BR112020014248A2 - Formulação contendo adenovírus do grupo b - Google Patents

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BR112020014248A2
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virus
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BR112020014248-4A
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Simon Alvis
Magdalena Kieltyka
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Psioxus Therapeutics Limited
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Abstract

a presente divulgação fornece uma formulação líquida adequada para um adenovírus do grupo b, que compreende: a) um adenovírus do grupo b, tal como adenovírus do grupo b competente para replicação, b) 15 a 25% v/v de glicerol, por exemplo 16, 17, 18, 19, 20, 21% v/v de glicerol; e c) 0,1 a 1,5% v/v de etanol, por exemplo 0,2 a 1%, tal como 1% v/v de etanol; e d) um tampão, e e) opcionalmente um aminoácido, em que o ph da formulação está na faixa de 8,0 a 9,6, e uso do mesmo no tratamento, particularmente no tratamento do câncer.

Description

“FORMULAÇÃO CONTENDO ADENOVÍRUS DO GRUPO B”
[0001] A presente divulgação refere-se a uma formulação de um adenovírus do grupo B, tal como o enadenotucirev (EnAd), um processo de produzir a formulação e usar a formulação em tratamento, em particular em tratamento de câncer.
ANTECEDENTES
[0002] Atualmente, o campo farmacêutico está prestes a realizar o potencial dos vírus como terapêutico para uso humano. Até a presente data, um vírus derivado do ONXY-15 (ONYX Pharmaceuticals e adquirido pela Shanghai Sunway Biotech) é aprovado para uso em câncer de cabeça e pescoço em um número limitado de países e o Imlygic® foi aprovado para o tratamento de melanoma. No entanto, atualmente existem vários vírus na clínica, o que deve resultar em alguns deles sendo registrados para uso em seres humanos.
[0003] Várias terapias de vírus são baseadas em adenovírus, tal como os adenovírus do Grupo B, por exemplo, EnAd. O EnAd (anteriormente conhecido como ColoAd1) é um adenovírus oncolítico quimérico (WO2005/118825) atualmente em ensaios clínicos para o tratamento de câncer epitelial. Esses agentes terapêuticos baseados em adenovirais necessitam ser fabricados em quantidades adequadas para apoiar os ensaios clínicos e a demanda após o registro e sob condições que aderem às boas práticas de fabricação (GMP).
[0004] As formulações adenovirais para armazenamento a longo prazo são conhecidas na técnica, consulte, por exemplo, US7.888.096 e US7.351.415. Tais formulações foram usadas para suspender adenovírus do Grupo C tais como Ad5 em particular vírus Ad5 deficientes em replicação, modificados geneticamente para expressar p53 humano.
[0005] Os adenovírus do grupo B têm propriedades diferentes dos adenovírus do grupo C, por exemplo, os vírus do grupo B infectam células por meio de CD46, enquanto os vírus do grupo C infectam células por meio do receptor CAR (receptor de vírus coxsackie e adenovírus). Os vírus do grupo B têm um tempo de retenção diferente dos vírus do grupo C quando analisados por cromatografia líquida de alta eficiência. Consulte, por exemplo, a Figura 7, que mostra os tempos de retenção relativos dos vírus do tipo Ad5 e Ad11 (tal como EnAd).
[0006] Os presentes inventores descobriram que quando as formulações da técnica anterior são usadas para suspender os adenovírus do Grupo B, tal como EnAd, os adenovírus só podem ser mantidos a 4 °C por períodos muito curtos de tempo antes que ocorra degradação significativa na concentração e potência do vírus. Esse tipo de degradação é chamada de degradação química, porque decorre de processos químicos que ocorrem na formulação.
[0007] A estabilidade física também é muito importante, por exemplo, a instabilidade física pode se manifestar por agregação, o que pode resultar em aumento da imunogenicidade.
[0008] Por conseguinte, há uma necessidade de uma formulação aprimorada especificamente adaptada para armazenamento a prazo mais longo de adenovírus do Grupo B, por exemplo, formulações adequadas para armazenamento a 4 C. Isso permite que as formulações sejam mantidas por períodos mais longos a 4 C, com efeitos prejudiciais mínimos na potência e viabilidade dos adenovírus. Isso, por sua vez, torna as formulações consideravelmente mais fáceis e baratas de armazenar e transportar, por exemplo, de uma fábrica para a clínica.
[0009] Surpreendentemente, os presentes inventores estabeleceram que, embora vários ingredientes sejam importantes para a estabilização da formulação do vírus do grupo B, uma pequena quantidade de etanol parece ser essencial para minimizar a degradação e manter a infecciosidade.
[0010] A presente divulgação fornece uma combinação de ingredientes, que juntos atuam para estabilizar os vírus do grupo B, tal como EnAd, em particular a 4 °C.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0011] A presente divulgação fornece formulações adequadas para o armazenamento de adenovírus do grupo B, por exemplo, um vírus do grupo B que codifica pelo menos um transgene e é sumarizado nos parágrafos a seguir:
[0012] 1. Uma formulação líquida adequada para um adenovírus do grupo B, que compreende:
[0013] a) um adenovírus do grupo B, tal como adenovírus do grupo B competente para replicação,
[0014] b) 15 a 25% v/v de glicerol (por exemplo 17 a 20% v/v), tal como 16, 17, 18, 19, 20, 21% v/v de glicerol; e
[0015] c) 0,1 a 1,6% v/v de etanol, por exemplo 0,1 a 1,5%, tal como 1% v/v de etanol ou alternativamente 1,4% ou 1,5% v/v;
[0016] d) um tampão,
[0017] em que o pH da formulação está na faixa de 8,0 a 9,6, por exemplo, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4 ou 9,5, tal como 8,5 a 9,5, em particular 8,5 a 9,0, mais especificamente pH de 8,5, 8,6, 8,7, 8,8 ou 8,9.
[0018] 2. A formulação de acordo com o parágrafo 1, em que o pH é 8,0.
[0019] 3. A formulação de acordo com o parágrafo 1, em que o pH é 8,1.
[0020] 4. A formulação de acordo com o parágrafo 1, em que o pH é 8,2.
[0021] 5. A formulação de acordo com o parágrafo 1, em que o pH é 8,3.
[0022] 6. A formulação de acordo com o parágrafo 1, em que o pH é 8,4.
[0023] 7. A formulação de acordo com o parágrafo 1, em que o pH é 8,5.
[0024] 8. A formulação de acordo com o parágrafo 1, em que o pH é 8,6.
[0025] 9. A formulação de acordo com o parágrafo 1, em que o pH é 8,7.
[0026] 10. A formulação de acordo com o parágrafo 1, em que o pH é 8,8.
[0027] 11. A formulação de acordo com o parágrafo 1, em que o pH é 8,9.
[0028] 12. A formulação de acordo com o parágrafo 1, em que o pH é 9.
[0029] 13. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 12, em que a formulação é para administração por administração intravenosa, por exemplo, após diluição com um líquido para injeção, tal como uma solução isotônica ou água para injeção.
[0030] 14. A formulação, de acordo com o parágrafo 13, em que a formulação é para administração por injeção lenta.
[0031] 15. A formulação, de acordo com o parágrafo 13, em que a formulação é para administração por infusão.
[0032] 16. A formulação, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 15, compreende ainda um tensoativo, por exemplo um tensoativo não iônico.
[0033] 17. A formulação, de acordo com o parágrafo 16, compreende ainda polissorbato, por exemplo polissorbato 20, 40, 60 ou 80, tal como 0,05 a 0,15% v/v de polissorbato 20, 40, 60 ou 80.
[0034] 18. A formulação de acordo com o parágrafo 17, em que a formulação compreende polissorbato 80, por exemplo polissorbato 0,05 a 0,15% v/v 80, tal como 0,115% v/v polissorbato 80.
[0035] 19. A formulação, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 18, que compreende ainda metionina, por exemplo 0,01 a 0,3 mM, tal como 0,01 a 0,25, em particular 0,25 mM de metionina.
[0036] 20. A formulação, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 18, que compreende ainda metionina, por exemplo 0,01 a 0,3 mM, por exemplo 0,01 a 0,2, tal como 0,15 mM de metionina.
[0037] 21. A formulação, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 20, que compreende ainda 5 a 20 mM, tal como 15 mM de arginina.
[0038] 22. A formulação, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 20, que compreende ainda arginina, por exemplo 5 a 15 mM, tal como 10 mM de arginina.
[0039] 23. A formulação, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 20, em que o tampão é selecionado a partir de meglumina, Gly-NaCl e TRIS.
[0040] 24. A formulação, de acordo com o parágrafo 23, em que a formulação compreende tampão de meglumina.
[0041] 25. A formulação, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 24, em que a formulação não compreende tampão de HEPES.
[0042] 26. A formulação, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 15, em que a formulação compreende:
[0043] a) 15 a 20% v/v de glicerol;
[0044] b) 1 a 1,5% v/v de etanol;
[0045] c) 0,2 a 0,3 mM de metionina;
[0046] d) 10 a 20 mM de arginina; e
[0047] e) um tampão, tal como meglumina; e
[0048] f) opcionalmente 0,1 a 0,2% v/v de polissorbato 80;
[0049] em que o pH da formulação está em um pH na faixa de 8,0 a 9,5, por exemplo 8,0 a 9,0, tal como pH de 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 ou 9,0, em particular 8,0.
[0050] 27. A formulação de acordo com o parágrafo 26, em que a formulação compreende
[0051] a) 20% v/v de glicerol;
[0052] b) 1,4 a 1,5% v/v de etanol;
[0053] c) 0,25 mM de metionina;
[0054] d) 15 mM de arginina; e
[0055] e) um tampão, tal como meglumina;
[0056] em que o pH da formulação está em um pH na faixa de 8,0 a 9,5, por exemplo 8,0 a 9,0, tal como pH de 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 ou 9,0, em particular 8,0.
[0057] 28. A formulação, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 15, em que a formulação compreende:
[0058] a) 20% v/v de glicerol;
[0059] b) 1% v/v de etanol;
[0060] c) 0,115% v/v de polissorbato 80;
[0061] d) 0,15 mM de metionina;
[0062] e) 10 mM de arginina; e
[0063] f) um tampão, tal como meglumina;
[0064] em que o pH da formulação está em um pH na faixa de 8,0 a 9,5, por exemplo, 8,5 a 9,5, tal como pH de 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 ou 9,0, em particular 9,0.
[0065] 29. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores, em que o adenovírus do grupo B compreende uma sequência da fórmula (I): 5’ITR-B1-BA-B2-BX-BB-BY-B3-3’ITR
[0066] em que:
[0067] B1 é uma aglutinação ou compreende: E1A, E1B ou E1A-E1B;
[0068] BA compreende-E2B-L1-L2-L3-E2A-L4;
[0069] B2 é uma aglutinação ou compreende: E3;
[0070] BX é uma aglutinação ou uma sequência de DNA que compreende: um sítio de restrição, um ou mais transgenes ou ambos;
[0071] BB compreende L5;
[0072] BY é uma aglutinação ou uma sequência de DNA que compreende: um sítio de restrição, um ou mais transgenes ou ambos;
[0073] B3 é uma aglutinação ou compreende: E4;
[0074] em que pelo menos um dentre BX ou BY não é uma aglutinação.
[0075] 30. A formulação de acordo com o parágrafo 29, em que BX compreende um transgene ou cassete de transgene.
[0076] 31. A formulação de acordo com os parágrafos 29 ou 30, em que BY compreende um transgene ou cassete de transgene.
[0077] 32. A formulação de acordo com o parágrafo 29, em que BY compreende um transgene ou cassete de transgene e BX é uma aglutinação.
[0078] 33. A formulação, de acordo com qualquer um dos parágrafos 29 a 32, em que um ou mais transgenes ou cassetes de transgenes estão sob o controle de um promotor endógeno ou exógeno, tal como um promotor endógeno.
[0079] 34. A formulação, de acordo com o parágrafo 33, em que um o cassete de transgene está sob o controle de um promotor endógeno selecionado a partir do grupo que consiste no promotor E4 e no promotor tardio principal, em particular, no promotor tardio principal.
[0080] 35. A formulação, de acordo com qualquer um dos parágrafos 29 a 34, em que o cassete de transgene compreende adicionalmente um elemento regulatório selecionado independentemente a partir de:
[0081] a) uma sequência aceitadora de emenda (por exemplo, uma sequência curta aceitadora de emenda CAGG, SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2),
[0082] b) uma sequência de entrada no ribossomo interno ou um peptídeo 2A de alta eficiência de autoclivagem,
[0083] c) uma sequência Kozak, e
[0084] d) combinações dos mesmos.
[0085] 36. A formulação, de acordo com o parágrafo 35, em que o cassete de transgene compreende uma sequência Kozak que está no início da sequência de codificação da proteína.
[0086] 37. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 29 a 36, em que o cassete de transgene codifica um peptídeo 2A de alta eficiência de autoclivagem, por exemplo, um peptídeo P2A, peptídeo E2A, peptídeo F2A e peptídeo T2A.
[0087] 38. A formulação de acordo com o parágrafo 37, em que o cassete de transgene codifica vários peptídeos 2A de alta eficiência de autoclivagem, tais como 2, 3 ou 4 peptídeos.
[0088] 39. A formulação de acordo com o parágrafo 38, em que peptídeos de autoclivagem são codificados por sequências de DNA não idênticas.
[0089] 40. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 29 a 39, em que o cassete de transgene compreende adicionalmente uma sequência de poliadenilação.
[0090] 41. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 29 a 40, em que o cassete de transgene compreende ainda uma sequência que codifica uma sequência líder.
[0091] 42. A formulação, de acordo com qualquer um dos parágrafos 29 a 41, em que o cassete de transgene compreende ainda um sítio de restrição na extremidade 3’ da sequência de DNA e/ou na extremidade 5’ da sequência de DNA.
[0092] 43. A formulação, de acordo com qualquer um dos parágrafos 29 a 42, em que pelo menos um cassete de transgene codifica o mRNA monocristrônico.
[0093] 44. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 29 a 43, em que pelo menos um cassete de transgene codifica um mRNA policistrônico.
[0094] 45. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 29 a 44, em que o transgene codifica uma sequência de RNAi, um polipeptídeo (tal como proteína ou peptídeo).
[0095] 46. A formulação de acordo com o parágrafo 45, em que o polipeptídeo é um anticorpo ou fragmento de aglutinação do mesmo.
[0096] 47. A formulação de acordo com o parágrafo 46, em que o anticorpo ou fragmento de aglutinação do mesmo é específico para OX40, ligante de OX40, CD27, CD28, CD30, CD40, ligante de CD40, CD70, CD137, GITR, 4-1BB, ICOS, ligante de ICOS, CTLA- 4, PD-1, PD-L1, PD-L2, VISTA, B7-H3, B7-H4, HVEM, ILT-2, ILT-3, ILT-4, TIM-3, LAG-3, BTLA, LIGHT, CD160, CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, por exemplo, CD40 e ligante de CD40.
[0097] 48. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 45 a 47, em que o polipeptídeo codificado é uma citocina selecionada independentemente do grupo que compreende IL−, IL-1, IL-6, IL-9, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-33, IL- 35, IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21, IL-25, IL-1RA, IFN, IFN, IFN, TNFα, TGF linfotoxina α (LTA) e GM-CSF, por exemplo IL-12, IL-18, IL-22, IL- 7, IL-15, IL-21, IFN, TNF, TGF e linfotoxina α (LTA).
[0098] 49. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 24 a 44, em que o polipeptídeo codificado é um selecionado independentemente do grupo que compreende IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21, CXCR2, CCR2, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CXCR3, CXCR4, CXCR5 e CRTH2, por exemplo, CCL5, CXCL9, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21, CXCR2, CCR2, CCR4 e CXCR4 ou um receptor do mesmo (tal como uma quimiocina selecionada a partir de IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21 ou um receptor do mesmo, mais especificamente CCL5, CXCL9, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21 ou um receptor do mesmo).
[0099] 50. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 29 a 49, em que o polipeptídeo codificado é um gene repórter, por exemplo, simulador de iodeto de sódio, metaloproteínas intracelulares, HSV1-tk, GFPs, luciferase ou receptor de estrogênio, por exemplo, simulador de iodeto de sódio.
[0100] 51. A formulação de acordo com o parágrafo 50, em que o gene repórter é proteína fluorescente.
[0101] 52. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 51, em que a região E4orf4 do adenovírus não é funcional, por exemplo, totalmente deletada, parcialmente deletada ou truncada.
[0102] 53. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 48, em que a região E2B do adenovírus é quimérica, por exemplo, em que a região E2B compreende uma sequência de ácido nucleico derivada de um primeiro sorotipo adenoviral e uma sequência de ácido nucleico derivada de um segundo sorotipo adenoviral distinto; em que os ditos primeiro e segundo sorotipos são cada um selecionados dos subgrupos adenovirais B, C, D, E ou F.
[0103] 54. A formulação, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 53, em que o adenovírus é EnAd quimérico.
[0104] 55. A formulação, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 54, em que o adenovírus é Ad11.
[0105] 56. A formulação, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 55, em que o adenovírus do grupo B é competente de replicação.
[0106] 57. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 56, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 14 ou um derivado do mesmo, por exemplo, sem uma etiqueta His.
[0107] 58. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 57, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 15 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0108] 59. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 58, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 16 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0109] 60. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 59, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 17 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0110] 61. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 60, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 18 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0111] 62. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 61, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 19 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0112] 63. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 62, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 20 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0113] 64. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 63, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 21 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0114] 65. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 64, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 22 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0115] 66. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 65, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 23 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0116] 67. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 66, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 24 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0117] 68. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 67, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 25 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0118] 69. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 68, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 26 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0119] 70. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 69, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 27 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0120] 71. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 70, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 28 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0121] 72. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 71, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 29 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0122] 73. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 72, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 30 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0123] 74. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 73, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 31 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0124] 75. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 74, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 32 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0125] 76. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 75, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 33 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0126] 77. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 76, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 34 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0127] 78. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 77, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 35 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0128] 79. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 78, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 36 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0129] 80. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 79, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 37 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0130] 81. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 80, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 38 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0131] 82. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 81, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 39 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0132] 83. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 82, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 40 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0133] 84. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 83, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 41 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0134] 85. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 84, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 42 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0135] 86. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 85, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 43 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0136] 87. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 86, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 44 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0137] 88. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 87, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 45 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0138] 89. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 88, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 46 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0139] 90. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 89, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 47 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0140] 91. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 86, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 48 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0141] 92. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 91, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 49 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0142] 93. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 92, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 50 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0143] 94. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 93, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 51 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0144] 95. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 94, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 52 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0145] 96. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 95, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 53 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0146] 97. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 96, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 54 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0147] 98. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 97, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 55 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0148] 99. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 98, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 56 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0149] 100. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 99, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 57 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0150] 101. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 100, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 58 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0151] 102. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 101, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 59 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0152] 103. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 102, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 60 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0153] 104. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 103, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 61 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0154] 105. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 104, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 62 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0155] 106. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 105, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 63 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0156] 107. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 106, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 64 ou um derivado do mesmo, por exemplo, sem uma etiqueta His.
[0157] 108. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 107, em que o vírus é mostrado na SEQ ID NO: 65 ou um derivado do mesmo, por exemplo, com ou sem uma etiqueta His.
[0158] 109. A formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 108, para uso em tratamento.
[0159] 110. A formulação de acordo com o parágrafo 109, para uso no tratamento de câncer, por exemplo, câncer colorretal, hepatoma, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de tireoide, câncer renal, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço ou câncer de pulmão.
[0160] 111. A formulação de acordo com os parágrafos 109 ou 110, para administração intravenosa, por exemplo, após diluição com um líquido para injeção.
[0161] 112. A formulação de acordo com os parágrafos 109 ou 110, para injeção intratumoral.
[0162] 113. Uso de uma formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 107 na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer, por exemplo, câncer colorretal, hepatoma, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de tireóide, câncer renal, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço ou câncer de pulmão.
[0163] 114. Um método de tratamento, que compreende a administração de uma formulação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 108 a um paciente com necessidade da mesma.
[0164] 115. O método de tratamento de acordo com o parágrafo 114, em que o paciente a ser tratado tem câncer, por exemplo, câncer colorretal, hepatoma, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de tireóide, câncer renal, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço ou câncer de pulmão.
[0165] 116. O método dos parágrafos 114 ou 115, em que a formulação é administrada por injeção intravenosa ou intratumoral.
[0166] Vantajosamente, os presentes inventores estabeleceram que a formulação como descrita nesse documento permite que os adenovírus do grupo B, tal como o EnAd, sejam armazenados com sucesso, por exemplo a 4 C, por longos períodos de tempo, tais como 6 meses ou mais, por exemplo, 1 ano, 1,5 anos e 2 anos (em especial 18 a 24 meses, tais como 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 meses), sem degradação ou redução significativa da potência. A agregação também pode ser minimizada nas formulações da presente divulgação. As formulações da divulgação também podem ser estáveis a temperaturas tais como 25 °C por períodos moderados de tempo.
[0167] O armazenamento a longo prazo do vírus pode, por exemplo, estar a temperaturas tais como -60 °C ou menos, mais especificamente na faixa de -60 a -80 ° C, em particular -60, -61, -62, -63, -64, - 65, -66, -67, -68, -69, -70, -71, -72, -73, -74, -75, -76, -77, -78, -79 e -80.
[0168] Em uma modalidade, as formulações da presente divulgação têm um pH de 8,5 a 9,5 (tais como pH de 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4 ou 9,5) que é significativamente maior que o pH fisiológico, isto é, pH de 7,4.
[0169] Em uma modalidade, a formulação tem um pH de 9,0. Surpreendentemente, os presentes inventores descobriram que o pH alto tem um efeito significativo na estabilidade dos adenovírus do grupo B (tais como EnAd) na formulação.
[0170] A concentração de glicerol também é importante para a estabilidade dos adenovírus do grupo B (tais como EnAd).
[0171] De acordo com a Agência de Medicamentos da UE, enquanto o etanol é utilizado em formulações farmacêuticas orais e tópicas de pequenas entidades químicas e remédios homeopáticos, existem certas preocupações de segurança em relação ao uso de etanol. O etanol é um depressor do sistema nervoso central. A intoxicação leve a moderada em adultos pode incluir euforia, ataxia, sedação, comportamento agressivo, náusea e vômito. Em doses mais altas, pode causar depressão ou insuficiência respiratória e cardiotoxicidades, tais como taquicardia atrial, fibrilação atrial, arritmias, bloqueio AV, hipotensão, insuficiência cardíaca congestiva e depressão miocárdica grave. Em crianças, a intoxicação por etanol pode resultar em hipoglicemia, hipotermia e coma. Outras toxicidades após exposição aguda incluem convulsões, hipotonia, hiporreflexia, sangramento gastrointestinal, hepatite aguda, pancreatite aguda, rabdomiólise, hipocalemia e acidose láctica.
[0172] O metabolismo do etanol varia entre indivíduos e com a idade, por exemplo, alguns indivíduos são deficientes na enzima álcool desidrogenase, o que reduz sua capacidade de metabolizar álcool. Nas formulações para administração intravenosa, o etanol entra diretamente na corrente sanguínea, o que maximiza quaisquer efeitos tóxicos. Além disso, os volumes administrados podem ser grandes, de modo que 500 ml a 1l de formulação que contém 10% de etanol é 50 a 100 ml de etanol.
[0173] Assim, embora o etanol pareça ser importante para a estabilização das formulações de adenovírus do grupo B, é importante que a toxicidade do etanol na formulação seja minimizada. Surpreendentemente, quantidades muito pequenas de etanol, por exemplo, inferiores a 1,5%, tal como inferiores a 1%, são suficientes para fornecer a estabilização. Em uma modalidade, não mais que 1,5% de etanol é utilizado, por exemplo, não mais que 1% é utilizado. Isso é benéfico, pois minimiza a toxicidade do etanol, enquanto fornece efeitos estabilizadores. Além disso, torna as formulações adequadas para uso na maioria das populações de pacientes.
[0174] Em uma modalidade, a formulação da presente divulgação compreende um tensoativo não iônico, por exemplo, selecionado do grupo que compreende cetomacrogol 1000 (também conhecido como Briji 52, 56 ou 58), álcool cetostearílico, ácido palmítico, monolaurato de glicerol, álcool oleílico, poloxâmeros, F127 plurônico, polissorbatos (por exemplo, polissorbato 20, 40, 60, 80 ou 85), ácido esteárico, tristearato de sorbitano. Em uma modalidade, é utilizado um tensoativo não iônico com um balanço hidrófilo-lipófilo na faixa de 14,5 a 17.
[0175] Em uma modalidade, a formulação compreende ainda polissorbato, por exemplo polissorbato 20, 40, 60 ou 80, tal como 0,05 a 0,15% de polissorbato 20, 40, 60, 80 ou uma combinação de dois ou mais do mesmo. Em uma modalidade, a formulação compreende 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,10%, 0,11%, 0,12%, 0,13%, 0,14% ou 0,15% de polissorbato 20, 40, 60 80 ou uma combinação de dois ou mais do mesmo. A vantagem de adicionar polissorbato à formulação é que o polissorbato ajuda a preservar a potência do adenovírus do grupo B durante o armazenamento a longo prazo e pode minimizar a agregação.
[0176] Em uma modalidade, a formulação compreende polissorbato 80, por exemplo 0,05 a 0,15% de polissorbato 80, tal como 0,09 a 0,11% de polissorbato 80, tal como 0,1% ou 0,115% de polissorbato. Em uma modalidade, a formulação compreende 0,115% de polissorbato.
[0177] Vantajosamente, o tensoativo não iônico, em particular o polissorbato (tal como o polissorbato 80) reduz ou inibe o estresse interfacial dentro da formulação, por exemplo, reduz o estresse da superfície do vírus, que por sua vez pode causar a ruptura do vírus.
[0178] Embora não deseje ficar vinculado pela teoria, acredita-se que a adição de certos aminoácidos, por exemplo metionina, arginina e combinações dos mesmos à formulação possa reduzir a interação vírus/vírus e, assim, contribuir para estabilizar a distribuição do adenovírus do grupo B na formulação, por exemplo, fornecendo proteção estérica. A adição do aminoácido (ou dos aminoácidos), por exemplo metionina, arginina e combinações dos mesmos, também pode otimizar a hidratação/exclusão preferencial do adenovírus do grupo B. Pensa-se que este parâmetro seja de grande importância na estabilização do adenovírus do grupo B. As interações preferenciais podem ser expressas em termos de aglutinação preferencial do cossolvente (tal como água) ou exclusão preferencial do mesmo (hidratação preferencial).
[0179] Em uma modalidade, a formulação compreende ainda pelo menos um aminoácido, por exemplo 1, 2 ou 3 aminoácidos.
[0180] Em uma modalidade, o pelo menos um aminoácido possui uma cadeia lateral hidrofóbica, por exemplo, é selecionada a partir de alanina, isoleucina, leucina, metionina, valina e combinações dos mesmos.
[0181] Em uma modalidade, a formulação compreende ainda metionina, por exemplo 0,01 a 0,3 mM (0,01 a 0,2 mM), por exemplo 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,20 mM, tal como 0,15 mM de metionina. Alternativamente, a metionina pode estar presente em 0,25 mM na formulação.
[0182] Em uma modalidade da formulação, o pelo menos um aminoácido possui uma cadeia lateral básica carregada eletronicamente, por exemplo, é selecionada a partir de arginina, histidina, lisina e combinações dos mesmos.
[0183] Em uma modalidade, a formulação compreende ainda arginina, por exemplo 1 a 20 mM (ou 1 a 15 mM), por exemplo 2 a 10 mM de arginina, tal como 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 ou 10 mM de arginina. Em uma modalidade, a arginina na formulação está na faixa de 10 a 20 mM, por exemplo 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 mM, tal como 14, 15 ou 16 mM. Vantajosamente, a adição de arginina à formulação aumenta ainda mais a estabilidade dos adenovírus, particularmente durante os primeiros 12 meses de armazenamento.
[0184] Em uma modalidade, a formulação compreende ainda um ou mais dos seguintes: tampão de meglumina, tampão de glicina, tampão de TRIS. Todos esses tampões demonstraram produzir boa estabilidade quando incorporados na formulação divulgada.
[0185] Em uma modalidade, a formulação compreende tampão de meglumina, por exemplo, a pH 8,0. O tampão de meglumina é adequado para uso na faixa de pH 8,0 a 10,5, tal como 8,5 a 10,5.
[0186] Em uma modalidade, o tampão é TRIS. O TRIS é capaz de tamponar na faixa de pH de 7 a 9. Em uma modalidade, o tampão não compreende TRIS.
[0187] Em uma modalidade, o tampão é o tampão de glicina, que é capaz de tamponar na faixa de pH de 8,6 a 10,6.
[0188] O tampão deve ser selecionado para corresponder com o pH, por exemplo, o HEPES só é capaz de tamponar até o pH de 8,2. Outros tampões divulgados nesse documento podem fornecer perfis de estabilidade aprimorados para adenovírus do grupo B em comparação com HEPES. Assim, embora HEPEs seja comumente usado para o armazenamento de adenovírus do Grupo B, tal como o EnAd, em uma modalidade, a formulação não compreende tampão de HEPES.
[0189] Em uma modalidade, o vírus na formulação de acordo com a presente divulgação codifica 1, 2, 3 ou 4 transgenes. DEFINIÇÕES PARA A FÓRMULA (I)
[0190] Em uma modalidade, BX compreende um sítio de restrição, por exemplo 1, 2, 3 ou 4 sítios de restrição, tal como 1 ou 2. Em uma modalidade, BX compreende pelo menos um transgene, por exemplo, 1 ou 2 transgenes. Em uma modalidade, BX compreende pelo menos um transgene, por exemplo 1 ou 2 transgenes e um ou mais sítios de restrição, por exemplo 2 ou 3 sítios de restrição, em particular onde os sítios de restrição interpõem um gene ou a sequência de DNA que compreende os genes para permitir que o mesmo seja especificamente excisado do genoma e/ou substituído (ou que os mesmos sejam especificamente excisados do genoma e/ou substituídos). Alternativamente, os sítios de restrição podem interpor cada gene, por exemplo, quando há dois transgenes, três sítios de restrição diferentes são exigidos para garantir que os genes possam ser excisados e/ou substituídos seletivamente.
Em uma modalidade, um ou mais, por exemplo todos, os transgenes estão na forma de um cassete de transgene.
[0191] Em uma modalidade, BX não compreende um sítio de restrição. Em uma modalidade, BX é uma aglutinação. Em uma modalidade, Bx compreende ou consiste em um ou mais transgenes.
[0192] Em uma modalidade, BY compreende um sítio de restrição, por exemplo 1, 2, 3 ou 4 sítios de restrição, tal como 1 ou 2. Em uma modalidade, BY compreende pelo menos um transgene, por exemplo, 1 ou 2 transgenes. Em uma modalidade, BY compreende pelo menos um transgene, por exemplo 1 ou 2 transgenes e um ou mais sítios de restrição, por exemplo 2 ou 3 sítios de restrição, em particular onde os sítios de restrição interpõem um gene ou a sequência de DNA que compreende os genes para permitir que o mesmo seja especificamente excisado do genoma e/ou substituído (ou que os mesmos sejam especificamente excisados do genoma e/ou substituídos). Alternativamente, os sítios de restrição podem interpor cada gene, por exemplo, quando há dois transgenes, três sítios de restrição diferentes são exigidos para garantir que os genes possam ser excisados e/ou substituídos seletivamente.
[0193] Em uma modalidade, BY não compreende um sítio de restrição. Em uma modalidade, BY é uma aglutinação. Em uma modalidade, BY compreende ou consiste em um ou mais transgenes.
[0194] Além de minimizar o tamanho da cassete de transgene, utilizar um promotor endógeno no vírus também pode ser vantajoso em um contexto terapêutico, porque o transgene é expresso apenas quando o vírus está se replicando. Isto contrasta com um promotor exógeno constitutivo que transcreva continuamente o transgene e pode levar a uma concentração ou localização inadequada da entidade codificada, tal como o polipeptídeo codificado.
[0195] Alternativamente, a utilização de um promotor exógeno pode ser vantajosa devido ao fato de que o mesmo pode expressar intensa e constitutivamente a entidade codificada, o que pode ser particularmente útil em algumas situações, por exemplo, em que o paciente tem um câncer muito pervasivo. Portanto, em uma modalidade, a expressão do transgene está sob o controle de um promotor de CMV.
[0196] Em uma modalidade, o cassete de transgene compreende ainda um elemento regulador selecionado independentemente de: uma sequência aceitadora de emenda, uma sequência de entrada de ribossomo interna ou um peptídeo 2A de alta eficiência de autoclivagem, uma sequência de Kozak e combinações dos mesmos.
[0197] Em uma modalidade, o cassete de transgene compreende uma sequência de Kozak que está no início da sequência de codificação da proteína.
[0198] Em uma modalidade, o cassete de transgene codifica um peptídeo 2A de alta eficiência de autoclivagem.
[0199] Em uma modalidade, o cassete de transgene compreende adicionalmente uma sequência de poliadenilação.
[0200] Em uma modalidade, o cassete de transgene compreende adicionalmente um sítio de restrição na extremidade 3’ da sequência de DNA e/ou na extremidade 5’ da sequência de DNA.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA DIVULGAÇÃO
[0201] A formulação presentemente divulgada possui um pH alcalino, que está acima do pH fisiológico. O tamponamento de uma determinada solução para um pH específico pode ser realizado com uso de técnicas de rotina conhecidas na técnica, por exemplo, incluindo um sistema ácido/base compreendendo Tris, lisina, um ácido forte (por exemplo, HCl) ou um ácido fraco (por exemplo, ácido acético ou ácido maleico), uma base forte (por exemplo, NaOH) ou base fraca (por exemplo, amônia).
[0202] Conforme utilizado nesse documento, tampão refere-se a um tampão adequado para suspender ou armazenar adenovírus do grupo B, sem afetar negativamente a integridade estrutural dos ditos adenovírus do grupo B ou a capacidade dos mesmos de se replicar, por exemplo. A maioria dos tampões biológicos em uso atualmente foi desenvolvida por NE Good e sua equipe de pesquisa (Good et al. 1966, Good & Izawa 1972, Ferguson et al. 1980; “Good buffers”) e incluem tampões de taurina ou glicina substituídos por N. Alguns tampões biológicos comumente usados estão listados abaixo. Esta lista não é exaustiva e outros tampões também serão conhecidos pelo destinatário versado.
[0203] Em uma modalidade, a formulação divulgada compreende um ou mais dos seguintes tampões: tampão de ácido 2- aminoetanossulfoni (AES), tampão de formato (tal como tampão de formato de amônio, tampão de acetato de amônio), tampão de 2-amino-2-metil-1-propanol (AMP), tampão de 2-amino-2-metil-1-propanodiol (AMPD), tampão de N- (1,1, - dimetil-2-hidroxietil)-3-amino-2-hidroxipropano sulfônico (AMPSO), tampão de bicino, bis-tris-propano, tampão de ácido bórico, tampão de ácido 3-(ciclo- hexilamino)-2-hidróxi-1-propanossulfônico (CAPSO), tampão de ácido N-ciclo- hexil-2-aminoetanossulfônico (CHES), tampão de ácido 3-[4- (2-hidroxietil)-1- piperazinil] propanossulfónico (HEPPS), tampão de 1-metilpiperidina, tampão de 4-(2-hidroxietil) piperazina-1-(ácido 2-hidroxipropanossulfônico) (HEPPSO), tampão de glicilglicina, di-hidrato de piperazina-1,4-bis (ácido 2- hidroxipropanossulfônico) ou tampão de piperazina-N, N′-bis (ácido 2- hidroxipropanossulfônico) (POPSO), tampão de ácido [tris (hidroximetil) metilamino] propanossulfônico (TAPS), tampão de ácido 3-[N- tris (hidroxilmetil)- metilamino]-2-hidroxipropanossulfônico (TAPSO), tampão da trietanolamina, tampão de ácido 2-[tris (hidroximetil) metilamino] etanossulfônico (TES), tampão de tricino, tampão de meglumina, tampão de glicina (tal como Gly-NaOH), tampão de TRIS.
[0204] Em uma modalidade, a formulação divulgada compreende um ou mais dos seguintes tampões: tampão de meglumina, tampão de Gly-NaCl, tampão de TRIS.
[0205] Longo prazo conforme usado neste documento refere-se a um período de pelo menos 6 meses, tal como 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 meses. Em uma modalidade, a formulação divulgada permite que os adenovírus do grupo B sejam armazenados de forma estável por pelo menos 12 meses, tal como 12 meses, 18 meses e 24 meses. A menos que especificado, o armazenamento a longo prazo geralmente se refere ao armazenamento a 4 C.
[0206] Em uma modalidade, a formulação é armazenada a uma temperatura na faixa de -1 a - 95C, por exemplo, -1 a -80C, tal como -1, -2, -3, -4 ou -65, -66, -67, -68, -69, -70, -71, -72, -73, -74, -75, -77, - 78, -79, -80, -81, -82, -83, -84, -85, -86, -87, -88, -89 ou -90C, em particular - 80C.
[0207] Em uma modalidade, é fornecida uma formulação parenteral líquida (incluindo uma formulação reconstituída), por exemplo, para infusão ou injeção, por exemplo de uma replicação com capacidade oncolítica de acordo com a presente divulgação, em que a formulação fornece um dose na faixa de 1x1010 a 1x1014 partículas virais por volume de dose.
[0208] Em uma modalidade, as formulações líquidas são fornecidas como um concentrado, o que requer diluição antes da administração a um paciente.
[0209] Em uma modalidade, a formulação é fornecida como uma formulação liofilizada para reconstituição com um líquido injetável, tal como água para injeção, solução salina ou glicose.
[0210] Em uma modalidade, a formulação é fornecida como uma concentração líquida, para diluição com líquido para injeção, tal como água para injeção, solução salina, glicose ou similar.
[0211] Em uma modalidade, a formulação é fabricada como um líquido (não é liofilizado a qualquer momento), em particular em uma forma final, isto é, adequada para administração a um paciente.
[0212] A formulação parenteral significa uma formulação projetada para não ser entregue através do trato GI. As rotas de entrega parenterais típicas incluem injeção, implantação ou infusão. Em uma modalidade, a formulação é fornecida em uma forma para entrega em bólus.
[0213] Em uma modalidade, a formulação parenteral está na forma de uma injeção. A injeção inclui injeção intravenosa, subcutânea, intratumoral ou intramuscular. Injeção, conforme utilizado no presente documento, significa a inserção de líquido no corpo por meio de uma seringa. Em uma modalidade, o método da presente divulgação não envolve injeção intratumoral.
[0214] Em uma modalidade, a formulação parenteral está sob a forma de uma infusão.
[0215] Infusão, conforme utilizado no presente documento, significa a administração de fluidos por meio de gotejamento, bomba de infusão, acionador de seringa ou dispositivo equivalente. Em uma modalidade, a infusão é administrada ao longo de um período na faixa de 1,5 minuto a 120 minutos, tal como cerca de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 65, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 ou 115 minutos.
[0216] Em uma modalidade, uma dose da formulação é inferior a 100 ml, por exemplo, 30 ml, tal como administrada por um acionador de seringa.
[0217] Em uma modalidade, a injeção é administrada como uma injeção lenta, por exemplo, ao longo de um período de 1,5 a 30 minutos. A injeção lenta como utilizada neste documento é a injeção manual com seringa.
[0218] Em uma modalidade, a formulação é para administração intravenosa (i.v.). Essa via é particularmente eficaz para entrega de vírus oncolíticos porque permite acesso rápido à maior parte dos órgãos e tecido e é particularmente útil para o tratamento de metástases, por exemplo,
metástases estabelecidas, especialmente aquelas localizadas em regiões altamente vascularizadas, tais como o fígado e pulmões.
[0219] As formulações terapêuticas serão tipicamente estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma ou outra formulação parenteral adequada para administração a um humano.
[0220] As formulações de acordo com a presente divulgação podem ser formuladas como um dispositivo pré-cheio, tal como uma seringa ou frasco, particularmente como uma dose única.
[0221] A formulação compreenderá geralmente um diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável, por exemplo, um carreador isotônico não tóxico que seja compatível com o vírus e no qual o vírus seja estável durante o período de tempo requerido.
[0222] O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão que contém, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e polietileno glicol e similares) e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, com uso de um dispersante ou tensoativo, tal como lecitina ou um tensoativo não iônico, tal como polissorbato 80 ou 40. Em dispersões, a manutenção do tamanho de partícula exigido pode ser assistida pela presença de um tensoativo. Os exemplos de agentes isotônicos incluem açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição.
[0223] Em uma modalidade, as formulações parenterais utilizadas podem compreender um açúcar, por exemplo, dextrose, manose, sacarose ou similar, um sal tal como cloreto de sódio, cloreto de magnésio ou cloreto de potássio e uma combinação de dois ou mais iguais.
[0224] Em uma modalidade, a formulação de acordo com a presente divulgação não compreende um açúcar. Os componentes do tampão não são considerados açúcares, para os fins desta divulgação.
[0225] Em uma modalidade, a formulação da presente divulgação não compreende um sal, tal como cloreto de sódio. Os reagentes utilizados no tampão não são considerados sal para os fins da presente divulgação.
[0226] Em uma modalidade, a formulação da presente divulgação não compreende um cátion divalente, por exemplo, CaCl 2, e/ou MgCl2.
[0227] A formulação também pode compreender um conservante tal como EDTA. Em uma modalidade, a formulação da presente divulgação não contém EDTA.
[0228] Em uma modalidade, a formulação de acordo com a presente divulgação não compreende clorobutanol.
[0229] Em uma modalidade, a formulação da divulgação não compreende gelatina.
[0230] Em uma modalidade, as formulações não contêm ingredientes que aumentam a imunogenicidade do adenovírus do grupo B, isto é, as formulações não contêm adjuvantes.
[0231] Em uma modalidade, a formulação compreenderá vírus oncolítico purificado de acordo com a presente divulgação, por exemplo, 1x1010 a 1x1014 partículas virais por dose, tais como 1x10 10 a 1x1012 partículas virais por dose. Em uma modalidade, a concentração de vírus na formulação está na faixa de 2x108 a 2x1014 vp/ml, tal como 2x1012 vp/ml.
[0232] Uma discussão completa de carreadores farmaceuticamente aceitáveis está disponível em Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).
[0233] A presente divulgação também se estende a soluções ou suspensões líquidas entregues intranasalmente, por exemplo, utilizando um dispositivo conforme divulgado nos documentos WO2009/068877 e US2004/0153033, ambos incorporados neste documento a título de referência.
[0234] O adenovírus do grupo B, conforme utilizado, geralmente se refere a um adenovírus com capacidade de replicação (inclusive competente para replicação) ou vírus com deficiência de replicação designado como vírus do grupo B, por exemplo Ad11, tal como Ad11p, incluindo quimeras do mesmo, tal como EnAd, a menos que o contexto indique o contrário. Em alguns casos, pode ser utilizado para se referir apenas a vírus competentes para replicação e isso ficará claro a partir do contexto.
[0235] O subgrupo B (grupo B ou tipo B), conforme utilizado neste documento, refere-se a vírus com pelo menos a fibra e o hexon de um adenovírus do grupo B, por exemplo, o capsídeo inteiro de um vírus do grupo B, tal como substancialmente todo o genoma de um vírus do grupo B. Os vírus do subgrupo B incluem 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 50 e 55.
[0236] Em uma modalidade, o vírus da divulgação, tal como um vírus oncolítico, tem um hexon Ad11, tal como um hexon A11p. Em uma modalidade, o vírus da divulgação, tal como um vírus oncolítico, tem uma fibra do subgrupo B. Em uma, o vírus da divulgação, tal como um vírus oncolítico, tem uma fibra Ad11, tal como uma fibra A11p. Em uma modalidade, o vírus da divulgação, tal como um vírus oncolítico, tem proteínas de fibra e hexon do mesmo serotipo, por exemplo, um adenovírus do subgrupo B, tal como Ad11, em particular Ad11p.
[0237] Em uma modalidade, o vírus da divulgação, tal como o vírus oncolítico tem uma fibra, proteínas hexon e penton do mesmo serotipo, por exemplo, Ad11, em particular Ad11p, por exemplo, encontrado nas posições 30.811 a 31.788, 18.254 a 21.100 e 13.682 a 15.367 da sequência genômica do último.
[0238] O enadenotucirev (EnAd) é um adenovírus oncolítico quimérico, anteriormente conhecido como ColoAd1 (WO2005/118825), com fibra, penton e hexon de Ad11p, portanto, é um vírus do subgrupo B. O mesmo tem uma região E2B quimérica que compreende DNA de Ad11p e Ad3. Quase toda a região E3 e parte da região E4 é deletada no EnAd.
[0239] E3, conforme utilizado no presente documento, se refere a uma sequência de DNA que codifica parte ou a totalidade de uma região E3 do adenovírus (isto é, proteína/polipeptídeo), o mesmo pode sofrer mutação de modo que a proteína codificada pelo gene E3 tenha alterações conservadoras ou não conversadoras de aminoácidos, de modo que tenha a mesma função do tipo selvagem (a proteína correspondente não mutada); função aumentada em comparação à proteína do tipo selvagem; função diminuída, tal como nenhuma função em comparação à proteína do tipo selvagem; ou tenha uma nova função em comparação à proteína do tipo selvagem ou uma combinação das mesmas, conforme apropriado. Onde parte da região E3 é deletada (parcialmente excluída na região E3) inclui onde 1 a 99% da região E3 é deletada, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94 95, 96, 97 ou 98% deletada, por exemplo em uma região codificante e/ou não codificante do gene.
[0240] E4, conforme utilizado no presente documento, se refere a uma sequência de DNA que codifica parte ou a totalidade de uma região E4 do adenovírus (isto é, região de polipeptídeo/proteína), o mesmo pode ser mutado de modo que a proteína codificada pelo gene E4 tenha alterações conservativas ou não conservativas de aminoácidos, e tenha a mesma função do tipo selvagem (a proteína correspondente não mutada); função aumentada em comparação à proteína do tipo selvagem; função diminuída, tal como nenhuma função em comparação à proteína do tipo selvagem; ou tenha uma nova função em comparação à proteína do tipo selvagem ou uma combinação das mesmas, conforme apropriado.
[0241] A região E4 pode ter alguma função ou funções relevantes para a replicação viral e, portanto, modificações, tal como a deleção da região E4, podem afetar o ciclo de vida e a replicação do vírus, por exemplo, de modo que uma célula de empacotamento possa ser requerida para a replicação.
[0242] Em uma modalidade, E4 tem a região E4ORF4 deletada.
[0243] "Derivado de", conforme utilizado neste documento, refere-se a, por exemplo, onde um fragmento de DNA é retirado de um adenovírus ou corresponde a uma sequência originalmente encontrada em um adenovírus. Esta linguagem não pretende limitar como a sequência foi obtida, por exemplo, uma sequência utilizada em um vírus de acordo com a presente divulgação pode ser sintetizada.
[0244] Em uma modalidade, o derivado tem 100% de identidade de sequência ao longo de todo o seu comprimento com a sequência de DNA original.
[0245] Em uma modalidade, o derivado tem 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade ou semelhança com a sequência de DNA original.
[0246] Em uma modalidade, o derivado hibridiza sob condições rigorosas com a sequência de DNA original.
[0247] Conforme usado neste documento, "rigor" ocorre tipicamente em uma faixa de cerca de Tm (temperatura de fusão) a -50 °C (5° abaixo da Tm da sonda) a cerca de 20 °C a 25 °C abaixo de Tm. Como será entendido por aqueles versados na técnica, uma hibridização rigorosa pode ser usada para identificar ou detectar sequências polinucleotídicas idênticas ou para identificar ou detectar sequências polinucleotídicas semelhantes ou relacionadas. Conforme utilizado neste documento, o termo "condições rigorosas" significa que a hibridização ocorrerá geralmente se houver pelo menos 95%, tal como pelo menos 97% de identidade entre as sequências.
[0248] Conforme utilizado neste documento, “hibridização” conforme utilizado neste documento, deve incluir "qualquer processo pelo qual uma cadeia polinucleotídica se junta a uma cadeia complementar através do emparelhamento de bases" (Coombs, J., Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York, NY, 1994).
[0249] Vírus oncolíticos são aqueles que infectam preferencialmente células cancerígenas e aceleram a morte celular, por exemplo por lise das mesmas, ou se replicam seletivamente nas células cancerígenas. Vírus que infectam preferencialmente células cancerígenas são vírus que mostram uma taxa mais alta de infectar células cancerígenas quando comparadas às células saudáveis normais.
[0250] Os vírus que se replicam seletivamente nas células cancerígenas são aqueles que requerem um gene ou proteína que é regulada de forma crescente em excesso em uma célula cancerígena para se replicar, tal como o gene p53.
[0251] A região E2B é uma região conhecida nos adenovírus do grupo B e representa cerca de 18% do genoma viral. Pensa-se que codifique a proteína IVa2, DNA polimerase e proteína terminal. Na cepa Slobitski de Ad11 (referida como Ad11p) estas proteínas são codificadas nas posições 5588-3964, 8435-5067 e 10342-8438 respectivamente na sequência genômica e a região E2B decorre de 10342-3950. A posição exata da região E2B pode mudar em outros serotipos, mas a função é conservada em todos os genomas de adenovírus humanos examinados até o momento, pois todos eles têm a mesma organização geral.
[0252] A replicação capaz conforme utilizada neste documento refere-se a um vírus capaz de se replicar in vivo, incluindo um vírus com replicação dependente de um gene regulado de forma crescente em uma célula doente, tal como p53, e vírus competentes para replicação.
[0253] Em uma modalidade, o vírus é competente para replicação. O vírus competente para replicação, conforme utilizado neste documento, refere-se a um vírus capaz de replicação sem a assistência de uma linha celular complementar que codifica uma proteína viral essencial, como a codificada pela região E1 (também chamada linha de embalagem celular) e um vírus capaz de se replicar sem a assistência de um vírus auxiliar.
[0254] Os vetores virais conforme utilizados neste documento são deficientes em replicação. Os vírus deficientes em replicação da presente divulgação requerem uma linha celular de empacotamento para replicar. As linhas celulares de empacotamento contêm um gene ou genes para complementar aqueles que são deficientes no vírus.
[0255] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece um processo de preparação de uma formulação farmacêutica que compreende a etapa de misturar um adenovírus do grupo B (tal como um vírus do grupo B competente para replicação) com 15 a 25% v/v de glicerol, 0,1 a 1,5% v/v de etanol, um tampão (em que a % v/v é o volume final da formulação) e, se necessário, ajustando o pH na faixa de 8,0 a 9,5, por exemplo, 8,0 a 9,5 (ou 8,5 a 9,5), tal como 8,0 a 8,5 (ou 8,5 a 9).
[0256] Em uma modalidade, o processo compreende ainda a adição de 0,01 a 0,3 mM, por exemplo 0,01 a 0,25 mM (ou 0,01 a 2 mM), tal como 0,25 mM (ou 0,15 mM) de metionina.
[0257] Em uma modalidade, a formulação compreende uma sequência de vírus divulgada na listagem de sequências associada depositada com este documento.
TRATAMENTO
[0258] O paciente receptor da formulação de acordo com a presente divulgação, pode ser um humano ou animal, tal como um animal doméstico. Em uma modalidade, o paciente é um humano, tal como um humano adulto.
[0259] A formulação da presente divulgação é adequada para a formulação de adenovírus do grupo B capazes de replicação (inclusive competentes para replicação) e vetores adenovirais do grupo B com deficiência de replicação, para aplicações terapêuticas e de diagnóstico, por exemplo, para aplicações de terapia gênica, vacinas, tratamento de câncer e similares.
[0260] Em outro aspecto, a presente divulgação se estende a uma formulação, conforme descrito no presente documento para uso em tratamento, em particular para o tratamento de câncer.
[0261] Em uma modalidade, o método de tratamento é para uso no tratamento de um tumor.
[0262] Tumor, conforme utilizado no presente documento, se refere a uma massa abnormal de tecido que resulta de uma divisão celular excessiva que é descontrolada e progressiva, também denominada neoplasma. Os tumores podem ser benignos (não cancerígenos) ou malignos. O tumor abrange todas as formas de câncer e metástases. Em uma modalidade, o tumor é cancerígeno.
[0263] Em uma modalidade, o tumor é um tumor sólido. O tumor sólido pode estar localizado ou metastizado.
[0264] Em uma modalidade, o tumor é de origem epitelial.
[0265] Em uma modalidade, o tumor é uma malignidade, tal como câncer colorretal, hepatoma, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de tireoide, câncer renal, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço ou câncer de pulmão.
[0266] Em uma modalidade, o tumor é uma malignidade colorretal.
[0267] A malignidade conforme utilizada neste documento refere-se a células cancerígenas.
[0268] Em uma modalidade, o adenovírus oncolítico é utilizado no tratamento ou prevenção de metástase.
[0269] Em uma modalidade, a formulação da presente invenção é utilizada no tratamento de cânceres resistentes a fármacos.
[0270] Em uma modalidade, o vírus é administrado em combinação com a administração de um tratamento ou terapia de câncer adicional.
[0271] Em uma modalidade, é fornecida uma formulação de acordo com a presente divulgação para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer, por exemplo, um câncer descrito acima.
[0272] Em um aspecto adicional, é fornecido um método de tratamento de câncer que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma formulação de acordo com a presente divulgação a um paciente em necessidade da mesma, por exemplo, um paciente humano.
[0273] Em uma modalidade, a formulação da presente invenção é administrada em combinação com outra terapia.
[0274] "Em combinação", conforme utilizado no presente documento, pretende abranger onde a formulação é administrada antes, simultaneamente e/ou após o tratamento ou terapia de câncer. No entanto, geralmente os regimes de tratamento para a terapia combinada geralmente se sobrepõem.
[0275] A terapia de câncer inclui cirurgia, radioterapia, terapia alvejada e/ou quimioterapia.
[0276] O tratamento de câncer, conforme usado no presente documento, se refere ao tratamento com um composto terapêutico ou agente biológico, por exemplo, um anticorpo destinado a tratar o câncer e/ou terapia de manutenção do mesmo.
[0277] Em uma modalidade, o tratamento de câncer é selecionado a partir de qualquer outra terapia anticancerígena incluindo um agente quimioterápico; um agente-alvo anticancerígeno, tal como um fármaco anticorpo conjugado; radioterapia, terapia com radioisótopos ou qualquer combinação dos mesmos.
[0278] Em uma modalidade, a formulação da presente divulgação pode ser usada como pré-tratamento da terapia, tal como cirurgia (terapia neoadjuvante), para encolher o tumor, para tratar metástase e/ou prevenir metástase ou metástase adicional. A formulação pode ser usada após a terapia, tal como uma cirurgia (terapia adjuvante), para tratar metástase e/ou prevenir metástase ou metástase adicional.
[0279] Em uma modalidade, uma formulação da presente divulgação é utilizada na terapia de manutenção.
[0280] Em uma modalidade, a formulação de acordo com a presente divulgação é administrada em combinação com, por exemplo concomitantemente com, uma terapia de câncer.
[0281] Concomitantemente, conforme utilizado no presente documento, é a administração do tratamento de câncer adicional ao mesmo tempo ou aproximadamente ao mesmo tempo que a formulação. O tratamento pode estar contido na mesma formulação ou administrado como uma formulação separada.
[0282] Em uma modalidade, o vírus é administrado em combinação, por exemplo, concomitantemente com a administração de um agente quimioterápico.
[0283] O agente quimioterápico, conforme utilizado no presente documento, se refere a agentes ou fármacos químicos antineoplásicos específicos que são seletivamente destrutivos a células e tecidos malignos. Por exemplo, agentes alquilantes, antimetabólitos, antraciclinas, alcaloides de plantas, inibidores de topoisomerase e outros agentes antitumorais. Exemplos de agentes quimioterapêuticos específicos incluem doxorrubicina, 5-fluorouracila (5-FU), paclitaxel, capecitabina, irinotecano e platinas, tais como cisplatina e oxaliplatina. A dose pode ser escolhida pelo praticante com base na natureza do câncer a ser tratado.
TERAPIAS DE COMBINAÇÃO E AGENTES QUIMIOTERAPÊUTICOS
[0284] A formulação da presente divulgação pode ser utilizada em combinação com uma terapia adicional de câncer, por exemplo quimioterapia.
[0285] O agente quimioterapêutico e quimioterapia ou agente citotóxico são utilizados de modo intercambiável no presente documento, a menos que o contexto indique de outro modo.
[0286] A quimioterapia, conforme utilizado no presente documento, se refere a agentes químicos ou fármacos antineoplásicos específicos que são "seletivamente" destrutivos para células e tecidos malignos, por exemplo, agentes alquilantes, antimetabólitos, incluindo inibidores da timidilato sintase, antraciclinas, agentes antimicrotúbulos, incluindo alcaloides de plantas, inibidores de topoisomerase, inibidores de parp e outros agentes antitumorais. Seletivamente, neste contexto, é usado livremente, porque é claro que muitos desses agentes têm efeitos colaterais graves.
[0287] A dose preferencial pode ser escolhida pelo praticante com base na natureza do câncer a ser tratado.
[0288] Exemplos de agentes alquilantes que podem ser utilizados no método da presente divulgação incluem um agente alquilante mostardas nitrogenada, nitrosoureias, tetrazinas, aziridinas, platinas e derivados, e agentes alquilantes não clássicos.
[0289] Exemplo um agente quimioterapêutico contendo platina (também referido como platinas), tais como cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, satraplatina, picoplatina, nedaplatina, triplatina e lipoplatina (uma versão lipossomal de cisplatina), em particular cisplatina, carboplatina e oxaliplatina.
[0290] A dose para cisplatina varia de cerca de 20 a cerca de 270 mg/m2, dependendo do câncer exato. Frequentemente, a dose está na faixa de cerca de 70 a cerca de 100mg/m2.
[0291] Mostardas nitrogenadas incluem mecloretamina, ciclofosfamida, melfalano, clorambucila, ifosfamida e bussulfano. Nitrosoureias incluem N-nitroso-N-metilureia (MNU), carmustina (BCNU), lomustina (CCNU) e semustina (MeCCNU), fotemustina e estreptozotocina. Tetrazinas incluem dacarbazina, mitozolomida e temozolomida.
[0292] Aziridinas incluem tiotepa, mitomicina e diaziquona (AZQ).
[0293] Exemplos de antimetabólitos que podem ser utilizados no método da presente divulgação incluem antifolatos (por exemplo, metotrexato e pemetrexede), análogos de purina (por exemplo, tiopurinas, tais como azatiopurina, mercaptopurina, tiopurina, fludarabina (incluindo a forma de fosfato), pentostatina e cladribina), análogos de pirimidina (por exemplo, fluoropirimidinas, tais como 5-fluorouracila e profármacos das mesmas, tais como capecitabina [Xeloda®]), floxuridina, gencitabina, citarabina, decitabina, cloridrato de raltitrexede (tomudex), cladribina e 6-azauracila.
[0294] Exemplos de antraciclinas que podem ser utilizadas no método da presente divulgação incluem daunorrubicina (Daunomicina), daunorrubicina (lipossomal), doxorrubicina (Adriamicina), doxorrubicina (lipossomal), epirrubicina, idarrubicina, valrubicina atualmente usada apenas para tratar câncer de bexiga e mitoxantrona, um análogo de antraciclina, em particular, doxorrubicina.
[0295] Exemplos de agentes antimicrotúbulos que podem ser utilizados no método da presente divulgação incluem alcaloides da vinca e taxanos.
[0296] Alcaloides de vinca incluem produtos químicos completamente naturais, por exemplo vincristina e vinblastina e também alcaloides de vinca semisintéticos, por exemplo vinorelbina, vindesinae vinflunina.
[0297] Taxanos incluem paclitaxel, docetaxel, abraxano, carbazitaxel e derivados dos mesmos. Os derivados de taxanos, conforme utilizados no presente documento, incluem reformulações de taxanos como taxol, por exemplo, em formulações micelares, os derivados também incluem derivados químicos em que a química sintética é utilizada para modificar um material de partida que é um taxano.
[0298] Inibidores da topoisomerase que podem ser utilizados em um método da presente divulgação incluem inibidores de topoisomerase tipo I, inibidores da topoisomerase tipo II e venenos de topoisomerase tipo II. Os inibidores do tipo I incluem topotecano, irinotecano, indotecano e indimitecano. Os inibidores de tipo II incluem genisteína e ICRF 193, que tem a seguinte estrutura: .
[0299] Venenos do tipo II incluem ansacrina, etoposídeo, fosfato de etoposídeo, teniposídeo e doxorrubicina e fluoroquinolonas.
[0300] Em uma modalidade, uma combinação de agentes quimioterapêuticos utilizada é, por exemplo, uma platina e 5-FU ou um profármaco dos mesmos, por exemplo, cisplatina ou oxaplatina e capecitabina ou a gencitabina, tal como FOLFOX.
[0301] Em uma modalidade, a quimioterapia compreende uma combinação de agentes de quimioterapia, em particular, agentes quimioterapêuticos citotóxicos.
[0302] Em uma modalidade, a combinação de quimioterapias compreende uma platina, tal como cisplatina, e fluorouracila ou capecitabina.
[0303] Em uma modalidade, a combinação de quimioterapias em capecitabina e oxaliplatina (Xelox).
[0304] Em uma modalidade, a quimioterapia é uma combinação de ácido folínico e 5-FU, opcionalmente em combinação com oxaliplatina.
[0305] Em uma modalidade, a quimioterapia é uma combinação de ácido folínico, 5-FU e irinotecano (FOLFIRI), opcionalmente em combinação com oxaliplatina (FOLFIRINOX). O regime consiste em: irinotecano (180 mg/m² IV em 90 minutos) concomitantemente com ácido folínico (400 mg/m² [ou 2 x 250 mg/m²] IV em 120 minutos); seguido de fluorouracil (bólus IV de 400 a 500 mg/m²) e depois fluorouracil (2400 a 3000 mg/m² de infusão intravenosa por 46 horas). Esse ciclo geralmente é repetido a cada duas semanas. As dosagens mostradas acima podem variar de ciclo para ciclo.
[0306] Em uma modalidade, a combinação de quimioterapias utiliza um inibidor de microtúbulos, por exemplo, sulfato de vincristina, epotilona A, N-[2-[(4-Hidroxifenil)amino]-3-piridinil]-4- metoxibenzenossulfonamida (ABT-751), um agente quimioterapêutico derivado de taxol, por exemplo, paclitaxel, abraxano ou docetaxel, ou uma combinação dos mesmos.
[0307] Em uma modalidade, a combinação utiliza um inibidor de mTor. Exemplos de inibidores de mTor incluem: everolimus (RAD001), WYE-354, KU-0063794, papamicina (Sirolimus), Temsirolimus, Deforolimus (MK-8669), AZD8055 e BEZ235 (NVP-BEZ235).
[0308] Em uma modalidade, a combinação utiliza um inibidor de MEK. Exemplos de inibidores de MEK incluem: AS703026, CI-1040 (PD184352), AZD6244 (Selumetinib), PD318088, PD0325901, AZD8330, PD98059, U0126-EtOH, BIX 02189 ou BIX 02188.
[0309] Em uma modalidade, a combinação de quimioterapias utiliza um inibidor de AKT. Exemplos de inibidores de AKT incluem: MK-2206 e AT7867.
[0310] Em uma modalidade, a combinação utiliza um inibidor de aurora quinase. Exemplos de inibidores da aurora quinase incluem:
Inibidor I da Aurora A, VX-680, AZD1152-HQPA (Barasertib), Mesilato SNS-314, PHA-680632, ZM-447439, CCT129202 e Hesperadin.
[0311] Em uma modalidade, a combinação utiliza um inibidor de p38, por exemplo, conforme divulgado no documento No. WO2010/038086, tal como N-[4-({4-[3-(3-terc-butil-1-p-tolil-1H-pirazol-5- il)ureido]naftalen-1-iloxi}metil)piridin-2-il]-2-metoxiacetamida.
[0312] Em uma modalidade, a combinação utiliza um inibidor de pi3K, por exemplo, selecionado entre dactolisibe, pictilisibe, LY294002, idelalsibe, buparlisibe, autofinibe, serabelisibe, IP1-549, SF2534, GDC-0326, SAR405, TGR-1202, VPS34, GSK2269557, 740 Y-P, PI-103, NU7441, TGX-221, IC-87114, wormannin, análogo de XL147, ZSTK474, alpelisibe, AS-605240, PIK-75, 3-metiladenina, A66, voxtalisibe, PIK-93, AZD6482, PF-04691502, apitolisibe, GSK105965, duvelisibe, TG100-115, AS- 252424, BGT226, CUDU-907 PIK-294, AS-604850, GSK2636771, copanlisib, YM201636, CH5132799, CAY10505, PIK-293, TG100713, VS-5584, taselisib, CZC24832, AMG319, GSK2292767, GDC-0084, HS-173, quercetib 317, LY3023414, VPS34-IN1, PIK-III, PI-3065, pilaralisibe, AZD8835, PF-4989216 e AZD8186.
[0313] Em uma modalidade, a combinação utiliza um inibidor de Bcl-2. Exemplos de inibidores de Bcl-2 incluem: mesilato de obatoclax, ABT-737, ABT-263 (navitoclax) e TW-37.
[0314] Em uma modalidade, a combinação de quimioterapia compreende um antimetabólito, tal como capecitabina (xeloda), fosfato de fludarabina, fludarabina (fludara), decitabina, raltitrexedo (tomudex), cloridcamundongo de gemcitabina e cladribina.
[0315] Em uma modalidade, a combinação compreende ganciclovir que pode auxiliar no controle das respostas imunológicas e/ou na vascularização do tumor.
[0316] Em uma modalidade, a combinação compreende um inibidor de PARP.
[0317] Em uma modalidade, o agente terapêutico é o ganciclovir que pode auxiliar no controle de respostas imunológicas e/ou na vascularização do tumor.
[0318] Em uma modalidade, uma ou mais terapias utilizadas no método do presente documento são metronômicas, isto é, um tratamento contínuo ou frequente com baixas doses de fármacos anticancerígenos, frequentemente, administrados concomitantemente com outros métodos de terapia.
[0319] Os adenovírus oncolíticos do subgrupo B (em particular Ad11 e aqueles derivados do mesmo, tais como EnAd) podem ser particularmente sinérgicos com agentes quimioterápicos devido ao fato de que parecem ter um mecanismo de ação que é amplamente independente da apoptose, exterminando as células cancerígenas por um mecanismo predominantemente necrolítico. Além disso, a imunossupressão que ocorre durante a quimioterapia pode permitir que o vírus oncolítico funcione com maior eficiência.
[0320] A dose terapêutica, conforme utilizado no presente documento se refere à quantidade de vírus, tal como adenovírus que é adequada para obter o efeito terapêutico pretendido quando utilizado em um regime de tratamento adequado, por exemplo, melhora de sintomas ou afecções de uma doença, em particular sem evocar os efeitos colaterais limitantes da dose. Uma dose pode ser considerada uma dose terapêutica no tratamento de câncer ou metástases quando o número de partículas virais pode ser suficiente para resultar no seguinte: o crescimento tumoral ou metastático ser retardado ou parado, ou o tumor ou metástase diminuírem de tamanho e/ou o tempo de vida do paciente ser prolongado. As doses terapêuticas adequadas são geralmente um equilíbrio entre o efeito terapêutico e a toxicidade tolerável, por exemplo, quando o efeito secundário e a toxicidade são toleráveis, visto o benefício alcançado pela terapia.
[0321] Em uma modalidade, é fornecida administração sistemática de doses múltiplas de uma formulação parenteral de um adenovírus oncolítico de acordo com a presente divulgação em um único ciclo de tratamento, por exemplo, em que a dose total dada em cada administração está na faixa de 1x1010 a 1x1014 de partículas virais por dose.
[0322] Em uma modalidade, uma ou mais doses (por exemplo, cada dose) de vírus ou composição que compreende o mesmo são administradas de modo que a taxa de entrega de partículas virais esteja na faixa de 2x1010 partículas por minuto a 2x1012 partículas por minuto.
[0323] Em uma modalidade, um vírus ou construto terapêutico de acordo com a presente divulgação (incluindo uma formulação que compreende o mesmo) é administrado semanalmente, por exemplo, na semana 1 a dose é administrada no dia 1, 3, 5, seguida por uma dose a cada semana subsequente.
[0324] Em uma modalidade, um vírus ou construto terapêutico, de acordo com a presente divulgação (incluindo uma formulação que compreende a mesma) é administrado a cada duas ou três semanas, por exemplo, é administrado na semana 1 um nos dias 1, 3 e 5 e na semana 2 ou 3 é também administrado nos dias 1, 3 e 5 das mesmas. Esse regime de dosagem pode ser repetido tantas vezes quanto apropriado.
[0325] Em uma modalidade, uma formulação de acordo com a presente divulgação (incluindo uma formulação compreendendo a mesma) é administrada mensalmente, por exemplo, em um ciclo de tratamento ou como terapia de manutenção.
[0326] Em uma modalidade, os vírus e construtos da presente divulgação são preparados por meio de técnicas recombinantes. A pessoa versada na técnica apreciará que o genoma de adenovírus armado pode ser fabricado por outros meios técnicos, incluindo sintetizar inteiramente o genoma ou um plasmídeo que compreende parte de todo o genoma. A pessoa versada na técnica apreciará que, no caso de sintetizar o genoma, a região de inserção pode não compreender os nucleotídeos do sítio de restrição, uma vez que os últimos são artefatos após a inserção de genes com o uso de métodos de clonagem.
[0327] Em uma modalidade, o genoma de adenovírus armado é fabricado inteiramente sinteticamente.
[0328] No contexto do presente relatório descritivo "que compreende" deve ser interpretado como "incluindo".
[0329] As modalidades da invenção que compreendem determinados recursos/elementos também são destinadas a abranger modalidades alternativas “que consistem” ou “que consistem essencialmente” nos elementos/recursos relevantes.
[0001] Onde for tecnicamente apropriado, as modalidades da invenção podem ser combinadas.
[0330] Referências técnicas tais como patentes e pedidos são incorporados ao presente documento a título de referência.
[0331] Quaisquer modalidades citadas especificamente e explicitamente no presente documento podem formar a base de uma isenção de responsabilidade, isoladamente ou em combinação com uma ou mais modalidades adicionais.
[0332] Os cabeçalhos deste documento são utilizados para dividir o documento em seções e não se destinam a ser usados para interpretar o significado da divulgação fornecida neste documento.
[0333] O presente pedido reivindica prioridade da GB1801614.7, depositado em 31 de janeiro de 2018 e incorporado neste documento a título de referência. O pedido de prioridade pode ser utilizado como base para uma correção no presente relatório descritivo.
[0334] A presente invenção é descrita adicionalmente por meio de ilustração somente nos exemplos a seguir.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0335] A Figura 1 mostra resultados de experimentos que comparam a estabilidade dos adenovírus do grupo B em diferentes tampões em uma faixa de diferentes valores de pH. (A) estabilidade dos adenovírus armazenados em 2 a 8 por 20 meses (B) estabilidade dos adenovírus do grupo B armazenados a 25 °C por 8 semanas.
[0336] A Figura 2 mostra os resultados de experimentos para determinar o efeito do glicerol na estabilidade dos adenovírus do grupo B. (A) gráficos que mostram estabilidade dos adenovírus do grupo B na semana 0, semana 7 e semana 17 em uma faixa de diferentes concentrações de glicerol, variando de 8 a 20%. (B) gráfico que mostra o papel do glicerol na polidispersividade ao longo de 7 semanas. (C) gráfico que mostra a % de mudança na concentração de adenovírus do grupo B em formulações contendo 0%, 10% e 20% de glicerol, conforme medido pelo ensaio de HPLC.
[0337] A Figura 3 mostra resultados de experimentos para determinar etanol/arginina/metionina/polissorbato que contribuem para a estabilidade dos adenovírus do grupo B. (A) gráfico que mostra a potência de um adenovírus do grupo B ao longo do tempo para diferentes tampões. (B) gráfico que mostra a concentração de um adenovírus do grupo B ao longo do tempo para diferentes tampões. (C) gráfico que mostra a concentração de uma formulação de controle que compreende glicerol, tampão de HEPES, etanol, arginina, metionina e polissorbato ao longo do tempo.
[0338] A Figura 4 mostra resultados de experimentos mostrando o impacto do etanol, arginina e metionina na potência dos adenovírus durante o armazenamento a longo prazo em 4 C. (A) mostra a potência do adenovírus do grupo B em 5 mM de HEPES com 20% de glicerol (B) gráfico que mostra o efeito na potência relativa quando o etanol é incluído na formulação. (C) gráfico que mostra o efeito na potência relativa quando etanol e metionina são incluídos na formulação. (D) gráfico que mostra o efeito na potência relativa quando etanol, metionina e arginina são incluídos na formulação. (E) gráfico que mostra a concentração de adenovírus ao longo do tempo para formulações testadas nas Figuras 4B a 4D.
[0339] A Figura 5 mostra resultados de experimentos para avaliar o efeito do polissorbato na estabilidade dos adenovírus. (A) gráfico que mostra a potência dos adenovírus ao longo do tempo quando 0,115% de polissorbato é incluído na formulação versus 0,15% de polissorbato. (B) gráfico que mostra a concentração de adenovírus ao longo do tempo, quando 0,115% de polissorbato é incluído na formulação versus 0,15% de polissorbato.
[0340] A Figura 6 mostra os resultados de experimentos para avaliar a estabilidade dos adenovírus armazenados em diferentes formulações a 25 C durante um período de 10 semanas. (A) potência de adenovírus armazenados em diferentes formulações durante um período de 10 semanas a 25 C. (B) concentração de adenovírus armazenados em diferentes formulações durante um período de 10 semanas a 25 C.
[0341] A Figura 7 mostra os tempos de retenção relativos de Ad5 (um vírus do grupo C) e Ad11 (um vírus do grupo B) analisados por cromatografia de troca de ânions.
[0342] A Figura 8A mostra análise de potência relativa oncolítica (20% de glicerol, 1,4% de etanol, 15 mM de arginina, 0,25 mM de metionina) armazenados a 4 °C.
[0343] A Figura 8B mostra a razão do vírus total: partículas infecciosas do vírus (20% de glicerol, 1,4% de etanol, 15 mM de arginina, 0,25 mM de metionina) armazenado a 4 °C.
[0344] A Figura 8C mostra análise de potência relativa oncolítica (20% de glicerol, 1,4% de etanol, 15 mM de arginina, 0,25 mM de metionina).
[0345] A Figura 8D mostra concentração de vírus por AEX-HPLC (20% de glicerol, 1,4% de etanol, 15 mM de arginina, 0,25 mM de metionina).
[0346] A Figura 8E mostra a razão do vírus total: partícula do vírus infeccioso (20% de glicerol, 1,4% de etanol, 15 mM de arginina, 0,25 mM de metionina).
SEQUÊNCIAS
[0347] SEQ ID NO: 1 Aceitador de Emenda (SA); SEQ ID NO: 2 Aceitador de Emenda Ramificado (BSA); SEQ ID NO: 3 Sequência de Entrada Interna de Ribossomo (IRES); SEQ ID NO: 4 Sequência de poliadenilação
[0348] SEQ ID NO: 5 Sequência de DNA BX correspondente e incluindo o pb 28166-28366 do genoma EnAd; SEQ ID NO: 6 Sequência de DNA BY correspondente e incluindo o pb 29345-29379 do genoma EnAd; SEQ ID NO: 7 Sequência Líder;SEQ ID NO: 8 Sequência Líder; SEQ ID NO: 9 Peptídeo P2A; SEQ ID NO 10: Peptídeo F2A; SEQ ID NO 11: Peptídeo E2A; SEQ ID NO: 12 Peptídeo 2A; SEQ ID NO: 13 genoma de EnAd; SEQ ID NO: 14 Sequência do genoma do vírus NG-73; SEQ ID NO: 15 Sequência do genoma do vírus NG-74; SEQ ID NO: 16 Sequência do genoma do vírus NG-76; SEQ ID NO: 17 Sequência do genoma do vírus NG-77; SEQ ID NO: 18 Sequência do genoma do vírus NG-78
[0349] SEQ ID NO: 19 Sequência do genoma do vírus NG-92; SEQ ID NO: 20 Sequência do genoma do vírus NG-95; SEQ ID NO: 21 Sequência do genoma do vírus NG-96; SEQ ID NO: 22 Sequência do genoma do vírus NG-97; SEQ ID NO: 23 Sequência do genoma do vírus NG- 134; SEQ ID NO: 24 Sequência do genoma do vírus NG-135; SEQ ID NO: 25 Sequência do genoma do vírus NG-139 que consiste em um cassete de transgene que codifica a citocina, TNFa, inserida na região BY; SEQ ID NO: 26 Uma sequência do genoma do vírus que consiste em um cassete de transgene que codifica um anticorpo anti-VEGF de comprimento total inserido na região BY. O cassete de transgene contém uma sequência de cadeia pesada SSA, ab com líder 5', uma sequência de cadeia leve SSA, ab; SEQ ID NO: 27 Uma sequência do genoma do vírus que consiste em um cassete de transgene que codifica um anticorpo anti-VEGF de comprimento total inserido na região BY; SEQ ID NO: 28 Sequência do genoma do vírus NG-165 que consiste em um cassete de transgene que codifica um anticorpo anti-VEGF de comprimento total inserido na região BY; SEQ ID NO: 29 Sequência do genoma do vírus NG-167 que consiste em um cassete transgênico que codifica um ScFv anti-VEGF com uma etiqueta His6 no C terminal, inserida na região BY; SEQ ID NO: 30 Sequência do genoma do vírus NG-177 que consiste em um cassete de transgene que codifica um anticorpo anti-PD-L1 de comprimento total inserido na região BY; SEQ ID NO: 31 Sequência do genoma do vírus NG-185 que consiste no genoma EnAd com sítios de restrição únicos inseridos nas regiões BX e BY; SEQ ID NO: 32 Sequência do genoma do vírus NG-190 que consiste em um cassete de transgene que codifica um anticorpo anti-PD-L1 de comprimento total inserido na região BY; SEQ ID NO: 33 Sequência do genoma do vírus NG-217 que consiste em um cassete de transgene que codifica o antígeno associado ao tumor, NY-ESO-1, inserido na região BY; SEQ ID NO: 34 Sequência do genoma do vírus NG-220 que consiste em um cassete de transgene que codifica o antígeno associado ao tumor, NY-ESO-1, inserido na região BY; SEQ ID NO: 35 Sequência do genoma do vírus NG-221 que consiste no genoma EnAd com um cassete de transgene que codifica um ScFv anti-PD-L1 com uma etiqueta His6 no C terminal, inserida na região BY; SEQ ID NO: 36Sequência do genoma do vírus NG-242 que consiste em um cassete de transgene que codifica um anticorpo anti-CTLA-4 de comprimento total inserido na região BY; SEQ ID NO: 37 Sequência do genoma do vírus NG-257 que compreende o genoma EnAd com um cassete de transgene que codifica um ScFv anti-VEGF inserido na região BX; SEQ ID NO: 38 sequência do genoma do vírus NG258 que consiste em um cassete de transgene que codifica um anticorpo anti-VEGF de tamanho completo inserido na região BY; SEQ ID NO: 39 Sequência do genoma do vírus NG-272 que compreende o genoma EnAd com um cassete de transgene que codifica um ScFv anti-VEGF e um ScFv anti-PD-L1 inserido na região BY; SEQ ID NO: 40 Sequência do genoma do vírus NG-280 que consiste em um cassete de transgene que codifica o simulador de iodeto de sódio (NIS) inserido na região BY; SEQ ID NO: 41 Sequência do genoma do vírus NG-281 que compreende o genoma EnAd com um cassete de transgene que codifica um ScFv anti-VEGF inserido na região Bx e um segundo cassete de transgene que codifica um ScFv anti-PD-L1 inserido na região BY; SEQ ID NO: 42 Sequência do genoma do vírus NG-330 que compreende o genoma EnAd com um cassete de transgene que codifica o antígeno de ativação de linfócitos T, CD80, inserido na região BY.
O cassete de transgene contém uma sequência de 5’ SSA, cDNA de CD80 humano e uma sequência de 3' poli(A); SEQ ID NO: 43 Sequência do genoma do vírus NG-343 que compreende o genoma EnAd com um cassete de transgene que codifica IFNα e CD80, inserido na região BY.
O cassete de transgene contém uma sequência 5’ SSA, IFNα cDNA, peptídeo P2A, sequência CD80 cDNA e uma sequência 3' poli (A); SEQ ID NO: 44 genoma de NG-641; SEQ ID NO: 45 sequência do genoma do vírus NG-345 que compreende o genoma EnAd com um cassete de transgene que codifica o ligante Flt3, MIP1α e IFNα, inserido na região BY.
O cassete de transgene contém uma sequência de cDNA 5’ SSA, ligante Flt3, sequência de peptídeo P2A, sequência de cDNA MIP1α, sequência de peptídeo T2A, sequência de cDNA de IFNα e uma sequência de poli (A) de 3'; SEQ ID NO: 46 Sequência do genoma do vírus NG-346 que compreende o genoma EnAd com um cassete de transgene que codifica o ligante Flt3, MIP1α e CD80, inserido na região BY.
O cassete de transgene contém uma sequência de cDNA 5’ SSA, ligante Flt3, sequência de peptídeo P2A, sequência cDNA MIP1α, sequência de peptídeo T2A, sequência cDNA CD80 e uma sequência poli (A) 3'; SEQ ID NO: 47 Sequência do genoma do vírus NG-347 que compreende o genoma EnAd com um cassete de transgene que codifica IFNα, MIP1α e CD80, inserido na região BY.
O cassete de transgene contém uma sequência 5’ SSA, IFNα cDNA, sequência peptídica P2A, sequência MIP1α cDNA, sequência peptídica T2A, sequência CD80 cDNA e uma sequência poli (A) 3’; SEQ ID NO: 48 sequência do genoma do vírus NG-348 que compreende o genoma EnAd com um cassete de transgene que codifica uma forma quimérica ancorada na membrana do CD3e anti-humano Fv de cadeia única e o antígeno de ativação de linfócitos T, CD80 inserido na região BY. A cassete de transgene contém uma sequência de 5’ SSA, anti-CD3Ɛ cDNA ancorada na membrana, peptídeo P2A, sequência de cDNA de CD80 humana e uma sequência poli (A) de 3’; SEQ ID NO: 49 Sequência do genoma do vírus NG-348A que compreende o genoma EnAd com um cassete de transgene que codifica uma forma quimérica ancorada na membrana do CD3e anti-humano Fv de cadeia única com etiqueta V5 do C terminal e o antígeno de ativação de linfócitos T, CD80 inserido na região BY. O cassete de transgene contém uma sequência de 5’ SSA, anti-CD3Ɛ cDNA ancorada na membrana, etiqueta V5, peptídeo P2A, sequência de cDNA de CD80 humana e uma sequência poli (A) de 3’; SEQ ID NO: 50 Sequência do genoma NG-350A; SEQ ID NO: 51 Sequência do genoma do vírus NG-420 que compreende o genoma EnAd com um cassete de transgene que codifica uma forma quimérica ancorada na membrana do CD3e anti-Fv anti-humano de cadeia única inserida na região BY. O cassete de transgene contém uma sequência de 5’ SSA, anti-CD3Ɛ ancorada na membrana e uma sequência poli (A) de 3’; SEQ ID NO: 52 Sequência do genoma do vírus NG-420A que compreende o genoma EnAd com um cassete de transgene que codifica uma forma quimérica ancorada na membrana do CD3e anti-humano Fv de cadeia única e uma etiqueta V5 do C terminal, inserida na região BY. O cassete de transgene contém uma sequência de 5’ SSA, anti-CD3Ɛ ancorada na membrana, sequência de etiqueta V5 e uma sequência poli (A) de 3’; SEQ ID NO: 53 NG-601 (EnAd-CMV-EpCAMBiTE); SEQ ID NO: 54 NG-602 (EnAd-SA-EpCAMBiTE); SEQ ID NO: 55 NG-605 (EnAd-CMV-FAPBiTE); SEQ ID NO: 56 NG-606 (EnAd-SA-FAPBiTE); SEQ ID NO: 57 genoma NG-611; SEQ ID NO: 58 genoma NG-612; SEQ ID NO: 59 genoma NG-613; SEQ ID NO: 60 genoma NG-614; SEQ ID NO: 61 genoma NG- 615; SEQ ID NO: 62 genoma NG-616; SEQ ID NO: 63 genoma NG-617; SEQ ID NO: 64 genoma NG-618; SEQ ID NO: 65 genoma NG-640.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1 - TESTE DA INFLUÊNCIA DO PH NA
ESTABILIDADE DE FORMULAÇÕES ADENOVIRAIS
[0350] Foi conduzido um experimento para determinar a influência do pH na estabilidade das formulações adenovirais do grupo B. Diferentes tampões foram testados: carbonato/bicarbonato, dietanolamina, Gly-NaCl, HEPEs, meglumina, borato de sódio e tampão de Tris. Cada tampão foi produzido com uma faixa de diferentes valores de pH: 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 e 10,0. Cada tampão também continha glicerol, etanol, arginina, metionina e polissorbato. O EnAd foi suspenso em cada tampão e as formulações foram armazenadas a 4 C. Amostras de cada formulação foram colhidas em intervalos regulares e a estabilidade dos adenovírus em cada formulação foi determinada medindo a concentração de DNA viral na amostra com uso de HPLC. Uma menor concentração de DNA foi forte indicativa de níveis mais altos de degradação viral e, portanto, menor estabilidade.
[0351] Os resultados do experimento são mostrados nas Figuras 1A e 1B. Como pode ser visto na Figura 1A, o pH tem um efeito significativo na estabilidade dos adenovírus. A estabilidade do pico foi observada em pH 9,0 e isso caiu notavelmente quando o pH foi reduzido para 8,0 ou aumentado para 10,0. Um efeito semelhante também foi observado no armazenamento de curto prazo (até 8 semanas) a 25 C (Figura 1B). É importante ressaltar que, embora haja pequenas variações na estabilidade entre os diferentes tampões, a influência do pH foi muito mais importante e as formulações que se afastaram mais do pH 9,0 tiveram a menor estabilidade, independentemente do tampão utilizado na formulação. Os resultados sugerem, portanto, que um pH entre 8,5 e 9,5 fornece a melhor estabilidade. EXEMPLO 2 - TESTE DA INFLUÊNCIA DO GLICEROL NA
ESTABILIDADE DE FORMULAÇÕES ADENOVIRAIS
[0352] Foi conduzida uma série de experimentos para determinar o efeito na estabilidade das formulações adenovirais do grupo B quando o glicerol foi incluído nas formulações. O glicerol foi triado em combinação com uso de um Projeto de Triagem Definitivo (DSD) em três concentrações: 9%, 14% e 20%. Os resultados foram analisados com uso do software estatístico SAS JMP. Um modelo foi criado com base nos dados DSD. Cada formulação também continha 10 mM de HEPES. Os adenovírus foram suspensos em cada formulação e as formulações foram armazenadas a 4 C por um período de 17 semanas. A estabilidade das formulações foi avaliada em 0 semanas, 7 semanas e 17 semanas medindo a concentração de DNA viral em amostras com uso de HPLC.
[0353] Os resultados são mostrados na Figura 2A. Como pode ser visto, existe uma clara correlação entre a concentração de glicerol e a estabilidade, com as formulações tendo concentrações mais altas de glicerol tendo maior estabilidade. O efeito parece diminuir gradualmente em torno da marca de concentração de 17 a 20% de glicerol, que sugere que é improvável que ultrapassar 20% de glicerol produza um impacto significativo na estabilidade. Esses resultados sugerem, portanto, que uma concentração de glicerol entre 15 e 20% aumentará significativamente a estabilidade e que uma concentração de cerca de 19 a 20% provavelmente produzirá os melhores resultados.
[0354] As Figuras 2B e 2C mostram os resultados de estudos adicionais em que as formulações de 0%, 10% e 20% de glicerol foram avaliadas após armazenamento a 37 C (Figura 2B) e armazenamento a 25 C. A Figura 2B mostra que a polidispersividade (que é uma medida da distribuição da massa molecular dentro de uma solução - maior polidispersidade se correlaciona com maior degradação dos adenovírus do grupo B) foi significativamente maior quando o glicerol foi excluído da formulação em comparação com quando 10% ou 20% de glicerol foi adicionado. A Figura 2C mostra a % de variação na concentração de adenovírus do grupo B ao longo do tempo e mostra claramente um declínio mais acentuado e mais drástico nos níveis de concentração quando nenhum glicerol é usado em comparação com quando 10% ou 20% de glicerol foi adicionado às formulações. Portanto, esses resultados também corroboram os achados da Figura 2A, isto é, que a inclusão de glicerol nas formulações tem um efeito significativo na estabilidade. EXEMPLO 3 - TESTE DO EFEITO DA ADIÇÃO DE ETANOL/ARGININA/METIONINA/POLISSORBATO NA ESTABILIDADE DAS
FORMULAÇÕES ADENOVIRAIS DO GRUPO B
[0355] Uma série de experimentos foi conduzida para determinar o efeito sobre a estabilidade das formulações adenovirais do grupo B quando etanol/arginina/metionina/polissorbato foi omitido das formulações. Uma variedade de tampões diferentes foi testada: 5 mM de HEPES, 10 mM de meglumina, 10 mM de TRIS e 10 mM de Gly-NaCl. Nenhuma das formulações continha etanol, arginina, metionina ou polissorbato. Os adenovírus do grupo B foram suspensos em cada formulação e as formulações foram armazenadas a 4 C por um período de 9 meses. A estabilidade e a potência das formulações foram avaliadas respectivamente por HPLC e por MTS (um ensaio de viabilidade celular, que avalia a capacidade dos adenovírus de lisar células) em intervalos de 3 meses, isto é, em 0 meses, 3 meses, 6 meses e 9 meses.
[0356] A Figura 3A mostra a potência dos adenovírus do grupo B durante o período de armazenamento de 9 meses. Como pode ser visto, há uma degradação significativa dos adenovírus do grupo B ao longo desse período, com a maioria das formulações se aproximando da potência de 0 U/vp pela marca de 9 meses. Uma exceção notável é a formulação que contém meglumina, mas mesmo essa formulação não foi poupada de uma queda significativa para cerca de 0,5 U/vp do nível inicial original de 1 U/vp, isto é, a potência dos adenovírus do grupo B na formulação foi reduzida pela metade após 9 meses. Esse resultado sugere que o tampão de meglumina foi o melhor em preservar a potência dos adenovírus do grupo B e também destaca a importância de incluir etanol, arginina, metionina e polissorbato nas formulações.
[0357] A Figura 3B mostra os níveis de concentração dos adenovírus do grupo B durante o período de 9 meses e novamente mostra uma tendência em que há uma diminuição significativa na concentração ao longo do período de 9 meses para todas as formulações testadas. Para comparação, a Figura 3C mostra a concentração dos adenovírus do grupo B em uma formulação que contém etanol/arginina/metionina/polissorbato. Nota-se que as concentrações estáveis de adenovírus do grupo B observadas mesmo após 20 meses de armazenamento a 4 C. Com base na Figura 3B, pelo menos em relação aos níveis de concentração, parece que o tampão de TRIS teve o melhor desempenho. Este experimento também mostra que esses componentes são importantes para a estabilidade geral das formulações. EXEMPLO 4 - TESTE DO IMPACTO INDIVIDUAL DE ETANOL, ARGININA E METIONINA NA ESTABILIDADE DE FORMULAÇÕES
ADENOVIRAIS
[0358] Após os resultados do Exemplo 3, outros experimentos foram conduzidos na tentativa de determinar o impacto relativo de cada um dentre etanol, arginina e metionina na estabilidade das formulações de adenovírus do grupo B durante o armazenamento a longo prazo (24 meses) em 4 C.
[0359] Os resultados dos ensaios MTS são mostrados na Figura 4. Três formulações diferentes foram testadas, a primeira que incluía 1% de etanol (Figura 4A), a segunda que incluía 1% de etanol e 0,15 mM de metionina (Figura 4C) e a terceira que incluía 1% de etanol, 0,15 mM de metionina e 10 mM de arginina (Figura 4B). Todas as formulações testadas continham 5 mM de HEPES, 17% de glicerol e estavam em pH 8,0.
[0360] Os resultados sugerem que a potência dos adenovírus do grupo B é preservada por todos os 3 componentes em comparação com uma formulação de controle que tinha apenas HEPES e glicerol e não continha nenhum desses componentes. A potência da formulação de controle caiu para 0,5 U/vp dentro de 3 meses, enquanto as Figuras 4A a 4C sugerem que o período de estabilidade é significativamente estendido quando os 3 componentes são adicionados. Especificamente, os resultados sugerem que a adição de etanol aumenta a estabilidade da formulação em cerca de 6 meses, a adição de etanol e metionina melhora a estabilidade em cerca de 15 meses e a adição de etanol, metionina e arginina melhora a estabilidade em cerca de 12 meses. Consequentemente, esses resultados indicam que etanol, metionina e arginina contribuem para a estabilidade.
[0361] A Figura 4D mostra os níveis de concentração de adenovírus conforme determinado por HPLC e sugere que a concentração de vírus permanece aproximadamente constante para todas as 3 formulações ao longo do período de armazenamento de 24 meses. Talvez isso sugira que o etanol tenha o maior impacto, uma vez que o etanol está presente nas 3 formulações. EXEMPLO 5 - TESTE DO EFEITO DO POLISSORBATO
NA ESTABILIDADE DAS FORMULAÇÕES ADENOVIRAIS DO GRUPO B
[0362] Este exemplo descreve os resultados de um experimento para avaliar a importância do polissorbato na estabilidade da formulação adenoviral durante o armazenamento a longo prazo (20 meses) em 4 C.
[0363] Duas formulações foram testadas, uma com 0,115% de polissorbato 80 e outra com 0,15% de polissorbato 80. Ambas as formulações também continham 20% de glicerol, 5 mM de HEPES, 1,5% de etanol, 10 mM de arginina, 0,2 mM de metionina e estavam em pH 8,0.
[0364] Os resultados do experimento são mostrados nas Figuras 5A e 5B. A Figura 5A mostra que a potência das formulações cai gradualmente para cerca de 0,5 U/vp em torno da marca de 10 meses para a formulação que contém 0,15% de polissorbato, mas permanece estável a 0,5 U/vp até o ponto de 20 meses. Assim, o polissorbato parece dar uma contribuição significativa para preservar a potência adenoviral nas formulações. A queda de potência é semelhante para a formulação que contém 0,115%. Isso sugere que manter o polissorbato em torno de 0,1% resulta em uma formulação com boa estabilidade.
[0365] A Figura 5B mostra os níveis de concentração de adenovírus conforme determinado por HPLC e sugere que a concentração de vírus permanece razoavelmente constante para ambas as formulações ao longo do período de armazenamento de 20 meses. EXEMPLO 6 - TESTE DE DIFERENTES TAMPÕES E O
IMPACTO DOS MESMOS NA ESTABILIDADE DE FORMULAÇÕES ADENOVIRAIS DO GRUPO B
[0366] Este exemplo descreve os resultados de um experimento para comparar a estabilidade de diferentes tampões quando utilizados nas formulações adenovirais do grupo B durante o armazenamento a curto prazo (11 semanas) em 25C.
[0367] Foram testadas 7 formulações diferentes: Gly- NaCl a pH 9,0, TRIS a pH 8,0, TRIS a pH 8,8, meglumina a pH 8,0, meglumina a pH 8,5, meglumina a pH 9,0 e HEPES a pH 8,0. Todas as formulações continham 20% de glicerol, 1,4% de etanol, 15 mM de arginina, 0,15 ou 0,25 mM de metionina, 0,15% de polissorbato.
[0368] Os resultados são mostrados na Figura 6A e 6B. A Figura 6A mostra a razão de potência (100 ppc/RS) ao longo do tempo, enquanto a Figura 6B mostra a concentração (vp/ml) das formulações medidas ao longo do tempo. Com base nos gráficos, uma ordem aproximada de aumento da estabilidade das formulações parece ser HEPEs, TRIS, Gly-NaCl e meglumina (melhor). EXEMPLO 7
[0369] Um experimento foi conduzido para confirmar que as condições identificadas com uso dos métodos de triagem em condições aceleradas se traduzem em armazenamento a longo prazo em 4 oC, com um painel mais amplo de métodos indicadores de estabilidade. Uma variedade de tampões diferentes foi testada a 10 mM: Meglumina pH 8,0, Meglumina pH 8,5, Meglumina pH 9,0, TRIS pH 8,5 e Gly-NaCl. Todas as formulações continham 20% de glicerol, 1,4% de etanol, 15 mM de arginina, 0,25 mM de metionina. As formulações de adenovírus do grupo B foram armazenadas a 4 oC e -80 oC por um período de 12 meses. A estabilidade e a potência das formulações armazenadas a 4 oC foram avaliadas por AEX-HPLC (concentração de vírus), MTS (um ensaio de viabilidade celular, que avalia a capacidade do adenovírus de lisar células) e um ensaio de infecciosidade (avaliar a capacidade do adenovírus de infectar células e iniciar a replicação) em intervalos regulares. Após 12 meses, as amostras armazenadas a -80 °C e 4 °C foram analisadas em conjunto, com uso dos mesmos métodos.
[0370] Os resultados da análise periódica dos adenovírus armazenados a 4 oC são mostrados nas Figuras 8A e 8B. O MTS (potência oncolítica relativa) na Figura 8A mostra que os adenovírus armazenados em pH 8,0 são mais estáveis por mais tempo do que quando armazenados em tampões de pH 8,5 e pH 9,0. Isto é confirmado por análise alternativa, conforme mostrado na Figura 8B; a razão de partículas não infecciosas presentes no armazenamento a 4 oC aumenta mais cedo à medida que o pH aumenta. A pH 8,0, com a presença dos excipientes (glicerol, metionina, arginina e etanol), o adenovírus é mais estável durante o armazenamento.
[0371] As Figuras 8C, 8D e 8E comparam adenovírus que foram armazenados a 4 oC com adenovírus armazenados a -80 oC pelo mesmo período de tempo. Em todas as figuras, o controle de glicerol é tamponado a pH 7,8 e contém 20% de glicerol e nenhum outro excipiente. A Figura 8D confirma que não há alteração na concentração de adenovírus detectada por AEX-HPLC em nenhuma das formulações testadas em qualquer temperatura. A Figura 8C compara a potência oncolítica relativa (MTS) do adenovírus armazenado em ambas as condições de temperatura. A presença de um ou mais dos excipientes (etanol, arginina ou metionina) estabilizou a potência do adenovírus quando armazenado a 4 oC em comparação a -80 oC. Com todos os excipientes presentes, a estabilidade do adenovírus, como medida por potência, a 4 oC foi maior em pH 8,0, com a estabilidade diminuindo à medida que o pH aumentou. Os resultados na Figura 8E, que comparam a taxa de formação de partículas não infecciosas no armazenamento, confirmam o resultado da potência oncolítica (MTS).
[0372] O armazenamento do vírus a 4 oC por 12 meses confirmou que a presença de um ou mais dos excipientes (metionina, arginina, etanol e glicerol) melhorou a estabilidade do adenovírus. Os resultados também confirmaram que a manutenção do pH era essencial para a estabilidade adenoviral quando armazenado a 4 oC. Neste experimento, o pH ideal para a estabilidade foi de 8,0 e a estabilidade diminuiu com um aumento no pH. No exemplo 1, os dados indicaram que pH > 8,0 seria mais estável, com um ótimo de 8,5 a 9,0. No entanto, a única condição de tampão testada em pH 8,0 foi HEPES. Portanto, pode-se concluir que Meglumina, um agente tampão à base de açúcar, tem maior efeito estabilizador no adenovírus a pH 8,0 em comparação com o tampão de HEPES usado no exemplo 1.

Claims (13)

REIVINDICAÇÕES
1. Formulação líquida adequada para um adenovírus do grupo B, caracterizada pelo fato de que compreende: a) um adenovírus do grupo B, tal como adenovírus do grupo B competente para replicação, b) 15 a 25% v/v de glicerol, por exemplo 16, 17, 18, 19, 20, 21% v/v de glicerol; e c) 0,1 a 1,5% v/v de etanol, por exemplo 0,2 a 1%, tal como 1% v/v de etanol; d) um tampão, em que: o pH da formulação está na faixa de 8,0 a 9,6, por exemplo, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4 ou 9,5 e a formulação não compreende um açúcar.
2. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, em que a formulação é caracterizada pelo fato de que é para administração intravenosa.
3. Formulação, de acordo com a reivindicação 2, em que a formulação é caracterizada pelo fato de que é para administração por injeção lenta.
4. Formulação, de acordo com a reivindicação 2, em que a formulação é caracterizada pelo fato de que é para administração por infusão.
5. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um tensoativo, por exemplo, um tensoativo não iônico.
6. Formulação, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que compreende ainda polissorbato, por exemplo polissorbato 20, 40, 60 ou 80, tal como 0,05 a 0,15% de polissorbato 20, 40, 60 ou 80.
7. Formulação, de acordo com a reivindicação 6, em que a formulação é caracterizada pelo fato de que compreende polissorbato 80, por exemplo, 0,05 a 0,15% de polissorbato 80, tal como 0,115% de polissorbato
80.
8. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que compreende ainda metionina, por exemplo 0,01 a 0,3 mM, por exemplo 0,01 a 0,3, tal como 0,25 mM de metionina.
9. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que compreende ainda arginina, por exemplo 5 a 20 mM, tal como 15 mM de arginina.
10. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que os tampões são selecionados a partir de meglumina, glicina (tal como Gly-NaCl), TRIS e combinações de dois ou mais dos mesmos.
11. Formulação, de acordo com a reivindicação 10, em que a formulação é caracterizada pelo fato de que compreende tampão de meglumina.
12. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que a formulação é caracterizada pelo fato de que não compreende tampão HEPES.
13. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que a formulação é caracterizada pelo fato de que compreende: a) 15 a 20% v/v de glicerol; b) 1 a 1,5% v/v de etanol; c) 0,1 a 0,2% v/v de polissorbato 80; d) 0,2 a 0,3 mM de metionina; e) 10 a 20 mM de arginina; e f) um tampão, tal como meglumina;
em que o pH da formulação está em um pH na faixa de 8,0 a 9,6, tal como pH 8.
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