BR112020008977A2 - processos acústicos para transfecção e transdu-ção - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a métodos para a introdução de ácidos nucleicos estranhos nas células, tais como através da realização de transfecção / transdução, usando processos acústicos são descritos no presente documento. O DNA / RNA estranho e as células ficam localizados juntos em uma onda estacionária acústica multidimensional, ou ficam localizados juntos pela transmissão acústica.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PRO- CESSOS ACÚSTICOS PARA TRANSFECÇÃO E TRANSDUÇÃO".

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos, nº de série 62 / 641.234, depositado em 9 de março de 2018, e ao Pedido de Patente dos Estados Unidos, nº de série 15 / 947.746, depositado em 6 de abril de 2018, todos no presente documento incorporados por referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES

[0002] A presente descrição refere-se a métodos de introdução de ácidos nucleicos estranhos nas células, tal como por transfecção e transdução usando ondas acústicas. Também estão incluídas células e composições associadas produzidas por esses métodos. Tais méto- dos e composições podem ser úteis em aplicações de terapia celular.

[0003] A transfecção e a transdução são processos para a introdu- ção intencional de ácidos nucleicos (DNA ou RNA) nas células. À transdução é realizada usando um vetor viral, tal como um bacteriófa- go ou outro vírus. Vírus, tais como adenoviírus, lentivírus ou paramixo- vírus são comumente usados. A transfecção refere-se à introdução dos ácidos nucleicos em uma célula usando métodos não virais.

BREVE DESCRIÇÃO

[0004] A presente descrição refere-se, em várias modalidades, a processos para a introdução de ácidos nucleicos estranhos (DNA / RNA) nas células, tal como através da realização de transfecção ou transdução de células usando ondas acústicas. Muito geralmente, as ondas acústicas são usadas para reunir as células e os ácidos nuclei- cos, de modo que os ácidos nucleicos possam ser transferidos para as células. Um dispositivo acústico pode ser usado para essa finalidade, e esses dispositivos são descritos no presente documento. Também estão incluídas células e composições associadas produzidas por es-

ses métodos.

[0005] Aqui são descritos em várias modalidades métodos para causar a transfecção ou a transdução de células. Os ácidos nucleicos podem estar nus, ou podem estar em um vetor viral. As células e os ácidos nucleicos são colocados em um dispositivo acustoforético, por exemplo, colocando-os em um saco que é inserido no dispositivo acustoforético, ou fluindo uma mistura fluida contendo tanto as células quanto os ácidos nucleicos através do dispositivo acustoforético. O dispositivo acustoforético compreende: uma câmara acústica na qual as células e os ácidos nucleicos são colocados; e um transdutor ul- trassônico e um refletor oposto ao transdutor ultrassônico, o transdutor ultrassônico incluindo um material piezoelétrico que pode ser acionado para criar uma onda estacionária acústica multidimensional na câmara acústica. O transdutor ultrassônico é acionado para criar uma onda acústica estacionária. Como resultado, as células e os ácidos nuclei- cos ficam localizados juntos pela onda acústica estacionária. Em ou- tras palavras, as células e os ácidos nucleicos são colocados próximos o suficiente um do outro para permitir reações entre si. A onda estaci- onária acústica pode ser uma onda estacionária acústica multidimen- sional, uma onda estacionária plana ou uma combinação de ambas.

[0006] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos estão em um vetor viral. A transdução pode ocorrer quando o vírus se liga à cé- lula alvo e injeta o ácido nucleico na célula alvo. Em outras modalida- des, os poros são abertos nas membranas celulares das células antes da localização conjunta das células com os ácidos nucleicos. A trans- fecção pode ocorrer quando o ácido nucleico entra na célula, por exemplo, através dos poros. Os poros podem ser abertos por eletropo- ração, sonoporação ou pela exposição ao fosfato de cálcio.

[0007] As células e os ácidos nucleicos (nus ou em um vetor viral) podem ficar suspensos em um fluido. Tais fluidos podem incluir meios de cultura de células, água, solução salina e similares.

[0008] Em modalidades particulares, as células são células de ovário de hamster chinês (CHO), células de hibridoma NSO, células de rim de hamster bebê (BHK), células humanas, células T reguladoras, células T auxiliares, células T citotóxicas, células T de memória, célu- las T efetoras, células T gama delta, células T Jurkat, células CAR-T, células B ou células NK, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), algas, células vegetais ou bactérias.

[0009] O transdutor ultrassônico pode ser acionado por um perío- do de tempo de cerca de 5 minutos a cerca de 15 minutos, embora esse período de tempo possa variar como desejável. O transdutor ul- trassônico pode ser acionado a uma frequência de cerca de 0,5 MHz a cerca de 20 MHz. Em algumas modalidades, a frequência da onda es- tacionária acústica multidimensional é variada em um padrão de var- redura para mover as células em relação aos ácidos nucleicos.

[0010] O material piezoelétrico do transdutor ultrassônico pode ser titanato de zirconato de chumbo (PZT) ou niobato de lítio. O dispositivo acustoforético pode ainda compreender uma unidade de resfriamento para resfriar o transdutor ultrassônico.

[0011] Também são no presente documento descritos métodos para causar a transdução de células. As células e um vetor viral com- preendendo os ácidos nucleicos são colocados em um dispositivo acustoforético que compreende: uma câmara acústica; e um transdu- tor ultrassônico incluindo um material piezoelétrico que pode ser acio- nado para criar uma onda estacionária acústica multidimensional, uma onda estacionária acústica planar ou uma combinação de ondas esta- cionárias acústicas planares e multidimensionais na câmara acústica. O transdutor ultrassônico é acionado para criar a onda estacionária acústica multidimensional, a onda estacionária acústica planar ou a combinação de ondas estacionárias acústicas multidimensionais e planares. As células e o vetor viral são localizados juntos pela onda acústica estacionária para causar a transdução das células.

[0012] Também são descritos métodos para causar a transfecção de células. Os poros são abertos nas membranas celulares das célu- las. As células são colocadas junto com os ácidos nucleicos em um dispositivo acustoforético que compreende: uma câmara acústica; e um transdutor ultrassônico incluindo um material piezoelétrico que po- de ser acionado para criar uma onda acústica estacionária na câmara acústica. A onda estacionária acústica pode ser uma onda estacionária acústica multidimensional, uma onda estacionária acústica planar ou uma combinação de ondas estacionárias acústicas planares e multidi- mensionais. Os poros podem ser abertos antes ou depois das células serem colocadas no dispositivo acustoforético. O transdutor ultrassôni- co é então acionado para criar a onda acústica estacionária. As células e os ácidos nucleicos são localizados juntos pela onda acústica esta- cionária para causar a transfecção das células.

[0013] Estas e outras características não limitativas são mais par- ticularmente descritas abaixo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0014] Os desenhos anexos, que são incorporados e fazem parte deste relatório descritivo, mostram certos aspectos do assunto descrito no presente documento e, junto com a descrição, ajudam a explicar alguns dos princípios associados às implementações descritas.

[0015] A figura 1 é um diagrama que ilustra um método / processo da presente descrição, no qual a eficiência da transdução viral é apri- morada. Uma cultura de células é combinada com um vetor viral mar- cado com proteína fluorescente verde (GFP) e exposta ao processa- mento acústico, onde a onda estacionária acústica multidimensional mantém as células e os vírus próximos uns dos outros, aumentando a eficiência da reação. Após a lavagem e a incubação durante a noite, a

GFP fica expressa nas células, mostrando assim que a transdução Ocorreu.

[0016] A figura 2A é uma vista em perspectiva explodida de um exemplo de dispositivo acustoforético de acordo com a presente des- crição, incluindo uma unidade de resfriamento para resfriar o transdu- tor. A figura 2B é uma vista em perspectiva do dispositivo montado da figura 2A.

[0017] A figura 3 é uma vista em perspectiva de outro dispositivo acustoforético que pode ser usado para praticar os métodos / proces- sos da presente descrição. Um recipiente descartável, tal como um saco plástica, contém a mistura de fluidos com dois tipos de partículas que são levadas a interagir umas com as outras em um dispositivo acustoforético separado contendo um ou mais transdutores ultrassôni- cos.

[0018] A figura 4 é um diagrama de seção transversal de um transdutor ultrassônico convencional.

[0019] A figura 5 é um diagrama de seção transversal de um transdutor ultrassônico da presente descrição. Um espaço de ar está presente no transdutor e nenhuma camada de suporte ou placa de desgaste está presente.

[0020] A figura 6 é um diagrama de seção transversal de um transdutor ultrassônico da presente descrição. Um espaço de ar está presente no transdutor e uma camada de suporte e uma placa de des- gaste estão presentes.

[0021] A figura 7 é um gráfico da amplitude da impedância elétrica versus a frequência para um transdutor quadrado acionado em dife- rentes frequências.

[0022] A figura 8 ilustra as configurações da linha de captura para sete das frequências de ressonância (mínimos de amplitudes de impe- dância elétrica) da figura 7 desde a direção ortogonal ao fluxo de flui-

do.

[0023] A figura 9 é uma simulação em computador da amplitude da pressão acústica (escala da direita em Pa) e do transdutor fora do deslocamento plano (escala da esquerda em metros). O texto na parte superior da escala esquerda mostra "x10”". O texto na parte superior da escala do lado esquerdo do triângulo apontando para cima indica "1,473x10%". O texto na parte inferior da escala do lado esquerdo do triângulo apontando para baixo mostra "1,4612x10". O texto na parte superior da escala da direita mostra "x106". O texto na parte superior da escala do lado direito do triângulo apontando para cima indica "1,1129x106". O texto na parte inferior da escala do lado direito do tri- ângulo apontando para baixo mostra "7,357". Os triângulos mostram os valores máximo e mínimo representados nesta figura para a escala especificada. O eixo horizontal é o local dentro da câmara ao longo do eixo X, em polegadas, e o eixo vertical é o local dentro da câmara, ao longo do eixo Y, em polegadas.

[0024] A figura 10 mostra o deslocamento dentro e fora do plano de um cristal onde ondas compostas estão presentes.

[0025] A figura 11 é uma imagem de um saco plástico no qual as células T e os vírus estão interagindo entre si.

[0026] A figura 12 é um gráfico que mostra a razão de eficiência de transdução (acústica / sem acústica) versus o tempo de transdução para três experimentos com diferentes tempos de execução (30, 60 e 90 minutos).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0027] A presente descrição pode ser entendida mais prontamente por referência à seguinte descrição detalhada das modalidades dese- jadas e aos exemplos incluídos nela. No relatório descritivo a seguir e nas reivindicações a seguir, será feita referência a vários termos que devem ser definidos para ter os seguintes significados.

[0028] Embora termos específicos sejam usados na descrição a seguir por uma questão de clareza, esses termos têm a intenção de se referir apenas à estrutura particular das modalidades selecionadas pa- ra ilustração nos desenhos, e não se destinam a definir ou limitar o es- copo da descrição. Nos desenhos e na descrição a seguir abaixo, de- ve ser entendido que designações numéricas similares referem-se a componentes de função similar.

[0029] As formas singulares "um", "uma" e "o" incluem referentes plurais, a menos que o contexto claramente dite o contrário.

[0030] O termo "compreendendo" é no presente documento usado como exigindo a presença do componente nomeado e permitindo a presença de outros componentes. O termo "compreendendo" deve ser interpretado para incluir o termo "consistindo em", o que permite a pre- sença apenas do componente nomeado, junto com quaisquer impure- zas que possam resultar da fabricação do componente nomeado.

[0031] Os valores numéricos devem ser entendidos como incluin- do valores numéricos que são iguais quando reduzidos ao mesmo número de algarismos significativos e valores numéricos que diferem do valor declarado por menos do que o erro experimental da técnica de medição convencional do tipo descrito no presente pedido para de- terminar o valor.

[0032] Todos os intervalos descritos neste documento incluem o ponto final recitado e combináveis independentemente (por exemplo, o intervalo de "de 2 gramas a 10 gramas" inclui os pontos finais, 2 gra- mas e 10 gramas e todos os valores intermediários). Os pontos finais dos intervalos e quaisquer valores no presente documento descritos não se limitam ao intervalo ou valor preciso; eles são suficientemente imprecisos para incluir valores que se aproximam desses intervalos e / ou valores.

[0033] O modificador "cerca de" usado em conexão com uma quantidade inclui o valor declarado e tem o significado ditado pelo con- texto. Quando usado no contexto de um intervalo, o modificador "cerca de" também deve ser considerado como revelando o intervalo definido pelos valores absolutos dos dois pontos de extremidade. Por exemplo, o intervalo de "de cerca de 2 a cerca de 10" também descreve o inter- valo "de 2 a 10". O termo "cerca de" pode se referir a mais ou menos 10% do número indicado. Por exemplo, "cerca de 10%" pode indicar um intervalo de 9% a 11% e "cerca de 1" pode significar de 0,9 a 1,1.

[0034] Deve-se notar que muitos dos termos no presente docu- mento usados são termos relativos. Por exemplo, os termos "superior" e "inferior" são relativos entre si no local, ou seja, um componente su- perior está localizado em uma elevação mais alta do que um compo- nente inferior em uma determinada orientação, mas esses termos po- dem mudar se o dispositivo for invertido. Os termos "entrada" e "saída" são relativos a um fluido que flui através deles em relação a uma dada estrutura, por exemplo, um fluido flui através da entrada para dentro da estrutura e flui através da saída para fora da estrutura. Os termos "a montante" e "a jusante" são relativos à direção na qual um fluido flui através de vários componentes, isto é, o fluido flui através de um com- ponente a montante antes de fluir através do componente a jusante. Deve-se notar que, em um circuito fechado, um primeiro componente pode ser descrito como sendo tanto a montante quanto a jusante de um segundo componente.

[0035] Os termos "horizontal" e "vertical" são usados para indicar a direção em relação a uma referência absoluta, isto é, ao nível do solo. No entanto, esses termos não devem ser interpretados para exigir que as estruturas sejam absolutamente paralelas ou absolutamente per- pendiculares entre si. Por exemplo, uma primeira estrutura vertical e uma segunda estrutura vertical não são necessariamente paralelas uma à outra. Os termos "topo" e "fundo" ou "base" são usados para se referir a superfícies em que o topo é sempre mais alto que o fundo / base em relação a uma referência absoluta, ou seja, a superfície da terra. Os termos "para cima" e "para baixo" também são relativos a uma referência absoluta; para cima é sempre contra a gravidade da terra.

[0036] O presente pedido refere-se a "a mesma ordem de magni- tude." Dois números são da mesma ordem de magnitude se o quocien- te do número maior dividido pelo número menor for um valor de pelo menos 1 e menor que 10.

[0037] Os dispositivos acustoforéticos discutidos neste documento podem operar em um modo multimodal ou planar ou uma combinação de ambos. Multimodal refere-se à geração de ondas acústicas por um transdutor acústico que cria forças acústicas em três dimensões. As ondas acústicas multimodais, que podem ser ultrassônicas, podem ser geradas por um único transdutor acústico e são algumas vezes referi- das no presente documento como ondas estacionárias acústicas mul- tidimensionais ou tridimensionais. O modo planar refere-se à geração de ondas acústicas por um transdutor acústico que cria forças acústi- cas substancialmente em uma dimensão, por exemplo, ao longo da direção da propagação. Tais ondas acústicas, que podem ser ultras- sônicas, que são geradas no modo planar são algumas vezes no pre- sente documento referidas como ondas estacionárias acústicas unidi- mensionais.

[0038] Os transdutores acústicos podem compreender um material piezoelétrico, como titanato de zirconato de chumbo (PZT) ou niobato de lítio. Tais transdutores acústicos podem ser eletricamente excitados para gerar ondas acústicas planares ou multimodais. As forças acústi- cas tridimensionais geradas por ondas acústicas multimodais incluem forças radiais ou laterais que ficam desalinhadas com uma direção de propagação da onda acústica. As forças laterais podem atuar em duas dimensões. As forças laterais são adicionais às forças axiais nas on- das acústicas multimodais, que são substancialmente alinhadas com a direção da propagação das ondas acústicas. As forças laterais podem ser da mesma ordem de magnitude que as forças axiais para essas ondas acústicas multimodais. O transdutor acústico excitado em ope- ração multimodal pode exibir uma onda estacionária em sua superfí- cie, gerando assim uma onda acústica multimodal. A onda estacionária na superfície do transdutor pode estar relacionada ao modo de opera- ção da onda acústica multimodal. Quando um transdutor acústico é eletricamente excitado para gerar ondas acústicas planares, a superfí- cie do transdutor pode exibir uma ação similar a um pistão, gerando, assim, uma onda estacionária acústica unidimensional. Comparadas às ondas acústicas planares, as ondas acústicas multimodais exibem significativamente maior atividade de captura de partículas em uma base contínua com a mesma potência de entrada. Um ou mais trans- dutores acústicos podem ser usados para gerar combinações de on- das estacionárias acústicas planares e multidimensionais. Por exem- plo, dois transdutores acústicos podem ser dispostos para se oporem para gerar uma onda estacionária. Nesse exemplo, um dos transduto- res acústicos pode ser passivo e atuar como um refletor de uma onda incidente. Alternativamente, ou além disso, cada transdutor pode ser ativo para gerar ondas acústicas, incluindo tais ondas acústicas como descritas no presente documento em outras partes.

[0039] A acustoforese é a manipulação de materiais usando ondas acústicas. Em alguns exemplos de implementações, a acustoforese é usada para a separação de materiais e pode representar uma aborda- gem de estado sólido de baixa potência, sem queda de pressão, sem obstrução, para separação de partículas de dispersões de fluidos. À dispersão do campo acústico para fora das partículas resulta em uma força de radiação acústica tridimensional, que atua como um campo de captura tridimensional. A força da radiação acústica é proporcional ao volume da partícula (por exemplo, o cubo do raio) quando a partícu- la é pequena em relação ao comprimento de onda. A força da radiação acústica é proporcional à frequência e ao fator de contraste acústico. A força da radiação acústica escala com a energia acústica (por exem- plo, o quadrado da amplitude da pressão acústica). Para a excitação harmônica, a variação espacial sinusoidal da força é o que leva as par- tículas às posições estáveis dentro das ondas estacionárias. Quando a força de radiação acústica exercida sobre as partículas é mais forte que o efeito combinado da força de arrasto do fluido e da força de flu- tuação / gravitacional, a partícula fica presa dentro do campo da onda estacionária acústica. A ação das forças acústicas laterais e axiais nas partículas retidas resulta na formação de agrupamentos firmemente compactados por meio de concentração, agrupamento, amontoamen- to, aglomeração e / ou coalescência de partículas que, ao atingir um tamanho crítico, assentam-se continuamente por gravidade aprimora- da para partículas mais pesadas do que o fluido hospedeiro ou se ele- vam por flutuação aprimorada para partículas mais leves que o fluido hospedeiro Além disso, forças secundárias entre partículas, como for- ças de Bjerkness, ajudam na aglomeração de partículas.

[0040] As ondas acústicas estacionárias criam regiões localizadas de alta e baixa pressão. As partículas são empurradas para os nodos ou antinodos das ondas estacionárias, dependendo de sua compressi- bilidade e densidade em relação ao fluido circundante. Partículas de maior densidade e compressibilidade movem-se para os nodos nas ondas estacionárias, enquanto as fases secundárias de menor densi- dade movem-se para os antinodos. A força exercida sobre as partícu- las também depende do seu tamanho, com partículas maiores experi- mentando forças maiores. A magnitude da força depende da densida- de e compressibilidade das partículas em relação ao meio fluido e au-

menta com o volume das partículas.

[0041] Para fins da presente descrição, células biológicas podem ser consideradas como partículas. A maioria dos tipos de células bio- lógicas apresenta uma maior densidade e menor compressibilidade do que o meio em que estão suspensos, de modo que o fator de contras- te acústico entre as células e o meio tem um valor positivo. Como re- sultado, a força de radiação acústica axial (ARF) direciona as células para os nodos de pressão da onda estacionária. O componente axial da força de radiação acústica direciona as células, com um fator de contraste positivo, para os nodos de pressão, enquanto as células ou outras partículas com um fator de contraste negativo são direcionadas para os antinodos de pressão. O componente radial ou lateral da força de radiação acústica é a força que retém as células. O componente radial ou lateral do ARF é maior que o efeito combinado da força de arrasto de fluido e força gravitacional.

[0042] Modelos teóricos e numéricos adicionais foram desenvolvi- dos para o cálculo da força de radiação acústica para uma partícula, sem qualquer restrição quanto ao tamanho de partícula em relação ao comprimento de onda. Esses modelos também incluem o efeito da vis- cosidade de fluidos e partículas e, portanto, são um cálculo mais pre- ciso da força da radiação acústica. Os modelos que foram implemen- tados são baseados no trabalho teórico de Yurii linskii e Evgenia Zabo- lotskaya, como descrito em AIP Conference Proceedings, vol. 1474-1, pp. 255-258 (2012). Modelos internos adicionais foram desenvolvidos para calcular as forças de captura acústica para objetos de formato cilíndrico, tal como os "discos de hóquei" de partículas presas na onda estacionária, que se assemelham a um cilindro.

[0043] Desejavelmente, o (s) transdutor (s) ultrassônico (s) gera (m) uma onda estacionária multidimensional no fluido que exerce uma força lateral sobre as partículas em suspensão para acompanhar a força axial. Resultados típicos publicados na literatura afirmam que a força lateral é duas ordens de magnitude menor do que a força axial. Por outro lado, a tecnologia descrita nest414e pedido fornece uma for- ça lateral da mesma ordem de magnitude que a força axial. No entan- to, em certas modalidades descritas no presente documento mais adi- ante, o dispositivo usa ambos os transdutores que produzem ondas estacionárias acústicas multidimensionais e transdutores que produ- zem ondas estacionárias acústicas planares. O componente de força lateral da força de radiação acústica total (ARF) gerada pelo (s) trans- dutor (s) ultrassônico (s) da presente descrição é significativo e é sufi- ciente para superar a força de arrasto do fluido em velocidades linea- res de até 1 cm / s, e para criar agrupamentos bem compactados e é da mesma ordem de magnitude que o componente de força axial da força total de radiação acústica.

[0044] A presente descrição refere-se a métodos de uso desses dispositivos acustoforéticos contendo transdutores ultrassônicos para realizar a transfecção ou a transdução. Resumidamente, os dispositi- vos acustoforéticos são usados para unir células com ácidos nucleicos (DNA ou RNA, ou ambos) em um volume localizado. Isso permite que os ácidos nucleicos sejam transferidos para as células. Os processos de transdução atuais podem ter um custo relativamente alto, baixa efi- ciência e baixa capacidade de serem ampliados para comercialização. Os métodos descritos neste documento podem reduzir custos, aumen- tar a eficiência e ter uma plataforma escalável para comercialização.

[0045] Muito geralmente, as células e o transportador (contendo RNA ou DNA) são colocados na câmara acústica de um dispositivo acustoforético. Geralmente, eles ficam suspensos em um fluido para formar uma mistura de fluidos. Em alguns exemplos de implementa- ções, o dispositivo acustoforético contém uma câmara acústica que possui um transdutor ultrassônico e um refletor oposto ao transdutor ultrassônico (por exemplo, em paredes opostas da câmara). O trans- dutor ultrassônico inclui um material piezoelétrico que pode ser acio- nado para criar uma onda estacionária acústica dentro da câmara acústica, por exemplo, uma onda estacionária acústica multidimensio- nal e / ou uma onda estacionária acústica planar. A onda acústica es- tacionária possui locais de pressão mais alta e locais de pressão mais baixa. Em alguns exemplos, os locais de pressão mais baixa capturam e retêm as células. Os ácidos nucleicos são escoados para a câmara acústica com as células retidas. Essa ação faz com que as células e os ácidos nucleicos fiquem localizados juntos para que os ácidos nu- cleicos possam entrar nas células. No caso de transfecção, poros são abertos nas membranas celulares das células, para permitir que áci- dos nucleicos nus entrem nas células. No caso da transdução, os áci- dos nucleicos fazem parte de um vetor viral. O vetor viral entra nas cé- lulas ou insere os ácidos nucleicos nas células. Os vetores virais es- pecíficos que podem ser usados para realizar a transdução na presen- te descrição incluem adenovírus, lentivírus ou paramixovírus.

[0046] Em alguns exemplos de implementações, a força acustofo- rética criada pela onda acústica estacionária nas células e / ou nos ácidos nucleicos (nus ou em um vetor viral) pode ser suficiente para superar a força de arrasto do fluido exercida pelo fluido em movimento nessas partículas. Em outras palavras, a força acustoforética pode atuar como um mecanismo que prende as células e / ou os ácidos nu- cleicos no campo acústico. A força acustoforética pode conduzir as células e / ou os ácidos nucleicos para os locais estáveis de amplitu- des de força acustoforética reduzidas ou mínimas. Esses locais de amplitudes de força acustoforética reduzidas ou mínimas podem ser os nodos de uma onda acústica estacionária. Com o tempo, a coleção de células e / ou ácidos nucleicos nos nodos cresce constantemente. Dentro de um período de tempo, que pode ser de minutos ou menos,

dependendo de sua concentração, a coleção de células e / ou ácidos nucleicos pode assumir a forma de uma coleção de discos similares a feixes. Cada disco pode ser espaçado por meio comprimento de onda do campo acústico.

[0047] Em algumas modalidades, a onda estacionária acústica captura as células e / ou os ácidos nucleicos e os localiza junto, me- lhorando a eficiência da reação de transfecção / transdução. Vários mecanismos diferentes podem ser implementados para essas modali- dades. Em um tal mecanismo, as células e os ácidos nucleicos podem ter fatores similares de contraste acústico, de modo que ambos os ti- pos de partículas podem ser direcionados para os nodos ou antinodos da onda estacionária. Esse mecanismo aproxima espacialmente as células e os ácidos nucleicos de maneira mais eficiente do que a con- fiança no movimento browniano (como na agitação convencional). Em outras palavras, as células e os ácidos nucleicos ficam presos em um pequeno volume tridimensional criado pela onda estacionária acústica multidimensional, em relação ao tamanho da câmara acústica. Em exemplos de modalidades particulares, as células e os ácidos nuclei- cos têm ambos um fator de contraste acústico positivo ou ambos têm um fator de contraste acústico negativo. Em outras palavras, seus fato- res de contraste acústico têm o mesmo sinal. Novamente, os ácidos nucleicos podem estar nus ou em um vetor viral.

[0048] Em outro mecanismo, um dos dois tipos de partículas (célu- las ou ácidos nucleicos) pode ser direcionado para os nodos, enquanto o outro tipo de partículas é direcionado para os antinodos. No entanto, em frequências mais altas, os nodos e os antinodos estão suficiente- mente próximos um do outro que as células e os ácidos nucleicos po- dem reagir entre si. Em tais modalidades, as células ou os ácidos nu- cleicos têm um fator de contraste acústico positivo, e o outro conjunto (isto é, ácidos nucleicos ou as células) possui um fator de contraste acústico negativo. Em outras palavras, seus fatores de contraste acús- tico têm sinais opostos. As partículas com um fator de contraste positi- vo são direcionadas aos nodos e as partículas com um fator de con- traste negativo são direcionadas aos antinodos. Alguns fatores rele- vantes para esse mecanismo de reação incluem os tamanhos das cé- lulas e do transportador, e a frequência com que o transdutor ultrassô- nico é operado.

[0049] Eventualmente, à medida que as células e / ou os ácidos nucleicos continuam sendo capturados e concentrados, eles podem atingir um tamanho e um peso tal que ocorrerá a sedimentação gravi- tacional, em que os agrupamentos de partículas cairão da onda acús- tica estacionária para o fundo da câmara acústica. Novas coleções de partículas podem então ser capturadas e reagidas dentro do campo acústico gerado pelas ondas acústicas estacionárias.

[0050] Em algumas implementações de exemplo, um dispositivo acustoforético é fornecido com uma câmara acústica que inclui um transdutor ultrassônico que inclui um material piezoelétrico que pode ser acionado para criar uma onda acústica estacionária dentro da câ- mara acústica, por exemplo, uma onda estacionária acústica multidi- mensional e / ou uma onda estacionária acústica planar. A onda acús- tica estacionária possui locais de pressão mais alta e locais de pres- são mais baixa. Um circuito fechado de recirculação é fornecido à câ- mara acústica que permite que o fluido de saída e as partículas sejam reintroduzidos na câmara acústica. Em alguns exemplos, os locais de pressão mais baixa capturam e retêm as células, mas não capturam ou retêm o vetor viral ou os ácidos nucleicos, que podem fluir para fora da câmara acústica e ser reintroduzidos através do circuito fechado de recirculação. No exemplo de vetores virais, as células são retidas no campo acústico gerado pela onda acústica estacionária e os vetores virais são escoados para o campo para permitir que as células e os vetores virais interagam. Um número aumentado de interações pode ser alcançado entre os vetores virais e as células recirculando, para a câmara acústica, os vetores virais que não interagem em uma passa- gem anterior. No exemplo de ácidos nucleicos, um tratamento adicio- nal pode ser realizado nas células que ficam retidas no campo acústi- co para permitir a formação de poros nas membranas celulares, como discutido em mais detalhes em outras partes deste documento. Os ácidos nucleicos são escoados para a câmara acústica com as células retidas para permitir que os ácidos nucleicos interajam com as células e para permitir que os ácidos nucleicos entrem nas células através dos poros. Os ácidos nucleicos não ficam retidos pelo campo acústico e são recirculados para a câmara acústica para permitir a ocorrência de várias passagens na transfecção.

[0051] Além disso, ou alternativamente, em alguns exemplos, o transdutor ultrassônico é acionado para causar a transmissão acústica dentro da câmara acústica. Resumidamente, a transmissão acústica refere-se ao fluxo de fluido que resulta dentro da câmara acústica quando o fluido absorve a energia acústica que é transmitida pelo transdutor ultrassônico (a partir da vibração do transdutor ultrassôni- co). A velocidade do fluido é induzida pelas ondas acústicas oscilantes geradas pelo transdutor ultrassônico. Normalmente, quando a trans- missão acústica é gerada, isso resulta em movimento circulatório ou vórtices que podem causar a agitação na mistura de fluidos. Esse fe- nômeno não é linear e pode fazer com que as células e os ácidos nu- cleicos interajam entre si.

[0052] As células e os ácidos nucleicos são colocados em proxi- midade de modo que eles podem reagir uns com os outros. Na pre- sente descrição, os termos "interagir" e "reagir" são usados para indi- car que ocorre uma alteração física nas células. Por exemplo, na transdução, o vírus que contém os ácidos nucleicos pode penetrar na célula para causar a transdução. O vírus pode ser, por exemplo, um retrovírus, tal como um lentivírus.

[0053] No que diz respeito aos exemplos de transfecção, poros são abertos nas membranas celulares das células para permitir que os ácidos nucleicos entrem nas células. Por exemplo, as células podem ser submetidas à eletroporação, onde as células são expostas a um campo elétrico para aumentar a permeabilidade da membrana celular. A sonoporação também pode ser usada, onde as células são expostas ao ultrassom para induzir a formação de poros na membrana celular. O fosfato de cálcio também pode ser usado para causar a transfecção. O local em que a abertura do poro ocorre não é importante e pode ocorrer no dispositivo acustoforético a montante da câmara acústica na qual as células e os ácidos nucleicos são misturados ou pode ocor- rer fora do dispositivo acustoforético.

[0054] Para referência, note-se que a transfecção produtiva e a transferência de genes requerem não apenas a entrada de DNA nas células e a subsequente transcrição de um promotor apropriado, mas também vários eventos intracelulares que permitem que o DNA se mova da superfície extracelular da célula para dentro e através do ci- toplasma e, finalmente, através do envelope nuclear e para dentro do núcleo antes que qualquer transcrição possa ser iniciada. Imediata- mente após a entrada no citoplasma, o DNA nu (entregue por técnicas físicas ou após a desmontagem de complexos portadores de DNA) associa-se a um grande número de proteínas celulares que mediam interações subsequentes com a rede de microtúbulos para se mover em direção ao centro organizador dos microtúbulos e ao envelope nu- clear. Os plasmídeos então entram no núcleo com a desmontagem mitótica do envelope nuclear ou através de complexos de poros nucle- ares na ausência de divisão celular, usando um conjunto diferente de proteínas.

[0055] Os vetores virais específicos que podem ser usados para realizar a transdução na presente descrição incluem adenovírus, lenti- vírus ou paramixovírus. Os retrovírus são caracterizados por sua ca- pacidade de retrotranscrever seu genoma de RNA em uma cópia de cCDNA, que é então integrada de maneira estável no genoma da célula hospedeira. Assim, o vírus transporta o ácido nucleico para dentro da célula.

[0056] Os retrovírus podem ser categorizados como simples ou complexos (por exemplo, lentivírus). As partículas virais de ambos os tipos contêm duas cópias de RNA de fita positiva com uma transcrip- tase reversa viral associada (RT) localizada dentro de um núcleo inter- no. Também localizadas dentro deste compartimento estão proteínas estruturais e enzimáticas, incluindo o nucleocapsídeo (NC), o capsídeo (CA), a integrase (IN) e a protease (PR). O núcleo interno é cercado por uma camada de proteína externa composta pela proteína da matriz (MA), que por sua vez é abrangida pelo envelope derivado da mem- brana da célula hospedeira, envolto em glicoproteína (ENV).

[0057] Sistemas de entrega (ou transportadores) de genes retrovi- rais e lentivirais exploram aspectos da replicação de retrovírus para proporcionar a integração estável da sequência de ácido nucleico de- sejada. Enquanto a transfecção de ácidos nucleicos estranhos resulta apenas na expressão transitória de transgene, a atividade da integrase viral em sistemas baseados em retrovirais e lentivirais permite a inte- gração estável do transgene estranho, que é então herdado e expres- so continuamente através de divisões celulares repetidas. Uma carac- terística fundamental de ambos os vetores lentivirais e retrovirais é que eles produzem partículas com defeito de replicação ou de autoinativa- ção. Isto permite a entrega da sequência desejada, sem replicação viral continuada nas células alvo.

[0058] Uma maneira comum de validar que os ácidos nucleicos estranhos foram introduzidos com sucesso nas células é medir a ex- pressão da proteína. Isso geralmente é realizado por Western blot ou imunocoloração.

[0059] Exemplos de células que podem ser transfectadas / trans- duzidas pelos processos da presente descrição incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), células de hibridoma NSO, células de rim de hamster bebê (BHK), células humanas, células T reguladoras, células T auxiliares, células T citotóxicas, células T de memória, célu- las T efetoras, células T gama delta, células T Jurkat, células CAR-T, células B ou células NK, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), algas, células vegetais ou bactérias. As próprias células po- dem ser ligadas a outros materiais, tal como contas. Exemplos de con- tas incluem contas de polímero, contas magnéticas, contas superpa- ramagnéticas e microesferas. Estas podem ser usadas para reações bioquímicas ou para fins de rotulagem.

[0060] Em algumas modalidades, aditivos podem ser incluídos na mistura das células e dos ácidos nucleicos. Esses aditivos podem in- cluir Polybrene!Y e RetroNectinTY. Polybrene'" é um polímero catiôni- co (brometo de poliexadimetrina) usado para aumentar a eficiência da transdução de certas células com retrovírus (e lentivírus) na cultura de células e é normalmente usado em quantidades de 10 ug / mL ou me- nos. O RetroNectin'Y é um polipeptídeo que consiste em três domínios funcionais derivados da proteína fibronectina humana (domínio C, do- mínio H e local CS-1). O RetroNectin'Y aumenta a eficiência da trans- dução mediada por retroviral e lentiviral em células hematopoiéticas, incluindo células-tronco hematopoiéticas e células diferenciadas termi- nalmente, tal como células T primárias e macrófagos. Outros aditivos podem incluir lipofectina, lipofectamina e peptídeos catiônicos, tal co- mo a protamina. Esses aditivos podem ser usados para melhorar a transdução, se apropriado.

[0061] Sem ser limitado pela teoria, acredita-se que a frequência da onda estacionária acústica multidimensional determine o diâmetro das partículas que podem ser capturadas pela onda estacionária acús- tica. Por exemplo, para uma onda de 2 MHz, o tamanho da partícula é de cerca de 1 a cerca de 100 mícrons.

[0062] A figura 1 é um diagrama que ilustra um método de exem- plo da presente descrição, como aplicado à transdução viral. Neste exemplo, as células são marcadas com proteína fluorescente verde (GFP). A partir do lado esquerdo da figura, primeiro, uma cultura de células 100 é combinada com um vetor viral 110. A mistura de fluido que contém as células e os vírus é então colocada em uma câmara acústica 120, que está localizada entre um transdutor ultrassônico 122 e um refletor 124. As ondas estacionárias acústicas são geradas por minutos em temperatura ambiente. Como ilustrado no presente do- cumento, as células e os vírus ficam presos nas ondas acústicas esta- cionárias. As células ficam presas nos nodos e os vírus ficam presos nos antinodos. No entanto, devido ao seu tamanho relativo, as células e os vírus ficam localizados juntos e os vírus são capazes de infectar as células (identificadas com o número de referência 128). Após lava- gem para remover o material que não reagiu, as células são incubadas durante a noite a 37ºC e a GFP é expressa nas células marcadas. Um método similar pode ser usado para produzir células T que expressam receptores de antígenos quiméricos (CARs) ou células CAR T.

[0063] Os métodos da presente descrição podem ser realizados em um processo contínuo, em que uma mistura de fluido contendo as células e os ácidos nucleicos suspensos em um fluido hospedeiro é escoada através do dispositivo acustoforético. Os ácidos nucleicos po- dem estar nus ou podem estar contidos em um vetor viral, tal como um bacteriófago ou outro vírus.

[0064] A figura 2A é uma vista explodida de um dispositivo acusto-

forético 200 que pode ser usado para processamento contínuo. A figu- ra 2B é uma vista do dispositivo 200 em uma condição totalmente montada.

[0065] Com referência à figura 2A, o dispositivo acustoforético po- de ser construído de modo que cada componente seja modular e pos- sa ser alterado ou alternado separadamente um do outro. Assim, quando novas revisões ou modificações são feitas em um determinado componente, o componente pode ser substituído enquanto o restante do dispositivo permanece o mesmo.

[0066] O dispositivo inclui um transdutor ultrassônico 220 e um re- fletor 250 em paredes opostas de uma câmara acústica 210. Note-se que o refletor 250 pode ser feito de um material transparente, de modo que o interior da câmara de fluxo 210 possa ser visto. O transdutor ul- trassônico fica próximo a uma primeira parede da câmara acústica. O refletor fica próximo a uma segunda parede da câmara acústica ou pode formar a segunda parede da câmara acústica.

[0067] Uma unidade de resfriamento 260 pode ser localizada entre o transdutor ultrassônico 220 e a câmara de fluxo 210. Como ilustrado no presente documento, a unidade de resfriamento 260 inclui um ca- minho de fluxo independente que é separado do caminho de fluxo através da câmara acústica. Uma entrada de refrigerante 262 permite a entrada de um fluido de resfriamento na unidade de resfriamento. O refrigerante e o calor residual saem da unidade de resfriamento atra- vés de uma saída de refrigerante 264. O refrigerante que flui através da unidade de resfriamento pode ser qualquer fluido apropriado. Por exemplo, o refrigerante pode ser água, ar, álcool, etanol, amônia ou alguma combinação dos mesmos. O refrigerante pode ser um líquido, gás ou gel. O refrigerante pode ser um fluido eletricamente não condu- tor para evitar curtos-circuitos elétricos.

[0068] Alternativamente, a unidade de resfriamento pode ser na forma de um gerador termoelétrico, que converte o fluxo de calor (isto é, diferenças de temperatura) em energia elétrica usando o efeito Seebeck, removendo assim o calor da câmara de fluxo. Dito de outra maneira, a eletricidade pode ser gerada a partir de calor residual inde- sejado enquanto operando o dispositivo acustoforético.

[0069] A unidade de resfriamento pode ser usada para resfriar o transdutor ultrassônico, o que pode ser particularmente vantajoso quando o dispositivo deve ser operado continuamente com processa- mento e recirculação repetidos por um período prolongado de tempo (por exemplo, perfusão). Alternativamente, a unidade de resfriamento também pode ser usada para resfriar o fluido que corre através da câ- mara acústica 210. Para aplicações desejadas, as células devem ser mantidas em torno da temperatura ambiente (- 20ºC) e no máximo em torno de 28ºC. Isso ocorre porque quando as células experimentam temperaturas mais altas, suas taxas metabólicas aumentam. Sem uma unidade de resfriamento, no entanto, a temperatura das células que fluem através da câmara acústica pode subir até 34ºC.

[0070] Note-se que a câmara acústica 210 é ilustrada no presente documento como incluindo pelo menos uma entrada 212 e uma saída

214. Isso fornece acesso ao volume interior 216 da câmara acústica. Entradas e saídas adicionais (por exemplo, entrada de fluido, saída de concentrado, saída de permeado, saída de recirculação, saída de san- gria / colheita) podem ser incluídas como desejado. O volume interior 216 pode ser considerado como sendo delimitado pelo transdutor ul- trassônico 220, a unidade de resfriamento 260, a câmara acústica 210 e o refletor 250.

[0071] A direção do fluxo do dispositivo acustoforético 200 pode ser orientada em uma direção diferente da horizontal. Por exemplo, o fluxo de fluido pode ser vertical para cima ou para baixo ou em algum ângulo em relação à vertical ou horizontal. Mais de um transdutor pode ser incluído no sistema.

[0072] A figura 3 ilustra outro dispositivo acustoforético 300 que pode ser usado para praticar os métodos e processos da presente descrição. Muito geralmente, o sistema inclui o dispositivo acustoforé- tico 300 e um recipiente substancialmente acusticamente transparente

310. Esses dois componentes são separáveis um do outro.

[0073] O recipiente 310 do dispositivo acustoforético é geralmente formado a partir de um material substancialmente acusticamente transparente, tais como plástico, vidro, policarbonato, polietileno de baixa densidade e polietileno de alta densidade (todos com uma es- pessura apropriada). No entanto, o recipiente pode ser formado a par- tir de qualquer material adequado para permitir a passagem da (s) on- da (s) estacionária (s) acústica (s) da presente descrição através do mesmo. O recipiente pode estar na forma de uma garrafa ou um saco. A diferença entre essas formas está em sua composição e estrutura. Uma garrafa é mais rígida do que um saco. Quando vazio, um saco geralmente não consegue se sustentar, enquanto uma garrafa é capaz de ficar de pé. Por exemplo, o recipiente 310 mostrado no presente documento é um saco de polietileno de alta densidade. O contêiner 310 geralmente tem uma extremidade superior 312 e uma extremidade inferior 314, e um volume interior no qual a mistura de fluido (contendo as primeiras partículas e as segundas partículas em um fluido hospe- deiro) fica localizada.

[0074] O dispositivo acustoforético 300 é definido por pelo menos uma parede 332, e geralmente uma pluralidade de paredes, que for- mam os seus lados. Por exemplo, o dispositivo acustoforético pode ser na forma de um cilindro ou em um retângulo (como representado). À (s) parede (s) é (são) sólida (s). Uma abertura 326 está presente na extremidade superior do dispositivo acustoforético, para receber o re- cipiente 310 através da mesma. Novamente, o dispositivo acustoforéti-

co 300 é separável do recipiente 310, de modo que o recipiente pode ser descartável ou reutilizável, dependendo da aplicação desejada do dispositivo acustoforético. Como ilustrado no presente documento, a base do dispositivo acustoforético 300 é sólida.

[0075] O dispositivo acustoforético 300 inclui pelo menos um transdutor ultrassônico 330 em uma parede 334. O transdutor ultras- sônico 330 tem um material piezoelétrico acionado por um sinal de vol- tagem para criar uma onda acústica estacionária. Os cabos 332 são ilustrados para transmitir força e informações de controle ao transdutor ultrassônico 330. Um refletor 340 pode estar presente e fica localizado na parede 336 oposta ao transdutor ultrassônico 330. A onda estacio- nária é assim gerada através das ondas iniciais irradiadas do transdu- tor e ondas refletidas do refletor. Em algumas modalidades, um refletor separado não é necessário. Por exemplo, uma parede da câmara ou limite de liberação, tal como o que pode ser fornecido pelo ar ambien- te, pode ser usado para refletir as ondas incidentes e criar as ondas estacionárias. Deve ser entendido que várias combinações de transdu- tor e refletor podem ser usadas. A (s) onda (s) acústica (s) estacionária (s) planares e / ou multidimensionais são geradas dentro do recipiente e são usadas para causar a interação das partículas dentro do recipi- ente 310. Deve-se notar que não há contato entre o transdutor ultras- sônico e a mistura de fluido dentro do recipiente 310.

[0076] Em certas modalidades, o dispositivo acustoforético inclui uma pluralidade de transdutores ultrassônicos 330 localizados em uma parede comum 334 oposta à parede 336 na qual o refletor 340 está localizado. Como alternativa, os transdutores ultrassônicos podem fi- car localizados um em frente ao outro, sem o refletor presente. Além disso, o dispositivo acustoforético 300 pode incluir uma janela de visu- alização 324 em outra parede 338. Como ilustrado no presente docu- mento, quando uma janela de visualização é fornecida, ela pode ficar em uma parede adjacente às paredes nas quais estão localizados o (s) transdutor (es) ultrassônico (s) e o refletor, de modo que a extremi- dade inferior 314 do recipiente 310 pode ser vista através da janela de visualização 324 na câmara de separação 320. Em outras modalida- des, a janela de visualização pode substituir o refletor.

[0077] Em certas modalidades, um fluido, tal como a água, pode ser colocado no espaço intersticial 305 entre o recipiente 310 e o dis- positivo acustoforético 300, de modo que a onda estacionária acústica passe através do fluido no espaço intersticial e da mistura de fluido no recipiente. O fluido intersticial pode ser qualquer fluido, embora deva ter um valor de impedância acústica que permita uma boa transmissão da (s) onda (s) acústica (s) estacionária (s) e, de preferência, uma bai- xa atenuação acústica.

[0078] Em modalidades de exemplo particulares, o transdutor ul- trassônico é acionado a uma frequência de cerca de 0,5 MHz a cerca de 20 MHz (megahertz). Os campos de ondas estacionárias de fre- quência mais alta resultam em gradientes de pressão mais acentua- dos, que por sua vez são mais adequados para capturar partículas menores, como vírus. O transdutor ultrassônico pode ser acionado por um período de tempo de cerca de 5 minutos a cerca de 15 minutos. Este é um período de tempo consideravelmente mais curto do que, por exemplo, processos convencionais de transdução viral em que a cultu- ra celular e o vetor viral são incubados juntos por cerca de 30 minutos a cerca de 120 minutos. Tais longos períodos de incubação são devi- dos à reação entre as células e os vírus que ocorre apenas quando o movimento browniano os aproxima. O uso dos dispositivos acustoforé- ticos da presente descrição aumenta muito a probabilidade de células e vírus ficarem suficientemente próximos para reagirem entre si. Isso resulta em maior eficiência da reação usando menos partículas. Se desejado, contudo, o transdutor ultrassônico pode ser acionado pelo período de tempo desejado, por exemplo, até 120 minutos ou mais.

[0079] Pode ser útil agora descrever os transdutores ultrassônicos usados no dispositivo de filtragem acústica com mais detalhes. A figu- ra 4 é um diagrama de seção transversal de um transdutor ultrassôni- co convencional. Este transdutor tem uma placa de desgaste 50 na extremidade inferior, camada de epóxi 52, elemento piezoelétrico de cerâmica 54 (feito de, por exemplo, titanato de zirconato de chumbo (PZT) ou niobato de lítio), uma camada de epóxi 56 e uma camada de suporte 58. Em ambos os lados do elemento piezoelétrico de cerâmi- ca, há um eletrodo: um eletrodo positivo 61 e um eletrodo negativo 63. A camada de epóxi 56 liga a camada de suporte 58 ao elemento pie- zoelétrico 54. Todo o conjunto fica contido em um alojamento 60 que pode ser feito, por exemplo, de alumínio. O alojamento é usado como o eletrodo de aterramento. Um adaptador elétrico 62 fornece conexão para que os fios passem através do alojamento e se conectem aos condutores (não mostrados) que se conectam ao elemento piezoelétri- co 54. Normalmente, as camadas de suporte são projetadas para adi- cionar amortecimento e criar um transdutor de banda larga com deslo- camento uniforme em uma ampla faixa de frequência e são projetadas para suprimir a excitação de modos autômatos vibratórios específicos do elemento piezoelétrico. As placas de desgaste são geralmente pro- jetadas como transformadores de impedância para melhor correspon- der à impedância característica do meio no qual o transdutor irradia.

[0080] A figura 5 é uma vista em seção transversal de um transdu- tor ultrassônico 81 da presente descrição, o qual é usado no dispositi- vo de filtragem acústica da presente descrição. O transdutor 81 tem a forma de um quadrado e tem um alojamento de alumínio 82. O aloja- mento de alumínio possui uma extremidade superior e uma extremida- de inferior. O alojamento do transdutor também pode ser composto de plásticos, tal como HDPE de grau médico ou outros metais. O elemen-

to piezoeléctrico é uma massa de cerâmica perovsquita, cada uma composta por um fon de metal tetravalente pequeno, normalmente de titânio ou de zircônio, em uma treliça de íons metálicos divalentes, maiores, geralmente chumbo ou bário, e íons de O”. Como um exem- plo, um elemento piezoelétrico 86 de PZT (titanato de zirconato de chumbo) define a extremidade inferior do transdutor e fica exposto a partir do exterior da extremidade inferior do alojamento. O elemento piezoelétrico é suportado em seu perímetro por uma pequena camada elástica 98, por exemplo, epóxi, silicone ou material similar, localizada entre o elemento piezoelétrico e o alojamento. Em outras palavras, nenhuma placa de desgaste ou material de suporte está presente. No entanto, em algumas modalidades, há uma camada de plástico ou ou- tro material que separa o elemento piezoelétrico do fluido no qual a onda acústica estacionária está sendo gerada. O material piezoelétrico / elemento / cristal possui uma superfície exterior (que fica exposta) e uma superfície interior também.

[0081] Os parafusos 88 prendem uma placa superior de alumínio 82a do alojamento ao corpo 82b do alojamento através de roscas. À placa superior inclui um conector 84 para alimentar o transdutor. A su- perfície superior do elemento piezoelétrico 86 está conectada a um eletrodo positivo 90 e um eletrodo negativo 92, que são separados por um material isolante 94. Os eletrodos podem ser feitos de qualquer material condutor, tal como prata ou níquel. A energia elétrica é forne- cida ao elemento piezoelétrico 86 através dos eletrodos no elemento piezoelétrico. Observe que o elemento piezoelétrico 86 não possui camada de suporte ou camada de epóxi. Dito de outra forma, há um volume interior ou um espaço de ar 87 no transdutor entre a placa su- perior de alumínio 82a e o elemento piezoelétrico 86 (isto é, o espaço de ar fica completamente vazio). Um suporte mínimo 58 e / ou placa de desgaste 50 pode ser fornecido em algumas modalidades, como visto na figura 6.

[0082] O projeto do transdutor pode afetar o desempenho do sis- tema. Um transdutor típico é uma estrutura em camadas com o ele- mento piezoelétrico de cerâmica ligado a uma camada de suporte e uma placa de desgaste. Como o transdutor é carregado com a alta im- pedância mecânica apresentada pela onda estacionária, as diretrizes de projeto tradicionais para placas de desgaste, por exemplo, meia espessura de comprimento de onda para aplicações de ondas estaci- onárias ou um quarto de espessura de comprimento de onda para aplicações de radiação, e os métodos de fabricação podem não ser adequados. Em vez disso, em uma modalidade da presente descrição dos transdutores, não há placa de desgaste ou suporte, permitindo que o elemento piezoelétrico vibre em um de seus modos próprios com um fator Q alto, ou em uma combinação de vários modos pró- prios. O elemento / disco piezoelétrico de cerâmica vibratório fica dire- tamente exposto ao fluido que flui através da célula do fluido.

[0083] A remoção do apoio (por exemplo, fazendo o elemento pie- zoelétrico ficar com ar) também permite que o elemento piezoelétrico de cerâmica vibre nos modos de vibração de ordem superior com pou- co amortecimento (por exemplo, deslocamento modal de ordem supe- rior). Em um transdutor com um elemento piezoelétrico com um supor- te, o elemento piezoelétrico vibra com um deslocamento mais unifor- me, como um pistão. A remoção do suporte permite que o elemento piezoelétrico vibre em um modo de deslocamento não uniforme. Quan- to mais alta a forma de modo do elemento piezoelétrico, mais linhas nodais o elemento piezoelétrico possui. O deslocamento modal de or- dem superior do elemento piezoelétrico cria mais linhas de captura, embora a correlação da linha de captura com o nó não seja necessari- amente uma a uma, e o acionamento do elemento piezoelétrico a uma frequência mais alta não necessariamente produzirá mais linhas de captura.

[0084] Em algumas modalidades do dispositivo de filtragem acús- tica da presente descrição, o elemento piezoelétrico pode ter um su- porte que afeta minimamente o fator Q do elemento piezoelétrico (por exemplo, menos de 5%). O suporte pode ser feito de um material substancialmente acusticamente transparente, tais como madeira bal- sa, espuma ou cortiça, que permite que o elemento piezoelétrico vibre em uma forma de modo de ordem superior e mantenha um alto fator Q, enquanto ainda fornecendo algum suporte mecânico para o ele- mento piezoelétrico. A camada de suporte pode ser sólida ou pode ser uma treliça com orifícios através da camada, de modo que a treliça siga os nodos do elemento piezoelétrico vibratório em um modo de vibração de ordem superior particular, fornecendo suporte nas locali- zações dos nodos, enquanto permitindo que o restante do elemento piezoelétrico vibre livremente. O objetivo do trabalho de treliça ou ma- terial acusticamente transparente é fornecer suporte sem diminuir o fator Q do elemento piezoelétrico ou interferir na excitação de uma forma de modo particular.

[0085] A colocação do elemento piezoelétrico em contato direto com o fluido também contribui para o alto fator Q, evitando os efeitos de amortecimento e absorção de energia da camada de epóxi e da placa de desgaste. Outras modalidades do (s) transdutor (es) podem ter placas de desgaste ou uma superfície de desgaste para impedir que o PZT, que contém chumbo, entre em contato com o fluido hospe- deiro. Isto pode ser desejável, por exemplo, em aplicações biológicas, tais como separação de sangue, perfusão biofarmacêutica ou filtração por lotes de células de mamíferos. Tais aplicações podem usar uma camada de desgaste, tais como cromo, níquel eletrolítico ou níquel sem eletrólito. A deposição química de vapor também pode ser usada para aplicar uma camada de poli (p-xilileno) (por exemplo, Parileno) ou outro polímero. Revestimentos orgânicos e biocompatíveis, tal como silicone ou poliuretano, também são usáveis como uma superfície de desgaste. Filmes finos, tal como um filme de polieteretercetona (PE- EK), também podem ser usados como uma cobertura da superfície do transdutor exposta ao fluido com a vantagem de ser um material bio- compatível. Em uma modalidade, o filme de PEEK é aderido à face do material piezoelétrico usando adesivo sensível à pressão (PSA). Ou- tros filmes também podem ser usados.

[0086] Em algumas modalidades, o transdutor ultrassônico tem uma frequência de ressonância nominal de 2 MHz. Cada transdutor pode consumir cerca de 28 W de energia para captura de gotículas a uma taxa de fluxo de 11,36 L por minuto (3 GPM (galões por minuto)). Isso se traduz em um custo de energia de 0,25 kWh / mê. Isso é uma indicação do custo muito baixo de energia dessa tecnologia. Deseja- velmente, cada transdutor é alimentado e controlado por seu próprio amplificador. Em outras modalidades, o transdutor ultrassônico usa um elemento piezoelétrico quadrado, por exemplo, com dimensões de 2,54 cm x 2,54 cm (1" x 1"). Como alternativa, o transdutor ultrassônico pode usar um elemento piezoelétrico retangular, por exemplo, com di- mensões de 2,54 cm x 6,35 cm (1" x 2,5"). A dissipação de energia por transdutor foi de 10 W por área de seção transversal do transdutor de 2,54 cm x 2,54 cm (1" x 1") e por polegada de extensão da onda acús- tica estacionária, a fim de obter forças de captura acústicas suficien- tes. Para uma extensão de 10,16 cm (4") de um sistema de escala in- termediária, cada transdutor quadrado de 2,54 cm x 2,54 cem (1" x 1") consome 40 W. O transdutor retangular maior de 2,54 cm x 6,35 cm (1" x 2,5") usa 100 W em um sistema de escala intermediária. A matriz de três transdutores quadrados de 2,54 cm x 2,54 cm (1" x 1") consu- miria um total de 120 W e a matriz de dois transdutores de 2,54 cm x 6,35 cm (1" x 2,5") consumiria cerca de 200 W. As matrizes de trans-

dutores com espaçamento estreito representam modalidades alternati- vas potenciais da tecnologia. O tamanho, a forma, o número e a locali- zação do transdutor podem ser variados como desejado para gerar os padrões de ondas estacionárias acústicas multidimensionais deseja- dos.

[0087] O tamanho, a forma e a espessura do transdutor determi- nam o deslocamento do transdutor em diferentes frequências de exci- tação, o que, por sua vez, afeta a eficiência da separação. Normal- mente, o transdutor é operado em frequências próximas à frequência de ressonância de espessura (meio comprimento de onda). Gradientes no deslocamento do transdutor normalmente resultam em mais locais de captura para as células / biomoléculas. Deslocamentos modais de ordem superior geram ondas estacionárias acústicas tridimensionais com gradientes fortes no campo acústico em todas as direções, dessa forma criando forças de radiação acústica igualmente fortes em todas as direções, levando a várias linhas de captura, em que o número de linhas de captura se correlaciona com a forma do modo particular do transdutor.

[0088] Para investigar o efeito do perfil de deslocamento do trans- dutor na força de captura acústica e na eficiência de separação, uma experiência foi repetida dez vezes usando um transdutor quadrado de 2,54 cm x 2,54 cm (1" x 1”), com todas as condições idênticas, exceto a frequência de excitação. Dez frequências de ressonância acústica consecutivas, indicadas pelos números 1-9 circulados e pela letra A na figura 7, foram usadas como frequências de excitação. As condições foram a duração do experimento de 30 min, uma concentração de óleo de 1000 ppm de gotículas de óleo SAE-30 de aproximadamente 5 mí- crons, uma vazão de 500 mL / min e uma potência aplicada de 20 W. Gotículas de óleo foram usadas porque o óleo é menos denso que a água e pode ser separado da água usando a acustoforese.

[0089] A figura 7 mostra a amplitude da impedância elétrica medi- da de um transdutor quadrado em função da frequência nas proximi- dades da ressonância do transdutor de 2,2 MHz. Os mínimos na im- pedância elétrica do transdutor correspondem às ressonâncias acústi- cas da coluna de água e representam as frequências potenciais para operação. Ressonâncias adicionais existem em outras frequências on- de ondas estacionárias multidimensionais são excitadas. A modela- gem numérica indicou que o perfil de deslocamento do transdutor varia significativamente nessas frequências de ressonância acústica e, por- tanto, afeta diretamente a onda acústica estacionária e a força de cap- tura resultante. Como o transdutor opera perto de sua ressonância de espessura, os deslocamentos das superfícies do eletrodo ficam es- sencialmente fora de fase. O deslocamento típico dos eletrodos do transdutor não é uniforme e varia dependendo da frequência de exci- tação. Como exemplo, em uma frequência de excitação com uma úni- ca linha de gotículas de óleo presas, o deslocamento tem um único máximo no meio do eletrodo e mínimos próximos às bordas do trans- dutor. Em outra frequência de excitação, o perfil do transdutor possui vários máximos levando a várias linhas retidas de gotículas de óleo. Padrões de deslocamento de transdutor de ordem superior resultam em forças de captura mais altas e em várias linhas de captura estáveis para as gotículas de óleo capturadas.

[0090] À medida que a emulsão de óleo e água passou pelo trans- dutor, as linhas de captura de gotículas de óleo foram observadas e caracterizadas. A caracterização envolveu a observação e o padrão do número de linhas de captura através do canal de fluido, como mostra- do na figura 8, para sete das dez frequências de ressonância identifi- cadas na figura 7. Diferentes perfis de deslocamento do transdutor po- dem produzir diferentes (mais) linhas de captura nas ondas estacioná- rias, com mais gradientes no perfil de deslocamento geralmente crian-

do forças de captura mais altas e mais linhas de captura.

[0091] A figura 9 é um modelo numérico que mostra um campo de pressão que corresponde ao padrão de 9 linhas de captura. O modelo numérico é um modelo bidimensional; e, portanto, apenas três linhas de captura são observadas. Existem mais dois conjuntos de três linhas de captura na terceira dimensão perpendicular ao plano da página.

[0092] A força lateral da força de radiação acústica gerada pelo transdutor pode ser aumentada acionando o transdutor em formas de modo de ordem superior, em oposição a uma forma de vibração em que o cristal se move efetivamente como um pistão com um desloca- mento uniforme. Em algumas implementações de exemplo, as formas do modo de ordem superior são funções de Bessel. A pressão acústi- ca é proporcional à tensão de acionamento do transdutor. A energia elétrica é proporcional ao quadrado da tensão. O transdutor é tipica- mente uma placa piezoelétrica fina, com campo elétrico no eixo z e deslocamento primário no eixo z. O transdutor é tipicamente acoplado de um lado pelo ar (ou seja, o espaço de ar dentro do transdutor) e do outro lado pela mistura de fluidos que contém as partículas que serão interagidas entre si. Os tipos de ondas geradas na placa são conheci- dos como ondas compostas. Um subconjunto de ondas compostas na placa piezoelétrica é similar às ondas de Lamb simétricas com vaza- mento (também conhecidas como compressivas ou extensionais). À natureza piezoelétrica da placa normalmente resulta na excitação de ondas simétricas de Lamb. As ondas estão vazando porque elas irra- diam para a camada de água, o que resulta na geração das ondas es- tacionárias acústicas na camada de água. As ondas de Lamb existem em placas finas de extensão infinita, com condições livres de estresse em suas superfícies. Como os transdutores desta modalidade são de natureza finita, os deslocamentos modais reais são mais complicados.

[0093] A figura 10 mostra a variação típica do deslocamento no plano (deslocamento x) e deslocamento fora do plano (deslocamento y) através da espessura da placa, sendo o deslocamento no plano uma função par em toda a espessura da placa e o deslocamento fora do plano sendo uma função ímpar. Devido ao tamanho finito da placa, os componentes de deslocamento variam ao longo da largura e do comprimento da placa. Em geral, um modo (m, n) é um modo de des- locamento do transdutor no qual existem m ondulações no desloca- mento do transdutor na direção da largura e n ondulações na direção do comprimento e com a variação de espessura como descrito na figu- ra 10. O número máximo de m e n é uma função da dimensão do ma- terial piezoelétrico (por exemplo, um cristal piezoelétrico) e da fre- quência de excitação. Existem modos tridimensionais adicionais que não são da forma (m, n).

[0094] Os transdutores são acionados de modo que o elemento piezoelétrico vibra nos modos de ordem superior da fórmula geral (m, n), onde m e n são independentemente 1 ou maior. Geralmente, os transdutores vibrarão em modos de ordem superior a (2,2). Os modos de ordem superior produzirão mais nodos e antinodos, resultando em ondas estacionárias tridimensionais na camada de água, caracteriza- das por fortes gradientes no campo acústico em todas as direções, não apenas na direção das ondas estacionárias, mas também nas di- reções laterais. Como consequência, os gradientes acústicos resultam em forças de captura mais fortes na direção lateral.

[0095] Geralmente, o (s) transdutor (es) ultrassônico (s) pode (m) ser acionado (s) por um sinal elétrico, que pode ser controlado com base na tensão, corrente, ângulo de fase, potência, frequência ou qualquer outra característica do sinal elétrico. Em particular, o sinal de acionamento para o transdutor pode ser baseado em tensão, corrente, magnetismo, eletromagnetismo, capacitivo ou qualquer outro tipo de sinal ao qual o transdutor é responsivo. Em modalidades, o sinal de tensão que aciona o transdutor pode ter uma forma de onda senoidal, quadrada, dente de serra, pulsada ou triangular; e tem uma frequência de 500 kHz a 10 MHz. O sinal de tensão pode ser acionado com mo- dulação de largura de pulso, que produz qualquer forma de onda dese- jada. O sinal de tensão também pode ter a capacidade de iniciar / pa- rar a modulação de amplitude ou frequência para eliminar a transmis- são. Em modalidades particulares, o sinal de tensão pode ter uma fre- quência de cerca de 0,5 MHz a cerca de 30 MHz, de modo que tais frequências são produzidas pelo transdutor ultrassônico.

[0096] Os transdutores são usados para criar um campo de pres- são que gera forças de radiação acústica da mesma ordem de magni- tude, ortogonais à direção da onda estacionária e na direção da onda estacionária. Quando as forças são aproximadamente da mesma or- dem de magnitude, partículas do tamanho de 0,1 mícron a 300 mí- crons serão movidas de maneira mais eficaz em direção a "linhas de captura", de modo que as células e os ácidos nucleicos (quer nus ou em um vetor viral) ficam localizados juntos próximos um do outro, permitindo que eles reajam um com o outro.

[0097] Em aplicações biológicas, todas as partes do sistema (isto é, o biorreator, dispositivo de filtragem acústica, tubulação conectando o mesmo com fluido, etc.) podem ser separadas uma da outra e ser descartáveis. Evitar centrífugas e filtros permite uma melhor separação das células biológicas do fluido sem diminuir a viabilidade das células. Os transdutores também podem ser acionados para criar rápidas mu- danças de pressão para impedir ou eliminar bloqueios devido à aglo- meração de células biológicas. A frequência dos transdutores também pode ser variada para obter a eficácia ideal para uma determinada po- tência.

[0098] As técnicas e implementações descritas neste documento podem ser usadas para bioprocessamento automático contínuo inte-

grado. O controle pode ser distribuído para algumas ou todas as uni- dades envolvidas no bioprocessamento. O retorno das unidades pode ser fornecido para permitir uma visão geral do bioprocesso, que pode ser na forma de exibições de tela, retornos de controle, relatórios, rela- tórios de estado e outra transmissão de informações. O processamen- to distribuído permite um alto grau de flexibilidade na obtenção de um controle de processo desejado, por exemplo, coordenando etapas en- tre as unidades e fornecendo um controle executivo em lote.

[0099] Os dispositivos acustoforéticos usando um sistema de onda acústica pode ser implementado com materiais biocompatíveis, e po- dem incluir componentes de uso único e esterilizáveis com gama. O sistema de processamento também permite a medição do fluxo ultras- sônico, que não é invasivo e é capaz de operar com fluidos de alta vis- cosidade. O sistema pode ser implementado com conectores sépticos estéreis de uso único e uma interface gráfica do usuário (GUI) simples para controle. O dispositivo acustoforético é escalável. Por exemplo, uma unidade relativamente pequena é capaz de operar na escala de 2 La50L.

[00100] Os métodos, sistemas e dispositivos discutidos acima são exemplos. Várias configurações podem omitir, substituir ou adicionar vários procedimentos ou componentes, como apropriado. Por exem- plo, em configurações alternativas, os métodos podem ser executados em uma ordem diferente da descrita e que várias etapas podem ser adicionadas, omitidas ou combinadas. Além disso, os recursos descri- tos em relação a determinadas configurações podem ser combinados em várias outras configurações. Diferentes aspectos e elementos das configurações podem ser combinados de maneira similar. Além disso, a tecnologia evolui e, portanto, muitos dos elementos são exemplos e não limitam o escopo da descrição ou reivindicações.

[00101] Detalhes específicos são fornecidos na descrição para for-

necer um entendimento completo de configurações de exemplo (inclu- indo implementações). No entanto, configurações podem ser pratica- das sem esses detalhes específicos. Por exemplo, processos, estrutu- ras e técnicas bem conhecidas foram mostrados sem detalhes desne- cessários para evitar obscurecer as configurações. Esta descrição for- nece apenas exemplos de configurações e não limita o escopo, a apli- cabilidade ou as configurações das reivindicações. Em vez disso, a descrição anterior das configurações fornece uma descrição para im- plementar as técnicas descritas. Várias mudanças podem ser feitas na função e disposição dos elementos sem se afastar do espírito ou es- copo da descrição.

[00102] “Uma declaração de que um valor excede (ou é mais que) um primeiro valor limite é equivalente a uma declaração de que o valor atende ou excede um segundo valor limite que é ligeiramente maior que o primeiro valor limite, por exemplo, o segundo valor limite sendo um valor maior que o primeiro valor limite na resolução de um sistema relevante. Uma declaração de que um valor é menor que (ou está den- tro) de um primeiro valor limite é equivalente a uma declaração de que o valor é menor que ou igual a um segundo valor limite que é ligeira- mente inferior ao primeiro valor limite, por exemplo, o segundo valor limite sendo um valor menor que o primeiro valor limite na resolução do sistema relevante.

[00103] Além disso, as configurações podem ser descritas como um processo que é representado como um diagrama de fluxo ou diagrama de blocos. Embora cada um possa descrever as operações como um processo sequencial, muitas das operações podem ser executadas em paralelo ou simultaneamente. Além disso, a ordem das operações po- de ser reorganizada. Um processo pode ter estágios ou funções adici- onais não incluídos na figura.

[00104] Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar os dispo-

sitivos e processos da presente descrição. Os exemplos são mera- mente ilustrativos e não se destinam a limitar a descrição aos materi- ais, condições ou parâmetros de processo no presente documento es- tabelecidos.

EXEMPLOS Exemplo 1:

[00105] A figura 11 é uma imagem de um saco plástico contendo uma mistura de fluidos com células T e vírus. O saco plástico foi colo- cado em um dispositivo acustoforético que estava cheio de água. Uma onda estacionária acústica multidimensional foi gerada, fazendo com que as células T e os vírus interagissem entre si. Isso é visível como uma série de feixes de discos dentro do saco plástico.

Exemplo 2:

[00106] O sistema de BacMamO (ThermoFisher Scientific) usa ba- culovírus para a transdução, e foi usado para a transdução de proteína fluorescente verde (GFP) em células T de Jurkat. Este sistema foi usado para várias experiências. Cinco resultados são mostrados abai- xo. Eles foram identificados como Controle, Controle de Processo 1, Controle de Processo 2, Acústica 3MHz e Acústica 10MHz.

[00107] O experimento Controle, o experimento Controle de Pro- cesso 1 e o experimento Controle de Processo 2 não foram expostos a ondas estacionárias acústicas.

[00108] Parao experimento Acústica 3MHz, a interação entre as células T e os vírus foi aprimorada usando uma onda acústica estacio- nária de frequência nominal de 3 Hz.

[00109] Parao experimento de Acústica 10MHz, a interação entre as células T e os vírus foi aprimorada usando uma onda estacionária acústica de frequência nominal de 10 Hz.

[00110] Os resultados estão listados na Tabela A abaixo. O MOl é a multiplicidade de infecção ou o número de partículas de vetores virais por célula. O GFP + é a % de células que expressaram o GFP.

Tabela A.

gemas — p=" Controle de Processo 1 Controle de Processo 2

[00111] O uso da acústica resultou em eficiência de transdução equivalente, com 80% menos partículas virais por célula.

Exemplo 3:

[00112] Uma câmara acústica incluía um transdutor ultrassônico e um refletor. Um circuito fechado de recirculação extraiu fluido de uma extremidade da câmara acústica e depois circulou o fluido de volta através da outra extremidade para dentro da câmara acústica. A câ- mara acústica tinha um volume de cerca de 1 mL e o circuito fechado de recirculação tinha um volume de cerca de 3 mL. Os testes de transdução foram realizados usando a câmara acústica.

[00113] Foram realizados quatro testes acústicos usando a câmara acústica com recirculação. Para dois testes acústicos, a acústica foi ligada no nível de potência de 1 W, para determinar o efeito da acústi- ca na eficiência da transdução. Nos outros dois testes, a acústica foi desativada (apenas recirculação).

[00114] Cada teste acústico também foi realizado com uma execução de controle e uma execução estática. Para a execução do controle, o ví- rus foi adicionado às células em uma placa de Petri e depois lavado ime- diatamente. Para a execução estática, o vírus foi adicionado às células em uma placa de Petri por 90 minutos e depois lavado. O MOI (o número de partículas de vetores virais por célula) para esses testes foi de 25.

Para todas as execuções, a viabilidade celular foi medida por nucleo- contador. Para cada execução acústica, a viabilidade celular também foi medida usando um analisador de viabilidade celular Vi-Cell.

[00115] A tabela B indica os parâmetros de cada teste. A tabela C indica os resultados de cada execução de teste. A tabela D fornece a análise do Vi-Cell. A tabela E fornece a análise do Nucleocontador. Na Tabela C, o ganho de transdução é a eficiência acústica dividida pela eficiência estática. Tabela B. Teste Volume |Vazão Potência acústica (W) |Número total de | Recirculações

F EEE a a a Efe fe fume o o et er Name areas de Tabela C. padrão (%) |(%) (%) transdução 7 eee 5 oa a 7 fee ms og | fee 5 e e E bo 2 emas ia og —s — 2 ese fr > «je TA 2 fase e e e e e 2 fee Tao ha a 2 fee us 7 a | Jem ps he e 1 Jesse me he e TA fee Ter e fa

Tabela D. Teste Células |Recuperação | Recuperação | Eficiência |Células Trans-|Razão de parti-|de célula (%) |de célula |(%) duzidas viáveis Tabela E. Teste Células |Recuperação | Recuperação |Eficiência [Células Trans- Razão de parti- |de célula (%) |de célula viá-|(%) duzidas viáveis

[00116] Como pode ser visto na Tabela C, o uso da recirculação melhorou a eficiência da transdução. O uso de acústica, além da recir- culação, melhorou ainda mais a eficiência da transdução. Referindo-se à Tabela D, as duas execuções com acústica e recirculação (execu- ções 1 e 2) mostraram cerca de 72% mais células transduzidas viáveis totais em comparação com as duas execuções com recirculação, mas sem acústica (execuções 3 e 4). Referindo-se à Tabela E, as duas execuções com acústica e recirculação (Execuções 1 e 2) mostraram cerca de 68% mais células transduzidas viáveis totais em comparação com as duas execuções com recirculação, mas sem acústica (Execu- ções 3 e 4). Exemplo 4:

[00117] Três testes acústicos foram realizados usando a câmara acústica com recirculação, tal como descrito no Exemplo 3, mas para tempos de execução de 30 minutos, 60 minutos e 90 minutos. A acús-

tica foi executada a uma frequência de 2 MHz e a uma potência de 3,5 W. As execuções de controle e estática também foram executadas como descrito no Exemplo 3, mas por 30 minutos, 60 minutos ou 90 minutos. A tabela F indica os parâmetros de cada teste. Os resultados são mostrados na figura 12. Como visto lá, à medida que o tempo de execução aumentava, a eficiência da transdução, em comparação com sem acústica, melhorou. Tabela F. Tempo delConcentração de/Vazão (mL |Volume Volume total |Volume — de execução célula (10º / mL) |/min) acústico (mL) | (mL) controle (mL) e es es

[00118] Tendo descrito várias configurações de exemplo, várias modificações, construções alternativas e equivalentes podem ser usa- dos sem se afastar do espírito da descrição. Por exemplo, os elemen- tos acima podem ser componentes de um sistema maior, em que ou- tras estruturas ou processos podem ter precedência sobre ou, de outra forma, modificar a aplicação da invenção. Além disso, várias opera- ções podem ser realizadas antes, durante ou após a consideração dos elementos acima. Por conseguinte, a descrição acima não vincula o escopo das reivindicações.

Claims (26)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para introduzir ácidos nucleicos estranhos nas células, caracterizado pelo fato de que compreende: colocar as células e os ácidos nucleicos em um dispositivo acustoforé- tico que compreende: uma câmara acústica na qual as células e os ácidos nuclei- cos são colocados e um transdutor ultrassônico incluindo um material piezoelé- trico que pode ser acionado para criar uma onda acústica estacionária na câmara acústica e acionar o transdutor ultrassônico para criar a onda acústica estacionária multidimensional; em que pelo menos as células ficam retidas pela onda acústica estacionária, os ácidos nucleicos ficando localizados juntos com as células para permitir a introdução dos ácidos nucleicos estra- nhos nas células.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os ácidos nucleicos estão em um vetor viral.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a abertura de poros nas membra- nas celulares das células antes de localizar junto as células com os ácidos nucleicos.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os poros são abertos por eletroporação, sonoporação ou pela exposição ao fosfato de cálcio.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dispositivo acustoforético compreende ainda um cir- cuito fechado de recirculação acoplado à câmara acústica; e uma ou mais das células ou dos ácidos nucleicos são recirculados através da câmara acústica.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células são células de ovário de hamster chinês (CHO), células de hibridoma NSO, células de rim de hamster bebê (BHK), células humanas, células T reguladoras, células T auxiliares, células T citotóxicas, células T de memória, células T efetoras, células T gama delta, células T Jurkat, células CAR-T, células B ou células NK, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), algas, célu- las vegetais ou bactérias.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a onda estacionária acústica é uma onda estacionária acústica multidimensional, uma onda estacionária planar ou uma com- binação de uma onda estacionária acústica multidimensional e uma onda estacionária planar.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o transdutor ultrassônico é acionado a uma frequência de cerca de 0,5 MHz a cerca de 20 MHz.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a frequência da onda acústica estacionária é variada em um padrão de varredura para mover as células em relação aos ácidos nucleicos.

10. Método para causar transdução de células, caracteriza- do pelo fato de que compreende: colocar as células e um vetor viral compreendendo ácidos nucleicos em um dispositivo acustoforético compreendendo: uma câmara acústica na qual as células e o vetor viral são colocados e um transdutor ultrassônico incluindo um material piezoelé- trico que pode ser acionado para criar uma onda acústica estacionária na câmara acústica e acionar o transdutor ultrassônico para criar a onda estacio-

nária acústica multidimensional; em que as células e o vetor viral ficam localizados juntos pela onda acústica estacionária para permitir a transdução das células.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracteriza- do pelo fato de que as células e o vetor viral ficam suspensos em um fluido.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracteriza- do pelo fato de que as células são células de ovário de hamster chinês (CHO), células de hibridoma NSO, células de rim de hamster bebê (BHK), células humanas, células T reguladoras, células T auxiliares, células T citotóxicas, células T de memória, células T efetoras, células T gama delta, células T Jurkat, células CAR-T, células B ou células NK, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), algas, célu- las vegetais ou bactérias.

13. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracteriza- do pelo fato de que o dispositivo acustoforético compreende ainda um circuito fechado de recirculação acoplado à câmara acústica; e uma ou mais das células ou dos ácidos nucleicos são recirculados através da câmara acústica.

14. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracteriza- do pelo fato de que o transdutor ultrassônico é acionado a uma fre- quência de cerca de 0,5 MHz a cerca de 20 MHz.

15. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracteriza- do pelo fato de que a frequência da onda acústica estacionária é vari- ada em um padrão de varredura para mover as células em relação ao vetor viral.

16. Método para causar a transfecção de células, caracteri- zado pelo fato de que compreende: abrir poros nas membranas celulares das células; colocar as células e os ácidos nucleicos em um dispositivo acustoforético, que compreende: uma câmara acústica na qual as células e os ácidos nuclei- cos são colocados e um transdutor ultrassônico incluindo um material piezoelé- trico que pode ser acionado para criar uma onda acústica estacionária na câmara acústica e acionar o transdutor ultrassônico para criar a onda acústica estacionária; em que as células e os ácidos nucleicos ficam localizados juntos pela onda acústica estacionária para causar a transfecção das células.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracteriza- do pelo fato de que os poros são abertos por eletroporação, sonopora- ção ou pela exposição ao fosfato de cálcio.

18. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracteriza- do pelo fato de que os poros são abertos antes ou depois das células serem colocadas no dispositivo acustoforético.

19. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracteriza- do pelo fato de que o dispositivo acustoforético compreende ainda um circuito fechado de recirculação acoplado à câmara acústica; e uma ou mais das células ou dos ácidos nucleicos são recirculados através da câmara acústica.

20. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracteriza- do pelo fato de que as células são células de ovário de hamster chinês (CHO), células de hibridoma NSO, células de rim de hamster bebê (BHK), células humanas, células T reguladoras, células T auxiliares, células T citotóxicas, células T de memória, células T efetoras, células T gama delta, células T Jurkat, células CAR-T, células B ou células NK, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), algas, célu- las vegetais ou bactérias.

21. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracteriza- do pelo fato de que a onda estacionária acústica é uma onda estacio- nária acústica multidimensional, uma onda estacionária planar ou uma combinação de uma onda estacionária acústica multidimensional e uma onda estacionária planar.

22. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracteriza- do pelo fato de que o transdutor ultrassônico é acionado a uma fre- quência de cerca de 0,5 MHz a cerca de 20 MHz.

23. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracteriza- do pelo fato de que a frequência da onda acústica estacionária é vari- ada em um padrão de varredura para mover as células em relação aos ácidos nucleicos.

24. Células, caracterizadas pelo fato de serem produzidas pelo método como definido na reivindicação 1.

25. Células, caracterizadas pelo fato de serem produzidas pelo método como definido na reivindicação 10.

26. Células, caracterizadas pelo fato de serem produzidas pelo método como definido na reivindicação 16.