BR112020010430A2 - biomarcadores e métodos inovadores para diagnosticar e avaliar lesão cerebral traumática - Google Patents

Abstract

A presente divulgação se refere a métodos para diagnosticar e avaliar um sujeito que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça, tal como uma lesão cerebral traumática (TBI). Em particular, a presente divulgação identifica vários biomarcadores, cuja detecção e/ou expressão diferencial pode ser usada para avaliar a presença ou ausência de uma TBI em um sujeito, e pode ser usado como uma base para diagnosticar um sujeito como tendo um tipo específico de TBI (por exemplo, TBI grave ou subclasses de TBI leve). Os vários biomarcadores da TBI podem ser detectados individualmente ou em combinação, e podem ser usados como uma importante ferramenta de diagnóstico, prognóstico e/ou estratificação de risco de TBI como parte da avaliação do estado da TBI do sujeito.

Description

“BIOMARCADORES E MÉTODOS INOVADORES PARA DIAGNOSTICAR E AVALIAR LESÃO CEREBRAL TRAUMÁTICA” Referência Cruzada aos Pedidos Relacionados

[001]Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório U.S. Nº 62/611.778, depositado em 29 de dezembro de 2017 e Pedido Provisório U.S. Nº 62/630.704, depositado em 14 de fevereiro de 2018, todos os quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

Campo

[002]A presente divulgação se refere a métodos para diagnosticar e avaliar um sujeito que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça, tal como uma lesão cerebral traumática (TBI). Em particular, a presente divulgação identifica vários biomarcadores, cuja detecção e/ou expressão diferencial pode ser usada para avaliar a presença ou ausência de uma TBI em um sujeito, e pode ser usada como uma base para diagnosticar um sujeito como tendo um tipo específico de TBI (por exemplo, TBI grave ou subclasses de TBI leve). Os vários biomarcadores da TBI podem ser detectados individualmente ou em combinação, e podem ser usados como uma importante ferramenta de diagnóstico, prognóstico e/ou estratificação de risco de TBI como parte da avaliação do estado da TBI do sujeito.

Antecedentes

[003]Mais de 5 milhões de lesões cerebrais traumáticas leves (mTBIs) ocorrem a cada ano apenas nos Estados Unidos. Atualmente, não há medidas simples, objetivas e precisas disponíveis para ajudar na avaliação do paciente. De fato, grande parte da avaliação e diagnóstico da TBI é fundamentada em dados subjetivos. Infelizmente, medições objetivas, tal como CT da cabeça e Escala de Coma de Glasgow (GCS) não são muito abrangentes ou sensíveis em avaliar a TBI leve. Além disso, a CT da cabeça não é reveladora para a grande maioria das vezes para a mTBI, é cara e expõe o paciente a radiação desnecessária. Adicionalmente,

uma CT negativa da cabeça não significa que o paciente não tenha tido uma concussão; ao contrário, pode simplesmente indicar que certas intervenções, tal como cirurgia, não são necessárias. Clínicos e pacientes precisam de informações objetivas e confiáveis para avaliar com precisão esta condição para promover triagem e recuperação apropriadas. Até o momento, dados limitados estavam disponíveis para o uso de biomarcadores para auxiliar no diagnóstico, avaliação e gestão do paciente.

[004]A maioria das TBIs são leves; entretanto, a capacidade para diagnosticar e tratar a mTBI é insuficiente, em grande parte porque falta a capacidade para caracterizar com precisão os diferentes estados da doença da TB! ou “assinaturas da doença”. Esta insuficiência geralmente decorre de desafios associados à interpretação de sintomas apresentados clinicamente ambíguos e técnicas de imagiologia ineficazes. Assim, os pesquisadores começaram a explorar abordagens com bases celulares e moleculares para melhorar o diagnóstico e o prognóstico. Isso teve uma variedade de desafios, incluindo a dificuldade em relacionar marcadores biológicos aos sintomas clínicos atuais, e superar nossa falta de entendimento fundamental da fisiopatologia da mTBI. Entretanto, a adoção recente de técnicas, tais como tecnologias de alto rendimento e biologia computacional forneceu os meios para determinar e caracterizar com mais precisão os estados da doença da TBI.

[005]Como a fisiopatologia subjacente da TBI permanece indeterminada, o diagnóstico, prognóstico, estratificação de risco e/ou ferramentas terapêuticas eficazes e eficientes ainda não estão atualmente disponíveis, especialmente em um ambiente clínico. Os pesquisadores começaram a investigar a TBI em nível celular e molecular, já que as deficiências nas atuais técnicas de imagiologia cerebral e abordagens falhas de diagnóstico clínico têm aumentado o apelo de utilizar o sangue periférico para identificar sinalização imune e relacionada a danos entre o cérebro e a periferia. O objetivo final deste método é descobrir biomarcadores únicos da TBI ou painéis de biomarcadores para auxiliar na detecção e diagnóstico precoce, distinguir eficazmente entre os vários estados da doença da TBI (por exemplo, mTBI vs. TBI grave ou sTBl), e para ajudar a prever os resultados do paciente. Além disso, estas abordagens podem ajudar a elucidar mecanismos biológicos subjacentes e fornecer maior compreensão em estratégias terapêuticas.

Sumário [0O6]As modalidades da presente divulgação incluem um método de medir ou detectar pelo menos um biomarcador. De acordo com estas modalidades, o método inclui obter uma amostra de um sujeito depois de uma lesão real ou suspeita na cabeça; e medir ou detectar pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado do grupo que consiste em AL9A1, ATPG, C1RL, CAND1, EPIPL, GLO?2, IGHA?2, PZP, SYTC, SYYC ou quaisquer combinações dos mesmos na amostra; e/ou medir ou detectar pelo menos um biomarcador de fragmento do mesmo selecionado do grupo que consiste em ABHEB, AL9A1, DNM1L, FCN2, INF2, K22E, M3K5, NCOR1, SBSN, SYEP, TPP2 ou quaisquer combinações dos mesmos na amostra. Em algumas modalidades, a medição ou detecção do pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu ou pode ter sofrido uma lesão cerebral traumática (TBI).

[007]As modalidades da presente divulgação também incluem um método de medir ou detectar pelo menos um biomarcador que inclui obter uma amostra de um sujeito depois de uma lesão real ou suspeita na cabeça; e medir ou detectar pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado do grupo que consiste em 1433G, ACK1, ACY1, AKA12, ARGI1, CADH5, CLH1, COPG2, DPOD2, DSG?2, HV307, IQGA2, KIC14, KIC19, KV105, LAMC1, MDHM, NQO2, PERM, PLST, PNCB, PTPRC, SEPT7, SYRC, TRXR2, TXNL1, UGGG1, WDR1 ou quaisquer combinações dos mesmos na amostra. Em algumas modalidades, a medição ou detecção do pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu ou pode ter sofrido uma lesão cerebral traumática leve (mTBI).

[008]As modalidades da presente divulgação também incluem um painel de biomarcadores para determinar o estado da lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito. De acordo com estas modalidades, o painel inclui pelo menos um dos seguintes biomarcadores: TPP2, CAND1, NCOR1, K22E, AL9A1, ABHEB, DNMI1L, INF2 ou quaisquer combinações dos mesmos; em que a medição ou a detecção do pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu ou pode ter sofrido uma TBI leve da subclasse 4.

[009]As modalidades da presente divulgação também incluem um painel de biomarcadores para determinar o estado da lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito que inclui pelo menos um dos seguintes biomarcadores: TPP2, NCOR1, HV103, INF2, IGHD, CK054, M3K5, ABHEB, AL9A1, DNM1L ou quaisquer combinações dos mesmos; em que a medição ou a detecção do pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu ou pode ter sofrido uma TBI leve da subclasse

3.

[010]As modalidades da presente divulgação também incluem um painel de biomarcadores para determinar o estado da lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito que inclui pelo menos um dos seguintes biomarcadores: NCOR1, TPP2, K22E, ABHEB, INF2, SBSN, AL9A1, MA2B2 ou quaisquer combinações dos mesmos; em que a medição ou a detecção do pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu ou pode ter sofrido uma TBI leve da subclasse 2.

[011]As modalidades da presente divulgação também incluem um painel de biomarcadores para determinar o estado da lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito que inclui pelo menos um dos seguintes biomarcadores: K22E, DNM1L, DIAP1, ABHEB, PLOD1, SYEP, KV133, AL9A1, EPHB4 ou quaisquer combinações dos mesmos; em que a medição ou a detecção do pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu ou pode ter sofrido uma TBI leve da subclasse 1.

[012]As modalidades da presente divulgação também incluem um painel de biomarcadores para determinar o estado da lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito que inclui pelo menos um dos seguintes biomarcadores: CAND1, NCOR1, K22E, ABHEB, DNM1L, SBSN, GLO2, SYEP ou quaisquer combinações dos mesmos; em que a medição ou a detecção de altos níveis do pelo menos um biomarcador no sujeito se comparados aos níveis do pelo menos um biomarcador em um sujeito saudável indica que o sujeito sofreu ou pode ter sofrido uma TBI leve da subclasse 4.

[013]As modalidades da presente divulgação também incluem um painel de biomarcadores para determinar o estado da lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito que inclui pelo menos um dos seguintes biomarcadores: NCOR1, HV103, IGHD, ABHEB, DNM1L, ALBU, THIM, IGHA2, KV139 e/ou quaisquer combinações dos mesmos; em que a medição ou a detecção de altos níveis do pelo menos um biomarcador no sujeito se comparados aos níveis do pelo menos um biomarcador em um sujeito saudável indica que o sujeito sofreu ou pode ter sofrido uma TBI leve da subclasse 3.

[014]As modalidades da presente divulgação também incluem um painel de biomarcadores para determinar o estado da lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito que inclui pelo menos um dos seguintes biomarcadores: NCOR1, K22E, ABHEB, SBSN, DNM1L, DIAP1, DYL1, PSA, EPHB4 ou quaisquer combinações dos mesmos; em que a medição ou a detecção de altos níveis do pelo menos um biomarcador no sujeito se comparados aos níveis do pelo menos um biomarcador em um sujeito saudável indica que o sujeito sofreu ou pode ter sofrido uma TBI leve da subclasse 2.

[015]As modalidades da presente divulgação também incluem um painel de biomarcadores para determinar o estado da lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito que inclui pelo menos um dos seguintes biomarcadores: K22E, DNM1L, DIAP1, ABHEB, PLOD1, SYEP, EPHB4, FBLN3 ou quaisquer combinações dos mesmos; em que a medição ou a detecção de altos níveis do pelo menos um biomarcador no sujeito se comparados aos níveis do pelo menos um biomarcador em um sujeito saudável indica que o sujeito sofreu ou pode ter sofrido uma TBI leve da subclasse 1.

[016]As modalidades da presente divulgação também incluem um painel de biomarcadores para determinar que um sujeito não sofreu uma lesão cerebral traumática (TBI) que inclui pelo menos um dos seguintes biomarcadores: ACTBL, ALDH2, ANXA5, CAMP, CPNE3, CRAC1, CYTC, DNPEP, EIF3l, GSHB, ICAM1, HV323, HNRPD, KVD33, FA9, FHR4, FRPD1, HS90B, MA2A1, PCYOX, PNPH, PROC, RL3, SH3L3, SRRM2, TBB1, TENA, TRAP1 ou quaisquer combinações dos mesmos; em que a medição ou a detecção do pelo menos um biomarcador no sujeito indica que o sujeito não sofreu uma TBI.

Breve Descrição Dos Desenhos

[017]As FIGS. 1A-1C incluem gráficos representativos obtidos a partir de análise de agrupamento não supervisionada de dados proteômicos da descoberta de espectrometria de massa quantitativa das amostras de plasma obtidas a partir de sujeitos classificados como saudáveis ou como tendo TBI leve com base em informação fisiológica clínica, bem como plasma combinado de sujeitos graves (isto é, CT positiva). Todos os pontos de dados são marcados de acordo com suas localizações de agrupamentos na FIG. 1A. A FIG. 1A é um gráfico filogênico representativo resultente da análise de agrupamentos não supervisionada de todos os dados de perfil de proteoma mostrando dois principais agrupamentos (agrupamento controle) e agrupamentos de TBI (TBI subclasse 1 = TBI-1; TBI subclasse 2 = TBI-2; TBI subclasse 3 = TBI-3; e TBI subclasse 4 = Complexo TB), junto com características associadas do paciente e da amostra que foram extraídas post-hoc, incluindo a Idade; Gênero; área de pico de GFAP MS normalizada (usando ensaio GFAP com base em espectrometria de massa direcionada com base na quantificação de peptídeos proteotípicos individuais); escaneamento por CT (positiva/negativa; cinza indica ausência de dados); e pontuações de biomarcadores de GFAP com base em ELISA (positivo/negativo; cinza indica ausência de dados). Agrupamentos patológicos predominantes das subclasses da TBI leve incluem subclasse 1 (TBI-1), subclasse 2 (TBI-2), subclasse 3 (TBI-3) e subclasse 4 (TBI Complexa), que também é referido aqui como “TBI leve complicada”. A FIG. 1B inclui resultados da principal análise de componentes do perfil de proteoma total. A FIG. 1C inclui agrupamentos filogênicos representativos representados como um gráfico de constelação.

[018]As FIGS. 2A-2C incluem agrupamentos representativos de proteínas que são compartilhadas e/ou únicas entre agrupamentos de amostras com base em análise não supervisionada. Agrupamentos patológicos predominantes das subclasses da TBI leve incluem subclasse 1 (TBI-1), subclasse 2 (TBI-2), subclasse 3 (TBI-3) e subclasse 4, ou TBI leve complicada (TBI Complexa); um agrupamento controle saudável também é mostrado (Controle). Cada um dos cinco principais sub- agrupamentos de amostra derivados da análise de agrupamento não supervisionada tem um mínimo de cinco proteínas expressadas de maneira única. A FIG. 2A é um diagrama de Venn representativo que inclui proteínas compartilhadas e/ou únicas entre os cinco agrupamentos de subgrupos identificados. A FIG. 3B inclui uma contagem numérica das proteínas totais e/ou proteínas únicas quantificadas em cada agrupamento de subgrupo. A FIG. 3C inclui Uniprot ID e designações de nome abreviado para as proteínas únicas quantificadas em cada agrupamento de subgrupo.

[019]As FIGS. 3A-3B incluem um gráfico de Venn representativo de proteínas que são compartilhadas ou únicas entre amostras saudáveis (círculo esquerdo) e de pacientes com TBI (incluindo a amostra grave combinada; círculo direito). Somente proteínas detectadas em todas as amostras em cada grupo foram incluídas nesta análise (FIG. 3A). A FIG. 3B inclui uma lista de 8 proteínas expressadas de maneira única em todas as amostras de TB, incluindo seu Uniprot ID e nome da proteína. AL9A1I1 e SYTC são expressadas no cérebro, enquanto FAS está relacionada à coagulação (ambas as designações são fundamentadas em informações anotadas da UniProt (uniprot.org)).

[020]As FIG. 4A-4E incluem esquemas representativo da Análise Floresta de Bootstrap como um método alternativo para a análise tradicional supervisionada de dados quantitativos de espectrometria de massa de aquisição independente (DIA- MS). As contribuições de proteínas individuais foram analisadas e resumidas nas cinco árvores de decisão separadas que atenderam aos critérios do modelo previsto (As FIGS. 4A-4E). Esta análise atribuiu um ponto de corte quantitativo para a capacidade de uma dada proteína servir como um biomarcador capaz de distinguir pacientes com TBI de suas contrapartes saudáveis, junto com uma probabilidade de diagnóstico associada. No caso onde uma única proteína foi insuficientemente capaz de fazer esta distinção, uma combinação de múltiplas proteínas é identificada e definida.

Descrição Detalhada

[021]A presente divulgação se refere a métodos para diagnosticar e avaliar um sujeito que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça, tal como uma lesão cerebral traumática (TBI). Em particular, a presente divulgação identifica vários biomarcadores, cuja detecção e/ou expressão diferencial pode ser usada para avaliar a presença ou ausência de uma TBI em um sujeito, e pode ser usada como uma base para diagnosticar um sujeito como tendo um tipo específico de TBI (por exemplo, TBI grave ou subclasses de mTBI). Os vários biomarcadores da TBI podem ser detectados individualmente ou em combinação, e podem ser usados como um importante diagnóstico e terapêutico ferramenta para avaliar um estado da TBI do sujeito.

[022]Os títulos das seções, como usados nesta seção e em toda a divulgação neste documento, são meramente para propósitos organizacionais e não são intencionados a serem limitativos.

1. Definições

[023]A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como comumente entendidos por um especialista na técnica. No caso de conflito, o presente documento, incluindo definições, prevalecerá. Os métodos e materiais preferidos são descritos abaixo, embora métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da presente divulgação. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências aqui mencionados são incorporados por referência em sua totalidade. Os materiais, métodos e exemplos aqui divulgados são apenas ilustrativos e não intencionados a serem limitativos.

[024]Os termos “compreendem”, “incluem”, “tendo”, “tem”, “podem”, “contêm”, e suas variantes, como aqui usados, são intencionados a serem frases, termos ou palavras de transição abertos, que não excluam a possibilidade de atos ou estruturas adicionais. As formas singulares “um/uma”, “e” e “o/a” incluem as referências plurais, a menos que o contexto indique claramente de outro modo. A presente divulgação também contempla outras modalidades “compreendendo”, “consistindo em” e “consistindo essencialmente em”, as modalidades ou elementos apresentados aqui, quer explicitamente estabelecidos ou não.

[025]Para a recitação de intervalos numéricos aqui, cada número intermediário entre eles com o mesmo grau de precisão é explicitamente considerado. Por exemplo, para o intervalo de 6 a 9, os números 7 e 8 são considerados além de 6 e 9, e para o intervalo de 6,0 a 7,0, o número 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 e 7,0 são explicitamente considerados.

[026]Uma “quantidade absoluta”, como aqui usado, se refere ao valor absoluto de uma mudança ou diferença entre pelo menos dois resultados de ensaios obtidos ou amostrados em diferentes pontos no tempo e que, semelhantes a um nível de referência, foram ligados ou estão associados aqui com vários parâmetros clínicos (por exemplo, presença de doença, estágio da doença, severidade da doença,

progressão, não progressão ou melhoria da doença, etc.). “Valor absoluto”, como aqui usado, se refere à magnitude de um número real (tal como, por exemplo, a diferença entre dois níveis comparados (tais como níveis obtidos em um primeiro ponto no tempo e níveis obtidos em um segundo ponto no tempo)) sem considerar o seu sinal, isto é, independentemente de ser positivo ou negativo.

[027]Esta divulgação fornece níveis de referência exemplares e quantidades absolutas (por exemplo, calculados comparando-se os níveis de referência em diferentes pontos no tempo). Entretanto, é bem conhecido que os níveis de referência e quantidades absolutas podem variar dependendo da natureza do imunoensaio (por exemplo, anticorpos utilizados, condições de reação, pureza da amostra, etc.) e que os ensaios podem ser comparados e padronizados. Além disso, está dentro da habilidade comum de um especialista na técnica adaptar a divulgação aqui para outros imunoensaios para obter níveis de referência e quantidades absolutas específicos do imunoensaio para estes outros imunoensaios com base na descrição fornecida por esta divulgação. Considerando que o valor preciso do nível de referência e da quantidade absoluta podem variar entre os ensaios, as descobertas como aqui descritas devem ser geralmente aplicáveis e capazes de ser extrapoladas para outros ensaios.

[028]“Anticorpo com maturação de afinidade” é aqui usado para se referir a um anticorpo com uma ou mais alterações em uma ou mais CDRs, o que resulta em uma melhoria na afinidade (isto é, Ko, ka ou ka) do anticorpo para um antígeno alvo em comparação com um anticorpo precursor, que não possui a alteração. Anticorpos com maturação de afinidade exemplares terão afinidades nanomolares ou mesmo picomolares para o antígeno alvo. Uma variedade de procedimentos para produzir anticorpos com maturação de afinidade é conhecida na técnica, incluindo a triagem de uma biblioteca combinatória de anticorpos que foi preparada usando exibição biológica. Por exemplo, Marks et al., BioTechnology, 10: 779 a 783 (1992) descreve a maturação de afinidade por embaralhamento de domínio de VH e VL. A mutagênese aleatória de CDR e/ou resíduos de estrutura é descrita por Barbas et a/l., Proc. Nat. Acad. Sci. EUA, 91: 3809 a 3813 (1994); Schier et al., Gene, 169: 147 a 155 (1995); Yelton et al., J. Immunol., 155: 1994 a 2004 (1995); Jackson et al., J. Inmunol., 154(7): 3310 a 3319 (1995); e Hawkins et a/, J. Mol. Biol., 226: 889 a 896 (1992). A mutação seletiva em posições de mutagênese seletiva e em posições de contato ou hipermutação com um resíduo de aminoácido que intensifica a atividade é descrita na Patente U.S. Nº 6.914.128 B1.

[029]“Anticorpo” e “anticorpos” como aqui usados se referem a anticorpos monoclonais, anticorpos monospecíficos (por exemplo, que podem ser monoclonais ou também podem ser produzidos por outros meios que os produzam a partir de uma célula germinativa comum), anticorpos multiespecíficos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados (completamente ou parcialmente humanizados), anticorpos de animais tais como, mas não limitados a uma ave (por exemplo, um pato ou um ganso), um tubarão, uma baleia e um mamífero, incluindo um não primata (por exemplo, uma vaca, um porco, um camelo, um lhama, um cavalo, uma cabra, um coelho, uma ovelha, um hamster, um porquinho da Índia, um gato, um cachorro, um rato, um camundongo, etc.) ou um primata não humano (por exemplo, um macaco, um chimpanzé, etc.), anticorpos recombinantes, anticorpos quiméricos, Fvs de cadeia simples (“scFv”), anticorpos de cadeia simples, anticorpos de domínio simples, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos F(ab')2, Fvs ligados por dissulfeto (“sdFv”) e anticorpos anti-idiotípicos (“anti-ld”), anticorpos de domínio duplo, anticorpos de domínio variável duplo (DVD) ou domínio variável triplo (TVD) (imunoglobulinas de domínio variável duplo e métodos para sua fabricação são descritos em Wu, C., et al., Nature Biotechnology, 25(11):1290 a 1297 (2007) e Pedido Internacional PCT WO 2001/058956, o conteúdo de cada um dos quais é aqui incorporado por referência), ou anticorpos de domínio (dAbs) (por exemplo, tal como descrito em Holt et a/. (2014) Trends in Biotechnology 21: 484 a 490), e incluindo anticorpos de domínio simples sdAbs que são de ocorrência natural, por exemplo, como em peixes cartilaginosos e camelídeos, ou que são sintéticos, por exemplo, nanocorpos, VHH ou outra estrutura de domínio), e fragmentos de ligação ao epítopo funcionalmente ativos de qualquer um dos acima. Em particular, os anticorpos incluem moléculas de imunoglobulina e fragmentos imunologicamente ativos de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação ao analito. As moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, 1gD, IgA e IgY), classe (por exemplo, I9gG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2).

[030] “Fragmento de anticorpo”, como aqui usado, se refere a uma porção de um anticorpo intacto compreendendo o sítio de ligação ao antígeno ou região variável. A porção não inclui os domínios de cadeia pesada constantes (isto é, CH2, CH3 ou CHA, dependendo do isotipo do anticorpo) da região Fc do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não são limitados a fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos Fab'-SH, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, diacorpos, moléculas de Fv cadeia simples (scFv), polipeptídeos de cadeia simples contendo apenas um domínio variável de cadeia leve, polipeptídeos de cadeia simples contendo as três CDRs do domínio variável de cadeia leve, polipeptídeos de cadeia simples contendo apenas uma região variável de cadeia pesada e polipeptídeos de cadeia simples contendo as três CDRs da região variável de cadeia pesada.

[031]“Grânulo" e “partícula” são usados aqui permutavelmente e se referem a um suporte sólido substancialmente esférico. Um exemplo de um grânulo ou partícula é uma micropartícula. As micropartículas que podem ser aqui usadas podem ser qualquer tipo conhecido na técnica. Por exemplo, o grânulo ou partícula pode ser um grânulo magnético ou partícula magnética. Partículas/grânulos magnéticos podem ser ferromagnéticos, ferrimagnéticos, = paramagnéticos, —superparamagnéticos — ou ferrofluídicos. Os materiais ferromagnéticos exemplares incluem Fe, Co, Ni, Gd, Dy, CrO2, MnAs, MnBi, EuO e NIO/Fe. Exemplos de materiais ferrimagnéticos incluem NiFe204, CoFe2O4, Fe3O04 (ou FeO FezO3). Os grânulos podem ter uma porção de núcleo sólida que é magnética e é cercada por uma ou mais camadas não magnéticas. Alternativamente, a porção magnética pode ser uma camada em torno de um núcleo não magnético. As micropartículas podem ser de qualquer tamanho que funcione nos métodos aqui descritos, por exemplo, de cerca de 0,75 a cerca de 5 nm, ou de cerca de 1 a cerca de 5 nm, ou de cerca de 1 a cerca de 3 nm.

[032]“Proteína de ligação” é aqui usada para se referir a uma proteína monomérica ou multimérica que se liga e forma um complexo com um parceiro de ligação, tal como, por exemplo, um polipeptídeo, um antígeno, um composto químico ou outra molécula, ou um substrato de qualquer tipo. Uma proteína de ligação se liga especificamente a um parceiro de ligação. As proteínas de ligação incluem anticorpos, bem como fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos e outras várias formas e derivados dos mesmos, como são conhecidos na técnica e aqui descritos abaixo, e outras moléculas compreendendo um ou mais domínios de ligação ao antígeno que se ligam a uma molécula do antígeno ou um sítio particular (epítopo) na molécula do antígeno. Consequentemente, uma proteína de ligação inclui, mas não é limitada a um anticorpo, uma imunoglobulina tetramérica, uma molécula de IgG, uma molécula de IgG1, um anticorpo monocional, um anticorpo quimérico, um anticorpo enxertado com CDR, um anticorpo humanizado, um anticorpo com maturação de afinidade e fragmentos de quaisquer destes anticorpos que retenham a capacidade para se ligar a um antígeno.

[033]“Anticorpo biespecífico” é aqui usado para se referir a um anticorpo de comprimento completo que é gerado por tecnologia de quadroma (ver Milstein et al., Nature, 305(5934): 537 a 540 (1983)), por conjugação química de dois anticorpos monoclonais diferentes (ver Staerz et al., Nature, 314(6012): 628 a 631 (1985)) ou por abordagens knob-in-hole ou similares, que introduzem mutações na região Fc (ver Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 90(14): 6444 a 6448 (1993)), resultando em múltiplas espécies de imunoglobulina diferentes das quais apenas uma é o anticorpo biespecífico funcional. Um anticorpo biespecífico se liga a um antígeno (ou epítopo) em um de seus dois braços de ligação (um par de HC/LC), e se liga a um antígeno diferente (ou epítopo) em seu segundo braço (um par diferente de HC/LC). Por esta definição, um anticorpo biespecífico tem dois braços de ligação ao antígeno distintos (em especificidade e nas sequências de CDR) e é monovalente para cada antígeno ao qual se liga.

[034]'CDR" é aqui usado para se referir à “região determinante de complementaridade” dentro de uma sequência variável de anticorpo. Existem três CDRs em cada uma das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve. A partir do terminal N de uma cadeia leve ou pesada, estas regiões são denotadas como “CDR1”, “CDR2” e “CDR3”, para cada uma das regiões variáveis. O termo “conjunto de CDR”, como aqui usado, se refere a um grupo de três CDRs que ocorre em uma única região variável que se liga ao antígeno. Um sítio de ligação ao antígeno, portanto, pode incluir seis CDRs, compreendendo o conjunto de CDR de cada uma das regiões variáveis de cadeia leve e pesada. Um polipeptídeo compreendendo uma única CDR, (por exemplo, uma CDR1, CDR2 ou CDR3) pode ser referido como uma “unidade de reconhecimento molecular”. As análises cristalográficas de complexos antígeno-anticorpo têm demonstrado que os resíduos de aminoácidos das CDRs formam contato extensivo com o antígeno ligado, em que o contato mais extensivo com o antígeno é com a CDR3 de cadeia pesada. Assim, as unidades de reconhecimento “molecular podem ser as principais responsáveis para a especificidade de um sítio de ligação ao antígeno. Em geral, os resíduos de CDR estão diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação ao antígeno.

[035]Os limites exatos destas CDRs foram definidos diferentemente de acordo com diferentes sistemas. O sistema descrito por Kabat (Kabat et a/., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) e (1991)) não apenas fornece um sistema de numeração de resíduos inequívoco aplicável a qualquer região variável de um anticorpo, mas também fornece limites de resíduos precisos que definem as três CDRs. Estas CDRs podem ser referidas como “CDRs de Kabat”. Chothia e colaboradores (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901 a 917 (1987); e Chothia et al., Nature, 342: 877 a 883 (1989)) descobriram que certas sub-porções dentro das CDRs de Kabat adotam conformações de esqueleto peptídico quase idênticas, apesar de terem grande diversidade no nível de sequência de aminoácidos. Estas sub-porções foram designadas como “L1”, “L2” e “L3” ou “H1”, “H2" e “H3”, onde a “L" e a “H” designam as regiões de cadeia leve e de cadeia pesada, respectivamente. Estas regiões podem ser referidas como “CDRs de Chothia”, que têm limites que se soprepõem às CDRs de Kabat. Outros limites que definem as CDRs que se sobrepõem às CDRs de Kabat foram descritos por Padlan, FASEB J., 9: 133 a 139 (1995) e MacCallum, J. Mol. Biol., 262(5): 732 a 745 (1996). Ainda outras definições de limites da CDR podem não seguir estritamente um dos sistemas aqui mencionados, mas, no entanto, irão se sobrepor às CDRs de Kabat, embora elas possam ser encurtadas ou prolongadas à luz de previsões ou descobertas experimentais de que resíduos particulares ou grupos de resíduos ou mesmo CDRs inteiras não afetam significativamente a ligação ao antígeno. Os métodos aqui usados podem utilizar as CDRs definidas de acordo com qualquer um destes sistemas, embora certas modalidades usem as CDRs definidas por Kabat ou Chothia.

[036]“Coeficiente de variação” (CV), também conhecido como “variabilidade relativa”, é igual ao desvio padrão de uma distribuição dividida por sua média.

[037] “Componente”, “componentes” ou “pelo menos um componente”, se refere geralmente a um anticorpo de captura, uma detecção ou conjugado, um calibrator, um controle, um painel de sensibilidade, um recipiente, um tampão, um diluente, um sal, uma enzima, um co-fator para uma enzima, um reagente de detecção, um reagente/solução de pré-tratamento, um substrato (por exemplo, como uma solução), uma solução de parada e semelhantes, que podem estar incluídos em um kit para o ensaio de uma amostra de teste, tal como uma amostra de urina, sangue total, soro ou plasma do paciente, de acordo com os métodos aqui descritos e outros métodos conhecidos na técnica. Alguns componentes podem estar em solução ou liofilizados para reconstituição para o uso em um ensaio.

[038]"“Controles”, como aqui usado, geralmente se refere a um reagente cujo propósito é avaliar o desempenho de um sistema de medição de modo a garantir que ele continue a produzir resultados dentro dos limites permitidos (por exemplo, limites que variam de medidas apropriadas para um ensaio de uso em pesquisa em uma extremidade para limites analíticos estabelecidos pelas especificações de qualidade para um ensaio comercial na outra extremidade). Para realizar isso, um controle deve ser indicativo dos resultados do paciente e, opcionalmente, deve, de algum modo, avaliar o impacto de erro na medição (por exemplo, erro devido à estabilidade do reagente, variabilidade do calibrador, variabilidade do instrumento e semelhantes). Como aqui usado, um “sujeito controle" se refere a um sujeito ou sujeitos que não tenham sofrido uma lesão cerebral traumática (TBI). Um “controle orto”, como aqui usado, se refere a (por exemplo, é fundamentado em) amostras ou informação de um sujeito ou sujeitos que tenham sofrido uma lesão ortopédica, mas não tenham sofrido uma TBI aparente. Como aqui usado, um “sujeito controle orto” se refere a um sujeito ou sujeitos que tenham sofrido uma lesão ortopédica, mas não tenham sofrido uma TBI aparente. Em alguns casos, “sujeitos controle orto” são pacientes ortopédicos adultos que têm uma Pontuação de Lesão Abreviada <4 (sem risco de vida) para sua lesão de extremidade e/ou pelve e/ou fratura da costela. Um “controle saudável”, como aqui usado, se refere a (por exemplo, é fundamentado em) amostras ou informação de um sujeito ou sujeitos que são considerados saudáveis e não sofreram TBI aparente ou lesão ortopédica. Como aqui usado, um “sujeito controle saudável” se refere a um sujeito ou sujeitos que são considerados como sendo saudáveis e não sofreram TBI aparente ou lesão ortopédica. Como aqui usado, “controle de TBI”, como aqui usado, se refere a (por exemplo, é fundamentado em) amostras ou informação de um sujeito ou sujeitos que tenham sofrido uma lesão na cabeça, mas não tenham sofrido uma TBI aparente. Como aqui usado, um “sujeito controle de TBI” se refere a um sujeito ou sujeitos que tenham sofrido uma lesão na cabeça, mas não tenham sofrido uma TBI aparente.

[039]“Correlacionado a”, como aqui usado, se refere a em comparação com.

[040] Escaneamento por CT”, como aqui usado, se refere a um escaneamento por tomografia computadorizada (CT). Um escaneamento por CT combina uma série de imagens de raios X tomadas de diferentes ângulos e usa processamento em computador para criar imagens de seções transversais, ou cortes, dos ossos, vasos sanguíneos e tecidos moles dentro do seu corpo. O escaneamento por CT pode usar CT por raios X, tomografia por emissão de pósitrons (PET), tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT), tomografia axial computadorizada (escaneamento por CAT) ou tomografia assistida por computador. O escaneamento por CT pode ser um escaneamento convencional por CT ou um escaneamento espiral/helicoidal por CT. Em um escaneamento convencional por CT, o escaneamento é feito corte por corte e depois de cada corte o escaneamento para e se move para o próximo corte, por exemplo, da parte superior do abdômen até a pelve. O escaneamento convencional por CT requir que os pacientes prendam a sua respiração para evitar artefatos de movimentos. O escaneamento espiral/helicoidal por CT é um escaneamento contínuo que é feito em uma forma espiral e é um processo muito mais rápido onde as imagens escaneadas são contíguas.

[041]“Derivado" de um anticorpo, como aqui usado, pode se referir a um anticorpo tendo uma ou mais modificações em sua sequência de aminoácidos quando em comparação com um anticorpo genuíno ou precursor e exibe uma estrutura de domínio modificada. O derivado pode ainda ser capaz de adotar a configuração típica de domínio encontrada em anticorpos nativos, bem como uma sequência de aminoácidos, que é capaz de se ligar a alvos (antígenos) com especificidade. Exemplos típicos de anticorpos derivados são anticorpos acoplados a outros polipeptídeos, domínios de anticorpos rearranjados ou fragmentos de anticorpos. O derivado também pode compreender pelo menos um composto adicional, por exemplo, um domínio de proteína, o dito domínio de proteína sendo ligado por ligações covalentes ou não covalentes. A ligação pode ser fundamentada na fusão genética de acordo com os métodos conhecidos na técnica. O domínio adicional presente na proteína de fusão compreendendo o anticorpo pode, preferivelmente, estar ligado por um conector flexível, vantajosamente um conector peptídico, em que o dito conector peptídico compreende aminoácidos plurais, hidrofíilicos, ligados a peptídeos de um comprimento suficiente para percorrer a distância entre a extremidade do terminal C do domínio de proteína adicional e a extremidade do terminal N do anticorpo ou vice- versa. O anticorpo pode estar ligado a uma molécula efetora tendo uma conformação adequada para atividade biológica ou ligação seletiva a um suporte sólido, uma substância biologicamente ativa (por exemplo, uma citocina ou hormônio do crescimento), um agente químico, um peptídeo, uma proteína ou um fármaco, por exemplo.

[042] DIA-MS" ou “espectrometria de massa de aquisição independente de dados” é aqui usado para se referir a um método de determinação da estrutura molecular em que todos os íons dentro de uma faixa m/z selecionada são fragmentados e analisados em um segundo estágio de espectrometria de massa em tandem. Tipicamente, uma mistura complexa de proteínas (por exemplo, amostras de plasma) é digerida em peptídeos e os peptídeos são analisados em um espectrômetro de massa. Os espectros de massa em tandem são geralmente adquiridos em cada peptídeo fragmentando todos os íons que entram no espectrômetro de massa em um dado momento (isto é, DIA-MS) ou isolando e fragmentando sequencialmente faixas de m/z (isto é, MS de aquisição dependente de dados ou DDA-MS). A DIA-MS é uma alternativa para a DDA-MS onde um número fixo de íons precursores é selecionado e analisado por espectrometria de massa em tandem, mas na maioria das vezes pode fornecer a mesma informação de proteína. Os peptídeos proteotípicos (um peptídeo que é único para uma identificação de proteína específica) são usados para quantificação de cada proteína. (ver: Holewinski, R.J., et al. Methods Mol Biol. 2016; 1410: 165 a 279; Kirk, J.A,, et al. Sci Trans! Med. 2015 Dec. 23; 7(319): 319ra; e Parker, S.J., et al. Proteomics. Agosto de 2016; 16(15-16): 2221 a 2237).

[043]“Anticorpo específico duplo” é aqui usado para se referir a um anticorpo de comprimento completo que pode se ligar a dois antígenos diferentes (ou epítopos) em cada um de seus dois braços de ligação (um par de HC/LC) (ver Publicação PCT WO 02/02773). Consequentemente, uma proteína de ligação específica dupla tem dois braços de ligação ao antígeno idênticos, com especificidade idêntica e sequências de CDR idênticas, e é bivalente para cada antígeno ao qual se liga.

[044]“Domínio variável duplo” é aqui usado para se referir a dois ou mais sítios de ligação ao antígeno em uma proteína de ligação, que podem ser proteínas de ligação divalentes (dois sítios de ligação ao antígeno), tetravalentes (quatro sítios de ligação ao antígeno) ou multivalentes. Os DVDs podem ser monoespecíficos, isto é, capazes de se ligarem a um antígeno (ou um epítopo específico), ou multiespecíficos, isto é, capazes de se ligarem a dois ou mais antígenos (isto é, dois ou mais epítopos da mesma molécula do antígeno alvo ou dois ou mais epítopos de antígenos alvo diferentes). Uma proteína de ligação de DVD preferida compreende dois polipeptídeos de DVD de cadeia pesada e dois polipeptídeos de DVD de cadeia leve e é referida como uma “imunoglobulina de DVD” ou “Ig de DVD”. Esta uma proteína de ligação de lg de DVD é, portanto, tetramérica e reminiscente de uma molécula de IgG, mas fornece mais sítios de ligação ao antígeno que uma molécula de IgG. Assim, cada metade de uma molécula de lg de DVD tetramérica é reminiscente de uma metade de uma molécula de IgG e compreende um polipeptídeo de DVD de cadeia pesada e um polipeptídeo de DVD de cadeia leve, mas diferente de um par de cadeias leves e pesadas de uma molécula de IgG que fornece um único domínio de ligação ao antígeno, um par de cadeias leves e pesadas de uma lg de DVD fornece dois ou mais sítios de ligação ao antígeno.

[045]Cada sítio de ligação ao antígeno de uma proteína de ligação de Ig de DVD pode ser derivado de um anticorpo monoclonal doador (“parental”) e, portanto, compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) e um domínio variável de cadeia leve (VL) com um total de seis CDRs envolvidas na ligação ao antígeno por sítio de ligação ao antígeno. Consequentemente, uma proteína de ligação de lg de DVD que se liga a dois epítopos diferentes (isto é, dois epítopos diferentes de duas moléculas do antígeno diferentes ou dois epítopos diferentes da mesma molécula do antígeno) compreende um sítio de ligação ao antígeno derivado de um primeiro anticorpo monoclonal parental e um sítio de ligação ao antígeno de um segundo anticorpo monoclional parental.

[046]Uma descrição do projeto, expressão e caracterização das moléculas de ligação da lg de DVD é fornecida na Publicação PCT Nº WO 2007/024715, Patente U.S. Nº 7.612.181 e Wu et al., Nature Biotech., 25: 1290 a 1297 (2007). Um exemplo preferido destas moléculas de Ig de DVD compreende uma cadeia pesada que compreende a fórmula estrutural VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, em que VD1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada, VD2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada, C é um domínio constante de cadeia pesada, X1 é um conector com a condição de que não seja CH1, X2 é uma região Fc e n é O ou 1, mas, preferivelmente, 1; e uma cadeia leve que compreende a fórmula estrutural VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, em que VD1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve, VD2 é um segundo domínio variável de cadeia leve, C é uma domínio constante de cadeia leve, X1 é um conector com a condição de que não seja CH1 e X2 não compreende uma região Fc; ené0Ooul, mas, preferivelmente, 1. Esta uma Ig de DVD pode compreender duas destas cadeias pesadas e duas destas cadeias leves, em que cada cadeia compreende domínios variáveis ligados em tandem sem uma região constante intermediária entre as regiões variáveis, em que uma cadeia pesada e uma cadeia leve se associam para formar sítios de ligação ao antígeno funcionais em tandem, e um par de cadeias leves e pesadas podem se associar com outro par de cadeias leves e pesadas para formar uma proteína de ligação tetramérica com quatro sítios de ligação ao antígeno funcionais. Em outro exemplo, uma molécula de lg de DVD pode compreender cadeias leves e pesadas que compreendem três domínios variáveis (VD1, VD2 e VD3) ligados em tandem sem uma região constante intermediária entre os domínios variáveis, em que um par de cadeias leves e pesadas podem se associar para formar três sítios de ligação ao antígeno, e em que um par de cadeias leves e pesadas pode se associar com outro par de cadeias leves e pesadas para formar uma proteína de ligação tetramérica com seis sítios de ligação ao antígeno.

[047]"Faixa dinâmica”, como aqui usado, se refere à faixa na qual uma etapa de leitura do ensaio é proporcional à quantidade da molécula ou analito alvo na amostra sendo analisada. A faixa dinâmica pode ser a faixa de linearidade da curva padrão.

[048]“Epítopo" ou “epítopos” ou “epítopos de interesse” se referem a um ou mais sítios em qualquer molécula que são reconhecidos e podem se ligar a um ou mais sítios complementares em seu parceiro de ligação específico. A molécula e o parceiro de ligação específico são parte de um par de ligação específico. Por exemplo, um epítopo pode ser em um polipeptídeo, uma proteína, um hapteno, um antígeno de carboidrato (tal como, mas não limitados a glicolipídios, glicoproteíinas ou lipopolissacarídeos) ou um polissacarídeo. Seu parceiro de ligação específico pode ser, mas não é limitado a um anticorpo.

[049] “Fragmento”, “fragmento biomarcador” ou “peptídeo biomarcador”, como aqui usado, inclui qualquer fragmento de identificação de qualquer um dos biomarcadores da TBI identificados e aqui descritos. “Fragmento(s) incluem peptídeos, peptídeos prototípicos, peptídeos proteolíticos, isoformas, incluindo SNPs ou formas modificadas após a tradução e quaisquer formas induzidas endogenamente ou exogenamente, de qualquer biomarcador da TBI identificado e aqui descrito. Os peptídeos biomarcadores podem ser usados para representar a quantidade de sua proteína representativa em DIA-MS, DDA-MS, monitoramento de reação múltipla (MRM, também conhecido como monitoramento de reação seletiva ou SRM) ensaios de espectrometria de massa ou ensaios de espectrometria de massa com monitoramento de reações paralelas (PRM). Os peptídeos proteolíticos podem ser alvejados para individual quantificação por MS ou junto com padrões internos. (ver: Fu OQ, et a. J Proteooma Res Novembro de 2017 (doi 10,1021/acs jproteome,7b00623); Fu, Q., et al. Methods Mol Biol. 2016; 1410: 249 a 264; e Liu, X., et al. Methods. 15 de junho de 2013; 61(3): 304 a 312).

[050] “Estrutura” (FR) ou “Sequência de estrutura”, como aqui usados, podem significar as sequências remanescentes de uma região variável menos as CDRs. Como a definição exata de uma sequência de CDR pode ser determinada por diferentes sistemas (por exemplo, veja acima), o significado de uma sequência de estrutura está sujeito a interpretações correspondentemente diferentes. As seis CDRs (CDR-L1, -L2 e -L3 de cadeia leve e CDR-H1, -H2 e -H3 de cadeia pesada) também dividem as regiões de estrutura na cadeia leve e na cadeia pesada em quatro sub- regiões (FR1, FR2, FR3 e FR4) em cada cadeia, em que a CDR1 está posicionada entre FR1 e FR2, a CDR2 entre FR2 e FR3, e CDR3 entre FR3 e FR4. Sem especificar as sub-regiões particulares como FR1, FR2, FR3 ou FRA4, uma região de estrutura, como referida por outros, representa as FRs combinadas dentro da região variável de uma única cadeia de imunoglobulina ocorrência natural. Como aqui usado, uma FR representa uma das quatro sub-regiões e as FRs representam duas ou mais das quatro sub-regiões que constituem uma região de estrutura.

[051]As sequências de FR de cadeia pesada e cadeia leve humanas são conhecidos na técnica e podem ser usadas como sequências de estrutura “aceitadoras"” de cadeia pesada e cadeia leve (ou simplesmente, sequências “aceitadoras”) para humanizar um anticorpo não humano usando técnicas conhecidas na técnica. Em uma modalidade, sequências aceitadoras de cadeia pesada e cadeia leve humanas são selecionadas das sequências de estrutura listadas em bancos de dados publicamente disponíveis, tais como V-base (protocolo de transferência de hipertexto://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) ou no sistema internacional de informações ImMunoGeneTicsº (IMGTº) (protocolo de transferência de hipertexto://imgt.cines fr/texts/IMGTrepertoire/LocusGenes/).

[052]“Sítio de ligação ao antígeno funcional”, como aqui usado, pode significar um sítio em uma proteína de ligação (por exemplo, um anticorpo) que é capaz de se ligar a um antígeno alvo. A afinidade de ligação ao antígeno do sítio de ligação ao antígeno pode não ser tão forte quanto a proteína de ligação precursora, por exemplo, anticorpo precursor, da qual o sítio de ligação ao antígeno é derivado, mas a capacidade para se ligar ao antígeno deve ser mensurável usando qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos para avaliar a proteína, por exemplo, anticorpo, que se liga a um antígeno. Além disso, a afinidade de ligação ao antígeno de cada um dos sítios de ligação ao antígeno de uma proteína multivalente, por exemplo, anticorpo multivalente, aqui não prescisa ser quantitativamente a mesma.

[053]'GFAP” é aqui usado para descrever a proteína ácida fibrilar glial. À GFAP é uma proteína que é codificada pelo gene GFAP em humanos, e que pode ser produzida (por exemplo, por meios recombinantes, em outra espécie). “Estado de GFAP” pode significar o nível ou quantidade de GFAP que está circulando em um ponto no tempo (tal como com uma única medição de GFAP), o nível ou quantidade de GFAP associada com o monitoramento (tal como com um teste repetido em um sujeito para identificar um aumento ou diminuição na quantidade de GFAP), o nível ou quantidade de GFAP associada ao tratamento para lesão cerebral traumática (seja uma lesão cerebral primária e/ou uma lesão cerebral secundária) ou combinações dos mesmos. A GFAP foi medida por ELISA e por espectrometria de massa direcionada para peptídeos específicos que eram únicos para GFAP.

[054]“Escala de Coma de Glasgow" ou “GCS”, como aqui usado, se refere a uma escala de 15 pontos para estimar e categorizar os resultados da lesão cerebral na base da capacidade social global ou dependência dos outros. O teste mede a resposta motora, resposta verbal e resposta de abertura ocular com estes valores: |. Resposta motora (6 - Obedece completamente aos comandos; 5 - Localiza a estímulos nocivos; 4 - Retira-se de estímulos nocivos; 3 - Flexão anormal, isto é, postura decorticada; 2 - Resposta extensora, isto é, postura descerebrada; e 1 - Sem resposta); Il. Resposta verbal (5 - Alerta e Orientado; 4 - Fala confusa, mas coerente; 3 - Palavras inapropriadas e frases confusas consistindo em palavras; 2 - Sons incompreensíveis; e 1 - Sem sons); e Ill. Abertura ocular (4 - Abertura ocular espontânea; 3 - Olhos abertos à fala; 2 - Olhos abertos à dor; e 1 - Sem abertura ocular). A pontuação final é determinada adicionando-se os valores de I+Il+Ill. À pontuação final pode ser categorizada em quatro níveis possíveis para sobrevivência, com um número mais baixo indicando uma lesão mais grave e um prognóstico pior: Leve (13 a 15); Incapacidade Moderada (9 a 12) (Perda de consciência superior a 30 minutos; Prejuízos físicos ou cognitivos que podem ou não podem se resolver: e Beneficia-se de Reabilitação); Incapacidade Grave (3 a 8) (Coma: estado inconsciente. Sem resposta significativa, sem atividades voluntárias); e Estado Vegetativo (Inferior a 3) (Ciclos de vigília do sono; Excitação, mas sem interação com o ambiente; Sem resposta localizada à dor). A lesão cerebral moderada é definida como uma lesão cerebral resultando em uma perda de consciência de 20 minutos a 6 horas e uma Escala de Coma de Glasgow de 9 a 12. A lesão cerebral grave é definida como uma lesão cerebral resultando em uma perda de consciência superior a 6 horas e uma Escala de Coma de Glasgow de 3 a 8.

[055]"Escala de Resultados de Glasgow", como aqui usado, se refere a uma escala global para resultados funcionais que classifica o estado do paciente em uma de cinco categorias: Morto, Estado Vegetativo, Incapacidade Grave, Incapacidade Moderada ou Boa Recuperação.

[056]“Escala Estendida de Resultados de Glasgow" ou “GOSE”, como usado permutavelmente aqui, fornece categorização mais detalhada em categorias subdividindo-se as categorias de incapacidade grave, incapacidade moderada e boa recuperação em uma categoria inferior e superior como mostrado na Tabela 1.

Tabela 1 [E RE

E RA O 3 Menor SD- Condição de inconsciência com incapacidade apenas respostas reflexas, mas com grave períodos de abertura ocular 4 Maior SD + espontânea incapacidade grave Menor MD - Paciente é dependente de incapacidade assistência diária por incapacidade moderada mental ou física, usualmente uma Maior MD + combinação de ambas. Se o incapacidade paciente pode ser deixado soziho moderada por mais de 8 horas em casa, é nível superior de SD, se não, então é nível inferior de SD.

[ recuperação tal como afasia, hemiparesia ou Maior boa GR + epilepsia e/ou déficits de memória recuperação ou personalidade, mas são capazes de cuidar de si mesmos. Eles são independentes em casa, mas dependentes fora. Se eles são capazes de voltar ao trabalho, mesmo com ajuste especial é nível superior de MD, se não, então é nível inferior de MD.

[057]“Anticorpo humanizado” é aqui usado para descrever um anticorpo que compreende sequências de região variável de cadeia leve e pesada de uma espécie não humana (por exemplo, um camundongo), mas em que pelo menos uma porção da sequência de VH e/ou VL foi alterada para ser mais “semelhante à humana”, isto é, mais semelhante às sequências variáveis da linhagem germinativa humana. Um “anticorpo humanizado” é um anticorpo ou uma variante, derivado, análogo ou fragmento do mesmo, que se liga imunoespecificamente a um antígeno de interesse e que compreende uma região de estrutura (FR) tendo substancialmente a sequência de aminoácidos de um anticorpo humano e uma região determinante de complementaridade (CDR) tendo substancialmente a sequência de aminoácidos de um anticorpo não humano. Como aqui usado, o termo “substancialmente” no contexto de uma CDR se refere a uma CDR tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % idêntica à sequência de aminoácidos de uma CDR de anticorpo não humano. Um anticorpo humanizado compreende substancialmente todos de pelo menos um e, tipicamente, dois, domínios variáveis (Fab, Fab', F(ab')2a, FabC, Fvy) em que todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana (isto é, anticorpo doador) e todas ou substancialmente todas as regiões de estrutura são aquelas de uma sequência consenso de imunoglobulina humana. Em uma modalidade, um anticorpo humanizado também compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente de uma imunoglobulina humana. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém a cadeia leve, bem como pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada. O anticorpo também pode incluir as regiões da cadeia pesada CH1, dobradiça, CH2, CH3 e CH4. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém apenas uma cadeia leve humanizada. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém apenas uma cadeia pesada humanizada. Em modalidades específicas, um anticorpo humanizado contém apenas um domínio variável humanizado de uma cadeia leve e/ou cadeia pesada humanizada.

[058]Um anticorpo humanizado pode ser selecionado de qualquer classe de imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, e qualquer isotipo, incluindo, sem limitação, I9G1, IgG2, IgG3 e I9G4. Um anticorpo humanizado pode compreender sequências de mais de uma classe ou isotipo, e domínios constantes particulares podem ser selecionados para otimizar funções efetoras desejadas usando técnicas bem conhecidas na técnica.

[059]As regiões de estrutura e CDRs de um anticorpo humanizado não precisam corresponder precisamente às sequências parentais, por exemplo, a CDR do anticorpo doador ou a estrutura consenso pode ser mutagenizada por substituição, inserção e/ou deleção de pelo menos um resíduo de aminoácido de modo que o resíduo de CDR ou estrutura naquele sítio não corresponda ao anticorpo doador ou à estrutura consenso. Em uma modalidade preferida, estas mutações, entretanto, não serão extensas. Usualmente, pelo menos 80 %, preferivelmente pelo menos 85 %, mais preferivelmente pelo menos 90 % e o mais preferivelmente pelo menos 95 % dos resíduos do anticorpo humanizado corresponderão àqueles da FR e sequências de CDR parentais. Como aqui usado, o termo “estrutura consenso” se refere à região de estrutura na sequência de imunoglobulina consenso. Como aqui usado, o termo

“sequência de imunoglobulina consenso” se refere à sequência formada pelos aminoácidos que ocorrem mais frequentemente (ou nucleotídeos) em uma família de sequências de imunoglobulinas relacionadas (ver, por exemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, 1987)). Uma “sequência de imunoglobulina consenso” pode então compreender uma ou mais “regiões de estrutura consenso” e/ou uma ou mais “CDRs consenso”. Em uma família de imunoglobulinas, cada posição na sequência consenso é ocupada pelo aminoácido que ocorre mais frequentemente nessa posição na família. Se dois aminoácidos ocorrem em igual frequência, ambos podem ser incluídos na sequência consenso.

[060]“Idêntico” ou “identidade”, como aqui usado, no contexto de duas ou mais sequências de polipeptídeos ou polinucleotídeos, pode significar que as sequências de aminoácidos ou nucleotídeos têm uma porcentagem específica de resíduos que são os mesmos em uma região especificada. A porcentagem pode ser calculada por alinhamento ótimo das duas sequências, comparando as duas sequências na região especificada, determinando o número de posições em que os resíduos idênticos ocorrem em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na região especificada e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência. Em casos onde as duas sequências são de comprimentos diferentes ou o alinhamento produz uma ou mais estremidades escalonadas e a região especificada de comparação inclui apenas uma única sequência, os resíduos da única sequência são incluídos no denominator, mas não no numerador do cálculo.

[061]“Procedimento de imagiologia”, como aqui usado, se refere a um teste médico que permite que o interior de um corpo seja observado de modo a diagnosticar, tratar e monitorar as condições de saúde. Um procedimento de imagiologia pode ser um procedimento não invasivo que permite o diagnóstico de doenças e lesões sem ser intrusivo. Exemplos de procedimentos de imagiologia incluem MRI, escaneamento por CT, raios X, escaneamento por tomografia por emissão de pósitrons (PET), tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT) e escaneamento por imageamento de tensor de difusão (DTI).

[062] Lesão na cabeça” ou “lesão da cabeça” como usado permutavelmente aqui, se refere a qualquer trauma no couro cabeludo, crânio ou cérebro. Estas lesões podem incluir apenas um pequeno impacto no crânio ou pode ser uma lesão cerebral grave. Estas lesões incluem lesões primárias no cérebro e/ou lesões secundárias no cérebro. As lesões primárias cerebrais ocorrem durante o insulto inicial e resultam do deslocamento das estruturas físicas do cérebro. Mais especificamente, uma lesão cerebral primária é o dano físico ao parênquima (tecidos e vasos) que ocorre durante o evento traumático, resultando em cisalhamento e compressão do tecido cerebral circundante. Lesões cerebrais secundárias ocorrem subsequente à lesão primária e podem envolver uma série de processos celulares. Mais especificamente, uma lesão cerebral secundária se refere às alterações que se desenvolvem ao longo de um período de tempo (de horas a dias) depois da lesão cerebral primária. Isso inclui uma cascata inteira de alterações celulares, químicas, de tecidos ou vasos sanguíneos no cérebro que contribuem para a destruição adicional do tecido cerebral.

[063]Uma lesão na cabeça pode ser fechada ou aberta (penetrante). Uma lesão fechada na cabeça se refere a um trauma no couro cabeludo, crânio ou cérebro onde não existe penetração do crânio por um objeto atingido. Uma lesão aberta na cabeça se refere a um trauma no couro cabeludo, crânio ou cérebro onde existe penetração do crânio por um objeto atingido. Uma lesão na cabeça pode ser causada por agitação física de uma pessoa, pelo impacto contundente por uma força mecânica externa ou outra que resulta em um trauma fechado ou aberto na cabeça (por exemplo, acidente de veículo tal como com um automóvel, avião, trem, etc.; golpe na cabeça tal como com um taco de beisebol ou de uma arma de fogo), um acidente vascular cerebral (por exemplo, derrame cerebral), uma ou mais quedas (por exemplo, como em esportes ou outras atividades), explosões ou detonações (coletivamente, “lesões por detonação”) e por outros tipos de trauma por força contundente. Alternativamente, uma lesão na cabeça pode ser causada pela ingestão e/ou exposição a um produto químico, toxina ou uma combinação de um produto químico e toxina. Exemplos de destes produtos químicos e/ou toxinas incluem incêndios, bolores, amianto, pesticidas e inseticidas, solventes orgânicos, tintas, colas, gases (tal como monóxido de carbono, sulfeto de hidrogênio e cianeto), metais orgânicos (tal como metil mercúrio, chumbo tetraetílico e estanho orgânico) e/ou uma ou mais drogas de abuso. Alternativamente, uma lesão na cabeça pode ser causada como um resultado de um sujeito sofrendo de uma doença autoimune, um transtorno metabólico, um tumor cerebral, um ou mais vírus, meningite, hidrocefalia, hipóxia ou quaisquer combinações dos mesmos. Em alguns casos, não é possível ter certeza de que qualquer evento ou lesão tenha ocorrido. Por exemplo, pode não haver histórico de um paciente ou sujeito, o sujeito pode ser incapaz de falar, o sujeito pode não estar ciente ou não ter informações completas sobre quais eventos ele foi exposto, etc. Estas circunstâncias são descritas aqui como o sujeito “pode ter sofrido uma lesão na cabeça”. Em certas modalidades aqui, a lesão fechada na cabeça não inclui e especificamente exclui um acidente vascular cerebral, tal como derrame cerebral.

[064]“Lesão intracraniana”, como aqui usado, se refere a uma área de lesão dentro do cérebro. Uma lesão intracraniana pode ser uma anormalidade observada em um procedimento de imagiologia ou teste de imagem cerebral, tal como MRI ou escaneamento por CT. Em escaneamentos por CT ou MRI, as lesões cerebrais podem aparecer como pontos escuros ou claros que não parecem tecido cerebral normal.

[065]“Polinucleotídeo isolado”, como aqui usado, pode significar um polinucleotídeo (por exemplo, de origem genômica, cDNA ou sintética, ou uma combinação das mesmas) que, em virtude da sua origem, o polinucleotídeo isolado não está associado a todo ou uma porção de um polinucleotídeo com o qual o “polinucleotídeo isolado” é encontrado na natureza; está ligado de maneira operável a um polinucleotídeo que não está ligado na natureza; ou não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior.

[066]"Marcador”" e “marcador detectável”, como aqui usado, se refere a uma porção ligada a um anticorpo ou um analito para tornar detectável a reação entre o anticorpo e o analito, e o anticorpo ou analito assim marcado é referido como “detectavelmente marcado”. Um marcador pode produzir um sinal que é detectável por meios visuais ou instrumentais. Vários marcadores incluem substâncias produtoras de sinal, tais como cromagenos, compostos fluorescentes, compostos quimioluminescentes, — compostos — radioativos e semelhantes. “Exemplos representativos de marcadores incluem porções que produzem luz, por exemplo, compostos de acridínio, e porções que produzem fluorescência, por exemplo, fluoresceína. Outros marcadores são descritos aqui. A este respeito, a porção, por si só, pode não ser detectável, mas pode se tornar detectável após a reação com outra porção. O uso do termo “detectavelmente marcado” é intencionado a abranger esta marcação.

[067] Qualquer marcador detectável adequado, como é conhecido na técnica, pode ser usado. Por exemplo, o marcador detectável pode ser um marcador radioativo (tal como 3H, 14C, 32P, 33P, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 1251, 1311, 177Lu, 166Ho e 153Sm), um marcador enzimático (tal como peroxidase de raiz forte, peroxidase alcalina, glicose G6-fosfato desidrogenase e semelhantes) um marcador quimioluminescente (tal como ésteres de acridínio, ticésteres ou sulfonamidas; luminol, isoluminol, ésteres de fenantridínio e semelhantes), um marcador fluorescente (tal como fluoresceíina (por exemplo, B5-fluoresceínay 6- carboxifluoresceína, 3'6-carboxifluoresceína, 5(6)-carboxifluoresceína, 6-hexacloro- fluoresceína, 6-tetraclorofluoresceína, isotiocianato de fluoresceína e semelhantes)),

rodamina, ficobiliproteínas, R-ficoeritrina, pontos quânticos (por exemplo, seleneto de cádmio tampado com sulfeto de zinco), um marcador termométrico ou um marcador de reação em cadeia de imuno-polimerase. Uma introdução a marcadores, procedimentos de marcação e detecção de marcadores é encontrada em Polak e Van Noorden, Introduction to Imnmunocytochemistry, 2º ed., Springer Verlag, N.Y. (1997) e em Haugland, Handbook of Fluorescent Probes e Research Products Chemicals (1996), que é um manual e catálogo combinado publicado pela Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon. Um marcador fluorescente pode ser usado em FPIA (ver, por exemplo, Patentes U.S. Nºs 5.593.896, 5.573.904, 5.496.925, 5.359.093 e 5.352.803, que são aqui incorporados por referência em sua totalidade). Um composto de acridínio pode ser usado como um marcador detectável em um ensaio quimioluminescente homogêneo (ver, por exemplo, Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16: 1324 a 1328 (2006); Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 2313 a 2317 (2004); Adamczyk et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 14: 3917 a 3921 (2004); e Adamczyk et al., Org. Lett. 5: 3779 a 3782 (2003)).

[068]Em um aspecto, o composto de acridínio é um acridínio-9-carboxamida. Métodos para preparar acridínios 9-carboxamida são descritos em Mattingly, J. Biolumin. Chemilumin. 6: 107 a 114 (1991); Adamczyk et al., J. Org. Chem. 63: 5636 a 5639 (1998); Adamczyk et al., Tetrahedron 55: 10899 a 10914 (1999); Adamczyk et al., Org. Lett. 1: 779 a 781 (1999); Adamczyk et al., Bioconjugate Chem. 11: 714 a 724 (2000); Mattingly et al., In Luminescence Biotechnology: Instruments and Applications; Dyke, K. V. Ed.; CRC Press: Boca Raton, páginas 77 a 105 (2002); Adamczyk et al., Org. Lett. 5: 3779 a 3782 (2003); e as Patentes U.S. Nºº 5.468.646, 5.543.524 e

5.783.699 (cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade para seus ensinamentos a respeito).

[069]Outro exemplo de um composto de acridínio é um acridínio-9-carboxilato aril éster. Um exemplo de um acridínio-9-carboxilato aril éster da fórmula |l é fluorosulfonato de 10-metil-9-(fenoxicarbonil)acridínio (disponível da Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Métodos para preparar acridínio 9-carboxilato aril ésteres são descritos em McCapra et al., Photochem.

Photobiol. 4: 1111-21 (1965); Razavi et al., Luminescence 15: 245 a 249 (2000); Razavi et al., Luminescence 15: 239 a 244 (2000); e a Patente U.S.

Nº 5.241.070 (cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade para seus ensinamentos a respeito). Estes acridínio-9- carboxilato aril ésteres são eficientes indicadores quimioluminescentes para o peróxido de hidrogênio produzido na oxidação de um analito por pelo menos uma oxidase em termos da intensidade do sinal e/ou da rapidez do sinal.

O curso da emissão quimioluminescente para o acridínio-9-carboxilato aril éster é concluído rapidamente, isto é, em menos de 1 segundo, enquanto a emissão quimioluminescente de acridínio-9-carboxamida se estende por mais de 2 segundos.

O acridínio-9-carboxilato aril éster, entretanto, perde suas propriedades quimioluminescentes na presença de proteína.

Portanto, seu uso requer a ausência de proteína durante a geração e detecção do sinal.

Métodos para separar ou remover proteínas na amostra são bem conhecidos pelos especilistas na técnica e incluem, mas não são limitados a ultrafiltração, extração, precipitação, diálise, cromatografia e/ou digestão (ver, por exemplo, Wells, High Throughput Bioanalytical Sample Preparation.

Methods and Automation Strategies, Elsevier (2003)). A quantidade de proteína removida ou separada da amostra de teste pode ser cerca de 40 %, cerca de 45 %, cerca de 50 %, cerca de 55 %, cerca de 60 %, cerca de 65 %, cerca de 70 %, cerca de 75 %, cerca de 80 %, cerca de 85 %, cerca de 90 % ou cerca de 95 %. Mais detalhes com respeito ao acridínio-9-carboxilato aril éster e seu uso são apresentados no Pedido de Patente U.S.

Nº 11/697.835, depositado em 9 de abril de 2007. Os acridínio-9-carboxilato aril ésteres podem ser dissolvidos em qualquer solvente adequado, tal como anidro N N-dimetilfformamida (DMF) desgaseificado ou colato de sódio aquoso.

[070]“Limite de Branco (LoB)", como aqui usado, se refere à concentração analito aparente mais alta esperada ser encontrada quando réplicas de uma amostra em branco não contendo nenhum analito são testadas.

[07 1]“Limite de Detecção (LoD)”, como aqui usado, se refere à concentração mais baixa do mensurando (isto é, uma quantidade intencionada a ser medida) que pode ser detectada em um nível especificado de confiança. O nível de confiança é tipicamente de 95 %, com uma probabilidade de 5 % de uma medição de falso negativo. LOoD é a concentração mais baixa de analito que pode ser distinguida com segurança do LOB e na qual a detecção é viável. O LoD pode ser determinado utilizando-se o LoB medido e as réplicas de teste de uma amostra conhecida por conter uma baixa concentração de analito. O termo LoD aqui usado é fundamentado na definição do protocol EP17-A2 do Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais (CLSI) (“Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation; Diretriz Aprovada - Segunda Edição”, EP17A2E, por James F. Pierson-Perry et al., Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais, 1 de junho de 2012).

[072] Limite de Quantificação (LoQ), como aqui usado, se refere à concentração mais baixa em que o analito pode não apenas ser detectado com segurança, mas em que algumas metas predefinidas para tendência e imprecisão são atingidas. O LoQ pode ser equivalente ao LoD ou pode estar em uma concentração muito maior.

[073]“Linearidade”" se refere a quão bem o desempenho real do método ou ensaio em uma faixa operacional especificada se aproxima de uma linha reta. À linearidade pode ser medida em termos de um desvio, ou não linearidade, de uma linha reta ideal. “Desvios da linearidade” podem ser expressados em termos de porcentagem da escala total. Em alguns dos métodos aqui divulgados, menos de 10 % de desvio de linearidade (DL) é obtido na faixa dinâmica do ensaio. “Linear” significa que existe menos de ou igual a cerca de 20 %, cerca de 19 %, cerca de 18 %, cerca de 17 %, cerca de 16 %, cerca de 15 %, cerca de 14 %, cerca de 13 %, cerca de 12 %, cerca de 11 %, cerca de 10 %, cerca de 9 % ou cerca de 8 % de variação para ou ciam de uma faixa exemplar ou valor recitado.

[074]“Sequência de ligação” ou “sequência peptídica de ligação” se refere a uma sequência polipeptídica natural ou artificial que está conectada a uma ou mais sequências polipeptídicas de interesse (por exemplo, comprimento total, fragmentos, etc.). O termo “conectada” se refere à união da sequência de ligação à sequência polipeptídica de interesse. Estas sequências polipeptídicas são preferivelmente unidas por uma ou mais ligações peptídicas. As sequências de ligação podem ter um comprimento de cerca de 4 a cerca de 50 aminoácidos. Preferivelmente, o comprimento da sequência de ligação é de cerca de 6 a cerca de 30 aminoácidos. Sequências de ligação naturais podem ser modificada por substituições, adições ou deleções de aminoácidos para criar sequências de ligação artificiais. As sequências de ligação podem ser usadas para muitos propósitos, incluindo em Fabs recombinantes. As sequências de ligação exemplares incluem, mas não são limitadas a: (i) marcadores (His) de Histidina, tal como um marcador 6X His, que tem uma sequência de aminoácidos de HHHHHH (SEQ ID NO: 1), são úteis como sequências de ligação para facilitar o isolamento e a purificação de polipeptídeos e anticorpos de interesse; (ii) Sítios de clivagem de enteroquinase, como marcadores His, são usados no isolamento e na purificação de proteínas e anticorpos de interesse. Frequentemente, os sítios de clivagem de enteroquinase são usados junto com marcadores His no isolamento e na purificação de proteínas e anticorpos de interesse. Vários sítios de clivagem de enteroquinase são conhecidos na técnica. Exemplos de sítios de clivagem de enteroquinase incluem, mas não são limitados à sequência de aminoácidos de DDDDK (SEQ ID NO: 2) e derivados da mesma (por exemplo, ADDDDK (SEQ ID NO: 3), etc.); (iii) Diversas sequências podem ser usadas para ligar ou conectar as regiões variáveis de cadeia leve e/ou pesada de fragmentos de região variável de cadeia simples. Exemplos de outras sequências de ligação podem ser encontrados em Bird et al., Science 242: 423 a 426 (1988); Huston et al., PNAS EUA 85: 5879 a 5883 (1988); e McCafferty et al., Nature 348: 552 a 554 (1990). As sequências de ligação também podem ser modificadas para funções adicionais, tal como fixação de medicamentos ou fixação em suportes sólidos. No contexto da presente divulgação, o anticorpo monoclonal, por exemplo, pode conter uma sequência de ligação, tal como um marcador His, um sítio de clivagem de enteroquinase ou ambos.

[075]“Imagiologia por ressonância magnética” ou “MRI”, como usado permutavelmente aqui, se refere a uma técnica de imagiologia médica usada em radiologia para formar fotografias dos processos anatômicos e fisiológicos do corpo em saúde e doença. A MRI é uma forma de imagiologia médica que mede a resposta dos núcleos atômicos de tecidos do corpo a ondas de radio de alta frequência quando colocados em um forte campo magnético, e que produz imagens dos orgãos internos. Os scanners de MRI, que são fundamentados na ciência da ressonância magnética nuclear (NMR), usam fortes campos magnéticos, ondas de rádio e gradientes de campo para gerar imagens do interior do corpo.

[076]“Anticorpo monoclonal”, como aqui usado, se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em menores quantidades. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único antígeno. Além disso, ao contrário de preparações de anticorpo policlonal que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclional é dirigido contra um único determinante no antígeno. Os anticorpos monoclonais aqui especificamente incluem anticorpos “quiméricos” em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou que pertencem a uma classe ou subclasse particular de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou que pertencem a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos destes anticorpos, desde que eles exibam o biológico desejado.

[077]“Proteína de ligação multivalente” é aqui usado para se referir a uma proteína de ligação compreendendo dois ou mais sítios de ligação ao antígeno (também referidos aqui como “domínios de ligação ao antígeno”). Uma proteína de ligação multivalente é preferivelmente manipulada para ter três ou mais sítios de ligação ao antígeno, e geralmente não é um anticorpo de ocorrência natural. O termo “proteína de ligação multiespecífica” se refere a uma proteína de ligação que pode se ligar a dois ou mais alvos relacionados ou não relacionados, incluindo uma proteína de ligação capaz de se ligar a dois ou mais epítopos diferentes da mesma molécula alvo.

[078]"“Dispositivo de ponto de atendimento” se refere a um dispositivo usado para fornecer testes de diagnóstico médico no ponto de atendimento ou próximo a ele (isto é, fora de um laboratório), no momento e local de cuidado ao paciente (tal como em um hospital, consultório médico, instalação de atendimento médico urgente ou outra, cada do paciente, uma casa de repouso e/ou um centro de cuidados prolongados e/ou instalação de cuidados paliativos). Exemplos de dispositivos de ponto de atendimento incluem aqueles produzidos pela Abbott Laboratories (Abbott Park, IL) (por exemplo, i-STAT e i-STAT Alinity, Universal Biosensors (Rowville, Australia) (ver US 2006/0134713), Axis-Shield PoC AS (Oslo, Noruega) e Clinical Lab Products (Los Angeles, EUA).

[079] “Reagentes de controle de qualidade” no contexto de imunoensaios e kits aqui descritos, incluem, mas não são limitados a calibradores, controles e painéis de sensibilidade. Um “calibrator” ou “padrão” tipicamente é usado (por exemplo, um ou mais, tal como uma pluralidade) de modo a estabelecer curvas de calibração (padrão) para interpolação da concentração de um analito, tal como um anticorpo ou um analito. Alternativamente, um único calibrator, que está próximo de um nível de referência ou nível de controle (por exemplo, níveis “baixo”, “médio” ou “alto”), pode ser usado. Múltiplos calibradores (isto é, mais de um calibrator ou uma quantidade variável de calibradores) podem ser usados em conjunto para compreender um “painel de sensibilidade”.

[080]“Anticorpo recombinante” e “anticorpos recombinantes” se referem a anticorpos preparados por uma ou mais etapas, incluindo clonagem de sequências de ácidos nucleicos que codificam todo ou uma parte de um ou mais anticorpos monoclonais em um vetor de expressão apropriado por técnicas recombinantes e subsequentemente expressam o anticorpo em uma célula hospedeira apropriada. Os termos incluem, mas não são limitados a anticorpos monoclonais produzido recombinantementes, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados (completamente ou parcialmente humanizados), estruturas multi-específicas ou multi- valentes formadas por fragmentos de anticorpo, anticorpos bifuncionais, Abs heteroconjugados, Igºs de DVD e outros anticorpos como descrito em (i) aqui. (Imunoglobulinas de domínio variável duplo e métodos para sua fabricação são descritos em Wu, C., et al., Nature Biotechnology, 25: 1290 a 1297 (2007)). O termo “anticorpo bifuncional”, como aqui usado, se refere a um anticorpo que compreende um primeiro braço tendo uma especificidade para um sítio antigênico e um segundo braço tendo uma especificidade para um sítio antigênico diferente, isto é, os anticorpos bifuncionais têm uma especificidade dupla.

[081]“Nível de referência”, como aqui usado, se refere a um valor de corte do ensaio que é usado para avaliar diagnóstico, prognóstico ou eficácia terapêutica e que está ligado ou está associado aqui com vários parâmetros clínicos (por exemplo,

presença de doença, estágio da doença, severidade da doença, progressão, não progressão ou melhoria da doença, etc.). Esta divulgação fornece níveis de referência exemplares. Entretanto, é bem conhecido que os níveis de referência podem variar dependendo da natureza do imunoensaio (por exemplo, anticorpos utilizados, condições de reação, pureza da amostra, etc.) e que os ensaios podem ser comparados e padronizados. Além disso, está dentro do conhecimento comum de um especialista na técnica adaptar a divulgação aqui para outros imunoensaios para obter níveis de referência específicos de imunoensaio para estes outros imunoensaios com base na descrição fornecida por esta divulgação. Considerando que o valor preciso do nível de referência pode variar entre os ensaios, as descobertas como aqui descritas devem ser geralmente aplicáveis e capazes de serem extrapoladas para outros ensaios.

[082]“Avaliação de risco”, “classificação de risco”, “identificação de risco” ou “estratificação de risco” de sujeitos (por exemplo, pacientes), como aqui usado, se refere à avaliação de fatores incluindo biomarcadores, para prever o risco de ocorrência de futuros eventos incluindo início da doença ou progressão da doença, de modo que as decisões de tratamento com respeito ao sujeito podem ser tomadas de uma maneira mais informada.

[083] “Amostra”, “amostra de teste”, “espécime”, “amostra de um sujeito” e “amostra do paciente”, como aqui usado, pode ser usado permutavelmente e pode ser uma amostra de sangue, tal como sangue total, tecido, urina, soro, plasma, líquido amniótico, líquido cefalorraquidiano, células ou tecidos placentários, células endoteliais, leucócitos ou monócitos. A amostra pode ser usada diretamente como obtida a partir de um paciente ou pode ser pré-tratada, tal como por filtração, destilação, extração, concentração, centrifugação, inativação de componentes interferentes, adição de reagentes e semelhantes, para modificar o caráter da amostra de alguma maneira como discutido aqui ou, de outro modo, como é conhecido na técnica.

[084]Uma variedade de tipos de células, tecido ou fluido corporal podem ser utilizados para obter uma amostra. Estes tipos de células, tecidos e fluidos podem incluir seções de tecidos, tal como amostras de biópsia e autópsia, seções congeladas tomadas para propósitos histológicos, sangue (tal como sangue total), plasma, soro, células vermelhas do sangue, plaquetas, líquido intersticial, líquido cefalorraquidiano, etc. Tipos de células e tecidos também podem incluir fluido linfático, líquido cefalorraquidiano, um fluido coletado por um tipo de tecido ou célula pode ser fornecido removendo-se uma amostra de células de um animal humano e um não humano, mas também pode ser realizado usando-se células previamente isoladas (por exemplo, isoladas por outra pessoa, em outro momento e/ou para outro propósito). Bem como tipos de células derivados de IPSC ou IPSC (por exemplo, neurônios motores) de sujeitos. Tecidos de arquivos, tal como aqueles tendo histórico de tratamento ou resultado, também podem ser usados. O isolamento e/ou purificação de proteína ou nucleotídeo pode não ser necessário.

[085]“Fase sólida” ou “suporte sólido” como usado permutavelmente aqui, se refere a qualquer material que pode ser usado para fixar e/ou atrair e imobilizar (1) um ou mais agentes de captura ou parceiros de ligação de captura específicos, ou (2) um ou mais agentes de detecção ou parceiros de ligação de detecção específicos. A fase sólida pode ser escolhida por sua capacidade intrínseca para atrair e imobilizar um agente de captura. Alternativamente, a fase sólida pode ter afixada a ela um agente de ligação que tem a capacidade de atrair e imobilizar o (1) agente de captura ou parceiro de ligação de captura específico, ou (2) agente de detecção ou parceiro de ligação de detecção específico. Por exemplo, o agente de ligação pode incluir uma substância carregada que é carregada opostamente em relação ao agente de captura (por exemplo, parceiro de ligação de captura específico) ou agente de detecção (por exemplo, parceiro de ligação de detecção específico) ou a uma substância carregada conjugada com o (1) agente de captura ou parceiro de ligação de captura específico ou (2) agente de detecção ou parceiro de ligação de detecção específico. Em geral, o agente de ligação pode ser qualquer parceiro de ligação (preferivelmente específico) que é imobilizado (ligado a) na fase sólida e que tem a capacidade de imobilizar o (1) agente de captura ou parceiro de ligação de captura específico, ou (2) agente de detecção ou parceiro de ligação de detecção específico por meio de uma reação de ligação. O agente de ligação permite a ligação indireta do agente de captura a um material de fase sólida antes da realização do ensaio ou durante a realização do ensaio. Por exemplos, a fase sólida pode ser plástica, plástica derivatizada, metal magnético ou não magnético, vidro ou silício, incluindo, por exemplo, um tubo de teste, poço de microtitulação, folha, grânulo, micropartícula, chip e outras configurações conhecidas àqueles com habilidade comum na técnica.

[086]“Ligação específica” ou “se liga especificamente”, como aqui usado, pode se referir à interação de um anticorpo, uma proteína ou um peptídeo com uma segunda espécie química, em que a interação é dependente da presença de uma estrutura particular (por exemplo, um determinante ou epítopo antigênico) na espécie química; por exemplo, um anticorpo reconhece e se liga a uma estrutura de proteína específica e não às proteínas em geral. Se um anticorpo é específico para o epítopo “A”, a presença de uma molécula contendo o epítopo A (ou A livre, não marcado), em uma reação contendo “A” marcado e o anticorpo, reduzirá a quantidade de A marcado ligado ao anticorpo.

[087]“Parceiro de ligação específico” é um membro de um par de ligação específico. Um par de ligação específico compreende duas moléculas diferentes, que se ligam especificamente uma à outra através de meios químicos ou físicos. Portanto, além dos pares de ligação específica ao antígeno e anticorpo de imunoensaios comuns, outros pares de ligação específica podem incluir biotina e avidina (ou estreptavidina), carboidratos e lectinas, sequências nucleotídicas complementares,

moléculas efetoras e receptoras, cofatores e enzimas, enzimas e inibidores de enzima, aptâmeros (por exemplo, aptâmeros de RNA e DNA) e semelhantes. Além disso, os pares de ligação específica podem incluir membros que são análogos dos membros de ligação específica originais, por exemplo, um análogo do analito. Os membros de ligação específica imunoreativos incluem antígenos, fragmentos de antígeno e anticorpos, incluindo anticorpos monocionais e policlonais, bem como complexos e fragmentos dos mesmos, quer isolados ou produzidos recombinantemente.

[088]“Sujeito” e “paciente”, como aqui usado, permutavelmente se refere a qualquer vertebrado, incluindo, mas não limitados a um mamífero e um ser humano. Em algumas modalidades, o sujeito pode ser um human ou um não humano. O sujeito ou paciente pode estar passando por outras formas de tratamento. Em algumas modalidades, quando o sujeito é um humano, o sujeito não inclui quaisquer humanos que tenham sufrido um acidente cerebrovascular (por exemplo, um acidente vascular cerebral). Em algumas modalidades, suspeita-se que o sujeito sofreu uma lesão na cabeça. Em algumas modalidades, sabe-se que o sujeito sofreu uma lesão na cabeça. Em algumas modalidades, suspeita-se que o sujeito esteja sofrendo de TBI leve, moderada ou grave. Em algumas modalidades, suspeita-se que o sujeito esteja sofrendo de TBI leve. Em algumas modalidades, suspeita-se que o sujeito esteja sofrendo de TBI moderada. Em algumas modalidades, suspeita-se que o sujeito esteja sofrendo de TBI grave.

[089]“Mamiífero”, como aqui usado, se refere a qualquer membro da classe Mamrmalia, incluindo, sem limitação, humanos e primatas não humanos, tal como chimpanzés e outros símios e espécies de macacos; animais de fazenda, tal como gado, ovelha, porcos, cabras, lhamas, camelos e cavalos; mamíferos domésticos, tal como cachorros e gatos; animais de laboratório incluindo roedores, tal como camundongos, ratos, coelhos, porquinhos da Índia e semelhantes. O termo não denota uma idade ou sexo particular. Assim, sujeitos adultos e recém-nascidos, bem como fetos, sejam machos ou fêmeas, são intencionados a estarem incluídos dentro do escopo deste termo.

[090]“Tratar”, “tratando” ou “tratamento” são usados permutavelmente aqui para descrever reversão, alívio ou inibição do progresso de uma doença e/ou lesão, ou um ou mais sintomas desta doença à qual esse termo se aplica. Dependendo da condição do sujeito, o termo também se refere a prevenir uma doença, e inclui prevenir o aparecimento de uma doença, ou prevenir os sintomas associados a uma doença. Um tratamento pode ser realizado em um modo agudo ou crônico. O termo também se refere a reduzir a severidade de uma doença ou sintomas associados a esta doença antes da aflição com a doença. Esta prevenção ou redução da severidade de uma doença antes da aflição se refere à administração de uma composição farmacêutica a um sujeito que não está, no momento da administração, afligido com a doença. “Prevenir” também se refere a prevenir a recorrência de uma doença ou de um ou mais sintomas associados a esta doença. “Tratamento” e “terapeuticamente”, se refere ao ato de tratar, como “tratar” é definido acima.

[091]Como aqui usado o termo “detecção de molécula única” se refere à detecção e/ou medição de uma única molécula de um analito em uma amostra de teste em níveis muito baixos de concentração (tal como níveis de pg/ml ou femtograma/mL). Vários analisadores ou dispositivos de única molécula diferentes são conhecidos na técnica e incluem dispositivos de nanoporo e nanopoço. Exemplos de dispositivos de nanoporo são descritos na Publicação de Patente Internacional Nº WO 2016/161402, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Exemplos de dispositivos de nanopoço são descritos na Publicação de Patente Internacional Nº WO 2016/161400, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[092]“Lesão cerebral traumática” ou “TBI”, como usado permutavelmente aqui, se refere a uma lesão complexa com um amplo espectro de sintomas e debilidades.

A TBI costuma ser um evento agudo semelhante a outras lesões. A TBI pode ser classificada como “leve”, “moderada” ou “grave”. Quando referida aqui meramente como “TBI”, geralmente isso significa qualquer categoria da TBI (por exemplo, leve, moderada ou grave). As causas da TBI são diversas e incluem, por exemplo, agitação física por uma pessoa, um acidente de carro, lesões de armas de fogo, acidentes vasculares cerebrais (por exemplo, derrame cerebral), quedas, explosões ou detonações e outros tipos de trauma por força contundente. Outras causas da TBI incluem a ingestão e/ou exposição a um ou mais produtos químicos ou toxinas (tal como incêndios, bolores, amianto, pesticidas e inseticidas, solventes orgânicos, tintas, colas, gases (tal como monóxido de carbono, sulfeto de hidrogênio e cianeto), metais orgânicos (tal como metil mercúrio, chumbo tetraetílico e estanho orgânico), uma ou mais drogas de abuso ou combinações das mesmas). Alternativamente, a TBI pode ocorrer em sujeitos sofrendo de uma doença autoimune, um transtorno metabólico, um tumor cerebral, hipóxia, um ou mais vírus, meningite, hidrocefalia ou combinações dos mesmos. Adultos jovens e os idosos são as faixas etárias com mais alto risco para TBI. Em certas modalidades aqui, a lesão cerebral traumática ou TBI não inclui e especificamente exclui acidentes vasculares cerebrais, tal como derrame cerebral.

[093]“TB] leve”, como aqui usado, se refere a uma lesão cerebral onde a perda de consciência é breve e usualmente alguns segundos ou minutos e/ou confusão e desorientação é inferior a 1 hora. A TBI leve também é referida como uma concussão, trauma cerebral menor, TBI menor, lesão cerebral menor e lesão menor na cabeça. Embora a MRI e escaneamento por CTs sejam frequentemente normais, o sujeito com TBI leve pode ter problemas cognitivos, tal como dor de cabeça, dificuldade para raciocinar, problemas de memória, déficits de atenção, alterações de humor e frustração.

[094]A TBI leve é a TBI mais prevalente e é frequentemente esquecida no momento da initial lesão. Tipicamente, um sujeito tem um número da Escala de Coma de Glasgow entre 13 a 15 (tal como 13 a 15 ou 14 a 15). Quinze por cento (15 %) das pessoas com TBl leve têm sintomas que duram 3 meses ou mais. A TBI leve é definida como o resultado do movimento vigoroso da cabeça ou impacto causando uma breve mudança no estado mental (confusão, desorientação ou perda de memória) ou a perda de consciência por menos de 30 minutos. Os sintomas comuns da TBI leve incluem fadiga, dores de cabeça, distúrbios visuais, perda de memória, atenção/concentração deficiente, distúrbios do sono, vertigem/perda de equilíbrio, distúrbios emocionais de irritabilidade, sentimentos de depressão e convulsões. Outros sintomas associados à TBI leve incluem náusea, perda de odor, sensibilidade à luz e sons, alterações do humor, perda ou confusão e/ou lentidão no pensamento.

[095]“Subclasse 1 da TBI leve” (TBIl-1) se refere a sujeitos que são classificados como tendo TBI leve e também exibem uma assinatura de proteoma plasmático que é diferente dos controles (por exemplo, controles saudáveis ou controles que não tenham sofrido uma TB), diferente dos sujeitos com TBI moderada a grave e diferente dos sujeitos com uma TBI leve de cada uma das subclasses 2, 3 ou 4.

[096]“Subclasse 2 da TBI leve” (TBI-2) se refere a sujeitos que são classificados como tendo TBI leve e também exibem uma assinatura de proteoma plasmático que é diferente dos controles (por exemplo, controles saudáveis ou controles que não tenham sofrido uma TB), diferente dos sujeitos com TBI moderada a grave e diferente dos sujeitos com uma TBI leve de cada uma das subclasses 1, 3 ou 4.

[097] Subclasse 3 da TBI leve” (TBI-3) se refere a sujeitos que são classificados como tendo TBI leve e também exibem uma assinatura de proteoma plasmático que é diferente dos controles (por exemplo, controles saudáveis ou controles que não tenham sofrido uma TB), diferente dos sujeitos com TBI moderada a grave e diferente dos sujeitos com uma TBI leve de cada uma das subclasses 1, 2 ou4.

[098]“Subclasse 4 da TBI leve” (TBI Complexa), também referida aqui como “TBI leve complicada”, se refere a sujeitos que são classificados como tendo TBI leve, e também exibem assinatura de proteoma plasmático que é diferente dos controles (por exemplo, controles saudáveis ou controles que não tenham sofrido uma TB), diferente dos sujeitos com TBI moderada a grave e diferente dos sujeitos com uma TBI leve de cada uma das subclasses 1, 2 ou 3. Adicionalmente, os sujeitos com TBI leve de subclasse 4 exibem uma assinatura de proteoma que se assemelha à assinatura de proteoma obtida a partir de amostras combinadas de sujeitos tendo TBI grave. Nos dados aqui divulgados, agrupamento de TBI leve de subclasse 4 continha o mais alto número de sujeitos tendo níveis de GFAP elevados (com base no ensaio de GFAP com base em ELISA e espectrometria de massa de GFAP) e o único sujeito tendo um escaneamento por CT positiva.

[099] TBI grave”, como aqui usado, se refere a uma lesão cerebral onde a perda de consciência e/ou confusão e desorientação se dá entre 1 e 24 horas e o sujeito tem um número da Escala de Coma de Glasgow entre 9 a 12. O sujeito com TBI moderada têm resultados de imagiologia cerebral anormal. “TBI grave”, como aqui usado, se refere a uma lesão cerebral onde a perda de consciência é superior a 24 horas e a perda de memória depois da lesão ou lesão penetrante no crânio é superior a 24 horas e o sujeito tem um número da Escala de Coma de Glasgow entre 3 a 8. Os déficits variam de prejuízo das funções cognitivas de alto nível aos estados comatosos. Os sobreviventes podem ter função limitada de braços ou pernas, fala ou linguagem anormal, perda de capacidade de pensamento ou problemas emocionais. Sujeitos com lesões graves podem ser deixados em estados não responsivos a longo prazo. Para muitas pessoas com TBI grave, a reabilitação a longo prazo é frequentemente necessária para maximizar a função e independência.

[0100]Os sintomas comuns da TBI moderada a grave incluem déficits cognitivos incluindo dificuldades com atenção, concentração, distração, memória, velocidade de processamento, confusão, perseverança, impulsividade, processamento de linguagem e/ou “funções executivas”, sem compreender a falavra falada (afasia receptiva), dificuldade de falar e ser entendido (afasia expressiva), fala arrastada, falar muito rápido ou muito devagar, problemas de leitura, problemas de escrita, dificuldades com interpretação de toque, temperatura, movimento, posição dos membros e discriminação fina, a integração ou padronização de impressões sensoriais em dados psicologicamente significativos, perda parcial ou total de visão, fraqueza dos músculos dos olhos e visão dupla (diplopia), visão embaçada, problemas de julgamento de distância, movimentos involuntários dos olhos (nistagmo), intolerância à luz (fotofobia), audição, tal como diminuição ou perda de audição, zumbido nos ouvidos (zumbido), sensibilidade aumentada aos sons, perda ou diminuição do senso olfativo (anosmia), perda ou diminuição do senso de paladar, as convulsões associadas com a epilepsia que podem ser de vários tipos e podem envolver interrupção da consciência, percepções sensoriais ou movimentos motores, controle de intestino e bexiga, distúrbios do sono, perda de força, alterações do apetite, regulação da temperatura corporal, dificuldades menstruais, comportamentos dependentes, capacidade emocional, falta de motivação, irritabilidade, agressão, depressão, desinibição ou negação/falta de consciência.

[0101] Variante" é aqui usado para descrever um peptídeo ou polipeptídeo que se difere na sequência de aminoácidos pela inserção, deleção ou substituição conservativa de aminoácidos, mas mantém pelo menos uma atividade biológica. “SNP” se refere a uma variante que é um polimorfismo de nucleotídeo único. Exemplos representativos de “atividade biológica” incluem a capacidade de se ligar a um específico anticorpo ou promover uma resposta imune. Variante é também aqui usado para descrever uma proteína com uma sequência de aminoácidos que é substancialmente idêntica a uma proteína referenciada com uma sequência de aminoácidos que mantém pelo menos uma atividade biológica. Uma substituição conservativa de um aminoácido, isto é, substituir um aminoácido por um aminoácido diferente de propriedades similares (por exemplo, hidrofilicidade, grau e distribuição de regiões carregadas) é reconhecida na técnica como envolvendo tipicamente uma mudança menor. Estas alterações menores podem ser identificadas, em parte, considerando-se o índice hidropático de aminoácidos, como entendido na técnica. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157: 105 a 132 (1982). O índice hidropático de um aminoácido é fundamentado em uma consideração de sua hidrofobicidade e carga. É conhecido na técnica que os aminoácidos de índices hidropáticos semelhantes podem ser substituídos e ainda manter a função da proteína. Em um aspecto, os aminoácidos tendo índices hidropáticos de + 2 são substituídos. A hidrofilicidade de aminoácidos também pode ser usada para revelar substituições que resultariam em proteínas mantendo a função biológica. Uma consideração da hidrofilicidade de aminoácidos no contexto de um peptídeo permite o cálculo da maior hidrofilicidade média local daquele peptídeo, uma medida útil que foi relatada como bem correlacionada com a antigenicidade e imunogenicidade. Patente U.S. Nº 4.554.101, incorporada completamente aqui por referência. A substituição de aminoácidos tendo valores de hidrofiliidade semelhantes pode resultar em peptídeos mantendo a atividade biológica, por exemplo, imunogenicidade, como é entendido na técnica. As substituições podem ser realizadas com aminoácidos tendo valores de hidrofilicidade dentro de + 2 um do outro. O índice de hidrofobicidade e o valor de hidrofilicidade de aminoácidos são influenciados pela cadeia lateral particular daquele aminoácido. Compatível com esta observação, entende-se que as substituições de aminoácidos que são compatíveis com a função biológica dependem da similaridade relativa dos aminoácidos e, particularmente, as cadeias laterais daqueles aminoácidos, como revelado pela hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho e outras propriedades.

[0102] Vetor" é aqui usado para descrever uma molécula de ácido nucleico que pode transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligada. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular em que segmentos de DNA adicionais podem estar ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem estar ligados no genoma viral. Certos vetores podem replicar autonomamente em uma célula hospedeira em que eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores de mamíferos epissomais). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira e, desse modo, são replicados junto com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles estão operativamente ligados. Estes vetores são referidos aqui como “vetores de expressão recombinantes” (ou simplesmente, “vetores de expressão”). Em geral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. “Plasmídeo” e “vetor” podem ser usados permutavelmente, pois o plasmídeo é a forma mais comumente usada de vetor. Entretanto, outras formas de vetores de expressão, tal como vetores virais (por exemplo, retrovírus com defeito de replicação, adenovírus e vírus adeno-associados), que servem funções equivalentes, podem ser usados. A este respeito, versões de RNA de vetores (incluindo vetores virais de RNA) também podem encontrar uso no contexto da presente divulgação.

[0103]A menos que de outro modo aqui definido, os termos científicos e técnicos usados em relação à presente divulgação terão os significados que são comumente entendidos pelos especialistas na técnica. Por exemplo, quaisquer nomenclaturas usadas em relação a técnicas de cultura de células e tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química e hibridização de proteína e ácido nucleico aqui descritas são aquelas que são bem conhecidas e comumente usadas na técnica. O significado e escopo dos termos devem ser claros; no caso,

entretanto, de qualquer ambiguidade latente, as definições aqui fornecidas têm precedência sobre qualquer definição de dicionário ou extrínseca. Além disso, a menos que de outro modo exigido pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e termos plurais devem incluir o singular.

2. Diagnosticar e Avaliar se um Sujeito Sofreu uma Lesão Cerebral Traumática

[0104]A presente divulgação se refere a métodos de auxiliar no diagnóstico, prognóstico, estratificação de risco e avaliação de se um sujeito sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça, incluindo se o sujeito sofreu uma TBI ou tipos da TBI leve. Estes métodos podem ajudar a determinar a extensão e/ou severidade da TBI em um sujeito humano com uma suspeita de lesão na cabeça, incluindo por exemplo, determinando se o sujeito sofreu uma TBI leve e, se sim, a subclasse da TBI leve sofrida, se o sujeito sofreu uma TBI moderada a grave ou se o sujeito não sofreu uma TBI. Mais especificamente, os biomarcadores da presente divulgação podem ser usados em testes de diagnóstico para determinar, qualificar e/ou avaliar o estado da lesão cerebral, por exemplo, para diagnosticar a TBI, em um sujeito, sujeito ou paciente. Em algumas modalidades, estado da TBI pode incluir determinar um estado subclínico da lesão cerebral ou estado da SCI do paciente, por exemplo, para diagnosticar a SCI em um sujeito, sujeito ou paciente. A detecção ou medição dos biomarcadores da presente divulgação pode ajudar no diagnóstico da TBI, e pode ajudar na geração de uma assinatura da TBlI, por exemplo, para as subclasses de TBI leve.

[0105]Determinar se um sujeito tem TBI leve (ou uma subclasse da mTBI) ou TBI moderada a grave pode incluir medir ou detectar um ou mais biomarcadores da TBI e integrar esta informação com outras informações (por exemplo, dados de avaliação clínica), para determinar se é mais provável que o sujeito não sofreu uma TBI e, se sim, que tipo de TBI sofreu. O método pode incluir realizar um ensaio em uma amostra obtida a partir do sujeito humano dentro de cerca de 24 horas, tal como dentro de cerca de 2 horas, depois de uma suspeita de lesão na cabeça para medir ou detectar um nível de um ou mais biomarcadores da TBI na amostra e determinar se o sujeito sofreu uma lesão cerebral traumática leve ou uma moderada a grave (STBI). Em algumas modalidades, o sujeito é determinado como tendo uma TBI e/ou uma subclasse da TBI leve quando o nível de um ou mais biomarcadores da TBI em uma amostra é alterado (por exemplo, nível de expressão mais alto ou mais baixo), como em comparação com um nível de referência de um ou mais biomarcadores da TBI (por exemplo, nível do biomarcador da TBI em uma amostra controle). Em outras modalidades, o sujeito é determinado como tendo uma TBI e/ou uma subclasse da TBI leve quando o nível de um ou mais biomarcadores da TBI em uma amostra é detectado, sem a necessidade de averiguar os níveis de biomarcadores ou comparar com uma amostra de referência ou controle.

[0106]A amostra pode ser uma amostra biológica. “Amostra”, como aqui usado, pode ser usado permutavelmente (por exemplo, amostra, amostra de teste ou amostra biológica) e pode ser uma amostra de sangue, tal como sangue total, tecido, urina, soro, plasma, líquido amniótico, líquido cefalorraquidiano, células ou tecidos placentários, células endoteliais, leucócitos ou monócitos. Em algumas modalidades, o método pode incluir obter uma amostra de um sujeito dentro de cerca de 48 horas de uma suspeita de lesão no sujeito e contatar a amostra com um anticorpo para um biomarcador da TBI para permitir a formação de um complexo do anticorpo e o biomarcador da TBIl. O método também inclui detectar o complexo anticorpo- biomarcador da TBI resultante.

[0107]Em algumas modalidades, o sujeito pode ter recebido uma pontuação da Escala de Coma de Glasgow antes ou depois do nível de um biomarcador da TBI ser determinado em um ou mais pontos no tempo. Em certas modalidades, o sujeito pode ser suspeito de ter uma TBI leve com base na pontuação da Escala de Coma de Glasgow. Em certas modalidades, o sujeito pode ser suspeito de ter uma TBI leve com base em uma CT anormal da cabeça. Em algumas modalidades, o sujeito recebeu um escaneamento por CT antes ou depois do ensaio ser realizado. Em algumas modalidades, o sujeito tem uma CT normal da cabeça. Em algumas modalidades, o nível de referência de um biomarcador da TBI está correlacionado com sujeitos tendo uma TBI. Em algumas modalidades, o nível de referência de um biomarcador da TBI está correlacionado com uma pontuação da Escala de Coma de Glasgow.

[0108]Geralmente, um nível de referência de um biomarcador da TBI também pode ser utilizado como uma marca de referência para avaliar os resultados obtidos após a análise de uma amostra de teste para um biomarcador da TBI. Geralmente, ao fazer esta comparação, o nível de referência de um biomarcador da TBI é obtido fazendo-se um ensaio particular em um número suficiente de tempos e sob condições apropriadas tal que possa ser feita uma ligação ou associação da presença, quantidade ou concentração de analito com um estágio ou ponto de extremidade particular da TBI ou com indícios particulares. Tipicamente, o nível de referência de um biomarcador da TBI é obtido com ensaios de sujeitos de referência (ou populações de sujeitos). O biomarcador da TBI medido pode incluir fragmentos do mesmo, produtos de degradação do mesmo e/ou produtos de clivagem enzimática do mesmo. Em certas modalidades, o nível de referência pode estar correlacionado com sujeitos controle que não sofreram uma lesão na cabeça.

[0109]A natureza do ensaio utilizado nos métodos aqui descritos não é crítica e o teste pode ser qualquer ensaio conhecido na técnica tal como, por exemplo, imunoensaios, imunoprecipitação de proteínas, imunoeletroforese, Western blot ou imunocoloração de proteína, ou métodos de espectrometria tal como cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC/MS), DIA-MS, DDA-MS, PRM-MS ou SRM/MRM-MS, ensaios de espectrometria de massa diretamente ou com enriquecimento (por exemplo, o enriquecimento pode ser por meio de um anticorpo para a(s) proteína(s) alvo). Os reagentes de captura usados para enriquecer seletivamente as amostras para proteínas biomarcadoras candidatas antes da análise espectroscópica de massa incluem, mas não são limitadas a aptâmeros, anticorpos, sonda de ácidos nucleicos, quimeras, moléculas pequenas, um fragmento F(ab'): , um fragmento de anticorpo de cadeia simples, um fragmento Fv, um fragmento Fv de cadeia simples, um ácido nucleico, uma lectina, um receptor de ligação ao ligante, anficorpos, nanocorpos, anquirinas, anticorpos de domínio, polímeros impressos em andaimes de anticorpo alternativo (por exemplo, diacorpos etc.), avímeros, peptidomiméticos, peptoides, ácidos nucleicos peptídicos, ácido nucleico de treose, um receptor de hormônio, um receptor de citocina e receptores sintéticos, e modificações e fragmentos destes. Com o enriquecimento, também pode ser usada dessorção/tempo de vôo para ionização a laser assistido por matriz (MALDI-TOF MS ou MALDI-TOF). Além disso, o ensaio pode ser utilizado em formato de química clínica, tal como seria conhecido por um especialista na técnica.

3. Painéis de Biomarcadores da TB!

[0110]Os biomarcadores da presente divulgação podem ser usados em testes de diagnóstico para avaliar, determinar e/ou qualificar (usados permutavelmente aqui) o estado da lesão cerebral em um paciente, tal como estado da TBI. A frase “estado da lesão cerebral” inclui qualquer manifestação distinguível da condição, incluindo não ter lesão cerebral. Por exemplo, o estado da lesão cerebral inclui, sem limitação, a presença ou ausência de lesão cerebral em um paciente, o risco de desenvolvimento da lesão cerebral, o estágio ou severidade da lesão cerebral, o progresso da lesão cerebral (por exemplo, progresso da lesão cerebral com o passar do tempo), a efetividade ou resposta para o tratamento da lesão cerebral (por exemplo, acompanhemitno clínico e vigilância da lesão cerebral depois do tratamento) e tipo de lesão cerebral, tal como TBI ou uma subclasse da TBIl. Com base nestes estados, outros procedimentos podem ser indicados, incluindo testes adicionais de diagnóstico ou procedimentos ou regimes terapêuticos.

[0111]O poder de um teste de diagnóstico para prever corretamente o estado é comumente medido como a sensibilidade do ensaio, a especificidade do ensaio ou a área sob uma curva característica operada pelo receptor (“ROC”). A sensibilidade é a porcentagem de positivos verdadeiros que são prognosticados por um teste como positivo, enquanto a especificidade é a porcentagem de negativos verdadeiros que são prognosticados por um teste como negativo. Uma curva de ROC fornece a sensibilidade de um teste como uma função de especificidade 1. Quanto maior a área sob a curva de ROC, mais poderoso o valor preditivo do teste. Outras medidas úteis da utilidade de um teste são valores preditivos positivos e valores preditivos negativos. Valor preditivo positivo é a porcentagem de pessoas que testaram positivo que são realmente positivas. Valor preditivo negativo é a porcentagem de pessoas que testaram negativo que são realmente negativas.

[0112]A análise dos dados descritos na presente divulgação, bem como dados clínicos de um coorte de pacientes com TBI e controle, resultou na geração de vários biomarcadores da TBI que podem ser usados individualmente, ou em várias combinações entre si e com outros biomarcadores na forma de um painel, para diagnosticar e/ou avaliar uma lesão cerebral em um sujeito. Os painéis de biomarcadores da TBI podem incluir qualquer um dos biomarcadores da TBI aqui divulgados, e podem incluir mais de um e até 20 biomarcadores diferentes correspondentes a proteínas distintas. Os painéis de biomarcadores da TBI também podem incluir biomarcadores de não TBI (por exemplo, biomarcadores de controle de ensaio), e biomarcadores previamente identificados como associados à TBI (por exemplo, GFAP e/ou UCH-L1 e/ou NSE). Em algumas modalidades, os painéis de biomarcadores da presente divulgação podem mostrar uma diferença estatística em diferentes estados da TBI. Testes de diagnóstico que usam estes biomarcadores podem mostrar uma ROC de pelo menos 0,6, pelo menos cerca de 0,7, pelo menos cerca de 0,8 ou pelo menos cerca de 0,9.

[0113]O0s biomarcadores da TBI podem estar diferencialmente presentes/expressados dependendo do tipo ou subclasse da TBI (por exemplo, uma assinatura da TBI) e, portanto, painéis de mais que um biomarcador da TBI podem ser úteis em auxiliar na determinação do estado da lesão cerebral.

Em algumas modalidades, os biomarcadores são medidos em uma amostra do paciente usando os métodos aqui descritos e comparados, por exemplo, a níveis predefinidos de biomarcadores e correlacionados ao estado da TBI.

Em algumas modalidades, as medições podem então ser comparadas com uma quantidade de diagnóstico relevante, pontos de corte ou pontuações de modelo multivariadas que distinguem um estado positivo da TBI de um estado negativo da TBI.

A quantidade de diagnóstico representa uma quantidade medida de um biomarcador acima ou abaixo da qual um paciente é classificado como tendo um estado particular da TBI.

Por exemplo, se os biomarcadores estão suprarregulados em comparação com um sujeito controle (por exemplo, um sujeito que não sofreu uma TBI) durante a lesão cerebral, então uma quantidade medida acima do ponto de corte de diagnóstico pode fornecer um diagnóstico da TBI.

Adicionalmente, se os biomarcadores estão presentes durante a lesão cerebral e não detectáveis em controles, então qualquer quantidade detectavelmente medida pode fornecer um diagnóstico de lesão cerebral.

Alternativamente, se os biomarcadores estão infrarregulados durante a lesão cerebral, então uma quantidade medida em ou abaixo do ponto de corte de diagnóstico pode fornecer um diagnóstico de não lesão cerebral.

Adicionalmente, se os biomarcadores não estão presentes durante a lesão cerebral e são detectáveis em controles, então qualquer quantidade detectavelmente medida pode fornecer um diagnóstico de não lesão cerebral.

Como é bem entendido na técnica, ajustando-se os pontos de corte de diagnósticos particulares usados em um ensaio, pode-se aumentar a sensibilidade ou especificidade do ensaio de diagnóstico dependendo da preferência do diagnosticador.

Em modalidades particulares, o ponto de corte de diagnósticos particulares pode ser determinado, por exemplo, medindo-se a quantidade de biomarcadores em um número estatisticamente significativo de amostras de pacientes com os diferentes estados da lesão cerebral e desenhando o ponto de corte de acordo com os níveis desejados de especificidade e sensibilidade.

[0114]De fato, como o técnico habilitado avaliará, existem muitas maneiras para usas as medições de dois ou mais biomarcadores de modo a melhorar a questão do diagnóstico sob investigação. Em um método bastante simples, porém frequentemente eficaz, um resultado positivo é considerado se uma amostra é positiva para pelo menos um dos marcadores investigados.

[0115]Além disso, em certas modalidades, os valores medidos para marcadores de um painel de biomarcadores são matematicamente combinados e o valor combinado é correlacionado com a questão do diagnóstico subjacente. Os valores de biomarcadores podem ser combinados por qualquer estado apropriado do método “matemático técnico. Métodos matemáticos bem conhecidos para correlacionar uma combinação de marcadores a um estado da doença utilizam métodos como análise discriminante (DA) (por exemplo, DA linear, quadrática, regularizada), Análise Funcional Discriminante (DFA), Métodos de Kernel (por exemplo, SVM), Escala Multidimensional (MDS), Métodos Não Paramétricos (por exemplo, Classificadores de k-Vizinhos mais Próximos), PLS (Mínimos Quadrados Parciais), Métodos com base em árvores (por exemplo, Regressão Lógica, CART, Métodos de Floresta Aleatória, Métodos Boosting/Bagging), Modelos Lineares Generalizados (por exemplo, Regressão Logística) Métodos com base em Componentes Principais (por exemplo, SIMCA), Modelos Aditivos Generalizados, Métodos com base na Lógica Fuzzy, Métodos com base em Redes Neurais e Algoritmos Genéticos. O técnico habilitado não terá problema em selecionar um método apropriado para avaliar uma combinação de biomarcadores da presente invenção. Em uma modalidade, o método usado na correlação de uma combinação de biomarcadores da presente invenção, por exemplo, para diagnosticar lesão cerebral, é selecionado de DA (por exemplo, Análise Discriminante Linear, Quadrática, Regularizada), DFA, Métodos de Kernel (por exemplo, SVM), MDS, Métodos Não Paramétricos (por exemplo, Classificadores de k-Vizinhos mais Próximos), PLS (Mínimos Quadrados Parciais), Métodos com base em árvores (por exemplo, Regressão Lógica, CART, Métodos de Floresta Aleatória, Métodos Boosting) ou Modelos Lineares Generalizados (por exemplo, Regressão Logística) e Análise de Componentes Principais. Detalhes referentes a estes métodos estatísticos são encontrados nas seguintes referências: Ruczinski et al., 12 J. OF COMPUTATIONAL AND GRAPHICAL STATISTICS 475 a 511 (2003); Friedman, J. H., 84 J. OF THE AMERICAN STATISTICAL ASSOCIATION 165 a 75 (1989); Hastie, Trevor, Tibshirani, Robert, Friedman, Jerome, The Elements of Statistical Learning, Springer Series in Statistics (2001); Breiman, L., Friedman, J. H., Olshen, R. A., Stone, C. J. Classification and regression trees, California: Wadsworth (1984); Breiman, L., 45 MACHINE LEARNING 5 a 32 (2001); Pepe, M. S., The Statistical Evaluation of Medical Testes for Classification and Prediction, Oxford Statistical Science Series, 28 (2003); e Duda, R. O., Hart, P. E., Stork, D. G., Pattern Classification, Wiley Interscience, 2º Edição (2001).

4. Avaliação das Características da TBI Usando Biomarcadores

[0116]Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para caracterizar e/ou categorizar a TBI com base na detecção, não detecção e/ou níveis de detecção de um ou mais biomarcadores da TB, tal como caracterizar a severidade da TBI em diferentes tipos de TBI. Cada classe ou subclasse da TBI provavelmente tem um nível característico de um biomarcador ou níveis relativos de um conjunto de biomarcadores (uma assinatura). Em uma modalidade, a presente divulgação fornece métodos para avaliar o progresso do estado da TBI em um paciente com o passar do tempo, incluindo progressão (piora) e regressão (melhora). Com o passar do tempo,

a quantidade ou quantidade relativa (por exemplo, o padrão ou assinatura) dos biomarcadores da TBI podem mudar. Por exemplo, biomarcador “X” pode ser aumentado com a lesão cerebral, enquanto o biomarcador “Y” pode ser diminuído com a lesão cerebral. Portanto, a tendência destes biomarcadores, seja aumentando ou diminuindo com o passar do tempo, com relação à lesão cerebral ou não lesão cerebral indica o curso da condição. Consequentemente, este método envolve medir o nível de um ou mais biomarcadores em um paciente em pelo menos dois diferentes pontos no tempo (por exemplo, um primeiro momento e um segundo momento, e comparar a mudança, se houver).

[0117]Em algumas modalidades, uma classe ou subclasse da TBI pode ser caracterizada medindo-se os biomarcadores relevantes e, em seguida, submetendo- os a um algoritmo de classificação ou comparando-os com uma quantidade de referência (por exemplo, um nível predefinido ou padrão de biomarcadores que está associado com a classe ou subclasse particular).

[0118]Em algumas modalidades, os dados que são gerados usando amostras, tal como “amostras conhecidas” podem então ser usados para “treinar” um modelo de classificação. Uma “amostra conhecida” é uma amostra que foi pré-classificada. Os dados que são usados para formar o modelo de classificação podem ser referidos como um “conjunto de dados de treinamento”. O conjunto de dados de treinamento que é usado para formar o modelo de classificação pode compreender dados brutos ou dados pré-processados. Uma vez treinado, o modelo de classificação pode reconhecer padrões em dados gerados usando amostras desconhecidas. O modelo de classificação pode então ser usado para classificar as amostras desconhecidas em classes. Isso pode ser útil, por exemplo, em prognosticar se uma amostra biológica particular está ou não associada com uma certa condição biológica (por exemplo, doente versus não doente).

[0119]Os modelos de classificação podem ser formados usando qualquer classificação estatística ou método de estudo adequado que tente segregar corpos de dados em classes com base nos parâmetros objetivos presentes nos dados. Os métodos de classificação podem ser supervisionados ou não supervisionados. Exemplos de processos de classificação supervisionados e não supervisionados são descritos em Jain, “Statistical Pattern Reconhecimento: A Review", IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence, Vol. 22, Nº 1, Janeiro de 2000, cujos ensinamentos são incorporados por referência.

[0120]Na classificação supervisionada, os dados de treinamento contendo exemplos de categorias conhecidas são apresentados a um mecanismo de estudo, que estuda um ou mais conjuntos de parentenscos que definem cada uma das classes conhecidas. Novos dados podem então ser aplicados ao mecanismo de estudo, que depois classifica os novos dados usando os parentenscos estudados. Exemplos de processos de classificação supervisionados incluem processos de regressão linear (por exemplo, regressão linear múltipla (MLR), regressão de mínimos quadrados parciais (PLS) e regressão de componentes principais (PCR)), árvores de decisão binária (por exemplo, processos de particionamento recursivo, tal como CART), redes neurais artificiais, tal como redes de propagação reversa, análises discriminantes (por exemplo, classificador Bayesiano ou análise de Fischer), classificadores de logística e classificadores de vetores de suporte (máquinas de vetores de suporte).

[0121]Outro método de classificação supervisionada é um processo de particionamento recursivo. Os processos de particionamento recursivo usam árvores de particionamento recursivo para classificar dados derivados de amostras desconhecidas. Outros detalhes acerca de processos de particionamento recursivo são fornecidos no Pedido de Patente U.S. Nº 2002 0138208 A1 por Paulse et al,, “Method for analyzing mass spectra”.

[0122]Em outras modalidades, os modelos de classificação que são criados podem ser formados usando métodos de estudos não supervisionados. A classificação não supervisionada tenta estudar as classificações com base em similaridades no conjunto de dados de treinamento, sem pré-classificar o espectro do qual o conjunto de dados de treinamento foi derivado. Os métodos de estudos não supervisionados incluem análises de agrupamentos. Uma análise de agrupamento tenta dividir os dados em “agrupamentos” ou grupos que idealmente devem ter membros que são muito semelhantes um ao outro e muito diferentes dos membros de outros agrupamentos. A similaridade é então medida usando alguma métrica de distância, que mede a distância entre itens de dados e agrupa itens de dados que são próximos um do outro. As técnicas de agrupamento incluem o algoritmo K-means de MacQueen e o algoritmo Self-Organizing Map de Kohonen.

[0123]Os algoritmos de estudo declarados para o uso na classificação de informação biológica são descritos, por exemplo, na Publicação Internacional PCT Nº WO 01/31580 (Barnhill et a/., “Methods and devices for identifying patterns in biological systems and methods of use thereof”), Pedido de Publicação de Patente U.S. Nº 2002/0193950 (Gavin et al. “Method or analyzing mass spectra”), Pedido de Publicação de Patente U.S. Nº 2003/0004402 (Hitt et al., “Process for discriminating between biological states based on hidden patterns from biological data”) e Pedido de Publicação de Patente U.S. Nº 2003/0055615 (Zhang e Zhang, “Systems and methods for processing biological expression data”).

[0124]Os modelos de classificação podem ser formados e usados em qualquer computador digital adequado. Computadores digitais adequados incluem computadores micro, mini ou grandes usando qualquer sistema operacional padrão ou especializado, tal como um sistema operacional com base Unix, Windowsº ou Linux"", Em modalidades que utilizam um espectrômetro de massa, o computador digital que é usado pode ser fisicamente separado do espectrômetro de massa que é usado para criar o espectro de interesse ou pode ser acoplado ao espectrômetro de massa.

[0125]O conjunto de dados de treinamento e os modelos de classificação de acordo com modalidades da invenção podem ser incorporados por código de computador que é executado ou usado um computador digital. O código de computador pode ser armazenado em qualquer meio legível por computador adequado, incluindo discos ópticos ou magnéticos, sticks, fitas, etc., e pode ser escrito em qualquer linguagem de programação de computador adequada incluindo R, C, C++, visual básico, etc.

[0126]Os algoritmos de estudo descritos acima são úteis para o desenvolvimento de algoritmos de classificação para os biomarcadores já descobertos e para a descoberta de novos biomarcadores. Os algoritmos de classificação, por sua vez, formam a base para testes de diagnóstico fornecendo valores de diagnóstico (por exemplo, pontos de corte) para biomarcadores usados isoladamente ou em combinação.

5. Tratamento e Monitoramento de Sujeitos que Sofrem de TBI

[0127]O sujeito identificado ou avaliado como tendo TBI pode ser tratado ou monitorado com base na avaliação, que pode incluir detectar ou medir vários biomarcadores da TBI. Em algumas modalidades, o método inclui ainda tratar o sujeito humano avaliado como tendo TBI com um tratamento, que pode assumir uma variedade de formas dependendo da severidade da lesão na cabeça. Por exemplo, para sujeitos que sofrem de TBI leve, o tratamento pode incluir um ou mais de repouso, abstenção de atividades físicas, tal como esportes, evitar luz ou usar óculos de sol quando exposto à luz, medicação para alívio de uma dor de cabeça ou enxaqueca, medicação anti-náusea, etc. O tratamento para pacientes que sofrem de TBI grave pode incluir a administração de uma ou mais medicações apropriadas (tal como, por exemplo, diuréticos, medicações anticonvulsivante, medicações para sedar e colocar um sujeito em um coma induzido por fármacos, ou outras medicações farmacêuticas ou biofarmacêuticas (conhecidas ou desenvolvidas no futuro para o tratamento da TBI), um ou mais procedimentos cirúrgicos (tal como, por exemplo, remoção de um hematoma, reparação de uma fratura no crânio, craniectomia descompressiva, etc.) e uma ou mais terapias (tal como, por exemplo uma ou mais reabilitações, terapia cognitivo-comportamental, controle da raiva, psicologia de aconselhamento, etc.). Em algumas modalidades, o método inclui ainda monitorar o sujeito humano avaliado como tendo lesão cerebral traumática (por exemplo, traumática leve ou moderada a grave). Em algumas modalidades, um sujeito identificado como tendo lesão cerebral traumática, tal como lesão cerebral traumática leve ou lesão cerebral traumática grave, pode ser monitorado com escaneamento por CT ou MRI.

[0128]EmM uma modalidade, a presente divulgação fornece métodos para determinar o risco de desenvolvimento TBI em um paciente. As porcentagens, quantidades ou padrões de biomarcadores da TBI são características de vários estados de risco (por exemplo, alto, médio ou baixo). O risco de desenvolvimento uma TBI pode ser determinado pela medição dos biomarcadores relevantes e, em seguida, submetendo-os a um algoritmo de classificação ou comparando-os com uma quantidade de referência (por exemplo, um nível predefinido ou assinatura de biomarcadores que está associada com o nível de risco particular).

[0129]Em algumas modalidades, tratar um sujeito que sofreu uma TBI pode incluir gerenciar o tratamento do paciente com base no estado da TBI conforme estabelecido usando um ou mais biomarcadores da TBI. Esta gestão pode incluir as ações do médico ou clínico subsequentes à determinação do estado da TBI. Por exemplo, se um médico faz um diagnóstico da TBI leve, então seguirá um certo regime de monitoramento. Uma avaliação do curso da TBI usando os métodos da presente divulgação podem então exigir um certo regime de terapia da TBI. Alternativamente, um diagnóstico de não TBI pode ser seguido por testes adicionais para determinar uma doença específica que o paciente pode estar sofrendo. Além disso, outros testes podem ser solicitados se o teste de diagnóstico fornecer um resultado inconclusivo no estado da TBI.

[0130]Em outra modalidade, a presente divulgação fornece métodos para determinar a eficácia terapêutica de um medicamento farmacêutico no contexto do tratamento da TBI. Estes métodos podem ser úteis na realização de ensaios clínicos de um fármaco, bem como no monitoramento do progresso de um paciente em um fármaco. Terapias ou ensaios clínicos envolvem administrar o fármaco em um regime particular. O regime pode envolver uma única dose do fármaco ou múltiplas doses do fármaco com o passar do tempo. O médico ou pesquisador clínico monitora o efeito do fármaco no paciente ou sujeito ao longo do curso da administração. Se o fármaco tiver um impacto farmacológico na condição, as quantidades ou quantidades relativas (por exemplo, o padrão ou assinatura) de um ou mais dos biomarcadores da TBI da presente invenção podem mudar para um perfil de não lesão cerebral. Portanto, pode- se seguir o curso de um ou mais biomarcadores da TBI no paciente durante o curso do tratamento.

[0131]Consequentemente, este método pode envolver a medição de um ou mais biomarcadores da TBI em um paciente recebendo terapia medicamentosa, e correlacionar os níveis de biomarcadores com o estado da TBI do paciente (por exemplo, comparando-se aos níveis predefinidos dos biomarcadores que correspondem aos diferentes estados da lesão cerebral). Uma modalidade deste método pode envolver determinar os níveis de um ou mais biomarcadores da TBI em pelo menos dois diferentes pontos no tempo durante um curso de terapia medicamentosa (por exemplo, um primeiro momento e um segundo momento, e comparar a mudança nos níveis dos biomarcadores, se houver). Por exemplo, os níveis de um ou mais biomarcadores da TBI podem ser medidos antes e depois da administração do fármaco ou em dois diferentes pontos no tempo durante a administração do fármaco. O efeito da terapia é determinado com base nessas comparações. Se um tratamento for eficaz, então o um ou mais biomarcadores da TBI tenderão ao normal, enquanto que se o tratamento for ineficaz, o um ou mais biomarcadores da TBI tenderão às indicações de lesão cerebral.

6. Biomarcadores da TB!

[0132]Os métodos aqui descritos podem ser usados para identificar um ou mais biomarcadores da TBI ou biomarcadores candidatos da TBI que podem auxiliar no diagnóstico e avaliação de um sujeito que pode ter sofrido uma TBI. Biomarcadores da TBI exemplares são descritos abaixo.

a. Biomarcadores da TBI Rule-lh

[0133]Como descrito abaixo, os seguintes biomarcadores da TBI foram identificados como sendo capazes de distinguir um sujeito saudável de um sujeito que sofreu uma TBI quando detectados isoladamente ou em combinação: Ezrina (EZR).

[0134]EZR também é conhecida como citovilina ou vilina-2, e codifica uma proteína que, em humanos, é codificada pelo gene EZR. O terminal N da Ezrina contém um domínio FERM que é ainda subdividido em três subdomínios. O terminal C contém um domínio ERM. A Ezrina é considerada envolvida em conecções das principais estruturas citoesqueléticas com a membrana plasmática. Em células epiteliais, necessárias para a formação de microvilos e pregas da membrana no polo apical. Junto com PLEKHG6, necessário para a micropinocitose normal. (Número de acesso principal ao UniProt: P15311).

4-Trimetilaminobutiraldeído desidrogenase (ALDH9A1 ou AL9A1).

[0135]JAL9A1 também é conhecida como 4-trimetilaminobutiraldeído desidrogenase, TMABADH, isozima Aldeído desidrogenase E3, membro A1 da família 9 de Aldeído desidrogenase, Gama-aminobutiraldeíido desidrogenase, R- aminobutiraldeído desidrogenase. A proteína converte gama-trimetilaminobutiraldeído em gama-butirobetaína, e catalisa a oxidação irreversível de uma ampla faixa de aldeídos aos ácidos correspondentes em uma reação dependente de NAD. A proteína é altamente expressada em fígado adulto, músculo esquelético e rim, expressada em baixos níveis no coração, pâncreas, pulmão e cérebro, e é expressada em todas as regiões do cérebro. Os níveis de expressão são variáveis nas diferentes áreas do cérebro, com os níveis mais altos na medula espinhal e os mais baixos no polo occipital. (Número de acesso principal ao UniProt: P49189).

ATP sintase subunidade gama mitocondrial (ATPG).

[0136]A ATP sintase da membrana mitocondrial (ATP sintase FiFo ou Complexo V) produz ATP a partir de ADP na presença de um gradiente de prótons através da membrana que é gerado por complexos de transporte de elétrons da cadeia respiratória. As ATPases tipo F consistem de dois domínios estruturais, F1 - contendo o núcleo catalítico extramembranoso e Fo - contendo o canal de prótons da membrana, ligados entre si por uma haste central e uma haste periférica. Durante a catálise, a síntese de ATP no domínio catalítico de F1 é acoplada por meio de um mecanismo rotativo das subunidades da haste central à translocação de prótons. Parte do complexo domínio F1 e haste central que é parte do complexo do elemento rotativo. À subunidade gama se projeta para o domínio catalítico formado por alfasbeta3. À rotação da haste central contra as subunidades alfa3beta3 circundantes leva à hidrólise de ATP em três sítios catalíticos separados nas subunidades beta. (Número de acesso principal ao UniProt: P36542).

[0137]Proteína como subcomponente do complemento C1r (C1IRL).

[0138]C1IRL medeia a clivagem proteolítica de HP/haptoglobina no retículo endoplasmático. As doenças associadas a C1RL incluem Adenocarcinoma Ovariano. (Número de acesso principal ao UniProt: Q9NZP8).

[0139]Proteína 1 dissociada de NEDD8 associada a Culina (CAND1).

[0140] CAND1 é um fator de montagem chave de complexos SCF de ubiquitina ligase E3 (proteína SKP1-CUL1-F-box) que promove a troca da subunidade F-box de reconhecimento de substrato em complexos SCF desempenhando, desse modo, um papel chave no repertório celular de complexos SCF. Atua como um fator de troca da proteína F-box. A atividade de troca de CAND1 é acoplada com ciclos de conjugação de nedilação: no estado denedilado, a CAND1 de ligação a culina se liga a CUL1- RBX1, aumentando a dissociação do complexo SCF e promovendo a troca da proteína F-box. Provavelmente desempenha um semelhante papel em outros complexos culina-RING ubiquitina ligase E3. (Número de acesso principal ao UniProt: Q86VP6).

Epiplaquina (EPIPL ou EPPK1).

[0141]EPIPL é uma proteína conectora citoesquelética que se conecta a filamentos intermediários e controla sua reorganização em resposta ao estresse. Na resposta ao estresse mecânico como cura do ferimento, está associada com o mecanismo para motilidade celular desacelerando a migração e a proliferação de queratinócitos e acelerando a agregação e proliferação da queratina dos queratinócitos, contribuindo assim para a arquitetura do tecido. Entretanto, na cura do ferimento no epitélio da córnea, também regula positivamente a diferenciação e proliferação celular e regula negativamente a migração, controlando assim a morfogênese e integridade do epitélio da córnea. Em resposta ao estresse celular, desempenha um papel na reorganização dos filamentos de queratina, provavelmente protegendo os filamentos de queratina contra rupturas. Durante lesões no fígado e pâncreas, a proteína desempenha um papel protetor acompanhando a reorganização dos filamentos intermediários induzidos pela doença (Por similaridade). (Número de acesso principal ao UniProt: P58107).

[0142]Hidrólase de hidroxiacilglutationa mitocondrial (GLO2 ou HAGH).

[0143]A GLO2 é uma tiolesterase que catalisa a hidrólise de S-D-lactoil- glutationa para formar glutationa e ácido D-láctico. (Número de acesso principal ao UniProt: Q16775).

[0144]Constante pesada alfa 2 de imunoglobulina (IGHA2).

[0145]I!GHA? é uma região constante de cadeias pesadas de imunoglobulina. As imunoglobulinas, também conhecidas como anticorpos, são glicoproteínas secretadas ou ligadas à membrana produzidas por linfócitos B. Na fase de reconhecimento da imunidade humoral, as imunoglobulinas ligadas à membrana servem como receptores que, após a ligação de um antígeno específico, desencadeiam a expansão e diferenciação clonal de linfócitos B em células plasmáticas secretoras de imunoglobulinas. As imunoglobulinas secretadas mediam a fase efetora da imunidade humoral, que resulta na eliminação dos antígenos ligados. O sítio de ligação ao antígeno é formado pelo domínio variável de uma cadeia pesada, junto com o de sua cadeia leve associada. Assim, cada imunoglobulina tem dois sítios de ligação ao antígeno com afinidade notável para um antígeno particular. Os domínios variáveis são organizados por um processo chamado reagrupamento V-(D)- J e podem então ser submetidos a hipermutações somáticas que, depois da exposição ao antígeno e seleção, permitem a maturação de afinidade para um antígeno particular. A lg alfa é a principal classe de imunoglobulinas nas secreções corporais. (Número de acesso principal ao UniProt: PO1877).

Proteína da zona de gravidez (PZP).

[0146]A PZP é capaz de inibir todas as quatro classes de proteinases por um mecanismo único de “captura”. Esta proteína tem um estiramento peptídico, chamado de “região de isca' que contém sítios de clivagem específicos para diferentes proteinases. Quando uma proteinase cliva a região de isca, uma mudança conformacional é induzida na proteína que captura a proteinase. A enzima capturada permanece ativa contra substratos de baixo peso molecular (atividade contra substratos de alto peso molecular é bastante reduzida). Após a clivagem na região de isca, uma ligação tioéster é hidrolisada e medeia a ligação covalente da proteína à proteinase. (Número de acesso principal ao UniProt: P20742).

Treonina-tRNA ligase citoplasmática (SYTC ou TARS).

[0147]SYTC catalisa a reação: ATP + L-treonina + tRNA(Thr) = AMP + difosfato + L-treonil--RNA(Thr). É inibida por borrelidina (BN, IC 50 é 7 nM), que se liga a 4 subsítios distintos na proteína, impedindo a ligação de todos os 3 substratos. (Número de acesso principal ao UniProt: P26639).

Tirosina-tRNA ligase citoplasmática (SYYC ou YARS).

[0148]SYYC catalisa a fixação de tirosina ao tRNA(Tyr) em uma reação de duas etapas: tirosina é primeiro ativada por ATP para formar Tyr-AMP e depois transferida para a extremidade aceitante de tRNA(Tyr). (Número de acesso principal ao UniProt: PS54577).

Proteína ABHD14B (ABHEB of ABHD14B).

[0149]ABHEB exibe atividade de hidrólase para p-nitrofenil butirato (in vitro) e pode ativar a transcrição. (Número de acesso principal ao UniProt: Q96/U4).

Proteína Dinamina tipo 1 (DNM1L).

[0150]DNM1L funciona na divisão mitocondrial e peroxissomal. A proteína medeia fissão da membrana através de oligomerização em estruturas tubulares associadas à membrana que envolvem o sítio da cisão para contrair e romper a membrana mitocondrial através de um mecanismo dependente de hidrólise de GTP. Devido à sua função na divisão mitocondrial, garante a sobrevivência de pelo menos alguns tipos de neurônios pós-mitóticos, incluindo células Purkinje, sumprimindo o dano oxidativo. É necessária para o desenvolvimento normal do cérebro, incluindo do cerebelo. Facilita a apoptose regulada por desenvolvimento durante formação do tubo neural. É necessária para uma taxa normal de liberação de citocromo c e ativação da caspase durante a apoptose; esse requisito pode depender do tipo de célula e das pistas apoptóticas fisiológicas. Desempenha um papel importante na fissão mitocondrial durante a mitose. É necessária para formação de vesículas endocíticas. Propõe-se a regular a dinâmica da membrana da vesícula sináptica através da associação com a isoforma BCL2L1 Bel-X(L) que estimula sua atividade GTPase em vesículas sinápticas; a função pode exigir seu recrutamento por MFF para vesículas contendo clatrina. E é necessária para a execução da necrose programada. (Número de acesso principal ao UniProt: 000429).

Ficolina-2 (FCN2).

[0151]FCN?2 pode funcionar na imunidade inata através da ativação da via do complemento de lectina. Exibe ligação dependente de cálcio e GICNAc à lectina. Aumenta a fagocitose de S. typhimurium por neutrófilos, sugerindo um efeito opsônico através da região de colágeno. (Número de acesso principal ao UniProt: Q15485).

Formina-2 invertida (IFN2).

[0152]IFN2 está envolvida na separação de filamentos de actina e acelera sua polimerização e despolimerização. (Número de acesso principal ao UniProt: Q027J81).

[0153] Queratina epidérmica tipo Il citoesquelética 2 (K22E ou KRT2).

[0154]K22E é uma proteína intermediária e considera-se que contribua para a cornificação terminal. A proteína está associada com a ativação, proliferação e queratinização de queratinócitos. (Número de acesso principal ao UniProt: P35908).

[0155]Proteína cinase cinase cinase 5 ativada por mitogênio (M3K5 ou MAP3KS5).

[0156]M3K5 é uma serina/treonina cinase que atua como um componente essencial da via de transdução de sinal da MAP cinase. Desempenha um papel importante nas cascatas de respostas celulares evocadas por alterações no ambiente. Medeia a sinalização para a determinação do destino da célula, tal como diferenciação e sobrevivência. Desempenha um papel crucial na apoptose através de transdução de sinal através da ativação da caspase dependente de mitocôndria. MAP3K5/ASK1 é necessária para a resposta imune inata, que é essencial para a defesa do hospedeiro contra uma ampla faixa de patógenos. Medeia a transdução de sinal de vários estressores como estresse oxidativo, bem como por sinais inflamatórios mediados pelo receptor, tal como o fator de necrose tumoral (TNF) ou lipopolissacarídeos (LPS). Uma vez ativada, atua como um ativador a montante da cascata de transdução de sinal de MKK/JNK e da cascata de transdução de sinal p38 MAPK através da fosforilação e ativação de várias MAP cinase cinases como MAP2K4/SEK1, MAP2K3/MKK3, MAP2K6/MKK6 e MAP2K7/MKK7. Estas MAP2Ks, por sua vez, ativam p38 MAPKs e cinases c-jun N-terminais (JNKs). As p38 MAPK e JNKs controlam a proteína-1 ativadora dos fatores de transcrição (AP-1). (Número de acesso principal ao UniProt: 099683).

Correpressor 1 do receptor nuclear (NCOR1).

[0157]NCOR]1 medeia repressão transcricional por certos receptores nucleares. Faz parte de um complexo que promove a desacetilação da histona e a formação de estruturas repressivas de cromatina que podem impedir o acesso de fatores de transcrição basais. Participa da atividade transcricional repressora produzida por BCL6. (Número de acesso principal ao UniProt: 075376).

Suprabasina (SBSN).

[0158]SBSN é um novo gene expressado em queratinócitos diferenciadores de camundongos e humanos. É considerado como sendo secretada a partir da camada espinhosa do epitélio estratificado e pode forma um novo complexo de genes no cromossomo 2 com dermocina-alfa/-beta e Kdap. (Número de acesso principal ao UniProt: QEUWP8).

[01 59]Glutamato/prolina-tRNA ligase bifuncional (SYEP ou EPRS).

[0160]SYEP cataliisa a fixação do aminoácido cognato ao tRNA correspondente em uma reação de duas etapas: o aminoácido é primeiro ativado por ATP para formar um intermediário covalente com AMP e depois é transferido para a extremidade aceitante do tRNA cognato. É um componente do complexo GAIT (inibidor da tradução ativado por interferon gama) que medeia a inibição da tradução seletiva por transcrição induzida por interferon gama nos processos inflamatórios.

Após a ativação do interferon gama e subsequente fosforilação, se dissocia do complexo multisintetase e se reúne no complexo GAIT, que se liga aos elementos GAIT contendo alça da haste em 3'-UTR de diversos mRNAs inflamatórios (tal como ceruplasmina) e supime sua tradução. (Número de acesso principal ao UniProt: PO07814).

Tripeptidil-peptidase 2 (TPP2).

[0161]TPP2 é um componente da cascata proteolítica que atua a jusante do proteassoma 268 na via ubiquitina-proteassoma. Pode ser capaz de complementar a função do proteassoma 26S em alguma extensão sob condições em que o último é inibido. Estimula a adipogênese (Por similaridade). (Número de acesso principal ao UniProt: P29144).

Anexina A6 (ANXAG6).

[0162]ANXAG6 pode se associar com CD21, e pode regular a liberação de Ca?* dos armazenamentos intracelulares. Pode ser secretada. (Número de acesso principal ao UniProt: PO8133).

Retículo endoplasmático aminopeptidase 1 (ERAP1).

[0163]ERAP1 é uma aminopeptidase que desempenha um papel central na aparação de peptídeos, uma etapa necessária para a geração da maior parte dos peptídeos de ligação à HLA classe |. A aparação de peptídeos é essencial para customizar peptídeos precursores mias longos para ajustá-los ao comprimento correto necessário para a apresentação nas moléculas de MHC classe |. Prefere fortemente os substratos longos de resíduos 9-16. Rapidamente degrada 13-mer a 9-mer e depois para. Hidroliza preferencialmente o resíduo Leu e peptídeos com um terminal C hidrofóbico, enquanto tem atividade fraca para peptídeos com terminal C carregado. Pode desempenhar um papel na inativação de hormônios peptídicos. Pode estar envolvida na regulação da pressão sanguínea por meio da inativação de angiotensina Il e/ou a geração de bradicinina no rim. (Número de acesso principal ao UniProt:

Q9NZO08).

Fator de coagulação V (FAS ou F5).

[0164]FA5 é um regulador central da hemostasia. Serve como um co-fator crítico para a atividade de protrombinase do fator Xa que resulta na ativação de protrombina em trombina. (Número de acesso principal ao UniProt: P12259).

[0165]Glicose-6-fosfato isomerase (G6PI ou GPI).

[0166]G6P| é uma enzima glicolítica, e a G6P| de mamíferos pode funcionar como um citocina secretada por tumor e um fator angiogênico (AMF) que estimula a motilidade celular endotelial. No citoplasma, o produto de gene funciona como uma enzima glicolítica (glicose-6-fosfato isomerase) que interconverte glicose-6-fosfato (G6P) e frutose-6-fosfato (F6P). Extracelularmente, a proteína codificada (também referida como neuroleucina) funciona como um fator neurotrófico que promove a sobrevivência de neurônios motores esqueléticos e neurônios sensoriais, e como uma limfocina que induz a secreção de imunoglobulina. A proteína codificada também é referida como fator de motilidade autócrina (AMF) com base em uma função adicional como uma citocina secretada por tumor e fator angiogênico. Defeitos neste gene são a causa de anemia hemolítica não esferocítica, e uma grave deficiência enzimática pode estar associada com a hidropsia fetal, morte neonatal imediata e prejuízo neurológico. O splicing alternativo resulta em múltiplas variantes de transcrição. (Número de acesso principal ao UniProt: PO6744).

[0167]Miosina cinase de cadeia leve muscular lisa (MYLK).

[0168]MYLK é uma miosina cinase de cadeia leve dependente de cálcio/calmodulina envolvida na contração do músculo liso por meio da fosforilação de cadeias leves de miosina (MLC). Também regula a interação actina-miosina por meio de uma atividade não-cinase. Fosforila as cadeias leves de PTK2B/PYK2 e miosina. Envolvida na resposta inflamatória (por exemplo, apoptose, permeabilidade vascular, diapedese de leucócitos), motilidade e morfologia celular, hiperreatividade das vias aéreas e outras atividades relevantes para a asma.

É necessária para contração do músculo liso vias aéreas tônicas, que é necessário para a resistência fisiológica e asmática das vias aéreas.

É necessária para a motilidade gastrointestinal.

Está envolvida na regulação da permeabilidade endotelial e vascular, provavelmente por meio da regulação de rearranjos citoesqueléticos.

No sistema nervoso, demonstrou controlar a iniciação do crescimento de processos astrocíticos em cultura e participar da liberação do transmissor nas sinapses formadas entre as células ganglionares simpáticas em cultura.

É uma participante crítica em sequências de sinalização que resultam em apoptose de fibroblastos.

Desempenha um papel na regulação da sobrevivência das células epiteliais.

Necessária para cura epitelial de ferimento, especialmente durante a contração do anel de actomiosina durante o fechamento da bolsa.

Medeia o blebbing na membrana dependente de RhoA.

Desencadeia a atividade do canal de TRPC5 em uma sinalização dependente de cálcio, induzindo sua localização subcelular na membrana plasmática.

Promove a migração celular (incluindo células tumorais) e metástase tumoral.

A ativação de PTK2B/PYK2 por fosforilação medeia a ativação de ITGB2 e é, portanto, essencial para acionar a transmigração de neutrófilos durante a lesão pulmonar aguda (ALI). Pode regular a migração de astrócitos na cabeça do nervo óptico.

Está provavelmente envolvida na regulação mitótica citoesqueléticaa Regula junção apertada provavelmente modulando-se a troca de ZO-1 no anel de actomiosina perijuncional.

Medeia lesão da barreira microvascular induzida por queimadura; desencadeia a contração endotelial no desenvolvimento de hiperpermeabilidade microvascular por fosforilação de MLC.

É essencial para a disfunção da intestinal barreira.

Medeia a função da barreira epitelial reduzida mediada por Giardia spp.

A durante infecção intestinal por giardíase por meio da reorganização de F-actina citoesquelética e ZO-1 juncional apertado.

É necessária para a entrada de Ca?* induzida por hipotonicidade e a subsequente ativação de osmólitos orgânicos/canais aniônicos sensíveis ao volume (VSOAC) em células cancerosas cervicais. É responsável pela alta capacidade proliferativa das células do câncer de mama através da anti-apoptose. (Número de acesso principal ao UniProt: 015746).

[0169] Componente P amiloide sérico (SAMP ou APCS).

[0170]O SAMP pode interagir com o DNA e histonas e pode eliminar material nuclear liberado das células circulantes defeituosas. Também pode funcionar como uma lectina dependente de cálcio. (Número de acesso principal ao UniProt: P02743).

[0171]Em algumas modalidades, um ou mais dos biomarcadores da TBI listados acima podem ser usados para determinar que um sujeito sofreu uma TBI com base na detecção de um ou mais destes biomarcadores da TBI em uma amostra do sujeito, e uma falta de detecção de um ou mais biomarcadores da TBI em um sujeito controle (por exemplo, um sujeito que não sofreu uma TBI). Estes biomarcadores da TBI podem incluir um ou mais de AL9A1, ATPG, C1RL, EPIPL, IGHA2, PZP, SYTC, SYYC, ABHEB, DNM1L, FCN2, INF2, K22E, M3K5, NCOR1, SBSN, SYEP, TPP?2, ANXA6, ERAP1, EZRI, FA5, G6PI, MYLK, SAMP ou quaisquer combinações dos mesmos. A medição ou detecção de um ou mais destes biomarcadores da TB| em um sujeito pode ser suficiente para indicar que o sujeito sofreu uma TB, independente da necessidade de detectar, medir, comparar e/ou quantificar a quantidade, concentração e/ou nível de expressão de um ou mais biomarcadores da TBI| em um sujeito controle. Embora um ou mais destes biomarcadores da TBI possam estar presentes em um sujeito controle, ou em um sujeito que não sofreu uma TB, estão geralmente presentes em uma quantidade que não capaz de ser detectada através de meios convencionais, como aqui descritos. Assim, em alguns casos, a detecção de um ou mais destes biomarcadores da TBI em um sujeito indica que um sujeito sofreu uma TBI.

[0172]Em algumas modalidades, um ou mais dos biomarcadores da TBI listados acima podem ser usados para determinar que um sujeito sofreu uma TBI grave com base na detecção de um ou mais destes biomarcadores da TBIl em uma amostra do sujeito, e uma falta de detecção de um ou mais biomarcadores da TB! em um sujeito controle (por exemplo, um sujeito que não sofreu uma TBlI) ou uma falta de detecção em um sujeito que sofreu uma TBI leve. Estes biomarcadores da TBI podem incluir um ou mais de ATPG, C1RL, SYYC ou quaisquer combinações dos mesmos. A medição ou detecção de um ou mais destes biomarcadores da TBI em um sujeito pode ser suficiente para indicar que o sujeito sofreu uma TBI grave, independente da necessidade de detectar, medir, comparar ou quantificar a quantidade, concentração ou nível de expressão de um ou mais biomarcadores da TBI em um sujeito controle ou um sujeito que sofreu uma TBI leve.

[0173]Em algumas modalidades, um ou mais dos biomarcadores da TBI listados acima podem ser usados para determinar que um sujeito sofreu uma TBI com base na detecção de um ou mais destes biomarcadores da TBI| em uma amostra do sujeito em uma quantidade, concentração e/ou nível de expressão que é superior a uma quantidade, concentração e/ou nível de expressão do biomarcador da TBI correspondente em um sujeito controle. Estes biomarcadores da TBI podem incluir um ou mais de CAND1 e GLO?2 ou quaisquer combinações dos mesmos. A medição ou detecção de um nível aumentado de um ou mais destes biomarcadores da TB| em um sujeito como em comparação com um sujeito controle (por exemplo, um sujeito que não sofreu uma TBI) pode ser suficiente para indicar que o sujeito sofreu uma TBIl e, em alguns casos, pode ser suficiente para indicar que o sujeito sofreu uma TBI grave.

[0174]Em algumas modalidades, um ou mais dos biomarcadores da TBI listados acima podem ser usados para determinar que um sujeito sofreu uma TBI com base na detecção de um ou mais destes biomarcadores da TBI em uma amostra do sujeito em uma quantidade, concentração e/ou nível de expressão que é superior ou inferior a uma quantidade, concentração e/ou nível de expressão do biomarcador da TBI correspondente em um sujeito controle. Estes biomarcadores da TBI podem incluir um ou mais de ABHEB, AL9A1, DNM1L ou quaisquer combinações dos mesmos. À medição ou detecção de um nível aumentado ou diminuído de um ou mais destes biomarcadores da TBI em um sujeito como em comparação com um sujeito controle (por exemplo, um sujeito que não sofreu uma TBI) pode ser suficiente para indicar que o sujeito sofreu uma TBI e, em alguns casos, pode ser suficiente para indicar que o sujeito sofreu uma TBI grave. Por exemplo, a detecção ou medição de um alto nível de ABHED e/ou um baixo nível de AL9A1 e/ou DNM1L em um sujeito que pode ter sofrido uma TBI se comparados aos níveis de um sujeito controle pode indicar que o sujeito realmente sofreu uma TBlI. Os níveis destes biomarcadores da TBI podem ser detectados ou medidos isoladamente ou em combinação como parte de um painel ou assinatura da TBI.

[0175]Em algumas modalidades, um ou mais dos biomarcadores da TBI listados acima podem ser usados para determinar que um sujeito sofreu uma TBI leve com base na detecção de um ou mais destes biomarcadores da TBI em uma amostra do sujeito em uma quantidade, concentração e/ou nível de expressão que é superior ou inferior a uma quantidade, concentração e/ou nível de expressão do biomarcador da TBI correspondente em um sujeito controle. Estes biomarcadores da TBI podem incluir um ou mais de M3K5, SBSN, SYEP ou quaisquer combinações dos mesmos. A medição ou detecção de um nível aumentado ou diminuído de um ou mais destes biomarcadores da TBI em um sujeito como em comparação com um sujeito controle (por exemplo, um sujeito que não sofreu uma TBI) pode ser suficiente para indicar que o sujeito sofreu uma TBI e, em alguns casos, pode ser suficiente para indicar que o sujeito sofreu uma TBI leve. Por exemplo, a detecção ou medição de um alto nível de SBSN e/ou SYEP e/ou um baixo nível de M3K5 em um sujeito que pode ter sofrido uma TBI se comparados aos níveis de um sujeito controle pode indicar que o sujeito realmente sofreu uma TBI leve. Os níveis destes biomarcadores da TBI podem ser detectados ou medidos isoladamente ou em combinação como parte de um painel ou assinatura da TBI.

[0176]Em algumas modalidades, um ou mais dos biomarcadores da TBI listados acima podem ser incluídos com outros biomarcadores que podem ou não terem sido identificados como biomarcadores da TBI. Por exemplo, um ou mais dos biomarcadores da TBI listados acima podem ser incluídos em um painel de biomarcadores que pode incluir um ou mais de ANXA6, ERAP1, EZRI, FA5, G6PI, MYLK, SAMP ou combinações dos mesmos. Em alguns casos, um painel de biomarcadores da TBIl, em conjunto com outros biomarcadores da TBI e biomarcadores de não TBI podem ajudar no diagnóstico da TBIl em uma extensão maior que biomarcadores individuais sozinhos.

b. Biomarcadores da TBI Leve Rule-ln

[0177]Como descrito abaixo, os seguintes biomarcadores da TBI foram identificados como sendo capazes de distinguir um sujeito saudável de um sujeito que sofreu uma TBI leve quando detectados isoladamente ou em combinação:

[0178]Proteína 2 de ligação a poli(rC) (Alfa-CP2) (PCBP2).

[0179]Proteína 2 de ligação a polifrC) é uma proteína que, em humanos, é codificada pelo gene PCBP2. A proteína codificada por este gene parece ser multifuncional. Junto com PCBP-1 e hnRNPK corresponde às principais proteínas de ligação a poli(rC) celulares. Contém três domínios homólogos K (KH) que podem estar envolvidos na ligação de RNA. Esta proteína codificada junto com PCBP-1 também funciona como coativadores traducionais de RNA de poliovírus por meio de uma interação específica de sequência com haste-alça IV de IRES e promove replicação do RNA de poliovírus pela ligação à sua estrutura em trevo 5"-terminal. Também está envolvida no controle traducional do MRNA da 15-lipoxigenase, MRNA do tipo 16 L2 do papilomavírus humano e RNA do vírus da hepatite A. Sugere-se que a proteína codificada também desempenha um papel na formação de um complexo de MRNP alfa-globina específico de sequência que está associado com a estabilidade do MRNA de alfa-globina. Considera-se que este mMRNA estrutural multiexon seja retrotransposto para gerar genes sem íntrons de PCBP-1 que tenham funções semelhantes. Este gene e a PCBP-1 têm PCBP3 e PCBP4 parálogos, que se acredita surgirem como um resultado dos eventos de duplicação de genes inteiros. Também tem dois pseudogenes processados PCBP2P1 e PCBP2P2. Existem presentemente duas variantes de transcrição alternativamente emendadas descritas para este gene. Em humanos, o gene PCBP2 se sobrepõe ao TUC338, um elemento ultra-conservado transcrito envolvido no carcinoma Hepatocelular. (Número de acesso principal ao UniProt: 015366).

[0180] Tioredoxina redutase 2 mitocondrial (TRXR2).

[0181]As tioredoxinas redutases (TR, TrxR) (EC 1,8,1,9) são as únicas enzimas conhecidas para reduzir a tioredoxina (Trx). Duas classes de tioredoxina redutase foram identificadas: uma classe em bactérias e alguns eucariotas e outra em animais. Ambas as classes são flavoproteínas que funcionam como homodímeros. Cada monômero contém um grupo protético FAD, um domínio de ligação a NADPH e um sítio ativo contendo uma ligação dissulfeto ativa redox. A tioredoxina redutase é a única enzima conhecida para catalisar a redução de tioredoxina e, consequentemente, é um componente central no sistema da tioredoxina. Junto com a tioredoxina (Trx) e NADPH, a descrição mais geral deste sistema é como um método de formar ligações dissulfeto reduzidas em células. Os elétrons são retirados da NADPH via TrxR e são transferidos para o sítio ativo de Trx, que reduz os dissulfetos de proteínas ou outros substratos. O sistema Trx existe em todas as células vivas e tem uma história evolutiva ligada ao DNA como um material genético, defesa contra danos oxidativos devido ao metabolismo de oxigênio e sinalização redox usando moléculas como peróxido de hidrogênio e óxido nítrico. (Número de acesso principal ao UniProt: Q9NNW7).

Proteína gama 14-3-3 (1433G ou YWHAG).

[0182] 1433G é uma proteína adaptadora envolvida na regulação de um grande espectro de vias de sinalização gerais e especializadas. Se liga a um grande número de parceiros, usualmente por reconhecimento de uma fosfoserina ou fosfotreonina motivo. A ligação geralmente resulta na modulação da atividade do parceiro de ligação. (Número de acesso principal ao UniProt: P61981).

Cinase CDC42 ativada 1 (ACK1 ou TKN2).

[0183]ACK1 é uma proteína tirosina e proteína serina/treonina cinase não receptora que está envolvida na disseminação e migração, sobrevivência celular, crescimento e proliferação celular. Transduz sinais extracelulares para efetores citosólicos e nucleares. Fosforila AKT1, AR, MCF2, WASL e WWOX. Envolvida em tráfico e endocitose mediada por clatrina por meio da ligação ao receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e clatrina. Se liga a poli- e mono-ubiquitina e regula degradação induzida por ligante de EGFR, contribuindo assim para o acúmulo de EGFR na membrana limitante de endossomos iniciais. É uma efetora a jusante de CDCA42 que medeia migração celular dependente de CDC42 por meio da fosforilação de BCAR1. Pode estar envolvida em função sináptica e plasticidade adulta e no desenvolvimento do cérebro. Ativa AKT1 por fosforilação em “Tyr-176". Fosforila AR em “Tyr-267" e “Tyr-363", promovendo assim seu recrutamento para aprimoradores responsivos ao androgênio (AREs). Fosforila WWOX em “Tyr-287"”. Fosforila MCF2, realçando assim sua atividade como um fator de troca de nucleotídeos de guanina (GEF) para proteínas da família Rho. Contribui para o controle de níveis de receptores AXL. Confere propriedades metastáticas em células cancerosas e promove o crescimento do tumor regulando negativamente supresor tumoral, tal como WWOX e regulando positivamente fatores pró-sobrevivência, tal como AKT1 e AR. Fosforila WASP. (Número de acesso principal ao UniProt: Q07912).

Aminoacilase-1 (ACY1).

[0184]ACY1 está envolvida na hidrólise de aminoácidos N-acilados ou N- acetilados (exceto L-aspartato). (Número de acesso principal ao UniProt: Q03154).

[0185]Proteína 12 de ancoragem à cinase A (AKA12 ou AKAP12).

[0186]AKA12 é uma proteína de ancoragem que medeia a compartimentação subcelular da proteína cinase A (PKA) e proteína cinase C (PKC). (Número de acesso principal ao UniProt: Q02952).

Arginase-1 (ARGI1 ou ARG1).

[0187]ARG]1 é elemento chave do ciclo da ureia convertendo L-arginina em ureia e L-ornitina, que é ainda metabolizada em metabólitos prolina e poliamidas que conduzem a síntese de colágeno e vias bioenergéticas críticas para a proliferação celular, respectivamente; o ciclo da ureia ocorre principalmente no fígado e, em menor extensão, nos rins. Funciona na homeostase de L-arginina em tecidos não hepáticos caracterizados pela competição entre óxido nítrico sintase (NOS) e arginase pela arginina do substrato intracelular disponível. O metabolismo da arginina é um regulador crítico das respostas imunes inatas e adaptativas. Está envolvida em uma via efetora antimicrobiana em granulócitos polimorfonucleares (PMN). Após a morte celular dos PMN, é liberada do fagolisossoma e exaure a arginina no microambiente, levando à proliferação celular suprimida de células T e exterminadoras naturais (NK) e secreção de citocina. No grupo 2 de células linfóides inatas (ILC2s), promove inflamação aguda tipo 2 no pulmão e está envolvida na proliferação ótima de ILC2, mas não sobrevivência (Por similaridade). (Número de acesso principal ao UniProt: PO5089).

Caderina-5 (CADH5 ou CDH5).

[0188]CADHS5 é uma caderina; caderinas são proteínas de adesão celular dependentes de cálcio. Elas interagem preferencialmente entre si de uma maneira homofílica na conexão de células; as caderinas podem assim contribuir para a classificação de tipos de células heterogêneos. Esta caderina pode desempenhar um papel importante na biologia celular endotelial através do controle da coesão e organização das junções intercelulares. Se associa com a alfa-catenina formando uma ligação ao citosqueleto. Atua em conjunto com KRIT1 para estabelecer e manter a polaridade celular endotelial correta e o lúmen vascular. Estes efeitos são mediados pelo recrutamento e ativação do complexo de polaridade Par e RAP1B. É necessária para a ativação de PRKCZ e para a localização de PRKCZ fosforilado, PARD3, TIAM1 e RAP1B na junção celular. (Número de acesso principal ao UniProt: P33151).

Cadeia pesada 1 de clatrina (CLH1 of CLTC).

[0189]CLH1 é a principal proteína do revestimento poliédrico de poros e vesículas revestidas. Dois complexos de proteínas adaptadoras diferentes ligam à grade de clatriha à membrana plasmática ou à rede trans-Golgi. Atua como componente do complexo TACC3/ch-TOG/clatrina, proposto a contribuir para a estabilização de fibras cinetocóricas do fuso mitótico, atuando como ponte entre microtúbulos. O complexo TACC3/ch-TOG/clatrina é necessário para a manutenção da tensão da fibra cinetocórica. Desempenha um papel na formação inicial do autofagossoma. (Número de acesso principal ao UniProt: Q00610).

Subunidade gama do coatômero 2 (COPG2).

[0190]COPG?2 é um complexo de proteínas citosólicas que se liga a motivos dilisina e se associa reversivelmente com vesículas não revestidas com clatrina do Golgi, que medeiam ainda o transporte de proteínas biossintéticas do ER, através do Golgi até a rede trans-Golgi. Um complexo coatômero é necessário para crescimento das membranas do Golgi, e é essencial para o transporte retrógrado Golgi para o ER de proteínas marcadas com dilisina. Em mamíferos, o coatômero só pode ser recrutado por membranas associadas aos fatores de ribosilação de ADP (ARFs), que são pequenas proteínas de ligação a GTP; o complexo também influencia a integridade estrutural do Golgi, bem como o processamento, atividade e reciclagem endocítica de receptores de LDL (Por similaridade). (Número de acesso principal ao UniProt: Q9UBF2).

[0191]Subunidade delta de DNA polimerase 2 (DPOD2 ou POLD?2).

[0192]Como um componente dos complexos delta DNA polimerase trimérico e tetramérico (Pol-delta3 e Pol-delta4, respectivamente), DPOD2 desempenha um papel na replicação do genoma alta fidelidade, incluindo na síntese e reparo de fitas lentas. Pol-delta3 e Pol-delta4 são caracterizadas pela ausência ou presença de POLDA4. Exibem diferenças na atividade catalítica. Mais notavelmente, Pol-delta3 mostra maior atividade de revisão que Pol-delta4. Embora Pol-delta3 e Pol-delta4 processem fragmentos de Okazaki in vitro, Pol-deltaã também pode se mais adequada para cumprir esta tarefa, exibindo quase ausência de atividade de deslocamento de fita em comparação com Pol-delta4 e interrompendo o contato com os oligonucleotídeos bloqueadores 5'. O processo lento de Pol-delta3 pode evitar a formação de um gap, mantendo um nick que pode ser facilmente ligado. Junto com DNA polimerase kappa, DNA polimerase delta realiza aproximadamente metade da síntese de reparo por excisão de nucleotídeos (NER) após irradiação UV. Sob condições de estresse da replicação de DNA, necessária para o reparo de garfos de replicação quebrados por meio da replicação induzida por quebra (BIR). Envolvida na síntese de translesão (TLS) de modelos portadores de O6-metilguanina ou sítios abásicos, realizada por Pol-delta4, independentemente de DNA polimerase zeta (REV3L) ou eta (POLH). Facilita o desvio do sítio abásico pelo DNA polimerase delta by promovendo a extensão do nucleotídeo inserido oposto à lesão. Também envolvida em TLS como um componente do complexo POLZ. Junto com POLD3, aumenta drasticamente a eficiência e processabilidade da síntese de DNA do complexo mínimo de DNA polimerase zeta, consistindo apenas em REV3L e REV7. (Número de acesso principal ao UniProt: P49005).

Desmogleína-2 (DSG2).

[0193]DSG2 é um componente de junções desmossomas intercelulares. Está envolvida na interação de proteínas da placa e filamentos intermediários que mediam a adesão célula-célula. (Número de acesso principal ao UniProt: 014126).

[0194]Variável pesada de Imunoglobulina 3-7 (HV307 ou IGHV3-7).

[0195]HV307 é a região V do domínio variável de cadeias pesadas de imunoglobulina que participa do reconhecimento de antígeno. As imunoglobulinas, também conhecidas como anticorpos, são glicoproteínas secretadas ou ligadas à membrana produzidas por linfócitos B. Na fase de reconhecimento da imunidade humoral, as imunoglobulinas ligadas à membrana servem como receptores que, após a ligação de um antígeno específico, desencadeiam a expansão e diferenciação clonal de linfócitos B em células plasmáticas secretoras de imunoglobulinas. As imunoglobulinas secretadas mediam a fase efetora da imunidade humoral, que resulta na eliminação dos antígenos ligados. O sítio de ligação ao antígeno é formado pelo domínio variável de uma cadeia pesada, junto com o de sua cadeia leve associada. Assim, cada imunoglobulina tem dois sítios de ligação ao antígeno com afinidade notável para um antígeno particular. Os domínios variáveis são organizados por um processo chamado reagrupamento V-(D)J e podem então ser submetidos a hipermutações somáticas que, depois da exposição ao antígeno e seleção, permitem a maturação de afinidade para um antígeno particular. (Número de acesso principal ao UniProt: PO1780).

[0196]Proteína IQGAP2 do tipo ativadora de Ras GTPase (IQGA2 ou IQGAP?2).

[0197]! QGA?2 se liga a CDC42 e RAC1 ativadas, mas não parece estimular sua atividade GTPase. Está associada com a calmodulina. (Número de acesso principal ao UniProt: Q13576).

[0198] Queratina tipo | citoesquelética 14 (K1C14 ou KRT14).

[0199]K1C14 é uma proteína de fita intermediária e o domínio não helicoidal da cuda está envolvido na promoção de filamentos de KRT5-KRT14 para se auto- organizarem em grandes feixes e melhora as propriedades mecânicas envolvidas na resiliência de filamentos intermediários de queratina in vitro. (Número de acesso principal ao UniProt: PO2533).

[0200] Queratina, tipo | citoesquelética 19 (K1C19 ou KRT19).

[0201]K1C19 está envolvida na organização de miofibras. Junto com KRT8, ajuda a ligar o aparelho contrátil à distrofina nos costâmeros do músculo estriado. (Número de acesso principal ao UniProt: PO8727).

[0202]Kappa variável de imunoglobulina 1-5 (KV105 de IGKV1-5).

[0203]KV105 é a região V do domínio variável de cadeias leves de imunoglobulina que participa do reconhecimento de antígeno. As imunoglobulinas, também conhecidas como anticorpos, são glicoproteínas secretadas ou ligadas à membrana produzidas por linfócitos B. Na fase de reconhecimento da imunidade humoral, as imunoglobulinas ligadas à membrana servem como receptores que, após a ligação de um antígeno específico, desencadeiam a expansão e diferenciação clonal de linfócitos B em células plasmáticas secretoras de imunoglobulinas. As imunoglobulinas secretadas mediam a fase efetora da imunidade humoral, que resulta na eliminação dos antígenos ligados. O sítio de ligação ao antígeno é formado pelo domínio variável de uma cadeia pesada, junto com o de sua cadeia leve associada. Assim, cada imunoglobulina tem dois sítios de ligação ao antígeno com afinidade notável para um antígeno particular. Os domínios variáveis são organizados por um processo chamado reagrupamento V-(D).J e podem então ser submetidos a hipermutações somáticas que, depois da exposição ao antígeno e seleção, permitem a maturação de afinidade para um antígeno particular. (Número de acesso principal ao UniProt: PO1602).

[0204]Subunidade de laminina gama-1 (LAMC1).

[0205]Ligando-se às células por meio de um receptor de alta afinidade, acredita-se que a LAMC1 medeia a ligação, migração e organização das células nos tecidos durante o desenvolvimento embrionário, interagindo com outros componentes da matriz extracelular. (Número de acesso principal ao UniProt: P11047).

[0206]Malato desidrogenase, mitocondrial (MDHM ou MDH2).

[0207]MDHM catalisa a oxidação reversível do malato em oxaloacetato, utilizando o sistema de cofator NAD/NADH no ciclo do ácido cítrico. A proteína codificada por esse gene está localizada nas mitocôndrias e pode desempenhar papéis fundamentais no transporte de malato-aspartato, que atua na coordenação metabólica entre o citosol e as mitocôndrias. Várias variantes de transcrição que codificam isoformas diferentes foram encontradas para esse gene. (Número de acesso principal ao UniProt: P40926).

[0208]Ribosildi-hidronicotinamida desidrogenase [quinona] (NQO2).

[0209]NQO2 serve como quinona redutase em conexão com reações de conjugação de hidroquinonas envolvidas em vias de desintoxicação, bem como em processos biossintéticos, como a gama-carboxilação gama-dependente de vitamina K de resíduos de glutamato na síntese de protrombina. (Número de acesso principal ao UniProt: P16083).

[021O0]Mieloperoxidase (PERM ou MPO).

[0211]PERM faz parte do sistema de defesa do hospedeiro dos leucócitos polimorfonucleares. É responsável pela atividade microbicida contra uma ampla gama de organismos. Na PMN estimulada, a MPO catalisa a produção de ácidos hipo- halosos, principalmente ácido hipocloroso em situações fisiológicas e outros intermediários tóxicos que aumentam bastante a atividade microbicida da PMN. (Número de acesso principal ao UniProt: PO5164).

[0212]Plastina-3 (PLST ou PLS3).

[0213]PLST é uma proteína que agrupa a actina encontrada nos microvilosidades intestinais, nos estereocílios das células ciliadas e nos filopódios de fibroblastos. Pode desempenhar um papel na regulação do desenvolvimento ósseo. (Número de acesso principal ao UniProt: P13797).

[0214]Nicotinato fosforibosiltransferase (PNCB ou NAPRT).

[0215]PNCB catalisa a conversão do ácido nicotínico (NA) em mononucleotídeo NA (NaMN). É essencial para NA aumentar os níveis celulares de NAD e prevenir o estresse oxidativo das células. Catalisa a síntese de beta-nicotinato D-ribonucleotídeo a partir de nicotinato e 5-fosfo-D-ribose 1-fosfato à custa do ATP. (Número de acesso principal ao UniProt: Q68XQN6).

[0216]Proteína tirosina-fosfatase C do tipo receptora (PTPRC).

[0217]PTPRC é uma proteína tirosina-fosfatase necessária para a ativação de células T através do receptor de antígeno. Atua como um regulador positivo da coativação de células T após a ligação ao DPP4. O primeiro domínio da PTPase possui atividade enzimática, enquanto o segundo parece afetar a especificidade do substrato do primeiro. Após a ativação das células T, ela recruta e desfosforila SKAP1 e FYN. Ela desfosforila a LYN e, assim, modula a atividade da LYN (por similaridade). (Número de acesso principal ao UniProt: PO8575).

Septina-7 (SEPT7).

[0218]SEPT7 é uma GTPase do citoesqueleto de formação de filamento. É necessária para a organização normal do citoesqueleto de actina. É necessária para o progresso normal através da mitose. Está envolvida na citocinese. É necessária para a associação normal do CENPE ao cinetocore. Desempenha um papel na ciliogênese e nos movimentos celulares coletivos. Forma uma estrutura filamentosa com SEPT12, SEPT6, SEPT2 e provavelmente SEPTA4 no anel espermático, o que é necessário para a integridade estrutural e a motilidade da cauda espermática durante a diferenciação pós-meiótica. (Número de acesso principal ao UniProt: Q16181).

[0219]Arginina-ARNt ligase citoplasmática (STRC ou ARSA).

[0220]SYRC faz parte de um complexo macromolecular que catalisa a ligação de aminoácidos específicos aos cognatos de tRNAs durante a síntese de proteínas. Modula a secreção de AIMP1 e pode estar envolvida na geração da citocina inflamatória EMAP2 a partir de AIMP1. (Número de acesso principal ao UniProt:

P54136).

[0221]Proteína 1 do tipo tioredoxina (TXNL1).

[0222]TXNL1 é uma tioredoxina ativa com um potencial redox de cerca de - 250 mV. (Número de acesso principal ao UniProt: 043396).

[0223]UDP-glucose: glicoproteína glucosiltransferase 1 (UGGG1 ou UGGT1).

[0224]UGGG1 reconhece glicoproteinas com pequenos defeitos de dobragem. Reglucosila N-glicanos únicos próximos à parte dobrada da proteína, fornecendo assim um controle de qualidade para a dobragem de proteínas no retículo endoplasmático. As proteínas reglucosiladas são reconhecidas pela calreticulina para reciclagem no retículo endoplasmático e redobragem ou degradação. (Número de acesso principal ao UniProt: Q9NYU2).

Proteína 1 contendo repetição de WD (WDR1).

[0225]WDR]1 induz a desmontagem dos filamentos de actina em conjunto com as proteínas da família ADF/cofilina. Aumenta o corte de actina mediada por cofilina (por similaridade). Está envolvida na citocinese. Está envolvida na migração celular quimiotática, restringindo as saliências da membrana lamelipodial. Está envolvida na organização dos sarcômeros do miocárdio. É necessária para o crescimento e manutenção de cardiomiócitos (por similaridade). Está envolvida na maturação de megacariócitos e no derramamento de plaquetas. É necessária para O estabelecimento da polaridade da célula planar (PCP) durante o desenvolvimento do epitélio folicular e para alterações no formato da célula durante a PCP; a função parece implicar cooperação com CFL1 e/ou DSTN/ADF. Está envolvida na geração/manutenção de tensão cortical (por similaridade). Ela está envolvida na montagem e manutenção de junções epiteliais de células apicais e desempenha um papel na organização do cinturão de actomiosina perijuncional. (Número de acesso principal ao UniProt: 075083).

[0226]Proteína associada a diferenciação de neuroblasto AHNAK (AHNK de

AHNAK).

[0227]AHNK é pensada ser necessária para a diferenciação de células neuronais. (Número de acesso principal ao UniProt: Q09666).

[0228]Retinal desidrogenase 1 (AL1A1 de ALDH1A1).

[0229]AL1A1 converte/oxida retinaldeído ao ácido retinóico. Ela se liga à retina livre e à retinal ligada à proteína de ligação ao retinol celular (por similaridade). Pode ter uma especificidade mais ampla e oxidar outros aldeídos in vivo. (Número de acesso principal ao UniProt: PO0352).

[0230]Aminopeptidase N (AMPN ou ANPEP).

[0231]JAMPN é uma ampla especificidade de aminopeptidase, que desempenha um papel na digestão final de peptídeos gerados a partir de hidrólise de proteínas por proteases pancreáticas e gástricas. Também está envolvida no processamento de vários peptídeos, incluindo hormônios peptídicos, como angiotensina Ill e IV, neuropeptídeos e quimiocinas. Também pode estar envolvida com a clivagem de peptídeos ligados às principais moléculas do complexo histocompatibilidade classe Il de células apresentadoras de antígeno. Pode ter um papel na angiogênese e promover a cristalização do colesterol. Ela atua como um receptor para o coronavírus humano 229E/HCoV-229E. No caso de infecção por coronavírus humano 229E (HCoV-229E), serve como receptor da glicoproteína do pico de HCoV-229E. Também medeia a infecção por citomegalovírus humano (HCMV). (Número de acesso principal ao UniProt: P15144).

[0232]Subunidade beta da proteína de capeamento de F-actina (CAPZB).

[0233] CAPZB é uma proteína de capeamento de F-actina que se liga em uma maneira independente de Ca?* às extremidades de crescimento rápido de filamentos de actina (extremidade farpada) bloqueando, assim, a troca de subunidades a estas extremidades. Ao contrário de outras proteínas de capeamento (como gelsolina e severina), estas proteínas não cortam os filamentos de actina. Desempenha um papel na regulação da morfologia celular e organização citoesquelética. (Número de acesso principal ao UniProt: P47756).

Catepsina D (CATD de CTSD).

[0234]CATD é uma protease ácida ativa em colapso de proteínas intracelulares. Ela desempenha um papel no processamento da APP após a clivagem e ativação pelo ADAM3O, o que leva à degradação da APP. Está envolvida na patogênese de várias doenças, como o câncer de mama e possivelmente a doença de Alzheimer. (Número de acesso principal ao UniProt: PO7339).

[0235]Proteína de ligação contendo domínio CAP-GlIy 2 (CLIP2).

[0236]CLIP2 liga os microtúbulos ao corpo lamelar dendrítico (DLB), uma organela membranosa predominantemente presente nos apêndices dendríticos bulbosos dos neurônios ligados por junções de dendrodendríticas. Pode operar no controle de translocações de organelas específicas do cérebro (por similaridade). (Número de acesso principal ao UniProt: Q9UDT6).

Cromogranina-A (CMGA ou CHGA).

[0237]Pancreastatina: Inibe fortemente a liberação de insulina induzida por glicose a partir do pâncreas. Catestatina: Inibe a liberação de catecolamina das células cromafinas e neurônios noradrenérgicos, agindo como um antagonista colinérgico nicotínico não competitivo. Exibe atividade antibacteriana contra bactérias Gram-positivas S. aureus e M. luteus e bactérias Gram-negativas E. coli e P. aeruginosa. Pode induzir a migração de mastócitos, desgranulação e produção de citocinas e quimiocinas. Atua como um potente limpador de radicais livres in vitro. Pode desempenhar um papel na regulação da função cardíaca e pressão arterial. Serpinina: regula a biogênese de grânulos em células endócrinas através da regulação positiva da transcrição da protease nexina 1 (SERPINE2) através de uma via cCAMP-PKA-SP1. Isto leva à inibição da degradação das proteínas granulares no complexo de Golgi, que por sua vez promove a formação de grânulos. (Número de acesso principal ao UniProt: P10645).

Fascina (FSCN1).

[0238]FSCN1 organiza a actina filamentosa em feixes com uma razão mínima de 4,1:1 de actina/fascinante. Ela desempenha um papel na organização dos feixes de filamentos de actina e na formação de micro-pontas, plissados de membrana e fibras de tensão. É importante para a formação de um conjunto diversificado de protrusões celulares, como os filópodes, e para a motilidade e migração celular. (Número de acesso principal ao UniProt: 016658).

GMP redutase 2 (GMPR2).

[0239]GMPR?2 catalisa a desaminação irreversível do GMP para IMP, dependente de NADPH. Funciona na conversão de nucleobases, nucleosídeos e derivados de nucleotídeos de nucleotídeos G em A e na manutenção do equilíbrio intracelular dos nucleotídeos A e G. Ela desempenha um papel na modulação da diferenciação celular. (Número de acesso principal ao UniProt: Q9P2T1).

[0240]Proteína regulada por glicose 78 kDa (GRP78 ou HSPAS5).

[0241]GRP78 desempenha um papel na facilitação da montagem de complexos proteicos multiméricos no interior do retículo endoplasmático. Está envolvida no dobramento correto de proteínas e na degradação de proteínas dobradas por meio de sua interação com DNAJC10, provavelmente para facilitar a liberação da DNAJC10 de seu substrato (por similaridade). Pensa-se ser uma proteína secretada. (Número de acesso principal ao UniProt: P11021).

[0242]Subunidade catalítica de glutamato-cisteína ligase (GSH1 ou GCLC).

[0243]GSH1, também conhecida como gama-glutamilcisteína sintetase, é a primeira enzima limitadora da taxa da síntese da glutationa. A enzima consiste em duas subunidades: uma subunidade catalítica pesada e uma subunidade reguladora leve. Esse locus codifica a subunidade catalítica, enquanto a subunidade reguladora é derivada de um gene diferente localizado no cromossomo 1p22-p21. Mutações nesse locus têm sido associadas à anemia hemolítica devido à deficiência de gama- glutamilcisteína sintetase e à suscetibilidade ao infarto do miocárdio. (Número de acesso principal ao UniProt: P48506).

[0244]lsocitrato desidrogenase [NADP] citoplasmática (IDHC de IDH1).

[0245]IDHC é uma enzima que em humanos é codificada pelo gene /DH1 no cromossomo 2. As isocitrato desidrogenases catalisam a descarboxilação oxidativa do isocitrato em 2-oxoglutarato. Estas enzimas pertencem a duas subclasses distintas, uma das quais usa NAD* como aceitador de elétrons e a outra NADP*. Foram relatadas cinco desidrogenases de isocitrato: três isocitrato desidrogenases dependentes de NAD*, localizadas na matriz mitocondrial, e duas isocitrato desidrogenases dependentes de NADP*, uma das quais é mitocondrial e a outra predominantemente citossólica. Cada isozima dependente de NADP* é um homodímero. A proteína codificada por esse gene é a isocitrato desidrogenase dependente de NADP*, encontrada no citoplasma e nos peroxissomos. Ela contém a sequência sinal de alvejamento peroxissômico PTS-1. A presença desta enzima nos peroxissomos sugere papéis na regeneração da NADPH para reduções intraperoxissômicas, como a conversão de 2,4-dienoil-CoAs em 3-enoil-CoAs, bem como em reações peroxissômicas que consomem 2-oxoglutarato, a alfa-hidroxilação do ácido fitânico. A enzima citoplasmática desempenha um papel significativo na produção citoplasmática de NADPH. Foram encontradas variantes transcritas de splicing alternativo que codificam a mesma proteína para este gene. (Número de acesso principal ao UniProt: 075874).

[0246] Queratina do tipo | citoesquelética 20 (K1IC20 ou KRT20).

[0247]K1C20 desempenha um papel significativo na manutenção da organização do filamento de queratina nos epitélios intestinais. Quando fosforilada, desempenha um papel na secreção de mucina no intestino delgado (por similaridade). (Número de acesso principal ao UniProt: P35900).

[0248]Homólogo do componente processômico de subunidade pequena KRR1 (KRR1).

[0249]KRR1 é necessário para a biogênese do ribossomo 408. Está envolvido no processamento nucleolar do RNA ribossômico pré-18S e na montagem do ribossomo (por similaridade). (Número de acesso principal ao UniProt: Q13601).

[0250]Proteína C de ligação à manose (MBL2).

[0251]MBL?2 é uma lectina dependente de cálcio envolvida na defesa imune inata. Liga-se à manose, fucose e N-acetilglucosamina em diferentes micro- organismos e ativa a via do complemento da lectina. Liga-se às células apoptóticas tardias, bem como às bolhas apoptóticas e às células necróticas, mas não às células apoptóticas precoces, facilitando sua absorção pelos macrófagos. Pode se ligar ao DNA. (Número de acesso principal ao UniProt: P11226).

[0252]Fator de transporte nuclear 2 (NTF2 ou NUTF2).

[0253]NTF2 medeia a importação de RAN ligado à GDP do citoplasma para o núcleo, o que é essencial para a função de RAN no transporte nucleocitoplasmático mediado por receptor de carga. Desse modo, desempenha indiretamente um papel mais geral no transporte nucleocitoplasmático mediado por receptor de carga. Ela interage com a RAN vinculada à GDP no citosol, a recruta para o complexo de poros nucleares por meio de sua interação com nucleoporinas e promove sua importação nuclear. (Número de acesso principal ao UniProt: P61970).

Fosfoglicerato cinase 1 (PGK1).

[0254]Além de seu papel como enzima glicolítica, a PGK-1 atua como uma proteína cofator polimerase alfa (proteína de reconhecimento de iniciador). Pode desempenhar um papel na motilidade espermática. (Número de acesso principal ao UniProt: POO0558).

Proteína amilóide A-1 sérica (SAA1I).

[0255]SAA1 é uma proteína que, em seres humanos é codificada pelo gene

SAAT. A SAA1 é uma importante proteína de fase aguda produzida principalmente por hepatócitos em resposta à infecção, lesão tecidual e malignidade. Quando liberada na circulação sanguínea, a SAAÍ está presente como uma apolipoproteína associada à lipoproteína de alta densidade (HDL). A SAA1 é um precursor principal da amilóide A (AA), cujo depósito leva à amiloidose inflamatória. (Número de acesso principal ao UniProt: PODJI8).

[0256]Proteína 1 do receptor de transferrina (TFR1 ou TFRC).

[0257]A captação celular de ferro ocorre via endocitose mediada por receptor do receptor de transferrina ocupado por ligante em endossomos especializados. À acidificação endossômica leva à liberação de ferro. O complexo apotransferrina- receptor é então reciclado para a superfície celular com um retorno ao pH neutro e a perda concomitante de afinidade da apotransferrina pelo seu receptor. O receptor de transferrina é necessário para o desenvolvimento de eritrócitos e do sistema nervoso (por similaridade). Um segundo ligante, a proteína de hemocromatose hereditária HFE, compete pela ligação com a transferrina por um sítio de ligação C-terminal sobreposto. Regula positivamente a proliferação de células T e B através da captação de ferro. (Número de acesso principal ao UniProt: P02786).

[0258]EmM algumas modalidades, um ou mais dos biomarcadores da TBI listados acima podem ser usados para determinar que um sujeito sofreu uma TBI com base na detecção de um ou mais destes biomarcadores da TBI em uma amostra do sujeito, e uma falta de detecção de um ou mais biomarcadores da TBI em um sujeito controle (por exemplo, um sujeito que não sofreu uma TBI) ou, em alguns casos, a falta de detecção em um sujeito que sofreu uma TBI grave. Estes biomarcadores da TBI podem incluir um ou mais de 1433G, ACK1, ACY1, AKA12, ARGI1, CADHS5, CLH1, COPG2, DPOD2, DSG2, HV307, IQGA2, KIC14, KIC19, KV105, LAMC1, MDHM, NQO2, PERM, PLST, PNCB, PTPRC, SEPT7, SYRC, TRXR2, TXNL1, UGGG1, WDR1, AHNK, AL1A1, AMPN, CAPZB, CATD, CLIP2, CMGA, FSCNI1,

GMPR2, GRP78, GSH1, IDHC, K1IC20, KRR1, MBL2, NTF2, PCBP2, PGK1, SAAJI, TFR1 ou quaisquer combinações dos mesmos. A medição ou detecção de um ou mais destes biomarcadores da TBI em um sujeito pode ser suficiente para indicar que o sujeito sofreu uma TBI leve, independente da necessidade de detectar, medir, comparar e/ou quantificar a quantidade, concentração e/ou nível de expressão de um ou mais biomarcadores da TBI em um sujeito controle, ou um sujeito que sofreu uma TBI grave. Embora um ou mais destes biomarcadores da TBI possam estar presentes em um sujeito controle, ou em um sujeito que não sofreu uma TB, estão geralmente presentes em uma quantidade que não capaz de ser detectada através de meios convencionais, como aqui descritos. Assim, em alguns casos, a detecção de um ou mais destes biomarcadores da TBI em um sujeito indica que um sujeito sofreu uma TBI leve.

[0259]Em algumas modalidades, um ou mais dos biomarcadores da TBI listados acima podem ser usados para determinar que um sujeito sofreu uma TBI leve de uma subclassificação particular. Sem estar vinculado a uma teoria particular, etiologia subjacente ou mecanismo da doença, um ou mais destes biomarcadores da TBI podem ser usados para classificar um sujeito que sofreu uma TBI leve em uma das quatro subclasses (por exemplo, subclasse 1, subclasse 2, subclasse 3 ou subclasse 4). Por exemplo, a detecção ou medição de um ou mais de ACK1, ACY1, PLST, PNCB, PTPRC, UGGG1 ou quaisquer combinações dos mesmos em um sujeito que pode ter sofrido uma TBI pode indicar que o sujeito realmente sofreu uma TBI leve da subclasse 1. A detecção ou medição de um ou mais de AKA12, HV307, PERM, KV105, NQO2, SEPT7, SYRC, TRXR2 ou quaisquer combinações dos mesmos em um sujeito que pode ter sofrido uma TBI pode indicar que o sujeito realmente sofreu uma TBI leve da subclasse 2. E detecção ou medição de um ou mais de 1433B, ARGI1, CADH5, CLH1, COPG2, DPOD?2, DSG2, IQGA2, KIC14, LAMC1, MDHM, TXNL1 ou quaisquer combinações dos mesmos em um sujeito que pode ter sofrido uma TBI pode indicar que o sujeito realmente sofreu uma TBI leve da subclasse 3. Os níveis destes biomarcadores da TBI podem ser detectados ou medidos isoladamente ou em combinação como parte de um painel ou assinatura de TBI leve.

[0260]Em algumas modalidades, um ou mais dos biomarcadores da TBI listados acima podem ser incluídos com outros biomarcadores que podem ou não terem sido identificados como biomarcadores da TBI. Por exemplo, um ou mais dos biomarcadores da TBI listados acima podem ser incluídos em um painel de biomarcadores que pode incluir um ou mais de AHNK, AL1A1, AMPN, CAPZB, CATD, CLIP2, CMGA, FSCN1, GMPR2, GRP78, GSH1, IDHC, K1C20, KRR1, MBL2, NTF2, PCBP2, PGK1, SAA1, TFR1 ou combinações dos mesmos. Em alguns casos, um painel de biomarcadores da TBI, em conjunto com outros biomarcadores da TBI e biomarcadores de não TBI podem ajudar no diagnóstico da TBIl em uma extensão maior que biomarcadores individuais sozinhos.

c. Assinaturas de TBI leve

[0261]Como descrito abaixo, os seguintes biomarcadores da TBI leve foram identificados como sendo capazes de distinguir um sujeito saudável de um sujeito que sofreu uma TBI leve e/ou uma TBI leve de uma subclasse específica quando detectados isoladamente ou em combinação:

[0262]Receptor de efrina tipo B 4 (EPHB4).

[0263]Receptor de efrina tipo B 4 é uma proteína que, em humanos, é codificada pelo gene EPHB4. Os receptores de efrina e seus ligantes, as efrinas, mediam numerosos processos de desenvolvimento, particularmente no sistema nervoso. Com base em suas estruturas e relações de sequência, as efrinas são divididas na classe efrina-A (EFNA), que estão ancoradas à membrana por uma ligação de glicosilfosfatidilinositol, e a classe efrina-B (EFNB), que são proteínas transmembranares. A família Eph de receptores é dividida em 2 grupos com base na similaridade de suas sequências de domínio extracelular e suas afinidades para ligação de ligantes de efrina-A e efrina-B. Os receptores de efrina constituem o maior subgrupo da família de receptores tirosina cinase (RTK). A proteína codificada por este gene se liga à efrina-B2 e desempenha um papel essencial no desenvolvimento vascular. (Número de acesso principal ao UniProt: P54760).

[0264]Variável pesada de imunoglobulina 1-3 (HV103 ou IGHV1-3).

[0265]HV103 é a região V do domínio variável de cadeias pesadas de imunoglobulina que participa do reconhecimento de antígeno. As imunoglobulinas, também conhecidas como anticorpos, são glicoproteínas secretadas ou ligadas à membrana produzidas por linfócitos B. Na fase de reconhecimento da imunidade humoral, as imunoglobulinas ligadas à membrana servem como receptores que, após a ligação de um antígeno específico, desencadeiam a expansão e diferenciação clonal de linfócitos B em células plasmáticas secretoras de imunoglobulinas. As imunoglobulinas secretadas mediam a fase efetora da imunidade humoral, que resulta na eliminação dos antígenos ligados. O sítio de ligação ao antígeno é formado pelo domínio variável de uma cadeia pesada, junto com o de sua cadeia leve associada. Assim, cada imunoglobulina tem dois sítios de ligação ao antígeno com afinidade notável para um antígeno particular. Os domínios variáveis são organizados por um processo chamado reagrupamento V-(D)J e podem então ser submetidos a hipermutações somáticas que, depois da exposição ao antígeno e seleção, permitem a maturação de afinidade para um antígeno particular. (Número de acesso principal ao UniProt: ADAOC4DH29).

[0266]Delta constante pesado de imunoglobulina (IGHD).

[0267]IGHD é uma região constante de cadeias pesadas de imunoglobulina. As imunoglobulinas, também conhecidas como anticorpos, são glicoproteínas secretadas ou ligadas à membrana produzidas por linfócitos B. Na fase de reconhecimento da imunidade humoral, as imunoglobulinas ligadas à membrana servem como receptores que, após a ligação de um antígeno específico, desencadeiam a expansão e diferenciação clonal de linfócitos B em células plasmáticas secretoras de imunoglobulinas. As imunoglobulinas secretadas mediam a fase efetora da imunidade humoral, que resulta na eliminação dos antígenos ligados. O sítio de ligação ao antígeno é formado pelo domínio variável de uma cadeia pesada, junto com o de sua cadeia leve associada. Assim, cada imunoglobulina tem dois sítios de ligação ao antígeno com afinidade notável para um antígeno particular. Os domínios variáveis são organizados por um processo chamado reagrupamento V-(D)- J e podem então ser submetidos a hipermutações somáticas que, depois da exposição ao antígeno e seleção, permitem a maturação de afinidade para um antígeno particular. A IgD é o principal isotipo receptor de antígeno na superfície da maioria das células B periféricas, onde é coexpressa com IgM. A IgD ligada à membrana (mIgD) induz a fosforilação de CD79A e CD79B pela família Src de proteínas tirosina quinases. A concentração de IgD (slgD) solúvel em soro é mais baixa que das IgG, IgA e IgM, mas muito mais que da IgE. As moléculas de IgM e I|gD presentes em células B têm regiões V e sítios de ligação ao antígeno idêntico. Depois que o antígeno se liga ao receptor da célula B, a forma secretada de sIgD é desativada. A IgD é um potente indutor de TNF, IL1B e ILIRN. A |lgD também induz a liberação de IL6, IL10 e LIF de células mononucleares do sangue periférico. Os monócitos parecem ser os principais produtores de citocinas in vitro na presença de IgD. (Número de acesso principal ao UniProt: PO01880).

[0268]Hidrólase de éster C110rf54 (CKO54 de C110rf54).

[0269]CK054 é uma proteína que, em humanos, é codificada pelo gene C110rf54. O gene humano, C110rf54, também é conhecido como PTDO012 e PTOD12. C110rf54 exibe atividade de hidrólase em acetato p-nitrofenila e atua em ligações de éster, embora a função global ainda não seja completamente entendida pela comunidade cintífica. A proteína é altamente conservada com o homólogo mais distante encontrado está em bactérias (Número de acesso principal ao UniProt: Q9HOwW9).

[0270]Alfa-manosidase específica de epidídimo (MA2B2 ou MAN2B2).

[027 1]MA2ZB? catalisa a hidrólise de resíduos de alfa-D-manose não redutores terminais em alfa-D-manosídeos. (Número de acesso principal ao UniProt: Q9Y2E5).

[0272]Homólogo diáfano de proteína 1 (DIAP1 ou DIAPH1).

[0273]DIAP1 atua de uma maneira dependente de Rho para recrutar PFY1 para a membrana. É necessário para a montagem de estruturas de F-actina, tal como cabos e fibras de estresse de actina. Filamentos de actina nucleados. Se liga à extremidade farpada da fita de actina e desacelera a polimerização e a despolimerização de actina. Isto é necessário para citocinese e ativação transcricional do fator de resposta sérico. As proteínas DFR acoplam a tirosina cinase Rho e Src durante a sinalização e a regulação da dinâmica da actina. Funciona como uma proteína de andaime para MAPRE1 e APC para estabilizar os microtúbulos e promover a migração celular (Por similaridade). Possui atividade de promoção de crescimento de neurite (Por similaridade). Nas células auditivas, pode desempenhar um papel na regulação da polimerização de actina em células capilares. A via de sinalização MEMO1-RHOA-DIAPH1 desempenha um papel importante na estabilização dependente de ERBB2 de microtúbulos no córtex da célula. Controles a localização de APC e CLASP2 na membrana celular através da regulação da atividade de GSK3B. Por sua vez, a APC ligada à membrana permite a localização da MACF1 na membrana celular, que é necessária para captura e estabilização de microtúbulos. Desempenha um papel na regulação de morfologia celular e organização citoesquelética. É necessária no controle da forma da célula. Desempenha um papel no desenvolvimento do cérebro. (Número de acesso principal ao UniProt: 060610).

[0274]Pró-colágeno-lisina,2-oxoglutarato 5-dioxigenase 1 (PLOD1).

[0275]PLOD1 é parte de um complexo composto de PLOD1, P3H3 e P3H4 que catalisa a hidroxilação de resíduos de lisina em cadeias alfa de colágeno e é necessário para montagem e reticulação normal de fibrilas de colágeno (Por similaridade). Forma resíduos de hidroxilisina em sequências -Xaa-Lys-Gly- em colágenos. Estas hidroxilisinas servem como sítios de fixação para unidades de carboidrato e são essenciais para a estabilidade da reticulação do colágeno intermolecular (Provável). (Número de acesso principal ao UniProt: Q02809).

[0276]Kappa variável de imunoglobulina 1-33 (KV133 ou IGKV1-33).

[0277]KV133 é a região V do domínio variável de cadeias leves de imunoglobulina que participa do reconhecimento de antígeno. As imunoglobulinas, também conhecidas como anticorpos, são glicoproteínas secretadas ou ligadas à membrana produzidas por linfócitos B. Na fase de reconhecimento da imunidade humoral, as imunoglobulinas ligadas à membrana servem como receptores que, após a ligação de um antígeno específico, desencadeiam a expansão e diferenciação clonal de linfócitos B em células plasmáticas secretoras de imunoglobulinas. As imunoglobulinas secretadas mediam a fase efetora da imunidade humoral, que resulta na eliminação dos antígenos ligados. O sítio de ligação ao antígeno é formado pelo domínio variável de uma cadeia pesada, junto com o de sua cadeia leve associada. Assim, cada imunoglobulina tem dois sítios de ligação ao antígeno com afinidade notável para um antígeno particular. Os domínios variáveis são organizados por um processo chamado reagrupamento V-(D)J e podem então ser submetidos a hipermutações somáticas que, depois da exposição ao antígeno e seleção, permitem a maturação de afinidade para um antígeno particular. (Número de acesso principal ao UniProt: PO1594).

[0278]Como aqui divulgado, os seguintes biomarcadores foram também identificados como sendo capazes de distinguir um sujeito saudável de um sujeito que sofreu uma TBI leve e/ou uma TBI leve de uma subclasse específica quando detectados isoladamente ou em combinação entre si e com os outros biomarcadores nesta seção: TPP2, CAND1, NCOR1, K22E, AL9A1, ABHEB, DNM1L, INF2, M3K5, SBSN, SYEP, MYLK e SAMP. Descrições destes biomarcadores foram fornecidas acima e não são replicadas aqui.

[0279]Em algumas modalidades, um ou mais dos biomarcadores da TBI listados acima podem ser usados para determinar que um sujeito sofreu uma TBI leve de uma subclassificação particular. Sem estar vinculado a uma teoria particular, etiologia subjacente ou mecanismo da doença, um ou mais destes biomarcadores da TBI podem ser usados para classificar um sujeito que sofreu uma TBI leve em uma das quatro subclasses (por exemplo, subclasse 1, subclasse 2, subclasse 3 ou subclasse 4). Em algumas modalidades, um ou mais dos biomarcadores da TBI listados acima podem ser usados para determinar que um sujeito sofreu uma TBI leve com base na detecção de um ou mais destes biomarcadores da TBIl em uma amostra do sujeito em uma quantidade, concentração e/ou nível de expressão que é superior ou inferior a uma quantidade, concentração e/ou nível de expressão do biomarcador da TBI correspondente em um sujeito controle. A medição ou detecção de um nível aumentado ou diminuído de um ou mais destes biomarcadores da TBI em um sujeito como em comparação com um sujeito controle (por exemplo, um sujeito que não sofreu uma TBI) pode ser suficiente para indicar que o sujeito sofreu uma TBI leve e, em alguns casos, pode ser suficiente para indicar que o sujeito sofreu uma TBI leve de uma subclasse particular.

[0280]Por exemplo, a detecção ou medição de um ou mais de TPP2, CAND1, NCOR1, K22E, AL9A1, ABHEB, DNM1L, INF2 ou quaisquer combinações dos mesmos em um sujeito que pode ter sofrido uma TBI pode indicar que o sujeito realmente sofreu uma TBI leve da subclasse 4. Em alguns casos, a detecção ou medição de um alto nível de CAND1, NCOR1, K22E, ABHEB, DNM1L ou qualquer combinação dos mesmos e/ou um baixo nível de TPP2, AL9A1, INF2 ou qualquer combinação dos mesmos em um sujeito que pode ter sofrido uma TBI se comparados aos níveis de um sujeito controle pode indicar que o sujeito realmente sofreu uma TB! leve da subclasse 4.

[0281]Em algumas modalidades, a detecção ou medição de um ou mais de TPP2, NCOR1, HV103, INF2, IGHD, CKO054, M3K5, ABHEB, AL9A1, DNM1L ou quaisquer combinações dos mesmos em um sujeito que pode ter sofrido uma TBI pode indicar que o sujeito realmente sofreu uma TBI leve da subclasse 3. Em alguns casos, a detecção ou medição de um alto nível de NCOR1, HV103, IGHD, ABHEB, DNM1L ou qualquer combinação dos mesmos e/ou um baixo nível de TPP2, IGHD, CKOS54, M3K5, AL9A1 ou qualquer combinação dos mesmos em um sujeito que pode ter sofrido uma TBI se comparados aos níveis de um sujeito controle pode indicar que o sujeito realmente sofreu uma TBI leve da subclasse 3.

[0282]Em algumas modalidades, a detecção ou medição de um ou mais de NCOR1, TPP2, K22E, ABHEB, INF2, SBSN, AL9A1I, MA2B2 ou quaisquer combinações dos mesmos em um sujeito que pode ter sofrido uma TBI pode indicar que o sujeito realmente sofreu uma TBI leve da subclasse 2. Em alguns casos, a detecção ou medição de um alto nível de NCOR1, K22E, ABHEB, SBSN ou qualquer combinação dos mesmos e/ou um baixo nível de TPP2, INF2, AL9A1, MA2B2 ou qualquer combinação dos mesmos em um sujeito que pode ter sofrido uma TBI se comparados aos níveis de um sujeito controle pode indicar que o sujeito realmente sofreu uma TBI leve da subclasse 2.

[0283]Em outras modalidades, a detecção ou medição de um ou mais de K22E, DNM1L, DIAP1, ABHEB, PLOD1, SYEP, KV133, AL9A1, EPHBA ou quaisquer combinações dos mesmos em um sujeito que pode ter sofrido uma TBI pode indicar que o sujeito realmente sofreu uma TBI leve da subclasse 1. Em alguns casos, a detecção ou medição de um alto nível de K22E, DNM1L, DIAP1, ABHEB, PLOD1, SYEP, EPHBA4 ou qualquer combinação dos mesmos e/ou um baixo nível de KV133 e AL9A1 ou qualquer combinação dos mesmos em um sujeito que pode ter sofrido uma TB! se comparados aos níveis de um sujeito controle pode indicar que o sujeito realmente sofreu uma TBI leve da subclasse 1.

[0284]Os níveis destes biomarcadores da TBI podem ser detectados ou medidos isoladamente ou em combinação como parte de um painel ou assinatura de TBI leve.

[0285]Em algumas modalidades, um ou mais dos biomarcadores da TBI listados acima podem ser incluídos com outros biomarcadores que podem ou não terem sido identificados como biomarcadores da TBI. Por exemplo, um ou mais dos biomarcadores da TBI listados acima podem ser incluídos em um painel de biomarcadores que pode incluir um ou mais de MYLK, SAMP ou combinações dos mesmos. Em alguns casos, um painel de biomarcadores da TBI, em conjunto com outros biomarcadores da TBI e biomarcadores de não TBI podem ajudar no diagnóstico da TBl em uma extensão maior que biomarcadores individuais sozinhos.

[0286]Como descrito abaixo, os seguintes biomarcadores da TBI leve foram identificados como sendo capazes de distinguir um sujeito saudável de um sujeito que sofreu uma TBI leve e/ou uma TBI leve de uma subclasse específica quando detectados isoladamente ou em combinação:

[0287]Cadeia leve de dineína citoplasmática 1 (DYL1 ou DYNLL1).

[0288]A DYL1 atua como um dos vários componentes acessórios não catalíticos do complexo da dineína citoplasmática 1 que se acredita estarem envolvidos na ligação da dineína às proteínas de carregamento e adaptadoras que regulam a função da dineína. A dineína citoplasmática 1 atua como um motor para a motilidade retrógrada intracelular de vesículas e organelas ao longo de microtúbulos. Pode desempenhar um papel na mutação ou manutenção da distribuição espacial de estruturas citoesqueléticas. Se liga e inibe a atividade catalítica de óxido nítrico sintase neuronal. Promove funções de transativação de ESR1 e desempenha um papel na localização nuclear de ESR1. Regula atividades apoptóticas de BCL2L11 sequestrando-o nos microtúbulos. Após estímulos apoptóticos, o complexo BCL2L11- DYNLL1 se dissocia da dineína citoplasmática e transloca para a mitocôndria e sequestra BCL2, neutralizando assim sua atividade antiapoptótica. (Número de acesso principal ao UniProt: P63167).

[0289]Aminopeptidase sensível a puromicina (PSA ou NPEPPS).

[0290]PSA é uma aminopeptidase com ampla especificidade de substrato para vários peptídeos. Está envolvida em eventos proteolíticos essenciais para o crescimento e viabilidade celular. Pode atuar como reguladora da atividade neuropeptídica. Desempenha um papel na via de processamento de antígeno para as moléculas de MHC classe |. Está envolvida na aparação N-terminal de precursores de epítopos de células T citotóxicas. Digere os peptídeos poli-Q encontrados em muitas proteínas celulares. Digere a tau do cérebro normal mais eficientemente que a tau do cérebro com doença de Alzheimer. (Número de acesso principal ao UniProt: P55786).

[0291]Proteína 1 da matriz extracelular tipo fibulina contendo EGF (FBLN3 ou EFEMP1).

[0292]FBLN3 se liga ao EGFR, o receptor de EGF, induzindo a autofosforilação do EGFR e a ativação das vias de sinalização a jusante. Pode desempenhar um papel na adesão e migração celular. Pode funcionar como um regulador negativo da diferenciação de condrócitos. No epitélio olfativo, pode regular a migração de células gliais, a diferenciação e a capacidade de células gliais para suportar o crescimento de neurite neuronal. (Número de acesso principal ao UniProt: Q12805).

[0293]Albumina do soro (ALBU ou ALB).

[0294]ALBU é a principal proteína do plasma, tem uma boa capacidade de ligação à água, Ca?*, Na*, K*, ácidos graxos, hormônios, bilirrubina e medicamentos. Sua principal função é a regulação da pressão osmótica coloidal de sangue. É um importante transportador de zinco no plasma, tipicamente liga cerca de 80 % de todo o zinco plasmático. (Número de acesso principal ao UniProt: P02768).

3-Cetoacil-CoA tiolase mitocondrial (THIM ou ACAA2).

[0295]THIM está envolvida na abolição da apoptose e dano mitocondrial mediados por BNIP3. (Número de acesso principal ao UniProt: P42765).

[0296]Kappa variável de imunoglobulina 1-39 (KV139 ou IGKV1-39).

[0297]KV139 é a região V do domínio variável de cadeias leves de imunoglobulina que participa do reconhecimento de antígeno. As imunoglobulinas, também conhecidas como anticorpos, são glicoproteínas secretadas ou ligadas à membrana produzidas por linfócitos B. Na fase de reconhecimento da imunidade humoral, as imunoglobulinas ligadas à membrana servem como receptores que, após a ligação de um antígeno específico, desencadeiam a expansão e diferenciação clonal de linfócitos B em células plasmáticas secretoras de imunoglobulinas. As imunoglobulinas secretadas mediam a fase efetora da imunidade humoral, que resulta na eliminação dos antígenos ligados. O sítio de ligação ao antígeno é formado pelo domínio variável de uma cadeia pesada, junto com o de sua cadeia leve associada. Assim, cada imunoglobulina tem dois sítios de ligação ao antígeno com afinidade notável para um antígeno particular. Os domínios variáveis são organizados por um processo chamado reagrupamento V-(D)-J e podem então ser submetidos a hipermutações somáticas que, depois da exposição ao antígeno e seleção, permitem a maturação de afinidade para um antígeno particular. (Número de acesso principal ao UniProt: PO1597).

[0298]Lectina serina protease 2 de ligação a manana (MASP2).

[0299]MASP? é uma protease sérica que desempenha um papel importante na ativação do sistema complemento através da lectina de ligação à manose. Depois da ativação por clivagem auto-catalítica, cliva C2 e C4, levando à sua ativação e à formação de C3 convertase. (Número de acesso principal ao UniProt: 000187).

[0300]Como aqui divulgado, os seguintes biomarcadores da TBI leve foram identificados como sendo capazes de distinguir um sujeito saudável de um sujeito que sofreu uma TBI leve e/ou uma TBI leve de uma subclasse específica quando detectados isoladamente ou em combinação entre si e com os outros biomarcadores nesta seção: ANXA6, CAND1, NCOR1, K22E, ABHEB, DIAP1, DNM1L, EPHBA, GLO2, HV103, IGHA2, IGHD, PLOD1, SBSN, SYEP, MYLK e SAMP. Descrições destes biomarcadores foram fornecidas acima e não são replicadas aqui.

[0301]Em algumas modalidades, um ou mais dos biomarcadores da TBI listados acima podem ser usados para determinar que um sujeito sofreu uma TBI leve de uma subclassificação particular. Sem estar vinculado a uma teoria particular, etiologia subjacente ou mecanismo da doença, um ou mais destes biomarcadores da TBI podem ser usados para classificar um sujeito que sofreu uma TBI leve em uma das quatro subclasses (por exemplo, subclasse 1, subclasse 2, subclasse 3 ou subclasse 4). Em algumas modalidades, um ou mais dos biomarcadores da TBI listados acima podem ser usados para determinar que um sujeito sofreu uma TBI leve com base na detecção de um ou mais destes biomarcadores da TBIl em uma amostra do sujeito em uma quantidade, concentração e/ou nível de expressão que é superior ou inferior a uma quantidade, concentração e/ou nível de expressão do biomarcador da TBI correspondente em um sujeito controle. A medição ou detecção de um nível aumentado ou diminuído de um ou mais destes biomarcadores da TBI em um sujeito como em comparação com um sujeito controle (por exemplo, um sujeito que não sofreu uma TBI) pode ser suficiente para indicar que o sujeito sofreu uma TBI leve e, em alguns casos, pode ser suficiente para indicar que o sujeito sofreu uma TBI leve de uma subclasse particular.

[0302]Por exemplo, a detecção ou medição de um ou mais de CAND1, NCOR1, K22E, ABHEB, DNM1L, SBSN, GLO2, SYEP ou quaisquer combinações dos mesmos em um sujeito que pode ter sofrido uma TBI pode indicar que o sujeito realmente sofreu uma TBI leve da subclasse 4. Em alguns casos, a detecção ou medição de um alto nível de CAND1, NCOR1, K22E, ABHEB, DNM1L, SBSN, GLO?, SYEP ou quaisquer combinações dos mesmos em um sujeito que pode ter sofrido uma TBI se comparados aos níveis de um sujeito controle pode indicar que o sujeito realmente sofreu uma TBl leve da subclasse 4.

[0303]Em algumas modalidades, a detecção ou medição de um ou mais de NCOR1, HV103, IGHD, ABHEB, DNM1L, ALBU, THIM, IGHA2, KV139 ou quaisquer combinações dos mesmos em um sujeito que pode ter sofrido uma TBI pode indicar que o sujeito realmente sofreu uma TBI leve da subclasse 3. Em alguns casos, a detecção ou medição de um alto nível de NCOR1, HV103, IGHD, ABHEB, DNM1L, ALBU, THIM, IGHA2, KV139 ou quaisquer combinações dos mesmos em um sujeito que pode ter sofrido uma TBI se comparados aos níveis de um sujeito controle pode indicar que o sujeito realmente sofreu uma TBI leve da subclasse 3.

[0304]Em algumas modalidades, a detecção ou medição de um ou mais de NCOR1, K22E, ABHEB, SBSN, DNM1L, DIAP1, DYL1, PSA, EPHB4 ou quaisquer combinações dos mesmos em um sujeito que pode ter sofrido uma TBI pode indicar que o sujeito realmente sofreu uma TBI leve da subclasse 2. Em alguns casos, a detecção ou medição de um alto nível de NCOR1, K22E, ABHEB, SBSN, DNM1L, DIAP1, DYL1, PSA, EPHB4 ou quaisquer combinações dos mesmos em um sujeito que pode ter sofrido uma TBI se comparados aos níveis de um sujeito controle pode indicar que o sujeito realmente sofreu uma TBI leve da subclasse 2.

[0305]Em outras modalidades, a detecção ou medição de um ou mais de K22E, DNM1L, DIAP1, ABHEB, PLOD1, SYEP, EPHB4, FBLN3 ou quaisquer combinações dos mesmos em um sujeito que pode ter sofrido uma TBI pode indicar que o sujeito realmente sofreu uma TBI leve da subclasse 1. Em alguns casos, a detecção ou medição de um alto nível de K22E, DNM1L, DIAP1, ABHEB, PLOD1, SYEP, EPHB4, FBLN3 ou quaisquer combinações dos mesmos em um sujeito que pode ter sofrido uma TBI se comparados aos níveis de um sujeito controle pode indicar que o sujeito realmente sofreu uma TBI leve da subclasse 1.

[0306]Os níveis destes biomarcadores da TBI podem ser detectados ou medidos isoladamente ou em combinação como parte de um painel ou assinatura de TBI leve.

[0307]Em algumas modalidades, um ou mais dos biomarcadores da TBI listados acima podem ser incluídos com outros biomarcadores que podem ou não terem sido identificados como biomarcadores da TBI. Por exemplo, um ou mais dos biomarcadores da TBI listados acima podem ser incluídos em um painel de biomarcadores que pode incluir um ou mais de ANXA6, MASP2, MYLK, SAMP ou combinações dos mesmos. Em alguns casos, um painel de biomarcadores da TBI, em conjunto com outros biomarcadores da TBI e biomarcadores de não TBI podem ajudar no diagnóstico da TBIl em uma extensão maior que biomarcadores individuais sozinhos.

d. Biomarcadores da TBI Rule-Out

[0308]Como descrito abaixo, os seguintes biomarcadores da TBI foram identificados como sendo capazes de distinguir um sujeito saudável de um sujeito que sofreu uma TBI quando detectados isoladamente ou em combinação:

[0309]Proteína tipo rica em ácido glutâmico de ligação ao domínio SH3 (SH3BGRL).

[0310]A proteína 3 do tipo rica em ácido glutâmico de ligação ao domínio SH3 é uma proteína que, em humanos, é codificada pelo gene SH3BGRL3. A proteína rica em ácido glutâmico de ligação à proteína SH3 de 10,5 kDa do tipo 3 tem um ponto isoelétrico de 5,0. O gene rico em ácido glutâmico de ligação a SH3 (SH3BGR) está localizado no cromossomo humano 21. Dois genes homólogos, SH3BGRL e SH3BGRL3, estão localizados no cromossomo Xq13.3 e 1p34.3-35, respectivamente, e codificam para proteínas pequenas semelhantes á região N-terminal da proteína SH3BGR. A proteina SH3BGRL3 mostra uma similaridade significativa com a glutarredoxina 1 da E. coli, e todas as três proteínas pertencem à família de proteínas do tipo tiorredoxina. As glutarredoxinas (GRXs) são oxidoredutases ubíquas, que catalisam a redução de muitos dissulfetos de proteínas intracelulares e desempenham um papel importante em muitas vias redox. Entretanto, a proteína SH3BGRL3 carece da função enzimática das glutarredoxinas e podem ter um papel como um regulador de atividade redox. (Número de acesso principal ao UniProt: 075368).

[0311]Proteína 2 do tipo beta-actina (ACTBL ou ACTBL2).

[0312]JACTBL é um membro da família actina. As actinas são proteínas altamente conservadas que estão envolvidas em vários tipos de motilidade celular e são ubiquitosamente expressadas em todas as células eucarióticas. (Número de acesso principal ao UniProt: Q562R1).

[0313]Aldeído desidrogenase mitocondrial (ALDH2).

[0314]ALDH2 cataliisa a oxidação de aldeídos. Apesar do nome “desidrogenase”, seu modo de oxidação é pela adição de oxigênio e não pela remoção de hidrogênio - isto é, ele converte aldeídos (R-C(=O)-H) em ácidos carboxílicos (R- C(=0)-O-H). Até o momento, dezenove genes ALDH foram identificados dentro do genoma humano. Estes genes participam de uma ampla variedade de processos biológicos, incluindo a desintoxicação de aldeídos exogenamente e endogenamente gerados. (Número de acesso principal ao UniProt: PO5091).

Anexina A5 (ANXAS5).

[0315]ANXA5 é uma proteína anticoagulante qua atua como um inibidor indireto do complexo específico de tromboplastina, que está envolvida na cascata de coagulação do sangue. (Número de acesso principal ao UniProt: PO8758).

[0316]Peptídeo antimicrobiano de catelicidina (CAMP).

[0317] CAMP se liga a lipopolissacarídeos bacterianos (LPS), e exibe atividade antibacteriana. (Número de acesso principal ao UniProt: P49913).

Copina-3 (CPNE3).

[0318]CPNE3 é uma proteína de ligação de fosfolipídios dependente de cálcio que desempenha um papel na migração de células tumorais maediada por ERBB2 em resposta à estimulação de heregulina do fator de crescimento. (Número de acesso principal ao UniProt: 075131).

Proteína ácida 1 da cartilagem (CRAC1 ou CRTAC1).

[0319] CRAC1 codifica uma proteína da matriz extracelular glicosilada que é encontrada na matriz interterritorial da cartilagem articular da zona profunda. Esta proteína é usada como um marcador para distinguir condrócitos de osteoblastos e células troncos mesenquimais em cultura. A presença de motivos FG-GAP e um motivo de ligação à integrina RGD sugere que esta proteína pode estar envolvida em interações célula-célula ou célula-matriz. Alterações no número de cópias neste gene foram observadas em tumores glômicos associados à neurofibromatose tipo 1. O Ssplicing alternativo resulta em múltiplas variantes de transcrição. (Número de acesso principal ao UniProt: Q9NQ79).

Cistatina-C (CYTC ou CST3).

[0320]Como um inibidor de proteinases de cisteína, acredita-se que a CYTC tenha um papel fisiológico importante como um regulador local de sua atividade enzimática. (Número de acesso principal ao UniProt: PO1034).

[0321]Aspartil aminopeptidase (DNPEP).

[0322]DNPEP é uma aminopeptidase com especificidade para um aminoácido ácido no terminal N. É provavelmente que desempenhem um papel importante no metabolismo intracelular proteínas e peptídeos. (Número de acesso principal ao UniProt: Q9ULAO).

[0323]Subunidade | do fator de iniciação da tradução eucariótica 3 (EIF3I).

[0324]E|F3] é um componente do complexo do fator de iniciação da tradução eucariótica 3 (elF-3), que é necessário para várias etapas na iniciação da síntese de proteínas. O complexo elF-3 se associa com o ribossomo 408 e facilita o recrutamento de elF-1, elF-1A, elF-2:GTP:metionil--0»RNAi e elF-5 para formar o complexo de pré- iniciação 438 (438 PIC). O complexo elF-3 estimula o recrutamento de MRNA para o 438 PIC e a varredura do MRNA para o reconhecimento de AUG. O complexo elF-3 também é necessário para a desmontagem e reciclagem de complexos ribossômicos pós-terminação e, subsequentemente, impede a união prematura das subunidades ribossômicas 408 e 608 antes da iniciação. O complexo elF-3 alveja especificamente e inicia a tradução de um subconjunto de MRNAs envolvidos na proliferação celular, incluindo ciclagem, diferenciação e apoptose celular, e usa diferentes modos de ligação haste-alça de RNA para exercer a ativação ou repressão traducional. (Número de acesso principal ao UniProt: 013347).

Glutationa sintetase (GSHB de GSS).

[0325]GSHB é a segunda enzima na via de biossíntese de glutationa (GSH). Catalisa a condensação de gama-glutamilcisteína e glicina, para formar glutationa. Glutationa sintetase é também um potente antioxidante. É encontrada em um grande número de espécies incluindo bactérias, leveduras, mamíferos e plantas. Em humanos, os defeitos na GSS são herdados de uma maneira autossômica recessiva e são a causa de acidose metabólica grave, 5-oxoprolinúria, aumentado a taxa de hemólise, e função defeituosa do sistema nervoso central. Deficiências em GSS podem causar um espectro de sintomas deletérios igualmente em plantas e seres humanos. Em eucariotas, é uma enzima homodimérica. O domínio de ligação ao substrato tem uma estrutura alfa/beta/alfa de 3 camadas. Esta enzima utiliza e estabiliza um acilfosfato intermediário para posteriormente realizar um ataque nucleofílico favorável de glicina. (Número de acesso principal ao UniProt: P48637).

[0326]Molécula de adesão intercelular 1 (ICAM1).

[0327]As proteínas ICAM1 são ligantes para a proteína de adesão leucocitária LFA-1 (integrina alfa-L/beta-2). Durante a migração trans-endotelial de leucócitos, o envolvimento da ICAM1 promove a montagem de copos apicais endoteliais por meio da ativação de ARHGEF26/SGEF e RHOG. Atua como um receptor para proteínas do capsídeo do rinovírus A-B do grupo receptor principal. Atua como um receptor para proteínas do capsídeo do vírus Coxsackie A21. Após a infecção por herpesvírus/HHV- 8 associado ao sarcoma de Kaposi, é degradada pela ubiquitina ligase E3 viral MIR2, presumidamente para impedir a lise de células infectadas por linfócitos T citotóxicos e células NK. (Número de acesso principal ao UniProt: PO5362).

(HV323 ou IGHV3-23).

[0328]HV323 é a região V do domínio variável de cadeias pesadas de imunoglobulina que participa do reconhecimento de antígeno. As imunoglobulinas, também conhecidas como anticorpos, são glicoproteínas secretadas ou ligadas à membrana produzidas por linfócitos B. Na fase de reconhecimento da imunidade humoral, as imunoglobulinas ligadas à membrana servem como receptores que, após a ligação de um antígeno específico, desencadeiam a expansão e diferenciação clonal de linfócitos B em células plasmáticas secretoras de imunoglobulinas. As imunoglobulinas secretadas mediam a fase efetora da imunidade humoral, que resulta na eliminação dos antígenos ligados. O sítio de ligação ao antígeno é formado pelo domínio variável de uma cadeia pesada, junto com o de sua cadeia leve associada. Assim, cada imunoglobulina tem dois sítios de ligação ao antígeno com afinidade notável para um antígeno particular. Os domínios variáveis são organizados por um processo chamado reagrupamento V-(D).J e podem então ser submetidos a hipermutações somáticas que, depois da exposição ao antígeno e seleção, permitem a maturação de afinidade para um antígeno particular. (Número de acesso principal ao UniProt: PO1764).

[0329]Ribonucleoproteína nuclear heterogênea DO (HNRPD ou HNRNPD).

[0330]HNRPD se liga com alta afinidade a moléculas de RNA que contêm elementos ricos em AU (AREs) encontrados dentro do 3-UTR de muitos proto- oncogenes e mRNAs de citocinas. Também se liga a sequências de DNA de fita simples e dupla de uma maneira específica e funciona como um fator de transcrição. Cada um dos domínios de ligação ao RNA pode se ligar especificamente somente a uma sequência 5-UUAG-3' não monótona de fita simples e também de modo mais fraco à repetição de DNA telomérico 5-TTAGGG-3' de fita simples. Se liga a oligonucleotídeos de RNA com repetições 5-UUAGGG-3' mais fortemente que a repetições 5-TTAGGG-3' de DNA telomérico de fita simples. A ligação de RRM1 ao DNA inibe a formação de estrutura quadruplex de DNA que pode desempenhar um papel no alongamento de telômeros. Pode estar envolvida na rotatividade do MRNA translacionalmente acoplado. Está envolvida com outras proteínas de ligação ao RNA na deadenilação/tradução citoplasmática e declínido da interação de MRNA FOS mediada pelo principal domínio de instabilidade da região determinante de codificação (MCRD). Pode desempenhar um papel na regulação da expressão rítmica de genes do núcleo do relógio circadiano. Se liga diretamente a 3 UTR de CRY1 mRNA e induz a tradução rítmica de CRY 1. Também pode estar envolvida na regulação de tradução de PER2. (Número de acesso principal ao UniProt: 014103).

[0331]Kappa variável 1D-33 de imunoglobulina (KVD33 ou IGKV1D-33).

[0332]KVD33 é a região V do domínio variável de cadeias leves de imunoglobulina que participa do reconhecimento de antígeno. As imunoglobulinas, também conhecidas como anticorpos, são glicoproteínas secretadas ou ligadas à membrana produzidas por linfócitos B. Na fase de reconhecimento da imunidade humoral, as imunoglobulinas ligadas à membrana servem como receptores que, após a ligação de um antígeno específico, desencadeiam a expansão e diferenciação clonal de linfócitos B em células plasmáticas secretoras de imunoglobulinas. As imunoglobulinas secretadas mediam a fase efetora da imunidade humoral, que resulta na eliminação dos antígenos ligados. O sítio de ligação ao antígeno é formado pelo domínio variável de uma cadeia pesada, junto com o de sua cadeia leve associada. Assim, cada imunoglobulina tem dois sítios de ligação ao antígeno com afinidade notável para um antígeno particular. Os domínios variáveis são organizados por um processo chamado reagrupamento V-(D).J e podem então ser submetidos a hipermutações somáticas que, depois da exposição ao antígeno e seleção, permitem a maturação de afinidade para um antígeno particular. (Número de acesso principal ao UniProt: PO1593).

Fator de coagulação IX (FAS ou F9).

[0333]FA9 é um fator IX, é uma proteína plasmática dependente de vitamina K que participa da via intrínseca da coagulação do sangue, convertendo o fator X em sua forma ativa na presença de íons Ca?*, fosfolipídios e fator Villa. (Número de acesso principal ao UniProt: PO0O740).

[0334]Proteína 4 relacionada ao fator H do complemento (FHR4 ou CFHR4).

[0335]FHRA4 está envolvida na regulação do complemento. Pode se associar com lipoproteínas e pode desempenhar um papel no metabolismo lipídico. (Número de acesso principal ao UniProt: Q92496).

[0336]Proteína 1 contendo domínio FERM e PDZ (FRPD1 ou FRMPD1).

[0337]FRPD1 atua para estabilizar a GPSM1 ligada à membrana e, desse modo, promove sua interação com GNAI1. (Número de acesso principal ao UniProt: Q5SYB0).

[0338]Proteína de choque térmico HSP 90-beta (HS90B ou HSP90AB1).

[0339]HS90B é uma chaperona molecular que promove a maturação, manutenção estrutural e regulação apropriada de proteínas alvo específicas envolvidas, por exemplo, no controle do ciclo celular e transdução de sinal. Passa por um ciclo funcional que está ligado à sua atividade ATPase. Este ciclo provavelmente induz alterações conformacionais nas proteínas clientes, causando assim sua ativação. Interage dinamicamente com várias co-chaperonas que modulam seu reconhecimento de substrato, ciclo de ATPase e função da chaperona. Se envolve com uma variedade de classes de proteína cliente através de sua interação com várias proteínas ou complexos co-chaperonay que atuam como adaptadores, simultaneamente capazes de interagir com a cliente específica e a própria chaperona central. O recrutamento de ATP e co-chaperona seguido por proteína cliente forma uma chaperona funcional. Depois da conclusão do processo de chaperonização, proteína cliente devidamente dobrada e co-chaperona deixam a HSP90 em uma conformação parcialmente aberta ligada à ADP e, finalmente, a ADP é liberada da HSP90 que adquire uma conformação aberta para o próximo ciclo. Além de sua atividade de chaperona, também desempenha um papel na regulação do mecanismo de transcrição. A HSP90 e suas co-chaperonas modulam a transcrição pelo menos em três diferentes níveis. Em primeiro lugar, elas alteram os níveis de estado estacionário de certos fatores de transcrição em resposta a várias pistas fisiológicas. Segundo, elas modulam a atividade de certos modificadores epigenéticos, tal como histona deacetilase ou DNA metil transferases e, desse modo, respondem à mudança no ambiente. Terceiro, elas participam da expulsão de histonas da região promotora de certos genes e, desse modo, ativam a expressão gênica. Antagonizam a inibição mediada por STUB1 da sinalização TGF-beta por meio da inibição da ubiquitinação e degradação de SMAD3 mediada por STUB1. Promovem a diferenciação celular acompanhando BIRC2 e, desse modo, protegem da auto-ubiquitinação e degradação pelo mecanismo proteassomal. É a principal chaperona que está envolvida na fosforilação/ativação de STAT1 acompanhando JAK2 e PRKCE sob choque térmico e, por sua vez, ativa sua própria transcrição. (Número de acesso principal ao UniProt: PO8238).

Alfa-manosidase 2 (MA2A1 ou MANZA1).

[0340]MAZA1 catalisa a primeira etapa de comprometimento na biossíntese de N-glicanos complexos. Controla a conversão de manose alta em N-glicanos complexos; a etapa hidrolítica final na via de maturação de N-glicanos. (Número de acesso principal ao UniProt: 016706).

Prenilcisteína oxidase 1 (PCYOX ou POYOX1).

[0341]PCY OX está envolvida na degradação de proteínas preniladas. Cliva a ligação tioéter de prenil-L-cisteínas, tal como farnesilcisteína e geranilgeranilcisteína. (Número de acesso principal ao UniProt: Q9UHG3).

Purina nucleosídeo fosforilase (PNPH de PNP).

[0342]PNPH é uma purina nucleosídeo fosforilase que catalisa a quebra fosforolítica da ligação N-glicosídica nas moléculas de beta-(desóxi)ribonucleosídeo, com a formação das bases livres de purina e pentose-1-fosfato correspondentes. (Número de acesso principal ao UniProt: POO0491).

Proteína C dependente de vitamina K (PROC).

[0343]PROC é uma serina protease dependente de vitamina K que regula a coagulação do sangue pela inativação dos fatores Va e Villa na presença de (íons de cálcio e fosfolipídios. Exerce um efeito protetor na função de barreira celular endotelial. (Número de acesso principal ao UniProt: PO4070).

Proteína L3 ribossômica 60S (RL3 ou RPL3).

[0344]RL3 é um componente da grande subunidade de ribossomos citoplasmáticos. (Número de acesso principal ao UniProt: P39023).

Proteína 2 de matriz repetitiva serina/arginina (SRRM2).

[0345]SRRM]? está envolvida no splicing de pré-mRNA. Pode funcionar antes ou durante a primeira etapa catalítica de splicing no centro catalítico do spliceossoma. Isso pode ser feito estabilizando o centro catalítico ou a posição do substrato de RNA (Por similaridade). Se liga ao RNA. (Número de acesso principal ao UniProt: Q9UUQ35).

Cadeia beta-1 de tubulina (TBB1 ou TUBB1).

[0346]TBBI é uma subunidade de tubulina, que é o principal constituinte dos microtúbulos. Se liga a dois moIls de GTP, um em um sítio permutável na cadeia beta e outro em um sítio não permutável na cadeia alfa (Por similaridade). (Número de acesso principal ao UniProt: Q9H4B7).

Tenascina (TENA ou TNC).

[0347]TENA é uma proteína da matriz extracelular envolvida na orientação de neurônios em migração bem como axônios durante o desenvolvimento, plasticidade sináptica bem como regeneração neuronal. Promove o crescimento de neurite de neurônios corticais cultivados em uma monocamada de astrócitos. É um ligante para integrinas alfa-8/beta-1, alfa-9/beta-1, alfa-V/beta-3 e alfa-V/beta-6. Em tumores, estimula a angiogênese por alongamento, migração e crescimento de células endoteliais. (Número de acesso principal ao UniProt: P24821).

[0348]Proteína de 75 kDa de choque térmico mitocondrial (TRAP1).

[0349] TRAP1 é uma chaperona que expressa uma atividade ATPase. Está envolvida na manutenção da função e polarização mitocondrial, a jusante da PINK1 e do complexo mitocondrial |. É um regulador negativo da respiração mitocondrial capaz de modular o equilíbrio entre fosforilação oxidativa e glicólise aeróbica. O impacto da TRAP1 na respiração mitocondrial é provavelmente mediado pela modulação de SRC mitocondrial e inibição de SDHA. (Número de acesso principal ao UniProt: 012931).

[0350]Em algumas modalidades, um ou mais dos biomarcadores da TBI listados acima podem ser usados para determinar que um sujeito não sofreu uma TBI com base na detecção de um ou mais destes biomarcadores da TBI em uma amostra do sujeito (TBI rule-out). Estes biomarcadores da TBI podem incluir um ou mais de ACTBL, ALDH2, ANXA5, CAMP, CPNE3, CRAC1, CYTC, DNPEP, EIF3l, GSHB, ICAM1, HV323, HNRPD, KVD33, FA9, FHR4, FRPD1, HS90B, MAZA1, PCYOX, PNPH, PROC, RL3, SH3L3, SRRM2, TBB1, TENA, TRAP1 ou quaisquer combinações dos mesmos. A medição ou detecção de um ou mais destes biomarcadores da TBI em um sujeito pode ser suficiente para indicar que o sujeito não sofreu uma TBI, independente da necessidade de detectar, medir, comparar e/ou quantificar a quantidade, concentração e/ou nível de expressão de um ou mais biomarcadores da TBI em um sujeito controle. Embora um ou mais destes biomarcadores da TBI possam estar presentes em um sujeito que sofreu uma TBI, estão geralmente presentes em uma quantidade que não capaz de ser detectada através de meios convencionais, como aqui descritos. Assim, em alguns casos, a detecção de um ou mais destes biomarcadores da TBI em um sujeito indica que um sujeito não sofreu uma TBI. Os níveis destes biomarcadores da TBI podem ser detectados ou medidos isoladamente ou em combinação como parte de um painel ou assinatura de TBI leve.

7. Métodos para Medir o Nível de um Biomarcador da TBI

[0351]Nos métodos descritos acima, os níveis do biomarcador da TBI podem ser medidos por quaisquer meios, tais como métodos dependentes de anticorpo, tais como imunoensaios, imunoprecipitação de proteínas, imunoeletroforese, análise química, análise de SDS-PAGE e Western blot, imunocoloração de proteína, análise de eletroforese, um ensaio de proteína, um ensaio de ligação competitiva, um ensaio de proteína funcional ou métodos de cromatografia ou espectrometria, tais como cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), espectrometria de massa ou cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC/MS) ou eletroforese capilar (CE)- MS ou infusão direta, ou qualquer extremidade frontal de separação acoplada à MS. Também, o ensaio pode ser utilizado no formato de química clínica, tal como seria conhecido por um especialista na técnica.

[0352]Em algumas modalidades, medir o nível de um biomarcador da TBI inclui contatar a amostra com um primeiro membro de ligação específico e segundo membro de ligação específico. Em algumas modalidades, o primeiro membro de ligação específico é um anticorpo de captura e o segundo membro de ligação específico é um anticorpo de detecção. Em algumas modalidades, medir o nível de um biomarcador da TBI inclui contatar a amostra, simultaneamente ou sequencialmente, em qualquer ordem: (1) um anticorpo de captura (por exemplo, um biomarcador da TBl-anticorpo de captura), que se liga a um epítopo em um biomarcador da TBI ou um fragmento biomarcador da TBI para formar um complexo de anticorpo de captura-antígeno biomarcador da TBI (por exemplo, complexo de biomarcador da TBl-anticorpo de captura-antígeno biomarcador da TBI), e (2) uma anticorpo de detecção (por exemplo, biomarcador da TBl-anticorpo de detecção), que inclui um marcador detectável e se liga a um epítopo em um biomarcador da TBI que não está ligado pelo anticorpo de captura, para formar um complexo de antígeno biomarcador da TBl-anticorpo de detecção (por exemplo, complexo de antígeno biomarcador da TBIl-biomarcador da TBl-anticorpo de detecção), tal que um complexo de anticorpo de captura-antígeno biomarcador da TBl-anticorpo de detecção (por exemplo, complexo de biomarcador da TBl-anticorpo de captura-antígeno biomarcador da TBI-biomarcador da TBl-anticorpo de detecção) é formado, e medir a quantidade ou concentração de um biomarcador da TBI na amostra com base no sinal generado pelo marcador detectável no complexo de anticorpo de captura-antígeno biomarcador da TBl-anticorpo de detecção.

[0353]Em algumas modalidades, o primeiro membro de ligação específico é imobilizado em um suporte sólido. Em algumas modalidades, o segundo membro de ligação específico é imobilizado em um suporte sólido. Em algumas modalidades, o primeiro membro de ligação específico é um anticorpo biomarcador da TBI como descrito abaixo.

[0354]EmM algumas modalidades, a amostra é diluída ou não diluída. À amostra pode ser de cerca de 1 a cerca de 25 microlitros, cerca de 1 a cerca de 24 microlitros, cerca de 1 a cerca de 23 microlitros, cerca de 1 a cerca de 22 microlitros, cerca de 1 a cerca de 21 microlitros, cerca de 1 a cerca de 20 microlitros, cerca de 1 a cerca de 18 microlitros, cerca de 1 a cerca de 17 microlitros, cerca de 1 a cerca de 16 microlitros, cerca de 15 microlitros ou cerca de 1 microlitro, cerca de 2 microlitros, cerca de 3 microlitros, cerca de 4 microlitros, cerca de 5 microlitros, cerca de 6 microlitros, cerca de 7 microlitros, cerca de 8 microlitros, cerca de 9 microlitros, cerca de 10 microlitros, cerca de 11 microlitros, cerca de 12 microlitros, cerca de 13 microlitros, cerca de 14 microlitros, cerca de 15 microlitros, cerca de 16 microlitros, cerca de 17 microlitros, cerca de 18 microlitros, cerca de 19 microlitros, cerca de 20 microlitros, cerca de 21 microlitros, cerca de 22 microlitros, cerca de 23 microlitros, cerca de 24 microlitros ou cerca de 25 microlitros. Em algumas modalidades, a amostra é de cerca de 1 a cerca de 150 microlitros ou menos ou de cerca de 1 a cerca de 25 microlitros ou menos.

[0355]Alguns instrumentos (tais como, por exemplo os instrumentos ARCHITECTº dos Abbott Laboratories, instrumentos Abbott Alinity, e outros instrumentos principais de laboratório) exceto um dispositivo de ponto de atendimento pode ser capaz de medr níveis de um biomarcador da TBI| em uma amostra a cerca de 0,032 ug/L a CV 10 % ou mais baixo. Outros métodos de detecção incluem o uso de ou podem ser adaptados para o uso em um dispositivo de nanoporo ou dispositivo de nanopoço. Exemplos de dispositivos de nanoporo são descritos na Publicação de Patente Internacional Nº WO 2016/161402, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Exemplos de dispositivo de nanopoço são descritos na Publicação de Patente Internacional Nº WO 2016/161400, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

a. Detecção por Espectrometria de Massa

[0356]Como aqui usado, os “dados de MS" geralmente se referem a dados de MS brutos obtidos a partir de um espectrômetro de massa e/ou dados de MS processados em que peptídeos e seus fragmentos (por exemplo, transições e picos de MS) são identificados, analisados e/ou quantificados. Em algumas das modalidades da presente divulgação, os métodos com base em MRM-MS ou SRM- MS e/ou PRM-MS levam em consideração a detecção e quantificação exata de peptídeos específicos em misturas complexas. SRM/MRM-MS é uma tecnologia com o potencial para quantificação confiável e abrangente de substâncias de baixa abundância em amostras complexas. SRM/MRM-MS é realizada em instrumentos do tipo triplo quadrupolo, em que a seletividade aumentada é obtida através da dissociação induzida por colisão. É uma técnica de espectrometria de massa sem varredura, onde dois analisadores de massa (Q1 e Q3) são usados como filtros de massa estáticos, para monitorar um fragmento particular de um precursor selecionado. Em instrumentos de triplo quadrapolo, vários métodos de ionização podem ser usados, incluindo sem limitação, ionização por electrospray, ionização química, ionização eletrônica, ionização química por pressão atmosférica e ionização por dessorção a laser assistida por matriz. Tanto o primeiro analisador de massa quanto a célula de colisão são continuamente expostos a íons a partr da fonte em uma maneira dependente de tempo. Uma vez que os íons se movem no terceiro analisador de massa, a dependência de tempo se torna um fator. Em instrumentos de triplo quadrupolo, o primeiro filtro de massa quadrapolo, Q1, é o seletor de m/z primário depois que a amostra sai da fonte de ionização. Quaisquer íons com razões de massa para carga diferentes da selecionada não poderão se infiltrar em Q1. A célula de colisão, denotada como “q2”, localizada entre o primeiro filtro de massa quadrapolo Q1 e segundo filtro de massa quadrapolo Q3, é onde a fragmentação da amostra ocorre na presença de um gás inerte do tipo argônio, hélio ou nitrogênio. Ao sair da célula de colisão, os íons fragmentados viajam para o segundo filtro de massa quadrapolo Q3, onde a seleção de m/z pode ocorrer novamente.

[0357]O específico par de valores de sobrecarga de massa (m/z) associados aos íons de precursor e fragmento selecionados é referido como uma “transição”. O detector atua como um dispositivo de contagem para os íons correspondentes à transição selecionada retornando assim uma distribuição de intensidade com o passar do tempo. MRM-MS é quando múltiplas transições de SRM-MS são medidas dentro do mesmo experimento na escala de tempo cromatográfica alterando-se rapidamente entre os diferentes pares de precursor/fragmento. Tipicamente, o instrumento triplo quadrupolo percorre uma série de transições e registra o sinal de cada transição como uma função do tempo de eluição. O método permite seletividade adicional monitorando-se a co-eluição cromatográfica de múltiplas transições para um determinado analito.

[0358]Para referências gerais sobre a espectrometria de massa e proteómica, ver, por exemplo, Salvatore Sechi, Salvatore Sechi, Quantitative Proteomics by Mass Spectrometry (Methods in Molecular Biology) 2º ed. Edição de 2016, Humana Press (Nova lorque, NY, 2009); Daniel Martins-de-Souza, Shotgun Proteomics: Methods and Protocols edição de 2014, Humana Press (Nova lorque, NY, 2014); Jôrg Reinders e Albert Sickmann, Proteomics: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) edição de 2009, Humana Press (Nova lorque, NY, 2009); e Jórg Reinders, Proteomics in Systems Biology: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) 1º ed. edição de 2016, Humana Press (Nova lorque, NY, 2009).

[0359]Além disso a PRM-MS é também uma aplicação de SRM com detecção em paralelo de todas as transições em uma única análise utilizando um espectrómetro de massa de alta resolução. O PRM-MS fornece alta seletividade, alta sensibilidade e alto rendimento para quantificar o peptídeo selecionado (Q1), portanto quantifica as proteínas (MS1) “Novamente, vários peptídeos podem ser selecionados especificamente para cada proteína. A metodologia PRM-MS usa o quadrupolo de um espectrômetro de massa para isolar um íon precursor alvo, fragmenta o íon precursor alvo na célula de colisão e, em seguida, detecta os íons do produto resultantes no analisador de massa Orbitrap. A quantificação é realizada após a aquisição dos dados, extraindo-se um ou mais íons fragmentos com janelas de massa de 5 a 10 ppm. O PRM-MS usa um espectrômetro de massa quadrupolo no tempo de voo (QTOF) ou híbrido quadrupolo-orbitrap (QOrbitrap) para realizar a quantificação de peptídeos/proteínas. Exemplos de QTOF incluem, entre outros: Sistema TripleTOF 6600 ou 5600 (Sciex); Sistema X500R QTOF (Sciex); Tempo de voo em quadrupolo de massa exata da série 6500 (Q-TOF) (Agilent); ou espectrometria de massa em tempo de voo quadrupolo Xevo G2-XS QTof (Waters). Exemplos de QObitrap incluem, mas não se limitam a: Espectrômetro de Massa Híbrido Exativo Quadrupolo-Orbitrap Q (Thermo Scientific); ou Orbitrap Fusion Tribrid (Thermo Scientific).

[0360]Em algumas modalidades, os métodos desenvolvidos neste documento podem ser aplicados à quantificação de polipeptídeos ou proteínas em amostras biológicas. Qualquer tipo de amostras biológicas compreendendo polipeptídeos ou proteínas pode ser o ponto de partida e ser analisado pelos métodos aqui divulgados. De fato, qualquer amostra contendo proteína/peptídeo pode ser usada e analisada pelos métodos aqui produzidos (por exemplo, tecidos e células). Os métodos aqui também podem ser utilizados com misturas peptídicas obtidas por digestão. À digestão de um polipeptídeo ou proteína inclui qualquer tipo de estratégias de clivagem, tais como enzimáticas, químicas, físicas ou combinações das mesmas. De acordo com algumas modalidades, os seguintes parâmetros dos métodos aqui fornecidos são determinados: digestão com tripsina (ou outra protease) e limpeza de peptídeos, polipeptídeos com melhor resposta, proteínas com melhor resposta, peptídeos com melhor resposta, fragmentos com melhor resposta, taxas de intensidade de fragmentos (aumento elevado e pico reproduzível de intensidades), energias de colisão ideais e todos os parâmetros ideais para maximizar a sensibilidade e/ou especificidade dos métodos.

[0361]Em outras modalidades, é desejável a quantificação dos polipeptídeos e/ou das proteínas correspondentes ou a atividade/regulação das proteínas correspondentes. Um peptídeo selecionado é marcado com um isótopo estável e usado como padrão interno (SIL) para alcançar a quantificação absoluta de uma proteína de interesse. A adição de um peptídico quantificado de marcador estável análogo da etiqueta à amostra de peptídeo em quantidade conhecida; e, subsequentemente, a etiqueta e o peptídeo de interesse são quantificados por espectrometria de massa e a quantificação absoluta dos níveis endógenos das proteínas é obtida.

[0362]Em algumas modalidades, os biomarcadores da presente divulgação podem ser detectados por espectrometria de massa, um método que emprega um espectrômetro de massa para detectar íons de fase gasosa, como descrito acima. Exemplos de espectrômetros de massa são tempo de voo, setor magnético, filtro quadrupolo, armadilha de íons, ressonância de íon ciclotrão, analisador de setor eletrostático, híbridos ou combinações dos anteriores e semelhantes. Em uma modalidade, o método espectrométrico de massa compreende o tempo de voo de dessorção/ionização por laser assistido por matriz (MALDI-TOF MS ou MALDI-TOF). Em outra modalidade, o método compreende espectrometria de massa em tandem MALDI-TOF (MALDI-TOF MS/MS). Em ainda outra modalidade, a espectrometria de massa pode ser combinada com outro(s) método(s) apropriado(s), como pode ser contemplada por um especialista na técnica. Por exemplo, o MALDI-TOF pode ser utilizado com digestão com tripsina e espectrometria de massa em tandem, conforme descrito aqui ou com enriquecimento. Em outra modalidade, a técnica espectrométrica de massa é o monitoramento de reação múltipla (MRM) ou MRM quantitativo.

[0363]EmM algumas modalidades, o método de espectrometria de massa envolve o primeiro enriquecimento capturando-se um ou mais biomarcadores em uma resina cromatográfica com propriedades cromatográficas que se ligam aos biomarcadores. Por exemplo, pode-se capturar os biomarcadores em uma resina de troca catiônica, como a resina CM Ceramic HyperD F, lavar a resina, eluir os biomarcadores e detectar por MALDI. Alternativamente, este método pode ser precedido fracionando-se a amostra em uma resina de troca aniônica antes da aplicação na resina de troca catiônica. Em uma modalidade, pode-se fracionar uma resina de troca aniônica e detectar diretamente pela MALDI. Em outra modalidade, pode-se capturar os biomarcadores em uma resina imuno-cromatográfica que compreende anticorpos que se ligam aos biomarcadores, lavar a resina para remover material não ligado, eluir os biomarcadores da resina e detectar os biomarcadores eluídos pelo MALDI ou em outro instrumento de MS (usando qualquer método para quantificação).

[0364]Os biomarcadores da presente divulgação também podem ser detectados por outros métodos adequados. Os paradigmas de detecção que podem ser empregados para este fim incluem métodos ópticos, métodos eletroquímicos (técnicas de voltametria e amperometria), microscopia de força atômica e métodos de radiofrequência, por exemplo, espectroscopia de ressonância multipolar. Ilustrativos dos métodos ópticos, além da microscopia, tanto confocais quanto não confocais, são a detecção de fluorescência, luminescência, quimioluminescência, absorvância, refletância, transmitância e birrefringência ou índice de refração (por exemplo, ressonância plasmônica de superfície, elipsometria, método de espelho ressonante), um método de guia de ondas do acoplador de grade ou interferometria) ou por espectrometria de massa usando qualquer instrumento de MS e qualquer método de MS.

8. Anticorpos Reconhecedores de Biomarcadores da TBI

[0365]Os métodos descritos neste documento podem usar um anticorpo isolado que se liga especificamente a um biomarcador da TBI ou a seus fragmentos, referido como “anticorpo biomarcador da TBI”. Os anticorpos biomarcadores da TBI podem ser usados para avaliar o estato de um biomarcador da TBI como uma medida de lesão cerebral traumática, detectar a presença de um biomarcador da TBI em uma amostra biológica, quantificar a quantidade de um biomarcador da TBI presente em uma amostra biológica ou detectar a presença e quantificação da quantidade de um biomarcador da TBI em uma amostra biológica.

[0366]Os anticorpos biomarcadores da TB! incluem qualquer anticorpo que se ligue a um biomarcador da TBI, um fragmento do mesmo, um epítopo de um biomarcador da TBI ou uma variante do mesmo. O anticorpo pode ser um fragmento do anticorpo anti-biomarcador da TBI ou uma variante ou um derivado do mesmo. O anticorpo pode ser um anticorpo policlonal ou monoclonal. O anticorpo pode ser um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia única, um anticorpo amadurecido por afinidade, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo totalmente humano ou um fragmento de anticorpo, como um fragmento Fab, ou uma mistura dos mesmos. Os fragmentos ou derivados de anticorpos podem compreender fragmentos F(ab')s, Fv ou scFv. Os derivados de anticorpos podem ser produzidos por peptidomiméticos. Além disso, as técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia única.

[0367]Os anticorpos anti-biomarcador da TBI podem ser um anticorpo quimérico anti-biomarcador da TBI ou um anticorpo humanizado anti-biomarcador da TBI. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado e o anticorpo quimérico são monovalentes. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado e o anticorpo quimérico compreendem uma única região Fab ligada a uma região Fc.

[0368]Os anticorpos humanos podem ser derivados a partir de tecnologia de fagos ou a partir de camundongos transgênicos que expressam genes da imunoglobulina humana. O anticorpo humano pode ser gerado como resultado de uma resposta imune humana in vivo e isolado. Ver, por exemplo, Funaro et al, BMC Biotechnology, 2008(8): 85. Portanto, o anticorpo pode ser um produto do repertório humano e não animal. Por ser de origem humana, os riscos de reatividade contra auto- antígenos podem ser minimizados. Alternativamente, as bibliotecas de exibição de leveduras padrão e as tecnologias de exibição podem ser usadas para selecionar e isolar anticorpos anti-biomarcadores da TBI humanos. Por exemplo, bibliotecas de fragmentos variáveis de cadeia única humana ingênua (scFv) podem ser usadas para selecionar anticorpos | anti-biomarcador da TBI humanos. Animais transgênicos podem ser usados para expressar anticorpos humanos.

[0369]Os anticorpos humanizados podem ser moléculas de anticorpo a partir de espécies de anticorpo não humano que se liga ao antígeno desejado possuindo uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) das espécies não humanas e regiões de estrutura de uma molécula de imunoglobulina humana.

[0370]O anticorpo é distinguível de anticorpos conhecidos na medida em que possui a(s) função(ões) biológica(s) diferente(s) do que os que são conhecidos na técnica.

[0371]O anticorpo pode se ligar imunoespecificamente ao peptídeo de um biomarcador da TBI, um fragmento do mesmo ou uma variante do mesmo. O anticorpo pode reconhecer e ligar imunoespecificamente pelo menos três aminoácidos, pelo menos quatro aminoácidos, pelo menos cinco aminoácidos, pelo menos seis aminoácidos, pelo menos sete aminoácidos, pelo menos oito aminoácidos, pelo menos nove aminoácidos ou pelo menos dez aminoácidos dentro de uma região de epítopo. O anticorpo pode reconhecer e se ligar imunoespecificamente a um epítopo que possui pelo menos três aminoácidos contíguos, pelo menos quatro aminoácidos contíguos, pelo menos cinco aminoácidos contíguos, pelo menos seis aminoácidos contíguos, pelo menos sete aminoácidos contíguos, pelo menos oito aminoácidos contíguos, pelo menos nove aminoácidos contíguos ou pelo menos dez aminoácidos contíguos de uma região epitópica.

9. Preparação/Produção de Anticorpo

[0372]Os anticorpos podem ser preparados por qualquer de uma variedade de técnicas, incluindo os que são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Em geral, os anticorpos podem ser produzidos por técnicas de cultura de células, incluindo a geração de anticorpos monoclonais por meio de técnicas convencionais ou por transfecção de genes de anticorpos, cadeias pesadas e/ou cadeias leves em hospedeiros celulares bacterianos ou mamíferos adequados, a fim de permitir a produção de anticorpos, em que os anticorpos podem ser recombinantes. As várias formas do termo “transfecção” destinam-se a abranger uma ampla variedade de técnicas comumente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção com DEAE-dextrano e semelhantes. Embora seja possível expressar os anticorpos em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, é preferível a expressão de anticorpos em células eucarióticas, e mais preferível em células hospedeiras de mamíferos, porque estas células eucarióticas (e, em particular, células de mamíferos) são mais prováveis que as células procarióticas montar e secretar um anticorpo adequadamente dobrado e imunologicamente ativo.

[0373]As células hospedeiras de mamíferos exemplares para expressar os anticorpos recombinantes incluem ovário de hamster chinês (células de CHO) (incluindo células de dhfr-CHO, descritas em Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 77: 4216-4220 (1980)), usadas com um marcador selecionável de DHFR, por exemplo, como descrito em Kaufman e Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601-621 (1982), células de mieloma NSO, células COS e células SP2. Quando os vetores de expressão recombinantes que codificam genes de anticorpos são introduzidos nas células hospedeiras de mamíferos, os anticorpos são produzidos cultivando-se as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferencialmente, a secreção do anticorpo no meio de cultura em que as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura usando métodos padrão de purificação de proteínas.

[0374]As células hospedeiras também podem ser utilizadas para produzir fragmentos de anticorpos funcionais, tais como fragmentos Fab ou moléculas scFv. Será entendido que variações no procedimento acima podem ser realizadas. Por exemplo, pode ser desejável transfectar uma célula hospedeira com DNA que codifica fragmentos funcionais da cadeia leve e/ou da cadeia pesada de um anticorpo. À tecnologia de DNA recombinante também pode ser usada para remover parte ou todo o DNA que codifica uma ou ambas as cadeias leve e pesada que não são necessárias para a ligação aos antígenos de interesse. As moléculas expressas a partir de tais moléculas de DNA truncadas também são englobadas pelos anticorpos. Além disso, podem ser produzidos anticorpos bifuncionais nos quais uma cadeia pesada e uma cadeia leve são um anticorpo (isto é, liga a troponina humana |) e a outra cadeia pesada e leve é específica para um antígeno que não seja um biomarcador da TBI humano, reticulando um anticorpo a um segundo anticorpo por métodos químicos de reticulação padrão.

[0375]Em um sistema preferido para expressão recombinante de um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, um vetor de expressão recombinante que codifica a cadeia pesada do anticorpo e a cadeia leve do anticorpo é introduzido nas células de dhfr-CHO por transfecção mediada por fosfato de cálcio. Dentro do vetor de expressão recombinante, os genes das cadeias pesada e leve do anticorpo estão operacionalmente ligados aos elementos reguladores do potenciador de CMV/promotor de AdMLP para conduzir altos níveis de transcrição dos genes. O vetor de expressão recombinante também carrega um gene DHFR, que permite a seleção de células de CHO que foram transfectadas com o vetor usando seleção/amplificação de metotrexato. As células hospedeiras transformantes selecionadas são cultivadas para permitir a expressão das cadeias pesada e leve do anticorpo e o anticorpo intacto é recuperado do meio de cultura. Técnicas de biologia molecular padrão são usadas para preparar o vetor de expressão recombinante, transfectar as células hospedeiras, selecionar transformantes, cultivar as células hospedeiras e recuperar o anticorpo do meio de cultura. Ainda mais, o método de sintetizar um anticorpo recombinante pode ser através da cultura de uma célula hospedeira em um meio de cultura adequado até que um anticorpo recombinante seja sintetizado. O método pode ainda compreender isolar o anticorpo recombinante do meio de cultura.

[0376]Os métodos de preparação de anticorpos monoclonais envolvem a preparação de linhagens celulares imortais capazes de produzir anticorpos com a especificidade desejada. Tais linhagens celulares podem ser produzidas a partir de células do baço obtidas de um animal imunizado. O animal pode ser imunizado com um biomarcador da TBI ou um fragmento e/ou variante do mesmo. O peptídeo utilizado para imunizar o animal pode compreender aminoácidos que codificam Fc humano, por exemplo a região cristalizável do fragmento ou a região da cauda do anticorpo humano. As células do baço podem então ser imortalizadas por, por exemplo, fusão com um parceiro de fusão celular de mieloma. Uma variedade de técnicas de fusão pode ser empregada. Por exemplo, as células do baço e as células do mieloma podem ser combinadas com um detergente não iônico por alguns minutos e depois plaqueadas em baixa densidade em um meio seletivo que suporta o crescimento de células híbridas, mas não as células do mieloma. Uma destas técnicas usa a seleção de hipoxantina, aminopterina, timidina (HAT). Outra técnica inclui eletrofusão. Após um tempo suficiente, geralmente cerca de 1 a 2 semanas, são observadas colônias de híbridos. Colônias únicas são selecionadas e seus sobrenadantes da cultura são testados quanto à atividade de ligação contra o polipeptídeo. Hibridomas com alta reatividade e especificidade podem ser utilizados.

[0377]Os anticorpos monoclonais podem ser isolados dos sobrenadantes de colónias de hibridoma em crescimento. Além disso, várias técnicas podem ser empregues para aumentar o rendimento, como injeção da linha celular de hibridoma na cavidade peritoneal de um hospedeiro vertebrado adequado, como um camundongo. Os anticorpos monoclonais podem então ser colhidos do líquido da ascite ou do sangue. Os contaminantes podem ser removidos dos anticorpos por técnicas convencionais, como cromatografia, filtração em gel, precipitação e extração. A cromatografia de afinidade é um exemplo de um método que pode ser usado em um processo para purificar os anticorpos.

[0378]A enzima proteolítica papaína cliva preferencialmente moléculas de IgG para produzir vários fragmentos, dois dos quais (os fragmentos F(ab)) compreendem um heterodímero covalente que inclui um sítio de ligação ao antígeno intacto. À enzima pepsina é capaz de clivar moléculas de IgG para fornecer vários fragmentos, incluindo o fragmento F(ab')2a, que compreende os dois sítios de ligação ao antígeno.

[0379]O fragmento Fv pode ser produzido por clivagem proteolítica preferencial de uma IgM, e em casos raros de moléculas de imunoglobulina IgG ou IgA. O fragmento Fv pode ser derivado usando técnicas recombinantes. O fragmento Fv inclui um heterodímero VH::VL não covalente, incluindo um sítio de ligação ao antígeno que retém grande parte das capacidades de reconhecimento e ligação ao antígeno da molécula de anticorpo nativo.

[0380]O anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado pode compreender um conjunto de regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada e cadeia leve (“CDR”), respectivamente interpostas entre um conjunto de cadeia pesada e uma estrutura de cadeia leve (“FR”) que fornece suporte às CDRs e defina a relação espacial das CDRs uma em relação à outra. O conjunto de CDR pode conter três regiões hipervariáveis de uma região V de cadeia pesada ou leve.

[0381]Outros métodos adequados de produção ou isolamento de anticorpos com a especificidade necessária podem ser utilizados, incluindo, mas não se limitando a, métodos que selecionam anticorpo recombinante de uma biblioteca de peptídeos ou proteínas (por exemplo, mas não se limitando a, um bacteriófago, ribossomo, oligonucleotídeo, RNA, cDNA, levedura ou semelhantes, biblioteca de exibição); por exemplo, conforme disponível em vários fornecedores comerciais, como Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, Reino Unido), MorphoSys (Martinsreid/Planegg, Del.), Biovation (Aberdeen, Escócia, Reino Unido) Biolnvent (Lund, Suécia), usando métodos conhecidos na técnica. Ver Patentes US Nº

4.704.692; 5.723.323; 5.763.192; 5.814.476; 5.817.483; 5.824.514; 5.976.862.

Métodos alternativos dependem da imunização de animais transgênicos (por exemplo, camundongos SCID, Nguyen et al. (1997) Microbiol. Immunol. 41: 901-907; Sandhu et al. (1996) Crit. Rev. Biotechnol. 16: 95-118; Eren et al. (1998) Immunol. 93: 154- 161) que são capazes de produzir um repertório de anticorpos humanos, como é conhecido na técnica e/ou como aqui descrito. Tais técnicas incluem, mas não se limitam a, exibição de ribossomos (Hanes et a/. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 94: 4937 a 4942; Hanes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 95: 14130 a 14135); tecnologias de produção de anticorpos de célula única (por exemplo, método de anticorpo para linfócito selecionado (“SLAM”) (Patente US Nº 5.627.052, Wen et al. (1987) J. Immunol. 17: 887 a 892; Babcook et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 93: 7843 a 7848); micropartículas em gel e citometria de fluxo (Powell et a/. (1990) Biotechnol. 8: 333 a 337; Sistemas de Célula Única, (Cambridge, Mass); Gray et al. (1995) J. Imm. Meth. 182: 155 a 163; Kenny et a/. (1995) Bio/Technol. 13: 787 a 790); seleção de células B (Steenbakkers et al. (1994) Molec. Biol. Reports 19: 125 a 134 (1994)).

[0382]Um anticorpo amadurecido por afinidade pode ser produzido por qualquer um de vários procedimentos conhecidos na técnica. Por exemplo, ver Marks et al., BioTechnology, 10: 779 a 783 (1992) descreve maturação por afinidade por embaralhamento de domínios VH e VL. A mutagênese aleatória de resíduos de CDR e/ou estrutura é descrita por Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. EUA, 91: 3809 a 3813 (1994); Schier et a/., Gene, 169: 147 a 155 (1995); Yelton et al., J. Immunol., 155: 1994 a 2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154(7): 3310 a 3319 (1995); Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889 a 896 (1992). A mutação seletiva em posições de mutagênese seletiva e em posições de contato ou hipermutação com um resíduo de aminoácido que aumenta a atividade é descrita na Patente US Nº 6.914.128 B1.

[0383]As variantes de anticorpo também podem ser preparadas utilizando a liberação de um polinucleotídeo que codifica um anticorpo para um hospedeiro adequado, como o fornecimento de animais ou mamíferos transgênicos, como cabras, vacas, cavalos, ovelhas e semelhantes, que produzem estes anticorpos em seu leite. Estes métodos são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, nas patentes US Nº 5.827.690; 5.849.992; 4.873.316; 5.849.992; 5.994.616; 5.565.362; e

5.304.489.

[0384]As variantes de anticorpos também podem ser preparadas liberando-se um polinucleotídeo para fornecer plantas transgênicas e células vegetais cultivadas (por exemplo, mas não limitadas a tabaco, milho e lentilha) que produzem estes anticorpos, porções ou variantes especificadas nas partes da planta ou em células cultivadas a partir delas. Por exemplo, Cramer et al. (1999) Curr. Topo. Microbiol. Immunol. 240: 95 a 118 e referências aqui citadas, descrevem a produção de folhas de tabaco transgênicas expressando grandes quantidades de proteinas recombinantes, por exemplo, usando um promotor induzível. O milho transgênico tem sido utilizado para expressar proteínas de mamíferos em níveis de produção comercial, com atividades biológicas equivalentes às produzidas em outros sistemas recombinantes ou purificadas de fontes naturais. Ver, por exemplo, Hood et a/l., Adv. Exp. Med. Biol. (1999) 464: 127 a 147 e referências aí citadas. As variantes de anticorpos também foram produzidas em grandes quantidades a partir de sementes de plantas transgênicas, incluindo fragmentos de anticorpos, como anticorpos de cadeia única (scFv's), incluindo sementes de tabaco e tubérculos de batata. Veja, por exemplo, Conrad et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38: 101 a 109 e referência aí citada. Assim, os anticorpos também podem ser produzidos usando plantas transgênicas, de acordo com métodos conhecidos.

[0385]Os derivados de anticorpos podem ser produzidos, por exemplo, adicionando sequências exógenas para modificar a imunogenicidade ou reduzir, aprimorar ou modificar a ligação, afinidade, taxa de associação, taxa de dissociação, avidez, especificidade, meia-vida ou qualquer outra característica adequada.

Geralmente, parte ou todas as sequências de CDR não humanas ou humanas são mantidas enquanto as sequências não humanas das regiões variável e constante são substituídas por aminoácidos humanos ou outros.

[0386]Pequenos fragmentos de anticorpo podem ser diabéticos com dois sítios de ligação ao antígeno, em que os fragmentos compreendem um domínio variável da cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável da cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH VL). Ver, por exemplo, EP 404.097; WO 93/11161; e Hollinger et a/., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90: 6444 a 6448. Ao usar um vinculador muito curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação ao antígeno. Ver também Patente US Nº

6.632.926 de Chen et al. que é aqui incorporada por referência na sua totalidade e divulga variantes de anticorpos que têm um ou mais aminoácidos inseridos em uma região hipervariável do anticorpo parental e uma afinidade de ligação a um antígeno alvo que é pelo menos cerca de duas vezes mais forte que a afinidade de ligação do anticorpo parental para o antígeno.

[0387]O anticorpo pode ser um anticorpo linear. O procedimento para produzir um anticorpo linear é conhecido na técnica e descrito em Zapata et a/., (1995) Protein Eng. 8 (10): 1057 a 1062. Resumidamente, estes anticorpos compreendem um par de segmentos Fd em tandem (VH-CH1-VH-CH1) que formam um par de regiões de ligação ao antígeno. Os anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespeciíficos.

[0388]Os anticorpos podem ser recuperados e purificados de culturas de células recombinantes por métodos conhecidos, incluindo, entre outros, purificação de proteína A, precipitação de sulfato de amônio ou etanol, extração ácida, cromatografia de troca aniônica ou catiônica, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxilapatita e cromatografia de lectina. A cromatografia líquida de alta eficiência (“HPLC”) também pode ser usada para purificação.

[0389]Pode ser útil marcar de forma detectável o anticorpo. Os métodos para conjugar anticorpos a estes agentes são conhecidos na técnica. Apenas para fins ilustrativos, os anticorpos podem ser marcados com uma porção detectável, como um átomo radioativo, um cromóforo, um fluoróforo ou semelhante. Tais anticorpos marcados podem ser utilizados para técnicas de diagnóstico, in vivo ou em uma amostra de teste isolada. Eles podem ser ligados a uma citocina, a um ligante, a outro anticorpo. Agentes adequados para acoplamento a anticorpos para obter um efeito antitumoral incluem citocinas, como interleucina 2 (IL-2) e Fator de Necrose Tumoral (TNF); fotossensibilizadores, para uso em terapia fotodinâmica, incluindo tetrassulfonato de ftalocianina de alumínio (Ill), hematoporfirina e ftalocianina; radionuclídeos, como iodo-131 (1311), ítrio-90 (90Y), bismuto-212 (212Bi), bismuto- 213 (213Bi), tecnécio-29m (99mTc), rênio-186 (186Re) e rênio-188 (188Re); antibióticos, tais como doxorrubicina, adriamicina, daunorrubicina, metotrexato, daunomicina, neocarzinostatina e carboplatina; toxinas bacterianas, vegetais e outras, como toxina da difteria, pseudomonas exotoxina A, enterotoxina estafilocócica A, toxina abrin-A, ricina A (ricina desglicosilada A e ricina nativa A), toxina TGF-alfa, citotoxina da cobra chinesa (naja naja atra) e gelonina (uma toxina vegetal); proteínas inativadoras de ribossoma de plantas, bactérias e fungos, tais como restrictocina (uma proteína inativadora de ribossoma produzida por Aspergillus restrictus), saporina (uma proteína inativadora de ribossoma de Saponaria officinalis), e RNase; inibidores de tirosina quinase; ly207702 (um nucleosídeo de purina difluorado); lipossomas contendo agentes anti-císticos (por exemplo, oligonucleotídeos antisense, plasmídeos que codificam toxinas, metotrexato, etc.); e outros anticorpos ou fragmentos de anticorpo, como F(ab).

[0390]A produção de anticorpos através do uso da tecnologia de hibridoma, o método selecionado de anticorpo para linfócitos (SLAM), animais transgênicos e bibliotecas de anticorpos recombinantes é descrita em mais detalhes abaixo.

10. Aptâmeros de Reconhecimento de Biomarcadores da TBI

[0391]Os métodos da presente divulgação incluem o uso de aptâmeros para detectar ou identificar um ou mais biomarcadores da TBIl. Os aptâmeros são adequados para uso no desenvolvimento de sondas com alta afinidade e seletividade para moléculas alvo, como biomarcadores peptídicos da TBI. Os aptâmeros incluem DNA de fita simples (ssDNA), RNA ou ácidos nucleicos modificados, que têm a capacidade de se ligar especificamente a seus alvos, que variam de pequenas moléculas orgânicas a proteínas e peptídeos. A base para o reconhecimento do alvo são as estruturas terciárias formadas pelos oligonucleotídeos de fita simples, como conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, os aptâmeros usados para detectar ou identificar um ou mais biomarcadores da TBI podem ser obtidos por meio de um processo de seleção in vitro conhecido como SELEX, no qual os aptâmeros são selecionados de uma biblioteca de sequências aleatórias de DNA ou RNA sintético por ligação repetida dos oligonucleotídeos para atingir moléculas.

[0392]Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos que constituem uma mistura de bibliotecas de aptâmeros utilizados para a triagem de agentes candidatos de captura de biomarcadores da TBI podem ser DNA ou RNA de fita simples com ou sem modificações químicas. A introdução de entidades químicas adicionais no DNA durante o processo de seleção pode incluir, por exemplo, o uso de uma nucleobase modificada com 5-alcino (por exemplo, timina). Além disso, nucleotídeo-trifosfatos modificados com 5-C8-alcino, por exemplo desoxitimidinas, estão disponíveis comercialmente ou podem ser sintetizados. Tais nucleobases modificadas em 5-C8- alcino podem ser introduzidas no DNA por PCR. Tais modificações podem ainda ser derivadas com a chamada química bio-ortogonal, por exemplo, usando a cicloadição 1,3-dipolar catalisada por Cu(l) das respectivas azidas com o alcino. Além da cicloadição de azida-alcino catalisada por Cu(l) (CUAAC), também são úteis as reações de cicloadição de azida-alcino promovida por cepa sem cobre (SPAAC). Em algumas modalidades envolvendo sistemas celulares ou vivos, a cicloadição azida- alcino promovida por deformação pode superar problemas de toxicidade associados ao uso de Cu(l). Qualquer número de modificações químicas desejáveis pode ser adicionado à biblioteca de oligonucleotídeos usada para fins de triagem. Exemplos de tais modificações incluem, sem limitação, resíduos alifáticos-aromáticos, carregados, básicos, ácidos, heteroaromáticos, de tipo açucarado, contendo metais ou peptídeos.

[0393]Em algumas modalidades, uma nucleobase que deve ser modificada para conter um grupo químico azida-alcido pode incluir um nucleotídeo etinil-, propinil- ou butinil- dU, dA, dC ou dG. Em outras modalidades, uma nucleobase que deve ser modificada para conter um grupo químico azida-alcido pode ser um nucleotídeo etinil- dU ou um nucleotídeo etinil-dA, um nucleotídeo etinil-dC ou um nucleotídeo etinil-dG. As bibliotecas de aptâmeros nucleotídicos com estas modificações de exemplo podem ser usadas em vários métodos de seleção baseados em SELEX, a fim de aumentar a diversidade química das bibliotecas de aptâmeros de DNA. A mistura inicial ou candidata de ácidos nucleicos pode ser modificada de modo que pelo menos 25 %, %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % dos membros da mistura são modificados para compreendem a funcionalidade introduzida pela química de cliques, por exemplo. Uma modificação menor que 100 % pode permitir uma diversidade aprimorada ao permitir que certas posições de um oligonucleotídeo sejam modificadas, mas não outras, enquanto que a modificação de 100 % garante consistência durante o processo de seleção. Em algumas modalidades, diferentes modificações são feitas em diferentes posições no oligonucleotídeo para aumentar ainda mais a diversidade.

[0394]Os aptâmeros que reconhecem o biomarcador da TBI podem ser usados em vários métodos para detectar a presença ou nível de um ou mais biomarcadores da TBI em uma amostra biológica (por exemplo, entidades biológicas de interesse, como proteínas, ácidos nucleicos ou microvesículas). O aptâmero pode funcionar como um agente de ligação ou agente de captura para avaliar a presença ou o nível do biomarcador da TBI cognato. Em várias modalidades da presente divulgação direcionada a diagnósticos e/ou prognósticos, um ou mais aptâmeros podem ser configurados em um ensaio baseado em ligante-alvo, em que um ou mais aptâmeros podem ser contatados com uma amostra biológica selecionada para permitir o ou mais aptâmeros associar ou se ligar à sua molécula alvo de biomarcador da TBI. Os aptâmeros também podem ser usados para identificar um perfil de vários biomarcadores da TBI (um perfil ou assinatura de “biomarcador”) com base nas amostras biológicas avaliadas e nos biomarcadores detectados. Um perfil de biomarcador de uma amostra biológica pode compreender uma presença, nível ou outra característica de um ou mais biomarcadores de interesse que podem ser avaliados, incluindo, sem limitação, presença, nível, sequência, mutação, rearranjo, translocação, exclusão, modificação epigenética, metilação, modificação pós- tradução, alelo, atividade, parceiros complexos, estabilidade, meia-vida e semelhantes.

[0395]Os perfis ou assinaturas de biomarcadores podem ser usados para avaliar critérios de diagnóstico e/ou prognóstico, como presença de doença, estadiamento da doença, monitoramento da doença, estratificação da doença ou vigilância para detecção, metástase ou recorrência ou progressão da doença. Por exemplo, os métodos da presente divulgação podem incluir métodos para correlacionar um perfil de biomarcador da TBI a uma condição ou doença selecionada, como TBI grave, TBI leve ou uma subclasse de TBI leve. Um perfil de biomarcador também pode ser usado clinicamente na tomada de decisões sobre modalidades de tratamento, incluindo intervenção terapêutica. Um perfil de biomarcador baseado na detecção, identificação e/ou quantificação de aptâmeros pode ainda ser usado clinicamente para tomar decisões de tratamento, incluindo a realização de um procedimento de imagem (por exemplo, ressonância magnética).

11. Variações nos Métodos

[0396]Os métodos divulgados para determinar a presença ou quantidade de analito de interesse (por exemplo, biomarcador da TBI) presente em uma amostra podem ser como aqui descritos. Os métodos também podem ser adaptados em vista de outros métodos para analisar analitos. Exemplos de variações bem conhecidas incluem, mas não se limitam a, imunoensaio, como imunoensaio em sanduíche (por exemplo, imunoensaios em sanduíche monocional-monoclonal, imunoensaios em sanduíche monoclonal-policlonal, incluindo detecção enzimática (imunoensaio enzimático (EIA)) ou ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), imunoensaio de inibição competitiva (por exemplo, frente e verso), técnica de imunoensaio multiplicado por enzima (EMIT), um ensaio de ligação competitiva, transferência de energia de ressonância de bioluminescência (BRET), ensaio de detecção de anticorpos em uma etapa, ensaio homogêneo, ensaio heterogêneo, ensaio de captura em tempo real, etc.

a. Imunoensaio

[0397]O analito de interesse e/ou peptídeos de seus fragmentos (por exemplo, biomarcador da TBI e/ou peptídeos ou fragmentos dos mesmos), podem ser analisados utilizando anticorpos biomarcadores da TBI em um imunoensaio. À presença ou quantidade de analito (por exemplo, biomarcador da TBI) pode ser determinada usando anticorpos e detectando ligação específica ao analito. Por exemplo, o anticorpo, ou seu fragmento de anticorpo, pode se ligar especificamente ao analito. Se desejado, um ou mais dos anticorpos podem ser utilizados em combinação com um ou mais anticorpos monoclonais/policlonais disponíveis comercialmente. Tais anticorpos estão disponíveis em empresas como R&D Systems,

Inc. (Minneapolis, MN) e Enzo Life Sciences International, Inc. (Plymouth Meeting, PA).

[0398]A presença ou quantidade de analito (por exemplo, biomarcador da TBI) presente em uma amostra corporal pode ser prontamente determinada usando um imunoensaio, como imunoensaio em sanduíche (por exemplo, imunoensaios em sanduíche monoclonal-monoclonal, imunoensaios em sanduíche monoclional- monoclonal, imunoensaios em sanduíche monoclional-policlonal, incluindo detecção de radioisótopos (radioimunoensaio (RIA)) e detecção enzimática (imunoensaio enzimático (EIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) (por exemplo, ensaios Quantikine ELISA, R&D Systems, Minneapolis, MN)). Um exemplo de dispositivo de ponto de atendimento que pode ser utilizado é o iI-STATº (Abbott, Laboratories, Abbott Park, IL). Outros métodos que podem ser utilizados incluem um imunoensaio quimioluminescente de micropartículas, em particular aquele que utiliza o analisador automático ARCHITECTS (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Outros métodos incluem, por exemplo, espectrometria de massa e imuno-histoquímica (por exemplo, com seções de biópsias de tecidos), usando anticorpos anti-analitos (por exemplo, anti-biomarcador da TBI) (monoclonais, policlonais, quiméricos, humanizados, humanos, etc.) ou seus fragmentos de anticorpos contra o analito (por exemplo, biomarcador da TBI). Outros métodos de detecção incluem os descritos em, por exemplo, as patentes US Nºs 6.143.576; 6.113.855; 6.019.944; 5.985.579;

5.947.124; 5.939.272; 5.922.615; 5.885.527; 5.851.776; 5.824.799; 5.679.526;

5.525.524; e 5.480.792, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade. A ligação imunológica específica do anticorpo ao analito pode ser detectada por meio de marcadores diretos, como marcadores fluorescentes ou luminescentes, metais e radionuclídeos ligados ao anticorpo ou por marcadores indiretos, como fosfatase alcalina ou peroxidase de rábano silvestre.

[0399]O uso de anticorpos imobilizados ou seus fragmentos de anticorpos pode ser incorporado no imunoensaio. Os anticorpos podem ser imobilizados em uma variedade de suportes, tais como partículas da matriz magnética ou cromatográfica, a superfície de uma placa de ensaio (como poços de microtitulação), pedaços de um material de substrato sólido e semelhantes. Uma tira de ensaio pode ser preparada revestindo o anticorpo ou a pluralidade de anticorpos em uma matriz em um suporte sólido. Esta tira pode ser mergulhada na amostra de teste e processada rapidamente através de lavagens e etapas de detecção para gerar um sinal mensurável, como um ponto colorido.

[0400]Um formato homogêneo pode ser usado. Por exemplo, após a amostra de teste ser obtida de um sujeito, uma mistura é preparada. A mistura contém a amostra de teste que está sendo avaliada quanto ao analito (por exemplo, biomarcador da TBI) e um parceiro de ligação específico. A ordem na qual a amostra de teste e o parceiro de ligação específico são adicionados para formar a mistura não é crítica. A amostra de teste é contatada simultaneamente com o parceiro de ligação específico. Em algumas modalidades, o parceiro de ligação específico e qualquer biomarcador da TBI contido na amostra de teste podem formar um complexo de parceiro de ligação-analito (por exemplo, biomarcador da TBI)-antígeno. O parceiro de ligação específico pode ser um anticorpo anti-analito (por exemplo, anticorpo anti- biomarcador da TBI que se liga a um epítopo com uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos três aminoácidos contíguos (3) do biomarcador da TBI. Além disso, o parceiro de ligação específico pode ser marcado com ou contém um marcador detectável como descrito acima.

[0401]Um formato heterogêneo pode ser usado. Por exemplo, após a amostra de teste ser obtida de um sujeito, uma primeira mistura é preparada. A mistura contém a amostra de teste que está sendo avaliada para o analito (por exemplo, biomarcador da TBI) e um primeiro parceiro de ligação específico, em que o primeiro parceiro de ligação específico e qualquer biomarcador da TBI contido na amostra de teste formam um complexo de primeiro parceiro de ligação específico-analito (por exemplo, marcador da TBI)-antígeno. O primeiro parceiro de ligação específico pode ser um anticorpo anti-analito (por exemplo, anticorpo anti-biomarcador da TBI que se liga a um epítopo com uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos três aminoácidos contíguos (3) do biomarcador da TBI. A ordem na qual a amostra de teste e o primeiro parceiro de ligação específico são adicionados para formar a mistura não é crítica.

[0402]O primeiro parceiro de ligação específico pode ser imobilizado sobre uma fase sólida. A fase sólida usada no imunoensaio (para o parceiro de ligação específico) pode ser qualquer fase sólida conhecida na técnica, como, mas não se limita a, uma partícula magnética, uma microesfera, um tubo de ensaio, uma placa de microtitulação, uma cubeta, uma membrana, uma molécula de andaime, uma película, um papel de filtro, um disco e um chip. Nas modalidades em que a fase sólida é uma microesfera, a microesfera pode ser uma microesfera magnética ou uma partícula magnética. As microesferas/partículas magnéticas podem ser ferromagnéticas, ferrimagnéticas, paramagnéticas, superparamagnéticas ou ferrofluídicas. Materiais ferromagnéticos exemplares incluem Fe, Co, Ni, Gd, Dy, CrO2, MnAs, MnBi, Euo e NiO/Fe. Exemplos de materiais ferrimagnéticos incluem NiFe204, CoFezO4, Fe304 (ou FeO-Fe203). As microesferas podem ter uma porção de núcleo sólido que é magnética e é cercada por uma ou mais camadas não magnéticas. Alternativamente, a porção magnética pode ser uma camada em torno de um núcleo não magnético. O suporte sólido no qual o primeiro membro de ligação específico está imobilizado pode ser armazenado na forma seca ou em um líquido. As microesferas magnéticas podem estar sujeitas a um campo magnético antes ou depois do contato com a amostra com uma microesfera magnética na qual o primeiro membro de ligação específico é imobilizado.

[0403]Depois da mistura contendo o complexo de primeiro parceiro de ligação específico-analito (por exemplo, biomarcador da TBlI)-antígeno ser formada, qualquer analito não ligado (por exemplo, biomarcador da TBI) é removido a partir do complexo utilizando qualquer técnica conhecida na técnica. Por exemplo, o analito não ligado pode ser removido por lavagem. Desejavelmente, no entanto, o primeiro parceiro de ligação específico está presente em excesso de qualquer analito presente na amostra de teste, de modo que todo o analito que está presente na amostra de teste seja ligado pelo primeiro parceiro de ligação específico.

[0404]Depois da remoção de qualquer analito não ligado (por exemplo, biomarcador da TBI), um segundo parceiro de ligação específico é adicionado à mistura para formar um complexo de primeiro parceiro de ligação específico-analito de interesse (por exemplo, biomarcador da TBI)-segundo parceiro de ligação específico. O segundo parceiro de ligação específico pode ser um anticorpo anti- analito (por exemplo, anticorpo biomarcador da TBI que se liga a um epítopo com uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos três aminoácidos contíguos (3) do biomarcador da TBI. Além disso, o segundo parceiro de ligação específico é marcado com ou contém um marcador detectável como descrito acima.

[0405]A utilização de anticorpos imobilizados ou fragmentos de anticorpo pode ser incorporada no imunoensaio. Os anticorpos podem ser imobilizados em uma variedade de suportes, como partículas da matriz magnética ou cromatográfica (como uma microesfera magnética), partículas de látex ou partículas de látex de superfície modificada, polímero ou película polimérica, plástico ou película plástica, substrato plano, a superfície da uma placa de ensaio (como poços de microtitulação), pedaços de um material de substrato sólido e semelhantes. Uma tira de ensaio pode ser preparada revestindo o anticorpo ou a pluralidade de anticorpos em uma matriz em um suporte sólido. Esta tira pode ser mergulhada na amostra de teste e processada rapidamente através de lavagens e etapas de detecção para gerar um sinal mensurável, como um ponto colorido.

(1) Imunoensaio em Sanduíche

[0406]O imunoensaio em sanduíche mede a quantidade de antígeno entre duas camadas de anticorpos (isto é, pelo menos, um anticorpo de captura) e um anticorpo de detecção (isto é, pelo menos, um anticorpo de detecção). O anticorpo de captura e o anticorpo de detecção se ligam a diferentes epítopos no antígeno, por exemplo, analito de interesse, como um biomarcador da TBI). Desejavelmente, a ligação do anticorpo de captura a um epítopo não interfere com a ligação do anticorpo de detecção a um epítopo. Os anticorpos monoclonais ou policlonais podem ser utilizados como anticorpos de captura e detecção no imunoensaio em sanduíche.

[0407]De um modo geral, pelo menos dois anticorpos são empregues para separar e quantificar o analito (por exemplo, biomarcador da TBI) em uma amostra de teste. Mais especificamente, os pelo menos dois anticorpos se ligam a certos epítopos de analito, formando um complexo imune que é referido como um “sanduíche”. Um ou mais anticorpos podem ser usados para capturar o analito na amostra de teste (estes anticorpos são frequentemente chamados de anticorpo de “captura” ou anticorpos de “captura”) e um ou mais anticorpos são usados para ligar um marcador detectável (isto é, quantificável) para o sanduíche (estes anticorpos são frequentemente chamados de anticorpo de “detecção” ou anticorpos de “detecção”). Em um ensaio em sanduíche, a ligação de um anticorpo ao seu epítopo não é desejavelmente diminuída pela ligação de qualquer outro anticorpo no ensaio ao seu respectivo epítopo. Os anticorpos são selecionados para que o um ou mais primeiros anticorpos postos em contato com uma amostra de teste suspeita de conter analito não se liguem a todo ou parte de um epítopo reconhecido pelo segundo ou pelos anticorpos subsequentes, interferindo assim na capacidade de um ou mais segundo anticorpos de detecção para se ligar ao analito.

[0408]Os anticorpos podem ser utilizados como um primeiro anticorpo no dito imunoensaio. O anticorpo se liga imunoespecificamente aos epítopos no analito (por exemplo, biomarcador da TBI). Além dos anticorpos da presente divulgação, o dito imunoensaio pode compreender um segundo anticorpo que se liga imunoespecificamente a epítopos que não são reconhecidos ou ligados pelo primeiro anticorpo.

[0409]Uma amostra de teste suspeita de conter analito (por exemplo, biomarcador da TBI) pode ser contatada com pelo menos um primeiro anticorpo (ou anticorpos) de captura e pelo menos um segundo anticorpo de detecção simultaneamente ou sequencialmente. No formato de ensaio em sanduíche, uma amostra de teste suspeita de conter analito é primeiro colocada em contato com pelo menos um primeiro anticorpo de captura que se liga especificamente a um epítopo específico em condições que permitem a formação de um complexo de primeiro antígeno analito de anticorpo. Se mais de um anticorpo de captura for usado, um complexo de primeiro anticorpo de captura múltipla-biomarcador da TBI antígeno é formado. Em um ensaio em sanduíche, os anticorpos, preferencialmente, pelo menos um anticorpo de captura, são utilizados em quantidades molares em excesso da quantidade máxima de analito esperada na amostra de teste. Por exemplo, podem ser utilizados de cerca de 5 ug/mL a cerca de 1 mg/mL de anticorpo por ml de tampão de revestimento de micropartículas.

i. Anticorpos de Captura Anti-biomarcador da TBI

[0410]Opcionalmente, antes de entrar em contato com a amostra de teste com pelo menos um primeiro anticorpo de captura, o pelo menos um primeiro anticorpo de captura pode ser ligado a um suporte sólido que facilita a separação do complexo de primeiro anticorpo-analito (por exemplo, biomarcador da TBI) da amostra de teste. Qualquer suporte sólido conhecido na técnica pode ser usado, incluindo, entre outros, suportes sólidos feitos de materiais poliméricos nas formas de poços, tubos ou microesferas (como uma micropartícula). O anticorpo (ou anticorpos) pode ser ligado ao suporte sólido por adsorção, por ligação covalente usando um agente de acoplamento químico ou por outros meios conhecidos na técnica, desde que esta ligação não interfira na capacidade do anticorpo de se ligar ao analito. Além disso, se necessário, o suporte sólido pode ser derivado para permitir reatividade com vários grupos funcionais no anticorpo. Esta derivação requer o uso de certos agentes de acoplamento, tais como, mas não se limitam a, anidrido maleico, N- hidroxissuccinimida e 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodi-imida.

[0411]Depois da amostra de teste suspeita de conter o analito (por exemplo, biomarcador da TBI) ser incubada para permitir a formação de um complexo de primeiro anticorpo de captura (ou múltiplos anticorpos)-analito. A incubação pode ser realizada a um pH de cerca de 4,5 a cerca de 10,0, a uma temperatura de cerca de 2 ºC a cerca de 45 ºC e por um período de pelo menos cerca de um (1) minuto a cerca de dezoito (18) horas, de 2 a 6 minutos, de 7 a 12 minutos, de 5 a 15 minutos ou de 3 a 4 minutos.

ii. Anticorpo de Detecção

[0412]Depois da formação do complexo de primeiro/múltiplos anticorpos de captura-analito (por exemplo, biomarcador da TBI), o complexo é então contatado com pelo menos um segundo anticorpo de detecção (sob condições que permitem a formação de um complexo de primeiro/múltiplos anticorpos-analito antigeno-segundo anticorpo). Em algumas modalidades, a amostra de teste é contatada com o anticorpo de detecção simultaneamente com o anticorpo de captura. Se o complexo de primeiro anticorpo-analito for contatado com mais de um anticorpo de detecção, um complexo de detecção de primeiro/múltiplos anticorpos-analito-múltiplos anticorpos é formado. Como no primeiro anticorpo, quando o pelo menos o segundo (e subsequente) anticorpo é colocado em contato com o complexo de primeiro anticorpo-analito, é necessário um período de incubação em condições semelhantes às descritas acima para a formação do complexo de primeiro/múltiplos anticorpos-analito- segundo/múltiplos anticorpos. De preferência, pelo menos um segundo anticorpo contém um marcador detectável. O marcador detectável pode ser ligado ao pelo menos um segundo anticorpo antes, simultaneamente com ou após a formação do complexo de primeiro/múltiplos anticorpos-analito-segundo/múltiplos anticorpos. Qualquer marcador detectável conhecido na técnica pode ser usado.

[0413]Os ensaios quimioluminescentes podem ser realizados de acordo com os métodos descritos em Adamczyk et al., Anal. Chim. Acta 579 (1): 61-67 (2006). Embora possa ser utilizado qualquer formato de ensaio adequado, um quimioluminômetro para microplacas (Mithras LB-940, Berthold Technologies EUA, LLC, Oak Ridge, TN) permite o teste de várias amostras de pequenos volumes rapidamente. O quimioluminômetro pode ser equipado com vários injetores de reagentes usando microplacas de poliestireno pretas de 96 poços (Costar 43792). Cada amostra pode ser adicionada a um poço separado, seguido pela adição simultânea/sequencial de outros reagentes, conforme determinado pelo tipo de ensaio empregado. Desejavelmente, é evitada a formação de pseudobases em soluções neutras ou básicas empregando um éster arílico de acridinio, como por acidificação. A resposta quimioluminescente é então registrada bem por poço. A este respeito, o tempo para registar a resposta quimioluminescente dependerá, em parte, do atraso entre a adição dos reagentes e o acridínio específico utilizado.

[0414]A ordem na qual a amostra de teste e o(s) parceiro(s) de ligação específico(s) são adicionados para formar a mistura para o ensaio quimioluminescente não é crítica. Se o primeiro parceiro de ligação específico for marcado de forma detectável com um composto de acridínio, formam-se complexos do primeiro parceiro de ligação específico-antígeno (por exemplo, biomarcador da TBI). Alternativamente, se um segundo parceiro de ligação específico é usado e o segundo parceiro de ligação específico é detectável e marcado com um composto de acridinio, formam-se complexos de primeiro parceiro de ligação específico-analito-segundo parceiro de ligação específico detectáveis. Qualquer parceiro de ligação específico não ligado,

marcado ou não, pode ser removido da mistura usando qualquer técnica conhecida na técnica, como lavagem.

[0415]O peróxido de hidrogênio pode ser gerado in situ na mistura ou fornecido à mistura antes, simultaneamente ou após a adição de um composto de acridínio descrito acima. O peróxido de hidrogênio pode ser gerado in situ de várias maneiras, como seria evidente a um especialista na técnica.

[0416]Em alternativa, uma fonte de peróxido de hidrogénio pode ser simplesmente adicionada à mistura. Por exemplo, a fonte do peróxido de hidrogênio pode ser um ou mais tampões ou outras soluções conhecidas por conter peróxido de hidrogênio. A este respeito, uma solução de peróxido de hidrogênio pode ser simplesmente adicionada.

[0417]Depois da adição simultânea ou subsequente de pelo menos uma solução básica à amostra, é gerado um sinal detectável, a saber, um sinal quimioluminescente, indicativo da presença de analito (por exemplo, biomarcador da TBI). A solução básica contém pelo menos uma base e tem um pH maior ou igual a 10, preferencialmente, maior ou igual a 12. Exemplos de soluções básicas incluem, mas não se limitam a, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de cálcio, hidróxido de amônio, hidróxido de magnésio, carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio e bicarbonato de cálcio. A quantidade de solução básica adicionada à amostra depende da concentração da solução básica. Com base na concentração da solução básica usada, um especialista na técnica pode determinar facilmente a quantidade de solução básica a ser adicionada à amostra. Outros marcadores que não sejam quimioluminescentes podem ser empregados. Por exemplo, podem ser empregues marcadores enzimáticos (incluindo, mas não se limitam a fosfatase alcalina).

[0418]O sinal quimioluminescente, ou outro sinal, que é gerado pode ser detectado usando técnicas de rotina conhecidas pelos especialistas na técnica. Com base na intensidade do sinal gerado, a quantidade de analito de interesse (por exemplo, biomarcador da TBI) na amostra pode ser quantificada. Especificamente, a quantidade de analito na amostra é proporcional à intensidade do sinal gerado. À quantidade de analito presente pode ser quantificada comparando a quantidade de luz gerada com uma curva padrão para analito ou comparando com um padrão de referência. A curva padrão pode ser gerada usando diluições em série ou soluções de concentrações conhecidas de analito por espectroscopia de massa, métodos gravimétricos e outras técnicas conhecidas no ramo.

(2) Ensaio de Inibição Competitiva Competitivo

[0419]Em um formato competitivo competitivo, uma alíquota de analito de interesse marcado (por exemplo, biomarcador da TBI) com um marcador fluorescente, uma etiqueta anexada a um ligante clivável, etc.) de uma concentração conhecida é usada para competir com o analito de interesse em uma amostra de teste para ligação ao anticorpo analito de interesse (por exemplo, um anticorpo biomarcador da TBI).

[0420]Em um ensaio de competição direta, um parceiro de ligação específico imobilizado (como um anticorpo) pode ser sequencial ou simultaneamente contatado com a amostra de teste e um analito marcado de interesse, fragmento de analito de interesse ou sua variante de analito de interesse. O peptídeo analito de interesse, fragmento analito de interesse ou variante analito de interesse pode ser marcado com qualquer marcador detectável, incluindo um marcador detectável constituído por etiqueta ligada a um ligante clivável. Neste ensaio, o anticorpo pode ser imobilizado em um suporte sólido. Alternativamente, o anticorpo pode ser acoplado a um anticorpo, como um anticorpo antiespécie, que foi imobilizado em um suporte sólido, como uma micropartícula ou substrato plano.

[0421]O analito marcado de interesse, a amostra de teste e o anticorpo são incubados em condições semelhantes às descritas acima em conexão com o formato de ensaio em sanduíche. Duas espécies diferentes de complexos de analito-anticorpo de interesse podem então ser geradas. Especificamente, um dos complexos analito de anticorpo de interesse gerado contém um marcador detectável (por exemplo, um marcador fluorescente, etc.) enquanto o outro complexo analito de anticorpo de interesse não contém um marcador detectável. O complexo de anticorpo-analito de interesse pode ser, mas não precisa ser, separado do restante da amostra de teste antes da quantificação do marcador detectável. Independentemente de o complexo de anticorpo-analito de interesse ser separado do restante da amostra de teste, a quantidade de marcador detectável no complexo de anticorpo-analito de interesse é então quantificada. A concentração de analito de interesse (como analito de interesse associado à membrana, analito de interesse solúvel, fragmentos de analito de interesse solúvel, variantes de analito de interesse (analito de interesse associado à membrana ou solúvel) ou qualquer combinação dos mesmos) na amostra de teste pode então ser determinada, por exemplo, como descrito acima.

(3) Ensaio de Inibição Competitiva Reversa

[0422]EM um ensaio de competição reversa, um analito imobilizado de interesse (por exemplo, biomarcador da TBI) pode ser sequencial ou simultaneamente contatado com uma amostra de teste e pelo menos um anticorpo marcado.

[0423]O analito de interesse pode ser ligado a um suporte sólido, como os suportes sólidos discutidos acima em conexão com o formato de ensaio em sanduíche.

[0424]O analito imobilizado de interesse, a amostra de teste e pelo menos um anticorpo marcado são incubados em condições semelhantes às descritas acima em conexão com o formato de ensaio em sanduíche. São então gerados dois analitos de espécies diferentes de complexos de interesse-anticorpo. Especificamente, um dos analitos de complexos de interesse-anticorpo gerados é imobilizado e contém um marcador detectável (por exemplo, um marcador fluorescente, etc.) enquanto o outro analito de complexo de interesse-anticorpo não é imobilizado e contém um marcador detectável. O analito não imobilizado de complexo de interesse-anticorpo e o restante da amostra de teste são removidos da presença de analito imobilizado de complexo de interesse-anticorpo através de técnicas conhecidas no ramo, como lavagem. Uma vez removido o analito não imobilizado de complexo de interesse-anticorpo, a quantidade de marcador detectável no analito imobilizado de complexo de interesse- analito é quantificada após a clivagem do marcador. A concentração de analito de interesse na amostra de teste pode então ser determinada comparando-se a quantidade de marcador detectável como descrito acima.

(4) Imunoensaio de Uma Etapa ou Ensaio de “Captura em Tempo Real”

[0425]Em um imunoensaio de captura em tempo real, um substrato sólido é pré-revestido com um agente de imobilização. O agente de captura, o analito (por exemplo, biomarcador da TBI) e o agente de detecção são adicionados juntos ao substrato sólido, seguidos por uma etapa de lavagem antes da detecção. O agente de captura pode ligar o analito e compreender um ligante para um agente de imobilização. O agente de captura e os agentes de detecção podem ser anticorpos ou qualquer outra porção capaz de captura ou detecção, como aqui descrito ou conhecido na técnica. O ligante pode compreender um marcador peptídico e um agente de imobilização pode compreender um anticorpo marcador peptídico. Alternativamente, oO ligante e o agente de imobilização podem ser qualquer par de agentes capazes de se ligar um ao outro de modo a serem empregados para uma captura em tempo real (por exemplo, par de ligação específico e outros como são conhecidos na técnica). Mais de um analito pode ser medido. Em algumas modalidades, o substrato sólido pode ser revestido com um antígeno e o analito a ser analisado é um anticorpo. Este método também pode ser acoplado à detecção e quantificação de MS.

[0426]Em certas outras modalidades, em um imunoensaio em uma etapa ou “captura em tempo real”, um suporte sólido (como uma micropartícula) pré-revestido com um agente de imobilização (como biotina, estreptavidina, etc.) e em pelo menos,

um primeiro membro de ligação específico e um segundo membro de ligação específico (que funcionam como reagentes de captura e detecção, respectivamente) são usados. O primeiro membro de ligação específico compreende um ligante para o agente de imobilização (por exemplo, se o agente de imobilização no suporte sólido for estreptavidina, o ligante no primeiro membro de ligação específico pode ser biotina) e também se liga ao analito de interesse (por exemplo, biomarcador da TBI). O segundo membro de ligação específico compreende um marcador detectável e se liga a um analito de interesse. O suporte sólido e os primeiro e segundo membros de ligação específicos podem ser adicionados a uma amostra de teste (sequencial ou simultaneamente). O ligante no primeiro membro de ligação específico liga-se ao agente de imobilização no suporte sólido para formar um complexo de suporte sólido/primeiro membro de ligação específico. Qualquer analito de interesse presente na amostra se liga ao complexo de suporte sólido/primeiro membro de ligação específico para formar um suporte sólido/primeiro membro de ligação específico/complexo analito. O segundo membro de ligação específico se liga ao complexo de suporte sólido/primeiro membro de ligação específico/analito e o marcador detectável é detectado. Uma etapa de lavagem opcional pode ser empregada antes da detecção. Em certas modalidades, em um ensaio de uma etapa, mais de um analito pode ser medido. Em certas outras modalidades, mais de dois membros de ligação específicos podem ser empregados. Em certas outras modalidades, vários marcadores detectáveis podem ser adicionados. Em certas outras modalidades, vários analitos de interesse podem ser detectados, ou suas quantidades, níveis ou concentrações, medidas, determinadas ou avaliadas, incluindo o uso de espectrometria de massa.

[0427]O uso de um ensaio de captura em tempo real pode ser feito em uma variedade de formatos, como aqui descrito e conhecido na técnica. Por exemplo, o formato pode ser um ensaio em sanduíche como descrito acima, mas alternativamente pode ser um ensaio de competição, pode empregar um único membro de ligação específico ou usar outras variações, como são conhecidas. Este método também pode ser acoplado à detecção e quantificação de MS.

12. Outros Fatores

[0428]Os métodos de diagnóstico, prognóstico, estratificação de risco e/ou avaliação, conforme descrito acima, podem incluir ainda o uso de outros fatores para o diagnóstico, prognóstico e avaliação. Em algumas modalidades, a lesão cerebral traumática pode ser diagnosticada usando a Escala de Coma de Glasgow ou a Escala Estendida de Resultados de Glasgow (GOSE). Outros testes, escalas ou índices também podem ser usados isoladamente ou em combinação com a Escala de Coma de Glasgow. Um exemplo é a Escala Ranchos Los Amigos. A Escala Ranchos Los Amigos mede os níveis de consciência, cognição, comportamento e interação com o meio ambiente. A Escala Ranchos Los Amigos inclui: Nível |: Sem Resposta; Nível |l: Resposta Generalizada; Nível Ill: Resposta Localizada; Nível IV: Confuso Agitado; Nível V: Confuso Inadequado; Nível VI: Confuso Apropriado; Nível VII: Apropriado Automaticamente; e Nível VIII: Finalidade Apropriada.

13. Amostras

[0429]Em algumas modalidades, a amostra é obtida depois que o sujeito humano sofreu uma lesão na cabeça causada por tremor físico, impacto contundente por uma força mecânica ou outra força externa que resulta em um traumatismo craniano fechado ou aberto, uma ou mais quedas, explosões ou explosões ou outros tipos de traumatismo contuso. Em algumas modalidades, a amostra é obtida após o sujeito humano ter ingerido ou ser exposto a um produto químico, toxina ou combinação de produto químico e toxina. Exemplos de tais produtos químicos e/ou toxinas incluem incêndios, fungos, amianto, pesticidas e inseticidas, solventes orgânicos, tintas, colas, gases (como monóxido de carbono, sulfeto de hidrogênio e cianeto), metais orgânicos (como metil mercúrio, tetraetil chumbo e estanho orgânico)

e/ou uma ou mais drogas de abuso. Em algumas modalidades, a amostra é obtida de um sujeito humano que sofre de uma doença autoimune, um distúrbio metabólico, um tumor cerebral, hipóxia, um ou mais vírus, meningite, hidrocefalia ou combinações dos mesmos.

[0430]Em ainda outra modalidade, os métodos aqui descritos usam amostras que também podem ser usadas para determinar se um sujeito tem ou está em risco de desenvolver lesão cerebral traumática leve, determinando os níveis de um biomarcador da TBI em um sujeito usando os anticorpos biomarcadores anti-TBl descritos abaixo, ou seus fragmentos de anticorpos. Assim, em modalidades particulares, a divulgação também fornece um método para determinar se um sujeito que tem, ou corre risco de lesões cerebrais traumáticas, discutidas aqui e conhecidas na técnica, é candidato à terapia ou tratamento. Geralmente, o sujeito é pelo menos aquele que: (i) sofreu um ferimento na cabeça; (ii) ingeriu e/ou foi exposto a um ou mais produtos químicos e/ou toxinas; (iii) sofre de uma doença autoimune, um distúrbio metabólico, um tumor cerebral, hipóxia, um ou mais vírus, meningite, hidrocefalia ou sofre de qualquer combinação dos mesmos; ou (iv) quaisquer combinações de (i) a (iii); ou, que foi realmente diagnosticado como tendo ou estando em risco de TBI (como, por exemplo, sujeitos que sofrem de uma doença autoimune, um distúrbio metabólico, um tumor cerebral, hipóxia, um ou mais vírus, meningite, hidrocefalia ou combinações) e/ou que demonstre uma concentração ou quantidade desfavorável (isto é, clinicamente indesejável) de um biomarcador da TBI ou um fragmento de biomarcador da TBI, como aqui descrito.

a. Teste ou Amostra Biológica

[0431]Como usado neste documento, “amostra”, “amostra de teste”, “amostra biológica” se refere a amostra de fluido contendo ou com suspeita de conter um biomarcador da TBI. A amostra pode ser derivada de qualquer fonte adequada. Em alguns casos, a amostra pode compreender um líquido, um sólido particulado fluente ou uma suspensão fluida de partículas sólidas. Em alguns casos, a amostra pode ser processada antes da análise aqui descrita. Por exemplo, a amostra pode ser separada ou purificada de sua fonte antes da análise; no entanto, em certas modalidades, uma amostra não processada contendo um biomarcador da TBI pode ser analisada diretamente. Em um exemplo específico, a fonte que contém um biomarcador da TBI é uma substância corporal humana (por exemplo, fluido corporal, sangue como sangue total, soro, plasma, urina, saliva, suor, escarro, sêmen, sêmen, muco, líquido lacrimal, líquido linfático, líquido amniótico, líquido intersticial, lavagem pulmonar, líquido cefalorraquidiano, fezes, tecidos, órgãos ou semelhantes). Os tecidos podem incluir, mas não se limitam a, tecido muscular esquelético, tecido hepático, tecido pulmonar, rim, miocárdico, tecido cerebral, medula óssea, tecido cervical, pele, etc. À amostra pode ser uma amostra líquida ou um extrato líquido de uma amostra sólida. Em certos casos, a fonte da amostra pode ser um órgão ou tecido, como uma amostra de biópsia, que pode ser solubilizada por desintegração tecidual/lise celular.

[0432]Uma ampla gama de volumes da amostra de fluido pode ser analisada. Em algumas modalidades exemplares, o volume da amostra pode ser de cerca de 0,5 nL, cerca de 1 nL, cerca de 3 nL, cerca de 0,01 uL, cerca de 0,1 ul, cerca de 1 uL, cerca de 5 ul, cerca de 10 yuL, cerca de 100 uL, cerca de 1 mL, cerca de 5 mL, cerca de 10 mL ou semelhantes. Em alguns casos, o volume da amostra de fluido está entre cerca de 0,01 ul e cerca de 10 mL, entre cerca de 0,01 uL e cerca de 1 mL, entre cerca de 0,01 ul e cerca de 100 uL ou entre cerca de 0,1 ul e cerca de 10 uL.

[0433]Em alguns casos, a amostra de fluido pode ser diluída antes do uso em um ensaio. Por exemplo, nas modalidades em que a fonte que contém um biomarcador da TBI é um fluido do corpo humano (por exemplo, sangue, soro), o fluido pode ser diluído com um solvente apropriado (por exemplo, um tampão como o tampão PBS). Uma amostra de fluido pode ser diluída cerca de 1 vezes, cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 4 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 6 vezes, cerca de 10 vezes, cerca de 100 vezes ou mais, antes usar. Em outros casos, a amostra de fluido não é diluída antes do uso em um ensaio.

[0434]Em alguns casos, a amostra pode sofrer processamento pré-analítico. O processamento pré-analítico pode oferecer funcionalidade adicional, como remoção inespecífica de proteínas e/ou funcionalidade de mistura eficaz, ainda que barata, implementável. Os métodos gerais de processamento pré-analítico podem incluir a utilização de aprisionamento por electrocinética, electrocinética AC, ondas acústicas de superfície, isotacoforese, dielectroforese, electroforese, ou outras técnicas de pré- concentração conhecida na técnica. Em alguns casos, a amostra de fluido pode ser concentrada antes do uso em um ensaio. Por exemplo, nas modalidades em que a fonte que contém um biomarcador da TB! é um fluido do corpo humano (por exemplo, sangue, soro), o fluido pode ser concentrado por precipitação, evaporação, filtração, centrifugação ou uma combinação dos mesmos. Uma amostra de fluido pode ser concentrada cerca de 1 vezes, cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 4 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 6 vezes, cerca de 10 vezes, cerca de 100 vezes ou mais, antes usar.

b. Controles

[0435]Pode ser desejável incluir um controle. O controle pode ser analisado simultaneamente com a amostra do sujeito, como descrito acima. Os resultados obtidos da amostra em questão podem ser comparados com os resultados obtidos na amostra controle. Podem ser fornecidas curvas padrão, com as quais os resultados do ensaio para a amostra podem ser comparados. Tais curvas padrão apresentam níveis de marcador em função das unidades de teste, isto é, intensidade do sinal fluorescente, se for usada uma etiqueta fluorescente. Usando amostras coletadas de vários doadores, podem ser fornecidas curvas padrão para os níveis de referência de um biomarcador da TBI em tecidos saudáveis normais, bem como para níveis de “risco” do biomarcador da TBI em tecidos retirados de doadores, que podem ter um ou mais das características estabelecidas acima.

[0436]Assim, em face do exposto, um método para determinar a presença, a quantidade ou concentração de um biomarcador da TBI em uma amostra de teste é fornecida. O método compreende a análise da amostra de teste de um biomarcador da TBI por um imunoensaio, por exemplo, empregando pelo menos um anticorpo de captura que se liga a um epítopo em um biomarcador da TBI e pelo menos um anticorpo de detecção que se liga a um epítopo em um biomarcador da TBI que é diferente do epítopo para o anticorpo de captura e, opcionalmente, inclui uma etiqueta detectável e compreendendo a comparação de um sinal gerado pela etiqueta detectável como uma indicação direta ou indireta da presença, quantidade ou concentração de um biomarcador da TBI na amostra de teste com um sinal gerado como indicação direta ou indireta da presença, quantidade ou concentração de um biomarcador de TBI em um calibrador. O calibrador é opcional e, de preferência, parte de uma série de calibradores em que cada um dos calibradores difere dos outros calibradores da série pela concentração do biomarcador da TBI.

14. Kit

[0437]É aqui fornecido um Kit, que pode ser usado para analisar ou avaliar uma amostra de teste para um ou mais biomarcadores da TBI e/ou fragmentos dos mesmos. O kit compreende pelo menos um componente para analisar a amostra de teste para um biomarcador da TBI e instruções para analisar a amostra de teste para um biomarcador da TBI. Por exemplo, o kit pode compreender instruções para analisar a amostra de teste para um biomarcador da TBI por imunoensaio (por exemplo, imunoensaio quimioluminescente por micropartículas) ou por espectrometria de massa (por exemplo, PRM-MS ou MRM/SRM-MS). As instruções incluídas nos kits podem ser afixadas no material da embalagem ou podem ser incluídas como uma bula. Embora as instruções sejam tipicamente materiais escritos ou impressos, elas não se limitam a isso. Qualquer meio capaz de armazenar estas instruções e comunicá-las a um usuário final é contemplado por esta divulgação. Estes meios incluem, entre outros, meios de armazenamento eletrônico (por exemplo, discos magnéticos, fitas, cartuchos, chips), mídias ópticas (por exemplo, CD-ROM) e semelhantes. Conforme usado aqui, o termo “instruções” pode incluir o endereço de um site da Internet que fornece as instruções.

[0438]O pelo menos um componente pode incluir pelo menos uma composição compreendendo um ou mais anticorpos isolados ou seus fragmentos de anticorpo que se ligam especificamente a um biomarcador da TBI. O anticorpo pode ser um anticorpo de detecção de biomarcador da TBI e/ou anticorpo de captura.

[0439]Alternativamente ou adicionalmente, o kit pode compreender um calibrador ou controle (por exemplo, biomarcador da TBI purificado e opcionalmente liofilizado) e/ou pelo menos um recipiente (por exemplo, tubo, placas ou tiras de microtitulação, que já pode ser revestido com um anticorpo anti-biomarcador da TBI) para a realização do ensaio e/ou um tampão, como um tampão de ensaio ou um tampão de lavagem, um dos quais pode ser fornecido como uma solução concentrada, uma solução de substrato para o marcador detectável (por exemplo, um marcador enzimático) ou uma solução de parada. De preferência, o kit compreende todos os componentes, isto é, reagentes, padrões, tampões, diluentes, etc., necessários para realizar o ensaio. As instruções também podem incluir instruções para gerar uma curva padrão.

[0440]O kit pode ainda compreender padrões de referência para quantificar um biomarcador da TBI. Os padrões de referência podem ser empregados para estabelecer curvas padrão para interpolação e/ou extrapolação de concentrações de biomarcadores da TBlI. As latas padrão incluem proteínas ou fragmentos peptídicos compostos por resíduos de aminoácidos ou proteínas marcadas isotópicas estáveis N15 ou fragmentos peptídicos para vários analitos, bem como padrões para o processamento de amostras, incluindo padrões envolvendo picos de proteínas e peptídeos quantitativos. Em algumas modalidades, os padrões de referência para um biomarcador da TBI podem corresponder ao percentil 99 derivado de uma população de referência saudável. Tais padrões de referência podem ser determinados usando técnicas de rotina conhecidas na técnica.

[0441]Quaisquer anticorpos fornecidos no Kit, como anticorpos recombinantes específicos para um biomarcador da TBI, podem incorporar um marcador detectável, como fluoróforo, fração radioativa, enzima, marcador de biotina/avidina, cromóforo, marcador quimioluminescente ou semelhantes, ou o kit pode incluir reagentes para marcar os anticorpos ou reagentes para detectar os anticorpos (por exemplo, anticorpos de detecção) e/ou para marcar os analitos (por exemplo, biomarcador da TBI) ou reagentes para detectar o analito (por exemplo, biomarcador da TBI). Os anticorpos, peptídeos padrão ou fragmentos de peptídeo, calibradores e/ou controles podem ser fornecidos em recipientes separados ou pré-dispensados em um formato de ensaio apropriado, por exemplo, em placas de microtitulação,

[0442] Opcionalmente, o kit inclui componentes de controle de qualidade (por exemplo, painéis de sensibilidade, calibradores e controles positivos). A preparação de reagentes de controle de qualidade é bem conhecida na técnica e é descrita em folhas de inserção para uma variedade de produtos imunodiagnósticos. Opcionalmente, os membros do painel de sensibilidade são usados para estabelecer as características de desempenho do ensaio e, opcionalmente, são indicadores úteis da integridade dos reagentes do kit de imunoensaio e da padronização dos ensaios.

[0443]O kit também pode incluir opcionalmente outros reagentes necessários para realizar um teste de diagnóstico ou facilitar avaliações de controle de qualidade, como tampões, sais, enzimas, cofatores enzimáticos, substratos, reagentes de detecção e semelhantes. Outros componentes, como tampões e soluções para o isolamento e/ou tratamento de uma amostra de teste (por exemplo, reagentes de pré- tratamento), também podem ser incluídos no kit. O kit também pode incluir um ou mais outros controles. Um ou mais dos componentes do kit podem ser liofilizados, caso em que o kit pode ainda compreender reagentes adequados para a reconstituição dos componentes liofilizados.

[0444]Os vários componentes do Kkit são fornecidos opcionalmente em recipientes adequados conforme necessário, por exemplo, uma placa de microtitulação. O kit também pode incluir recipientes para armazenar uma amostra (por exemplo, um recipiente ou cartucho para uma amostra de urina, sangue total, plasma ou soro). Onde apropriado, o kit opcionalmente também pode conter recipientes de reação, recipientes de mistura e outros componentes que facilitam a preparação de reagentes ou a amostra de teste. O kit também pode incluir um ou mais instrumentos para ajudar na obtenção de uma amostra de teste, como uma seringa, pipeta, pinça, colher medida ou semelhantes.

[0445]Se o marcador detectável for pelo menos um composto de acridínio, o kit pode compreender pelo menos um acridínio-9-carboxamida, pelo menos um éster arílico de acridínio-9-carboxilato ou qualquer combinação dos mesmos. Se o marcador detectável for pelo menos um composto de acridínio, o kit também poderá compreender uma fonte de peróxido de hidrogênio, como um tampão, solução e/ou pelo menos uma solução básica. Se desejado, o kit pode conter uma fase sólida, como partícula magnética, microesfera, tubo de ensaio, placa de microtitulação, cubeta, membrana, molécula de andaime, película, papel de filtro, disco ou chip.

[0446]Se desejado, o Kit pode ainda compreender um ou mais componentes, isoladamente ou em combinação com instruções, para analisar a amostra de teste para outro analito, que pode ser um biomarcador, como um biomarcador de lesão ou distúrbio cerebral traumático.

a. Adaptação de Kit e Método

[0447]O kit (ou seus componentes), bem como o método para avaliar ou determinar a concentração de um biomarcador da TBI em uma amostra de teste por um imunoensaio, conforme descrito aqui, podem ser adaptados para uso em uma variedade de métodos automatizados e sistemas semi-automatizados (incluindo aqueles em que a fase sólida compreende uma micropartícula), como descrito, por exemplo, Patente US Nº 5.063.081, Publicação de Pedido de Patente US Nºs 2003/0170881, 2004/0018577, 2005/0054078 e 2006/0160164 e comercialmente comercializados, por exemplo, pela Abbott Laboratories (Abbott Park, IL) como Abbott Point of Care (I-STATº ou i-STAT Alinity, Abbott Laboratories), bem como aqueles descritos nas Patentes US Nº 5.089.424 e 5.006.309 e comercialmente comercializados, por exemplo, pelos laboratórios Abbott (Abbott Park, IL) como ARCHITECTS ou pela série de dispositivos Abbott Alinity.

[0448]Algumas das diferenças entre um sistema automatizado ou semi- automatizado em comparação com um sistema não automatizado (por exemplo, ELISA) incluem o substrato ao qual o primeiro parceiro de ligação específico (por exemplo, anticorpo analito ou anticorpo de captura) está conectado (que pode afetar a formação do sanduíche e a reatividade do analito) e o comprimento e o tempo da captura, detecção e/ou quaisquer etapas opcionais de lavagem. Considerando que um formato não automatizado, como um ELISA, pode exigir um tempo de incubação relativamente mais longo com amostra e reagente de captura (por exemplo, cerca de 2 horas), um formato automatizado ou semi-automatizado (por exemplo, ARCHITECTS, Alinity e qualquer plataforma sucessora, Abbott Laboratories) pode ter um tempo de incubação relativamente menor (por exemplo, aproximadamente 18 minutos para o ARCHITECTº). Da mesma forma, enquanto um formato não automatizado como um ELISA pode incubar um anticorpo de detecção como o reagente conjugado por um tempo de incubação relativamente mais longo (por exemplo, cerca de 2 horas), um formato automatizado ou semi-automatizado (por exemplo, ARCHITECTº e qualquer plataforma sucessora) pode ter um tempo de incubação relativamente menor (por exemplo, aproximadamente 4 minutos para o

ARCHITECTS, Alinity e qualquer plataforma sucessora).

[0449]Outras plataformas disponíveis na Abbott Laboratories incluem, mas não se limitam a, AXSYMS, IMxº (ver, por exemplo, Patente US Nº 5.294.404, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade), PRISMº, EIA (mricoesfera) e Quantum ”Y Il, além de outras plataformas. Além disso, os ensaios, kits e componentes do kit podem ser empregados em outros formatos, por exemplo, em sistemas eletroquímicos ou outros sistemas de ensaios manuais ou de ponto de atendimento. Como mencionado anteriormente, a presente divulgação é, por exemplo, aplicável ao sistema de imunoensaio eletroquímico comercial Abbott Point of Care (I-STATº, Abbott Laboratories) que executa imunoensaios em sanduíche. Os imunossensores e seus métodos de fabricação e operação em dispositivos de teste de uso único são descritos, por exemplo, na patente US Nº 5.063.081, Publicações de Pedido de Patente US Nºs 2003/0170881, 2004/0018577, 2005/0054078 e 2006/0160164, que são incorporadas na sua totalidade por referência para seus ensinamentos a respeito.

[0450]Em particular, no que diz respeito à adaptação de um ensaio ao sistema -STATº, é preferida a seguinte configuração. Um chip de silicone microfabricado é fabricado com um par de eletrodos de trabalho amperométricos de ouro e um eletrodo de referência de cloreto de prata e prata. Em um dos eletrodos de trabalho, microesferas de poliestireno (0,2 mm de diâmetro) com anticorpo de captura imobilizado são aderidas a um revestimento de polímero de álcool polivinílico padronizado sobre o eletrodo. Este chip é montado em um cartucho i-STATºÉ com um formato fluídico adequado para imunoensaio. Em uma porção do chip de silício, há um parceiro de ligação específico para um biomarcador da TBI, como um ou mais anticorpos biomarcadores da TBI, um ou mais anticorpos monoclonais/policlonais ou um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou um fragmento de uma variante do mesmo que pode ligar um biomarcador da TBI ou um ou mais DVD-lgs de biomarcador de anti-TBI (ou um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou um fragmento de uma variante do mesmo que possa se ligar ao biomarcador do TB), qualquer um dos quais pode ser detectável. Dentro da bolsa de fluido do cartucho está um reagente aquoso que inclui fosfato de p-aminofenol.

[0451]Em operação, uma amostra de um sujeito com suspeita da TBI é adicionada à câmara de retenção do cartucho de teste e o cartucho é inserido no leitor I-STATº. Um elemento da bomba dentro do cartucho empurra a amostra para um conduíte contendo o chip. A amostra é colocada em contato com os sensores, permitindo que o conjugado enzimático se dissolva na amostra. A amostra é oscilada através dos sensores para promover a formação do sanduíche de aproximadamente 2 a 12 minutos. Na penúltima etapa do teste, a amostra é empurrada para uma câmara de resíduos e o fluido de lavagem, contendo um substrato para a enzima fosfatase alcalina, é usado para lavar o excesso de conjugado enzimático e coletar a amostra do chip sensor. Na etapa final do ensaio, o marcador de fosfatase alcalina reage com o fosfato de p-aminofenol para clivar o grupo fosfato e permitir que o p-aminofenol liberado seja oxidado eletroquimicamente no eletrodo de trabalho. Com base na corrente medida, o leitor é capaz de calcular a quantidade de um biomarcador da TB! na amostra por meio de um algoritmo incorporado e de uma curva de calibração determinada pelo fabricante.

[0452]Os métodos e kits conforme descritos neste documento abrangem necessariamente outros reagentes e métodos para a realização do imunoensaio. Por exemplo, são abrangidos vários tampões, como os conhecidos na técnica e/ou que podem ser prontamente preparados ou otimizados para serem empregados, por exemplo, para lavagem, como diluente de conjugado e/ou como diluente de calibrador. Um diluente de conjugado exemplar é o diluente de conjugado ARCHITECTº empregado em certos kits (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) e contendo ácido 2- (N-morfolino)etanossulfônico (MES), um sal, um bloqueador de proteínas, um agente antimicrobiano e um detergente. Um diluente de calibrador exemplar é o diluente de calibrador humano ARCHITECTº empregado em certos kits (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), que compreende um tampão contendo MES, outro sal, um bloqueador de proteínas e um agente antimicrobiano. Além disso, conforme descrito no Pedido de Patente US Nº 61/142.048 depositado em 31 de dezembro de 2008, é possível obter uma melhor geração de sinal, por exemplo, em um formato de cartucho I-STATº, usando uma sequência de ácido nucleico ligada ao anticorpo sinal como sinal amplificador. A adaptação de um cartucho para uso multiplex, como o usado para i-STAT, foi descrita na literatura de patentes, como, por exemplo, a Patente US Nº

6.438.498, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência.

[0453]Os métodos e kits como aqui descritos também podem envolver contagem de molécula única. Em certas modalidades, um método para análise de analito pode envolver a avaliação de um analito presente em uma amostra. Em certas modalidades, a avaliação pode ser usada para determinar a presença e/ou concentração de um analito em uma amostra. Em certas modalidades, o método também pode ser usado para determinar a presença e/ou concentração de uma pluralidade de analitos diferentes presentes em uma amostra.

[0454] Qualquer dispositivo conhecido na técnica que permite a detecção de uma única molécula de um ou mais analitos de interesse pode ser utilizado nos sistemas descritos aqui. Por exemplo, o dispositivo pode ser um dispositivo microfluídico, um dispositivo microfluídico digital (DMF), um dispositivo microfluídico baseado em ondas acústicas de superfície (SAW), um dispositivo integrado de detecção de DMF e analito, um dispositivo integrado de detecção de SAW e analito ou unidade de processamento de ensaios por robótica. Exemplos de outros dispositivos que podem ser usados incluem a Quanterix SIMOA'Y (Lexington, MA), a tecnologia de contagem única de moléculas (SMCTY) da Singulex (Alameda, CA, ver, por exemplo, a patente US Nº 9.239.284, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência), etc.

[0455]Outros métodos de detecção incluem o uso de, ou podem ser adaptados para utilização em um dispositivo de nanoporos ou dispositivo de nanopoços. Exemplos de dispositivos de nanoporos são descritos na Publicação Internacional de Patente Nº WO 2016/161402, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Exemplos de dispositivo de nanopoços são descritos na Publicação Internacional de Patente Nº WO 2016/161400, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[0456]Os métodos e kits como aqui descritos podem envolver espectrometria de massa usando DIA-MS, DDA-MS ou SRM/MRM-MS ou PRM-MS. Em certas modalidades, os métodos para análise de analito podem envolver a avaliação de uma amostra quanto à presença de um analito. Em certas modalidades, a avaliação de uma amostra quanto à presença de um analito pode ser usada para determinar a presença e/ou concentração de um analito ou fragmento em uma amostra. Em certas modalidades, um método também pode ser usado para determinar a presença e/ou concentração de uma pluralidade de diferentes analitos ou fragmentos de analito presentes em uma amostra. A quantificação pode ser realizada usando proteínas de controle interno ou fragmentos peptídicos.

[0457]Enquanto certas formas de realização aqui são vantajosas quando empregues para avaliar a doença, tais como lesão cerebral traumática, os ensaios e kits também podem, opcionalmente, ser empregues para avaliar diversos biomarcadores em outras doenças, distúrbios e condições, conforme apropriado.

[0458]O método de ensaio também pode ser utilizado para identificar um composto que melhora a doenças, tais como lesão cerebral traumática. Por exemplo, uma célula que expressa qualquer um dos vários biomarcadores descritos aqui pode ser contatada com um composto candidato. O nível de expressão de um ou mais destes biomarcadores na célula em contato com o composto pode ser comparado ao de uma célula controle usando os métodos e ensaios aqui descritos.

[0459]A presente divulgação tem vários aspectos, ilustrados pelos seguintes exemplos não limitativos.

15. Exemplos

[0460]Será facilmente evidente para os especialistas na técnica que outras modificações e adaptações adequadas dos métodos da presente divulgação aqui descritas são facilmente aplicáveis e apreciáveis, e podem ser feitas usando equivalentes adequados sem se afastar do escopo da presente divulgação ou os aspectos e modalidades divulgados neste documento. Tendo agora descrito a presente divulgação em detalhes, o mesmo será mais claramente entendido por referência aos seguintes exemplos, que são meramente destinados a ilustrar alguns aspectos e modalidades da divulgação, e não devem ser vistos como limitativos do escopo da divulgação. As divulgações de todas as referências de periódicos, patentes dos EUA e publicações aqui referidas são incorporadas por referência em sua totalidade.

[0461]A presente divulgação tem vários aspectos, ilustrados pelos seguintes exemplos não limitativos.

Exemplo 1 Desenvolvimento de um Esquema de Classificação de Multimodalidade para Lesão Cerebral Traumática

[0462]Este estudo foi direcionado ao desenvolvimento de um esquema de classificação para lesão cerebral que indica a natureza (tipo) e a gravidade da lesão. Os pacientes com trauma foram divididos em três grupos para análise: somente lesão cerebral, somente lesão não cerebral e lesão combinada. Os grupos de trauma com lesão cerebral e sem lesão cerebral foram comparados entre si e com a combinação de trauma cerebral/não cerebral. Estes grupos de trauma foram comparados aos controles sem trauma. O CSF de pacientes com trauma foi comparado ao CSF de pacientes sem trauma. Um objetivo secundário era determinar se alguma das medidas, isoladamente ou em combinação, tinha utilidade como preditor de resultado clínico após a TBI.

[0463]UmM esquema objetivo de classificação de multimodalidade e uma medida de resultado para lesão cerebral traumática foram desenvolvidos com base em várias medidas: 1) biomarcadores sanguíneos; 2) medidas fisiológicas e avaliação; e 3) medidas radiográficas (MRI de CT e 3Tesla (também conhecida como 37)). Os biomarcadores sanguíneos podem indicar quais tipos de células estão danificados (por exemplo, glial vs. neuronal) e a radiografia pode detectar alterações estruturais.

[0464]Local de Estudo: Paciente com trauma foram recrutados no Hennepin County Medical Center (HCMC) no estado de Minnesota. Os participantes incluíram pacientes com trauma de todas as idades que se apresentaram no Departamento de Emergência do HCMC (ED), área de trauma ou como transferência direta para neurocirurgia. Os pacientes com trauma foram excluídos se apresentassem um distúrbio psiquiátrico ou neurológico grave, apresentassem alterações anormais no desenvolvimento ou fossem prisioneiros. Os sujeitos foram identificados pesquisando nos registros médicos todas as admissões de trauma e verificando com o registro de trauma do American College of Surgeons utilizado no hospital.

[0465]Todos os pacientes com trauma foram recrutados para triagem no momento da apresentação e foram submetidos a: 1) um histórico padronizado (modelo) e exame físico; 2) análise dos biomarcadores séricos se o sangue foi coletado para outras indicações; 3) estudo radiográfico conforme clinicamente indicado; 4) acompanhamento conforme indicado clinicamente com 1) a 3); 5) análise de amostra patológica em pacientes que vão apenas à sala de cirurgia; 6) análise do CSF em pacientes que recebem apenas cateteres de ventriculostomia; 7) análise da oxigenação do tecido cerebral em pacientes recebendo apenas Licox; e 8) avaliação de resultados no centro da TBI, conforme clinicamente indicado. No momento da admissão, os participantes potenciais foram submetidos a um processo de triagem de

24 horas (Tabela 2) antes de fornecer o consentimento informado. Tabela 2 Avaliações de Triagem Seleções de Histórico de Trauma Neurocirúrgico e Acordado SCAT3: SAC, SSC-C SCAT3 Infantil: SAC-C, SSS-C RO amsePa OR: Pacientes indo para a sala de cirurgia; VC Pacientes recebendo cateteres de ventriculostomia; Licox: Pacientes recebendo Licox

[0466]Os pacientes que consentiram e controles (pareados por idade e gênero) que foram submetidos ao exposto acima foram submetidos aos seguintes estudos adicionais: 1) triagem genômica, sérica e no CSF; e 2) MRI 3T em circunstâncias selecionadas (marcadores séricos no grupo de teste; marcadores normais no grupo controle). Os pacientes com trauma incluíram todo o espectro, desde lesões não cerebrais, CT negativa a lesões estruturalmente cerebrais, exigindo cirurgia. Pacientes e controles foram recrutados por aproximadamente 15 meses. Os sujeitos sobreviventes ao trauma foram acompanhados até receber alta dos serviços do HCMC. Os sujeitos avaliados no PS e liberados foram convidados para o acompanhamento da pesquisa.

[0467]O processo de triagem incluiu um histórico médico padrão e modelo e exame físico. O modelo era o modelo atual “Histórico de Trauma Cirúrgico e Físico” no EPIC com uma questão adicional que questiona se o paciente sofreu um trauma na cabeça. Se o paciente sofreu o trauma, três seções caíram automaticamente para obter informações adicionais. A primeira foi a informação do modelo de histórico de trauma neurocirúrgico e físico, incluindo grau subaracnóideo, grau de hemorragia,

hemorragia intracerebral e histórico social (nível de educação, emprego, condições de vida e etnia). Os dois últimos foram instrumentos padronizados de avaliação de lesões cerebrais: a Avaliação Padronizada de Concussão (SAC) e o Pontuação de Gravidade dos Sintomas (SSS). Versões pediátricas destas avaliações estavam disponíveis e foram usadas quando indicado. Além disso, a questão da perda de consciência já incluída no modelo “Histórico de Trauma Físico e Cirúrgico” foi copiada nesta seção suspensa com um subconjunto de perguntas que forneciam uma compreensão mais clara do evento de perda de consciência e da orientação atual do paciente. A avaliação clinicamente mais precisa realizada durante as primeiras 24 horas de internação foi usada para análise de dados futuros.

[0468]Os sujeitos sem TBI também foram incluídos com base nos seguintes critérios: ter entre 15 e 50 anos de idade no momento da inscrição; ter características semelhantes à população da TBI em termos de gênero, idade, porte, nível educacional e critérios de verificação; e ser capaz de comunicação e fluência linguística suficientemente claras para permitir que o sujeito forneça consentimento informado por escrito, ou consentimento com a anuência dos pais ou responsáveis para menores de idade, e concluir as avaliações do estudo para participação em todas as partes do estudo. Os sujeitos sem TBI foram excluídos se: foram diagnosticados com TBI leve nos últimos 6 meses; TBI anterior moderada a grave (GCS <13) nos últimos 10 anos; epilepsia com crises recorrentes nos últimos 10 anos; abuso de drogas (exceto maconha) nos últimos 10 anos com base na triagem do DAST-10; abuso de álcool com base na triagem AUDIT-C; distúrbios psiquiátricos primários do Eixo | ou || atuais, exceto distúrbios classificados como menores e que não devem afetar a conduta ou a integridade do estudo; uma história de massa cerebral, neurocirurgia, acidente vascular cerebral, doença da substância branca e/ou demência; uma disfunção cognitiva conhecida ou doença/malformação estrutural do cérebro; uma lesão cerebral estrutural nos achados anteriores de neuroimagem; medicamentos prescritos antipsicóticos/antiepilépticos; tenha sido incapaz (como devido a necessidades urgentes de assistência médica) ou não queira concluir os procedimentos do estudo com precisão ou tenha algum conflito de interesses que possa afetar os resultados do estudo, na opinião do investigador; ou contraindicações à ressonância magnética, incluindo: a. gravidez atual ou suspeita por prática no local; b. outras condições que possam constituir um risco para o sujeito durante a participação no estudo, por investigador; e C. incapacidade de cumprir qualquer parte da política de segurança de MRI do local.

[0469]Colheita e Manipulação de Amostra. Foram obtidos até 40 mL (aproximadamente 3 colheres de sopa) de sangue em cada coleta de amostras. 2 tubos de soro e 2 tubos de plasma foram retirados nos Encontros 1, 24 e 5. No Encontro 3, 2 tubos de soro, 1 tubo de plasma e 1 ou 2 tubos de sangue total foram retirados. Estas amostras do estudo foram processadas, divididas em alíquotas, congeladas e enviadas ao Abbott Laboratories para teste de biomarcadores e armazenamento. As alíquotas de amostra foram enviadas aos locais de teste para testes adicionais de biomarcadores da TBI. Uma amostra foi considerada inestimável para o estudo se: continha volume insuficiente para realizar as medições necessárias, estava grosseiramente hemolisada, lipêmica ou ictérica; não foi coletado no tipo adequado de tubo coletor; não foi devidamente rotulada; ou não foi armazenada adequadamente pelo local de coleta ou pelo Abbott Laboratories.

[0470]As amostras de soro/plasma foram obtidas através de colheita de sangue. Se uma coleta de sangue foi obtida no momento da admissão para fins clínicos, amostras adicionais foram obtidas e retidas para fins de pesquisa. Se o sangue não foi coletado para fins clínicos, pessoal de pesquisa treinado coletou o sangue necessário para a pesquisa. O sangue foi coletado através de punção venosa, a menos que um acesso venoso central fosse exigido pelo padrão de atendimento, caso em que o sangue foi retirado por esse acesso. A primeira coleta de sangue foi realizada na admissão, a segunda 3 a 6 horas após a primeira e a terceira foi realizada 24 horas após o trauma. Esforços de descoberta também estavam em andamento para encontrar marcadores genéticos de suscetibilidade à TBI ou marcadores preditivos da TBIl. Em cada momento, foram coletados 40 mL (menos de 3 colheres de sopa) de sangue: 20 mL de soro (2 tubos) e 20 mL de plasma (2 tubos). Durante o Encontro 1, apenas 2 tubos de soro e 1 tubo de plasma foram coletados para análise de biomarcadores sanguíneos. Esta coleta de sangue total foi de 6,0 mL em um tubo de sangue total. Se um paciente foi inscrito no Encontro 2 em vez do Encontro 1, eles tiveram 2 tubos de soro e 1 tubo de plasma coletados para análise de biomarcadores sanguíneos. Esta coleta de sangue total foi de 6,0 mL em um tubo de sangue total.

[0471]A quantidade de sangue foi tirada limitada de acordo com a tabela padrão NINOS (Tabela 3). O número de tentativas de coleta de sangue foi limitado para crianças com menos de sete anos de idade a duas tentativas. No caso em que a tabela padrão NINOS não permitia a coleta de sangue suficiente para o estudo ou houve duas tentativas fracassadas de coleta de sangue em uma paciente criança, foi solicitado o acesso a outras amostras de sangue coletadas sob o padrão de atendimento clínico para a análise completa de biomarcador neste estudo. Esta coleta de sangue permitiu a análise de até 390 biomarcadores sanguíneos relacionados a lesões cerebrais traumáticas. Tabela 3 Volumes Máximos Totais de Coleta de Sangue Permitidos Peso Peso Volume Volume Volume Hgb Hgb mínimo corporal | corporal | total de máximo máximo mínimo necessário no (Kg) (Ibs) sangue permitido | (clínico + necessário | momento da (mL) (mL) um pesquisa) | no coleta de sangue uma (mL) em momento | seo sujeito tiver coleta de um da coleta | comprometimento sangue (= | período de | de sangue | respiratório/CV 2,5% de 30 dias volume total de sangue 9,0-10,0 7,0 9,0-10,0 83 163 [240 [6 fd 70 [90100

[4 88 [320 8 6 70 [90100 9,0-10,0 le j132 [46 [12 24 9,0-10,0 14 28 9,0-10,0 8 17,6 16 32 7,0 9,0-10,0 le 198 [70 [18 36 9,0-10,0 20 40 9,0-10,0 11-15 24-33 880-1200 | 22-30 44-60 7,0 9,0-10,0 16-20 35-44 1280- 32-40 64-80 7,0 9,0-10,0 1600 21-25 46-55 1680- 42-50 64-100 7,0 9,0-10,0 2000 26-30 [57-66 |2080- 52-60 104-120 )7,0 9,0-10,0 2400 31-35 68-77 2480- 62-70 124-140 7,0 9,0-10,0 2800 36-40 /79-88 |2880- 72-80 144-160 )7,0 9,0-10,0 3200 41-45 90-99 3280- 82-90 164-180 7,0 9,0-10,0 3600 46-50 — | 101-110 | 3680- 92-100 184-200 9,0-10,0 4000 51-55 112-121 | 4080- 102-110 204-220 7,0 9,0-10,0 4400 56-60 — | 123-132 | 4480- 112-120 | 224-240 9,0-10,0 4800 61-65 /134-143 | 4880- 122-130 /244-260 [7,0 9,0-10,0 5200 68-70 145-154 | 5280- 132-140 264-280 9,0-10,0 5600 71-75 |156-185 | 5680- 142-150 — | 284-300 9,0-10,0 6000 76-80 — | 167-176 | 6080- 152-160 /304-360 |7,0 9,0-10,0 6400 81-85 178-187 | 6480- 162-170 324-340 7,0 9,0-10,0 6800 86-90 — | 189-198 | 6880- 172180 344360 9,0-10,0 7200 91-95 — | 200-209 | 7280- 182-190 — | 364-380 9,0-10,0 7600 96-100 /211-220 | 7680- 192-200 384-400 7,0 9,0-10,0 8000

[0472]Além do exame físico inicial, os pacientes que foram enviados para a sala de cirurgia foram submetidos à análise de amostras patológicas, os pacientes que receberam Licox tiveram informações de oxigenação do tecido cerebral registradas e os pacientes que receberam cateteres de ventriculostomia tiveram o CSF coletado para análise. Para análise do CSF, foram coletados 5,0 mL nos mesmos intervalos em que o sangue foi coletado. Estudos radiográficos foram realizados de acordo com o padrão de atendimento. Nenhuma das avaliações realizadas durante os processos de triagem foi analisada com o restante dos dados até que o consentimento informado fosse obtido. Se o paciente não concordou com a pesquisa, as amostras e as avaliações iniciais foram descartadas.

[0473]Depois que os participantes receberam alta, os registos médicos dos pacientes foram acessados para obter informações sobre o curso clínico, incluindo o tempo gasto no ED, quaisquer cirurgias ou outros métodos de neuromonitoramento utilizados, e a avaliação dos resultados de cuidados agudos. Se o paciente passou algum tempo na ICU, as informações também foram extraídas deste período, incluindo dados dos monitores Moberg e nível de intensidade terapêutica diária.

[0474]Os pacientes com trauma foram divididos em três grupos para análise: apenas lesão cerebral, apenas lesão não cerebral e lesão combinada. Dois grupos controle por idade e gênero foram incluídos neste estudo e recrutados no ED: controles sem trauma e CSF. Os controles sem trauma foram aqueles que não sofreram nenhum trauma, e este grupo era composto principalmente por familiares e amigos dos pacientes admitidos por lesão cerebral. Ambos os grupos controle consentiram em passar por uma única avaliação intensiva que incluiu uma coleta de sangue e avaliações cognitivas, neurológicas e de qualidade de vida (SAC, NOS-TBI, QoLABI). Pacientes que receberam ventriculostomia eletiva ou cateteres de drenagem lombar (pré-operatório) consentiram em fazer parte do grupo controle do CSF. Foram coletados 5 mL de CSF do cateter de ventriculostomia dos pacientes deste grupo controle para comparação com o CSF coletado da parte do grupo de estudo que recebeu um cateter de ventriculostomia como parte de seu padrão de atendimento. O grupo controle do CSF também teve a chance de participar da mesma avaliação intensiva dos outros dois grupos controle que incluíram uma coleta de sangue e um escaneamento por MRI 3T.

[0475]Acompanhamento: Todos os pacientes que consentiram em participar da parte de acompanhamento do estudo foram solicitados a retornar ao hospital. Os pacientes que retornaram foram atendidos no Ambulatório de TBI| em 2 semanas, 4 semanas, meses, 6 meses e 1 ano. Se eles não tivessem uma consulta agendada no Ambulatório de TBI, eles teriam um horário marcado para entrar no Laboratório de Pesquisa de Lesões Cerebrais (PL.610) nesses momentos. A Tabela 4 fornece uma linha do tempo para cada uma das avaliações. A coleta de sangue para análise de biomarcadores foi realizada em cada um dos cinco momentos de acompanhamento no mesmo método, conforme descrito acima. A bateria de avaliação de resultados listada nas Tabelas 10 e 11 foi concluída em 3 meses, 6 meses e um ano. Os exames radiográficos que faziam parte do padrão de atendimento foram acessados através dos registros médicos do participante, mas os participantes e controles consentidos selecionados também foram submetidos a exames de MRI 3T em 2 semanas e 6 meses após a lesão cerebral. Cada exame de MRI levou aproximadamente uma hora e incluiu as seguintes sequências de pulso: (1) Localisador sagital curto de TR, (2) Fse axial, (3) FLAIR axial, (4) SWI axial, (5) T2* axial. No caso de os pacientes não terem conseguido entrar no hospital para acompanhamento, foram contatados por telefone três meses e um ano após a lesão para concluir o BT ACT, uma avaliação cognitiva de 15 a 20 minutos projetada para ser administrada por telefone. Tabela 4 Cronograma dos Resultados Coleta |3T |Coleção | Escaneamento | Avaliações | Tempo Total de MRI | de CSF | por CT (minutos) Sangue ADM x X (se 10

RR 2 x x 70 [somar 4 x 10 [Pomar ese TT TO RE) [mes x x 1 ano x x x x 160 (130 sem

ANNA Tabela 5 Avaliações dos Resultados - Não Finalizadas E fa pegam Acordado SCAT3: SSS e SCAT3 Infantil: SAC Relatóro de Filhos & Pais; SAC-C Duração de Duração de Qualidade de Qualidade de Vida: Vida: - Cronograma de - MPAI-4 Classificação Neuropsiquiátrica - Inventário Pediátrico de Qualidade de Vida (Para Crianças e para Procuração) Não Acordado CRS-R (Apenas Grade de Reflexo do o rec Tabela 6 Avaliações Infantis Possíveis Bayley Ill, BSID* 0-3,5 30-90 Desenvolvimento cognitivo, de linguagem (receptivo e expressivo) e motor mais comumente usado em testes para esta faixa etária

BITSEA* 1-3 7-12 Percepção dos pais sobre comportamento social e emocional 17 itens de 42 são para autismo, portanto, podem ser reduzidos

CBCL 1,5-5 25-30 Percepção dos pais sobre o desempenho nas atividades, desempenho social e escolar

MSEL* 1 15 Habilidade

3 25-35 cognitiva e motora 40-60 (motricidade bruta,

recepção visual, motricidade fina, linguagem principalmente para a prontidão para a escola

Shape School* 3-6 45-75 Processos de inibição e comutação: funções executivas

ED A eis Trails-Preschool* 2-6 5-10 Função neuropsicológica: teste avançado de triagem para velocidade psicomotora, atenção complexa, função executiva *Acesso Solicitado

[0476]Plano de Análise Estatísticaa Os dados do biomarcador foram analisados examinando o consumo máximo de concentração para cada biomarcador por paciente, ou pelo tempo a partir de cubetas incidentes, ou ambos. Para abordar o objetivo principal de determinar associações entre as concentrações de biomarcadores no sangue e os dados clínicos de imagiologia de ressonância magnética e neurológica, análises múltiplas foram empregadas. A análise de componentes principais foi usada para examinar quais biomarcadores podem estar explicando a mesma variação ou se um biomarcador estava contribuindo com muito pouca variação. Os biomarcadores foram utilizados em uma análise de regressão logística e alguns biomarcadores foram excluídos com base nos resultados da análise de componentes principais e na contribuição clínica. Um nível de significância de 0,05 foi utilizado para a análise de regressão logística. A análise ROC também foi usada para examinar a capacidade preditiva de cada biomarcador na determinação do estato da ressonância magnética ou nos resultados dos testes neurológicos para esse conjunto de dados. Exemplo 2 Análise DIA-MS

[0477]A espectrometria de massa baseada em descoberta utilizando aquisição independente de dados (DIA-MS) foi realizada em 49 plasmas de sujeitos com TBI leve e controles. Quinze (15) destas amostras foram provenientes de pacientes saudáveis que não apresentavam lesão cerebral traumática conhecida. Das 34 amostras restantes, 33 foram derivadas de pacientes diagnosticados como tendo sofrido lesão cerebral traumática leve (mMTBI), sendo a amostra restante um reservatório de plasma de pacientes diagnosticados como tendo sofrido uma lesão cerebral traumática grave (TBI). As pontuações da GCS para cada um dos pacientes do coorte também foram obtidas, e todas dentro do intervalo normal (com exceção das amostras de TBI grave reunidas). Os escaneamentos por CT foram realizados em um subconjunto de sujeitos e foram incluídas amostras de um sujeito com CT positiva (ver FIG. 1A). As amostras de plasma foram digeridas com tripsina para gerar peptídios que foram analisados usando DIA-MS (as identidades peptídicas estão incluídas abaixo). Todos os peptídios e proteínas quantificáveis foram incluídos. À detecção de GFAP com base em 2 peptídios únicos também foi seletivamente retirada dos dados e incluída na FIG. 1, e os níveis de GFAP avaliados independentemente usando um imunoensaio (ensaio de GFAP baseado em ELISA) também foram incluídos na FIG. 1

[0478]Os métodos acima descritos foram utilizados para identificar biomarcadores de TBI para as várias classes e subclasses da TBI. A Tabela 7 mostra os biomarcadores candidatos da TBI associados a TBI grave (agrupados com a amostra de sSTBI agrupada com níveis detectáveis de GFAP). O SAMP foi infrarregulado no grupo sTBI (e sobrerregulado no grupo controle saudável), e CAND1 e GLO2 foram infrarregulados no grupo STBI (infrerregulado no grupo controle saudável). ERAP1, SYYC, C1IRL e ATPG foram detectados apenas no grupo STBIl e não nos controles saudáveis (isto é, expressão única).

Tabela 7 Biomarcadores Candidatos para TBI Grave

[0479]Análise não supervisionada. A análise de agrupamento não supervisionada foi aplicada aos dados proteômicos obtidos pela DIA-MS para determinar como as amostras de coorte dos pacientes foram agrupadas de acordo com seus perfis proteômicos moleculares, imparciais de qualquer agrupamento clínico. A hipótese nula nesta análise é que os dados proteômicos estão espalhados aleatoriamente em todas as amostras, sem nenhum padrão de agrupamento relacionado à presença ou gravidade de uma TBI. Como mostrado na FIG. 1A, o ramo Controle da análise de agrupamento (agrupamento mais baixo dos cinco grupos) discerniu com êxito 10 de 15 amostras saudáveis de amostras da TBI. Por fim, surgiram quatro sub-agrupamentos adicionais e correspondem às subclasses da TBI leve. Estes dados estão resumidos e descritos abaixo.

[0480]A análise de cluster não supervisionada produziu 5 grupos (Figuras 1A- 1C). Isso inclui um agrupamento de sujeitos “saudáveis” (isto é, agrupamento controle) que consiste nas dez amostras originais designadas como sujeitos saudáveis. Além disso, estes dados e a análise anexa demonstraram a presença de quatro subclasses distintas da TBI leve. Para fins de clareza e diferenciação, foi atribuído um número a cada um destes agrupamentos: o agrupamento da TBI-1 = subclasse 1 da TBI leve; o agrupamento da TBI-2 = subclasse 2 leve da TBI; o agrupamento da TBI-3 = subclasse 3 da TBI leve; e o agrupamento TBI complexa = subclasse 4 da TBI leve (também conhecida como TBI leve “complicada”).

[0481]"Subclasse 1 da TBI leve” (TBI-1) se refere a sujeitos classificados como TBI leve e também exibem uma assinatura de proteoma plasmático diferente de controles (por exemplo, controles saudáveis ou controles que não sofreram TB), diferente de sujeitos com TBIl moderada a grave e diferente de sujeitos com TBI leve de cada uma das subclasses 2, 3 ou 4. “Subclasse 2 da TBI leve” (TBI-2) se refere a sujeitos classificados como tendo leve TBI e também exibem uma assinatura de proteoma plasmático diferente de controles (por exemplo, controles saudáveis ou controles que não sofreram TB), diferente de sujeitos com TBI moderada a grave e diferente de sujeitos com TBI leve de cada uma das subclasses 1, 3 ou 4. “Subclasse 3 da TBI leve” (TBI-3) se refere a sujeitos classificados como TBI leve e também exibem uma assinatura de proteoma plasmático diferente de controles (por exemplo, controles saudáveis ou controles que não sofreram uma TB), diferente dos sujeitos com TBI moderada a grave e diferente de sujeitos com TBI leve de cada uma das subclasses 1, 2 ou 4. “Subclasse 4 da TBI leve" (TBI complexa) se refere a sujeitos classificados como tendo TBI leve e também exibem assinatura de proteoma plasmático diferente de controles (por exemplo, controles saudáveis ou controles que não sofreram TBI), diferente de sujeitos com TBI moderada a grave e diferente de sujeitos com TBI leve de cada uma das subclasses 1, 2 ou 3. Além disso, sujeitos com subclasse 4 da TBI leve exibem uma assinatura de proteoma que se assemelha à assinatura de proteoma obtida de amostras reunidas de sujeitos com TBI grave; portanto, esta subclasse é aqui referida como “TBI leve complicada”. Nos dados aqui divulgados, o agrupamento da subclasse 4 da TBI leve (“TBI complexa”) continha o maior número de sujeitos com níveis elevados de GFAP (com base no ensaio de GFAP com base em ELISA e na espectrometria de massa de GFAP) e o único sujeito com um escaneamento por CT positiva.

[0482]As origens das amostra foram identificadas após a conclusão do agrupamento não supervisionado, e quatro parâmetros-chave foram incluídos separadamente e mostrados na FIG. 1A. Estes parâmetros incluíram uma pontuação do biomarcador Glial (positivo (cinza) (ensaio GFAP baseado em ELISA), negativo

(ausente), zona de limite (branca), inconclusivo ou com falta de informação (cinza claro); uma pontuação no escaneamento por CT (positiva (cinza), negativa (preta) ou não realizada (cinza claro)); um nível de expressão da proteína GFAP obtido usando MS (quantidade numérica entre mais baixo (preto) e mais alto (cinza)); Gênero (masculino (cinza) ou feminino (preto)); e Idade (quantidade numérica entre 20 (preto) e 59 (cinza) anos).

[0483]Com base nesta análise, concluiu-se que a TBI como uma indicação de doença inclui um espectro de estados de danos que podem ser descritos e classificados com base em assinaturas de biomarcadores de TBI. Quatro grupos diferentes foram identificados como correspondendo a quatro subclasses diferentes da TBI leve (Figuras 1B-1C). O agrupamento da TBI complexa representa a subclasse da TBI leve mais grave, pois contém a amostra agrupada da TBI grave, o único sujeito com um escaneamento por CT positiva, o maior número de amostras positivas do biomarcador GFAP (detectadas por imunoensaio) e o maior número de amostras positivas para GFAP (com base nos dados da MS).

[0484]O agrupamento controle representa os sujeitos saudáveis, uma vez que é negativo para todos os marcadores clínicos e bioquímicos e contém exclusivamente amostras de pacientes sem TBI conhecida. Este grupo foi usado como o conjunto de controle saudável para todas as análises subsequentes.

[0485]O agrupamento de TBI-1 representa a subclasse menos grave da TBI leve. Este agrupamento contém algumas amostras controle designadas e amostras com níveis baixos, mas detectáveis de GFAP pela MS. Além disso, como mostrado nas Figuras 1B-1C, a análise de agrupamento não supervisionada levou à identificação de duas subclasses adicionais da TBI leve, o agrupamento da TBIl-2 e o agrupamento da TBI-3. Os grupos TBI-2 e TBI-3 representam agrupamentos discretos que mostraram ser distintos do agrupamento da TBI-1 (menos grave) e do agrupamento da TBI complexa (mais grave).

[0486]Assim, estes dados e a análise que os acompanha demonstram a presença de quatro subclasses distintas da TBI leve.

[0487]Em seguida, estes quatro sub-agrupamentos “não saudáveis” foram comparados com o agrupamento “saudável” (controles), e esta comparação foi expressa como valores de loga[mudança de dobra]. As Tabelas 8A e 8B incluem as identidades das dez proteínas mais diferencialmente reguladas e as dez proteínas mais suprarreguladas, respectivamente, de acordo com os seus valores de log2almudança de dobra].

Tabela 8A Biomarcadores da TBI Diferencialmente Regulados Entre as Subclasses de mTBI e Controle Tabela 8A. As 10 principais proteínas de cada subclasse com as maiores alterações Subclass Subclass Subclass Subclass e4 e2 e e3 /Saudável /Saudável Saudável Saudável UniProtID | log2FCNML | UniProtiD | log2F | UniProtiD | log2F | UniProtiD | log2F | Nome 1 | Nome Cc | Nome [( | Nome Cc da da da da Proteína Proteína Proteína Proteína P29144| |-3,07 075376 | [2,93 Q15746 | |2,26 P29144 | |-3,42 TPP2 NCOR1 MYLK TPP2 OS86VP6 | | 2,67 P29144 | |-2,35 P35908 | | 2,09 O75376 | |2,72 CAND1 TPP2 K22E NCOR1 075376 | | 2,64 P35908 | | 2,03 PO0429 | | 1,67 P23083| |2,07 NCOR1 K22E DNM1L HV103 P35908| | 2,04 Q15746 | | 1,99 O60610 | | 1,66 Q27J81| |-2,01 K22E MYLK DIAP1 INF2 Q15746 | | 1,84 Q96IV4 | |1,98 Q96/U4 | | 1,59 PO1880 | | 1,98 MYLK ABHEB ABHEB 1GHD P49189| |-1,79 PO02743| |-1,82 Q02809 | | 1,49 Q9HO0W9 |-1,94 AL9A1 SAMP PLOD1 CKo54 QI6IU4| |1,72 Q27J81| |-1,75 [Po7814|] [1,42 |/A99683| |-1,75 ABHEB INF2 SYEP M3K5 000429 | | 1,68 Q6UWP8 | 1,71 PO1594 | |-1,41 Q9I6IV4 | |1,75 DNM1L SBSN KV102 ABHEB Q27J81| |-1,67 P49189| |-1,69 |P49189] [-140 [P49189| |-1,65 INF2 AL9A1 AL9A1 AL9A1 PO2743| |-1,60 Q9Y2E5 | |-1,53 P54760 | | 1,38 000429 | | 1,48 SAMP MAZB2 EPHB4 DNM1L Tabela 8B

Biomarcadores da TBI Suprarregulados Entre as Subclasses de mTBI e Controle Subclasse Subclasse Subclasse Subclasse 4 [Saudável 2 1 3 Saudável /Saudável /Saudável UniProtIlD | | log2FC | UniProtiD | log2FC | UniProtiD |log2FC ) UniProtiD | log2FC Nome da | Nome da | Nome da | Nome da Proteína Proteína Proteína Proteína QBEVP6| [2,67 O75376| |2,93 Q15746| [2,26 075376] |2,72 CAND1 NCOR1 MYLK NCOR1 075376 | 2,64 P35908 | |2,03 P35908 | | 2,09 P23083| |2,07 NCOR1 K22E K22E HV103 P35908 | 2,04 Q15746 | |1,99 000429 | | 1,67 PO1880 | |1,98 K22E MYLK DNM1L IGHD Q15746 | 1,84 Q96IU4 | 1,98 O60610 | | 1,66 Q961IU4 | 1,75 MYLK ABHEB DIAP1 ABHEB P96IVA4 | 1,72 QSUWP8 | 1,71 Q96IV4 | |1,59 000429 | | 1,48 ABHEB SBSN ABHEB DNM1L 000429 | 1,68 000429 | | 1,40 Q02809 | | 1,49 PO2768| |1,21 DNM1L DNM1L PLOD1 ALBU QSUWP8| |1,54 O60610 | | 1,33 PO7814| |1,42 P42765| |1,19 SBSN DIAP1 SYEP THIM PO8133 | 1,49 P63167 | [1,30 P54760 | [1,38 PO1877 | |1,13 ANXA6 DYL1 EPHB4 IGHA2 016775 | 1,38 P55786 | 1,28 PO8133 | 1,32 PO1597 | 1,11 GLO2 PSA ANXA6S HV105 PO7814 | 1,380 P54760 | |1,26 Q12805| |1,31 000187 | | 1,09 SYEP EPHB4 FBLN3 MASP2

[0488]Além disso, para diferenciar cada um dos agrupamentos da doença, foi realizada uma análise da estratificação preliminar com base em classes putativas ou na gravidade das subclasses da TBI leve. Comparações pareadas relativas foram realizadas entre cada combinação de agrupamentos “não saudáveis” na ausência do agrupamento controle “saudável”. Estes dados estão resumidos abaixo na Tabela 9 como dez proteínas em cada grupo com a maior magnitude de valores de loga[l mudança de dobra], juntamente com seu ID de UniProt. Tabela 9 Biomarcadores da TBI Diferencialmente Regulados Entre as Subclasses de mTBI

UniProt | log | UniProt | log | UniPro | log | UniPro | log | UniPro | log | UniProt | log I1D| 2F ID] 2F |tD| 2F |tD| 2F |tD| 2F |1ID| 2F Nome |C |Nome |C |Nome |C |Nome |C |Nome |C |Nome |C da da da da da da Protein Protein Protein Protein Protein Protein a a a a a a PO8519 | 1,3 | P8O74 |- P2308 |1,5 | P2308 |2,3 /PO188 | 1,7 | PO1594 | 1,5 IAPOA |1 8|LV30 | 1,5 | 3IHV1 |3 3/HV1 |1 OI/GHD |1 IKV102 | 8 2 4 o3 os B9A06 |- PO159 |1,3 | PO188 | 1,1 | PO159 |1,7 /P1293 |- QIY2H |- 4/GLL |1,1 4lKV10 |5 lollGH 3 [4KVi0|/3 |1/SRC [1,4 |5/PKH [1,2 7 2 D 2 9 A6 6 Q9Y2H | 1,0 | PO186 [0,9 /P0187 |- P4868 |- PO851 | 1,4 | PO1860 | 1,1 5IPKH |1 lolGH |2 [1/GH 0,9 /1/NES |1,5/9/)aPO |2 |/IGHG3|6 A6 G3 M 8 T 4 A PO4220 | 0,9 | P2308 |0,7 | PO422 P1293 |- P2308 | 1,2 | P23083 | 1,1 IMUCB | 8 3/HV10 | 8 Oo|lMUC 1/SRC |1,3 | 3|HV1 |1 IHV103 | O 3 B 5 o3 01379 |0,9 /P2129 |- P1293 |- 04358 |- 04358 |- P13727 |- OJAPO |7 |1/CSR |0,7 |1/SRC [08 |3IDEN |1,2 | 3IDEN |1,1 | |PRG2 [1,0 F P1 6 4 R 9 R 8 8 P13727 [0,8 | POSS8 |0,6 |P0275 |- PO188 | 1,2 | O7536 |- P21291 |- IPRG2 |9 2/1TRF |8 1|/FINC [0,7 [OlIGH |8 8|/SH3 |1,0 | |ESRP [0,9 M 8 D L1 9 1 2 PO02745 | 0,8 | PO719 |0,6 |04358 |- P2352 |- P2914 |- PO02775 |- IC1QA |2 |5/LDH |5 |3IDEN [0,7 |6/SAH |1,2 |4/1TPP |1,0 | |OXCL7 | 0,8 B R 6 H 7 2 7 6 PO4207 [0,8 | P1531 | 0,6 |P2352 |- PO186 |1,1 | PO1O01 |1,0 |/B9AO06 |0,8 IKV308 | O 1/EZRI | 3 6/SAH |0,7 /OIIGH |O 9JANG | 4 4/GLL |6 H 5 G3 T 5 Q1584 |0,7 04339 |- O4386 |- 07536 |- B9A06 |- PO02745 |- 8/ADIP |6 6ITXN |0,6/6/CD5 |0,7 /8/SH3 |1,0 | 4/IGLL | 1,0 | |CIQA |08 Oo L1 2 L 1 Li 6 5 2 o P29144 |- P1806 |- 01584 |- P1965 | 0,9 | Q1379 | 1,0 | PO0338 | - ITPP2 07 |5/BP2 [0,6 |8/ADIP [06 /2)AIA |7 /0OJAPO [1 ||LDHA 08 2 1 Oo 8 G2 F o

[0489]Os dados foram então avaliados em um esforço para identificar as proteínas que eram únicas para cada agrupamento, uma vez que estas potencialmente poderiam ser incluídas como candidatos exclusivos de biomarcadores de TBI para uma determinada subclasse da TBI (Figuras 2A-2C). Cada um dos cinco principais sub-agrupamentos de amostras derivadas da análise de agrupamento não supervisionada continha um mínimo de cinco proteínas expressadas exclusivamente. Estas proteinas podem ser incluídas nas proteínas que são aumentadas exclusivamente em cada subclasse (Tabelas 8 e 9). As figuras 2A-2C incluem proteínas que são compartilhadas e únicas entre agrupamentos de amostras com base em análises não supervisionadas. Cada um dos cinco principais sub- agrupamentos de amostras derivados da análise de agrupamento não supervisionada possui um mínimo de cinco proteínas expressadas exclusivamente. A Figura 2A inclui um diagrama de Venn com proteínas únicas e compartilhadas entre os cinco grupos de subgrupos identificados; e a FIG. 2B inclui uma contagem numérica de proteínas totais e proteínas únicas quantificadas em cada agrupamento de subgrupos. A Figura 2C inclui o UniProt ID e o nome abreviado das proteínas únicas quantificadas em cada agrupamento de subgrupos.

[0490]Análise supervisionada. Uma vez que as análises não supervisionadas cegas foram concluídas, as amostras foram desidentificadas em termos do estado da TBI dos pacientes dos quais foram derivadas. Estas informações adicionais permitiram a execução de várias iterações de análises supervisionadas.

[0491]Na primeira iteração desta análise supervisionada, todas as quantidades de proteínas obtidas nas amostras derivadas da TBI foram comparadas com aquelas das amostras não-TBI (com base nas caracterizações dos pacientes) e as proteínas foram classificadas de acordo com a magnitude de sua expressão diferencial. Isso foi feito de acordo com dois critérios distintos: 1) classificação das proteínas de acordo com a magnitude de sua expressão diferencial, independentemente da direcionalidade da alteração (suprarregulada e infrerregulada); e 2) como as proteínas suprarreguladas se prestam mais favoravelmente à detecção como biomarcador, classifica-se as proteínas de acordo com a magnitude de sua expressão diferencialmente suprarregulada. Estes são candidatos de biomarcadores da TBI de alta probabilidade úteis para distinguir a TBI leve de um controle. Estes dados estão resumidos na Tabela 10 e nas Figuras 2A-2C.

Tabela 10

Análise Supervisionada Entre Amostras da TB! e Controles Saudáveis Tabela 10: Principais alterações na TBIl em comparação com todos os sujeitos saudáveis com base em análise supervisionada Principal proteína diferencial | log2FC Principal proteína log2FC (UniProtID | Nome da suprarregulada (UniProtl|D | o o mete Q27J81 | INF2 -1,15 O00429 | DNM1L 0,98

[0492]As Figuras 3A-3B incluem um gráfico de Venn representativo de proteínas de que são compartilhadas ou únicas entre amostras de pacientes com TB! e saudáveis. Somente as proteínas detectadas em todas as amostras em cada grupo foram incluídas nesta análise (FIG. 3A). A Figura 3B inclui uma lista de 8 proteínas expressadas exclusivamente em todas as amostras da TB, incluindo seu UniProt ID e nome da proteína. AL9A1 e SYTC são expressas no cérebro, enquanto FAS está relacionada à coagulação (ambas as designações são baseadas em informações anotadas da UniProt (uniprot.org)). Estas proteínas mostram expressão aumentada ou única em todas as 34 amostras da TBI, abrangendo todas as subclasses 1 a 3 (TBI-1, TBI-2 e TBI-3) e a subclasse 4 da TBI leve mais grave (TBI complexa), em comparação com o coorte de 15 amostras controle saudáveis (ver Figuras 1 e 2). As figuras 3A-3B representam um agrupamento de alta probabilidade e algumas destas proteínas foram encontradas como parte dos painéis de proteínas dos modelos supervisionados e não supervisionados.

[0493]Além disso, a Tabela 11 abaixo fornece mais de uma abordagem holística para a determinação da TBI em um sujeito, tal como TBI grave, TBI leve ou ausência da TBI. A Tabela 11 inclui proteínas encontradas em todas as classes da TBI usando modelos de diferença.

Tabela 11 Biomarcadores TBI! Comumente Encontrados Tabela 11. Proteínas encontradas na TBI (todas as classes) e comumente

[0494]Análise de floresta de bootstrap. Em outra iteração de análise supervisionada, a Análise de Floresta de Bootstrap foi realizada como uma abordagem alternativa à análise supervisionada tradicional de dados quantitativos de DIA-MS. Esta análise classifica as proteínas de acordo com sua porção contribuinte de um todo e está resumida na Tabela 12.

Tabela 12

Análise de Floresta de Bootstrap de Amostras da TBI e Controles Saudáveis UniProtlD | Nome da | & GM2 Porção Pee Be or oa os oa Loss | oa

EAN oa E eam) asa] os]

EA os —— ea |

ML

[0495]Além de resumir o conjunto de dados geral por meio da Análise de Floresta de Bootstrap, a contribuição de proteínas individuais foi avaliada. Esta abordagem é resumida como um total de cinco árvores de decisão separadas que atendiam aos critérios do modelo de previsão, como mostrado nas Figuras 4A-4E. Esta análise atribuiu um ponto de corte quantitativo à capacidade de uma dada proteína de servir como um biomarcador capaz de distinguir pacientes com TBI de seus colegas saudáveis, juntamente com uma probabilidade de diagnóstico associada. No caso em que uma única proteína era insuficientemente capaz de fazer esta distinção, uma combinação de múltiplas proteínas é identificada e definida.

Exemplo 3 Proteínas de Biomarcadores da TBI e Fragmentos de Peptídios

[0496]As técnicas de espectrometria de massa normalmente envolvem a detecção de íons que sofreram alterações físicas em um espectrômetro de massa. Frequentemente, a mudança física envolve a fragmentação de um fon precursor selecionado e o registro do espectro de massa dos íons fragmentados resultantes. À informação no espectro de massa do íon fragmento é frequentemente uma ajuda útil na elucidação da estrutura do íon precursor. A abordagem geral usada para obter um espectro de espectrometria de massa/espectrometria de massa (MS/MS ou MS?) é isolar um fon precursor selecionado com um analisador m/z adequado, submeter o íon precursor a colisões energéticas com um gás neutro a fim de induzir a dissociação e, finalmente, analisar a massa dos fragmentos de íons de modo a gerar um espectro de massa.

[0497]Como seria reconhecido por um especialista na técnica com base na presente divulgação, estes fragmentos de peptídio usados em DIA-MS (ou DDA-MS) podem ser usados para identificar proteínas/biomarcadores. Mais especificamente, as tabelas a seguir incluem os números de identificação UniProt e nomes abreviados dos vários biomarcadores da TBI identificados e descritos aqui, listados ao lado de suas sequências de fragmentos peptídicos correspondentes.

[0498]Além disso, DIA-MS, DDA-MS e SRM/MRM-MS podem ser utilizadas para quantificação confiável e abrangente de vários analitos peptídicos. A SRM/MRM- MS é geralmente realizada em instrumentos do tipo triplo quadrupolo, nos quais a seletividade aumentada é obtida por dissociação induzida por colisão. É uma técnica de espectrometria de massa sem varredura, na qual dois analisadores de massa (Q1 e Q3) são usados como filtros de massa estáticos, para monitorar um fragmento específico de um precursor selecionado. Em instrumentos de triplo quadrupolo, vários métodos de ionização podem ser utilizados, incluindo, sem limitação, ionização por eletropulverização, ionização química, ionização de elétrons, ionização química de pressão atmosférica e ionização por dessorção a laser assistida por matriz. O par específico de valores de sobrecarga de massa (m/z) associado aos íons precursores e fragmentos selecionados é chamado de “transição”. O detector atua como um dispositivo de contagem para os íons correspondentes à transição selecionada, retornando assim uma distribuição de intensidade ao longo do tempo. MRM-MS é quando várias transições SRM-MS são medidas dentro da mesma experiência na escala de tempo cromatográfica, alternando rapidamente entre os diferentes pares de precursores/fragmentos. Tipicamente, o instrumento triplo quadrupolo percorre uma série de transições e registra o sinal de cada transição em função do tempo de eluição. O método permite a seletividade adicional, monitorando a co-eluição cromatográfica de múltiplas transições para um determinado analito. Os peptídios potenciais estão listados nas Tabelas 13-21 para as diferentes classificações descritas na presente divulgação.

[0499]Além disso, a PMR-MS pode ser usada onde há detecção paralela de todas as transições em uma única análise utilizando um espectrômetro de massa de alta resolução. A PRM-MS fornece alta seletividade, alta sensibilidade e alto rendimento para quantificar o peptídio selecionado (Q1) e, portanto, quantificar as proteínas. Novamente, vários peptídios podem ser selecionados especificamente para cada proteína. A metodologia PRM-MS usa o quadrupolo de um espectrômetro de massa para isolar um fon precursor alvo, fragmenta o íon precursor alvo na célula de colisão e, em seguida, detecta os íons do produto resultantes no analisador de massa Orbitrap. A PRM-MS usa um espectrômetro de massa quadrupolo no tempo de vôo (QTOF) ou Orbitrap quadrupolo híbrido (QOrbitrap) para realizar a quantificação de peptídios/proteínas. Os peptídios potenciais estão listados nas Tabelas 13-21 para as diferentes classificações descritas na presente divulgação.

[0500]Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos podem ser aplicados à quantificação de polipeptídios ou proteínas em amostras biológicas. Qualquer tipo de amostras biológicas compreendendo polipeptídios ou proteínas pode ser o ponto de partida e ser analisado pelos métodos aqui descritos. De fato, qualquer amostra contendo proteína/peptídio pode ser usada e analisada pelos métodos aqui produzidos (por exemplo, tecidos e células). Os métodos aqui também podem ser utilizados com misturas peptídicas obtidas por digestão. A digestão de um polipeptídio ou proteína inclui qualquer tipo de estratégias de clivagem, tais como enzimáticas, químicas, físicas ou combinações das mesmas. De acordo com algumas modalidades, os seguintes parâmetros dos métodos aqui fornecidos são determinados: digestão com tripsina (ou outra protease) e limpeza de peptídios, polipeptídios com melhor resposta, proteínas com melhor resposta, peptídios com melhor resposta, peptídios com melhor resposta, fragmentos com melhor resposta, taxas de intensidade de fragmentos (intensidades de aumento elevado e pico reproduzível), energias de colisão ideais e todos os parâmetros ideais para maximizar a sensibilidade e/ou especificidade dos métodos.

[0501]Em outras modalidades, é desejável a quantificação dos polipeptídios e/ou das proteínas correspondentes ou a atividade/regulação das proteínas correspondentes. Um peptídio selecionado é marcado com um isótopo estável e usado como padrão interno (SIL) para alcançar a quantificação absoluta de uma proteína de interesse. A adição de um análogo peptídico quantificado de marcador estável do marcador à amostra de peptídio em quantidade conhecida; e subsequentemente o marcador e o peptídio de interesse são quantificados por espectrometria de massa e é obtida quantificação absoluta dos níveis endógenos das proteínas.

Tabela 13 Biomarcadores da TBI Rule-ln - Únicos

Única Primário ao UniProt Q

ID

NO PZP PZP HUM | P20742

AN E fi

MAN E fi A

MAN AL9A1 AL9A1 HU | P49189

O A G6P| G6PI HUM | PO6744

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AN FA5 FAS HUM | P12259

AN Lo Pas a BRR a | [PO6TA4 | LAQW Ro 5 | | Po6GTA4 | SEENER 6 |

SK [Po6T44 [INYTEGR OP 68 | | PO6TA4 | SNTPILVDEK | | PO6GTA4 | VWYVSNIDGETHAR | Po67z44 | TLAGLNPESSLFIASK PU pu 12 | PO6744 TFTTQETITNAETAK 13 | PO6TA4 | HEVALSTNTEK 116 PO6744 ELQAAGK 17 | Po67T44 — |[VFEGNRPINSIVETK [Up 18 | E e A

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GTEAAQLR P12259 EKPQSTISGLLGPTLYAEV 22

GDIIK P12259 ADKPLSIHPQGIR 23 [P12259 [LSEGASYLDHTIFPAEK [| Up 24| | P12259 | GTLTEGETAK Pg 125 | | P12259 | QIVLLFAVEDESK Pg 26| P12259 WIISSLTPK 27 [P12259 | SQHLoONFSNAIEK PAR [28

[P12259 | EDGEPR A 29 | P12259 | AVAPGETVAKR jo | P12259 — | AADIEQQAVEAVEDENK a | [P12259-— | SWYLeDNINK 32) LP12259 AMAR | | P12259 — | FTVNNCABPEK 35 | [P12259-— | LESEGAGEFK E 87 | | P12259-— | DPPSDELEEK Sp as | P12259 ss 4) P12259 WHLASEK 41 P12259 FASE as [P12259 | HTHHAPESPR as | LP12259 FTEHPERO A 4) LP12259 SEVERO as E ram A

DDPYK [P12259 | DPEONAAP RO 63 | [P12259 — | NYVIAMEEISWDYSEFVAR [PN 65 | | P12259 — | ETDIEDSDDIPEDTAK Pp 66 | [P12259 — | AEVDDVIOVR 59 | | P12259 | TYEDOSPEWEK je [ME e O

ER P12259 SAE je | P12259 | QHQLGVWPLLPESEK A je5|

R [P12259 — | ASEFLGYWEPR SP 6 [P12259-— | ENQFDPPIVAR ro Tas ANA mn) PT2259 ASS 7 | [P12259 SAE 73 [P12259 VN BA 7a P12259 QWLEIDLLK 75 [P12259 | SYTIHYSEQGVEWRKPR 76

Pa EEN | PT2259 NEN RO 78 Ta Ns 7 | P15311 | EVWYFGLHYVDNK Lo o 8%) P15311 GFPTWLK 81 RISE VS DER 8% | | P15311 | FYPEDVAEELIDITAR Pp es P15311 FGDYNK 84 P15311 |SGYLSSER Rr P15311 DQWEDR 86 [PIS [IQWRHAERBR [o 187] GTDLWLGVDALGENVER NPR) P15311 QQLETEK 89 P15311 LQDYEEK 90 eTSST EEE ea QAVDAQIK PO Tea P15311 | SQEQLAAELAEYTAK Lo] || P15311 IALLEEAR 95 [P15311 | EDEVEEWARR je P15311 OQLLTLSSELSQAR 98 P15311 | IDEFEAL Lo o 9%) o e e 1 2 P20742 LEAGINQLSFPLSSEPIOG 10 SYR 3 4 e e E

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ID

NO NCORT1 NCORT H | 075376 '

UMAN ABHEB ABHEB HU | Q96IU4

MAN ANXA6S ANXA6 HU | PO8133

MAN | DNM1L DNM1L HU | 000429

MAN [| “Fen? FCN2 HUM [| 015485 E)

E E AR DP HBA HBA HUM P69905

AN MYLK MYLK HU | Q15746

MAN SBSN SBSN HU | Q6UWP8

MAN AHNK AHNK HU | Q09666

MAN | je K22E HUM | P35908

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E E 7 000429 INVLAAQYQSLLNSYGEP 27 VDDK 8 a PR E)

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ID

N o: cm em

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MAN Rs e O

MAN DIAP1 DIAP1 HU | O60610

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SN RN o 1 2

EE 3 4 5 6 Tabela 16 Biomarcadores da TBI Rule-ln - Análise de Inicialização Proteína Nome Abreviado Descritor Número de Acesso Primário | SE Unica ao UniProt Q

ID

NO ss age

MAN 1433B 1433B HU | P31946

MAN FIBB FIBB HUM | P02675

AN RS28 RS28 P62857

HUMAN

Lo qr A

HUMAN

NO RR O | Proteína — | Sequência Peptídica E ae E me) pgs o eee E PO02675 HQLYIDETVNSNIPTNLR ss Ee Pã ps PO02675 QGFGNVATNTDGK os ss ee Ep a oem

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TE e PO02743 IVLGQEQDSYGGK a psp o fee

E E Pes e o E 1 2 3 4 SK 5 E a E

K P31946 DNLTLWTSENQGDEGD 96 AGEGEN 7 8 Tabela 17 Biomarcadores da TB! Leve Rule-ln - Únicos Proteína Nome Abreviado Descritor Número de Acesso Primário SE Unica ao UniProt Q

ID

NO [PE DYL1 HUM | P63167

AN FBLN3 FBLN3 HU |Q12805

MAN

N [| InHvio3 HV103 HU | ADAOC4DH29 L)

Lo o MAN pj IGHD IGHD HUM | P01880

AN Lo Proteína — | Sequência Peptídica AOAOC4D | QAPGOR H29 PO1880 EVNTSGFAPARPPPQ 97 PR o 1 2 3 4 6 P55786 LGWDPKPGEGHLDAL 97 LR 7 8 9 o 1 2 3 4 5 6 7 8 9 E os 1

EEE 2 meme E 3 [gu pegam A TINTFR 4 gas ee o e E] Tabela 18 Biomarcadores da TBI Leve Rule-ln - Análise Supervisionada Única ao UniProt e ge

AN o mo esp

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HUMAN | Proteína — | Sequência Peptídica [Pessos — [TYFPHFDLSHGSAQVK — | [998 | Pesos —|FLASVSTVLTISK pie | a amena mm

R [aosses — [DDGVFVAEVTANSPARR f[ [10 [aca666 | SEDGVEGDLGETASR gos [LQAOI666 | TIVER A | aoas66 — | DIDISSPEFK os | aca666 —|LPSGSGAASPTGSAVDIR | = jf108 """"=&=7)> | oacas6s —|AGAISASGPELAGAGHSK | == fg || | | acesse | veesevnvuna og | acases | GLDEGeR o | Lacasss —|GGvavPAVDISSSLEGR | jan | Q09666 AVEVOGPSLESGDHGK 1013 Q09666 VSAPEVSVGHK 1016 [acesse —|GcrarePpsLEGDLELK [| jo | Lacasss | FsvSGAK og | | acases —|vsapevespvkK po Q09666 VDIETPNLEGTLTGPR 1021 Lacas66 — [LESPSEK Up jo

QEa666 ESTO aa oa REVER A [09666 — | VOVSAPDVEAHEPEMNEK PDA oa ESSE OAB Fa EDP OAB | 09666 — | VDIDAPDVDVHGPEWHEK oa

FAB ASPEN OB | 09666 — | IDVTAPDVSIEEPEGK aaa oa VPDVEK OBA Qo9666 — | VGVEVPDVNIEGPEGK 1035 oa ANVISA oa oa ENVIA OB | Q0a666 | APDVEGAGEDWSEK OO oa Ds PK Aa oa PVE OAB Fa EO OAB Fa DES EP OA | 09666 — | VOVEVPDVSLEGPEGK Proa oa ESPE OB oa ADS BK OB Ras EDV O OBR oa VEGERS OB | 09666 — | VDINAPDVEVAGPEWHEK oe oa EV SP OB oa EEE OB oa EEB OB | 09666 — | VDIDAPDVEVHDPDWHEK PS rag Q09666 — | ADIDVSGPSVDTDAPDLDIE 1063

GPEGK | Q09666 — | GEIDASVPELEGEER oa Q09666 — | GDADVSVPK 1065 Fa EE OB oa VPBVIR oB

COPA EDP OB |Looa66S6 | GPELDVK os oa EE OZ Locasss | epvovsvPEvEEK oz

[Qo9666 — | VOVNAPDVQAPDWHEKO or | aoasss — | VDIEGPDVNIEGPEGK or LAa666 | GPEVDIK or | Q09666 — | VDINAPDVGVAGPDWHEK PN ore | 9666 | GEGPDVDVNEPK ore [Aa666 | GDVDVTEPK o [09666 — | VDIDVPDVNVAGPEWHEK ros LQa66s GDS oa [LQ09666 | GPEVDIR O Br Q09666 GPQVDIDVPDVGVAQGPDW 1085

HLK | Qoa666 | ADEDVSGPK o oBB | aoa666 — | VDIDVPDVNTEGPEGK o o | QA9666 — | VDINAPDVDVAGPEWHEK ro | Q09666 — | VOVDVPDVNIEGPRAK PN o LAaB6s EPA o | Qoa666 | IDVDAPDIDIHGPDARK oa Q09666 GDVDVSGPK 1093 [LQOEa666 | APSEDIK od | aoasss | GPEVDVSEPK A o FAaB66 ENTER o LABa666 | ENFSGESK oz [Q09666 | KPDIDITGPK o o [Qos8A6 — [VDINAPDVEVEGK [100 E aeee E

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GPDAK | Qoa666 — | VDIDTPDINTEGSEGK o |

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[Qoa666 EDV a LABa666 | GPEADIK o a | Q9666 | VDINTPDVDVHGPDWHEK ra | | Q09666 — | GEGPDVDVSEPK O LABa666 SPEED a | Apa666 | GREAT az [Q09666 — | LDFEGPRARK Sp a LAaB6s VAPOR AB LQO9666 | IGESGPK O Ba Q09666 LEGGEVDLK 1133

SVGGK [ apa666 | QGFDLNVPGGEIDASEK rs | | Q09666 — | APDVDVNIAGPDAALK ag eae

GLDIK

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EAK LQROA666 EPE A | aoasss | LEGPDVSEK AB LARa666 | VSGPDEDENEK o AB [Q09666 — | ENVGAPDVTER A | aoasss | GPSLQGDLAVSGDIK BO | | aas66 | VSVGAPDLSLEASEGSTK RB | Q09666 GPQVSGELK 1153 [Q09666 | GPEVOVNK o AB | Q9666 | ISAPNVDENEEGPK SS BB LQOA666 | GSEGATEEM BB [09666 — | GSEVGFHGAAPDISVK SB Q09666 GGADVSGGVSAPDISLGEG 1159

HLSVK [09666 | ESEGEWK o | Qoa666 | GPQVSSALNED TS AB Fases MESEK BB LQO9666 | FTESGR [eee

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[aoa666 | FNFSKPKO Bm | Lacsses —|GcevrespeasiseasK | io | | aoa666 —[ASLGSLEGEAMEAEASSPK | == je o | Lacasss | SNSFSDER BB Q09666 EFSGPSTPTGTLEFEGGEV 1170

NESSA RR Lacasee —|FetFreGLesK po Q09666 GHYEVTGSDDETGK 1172 Lacasss | LAGSGVSLASK AB Lotsa85 [vossvorvR NA pe Lats485 BW A Q15485 LGEFWLGNDNIHALTAQGT 1178

RM E A RR | o15485 | VOLVDFEDNYAFARK ÚÚU pÚÂÚÂÚÔ ing Lats485 | GTHGSFANGINVWK PB Q15485 GYNYSYK 1181 Lo1ts485 | GEAGTNEK pino Tabela 19 Biomarcadores da TBI Leve Rule-lh - Análise Não Supervisionada Proteína —| Nome Abreviado Descritor Número de Acesso SE Única Primário ao UniProt Q

ID

NO Om eee

MAN ss geme

AN THIM THIM HUM | P42765

AN

MAN KV105 KV105 HU | P01602

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MAN PLOD1 PLOD1 HU | Q02809 a es see

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MAN e ae

AN PSA PSA HUM |P55786 ARA e

E A | Proteína —| Sequência Peptídica AOAOC4D | QAPGOR n H29 83 84 000187 LASPGFPGEYANDQER n 85 86 87 000187 AGYVLHR A 88 89 WK 90 000187 VEYITGPGVTTYK A 91 000187 NGGAK 1 92 EX) 94 95 96 97 98 99 060610 FQPLLDGLK 12 oo o1 e 02 060610 VOLNVFDEQGEEDSYDLK 12 os o4 os os 060610 LADLAGEK 12 o7

A E O60610 QQIATEK oa

EE E E A

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E

EE see Pc E 33

EE EE TH 34 SR 35 36 P54760 LETADLK 12 37 P54760 WVTFPQVDGQWEELSGL 12 DEEQHSVR 38 39

FR 40 41 42 43 P54760 LGPLSK 12 44 45 R 46 47 48

E E 49 50 51 52 53 P54760 SEAGYGPFGQEHHSQOTA 12 LDESEGWR 54 55 56 57 P54760 GGYTER 12 58 59 ee PD E so ee E e ee E

EEE E eee E am een ÍA

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EEE 73

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E re dE gem E a a Q02809 LVAEWEGQDSDSDAQLFY o TK 91 ms 92

E A a á cm eee Bm a a E a aee o ã meme NAAS E E) e A EEE a WK o6 GN US E) a EmeEm o e

Q12805 SVPSDIFQIQATTIYANTIN 13 TFR 17 18 Q12805 LTIIVGPFSF 13 19 Tabela 20 Biomarcadores da TBI Grave Rule-ln Proteína Nome Abreviado Descritor Número de Acesso Primário | SE Única ao UniProt Q

ID

NO CAND1 CAND1 HU | Q86VP6 |

MAN PA GLO?2 GLO2 HUM | Q16775 |

AN ERAP1 ERAP1 HU | Q9NZO8

MAN [| SYYc SYYC HU |P54577 | |

MAN EN C1IRL C1IRL HUM | Q9NZP8 |

AN ATPG ATPG HU P36542

MAN Sequência Peptídica Pl | || P36542 AGVAGLSAWTLQPQW!I! 18 QVR 20 21 P36542 — | HLLIGVSSDR 22 23 24 P36542 SVISYK 13 P36542 — | ESTTSEQSAR LL 1113)

Lo o" 112) P36542 —|LTLTFNR 13 27

28

29

P54577 | LHLITR 13

31

32

33

34

36

37

38

P54577 — | QVEHPLLSGLLYPGLQA 13 LDEEYLK 39

40

41

42

P54577 | HVLFPLK 43

P54577 | SEFVILR 13 44 cu OS 45

46

47

P54577 —|LLDPIR 13 48

49

P54577 — | LASAAYPDPSK 50

51

P54577 — | INTVEK Lo dl 18)

Lo 8) ge | 53 54 55 P54577 — | QVEPLDPPAGSAPGEHV 13 FVK 56 57

EE E 58 59 Q16775 |LTTVLTTHHHWDHAGG 13 NEK 60 o IA 61 62

RA E RN 63 64 Q16775 | ALLEVLGR 65 o 66 67 68 QB86VP6 | LTSAIAK 69 OBEVP6 | IGEYLEK 13 7O 71 A a 72 73 Q86VP6 | ALTLIAGSPLK | | 74 R 75 Q86VP6 | LGTLSALDILIK 76 SA a RR 77 QB6VP6 | ISGSILNELIGLVR Lo | 113)

Lo o 178)| A re 79 80 81 OB6VP6 | LLALLSLGEVGHHIDLSG 13 QLELK 82 83 84 QBEVP6 | EIISSASVVGLKPYVENI 13 WALLLK 85 86 87 88

E E OR 89 90 QB86VP6 | VALVTFNSAAHNKPSLIR 91 E o 92 93 94 QB86VP6 | DHYDIK 95 OB6VP6 | LVEPLR 13 96 97 ame eee E 98 99 oo Q9NZ08 | VEITASQPTSTIILHSHHL 14 QISR o1 Q9NZO08 | LSEEPLQVLEHPR o2 am o3 Q9NZO8 | ASFSIK LL | 1)

NS RD E e eee A

E E A

SR E Se RR E Se E e gs A VK n

E E eee E TFITSK 13 gs em A ge fem Se pa ge om [RR A A, Q9NZ08 | NPVGYPLAWQFLR a PR A AE,

E e E YPEPYGK 26 ge ER E [FR OT, [ERP TIRSS Ha

ENS RR O E

E 31 Q9NZP8 | GFLALYQTVAVNYSQPIS 14 EASR 32 33

LGNFPWOAFTSIHGR 34

E A A 36 37 Q9NZP8 VLSYVDWIK 14 38 Tabela 21 Biomarcadores da TBI Rule-Out Proteína Nome Abreviado Descritor Número de Acesso SE Unica Primário ao UniProt Q

ID

NO ACTBL ACTBL HU | Q562R1 '

MAN ALDH2 ALDH2 HU | PO5091

MAN ANXAS5 ANXAS HU | PO8758

MAN CAMP CAMP HU | P49913

MAN CPNE3 CPNE3 HU | 075131

MAN CRAC1 CRAC1 HU | QINQ79

MAN CYrTC CYTC HU |PO01034

MAN DNPEP DNPEP HU | Q9ULAO

MAN EIF3I EIF3l HUM | 013347

AN ss E

MAN ICAM1 ICAM1 HU | Po5362

MAN HV323 HV323 HU | PO01764

MAN HNRPD HNRPD H |Q14103

UMAN

KVD33 KvVD33 HU | Po1593

MAN AL LL

N || FHR4 HUM | 092496 | |

AN FRPD1 FRPD1 HU | QS5sYBO

MAN HS90B HS90B HU | Po8238

MAN MAZA1 MAZA1 HU | 016706

MAN PCYOX PCYOX H | Qa9uHG3

UMAN PNPH PNPH HU | Poo4e1

MAN PROC PROC HU | Po4070

MAN

N SH3L3 SH3L3 HU | Q9H299

MAN SRRM2 SRRM2 H | Q9UA35

UMAN TBB1 TBB1 HUM | Q9H4B7

AN TENA TENA HU |P24821

MAN TRAP1 TRAP1 HU | Q12931

MAN o | Proteína —| Sequência Peptídica 39

IA 41 O75131 [TGRPAGK 14 42 43 a a 44 O75131 | NNLNPVWRPFK 14 45 a 46 075131 | LYGPTNFSPIINHVAR PR] 47 A a AR 48 O75131 | SPLGEVAIR 14 49

PO0491 LTQAQIFDYGEIPNFPR PE) 52

53

54

PO0491 | VFHLLGVDTLVVTNAAGG 14 LNPK 55

56

57

Po04971 — | ALSTWK 14 58

59

60

61

62

63

64

Poo740 | NSADNK 14 65

66

67

POO740 — | VWGGEDAKPGQFPWAQVV 14 LNGK 68

69

7O

71

72

73

POO740 — | VPLVDR 14 74

75

SE SEE O FS ese OE ee PO1764 GLEWVSAISGSGGSTYYA DSVK 79

TR A

E E E e E

RE HA e e SS ame E e

E

E RA 5 eee E SSR 89

ET A A o e

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SS EE DO TE E e E e E e A EE TA Hã E fee A E Hã E EA o E fome E E e E eme A

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E E E E

E E E eee E E ge EM e E pp aeee | 18 27

PO8758 QVYEEEYGSSLEDDVVG 15 DTSGYYOR 34

PO8758 DPDAGIDEAQVEQDAQAL 15 FOAGELK 35

36

37

38

39

40

41

P24821 QSGVNATLPEENQPVVF 15 NHVYNIK 42

43

P24821 VPGDQTSTIIQELEPGVEY 15 FIR 44

45

46

47

P24821 ETSVEVEWDPLDIAFETW 15 EIIFR 48

49

50

51

52

53 eme DE 54

E 55 P24821 — | YAPISGGDHAEVDVPK PR] 56 A e E 57 P24821 | TTLTGLRPGTEYGIGVSA 15 vK 58

E 59

E DI OR 60 61 Ae E 62 63 P24821 —|ASTEQAPELENLTVTEVG 15 WDGLR 64 P24821 — | LNWTAADQAYEHFIIQVO 15 EANK 65 66 A e LE 67 68 A a E 69

EEE OR 7O 71 P24821 — | LNWTAADNAYEHFVIQVQ 15 EVNK 72 73 eee A 74 75

FE E 76 77 P24821 | TAHISGLPPSTDFIVYLSG 15 LAPSIR 78 79

P24821 AEIVTEAEPEVDNLLVSDA 15 TPDGFR 80 Ss O E 81 82 E ee E 83 84 E e 85 P24821 WQPAIATVDSYVISYTGE 15 K 86 P24821 VPEITR 15 87 P24821 TVSGNTVEYALTDLEPAT 15 EYTLR 88 89

E EE E 90 P24821 DLTATEVOSETALLTWRP 15 PR 91 92 P24821 EVIVGPDTTSYSLADLSPS 15 THYTAK 93 94 E e A 95

RR E 96 97

FR 98 99 E Re A oo o1 P24821 GAFWYR 16 o2 os 04 os o6 E e A o7 o8 P39023 IGOGYLIK 16 o9 1

E E A 12 13 Ro A 14

RE 16 17 18 e A 19

A 21

E O HA 22 P48637 AIEHADGGVAAGVAVLDN 16 PYPV 23 e FR A 24 e 26 27 P48637 TPAVHR 16 28 29

RB A Pp 31

P48637 AWELYGSPNALVLLIAQE 16 K 32

ER 33 34

RE A 36 e A 37 o RR A 38 012931 LLDIVAR 16 39 012931 SLYSEK 16 40 41 42 43 012931 EFSSEAR 16 44 e a 45 46 ge ee A 47 FE Hi 48 012931 TDAPLNIR 16 49 50 51 012931 ATDILPK 16 52 53 e es 54 55 Eee E 56 012931 YESSALPSGQLTSLSEYA 16 SR 57

Se DT 58

FE 59 60 o 61 62 e se E 63 o 64 012931 EEPLHSIISSTESVOGSTS 16 K 65 Q13347 SITQIK 16 66 67 gr eee E 68 69

TO 71 72 ss E 73 74 75 ee o E 76 77 e 78 Q14103 LDPITGR 16 79 Q14103 ESESVDK 16 80 81

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[0502]Entende-se que a descrição detalhada acima e os exemplos anexos são meramente ilustrativos e não devem ser tomados como limitações ao escopo da divulgação, que é definido apenas pelas reivindicações anexas e seus equivalentes.

[0503]Várias alterações e modificações nas modalidades divulgadas serão evidentes para os especialistas na técnica. Tais mudanças e modificações, incluindo, sem limitação, aquelas relacionadas às estruturas químicas, substituintes, derivados, intermediários, sínteses, composições, formulações ou métodos de uso da divulgação, podem ser feitas sem se afastar do espírito e escopo da mesma.

[0504]Por razões de completude, vários aspectos da divulgação são estabelecidos nas seguintes cláusulas numeradas:

[0505]Cláusula 1. Um método para medir ou detectar pelo menos um biomarcador, o método compreendendo: testar uma amostra obtida de um sujeito; e medir ou detectar pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado do grupo que consiste em AL9A1, ATPG, C1RL, CAND1, EPIPL, GLO?2, IGHA?2, PZP, SYTC, SYYC ou qualquer combinação dos mesmos na amostra; e/ou medir ou detectar pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado do grupo que consiste em ABHEB, AL9A1, DNM1L, FCN2, INF2, K22E, M3K5, NCOR1, SBSN, SYEP, TPP2 ou qualquer combinação dos mesmos na amostra; em que a medição ou detecção de pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu ou pode ter sofrido uma lesão cerebral traumática (TBI).

[0506]Cláusula 2. O método da cláusula 1, em que pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo que consiste em AL9A1, ATPG, C1IRL, EPIPL, IGHA2, PZP, SYTC, SYYC ou qualquer combinação dos mesmos; e em que o pelo menos um biomarcador não é detectável em uma amostra obtida de um sujeito saudável.

[0507]Cláusula 3. O método de qualquer da cláusula 1 ou cláusula 2, em que o pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado a partir do grupo que consiste em ATPG, C1RL, SYYC, ou quaisquer combinações dos mesmos.

[0508]Cláusula 4. O método da cláusula 1, em que o pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo que consiste em CAND1, GLO?2, ou a combinação dos mesmos, em que os níveis de CAND1 e GLO2 são mais altos em comparação aos níveis de CAND1 e GLO2 em uma amostra obtida de um sujeito saudável.

[0509]Cláusula 5. O método da cláusula 1, em que o pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado a partir do grupo que consiste em ABHEB, AL9A1, DNM1L, ou suas combinações; em que os níveis de ABHEB são mais altos em comparação com os níveis de ABHEB em uma amostra obtida de um sujeito saudável; e/ou em que os níveis de AL9A1 e DNM1L são mais baixos em comparação com os níveis de AL9A1 e DNM1L em uma amostra obtida de um sujeito saudável.

[0510]Cláusula 6. O método da cláusula 1, em que pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo que consiste em M3K5, SBSN, SYEP ou combinações dos mesmos; e em que a medição ou detecção de pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu ou pode ter sofrido uma TBI leve.

[0511]Cláusula 7. O método da cláusula 1 ou cláusula 6, em que os níveis de SBSN e SYEP são mais altos em comparação com os níveis de SBSN e SYEP em uma amostra obtida de um sujeito saudável; e/ou em que os níveis de M3K5 são mais baixos em comparação com os níveis de M3K5 em uma amostra obtida de um sujeito saudável.

[0512]Cláusula 8. O método da cláusula 1, em que pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo que consiste em INF2, SYEP ou combinações dos mesmos.

[0513]Cláusula 9. O método da cláusula 1, em que o pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo compreende ainda pelo menos um biomarcador selecionado do grupo que consiste em ANXA6, ERAP1, EZRI, FAS, G6PI, MYLK, SAMP ou combinações dos mesmos.

[0514]Cláusula 10. Um método para medir ou detectar pelo menos um biomarcador, o método compreendendo: testar uma amostra obtida de um sujeito; e medir ou detectar pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado do grupo que consiste em 1433G, ACK1, ACY1, AKA12, ARGI1, CADH5, CLH1, COPG2, DPOD2, DSG2, HV307, IQGA2, KIC14, KIC19, KV105, LAMC1, MDHM, NQO2, PERM, PLST, PNCB, PTPRC, SEPT7, SYRC, TRXR2, TXNL1, UGGG1, WDR1 ou quaisquer combinações dos mesmos na amostra; em que a medição ou detecção de pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu ou pode ter sofrido uma lesão cerebral traumática leve (mTBI).

[0515]Cláusula 11. O método da cláusula 10, em que o pelo menos um biomarcador não é detectável em uma amostra obtida de um sujeito saudável.

[0516]Cláusula 12. O método da cláusula 10, em que o pelo menos um biomarcador não é detectável em uma amostra obtida de um sujeito que sofreu uma TBI grave (sTBI).

[0517]Cláusula 13. O método de qualquer uma das cláusulas 10 a 12, em que o pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo que consiste em ACK1, ACY1, PLST, PNCB, PTPRC, UGGG1 ou qualquer combinação dos mesmos na amostra; em que a medição ou detecção de pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu ou pode ter sofrido uma mTBI da subclasse 1.

[0518]Cláusula 14. O método de qualquer uma das cláusulas 10 a 12, em que o pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo que consiste em AKA12, HV307, PERM, KV105, NQO2, SEPT7, SYRC, TRXR2 ou quaisquer combinações dos mesmos na amostra; em que a medição ou detecção de pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu ou pode ter sofrido uma mTBI da subclasse 2.

[0519]Cláusula 15. O método de qualquer uma das cláusulas 10 a 12, em que o pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo que consiste em 1433B, ARGI1, CADH5, CLH1, COPG2, DPOD?2, DSG2, IQGA2, K1C14, LAMC1, MDHM, TXNL1 ou qualquer combinação dos mesmos na amostra; em que a medição ou detecção de pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu ou pode ter sofrido uma mTBI da subclasse 3.

[0520]Cláusula 16. O método da cláusula 10, em que o pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo compreende ainda pelo menos um biomarcador selecionado do grupo que consiste em AHNK, AL1A1, AMPN, CAPZB, CATD, CLIP2, CMGA, FSCN1, GMPR2, GRP78, GSH1, IDHC, K1C20, KRR1, MBL2, NTF2, PCBP?2, PGK1, SAA1, TFR1 ou combinações dos mesmos.

[0521]Cláusula 17. Um painel de biomarcadores para determinar o estato de lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito, compreendendo pelo menos um dos seguintes biomarcadores: TPP2, CAND1, NCOR1, K22E, AL9A1, ABHEB, DNMI1L, INF2 ou quaisquer combinações dos mesmos; em que a medição ou detecção de pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu ou pode ter sofrido uma TBI leve da subclasse 4.

[0522]Cláusula 18. O painel de biomarcadores da cláusula 17, em que os níveis de CAND1, NCOR1, K22E, ABHEB e DNM1L são mais altos em comparação com os níveis de CAND1, NCOR1, K22E, ABHEB e DNM1L em uma amostra obtida de um sujeito saudável; e/ou em que os níveis de TPP2, AL9A1 e INF2 são mais baixos em comparação com os níveis de TPP2, AL9A1 e INF2 em uma amostra obtida de um sujeito saudável.

[0523]Cláusula 19. Um painel de biomarcadores para determinar o estato de lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito, compreendendo pelo menos um dos seguintes biomarcadores: TPP2, NCOR1, HV103, INF2, IGHD, CKO054, M3K5, ABHEB, AL9A1, DNM1L ou qualquer combinação dos mesmos; em que a medição ou detecção do pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu ou pode ter sofrido uma TBI leve da subclasse 3.

[0524]Cláusula 20. O painel de biomarcadores da cláusula 19, em que os níveis de NCOR1, HV103, IGHD, ABHEB e DNM1L são mais altos em comparação com os níveis de NCOR1, HV103, IGHD, ABHEB e DNM1L em uma amostra obtida de um sujeito saudável; e/ou em que os níveis de TPP2, IGHD, CKO54, M3K5 e AL9A1 são mais baixos em comparação com os níveis de TPP2, IGHD, CK054, M3K5 e AL9A1 em uma amostra obtida de um sujeito saudável.

[0525]Cláusula 21. Um painel de biomarcadores para determinar o estato de lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito, compreendendo pelo menos um dos seguintes biomarcadores: NCOR1, TPP2, K22E, ABHEB, INF2, SBSN, AL9A1, MAZB2 ou quaisquer combinações dos mesmos; em que a medição ou detecção do pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu ou pode ter sofrido uma TBI leve da subclasse 2.

[0526]Cláusula 22. O painel de biomarcadores da cláusula 21, em que os níveis de NCOR1, K22E, ABHEB e SBSN são mais altos em comparação com os níveis de NCOR1, K22E, ABHEB e SBSN em uma amostra obtida de um sujeito saudável; e/ou em que os níveis de TPP2, INF2, ALGA1 e MAZB2 são mais baixos em comparação com os níveis de TPP2, INF2, AL9A1 e MA2B2 em uma amostra obtida de um sujeito saudável.

[0527]Cláusula 23. Um painel de biomarcadores para determinar o estato de lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito, compreendendo pelo menos um dos seguintes biomarcadores: K22E, DNM1L, DIAP1, ABHEB, PLOD1, SYEP, KV133, AL9A1, EPHBA4, ou qualquer combinação dos mesmos; em que a medição ou detecção de pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu ou pode ter sofrido uma TBI leve da subclasse 1.

[0528]Cláusula 24. O painel de biomarcadores da cláusula 23, em que os níveis de K22E, DNM1L, DIAP1, ABHEB, PLOD11, SYEP e EPHB4 são mais altos em comparação com os níveis de K22E, DNM1L, DIAP1, ABHEB, PLOD1, SYEP e EPHB4 em uma amostra obtida de um sujeito saudável; e/ou em que os níveis de KV133 e AL9A1 são mais baixos em comparação com os níveis de KV133 e AL9GA1 em uma amostra obtida de um sujeito saudável.

[0529]Cláusula 25. O método da cláusula 1, em que o pelo menos um biomarcador ou um fragmento do mesmo compreende ainda, pelo menos, um biomarcador selecionado a partir do grupo que consiste em MYLK, SAMP, ou uma combinação dos mesmos.

[0530]Cláusula 26. Um painel de biomarcadores para determinar o estato de lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito, compreendendo pelo menos um dos seguintes biomarcadores: CAND1, NCOR1, K22E, ABHEB, DNM1L, SBSN, GLO?, SYEP ou quaisquer combinações dos mesmos; em que a medição ou detecção de níveis mais altos de pelo menos um biomarcador no sujeito, em comparação com os níveis de pelo menos um biomarcador em um sujeito saudável, indica que o sujeito sofreu ou pode ter sofrido uma TBI leve da subclasse 4.

[0531]Cláusula 27. Um painel de biomarcadores para determinar o estato de lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito, compreendendo pelo menos um dos seguintes biomarcadores: NCOR1, HV103, IGHD, ABHEB, DNM1L, ALBU, THIM, IGHA2, KV139 e, ou qualquer combinação dos mesmos; em que a medição ou detecção de níveis mais altos de pelo menos um biomarcador no sujeito, em comparação com os níveis de pelo menos um biomarcador em um sujeito saudável,

indica que o sujeito sofreu ou pode ter sofrido uma TBI leve da subclasse 3.

[0532]Cláusula 28. Um painel de biomarcadores para determinar o estato de lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito, compreendendo pelo menos um dos seguintes biomarcadores: NCOR1, K22E, ABHEB, SBSN, DNM1L, DIAP1, DYL1, PSA, EPHBA, ou qualquer combinação dos mesmos; em que a medição ou detecção de níveis mais altos de pelo menos um biomarcador no sujeito, em comparação com os níveis de pelo menos um biomarcador em um sujeito saudável, indica que o sujeito sofreu ou pode ter sofrido uma TBI leve da subclasse 2.

[0533]Cláusula 29. Um painel de biomarcadores para determinar o estato de lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito, compreendendo pelo menos um dos seguintes biomarcadores: K22E, DNM1L, DIAP1, ABHEB, PLOD1, SYEP, EPHBA, FBLN3 ou quaisquer combinações dos mesmos; em que a medição ou detecção de níveis mais altos de pelo menos um biomarcador no sujeito, em comparação com os níveis de pelo menos um biomarcador em um sujeito saudável, indica que o sujeito sofreu ou pode ter sofrido uma TBI leve da subclasse 1.

[0534]Cláusula 30. O método da cláusula 10, em que o pelo menos um biomarcador ou um fragmento do mesmo compreende ainda, pelo menos, um biomarcador selecionado a partir do grupo que consiste em ANXA6, MASP2, MYLK, SAMP, ou uma combinação dos mesmos.

[0535]Cláusula 31. Um painel de biomarcadores para determinar que um sujeito não sofreu lesão cerebral traumática (TBI), compreendendo pelo menos um dos seguintes biomarcadores: ACTBL, ALDH2, ANXA5, CAMP, CPNE3, CRAC1, CYTC, DNPEP, EIF3l, GSHB, ICAM1, HV323, HNRPD, KVD33, FA9, FHRA4, FRPD1, HS90B, MAZ2A1, PCYOX, PNPH, PROC, RL3, SH3L3, SRRM2, TBB1, TENA, TRAP1 ou qualquer combinação dos mesmos; em que a medição ou detecção de pelo menos um biomarcador no sujeito indica que o sujeito não sofreu uma TBI.

[0536]Cláusula 32. Um método para medir ou detectar pelo menos um biomarcador, o método compreendendo: obter uma amostra de um sujeito após um traumatismo craniano real ou suspeito; e medir ou detectar pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado do grupo que consiste em AL9A1, ATPG, C1IRL, CAND1, EPIPL, GLO2, IGHA2, PZP, SYTC, SYYC ou qualquer combinação dos mesmos na amostra; e/ou medir ou detectar pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado do grupo que consiste em ABHEB, AL9A1, DNM1L, FCN2, INF2, K22E, M3K5, NCOR1, SBSN, SYEP, TPP2 ou qualquer combinação dos mesmos na amostra.

[0537]Cláusula 33. O método, de acordo com a cláusula 32, em que a medição ou detecção de pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu uma lesão cerebral traumática (TBI).

[0538]Cláusula 34. O método, de acordo com a cláusula 32 ou cláusula 33, em que pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado a partir do grupo que consiste em AL9A1, ATPG, C1RL, EPIPL, IGHA2, PZP, SYTC, SYYC ou quaisquer combinações dos mesmos; e em que o pelo menos um biomarcador não é detectável em uma amostra obtida de um sujeito saudável.

[0539]Cláusula 35. O método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 32 a 34, em que o pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado a partir do grupo que consiste em ATPG, C1RL, SYYC, ou quaisquer combinações dos mesmos.

[0540]Cláusula 36. O método, de acordo com a cláusula 32 ou cláusula 33, em que pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado a partir do grupo que consiste em CAND1, GLO2 ou a combinação dos mesmos; e em que os níveis de CAND1 e GLO?2 são mais altos em comparação com os níveis de CAND1 e GLO2 em uma amostra obtida de um sujeito saudável.

[0541]Cláusula 37. O método, de acordo com a cláusula 32 ou cláusula 33, em que pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo que consiste em ABHEB, AL9A1, DNM1L ou combinações dos mesmos; em que os níveis de ABHEB são mais altos em comparação com os níveis de ABHEB em uma amostra obtida de um sujeito saudável; e/ou em que os níveis de AL9A1 e DNM1IL são mais baixos em comparação com os níveis de AL9A1 e DNM1L em uma amostra obtida de um sujeito saudável.

[0542]Cláusula 38. O método, de acordo com a cláusula 32 ou cláusula 33, em que pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado a partir do grupo que consiste em M3K5, SBSN, SYEP ou combinações dos mesmos; em que os níveis de SBSN e SYEP são mais altos em comparação com os níveis de SBSN e SYEP em uma amostra obtida de um sujeito saudável; e/ou em que os níveis de M3K5 são mais baixos em comparação com os níveis de M3K5 em uma amostra obtida de um sujeito saudável.

[0543]Cláusula 39. O método, de acordo com a cláusula 32 ou cláusula 33, em que pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado a partir do grupo que consiste em INF2, SYEP ou combinações dos mesmos.

[0544]Cláusula 40. O método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 32 a 39, em que pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo compreende ainda pelo menos um biomarcador selecionado do grupo que consiste em ANXA6, ERAP11, EZRI, FA5, G6PI, MYLK, SAMP, ou combinações dos mesmos.

[0545]Cláusula 41. O método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 32 a 39, em que pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo compreende ainda pelo menos um biomarcador selecionado do grupo que consiste em MYLK, SAMP ou uma combinação dos mesmos.

[0546]Cláusula 42. Um método para medir ou detectar pelo menos um biomarcador, em que compreende: obter uma amostra de um sujeito após uma lesão na cabeça real ou suspeita; e medir ou detectar pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado a partir do grupo que consiste em 1433G, ACK1,

ACY1, AKA12, ARGI1, CADH5, CLH1, COPG2, DPOD2, DSG2, HV319, IQGA?, K1C14, KIC19, KV105, LAMC1, MDHM, NQO2, PERM, PLST, PNCB, PTPRC, SEPT7, SYRC, TRXR2, TXNL1, UGGG1, WDR1 ou quaisquer combinações dos mesmos na amostra.

[0547]Cláusula 43. O método, de acordo com a cláusula 42, em que a medição ou detecção de pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu uma lesão cerebral traumática (TBI).

[0548]Cláusula 44. O método, de acordo com a cláusula 42 ou cláusula 43, em que o pelo menos um biomarcador não é detectável em uma amostra obtida de um sujeito saudável.

[0549]Cláusula 45. O método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 42 a 44, em que o pelo menos um biomarcador não é detectável em uma amostra obtida de um sujeito que tenha sofrido uma TB! grave.

[0550]Cláusula 46. O método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 42 a 44, em que pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado a partir do grupo que consiste em ACK1, ACY1, PLST, PNCB, PTPRC, UGGG1 ou qualquer combinação dos mesmos na amostra; em que a medição ou detecção de pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu uma TBI leve da subclasse 1.

[0551]Cláusula 47. O método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 42 a 44, em que pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo que consiste em AKA12, HV319, PERM, KV105, NQO2, SEPT7, SYRC, TRXR2 ou quaisquer combinações das mesmas na amostra; em que a medição ou detecção de pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu uma TBI leve da subclasse

2.

[0552]Cláusula 48. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 42 a 44, em que pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado a partir do grupo que consiste em 1433B, ARGI1, CADH5, CLH1, COPG2, DPOD?2,

DSG2, IQGA2, KIC14, LAMC1, MDHM, TXNL1 ou qualquer combinação dos mesmos na amostra; em que a medição ou detecção de pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu uma TBI leve da subclasse 3.

[0553]Cláusula 49. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 42 a 48, em que pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo compreende ainda pelo menos um biomarcador selecionado do grupo que consiste em AHNK, AL1A1, AMPN, CAPZB, CATD, CLIP2, CMGA, FSCN1, GMPR2, GRP78, GSH1, IDHC, K1C20, KRR1, MBL2, NTF2, PCBP2, PGK1, SAA1I, TFR1 ou combinações dos mesmos.

[0554]Cláusula 50. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 42 a 48, em que pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo compreende ainda pelo menos um biomarcador selecionado do grupo que consiste em ANXA6, MASP?2, MYLK, SAMP ou uma combinação dos mesmos.

[0555]Cláusula 51. Um painel de biomarcadores para determinar o estato de lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito, compreendendo pelo menos um dos seguintes biomarcadores: TPP2, CAND1, NCOR1, K22E, AL9A1, ABHEB, DNM1L, INF2 ou quaisquer combinações dos mesmos; em que a medição ou detecção do pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu uma TBI leve da subclasse 4.

[0556]Cláusula 52. O painel de biomarcadores, de acordo com a cláusula 51, em que os níveis de CAND1, NCOR1, K22E, ABHEB e DNM1L são mais altos em comparação com os níveis de CAND1, NCOR1, K22E, ABHEB e DNM1L em uma amostra obtida de um sujeito saudável; e/ou em que os níveis de TPP2, AL9A1 e INF2 são mais baixos em comparação com os níveis de TPP2, AL9A1 e INF2 em uma amostra obtida de um sujeito saudável.

[0557]Cláusula 53. Um painel de biomarcadores para determinar o estato de lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito, compreendendo pelo menos um dos seguintes biomarcadores: TPP2, NCOR1, HV103, INF2, IGHD, CKO54, M3K5,

ABHEB, AL9A1, DNM1L ou qualquer combinação dos mesmos; em que a medição ou detecção do pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu uma TBlI leve da subclasse 3.

[0558]Cláusula 54. O painel de biomarcadores, de acordo com a cláusula 53, em que os níveis de NCOR1, HV103, IGHD, ABHEB e DNM1L são mais altos em comparação com os níveis de NCOR1, HV103, IGHD, ABHEB e DNM1L em uma amostra obtida de um sujeito saudável; e/ou em que os níveis de TPP2, IGHD, CK054, M3K5 e AL9A1I são mais baixos em comparação com os níveis de TPP2, IGHD, CKO54, M3K5 e AL9A1 em uma amostra obtida de um sujeito saudável.

[0559]Cláusula 55. Um painel de biomarcadores para determinar o estato de lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito, compreendendo pelo menos um dos seguintes biomarcadores: NCOR1, TPP2, K22E, ABHEB, INF2, SBSN, AL9A1, MAZB2 ou quaisquer combinações dos mesmos; em que a medição ou detecção do pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu uma TBI leve da subclasse 2.

[0560]Cláusula 56. O painel de biomarcadores, de acordo com a cláusula 55, em que os níveis de NCOR1, K22E, ABHEB e SBSN são mais altos em comparação com os níveis de NCOR1, K22E, ABHEB e SBSN em uma amostra obtida de um sujeito saudável; e/ou em que os níveis de TPP2, INF2, AL9A1 e MAZB2 são mais baixos em comparação com os níveis de TPP2, INF2, AL9A1 e MA2B2 em uma amostra obtida de um sujeito saudável.

[0561]Cláusula 57. Um painel de biomarcadores para determinar o estato de lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito, compreendendo pelo menos um dos seguintes biomarcadores: K22E, DNM1L, DIAP1, ABHEB, PLOD1, SYEP, KV102, AL9A1, EPHBA4, ou qualquer combinação dos mesmos; em que a medição ou detecção do pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu uma TBI leve da subclasse 1.

[0562]Cláusula 58. O painel de biomarcadores, de acordo com a cláusula 57,

em que os níveis de K22E, DNM1L, DIAP1, ABHEB, PLOD1, SYEP e EPHB4 são mais altos em comparação com os níveis de K22E, DNM1L, DIAP1, ABHEB, PLOD1, SYEP e EPHB4 em uma amostra obtida de um sujeito saudável; e/ou em que os níveis de KV102 e AL9A1 são mais baixos em comparação com os níveis de KV102 e AL9A1 em uma amostra obtida de um sujeito saudável.

[0563]Cláusula 59. Um painel de biomarcadores para determinar o estato de lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito, compreendendo pelo menos um dos seguintes biomarcadores: CAND1, NCOR1, K22E, ABHEB, DNM1L, SBSN, GLO?, SYEP ou quaisquer combinações dos mesmos; em que a medição ou detecção de níveis mais altos de pelo menos um biomarcador no sujeito, em comparação com os níveis de pelo menos um biomarcador em um sujeito saudável, indica que o sujeito sofreu uma TBl leve da subclasse 4.

[0564]Cláusula 60. Um painel de biomarcadores para determinar o estato de lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito, compreendendo pelo menos um dos seguintes biomarcadores: NCOR1, HV103, IGHD, ABHEB, DNM1L, ALBU, THIM, IGHA2, KV139 e, ou qualquer combinação dos mesmos; em que a medição ou detecção de níveis mais altos de pelo menos um biomarcador no sujeito, em comparação com os níveis de pelo menos um biomarcador em um sujeito saudável, indica que o sujeito sofreu uma TBI leve da subclasse 3.

[0565]Cláusula 61. Um painel de biomarcadores para determinar o estato de lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito, compreendendo pelo menos um dos seguintes biomarcadores: NCOR1, K22E, ABHEB, SBSN, DNM1L, DIAP1, DYL1, PSA, EPHBA, ou qualquer combinação dos mesmos; em que a medição ou detecção de níveis mais altos de pelo menos um biomarcador no sujeito, em comparação com os níveis de pelo menos um biomarcador em um sujeito saudável, indica que o sujeito sofreu uma TBI leve da subclasse 2.

[0566]Cláusula 62. Um painel de biomarcadores para determinar o estato de lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito, compreendendo pelo menos um dos seguintes biomarcadores: K22E, DNM1L, DIAP1, ABHEB, PLOD1, SYEP, EPHBA4, FBLN3 ou quaisquer combinações dos mesmos; em que a medição ou detecção de níveis mais altos de pelo menos um biomarcador no sujeito, em comparação com os níveis de pelo menos um biomarcador em um sujeito saudável, indica que o sujeito sofreu uma TBI leve da subclasse 1.

[0567]Cláusula 63. Um painel de biomarcadores para determinar que um sujeito não sofreu lesão cerebral traumática (TBI), compreendendo pelo menos um dos seguintes biomarcadores: ACTBL, ALDH2, ANXA5, CAMP, CPNE3, CRAC1, CYTC, DNPEP, EIF3I, GSHB, ICAM1, HV303, HNRPD, KV121, FA9, FHRA4, FRPD1, HS90B, MA2A1, PCYOX, PNPH, PROC, RL3, SH3L3, SRRM2, TBB1, TENA, TRAP1 ou qualquer combinação dos mesmos; em que a medição ou detecção de pelo menos um biomarcador no sujeito indica que o sujeito não sofreu uma TB.

[0568]Cláusula 64. Um método de medição ou detecção de, pelo menos, um biomarcador, o método compreendendo: a obtenção de uma amostra de um sujeito depois de uma lesão na cabeça real ou suspeita; e medir ou detectar pelo menos um peptídeo de pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado a partir do grupo que consiste em PZP, EPIPL, IGHA2, AL9A1, G6PI, SYTC, EZRI, FAS ou qualquer combinação dos mesmos na amostra; em que o pelo menos um peptídeo do pelo menos um biomarcador é selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4-260.

[0569]Cláusula 65. Uso de pelo menos um peptídeo selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4-260 para isolar ou identificar pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado do grupo que consiste em PZP, EPIPL, IGHA?2, AL9A1, G6PI, SYTC, EZRI, FA5 ou qualquer combinação dos mesmos.

[0570]Cláusula 66. Um método de medição ou detecção de, pelo menos, um biomarcador, o método compreendendo: a obtenção de uma amostra de um sujeito depois de uma lesão na cabeça real ou suspeita; e medir ou detectar pelo menos um peptídeo de pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado a partir do grupo que consiste em NCOR1, ABHEB, ANXA6, DNM1L, FCN2, HBA, MYLK, SBSN, AHNK, K22E ou qualquer combinação dos mesmos na amostra; em que o pelo menos um peptídeo do pelo menos um biomarcador é selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 261-698.

[057 1]Cláusula 67. Uso de pelo menos um peptídeo selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 261-698 para isolar ou identificar pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado do grupo que consiste em NCOR1, ABHEB, ANXA6, DNM1L, FCN2, HBA, MYLK, SBSN, AHNK, K22E ou qualquer combinação dos mesmos.

[0572]Cláusula 68. Um método de medição ou detecção de, pelo menos, um biomarcador, o método compreendendo: a obtenção de uma amostra de um sujeito depois de uma lesão na cabeça real ou suspeita; e medir ou detectar pelo menos um peptídeo de pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado do grupo que consiste em CAND1, SYEP, GLO2, DIAP1, DYL1, PSA, EPHB4, PLOD1, FBLN3, HV103, IGHD, THIM, IGHA2, KV105, MASP2, ou qualquer combinação dos mesmos na amostra; em que o pelo menos um peptídeo do pelo menos um biomarcador é selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 699-926.

[0573]Cláusula 69. Uso de pelo menos um peptídeo selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 699-926 para isolar ou identificar pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado do grupo que consiste em CAND1, SYEP, GLO2, DIAP1, DYL1, PSA, EPHB4, PLOD1, FBLN3, HV103, IGHD, THIM, IGHA2, KV105, MASP?2 ou quaisquer combinações dos mesmos.

[0574]Cláusula 70. Um método de medição ou detecção de, pelo menos, um biomarcador, o método compreendendo: a obtenção de uma amostra de um sujeito depois de uma lesão na cabeça real ou suspeita; e medir ou detectar pelo menos um peptídeo de pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado a partir do grupo que consiste em SAMP, 1433B, FIBB, RS28, TRFE ou qualquer combinação dos mesmos na amostra; em que o pelo menos um peptídeo do pelo menos um biomarcador é selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 927-968.

[0575]Cláusula 71. Uso de pelo menos um peptídeo selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 927-968 para isolar ou identificar pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado do grupo que consiste em SAMP, 1433B, FIBB, RS28, TRFE, ou qualquer combinação dos mesmos.

[0576]Cláusula 72. Um método de medição ou detecção de, pelo menos, um biomarcador, o método compreendendo: a obtenção de uma amostra de um sujeito depois de uma lesão na cabeça real ou suspeita; e medir ou detectar pelo menos um peptídeo de pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado a partir do grupo que consiste em DYL1, FBLN3, PSA, HV103, IGHD ou qualquer combinação dos mesmos na amostra; em que o pelo menos um peptídeo do pelo menos um biomarcador é selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 969-996.

[0577]Cláusula 73. Uso de pelo menos um peptídeo selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 969-996 para isolar ou identificar pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado do grupo que consiste em DYL1, FBLN3, PSA, HV103, IGHD ou qualquer combinação dos mesmos.

[0578]Cláusula 74. Um método de medição ou detecção de, pelo menos, um biomarcador, o método compreendendo: a obtenção de uma amostra de um sujeito depois de uma lesão na cabeça real ou suspeita; e medir ou detectar pelo menos um peptídeo de pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado a partir do grupo que consiste em FCN2, HBA, AHNK ou qualquer combinação dos mesmos na amostra; em que o pelo menos um peptídeo do pelo menos um biomarcador é selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 997-1182.

[0579]Cláusula 75. Uso de pelo menos um peptídeo selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 997-1182 para isolar ou identificar pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado do grupo que consiste em FCN2, HBA, AHNK ou quaisquer combinações dos mesmos.

[0580]Cláusula 76. Um método de medição ou detecção de, pelo menos, um biomarcador, o método compreendendo: a obtenção de uma amostra de um sujeito depois de uma lesão na cabeça real ou suspeita; e medir ou detectar pelo menos um peptídeo de pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado do grupo que consiste em HV103, IGHD, THIM, IGHA2, KV105, MASP2, DIAP1, PLOD1, EPHB4, FBLN3, DYL1, PSA ou qualquer combinação dos mesmos na amostra; em que o pelo menos um peptídeo do pelo menos um biomarcador é selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1183-1319.

[0581]Cláusula 77. Uso de pelo menos um peptídeo selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1183-1319 para isolar ou identificar pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado do grupo que consiste em HV103, IGHD, THIM, IGHA2, KV105, MASP2, DIAP1, PLOD1, EPHBA4, FBLN3, DYL1, PSA ou qualquer combinação dos mesmos.

[0582]Cláusula 78. Um método de medição ou detecção de, pelo menos, um biomarcador, o método compreendendo: a obtenção de uma amostra de um sujeito depois de uma lesão na cabeça real ou suspeita; e medir ou detectar pelo menos um peptídeo de pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado a partir do grupo que consiste em CAND1, GLO2, ERAP1, SYYC, C1IRL, ATPG ou qualquer combinação dos mesmos na amostra; em que o pelo menos um peptídeo do pelo menos um biomarcador é selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1320-1438.

[0583]Cláusula 79. Uso de pelo menos um peptídeo selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1320-1438 para isolar ou identificar pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado do grupo que consiste em CAND1,

GLO?2, ERAP1, SYYC, C1IRL, ATPG ou qualquer combinação dos mesmos.

[0584]Cláusula 80. Um método de medição ou detecção de, pelo menos, um biomarcador, o método compreendendo: a obtenção de uma amostra de um sujeito depois de uma lesão na cabeça real ou suspeita; e medir ou detectar pelo menos um peptídeo de pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado do grupo que consiste em ACTBL, ALDH2, ANXA5, CAMP, CPNE3, CRAC1, CYTC, DNPEP, EIF3|, GSHB, ICAM1, HV323, HNRPD, KVD33, FA9, FHR4, FRPD1, HS90B, MAZ2A1, PCYOX, PNPH, PROC, RL3, SH3L3, SRRM2, TBB1, TENA, TRAP1 ou qualquer combinação dos mesmos na amostra; em que o pelo menos um peptídeo do pelo menos um biomarcador é selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1439-1923.

[0585]Cláusula 81. Uso de pelo menos um peptídeo selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1439-1923 para isolar ou identificar pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado do grupo que consiste em ACTBL, ALDH2, ANXA5, CAMP, CPNE3, CRAC1, CYTC, DNPEP, EIF3l, GSHB, ICAM1, HV323, HNRPD, KVD33, FA9, FHR4, FRPD1, HS90B, MA2A1, PCYOX, PNPH, PROC, RL3, SH3L3, SRRM2, TBB1, TENA combinações dos mesmos.

Claims (32)

REIVINDICAÇÕES

1. Método de medir ou detectar pelo menos um biomarcador, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: obter uma amostra de um sujeito depois de uma lesão real ou suspeita na cabeça; e medir ou detectar pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado do grupo que consiste em AL9A1, ATPG, C1RL, CAND1, EPIPL, GLO?2, IGHA?2, PZP, SYTC, SYYC ou quaisquer combinações dos mesmos na amostra; e/ou medir ou detectar pelo menos um biomarcador de fragmento do mesmo selecionado do grupo que consiste em ABHEB, AL9A1, DNM1L, FCN2, INF2, K22E, M3K5, NCOR1, SBSN, SYEP, TPP2 ou quaisquer combinações dos mesmos na amostra.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a medição ou a detecção do pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu uma lesão cerebral traumática (TBI).

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo que consiste em AL9A1, ATPG, C1RL, EPIPL, IGHA?2, PZP, SYTC, SYYC ou quaisquer combinações dos mesmos; e em que o pelo menos um biomarcador não é detectável em uma amostra obtida a partir de um sujeito saudável.

4, Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo que consiste em ATPG, C1IRL, SYYC ou quaisquer combinações dos mesmos.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo que consiste em CAND1, GLO2, ou a combinação dos mesmos; e em que os níveis de CAND1 e GLO2 são mais altos em comparação com os níveis de CAND1 e GLO2 em uma amostra obtida a partir de um sujeito saudável.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo que consiste em ABHEB, AL9A1, DNM1L ou combinações dos mesmos; em que os níveis de ABHEB são mais altos em comparação com os níveis de ABHEB em uma amostra obtida a partir de um sujeito saudável; e/ou em que os níveis de AL9A1 e DNM1L são mais baixos em comparação com os níveis de AL9A1 e DNM1L em uma amostra obtida a partir de um sujeito saudável.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo que consiste em M3K5, SBSN, SYEP ou combinações dos mesmos; em que os níveis de SBSN e SYEP são mais altos em comparação com os níveis de SBSN e SYEP em uma amostra obtida a partir de um sujeito saudável; e/ou em que os níveis de M3K5 são mais baixos em comparação com os níveis de M3K5 em uma amostra obtida a partir de um sujeito saudável.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo que consiste em INF2, SYEP ou combinações dos mesmos.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo compreende ainda pelo menos um biomarcador selecionado do grupo que consiste em ANXA6, ERAP1, EZRI, FA5, G6PI, MYLK, SAMP ou combinações dos mesmos.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo compreende ainda pelo menos um biomarcador selecionado do grupo que consiste em MYLK, SAMP ou uma combinação dos mesmos.

11. Método de medir ou detectar pelo menos um biomarcador, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: obter uma amostra de um sujeito depois de uma lesão real ou suspeita na cabeça; e medir ou detectar pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo selecionado do grupo que consiste em 1433G, ACK1, ACY1, AKA12, ARGI1, CADHS5, CLH1, COPG2, DPOD2, DSG2, HV307, IQGA2, K1IC14, KIC19, KV105, LAMC1, MDHM, NQO2, PERM, PLST, PNCB, PTPRC, SEPT7, SYRC, TRXR2, TXNL1, UGGG1, WDR1 ou quaisquer combinações dos mesmos na amostra.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a medição ou a detecção do pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu uma lesão cerebral traumática (TB).

13. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um biomarcador não é detectável em uma amostra obtida a partir de um sujeito saudável.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um biomarcador não é detectável em uma amostra obtida a partir de um sujeito que sofreu uma TBI grave.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo que consiste em ACK1, ACY1, PLST, PNCB, PTPRC,

UGGG1 ou quaisquer combinações dos mesmos na amostra; em que a medição ou a detecção do pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu uma TBI leve da subclasse 1.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo que consiste em AKA12, HV307, PERM, KV105, NQO?2, SEPT7, SYRC, TRXR2 ou quaisquer combinações dos mesmos na amostra; em que a medição ou a detecção do pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu TBI leve da subclasse 2.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo que consiste em 1433B, ARGI1, CADH5, CLH1, COPG2, DPOD2, DSG2, IQGA2, KIC14, LAMC1, MDHM, TXNL1 ou quaisquer combinações dos mesmos na amostra; em que a medição ou a detecção do pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu uma TBI leve da subclasse 3.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo compreende ainda pelo menos um biomarcador selecionado do grupo que consiste em AHNK, AL1A1, AMPN, CAPZB, CATD, CLIP2, CMGA, FSCN1, GMPR2, GRP78, GSH1, IDHC, KI1C20, KRR1, MBL2, NTF2, PCBP2, PGK1, SAA1, TFR1 ou combinações dos mesmos.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um biomarcador ou fragmento do mesmo compreende ainda pelo menos um biomarcador selecionado do grupo que consiste em ANXA6, MASP2, MYLK, SAMP ou uma combinação dos mesmos.

20. Painel de biomarcadores para determinar o estado da lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito, o painel CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos um dos seguintes biomarcadores: TPP2, CAND1, NCOR1, K22E, AL9A1, ABHEB, DNM1L, INF2 ou quaisquer combinações dos mesmos; em que a medição ou a detecção do pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu uma TBI leve da subclasse 4.

21. Painel de biomarcadores, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que os níveis de CAND1, NCOR1, K22E, ABHEB e DNM1L são mais altos em comparação com os níveis de CAND1, NCOR1, K22E, ABHEB e DNM1L em uma amostra obtida a partir de um sujeito saudável; e/ou em que os níveis de TPP2, AL9A1 e INF2 são mais baixos em comparação com os níveis de TPP2, AL9A1 e INF2 em uma amostra obtida a partir de um sujeito saudável.

22. Painel de biomarcadores para determinar o estado da lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito, o painel CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos um dos seguintes biomarcadores: TPP2, NCOR1, HV103, INF2, IGHD, CK054, M3K5, ABHEB, AL9A1, DNM1L ou quaisquer combinações dos mesmos; em que a medição ou a detecção do pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu uma TBI leve da subclasse 3.

23. Painel de biomarcadores, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que os níveis de NCOR1, HV103, IGHD, ABHEB e DNM1L são mais altos em comparação com os níveis de NCOR1, HV103, IGHD, ABHEB e DNM1L em uma amostra obtida a partir de um sujeito saudável; e/ou em que os níveis de TPP2, IGHD, CKO54, M3K5 e AL9A1 são mais baixos em comparação com os níveis de TPP2, IGHD, CKO054, M3K5 e AL9A1 em uma amostra obtida a partir de um sujeito saudável.

24. Painel de biomarcadores para determinar o estado da lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito, o painel CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos um dos seguintes biomarcadores: NCOR1, TPP2, K22E, ABHEB, INF2, SBSN, AL9A1, MA2B2 ou quaisquer combinações dos mesmos; em que a medição ou a detecção do pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu uma TBI leve da subclasse 2.

25. Painel de biomarcadores, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que os níveis de NCOR1, K22E, ABHEB e SBSN são mais altos em comparação com os níveis de NCOR1, K22E, ABHEB e SBSN em uma amostra obtida a partir de um sujeito saudável; e/ou em que os níveis de TPP2, INF2, AL9A1 e MAZ2B2 são mais baixos em comparação com os níveis de TPP2, INF2, AL9A1 e MA2B2 em uma amostra obtida a partir de um sujeito saudável.

26. Painel de biomarcadores para determinar o estado da lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito, o painel CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos um dos seguintes biomarcadores: K22E, DNM1L, DIAP1, ABHEB, PLOD1, SYEP, KV133, AL9A1, EPHB4 ou quaisquer combinações dos mesmos; em que a medição ou a detecção do pelo menos um biomarcador indica que o sujeito sofreu uma TBI leve da subclasse 1.

27. Painel de biomarcadores, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que os níveis de K22E, DNM1L, DIAP1, ABHEB, PLOD1, SYEP e EPHB4 são mais altos em comparação com os níveis de K22E, DNM1L, DIAP1, ABHEB, PLOD1, SYEP e EPHB4 em uma amostra obtida a partir de um sujeito saudável; e/ou em que os níveis de KV133 e AL9A1 são mais baixos em comparação com os níveis de KV133 e AL9A1 em uma amostra obtida a partir de um sujeito saudável.

28. Painel de biomarcadores para determinar o estado da lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito, o painel CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos um dos seguintes biomarcadores: CAND1, NCOR1, K22E, ABHEB, DNM1L, SBSN, GLO2, SYEP ou quaisquer combinações dos mesmos; em que a medição ou a detecção de altos níveis do pelo menos um biomarcador no sujeito se comparados aos níveis do pelo menos um biomarcador em um sujeito saudável indica que o sujeito sofreu uma TBI leve da subclasse 4.

29. Painel de biomarcadores para determinar o estado da lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito, o painel CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos um dos seguintes biomarcadores: NCOR1, HV103, IGHD, ABHEB, DNM1L, ALBU, THIM, IGHA2, KV139 e/ou quaisquer combinações dos mesmos; em que a medição ou a detecção de altos níveis do pelo menos um biomarcador no sujeito se comparados aos níveis do pelo menos um biomarcador em um sujeito saudável indica que o sujeito sofreu uma TBI leve da subclasse 3.

30. Painel de biomarcadores para determinar o estado da lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito, o painel CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos um dos seguintes biomarcadores: NCOR1, K22E, ABHEB, SBSN, DNM1L, DIAP1, DYL1, PSA, EPHB4 ou quaisquer combinações dos mesmos; em que a medição ou a detecção de altos níveis do pelo menos um biomarcador no sujeito se comparados aos níveis do pelo menos um biomarcador em um sujeito saudável indica que o sujeito sofreu uma TBI leve da subclasse 2.

31. Painel de biomarcadores para determinar o estado da lesão cerebral traumática (TBI) de um sujeito, o painel CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos um dos seguintes biomarcadores: K22E, DNM1L, DIAP1, ABHEB, PLOD1, SYEP, EPHBA4, FBLN3 ou quaisquer combinações dos mesmos; em que a medição ou a detecção de altos níveis do pelo menos um biomarcador no sujeito se comparados aos níveis do pelo menos um biomarcador em um sujeito saudável indica que o sujeito sofreu uma TBI leve da subclasse 1.

32. Painel de biomarcadores para determinar que um sujeito não sofreu uma lesão cerebral traumática (TBI), o painel CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos um dos seguintes biomarcadores: ACTBL, ALDH2, ANXAS5, CAMP, CPNE3, CRAC1, CYTC, DNPEP, EIF3I, GSHB, ICAM1, HV323, HNRPD, KVD33, FA9, FHR4, FRPD1, HS90B, MAZA1, PCYOX, PNPH, PROC, RL3, SH3L3, SRRM?2, TBB1, TENA, TRAP1 ou quaisquer combinações dos mesmos; em que a medição ou a detecção do pelo menos um biomarcador no sujeito indica que o sujeito não sofreu uma TBI.