BR112020014216A2

BR112020014216A2 - inibidores de glicosiltransferase

Info

Publication number: BR112020014216A2
Application number: BR112020014216-6A
Authority: BR
Inventors: William M. Clemons; Michio Kurosu
Original assignee: California Institute Of Technology; University Of Tennessee Research Foundation
Priority date: 2018-01-12
Filing date: 2019-01-11
Publication date: 2020-12-01
Also published as: JP7334183B2; EP3737385A1; CA3087998A1; EP3737385A4; WO2019140158A1; US20200361981A1; US11597743B2; JP2021510732A

Abstract

A presente invenção refere-se a métodos de tratar infecções bacterianas e câncer em um indivíduo em necessidade dos mesmos, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um composto provido neste documento.

Description

“INIBIDORES DE GLICOSILTRANSFERASE”. PEDIDO RELACIONADO

[001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório dos EUA Nº. 62/616.657, depositado em 12 de janeiro de 2018. Todo o conteúdo deste pedido é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

[002] Um alvo biológico de interesse atual é dolichil-fosfato N- acetilglucosamina-fosfotransferase (DPAGT1). DPAGT1 é a primeira enzima comprometida para a biossíntese de glicoproteínas. Os polissacarídeos da superfície celular desempenham papéis importantes em vários processos biológicos em organismos vivos, e glicosilação anormal de proteínas da superfície celular ocorre, durante as quais as células normais progridem para um estado neoplásico maligno.

Assim, a modificação da glicosilação de superfície celular é uma característica de muitas células cancerosas. Muitos dos marcadores tumorais desenvolvidos recentemente são antígenos de carboidrato. Embora seja um assunto extremamente desafiador descobrir glicosiltransferases semelhantes a drogas para bloquear a biossíntese de processos de ramificação específicos em células cancerosas, a biossíntese de N-glicano pode ser terminada pela inibição da primeira enzima comprometida, DPAGT1. Inibidores seletivos de DPAGT1 têm o potencial terapêutico promissor para certos cânceres sólidos que exigem aumento da ramificação de glicanos ligados a N em suas progressões de crescimento. Como a forte inibição de DPAGT1 pode causar citotoxicidade, os inibidores de DPAGT1 também têm potencial terapêutico promissor como agentes antibacterianos.

[003] Permanece a necessidade de preparar inibidores de DPAGT1 estruturalmente diversos, particularmente aqueles que são potentes e/ou seletivos para o tratamento de infecções bacterianas e câncer.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[004] São providos neste documento compostos e métodos de uso desses compostos para inibir DPAGT1 em um indivíduo em necessidade do mesmo.

[005] Por conseguinte, em um aspecto, são providos neste documento compostos de Fórmula I: HO NH2

O

HO O R1 2

R H N X N O NH

Y H2 N N

O O O

O HO OH (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos; em que R1 é C1-C10 alquil ou piperazina-O-Ph, em que Ph é opcionalmente substituído por C1-C4 alquil ou OC1-C4 alquil, em que C1-C4 alquil ou OC1-C4 alquil é opcionalmente ainda substituído por 1, 2 ou 3 halo; R2 é H ou C1-C6 alquil; X é selecionado do grupo que consiste em ausente, -(CH2)m-, e -NH-; Y é ausente ou -(CH2)n-; e m e n são, independentemente em cada ocorrência, 1, 2 ou 3.

[006] Em uma modalidade, R1 é piperazina-O-Ph-CF3; X é ausente; e Y é - CH2-.

[007] Em outra modalidade, o composto de Fórmula I é ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[008] Ainda em outra modalidade, o composto de Fórmula I é ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[009] Ainda em outra modalidade, R1 é C7 alquil; X é ausente; e Y é ausente.

[010] Em uma modalidade, o composto de Fórmula I é ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[011] Em outra modalidade, o composto de Fórmula I é ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[012] Ainda em outra modalidade, R1 é piperazina-O-PhCF3; X é -NH-; e Y é - CH2-.

[013] Ainda em outra modalidade, o composto de Fórmula I é

HO NH2

O

O O F3 C N HO

O H H H

N N N O NH H2N N

O O O O

HO OH ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[014] Em uma modalidade, o composto de Fórmula I é ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[015] Em outro aspecto, são providos neste documento composições farmacêuticas compreendendo qualquer um dos compostos descritos neste documento, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos, em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável.

[016] Ainda em outro aspecto, são providos neste documento métodos de inibir dolichil-fosfato N-acetilglucosaminafosfotransferase (DPAGT1) em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos compostos ou composições descritos neste documento.

[017] Em uma modalidade dos métodos, o método ainda compreende administrar um segundo composto. Em outra modalidade, o segundo composto é selecionado do grupo que consiste em taxol, tunicamicina e gemcitabina.

[018] Em uma modalidade dessas terapias de combinação, o composto e o agente terapêutico adicional são coformulados. Em outra modalidade, o composto e o agente terapêutico adicional são coadministrados.

[019] Em outra modalidade dessas terapias de combinação, administrar um composto provido neste documento permite a administração do um agente terapêutico adicional em uma dose ou frequência menor em comparação com a administração do pelo menos um agente terapêutico adicional sozinho, que é necessário para alcançar resultados similares na inibição de DPAGT1 em um indivíduo em necessidade do mesmo.

[020] Ainda em outro aspecto, é provido neste documento um método de tratar uma infecção em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos compostos ou composições descritos neste documento.

[021] Em uma modalidade dos métodos, a infecção é uma infecção bacteriana. Em outra modalidade, a infecção bacteriana é causada por bactérias selecionadas do grupo que consiste em Clostridium difficile, Bacillus subtilis, Clostridium perfringens e Mycobacterium smegmatis. Ainda em outra modalidade, a infecção bacteriana é causada por Clostridium difficile.

[022] Em um aspecto, é provido neste documento um método de tratar câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos compostos ou composições descritos neste documento.

[023] Em uma modalidade dos métodos, o câncer é câncer cervical, câncer de cólon, câncer de ovário, câncer de mama, câncer pancreático, carcinoma ou adenocarcinoma.

[024] Em outro aspecto, é provido neste documento um processo para preparar uma composição compreendendo um composto de Fórmula III:

(III) compreendendo reagir um composto de Fórmula II: (II) com um reagente de cobre na presença de um solvente e uma base, e ainda reagir o composto de Fórmula II com um reagente de grupo de proteção em que R2 é H ou C1-C6 alquil; e PG é um grupo de proteção selecionado do grupo que consiste em acetil (Ac), benzil (Bn), terc-butiloxicarbonil (Boc), benzoil (Bz), carboxibenzil (Cbz), carbamato, 3,4-dimetoxi-benzil (DMPM), 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc), p-metoxibenzil carbonil (Moz), 4-nitrobenzilsulfonil (Nos), p-metoxibenzil (PMB), p-metoxifenil (PMP), 4-toluenossulfonil (Tos), e tricloroetil cloroformiato (Troc).

[025] Em uma modalidade, o reagente de cobre é selecionado do grupo que consiste em CuSO4, Cu(OAc)2 e CuCl2. Em outra modalidade, o reagente de cobre é Cu(OAc)2.

[026] Ainda em outra modalidade, a base é hidróxido de sódio. Ainda em outra modalidade, o solvente é uma mistura de dimetilformamida, metanol e água. Em uma modalidade, PG é terc-butiloxicarbonil (Boc) e o reagente de grupo de proteção é di-

terc-butil dicarbonato (Boc2O). Em outra modalidade, PG é carboxibenzil (Cbz) e o reagente de grupo de proteção é benzil cloroformiato ou é N- (benziloxicarboniloxi)succinimida.

[027] Ainda em outro aspecto, é provido neste documento um processo para preparar uma composição compreendendo um composto de Fórmula V: (V) compreendendo reagir um composto de Fórmula III: (III) com um composto de Fórmula IV: (IV) sob condições básicas em um solvente em que R2 é H ou C1-C6 alquil; PG é um grupo de proteção selecionado do grupo que consiste em acetil (Ac), benzil (Bn), terc-butiloxicarbonil (Boc), benzoil (Bz), carboxibenzil (Cbz), carbamato, 3,4-dimetoxi-benzil (DMPM), 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc), p-metoxibenzil carbonil (Moz), 4-nitrobenzilsulfonil (Nos), p-metoxibenzil (PMB), p-metoxifenil (PMP), 4-toluenossulfonil (Tos), e tricloroetil cloroformiato (Troc); e R3 é selecionado do grupo que consiste em OC1-C4 alquil, tosilato, mesilato, iodeto, brometo, cloreto, imidazol e triflato.

[028] Em uma modalidade, R3 é imidazol. Em outra modalidade, a base é trietilamina. Ainda em outra modalidade, o solvente é uma mistura de dimetilformamida e diclorometano.

[029] Ainda em outro aspecto, é provido neste documento um processo para preparar uma composição compreendendo um composto de Fórmula I: HO NH2

O

HO O R1 2

R H N X N O NH

Y H2 N N

O O O

O HO OH (I) compreendendo tratar um composto de Fórmula V: (V) com um ácido em um solvente em que: R1 é piperazina-O-Ph, em que Ph é opcionalmente substituído por C1-C4 alquil ou OC1-C4 alquil, em que OC1-C4 alquil é opcionalmente ainda substituído por 1, 2 ou 3 halo; R2 é H ou C1-C6 alquil; X é -NH-;

Y é -(CH2)n-; PG é um grupo de proteção selecionado do grupo que consiste em acetil (Ac), benzil (Bn), terc-butiloxicarbonil (Boc), benzoil (Bz), carboxibenzil (Cbz), carbamato, 3,4-dimetoxi-benzil (DMPM), 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc), p-metoxibenzil carbonil (Moz), 4-nitrobenzilsulfonil (Nos), p-metoxibenzil (PMB), p-metoxifenil (PMP), 4-toluenossulfonil (Tos), e tricloroetil cloroformiato (Troc); e n é 1.

[030] Em uma modalidade, o ácido é ácido trifluoroacético. Em outra modalidade, o solvente é diclorometano.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[031] Com o objetivo de ilustrar a invenção, são representadas nos desenhos certas modalidades da invenção. No entanto, a invenção não se limita aos arranjos e instrumentos precisos das modalidades representadas nos desenhos.

[032] A Figura 1 mostra um método sintético geral para preparar os compostos contendo amida providos neste documento.

[033] A Figura 2 mostra um método sintético geral para preparar os compostos contendo ureia providos neste documento.

[034] AFigura 3 mostra a viabilidade de esporos C. difficile na presença dos compostos da invenção e agentes antibacterianos conhecidos.

[035] Figura 4 mostra a atividade antibacteriana do Composto 11.

[036] A Figura 5 mostra ensaios de viabilidade celular de AsPc-1 e Panc-1 do Composto 11.

[037] A Figura 6 mostra ensaios de western blot com -catenina e inibição de DPAGT1 pelo Composto 11.

[038] A Figura 7 mostra ensaios de Migração de Câmara de Boyden com células Panc-1 com Gemcitabina, Taxol, Tunicamicina e Composto 11.

[039] A Figura 8 mostra ensaios de Migração de Câmara de Boyden com células AsPc-1 com Tunicamicina, Taxol e Composto 11.

[040] A Figura 9 mostra ensaios de fechamento de lesão (scratch assays) com linhagens de células AsPc-1 e Pac-1 na presença de Gemcitabina e Composto 11.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[041] São providos neste documento compostos, e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, que são úteis no tratamento de câncer ou uma infecção bacteriana em um indivíduo em necessidade do mesmo.

[042] Em um aspecto não limitante, esses compostos podem inibir DPAGT1.

Em uma modalidade particular, os compostos providos neste documento são considerados inibidores de DPAGT1. Dessa forma, em um aspecto, os compostos providos neste documento são úteis no tratamento de câncer ou infecções bacterianas em um indivíduo atuando como um inibidor de DPAGT1.

[043] DPAGT1, que pertence à família da glicosiltransferase 4, é uma proteína de membrana integral localizada no ER que catalisa a transformação de UDP-GlcNAc em N-acetil-D-glucosaminil-difosfodolichol com dolichil fosfato. N-acetil-D- glucosaminil-difosfodolichol ancorado na membrana do ER é modificado por glicosiltransferases sequenciais para formar precursores de oligossacarídeos ligados a dolichol que são transferidos para resíduos de asparagina selecionados (sequências N-X-S ou N-X-T) de cadeias polipeptídicas por oligossacariltransferase (OST).

Tratamento Antibacteriano

[044] A infecção por Clostridium difficile (CDI) é declarada uma ameaça à saúde pública desde 2013. A CDI causa diarreia, inflamação do intestino e, em alguns casos, morte. Aproximadamente 250.000 pessoas são hospitalizadas nos EUA todos os anos devido a CDI. A forma infecciosa de C. difficile é o esporo e sua germinação é a primeira etapa comprometida no início da CDI. C. difficile é encontrada em abundância no ambiente e coloniza o intestino onde produz toxinas que causam diarreia associada a C. difficile (CDAD). Frequentemente, a terapia com antibióticos para CDI com antibiótico(s) de amplo espectro tem efeito adverso na interrupção do equilíbrio normal da flora intestinal, causando colite por C. difficile. O tratamento de CDI com antibióticos é difícil devido à resistência a antibióticos e a fatores fisiológicos das bactérias (por exemplo, formação de esporos, efeitos protetores da pseudomembrana). Há um número limitado de drogas disponíveis para o tratamento de CDAD.

[045] Curiosamente, certos agentes antibióticos exibiram forte atividade bacteriostática contra Mycobacterium tuberculosis, visando as fosfotransferases bacterianas (MurX e WecA). Os inibidores da enzima WecA têm o potencial de interferir com um homólogo humano, DPAGT1. Dessa forma, observou-se forte inibição de DPAGT1 que causa citotoxicidade em muitas cepas bacterianas.

Tratamento de Câncer

[046] A β-catenina, codificada pelo gene CTNNB1 (um proto-oncogene), é uma proteína multifuncional que regula e coordena a adesão célula-célula e a transcrição de genes. A β-catenina é um fator de transcrição crucial na via de sinalização Wnt (Wingless-Int)/β-catenina altamente conservada, e desempenha um papel importante no desenvolvimento embrionário e na carcinogênese (Vargas, D.A.

et al. (2016) PLoS Computational Biol. 12: e1005007). Em células normais, a concentração de β-catenina é baixa devido à degradação de proteassoma. As mutações de β-catenina são encontradas em uma variedade de cânceres, incluindo câncer de ovário, câncer de mama, tumores hepáticos cancerosos, câncer colorretal, câncer de pulmão e glioblastoma (Nita-Lazar M. et al. (2009) Cancer Res. 316: 1871- 1884). Nessas células de câncer, as mutações são observadas no motivo de ligação de proteína contendo repetição de β-transducina (β-TrCP) que facilita a ubiquitinilação, dificultando a degradação de β-catenina. Causa um alto nível de β- catenina no citoplasma, que é translocado para o núcleo e leva à transcrição dos genes alvo, incluindo os genes Wnt. Uma função alternativa de β-catenina e o outro membro da família de proteínas da catenina (α-catenina e -catenina (placoglobina)) está ligada à E-caderina, uma molécula de adesão célula-célula dependente de cálcio que é responsável pelas adesões de célula intercelulares. Um dos alvos de N- glicosilação de DPAGT1 é E-caderina. A superexpressão de β-catenina causa um alto nível de expressão de DPAGT1, levando à modificação anormal de E-caderina. Vários estudos concluíram que a via de sinalização de Wnt/β-catenina regula a via metabólica de N-glicosilação de proteína, visando a expressão de DPAGT1. A desregulação de DPAGT1 causa distúrbios na adesão intercelular em câncer bucal (Nita-Lazar et al., 2009). Com base nesses processos biológicos observados, a inibição de DPAGT1 pode induzir a perda de adesão célula-célula e metátese e desencadear uma via apoptótica (Lim, E. et al. (2015) Apoptose, 8: 1087-1098). Apenas alguns inibidores de DPAGT1 foram identificados até o momento. Portanto, a inibição de DPAGT1 pode muito bem ser o “calcanhar de Aquiles” da biossíntese de N-glicano essencial em certos cânceres.

Definições

[047] São listadas abaixo definições de vários termos usados para descrever esta invenção. Essas definições aplicam-se aos termos conforme são usados ao longo desta especificação e reivindicações, a menos que de outro modo limitado em casos específicos, individualmente ou como parte de um grupo maior.

[048] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados geralmente têm o mesmo significado que é comumente entendido por um versado na técnica à qual a presente invenção pertence. Geralmente, a nomenclatura usada neste documento e os procedimentos laboratoriais de cultura celular, genética molecular, química orgânica e química de peptídeos são aqueles bem conhecidos e comumente empregados na técnica.

[049] Como usado neste documento, os artigos “um” e “uma” se referem a um ou a mais de um (ou seja, pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, “um elemento” significa um elemento ou mais de um elemento. Além disso, o uso do termo “incluindo”, bem como outras formas, como “incluir”, “inclui” e “incluído”, não é limitante.

[050] Como usado neste documento, o termo “cerca de” será entendido por pessoas versadas na técnica e variará em certa medida no contexto em que é usado.

Conforme usado neste documento, quando se refere a um valor mensurável, tal como uma quantidade, uma duração temporal, e semelhantes, o termo “cerca de” destina- se a abranger variações de ±20% ou ±10%, incluindo ±5%, ±1% e ±0,1% do valor especificado, uma vez que tais variações são apropriadas para executar os métodos divulgados.

[051] O termo “tratar”, “tratado”, “tratando” ou “tratamento” inclui a diminuição ou alívio de pelo menos um sintoma associado ou causado pelo estado, distúrbio ou doença em tratamento. Em certas modalidades, o tratamento compreende colocar em contato com DPAGT1 uma quantidade eficaz de um composto da invenção para condições relacionadas a cânceres e infecções bacterianas.

[052] Como aqui utilizado, o termo “prevenir” ou “prevenção” significa nenhum desenvolvimento de distúrbio ou doença, se nenhum tiver ocorrido, ou ainda nenhum desenvolvimento de distúrbio ou doença se já houver desenvolvimento do distúrbio ou doença. Também se considera a capacidade de prevenir alguns ou todos os sintomas associados ao distúrbio ou doença.

[053] Como usado neste documento, o termo “paciente”, “indivíduo” ou “sujeito” refere-se a um mamífero humano ou não humano. Mamíferos não humanos incluem, por exemplo, animais domésticos e animais de estimação, tais como mamíferos ovinos, bovinos, suínos, caninos, felinos e marinhos. De preferência, o paciente, sujeito ou indivíduo é um ser humano.

[054] Como usado neste documento, os termos “quantidade eficaz”, “quantidade farmaceuticamente eficaz” e “quantidade terapeuticamente eficaz”

referem-se a uma quantidade não tóxica, mas suficiente de um agente para fornecer o resultado biológico desejado. Esse resultado pode ser a redução ou alívio dos sinais, sintomas ou causas de uma doença ou qualquer outra alteração desejada de um sistema biológico. Uma quantidade terapêutica apropriada em qualquer caso individual pode ser determinada por um versado na técnica usando experimentação de rotina.

[055] Como usado neste documento, o termo “farmaceuticamente aceitável” refere-se a um material, tal como um veículo ou diluente, que não revoga a atividade biológica ou as propriedades do composto, e é relativamente não-tóxico, ou seja, o material pode ser administrado a um indivíduo sem causar efeitos biológicos indesejáveis ou interagir de maneira prejudicial com qualquer um dos componentes da composição na qual está contido.

[056] Como usado neste documento, o termo “sal farmaceuticamente aceitável” refere-se a derivados dos compostos divulgados, em que que o composto de origem é modificado pela conversão de uma porção de ácido ou base existente em sua forma de sal. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas sem limitação, sais de ácidos minerais ou orgânicos de resíduos básicos, tais como aminas; sais alcalinos ou orgânicos de resíduos ácidos, tais como ácidos carboxílicos; e semelhantes. Os sais farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção incluem os sais não tóxicos convencionais do composto de origem formado, por exemplo, a partir de ácidos inorgânicos ou orgânicos não tóxicos. Os sais farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção podem ser sintetizados a partir do composto de origem que contém uma porção básica ou ácida por métodos químicos convencionais.

Geralmente, esses sais podem ser preparados reagindo as formas livres de ácido ou base desses compostos com uma quantidade estequiométrica da base ou ácido apropriado em água ou em um solvente orgânico, ou em uma mistura dos dois; geralmente, meios não aquosos como éter, etil acetato, etanol, isopropanol ou acetonitrila são preferidos. A frase “sal farmaceuticamente aceitável” não se limita a um sal mono ou 1: 1. Por exemplo, “sal farmaceuticamente aceitável” também inclui bis-sais, tais como um sal de bis-cloridrato. As listas de sais adequados são encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ª ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418 e Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 (1977), cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

[057] Conforme usado neste documento, o termo “composição” ou “composição farmacêutica” refere-se a uma mistura de pelo menos um composto útil dentro da invenção com um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica facilita a administração do composto a um paciente ou sujeito. Existem várias técnicas de administração de um composto na técnica, incluindo, mas sem limitação, administração intravenosa, oral, aerossol, parentérica, oftálmica, pulmonar e tópica.

[058] Como usado neste documento, o termo “veículo farmaceuticamente aceitável” significa um material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável, tal como um agente de enchimento líquido ou sólido, estabilizante, agente dispersante, agente de suspensão, diluente, excipiente, agente espessante, solvente ou material encapsulante, envolvido no carregamento ou transporte de um composto útil dentro da invenção dentro ou para o paciente para que ele possa realizar sua função pretendida. Tipicamente, esses constructos são carregados ou transportados de um órgão ou parte do corpo para outro órgão ou parte do corpo. Cada veículo deve ser “aceitável” no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação, incluindo o composto útil dentro da invenção, e não prejudiciais para o paciente.

Alguns exemplos de materiais que podem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem: açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose; amidos, tais como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados, tais como carboximetil celulose de sódio, etil celulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte;

gelatina; talco; excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras para supositórios; óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de açafrão, óleo de gergelim, azeite, óleo de milho e óleo de soja; glicóis, tais como propileno glicol; polióis, tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietilenoglicol; ésteres, tais como etil oleato e etil laurato; ágar; agentes tamponantes, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; agentes tensoativos; ácido algínico; água livre de pirogênio; solução salina isotônica; solução de Ringer; álcool etílico; soluções tampão de fosfato; e outras substâncias compatíveis não tóxicas empregadas em formulações farmacêuticas.

[059] Como usado neste documento, “veículo farmaceuticamente aceitável” também inclui todos os revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes retardadores de absorção e similares que são compatíveis com a atividade do composto útil dentro da invenção e são fisiologicamente aceitáveis para o paciente.

Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados às composições.

O “veículo farmaceuticamente aceitável” ainda pode incluir um sal farmaceuticamente aceitável do composto útil dentro da invenção. Outros ingredientes adicionais que podem ser incluídos nas composições farmacêuticas usadas na prática da invenção são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Remington’s Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA), que é incorporado aqui por referência.

[060] Como aqui utilizado, “terapia de combinação” refere-se à administração de dois ou mais agentes terapêuticos para tratar uma condição ou distúrbio terapêutico descrito na presente divulgação. Essa administração abrange a coadministração desses agentes terapêuticos de maneira substancialmente simultânea, tal como em uma cápsula única com uma proporção fixa de ingredientes ativos ou em múltiplos ou recipientes separados (por exemplo, cápsulas) para cada ingrediente ativo. Além disso, essa administração também engloba o uso de cada tipo de agente terapêutico de maneira sequencial, aproximadamente ao mesmo tempo ou em momentos diferentes. Em qualquer um dos casos, o regime de tratamento fornecerá efeitos benéficos da combinação de droga no tratamento das condições ou distúrbios descritos neste documento.

[061] A combinação de agentes descritos neste documento exibe um efeito sinérgico. O termo “efeito sinérgico” e a frase “sinergia”, conforme usados neste documento, referem-se à ação de dois agentes, tais como, por exemplo, um inibidor de DPAGT1 e um segundo composto (por exemplo, Tunicamicina), produzindo um efeito, por exemplo, inibir o crescimento de bactérias, que é superior à simples adição dos efeitos de cada droga administrada individualmente. Um efeito sinérgico pode ser calculado, por exemplo, usando métodos adequados, tais como a equação sigmoide Emax (Holford, N.H.G and Scheiner, L.B., Clin. Pharmacokinet. 6: 429-453 (1981)), a equação de aditividade de Loewe (Loewe, S. and Muischnek, H., Arch. Exp. Pathol Pharmacol. 114: 313-326 (1926)) e a equação de efeito mediano (Chou, T.C. e Talalay, P., Adv. Enzyme Regul. 22: 27- 55.

[062] O termo “DPAGT1”, conforme usado aqui, refere-se a dolichil-fosfato N- acetilglucosamina-fosfotransferase, que é a primeira enzima comprometida para a biossíntese de N-glicano.

[063] Como usado neste documento, o termo “alquil”, por si só ou como parte de outro substituinte, significa, salvo indicação em contrário, um hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada com o número de átomos de carbono designado (isto é, C1-C10-alquil significa um alquil com um a dez átomos de carbono) e inclui cadeias lineares e ramificadas. Em uma modalidade, grupos C1-C10 alquil são fornecidos neste documento. Exemplos incluem metil, etil, propil, isopropil, butil, isobutil, terc-butil, pentil, neopentil, hexil, heptil, octil, nonil e decil.

[064] Como usado neste documento, o termo “alcóxi” refere-se ao grupo –O- alquil, em que alquil é como aqui definido. Alcóxi inclui, a título de exemplo, metóxi,

etóxi, n-propóxi, isopropóxi, n-butóxi, sec-butóxi, t-butóxi e similares. Em uma modalidade, grupos C1-C4 alcóxi são fornecidos neste documento.

[065] Como usado neste documento, o termo “halo” ou “halogênio”, sozinho ou como parte de outro substituinte, significa, salvo indicação em contrário, um átomo de flúor, cloro, bromo ou iodo, preferencialmente, flúor, cloro ou bromo, mais preferencialmente, flúor ou cloro.

[066] Como usado neste documento, o termo “Ph” significa fenil, que é um sistema C6 aril. O termo “aril” significa um sistema carbocíclico aromático contendo 1, 2 ou 3 anéis, em que esses anéis podem ser fundidos, em que fundido é definido acima. Se os anéis forem fundidos, um dos anéis deve ser totalmente insaturado e o(s) anel(éis) fundido(s) pode(m) ser totalmente saturado(s), parcialmente insaturado(s) ou totalmente insaturado(s). O termo “aril” inclui, mas sem limitação, fenil, naftil, indanil e 1,2,3,4-tetra-hidronaftalenil. Em algumas modalidades, os grupos aril têm 6 átomos de carbono.

[067] Deve-se entender que, se uma porção aril puder ser ligada ou de outra forma acoplada a uma porção designada através de átomos de anel diferentes (isto é, mostrados ou descritos sem denotação de um ponto de ligação específico), todos os pontos possíveis serão pretendidos.

[068] Como usado neste documento, o termo “substituído” significa que um átomo ou grupo de átomos substituiu hidrogênio como o substituinte ligado a outro grupo.

[069] Como aqui utilizado, o termo “opcionalmente substituído” significa que o grupo referenciado pode ser substituído ou não substituído. Em uma modalidade, o grupo referenciado é opcionalmente substituído por zero substituintes, isto é, o grupo referenciado é não substituído. Em outra modalidade, o grupo referenciado é opcionalmente substituído por um ou mais grupos adicionais individualmente e independentemente selecionados dos grupos descritos neste documento.

Compostos

[070] Em um aspecto, são providos neste documento compostos de Fórmula I: HO NH2

O

HO O R1 R2

H N X N O NH

Y H2 N N

O O O

[071] Em uma modalidade de Fórmula I, X é ausente. Em outra modalidade de Fórmula I, Y é -CH2-. Ainda em outra modalidade de Fórmula I, R1 é piperazina-O- Ph, em que Ph é opcionalmente substituído por C1-C4 alquil ou OC1-C4 alquil, em que C1-C4 alquil ou OC1-C4 alquil é opcionalmente ainda substituído por 1, 2 ou 3 halo.

Ainda em outra modalidade de Fórmula I, R1 é C6-C8 alquil. Em uma modalidade de Fórmula I, R1 é C7 alquil. Em outra modalidade de Fórmula I, X é -NH-. Ainda em outra modalidade de Fórmula I, Y é ausente. Ainda em outra modalidade de Fórmula I, R1 é piperazina-O-Ph-CF3. Em uma modalidade de Fórmula I, R2 é C1 alquil. Em uma modalidade de Fórmula I, R2 é H.

[072] Em uma modalidade, R1 é

; X é ausente; e Y é -CH2-.

[073] Em outra modalidade, o composto de Fórmula I é ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[074] Ainda em outra modalidade, o composto de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, tem a seguinte estereoquímica: .

[075] Ainda em outra modalidade, o composto de Fórmula I é ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[076] Em uma modalidade, o composto de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, tem a seguinte estereoquímica:

.

[077] Em outra modalidade, R1 é C7 alquil; X é ausente; e Y é ausente.

[078] Ainda em outra modalidade, o composto de Fórmula I é ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[079] Ainda em outra modalidade, o composto de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, tem a seguinte estereoquímica: .

[080] Em uma modalidade, o composto de Fórmula I é ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[081] Em outra modalidade, o composto de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, tem a seguinte estereoquímica: .

[082] Ainda em outra modalidade, R1 é ; X é -NH-; e Y é -CH2-.

[083] Ainda em outra modalidade, o composto de Fórmula I é HO NH2

O

O O F3 C N HO

O H H H

N N N O NH H2N N

O O O O

HO OH ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[084] Em uma modalidade, o composto de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, tem a seguinte estereoquímica: .

[085] Em outra modalidade, o composto de Fórmula I é

HO NH2

O

O O F3 C N HO

O H H

N N N O NH H2N N

O O O O

HO OH ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[086] Ainda em outra modalidade, o composto de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, tem a seguinte estereoquímica: .

[087] Em uma modalidade, o composto de Fórmula I é selecionado dos compostos da Tabela A, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos: Tabela A Composto Estrutura Número 8 9

[088] Em um aspecto, são providas neste documento composições farmacêuticas compreendendo qualquer um dos compostos descritos neste documento, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos, em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável.

[089] Em uma modalidade, os compostos divulgados podem existir como tautômeros. Todos os tautômeros são incluídos no escopo dos compostos apresentados neste documento.

[090] Os compostos descritos neste documento também incluem compostos isotopicamente rotulados em que um ou mais átomos são substituídos por um átomo tendo o mesmo número atômico, mas uma massa atômica ou número de massa diferente da massa atômica ou número de massa geralmente encontrado na natureza.

Exemplos de isótopos adequados para inclusão nos compostos descritos neste documento incluem e não são limitados a 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 36Cl, 18F, 123I, 125I, 13N, 15N, 15O, 17O, 18O, 32P, e 35S. Em outra modalidade, compostos isotopicamente rotulados são úteis em estudos de distribuição de tecido de substrato ou droga. Em outra modalidade, substituição com isótopos mais pesados , tais como deutério gera maior estabilidade metabólica (por exemplo, maior meia-vida in vivo ou requisitos de dose reduzidos). Ainda em outra modalidade, os compostos descritos neste documento incluem um isótopo 2H (isto é, deutério).

[091] Ainda em outra modalidade, substituição com isótopos de emissão de pósitrons, tais como 11C, 18F, 15O e 13N, é útil em estudos de Topografia de Emissão de Pósitrons (PET) para examinar ocupância de receptor de substrato. Compostos isotopicamente rotulados são preparados por qualquer método adequado ou por processos usando um reagente isotopicamente rotulado apropriado no lugar do reagente não rotulado de outra forma empregado.

[092] Os compostos específicos descritos neste documento e outros compostos englobados pela Fórmula descritos neste documento tendo diferentes substituintes são sintetizados usando técnicas e materiais descritos neste documento e conforme descrito, por exemplo, em Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis, Volumes 1-17 (John Wiley and Sons, 1991); Rodd’s Chemistry of Carbon Compounds, Volumes 1-5 e Supplementals (Elsevier Science Publishers, 1989); Organic Reactions, Volumes 1-40 (John Wiley and Sons, 1991), Larock’s Comprehensive Organic Transformations (VCH Publishers Inc., 1989), March, Advanced Organic Chemistry 4ª Ed., (Wiley 1992); Carey and Sundberg, Advanced Organic Chemistry 4ª Ed., Vols. A e B (Plenum 2000, 2001), e Green and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis 3ª Ed., (Wiley 1999) (todos os quais são incorporados por referência para tal divulgação). Métodos gerais para a preparação de compostos, como descritos neste documento, são modificados pelo uso de reagentes e condições apropriados, para a introdução das várias porções encontradas nas Fórmulas, conforme provido neste documento.

[093] Compostos descritos neste documento são sintetizados usando quaisquer procedimentos adequados começando dos compostos que são disponíveis de fontes comerciais ou são preparados usando procedimentos descritos neste documento.

Métodos de Tratamento

[094] Os compostos da invenção podem ser usados em um método de tratar uma doença ou condição em um indivíduo, o referido método compreendendo administrar ao indivíduo um composto da invenção ou uma composição farmacêutica compreendendo um composto da invenção.

[095] Em um aspecto, a invenção provê um método de seletivamente inibir DPAGT1 em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao indivíduo qualquer um dos compostos de composições descritos neste documento.

[096] Em outro aspecto, a invenção provê um método de inibir DPAGT1 em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo qualquer um dos compostos de composições descritos neste documento.

[097] Em uma modalidade, o método compreende administrar um segundo composto. Em certas modalidades, o segundo composto é selecionado do grupo que consiste em taxol, tunicamicina e gemcitabina.

[098] Em outra modalidade, o método de inibir DPAGT1 compreende administrar um composto de Fórmula I: HO NH2

O

HO O R1 R2

H N X N O NH

Y H2 N N

O O O

O HO OH (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

em que R1 é C1-C10 alquil ou piperazina-O-Ph, em que Ph é opcionalmente substituído por C1-C4 alquil ou OC1-C4 alquil, em que C1-C4 alquil ou OC1-C4 alquil é opcionalmente ainda substituído por 1, 2 ou 3 halo; R2 é H ou C1-C6 alquil; X é selecionado do grupo que consiste em ausente, -(CH2)m-, e -NH-; Y é ausente ou -(CH2)n-; e m e n são, independentemente em cada ocorrência, 1, 2 ou 3.

[099] Ainda em outra modalidade, o método de inibir DPAGT1 compreende administrar o Composto 11: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0100] Ainda em outro aspecto, a invenção provê um método de tratar uma infecção em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos compostos ou composições descritos neste documento.

[0101] Em uma modalidade, a infecção bacteriana é causada por bactérias selecionadas do grupo que consiste em Clostridium difficile, Bacillus subtilis, Clostridium perfringens e Mycobacterium smegmatis. Em outra modalidade, a infecção bacteriana é causada por Clostridium difficile.

[0102] Em outra modalidade, o método de tratar uma infecção compreende administrar um composto de Fórmula I:

HO NH2

O

HO O R1 R2

H N X N O NH

Y H2 N N

O O O

O HO OH (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; em que R1 é C1-C10 alquil ou piperazina-O-Ph, em que Ph é opcionalmente substituído por C1-C4 alquil ou OC1-C4 alquil, em que C1-C4 alquil ou OC1-C4 alquil é opcionalmente ainda substituído por 1, 2 ou 3 halo; R2 é H ou C1-C6 alquil; X é selecionado do grupo que consiste em ausente, -(CH2)m-, e -NH-; Y é ausente ou -(CH2)n-; e m e n são, independentemente em cada ocorrência, 1, 2 ou 3.

[0103] Ainda em outra modalidade, o método de tratar uma infecção compreende administrar o Composto 11: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0104] Ainda em outro aspecto, a invenção provê um método de tratar câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos compostos ou composições descritos neste documento.

[0105] Em uma modalidade, o câncer é câncer cervical, câncer de cólon,

câncer de ovário, câncer de mama, câncer pancreático, carcinoma ou adenocarcinoma.

[0106] Em outra modalidade, o método de tratar câncer compreende administrar um composto de Fórmula I: HO NH2

O

HO O R1 2

R H N X N O NH

Y H2 N N

O O O

[0107] Ainda em outra modalidade, o método de tratar câncer compreende administrar o Composto 11: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Processos de Preparação

[0108] A presente invenção provê, inter alia, processos de preparar compostos de Fórmula I, que são úteis como inibidores de DPAGT1. HO NH2

O

HO O R1 R2

H N X N O NH

Y H2 N N

O O O O HO OH (I)

[0109] Em um aspecto, a invenção provê processos para preparar compostos intermediários úteis para produzir compostos de Fórmula I. Ainda em outro aspecto, a presente invenção provê composições enantiomericamente enriquecidas de qualquer um dos intermediários descritos neste documento, desde que os intermediários tenham pelo menos um centro quiral.

[0110] Os processos descritos neste documento incluem processos para preparar compostos e intermediários e composições dos mesmos, em que R1 é selecionado de C1-C10 alquil e piperazina-O-Ph, em que Ph é opcionalmente substituído por C1-C4 alquil ou OC1-C4 alquil, em que C1-C4 alquil ou OC1-C4 alquil é opcionalmente ainda substituído por 1, 2 ou 3 halo. Em algumas modalidades, R1 é piperazina-O-PhCF3. Em algumas modalidades, R1 é C5-C8 alquil. Em outra modalidade, R1 é C7 alquil. Em algumas modalidades, R1 é piperazina-O-PhCF3. Em algumas modalidades, R2 é selecionado de H ou C1-C6 alquil. Em algumas modalidades, R2 é H. Em algumas modalidades, R2 é C1-C6 alquil. Em algumas modalidades, R2 é C1 alquil. Em algumas modalidades, X é selecionado do grupo que consiste em ausente, -(CH2)m-, e -NH-. Em algumas modalidades, X é ausente. Em algumas modalidades, X é -NH-. Em algumas modalidades, Y é ausente ou -(CH 2)n-.

Em algumas modalidades, Y é -CH2-. Em algumas modalidades, Y é ausente. Em algumas modalidades, m e n são, independentemente em cada ocorrência, 1, 2 ou 3.

Em algumas modalidades, m é 1. Em algumas modalidades, n é 1. Essas modalidades podem ser aplicar a qualquer um dos intermediários ou compostos descritos neste documento em qualquer um dos processos, conforme apropriado.

[0111] Em um aspecto, é provido neste documento um processo para preparar uma composição compreendendo um composto de Fórmula III: (III) compreendendo reagir um composto de Fórmula II: (II) com um reagente de cobre na presença de um solvente e uma base, e ainda reagir o composto de Fórmula II com um reagente de grupo de proteção em que R2 é H ou C1-C6 alquil; e

[0112] PG é um grupo de proteção selecionado do grupo que consiste em acetil (Ac), benzil (Bn), terc-butiloxicarbonil (Boc), benzoil (Bz), carboxibenzil (Cbz), carbamato, 3,4-dimetoxi-benzil (DMPM), 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc), p- metoxibenzil carbonil (Moz), 4-nitrobenzilsulfonil (Nos), p-metoxibenzil (PMB), p- metoxifenil (PMP), 4-toluenossulfonil (Tos), e tricloroetil cloroformiato (Troc).

[0113] Em uma modalidade, o reagente de cobre é selecionado do grupo que consiste em CuSO4, Cu(OAc)2 e CuCl2. Em outra modalidade, o reagente de cobre é

Cu(OAc)2.

[0114] Ainda em outra modalidade, a base é hidróxido de sódio. Ainda em outra modalidade, o solvente é uma mistura de dimetilformamida, metanol e água. Em uma modalidade, PG é terc-butiloxicarbonil (Boc) e o reagente de grupo de proteção é di-terc-butil dicarbonato (Boc2O). Em outra modalidade, PG é carboxibenzil (Cbz) e o reagente de grupo de proteção é benzil cloroformiato ou é N- (benziloxicarboniloxi)succinimida.

[0115] Em outro aspecto, é provido neste documento um processo para preparar uma composição compreendendo um composto de Fórmula V: (V) compreendendo reagir um composto de Fórmula III: (III) com um composto de Fórmula IV: (IV) sob condições básicas em um solvente em que

R2 é H ou C1-C6 alquil; PG é um grupo de proteção selecionado do grupo que consiste em acetil (Ac), benzil (Bn), terc-butiloxicarbonil (Boc), benzoil (Bz), carboxibenzil (Cbz), carbamato, 3,4-dimetoxi-benzil (DMPM), 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc), p-metoxibenzil carbonil (Moz), 4-nitrobenzilsulfonil (Nos), p-metoxibenzil (PMB), p-metoxifenil (PMP), 4-toluenossulfonil (Tos), e tricloroetil cloroformiato (Troc); e R3 é selecionado do grupo que consiste em OC1-C4 alquil, tosilato, mesilato, iodeto, brometo, cloreto, imidazol e triflato.

[0116] Em uma modalidade, R3 é imidazol. Em outra modalidade, a base é trietilamina. Ainda em outra modalidade, o solvente é uma mistura de dimetilformamida e diclorometano. Ainda em outra modalidade, R3 é imidazol, a base é trietilamina, e o solvente é uma mistura de dimetilformamida e diclorometano.

[0117] Ainda em outro aspecto, é provido neste documento um processo para preparar uma composição compreendendo um composto de Fórmula I: HO NH2

O

HO O R1 R2

H N X N O NH

Y H2 N N

O O O

O HO OH (I) compreendendo tratar um composto de Fórmula V: (V) com um ácido em um solvente em que:

R1 é piperazina-O-Ph, em que Ph é opcionalmente substituído por C1-C4 alquil ou OC1-C4 alquil, em que OC1-C4 alquil é opcionalmente ainda substituído por 1, 2 ou 3 halo; R2 é H ou C1-C6 alquil; X é -NH-; Y é -(CH2)n-; PG é um grupo de proteção selecionado do grupo que consiste em acetil (Ac), benzil (Bn), terc-butiloxicarbonil (Boc), benzoil (Bz), carboxibenzil (Cbz), carbamato, 3,4-dimetoxi-benzil (DMPM), 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc), p-metoxibenzil carbonil (Moz), 4-nitrobenzilsulfonil (Nos), p-metoxibenzil (PMB), p-metoxifenil (PMP), 4-toluenossulfonil (Tos), e tricloroetil cloroformiato (Troc); e n é 1.

[0118] Em uma modalidade, o ácido é ácido trifluoroacético. Em outra modalidade, o solvente é diclorometano. Ainda em outra modalidade, PG é terc- butiloxicarbonil (Boc). Ainda em outra modalidade, PG é carboxibenzil (Cbz). Em uma modalidade, o ácido é ácido trifluoroacético, o solvente é diclorometano, e PG é terc- butiloxicarbonil (Boc).

[0119] Em um aspecto, são providos neste documento compostos preparados por os processos descritos supra.

Administração / Dosagem / Formulações

[0120] Em outro aspecto, é provido neste documento uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um composto da invenção, em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0121] Os níveis reais de dosagem dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas desta invenção podem variar de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração em particular, sem ser tóxico para o paciente.

[0122] Em particular, o nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores, incluindo a atividade do composto específico empregado, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto, a duração do tratamento, outras drogas, compostos ou materiais usados em combinação com o composto, idade, sexo, peso, condição, estado geral de saúde e histórico médico anterior do paciente em tratamento, e fatores semelhantes bem conhecidos na arte médica.

[0123] Um médico, por exemplo, clínico ou veterinário, com habilidade comum na técnica, pode facilmente determinar e prescrever a quantidade eficaz da composição farmacêutica necessária. Por exemplo, o médico ou o veterinário pode iniciar a administração da composição farmacêutica para dosar o composto divulgado em níveis inferiores aos requeridos para alcançar o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até que o efeito desejado seja alcançado.

[0124] Em modalidades particulares, é especialmente vantajoso formular o composto em forma de dosagem unitária para facilitar a administração e uniformidade da dosagem. Forma de dosagem unitária, como aqui utilizado, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os pacientes a serem tratados; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada do composto divulgado calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico necessário. As formas de dosagem unitárias da invenção são ditadas por e diretamente dependentes de (a) as características únicas do composto divulgado e do efeito terapêutico específico a ser alcançado, e (b) as limitações inerentes à técnica de composição/formulação de tal composto divulgado para o tratamento da dor, transtorno depressivo ou dependência de drogas em um paciente.

[0125] Em uma modalidade, os compostos da invenção são formulados usando um ou mais excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Em uma modalidade, as composições farmacêuticas da invenção compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto divulgado e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0126] Rotas de administração de qualquer uma das composições da invenção incluem oral, nasal, retal, intravaginal, parenteral, bucal, sublingual ou tópica.

Os compostos para uso na invenção podem ser formulados para administração por qualquer via adequada, tal como oral ou parenteral, por exemplo, administração transdérmica, transmucosa (por exemplo, sublingual, lingual, (trans)bucal, (trans)uretral, vaginal (por exemplo) , trans e perivaginal), (intra)nasal e (trans)retal), intravesical, intrapulmonar, intraduodenal, intragástrica, intratecal, subcutânea, intramuscular, intradérmica, intra-arterial, intravenosa, intrabronquial, inalatória e tópica. Em uma modalidade, a via de administração preferida é oral.

[0127] As composições e formas de dosagem adequadas incluem, por exemplo, comprimidos, cápsulas, caplets (cápsulas), pílulas, cápsulas de gel, trociscos, dispersões, suspensões, soluções, xaropes, grânulos, esferas, adesivos transdérmicos, géis, pós, péletes, magmas, pastilhas, cremes, pastas, emplastros, loções, discos, supositórios, sprays líquidos para administração nasal ou oral, pó seco ou formulações em aerossol para inalação, composições e formulações para administração intravesical, e semelhantes. Deve-se entender que as formulações e composições que seriam úteis na presente invenção não são limitadas às formulações e composições particulares que são descritas neste documento.

[0128] Para aplicação oral, são particularmente adequados comprimidos, drágeas, líquidos, gotas, supositórios, ou cápsulas, caplets e cápsulas de gel. As composições destinadas ao uso oral podem ser preparadas de acordo com qualquer método conhecido na técnica, e essas composições podem conter um ou mais agentes selecionados do grupo que consiste em excipientes inertes farmaceuticamente não tóxicos que são adequados para a fabricação de comprimidos. Tais excipientes incluem, por exemplo, um diluente inerte, tal como lactose; agentes de granulação e desintegração, tais como amido de milho; agentes aglutinantes, tais como amido; e agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio. Os comprimidos podem ser não revestidos ou podem ser revestidos por técnicas conhecidas por estética ou para atrasar a liberação dos ingredientes ativos.

As formulações para uso oral também podem ser apresentadas como cápsulas duras de gelatina, em que o ingrediente ativo é misturado com um diluente inerte.

[0129] Para administração parenteral, os compostos divulgados podem ser formulados para injeção ou infusão, por exemplo, injeção ou infusão intravenosa, intramuscular ou subcutânea, ou para administração em dose de bolus ou infusão contínua. Suspensões, soluções ou emulsões em um veículo oleoso ou aquoso, contendo opcionalmente outros agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, estabilização ou dispersão, podem ser utilizadas.

[0130] Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar usando não mais do que experimentação de rotina, vários equivalentes aos procedimentos, modalidades, reivindicações e exemplos específicos descritos neste documento. Considera-se que tais equivalentes devem estar dentro do escopo desta invenção e cobertos pelas reivindicações anexas. Por exemplo, deve-se entender que modificações nas condições da reação, incluindo, mas sem limitação, tempos de reação, tamanho/volume de reação, e reagentes experimentais, tais como solventes, catalisadores, pressões, condições atmosféricas, por exemplo, atmosfera de nitrogênio, e agentes de redução/oxidação, com alternativas reconhecidas na técnica e usando não mais do que experimentação de rotina, fazem parte do escopo do presente pedido.

[0131] Deve-se entender que, sempre que valores e intervalos forem apresentados neste documento, todos os valores e intervalos abrangidos por esses valores e intervalor devem ser incluídos no escopo da presente invenção. Além disso, todos os valores que se enquadram dentro desses intervalos, bem como os limites superior ou inferior de um intervalo de valores, são também contemplados pelo presente pedido.

[0132] Os exemplos a seguir ainda ilustram aspectos da presente invenção.

No entanto, eles não são de forma alguma uma limitação dos ensinamentos ou da divulgação da presente invenção, conforme apresentado.

EXEMPLOS

[0133] A invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos, que não devem ser interpretados como limitantes. A prática da presente invenção empregará, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de síntese orgânica, biologia celular, cultura celular, biologia molecular, biologia transgênica, microbiologia e imunologia, que estão dentro da habilidade da técnica.

Abreviações ÅAngstrom aq. aquoso Bocterc-butiloxicarbonil Boc2Odi-terc-butil dicarbonato CDCl3clorofórmio deuterado CH3CNacetonitrila (MeCN) D2Oóxido de deutério DCCN,N’-dicyclohexylcarbodiimide DCMdiclorometano DMSOdimetil sulfóxido ESIionização por eletropulverização Et3Ntrietilamina EtOAcetil acetato EtOHetanol Catalisador de Lindlar 5% Pd-CaCO3, Pb(OCOCH3)2, e quinolina

MeODmetanol deuterado

MSpeneiras moleculares

MTPMmonometoxitetraclorodifenilmetoximetil

Na2SO4sulfato de sódio

NaB(CN)H3cianoborohidreto de sódio

NaHCO3bicarbonato de sódio

NISN-iodossuccinimida

NMON-óxido de N-metilmorfolina

OAcacetato

OTftriflato, trifluorometanossulfonato tBuOHterc-butanol

TFAácido trifluoroacético

THFtetrahidrofurano

TIPStriisopropilsilano

TMStrimetilsilano

TMSCNtrimetilsilil cianeto

Toltolueno

Exemplo 1: Síntese do Composto 9

Etapa 1

[0134] A uma solução agitada de 13 (0,65 g, 1,0 mmol) e ácido dicloroacético (0,12 ml, 1,5 mmol) em CH2Cl2 (5,0 ml) e DMSO (1,0 ml), foi adicionado DCC (0,23 ml, 1,5 mmol) a 0ºC, e a mistura de reação foi aquecida para temperatura ambiente.

Após 8 h, a reação foi resfriada bruscamente com NaHCO 3 aquoso saturado e extraída com EtOAc. Os extratos orgânicos combinados foram secos sobre Na 2SO4 e concentrados in vacuo. Os precipitados foram filtrados, e o aldeído bruto foi usado para a reação seguinte sem purificação. A uma suspensão de Zn(OTf)2 (1,45 g, 4,0 mmoles) e (+)-N-metilefedrina (0,79 g, 4,8 mmoles) em tolueno (6 ml), foi adicionado Et3N (0,61 ml, 4,8 mmoles) à temperatura ambiente. Após 2 h, 4-fenil-1-butino (0,62 ml, 4,8 mmol) foi adicionado. Após 4 h, uma solução de aldeído bruto em tolueno (5 ml) foi adicionada. A mistura de reação foi agitada por 16 h e resfriada bruscamente com NaHCO3 aquoso saturado, extraída com EtOAc. Os extratos orgânicos combinados foram secos sobre Na2SO4 e concentrados in vacuo. A mistura bruta foi purificada por cromatografia de coluna de sílica gel (hexanos/EtOAc 60:40) para gerar 14 (0,62 g, 0,80 mmol, 80% para 2 etapas): TLC (hexanos/EtOAc 50:50) R f = 0,30; []22D -0,116 (c = 2,17, CHCl3); IR (película fina) max = 3387 (br), 3087, 2981, 2937, 1716, 1664, 1597, 1556, 1454, 1374, 1276, 1211, 1156, 1065, 1039, 916, 856, 807, 786, 733, 698 cm−1 ; 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,53 (ddd, J = 20,4, 8,5, 0,7 Hz, 1H), 7,35 – 7,27 (m, 4H), 7,24 – 7,15 (m, 4H), 6,85 (d, J = 5,1 Hz, 2H), 6,51 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 5,68 (dd, J = 8,1, 4,1 Hz, 1H), 5,60 – 5,50 (m, 3H), 4,89 – 4,78 (m, 2H), 4,57 (ddt, J = 12,0, 4,3, 2,0 Hz, 1H), 4,24 (dd, J = 4,4, 3,1 Hz, 1H), 3,78 (d, J = 3,3 Hz, 3H), 2,83 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,53 (td, J = 7,4, 2,0 Hz, 2H), 1,57 (s, 3H), 1,36 (s, 3H); 13C RMN (101 MHz, CDCl3) δ 162,11, 162,08, 159,50, 150,87, 150,85, 141,07, 140,84, 140,30, 140,27, 136,90, 135,36, 135,29, 133,99, 133,95, 133,79, 133,64, 131,21, 129,37, 129,34, 128,41, 128,39, 126,40, 126,21, 126,18, 125,49, 125,44, 115,34, 115,32, 114,28, 114,24, 101,79, 101,74, 96,69, 96,37, 89,23, 89,19, 86,83, 86,73, 84,09, 83,93, 80,91, 69,46, 63,02, 62,99, 55,68, 34,72, 34,70, 27,16, 25,29, 20,87, 20,85; HRMS (ESI+) m/z calculado para C37H34N2O8NaCl4 [M + Na] 797,0967, encontrado:

797,0994.

Etapa 2

[0135] A uma suspensão agitada de 14 (227 mg, 0,292 mmol), 15 (497 mg, 0,584 mmol), peneiras moleculares 3 Å (900 mg) e SrCO3 (431 mg, 2,920 mmoles) em CH2Cl2 (12,0 ml) foram adicionados AgBF4 (28,5 mg, 0,146 mmol) e NIS (131 mg, 0,584 mmol) a 0ºC. Após 24 h, Et3N (2 ml) foi adicionado à mistura de reação, e a mistura foi passada em um tampão de sílica gel (hexanos/EtOAc 1:1). A fase orgânica combinada foi concentrada in vacuo. A mistura bruta foi purificada por cromatografia de coluna de sílica gel (hexanos/EtOAc 90:10 para 80:20 para 70:30) para gerar 16 (416 mg, 0,277 mmol, 95%): TLC (hexanos/EtOAc 67:33) Rf = 0,70; []21D +0,100 (c = 2,09, CHCl3); IR (película fina) max = 2942, 2866, 2102, 1743, 1724, 1675, 1456, 1278, 1218, 1099, 1070, 882, 772 cm−1; 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,54 (dd, J = 23,1, 8,5 Hz, 1H), 7,32 – 7,27 (m, 4H), 7,24 – 7,16 (m, 4H), 6,84 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 6,51 (d, J = 3,7 Hz, 1H), 5,71 – 5,64 (m, 2H), 5,60 – 5,49 (m, 2H), 5,20 – 5,16 (m, 3H), 4,79 (ddd, J = 7,5, 6,5, 3,1 Hz, 1H), 4,64 (td, J = 5,9, 2,6 Hz, 1H), 4,57 (ddt, J = 11,4, 6,3, 1,9 Hz, 1H), 4,28 (dt, J = 6,2, 2,8 Hz, 1H), 4,19 (tt, J = 6,1, 3,0 Hz, 1H), 3,79 – 3,72 (m, 7H), 3,50 (ddd, J = 13,0, 7,6, 3,3 Hz, 1H), 3,35 (dd, J = 13,0, 3,4 Hz, 1H), 2,83 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,55 (td, J = 7,4, 1,8 Hz, 2H), 2,29 (t, J = 1,6 Hz, 2H), 2,24 (dd, J = 5,1, 2,1 Hz, 2H), 1,62 – 1,55 (m, 7H), 1,36 (d, J = 2,0 Hz, 3H), 1,08 – 1,00 (m, 54H); 13C RMN (101 MHz, CDCl3) δ 175,6, 171,0, 170,9, 170,71, 170,70, 170,6, 162,2, 162,1, 159,5, 150,8, 150,7, 140,4, 140,19, 140,15, 140,13, 136,92, 136,91, 135,4, 135,3, 133,9, 133,8, 133,7, 131,2, 129,4, 129,3, 128,5 (2C), 128,4 (2C), 126,5, 126,4, 126,2, 126,1, 125,6, 125,5, 115,29, 115,25, 114,23, 114,22, 104,61, 104,55, 101,83, 101,82, 88,8, 88,2, 84,44, 84,35, 83,9, 81,4, 81,3, 80,6, 79,9, 76,5, 75,9, 75,8, 74,1, 71,8, 71,7, 71,4, 70,7, 69,6, 69,5, 68,9, 68,8, 59,97, 59,96, 55,7, 46,2, 46,0, 44,7, 44,6, 34,7, 34,51, 34,49, 32,7, 32,61, 32,57, 28,0, 27,38, 27,35, 27,3, 27,1, 25,34, 25,27, 20,9, 18,1 (12C), 11,9 (6C); HRMS (ESI+) m/z calculado para

C74H106Cl4N5O15Si2 [M + H] 1500,5978, encontrado: 1500,5992.

Etapa 3

[0136] Uma solução suspensa de 16 (286 mg, 0,19 mmol), NH 4Cl (305 mg, 5,70 mmoles) e Zn (373 mg, 5,70 mmoles) em EtOH/H2O (9:1, 9,5 ml) foi agitada a 80 ºC por 12 h e resfriada para temperatura ambiente. Os precipitados foram filtrados e a solução orgânica combinada foi concentrada in vacuo. A mistura bruta foi usada para a reação seguinte sem purificação. A uma solução agitada de mistura bruta em THF (9,5 ml), foram adicionados NaHCO 3 saturado (aq., 9,5 ml) e Boc2O (124 mg, 0,57 mmol). A mistura de reação foi agitada por 6 h à temperatura ambiente, e a camada aquosa foi extraída com EtOAc. Os extratos orgânicos combinados foram secos sobre Na2SO4 e concentrados in vacuo. A mistura bruta foi purificada por cromatografia de coluna de sílica gel (hexanos/EtOAc 85:15 para 80:20 para 67:33) para gerar 17 (258 mg, 0,16 mmol, 86% para 2 etapas): TLC (hexanos/EtOAc 70:30) Rf = 0,30; []21D +0,012 (c = 0,90, CHCl3); IR (película fina) max = 2941, 2866, 1720, 1676, 1456, 1366, 1278, 1219, 1100, 1070, 882, 772 cm−1; 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,54 (dd, J = 19,9, 8,5 Hz, 1H), 7,33 – 7,27 (m, 4H), 7,24 – 7,16 (m, 4H), 6,85 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 6,51 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 5,72 – 5,64 (m, 2H), 5,60 – 5,48 (m, 2H), 5,26 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5,17 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 5,13 – 5,08 (m, 1H), 4,82 – 4,76 (m, 1H), 4,65 (t, J = 7,0 Hz, 1H), 4,51 (dd, J = 13,8, 6,0 Hz, 1H), 4,31 – 4,26 (m, 1H), 4,23 – 4,17 (m, 1H), 3,78 (d, J = 2,7 Hz, 3H), 3,74 (d, J = 6,9 Hz, 4H), 3,48 – 3,40 (m, 1H), 3,36 – 3,26 (m, 1H), 2,83 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,56 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,27 (t, J = 2,6 Hz, 2H), 2,23 (t, J = 3,0 Hz, 2H), 1,62 – 1,55 (m, 7H), 1,42 (s, 9H), 1,37 (d, J = 2,6 Hz, 3H), 1,11 – 0,99 (m, 54H); 13C RMN (101 MHz, CDCl3) δ 159,5, 150,8, 136,9, 131,3, 129,3, 128,5 (2C), 128,4 (2C), 126,5, 126,1, 125,4, 115,30, 115,26, 80,0, 60,0, 55,7, 46,4, 46,2, 46,0, 44,83, 44,78, 42,5, 34,51, 34,49, 32,60, 32,55, 31,9, 29,7, 28,7, 28,4, 28,3, 27,4, 27,33, 27,29, 27,26, 27,09, 27,05, 25,4, 22,7, 22,6, 20,9, 18,1 (6C), 17,9 (6C), 14,1, 11,9 (3C), 11,8 (3C); HRMS (ESI+) m/z calculado para C79H116Cl4N3O17Si2

[M + H] 1574,6597, encontrado: 1574,6609.

Etapa 4

[0137] A uma solução agitada de 17 (258 mg, 0,16 mmol) e quinolina (38,7 L, 0,33 mmol) em EtOAc (50 ml) e MeOH (50 ml), foi adicionado catalisador Lindlar (300 mg). Gás H2 foi introduzido e a mistura de reação foi agitada sob atmosfera de H2 (600 psi) à temperatura ambiente. Após ser agitada por 7 h, catalisador Lindlar (150 mg) foi adicionado à mistura de reação. A mistura de reação foi agitada por 11 h sob atmosfera de H2 (600 psi) à temperatura ambiente. A solução foi filtrada através de Celite e lavada com 1N HCl (aq.). A solução orgânica combinada foi seca sobre Na 2SO4, concentrada in vacuo. A mistura bruta foi usada para a reação seguinte sem purificação. A uma solução agitada da mistura bruta e NMO (192 mg, 1,64 mmol) em t-BuOH/acetona (1:1, 2,1 ml), foi adicionado OsO4 (4% em água, 1,04 ml, 0,16 mmol) à temperatura ambiente. Após a reação ser agitada por 2 h a 40ºC, NMO (192 mg, 1,64 mmol) e OsO4 (4% em água, 1,04 ml, 0,16 mmol) foram adicionados. Após ser agitada por 2 h a 40ºC, a solução de reação foi diluída com EtOAc e resfriada bruscamente com NaHCO3 saturado aq./Na2SO3 saturado aq. (2:1). A mistura heterogênea foi agitada por 30 min, em seguida, extraída com EtOAc. Os extratos orgânicos combinados foram secos sobre Na2SO4 e concentrados in vacuo. A mistura bruta foi passada em um tampão de sílica gel (hexanos/EtOAc 33:67) para gerar 18 como mistura diastereomérica. Essa mistura foi usada para a reação seguinte sem purificação adicional.

Etapa 5

[0138] A uma solução agitada de 18 (22,1 mg, 0,014 mmol) e NaHCO3 (11,5 mg, 0,14 mmol) em CH2Cl2 (0,7 ml), foi adicionado Pb(OAc)4 (12,1 mg, 0,027 mmfol) a 0ºC. A mistura de reação foi agitada por 2 h a 0oC e resfriada bruscamente com NaHCO3(aq) saturado, extraída com EtOAc. Os extratos orgânicos combinados foram secos sobre Na2SO4 e concentrados in vacuo. A mistura bruta de aldeído 18 foi usada para a reação seguinte sem purificação. A uma solução agitada de (BnO)2P(O)-CH2- P(O)(OBn)OH (30,6 mg, 0,069 mmol) em CH2Cl2 (0,4 ml), foi adicionada uma solução de CH2Cl2 (0,3 ml) da mistura de 18, 19 foi adicionado à solução. Após 9 h, foi adicionado TMSCN (17,1 L, 0,14 mmol) à reação e agitada por 9 h à temperatura ambiente. Após conclusão, a mistura de reação foi resfriada bruscamente com NaHCO3 saturado aq., extraída com EtOAc. Os extratos orgânicos combinados foram secos sobre Na2SO4 e concentrados in vacuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica gel (hexanos/EtOAc 80:20 para 60:40) para gerar 21 (16,7 mg, 9,49 moles, 69% para 2 etapas): TLC (hexanos/EtOAc 60:40) Rf = 0,40; []21D +0,075 (c = 0,73, CHCl3); IR (película fina) max = 3317 (br), 2930, 2865, 1719, 1675, 1600, 1462, 1102, 1071, 882, 772, 683 cm−1; 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,68 (s, 1H), 7,49 (dd, J = 11,4, 8,8 Hz, 1H), 7,39 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 7,32 (s, 1H), 7,19 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,11 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 6,86 (d, J = 9,3 Hz, 2H), 6,50 (d, J = 15,4 Hz, 1H), 5,73 (dd, J = 23,0, 8,0 Hz, 1H), 5,59 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 5,54 (d, J = 9,4 Hz, 2H), 5,42 (t, J = 10,1 Hz, 1H), 5,25 (s, 1H), 5,08 – 5,00 (m, 2H), 4,96 – 4,82 (m, 2H), 4,50 – 4,45 (m, 1H), 4,25 – 4,19 (m, 1H), 4,15 – 4,06 (m, 1H), 3,94 – 3,83 (m, 1H), 3,80 – 3,63 (m, 10H), 3,49 – 3,41 (m, 1H), 3,39 – 3,31 (m, 1H), 3,03 (dt, J = 12,0, 6,1 Hz, 1H), 2,71 – 2,61 (m, 1H), 2,54 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 2,51 – 2,45 (m, 1H), 2,29 – 2,17 (m, 4H), 1,67 – 1,51 (m, 10H), 1,41 (s, 9H), 1,28 (dd, J = 15,7, 8,1 Hz, 10H), 1,05 (s, 42H), 1,01 (s, 6H), 0,95 (s, 6H), 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 3H); 13C RMN (101 MHz, CDCl3) δ 170,9, 159,5, 136,9, 136,8, 131,3, 131,2, 129,42, 129,36, 128,84 (2C), 128,82 (2C), 128,80 (2C), 126,4, 126,2, 125,1, 120,09, 120,05, 115,4, 115,31, 115,30, 114,84, 114,81, 84,90, 84,87, 80,84, 80,78, 80,2, 79,8, 79,4, 78,2, 76,1, 74,3, 60,0, 59,9, 55,8, 55,7, 52,0, 46,2, 46,0, 44,83, 44,77, 35,4, 32,56, 32,55, 31,8, 31,5, 29,7, 29,19, 29,16, 28,4, 28,3, 27,3, 27,2, 22,7, 18,1 (12C), 14,1, 11,9 (6C); HRMS (ESI+) m/z calculado para C88H135Cl4N6O18Si2 [M + H] 1759,8126, encontrado: 1759,8135.

Etapa 6

[0139] A uma solução agitada de 21 (8,8 mg, 5,0 moles) em EtOH/H2O (9:1, 0,5 ml), foram adicionados HgCl2 (2,7 mg, 0,010 mmol) e acetaldoxima (3,0 L, 0,050 mmol) à temperatura ambiente. Após ser agitada por 6 h à temperatura ambiente, a mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi resfriado bruscamente com NaHCO3 saturado aq. e extraído com CHCl3. Os extratos orgânicos combinados foram secos sobre Na2SO4 e concentrados in vacuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica gel (CHCl3/MeOH 99,5:0,5 para 99,2:0,8 para 98,8:1,2) para gerar 22 (7,9 mg, 4,5 moles, 89%): TLC (CHCl3/MeOH 95:5) Rf = 0,40; IR (película fina) max = 3335 (br), 2927, 2865, 1668, 1601, 1460, 1099, 1071, 882, 681 cm−1; 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,59 (dd, J = 19,5, 8,5 Hz, 1H), 7,40 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,30 (t, J = 2,6 Hz, 1H), 7,24 – 7,18 (m, 1H), 7,11 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 6,84 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 6,50 (s, 1H), 5,84 (brs, 1H), 5,59 – 5,47 (m, 3H), 5,26 – 5,14 (m, 2H), 5,06 – 4,97 (m, 1H), 4,96 – 4,87 (m, 1H), 4,84 – 4,73 (m, 1H), 4,55 (t, J = 5,0 Hz, 1H), 4,28 – 4,14 (m, 2H), 3,80 – 3,70 (m, 7H), 3,59 – 3,46 (m, 1H), 3,41 (brs, 2H), 2,83 (brs, 2H), 2,54 (t, J = 7,7 Hz, 3H), 2,50 – 2,43 (m, 1H), 2,29 – 2,21 (m, 4H), 1,99 (brs, 2H), 1,65 – 1,53 (m, 10H), 1,43 (s, 9H), 1,35 (d, J = 5,2 Hz, 3H), 1,32 – 1,24 (m, 10H), 1,05 (d, J = 3,2 Hz, 48H), 1,00 – 0,97 (m, 6H), 0,87 (t, J = 6,8 Hz, 3H); 13C RMN (101 MHz, CDCl3) δ 159,6, 159,5, 136,87, 136,85, 136,4, 135,2, 134,0, 133,64, 133,59, 131,3, 129,42, 129,40, 128,9 (2C), 126,2, 125,3, 120,2, 120,1, 115,4 (2C), 74,5, 60,0, 59,9, 55,73, 55,72, 46,2, 46,1, 46,0, 44,8, 35,4, 32,7, 32,6, 31,8, 31,5, 29,69, 29,67, 29,6, 29,5, 29,4, 29,3, 29,24, 29,16, 29,09, 28,51, 28,49, 28,48, 28,45, 28,43, 28,42, 28,36, 28,33, 28,31, 28,28, 27,33, 27,30, 27,25, 27,2, 25,3, 22,7, 18,1 (12C), 14,1, 11,9 (6C); HRMS (ESI+) m/z calculado para C88H137Cl4N6O19Si2 [M + H] 1777,8231, encontrado: 1777,8219.

Etapa 7

[0140] A uma solução agitada de 22 (5,8 mg, 3,3 moles) e paraformaldeído (2,9 mg, 0,098 mmol) em CH3CN (0,5 ml), foi adicionado NaB(CN)H3 (6,2 mg, 0,098 mmol). Após ser agitada por 4 h à temperatura ambiente, a mistura de reação foi resfriada bruscamente com NaHCO3 saturado aq. e extraída com CHCl3. Os extratos orgânicos combinados foram secos sobre Na2SO4 e concentrados in vacuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica gel (hexanos/EtOAc 40:60) para gerar 23 (5,5 mg, 3,1 moles, 95%): TLC (hexanos/EtOAc 33:67) Rf = 0,60; []21D +0,022 (c = 0,28, CHCl3); IR (película fina) max = 2932, 2866, 1718, 1672, 1601, 1463, 1101, 1071, 884 cm−1; 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,75 (d, J = 17,0 Hz, 1H), 7,56 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,43 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 7,34 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,30 (s, 2H), 7,20 (dt, J = 8,5, 2,0 Hz, 1H), 7,10 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 6,85 (s, 2H), 6,51 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 6,28 (brs, 1H), 5,95 (d, J = 21,6 Hz, 1H), 5,84 – 5,78 (m, 1H), 5,74 (d, J = 23,3 Hz, 1H), 5,54 (s, 2H), 5,49 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 5,18 (brs, 1H), 5,11 (s, 2H), 5,02 (brs, 1H), 4,88 – 4,83 (m, 1H), 4,80 – 4,74 (m, 1H), 4,39 – 4,31 (m, 2H), 4,24 – 4,18 (m, 1H), 3,92 (t, J = 5,8 Hz, 1H), 3,78 (s, 3H), 3,74 (q, J = 6,6 Hz, 4H), 3,68 – 3,63 (m, 1H), 3,50 – 3,40 (m, 2H), 3,37 – 3,30 (m, 1H), 2,83 – 2,74 (m, 1H), 2,68 – 2,59 (m, 1H), 2,54 (t, J = 7,8 Hz, 2H), 2,49 (s, 3H), 2,37 (q, J = 8,0, 7,6 Hz, 2H), 2,29 – 2,20 (m, 4H), 1,98 – 1,88 (m, 2H), 1,62 – 1,52 (m, 6H), 1,40 (s, 9H), 1,36 (brs, 3H), 1,33 – 1,23 (m, 6H), 1,09 – 1,01 (m, 48H), 0,98 (s, 6H), 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 3H); 13C RMN (101 MHz, CDCl3) δ 171,0, 162,0, 159,5, 157,1, 136,9, 131,3, 129,4, 128,7 (2C), 119,9 (2C), 115,3, 115,1, 114,2, 70,6, 70,1, 69,9, 67,1, 60,4, 60,1, 59,96, 59,95, 58,9, 55,8, 55,7, 54,4, 54,1, 46,22, 46,16, 46,1, 45,3, 44,9, 44,8, 44,7, 42,3, 41,2, 39,93, 39,86, 39,6, 39,04, 38,97, 35,4, 32,7, 32,64, 32,63, 32,62, 32,58, 31,9, 31,8, 31,7, 31,6, 31,53, 31,48, 29,69, 29,67, 29,6, 29,4, 29,22, 29,17, 28,50, 28,49, 28,4, 27,29, 27,28, 27,21, 27,17, 25,23, 25,20, 22,68, 22,66, 18,1 (12C), 14,1, 11,9 (6C); HRMS (ESI+) m/z calculado para C89H139Cl4N6O19Si2 [M + H] 1791,8388, encontrado: 1791,8404.

Etapa 8

[0141] A uma solução agitada de 23 (2,9 mg, 1,6 mol) em CH2Cl2 (0,70 ml),

foi adicionado TFA (0,30 ml). A mistura de reação foi agitada por 2 h à temperatura ambiente, e todos os solventes voláteis foram evaporados in vacuo. A uma solução agitada da mistura bruta em H2O (0,2 ml), foi adicionado TFA (0,8 ml). A mistura de reação foi agitada por 4 h a 40ºC, e todos os solventes voláteis foram evaporados in vacuo. A mistura bruta foi purificada por cromatografia de coluna de sílica gel (CHCl3/MeOH 80:20 para CHCl3/MeOH/H2O/50% de amônia aquosa 56:42:7:3) para gerar 9 (1,2 mg, 1,6 moles, 100%): TLC (n-butanol/etanol/CHCl3/28% de amônia aquosa 4:7:2:7) Rf = 0,55; []20D +0,038 (c = 0,12, metanol); IR (película fina) max = 3333 (br), 2926, 2855, 1676, 1204, 1135, 840, 801, 722 cm−1; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ 7,82 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,44 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,12 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 5,76 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 5,70 (s, 1H), 5,18 (s, 1H), 4,58 (s, 1H), 4,28 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 4,21 – 4,16 (m, 3H), 4,14 – 4,07 (m, 3H), 3,61 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 3,21 (dd, J = 13,6, 3,4 Hz, 1H), 2,83 (td, J = 12,1, 11,7, 5,0 Hz, 1H), 2,57 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 2,46 (s, 3H), 2,46 – 2,40 (m, 2H), 2,00 – 1,89 (m, 1H), 1,79 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 1,63 – 1,55 (m, 2H), 1,37 – 1,23 (m, 10H), 0,91 – 0,87 (m, 3H); 13C RMN (101 MHz, CD3OD) δ 173,9, 172,3, 142,4, 140,2, 137,3, 129,7 (2C), 121,5 (2C), 112,1, 102,4, 92,5, 84,2, 80,5, 78,4, 76,4, 75,4, 72,0, 70,8, 68,5, 54,5, 39,5, 36,3, 35,0, 33,0, 32,8, 30,29, 30,26, 24,3, 23,7, 14,4; HRMS (ESI+) m/z calculado para C34H53N6O11 [M + H] 721,3772, encontrado: 721,3761.

Exemplo 2: Síntese de Composto 10

[0142] A uma solução agitada de 22 (7,9 mg, 4,5 moles) em CH2Cl2 (0,70 ml), foi adicionado TFA (0,30 ml). A mistura de reação foi agitada por 1 h à temperatura ambiente, e todos os solventes voláteis foram evaporados in vacuo. A uma solução agitada da mistura bruta em H2O (0,2 ml), foi adicionado TFA (0,8 ml). A mistura de reação foi agitada por 2 h a 40ºC, e todos os solventes voláteis foram evaporados in vacuo. A mistura bruta foi purificada por cromatografia de coluna de sílica gel (CHCl3/MeOH 80:20 para CHCl3/MeOH/H2O/50% de amônia aquosa 56:42:7:3) para gerar 10 (2,4 mg, 3,4 moles, 76%, 95,8% de pureza): TLC (n- butanol/etanol/CHCl3/28% de amônia aquosa 4:7:2:7) Rf = 0,50; []21D +0,538 (c = 0,24, metanol); IR (película fina) max = 3302 (br), 2926, 1672, 1542, 1412, 1271, 1131, 1111, 1062, 819, 721 cm−1; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ 7,77 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,43 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 7,12 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 5,74 (s, 1H), 5,73 (d, J = 12,6 Hz, 1H), 5,14 (s, 1H), 4,21 (dd, J = 4,7, 4,2 Hz, 1H), 4,19 – 4,13 (m, 2H), 4,11 (t, J = 4,7 Hz, 1H), 4,08 (s, 2H), 4,02 – 3,99 (m, 1H), 3,50 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 3,24 (d, J = 13,0 Hz, 1H), 3,16 – 3,09 (m, 1H), 2,73 – 2,60 (m, 2H), 2,57 (t, J = 7,7 Hz, 2H), 2,43 (dd, J = 7,4, 4,0 Hz, 2H), 1,86 (quin, J = 7,2 Hz, 2H), 1,59 (quin, J = 6,4, 5,7 Hz, 2H), 1,35 – 1,26 (m, 8H), 0,92 – 0,87 (m, 3H); 13C RMN (101 MHz, CD3OD) δ 177,2, 174,2, 166,1, 152,1, 142,6, 140,1, 137,4, 129,7 (2C), 121,5 (2C), 110,6, 102,7, 92,5, 85,2, 80,5, 76,4, 75,0, 73,0, 71,2, 64,3, 43,2, 36,3, 35,5, 33,0, 32,8, 30,3, 26,6, 23,7, 14,4; HRMS (ESI+) m/z calculado para C33H51N6O11 [M + H] 707,3616, encontrado: 707,3624.

Exemplo 3: Síntese de Composto 11

Etapa 1

[0143] A uma solução agitada de 18 (32,5 mg, 0,020 mmol) e NaHCO3 (16,9 mg, 0,20 mmol) em CH2Cl2 (1,0 ml), foi adicionado Pb(OAc)4 (17,9 mg, 0,040 mmfol) a 0ºC. A mistura de reação foi agitada por 2 h a 0ºC e resfriada bruscamente com NaHCO3 saturado aq., em seguida, extraída com EtOAc. Os extratos orgânicos combinados foram secos sobre Na2SO4 e concentrados in vacuo. O produto bruto foi dissolvido em CH2Cl2 (0,5 ml) e adicionado a uma solução agitada de (BnO)2P(O)-CH2-

P(O)(OBn)OH (45,0 mg, 0,10 mmol) em CH2Cl2 (0,5 ml). Em seguida, 20 foi adicionado à solução.

Após 6 h, foi adicionado TMSCN (25,2 L, 0,20 mmol) a reação e agitada por 12 h à temperatura ambiente.

Após conclusão, a mistura de reação foi resfriada bruscamente com NaHCO3 saturado aq. e extraída com EtOAc.

Os extratos orgânicos combinados foram secos sobre Na2SO4 e concentrados in vacuo.

O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica gel (hexanos/EtOAc 80:20 para 60:40)

para gerar 24 (23,9 mg, 0,012 mmol, 61% para 2 etapas): TLC (hexanos/EtOAc 50:50) Rf = 0,40; []21D +0,102 (c = 0,75, CHCl3); IR (película fina) max = 3342 (br), 2941, 2866,

1718, 1675, 1505, 1464, 1243, 1164, 1101, 1071, 883, 772, 688 cm−1; 1H RMN (400

MHz, CDCl3) δ 7,49 (dd, J = 8,5, 4,3 Hz, 1H), 7,32 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,22 – 7,11 (m,

7H), 6,94 – 6,88 (m, 5H), 6,86 (d, J = 6,5 Hz, 2H), 6,50 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,25 – 6,16

(m, 1H), 5,73 (dd, J = 22,2, 8,0 Hz, 1H), 5,60 (t, J = 8,8 Hz, 1H), 5,56 – 5,41 (m, 3H),

5,21 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 5,05 – 4,98 (m, 2H), 4,94 – 4,77 (m, 2H), 4,53 – 4,37 (m, 3H),

4,25 – 4,16 (m, 2H), 4,05 – 3,98 (m, 1H), 3,80 – 3,69 (m, 6H), 3,68 – 3,63 (m, 1H), 3,56

(dd, J = 17,3, 3,4 Hz, 1H), 3,48 (ddt, J = 11,6, 7,2, 4,0 Hz, 2H), 3,44 – 3,29 (m, 1H),

3,08 (dq, J = 9,5, 5,3, 4,8 Hz, 2H), 2,95 (dt, J = 11,4, 5,5 Hz, 1H), 2,47 (td, J = 12,0,

11,4, 5,7 Hz, 1H), 2,36 – 2,14 (m, 5H), 2,13 – 2,05 (m, 2H), 1,97 – 1,85 (m, 3H), 1,84

– 1,75 (m, 1H), 1,58 (t, J = 6,9 Hz, 2H), 1,55 – 1,50 (m, 4H), 1,40 (s, 9H), 1,33 (d, J =

4,8 Hz, 3H), 1,28 – 1,23 (m, 3H), 1,08 – 1,02 (m, 42H), 1,01 (s, 6H), 0,94 (d, J = 2,1

Hz, 6H); 13C RMN (101 MHz, CDCl3) δ 172,4, 171,0, 170,9, 159,5, 155,8, 150,9, 150,7,

142,8, 136,9, 136,8, 135,3, 135,1, 134,13, 134,05, 133,86, 133,85, 133,78, 131,2,

131,1, 129,42, 129,37, 129,0, 126,4, 126,2, 125,5, 125,2, 122,5 (2C), 121,8, 119,3,

118,4, 116,8 (2C), 116,6 (2C), 115,4, 115,3, 114,71, 114,66, 106,4, 102,3, 102,2, 84,8,

80,7, 80,6, 79,9, 79,8, 79,3, 76,2, 74,32, 74,30, 72,9, 60,38, 60,35, 60,0, 59,9, 55,72,

55,71, 52,0, 46,6, 46,2, 45,9, 44,84, 44,77, 42,99, 42,96, 42,4, 41,2, 33,53, 33,49, 32,6,

32,5, 30,3, 28,4, 27,3 (2C), 27,17, 27,16, 27,1, 25,4, 18,1 (12C), 14,2, 14,1, 11,91 (3C),

11,90 (3C); HRMS (ESI+) m/z calculado para C94H135Cl4F3N7O20Si2 [M + H] 1934,8007, encontrado: 1934,8021.

Etapa 2

[0144] A uma solução agitada de 24 (15,4 mg, 8,0 moles) em EtOH/H2O (9:1, 0,5 ml), foram adicionados HgCl2 (4,3 mg, 0,016 mmol) e acetaldoxima (4,9 L, 0,080 mmol) à temperatura ambiente. Após ser agitada por 6 h à temperatura ambiente, a mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi resfriado bruscamente com NaHCO3 saturado aq., extraído com CHCl3. Os extratos orgânicos combinados foram secos sobre Na2SO4 e concentrados in vacuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica gel (CHCl3/MeOH 99,5:0,5 a 99,2:0,8 a 98,8:1,2) para gerar 25 (15,3 mg, 7,8 moles, 98%): TLC (CHCl3/MeOH 95:5) Rf = 0,30; []21D +0,144 (c = 0,53, CHCl3); IR (película fina) max = 3335 (br), 2940, 2866, 1719, 1676, 1505, 1464, 1367, 1242, 1162, 1101, 1070, 882, 681 cm −1; 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,53 (dd, J = 8,6, 5,1 Hz, 1H), 7,30 (s, 1H), 7,28 – 7,22 (m, 2H), 7,21 – 7,12 (m, 6H), 6,91 (d, J = 8,5 Hz, 4H), 6,86 (d, J = 2,6 Hz, 2H), 6,51 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 5,94 (brs, 1H), 5,79 – 5,67 (m, 3H), 5,56 – 5,47 (m, 2H), 5,17 (brs, 1H), 5,06 (s, 1H), 4,96 (brs, 1H), 4,82 – 4,73 (m, 2H), 4,43 (tt, J = 7,8, 3,8 Hz, 1H), 4,39 – 4,28 (m, 3H), 4,21 (brs, 1H), 4,13 (brs, 1H), 3,78 (s, 3H), 3,73 (q, J = 7,4 Hz, 5H), 3,67 (brs, 1H), 3,48 (ddd, J = 11,7, 7,2, 3,7 Hz, 2H), 3,41 – 3,28 (m, 1H), 3,17 (s, 1H), 3,09 (ddd, J = 12,2, 8,2, 3,3 Hz, 2H), 2,80 – 2,60 (m, 2H), 2,38 – 2,15 (m, 7H), 2,13 – 2,05 (m, 2H), 1,93 (ddd, J = 12,8, 8,0, 3,7 Hz, 2H), 1,85 – 1,79 (m, 2H), 1,54 (s, 3H), 1,42 (s, 9H), 1,34 (s, 3H), 1,04 (d, J = 2,8 Hz, 42H), 1,01 (s, 6H), 0,96 (s, 6H); 13C RMN (101 MHz, CDCl3) δ 162,1, 162,0, 159,6, 159,5, 156,2, 155,8, 150,9, 150,4, 142,80, 142,78, 136,88, 136,86, 135,23, 135,21, 133,9, 133,6, 131,33, 131,30, 131,29, 129,40, 129,37, 129,2, 129,1, 129,02, 128,98, 126,24, 126,22, 126,21, 125,40, 125,36, 124,5, 124,4, 123,20, 123,19, 122,5 (2C), 121,8, 120,1, 119,3, 116,8 (2C), 115,4, 80,4, 80,02, 79,99, 79,96, 79,95, 79,92, 79,87, 79,85, 79,83, 74,51, 74,50, 72,7, 70,4, 70,3, 69,5, 60,0, 59,9, 55,73,

55,72, 46,7, 46,19, 46,15, 46,13, 46,11, 46,10, 46,07, 46,0, 44,8, 34,7, 34,5, 32,61, 32,58, 30,2, 29,7, 29,64, 29,60, 28,50, 28,45, 28,42, 28,38, 28,34, 27,25 (2C), 27,19, 27,16, 25,31, 25,29, 25,27, 18,1 (12C), 14,1, 12,2, 11,9 (6C); HRMS (ESI+) m/z calculado para C94H137Cl4F3N7O21Si2 [M + H] 1952,8112, encontrado: 1952,8098.

Etapa 3

[0145] A uma solução agitada de 25 (5,3 mg, 2,7 moles) em CH2Cl2 (0,70 ml), foi adicionado TFA (0,30 ml). A mistura de reação foi agitada por 1 h à temperatura ambiente, e todos os solventes voláteis foram evaporados in vacuo. A uma solução agitada da mistura bruta em H2O (0,2 ml), foi adicionado TFA (0,8 ml). A mistura de reação foi agitada por 2 h a 40ºC, e todos os solventes voláteis foram evaporados in vacuo. A mistura bruta foi purificada por cromatografia de coluna de sílica gel (CHCl3/MeOH 80:20 para CHCl3/MeOH/H2O/50% de amônia aquosa 56:42:7:3) para gerar 11 (2,2 mg, 2,5 moles, 91%): TLC (n-butanol/etanol/CHCl3/28% de amônia aquosa 4:7:2:7) Rf = 0,50; []21D +0,375 (c = 0,30, metanol); IR (película fina) max = 3352 (br), 2932, 1677, 1505, 1243, 1201, 1136, 801, 722 cm−1; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ 7,78 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,18 (dd, J = 9,0, 3,5 Hz, 4H), 7,00 (dd, J = 16,0, 8,6 Hz, 4H), 5,77 (d, J = 2,9 Hz, 1H), 5,73 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,14 (s, 1H), 4,57 – 4,50 (m, 1H), 4,28 (s, 2H), 4,22 – 4,13 (m, 3H), 4,10 (dd, J = 8,6, 4,4 Hz, 1H), 4,07 – 3,98 (m, 2H), 3,52 – 3,46 (m, 3H), 3,44 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 3,17 (d, J = 13,0 Hz, 1H), 3,14 – 3,02 (m, 3H), 2,60 (ddq, J = 18,4, 11,8, 6,9 Hz, 2H), 2,29 (td, J = 7,3, 2,8 Hz, 2H), 2,12 (dd, J = 14,5, 5,6 Hz, 2H), 1,93 – 1,73 (m, 4H), 1,39 – 1,25 (m, 2H); 13C RMN (101 MHz, CD3OD) δ 175,6, 166,2, 157,6, 152,0, 142,6, 131,2, 129,6 (2C), 123,6 (2C), 118,11 (2C), 118,07 (2C), 110,5, 102,7, 92,3, 85,3, 81,4, 80,4, 76,5, 75,1, 74,1 (2C), 73,0, 71,3, 64,4, 43,7, 43,6, 34,7, 31,5, 26,9; HRMS (ESI+) m/z calculado para C39H51F3N7O13 [M + H] 882,3497, encontrado: 882,3512.

Exemplo 4: Síntese de Composto 12

Etapa 1

[0146] A uma solução agitada de 25 (7,8 mg, 4,0 moles) e paraformaldeído (3,6 mg, 0,12 mmol) em CH3CN (0,5 ml), foi adicionado NaB(CN)H3 (7,5 mg, 0,12 mmol). Após ser agitada por 17 h à temperatura ambiente, a mistura de reação foi resfriada bruscamente com NaHCO3 saturado aq. e extraída com CHCl3. Os extratos orgânicos combinados foram secos sobre Na2SO4 e concentrados in vacuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica gel (hexanos/EtOAc 33:67) para gerar 26 (4,7 mg, 2,4 moles, 59%): TLC (hexanos/EtOAc 20:80) Rf = 0,50; 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,57 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,38 (dd, J = 19,7, 7,9 Hz, 1H), 7,29 (s, 1H), 7,22 – 7,10 (m, 5H), 6,90 (d, J = 9,1 Hz, 4H), 6,85 (d, J = 3,6 Hz, 2H), 6,51 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 6,25 (d, J = 27,7 Hz, 1H), 5,84 (dd, J = 13,4, 8,0 Hz, 1H), 5,55 (s, 1H), 5,48 (brs, 1H), 5,13 (brs, 1H), 5,09 (s, 1H), 4,99 (brs, 1H), 4,86 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 4,74 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 4,43 (tt, J = 7,5, 3,6 Hz, 1H), 4,36 – 4,28 (m, 4H), 4,20 (dd, J = 8,6, 3,5 Hz, 1H), 3,77 (s, 3H), 3,74 (t, J = 6,5 Hz, 4H), 3,69 – 3,63 (m, 2H), 3,51 – 3,42 (m, 4H), 3,29 (d, J = 14,5 Hz, 1H), 3,08 (ddd, J = 12,2, 8,4, 3,4 Hz, 2H), 2,76 – 2,68 (m, 1H), 2,61 – 2,51 (m, 1H), 2,45 (s, 3H), 2,29 – 2,14 (m, 5H), 2,12 – 2,05 (m, 2H), 1,96 – 1,83 (m, 4H), 1,55 (s, 3H), 1,39 (s, 9H), 1,37 (s, 3H), 1,26 (s, 3H), 1,04 (d, J = 4,6

Hz, 42H), 1,01 (s, 6H), 0,99 (s, 6H); 13C RMN (101 MHz, CDCl3) δ 173,0, 172,3, 171,22, 171,15, 162,0, 159,5, 157,5, 155,8, 150,6, 142,83, 142,81, 136,9, 135,4, 131,3, 129,36, 129,35, 129,31, 129,30, 129,03, 128,99, 128,95, 128,93, 126,1, 122,5 (2C), 116,8 (2C), 116,6, 115,33, 115,29, 107,3, 106,9, 84,1, 79,30, 79,28, 79,26, 79,24, 79,23, 74,88, 74,87, 73,6, 72,83, 72,80, 70,61, 70,56, 69,8, 67,3, 60,39, 60,36, 60,0, 59,9, 55,70 (2C), 54,2, 46,6 (2C), 46,1, 46,0, 45,0, 44,9, 44,7, 43,1, 41,2, 32,61, 32,59, 30,33 (2C), 30,27, 30,25, 29,69, 29,67, 29,65, 29,60, 28,52, 28,45, 27,31, 27,28, 27,24, 27,23, 27,22, 27,15, 25,14, 25,11, 22,7, 18,1 (12C), 14,2, 14,1, 11,9 (6C); HRMS (ESI+) m/z calculado para C95H139Cl4F3N7O21Si2 [M + H] 1966,8269, encontrado: 1966,8288.

Etapa 2

[0147] A uma solução agitada de 26 (4,7 mg, 2,4 moles) em CH2Cl2 (0,70 ml), foi adicionado TFA (0,30 ml). A mistura de reação foi agitada por 2 h à temperatura ambiente, e todos os solventes voláteis foram evaporados in vacuo. A uma solução agitada da mistura bruta em H2O (0,2 ml), foi adicionado TFA (0,8 ml). A mistura de reação foi agitada por 4 h a 40ºC, e todos os solventes voláteis foram evaporados in vacuo. A mistura bruta foi purificada por cromatografia de coluna de sílica gel (CHCl3/MeOH 80:20 para CHCl3/MeOH/H2O/50% de amônia aquosa 56:42:7:3) para gerar 12 (2,0 mg, 2,2 moles, 92%): TLC (n-butanol/etanol/CHCl3/28% de amônia aquosa 4:7:2:7) Rf = 0,55; []20D +0,246 (c = 0,24, metanol); IR (película fina) max = 3276 (br), 2933, 1675, 1505, 1465, 1271, 1243, 1199, 1111 cm−1; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ 7,84 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 7,19 (dd, J = 8,5, 3,3 Hz, 4H), 7,01 (dd, J = 13,1, 8,6 Hz, 4H), 5,86 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 5,73 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,16 (s, 1H), 4,54 (tt, J = 7,3, 3,1 Hz, 1H), 4,30 – 4,25 (m, 3H), 4,26 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 4,22 – 4,05 (m, 6H), 3,70 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 3,52 – 3,44 (m, 2H), 3,09 (ddt, J = 12,3, 8,6, 4,3 Hz, 2H), 2,91 – 2,82 (m, 1H), 2,58 – 2,53 (m, 1H), 2,50 (s, 3H), 2,30 (q, J = 6,9 Hz, 2H), 2,15 – 2,08 (m, 2H), 1,96 – 1,82 (m, 3H), 1,81 – 1,71 (m, 1H), 1,39 – 1,25 (m, 2H); 13C RMN (101

MHz, CD3OD) δ 175,3, 172,2, 157,6, 152,0, 142,4, 131,3, 129,7 (2C), 123,6 (2C), 118,12 (2C), 118,08 (2C), 111,9, 92,1, 84,4, 80,3, 78,4, 76,4, 75,4, 74,1 (2C), 71,5, 70,8, 68,3, 43,7, 39,7, 34,5, 31,5 (2C), 24,5; HRMS (ESI+) m/z calculado para C40H53F3N7O13 [M + H] 896,3653, encontrado: 896,3640.

Exemplo 6: Síntese de Composto 8 Etapa 1

[0148] A uma solução agitada de 27 (32 mg, 0,06 mmol), NH4Cl (0,17 g, 3,17 mmoles), NaHCO3 (80 mg, 0,95 mmol) e 28 (72 mg, 0,32 mmol) em DMF/H2O (9:1, 0,60 ml), foi adicionado EDCI (61 mg, 0,32 mmol). A mistura de reação foi agitada por 8 h à temperatura ambiente, filtrada e concentrada in vacuo. A mistura bruta foi purificada por HPLC de fase reversa C18 [coluna: Luna® (100 Å, 10 m, 250 x 10 mm), solventes: 5:95 de MeOH:0,05M NH4HCO3 em H2O, taxa de fluxo: 3,0 ml/min, UV: 254 nm] para gerar 29 (30 mg, 0,061 mmol, 95%, tempo de retenção: 6,7 min): TLC (n-butanol/etanol/CHCl3/28% de amônia aquosa 4:7:2:7) Rf = 0,10; []22D +0,168 (c = 0,26, metanol); IR (película fina) max = 3298 (br), 2923, 2852, 1677, 1632, 1464,

1405, 1272, 1112, 1061 cm−1; 1H RMN (400 MHz, D2O) δ 7,70 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,84 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 5,18 (s, 1H), 4,37 (dd, J = 5,6, 2,8 Hz, 1H), 4,26 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 4,20 (dd, J = 7,5, 4,8 Hz, 1H), 4,13 – 4,06 (m, 3H), 3,94 – 3,75 (m, 1H), 3,31 (d, J = 13,4 Hz, 1H), 3,12 – 3,06 (m, 1H), 3,01 (dt, J = 6,9, 3,4 Hz, 2H), 2,95 – 2,83 (m, 1H), 2,83 – 2,68 (m, 1H), 1,93 – 1,80 (m, 2H); 13C RMN (101 MHz, D2O) δ 166,19, 163,11, 162,76, 151,29, 142,38, 108,44, 101,89, 91,71, 83,25, 78,45, 74,44, 72,81, 71,54, 69,33, 62,08, 44,89, 42,07, 37,52; HRMS (ESI+) m/z calculado para C19H33N6O10 [M + H] 505,2258, encontrado: 505,2272.

Etapa 2

[0149] A uma solução agitada de 29 (8,1 mg, 0,016 mmol), Cu(OAc)2 (1,0M em H2O, 0,048 ml, 0,048 mmol), e NaOH (1,0M em H2O, 0,048 ml, 0,048 mmol) em H2O-MeOH-DMF (1:1:1, 0,6 ml), foi adicionado Boc2O (8,7 mg, 0,040 mmol). A mistura de reação foi agitada por 4 h à temperatura ambiente, filtrada e concentrada in vacuo.

A mistura bruta foi purificada por HPLC de fase reversa C18 [coluna: Luna® (100 Å, 10 m, 250 x 10 mm), solventes: 25:75 de MeOH:0,05M NH4HCO3 em H2O, taxa de fluxo: 3,0 ml/min, UV: 254 nm] para gerar 30 (8,8 mg, 0,015 mmol, 91%, tempo de retenção: 13,0 min): TLC (CHCl3/MeOH/H2O/28% de amônia aquosa 56:42:7:3) Rf = 0,10; IR (película fina) max = 3329 (br), 3312 (br), 2979, 2929, 1678, 1572, 1508, 1459, 1392, 1367, 1279, 1131, 1115, 1077, 1057, 1018 cm−1; 1H RMN (400 MHz, D2O) δ 7,76 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 5,79 (s, 1H), 5,76 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 5,05 (s, 1H), 4,25 – 4,13 (m, 3H), 4,03 (dd, J = 10,5, 6,8 Hz, 3H), 3,52 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 3,36 – 3,31 (m, 2H), 3,29 (s, 1H), 2,97 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 2,65 (t, J = 7,1 Hz, 2H), 1,82 – 1,73 (m, 2H), 1,34 (s, 9H); 13C RMN (101 MHz, D2O) δ 176,10, 161,92, 161,73, 160,96, 146,67, 140,44, 109,60, 102,04, 90,59, 90,39, 82,37, 81,77, 80,86, 79,92, 75,26, 74,88, 41,07, 38,32, 38,19, 27,69 (3C); HRMS (ESI+) m/z calculado para C 24H41N6O12 [M + H] 605,2782, encontrado: 605,2795.

Etapa 3

[0150] A uma solução agitada de 30 (4,3 mg, 7,1 moles) e 31 (9,8 mg, 0,021 mmol) em DMF-CH2Cl2 (1:1, 0,2 ml), foi adicionado Et3N (4,7 L, 0,036 mmol) à temperatura ambiente. A mistura de reação foi agitada por 12 h à temperatura ambiente, e todos os solventes voláteis foram evaporados in vacuo. A mistura bruta foi passada em uma cromatografia de coluna de sílica gel (EtOAc para CHCl3/MeOH/H2O/28% de amônia aquosa 56:42:7:3) para gerar 32 (6,4 mg, 6,4 moles, 90%). TLC (CHCl3/MeOH/H2O/28% de amônia aquosa 56:42:7:3) Rf = 0,55; [α]21D +0,086 (c = 0,17, metanol); IR (película fina) max = 3325 (br), 2930, 2855, 1678, 1553, 1505, 1267, 1242, 1197, 1163, 1113, 1033 cm−1; 1H RMN (400 MHz, MeOD) δ 7,92 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,21 – 7,16 (m, 4H), 7,01 – 6,95 (m, 6H), 5,82 (s, 1H), 5,75 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,10 (s, 1H), 4,53 (dd, J = 7,8, 4,0 Hz, 2H), 4,34 (s, 1H), 4,26 (s, 2H), 4,22 (s, 1H), 4,19 – 4,15 (m, 2H), 4,06 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 3,98 – 3,94 (m, 2H), 3,93 (s, 1H), 3,52 – 3,44 (m, 4H), 3,26 – 3,20 (m, 1H), 3,08 (ddd, J = 12,2, 8,6, 3,1 Hz, 4H), 2,15 – 2,06 (m, 2H), 1,91 – 1,82 (m, 2H), 1,44 (s, 9H); 13C RMN (101 MHz, MeOD) δ 173,09, 172,96, 158,76, 157,79, 157,63, 152,17, 152,09, 131,12, 130,54 (2C), 130,43, 129,63 (2C), 129,23, 123,85, 123,58, 121,89, 120,53, 120,32, 118,20, 118,11 (2C), 118,02, 117,15 (2C), 76,68, 74,01, 73,34, 71,10, 43,80, 31,62, 31,49, 28,89 (3C), 28,75, 23,77, 22,54; HRMS (ESI+) m/z calculado para C44H60F3N8O15 [M + H] 997,4130, encontrado: 997,4168.

Etapa 4

[0151] A uma solução agitada de 32 (6,4 mg, 6,4 moles) em CH2Cl2 (0,35 ml), foi adicionado TFA (0,15 ml). A mistura de reação foi agitada por 3 h à temperatura ambiente, e todos os solventes voláteis foram evaporados in vacuo. A mistura bruta foi purificada por resina de troca iônica DOWEX (50W x 4). A resina foi lavada com MeOH/H2O (4:1) e MeOH. O produto bruto (sal TFA) foi dissolvido em MeOH (10 ml) e absorvido em DOWEX (50W x 4). As resinas foram lavadas com MeOH e eluídas com MeOH/50% de amônia aquosa (10:1). O eluente foi concentrado sob pressão reduzida e a solução aquosa resultante foi liofilizado para gerar 8 (5,7 mg, 6,4 moles, 100%): TLC (CHCl3/MeOH/H2O/28% de amônia aquosa 56:42:7:3) Rf = 0,35; [α]20D +0,037 (c = 0,05, metanol); IR (película fina) max = 3310 (br), 3077, 2928, 2853, 1649, 1614, 1555, 1515, 1504, 1267, 1241, 1222, 1196, 1162, 1112, 1037, 1029 cm −1; 1H RMN (400 MHz, MeOD) δ 7,84 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,22 – 7,15 (m, 4H), 7,06 – 6,96 (m, 6H), 5,79 (s, 1H), 5,74 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,13 (s, 1H), 4,58 – 4,51 (m, 2H), 4,26 (s, 1H), 4,23 – 4,20 (m, 1H), 4,19 – 4,14 (m, 2H), 4,10 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 3,97 – 3,94 (m, 1H), 3,47 (d, J = 10,7 Hz, 2H), 3,40 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 3,23 (t, J = 6,7 Hz, 2H), 3,07 (ddd, J = 12,5, 8,5, 3,6 Hz, 2H), 2,90 (dd, J = 13,3, 3,8 Hz, 1H), 2,80 (dd, J = 13,3, 7,2 Hz, 1H), 2,70 – 2,55 (m, 2H), 2,17 – 2,05 (m, 2H), 1,92 – 1,82 (m, 2H), 1,69 – 1,60 (m, 2H); 13C RMN (101 MHz, MeOD) δ 158,76, 157,63, 152,09, 143,91, 131,12, 130,54 (2C), 130,43, 129,63 (2C), 129,24, 123,85, 123,59, 121,89, 120,53, 120,32, 118,19, 118,11 (2C), 118,03, 117,16 (2C), 102,63, 76,69, 74,01, 73,35, 43,80, 31,62, 31,49, 28,92, 22,53; HRMS (ESI+) m/z calculado para C39H52F3N8O13 [M + H] 897,3606, encontrado: 897,3629.

Exemplo 5: Inibição de Enzima

[0152] Preparação de esporos. C. difficile (ATCC43596) foi inoculada em placa de ágar BHI e incubada a 37ºC sob condição anaeróbica por 7 dias. Os esporos foram coletados do ágar usando água destilada estéril e purificados de acordo com os procedimentos descritos na literatura. As formas vegetativas de C. difficile foram mortas após aquecimento a 50ºC por 30 min. Os esporos preparados foram suspensos em água destilada estéril a 4ºC.

[0153] Ensaios de Concentração Inibitória Mínima. Uma única colônia de C.

difficile (ATCC43596) foi cultivada em uma placa de ágar BHI. Culturas de sementes e culturas maiores foram obtidas utilizando caldo BHI. Os frascos foram incubados anaerobicamente por 48 h a 37ºC e cultivados até a fase logarítmica média (OD600 0,4). Os inibidores foram dissolvidos em polietileno glicol 300-H2O (1/1, uma concentração final de 1 mg por 100 μl). Essa concentração foi usada como solução estoque para todos os estudos. As culturas bacterianas foram tratadas com diluições em série de inibidores e incubadas a 37ºC por 48 h. A MIC foi determinada por um leitor de placas de 96 cavidades (Biotek Synergy XT (Winooski, VT, EUA) a 570 nm e 600 nm. Se necessário, as bactérias viáveis em cada cavidade (placa de 96 cavidades) foram medidas através de unidade de formação de colônias (CFU) em placa de ágar BHI As medições de absorbância também foram realizadas utilizando um leitor de placas de 96 cavidades Biotek Synergy XT (Winooski, VT, EUA), a 570 nm e 600 nm.

[0154] Teste de viabilidade de esporos. uma solução de composto de teste foi adicionada a uma suspensão contendo esporos C. difficile (2 x 105 ml-1), e a mistura foi incubada a 37ºC por 24 h. A suspensão de esporos tratada com o composto de teste foi centrifugada (x4,700 g) e o pélete foi lavado com água destilada estéril, e plaqueado em ágar BHI contendo taurocolato de sódio a 0,1% (agente germinativo) e incubado a 37ºC por 48 h sob condições anaeróbicas. As colônias resultantes foram contadas.

[0155] Ensaio WecA. UDP-Glucosamina-C6-FITC (2 mM de solução estoque, 0,56 l), MgCl2 (0,5 M, 4 l), β-mercaptoetanol (50 mM, 5 l), CHAPS (5%, 11,25 l), tampão Tris (pH 8,0, 50 mM), undecaprenil fosfato (4 mM, 1,4 l), e molécula inibitória (0 - 100 g/ml em tampão Tris) foram colocados em um tubo Eppendorf de 500 l. A uma mistura de reação agitada, P-60 (10 l) foi adicionado (volume total da mistura de reação: ajuste de 50 l com tampão Tris). A mistura de reação foi incubada por 4 horas a 37ºC e resfriada bruscamente com n-butanol (150 l). Duas fases foram misturadas via vórtice e centrifugadas a 10.000 xg por 3 min. A fase orgânica superior foi testada por HPLC de fase reversa. A fase orgânica (30 l) foi injetada em HPLC (solvente: eluição de gradiente de 85:15 a 95:5 de MeOH/0,05 M de NH4HCO3 aq.; UV: 485 nm; taxa de fluxo: 0,5 ml/min ; coluna: Kinetex 5 m C8, 100 Å, 150 x 4,60 mm) e a área do pico para C55-PP-glucosamina-C6-FITC foi quantificada para obter o valor de IC50. Os valores de IC50 foram calculados a partir de plotagens da percentagem de inibição de produto versus a concentração de inibidor.

[0156] Ensaio MraY. O nucleotídeo de Park- Nε -C6-dansil (2 mM de solução estoque, 1,88 μl), MgCl2 (0,5 M, 5 μl), KCl (2 M, 5 μl), Triton X-100 (0,5%, 5,63 μl), tampão Tris (pH 8,0, 50 mM), neril fosfato (0,1 M, 2,25 μl) e molécula inibitória (0 a 100 μg/ml em tampão Tris) foram colocados em um tubo Eppendorf de 500 μl. Para uma mistura de reação agitada, P-60 (10μl) foi adicionado (volume total da mistura de reação: ajuste de 50 μl com tampão Tris). A mistura de reação foi incubada por 2 h à temperatura ambiente (26ºC) e resfriada bruscamente com CHCl3 (100μl). Duas fases foram misturadas por vórtice e centrifugadas a 25.000 xg por 10 min. A fase aquosa superior foi testada por HPLC de fase reversa. A fase aquosa (10 μl) foi injetada em HPLC (solvente: CH3CN/0,05 M de NH4HCO3 = 25:75; UV: 350 nm; taxa de fluxo: 0,5 ml/min; coluna: Kinetex 5μm C8, 100 Å, 150 x 4,60 mm), e a área do pico para derivado de lipídio I-neril foi quantificada para obter o valor de IC50. Os valores de IC50 foram calculados a partir de plotagens da porcentagem de inibição de produto versus a concentração de inibidor.

Tabela 1. C.difficile Inibição de Inibição de Composto ATCC43596 MIC WecA IC50 (μM) WraY IC50 (μM) (μg/ml) FR-900493 (1) 5 25 >50 9 0,85 0,69 25 10 12,5 0,25 12,5 11 0,32 0,08 3,25 12 12,3 7,7 50 Tunicamicina 0,15 3,38 >50

[0157] Os valores de IC50 dos compostos 9 a 12 foram medidos em comparação com outros agentes antibacterianos conhecidos (Tabela 1).

Surpreendentemente, FR-900493 (1) exibiu uma atividade inibitória de MraY fraca (IC50 25,0 M), mas uma atividade inibitória de WecA moderada (IC50 5,0 M). Os quatro compostos (9, 10, 11 e 12) foram identificados como exibindo atividade anti-C.

difficile. Os análogos de N-metil, 9 e 12, exibiram fraca atividade inibitória de crescimento anti-C. difficile, embora sua atividade inibitória de MraY tenha sido 30 e 3 vezes mais potente do que a de FR-900493 (1). Em nítido contraste, os análogos de de-N-metil, 10 e 11, foram mais de 100 e 300 vezes mais significativos na atividade inibitória de MraY do que 1. A atividade inibitória de WecA de 11 foi cerca de 15 vezes mais significativa do que 1, no entanto, a inibição da enzima MraY pode ser atribuída à atividade anti-C. difficile; um inibidor fraco de WecA 10 exibiu uma atividade bactericida contra o estado vegetativo de C. difficile. Surpreendentemente, 11 demonstrou ser um inibidor muito forte de MraY/WecA, cuja atividade foi significativamente melhor do que tunicamicina, um antibiótico inibidor de MraY/WecA conhecido. A atividade anti-C.difficile está bem correlacionada com a atividade inibitória enzimática de MraY; 11 e 10 exibiram o valor de MIC de 3,25 e 12,5 µg / ml, respectivamente contra C. difficile (por exemplo, MICs 2,5 µg/ml para vancomicina).

[0158] O efeito de 9, 10 e 11 nos esporos de C. difficile foi determinado pela contagem de unidades formadoras de colônias (CFUs) da germinação de esporos nas placas de ágar contendo taurocolato após o tratamento dos esporos de C. difficile com esses análogos (x2 MIC) por 24 horas. Os esporos de C. difficile mostram resistência aos agentes anti-C.difficile mais conhecidos. De fato, nesses estudos, vancomicina, metronidazol e linezolida não inibiram a germinação de esporos, mesmo na x5 MIC.

Pelo contrário, os novos inibidores de MraY 9, 10 e 11 causaram perda de viabilidade de esporos de C. difficile em x2 MIC (Figura 3).

Exemplo 6: Inibição de WecA

[0159] Ensaios de Citotoxicidade. Os ensaios de citotoxicidade foram realizados utilizando linhagens celulares de rim de macaco Vero (ATCC CCL-81) e de hepatoblastoma humano HepG2 (ATCC HB-8065). As células Vero ou HepG2 foram cultivadas em frascos de 75 cm2 e transferidas para placas de cultura de 96 cavidades usando o meio essencial mínimo de Eagle formulado por ATCC contendo 10% de FBS, penicilina e estreptomicina. Alíquotas diluídas em série de cada composto de teste em concentrações variando de 0,78–200 g/ml foram armazenadas às células.

Os compostos de controle com toxicidade conhecida, tais como tunicamicina, colistina ou tobramicina foram incluídos em cada placa. As placas foram incubadas e os efeitos citotóxicos foram determinados através de ensaio MTT.

[0160] Ensaio de AglH. Ensaios de AglH foram realizados como o procedimento para ensaios de WecA, mas usaram MjAglH e α-di-hidroundecaprenil fosfato em vez de WecA e undecaprenil fosfato.

Tabela 2. Inibição de WecA IC50 IC50 de inibição IC50 de IC50 de (M) de AgIH (M) Células hemólise Composto M. E. coli M. jannaschii Vero (M) sangue smegmatis WecA AgIH (M) de ovelha WecA 10 12,5 12,5 12,5 7,08 70 11 0,32 0,25 3,61 56,8 205,8 Tunicamicina 0,15 0,15 13,27 0,12 15

[0161] O Composto 11 exibiu características físico-químicas superiores aos outros compostos testados (Tabela 2); 1) a solubilidade em água de 11 (22 mg/ml) é 200 vezes maior do que de 10, 2) 11 exibiu aproximadamente 450 vezes menos citotoxicidade do que Tunicamicina contra células Vero (IC50 56,8 M para 11 versus 0,12 M para Tunicamicina), e 3) 11 apresentou indução relativamente baixa de hemólise (IC50 205,6 M), enquanto Tunicamicina causou lise de células sanguíneas em uma concentração muito menor que 11. Curiosamente, 11 apresentou uma atividade inibitória de AglH relativamente mais forte (IC 50 3,61 M) do que 10 e tunicamicina, no entanto, o nível de IC50 de 11 contra células Vero foi significativamente maior do que o de 10 e tunicamicina. O composto 11 também apresentou atividade antibacteriana contra C. difficile, C. perfringens e B. subtilis (linha vermelha na Figura 4).

Exemplo 7: Citotoxicidade contra células cancerosas

[0162] Moléculas selecionadas foram testadas quanto à citotoxicidade (IC 50) em células saudáveis e de câncer através de um ensaio colorimétrico MTT. Os resultados são mostrados nas Tabelas 3 e 4.

[0163] Ensaios de citotoxicidade. Para células Vero: a célula Vero foi cultivada em meio de crescimento essencial mínimo completo de Eagle (EMEM) contendo L- glutamina, piruvato de sódio, aminoácidos essenciais mínimos, penicilina- estreptomicina e soro fetal bovino a 10%. O número de células inoculadas foi de

400.000 células/ml e 40.000 células/cavidade final. Após 72 horas de exposição das moléculas a essa linhagem celular em concentrações variando de 0,78 a 200 µg/ml, o meio de cultura foi alterado para completar EMEM sem vermelho de fenol antes da adição do corante de tetrazólio amarelo; MTT. A viabilidade foi avaliada com base na conversão celular de MTT em um produto de formazana roxo. A absorvância do produto de formazana colorido foi medida a 570 nm pelo espectrofotômetro BioTek Synergy HT. A linearidade da resposta MTT para o número de células foi determinada.

[0164] Cada célula foi cultivada em meio recomendado pela ATCC, e os dados de IC50 foram obtidos com cada linhagem celular.

Tabela 3 Citotoxicidade IC50 (M) Linhagens celulares MDA-MB- Moléculas L12210 KB LoVo SK-OV-3 Vero 435S Composto 11 >100 7,09 0,22 2,85 7,09 >65,0 Tunicamicina 1,7 2,5 1,7 1,85 0,9 0,12 Mitomicina C 25 9,34 0,3 18,7 4,7 4,67 Taxol 0,55 0,79 0,057 1,08 0,11 0,19 Tabela 4

Citotoxicidade IC50 (M) Linhagens celulares Moléculas AsPc-1 Panc-1 HPAF-II HCT 116 HepG2 Caco-2 Composto 11 0,95 <0,098 <0,098 3,54 >60 >60 Tunicamicina 0,46 0,625 <0,098 0,92 0,19 0,95 Mitomicina C 1,16 - - 2,33 2,33 5,5 Taxol 0,19 0,02 0,02 - - -

[0165] O composto 11 exibiu forte atividade citotóxica em muitas das linhagens de câncer testadas. Diferentemente dos outros compostos testados (Tunicamicina, Mitomicina C e Taxol), 11 teve poucos efeitos citotóxicos em células Vero não cancerosas, saudáveis. O composto 11 também exibiu citotoxicidade seletiva para células Panc-1 sobre células HPNE saudáveis (>1:350, IC 50 de HPNE/IC50 de Panc-1).

[0166] A atividade citotóxica de 11 contra células AsPc-1 e Panc-1 também foi medida através de ensaios de viabilidade celular (Figura 5). Quase todas as células AsPc-1 foram mortas após 4 dias na presença de 11 em concentrações variadas (1,77  M, 3,54 M e 14,17 M). Da mesma forma, a porcentagem de células Panc-1 viáveis foi quase nula após cerca de 3 dias na presença de 11 (0,44 M, 1,77 M e 7,08 M).

[0167] Acredita-se que o efeito anticâncer de 11 seja devido à sua capacidade de inibir DPAGT1, uma enzima essencial na biossíntese de glicoproteína, com um valor de IC50 de 0,26 M (Figura 6). Inibindo DPAGT1, a N-glicosilação de β-catenina também é inibida. A superexpressão de β-Catenina é associada a muitos cânceres, e 11 demonstrou inibir a N-glicosilação de β-catenina em concentrações tão baixas quanto 0,39 nM. Essa inibição de DPAGT1 e subsequente inibição de N-glicosilação pode fornecer ainda informações sobre o mecanismo de ação dos compostos da invenção.

[0168] A atividade citotóxica de 11 contra células Panc-1 e células AsPc-1 também foi determinada por meio de ensaios de migração de Câmara de Borden

(Figuras 7 e 8) e ensaios de fechamento de lesão (cicatrização de feridas) (Figura 9).

O composto 11 resultou em menos células migratórias Panc-1 do que Gemcitabina, Taxol e Tunicamicina (Figura 7). Resultados semelhantes foram observados em células AsPc-1 (Figura 8). Em ensaios de fechamento de lesão, o tratamento com 11 resultou em menos migração celular de AsPc-1 do que Gemcitabina, enquanto a migração celular de Panc-1 foi semelhante à de Gemcitabina (Figura 9).

Exemplo 8: Efeitos sinérgicos com o composto 11 e paclitaxel (taxol)

[0169] Ensaio sinérgico. As atividades sinérgicas ou antagonísticas de 11 com outras drogas contra o câncer foram avaliadas in vitro por meio da técnica de microdiluição em caldo do tabuleiro de xadrez previamente relatada. O índice FIC foi calculado de acordo com a seguinte equação. ΣFIC = FICA + FICB = CA/MICA + CB/MICB, em que MICA e MICB são MIC de drogas A e B, CA e CB são as concentrações de drogas A e B usadas em combinação. Nesses estudos de interação, ΣFIC inferior a 0,5 representa atividade sinérgica. Os resultados são mostrados na Tabela 5.

Tabela 5 IC50 A (nM) Ʃ Entrada Combinação de A e B CA e CB (nM) IC50 B (nM) FIC A: 11 982 14,2 1 0,224 B: Paclitaxel 550 0,4 A: 11 982 14 2 0,16 B: Paclitaxel 550 0,88 A: 11 982 14 3 0,27 B: Paclitaxel 550 7 A: 11 982 220 4 0,224 B: Paclitaxel 550 40 A: 11 982 110 5 0,114 B: Paclitaxel 550 88

[0170] O índice FIC é considerado uma boa medida de sinergia. Um valor de FIC inferior a 0,5 indica que a combinação de compostos produz um efeito sinérgico que é maior que a soma dos efeitos dos compostos isolados (isto é, mais do que um efeito aditivo). Surpreendentemente, todas as cinco combinações de 11 e Taxol resultaram em um efeito sinérgico. Quando combinado com 11, Taxol pode ser usado em concentrações tão baixas quanto 7 nM para matar células AsPc-1.

[0171] Esses resultados podem ser benéficos do ponto de vista clínico. Como mostrado na Tabela 3, 11 tem pouco efeito sobre células saudáveis, enquanto Taxol é tóxico para todas as células que se dividem no corpo, independentemente de as células serem cancerosas ou não. Os resultados das combinações químicas na Tabela 5 implicam que Taxol pode ser utilizado em concentrações mais baixas para alcançar o mesmo grau de efeito terapêutico, diminuindo assim os efeitos adversos típicos de um tratamento de câncer com Taxol sozinho.

Exemplo 8: Efeitos sinérgicos com o composto 11 e Gemcitabina

[0172] O efeito do tratamento de células AsPc-1 com várias combinações de Composto 11 e Gemcitabina foi medido. Esses experimentos foram realizados da mesma maneira que os do Exemplo 7. Os resultados são mostrados nas Tabelas 6 e

7.

Tabela 6 IC50 A (M) Entrada Combinação de A e B CA e CB (M) Ʃ FIC IC50 B (M) A: 11 0,98 0,055 1 0,3 B: Gemcitabina 0,39 0,37 A: 11 0,98 0,22 2 0,47 B: Gemcitabina 0,39 0,37 Tabela 7 Concentração de Composto 11 (M) 0,78125 0,390625 0,1953125 0,0976563 0,0488281 0,390625 mortas mortas mortas mortas mortas Conc. de Gemcitabina mortas mortas mortas mortas mortas 0,195313 (M) mortas mortas mortas mortas mortas 0,097656 vivas vivas vivas vivas vivas 0,048828 vivas vivas vivas vivas vivas 0,024414

[0173] Novamente, ambas as combinações testadas produziram um efeito sinérgico, como mostrado pelos valores de FIC. Os dados da Tabela 7 ainda demonstram a atividade citotóxica 11 e Gemcitabina contra células AsPc-1, em que concentrações tão baixas quanto 0,0488 M de 11 e 0,977 M de Gemcitabina, resultando em morte celular de AsPc-1.

[0174] Como a Gemcitabina mata todas as células que estão se dividindo rapidamente, alguns efeitos adversos do tratamento com Gemcitabina incluem perda de glóbulos brancos, plaquetas e glóbulos vermelhos, bem como perda de cabelo, náusea e vômito. O efeito sinérgico observado para a combinação de 11 e Gemcitabina indica que concentrações mais baixas de Gemcitabina podem ser administradas com 11 para produzir o mesmo efeito terapêutico que o tratamento de concentrações mais altas de Gemcitabina isoladamente, aliviando assim alguns dos efeitos adversos associados ao tratamento com Gemcitabina.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composto de Fórmula I: HO NH2

O

HO O R1 R2

H

N X N O NH

Y H2 N N

O O O

O HO OH (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; CARACTERIZADO pelo fato de que R1 é C1-C10 alquil ou piperazina-O-Ph, em que Ph é opcionalmente substituído por C1-C4 alquil ou OC1-C4 alquil, em que C1-C4 alquil ou OC1-C4 alquil é opcionalmente ainda substituído por 1, 2 ou 3 halo; R2 é H ou C1-C6 alquil; X é selecionado do grupo que consiste em ausente, -(CH2)m-, e -NH-; Y é ausente ou -(CH2)n-; e m e n são, independentemente em cada ocorrência, 1, 2 ou 3.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 é ; X é ausente; e Y é -CH2-.

3. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto de Fórmula I é:

.

4. Composto, de acordo com a reivindicação 3, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto tem a seguinte estereoquímica: .

5. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto de Fórmula I é: .

6. Composto, de acordo com a reivindicação 5, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto tem a seguinte estereoquímica:

.

7. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 é C7 alquil; X é ausente; e Y é ausente.

8. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 7, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto de Fórmula I é: .

9. Composto, de acordo com a reivindicação 8, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto tem a seguinte estereoquímica: .

10. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 7, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto de Fórmula I é: .

11. Composto, de acordo com a reivindicação 10, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto tem a seguinte estereoquímica: .

12. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que: R1 é ; X é -NH-; e Y é -CH2-.

13. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 12, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto de Fórmula I é:

HO NH2

O

O O F3 C N HO

O

H H H

N N N O NH H2N N

O O O

O HO OH .

14. Composto, de acordo com a reivindicação 13, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto tem a seguinte estereoquímica: .

15. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, ou um sal do mesmo, e pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável.

16. Método de inibir dolichil-fosfato N-acetilglucosaminafosfotransferase (DPAGT1) em um indivíduo em necessidade do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, ou uma composição, conforme definida na reivindicação 15.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o método ainda compreende administrar um segundo composto.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo composto é taxol.

19. Método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo composto é tunicamicina.

20. Método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo composto é gemcitabina.

21. Método de tratar uma infecção em um indivíduo em necessidade do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, ou uma composição, conforme definida na reivindicação 15.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a infecção é uma infecção bacteriana.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que a infecção bacteriana é causada por Clostridium difficile.

24. Método de tratar câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, ou uma composição, conforme definida na reivindicação 15.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é câncer cervical, câncer de cólon, câncer de ovário, câncer de mama, câncer pancreático, carcinoma ou adenocarcinoma.

26. Processo para preparar uma composição, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um composto de Fórmula III: (III)

compreendendo reagir um composto de Fórmula II: (II) com um reagente de cobre na presença de um solvente e uma base, e ainda reagir o composto de Fórmula II com um reagente de grupo de proteção; em que R2 é H ou C1-C6 alquil; e PG é um grupo de proteção selecionado do grupo que consiste em acetil (Ac), benzil (Bn), terc-butiloxicarbonil (Boc), benzoil (Bz), carboxibenzil (Cbz), carbamato, 3,4-dimetoxi-benzil (DMPM), 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc), p-metoxibenzil carbonil (Moz), 4-nitrobenzilsulfonil (Nos), p-metoxibenzil (PMB), p-metoxifenil (PMP), 4-toluenossulfonil (Tos), e tricloroetil cloroformiato (Troc).

27. Processo, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que o reagente de cobre é selecionado do grupo que consiste em CuSO4, Cu(OAc)2 e CuCl2.

28. Processo, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o reagente de cobre é Cu(OAc)2.

29. Processo, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que a base é hidróxido de sódio.

30. Processo, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que o solvente é uma mistura de dimetilformamida, metanol e água.

31. Processo, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que PG é terc-butiloxicarbonil (Boc).

32. Processo, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que o reagente de grupo de proteção é di-terc-butil dicarbonato (Boc2O).

33. Processo, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que PG é carboxibenzil (Cbz).

34. Processo, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que o reagente de grupo de proteção é benzil cloroformiato.

35. Processo, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que o reagente de grupo de proteção é N-(benziloxicarboniloxi)succinimida.

36. Processo para preparar uma composição, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um composto de Fórmula V: (V) compreendendo reagir um composto de Fórmula III: (III) com um composto de Fórmula IV: (IV) sob condições básicas em um solvente;

em que R2 é H ou C1-C6 alquil; PG é um grupo de proteção selecionado do grupo que consiste em acetil (Ac), benzil (Bn), terc-butiloxicarbonil (Boc), benzoil (Bz), carboxibenzil (Cbz), carbamato, 3,4-dimetoxi-benzil (DMPM), 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc), p-metoxibenzil carbonil (Moz), 4-nitrobenzilsulfonil (Nos), p-metoxibenzil (PMB), p-metoxifenil (PMP), 4-toluenossulfonil (Tos), e tricloroetil cloroformiato (Troc); e R3 é selecionado do grupo que consiste em OC1-C4 alquil, tosilato, mesilato, iodeto, brometo, cloreto, imidazol e triflato.

37. Processo, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato de que R3 é imidazol.

38. Processo, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato de que a base é trietilamina.

39. Processo, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato de que o solvente é uma mistura de dimetilformamida e diclorometano.

40. Processo para preparar uma composição, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um composto de Fórmula I: HO NH2

O

HO O R1 R2

H

N X N O NH

Y H2 N N

O O O

O HO OH (I) compreendendo tratar um composto de Fórmula V:

(V) com um ácido em um solvente; em que: R1 é piperazina-O-Ph, em que Ph é opcionalmente substituído por C1-C4 alquil ou OC1-C4 alquil, em que OC1-C4 alquil é opcionalmente ainda substituído por 1, 2 ou 3 halo; R2 é H ou C1-C6 alquil; X é -NH-; Y é -(CH2)n-; PG é um grupo de proteção selecionado do grupo que consiste em acetil (Ac), benzil (Bn), terc-butiloxicarbonil (Boc), benzoil (Bz), carboxibenzil (Cbz), carbamato, 3,4-dimetoxi-benzil (DMPM), 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc), p-metoxibenzil carbonil (Moz), 4-nitrobenzilsulfonil (Nos), p-metoxibenzil (PMB), p-metoxifenil (PMP), 4-toluenossulfonil (Tos), e tricloroetil cloroformiato (Troc); e n é 1.

41. Processo, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido é ácido trifluoroacético.

42. Processo, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de que o solvente é diclorometano.