BR112020014068B1 - Microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno,método, enchimento, seringa pré-enchida e uso - Google Patents

Abstract

A presente descrição se refere a um enchimento de microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno, um enchimento que inclui o mesmo e um método de preparação para o mesmo. É fornecido um enchimento de microesfera de policaprolactona obtido por encapsulação de peptídeo de colágeno em microesferas de policaprolactona, que, quando injetadas em um corpo vivo, exibem um rápido efeito de formação de colágeno, bem como uma alta propriedade de restauração tecidual e mantêm os efeitos por um longo período de tempo, mostrando assim excelentes propriedades de restauração ou expansão de volume dos tecidos moles, tais como, bochechas, seios, nariz, lábios e nádegas e redução de rugas.

Description

[Campo Técnico] REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Esse pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Coreano N° 10-2018-0003585 depositado em 10 de janeiro de 2018 no Escritório Coreano de Propriedade Intelectual, cuja descrição é incorporada nesse documento por referência na sua totalidade.

[002] A presente descrição se refere a um enchimento de microesferas de policaprolactona e a um método para prepará-lo, e mais particularmente, a um enchimento de microesferas de policaprolactona que não apenas resolveu os problemas de estabilidade in vivo do peptídeo de colágeno contendo peptídeo de colágeno nas mesmas, mas também quando aplicado a um corpo vivo, exibe rapidamente efeitos de regeneração de colágeno e aumento de volume após o tratamento, além de manter os efeitos por um longo período de tempo, e um método para preparar o mesmo.

[Fundamentos da Técnica]

[003] Os enchimentos dérmicos são um instrumento médico do tipo injeção que injeta materiais seguros para o corpo humano em uma camada dérmica do rosto para reabastecer os tecidos dérmicos, tal como melhorar rugas e volume na aparência estética, e são usados nos chamados tratamentos antienvelhecimento, incluindo toxina botulínica (Botox®), transplante autólogo de gordura, levantamento de linhas de expressão, microagulhamento, tratamento a laser, dermoabrasão e semelhantes.

[004] O enchimento dérmico de primeira geração que foi desenvolvido pela primeira vez é um enchimento de colágeno derivado de animais e raramente é usado nos últimos anos porque a duração do efeito após o tratamento é curta de 2 a 4 meses e é problemático que os testes de reação de hipersensibilidade dérmica devam ser realizados um mês antes do tratamento.

[005] O enchimento dérmico de segunda geração é um enchimento com ácido hialurônico, e atualmente é o enchimento mais frequentemente usado, pois tem um efeito de duração mais longo que o enchimento com colágeno, e tem significativamente menos efeitos colaterais, tais como, reações de hipersensibilidade dérmica, pois é composto de polissacarídeos semelhantes aos componentes do corpo humano e, portanto, não requerem testes de reação dérmica, tais como enchimentos de colágeno. Em particular, o ácido hialurônico é fácil de tratar e remover, tem excelente viscoelasticidade, mantém a umidade, o volume e a elasticidade da pele, o que é, portanto, muito adequado como matéria-prima para enchimentos dérmicos. Recentemente, estudos foram ativamente conduzidos para prolongar a duração do efeito, induzindo a reticulação do ácido hialurônico para aumentar o tamanho das partículas e o peso molecular, mas como a duração do efeito é relativamente curta de 6 a 12 meses, é um problema que os tratamentos devam ser repetidos a cada 6 a 12 meses.

[006] O enchimento dérmico de terceira geração, que é um enchimento de polímero sintético, tal como ácido polilático (PLA) ou policaprolactona (PCL), é decomposto muito gradualmente no corpo humano e, portanto, é usado com a finalidade de exibir uma maior duração do efeito em comparação com os enchimentos de colágeno e ácido hialurônico que são enchimentos absorventes. Em particular, a policaprolactona é 100% absorvida pelo corpo humano e, portanto, é um componente seguro e é vantajosa, pois é absorvida mais lentamente que o ácido polilático após ser implantada na pele, promove a produção de colágeno e dura o efeito de 1 a 4 anos como um tecido macio, sem sensação de matéria estranha. No entanto, o enchimento de policaprolactona é um enchimento na forma de uma microesfera e deve ser administrado suspendendo-o em um carreador de gel, tal como a carboximetilcelulose (CMC), e mostra os efeitos somente após 6-8 semanas após a injeção na pele. Assim, isso é desvantajoso, pois a satisfação do tratamento é menor que a do enchimento de ácido hialurônico, mostrando um efeito imediato após o tratamento.

[007] Enquanto isso, sabe-se que peptídeos bioativos, tais como KTTKS, são substâncias derivadas de colágeno, que inibem a síntese de colagenase ou promovem a produção de matriz extracelular (MEC) e promovem a expressão de colágeno tipo I e III e fibronectina. No entanto, é um fato que, devido à baixa estabilidade in vivo de peptídeos e à baixa permeabilidade na pele, os peptídeos bioativos são usados restritamente a cosméticos e semelhantes com o objetivo de melhorar as rugas e de regenerar a pele utilizando vários derivados.

[008] Portanto, há uma necessidade de desenvolver um novo enchimento de micropartículas de policaprolactona com eficácia aprimorada, resolvendo o problema de estabilidade in vivo do peptídeo de colágeno, utilizando as propriedades do enchimento de micropartículas de policaprolactona existente e encapsulando o peptídeo de colágeno com microesferas de policaprolactona.

[DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO] [Problema Técnico]

[009] A presente descrição foi planejada para resolver os problemas de estabilidade in vivo acima mencionados do peptídeo de colágeno e melhorar a eficácia do enchimento de microesferas de policaprolactona, e é um objetivo da presente descrição fornecer uma microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno que, quando aplicada a um corpo vivo, exibe rapidamente efeitos após o tratamento e mantém os efeitos por um longo período de tempo, e um enchimento que compreende a mesma e um método para prepará-la.

[Solução Técnica]

[0010] De modo a alcançar os objetos acima, um aspecto da presente descrição fornece uma microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno que compreende 0,01 a 7% em peso do colágeno com base no peso total da microesfera, e tem um tamanho médio de partícula de 10 a 100 μm.

[0011] Em outro aspecto da presente descrição, é fornecido um método para preparar uma microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno, que compreende as etapas de: (a) preparar uma fase dispersa dissolvendo policaprolactona em um primeiro solvente e dissolver peptídeo de colágeno em um segundo solvente preparar cada solução e, em seguida, misturar uniformemente as duas soluções para preparar uma única solução; (b) preparar uma emulsão misturando a fase dispersa com uma solução aquosa (fase contínua) contendo um tensoativo para preparar uma emulsão; (c) formar uma microesfera extraindo e evaporando solventes orgânicos da fase dispersa em uma fase contínua na emulsão preparada na etapa (b); e (d) recuperar a microesfera da fase contínua da etapa (c).

[0012] De acordo com ainda outro aspecto da presente descrição, é fornecido um enchimento que compreende a microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno da presente descrição; e um carreador aquoso farmaceuticamente aceitável e uma microesfera de policaprolactona.

[EFEITOS VANTAJOSOS]

[0013] O enchimento que compreende a microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno, de acordo com a presente descrição, não apenas exibe um rápido efeito de formação de colágeno quando aplicado a um corpo vivo e exibe uma alta propriedade de restauração de tecidos, mas também mantém os efeitos por um longo período de tempo, desse modo mostrando excelentes propriedades de restauração ou expansão de volume dos tecidos moles, tais como, bochechas, seios, nariz, lábios e nádegas ou melhoria das rugas.

[BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS]

[0014] A FIG. 1a é uma fotografia da forma da microesfera de policaprolactona contendo palmitoil-KTTKS (Palmitoil-KTTKS) preparado de acordo com o Exemplo 1-1, tirada por um microscópio óptico. Como pode ser visto na fotografia, pode ser confirmado que as microesferas produzidas mantêm uma forma esférica e o tamanho da partícula pode ser ajustado dependendo do diâmetro da membrana usada na produção.

[0015] A FIG. 1b é uma fotografia do formato da microesfera de policaprolactona contendo palmitoil-KTTKS preparada usando excesso de ácido ascórbico de acordo com o Exemplo Comparativo 3-1, tirada por um microscópio óptico. Como pode ser visto na fotografia, pode ser confirmado que as microesferas produzidas mantêm um formato esférico e o tamanho da partícula pode ser ajustado dependendo do diâmetro da membrana usada na produção.

[0016] A FIG. 1c é uma fotografia do formato da microesfera de policaprolactona contendo palmitoil-KTTKS preparada usando excesso de ácido ascórbico de acordo com o Exemplo Comparativo 3-2, tirada por um microscópio óptico. Como pode ser visto na fotografia, pode ser confirmado que as microesferas produzidas mantêm um formato esférico e o tamanho da partícula pode ser ajustado dependendo do diâmetro da membrana usada na produção.

[DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO]

[0017] A seguir, a presente descrição será descrita em mais detalhes.

[0018] O peptídeo de colágeno de acordo com a presente descrição se refere a um peptídeo que exibe um efeito de promoção da regeneração de colágeno in vivo, e pode ser pelo menos um selecionado do grupo que consiste em KTTKS, GHK, AHK e derivados dos mesmos. Exemplos não limitativos de derivados dos peptídeos de colágeno incluem palmitoil-KTTKS, GHK-Cu, AHK-Cu e semelhantes. De preferência, KTTKS, palmitoil-KTTKS, GHK, AHK e misturas dos mesmos podem ser usadas. Mais de preferência, pode ser usado KTTKS ou palmitoil-KTTKS.

[0019] Em uma modalidade, o conteúdo de peptídeo de colágeno (quantidade de encapsulação) na microesfera de policaprolactona da presente descrição pode ser de 0,01 a 7% em peso, de preferência de 0,05 a 6% em peso, com base no peso total da microesfera. Essa quantidade de encapsulamento é otimizada de modo que a atividade fisiológica característica do peptídeo de colágeno possa exibir um efeito sinergístico no sítio injetado, garantindo a estabilidade in vivo do peptídeo de colágeno. Quando a quantidade de encapsulamento do peptídeo de colágeno é menor que 0,01% em peso, o efeito da promoção sinergística da produção de colágeno que pode ser expressado pelo peptídeo de colágeno não aparece suficientemente. Quando a quantidade de encapsulamento do peptídeo de colágeno excede 7% em peso, a eficiência de encapsulamento do peptídeo de colágeno na microesfera de policaprolactona diminui, e o peptídeo de colágeno forma canais não uniformes no interior das microesferas, e o peptídeo de colágeno é rapidamente liberado através da difusão no canal formado, o que não é preferível.

[0020] A microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno da presente descrição é preparada usando policaprolactona na qual uma viscosidade intrínseca da policaprolactona, que é um polímero biodegradável, é de 0,16 a 1,90 dL/g. A viscosidade intrínseca da policaprolactona usada nesse documento se refere à viscosidade intrínseca medida em clorofórmio a 25 °C usando um viscosímetro Ubbelohde. Exemplos do polímero de policaprolactona acima incluem o Resormer C209, C212 e C217 disponível na Evonik, Purasorb PC02, PC04, PC08, PC12 e PC17 disponível na Corbion e semelhantes. Quando a viscosidade intrínseca da policaprolactona usadas é menor que 0,16 dL/g, devido à sua baixa viscosidade, a microesfera de policaprolactona não está bem formada, ou a microesfera é decomposta muito rapidamente quando injetada em um corpo vivo e, portanto, a liberação inicial de peptídeo de colágeno pode ser aumentada rapidamente. Quando a viscosidade excede 1,90 dL/g, a taxa de degradação da microesfera é reduzida quando injetada em um corpo vivo, e devido à influência da taxa de degradação lenta do polímero, a taxa na qual o peptídeo de colágeno na microesfera se espalha no corpo vivo é reduzida, dificultando a exibição de um efeito promotor da produção de colágeno suficiente.

[0021] A microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno, de acordo com a presente descrição, tem um tamanho médio de partícula de 10 μm ou mais e 100 μm ou menos, por exemplo, de preferência 10 a 30 μm, 10 a 50 μm ou 10 a 100 μm, 2 0 a 50 μm, 3 0 a 60 μm ou 4 0 a 7 0 μm. O tamanho médio de partícula usados nesse documento se refere a um diâmetro mediano como o tamanho de partícula correspondente a 50% do volume na curva de distribuição de tamanho de partícula, e é representado por D50 ou D (v, 0,5).

[0022] Quando o tamanho médio de partícula da microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno é menor que 10 μm, ele pode ser fagocitado por macrófagos quando administrado no corpo vivo. Quando o tamanho médio das partículas é maior que 100 μm, a injetabilidade diminui quando injetada com uma seringa, e a agulha da injeção se torna mais espessa, causando mais dor durante a injeção, o que não é preferível.

[0023] De preferência, a microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno de acordo com a presente descrição tem uma distribuição uniforme de partículas. A microesfera tendo uma distribuição uniforme de partículas tem menos desvio na quantidade residual da seringa e da agulha durante a injeção e menos fenômeno de entupimento da agulha de injeção em comparação com uma microesfera não uniforme e, portanto, uma agulha de injeção fina pode ser usada. De preferência, o grau de distribuição de tamanho ou valor de amplitude das microesferas de policaprolactona da presente descrição é de 1,0 ou menos. Mais de preferência, a distribuição de tamanho é 0,8 ou menos. A distribuição de tamanho ou valor de amplitude usados nesse documento é um índice que indica a uniformidade do tamanho de partícula da microesfera, e significa um valor determinado pela fórmula da distribuição de tamanho (valor de amplitude) = (Dv0,9- Dv0,1)/Dv0,5. Nesse documento, Dv0,1 significa um tamanho de partícula correspondente a 10% do volume na curva de distribuição de tamanho de partícula da microesfera, Dv0,5 significa um tamanho de partícula correspondente a 50% do volume na curva de distribuição de tamanho de partícula da microesfera, e Dv0,9 significa um tamanho de partícula correspondente a 90% do volume na curva de distribuição de tamanho de partícula da microesfera. A microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno de acordo com a presente descrição é caracterizada por exibir uma distribuição de tamanho uniforme enquanto exibe um tamanho de partícula de 10 μm ou mais e 100 μm ou menos, reduzindo assim o entupimento da agulha e melhorando a injetabilidade.

[0024] A faixa de tamanho de partícula e os valores de amplitude, como descrito acima, são otimizados de modo a incluir a quantidade de encapsulamento que permite que o peptídeo de colágeno na microesfera de policaprolactona seja eluído em uma quantidade apropriada por um longo período de tempo. As micropartículas de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno, de acordo com a presente descrição, tendo tais características, são caracterizadas pela liberação de uma quantidade eficaz de peptídeo de colágeno por um longo período de tempo. Especificamente, a microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno de acordo com a presente descrição libera gradualmente peptídeo de colágeno por de preferência 30 dias, mais de preferência 35 dias a 42 dias, ainda mais de preferência 56 dias a 60 dias.

[0025] Além disso, o peptídeo de colágeno de acordo com a presente descrição mostra uma taxa de eluição acumulativa de 0,1 a 10% até 1 dia após a eluição, ao medir a taxa de eluição acumulativa das microesferas in vitro. Ele mostra uma taxa acumulativa de eluição de 40 a 65% até 14 dias e uma taxa acumulativa de eluição de 70 a 100% até 56 dias.

[0026] A microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno de acordo com a presente descrição pode ser preparada, por exemplo, usando o “método de evaporação/extração por solvente”, sem estar limitado ao mesmo.

[0027] Como um exemplo específico de um método para preparar a microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno de acordo com a presente descrição, esse método de preparação compreende as etapas de: (a) preparar uma fase dispersada dissolvendo policaprolactona em um primeiro solvente e dissolvendo peptídeo de colágeno em um segundo solvente para preparar cada solução e, em seguida, misturar uniformemente as duas soluções para preparar uma única solução; (b) preparar uma emulsão misturando a fase dispersa com uma solução aquosa (fase contínua) contendo um tensoativo; (c) formar uma microesfera extraindo e evaporando o solvente orgânico da fase dispersa em uma fase contínua na emulsão preparada na etapa (b); e (d) recuperar a microesfera da fase contínua da etapa (c) para preparar uma microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno.

[0028] Na etapa (a), a viscosidade intrínseca da policaprolactona é, de preferência, na faixa de 0,16 a 1,90 dL/g.

[0029] O primeiro solvente usado para dissolver a policaprolactona na etapa (a) tem, de preferência, propriedades que são imiscíveis com a água. Utilizando as propriedades do solvente orgânico que são imiscíveis com água, a fase dispersa pode ser homogeneamente misturada e dispersa em uma solução aquosa contendo um tensoativo que é uma fase contínua na etapa (b) descrita abaixo, formando assim uma emulsão. O tipo de solvente que dissolve a policaprolactona não é particularmente limitado e, de preferência, pode ser selecionado do grupo que consiste em diclorometano, clorofórmio, acetato de etila, metiletilcetona e um solvente misturado dos mesmos. Mais de preferência, pode ser usado diclorometano, acetato de etila ou um solvente misturado dos mesmos.

[0030] O segundo solvente para dissolver a peptídeo de colágeno na etapa (a) pode ser selecionado do grupo que consiste em álcool metílico, álcool etílico, acetona, acetonitrila, dimetilssulfóxido, dimetilformamida, N- metilpirrolidona, ácido acético e uma mistura dos mesmos. De preferência, podem ser usados álcool metílico, dimetilssulfóxido ou um solvente misturado dos mesmos.

[0031] Na etapa (a), uma policaprolactona e uma solução de peptídeo de colágeno são misturadas para preparar uma solução misturada uniforme, preparando assim uma fase dispersa. De preferência, a solução misturada de policaprolactona e peptídeo de colágeno é dissolvida homogeneamente de modo que o peptídeo de colágeno seja adequadamente encapsulado na microesfera de policaprolactona. Como exemplo, ao usar diclorometano como solvente para policaprolactona e usar dimetilssulfóxido como um solvente para peptídeo de colágeno, a quantidade de álcool metílico usada é, de preferência, 2% em peso a 50% em peso em relação ao peso de diclorometano. Quando a quantidade de álcool metílico é menor que 2% em peso, é altamente provável que o peptídeo de colágeno seja precipitado devido à diminuição da solubilidade pelo diclorometano. Quando excede 50% em peso, é altamente provável que a policaprolactona seja precipitada por álcool metílico, o que não é preferível.

[0032] Na etapa (b), o método para misturar homogeneamente a fase de dispersão e a solução aquosa contendo o tensoativo não é particularmente limitado e, de preferência, a mistura pode ser realizada usando um agitador de alta velocidade, um misturador em linha, um método de emulsificação por membrana, um método de emulsificação microfluídica ou semelhantes. Como exemplo, ao realizar a mistura usando um método de emulsificação por membrana, a fase dispersa preparada na etapa (a) é passada através de uma membrana tendo microporos de tamanho uniforme e transferida para uma fase contínua contendo um tensoativo para preparar uma emulsão.

[0033] O tipo de tensoativo usado na etapa (b) não é particularmente limitado, e o tensoativo pode ser usado sem limitação, desde que ajude a fase de dispersão a formar uma emulsão em gotas estável dentro da fase contínua. De preferência, o tensoativo pode ser selecionado do grupo que consiste em metilcelulose, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulose, lecitina, gelatina, álcool polivinílico, éster de ácido graxo de polioxietileno sorbitano, derivados de polioxietileno óleo de rícino e misturas dos mesmos. Mais de preferência, pode ser usado álcool polivinílico.

[0034] Na etapa (b), o conteúdo do tensoativo na fase contínua contendo o tensoativo pode ser de 0,01% p/v a 20% p/v, de preferência 0,1% p/v a 5% p/v com base no volume total da fase contínua contendo o tensoativo. Quando o teor de tensoativo é menor que 0,01% p/v, uma fase dispersa ou emulsão na forma de gotículas não pode ser formada na fase contínua. Quando o conteúdo do tensoativo excede 20% p/v, pode ser difícil remover o tensoativo após a formação de partículas finas na fase contínua devido ao excesso de tensoativo. Em uma modalidade da presente descrição, a microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno é preparada usando 1 a 5% p/v de álcool polivinílico.

[0035] Na etapa (c), a emulsão que compreende uma fase dispersa na forma de gotículas e uma fase contínua contendo um tensoativo pode ser agitada por 48 horas ou menos, de preferência 1 a 36 horas, mais de preferência por cerca de 3 a 24 horas, enquanto mantém uma temperatura abaixo do ponto de ebulição do solvente orgânico, por exemplo, não limitado ao mesmo, 5 a 39,6 °C, de preferência 10 a 35 °C, mais de preferência 15 a 30 °C, removendo assim o solvente orgânico. A velocidade de agitação não é particularmente limitada, mas 10 a 300 rpm é adequada. Uma parte do solvente orgânico extraído na fase contínua pode ser evaporada da superfície da fase contínua. À medida que o solvente orgânico é removido da solução na forma de gotículas, a fase dispersa na forma de gotículas é solidificada para formar microesferas e, desse modo, é obtida a forma de uma suspensão contendo microesferas (suspensão de microesferas).

[0036] Na etapa (c), de modo a remover com mais eficiência o solvente orgânico, a temperatura da fase contínua pode ser aquecida por um determinado período de tempo.

[0037] Na etapa (d), o método para recuperar microesferas de policaprolactona pode ser realizado usando várias técnicas conhecidas e, por exemplo, um método, tal como filtração ou centrifugação, pode ser usado.

[0038] Entre as etapas (c) e (d), o tensoativo residual pode ser removido por filtração e lavagem e, em seguida, a filtração pode ser realizada novamente para recuperar as microesferas.

[0039] A etapa de lavagem para remover o tensoativo residual geralmente pode ser realizada com água, e a etapa de lavagem pode ser repetida várias vezes.

[0040] Além disso, como descrito acima, quando a emulsão é formada usando o agitador de alta velocidade e o misturador em linha na etapa (b), uma microesfera uniforme pode ser obtida usando adicionalmente um processo de peneiração entre as etapas (c) e (d). O processo de peneiração pode ser realizado usando uma técnica conhecida, e as microesferas de pequenas partículas e partículas grandes podem ser filtradas usando uma membrana de peneira tendo tamanhos diferentes para obter microesferas de tamanho uniforme.

[0041] De acordo com outro aspecto da presente descrição, é fornecido um enchimento que compreende a microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno da presente descrição; e um carreador aquoso farmaceuticamente aceitável.

[0042] Como carreador aquoso farmaceuticamente aceitável, por exemplo, uma solução aquosa para injeção, tal como água purificada, solução salina fisiológica ou tampão fosfato, pode ser usada. Além disso, o enchimento pode, além da microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno e o carreador aquoso farmaceuticamente aceitável, incluir pelo menos um selecionado do grupo que consiste em derivados de celulose, tais como, carboximetilcelulose (CMC) e hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), solutos, tais como, ácido hialurônico, lidocaína, polidesoxirribonucleotídeo (PDRN), polinucleotídeo (PN) e lubrificantes, tal como glicerina, se necessário, mas não são limitados aos mesmos. O ácido hialurônico é preferido. Quando o ácido hialurônico é adicionalmente incluído e combinado, o volume durante a administração inicial pode ser mantido por mais tempo. Os solutos preferidos são carboximetilcelulose ou ácido hialurônico.

[0043] Em uma modalidade, o conteúdo de cada componente incluído no enchimento que compreende a microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno da presente descrição pode ser de 2 a 50% em peso da microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno (o conteúdo de peptídeo de colágeno nas micropartículas de policaprolactona é de 0,01 a 7% em peso), 15 a 97,9% em peso do carreador aquoso farmaceuticamente aceitável, 0,1 a 5% em peso do soluto e 0 a 48% em peso do lubrificante, com base no total de 100% em peso da formulação de enchimento, mas não está limitado aos mesmos. Quando o ácido hialurônico é adicionado como um soluto, o ácido hialurônico tendo uma taxa de reticulação de 0 a 5% pode ser usado.

[0044] O enchimento que compreende a microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno, de acordo com a presente descrição, não apenas exibe um rápido efeito de formação de colágeno no sítio tratado imediatamente após o tratamento, como exibe uma propriedade de reparo do tecido que mostra uma sensação de volume natural e ideal, mas também mantém a estabilidade in vivo do peptídeo de colágeno, tem boa capacidade de injeção e exibe excelentes efeitos por um longo período de tempo e, portanto, pode ser muito útil para fins cosméticos ou terapêuticos.

[0045] Como exemplo específico, o enchimento, incluindo essas microesferas de policaprolactona, pode ser usado para enchimento de tecidos biológicos, melhoria das rugas por enchimentos das rugas, remodelação do rosto, ou restauração ou aumento do volume de tecidos moles, tais como, lábios, nariz, nádegas, bochechas ou nos seios. O enchimento incluindo as microesferas de policaprolactona pode ser administrado em uma forma de dosagem adequada para esse uso, e de preferência, pode ser uma injeção.

[0046] Em outro aspecto, a presente descrição fornece uma seringa preenchida cheia com um enchimento que compreende as microesferas de policaprolactona.

[0047] A seguir, a presente descrição será descrita em mais detalhes a título de exemplos. No entanto, esses exemplos são apenas para fins ilustrativos, e o escopo da presente descrição não é limitado aos mesmos.

Exemplo 1: Preparação da microesfera com peptídeo de colágeno encapsulado

[0048] A fase dispersa foi preparada dissolvendo completamente 9,99 g de polímero biocompatível Purasorb PC 04 (fabricante: Corbion, Holanda) e 0,01 g de palmitoil- KTTKS (fabricante: Incospharm, Coréia) em 39,96 g de diclorometano (fabricante: JT Baker, EUA) e 2,02 mL de álcool metílico (fabricante: Sigma Aldrich, EUA), respectivamente, e misturando as duas soluções. Como fase contínua, foi usada uma solução aquosa de álcool polivinílico a 2% p/v (viscosidade: 4,8 a 5,8 mPa-s), e 3200 mL da fase contínua foram fornecidos a um aparelho de emulsificação equipado com membrana porosa de 10 μm de diâmetro e, ao mesmo tempo, a fase dispersa preparada foi injetada para preparar uma microesfera. A suspensão de microesferas preparada foi colocada em um recipiente de preparação e agitada a uma velocidade de 150 rpm. A temperatura do aparelho de emulsificação por membrana e do recipiente de preparação foi mantida a 25 °C.

[0049] Quando a injeção da fase dispersa foi completada, a suspensão de microesferas foi agitada a 25 °C por 12 horas a uma velocidade de 150 rpm para remover o solvente orgânico. Quando a remoção do solvente orgânico foi completada, a suspensão de microesferas foi repetidamente lavada com água destilada várias vezes para remover e obter álcool polivinílico residual, e as microesferas obtidas foram liofilizadas.

Exemplo 1-1: Preparação da microesfera de peptídeo de colágeno encapsulado

[0050] A fase dispersa foi preparada dissolvendo completamente 9,98 g de polímero biocompatível Purasorb PC 04 (fabricante: Corbion, Holanda) e 0,02 g de palmitoil- KTTKS (fabricante: Incospharm, Coréia) em 39,92 g de diclorometano (fabricante: JT Baker, EUA) e 2,52 mL de álcool metílico (fabricante: Sigma Aldrich, EUA), respectivamente, e misturando as duas soluções. Como fase contínua, foi usada uma solução aquosa de álcool polivinílico a 2% p/v (viscosidade: 4,8 a 5,8 mPa-s), e 4000 mL da fase contínua foram fornecidos a um aparelho de emulsificação equipado com membrana porosa de 10 μm de diâmetro e, ao mesmo tempo, a fase dispersa preparada foi injetada para preparar uma microesfera. A suspensão de microesferas preparada foi colocada em um recipiente de preparação e agitada a uma velocidade de 150 rpm. A temperatura do aparelho de emulsificação por membrana e do recipiente de preparação foi mantida a 25 °C.

[0051] Quando a injeção da fase dispersa foi completada, a suspensão de microesferas foi agitada a 25 °C por 12 horas a uma velocidade de 150 rpm para remover o solvente orgânico. Quando a remoção do solvente orgânico foi completada, a suspensão de microesferas foi repetidamente lavada com água destilada várias vezes para remover e obter álcool polivinílico residual, e as microesferas obtidas foram liofilizadas.

Exemplo 1-2: Preparação da microesfera de peptídeo de colágeno encapsulado

[0052] A fase dispersa foi preparada dissolvendo completamente 9,9 g de polímero biocompatível Purasorb PC 04 (fabricante: Corbion, Holanda) e 0,1 g de palmitoil-KTTKS (fabricante: Incospharm, Coréia) em 39,6 g de diclorometano (fabricante: JT Baker, EUA) e 4,0 mL de álcool metílico (fabricante: Sigma Aldrich, EUA), respectivamente, e misturando as duas soluções. Como fase contínua, foi usada uma solução aquosa de álcool polivinílico a 1% p/v (viscosidade: 4,8 a 5,8 mPa-s), e 5000 mL da fase contínua foram fornecidos a um aparelho de emulsificação equipado com membrana porosa de 10 μm de diâmetro e, ao mesmo tempo, a fase dispersa preparada foi injetada para preparar uma microesfera. A suspensão de microesferas preparada foi colocada em um recipiente de preparação e agitada a uma velocidade de 150 rpm. A temperatura do aparelho de emulsificação por membrana e do recipiente de preparação foi mantida a 25 °C.

[0053] Quando a injeção da fase dispersa foi completada, a suspensão de microesferas foi agitada a 25 °C por 12 horas a uma velocidade de 150 rpm para remover o solvente orgânico. Quando a remoção do solvente orgânico foi completada, a suspensão de microesferas foi repetidamente lavada com água destilada várias vezes para remover e obter álcool polivinílico residual, e as microesferas obtidas foram liofilizadas.

Exemplo 1-3: Preparação da microesfera de peptídeo de colágeno encapsulado

[0054] A fase dispersa foi preparada dissolvendo completamente 9,5 g de polímero biocompatível Purasorb PC 04 (fabricante: Corbion, Holanda) e 0,5 g de palmitoil-KTTKS (fabricante: Incospharm, Coréia) em 38,0 g de diclorometano (fabricante: JT Baker, EUA) e 6,19 mL de álcool metílico (fabricante: Sigma Aldrich, EUA), respectivamente, e misturando as duas soluções. Como fase contínua, foi usada uma solução aquosa a 3% p/v de álcool polivinílico (viscosidade: 4,8 a 5,8 mPa-s), e 5400 mL da fase contínua foram fornecidos a um aparelho de emulsificação equipado com membrana porosa de 10 μm de diâmetro e, ao mesmo tempo, a fase dispersa preparada foi injetada para preparar uma microesfera. A suspensão de microesferas preparada foi colocada em um recipiente de preparação e agitada a uma velocidade de 150 rpm. A temperatura do aparelho de emulsificação da membrana e do recipiente de preparação foi mantida a 25 °C.

[0055] Quando a injeção da fase dispersa foi completada, a suspensão de microesferas foi agitada a 25 °C por 12 horas a uma velocidade de 150 rpm para remover o solvente orgânico. Quando a remoção do solvente orgânico foi completada, a suspensão de microesferas foi repetidamente lavada com água destilada várias vezes para remover e obter álcool polivinílico residual, e as microesferas obtidas foram liofilizadas.

Exemplo 1-4: Preparação da microesfera com peptídeo de colágeno encapsulado

[0056] A fase dispersa foi preparada dissolvendo completamente 9 g de polímero biocompatível Purasorb PC 04 (fabricante: Corbion, Holanda) e 1 g de palmitoil-KTTKS (fabricante: Incospharm, Coréia) em 36,0 g de diclorometano (fabricante: JT Baker, EUA) e 10,77 mL de álcool metílico (fabricante: Sigma Aldrich, EUA), respectivamente, e misturando as duas soluções. Como fase contínua, foi usada uma solução aquosa de álcool polivinílico a 3% p/v (viscosidade: 4,8 a 5,8 mPa-s), e 4800 mL da fase contínua foram fornecidos a um aparelho de emulsificação equipado com membrana porosa de 10 μm de diâmetro e, ao mesmo tempo, a fase dispersa preparada foi injetada para preparar uma microesfera. A suspensão de microesferas preparada foi colocada em um recipiente de preparação e agitada a uma velocidade de 150 rpm. A temperatura do aparelho de emulsificação da membrana e do recipiente de preparação foi mantida a 25 °C.

[0057] Quando a injeção da fase dispersa foi completada, a suspensão de microesferas foi agitada a 25 °C por 12 horas a uma velocidade de 150 rpm para remover o solvente orgânico. Quando a remoção do solvente orgânico foi completada, a suspensão de microesferas foi repetidamente lavada com água destilada várias vezes para remover e obter álcool polivinílico residual, e as microesferas obtidas foram liofilizadas.

Exemplo 2: Preparação da microesfera com peptídeo de colágeno encapsulado

[0058] A fase dispersa foi preparada dissolvendo completamente 9,98 g de polímero biocompatível Purasorb PC 04 (fabricante: Corbion, Holanda) e 0,02 g de palmitoil- KTTKS (fabricante: Incospharm, Coréia) em 24,95 g de diclorometano (fabricante: JT Baker, EUA) e 1,57 mL de álcool metílico (fabricante: Sigma Aldrich, EUA), respectivamente, e misturando as duas soluções. Como fase contínua, foi usada uma solução aquosa de álcool polivinílico a 2% p/v (viscosidade: 4,8 a 5,8 mPa-s), e 2500 mL da fase contínua foram fornecidos a um aparelho de emulsificação equipado com membrana porosa de 10 μm de diâmetro e, ao mesmo tempo, a fase dispersa preparada foi injetada para preparar uma microesfera. A suspensão de microesferas preparada foi colocada em um recipiente de preparação e agitada a uma velocidade de 150 rpm. A temperatura do aparelho de emulsificação por membrana e do recipiente de preparação foi mantida a 25 °C.

[0059] Quando a injeção da fase dispersa foi completada, a suspensão de microesferas foi agitada a 25 °C por 12 horas a uma velocidade de 150 rpm para remover o solvente orgânico. Quando a remoção do solvente orgânico foi completada, a suspensão de microesferas foi repetidamente lavada com água destilada várias vezes para remover e obter álcool polivinílico residual, e as microesferas obtidas foram liofilizadas.

Exemplo 2-1: Preparação da microesfera com peptídeo de colágeno encapsulado

[0060] A fase dispersa foi preparada dissolvendo completamente 9,98 g de polímero biocompatível Purasorb PC 12 (fabricante: Corbion, Holanda) e 0,02 g de palmitoil- KTTKS (fabricante: Incospharm, Coréia) em 55,44 g de diclorometano (fabricante: JT Baker, EUA) e 3,5 mL de álcool metílico (fabricante: Sigma Aldrich, EUA), respectivamente, e misturando as duas soluções. Como fase contínua, foi usada uma solução aquosa de álcool polivinílico a 2% p/v (viscosidade: 4,8 a 5,8 mPa-s), e 6700 mL da fase contínua foram fornecidos a um aparelho de emulsificação equipado com membrana porosa de 10 μm de diâmetro e, ao mesmo tempo, a fase dispersa preparada foi injetada para preparar uma microesfera. A suspensão de microesferas preparada foi colocada em um recipiente de preparação e agitada a uma velocidade de 150 rpm. A temperatura do aparelho de emulsificação por membrana e do recipiente de preparação foi mantida a 25 °C.

[0061] Quando a injeção da fase dispersa foi completada, a suspensão de microesferas foi agitada a 25 °C por 12 horas a uma velocidade de 150 rpm para remover o solvente orgânico. Quando a remoção do solvente orgânico foi completada, a suspensão de microesferas foi repetidamente lavada com água destilada várias vezes para remover e obter álcool polivinílico residual, e as microesferas obtidas foram liofilizadas.

Exemplo 2-2: Preparação da microesfera com peptídeo de colágeno encapsulado

[0062] A fase dispersa foi preparada dissolvendo completamente 9,98 g de polímero biocompatível Purasorb PC 17 (fabricante: Corbion, Holanda) e 0,02 g de palmitoil- KTTKS (fabricante: Incospharm, Coréia) em 83,16 g de diclorometano (fabricante: JT Baker, EUA) e 5,25 mL de álcool metílico (fabricante: Sigma Aldrich, EUA), respectivamente, e misturando as duas soluções. Como fase contínua, foi usada uma solução aquosa de álcool polivinílico a 2% p/v (viscosidade: 4,8 a 5,8 mPa-s), e 12500 mL da fase contínua foram fornecidos a um aparelho de emulsificação equipado com membrana porosa de 10 μm de diâmetro e, ao mesmo tempo, a fase dispersa preparada foi injetada para preparar uma microesfera. A suspensão de microesferas preparada foi colocada em um recipiente de preparação e agitada a uma velocidade de 150 rpm. A temperatura do aparelho de emulsificação da membrana e do recipiente de preparação foi mantida a 25 °C.

[0063] Quando a injeção da fase dispersa foi completada, a suspensão de microesferas foi agitada a 25 °C por 12 horas a uma velocidade de 150 rpm para remover o solvente orgânico. Quando a remoção do solvente orgânico foi completada, a suspensão de microesferas foi repetidamente lavada com água destilada várias vezes para remover e obter álcool polivinílico residual, e as microesferas obtidas foram liofilizadas.

Exemplo 3: Preparação da microesfera com peptídeo de colágeno encapsulado

[0064] A fase dispersa foi preparada dissolvendo completamente 9,98 g de polímero biocompatível Purasorb PC 04 (fabricante: Corbion, Holanda) e 0,02 g de palmitoil- KTTKS (fabricante: Incospharm, Coréia) em 39,92 g de diclorometano (fabricante: JT Baker, EUA) e 2,52 mL de álcool metílico (fabricante: Sigma Aldrich, EUA), respectivamente, e misturando as duas soluções. Como fase contínua, foi usada uma solução aquosa de álcool polivinílico a 2% p/v (viscosidade: 4,8 a 5,8 mPa-s), e 4000 mL da fase contínua foram fornecidos a um aparelho de emulsificação equipado com uma membrana porosa tendo um diâmetro de 5 μm e, ao mesmo tempo, a fase dispersa preparada foi injetada para preparar uma microesfera. A suspensão de microesferas preparada foi colocada em um recipiente de preparação e agitada a uma velocidade de 150 rpm. A temperatura do aparelho de emulsificação da membrana e do recipiente de preparação foi mantida a 25 °C.

[0065] Quando a injeção da fase dispersa foi completada, a suspensão de microesferas foi agitada a 25 °C por 12 horas a uma velocidade de 150 rpm para remover o solvente orgânico. Quando a remoção do solvente orgânico foi completada, a suspensão de microesferas foi repetidamente lavada com água destilada várias vezes para remover e obter álcool polivinílico residual, e as microesferas obtidas foram liofilizadas.

Exemplo 3-1: Preparação da microesfera com peptídeo de colágeno encapsulado

[0066] A fase dispersa foi preparada dissolvendo completamente 9,98 g de polímero biocompatível Purasorb PC 04 (fabricante: Corbion, Holanda) e 0,02 g de palmitoil- KTTKS (fabricante: Incospharm, Coréia) em 39,92 g de diclorometano (fabricante: JT Baker, EUA) e 2,52 mL de álcool metílico (fabricante: Sigma Aldrich, EUA), respectivamente, e misturando as duas soluções. Como fase contínua, foi usada uma solução aquosa de álcool polivinílico a 2% p/v (viscosidade: 4,8 a 5,8 mPa-s), e 4000 mL da fase contínua foram fornecidos a um aparelho de emulsificação equipado com uma membrana porosa tendo um diâmetro de 30 μm e, ao mesmo tempo, a fase dispersa preparada foi injetada para preparar uma microesfera. A suspensão de microesferas preparada foi colocada em um recipiente de preparação e agitada a uma velocidade de 150 rpm. A temperatura do aparelho de emulsificação da membrana e do recipiente de preparação foi mantida a 25 °C.

[0067] Quando a injeção da fase dispersa foi completada, a suspensão de microesferas foi agitada a 25 °C por 12 horas a uma velocidade de 150 rpm para remover o solvente orgânico. Quando a remoção do solvente orgânico foi completada, a suspensão de microesferas foi repetidamente lavada com água destilada várias vezes para remover e obter álcool polivinílico residual, e as microesferas obtidas foram liofilizadas.

Exemplo 3-2: Preparação da microesfera com peptídeo de colágeno encapsulado

[0068] A fase dispersa foi preparada dissolvendo completamente 9,98 g de polímero biocompatível Purasorb PC 04 (fabricante: Corbion, Holanda) e 0,02 g de palmitoil- KTTKS (fabricante: Incospharm, Coréia) em 39,92 g de diclorometano (fabricante: JT Baker, EUA) e 2,52 mL de álcool metílico (fabricante: Sigma Aldrich, EUA), respectivamente, e misturando as duas soluções. Como fase contínua, foi usada uma solução aquosa de álcool polivinílico a 2% p/v (viscosidade: 4,8 a 5,8 mPa-s), e 4000 mL da fase contínua foram fornecidos a um aparelho de emulsificação equipado com uma membrana porosa tendo um diâmetro de 40 μm e, ao mesmo tempo, a fase dispersa preparada foi injetada para preparar uma microesfera. A suspensão de microesferas preparada foi colocada em um recipiente de preparação e agitada a uma velocidade de 150 rpm. A temperatura do aparelho de emulsificação da membrana e do recipiente de preparação foi mantida a 25 °C.

[0069] Quando a injeção da fase dispersa foi completada, a suspensão de microesferas foi agitada a 25 °C por 12 horas a uma velocidade de 150 rpm para remover o solvente orgânico. Quando a remoção do solvente orgânico foi completada, a suspensão de microesferas foi repetidamente lavada com água destilada várias vezes para remover e obter álcool polivinílico residual, e as microesferas obtidas foram liofilizadas.

Exemplo 4: Preparação da microesfera com peptídeo de colágeno encapsulado usando agitador de alta velocidade

[0070] A fase dispersa foi preparada dissolvendo completamente 9,98 g de polímero biocompatível Purasorb PC 04 (fabricante: Corbion, Holanda) e 0,02 g de palmitoil- KTTKS (fabricante: Incospharm, Coréia) em 39,92 g de diclorometano (fabricante: JT Baker, EUA) e 2,52 mL de álcool metílico (fabricante: Sigma Aldrich, EUA), respectivamente, e misturando as duas soluções. Como fase contínua, foi usada uma solução aquosa de álcool polivinílico a 1% p/v (viscosidade: 4,8 a 5,8 mPa-s), e 4000 mL da fase contínua foram colocados em um recipiente de preparação e, enquanto se agitava o misturador de alta velocidade equipado a uma velocidade de 4500 rpm, a fase dispersa foi injetada a uma vazão de 7 mL por minuto. A suspensão de microesferas foi agitada a uma velocidade de 150 rpm. A temperatura do recipiente de preparação foi mantida a 25 °C.

[0071] Quando a injeção da fase dispersa foi completada, a suspensão de microesferas foi agitada a 25 °C por 12 horas a uma velocidade de 150 rpm para remover o solvente orgânico. Quando a remoção do solvente orgânico foi completada, a suspensão de microesferas foi repetidamente lavada com água destilada várias vezes para remover e obter álcool polivinílico residual, e as microesferas obtidas foram liofilizadas.

Exemplo 5: Preparação da microesfera de policaprolactona com GHK-Cu encapsulado

[0072] A fase dispersa foi preparada dissolvendo completamente 9,98 g de polímero biocompatível Purasorb PC 04 (fabricante: Corbion, Holanda) e 0,02 g de GHK-Cu (fabricante: Incospharm, Coréia) como material bioativo em 39,92 g de diclorometano (fabricante: JT Baker, EUA) e 60 μL de tampão fosfato (pH 7,2), respectivamente, e agitando em vórtice as duas soluções. Como fase contínua, foi usada uma solução aquosa de álcool polivinílico a 1% p/v (viscosidade: 4,8 a 5,8 mPa-s), e 4800 mL da fase contínua foram fornecidos a um aparelho de emulsificação equipado com membrana porosa de 10 μm de diâmetro e, ao mesmo tempo, a fase dispersa preparada foi injetada para preparar uma microesfera. A suspensão de microesferas preparada foi colocada em um recipiente de preparação e agitada a uma velocidade de 150 rpm. A temperatura do aparelho de emulsificação da membrana e do recipiente de preparação foi mantida a 25 °C.

[0073] Quando a injeção da fase dispersa foi completada, a suspensão de microesferas foi agitada a 25 °C por 12 horas a uma velocidade de 150 rpm para remover o solvente orgânico. Quando a remoção do solvente orgânico foi completada, a suspensão de microesferas foi repetidamente lavada com água destilada várias vezes para remover e obter álcool polivinílico residual, e as microesferas obtidas foram liofilizadas.

Exemplo 5-1: Preparação da microesfera de policaprolactona com AHK-Cu encapsulado

[0074] A fase dispersa foi preparada dissolvendo completamente 9,98 g de polímero biocompatível Purasorb PC 04 (fabricante: Corbion, Holanda) e 0,02 g de AHK-Cu (fabricante: Incospharm, Coréia) como material bioativo em 39,92 g de diclorometano (fabricante: JT Baker, EUA) e 70 μL de tampão fosfato (pH 7,2), respectivamente, e agitando em vórtice as duas soluções. Como fase contínua, foi usada uma solução aquosa de álcool polivinílico a 1% p/v (viscosidade: 4,8 a 5,8 mPa-s), e 4800 mL da fase contínua foram fornecidos a um aparelho de emulsificação equipado com membrana porosa de 10 μm de diâmetro e, ao mesmo tempo, a fase dispersa preparada foi injetada para preparar uma microesfera. A suspensão de microesferas preparada foi colocada em um recipiente de preparação e agitada a uma velocidade de 150 rpm. A temperatura do aparelho de emulsificação da membrana e do recipiente de preparação foi mantida a 25 °C.

[0075] Quando a injeção da fase dispersa foi completada, a suspensão de microesferas foi agitada a 25 °C por 12 horas a uma velocidade de 150 rpm para remover o solvente orgânico. Quando a remoção do solvente orgânico foi completada, a suspensão de microesferas foi repetidamente lavada com água destilada várias vezes para remover e obter álcool polivinílico residual, e as microesferas obtidas foram liofilizadas.

Exemplo 6: Preparação do enchimento de microesferas de policaprolactona usando carboximetilcelulose como um soluto

[0076] O enchimento de microesferas de policaprolactona foi preparado preparando uma solução para a suspensão de microesferas e depois misturando as microesferas. Especificamente, 2 g de carboximetilcelulose (fabricante: Ashland, EUA) foram adicionados a um tampão de fosfato a 75 °C, dissolvidos e resfriados com agitação a 100 rpm durante 3 horas. Quando a temperatura da solução atingiu 25 °C, foram adicionados 18 g de glicerina e, finalmente, a microesfera de policaprolactona com peptídeo de colágeno encapsulado de acordo com os Exemplos 1-2 foi misturada a 30% (p/p) para completar a preparação de um enchimento de microesferas de policaprolactona.

Exemplo 6-1: Preparação do enchimento de microesferas de policaprolactona usando ácido hialurônico como um soluto

[0077] O enchimento de microesferas de policaprolactona foi preparado preparando uma solução para a suspensão de microesferas e depois misturando as microesferas. Foi adicionado 1 g de ácido hialurônico (fabricante: Bloomage Freda Biopharm, China) a um tampão de fosfato a 55 °C, dissolvido e resfriado. Quando a temperatura da solução atingiu 25 °C, foram adicionados 18 g de glicerina e, finalmente, a microesfera de policaprolactona com peptídeo de colágeno encapsulado de acordo com os Exemplos 1-2 foi misturada a 30% (p/p) em relação ao peso total da microesfera de policaprolactona para completar a preparação de um enchimento de microesferas de policaprolactona.

Exemplo Comparativo 1: Preparação de microesferas com peptídeo de colágeno encapsulado

[0078] A fase dispersa foi preparada dissolvendo completamente 8 g de polímero biocompatível Purasorb PC 04 (fabricante: Corbion, Holanda) e 2 g de palmitoil-KTTKS (fabricante: Incospharm, Coréia) em 32,0 g de diclorometano (fabricante: JT Baker, EUA) e 15,32 mL de álcool metílico (fabricante: Sigma Aldrich, EUA), respectivamente, e misturando as duas soluções. Como fase contínua, foi usada uma solução aquosa de álcool polivinílico a 3% p/v (viscosidade: 4,8 a 5,8 mPa-s), e 4800 mL da fase contínua foram fornecidos a um aparelho de emulsificação equipado com membrana porosa de 10 μm de diâmetro e, ao mesmo tempo, a fase dispersa preparada foi injetada para preparar uma microesfera. A suspensão de microesferas preparada foi colocada em um recipiente de preparação e agitada a uma velocidade de 150 rpm. A temperatura do aparelho de emulsificação da membrana e do recipiente de preparação foi mantida a 25 °C.

[0079] Quando a injeção da fase dispersa foi completada, a suspensão de microesferas foi agitada a 25 °C por 12 horas a uma velocidade de 150 rpm para remover o solvente orgânico. Quando a remoção do solvente orgânico foi completada, a suspensão de microesferas foi repetidamente lavada com água destilada várias vezes para remover e obter álcool polivinílico residual, e as microesferas obtidas foram liofilizadas.

Exemplo Comparativo 2: Preparação de microesferas com peptídeo bioativo encapsulado usando agitador de alta velocidade

[0080] A fase dispersa foi preparada dissolvendo completamente 9,98 g de polímero biocompatível Purasorb PC 04 (fabricante: Corbion, Holanda) e 0,02 g de palmitoil- KTTKS (fabricante: Incospharm, Coréia) em 39,92 g de diclorometano (fabricante: J.T. Baker, EUA) e 2,52 mL de álcool metílico (fabricante: Sigma Aldrich, EUA),respectivamente, e misturando as duas soluções. Como fase contínua, foi usada uma solução aquosa de álcool polivinílico a 1% p/v (viscosidade: 4,8 a 5,8 mPa-s), e 4000 mL da fase contínua foram colocados em um recipiente de preparação e enquanto se agitava o misturador de alta velocidade a uma velocidade de 4500 rpm, a fase dispersa foi injetada a uma vazão de 7 mL por minuto. A suspensão de microesferas foi agitada a uma velocidade de 150 rpm. A temperatura do recipiente de preparação foi mantida a 25 °C.

[0081] Quando a injeção da fase dispersa foi completada, a suspensão de microesferas foi agitada a 25 °C por 12 horas a uma velocidade de 150 rpm para remover o solvente orgânico. Quando a remoção do solvente orgânico foi completada, a suspensão de microesferas foi repetidamente lavada com água destilada várias vezes para remover e obter álcool polivinílico residual, e as microesferas obtidas foram liofilizadas.

Exemplo Experimental 1: Análise Morfológica por Microscópio Eletrônico

[0082] Nesse experimento, as características morfológicas das microesferas preparadas foram analisadas através de um microscópio eletrônico. O procedimento experimental é como a seguir. 5 mg das microesferas preparadas nos Exemplos 1-1, 3-1 e 3-2 foram colocados em uma haste de alumínio afixada com fita de carbono, e o revestimento de platina foi realizado usando ION-COATER (COXEM, Coréia). Uma haste de alumínio foi montada em um microscópio eletrônico de varredura (COXEM EM-30, Coréia), e as características morfológicas das microesferas foram observadas com uma voltagem de aceleração de 15 kV, e os resultados são mostrados na FIG. 1a (Exemplo 1-1) e FIG. 1b (Exemplo 3-1) e FIG. 1c (Exemplo 3-2).

[0083] Como mostrado na FIG. 1a, na FIG. 1b e na FIG. 1c, foi confirmado que as microesferas mantinham um formato esférico e o tamanho da partícula podia ser ajustado dependendo do diâmetro da membrana usado na produção.

Exemplo experimental 2: Análise do tamanho de partículas da microesfera usando um método de difração a laser

[0084] Esse experimento foi realizado para medir quantitativamente o tamanho médio das partículas e a distribuição das microesferas e confirmar a uniformidade das partículas. O procedimento experimental é como a seguir.

[0085] 50 mg de microesferas foram misturadas com 1 mL de água destilada terciária, misturadas com um misturador de vórtice por 20 segundos, depois colocadas em um gerador ultrassônico por 1 minuto e dispersadas. A dispersão da microesfera foi colocada em um analisador de tamanho de partículas (Microtrac Bluewave, Japão) e medida por 20 segundos. Como um índice de uniformidade de tamanho de partícula, o valor de amplitude foi determinado pela seguinte fórmula. [Fórmula 1] Valor de amplitude = (Dv,o,9 — DV,O,I)/DV,O,5 [Tabela 1]

[0086] Como mostrado na Tabela 1 acima, foi confirmado que o Exemplo 1, o Exemplo 1-1, o Exemplo 1-2, o Exemplo 1-3, o Exemplo 1-4 e o Exemplo Comparativo 1 tinham tamanhos médios de partículas semelhantes através de Dv,o,5 e o valor de amplitude medido por um analisador de tamanho de partícula. O Exemplo 1-1, o Exemplo 3, o Exemplo 3-1 e o Exemplo 3-2 foram microesferas preparadas usando membranas tendo diâmetros diferentes, respectivamente, e tinham um tamanho médio de partícula de cerca de 10 a 100 μm. Nesse momento, todas as microesferas tinham um valor de amplitude de 1,0 ou menos e, portanto, uma distribuição uniforme de partículas. A partir disso, foi confirmado que era possível preparar microesferas tendo um tamanho médio de partícula de 10 a 100 μm enquanto possuíam um valor de amplitude de 1,0 ou menos e, portanto, uma distribuição uniforme de partículas.

[0087] No caso do Exemplo 2, do Exemplo 2-1 e do Exemplo 2-1, os tipos de polímeros usados para preparar a fase dispersa eram diferentes, mas foi confirmado que era possível ajustar o tamanho da fase dispersa preparada e o tamanho da membrana do aparelho para a produção de microesferas, ajustando-o assim para tamanhos médios de partículas similares.

[0088] No caso do Exemplo 1-1, do Exemplo 4 e do Exemplo Comparativo 2, houve uma diferença no método de mistura da fase dispersa com uma solução aquosa contendo um tensoativo, e as microesferas preparadas mostraram diferentes tamanhos médios de partículas e valores de amplitude, dependendo do método. Em particular, no caso do Exemplo 4 e do Exemplo Comparativo 2 usando um agitador de alta velocidade, o valor da amplitude pode ser ajustado para 1,0 ou menos por peneiramento, que é um processo de triagem de micropartículas. No caso do Exemplo Comparativo 2 sem um processo de peneiração separado, ele tinha um valor de amplitude de 1,38 e, portanto, uma distribuição de tamanho de partícula relativamente ampla.

Exemplo experimental 3: Análise do conteúdo de peptídeo de colágeno

[0089] Esse experimento foi realizado para analisar quantitativamente o peptídeo de colágeno encapsulado na microesfera, e a análise quantitativa foi realizada usando espectrometria de massa por cromatografia líquida (LC- MS/MS). O procedimento experimental é como a seguir.

[0090] 100 mg das microesferas foram completamente dissolvidos em uma solução misturada de dimetilssulfóxido e álcool metílico e depois diluídos com uma fase móvel. A fase móvel usada para a análise foi usada misturando solução de acetato de amônio e acetonitrila em uma razão de 30:70 (v/v) e foi preparada para conter ácido acético 0,05%. Uma coluna C8 (2,0 x 100 mm, 5 μm) foi usada para esta medição. A quantidade de encapsulamento medida é mostrada na Tabela 2 abaixo. [Tabela 2]

[0091] Como mostrado na Tabela 2 acima, a quantidade de encapsulamento (conteúdo) aumentou proporcionalmente à quantidade de peptídeo de colágeno usado para preparar a fase dispersa, e a eficiência do encapsulamento diminuiu em proporção inversa à quantidade de peptídeo de colágeno usado. Os conteúdos do peptídeo de colágeno do Exemplo 1-1, do Exemplo 3, do Exemplo 3-1 e do Exemplo 3-2 foram similares, confirmando que o tamanho das partículas não afetou a taxa de encapsulamento.

Exemplo Experimental 4: Comportamento de liberação in vitro do peptídeo de colágeno

[0092] Esse experimento foi conduzido para confirmar o desempenho da liberação do fármaco do peptídeo de colágeno encapsulado na microesfera de policaprolactona, e o procedimento experimental é como a seguir.

[0093] 100 mg de microesferas produzidas nos Exemplos 1-1, 1-2, 1-4, 2 e 2-2, e no Exemplo Comparativo 1 foram colocados em um frasco de boca larga de 250 ml de largura contendo 200 ml de um tampão HEPES 10 mM. Em um intervalo de tempo predeterminado, foi retirado 1 mL da solução de um frasco de boca larga e foi adicionada uma quantidade igual de tampão HEPES recém-preparado. A solução coletada foi colocada em um tubo de 1,5 mL, centrifugada a 13000 rpm por 5 minutos e, em seguida, a taxa de eluição foi confirmada por espectrometria de massa por cromatografia líquida de maneira semelhante ao método de análise do conteúdo de peptídeo de colágeno. [Tabela 3]

[0094] Como mostrado na Tabela 3 acima, através da taxa acumulativa de eluição do Exemplo 1, do Exemplo 1-2 e do Exemplo 1-4 de acordo com a presente descrição, confirmou- se que a liberação do peptídeo de colágeno encapsulado nas microesferas de policaprolactona liberou gradualmente mais de 56 dias.

[0095] Mais detalhadamente, foi confirmado que quanto maior a quantidade de peptídeo de colágeno encapsulado na microesfera, maior a liberação inicial e mais rápida a taxa de liberação. Por outro lado, no caso da microesfera produzida de acordo com o Exemplo Comparativo 1 e não de acordo com a presente invenção, exibiu uma alta taxa de eluição desde o estágio inicial da eluição, e mostrou um comportamento de liberação rápida de cerca de 69% do peptídeo de colágeno encapsulado por 4 dias. Em cerca de 14 dias, foi confirmado que a eluição do peptídeo de colágeno estava quase completada e a duração não foi longa. Considerando que a quantidade de peptídeo de colágeno e solvente usado para preparar a fase dispersa foi excessivamente maior do que no Exemplo 1, no Exemplo 1-2 e no Exemplo 1-4 e a eficiência do encapsulamento também foi diminuída, foi previsto que os peptídeos de colágeno formaram canais não uniformes dentro das microesferas, e o peptídeo de colágeno foi rapidamente liberado através da difusão no canal formado.

[0096] Através dos resultados da taxa de eluição acumulativa dos Exemplos 1-1, 2 e 2, confirmou-se que quando a viscosidade do polímero usado para preparar a fase dispersa aumentava, a taxa de liberação do peptídeo de colágeno encapsulado diminuía. Isso foi previsto porque não apenas a taxa de degradação da microesfera diminui com o aumento do peso molecular do polímero, mas também a taxa de difusão do peptídeo de colágeno na microesfera no eluato diminui devido ao efeito da taxa de degradação lenta do polímero.

Claims (14)

1. Microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno caracterizada pelo fato de que compreende 0,01 a 7% em peso de peptídeo de colágeno com base no total de 100% em peso da microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno e tendo um tamanho médio de partícula de 10 a 100 μm, em que a policaprolactona tem uma viscosidade intrínseca de 0,16 a 1,90 dL/g; a microesfera tem um valor de amplitude de 1,0 ou menos; e o peptídeo de colágeno é pelo menos um selecionado do grupo que consiste em KTTKS, GHK e AHK.

2. Método para preparar uma microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno conforme definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) preparar uma fase dispersa dissolvendo policaprolactona em um primeiro solvente e dissolvendo peptídeo de colágeno em um segundo solvente para preparar cada solução e, em seguida, misturando uniformemente as duas soluções para preparar uma única solução; (b) preparar uma emulsão misturando a fase dispersa com uma solução aquosa (fase contínua) contendo um tensoativo; (c) formar uma microesfera extraindo e evaporando solventes orgânicos da fase dispersa em uma fase contínua na emulsão preparada na etapa (b); e (d) recuperar a microesfera da fase contínua da etapa (c) para preparar uma microesfera de policaprolactona, em que a policaprolactona tem uma viscosidade intrínseca de 0,16 a 1,90 dL/g; a microesfera tem um valor de amplitude de 1,0 ou menos; e o peptídeo de colágeno é pelo menos um selecionado do grupo que consiste em KTTKS, GHK e AHK.

3. Método para preparar uma microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o primeiro solvente da etapa (a) é pelo menos um selecionado do grupo que consiste em diclorometano, clorofórmio, acetato de etila, metiletilcetona e um solvente misturado dos mesmos.

4. Método para preparar uma microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o segundo solvente da etapa (a) é pelo menos um selecionado do grupo que consiste em álcool metílico, álcool etílico, acetona, acetonitrila, dimetilssulfóxido, dimetilformamida, N-metilpirrolidona, ácido acético e uma mistura dos mesmos.

5. Método para preparar uma microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o tensoativo da etapa (b) é pelo menos um selecionado do grupo que consiste em metilcelulose, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulose, lecitina, gelatina, álcool polivinílico, éster de ácido graxo de polioxietileno sorbitano, derivados de polioxietileno óleo de rícino e misturas dos mesmos.

6. Método para preparar uma microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o tensoativo da etapa (b) está contido em uma quantidade de 0,01% em p/v a 20% em p/v com base no volume total da solução aquosa contendo o tensoativo.

7. Enchimento de microesferas de policaprolactona caracterizado pelo fato de que compreende 2 a 50% em peso de uma microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno conforme definida na reivindicação 1, que compreende 0,01 a 7% em peso do peptídeo de colágeno e tem um tamanho médio de partícula de 10 a 100 μm; 0,1 a 5% em peso de um soluto; 0 a 48% em peso de um lubrificante; e 15 a 97,9% em peso de um carreador aquoso farmaceuticamente aceitável, com base no total de 100% em peso do enchimento de microesferas de policaprolactona, em que a policaprolactona tem uma viscosidade intrínseca de 0,16 a 1,90 dL/g; a microesfera tem um valor de amplitude de 1,0 ou menos; e o peptídeo de colágeno é pelo menos um selecionado do grupo que consiste em KTTKS, GHK e AHK.

8. Enchimento de microesferas de policaprolactona, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o soluto é pelo menos um selecionado do grupo que consiste em carboximetilcelulose (CMC), hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), ácido hialurônico, lidocaína, polidesoxirribonucleotídeo (PDRN), polinucleotídeo (PN) e uma mistura dos mesmos.

9. Enchimento de microesferas de policaprolactona, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o lubrificante é glicerina.

10. Enchimento de microesferas de policaprolactona, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o carreador aquoso farmaceuticamente aceitável é água destilada, solução salina fisiológica ou tampão fosfato.

11. Enchimento de microesferas de policaprolactona, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o enchimento é para melhorar rugas, reparar tecidos moles ou expandir o volume ou corrigir contornos.

12. Enchimento de microesferas de policaprolactona, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o enchimento é para uma injeção.

13. Seringa pré-enchida, caracterizada pelo fato de que é enchida com o enchimento de microesferas de policaprolactona conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 12.

14. Uso de uma microesfera de policaprolactona contendo peptídeo de colágeno conforme definida na reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que é na produção de um enchimento de microesferas de policaprolactona para melhorar rugas, reparar tecidos moles ou expandir o volume, ou corrigir contornos.