BR112020013865A2 - fragmento de dna, vetor recombinante, transformante e enzima de fixação de nitrogênio - Google Patents
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Abstract
Este fragmento de DNA codifica uma enzima de fixação de nitrogênio e apresenta uma sequência base da SEQ ID N°: 1 ou uma sequência base que apresenta uma homologia de 50% ou mais com a sequência base da SEQ ID N°: 1. Este vetor recombinante contém o fragmento de DNA. Este transformante é transformado com o vetor recombinante. Esta enzima de fixação de nitrogênio é expressa pelo transformante. A enzima de fixação de nitrogênio compreende qualquer uma ou mais sequências de aminoácidos das SEQ ID Nos: 34 a 65.
Description
[0001] A presente invenção se refere a um fragmento de DNA que codifica uma enzima de fixação de nitrogênio, um vetor recombinante que contém o fragmento de DNA, um transformante transformado pelo vetor recombinante e uma enzima de fixação de nitrogênio.
[0002] Em geral, Escherichia coli é inibida de crescer em um meio sem qualquer fonte de nitrogênio (cloreto de amônio, nitrato de sódio, etc.) e, portanto, é necessário adicionar uma fonte de nitrogênio ao meio para sua multiplicação.
[0003] Como um processo de fixação de nitrogênio que não seja o processo convencional de Haber-Bosch, existe um processo enzimático que usa nitrogenase. Nesse processo, o nitrogênio atmosférico pode ser fixado como amônia em um ambiente à temperatura comum e pressão normais. Portanto, na presença de nitrogenase, é possível eliminar a necessidade da adição acima mencionada de uma fonte de nitrogênio.
[0004] Por outro lado, a nitrogenase é uma enzima de metal que contém V ou Mo (consultar, por exemplo, Literatura de Patente 1)
LITERATURA DE PATENTE Literatura de Patente 1: JP 2016/136972 A (parágrafos 0006 e 0007)
[0005] No entanto, se a fixação de nitrogênio for realizada usando Escherichia coli com nitrogenase introduzida no mesmo, um elemento metálico como centro ativo, como, por exemplo, V ou Mo, não é suficiente e, portanto, a adição de elemento metálico como, por exemplo, V ou Mo, é essencialmente necessária de modo a multiplicar Escherichia coli com nitrogenase introduzida no mesmo em um meio sem nenhuma fonte de nitrogênio.
[0006] É um objeto da invenção fornecer um fragmento de DNA que codifique uma enzima de fixação de nitrogênio que permita a eliminação da necessidade de uma fonte de nitrogênio exigida para ser adicionada a um meio para multiplicação de Escherichia coli, um vetor recombinante que contém o fragmento de DNA, um transformante transformado pelo vetor recombinante e a enzima de fixação de nitrogênio.
[0007] Um outro objeto da invenção é fornecer um fragmento de DNA que codifique uma enzima de fixação de nitrogênio que permita a multiplicação de Escherichia coli sem adicionar um elemento metálico, como, por exemplo, V ou Mo, a um meio, um vetor recombinante que contém o fragmento de DNA, um transformante transformado pelo vetor recombinante e a enzima de fixação de nitrogênio.
[0008] De acordo com uma modalidade da invenção, são fornecidos um fragmento de DNA, um vetor recombinante, um transformante e uma enzima de fixação de nitrogênio definidos por [1] a [12] abaixo. A enzima de fixação de nitrogênio, conforme usada no presente documento, significa uma enzima que promove a multiplicação (crescimento) de Escherichia coli em um meio sem qualquer fonte de nitrogênio (cloreto de amônio, nitrato de sódio, etc.).
[1] Um fragmento de DNA para codificar uma enzima de fixação de nitrogênio que compreende uma sequência base da SEQ ID N°: 1 ou uma sequência base que apresenta não menos que 50% de identidade com a SEQ ID N°: 1.
[2] O fragmento de DNA, de acordo com o item [1], em que o fragmento de DNA que compreende a sequência base da SEQ ID N°: 1 é derivado de um DNA genômico de cianobactérias.
[3] Um fragmento de DNA para codificar uma enzima de fixação de nitrogênio que compreende qualquer uma ou mais sequências base da SEQ ID Nos: 2 a 33.
[4] O fragmento de DNA, de acordo com o item [3], em que o fragmento de DNA é derivado de um DNA genômico de cianobactérias.
[5] O fragmento de DNA, de acordo com o item [2] ou [4], em que as cianobactérias compreendem Cyanothece sp. ATCC 51142.
[6] Um vetor recombinante que compreende o fragmento de DNA de acordo com qualquer um dos itens [1] a [5].
[7] O vetor recombinante, de acordo com o item [6], que compreende um vetor de fosmídeo que compreende o fragmento de DNA incorporado ao mesmo.
[8] Um transformante transformado pelo vetor recombinante de acordo com o item [6] ou [7].
[9] Uma enzima de fixação de nitrogênio expressa pelo transformante de acordo com o item [8].
[10] Uma enzima de fixação de nitrogênio que compreende uma mesma sequência de aminoácidos que a enzima de fixação de nitrogênio de acordo com o item [9], ou uma sequência de aminoácidos que apresenta não menos que 40% de identidade com a sequência de aminoácidos.
[11] A enzima de fixação de nitrogênio, de acordo com o item [9] ou [10], que compreende qualquer uma ou mais sequências de amino das SEQ ID Nos: 34 a
65.
[12] Uma enzima de fixação de nitrogênio que compreende qualquer uma ou mais sequências de amino das SEQ ID Nos: 34 a 65.
[0009] De acordo com uma modalidade da invenção, é possível fornecer um fragmento de DNA para codificar uma enzima de fixação de nitrogênio que permita a eliminação da necessidade de uma fonte de nitrogênio exigida para ser adicionada a um meio para multiplicação de Escherichia coli, um vetor recombinante que contém o fragmento de DNA, um transformante transformado pelo vetor recombinante e a enzima de fixação de nitrogênio.
[0010] Além disso, de acordo com uma modalidade, é possível fornecer um fragmento de DNA para codificar uma enzima de fixação de nitrogênio que permita a multiplicação de Escherichia coli sem adicionar um elemento metálico, como, por exemplo, V ou Mo, a um meio, um vetor recombinante que contém o fragmento de DNA, um transformante transformado pelo vetor recombinante e a enzima de fixação de nitrogênio.
[0011] A Figura 1 é um diagrama explicativo que ilustra uma posição de um fragmento de DNA em uma modalidade da presente invenção em um DNA genômico e em trinta e duas fases de leitura abertas contidas no fragmento de DNA.
[0012] A Figura 2 é um diagrama explicativo que ilustra uma posição em um vetor de fosmídeo no qual o fragmento de DNA na modalidade da invenção é incorporado.
[0013] A Figura 3 é um gráfico que mostra os resultados da avaliação da capacidade de fixação de nitrogênio no Exemplo.
[0014] A Figura 1 é um diagrama explicativo que ilustra uma posição de um fragmento de DNA em uma modalidade da invenção em um DNA genômico e em trinta e duas fases de leitura abertas contidas no fragmento de DNA.
[0015] Um fragmento de DNA 2 na modalidade da invenção apresenta uma sequência base da SEQ ID N°: 1 ou uma sequência base que apresenta não menos que 50% de identidade com a SEQ ID N°: 1, que codifica uma enzima de fixação de nitrogênio. Na modalidade da invenção, a enzima de fixação de nitrogênio significa uma enzima de fixação de nitrogênio que permite eliminar a necessidade de uma fonte de nitrogênio exigida para ser adicionada a um meio para multiplicação de Escherichia coli, ou uma enzima de fixação de nitrogênio que permite a multiplicação de Escherichia coli sem adicionar um elemento metálico exigido para a nitrogenase, como, por exemplo, V ou Mo, a um meio. Em uma modalidade mais desejável da invenção, significa uma enzima de fixação de nitrogênio que é ativa em organismos fotossintéticos que produzem oxigênio, como, por exemplo, algas ou plantas.
[0016] O fragmento de DNA que apresenta uma sequência base da SEQ ID N°: 1 (indicado pelo número 2 na Figura 1) é derivado, por exemplo, de um DNA genômico (indicado pelo número 1 na Figura 1) de cianobactérias (também chamada de alga verde-azul) (uma sequência base 31247, de 2982634ª a 3013880ª). As cianobactérias são, por exemplo, Cyanothece sp. ATCC 51142. O Cyanothece sp. O ATCC 51142 pode ser obtido a partir, por exemplo, da Coleção Americana de Cultura (ATCC).
[0017] A sequência base que codifica a enzima de fixação de nitrogênio pode ser uma sequência base que apresenta não menos que 50% de identidade com a SEQ ID N°: 1 e é, preferencialmente, uma sequência base que apresenta não menos que 60% de identidade com a SEQ ID N°: 1, mais preferencialmente, uma sequência base que apresenta não menos que 70% de identidade com a SEQ ID N°: 1, ainda mais preferencialmente, uma sequência base que apresenta não menos que 80% de identidade com a SEQ ID N°: 1, ainda mais preferencialmente, uma sequência base que apresenta não menos que 90% de identidade com a SEQ ID N°: 1, ainda mais preferencialmente, uma sequência base que apresenta não menos que 95% de identidade com a SEQ ID N°: 1 e, ainda mais preferencialmente, uma sequência base que apresenta não menos que 98% de identidade com a SEQ ID N°: 1.
[0018] O fragmento de DNA que apresenta uma sequência base da SEQ ID N°: 1 ou uma sequência base que apresenta não menos de 50% de identidade com a SEQ ID N°: 1 pode ser sintetizado artificialmente por um procedimento de engenharia genética.
[0019] O fragmento de DNA na modalidade da invenção apresenta qualquer uma ou mais sequências base das SEQ ID Nos: 2 a 33 que codificam a enzima de fixação de nitrogênio. As sequências base das SEQ ID Nos: 2 a 33 correspondem, respectivamente, a fases de leitura abertas (ID do Gene: de cce_2943 a cce_2974) mostradas na Figura 1. O ID do gene é definido em, por exemplo, CyanoBase ([genome.microbedb.jp/cyanobase/]) ou KEGG, Enciclopédia de Kyoto de Genes e Genomas ([http://www.genome.jp/kegg/]).
[0020] O fragmento de DNA na modalidade da invenção apresenta preferencialmente não menos que 5, mais preferencialmente, não menos que 10, ainda mais preferencialmente, não menos que 15, ainda preferencialmente, não menos que 20, ainda preferencialmente, não menos que 25, ainda preferencialmente, não menos que 28, e ainda preferencialmente, não menos que 30 sequências base das SEQ ID Nos: 2 a 33. A ordem das sequências base das SEQ ID Nos: 2 a 33 pode ser alterada, mas, preferencialmente, não é alterada.
[0021] O fragmento de DNA 2 na modalidade da invenção mostrada na Figura 1 apresenta a sequência base da SEQ ID N°: 1 e também apresenta todas as sequências base das SEQ ID Nos: 2 a 33. O fragmento de DNA 2 na modalidade da invenção pode apresentar uma sequência base diferente das sequências base das SEQ ID Nos: 2 a 33 e pode apresentar, por exemplo, uma sequência base de tRNA (ID do Gene: cce_RNA037).
[0022] O fragmento de DNA que apresenta qualquer uma ou mais sequências base das SEQ ID Nos: 2 a 33 é derivado, por exemplo, de um DNA genômico de cianobactérias. As cianobactérias são, por exemplo, Cyanothece sp. ATCC 51142.
[0023] O fragmento de DNA 2 pode ser isolado a partir de um DNA genômico de cianobactéria seguindo o procedimento de operação comumente realizado, conforme descrito nos itens 1 a 5 abaixo. Mais detalhadamente, é possível isolar de acordo com, por exemplo, o Exemplo que é descrito mais adiante. O procedimento de cada operação não é especificamente limitado e vários métodos conhecidos podem ser empregados.
1. Cultura de massa de Cianobactérias
2. Extração e Fragmentação do DNA Genômico de cianobactérias: Como um passo para aumentar a pureza do DNA, os polissacarídeos podem ser removidos após a fragmentação.
3. Clonagem (1) Modificar as extremidades dos fragmentos de DNA (2) Classificar de acordo com o tamanho por eletroforese (por exemplo, usando uma agarose de baixo ponto de fusão para a separação de polímeros, a 18 V por 24 horas) (3) Coletar fragmentos de DNA de cerca de 25 a 40 kb (4) Inserir cada um dos fragmentos de DNA coletados em um vetor (por exemplo, um vetor de fosmídeo), formando, desse modo, vetores com vários fragmentos de DNA (vetores recombinantes)
4. Produzir Transformante (1) Os vetores com vários fragmentos de DNA são introduzidos
(empacotamento) em bacteriófagos (2) Infectar o Hospedeiro, como, por exemplo, Escherichia coli, com os bacteriófagos acima (1), obtendo, desse modo, Escherichia coli que apresenta vetores com vários fragmentos de DNA (transformantes) (3) Os transformantes são cultivados em meio de ágar e obtidos, então, como colônias.
5. Varredura (1) Selecionar Escherichia coli, que pode ser cultivada em meios que não contêm nenhuma fonte de nitrogênio (um composto de nitrogênio, como, por exemplo, cloreto de amônio, nitrato de sódio) (2) Extrair os vetores da Escherichia coli (3) Decodificar informações genéticas dos fragmentos de DNA inseridos nos vetores
[0024] O fragmento de DNA que apresenta qualquer uma ou mais sequências base das SEQ ID Nos: 2 a 33 pode ser sintetizado artificialmente por um procedimento de engenharia genética.
[0025] A Figura 2 é um diagrama explicativo que ilustra uma posição em um vetor de fosmídeo no qual o fragmento de DNA na modalidade da invenção é incorporado.
[0026] Um vetor recombinante 3 na modalidade da invenção contém o fragmento de DNA acima descrito na modalidade da invenção. O vetor recombinante 3 é obtido, de preferência, incorporando (inserindo) o fragmento de DNA em um vetor de fosmídeo, mas não está limitado a ele. Isso pode ser obtido por incorporação, por exemplo, em um vetor plasmídeo, um vetor de cosmídeo ou um vetor de vírus, etc.
[0027] O vetor recombinante 3 na modalidade da invenção pode ser obtido, por exemplo, seguindo o procedimento de operação acima mencionado para isolar o fragmento de DNA 2 do DNA genômico das cianobactérias.
[0028] O transformante na modalidade da invenção é obtido através da transformação de um hospedeiro, como, por exemplo, Escherichia coli, usando o vetor recombinante acima descrito na modalidade da invenção.
[0029] O transformante na modalidade da invenção pode ser obtido, por exemplo, seguindo o procedimento de operação acima mencionado para isolar o fragmento de DNA 2 do DNA genômico das cianobactérias.
[0030] A enzima de fixação de nitrogênio na modalidade da invenção é expressa pelo transformante acima descrito na modalidade da invenção. A enzima de fixação de nitrogênio na modalidade da invenção apresenta, preferencialmente, sequências de amino das SEQ ID Nos: 34 a 65 que são dispostas nessa ordem (com a SEQ ID N°: 34 no lado esquerdo da extremidade e a SEQ ID N°: 65 no lado direito da extremidade) e, respectivamente, correspondem às sequências base das SEQ ID Nos: 2 a 33 (consultar Tabela 1 abaixo; SEQ ID N°: 2 corresponde à SEQ ID N°: 34, … e SEQ ID N°: 33 corresponde à SEQ ID N°: 65. Qualquer uma ou mais sequências de aminoácidos das SEQ ID Nos: 34 a 65 podem ser sequências de aminoácidos nas quais um ou mais aminoácidos são inseridos, substituídos, excluídos e/ou adicionados e que codificam uma enzima de fixação de nitrogênio funcionalmente equivalente à enzima de fixação de nitrogênio descrita acima (o mesmo aplicado à enzima de fixação de nitrogênio em uma outra modalidade da invenção descrita mais adiante). Em tal enzima de fixação de nitrogênio, por exemplo, 1 a 30, preferencialmente, 1 a 20, mais preferencialmente, 1 a 10, ainda preferencialmente, 1 a 5, mais preferencialmente, 1 a 2 aminoácidos podem ser inseridos, substituídos, excluídos e/ou adicionados (o mesmo aplicado à enzima de fixação de nitrogênio em uma outra modalidade da invenção descrita mais adiante).
TABELA 1 Gene Produto gênico
ID do Tipo de Tipo Número Topolo Comp SEQ ID da Tipo de Tipo Topol Com SEQ gene Sequên molecul de gia riment ID N°. Proteína Sequên mole ogia prime ID cia ar filament o (bp) cia cular nto N°. ID da os NCBI-ID (aa) CyanoBas da e) Proteína) cce_2943 DNA cDNA Filament Linear 1.665 2 ACB5229 Aminoá Prote Linea 554 34 o duplo 1 cidos ína r cce_2944 DNA cDNA Filament Linear 3.198 3 ACB5229 Aminoá Prote Linea 1.065 35 o duplo 2 cidos ína r cce_2945 DNA cDNA Filament Linear 1.572 4 ACB5229 Aminoá Prote Linea 523 36 o duplo 3 cidos ína r cce_2946 DNA cDNA Filament Linear 885 5 ACB5229 Aminoá Prote Linea 294 37 o duplo 4 cidos ína r cce_2947 DNA cDNA Filament Linear 525 6 ACB5229 Aminoá Prote Linea 174 38 o duplo 5 cidos ína r cce_2948 DNA cDNA Filament Linear 465 7 ACB5229 Aminoá Prote Linea 154 39 o duplo 6 cidos ína r cce_2949 DNA cDNA Filament Linear 600 8 ACB5229 Aminoá Prote Linea 199 40 o duplo 7 cidos ína r cce_2950 DNA cDNA Filament Linear 321 9 ACB5229 Aminoá Prote Linea 106 41 o duplo 8 cidos ína r cce_2951 DNA cDNA Filament Linear 1.566 10 ACB5229 Aminoá Prote Linea 521 42 o duplo 9 cidos ína r cce_2952 DNA cDNA Filament Linear 183 11 ACB5230 Aminoá Prote Linea 60 43 o duplo 0 cidos ína r cce_2953 DNA cDNA Filament Linear 345 12 ACB5230 Aminoá Prote Linea 114 44 o duplo 1 cidos ína r cce_2954 DNA cDNA Filament Linear 702 13 ACB5230 Aminoá Prote Linea 233 45 o duplo 2 cidos ína r cce_2955 DNA cDNA Filament Linear 486 14 ACB5230 Aminoá Prote Linea 161 46 o duplo 3 cidos ína r cce_2956 DNA cDNA Filament Linear 96 15 ACB5230 Aminoá Prote Linea 31 47 o duplo 4 cidos ína r cce_2957 DNA cDNA Filament Linear 714 16 ACB5230 Aminoá Prote Linea 237 48 o duplo 5 cidos ína r cce_2958 DNA cDNA Filament Linear 543 17 ACB5230 Aminoá Prote Linea 180 49 o duplo 6 cidos ína r cce_2959 DNA cDNA Filament Linear 912 18 ACB5230 Aminoá Prote Linea 303 50 o duplo 7 cidos ína r cce_2960 DNA cDNA Filament Linear 99 19 ACB5230 Aminoá Prote Linea 32 51 o duplo 8 cidos ína r cce_2961 DNA cDNA Filament Linear 933 20 ACB5230 Aminoá Prote Linea 310 52 o duplo 9 cidos ína r cce_2962 DNA cDNA Filament Linear 780 21 ACB5231 Aminoá Prote Linea 259 53 o duplo 0 cidos ína r cce_2963 DNA cDNA Filament Linear 816 22 ACB5231 Aminoá Prote Linea 271 54 o duplo 1 cidos ína r cce_2964 DNA cDNA Filament Linear 129 23 ACB5231 Aminoá Prote Linea 42 55 o duplo 2 cidos ína r cce_2965 DNA cDNA Filament Linear 267 24 ACB5231 Aminoá Prote Linea 88 56 o duplo 3 cidos ína r cce_2966 DNA cDNA Filament Linear 1.065 25 ACB5231 Aminoá Prote Linea 354 57 o duplo 4 cidos ína r cce_2967 DNA cDNA Filament Linear 1.107 26 ACB5231 Aminoá Prote Linea 368 58 o duplo 5 cidos ína r cce_2968 DNA cDNA Filament Linear 444 27 ACB5231 Aminoá Prote Linea 147 59 o duplo 6 cidos ína r cce_2969 DNA cDNA Filament Linear 285 28 ACB5231 Aminoá Prote Linea 94 60 o duplo 7 cidos ína r cce_2970 DNA cDNA Filament Linear 1.011 29 ACB5231 Aminoá Prote Linea 336 61 o duplo 8 cidos ína r cce_2971 DNA cDNA Filament Linear 1.560 30 ACB5231 Aminoá Prote Linea 519 62 o duplo 9 cidos ína r cce_2972 DNA cDNA Filament Linear 387 31 ACB5232 Aminoá Prote Linea 128 63 o duplo 0 cidos ína r cce_2973 DNA cDNA Filament Linear 1.221 32 ACB5232 Aminoá Prote Linea 406 64 o duplo 1 cidos ína r cce_2974 DNA cDNA Filament Linear 204 33 ACB5232 Aminoá Prote Linea 67 65 o duplo 2 cidos ína r
[0031] Alternativamente, a enzima de fixação de nitrogênio na modalidade da invenção pode apresentar qualquer uma ou mais sequências de amino das SEQ ID Nos: 34 a 65.
[0032] A enzima de fixação de nitrogênio na modalidade da invenção apresenta preferencialmente não menos que 5, mais preferencialmente, não menos que 10, ainda mais preferencialmente, não menos que 15, ainda preferencialmente, não menos que 20, ainda preferencialmente, não menos que 25, ainda preferencialmente, não menos que 28, e ainda preferencialmente, não menos que 30 sequências de amino das SEQ ID Nos: 34 a 65. A ordem das sequências de amino das SEQ ID Nos: 34 a 65 podem ser alteradas, mas, preferencialmente, não é alterada.
[0033] Além disso, a enzima de fixação de nitrogênio em uma outra modalidade da invenção não está limitada à expressa pelo transformante acima descrito na modalidade da invenção, desde que seja uma enzima de fixação de nitrogênio que apresente a mesma sequência de aminoácidos que a da enzima de fixação de nitrogênio acima descrita na modalidade da invenção. Por exemplo, pode ser, por exemplo, aquele sintetizado por um sintetizador de proteína comercialmente disponível.
[0034] A enzima de fixação de nitrogênio descrita acima não se limita àquela que apresenta a mesma sequência de aminoácidos que a da enzima de fixação de nitrogênio acima descrita na modalidade da invenção e pode ser uma enzima de fixação de nitrogênio com uma sequência de aminoácidos que apresenta não menos de 40% de identidade com a dita sequência de aminoácidos. É preferencialmente uma enzima de fixação de nitrogênio com uma sequência de aminoácidos que apresente não menos que 50% de identidade com a dita sequência de aminoácidos, mais preferencialmente, uma enzima de fixação de nitrogênio com uma sequência de aminoácidos que apresente não menos que 60% de identidade com a dita sequência de aminoácidos, ainda mais preferencialmente, uma enzima de fixação de nitrogênio com uma sequência de aminoácidos que apresente não menos que 70% de identidade com a dita sequência de aminoácidos, ainda mais preferencialmente, uma enzima de fixação de nitrogênio com uma sequência de aminoácidos que apresente não menos que 80% de identidade com a dita sequência de aminoácidos, ainda mais preferencialmente, uma enzima de fixação de nitrogênio com uma sequência de aminoácidos que apresente não menos que 90% de identidade com a dita sequência de aminoácidos, ainda mais preferencialmente, uma enzima de fixação de nitrogênio com uma sequência de aminoácidos que apresente não menos que 95% de identidade com a dita sequência de aminoácidos e, ainda mais preferencialmente, uma enzima de fixação de nitrogênio com uma sequência de aminoácidos que apresente não menos que 98% de identidade com a dita sequência de aminoácidos.
[0035] A enzima de fixação de nitrogênio com uma sequência de aminoácidos que apresenta não menos que 40% de identidade com a enzima de fixação de nitrogênio acima descrita pode ser sintetizada artificialmente por um sintetizador de proteína disponível comercialmente.
[0036] "Identidade" da sequência base ou da sequência de aminoácidos, conforme usado no presente documento, significa um nível de homologia de bases ou resíduos de aminoácidos, constituindo cada sequência entre as sequências a serem comparadas. Em relação à sequência de aminoácidos, é levada em consideração uma presença de vãos e propriedades de aminoácidos (Wilbur, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:726 a 730 (1983)). Para calcular a identidade, é possível usar o BLAST (Altschul: J. Mol. Biol. 215: 403 a 410 (1990)) ou FASTA (Peasron: Methods in Enzymology 183:63 a 69 (1990)), etc., que são softwares comercialmente disponíveis. Quaisquer valores numéricos para “identidade” precisam apenas ser valores numéricos calculados por um programa de pesquisa de homologia conhecido por aqueles que são versados na técnica e podem ser calculados usando, por exemplo, parâmetros padrão (configuração inicial) no algoritmo de homologia BLAST (Ferramenta Básica de Busca de Alinhamento Local) http:/www./ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ do Centro Nacional de Informações de Biotecnologia (NCBI).
[0037] Os seguintes efeitos são obtidos nas modalidades da invenção. (1) É possível fornecer um fragmento de DNA que codifique uma enzima de fixação de nitrogênio que permita a eliminação da necessidade de uma fonte de nitrogênio exigida para ser adicionada a um meio para multiplicação de Escherichia coli, um vetor recombinante que contém o fragmento de DNA, um transformante transformado pelo vetor recombinante e a enzima de fixação de nitrogênio. (2) É possível fornecer um fragmento de DNA que codifique uma enzima de fixação de nitrogênio que permita a multiplicação de Escherichia coli sem adicionar um elemento metálico raro, como, por exemplo, V ou Mo, a um meio, um vetor recombinante que contém o fragmento de DNA, um transformante transformado pelo vetor recombinante e a enzima de fixação de nitrogênio. (3) A enzima de fixação de nitrogênio é expressa usando um gene derivado de cianobactérias, que é um organismo fotossintético que produz oxigênio (é uma enzima de fixação de nitrogênio diferente da nitrogenase). Portanto, é possível realizar a fixação de nitrogênio em organismos fotossintéticos que produzem oxigênio, como, por exemplo, algas ou plantas. (4) É uma reação de fixação de nitrogênio com economia de energia que funciona sob temperatura comum e pressão normal e, portanto, é possível reduzir significativamente o custo de energia em comparação com o processo de Haber- Bosch, que exige uma grande quantidade de energia em um ambiente de temperatura e alta pressão. (5) Ao introduzir o fragmento de DNA na modalidade da invenção em bactérias, algas ou plantas industrialmente úteis, é possível obter uma espécie que pode ser cultivada sem a necessidade de fertilizante de nitrogênio (amônia, cloreto de amônio, nitrato de sódio, etc.).
[0038] A invenção será descrita em mais detalhes abaixo com base nos Exemplos abaixo. No entanto, a invenção não se limita aos mesmos.
[0039] Um DNA genômico extraído de cianobactérias Cyanothece sp. ATCC 51142 (número de ATCC (número de acesso): 51142) foi fisicamente partido, em detalhes, uma solução de DNA genômico extraído foi elaborada e distribuída cinco vezes por uma ponta de pipeta de ponta fina (da Quality Scientific Plastics, Inc.) e as extremidades sem corte foram geradas pela End-Repair Enzyme Mix (da Epicenter) Alternativamente, o vórtice ou a sonicação, etc., podem ser usados para o corte físico. Os fragmentos de DNA com extremidades cegas foram classificados por tamanho usando eletroforese e os fragmentos de DNA que apresentam um comprimento médio de filamento de 25 a 40 kb foram extraídos. Em seguida, os fragmentos de DNA foram ligados respectivamente aos Vetores de Fosmídeo CopyControl™ pCC2FOS™ (da Epicenter) que apresentam um gene de resistência ao cloranfenicol (cortado e linearizado no local Eco72 I (entre 382o C e 383o G) e desfosforilado) (consultar a Figura 2. A ligase de T4DNA (de TaKaRa) foi usada para ligação aos vetores de fosmídeo. MaxPlax™Lambda Packaging Extracts (da Epicentre) foram usadas para empacotamento in vitro dos fragmentos de DNA ligados aos vetores de fosmídeo. E. coli EPI-300T1R (da Epicentre) (doravante no presente documento, denominada EPI300), que é Escherichia coli, foi usado como um microrganismo hospedeiro. Em seguida, Escherichia coli transformada (transformante) foi obtido em placas de agar em meio LB (LB / Cm) contendo 12,5 mg/ml de cloranfenicol.
[0040] Uma colônia de Escherichia coli transformada foi colhida e colocada em 4 ml de meio LB (LB / Cm) contendo 12,5 mg/ml de cloranfenicol e cultivada ao ar a 37 °C e 180 rpm por 18 horas. Em seguida, a Escherichia coli cultivada foi coletada, lavada três vezes com um meio M9-N (0,6% de Na2HPO4, 0,3% de KH2PO4, 0,05% de NaCl, 0,2% de glicose, 0,00147% de CaCl2×2H2O, 0,05% de MgSO4×7H2O, 0,01% de L-leucina) que não contém nenhuma fonte de nitrogênio (um composto de nitrogênio, como, por exemplo, cloreto de amônio, nitrato de sódio) e foi, então, ressuspenso com um meio M9-N. A suspensão de Escherichia coli preparada foi colocada em uma placa de ágar de meio M9-N (M9-N / Cm) contendo 12,5 mg/ml de cloranfenicol e foi cultivada a 37 °C por 72 horas. A colônia obtida foi subcultivada em uma placa de ágar de meio M9-N (M9-N / Cm) novamente, e uma cepa que mostra que o cultivo foi isolado como um clone com fenótipo de fixação de nitrogênio. O clone foi nomeado Transformante 1.
[0041] Em seguida, uma sequência base inserida no vetor de fosmídeo do clone que exibe fenótipo de fixação de nitrogênio foi analisada. Como um resultado, foi verificado que a sequência base anteriormente descrita da SEQ ID N°: 1 foi inserida no transformante 1. Nessa sequência base, foi verificado que as trinta e duas fases de leitura abertas mencionadas anteriormente que apresentam as sequências base das SEQ ID Nos: 2 a 33 estão contidas e codificam respectivamente as sequências de amino descritas anteriormente das SEQ ID Nos: 34 a 65. As sequências de aminoácidos dessas proteínas não são homólogas à proteína fixadora de nitrogênio (nitrogenase) conhecida e, portanto, foi julgado que a enzima de fixação de nitrogênio e o fragmento de DNA que a codifica, que foram obtidos neste exemplo, são inovadores. A sequência base inserida no vetor de fosmídeo foi analisada usando iniciadores pCC2 direto-b e pCC2 inverso-b. As sequências base dos iniciadores usados são as seguintes; pCC2 direto-b; CCAGTCACGACGTTGTAAAACG pCC2 inverso-b; CGCCAAGCTATTTAGGTGAGAC
[0042] Usando um meio M9-N que não contém fonte de nitrogênio, foi realizado um teste de multiplicação para avaliar a capacidade de fixação de nitrogênio do transformante 1. O transformante 1 (Exemplo 1) e o EPI300 com um Vetor de Fosmídeo pCC2FOS™ (da Epicenter) sem inserção de fragmento de DNA descrito acima (Exemplo Comparativo 1) foram cultivados por 24 horas em meios M9+N (M9+N/Cm), cada um obtido através da adição de 0,1% de cloreto de amônio como uma fonte de nitrogênio a um meio M9-N e as células bacterianas foram coletadas, lavadas três vezes com um meio M9-N e, então, inoculadas em 5 ml de um meio M9- N (M9-N/Cm), de modo que a densidade óptica em um comprimento de onda de 660 nm (doravante no presente documento, descrita como OD660) foi 0,02. A cultura de agitação foi realizada a 37 °C e 45 rpm usando um pequeno aparelho de cultura de agitação [Bio Photo Recorder (marca registrada) TVS062CA, de Toyo Co., Ltd.] e o OD660 do caldo foi medido a cada hora. Os resultados do teste de multiplicação são mostrados na Figura 3.
[0043] No meio M9-N (M9-N/Cm) que não contém uma fonte de nitrogênio, a multiplicação de Escherichia coli EPI-300 (Exemplo Comparativo 1) foi inibida significativamente, porém o transformante 1 (Exemplo 1) exibiu uma multiplicação rápida. Esse resultado mostra que a capacidade de fixação de nitrogênio pode ser fornecida através da introdução do fragmento de DNA, obtido neste exemplo, e codificando a enzima de fixação de nitrogênio em Escherichia coli.
[0044] A invenção não está limitada às modalidades e ao Exemplo e pode ser alterada de várias maneiras.
LISTA DE SINAIS DE REFERÊNCIA 1 DNA GENÔMICO 2 FRAGMENTO DE DNA 3 VETOR DE FOSMÍDEO (VETOR RECOMBINANTE)
Claims (12)
1. Fragmento de DNA para codificar uma enzima de fixação de nitrogênio caracterizado por compreender uma sequência base da SEQ ID N°: 1 ou uma sequência base tendo não menos que 50% de identidade com a SEQ ID N°: 1.
2. Fragmento de DNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fragmento de DNA compreendendo a sequência base da SEQ ID N°: 1 é derivado de um DNA genômico de cianobactérias.
3. Fragmento de DNA para codificar uma enzima de fixação de nitrogênio caracterizado por compreender qualquer uma ou mais sequências base das SEQ ID Nos: 2 a 33.
4. Fragmento de DNA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o fragmento de DNA é derivado de um DNA genômico de cianobactérias.
5. Fragmento de DNA, de acordo com a reivindicação 2 ou 4, caracterizado pelo fato de que as cianobactérias compreendem Cyanothece sp. ATCC 51142.
6. Vetor recombinante caracterizado por compreender o fragmento de DNA do tipo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
7. Vetor recombinante, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por compreender um vetor de fosmídeo compreendendo o fragmento de DNA incorporado ao mesmo.
8. Transformante caracterizado por ser transformado pelo vetor recombinante do tipo definido na reivindicação 6 ou 7.
9. Enzima de fixação de nitrogênio caracterizada por ser expressa pelo transformante do tipo definido na reivindicação 8.
10. Enzima de fixação de nitrogênio caracterizada pelo fato de que compreende uma mesma sequência de aminoácidos que a enzima de fixação de nitrogênio, do tipo definido na reivindicação 9, ou uma sequência de aminoácidos tendo não menos que 40% de identidade com a sequência de aminoácidos.
11. Enzima de fixação de nitrogênio, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada por compreender qualquer uma ou mais sequências de amino das SEQ ID Nos: 34 a 65.
12. Enzima de fixação de nitrogênio caracterizada por compreender qualquer uma ou mais sequências de amino das SEQ ID Nos: 34 a 65.
HIRATA & PARTNERS PTBOW-18102BR
1/3 posição (bp) posição (bp)
FIGURA 1
HIRATA & PARTNERS PTBOW-18102BR
2/3
FIGURA 2
HIRATA & PARTNERS PTBOW-18102BR 3/3 MÉDIA M9-N EXEMPLO 1
EXEMPLO COMPARATIVO 1 TEMPO (h) FIGURA 3
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