物中的类似物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸及其类似物。对核苷酸结构的修饰，如果存在的话，可以在聚合物组装之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在合成后进一步修饰，例如通过与标记缀合进一步修饰。其他类型的修饰包括：例如“帽”；用类似物替换一个或者多个天然核苷酸；核苷酸间修饰，例如具有不带电荷的连接键的那些核苷酸间修饰(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯)和具有带电荷的连接键的那些核苷酸间修饰(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)，含有侧基部分例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的那些核苷酸间修饰，具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的那些核苷酸间修饰，包含螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的那些核苷酸间修饰，包含烷基化剂的那些核苷酸间修饰，具有修饰的连接键的那些核苷酸间修饰(例如α异头核酸等)；以及多核苷酸的未修饰形式。此外，糖中通常存在的任何羟基均可以被例如膦酸酯基团、磷酸基团取代，被标准保护基团保护，或被活化以制备连接另外的核苷酸的另外的连接键，或者可以与固体或半固体载体缀合。5'末端和3'末端的OH可以被磷酸化或被胺或具有1至20个碳原子的有机封端基部分取代。其他羟基也可以被衍生为标准保护基。多核苷酸还可以包含本领域通常已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基-、2'-氟-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构糖例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚糖、无环类似物和碱性核苷类似物例如甲基核糖苷。一个或多个磷酸二酯键可以被可替代的连接基团取代。这些可替代的连接基团包括但不限于其中磷酸被P(O)S(“硫代(thioate)”)、P(S)S(“二硫代(dithioate)”)、“(O)NR₂(“酰胺化物(amidate)”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH₂(“甲缩醛”)取代的实施方案，其中每个R或R'独立地为H或取代或未取代的烷基(1-20C)，任选地包含醚(--O--)连接键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳醛基(araldyl)基团。并非多核苷酸中的所有连接键都必须相同，前面的描述适用于本文所指的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，scFv多肽进一步包含在V_H和V_L结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成所需的抗原结合结构。图1显示了抗体和scFv结构。有关scFv的综述，请参阅Pluckthun,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg andMoore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。

如本文所用，术语“基本上相似”或“基本上相同”表示两个数值之间足够高的相似度(例如，一个与本公开的抗体相关，另一个与参考/比较抗体相关)，使得本领域技术人员会认为，在通过值(例如K_d值)度量的生物学特性的背景下，两个值之间的差异几乎没有或没有生物学和/或统计学意义。所述两个值之间的差例如小于参考/比较值的函数的约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％和/或小于约10％。

如本文所用，短语“基本上减少”或“基本上不同”表示两个数值之间足够高的差异度(通常一个与某个分子相关，另一个与参考/比较分子相关)，使得本领域技术人员会认为，在通过所述值(例如，K_d值)度量的生物学特征的背景下，两个值之间的差异具有统计学意义。所述两个值之间的差例如小于参考/比较分子的值的函数的大于约10％、大于约20％、大于约30％、大于约40％和/或大于约50％。

“TLR2相关疾病和病症”包括但不限于自身免疫性疾病，包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、全身性硬化症、干燥综合征、牛皮癣、多发性硬化症和自身免疫性糖尿病。TLR相关病症(例如，与TLR如TLR2等直接和/或间接相关的病症)可包括以下一种或多种：糖尿病、肥胖、败血症、炎性疾病(例如克罗恩病)、免疫疾病、代谢性疾病(例如与代谢综合征相关的疾病)、内分泌疾病、动脉粥样硬化、哮喘、心血管疾病、免疫相关疾病和/或任何其他合适的疾病。例如，TLR2介导的疾病或病症可以选自川崎病、2型糖尿病、类风湿性关节炎、皮肤病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、格雷夫斯氏病、干燥综合征、自身免疫性甲状腺疾病、血管炎、及其任何组合。

如本文所用，“治疗/处理”是指试图改变被治疗/处理个体或细胞的自然进程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理过程中进行。理想的治疗效果包括防止疾病的发生或复发、减轻症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、降低疾病的进展速度、改善或减轻疾病的状态以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体(人源化或非人源化)、抗体片段或多肽、或本发明的人源化抗体用于延迟疾病或病症的发展。

术语“可变(的)”是指可变区的某些部分在抗体之间在序列上差异很大，并用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。但是，可变性并非在抗体的可变区中均匀分布。它集中在轻链和重链的可变区中的称为互补决定区或高变区(CDR或HVR，在本文中可互换使用)的三个区段中。可变区中保守性更高的部分称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变区各自包含四个FR区，主要采用通过三个HVR连接的β-片层结构，这三个HVR形成连接所述β-片层结构的环，并且在某些情况下形成所述β-片层结构的一部分。每条链中的HVR通过FR区紧密结合在一起，并与另一条链中的HVR共同形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat etal.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,NationalInstitute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种效应功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性作用。

如本文所用，术语“载体”旨在指能够转运已与其连接的另一核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，其是指其中可以连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。载体的另一种类型是噬菌体载体。载体的另一种类型是病毒载体，其中可以将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。在导入宿主细胞后，其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)可以整合到宿主细胞的基因组中，并与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒的形式。

“变体Fc区”包含由于至少一种氨基酸修饰(通常为一个或多个氨基酸置换)而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列。通常，与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸置换，例如，在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中具有约1至约10个氨基酸置换，通常约1至约5个氨基酸置换。本公开的变体Fc区与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区具有至少约80％的同源性，与其具有至少约90％的同源性，并且通常与其具有至少约95％的同源性。

“氧化磷脂”(OxPL)是指具有磷酸胆碱(PC)头基的磷脂。OxPL具有高度促炎和促动脉粥样硬化作用。磷酰胆碱是某些磷脂上的极性头基，已广泛涉及心血管疾病。冠状动脉炎症期间产生的活性氧会导致低密度脂蛋白(LDL)氧化，从而产生氧化LDL(oxLDL)。实际上，心血管疾病(CVD)例如动脉粥样硬化、不稳定型心绞痛或急性冠状动脉综合征已被证明与oxLDL的血浆水平升高有关。LDL是一种循环的脂蛋白颗粒，其中包含具有PC极性头基的脂质和蛋白apoB100蛋白。

在LDL的氧化过程中，产生了在未修饰的LDL上不存在的含有新表位的PC。oxLDL上新暴露的PC被巨噬细胞上的清道夫受体(例如CD36)识别，并且所产生的由巨噬细胞吞噬的oxLDL会在血管壁上形成促炎性泡沫细胞。氧化LDL也可被内皮细胞表面上的受体识别，据报道其可刺激一系列反应，包括内皮功能障碍、细胞凋亡和未折叠的蛋白反应。在用磷脂酶A2或胺反应性疾病代谢产物如糖化蛋白质氧化产生的醛修饰后，PC新表位也暴露于LDL上。这些以其他方式修饰的LDL颗粒也是CVD中的促炎因子。在体内模型或体外研究中，已证明针对磷酰胆碱(PC)的抗体可结合氧化的或以其他方式修饰的LDL并阻断oxLDL的促炎活性。

甘油磷脂代表一类常见的对细胞膜的完整性很重要的脂质。酯化的不饱和脂肪酸的氧化极大地改变了磷脂的生物活性。除了损害其结构功能外，氧化还使氧化磷脂(OxPL)成为“修饰自我(modified-self)”类型的标记，这些标记被先天免疫的可溶性细胞相关受体(包括清道夫受体)、天然(种系编码的)抗体、和C反应蛋白识别，从而指导除去衰老和凋亡细胞或氧化脂蛋白。此外，OxPL具有其非氧化前体所不具备的新生物活性，包括调节先天性和适应性免疫反应的能力。所描述的OxPL在体外和体内的作用表明它们在不同病变中的潜在相关性，所述病变包括动脉粥样硬化、急性炎症、肺损伤和许多其他病况。

甘油磷脂包括由甘油主链、含极性头基的磷酸和两个脂肪酸残基组成的一类丰富的脂质。与PL结合的多不饱和脂肪酸(PUFA)是与代谢能形成无关的非酶促或酶促氧化的主要目标。PL分子的氧化性片段化会产生几种生物活性产物，包括PUFA的小化学反应性片段，例如未酯化的氧化脂肪酸(例如氢过氧化物和异前列腺素)和溶血磷脂。这些产品表现出多种生物活性。已有证据表明，PL-PUFA的非酶促氧化是按照与游离(未酯化)PUFA氧化相同的基本机理进行的。这一假设通过鉴定通过氧化本文所述的游离的和PL结合的PUFA而产生的相似类别的分子种类而得到支持。与非酶促氧化相反，酶对PL-PUFA的氧化与未酯化的PUFA的氧化显著不同。虽然游离的PUFA可以被属于不同蛋白质家族并引入各种氧化基团的多种酶氧化，但只有一组脂氧合酶(12/15脂氧合酶)接受PL-PUFA作为底物来产生PL氢过氧化物。进一步的氧化和重排在没有酶参与的情况下继续进行，因此由酶促和非酶促机制引发的氧化会产生许多类似的高级PL氧化产物。

Toll样受体2，也称为TLR2，是人类中由TLR2基因编码的蛋白质。TLR2也被称为CD282(分化簇282)。TLR2在免疫系统中起作用。TLR2是一种膜蛋白受体，在某些细胞的表面上表达，识别外来物质并将适当的信号传递至免疫系统的细胞。TLR2在病原体识别和先天免疫激活中起着基本作用。Toll样受体(TLR)从果蝇到人类是高度保守的，并且在结构和功能上相似。它们识别在致病原上表达的病原体相关分子模式(PAMP)，并介导有效免疫产生所必需的细胞因子的产生。各种TLR表现出不同的表达模式。该基因在外周血白细胞中表达最为丰富，并通过刺激NF-κB介导宿主对革兰氏阳性细菌和酵母的反应。TLR2可检测多种微生物组分，例如革兰氏阳性来源的脂磷壁酸、细菌脂蛋白和酵母聚糖。在11种表征的TLR中，TLR2在与TLR1或TLR6异二聚化的能力方面是独特的，从而导致相对较宽的配体特异性。

CD36，通过作为TLR2的共同受体，已证明在内源性来源的脂质与先天免疫激活之间存在促炎途径。研究还发现，在受干扰的血流区域(例如主动脉树和心脏内的损伤部位)，内皮TLR2的表达和激活增强。因此，TLR2的表达可能会促进非BM来源的细胞(如内皮细胞)的动脉粥样硬化，从而可能有助于活化的内皮细胞的促炎表型。

在易患动脉粥样硬化的低密度脂蛋白受体缺陷型(Ldlr^-/-)小鼠中，TLR2的完全缺乏导致动脉粥样硬化的减少。然而，BM来源的细胞中TLR2表达的丧失对疾病进展没有影响。该数据表明，未知的内源性TLR2激动剂通过激活非BM细胞来源的细胞中的TLR2来影响病变进程。如本文所示，腹膜内施用合成的TLR2/TLR1激动剂Pam3CSK4，Ldlr^-/-小鼠中的疾病负担显著增加。Ldlr^-/-小鼠中TLR2的完全缺乏，以及Ldlr^-/-小鼠中仅BM来源的细胞中的TLR2缺乏，减弱了Pam3CSK4介导的动脉粥样硬化，这提示BM来源细胞的TLR2表达在转导外源性TLR2激动剂的效果中的作用。

OxPL可以通过TLR2介导的途径激活细胞信号传递，导致促炎性细胞信号传递。此外，OxPL介导的TLR2激活可导致与促进ER应激的信号传递通路相关联出现时的凋亡和细胞死亡。OxPL通过依赖TLR2的信号传递通路诱导内皮细胞的IL-8信号传递并在巨噬细胞中诱导IL-1β和TNFα信号传递。如本文进一步证明的，经由合成TLR2激动剂PAM3CSK4活化巨噬细胞直接刺激巨噬细胞产生OxPL。也有报道称，通过激动剂(例如LPS)激活TLR4也将导致巨噬细胞产生OxPL(Popat et al.,JCI,2017)。总体而言，本文提供的数据表明，OxPL可以通过TLR2(或TLR4)直接激活巨噬细胞以诱导促炎性信号传递和/或凋亡，相反，通过TLR2或TLR4信号传递激活巨噬细胞又会导致巨噬细胞产生OxPL。在后一种情况下，当巨噬细胞被TLR2/4激动剂刺激时，局部产生的OxPL具有通过自分泌作用增加和增强炎症途径的潜力。因此，本文提出的研究表明，OxPL既可以直接刺激TLR2途径，又可以旁分泌的方式发挥作用以促进促炎性TLR2/4激动剂信号传递。这些见解解释了为什么在各种炎症环境中用抗OxPL的抗体在体内中和OxPL会赋予这种深刻的表现为减少的疾病发展的抗炎作用。

该数据表明，结合OxPL的抗体或其片段(包括EO6)或其他旨在结合含PC的氧化磷脂(OxPL)的磷酸胆碱(PC)头基的抗体或其片段，可用于改善多种疾病中存在的TLR2激动作用的有害作用。这些疾病包括动脉粥样硬化、自身免疫性疾病特别是川崎病(一种未知来源的儿童疾病，据信其中TLR2介导的激动作用可促进冠状动脉炎，从而导致冠状动脉瘤)、严重的冠状动脉钙化、冠状动脉血流紊乱、急性血栓形成和严重发病率和死亡。当无症状的冠状动脉瘤转变为导致急性心肌梗塞的急性血栓形成时，该疾病也会影响年轻人。川崎病还可以与心肌炎、心力衰竭和心脏移植需求有关。

先天天然抗体(NAb)提供针对病原体的内源性新表位(OxLDL和凋亡细胞)和外源表位上常见的氧化特异性表位(OSE)的第一线宿主防御，并维持宿主体内稳态。OSE无处不在，在许多炎症组织(包括动脉粥样硬化病变)中形成，并且是IgM NAb的主要靶标。原型IgMNAb EO6与氧化磷脂(OxPL)中的磷酸胆碱(PC)头基结合，并阻止巨噬细胞摄取OxLDL。已克隆并表征了抗OxPL的鼠IgM天然抗体，该抗体与OxPL的磷酸胆碱(“PC”)头基结合，但不与天然的非氧化磷脂(“PL”)结合。但是，像IgM Nab EO6这样的抗体溶解度有限，不能轻易地合成。

亲本EO6抗体是鼠IgM抗体，其被克隆和表征并且是美国专利号6,225,070的主题，该美国专利通过引用并入本文。美国专利公开号20150376268A1描述了与OxPL结合的完全功能单链抗体和人源化抗体。它描述了对亲本抗体框架区、重链、轻链和接头序列的DNA序列(通过反复试验确定的)的众多独特的分子变化，从而开发出完全功能的EO6-scFv。当将此序列插入适当的载体中时，所得的scFc以可溶形式表达，并具有亲本对其鉴定出的靶抗原的所有免疫结合特性，包括与独特的抗独特型抗体AB1-2结合的能力，AB1-2的表位由亲本抗体的重链和轻链组成。该申请的公开内容还提供了选择性结合氧化磷脂的单链可变抗体片段(“scFv”)、V_H区、V_L区和互补决定区。本公开的scFv是可溶的并且可以容易地合成。美国专利公开第20150376268A1号的公开内容为了所有目的通过引用纳入到本文中。

在本文提出的研究中，通过体内内源性表达的EO6抗体(使用EO6-scFv转基因小鼠)中和OxPL极大地抑制了由TLR2激动作用引起的动脉粥样硬化的形成。特别地，将TLR2激动剂PAM3CSK4注入胆固醇喂养的Ldlr^-/-小鼠会导致动脉粥样硬化的明显增强。对EO6-scFv转基因小鼠(在Ldlr^-/-背景下)进行类似的注射导致明显抑制了损伤形成。

在本文提出的其他研究中，中和OxPL可以保护川崎病的小鼠模型。已经证明，给予病原体干酪乳杆菌(Lactobaccilus casei)可引起小鼠川崎样疾病，并导致动脉粥样硬化、冠状动脉炎和腹部动脉瘤的增强。这是TLR2依赖性的，因为将干酪乳杆菌施用给TLR2缺陷的小鼠没有致病作用。重要的是，已证明IL-1有参与，并且如所指出的，OxPL也是IL-1释放的有力诱导剂。与注射到Ldlr^-/-小鼠中相比，在相同的操作规程下将干酪乳杆菌注射到EO6转基因小鼠中(在Ldlr^-/-背景下)，不仅导致动脉粥样硬化显著减少，而且意义重大的是还会导致冠状动脉炎的显著减少。EO6抗体不直接结合干酪乳杆菌，因此中和与TLR2介导的激动作用相关的炎性作用引起的OxPL。冠状动脉炎和随后的冠状动脉瘤的发生已成为患川崎病儿童的主要且令人担忧的并发症，尽管采用了目前的治疗方法，但据估计仍有多达25％的儿童出现这样的并发症。典型地，川崎病用来源于合并和纯化的人血浆的静脉内免疫球蛋白(IVIG)和阿司匹林治疗(这是一种普遍但非特异性的抗炎疗法)。注射经修饰以增强其生物学效力的高滴度人源化或人等效抗OxPL抗体可随后提供保护而没有任何预期的副作用，因为此类抗OxPL抗体存在于人B细胞库中。

因此，实验数据表明，通过中和OxPL可以预防小鼠体内由TLR2介导的激动作用引起的动脉粥样硬化和炎性动脉炎。当然，TLR2激动作用不仅与多种细菌性疾病有关，而且还与多种所谓的自身免疫介导的疾病例如狼疮、类风湿性关节炎等有关。数据表明，通过使用靶向OxPL PC的抗体来中和OxPL可改善或预防由激活TLR2介导的信号传递通路所加重或影响的许多疾病。

本公开提供了与OxPL结合并且在某些情况下与EO6抗体具有相同或相似结合特异性的抗体、抗体片段和人源化抗体的用途。抗体片段可以通过传统方式例如酶消化、或通过重组技术来产生。在某些情况下，使用抗体片段而不是完整抗体具有优势。较小尺寸的片段允许快速清除，并可导致更好地进入组织。在急性情况下，抗体片段的半衰期并不重要。有关某些抗体片段的综述，请参见Hudson et al.(2003)Nat.Med.9:129-134。

本公开尽管提供了具有生物学活性的特异性抗体序列和抗体序列片段，但还进一步公开了这些序列可用于产生改良的变体。因此，在某些情况下，抗体或抗体片段可以与本公开的序列具有某一百分比的同一性。

在一些实施方案中，考虑了对本文描述的抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能需要改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过将适当的改变引入编码抗体的核苷酸序列中或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或置换。可以进行缺失、插入和置换的任何组合，以得到最终的构建体，前提条件是最终的构建体具有所需的特性。可以在形成序列时将氨基酸改变引入目标抗体的氨基酸序列中。

本公开提供了能够结合OxPL或磷酰胆碱和/或磷酰胆碱缀合物的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含可变重链(V_H)结构域和/或可变轻链(V_L)结构域，并且其中

(a)所述V_H结构域包含包括一个、两个或三个选自由以下组成的组的互补决定区(CDR)的氨基酸序列：

SEQ ID NO：6和与SEQ ID NO：6至少95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同的序列；

SEQ ID NO：7和与SEQ ID NO：7至少95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同的序列；和

SEQ ID NO：8和与SEQ ID NO：8至少95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同的序列；

(b)所述V_L结构域包含包括一个、两个或三个选自由以下组成的组的互补决定区(CDR)的氨基酸序列：

SEQ ID NO：9或12和与SEQ ID NO：9或12至少95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同的序列；

SEQ ID NO：10和与SEQ ID NO：10至少95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同的序列；和

SEQ ID NO：11和与SEQ ID NO：11至少95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同的序列。

在一个实施方案中，抗体或抗体片段包含V_H结构域和/或V_L结构域，所述V_H结构域包含包括CDR的氨基酸序列，所述CDR包括SEQ ID NO：6、7和8，所述V_L结构域包含包括CDR的氨基酸序列，所述CDR包括SEQ ID NO：9、10和11，或SEQ ID NO：10、11和12。

在一个实施方案中，本公开提供了选自由以下组成的组的抗体或scFv：(a)具有包含SEQ ID NO：6、7、8、9、10和11的互补决定区的重链和轻链结构域的抗体或scFv；(b)具有包含SEQ ID NO：6、7、8、10、11和12的互补决定区的重链和轻链结构域的抗体或scFv。在一个实施方案中，(a)或(b)中的任一个与Fc区连接。

在一个实施方案中，本公开提供了一种抗体，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸1至约146所示的轻链可变区。在另一个实施方案中，本公开提供了一种抗体，其具有包含SEQ IDNO：4的氨基酸1至约135的序列的人源化轻链可变区。在另一个实施方案中，本公开提供了一种抗体，其包含包括SEQ ID NO：2的约162至约269的序列的重链可变区。在另一个实施方案中，本公开提供了一种抗体，其包含包括SEQ ID NO：4的约152至约258的序列的人源化重链可变区。

在另一个实施方案中，本公开提供了一种嵌合抗体，其包含例如鼠V_H区和/或V_L区和人Fc区。例如，SEQ ID NO：14提供了本公开的嵌合抗体的序列。在SEQ ID NO：14中，氨基酸1-33包含用于抗体分泌的Igκ链前导序列；氨基酸34-146包含EO6轻链可变区；氨基酸147-161提供柔性接头序列；氨基酸162-284提供了EO6重链可变区，其相对于野生型尿EO6抗体具有P201A、S224A和A225D三重突变；氨基酸285-517包含Fc区，在SEQ ID NO：14中，Fc区是具有C290S和H294Y修饰以增加ADCC活性的人IgG1-Fc。SEQ ID NO：14还提供了另外的接头和His标签序列，这对于本领域技术人员而言是可选的(例如，SEQ ID NO：14的氨基酸518至528)。本公开还预期并提供了包含SEQ ID NO：13的SEQ ID NO：14的编码序列。本领域技术人员可以容易地鉴定与上文鉴定的各结构域相对应的核酸序列。本公开还包括同与来自不同免疫球蛋白(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM或任何亚类(同种型)如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂的Fc区连接的SEQ ID NO：14的氨基酸1至284至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同的嵌合抗体序列。

在一个实施方案中，本公开提供了一种scFv，其在轻链可变区和重链可变区之间包含接头。接头可以是任何数量的常用肽接头。在一个实施方案中，接头包含GGGS(SEQ IDNO：5)的重复单元。GGGS(SEQ ID NO：5)的重复可以为2、3、4或更多次。

在另一个实施方案中，本公开包括一种scFv，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸1至146的轻链可变区，该轻链可变区通过肽接头连接至SEQ ID NO：2的氨基酸162至约269的重链可变区。在一个具体的实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的序列。在另一个实施方案中，本发明提供了一种scFv，其具有SEQ ID NO：2的氨基酸1至约269或1至约303的多肽序列。在另一个实施方案中，本公开提供了一种scFv，其具有的多肽序列与SEQID NO：2的氨基酸1至约303具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、具有至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性，并且其选择性地结合氧化磷脂。

在其他实施方案中，融合构建体包含与第二结构域可操作地连接的连接的第一结构域，所述第一结构域包含SEQ ID NO：2的氨基酸1至约269或氨基酸1至约303或其变体，所述第二结构域包含(i)可检测标记或(ii)目的多肽。本领域技术人员将认识到，可以使用将包含SEQ ID NO：1的序列或其变体的编码序列与例如目标多肽的编码序列连接起来的化学或分子生物学技术产生此类融合构建体。编码序列和结构域可以通过接头分开或直接连接。

在又一个实施方案中，本公开包括一种scFv，其包含通过肽接头与SEQ ID NO：4的氨基酸152至约258的重链可变区连接的SEQ ID NO：4的氨基酸1至135的轻链可变区。在一个具体的实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO：4的氨基酸1至258的序列。在另一个实施方案中，本公开提供了一种scFv，其具有SEQ ID NO：4的氨基酸1至约258或1至约263的多肽序列。在另一个实施方案中，本发明提供了一种scFv，其具有的多肽序列与SEQ ID NO：4的氨基酸1至约258具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性，并且与氧化磷脂选择性结合。

在另外的实施方案中，融合构建体包含与第二结构域可操作地连接的第一结构域，所述第一结构域包含SEQ ID NO：4的氨基酸1至约258或1至约264或其变体，所述第二结构域包含(i)可检测标记或(ii)目的多肽。本领域技术人员将认识到，可以使用将包含SEQID NO：3或其变体的编码序列与例如目标多肽的编码序列连接起来的化学或分子生物学技术来产生这样的融合构建体。编码序列和结构域可以通过接头分开或直接连接。

编码抗体、抗体片段和抗体变体的氨基酸序列的核酸分子通过本领域已知的多种方法制备。为了制备变体，这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)或通过寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变、和盒式诱变抗体的较早制备的变体或非变体形式。

在一个具体的实施方案中，本公开提供了由SEQ ID NO：1的多核苷酸序列编码的鼠scFv。在另一个实施方案中，本公开提供了由与SEQ ID NO：1具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性并产生与氧化磷脂选择性结合的多肽的多核苷酸序列编码的鼠scFv。

在另一个实施方案中，本公开提供了一种scFv，其包括在轻链可变区和重链可变区之间的接头。接头可以是任何数量的常用肽接头。在一个实施方案中，接头包含GGGS(SEQID NO：5)的重复单元。GGGS(SEQ ID NO：5)的重复可以为2、3、4或更多次。

本公开还涵盖人源化抗体。人源化非人抗体的各种方法是本领域已知的。例如，人源化抗体可以具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入(import)”残基，其通常取自“输入”可变区。人源化可以基本上按照Winter和同事的方法(Jones et al.(1986)Nature 321:522-525；Riechmann et al.(1988)Nature332:323-327；Verhoeyen et al.(1988)Science 239:1534-1536)，通过用高变区序列替换人抗体的相应序列。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于完整的人可变区已被来自非人物种的相应序列替换。在实践中，人源化抗体通常是其中一些高变区残基和可能的某些FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基替换的人抗体。

对有待用于制备人源化抗体的人轻链和重链可变区的选择对于降低抗原性可能是重要的。根据所谓的“最匹配(best-fit)”方法，针对已知的人可变区序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变区的序列。然后将最接近啮齿动物的序列的人序列接纳为人源化抗体的人框架。参见例如Sims et al.(1993)J.Immunol.151:2296；Chothia et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901。另一种方法使用来自轻链或重链某一亚组的所有人类抗体的共有序列的具体框架。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体。参见例如Carter et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285；Presta et al.(1993)J.Immunol.,151:2623。

通常还期望抗体被人源化，同时保留对抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性。为了实现该目标，根据一种方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型对亲本序列和各种概念化人源化产物进行分析的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是普遍可获得的并且为本领域技术人员所熟悉。可获得计算机程序，其说明并展示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。对这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以从受体和输入序列中选择并结合FR残基，从而获得期望的抗体特征，例如对靶抗原的亲和力增加。通常，高变区残基直接且最主要地参与影响抗原结合。

在一个具体实施方案中，本公开提供了人源化的scFv，其由SEQ ID NO：3的多核苷酸序列编码。在另一个实施方案中，本公开提供了人源化scFv，其由与SEQ ID NO：3具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或者至少99％序列同一性且产生与氧化磷脂选择性结合的多肽的多核苷酸序列编码。

本公开进一步提供了本文公开的scFv，其进一步包含抗体的片段可结晶区(“Fc”)。在一个具体实施方案中，Fc区来自人抗体或人源化抗体。Fc区是与称为Fc受体的细胞表面受体和补体系统的某些蛋白质相互作用的抗体的尾部区域。该特性使抗体可以激活免疫系统。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区由两个相同的蛋白片段组成，它们来自抗体两条重链的第二恒定区和第三恒定区；IgM和IgE Fc区在每条多肽链中包含三个重链恒定区(CH域2-4)。IgG的Fc区带有高度保守的N-糖基化位点。Fc片段的糖基化对于Fc受体介导的活性至关重要。附接于该位点的N-聚糖主要是复杂类型的核心岩藻糖基化的双触角结构。另外，少量的这些N-聚糖还带有二等分的GlcNAc和α-2,6连接的唾液酸残基。抗体的另一部分称为Fab区，包含界定抗体可以结合的特定靶标的可变部分。本公开的scFv由来自Fab区的元件组成。相比之下，某个类别中所有抗体的Fc区对于每个物种而言都是相同的；它们是恒定的，而不是可变的。因此，有时将Fc区称为“片段恒定区”。因此，已经确定了编码无数物种的Fc区的多核苷酸和多肽序列，并且它们是本领域技术人员已知的。在一个具体的实施方案中，本公开提供了本文公开的scFv多核苷酸序列，其还包含编码来自IgG抗体(例如来自人IgG抗体)的Fc区的多核苷酸序列。在另一个实施方案中，本公开提供了本文公开的scFv多肽序列，其还包含来自IgG抗体的Fc区的多肽序列。

在一个具体的实施方案中，本公开提供了本文公开的scFv多核苷酸序列，其还包含编码来自IgG抗体(例如，来自人IgG抗体)的Fc区的多核苷酸序列。在另一个实施方案中，本公开提供了本文公开的scFv多肽序列，其还包含来自IgG抗体的Fc区的多肽序列。在一个实施方案中，Fc区的编码序列包含SEQ ID NO：3所示的约核苷酸790至约核苷酸1518的序列。

在另一个实施方案中，本公开提供了一种载体，其包含编码scFv的如上文参考SEQID NO：1和3所述的多核苷酸序列，或包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3具有至少99％、至少具有95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％或至少70％序列同一性的序列。

本公开还提供了具有EO6抗体的结合特异性的人源化抗体。人源化抗体包含：(i)SEQ ID NO：4的氨基酸1至约氨基酸506所示的序列，或(ii)与SEQ ID NO：4的氨基酸1至约506具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.8％同一性的序列。

本公开还提供了编码本公开的人源化抗体的多核苷酸。该多核苷酸包含选自由以下组成的序列：(i)编码SEQ ID NO：4的多核苷酸，(ii)在严格条件下与由SEQ ID NO：3组成的多核苷酸杂交并编码以与EO6抗体基本相似的特异性结合OxPL的人源化抗体的多核苷酸，(iii)与SEQ ID NO：3至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.8％相同并编码以与EO6抗体基本类似的特异性结合OxPL的抗体的多核苷酸；(iv)SEQ ID NO：3所示的多核苷酸；(v)(i)至(iv)中任一项的多核苷酸，其中该多核苷酸包含RNA。

可以使用标准重组技术获得编码本公开的抗体或抗体片段的多肽组分的多核苷酸序列。可以从产生抗体的细胞例如杂交瘤细胞中分离期望的多核苷酸序列并对其进行测序。或者，可以使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦获得，就将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制和表达异源多核苷酸的重组载体中。为了本发明的目的，可以使用本领域可获得和已知的许多载体。合适载体的选择将主要取决于要插入载体中的核酸的大小以及要用该载体转化的具体宿主细胞。每个载体都包含多种组分，这取决于其功能(异源多核苷酸的扩增或表达，或两者兼有)及其与该具体宿主细胞的相容性。载体组分通常包括但不限于：复制起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入物和转录终止序列。

通常，包含源自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主结合使用。载体通常带有复制位点以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，大肠杆菌通常使用pBR322(来源于大肠杆菌的质粒)转化。pBR322包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，因此提供了鉴定转化细胞的简便方法。pBR322、其衍生物或其他微生物质粒或噬菌体也可包含或被修饰为包含可被微生物有机体用于表达内源蛋白质的启动子。用于表达特定抗体的pBR322衍生物的实例在Carter等人的美国专利No.5,648,237中有详细描述。

此外，包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可以用作与这些宿主联合的转化载体。例如，噬菌体载体可用于制备重组载体，而该重组载体可用于转化易感宿主细胞，例如大肠杆菌LE392。

本公开的表达载体可以包含两个或更多个编码每个多肽组分的启动子-顺反子对。启动子是位于顺反子上游(5')的非翻译调控序列，其调节顺反子的表达。原核启动子通常分为两类：诱导型和组成型。诱导型启动子是这样的启动子：其响应于培养条件的变化例如营养物质的存在与否或温度变化而启动在其控制下的顺反子转录水平的提高。

被多种潜在宿主细胞识别的大量启动子为人们所熟知。通过经由限制酶消化从来源DNA取出启动子并将分离的启动子序列插入本发明的载体中，可以将经选择的启动子与编码轻链或重链的顺反子DNA可操作地连接。天然启动子序列和许多异源启动子均可用于指导靶基因的扩增和/或表达。在一些实施方案中，利用异源启动子，因为与天然靶标多肽启动子相比，它们通常允许被表达基因更大的转录和更高的产量。

适合与原核宿主一起使用的启动子包括PhoA启动子、β-半乳糖酶和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统以及杂合启动子例如tac或trc启动子。在细菌中具有功能性的启动子例如其他已知的细菌或噬菌体启动子也是合适的。它们的核苷酸序列已经被公开，从而使技术人员能够使用接头或衔接子可操作地将其连接至编码目标轻链和重链的顺反子(Siebenlist et al.,(1980)Cell 20:269)，以提供任何所需的限制性酶切位点。

在另一个实施方案中，根据本公开的免疫球蛋白的产生可以在宿主细胞的细胞质中发生，因此不需要在每个顺反子内存在分泌信号序列。在这方面，免疫球蛋白轻链和重链被表达、折叠和组装以在细胞质内形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(例如大肠杆菌trxB菌株)提供了有利于二硫键形成的细胞质条件，从而允许表达的蛋白质亚基的适当折叠和组装。Proba and Pluckthun Gene,159:203(1995)。

适用于表达本发明抗体的原核宿主细胞包括古细菌和真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性有机体。有用细菌的实例包括埃希氏菌(Escherichia)(例如大肠杆菌)、芽孢杆菌(Bacilli)(例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、肠杆菌(Enterobacteria)、假单胞菌(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、变形杆菌(Proteus)、志贺氏菌(Shigella)、根瘤菌(Rhizobia)、透明颤菌(Vitreoscilla)、或副球菌(Paracoccus)。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，大肠杆菌细胞用作本公开的宿主。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110(Bachmann,Cellular andMolecular Biology,vol.2(Washington,D.C.:American Society for Microbiology,1987),pp.1190-1219；ATCC Deposit No.27,325)及其衍生物，包括菌株33D3(美国专利号5,639,635)。其他菌株及其衍生物，例如大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌X 1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌RV308也是合适的。这些示例是说明性的而不是限制性的。用于构建具有确定基因型的上述任何细菌的衍生物的方法是本领域已知的，并且描述于例如Bass et al.,Proteins,8:309-314(1990)。通常必须考虑复制子在细菌细胞中的复制能力来选择合适的细菌。例如，当使用熟知的质粒例如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌或沙门氏菌可以适合用作宿主。通常，宿主细胞应分泌最小量的蛋白水解酶，并且可能希望将其他蛋白酶抑制剂掺入细胞培养物中。

用上述表达载体转化宿主细胞，并在常规营养培养基中培养，所述营养培养基经适当修饰以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。

转化是指将DNA引入原核宿主中，使得该DNA可以作为染色体外元件或通过染色体整合体而被复制。根据所用宿主细胞，使用适合于此类细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理通常用于含有大量细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/DMSO。使用的另一种技术是电穿孔。

用于产生本公开的多肽的原核细胞在本领域已知并适合于培养选定宿主细胞的培养基中生长。合适的培养基的实例包括Luria肉汤(LB)并添加有必要的营养补充剂。在一些实施方案中，培养基还包含基于表达载体的构建选择的选择剂，以选择性地允许含有表达载体的原核细胞生长。例如，将氨苄青霉素添加到培养基中以使表达氨苄青霉素抗性基因的细胞生长。

除碳、氮和无机磷酸盐源外，还可以包括以合适浓度单独地或以与另一种补充剂或介质如复合氮源的混合物形式引入的任何必要的补充剂。任选地，培养基可以包含一种或多种选自由以下组成的组的还原剂：谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸盐(thioglycollate)、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。原核宿主细胞在合适的温度下培养。

在一个实施方案中，表达的多肽分泌到宿主细胞的细胞周质中并从宿主细胞的细胞周质中回收。蛋白质回收通常涉及破坏微生物，通常通过诸如渗透冲击、超声处理或裂解等方式。细胞破裂后，可通过离心或过滤去除细胞碎片或整个细胞。可以例如通过亲和树脂色谱法进一步纯化蛋白质。或者，可以将蛋白质转运到培养基中并在其中分离。可以从培养物中除去细胞，并且将培养上清液过滤并浓缩以进一步纯化产生的蛋白质。可以使用公知的方法，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western blot测试，进一步分离和鉴定表达的多肽。可以使用大规模或小规模发酵，并且可以使用本领域熟知的技术对其进行优化。

可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化方法。以下方法步骤是合适的纯化方法步骤的示例：在免疫亲和柱或离子交换柱上进行分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、在硅胶上或在阳离子交换树脂(例如DEAE)上进行色谱分析、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、和凝胶过滤。

本公开还提供了编码本文公开的抗体、抗体片段或多肽的被转移到合适的宿主生物中的表达载体。合适的宿主生物是微生物、酵母或哺乳动物细胞系统。通常，哺乳动物细胞系统是单核细胞衍生的细胞(例如巨噬细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞)、淋巴细胞衍生的细胞(例如骨髓瘤、杂交瘤和正常的永生B细胞)、实质细胞(例如肝细胞)和非实质细胞(例如星状细胞)。

本公开还提供了包含治疗有效量的本公开的抗体、抗体片段或多肽的药物组合物或制剂。药物组合物或制剂可进一步包含载体、赋形剂、稀释剂、增溶剂、稳定剂、缓冲剂、张力调节剂、填充剂、粘度增加剂/减少剂、表面活性剂、螯合剂和佐剂。

“治疗有效量”的本公开物质/分子、激动剂或拮抗剂可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及该物质/分子、激动剂或拮抗剂在该个体中引起所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量也是该物质/分子、激动剂或拮抗剂的任何毒性或有害作用被治疗有益作用超过的量。

“预防有效量”是指在必需的剂量和时间段有效达到期望的预防结果的量。通常但不是必须的，因为预防剂量是在疾病之前或疾病的较早阶段在受试者中使用的，所以预防有效量将小于治疗有效量。

通过将具有所需纯度的抗体或片段与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备包含本公开的抗体或其片段的治疗制剂以进行储存(Remington:TheScience and Practice of Pharmacy 20th edition(2000))，为水性溶液、冻干制剂或其他干燥制剂的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对受体无毒，并且包括：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚，丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐的抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂或聚乙二醇(PEG)。

本文公开的药物组合物可以通过注射、输注或植入进行肠胃外给药，以进行局部或全身给药。如本文所用，肠胃外给药包括静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌内、滑膜内和皮下给药。

本文公开的药物组合物可以配制为适合肠胃外给药的任何剂型，包括溶液、悬浮液、乳剂、和适合于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式。这样的剂型可以根据药学领域的技术人员已知的常规方法制备(参见Remington:The Science and Practice ofPharmacy，同上)。

用于肠胃外给药的药物组合物可以包含一种或多种药学上可接受的载体和赋形剂，包括但不限于水性媒介物、水混溶性媒介物、非水性媒介物、抗微生物剂或防止微生物生长的防腐剂、稳定剂、溶解度增强剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局麻药、助悬剂和分散剂、润湿剂或乳化剂、络合剂、螯合剂或螯合剂、冷冻保护剂、冻干保护剂、增稠剂、pH调节剂和惰性气体。

合适的水性媒介物包括但不限于水、盐水、生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)、氯化钠注射液、林格注射液、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液、右旋糖和乳酸林格注射液。非水媒介物包括但不限于植物来源的不挥发油、蓖麻油、玉米油、棉籽油、橄榄油、花生油、薄荷油、红花油、芝麻油、大豆油、氢化植物油、氢化大豆油、椰子油和棕榈籽油的中链甘油三酸酯。与水混溶的媒介物包括但不限于乙醇、1,3-丁二醇、液体聚乙二醇(例如聚乙二醇300和聚乙二醇400)、丙二醇、甘油、N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基乙酰胺、和二甲基亚砜。

在一个实施方案中，本文公开的药物组合物被配制成即用型无菌溶液。在另一个实施方案中，本文公开的药物组合物被配制成无菌的可溶性干品，包括散剂和皮下注射片剂，如果需要的话，可以在使用前用媒介物对其进行重构。在另一个实施方案中，所述药物组合物被公开为即用型无菌悬浮液。在又一个实施方案中，所述药物组合物被公开为无菌不溶性干品，其在使用前用媒介物重构。在另一个实施方案中，所述药物组合物被公开为即用型无菌乳剂。

药物组合物可以配制成悬浮液、固体、半固体或触变液体，以作为植入的贮库给药。在一个实施方案中，本文公开的药物组合物分散在固体内部基质中，该固体内部基质被不溶于体液但允许药物组合物中的活性成分扩散通过的外部聚合物膜包围。

合适的内部基质包括聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸丁酯、增塑或未增塑的聚氯乙烯、增塑的尼龙、增塑的聚对苯二甲酸乙二醇酯、天然橡胶、聚异戊二烯、聚异丁烯、聚丁二烯、聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、硅酮橡胶、聚二甲基硅氧烷、碳酸硅酮共聚物、亲水性聚合物例如丙烯酸和甲基丙烯酸的酯的水凝胶、胶原蛋白、交联的聚乙烯醇和交联的部分水解的聚乙酸乙烯酯。

合适的外部聚合物膜包括聚乙烯、聚丙烯、乙烯/丙烯共聚物、乙烯/丙烯酸乙酯共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、硅酮橡胶、聚二甲基硅氧烷、氯丁橡胶、氯化聚乙烯、聚氯乙烯、氯乙烯与乙酸乙烯酯、偏二氯乙烯、乙烯和丙烯的共聚物、离聚物聚对苯二甲酸乙二酯、丁基橡胶、表氯醇橡胶、乙烯/乙烯醇共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯/乙烯醇三元共聚物、和乙烯/乙烯氧基乙醇共聚物。

本文的制剂还可以包含对于所治疗的特定适应症所必需的超过一种的活性化合物，优选地是具有互补活性且不会彼此不利影响的那些活性化合物。这样的分子合适地以对于预期目的有效的量组合存在。

活性成分也可以被包封在微胶囊(通过例如凝聚技术或通过界面聚合制备，例如羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，包埋在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或者在粗乳液中。此类技术公开于Pharmacy 20th edition(2000)。

用于体内给药的制剂必须是无菌的。这通过无菌过滤膜过滤很容易实现。

可以制备缓释制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有本发明的免疫球蛋白的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质呈有形制品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)、聚丙交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物。不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRON DEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟丁酸。尽管诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物能够释放分子超过100天，但某些水凝胶却可以在较短的时间内释放蛋白质。当封装的免疫球蛋白长时间留在体内时，由于暴露于37℃的湿气中，它们可能会变性或聚集，从而导致生物学活性丧失并且免疫原性可能改变。可以根据所涉及的机制设计合理的稳定策略。例如，如果发现聚集机理是通过硫代-二硫键交换形成分子间S-S键，则可以通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制水分含量、使用适当的添加剂和开发特定的聚合物来实现稳定化基质组成。

本文公开的抗体、抗体片段和多肽与OxPL结合并阻断其促炎作用。可以预料，在许多不同情况下，体内使用本公开的抗体、抗体片段或多肽可阻断OxPL的生物学作用。例如，已显示OxPL由巨噬细胞和其他细胞通过TLR2介导的机制产生。这些释放的OxPL可能在患者全身带来不利的血管活性作用。因此，本公开的抗体、抗体片段或多肽的急性和/或慢性注射/输注能够阻断这些不良作用和/或替代地阻断或减弱由TLR2激活引起的类似的炎症事件。类似地，本公开的抗体、抗体片段或多肽也可以输注至受试者，以阻断由多种病理状况如病毒或细菌感染或自身免疫性疾病产生的OxPL介导的促炎作用。因此，本公开的抗体、抗体片段或多肽将在由TLR2活化介导的其他全身性炎症环境中(例如在类风湿性关节炎中)有效用作抗炎剂。因此，本公开的抗体、抗体片段或多肽可用于需要临时地和/或长期地施用抗炎药和/或抗动脉粥样硬化剂的许多临床应用或环境中。

本公开提供了使用本公开的抗体、抗体片段和多肽治疗患有TLR2介导的疾病或病症的受试者的治疗方法。在一个具体的实施方案中，本发明提供了用治疗有效量的本发明的抗体、抗体片段或多肽治疗TLR2介导的疾病或病症。TLR2介导的疾病或病症的实例包括但不限于川崎病(Kang et al.,Korean J Pediatr 60(7):208-215(2017))、2型糖尿病(Sepehri et al.,Cell Mol Biol Lett 21:2(2016))、类风湿性关节炎(McGarry et al.,Arthritis Res Ther 17:153(2015))、皮肤学(Kang et al.,Journal of AmericanAcademy of Dermatology,54(6):951-983(2006))、多发性硬化症(Hossain et al.,Oncotarget 6(34):35131-35132(2015))、系统性红斑狼疮(Liu et al.,EuropeanJournal of Immunology,45(9):2683-2693(2015))、溃疡性结肠炎(Folova et al.,Journal of Histochemistry&Cytochemistry 56(3):267-274(2008))、格雷夫斯病(Penget al.,Front Immunol,7:578(2016))、干燥综合征(Sisto et al.,Clin Exp Med 17(3):341-350(2017))、自身免疫性甲状腺疾病(Peng et al.,Front Immunol 7:547(2016))和血管炎(Summers et al.,Arthritis Rheum 63(4):1124-35(2011))。在一个具体的实施方案中，本公开提供了用治疗有效量的本公开的抗体、抗体片段或多肽治疗患川崎病的受试者。

为了用于本文所述的治疗应用，本文还描述了试剂盒和制品。这样的试剂盒可以包括被分隔开以容纳一个或多个容器例如小瓶、试管等的载体、包装或容器，每个容器包括待用于本文所述方法的单独元件之一。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。容器可以由多种材料例如玻璃或塑料形成。

例如，一个或多个容器可包含本文所述的一种或多种抗体、抗体片段或多肽，任选地以组合物的形式或与本文所述的另一种试剂组合。所述容器任选地具有无菌入口(例如，所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。此类试剂盒任选地包含与其在本文所述方法中的使用有关的识别性描述或标签或说明。

试剂盒通常将包括一个或多个另外的容器，每个容器具有一种或多种从商业和用户的角度出发对于使用本文所述化合物所期望的各种材料(例如试剂，任选地以浓缩形式，和/或装置)。此类材料的非限制性实例包括但不限于缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器；载有内容物和/或使用说明的载体、包装、容器、小瓶和/或试管标签、以及带有使用说明的包装插页。通常还将包括一组说明。

标签可以在容器上或与容器相关联。当将字母、数字或其他形成标签的字符粘贴、模制或蚀刻到容器本身中时，标签可以位于容器上，当标签存在于还可以容纳容器的接收器或载体中时，可以将标签与该容器相关联，例如，作为包装插页。标签可用于指示待用于特定的治疗应用的内容物。标签还可以指示(例如本文所述方法中的)内容物的使用说明。这些其他治疗剂可以例如以医师用药指南(Physicians'Desk Reference,PDR)中指示的量或以本领域普通技术人员另外确定的量使用。

以下实施例旨在说明而非限制本公开。尽管它们是可能使用的典型方法，但也可以使用本领域技术人员已知的其他方法。

实施例

材料。合成标准品1,2-二壬酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DNPC)、1-棕榈酰基-2-(5-氧代戊酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POVPC)、1-棕榈酰基-2-谷氨酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PGPC)、1-棕榈酰基-2-壬二酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PAzPC)、1-棕榈酰基-2-(9-氧代)壬酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PONPC)和不含LPS的IgM鼠天然抗体EO6从Avanti PolarLipids(Alabaster，AL)获得。1-(棕榈酰基)-2-(5-酮-6-辛烯-二酰基)-3-磷酸胆碱(KOdiAPC)和1-棕榈酰基-2-(4-酮-十二烷基-3-烯-二酰基)-sn-甘油3-磷酸胆碱(KDdiAPC)购自Cayman Chemicals(密歇根州安阿伯)。所有溶剂均为HPLC级。

EO6-scFv转基因小鼠的产生和表征。产生表达单链可变抗体片段形式的T15/EO6独特型(称为EO6-scFv-Tg)的转基因C57BL/6小鼠。简而言之，通过重叠PCR将编码EO6重链和轻链可变区的cDNA与编码一个15个氨基酸的肽的核酸序列连接，并将其克隆到含有分泌用鼠Igκ链前导序列和c-myc和polyHis作为表位标签的表达载体pSecTag2A(Invitrogen)中。转染HEK293细胞，并且分泌到培养上清液中的EO6-scFv的结合特性被证明模仿完整的EO6的结合特性。然后将相同的构建体克隆到肝特异性表达载体pLiv7中，并用于形成C57BL/6背景的表达由apoE启动子驱动的EO6-scFv转基因的转基因(Tg)小鼠。通过PCR扩增尾部DNA筛选后代的血浆EO6-scFv滴度和转基因整合。将转基因的EO6-scFv创建系相互繁育，以产生“纯合”转基因小鼠，然后将它们杂交到C57BL/6背景上的Ldl^-/-小鼠中。分别对所有动物进行EO6-scFv和Ldlr^-/-基因分型，并通过免疫测定对血浆进行分析以确认EO6-scFv的表达。EO6-scFv mRNA在肝脏、腹膜巨噬细胞和脾脏中强烈表达，而在心脏中表达较少。在这些研究中，EO6-scFv的血浆水平平均为20-30μg/ml。

OxPL质谱。从NNCM提取含PC的磷脂。除去细胞培养基，并用PBS洗涤细胞。将每个孔刮入1mL含0.01％BHT的甲醇/乙酸(3％v/v)溶液中，并转移至10mL玻璃锥形管中，并在N₂(g)下封盖。出于定量目的，将十纳克的DNPC作为内标添加到每个样品中。向试管中加入2毫升含BHT的己烷，在N₂(g)下加盖，涡旋五秒钟，然后在4℃以3500rpm离心5分钟。然后使用玻璃巴斯德吸管虹吸除去上层己烷层并弃去。重复己烷/BHT洗涤3次，在N₂(g)下加盖，涡旋5秒钟，并在每次洗涤后离心。在最终的己烷/BHT洗涤后，将2mL含BHT的氯仿和750μL PBS添加到试管中，然后如上所述进行涡旋和离心。使用玻璃巴斯德移液器取出下部有机层，并将其转移至干净的15mL玻璃锥形管中，在其中使用氮气蒸发器吸出溶液，然后将其重构于300μL氯仿/甲醇(2:1v/v)中，以在-80℃储存。

使用反相(RP)色谱法进行OxPL的分离。将提取的心脏在由60:40乙腈:水、10mM甲酸铵和0.1％甲酸组成的RP洗脱液中重构，然后立即注射。将30微升样品注射到AscentisExpress C18 HPLC柱(15cm×2.1mm,2.7μm；Supelco Analytical,Pennsylvania,USA)上，该柱具有Shimadzu Corporation(Canby,Oregon,USA)的Prominence UFLC系统。使用线性梯度的溶剂A(乙腈/水，60:40v/v)和溶剂B(异丙醇/乙腈，90:10，v/v)进行洗脱，两种溶剂均含有10mM甲酸铵和0.1％甲酸。所使用的流动相组成如下：起始溶剂B为32％，一直到4.00min；换成45％B；5.00分钟52％B；8.00分钟58％B；11.00分66％B；14.00分钟70％B；18.00分钟75％B；21.00分钟97％B；25.00分钟97％B；25.10分钟32％B。260μl/min的流速用于分析，样品盘和柱箱分别保持在4℃和45℃。

通过质谱法以正极性模式进行OxPL的检测。使用184.3m/z的产物离子(对应于裂解的磷胆碱部分)在6个跃迁上执行MRM扫描。注入了六种商用标准品PONPC、POVPC、PGPC、PAzPC、KOdiAPC和KDdiAPC，并且基于保留时间和质量跃迁确定了准确的峰分配。质谱设置如下：气帘气26psi；碰撞气体，中等；离子喷雾电压，5500V；温度，500.0℃；离子源气体1，40.0psi；离子源气体2，30.0psi；去簇电位125V，入口电位10V；碰撞能量，53V；碰撞室出口电势，9V；和停留时间，50毫秒。定期进行外部质量校准。为了进行定量，对6种市售OxPL标准品中的每一种绘制了多反应监测(MRM)校准曲线，并根据其相对响应对峰进行了归一化。在提取过程中，将十纳克内标物添加到所有样品中。将具有AB Sciex的Turbo V电喷雾离子源的4000三重四极杆质谱仪系统(美国马萨诸塞州弗拉明汉姆)连接到液相色谱系统。

在LCWE诱导的KD血管炎小鼠模型中腹主动脉瘤的发展和扩张。川崎病会导致幼儿持续性冠状动脉炎(CA)，并且被认为是当今发达国家儿童后天性心脏病的主要原因。在动物模型中，干酪乳杆菌细胞壁提取物(LCWE)诱导的小鼠CA准确模拟了人类KD的发病机理。B组干酪乳杆菌(ATCC 11578)在乳杆菌MRS肉汤中生长，在指数生长期通过离心收获，并用pH7.40的PBS洗涤。收集后，将细胞用4％SDS处理过夜，然后依次与250ug/ml Rnase、DNaseI和胰蛋白酶孵育。然后将最终的沉淀物超声处理(在15ml PBS中5g包装的湿重)在9s脉冲/5s暂停的脉冲设置下以20kHz频率进行超声处理2h(Vibra Cell,Sonics&Materials Inc.,Newtown,CT)。在20,000×g下离心1h后，通过使用苯酚-硫酸比色法(Dubois et al.1956)，基于其鼠李糖含量测定上清液浓度。该制剂的内毒素浓度＜1.5pg/μg，通过鲎变形细胞裂解物测定(Associates of Cape Cod Inc.,East Falmouth,MA)。

给四周龄的C57/BL6小鼠注射250ug PBS中的LCWE或单独注射盐水。在7、14、21和28天这四个时间点处死小鼠。在连续切片(7μm)中鉴定出腹部动脉和冠状动脉，将其用福尔马林固定，并用苏木精和曙红染色。为了进行免疫组织化学分析，将切片用PBS中的0.3％过氧化氢预处理30分钟。将炎性标志物抗体或同种型对照抗体在PBS中的0.5％牛血清白蛋白中以1:100施加1小时。然后洗涤载玻片，并以1:500施加生物素化辣根过氧化物酶缀合的二抗(Vector Lab,Burlingame,CA)30分钟，洗涤并用链霉亲和素缀合的辣根过氧化物酶以1:1,000染色30分钟。根据制造商的说明(Vector Lab)，使用SK-4100 DAB试剂盒检测了免疫组织化学染色。数据显示，与对照小鼠相比，EO6-Tg小鼠中LCWE诱导的AAA形成和强烈的炎症组织学明显降低(图17-图21)。

血清炎性细胞因子测定。使用Bio-Plex Pro小鼠细胞因子23-Plex免疫测定试剂盒(Bio-Rad Laboratories,Inc.)来同时检测经LCWE处理并给予HFC饮食12周的Ldlr^-/-或Ldlr^-/-/EO6scFv-Tg小鼠血浆中的不同细胞因子。根据Bio-Plex系统的规程结合Bio-PlexManager软件执行所有测定的测量和数据分析。结果如图10所示。与Ldlr^-/-小鼠(n＝7-10)相比，Ldlr^-/-EO6-scFv-Tg小鼠(n＝7-10)显示某些促炎性细胞因子/趋化因子(TNF-α、CCL2、CCL5、CXCL1、IL6和IL12)的血浆水平分析显著降低(通过多重Bio-Plex(Bio-Rad)测试)，表明EO6scFv-TG Ldlr^-/-小鼠的全身炎症反应普遍降低。

本文已经描述了多个实施例。然而，将理解的是，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。因此，其他实施例在所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 加利福尼亚大学董事会

<120> 治疗TLR2介导的疾病和病症的疗法和方法

<130> 00015-348WO1

<140> Not yet assigned

<141> 2019-01-29

<150> US 62/623,276

<151> 2018-01-29

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 930

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 工程化的scFV E06抗体结构域

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(930)

<400> 1

atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca 48

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

ggt tcc act ggt gac gcg gcc cag ccg gcc agg cgc gcc gta cga agc 96

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Val Arg Ser

20 25 30

tta gac att gtg atg act cag tct cca tct tcc ctt tct gtg tca gca 144

Leu Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala

35 40 45

ggt aag aag gtc acc att agt tgc acg gcc agt gag agc ctt tat tca 192

Gly Lys Lys Val Thr Ile Ser Cys Thr Ala Ser Glu Ser Leu Tyr Ser

50 55 60

agc aaa cac aag gtg cac tac ttg gct tgg tac cag aag aaa cca gag 240

Ser Lys His Lys Val His Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Glu

65 70 75 80

caa tct cct aaa ctg ctg ata tac ggg gca tcc aac cga tac att ggg 288

Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Ile Gly

85 90 95

gtc cct gat cgc ttc aca ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctg 336

Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

100 105 110

acc atc agc agt gta cag gtt gaa gac ctc aca cat tat tac tgt gca 384

Thr Ile Ser Ser Val Gln Val Glu Asp Leu Thr His Tyr Tyr Cys Ala

115 120 125

cag ttt tac agc tat ccg ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gaa 432

Gln Phe Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu

130 135 140

atc aaa ggt ggt gga gga tca ggt gga ggt ggt tca gga ggt ggc gga 480

Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

tcc gag gtg aag ctg gtg gag tct gga gga ggc ttg gta cag cct ggg 528

Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

165 170 175

ggt tct ctg aga ctc tcc tgt gca act tct ggg ttc acc ttc agt gat 576

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp

180 185 190

ttc tac atg gag tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag aga ctg gag tgg 624

Phe Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp

195 200 205

att gct gca agt aga aac aaa gct aat gat tat aca aca gag tac gct 672

Ile Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala

210 215 220

gac tct gtg aag ggt cgg ttc atc gtc tcc aga gac act tcc caa agc 720

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Thr Ser Gln Ser

225 230 235 240

atc ctc tac ctt cag atg aat gcc ctg aga gcc gag gac act gcc att 768

Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile

245 250 255

tat tac tgt gca aga gat tac tac ggt agt agc tac tgg tac ttc gat 816

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp

260 265 270

gtc tgg ggc gca ggg acc acg gtc acc gtc tcc tct cga gga ggg ccc 864

Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Arg Gly Gly Pro

275 280 285

gaa caa aaa ctc atc tca gaa gag gat ctg aat agc gcc gtc gac cat 912

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His

290 295 300

cat cat cat cat cat tga 930

His His His His His

305

<210> 2

<211> 309

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 2

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Val Arg Ser

20 25 30

Leu Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala

35 40 45

Gly Lys Lys Val Thr Ile Ser Cys Thr Ala Ser Glu Ser Leu Tyr Ser

50 55 60

Ser Lys His Lys Val His Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Glu

65 70 75 80

Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Ile Gly

85 90 95

Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

100 105 110

Thr Ile Ser Ser Val Gln Val Glu Asp Leu Thr His Tyr Tyr Cys Ala

115 120 125

Gln Phe Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu

130 135 140

Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

165 170 175

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp

180 185 190

Phe Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp

195 200 205

Ile Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala

210 215 220

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Thr Ser Gln Ser

225 230 235 240

Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile

245 250 255

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp

260 265 270

Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Arg Gly Gly Pro

275 280 285

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His

290 295 300

His His His His His

305

<210> 3

<211> 1554

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有IgG1-Fc的人源化E06单链抗体(E06scFv-Fc)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1554)

<400> 3

atg gag acc gac aca ctg ttg ttg tgg gtg ttg ctg ctc tgg gtg cca 48

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

gga agc aca ggt gac gct gct gac atc gtc atg acc cag agc ccc gac 96

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp

20 25 30

tct ctc gcg gtt tct ctg gga gag cgg gca aca atc aac tgc aca gca 144

Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Thr Ala

35 40 45

agc gaa tcc ctg tac tca tcc aag cac gtg cat tac ctc gct tgg tac 192

Ser Glu Ser Leu Tyr Ser Ser Lys His Val His Tyr Leu Ala Trp Tyr

50 55 60

cag cag aaa cca ggg caa cca cca aag ctc ctc att tat ggg gcc agc 240

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser

65 70 75 80

aac aga tat att gga gtc cca gat cga ttc agc ggt tcc ggc tcc gga 288

Asn Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

85 90 95

aca gac ttt acc ctc acg ata agc agc ctg cag gcg gaa gat gtg gcc 336

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala

100 105 110

gtg tat tac tgc gca caa ttc tac agc tat cct ctg acc ttc gga gga 384

Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Phe Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly

115 120 125

gga aca aaa gtg gag atc aaa ggc gga ggt gga tcc gga ggg ggt gga 432

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

tct gga ggt ggc ggt agt gaa gtg cag ctg gtg gaa agt gga ggc ggc 480

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

ctg gtg caa cca ggt ggc tct ctg agg ctg tca tgc gct gcc tct gga 528

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

165 170 175

ttt acc ttc tca gat ttc tac atg gaa tgg gtc aga caa gcc cct gga 576

Phe Thr Phe Ser Asp Phe Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

180 185 190

aag ggg ctc gag tgg gtg gcc gct tcc agg aac aag gct aat gac tac 624

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr

195 200 205

acc aca gag tac gcc gca agt gtt aaa ggc cgc ttt ata atc tcc cgc 672

Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg

210 215 220

gat gac tct aag aac tcc ttg tac ctt caa atg aat agt ctc aag aca 720

Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr

225 230 235 240

gaa gat aca gcg gta tac tac tgc gcc cgc gac tac tac gga tca agt 768

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser

245 250 255

tat tgg tac ttc gat gtt tgg aga gct ggc aca ctt gtg act gtc agc 816

Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Arg Ala Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

260 265 270

agt ctt gat cct aaa tcc tct gac aag acc tat acc tgc cca cct tgt 864

Ser Leu Asp Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr Tyr Thr Cys Pro Pro Cys

275 280 285

ccc gcc cca gaa ctt ctg ggt ggc cca tcc gtg ttt ctg ttc cca cca 912

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

290 295 300

aag cca aag gat aca ctc atg atc tct cgc act ccg gaa gtc acg tgc 960

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

305 310 315 320

gtc gtg gtt gat gtg tca cac gag gac ccg gag gtc aaa ttc aat tgg 1008

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

325 330 335

tac gtg gac gga gtc gag gtg cac aac gcc aag aca aag cca cgc gaa 1056

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

340 345 350

gag cag tac aac agc acg tat aga gta gtg agc gtg ctg aca gtg ctc 1104

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

355 360 365

cac cag gat tgg ctt aac ggt aag gaa tac aag tgt aag gtc tcc aac 1152

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

370 375 380

aaa gct ctt cct gct cca ata gaa aag acc att tca aag gcc aag ggg 1200

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

385 390 395 400

caa cct cga gaa ccc cag gtg tac acg ctg cct ccc agc cga gag gag 1248

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

405 410 415

atg acc aag aac caa gta agt ctg aca tgc ctt gtc aaa ggg ttc tac 1296

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

420 425 430

ccc tca gac atc gcc gtg gaa tgg gaa agc aac ggt caa ccc gaa aac 1344

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

435 440 445

aat tac aag aca acg cca ccg gta ctc gat tcc gat ggt tcc ttt ttt 1392

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

450 455 460

ctg tac tcc aaa ctc acg gtg gac aag agt cga tgg cag cag gga aac 1440

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

465 470 475 480

gtt ttc tcc tgt tcc gtg atg cac gaa gca ctg cac aat cac tat acc 1488

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

485 490 495

cag aag tca ctg agt ttg agc cct ggc aaa gga ggg ggc gga tca cat 1536

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser His

500 505 510

cat cac cat cac cat taa 1554

His His His His His

515

<210> 4

<211> 517

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 4

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp

20 25 30

Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Thr Ala

35 40 45

Ser Glu Ser Leu Tyr Ser Ser Lys His Val His Tyr Leu Ala Trp Tyr

50 55 60

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser

65 70 75 80

Asn Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

85 90 95

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Phe Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly

115 120 125

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

165 170 175

Phe Thr Phe Ser Asp Phe Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

180 185 190

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr

195 200 205

Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg

210 215 220

Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr

225 230 235 240

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser

245 250 255

Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Arg Ala Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

260 265 270

Ser Leu Asp Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr Tyr Thr Cys Pro Pro Cys

275 280 285

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

290 295 300

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

305 310 315 320

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

325 330 335

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

340 345 350

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

355 360 365

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

370 375 380

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

385 390 395 400

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

405 410 415

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

420 425 430

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

435 440 445

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

450 455 460

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

465 470 475 480

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

485 490 495

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser His

500 505 510

His His His His His

515

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头

<400> 5

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CDR1

<400> 6

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CDR2

<400> 7

Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr

1 5

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CDR3

<400> 8

Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp

1 5 10 15

<210> 9

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CDR1

<400> 9

Thr Ala Ser Glu Ser Leu Tyr Ser Ser Lys His Lys Val His Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CDR2

<400> 10

Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Ile

1 5

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CDR3

<400> 11

Cys Ala Gln Phe Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5 10

<210> 12

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CDR1-人源化的

<400> 12

Thr Ala Ser Glu Ser Leu Tyr Ser Ser Lys His Val His Tyr Leu Ala

1 5 10 15

<210> 13

<211> 1587

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合的E06scFv-人IgG1-Fc抗体序列

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1587)

<400> 13

atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca 48

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

ggt tcc act ggt gac gcg gcc cag ccg gcc agg cgc gcc gta cga agc 96

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Val Arg Ser

20 25 30

tta gac att gtg atg act cag tct cca tct tcc ctt tct gtg tca gca 144

Leu Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala

35 40 45

ggt aag aag gtc acc att agt tgc acg gcc agt gag agc ctt tat tca 192

Gly Lys Lys Val Thr Ile Ser Cys Thr Ala Ser Glu Ser Leu Tyr Ser

50 55 60

agc aaa cac aag gtg cac tac ttg gct tgg tac cag aag aaa cca gag 240

Ser Lys His Lys Val His Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Glu

65 70 75 80

caa tct cct aaa ctg ctg ata tac ggg gca tcc aac cga tac att ggg 288

Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Ile Gly

85 90 95

gtc cct gat cgc ttc aca ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctg 336

Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

100 105 110

acc atc agc agt gta cag gtt gaa gac ctc aca cat tat tac tgt gca 384

Thr Ile Ser Ser Val Gln Val Glu Asp Leu Thr His Tyr Tyr Cys Ala

115 120 125

cag ttt tac agc tat ccg ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gaa 432

Gln Phe Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu

130 135 140

atc aaa ggt ggt gga gga tca ggt gga ggt ggt tca gga ggt ggc gga 480

Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

tcc gag gtg aag ctg gtg gag tct gga gga ggc ttg gta cag cct ggg 528

Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

165 170 175

ggt tct ctg aga ctc tcc tgt gca act tct ggg ttc acc ttc agt gat 576

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp

180 185 190

ttc tac atg gag tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag aga ctg gag tgg 624

Phe Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp

195 200 205

att gct gca agt aga aac aaa gct aat gat tat aca aca gag tac gct 672

Ile Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala

210 215 220

gac tct gtg aag ggt cgg ttc atc gtc tcc aga gac act tcc caa agc 720

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Thr Ser Gln Ser

225 230 235 240

atc ctc tac ctt cag atg aat gcc ctg aga gcc gag gac act gcc att 768

Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile

245 250 255

tat tac tgt gca aga gat tac tac ggt agt agc tac tgg tac ttc gat 816

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp

260 265 270

gtc tgg ggc gca ggg acc acg gtc acc gtc tcc tct ctg gac ccg aag 864

Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Leu Asp Pro Lys

275 280 285

tct tct gac aaa act tac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc 912

Ser Ser Asp Lys Thr Tyr Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

290 295 300

ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc 960

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

305 310 315 320

ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg 1008

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

325 330 335

agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg 1056

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

340 345 350

gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc 1104

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

355 360 365

acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg 1152

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

370 375 380

aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc 1200

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

385 390 395 400

ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca 1248

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

405 410 415

cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag 1296

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

420 425 430

gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc 1344

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

435 440 445

gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg 1392

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

450 455 460

cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc 1440

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

465 470 475 480

acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc 1488

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

485 490 495

gtg atg cac gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc 1536

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

500 505 510

ctg tct ccg ggt aaa ggt gga ggt gga tca cat cat cat cat cat cat 1584

Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His

515 520 525

taa 1587

<210> 14

<211> 528

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 14

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Val Arg Ser

20 25 30

Leu Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala

35 40 45

Gly Lys Lys Val Thr Ile Ser Cys Thr Ala Ser Glu Ser Leu Tyr Ser

50 55 60

Ser Lys His Lys Val His Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Glu

65 70 75 80

Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Ile Gly

85 90 95

Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

100 105 110

Thr Ile Ser Ser Val Gln Val Glu Asp Leu Thr His Tyr Tyr Cys Ala

115 120 125

Gln Phe Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu

130 135 140

Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

165 170 175

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp

180 185 190

Phe Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp

195 200 205

Ile Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala

210 215 220

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Thr Ser Gln Ser

225 230 235 240

Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile

245 250 255

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp

260 265 270

Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Leu Asp Pro Lys

275 280 285

Ser Ser Asp Lys Thr Tyr Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

290 295 300

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

305 310 315 320

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

325 330 335

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

340 345 350

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

355 360 365

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

370 375 380

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

385 390 395 400

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

405 410 415

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

420 425 430

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

435 440 445

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

450 455 460

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

465 470 475 480

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

485 490 495

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

500 505 510

Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His

515 520 525

Claims

1.治疗有效量的特异性结合氧化磷脂的抗体、抗体片段或多肽在制备治疗受试者中的川崎病和/或与川崎病相关的冠状动脉和腹动脉动脉瘤的药物中的用途，其中所述抗体、抗体片段或多肽识别并结合氧化磷脂的磷酸胆碱头基，其中所述抗体、抗体片段或多肽选自由以下组成的组：（a）具有包含SEQ ID NO：6、7、8、9、10和11的互补决定区的重链结构域和轻链结构域的抗体、抗体片段或多肽；（b）具有包含SEQ ID NO：6、7、8、12、10和11 的互补决定区的重链结构域和轻链结构域的抗体、抗体片段或多肽，并且其中所述抗体、抗体片段或多肽抑制氧化磷脂的生物学活性。

2.权利要求1所述的用途，其中所述药物被制备为包括进一步向所述受试者施用的静脉内免疫球蛋白和/或水杨酸盐。

3.权利要求1所述的用途，其中所述受试者是小于五岁的人类受试者。

4.权利要求1的所述的用途，其中所述氧化磷脂的生物学活性包括CD36-TLR2凋亡通路的激活。

5.权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述抗体、抗体片段或多肽是单链可变片段。

6.权利要求1所述的用途，其中所述抗体、抗体片段或多肽经血管内施用。

7.权利要求1所述的用途，其中所述重链结构域包含互补决定区：SEQ ID NO：6、7和8，和所述轻链结构域包含互补决定区：SEQ ID NO：9、10和11，或SEQ ID NO：12、10和11。

8.权利要求5至7中任一项所述的用途，其中所述重链结构域和轻链结构域连接至Fc或FC2区域。

9.权利要求5至7中任一项所述的用途，其中所述抗体片段包含识别氧化磷脂的磷酸胆碱首基的单链可变片段。

10.权利要求8所述的用途，其中所述抗体片段包含识别氧化磷脂的磷酸胆碱首基的单链可变片段。

11.权利要求9所述的用途，其中所述单链可变片段在生理条件下是可溶的。

12.权利要求10所述的用途，其中所述单链可变片段在生理条件下是可溶的。