KR102487074B1 - 형질감염 및 형질도입을 위한 음향 처리 - Google Patents

형질감염 및 형질도입을 위한 음향 처리 Download PDF

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Abstract

음향 처리를 사용하여, 예컨대, 형질감염/형질도입을 수행하여, 외래 핵산을 세포 내로 도입하는 방법은 여기에 개시된다. 외래 DNA/RNA 및 세포는, 다-차원 음향 정재파에 함께-위치되거나 또는 음향 스트리밍에 의해 함께-위치된다.

Description

형질감염 및 형질도입을 위한 음향 처리
본 출원은 2018년 3월 9일자에 출원된, 미국 가 특허출원 제62/641,234호, 및 2018년 4월 6일자에 출원된, 미국 특허출원 제15/947,746호의 우선권을 주장하며, 이들 모두의 전체적인 내용은 여기에 참조로서 병합된다.
본 개시는, 예컨대, 음향파 (acoustic waves)를 활용한 형질감염 (transfection) 및 형질도입 (transduction)에 의해, 외래 핵산 (foreign nucleic)을 세포 내로 도입하는 방법에 관한 것이다. 또한, 이러한 방법에 의해 생성된 세포 및 관련 조성물은 포함된다. 이러한 방법 및 조성물은 세포 요법 적용들 (cell therapy applications)에 유용할 수 있다.
형질감염 및 형질도입은, 핵산 (DNA 또는 RNA)을 세포 내로 의도적으로 도입하기 위한 공정이다. 형질도입은 박테리오파지 (bacteriophage) 또는 기타 바이러스와 같은, 바이러스 벡터 (viral vector)를 사용하여 수행된다. 아데노바이러스, 렌티바이러스 (lentivirus), 또는 파라믹소바이러스 (paramyxovirus)와 같은, 바이러스는 통상 사용된다. 형질감염은, 비-바이러스성 방법 (non-viral methods)을 사용하여 세포 내로 핵산의 도입을 지칭한다.
본 개시은, 다양한 구현 예에서, 예컨대, 음향파를 사용하여 세포의 형질감염 또는 형질도입을 수행하여, 외래 핵산 (DNA/RNA)을 세포 내로 도입하는 공정에 관한 것이다. 매우 일반적으로, 음향파는, 핵산이 세포로 전달될 수 있도록, 세포와 핵산을 함께 가져오는데 사용된다. 음향 장치는 이러한 목적을 위해 사용될 수 있으며, 이러한 장치는 여기에 기재된다. 또한, 이러한 방법에 의해 생성된 세포 및 관련 조성물은 포함된다.
다양한 구현 예에서, 세포의 형질감염 또는 형질도입을 일으키는 방법은 여기에 개시된다. 핵산은 나출형 (naked)일 수 있거나, 또는 이들은 바이러스 벡터에 있을 수 있다. 세포 및 핵산은, 예를 들어, 음향영동 장치 (acoustophoretic device) 내로 삽입된 백 (bag)에 이들을 배치하거나, 또는 음향영동 장치를 통해 세포 및 핵산 모두를 함유하는 유체 혼합물을 유동시켜, 음향영동 장치에 배치된다. 음향영동 장치는: 세포 및 핵산이 배치되는 음향 챔버; 및 초음파 변환기 (ultrasonic transducer) 및 상기 초음파 변환기 맞은편의 반사기 (reflector)를 포함하며, 상기 초음파 변환기는 음향 챔버 내에 다-차원 음향 정재파 (multi-dimensional acoustic standing wave)를 생성하도록 구동될 수 있는 압전 물질 (piezoelectric material)을 포함한다. 초음파 변환기는 음향 정재파를 생성하도록 구동된다. 결과적으로, 세포 및 핵산은, 음향 정재파에 의해 함께-위치된다 (co-located). 달리 말하면, 세포 및 핵산은 서로 반응할 수 있도록 서로 충분히 아주 근접하게 배치된다. 음향 정재파는 다-차원 음향 정재파, 평면 정재파 (planar standing wave), 또는 모두의 조합일 수 있다.
몇몇 구현 예에서, 핵산은 바이러스 벡터 내에 있다. 형질도입은, 바이러스가 표적 세포에 그 자체를 부착하고, 핵산을 표적 세포 내로 주입할 때, 발생할 수 있다. 다른 구현 예에서, 세포와 핵산을 함께-위치시키기 전에, 기공 (pores)은 세포의 세포막에서 개방된다. 형질감염은, 핵산이 세포에, 예를 들어, 기공을 통해 진입할 때, 발생할 수 있다. 기공은, 전기 천공법 (electroporation), 세포 천공법 (sonoporation), 또는 인산 칼슘에 노출에 의해 개방될 수 있다.
(나출형 또는 바이러스 벡터 내에) 세포 및 핵산은, 유체에서 현탁될 수 있다. 이러한 유체는, 세포 배양 배지, 물, 식염수 용액, 및 이와 유사한 것을 포함할 수 있다.
특정 구현 예에서, 세포는, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0 하이브리도마 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 인간 세포, 조절 T-세포, 헬퍼 T-세포, 세포독성 T-세포, 기억 T-세포, 이펙터 T-세포 (effector T-cells), 감마 델타 T-세포, Jurkat T-세포, CAR-T 세포, B 세포, 또는 NK 세포, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs), 조류, 식물 세포, 또는 박테리아이다.
초음파 변환기는 약 5분 내지 약 15분의 기간 동안 구동될 수 있지만, 이러한 기간은 원하는 대로 변할 수 있다. 초음파 변환기는, 약 0.5 MHz 내지 약 20 MHz의 주파수에서 구동될 수 있다. 몇몇 구현 예에서, 다-차원 음향 정재파의 주파수는, 스윕 패턴 (sweep pattern)으로 변화되어 핵산에 대해 세포를 이동시킨다.
초음파 변환기의 압전 물질은, 티탄산 지르콘산 연 (PZT) 또는 니오브산 리튬 (lithium niobate)일 수 있다. 음향영동 장치는, 초음파 변환기를 냉각시키기 위한 냉각 유닛 (cooling unit)을 더욱 포함할 수 있다.
세포의 형질도입을 일으키는 방법은 또한 여기에 개시된다. 핵산을 포함하는 바이러스 벡터 및 세포는: 음향 챔버; 및 상기 음향 챔버 내에 다-차원 음향 정재파, 평면 음향 정재파, 또는 평면 및 다차원 음향 정재파의 조합을 생성하도록 구동될 수 있는 압전 물질을 포함하는 초음파 변환기를 포함하는 음향영동 장치에 배치된다. 초음파 변환기는, 다-차원 음향 정재파, 평면 음향 정재파, 또는 다-차원 및 평면 음향 정재파의 조합을 생성하도록 구동된다. 세포 및 바이러스 벡터는, 음향 정재파에 의해 함께-위치되어 세포의 형질도입을 일으킨다.
세포의 형질감염을 일으키는 방법은 또한 개시된다. 기공은 세포의 세포막에서 개방된다. 세포는: 음향 챔버; 및 상기 음향 챔버 내에 음향 정재파를 생성하도록 구동될 수 있는 압전 물질을 포함하는 초음파 변환기를 포함하는 음향영동 장치에 핵산과 함께 배치된다. 음향 정재파는, 다-차원 음향 정재파, 평면 음향 정재파, 또는 평면 및 다차원 음향 정재파의 조합일 수 있다. 기공은 세포가 음향영동 장치에 배치되기 전 또는 후에 개방될 수 있다. 초음파 변환기는 그 다음 구동되어 음향 정재파를 생성한다. 세포 및 핵산은 음향 정재파에 의해 함께-위치되어 세포의 형질감염을 일으킨다.
이들 및 기타 비-제한적인 특징은 이하 좀 더 구체적으로 기재된다.
본 명세서에 병합되고, 본 명세서의 일부를 구성하는, 첨부 도면은, 여기에 개시된 주제의 특정 관점을 나타내고, 상세한 설명과 함께, 개시된 실행과 관련된 원리 중 일부를 설명하는 것을 돕는다.
도 1은, 바이러스 형질도입의 효율이 향상되는, 본 개시의 방법/공정을 예시하는 도면이다. 세포 배양물 (cell culture)은, 녹색 형광 단백질 (GFP)로 태그된 바이러스 벡터와 조합되고, 음향 처리 (acoustic processing)에 노출되며, 여기서, 다-차원 음향 정재파는 세포와 바이러스를 서로 매우 근접하게 이동시켜, 반응 효율을 향상시킨다. 세척 및 밤새 배양 후, GFP는 세포에서 발현되고, 따라서 형질도입이 발생됨을 나타낸다.
도 2a는, 변환기를 냉각시키기 위한 냉각 유닛을 포함하는 본 개시에 따른 대표 음향영동 장치의 분해 사시도이다. 도 2b는, 도 2a의 조립된 장치의 사시도이다.
도 3은, 본 개시의 방법/공정을 실시하는데 사용될 수 있는 또 다른 음향영동 장치의 사시도이다. 플라스틱 백과 같은, 일회용 용기는, 하나 이상의 초음파 변환기를 함유하는 별도의 음향영동 장치에서 서로 상호작용을 일으키는 2개의 입자 타입 (particle types)을 갖는 유체 혼합물을 함유한다.
도 4는 종래의 초음파 변환기의 단면도이다.
도 5는, 본 개시의 초음파 변환기의 단면도이다. 상기 변환기 내에 에어 갭 (air gap)이 존재하고, 백킹층 (backing layer) 또는 웨어 플레이트 (wear plate)는 존재하지 않는다.
도 6은, 본 개시의 초음파 변환기의 단면도이다. 상기 변환기 내에 에어 갭이 존재하고, 백킹층 또는 웨어 플레이트도 존재한다.
도 7은, 다른 주파수에서 구동되는 정사각 변환기 (square transducer)에 대한 전기 임피던스 진폭 (electrical impedance amplitude) 대 주파수의 그래프이다.
도 8은, 유체 흐름 (fluid flow)에 직교하는 방향으로부터 도 7의 7개의 공진 주파수 (최소의 전기 임피던스 진폭)에 대한 포획 라인 구성 (trapping line configuration)을 예시한다.
도 9는, 음압 진폭 (Pa 단위의 우-측 스케일 (scale)) 및 변환기 면외 변위 (transducer out of plane displacement) (미터 단위의 좌-측 스케일)의 컴퓨터 시뮬레이션이다. 좌-측 스케일의 상부에 텍스트는 "x10-7"으로 판독된다. 위쪽에 있는 삼각형으로 좌-측 스케일의 상부에 텍스트는, "1.473x10-6"으로 판독된다. 아래쪽에 있는 삼각형으로 좌-측 스케일의 하부에 텍스트는, "1.4612x10-10"으로 판독된다. 우-측 스케일의 상부에 텍스트는 "x106"으로 판독된다. 위쪽에 있는 삼각형으로 우-측 스케일의 상부에 텍스트는, "1.1129x106"으로 판독된다. 아래쪽에 있는 삼각형으로 우-측 스케일의 하부에 텍스트는, "7.357"로 판독된다. 삼각형은 주어진 스케일에 대해 이러한 도에 도시된 최대값 및 최소값을 나타낸다. 가로 축은 X-축 (인치)를 따라 챔버 내에 위치이며, 세로 축은 Y-축 (인치)을 따라 챔버 내에 위치이다.
도 10은, 합성파 (composite waves)가 존재하는 결정 (crystal)의 면-내 및 면-외 변위를 나타낸다.
도 11은, T-세포 및 바이러스가 서로 상호작용하는 플라스틱 백의 사진이다.
도 12는, 다른 실행 시간 (30, 60, 및 90분)을 갖는 3개의 실험에 대한 형질도입 효율 (음향/음향이 없음) 대 형질도입 시간의 비를 나타내는 그래프이다.
본 개시는, 다음의 바람직한 구현 예의 상세한 설명 및 그 안에 포함된 실시 예를 참조하면 좀 더 쉽게 이해될 수 있다. 다음의 명세서 및 청구범위에서, 언급은, 다음의 의미를 갖는 것으로 정의될 다수의 용어에 대해 만들어질 것이다.
비록 하기 상세한 설명에서 특정 용어가 명확성을 위해 사용되지만, 이들 용어는 도면에서 예시를 위해 선택된 구현 예들의 특정 구조만을 지칭하는 것으로 의도되며, 본 개시의 범주를 한정하거나 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 이하, 도면 및 하기 상세한 설명에서, 유사한 숫자 표시는, 유사한 기능의 구성요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
단어의 단수 형태는, 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
용어 "포함하는"는, 명명된 구성요소의 존재를 필요로 하고, 다른 구성요소의 존재를 허용하는 것으로 여기에서 사용된다. 용어 "포함하는"는, 명명된 구성요소의 제조로부터 결과할 수 있는 불순물과 함께, 오직 명명된 구성요소의 존재를 허용하는, 용어 "이루어진"을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
수치 값은, 동일한 수의 유효 숫자로 감소되는 경우 동일한 수치 값 및 값을 결정하기 위해 본 출원에서 기재된 타입의 종래의 측정 기술의 실험 오차 미만 만큼 명시된 값과 다른 수치 값을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
여기에 개시된 모든 범위는, 인용된 말단점을 포함하고, 독립적으로 조합 가능하다 (예를 들어, "2 grams 내지 10 grams"의 범위는, 말단점인, 2 grams 및 10 grams, 및 모든 중간 값을 포함한다). 여기에 개시된 범위들 및 임의의 값들의 말단점은, 정확한 범위 또는 값으로 제한되지 않으며; 이들은 충분히 부정확하여 이러한 범위 및/또는 값에 근접한 값을 포함한다.
수량과 관련하여 사용된 한정어 "약"은, 명시된 값을 포함하며, 문맥에 의해 지시된 의미를 갖는다. 범위의 맥락에서 사용될 때, 한정어 "약"은 또한 두 말단점의 절대 값에 의해 정의된 범위를 개시하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, "약 2 내지 약 10"의 범위는 또한 "2 내지 10"의 범위를 개시한다. 용어 "약"은, 표시된 수의 ±10%를 지칭할 수 있다. 예를 들어, "약 10%"는 9% 내지 11%의 범위를 나타낼 수 있고, "약 1"은 0.9-1.1을 의미할 수 있다.
여기에 사용된 많은 용어는 상대적인 용어임을 유의해야 한다. 예를 들어, 용어 "상단" 및 "하단"은, 예를 들어, 위치에서 서로에 대해 상대적인데, 예를 들어, 상단 구성요소는, 지정된 방향에서 하단 구성요소보다 더 높은 고도에 위치하지만, 이러한 용어는, 장치가 뒤집히면, 변경될 수 있다. 용어 "입구" 및 "출구"는, 주어진 구조물에 대하여 그들을 통해 유동하는 유체와 관련이 있는데, 예를 들어, 유체는 유입구를 통해 구조물로 유동하고, 유출구를 통해 구조물 밖으로 유동한다. 용어 "업스트림" 및 "다운스트림"은, 유체가 다양한 구성요소를 통해 유동하는 방향과 관계가 있는데, 예를 들어, 유체는 다운스트림 구성요소를 통해 유동하기 전에 업스트림 구성요소를 통해 유동한다. 루프 (loop)에서, 제1 구성요소는 제2 구성요소의 업스트림 및 다운스트림 모두인 것으로 기재될 수 있음에 유의해야 한다.
용어 "수평" 및 "수직"은, 절대 기준, 예를 들어, 지상 (ground level)에 대한 방향을 나타내는데 사용된다. 그러나, 이들 용어들은, 구조물들이 서로 절대적으로 평행하거나 또는 절대적으로 직각인 것을 요구하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 제1 수직 구조물 및 제2 수직 구조물은, 반드시 서로 평행할 필요는 없다. 용어 "상부" 및 "하부" 또는 "기부 (base)"는, 절대 기준, 예를 들어, 지구의 표면과 관련하여 상부가 항상 하부/기부보다 더 높은 표면을 지칭하는 것으로 사용된다. 용어 "상향" 및 "하향"은, 또한 절대 기준과 관련이 있다; 상향은 항상 지구의 중력에 반대한다.
본 출원은 "동일한 자릿수"와 관련이 있다. 더 작은 숫자로 나눈 더 큰 숫자의 몫이 적어도 1이고 10보다 작은 값인 경우, 두 숫자는 동일한 자릿수이다.
여기에서 논의된 음향영동 장치는, 다중모드 또는 평면 모드 또는 모두의 조합에서 작동할 수 있다. 다중모드는, 3차원의 음향력 (acoustic forces)을 생성하는 음향 변환기에 의한 음향파의 발생을 지칭한다. 초음파일 수 있는, 다중모드 음향파는, 단일 음향 변환기에 의해 발생될 수 있으며, 여기에서 종종 다-차원 또는 3-차원 음향 정재파로 지칭된다. 평면 모드는, 예를 들어, 전파의 방향을 따라 실질적으로 1차원으로 음향력을 생성하는 음향 변환기에 의한 음향파의 발생을 지칭한다. 평면 모드에서 발생되는, 초음파일 수 있는, 이러한 음향파는, 여기에서 종종 1-차원 음향 정재파로 지칭된다.
음향 변환기는, 티탄산 지르콘산 연 (PZT) 또는 니오브산 리튬과 같은, 압전 물질을 포함할 수 있다. 이러한 음향 변환기는, 평면 또는 다중모드 음향파를 발생시키기 위해 전기적으로 여기될 수 있다. 다중모드 음향파에 의해 발생된 3-차원 음향력은, 음향파 전파의 방향과 정렬되지 않은 방사력 또는 횡력 (lateral forces)을 포함한다. 횡력은 2차원으로 작용할 수 있다. 횡력은, 음향파 전파의 방향과 실질적으로 정렬되는, 다중모드 음향파에서 축력 (axial forces)에 부가된다. 횡력은 이러한 다중모드 음향파에 대한 축력과 동일한 정도의 크기일 수 있다. 다중모드 작동에서 여기된 음향 변환기는, 이의 표면 상에 정재파를 나타낼 수 있고, 이에 의해 다중모드 음향파를 발생시킨다. 변환기의 표면 상에 정재파는, 다중모드 음향파의 작동 모드와 관련될 수 있다. 음향 변환기가 전기적으로 여기되어 평면 음향파를 발생시키는 경우, 변환기의 표면은, 피스톤과 같은 작동을 나타낼 수 있고, 이에 의해 1-차원 음향 정재파를 발생시킨다. 평면 음향파와 비교하면, 다중모드 음향파는, 동일한 입력 전력 (input power)으로 연속적으로 상당히 큰 입자 포획 활동 (particle trapping activity)을 나타낸다. 평면 및/또는 다-차원 음향 정재파의 조합을 발생시키기 위해 하나 이상의 음향 변환기는 사용될 수 있다. 예를 들어, 2개의 음향 변환기는, 정재파를 발생시키기 위해 서로 마주하도록 배열될 수 있다. 이러한 예에서, 음향 변환기 중 하나는, 수동적일 수 있고 입사파 (incident wave)의 반사기로서 작용할 수 있다. 선택적으로 또는 부가적으로, 각 변환기는, 여기에서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 음향파를 포함하는, 음향파를 발생시키기 위해 활성화될 수 있다.
음향영동은 음향파를 사용한 물질의 조작이다. 몇몇 대표 실행에서, 음향영동은 물질의 분리를 위해 사용되며, 유체 분산액으로부터 입자 분리에 대한 저-전력, 비-압력-강하 (no-pressure-drop), 비-막힘 (no-clog), 고체-상태 접근법을 대표할 수 있다. 입자들을 벗어난 음향장 (acoustic field)의 산란 (scattering)은, 3-차원 포획장 (trapping field)으로서 작용하는, 3-차원 음향 방사력을 결과한다. 음향 방사력은, 입자가 파장에 비해 작은 경우, 입자 부피 (예를 들어, 반경의 입방체)에 비례한다. 음향 방사력은, 주파수 및 음향 대비 계수 (contrast factor)에 비례한다. 음향 방사력은, 음향 에너지 (예를 들어, 음압 진폭의 제곱)에 따라 달라진다. 고조파 여기 (harmonic excitation)의 경우, 힘의 정현파 (sinusoidal) 공간 변화는, 입자를 정재파 내에 안정적인 위치로 유도하는 것이다. 입자에 가해지는 음향 방사력이 유체 항력 (drag force)과 부력/중력의 조합된 효과보다 강할 때, 입자는 음향 정재파 장 내에 포획된다. 포획된 입자에 대한 횡 및 축 음향력의 작용은, 임계 크기에 도달할 때, 숙주 유체 (host fluid)보다 더 가벼운 입자에 대한 향상된 부력을 통해 상승하거나 또는 숙주 유체보다 더 무거운 입자에 대한 향상된 중력을 통해, 계속적으로 침강되는, 입자의 농축, 클러스터링 (clustering), 군집, 응집 및/또는 합체를 통해 밀집된 클러스터의 형성을 결과한다. 부가적으로, 비에르크네스 힘 (Bjerknes forces)과 같은, 2차 입자-간 힘은 입자 응집을 돕는다.
음향 정재파는 고압 및 저압의 국소 영역 (localized regions)을 생성한다. 입자는, 주변 유체에 대한 이들의 압축성 (compressibility) 및 밀도에 따라 정재파 노드 (standing wave nodes) 또는 안티-노드로 밀려나게 된다. 더 높은 밀도 및 압축성의 입자는, 정재파에서 노드로 이동하는 반면, 더 낮은 밀도의 2차 상들 (secondary phases)은 안티-노드로 이동한다. 입자에 가해지는 힘은 또한 그들의 크기에 의존하며, 더 큰 입자가 더 큰 힘을 겪는다. 힘의 크기는, 유체 매체 (fluid medium)에 대한 입자 밀도 및 압축성에 의존하며, 입자 부피에 따라 증가한다.
본 개시의 목적을 위해, 생물학적 세포는 입자로 고려될 수 있다. 대부분의 생물학적 세포 타입은, 이들이 현탁된 매체보다 더 높은 밀도 및 더 낮은 압축성을 나타내어서, 세포와 매체 사이에 음향 대비 계수는 양의 값을 갖는다. 결과적으로, 축 음향 방사력 (ARF)은, 세포를 정재파 압력 노드로 향하게 유도한다. 음향 방사력의 축 구성요소는, 양의 대비 계수를 갖는, 세포를 압력 노드로 유도하는 반면, 음의 대조 계수를 갖는 세포 또는 다른 입자는 압력 안티-노드로 유도된다. 음향 방사력의 방사상 또는 횡적 구성요소는 세포를 포획하는 힘이다. ARF의 방사상 또는 횡적 구성요소는, 유체 항력과 중력의 조합 효과보다 더 크다.
부가적인 이론 및 수치 모델은, 파장에 대한 입자 크기에 관한 어떠한 제한 없이 입자에 대한 음향 방사력의 계산을 위해 개발되었다. 이러한 모델은 또한 유체 및 입자 점도의 영향을 포함하고, 따라서, 음향 방사력을 좀 더 정확하게 계산할 수 있다. 실행된 모델은, AIP Conference Proceedings, Vol. 1474-1, pp. 255-258 (2012)에 기재된 바와 같은 Yurii Ilinskii 및 Evgenia Zabolotskaya의 이론적 작업에 기초한다. 부가적인 인-하우스 모델은, 원통 (cylinder)과 매우 유사한, 정재파에서 포획된 입자의 "하키용 퍽 (hockey pucks)"과 같은, 원통형 형상의 물체에 대한 음향 포획력을 계산하기 위해 개발되었다.
바람직하게는, 초음파 변환기(들)은, 축력이 동반되도록 현탁된 입자들에 횡력을 가하는 유체 내에 다-차원 정재파를 발생시킨다. 문헌에 발표된 통상적인 결과는, 횡력이 축력보다 100배 더 작은 것으로 명시한다. 대조적으로, 본 출원에 개시된 기술은, 축력과 동일한 정도의 크기인 횡력을 제공한다. 그러나, 여기에서 더욱 기재되는 특정 구현 예에서, 장치는, 다-차원 음향 정재파를 생성하는 변환기 및 평면 음향 정재파를 생성하는 변환기를 모두 사용한다. 본 개시의 초음파 변환기(들)에 의해 발생된 총 음향 방사력 (ARF)의 횡력 구성요소는, 최대 1 cm/s의 선형 속도에서 유체 항력을 극복하고, 밀집된 클러스터를 생성하는데 충분하고 중요하며, 총 음향 방사력의 축력 구성요소와 동일한 정도의 크기이다.
본 개시는 형질감염 또는 형질도입을 수행하는데 초음파 변환기를 함유하는 이러한 음향영동 장치를 사용하는 방법에 관한 것이다. 간단히 말해서, 음향영동 장치는, 국소 부피 (localized volume)로 핵산 (DNA 또는 RNA, 또는 모두)과 함께 세포를 가져오는데 사용된다. 이는 핵산이 세포 내로 전달되는 것을 가능하게 한다. 현재의 형질도입 공정은, 비교적 고비용, 저효율, 및 상용화를 위해 확장될 수 있는 부족한 역량을 가질 수 있다. 여기에 기재된 방법은, 비용을 절감할 수 있고, 효율을 증가시킬 수 있으며, 상업화를 위한 확장 가능한 플랫폼을 가질 수 있다.
매우 일반적으로, 세포 및 캐리어 (carrier) (RNA 또는 DNA 함유)는 음향영동 장치의 음향 챔버에 배치된다. 일반적으로, 이들은 유체에 현탁되어 유체 혼합물을 형성한다. 몇몇 대표 실행에서, 음향영동 장치는, 초음파 변환기 및 (예를 들어, 챔버의 맞은편의 벽 상에) 상기 초음파 변환기 맞은편의 반사기를 갖는 음향 챔버를 함유한다. 초음파 변환기는, 음향 챔버 내에 음향 정재파, 예를 들어, 다-차원 음향 정재파 및/또는 평면 음향 정재파를 생성하도록 구동될 수 있는 압전 물질을 포함한다. 음향 정재파는 더 고압의 로케일 (locales) 및 더 저압의 로케일을 갖는다. 몇몇 예에서, 더 낮은 로케일은 세포를 포획하고 보유한다. 핵산은 보유된 세포와 함께 음향 챔버로 유동된다. 이러한 작동은 세포와 핵산이 함께-위치되게 하고, 그래서 핵산은 세포로 진입할 수 있다. 형질감염의 경우, 기공은 세포의 세포막에서 개방되어, 나출형 핵산이 세포로 진입하는 것을 가능하게 한다. 형질도입의 경우, 핵산은 바이러스 벡터의 일부이다. 바이러스 벡터는 세포에 진입하거나 또는 핵산을 세포 내로 삽입시킨다. 본 개시에서 형질도입을 수행하는데 사용될 수 있는 특정 바이러스 벡터는, 아데노바이러스, 렌티바이러스 또는 파라믹소바이러스를 포함한다.
몇몇 대표 실행에서, 세포 및/또는 핵산 (나출형 또는 바이러스 벡터)에 대한 음향 정재파에 의해 생성된 음향영동력 (acoustophoretic force)은, 이러한 입자들에 대한 이동 유체에 의해 가해지는 유체 항력을 극복하기에 충분할 수 있다. 다시 말하면, 음향영동력은 음향장에서 세포 및/또는 핵산을 포획하는 메커니즘으로서 작동할 수 있다. 음향영동력은 세포 및/또는 핵산을 감소된 또는 최소 음향영동력 진폭의 안정된 위치로 유도할 수 있다. 감소된 또는 최소 음향영동력 진폭의 이러한 위치는, 정재파의 노드 (nodes)일 수 있다. 시간이 지남에 따라, 노드에서 세포 및/또는 핵산의 수집은 꾸준히 증가한다. 그들의 농도에 따라 몇 분 이하일 수 있는 일정 기간 내에, 세포 및/또는 핵산의 수집은, 디스크의 빔-형 수집 (beam-like collection)의 형상을 가정할 수 있다. 각 디스크는 음향장의 반 파장만큼 이격될 수 있다.
몇몇 구현 예에서, 음향 정재파는 세포 및/또는 핵산을 포획하고, 이들을 함께-위치시켜, 형질감염/형질도입 반응의 효율을 개선시킨다. 다수의 다른 메커니즘은 이러한 구현 예들에 대해 실행될 수 있다. 하나의 이러한 메커니즘에서, 세포 및 핵산은, 유사한 음향 대비 계수를 가질 수 있어서, 양 타입의 입자는 정재파의 노드 또는 안티-노드 (anti-nodes)로 구동될 수 있다. 이러한 메커니즘은, 세포와 핵산을 (전통적인 교반에서와 같이) 브라운 운동 (Brownian motion)에 의존하는 것보다 좀 더 효율적으로 서로 공간적으로 매우 근접하게 한다. 달리 말하면, 세포 및 핵산은, 음향 챔버의 크기에 비해, 다-차원 음향 정재파에 의해 생성된 작은 3-차원 부피에 포획된다. 특정 대표 구현 예에서, 세포 및 핵산은 모두 양의 음향 대비 계수를 갖거나, 또는 모두 음의 음향 대비 계수를 갖는다. 달리 말하면, 이들의 음향 대비 계수는, 동일한 부호를 갖는다. 다시, 핵산은 나출형일 수 있거나 또는 바이러스 벡터에 있을 수 있다.
또 다른 메커니즘에서, 2가지 타입의 입자 (세포 또는 핵산) 중 하나는 노드로 유도될 수 있는 반면, 다른 타입의 입자는 안티-노드로 유도될 수 있다. 그러나, 더 높은 주파수에서, 노드 및 안티-노드는, 서로 충분히 가까워서 세포 및 핵산이 서로 반응할 수 있다. 이러한 구현 예에서, 세포 또는 핵산은, 양의 음향 대비 계수를 가지며, 다른 세트 (즉, 핵산 또는 세포)는 음의 음향 대비 계수를 갖는다. 달리 말하면, 음향 대비 계수는 반대 부호를 갖는다. 양의 대비 계수를 갖는 입자는 노드로 유도되고, 음의 대비 계수를 갖는 입자는 안티-노드로 유도된다. 이러한 반응 메커니즘에 대한 몇 가지 관련 요소는, 세포 및 캐리어의 크기, 및 초음파 변환기가 작동되는 주파수를 포함한다.
결국, 세포 및/또는 핵산이 계속 포획되고 농축됨에 따라, 중력 침강이 일어나도록, 이들은 크기 및 무게를 획득할 수 있으며, 여기서, 입자의 클러스터는 음향 정재파에서 음향 챔버의 하부로 떨어질 것이다. 입자의 새로운 축적물은 그 다음 음향 정재파에 의해 발생된 음향장 내에 포획되고 반응될 수 있다.
몇몇 대표 실행에서, 음향영동 장치는, 음향 챔버 내에 음향 정재파, 예를 들어, 다-차원 음향 정재파 및/또는 평면 음향 정재파를 생성하도록 구동될 수 있는 압전 물질을 포함하는 초음파 변환기를 포함하는 음향 챔버가 제공된다. 음향 정재파는 더 고압의 로케일 및 더 저압의 로케일을 갖는다. 재순환 루프 (recirculation loop)는 음향 챔버에 제공되어, 출력 유체 및 입자가 음향 챔버로 재도입되는 것을 가능하게 한다. 몇몇 예에서, 더 저압 로케일은 세포를 포획 및 보유하지만, 음향 챔버 밖으로 유동하고 재순환 루프를 통해 재도입될 수 있는 바이러스 벡터 또는 핵산을 포획 또는 보유하지 못한다. 바이러스 벡터의 예에서, 세포는 음향 정재파에 의해 발생된 음향장에 보유되고, 바이러스 벡터는 세포와 바이러스 벡터의 상호작용이 가능하도록 상기 음향장으로 유동된다. 증가된 수의 상호작용은, 이전 통과시 상호작용하지 않는 바이러스 벡터를 음향 챔버로 재순환시켜 바이러스 벡터와 세포 사이에서 달성될 수 있다. 핵산의 예에서, 여기에서의 다른 곳에서 더 상세하게 논의되는 바와 같이, 세포막에 기공의 형성이 가능하도록 음향장에 보유된 세포에 대해 부가적인 처리는 수행될 수 있다. 핵산은 보유된 세포와 함께 음향 챔버로 유동되어 핵산과 세포의 상호작용을 가능하게 하고, 핵산이 기공을 통해 세포에 진입하는 것을 가능하게 한다. 핵산은, 음향장에 의해 보유되지 않고, 음향 챔버로 재순환되어 형질감염을 일으키도록 다중 통과를 허용한다.
부가적으로 또는 선택적으로, 몇몇 예에서, 초음파 변환기는 음향 챔버 내에서 음향 스트리밍 (acoustic streaming)을 일으키도록 구동된다. 간단히 말해서, 음향 스트리밍은, 유체가 (초음파 변환기의 진동으로부터) 초음파 변환기에 의해 전달되는 음향 에너지를 흡수할 때 음향 챔버 내에서 결과하는 유체 흐름을 지칭한다. 유체의 속도는, 초음파 변환기에 의해 발생된 진동하는 음향파에 의해 유발된다. 통상적으로, 음향 스트리밍이 발생될 때, 이는 유체 혼합물에서 교반을 일으킬 수 있는 순환 운동 또는 와동 (vortices)을 결과한다. 이러한 현상은 비선형적이며, 세포와 핵산 서로의 상호작용을 일으킬 수 있다.
세포와 핵산은 이들이 서로 반응할 수 있도록 근접하게 된다. 본 개시에서, 용어 "상호작용" 및 "반응"은, 세포에서 물리적 변화가 일어나는 것을 나타내는데 사용된다. 예를 들어, 형질도입에서, 핵산을 함유하는 바이러스는, 세포 내로 침투하여 형질도입을 일으킬 수 있다. 바이러스는, 예를 들어, 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스일 수 있다.
형질감염 예와 관련하여, 핵산이 세포로의 진입을 가능하도록 세포의 세포막에서 기공은 개방된다. 예를 들어, 세포는 전기 천공법에 적용될 수 있으며, 여기서, 세포는 전기장에 노출되어 세포막의 침투성 (permeability)을 증가시킨다. 세포 천공법은 또한 사용될 수 있으며, 여기서, 세포는 초음파에 노출되어 세포막에 기공 형성을 유발한다. 인산 칼슘은 또한 형질감염을 일으키는데 사용될 수 있다. 기공 개방이 일어나는 위치는 중요하지 않으며, 세포 및 핵산이 혼합된 음향 챔버의 상류의 음향영동 장치에서 일어날 수 있거나, 또는 음향영동 장치 외부에서 일어날 수 있다.
참고로, 생산적 형질감염 및 유전자 전이는, 단순히 세포 내로 DNA의 진입 및 적절한 프로모터로부터의 후속 전사뿐만 아니라, DNA가 세포의 세포외 표면으로부터 세포질 내로 및 세포질을 통해, 궁극적으로 임의의 전사가 개시되기 전에 핵으로 및 핵 외피 (nuclear envelope)를 가로질러, 이동을 가능하게 하는 다수의 세포내 사건들을 필요로 한다는 점이 주목된다. 세포질 내로 진입 즉시, (물리적 기술을 통해 또는 DNA-캐리어 복합체의 분해 후에 전달된) 나출형 DNA는, 미세소관 형성 중심 (microtubule organizing center) 및 핵 외피를 향한 이동을 위해 미세소관 네트워크와의 후속 상호작용을 매개하는 다수의 세포 단백질과 관련된다. 플라스미드 (Plasmids)는 그 다음, 다른 세트의 단백질을 사용하여, 세포 분열의 부재하에서 핵 기공 복합체를 통해 또는 핵 외피의 유사분열 분해 (mitotic disassembly)시 핵에 진입한다.
본 개시에서 형질도입을 수행하는데 사용될 수 있는 특정 바이러스 벡터는, 아데노바이러스, 렌티바이러스 또는 파라믹소바이러스를 포함한다. 레트로바이러스는, 그들의 RNA 게놈을 cDNA 카피 (cDNA copy)로 역전사시키고, 이어서 숙주 세포 게놈 내로 안정적으로 통합되는 이들의 능력을 특징으로 한다. 따라서, 바이러스는 핵산을 세포로 운반한다.
레트로바이러스는 단순하거나 또는 복합한 것으로 분류될 수 있다 (예를 들어, 렌티바이러스). 양 타입의 바이러스 입자는, 내부 코어 내에 위치한 관련된 바이러스 역전사효소 (RT)를 갖는 양성-가닥 RNA의 2개의 카피를 함유한다. 또한, 이러한 구획 내에는, 뉴클레오캡시드 (NC), 캡시드 (CA), 인테그라아제 (integrase) (IN), 및 프로테아제 (PR)를 포함하는, 구조적 및 효소적 단백질이 위치된다. 내부 코어는, 매트릭스 (MA) 단백질로 구성된 외부 단백질층으로 둘러싸이고, 이는 결과적으로 외피 당단백 (ENV)-스터드된 (studded), 숙주 세포 막-유래 외피에 의해 에워싸인다.
렌티바이러스 및 레트로바이러스 유전자 전달 시스템 (또는 캐리어)은, 레트로바이러스 복제의 관점을 이용하여 원하는 핵산 서열의 안정적인 통합을 제공한다. 외래 핵산의 형질감염이 일시적인 전이유전자 발현 (transgene expression)을 오직 결과하는 반면, 레트로바이러스 및 렌티바이러스-계 시스템에서 바이러스 인테그라아제의 활성은, 외래 전이유전자의 안정적인 통합을 가능하게 하며, 그 다음 유전되며, 반복된 세포 분열에 걸쳐서 지속적으로 발현된다. 렌티바이러스 및 레트로바이러스 벡터 모두의 주요 특색은, 이들이 복제-결함, 또는 자기-불활성화 입자를 생성한다는 점이다. 이는, 표적 세포에서 지속적인 바이러스 복제없이, 원하는 서열의 전달을 가능하게 한다.
외래 핵산이 세포 내로 성공적으로 도입되었음을 입증하는 보통의 방법은, 단백질 발현을 측정하는 것이다. 이것은 통상적으로 웨스턴 블롯 (Western blot) 또는 면역염색법 (immunostaining)에 의해 수행된다.
본 개시의 공정에 의해 형질감염/형질도입될 수 있는 세포의 예로는, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0 하이브리도마 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 인간 세포, 조절 T-세포, 헬퍼 T-세포, 세포독성 T-세포, 기억 T-세포, 이펙터 T-세포, 감마 델타 T-세포, Jurkat T-세포, CAR-T 세포, B 세포, 또는 NK 세포, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs), 조류 , 식물 세포, 또는 박테리아를 포함한다. 세포들은 그들 스스로 기타 물질, 예컨대, 비드 (beads)에 부착될 수 있다. 비드의 예로는, 고분자 비드, 자기 비드 (magnetic beads), 초상자성 비드, 및 미세구체 (microspheres)를 포함한다. 이들은 생화학 반응 또는 라벨링 목적으로 사용될 수 있다.
몇몇 구현 예에서, 첨가제는 세포와 핵산의 혼합물에 포함될 수 있다. 이러한 첨가제는, Polybrene™ 및 RetroNectin™을 포함할 수 있다. Polybrene™은, 세포 배양물에서 레트로바이러스 (및 렌티바이러스)로 특정 세포의 형질도입의 효율을 증가시키는데 사용되는 양이온성 고분자 (폴리헥사디메스린 브로마이드 (polyhexadimethrine bromide))이며, 통상적으로 10 ㎍/mL 이하의 양으로 사용된다. RetroNectin™은, 인간 피브로넥틴 단백질에서 유래된 3개의 기능성 도메인 (C-도메인, H-도메인, 및 CS-1 부위)으로 이루어진 폴리펩티드이다. RetroNectin™은, 1차 T 세포 및 대식세포와 같은 말단 분화된 세포 및 조혈 줄기 세포를 포함하는 조혈 세포에서 레트로바이러스- 및 렌티바이러스-매개 형질도입의 효율을 향상시킨다. 기타 첨가제는, 리포펙틴, 리포펙타민 (lipofectamine), 및 프로타민과 같은 양이온성 펩티드를 포함할 수 있다. 이들 첨가제는, 해당하는 경우, 형질도입을 향상시키는데 사용될 수 있다.
이론에 의해 제한됨이 없이, 다-차원 음향 정재파의 주파수는, 음향 정재파에 의해 포획될 수 있는 입자의 직경을 결정하는 것으로 믿어진다. 예를 들어, 2 MHz 파의 경우, 입자 크기는, 약 1 내지 약 100 microns이다.
도 1은, 바이러스 형질도입에 적용된 대로의, 본 개시의 대표 방법을 예시하는 도면이다. 이러한 예에서, 세포는 녹색 형광 단백질 (GFP)로 표지된다. 도면의 좌-측에서 시작하여, 먼저, 세포 배양물 (100)은 바이러스 벡터 (110)와 조합된다. 세포 및 바이러스를 함유하는 유체 혼합물은 그 다음 초음파 변환기 (122)와 반사기 (124) 사이에 위치한 음향 챔버 (120)에 배치된다. 음향 정재파는 실온에서 10분 동안 발생된다. 여기에 예시된 바와 같이, 세포 및 바이러스는 음향 정재파에 포획된다. 세포는, 노드에 포획되고, 바이러스는 안티-노드에 포획된다. 그러나, 이들의 상대적 크기로 인해, 세포 및 바이러스는 함께-위치되며, 바이러스는 세포를 감염시킬 수 있다 (참조 번호 128로 식별됨). 미반응 물질을 제거하기 위해 세척한 후, 세포는 37℃에서 밤새 배양되고, GFP는 표지된 세포에서 발현된다. 키메라 항원 수용체 (CARs)를 발현하는 T-세포, 또는 CAR T-세포를 만들기 위해 유사한 방법은 사용될 수 있다.
본 개시의 방법은, 숙주 유체에 현탁된 핵산 및 세포를 함유하는 유체 혼합물이 음향영동 장치를 통해 유동되는, 연속 공정으로 수행될 수 있다. 핵산들은 나출형일 수 있거나, 또는 그들은. 박테리오파지 또는 다른 바이러스와 같은, 바이러스 벡터에 함유될 수 있다.
도 2a는 연속 공정에 사용될 수 있는 음향영동 장치 (200)의 분해도이다. 도 2b는 완전히 조립된 상태에서의 장치 (200)의 도면이다.
도 2a를 참조하면, 음향영동 장치는, 각 구성요소가 모듈화되도록 구성될 수 있으며, 서로 개별적으로 교환 또는 전환될 수 있다. 따라서, 주어진 구성요소에 대해 새로운 수정 또는 변경이 이루어진 경우, 상기 구성요소는, 장치의 나머지 부분을 그대로 유지하면서 대체될 수 있다.
장치는 음향 챔버 (210)의 맞은편의 벽들 상에 초음파 변환기 (220) 및 반사기 (250)를 포함한다. 반사기 (250)는 투명한 물질로 만들어질 수 있어서, 유동 챔버 (210: 여기에서 용어 "유동 챔버"는, 용어 "음향 챔버"와 상호교환적으로 사용됨)의 내부를 볼 수 있는 점이 주목된다. 초음파 변환기는 음향 챔버의 제1 벽에 근접하게 있다. 반사기는 음향 챔버의 제2 벽에 근접하거나 또는 음향 챔버의 제2 벽을 구성할 수 있다.
냉각 유닛 (260)은, 초음파 변환기 (220)와 유동 챔버 (210) 사이에 위치될 수 있다. 여기에 예시된 바와 같이, 냉각 유닛 (260)은, 음향 챔버를 통한 유동 경로로부터 분리된 독립적인 유동 경로를 포함한다. 냉각제 유입구 (262)는, 냉각 유닛으로 냉각 유체의 진입을 가능하게 한다. 냉각제 및 폐열은, 냉각제 배출구 (264)를 통해 냉각 유닛을 빠져나간다. 냉각 유닛을 통해 유동하는 냉각제는 임의의 적절한 유체일 수 있다. 예를 들어, 냉각제는, 물, 공기, 알코올, 에탄올, 암모니아, 또는 이들의 몇몇 조합일 수 있다. 냉각제는 액체, 가스, 또는 겔일 수 있다. 냉각제는, 전기 단-락을 방지하기 위해 전기적으로 비-전도성 유체일 수 있다.
선택적으로, 냉각 유닛은, 제벡 효과 (Seebeck effect)를 사용하여 열 플럭스 (heat flux) (즉, 온도 차이)을 전기 에너지로 변환시키고, 따라서 유동 챔버로부터 열을 제거하는, 열전 발전기의 형태일 수 있다. 달리 말하면, 음향영동 장치를 작동시키는 동안 원하지 않는 폐열로부터 전기는 발생될 수 있다.
냉각 유닛은, 초음파 변환기를 냉각시키는데 사용될 수 있으며, 이는 장치가 연장된 기간 동안 반복된 공정 및 재순환으로 연속적으로 운전 (예를 들어, 관류)될 때 특히 유리할 수 있다. 선택적으로, 냉각 유닛은 또한 음향 챔버 (210)를 통해 유동하는 유체를 냉각시키는데 사용될 수 있다. 원하는 적용들을 위해, 세포는 실온 (~20℃) 주위, 및 최대 약 28℃에서 유지되어야 한다. 이는, 세포가 더 높은 온도를 겪을 때, 이들의 대사 속도가 증가하기 때문이다. 그러나, 냉각 유닛이 없으면, 음향 챔버를 통해 유동하는 세포의 온도는 34℃만큼 상승될 수 있다.
음향 챔버 (210)는, 적어도 유입구 (212) 및 배출구 (214)를 포함하는 것으로 여기에서 예시된 점이 주목된다. 이는 음향 챔버의 내부 부피 (216)에 대한 진입로를 제공한다. 부가적인 유입구들 및 배출구들 (예를 들어, 유체 유입구, 농축물 배출구, 침투물 배출구, 재순환 배출구, 블리드/수확 (bleed/harvest) 배출구)은 원하는 대로 포함될 수 있다. 내부 부피 (216)는, 초음파 변환기 (220), 냉각 유닛 (260), 음향 챔버 (210), 및 반사기 (250)에 의해 경계가 지워지는 것으로 고려될 수 있다.
음향영동 장치 (200)의 유동 방향은, 수평 이외의 방향으로 배향될 수 있다. 예를 들어, 유체 유동은, 수직 또는 수평에 대해 위쪽 또는 아래쪽으로 또는 임의의 각도로 수직일 수 있다. 둘 이상의 변환기는 시스템에 포함될 수 있다.
도 3은, 본 개시의 방법 및 공정을 실시하는데 사용될 수 있는 또 다른 음향영동 장치 (300)를 예시한다. 매우 일반적으로, 시스템은, 음향영동 장치 (300) 및 실질적으로 음향적으로 투명한 용기 (310)를 포함한다. 이러한 2개의 구성요소는 서로 분리 가능하다.
음향영동 장치의 용기 (310)는, (모두 적절한 두께로) 플라스틱, 유리, 폴리카보네이트, 저-밀도 폴리에틸렌, 및 고-밀도 폴리에틸렌과 같은, 실질적으로 음향적으로 투명한 물질로 일반적으로 형성된다. 그러나, 용기는, 그것을 통해서 본 개시의 음향 정재파(들)의 통과를 가능하게 하기에 적합한 임의의 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 병 (bottle) 또는 백의 형태일 수 있다. 이러한 형태들 사이에 차이는, 이들의 조성과 구조에 있다. 병은 백보다 좀 더 단단한다. 비었을 때, 백은 일반적으로 스스로를 지지할 수 없고, 병은 똑바로 세워질 수 있다. 예를 들어, 여기에 나타낸 용기 (310)는, 고-밀도 폴리에틸렌 백이다. 용기 (310)는 일반적으로 상단부 (312) 및 하단부 (314), 및 (숙주 유체에 제1 입자 및 제2 입자를 함유하는) 유체 혼합물이 위치된 내부 부피를 갖는다.
음향영동 장치 (300)는, 이의 측면을 형성하는, 적어도 하나의 벽 (322), 및 보통 복수의 벽에 의해 한정된다. 예를 들어, 음향영동 장치는 원통의 형상, 또는 (도시된 바와 같이) 직사각형일 수 있다. 벽(들)은 견고하다. 개구부 (326)는, 그것을 통해 용기 (310)를 수용하기 위해, 음향영동 장치의 상단부에 존재한다. 다시, 음향영동 장치 (300)는 용기 (310)로부터 분리될 수 있어, 용기는, 음향영동 장치의 원하는 적용에 따라, 일회용일 수 있거나 또는 재사용할 수 있다. 여기에 예시된 바와 같이, 음향영동 장치 (300)의 기부 (base)는 견고하다.
음향영동 장치 (300)는 벽 (334) 상에 적어도 하나의 초음파 변환기 (330)를 포함한다. 초음파 변환기 (330)는 음향 정재파를 생성하기 위해 전압 신호에 의해 구동되는 압전 물질을 갖는다. 케이블 (332)은 전력 및 제어 정보를 초음파 변환기 (330)로 전송하기 위해 예시된다. 반사기 (340)는 존재할 수 있고, 초음파 변환기 (330)의 맞은편의 벽 (336) 상에 위치된다. 정재파는 따라서 변환기로부터 방사된 초기 파동 및 반사판에서 반사된 파동을 통해 발생된다. 몇몇 구현 예에서, 별도의 반사기는 필요하지 않다. 예를 들어, 주변 공기에 의해 제공될 수 있는 것과 같은, 해제 경계 (release boundary) 또는 챔버 벽은, 입사파를 반사하고 정재파를 생성하는데 사용될 수 있다. 다양한 변환기 및 반사기 조합이 사용될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 평면 및/또는 다-차원 음향 정재파(들)는, 용기 내에서 발생되고, 용기 (310) 내에 입자의 상호작용을 일으키기 위해 사용된다. 초음파 변환기와 용기 (310) 내에 유체 혼합물 사이에 접촉이 없음에 유의해야 한다.
특정 구현 예에서, 음향영동 장치는, 반사기 (340)가 위치된 벽 (336) 맞은편의 공통 벽 (334) 상에 위치한 복수의 초음파 변환기 (330)를 포함한다. 선택적으로, 초음파 변환기는, 반사기 없이, 서로 대향하여 위치될 수 있다. 부가적으로, 음향영동 장치 (300)는, 또 다른 벽 (338)에 관찰 창 (viewing window: 324)을 포함할 수 있다. 여기에 예시된 바와 같이, 관찰 창이 제공된 경우, 초음파 변환기(들) 및 반사기가 위치되는 벽에 인접한 벽에 있을 수 있어, 용기 (310)의 하단부 (314)는, 분리 챔버 (320)에서 관찰 창 (324)을 통해 관찰될 수 있다. 다른 구현 예에서, 관찰 창은 반사기를 대체할 수 있다.
특정 구현 예에서, 물과 같은, 유체가 용기 (310)와 음향영동 장치 (300) 사이에 간극 공간 (305)에 배치될 수 있어, 음향 정재파는 간극 공간 내에 유체 및 용기 내에 유체 혼합물 모두를 통해 통과한다. 간극 유체는, 임의의 유체일 수 있지만, 이것은 음향 정재파(들)의 양호한 전송, 바람직하게는 낮은 음향 감쇠 (low acoustic attenuation)를 가능하게 하는 음향 임피던스 값을 가져야 한다.
특정 대표 구현 예에서, 초음파 변환기는, 약 0.5 MHz 내지 약 20 MHz (메가헤르츠)의 주파수로 구동된다. 더 높은 주파수 정재파 장 (fields)은, 가파른 압력 구배 (pressure gradients)를 결과하여, 결과적으로 바이러스와 같은 더 작은 입자를 포획하는데 더 적합한다. 초음파 변환기는, 약 5분 내지 약 15분의 기간 동안 구동될 수 있다. 이는, 예를 들어, 세포 배양물 및 바이러스 벡터가 약 30분 내지 약 120분 동안 함께 배양되는 전통적인 바이러스 형질도입 공정보다 상당히 짧은 기간이다. 이러한 긴 배양 기간은, 브라운 운동 (Brownian motion)이 이들을 서로 근접하게 할 때만 일어나는 세포와 바이러스 사이에 반응에 기인한다. 본 개시의 음향영동 장치의 사용은, 세포 및 바이러스가 서로 반응하기에 충분히 근접할 가능성을 크게 증가시킨다. 이는, 더 적은 입자를 사용하여 더 높은 반응 효율을 결과한다. 그렇지만, 원하는 경우, 초음파 변환기는 원하는 만큼 긴 기간 동안, 예를 들어, 최대 120분 이상 구동될 수 있다.
음향 필터링 장치에 사용되는 초음파 변환기(들)를 보다 상세히 설명하는 것은 이제 도움이 될 수 있다. 도 4는, 전통적인 초음파 변환기의 단면도이다. 이러한 변환기는 하단부에 웨어 플레이트 (50), 에폭시층 (52), (예를 들어, 티탄산 지르콘산 연 (PZT) 또는 니오브산 리튬으로 제조된) 세라믹 압전 소자 (piezoelectric element: 54), 에폭시층 (56), 및 백킹층 (58)을 갖는다. 세라믹 압전 소자의 양 측 상에, 전극: 양극 (61) 및 음극 (63)이 있다. 에폭시층 (56)은, 백킹층 (58)을 압전 소자 (54)에 부착시킨다. 전체 조립체는, 예를 들어, 알루미늄으로 만들어질 수 있는 하우징 (60)에 함유된다. 하우징은 접지 전극으로 사용된다. 전기 어댑터 (62)는, 하우징을 통해 통과하고, 압전 소자 (54)에 부착되는 리드 (leads) (도시되지 않음)에 연결하기 위한 와이어에 대한 연결을 제공한다. 통상적으로, 백킹층은 댐핑 (damping)을 부가하고, 광범위한 주파수에 걸쳐 균일한 변위를 갖는 광대역 변환기를 생성하도록 설계되고, 압전 소자의 특정 진동 고유-모드 (eigen-modes)의 여기를 억제하도록 설계된다. 웨어 플레이트는 보통 변환기가 방사하는 매체의 특성 임피던스 (characteristic impedance)에 더 잘 일치하도록 임피던스 트랜스포머 (impedance transformers)로 설계된다.
도 5는, 본 개시의 초음파 변환기 (81)의 단면도로서, 본 개시의 음향 필터링 장치에 사용된다. 변환기 (81)는, 사각으로 형상화되며, 알루미늄 하우징 (82)을 갖는다. 알루미늄 하우징은 상단부 및 하단부를 갖는다. 변환기 하우징은 또한, 의료 등급 HDPE와 같은, 플라스틱 또는 기타 금속으로 구성될 수 있다. 압전 소자는, 큰, 2가 금속 이온, 보통 납 또는 바륨, 및 O2- 이온의 격자에, 작은, 4가 금속 이온, 보통 티타늄 또는 지르코늄으로 각각 이루어진, 페로브스카이트 세라믹 (perovskite ceramic)의 덩어리이다. 일 실시 예로서, PZT (티탄산 지르콘산 연) 압전 소자 (86)는, 변환기의 하단부를 한정하고, 하우징의 하단부의 외부로부터 노출된다. 압전 소자는, 작은 탄성층 (98), 예를 들어, 압전 소자와 하우징 사이에 위치된, 에폭시, 실리콘 또는 유사한 물질에 의해 이의 주변부 상에서 지지된다. 달리 말하면, 웨어 플레이트 또는 백킹 물질은 존재하지 않는다. 그러나, 몇몇 구현 예에서, 음향 정재파가 발생되는 유체로부터 압전 소자를 분리하는 플라스틱 또는 기타 물질의 층은 존재한다. 압전 물질/소자/결정은, (노출된) 외부 표면 및 내부 표면을 갖는다.
나사 (88)는, 하우징의 알루미늄 상판 (82a)을 나사산을 통해 하우징의 몸체 (82b)에 부착시킨다. 상판은 변환기에 전력을 공급하기 위한 커넥터 (84)를 포함한다. 압전 소자 (86)의 상부 표면은, 절연 물질 (94)에 의해 분리된, 양극 (90) 및 음극 (92)에 연결된다. 전극들은, 은 또는 니켈과 같은, 임의의 전도성 물질로 만들어질 수 있다. 전력은, 압전 소자 상에 전극을 통해 압전 소자 (86)에 제공된다. 압전 소자 (86)가 백킹층 또는 에폭시층을 갖지 않는 점은 주의된다. 달리 말하면, 알루미늄 상판 (82a)과 압전 소자 (86) 사이에 변환기에 내부 부피 또는 에어 갭 (87)은 존재한다 (즉, 에어 갭은 완전히 비어 있다). 최소 백킹 (58) 및/또는 웨어 플레이트 (50)는, 도 6에서 볼 수 있듯이, 몇몇 구현 예들에서 제공될 수 있다.
변환기 디자인은, 시스템의 성능에 영향을 미칠 수 있다. 통상적인 변환기는, 세라믹 압전 소자가 백킹층 및 웨어 플레이트에 결합된 층상 구조물이다. 변환기가 정재파에 의해 나타나는 높은 기계적 임피던스로 부하받기 때문에, 웨어 플레이트에 대한 전통적인 설계 지침들인, 예를 들어, 정재파 적용을 위한 반 파장 두께 또는 방사선 적용을 위한 1/4 파장 두께, 및 제조 방법들은, 적절하지 않을 수 있다. 오히려, 본 개시의 하나의 구현 예에서, 변환기는 웨어 플레이트 또는 백킹이 없어, 압전 소자가 높은 Q-팩터 (Q-factor)를 갖는 이의 고유모드 중 하나로, 또는 여러 고유모드들의 조합으로 진동하는 것을 가능하게 한다. 진동 세라믹 압전 소자/디스크는, 유체 세포를 통해 유동하는 유체에 직접 노출된다.
백킹의 제거 (예를 들어, 공기로 백킹된 압전 소자)는 또한, 세라믹 압전 소자가 댐핑이 거의 없는 고차 모드의 진동 (예를 들어, 고차 모달 변위 (modal displacement))으로 진동하는 것을 가능하게 한다. 백킹을 갖는 압전 소자를 구비한 변환기에서, 압전 소자는, 피스톤과 같이, 좀 더 균일한 변위로 진동한다. 백킹의 제거는, 압전 소자가 비-균일 변위 모드에서 진동하는 것을 가능하게 한다. 압전 소자의 모드 형상이 고차일수록, 압전 소자는 더 많은 노드 라인을 갖는다. 노드에 대한 포획 라인의 상관관계가 반드시 일 대 일이 아닐지라도, 압전 소자의 고차 모달 변위는, 더 많은 포획 라인을 생성하며, 더 높은 주파수에서 압전 소자의 구동은, 더 많은 포획 라인을 반드시 생성하지 않을 것이다.
본 개시의 음향 필터링 장치의 몇몇 구현 예에서, 압전 소자는, 압전 소자의 Q-팩터에 최소로 영향을 미치는 백킹을 가질 수 있다 (예를 들어, 5% 미만). 백킹은, 압전 소자가 고차 모드 형상에서 진동하고, 압전 소자에 대한 약간의 기계적 지지를 여전히 제공하면서 높은 Q-팩터를 유지하는 것을 가능하게 하는, 발사 나무 (balsa wood), 폼, 또는 코르크와 같은, 실질적으로 음향적으로 투명한 물질로 만들어질 수 있다. 백킹층은 고체일 수 있거나, 또는 층을 관통하는 구멍을 갖는 격자일 수 있어서, 격자가 특정한 고차 진동 모드에서 진동 압전 소자의 노드를 뒤따라서, 압전 소자의 나머지가 자유롭게 진동하는 것을 가능하게 하면서 노드 위치에서 지지를 제공한다. 격자 작업 또는 음향적으로 투명한 물질의 목표는, 압전 소자의 Q-팩터를 낮추지 않거나 또는 특정 모드 형상의 여기를 방해하지 않고 지지를 제공하는 것이다.
압전 소자를 유체와 직접 접촉시키는 배치는 또한, 에폭시층 및 웨어 플레이트의 댐핑 및 에너지 흡수 효과를 피하여 높은 Q-팩터에 기여한다. 변환기(들)의 다른 구현 예는, 납을 함유하는, PZT가 숙주 유체와 접촉하는 것을 방지하기 위해 웨어 플레이트 또는 웨어 표면을 가질 수 있다. 이것은, 예를 들어, 포유동물 세포의 혈액 분리, 생물약제 관류 (biopharmaceutical perfusion), 또는 유가-식 여과 (fed-batch filtration)와 같은, 생물학적 적용에서 바람직할 수 있다. 이러한 적용들은, 크롬, 전해 니켈, 또는 무전해 니켈과 같은, 웨어층을 사용할 수 있다. 화학적 증착은, 폴리(p-자일릴렌) (예를 들어, 파릴렌) 또는 기타 고분자의 층을 적용하는데 또한 사용될 수 있다. 실리콘 또는 폴리우레탄과 같은 유기 및 생체적합성 코팅은 또한 웨어 표면으로 사용할 수 있다. 폴리에테르에테르케톤 (PEEK) 필름과 같은, 박막은 또한 생체적합성 물질의 이점으로 유체에 노출된 변환기 표면의 커버로서 사용될 수 있다. 하나의 구현 예에서, PEEK 필름은, 감압 접착제 (PSA)를 사용하여 압전 물질의 겉면에 부착된다. 다른 필름들도 사용될 수 있다.
몇몇 구현 예에서, 초음파 변환기는 공칭 2MHz 공명 주파수를 갖는다. 각 변환기는 3 GPM (gallons per minute)의 유속에서 액적 포획 (droplet trapping)을 위해 약 28 W의 전력을 소비할 수 있다. 이는 0.25 kW hr/㎥의 에너지 비용으로 전환된다. 이것은 이러한 기술의 에너지 비용이 매우 낮음을 나타낸다. 바람직하게는, 각 변환기는, 이의 자체 증폭기에 의해 전력이 공급되고 제어될 수 있다. 다른 구현 예에서, 초음파 변환기는, 예를 들어, 1"x1" 치수를 갖는, 정사각 압전 소자를 사용한다. 선택적으로, 초음파 변환기는, 예를 들어, 1"x2.5" 치수를 갖는 직각 압전 소자를 사용할 수 있다. 변환기당 전력 손실은, 충분한 음향 포획력을 얻기 위해 음향 정재파 스팬 (span)의 인치당 및 1"x1" 변환기 단-면적당 10 W이다. 중간 스케일 시스템의 4" 스팬의 경우, 각 1"x1" 정사각 변환기는 40 W를 소비한다. 더 큰 1"x2.5" 직각 변환기는, 중간 스케일 시스템에서 100 W를 사용한다. 3개의 1"x1" 정사각 변환기의 어레이는, 총 120 W를 소비할 것이고, 2개의 1"x2.5" 변환기의 어레이는 약 200W를 소비할 것이다. 밀접 이격된 변환기의 어레이는, 기술의 대안적인 잠재적 구현 예를 나타낸다. 변환기 크기, 형상, 수, 및 위치는, 원하는 다-차원 음향 정재파 패턴을 발생시키기 위해 원하는 대로 변경될 수 있다.
변환기의 크기, 형상, 및 두께는, 여기의 다른 주파수에서 변환기 변위를 결정하여, 결국 분리 효율에 영향을 미친다. 통상적으로, 변환기는 두께 공명 주파수 (반 파장) 근처의 주파수에서 작동한다. 변환기 변위의 구배는, 통상적으로 세포/생분자에 대한 더 많은 포획 위치를 결과한다. 고차 모달 변위는, 모든 방향에서 음향장 내에 강한 구배를 갖는 3-차원 음향 정재파를 발생시키고, 이에 의해 모든 방향에서 동일하게 강한 음향 방사력을 생성하여, 다중 포획 라인으로 이어지며, 여기서, 포획 라인의 수는 변환기의 특정 모드 형상과 관련이 있다.
음향 포획력 및 분리 효율에 대한 변환기 변위 프로파일의 효과를 조사하기 위해, 실험은, 여기 주파수를 제외하고 동일한 모든 조건으로, 1"x1" 정사각 변환기를 사용하여 10회 반복된다. 도 7 상에 원번호 1-9 및 원문자 A로 나타낸, 10개의 연속 음향 공명 주파수는, 여기 주파수로 사용되었다. 조건은, 30분의 실험 지속기간, 대략 5-micron SAE-30 오일 액적의 1000 ppm 오일 농도, 500ml/분의 유속, 및 20 W의 인가 전력이다. 오일이 물보다 밀도가 낮고, 음향영동을 사용하여 물로부터 분리될 수 있기 때문에, 오일 액적은 사용되었다.
도 7은, 2.2 MHz 변환기 공진의 부근에서 주파수의 함수에 따른 정사각 변환기의 측정된 전기 임피던스 진폭을 나타낸다. 변환기 전기 임피던스에서 최소값은, 물기둥 (water column)의 음향 공명에 해당하고, 작동을 위한 잠재적 주파수를 나타낸다. 부가적인 공명은, 다-차원 정재파가 여기되는 다른 주파수에 존재한다. 수치 모델링은, 변환기 변위 프로파일이 이러한 음향 공명 주파수에서 크게 변하며, 이에 의해 음향 정재파 및 그 결과로 생긴 포획력에 직접 영향을 미친다는 것을 나타냈다. 변환기가 이의 두께 공진 근처에서 작동하기 때문에, 전극 표면의 변위는 본질적으로 위상 (phase)을 벗어난다. 변환기 전극의 통상적인 변위는, 일정하지 않으며, 여기의 주파수에 따라 변한다. 예로서, 단일 라인의 포획된 오일 액적을 갖는 여기의 한 주파수에서, 변위는 전극의 중간에서 단일 최대값 및 변환기 가장자리 근처에서 최소값을 갖는다. 또 다른 여기 주파수에서, 변환기 프로파일은, 다중 최대값을 가져서 오일 액적의 다중 포획 라인으로 이어진다. 고차 변환기 변위 패턴은, 포집된 오일 액적에 대해 다중의 안정적 포획 라인 및 더 높은 포획력을 결과한다.
유-수 에멀젼 (oil-water emulsion)이 변환기에 의해 통과됨에 따라, 오일 액적의 포획 라인은 관찰되고 특성화된다. 특성화는, 도 7에서 확인된 10개의 공진 주파수 중 7개에 대해, 도 8에 나타낸 바와 같이, 유체 채널을 가로지르는 포획 라인의 수의 관찰 및 패턴을 포함한다. 변환기의 다른 변위 프로파일은, 정재파에서 다른 (더 많은) 포획 라인을 생성할 수 있어, 변위 프로파일에서 더 많은 구배로 일반적으로 더 높은 포획력 및 더 많은 포획 라인을 생성한다.
도 9는, 9개의 포획 라인 패턴과 일치하는 압력장 (pressure field)를 나타내는 수치 모델이다. 수치 모델은 2-차원 모델이고; 따라서, 3개의 포획 라인 만이 관찰된다. 두 세트의 3개의 포획 라인는, 페이지의 평면에 수직인 3차원에 더 존재한다.
변환기에 의해 발생된 음향 방사력의 횡력은, 결정이 일정한 변위를 갖는 피스톤으로서 효과적으로 이동하는 진동의 형태와 달리, 고차 모드 형상으로 변환기를 구동하여 증가될 수 있다. 몇몇 대표 실행에서, 고차 모드 형상은 베셀 함수 (Bessel functions)이다. 음압은 변환기의 구동 전압에 비례한다. 전력은 전압의 제곱에 비례한다. 변환기는, 통상적으로, z-축에 전기장 및 z-축에 일차 변위를 갖는, 얇은 압전판이다. 변환기는, 일 측에서 공기 (예를 들어, 변환기 내에 에어 갭)에 의해 및 다른 측에서 서로 상호작용될 입자를 함유하는 유체 혼합물에 의해 통상적으로 연결된다. 상기 판에서 발생된 파동의 타입은 합성파로 알려져 있다. 압전판에서 합성파의 서브세트는, 누설 대칭 (또한 압축 또는 확장이라 함) 램파 (Lamb waves)와 유사하다. 상기 판의 압전 성질은, 통상적으로 대칭 램파의 여기를 결과한다. 상기 파동은 이들이 수층 (water layer)으로 방사되기 때문에 누출되며, 이는 수층에서 음향 정재파의 발생을 결과한다. 램파는, 표면 상에 응력이 없는 조건 (stress free conditions)으로 무한 크기 (infinite extent)의 얇은 판에 존재한다. 이러한 구현 예의 변환기가 본질적으로 유한하기 때문에, 실제 모달 변위는 더 복잡하다.
도 10은, 판의 두께에 걸친 면-내 변위 (x-변위) 및 면-외 변위 (y-변위)의 통상적인 변화를 나타내며, 면-내 변위는 판의 두께에 걸친 짝함수 (even function)이고, 면-외 변위는 홀함수 (odd function)이다. 판의 유한 크기 때문에, 변위 구성요소는, 판의 폭 및 길이에 따라 변한다. 일반적으로, (m,n) 모드는, 도 10에 도시된 바와 같이 두께 변화와 함께, 폭 방향으로 변환기 변위에서 m 음파 (undulations) 및 길이 방향으로 n 음파가 있는 변환기의 변위 모드이다. m 및 n의 최대 수는, 압전 물질 (예를 들어, 압전 결정)의 치수 (dimension) 및 여기의 주파수의 함수이다. 형식 (m,n)이 아닌 부가적인 3-차원 모드는 존재한다.
변환기는, 압전 소자가 고차 모드의 일반식 (m, n)으로 진동하도록 구동되며, 여기서, m 및 n은 독립적으로 1 이상이다. 일반적으로, 변환기는 (2,2)보다 더 고차 모드로 진동할 것이다. 고차 모드는, 정재파의 방향뿐만 아니라 횡방향으로, 모든 방향에서 음향장 내에 강한 구배에 의해 특징화된, 수층에 3-차원 정재파를 결과하는, 더 많은 노드와 안티노드를 생성할 것이다. 결과적으로, 음향 구배는 횡방향에서 더 강한 포획력을 결과한다.
일반적으로, 초음파 변환기(들)는, 전압, 전류, 위상 각, 전력, 주파수 또는 임의의 다른 전기 신호 특성에 기초하여 제어될 수 있는, 전기 신호에 의해 구동될 수 있다. 특히, 변환기에 대한 구동 신호는, 전압, 전류, 자성, 전자기, 전기용량 (capacitive) 또는 변환기가 응답하는 임의의 다른 타입의 신호에 기초할 수 있다. 구현 예들에서, 변환기를 구동하는 전압 신호는, 정현파, 정사각, 톱니, 펄스, 또는 삼각 파형을 가질 수 있으며; 500kHz 내지 10MHz의 주파수를 갖는다. 전압 신호는, 임의의 원하는 파형을 생성하는, 펄스 폭 변조로 구동될 수 있다. 전압 신호는 또한 스트리밍을 제거하기 위해 진폭 또는 주파수 변조 시작/정지 성능을 가질 수 있다. 특정 구현 예에서, 전압 신호는, 약 0.5 MHz 내지 약 30 MHz의 주파수를 가질 수 있고, 이러한 주파수는 초음파 변환기에 의해 생성된다.
변환기는, 정재파 방향에서 및 정재파에 직교하는 방향 모두에 동일한 크기 정도의 음향 방사력을 발생시키는 압력장을 생성하는데 사용된다. 힘이 거의 동일한 정도의 크기인 경우, 0.1 microns 내지 300 microns 크기의 입자는, "포획 라인"을 향해 좀 더 효과적으로 이동할 것이어서, 세포 및 핵산 (나출형이든 바이러스 벡터에 있든)은 서로 옆에 함께-위치되어, 이들이 서로 반응하는 것을 가능하게 한다.
생물학적 적용들에서, 시스템의 모든 부품들 (예를 들어, 생물반응기, 음향 필터링 장치, 이를 유체적으로 연결하는 튜브, 등)은, 서로 분리될 수 있고, 일회용일 수 있다. 원심분리기 및 필터의 회피는, 세포의 생존도 (viability)를 저하시키지 않으면서 유체로부터 생물학적 세포의 더 나은 분리를 가능하게 한다. 변환기는 또한 생물학적 세포의 응집으로 인한 막힘을 방지하거나 제거하기 위해 빠른 압력 변화를 생성하도록 구동될 수 있다. 변환기의 주파수는 또한 주어진 전력에 대한 최적의 효과를 얻기 위해 변화될 수 있다.
여기에 기재된 기술 및 실행은, 통합된 연속 자동화 생물공정 (bioprocessing)에 대해 사용될 수 있다. 생물공정과 관련된 일부 또는 모든 유닛 (units)에 대해 제어는 분산될 수 있다. 스크린 디스플레이, 제어 피드백 (control feedbacks), 보고, 상태 보고 및 기타 정보 전달의 형태일 수 있는, 생물공정의 개요 (overview)를 가능하게 하기 위해 유닛으로부터의 피드백은 제공될 수 있다. 분산 처리는, 예를 들어, 유닛 간의 단계를 조정하고, 배치 실행 제어 (batch executive control)를 제공하여, 원하는 공정 제어를 달성하는데 높은 유연성을 가능하게 한다.
음향파 시스템을 활용하는 음향영동 장치는, 생체적합성 물질로 실행될 수 있으며, 감마 멸균성 및 일회용 구성요소를 포함할 수 있다. 공정 시스템은 또한, 비침습적이며, 고점도 유체로 작동할 수 있는, 초음파 유량 측정 (ultrasonic flow measurement)을 가능하게 한다. 상기 시스템은, 제어를 위해 간단한 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 및 일회용 멸균 무균성 커넥터로 실행될 수 있다. 음향영동 장치는 확장 축소 가능한다. 예를 들어, 비교적 작은 유닛은 2 L 내지 50 L 스케일에서 작동할 수 있다.
위에서 논의된 방법, 시스템, 및 장치는 예이다. 다양한 구성들은, 다양한 절차 또는 구성요소를 적절하게 생략, 대체, 또는 추가할 수 있다. 예를 들어, 선택적인 구성에서, 방법은 기재된 것과 다른 순서로 수행될 수 있고, 다양한 단계들은 추가, 생략, 또는 조합될 수 있다. 또한, 특정 구성과 관련하여 기재된 특색은, 다양한 다른 구성에서 조합될 수 있다. 구성의 다른 관점들 및 요소들은, 유사한 방식으로 조합될 수 있다. 또한, 기술은 발전하고, 따라서, 많은 요소들은 예이며, 본 개시 또는 청구범위의 범주를 제한하지 않는다.
(실행을 포함하는) 대표 구성의 철저한 이해를 제공하기 위해 구체적인 세부 사항은 상세한 설명에 제공된다. 그러나, 이러한 구체적인 세부 사항 없이 구성들은 실시될 수 있다. 예를 들어, 공지된 공정, 구조, 및 기술은, 구성을 모호하게 하는 것을 피하기 위해 불필요한 세부 사항 없이 나타낸다. 이러한 설명은 대표 구성만을 제공하며, 청구범위의 범주, 적용성, 또는 구성을 제한하지 않는다. 오히려, 구성들의 전술한 상세한 설명은, 기재된 기술을 실행하기 위한 상세한 설명을 제공한다. 본 개시의 사상 또는 범주를 벗어나지 않으면서 요소들의 기능 및 배열에서 다양한 변화는 만들어질 수 있다.
값이 제1 임계값을 초과한다는 (또는 보다 많다는) 진술은, 상기 값이 제1 임계값보다 약간 큰 제2 임계값, 예를 들어, 관련 시스템의 분석에서 제1 임계값보다 더 큰 하나의 값인 제2 임계값을 만족하거나 또는 초과한다는 진술과 대등하다. 값이 제1 임계값보다 작다는 (또는 내에 있다는) 진술은 상기 값이 제1 임계값보다 약간 작은 제2 임계값, 예를 들어, 관련 시스템의 분석에서 제1 임계값보다 작은 하나의 값인 제2 임계값 이하라는 진술과 대등하다.
또한, 구성들은, 흐름도 또는 블록도로 도시된 공정로서 설명될 수 있다. 비록 각각이 순차적인 공정로서 작동들을 기재될 수 있지만, 많은 작동들은, 병렬적으로 또는 동시에 수행될 수 있다. 부가적으로, 작동의 순서는 재배열될 수 있다. 공정은, 도면에 포함되지 않은 부가적인 단계 또는 기능들을 가질 수 있다.
하기 실시 예는 본 개시의 장치 및 공정을 예시하기 위해 제공된다. 실시 예는 오직 예시적인 것이고, 그 안에 서술된 물질, 조건, 또는 공정 파라미터로 본 개시를 제한하려는 것은 아니다.
실시 예
실시 예 1:
도 11은, T-세포 및 바이러스를 갖는 유체 혼합물을 함유하는 플라스틱 백의 사진이다. 플라스틱 백은 물로 채워진 음향영동 장치 내로 배치된다. 다-차원 음향 정재파는 발생되어, T-세포 및 바이러스가 서로 상호작용하도록 한다. 이것은, 플라스틱 백 내에 일련의 디스크의 빔으로 볼 수 있다.
실시 예 2:
BacMam® 시스템 (ThermoFisher Scientific)은, 형질도입을 위해 배큘로바이러스 (baculoviruses)를 사용하고, Jurkat T-세포 내로 녹색 형광 단백질 (GFP)의 형질도입을 위해 사용된다. 이러한 시스템은, 다양한 실험에 대해 사용된다. 5개의 결과는 아래에 나타낸다. 이들은 대조군, 공정 대조군 1, 공정 대조군 2, 음향 3MHz, 및 음향 10MHz로 표시된다.
대조군 실험, 공정 대조군 1 실험, 및 공정 대조군 2 실험은, 음향 정재파에 노출되지 않았다.
음향 3 MHz 실험의 경우, 공칭 주파수 3 Hz의 음향 정재파를 사용하여 T-세포와 바이러스 사이에서 상호작용은 향상되었다.
음향 10 MHz 실험의 경우, 공칭 주파수 10 Hz의 음향 정재파를 사용하여 T-세포와 바이러스 사이에서 상호작용은 향상되었다.
결과는 하기 표 1에 열거된다. MOI는, 감염 다중도 (multiplicity of infection), 또는 세포당 바이러스 벡터 입자의 수이다. GFP+는 GFP를 발현한 세포의 %이다.
실험 MOI GFP+ (%)
대조군 - -
공정 대조군 1 50 28.4
공정 대조군 2 50 48.8
음향 3MHz 10 21.8
음향 10MHz 10 48.4
음향의 사용은 세포당 80% 더 적은 바이러스 입자로 동등한 형질도입 효율을 결과했다.
실시 예 3:
음향 챔버는 초음파 변환기 및 반사기를 포함한다. 재순환 루프는, 음향 챔버의 일측 단부로부터 유체를 끌어당긴 다음, 유체를 다른 단부를 통해 음향 챔버 내로 다시 순환시킨다. 음향 챔버는, 약 1 mL의 부피를 갖고, 재순환 루프는, 약 3 mL의 부피를 갖는다. 음향 챔버를 사용하여 형질도입 시험은 수행되었다.
재순환을 갖는 음향 챔버를 사용하여 4개의 음향 시험은 수행되었다. 2가지 음향 시험의 경우, 형질도입 효율에 대한 음향의 효과를 결정하기 위해, 음향은 1 W의 출력 수준에서 켠다 (turned on). 다른 2개의 시험의 경우, 음향은 끈다 (turned off) (오직 재순환).
각 음향 시험은 또한 대조군 실행 (Control run) 및 정적 실행 (Static Run)으로 수행된다. 대조군 실행의 경우, 바이러스는 페트리 접시 (Petri dish)에서 세포에 첨가되고, 그 다음 즉시 세척된다. 정적 실행의 경우, 바이러스는 페트리 접시에서 90분 동안 세포에 첨가된 다음, 세척된다. 이러한 시험에 대한 MOI (세포당 바이러스 벡터 입자의 수)는 25이다. 모든 실행의 경우, 세포 생존도는 뉴클레오카운터 (Nucleocounter)에 의해 측정된다. 각 음향 실행의 경우, 세포 생존도는 또한 Vi-Cell 세포 생존도 분석기 (Vi-Cell cell viability analyzer)를 사용하여 측정된다.
표 2는 각 시험의 파라미터를 나타낸다. 표 3은 각 시험 실행의 결과를 나타낸다. 표 4는 Vi-Cell 분석을 제공한다. 표 5는 뉴클레오카운터 분석을 제공한다. 표 3에서, 형질도입 이득 (gain)은, 정적 효율로 나눈 음향 효율이다.
시험 부피 (mL) 유속 (mL/min) 음향 파워 (W) 세포의 총 수 (million) 재순환
1 4.13 4.13 1 8 90
2 4.13 4.13 1 8 90
3 4.13 4.13 N/A (오직 재순환) 8 90
4 4.13 4.13 N/A (오직 재순환) 8 90
생존도
시험 실행 효율 (%) 표준 편차 (%) 뉴클레오카운터 (%) Vi-Cell (%) 형질도입 이득
1 대조군 1.6 0.2 96
1 정적 17.5 0.7 97
1 음향 35.4 1.6 96 93 2.02
2 대조군 1.3 0.1 96
2 정적 18.7 1.7 94
2 음향 28.8 1.6 96 90 1.53
3 대조군 2.9 0.2 96
3 정적 14.9 1.7 94
3 재순환 19.4 0.7 95 93 1.31
4 대조군 2.9 0.4 96
4 정적 14.9 0.6 96
4 재순환 19.1 0.8 94 87 1.29
시험 출발 세포
(x106)		 세포 회복
(%)		 생존 세포 회복
(%)		 효율
(%)		 총 생존 형질도입된 세포 (x106) 비
1 (음향) 8.00 97.0 87.2 35.4 2.47 1.95
2 (음향) 8.00 96.7 85.8 28.8 1.98 1.56
3 (재순환) 8.00 97.4 84.7 19.4 1.32 1.04
4 (재순환) 8.00 94.6 82.6 19.1 1.26 1.00
시험 출발 세포
(x106)		 세포 회복
(%)		 생존 세포 회복
(%)		 효율
(%)		 총 생존 형질도입된 세포 (x106) 비
1 (음향) 6.20 89.2 84.7 35.4 1.86 1.82
2 (음향) 6.20 95.4 92.0 28.8 1.64 1.61
3 (재순환) 6.20 91.4 87.8 19.4 1.06 1.04
4 (재순환) 6.20 87.7 86.2 19.1 1.02 1.00
표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 재순환의 사용은, 형질도입 효율을 개선시킨다. 재순환에 부가하여 음향의 사용은, 형질도입 효율을 훨씬 개선시킨다. 표 4를 참조하면, 음향 및 재순환을 이용한 2개의 실행 (실행 1 & 2)은, 재순환을 갖지만 음향이 없는 2개의 실행 (실행 3 & 4)과 비교하여 약 72% 더 많은 총 생존 형질도입된 세포를 나타냈다. 표 5를 참조하면, 음향 및 재순환을 이용한 2개의 실행 (실행 1 & 2)은, 재순환을 갖지만 음향이 없는 2개의 실행 (실행 3 & 4)과 비교하여 약 68% 더 많은 총 생존 형질도입된 세포를 나타냈다.
실시 예 4:
3개의 음향 시험은, 실시 예 3에 기재된 바와 같은 재순환되는 음향 챔버를 사용하지만, 30분, 60분 및 90분의 실행 시간 동안 수행된다. 음향은 2 MHz의 주파수 및 3.5 W의 파워로 실행된다. 대조군 및 정적 실행들은 또한 실시 예 3에 기재된 바와 같이 수행되지만, 30분, 60분, 또는 90분 동안 수행된다. 표 6는 각 시험의 파라미터를 나타낸다. 결과는 도 12에 나타낸다. 도 12에서 볼 수 있듯이, 실행 시간이 증가됨에 따라, 음향이 없는 것에 비해 형질도입 효율은 개선된다.
실행 시간
(min)		 세포 농도
(106/mL)		 유속
(mL/min)		 음향 부피
(mL)		 총 부피
(mL)		 대조군 부피
(mL)
30 1 10 1 10 0.5
60 1 10 1 10 0.5
90 1 10 1 10 0.5
몇 가지 대표 구성을 기재하였지만, 본 개시의 사상을 벗어나지 않고 다양한 변경, 대안적인 구조물, 및 등가물은 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 요소들은 더 큰 시스템의 구성요소일 수 있으며, 여기서, 다른 구조 또는 공정들이 본 개시의 적용보다 우선하거나 또는 다른 방식으로 변경될 수 있다. 또한, 상기 요소들이 고려되기 전, 동안, 또는 후에, 다수의 작동들은 착수될 수 있다. 따라서, 상기 설명은 청구범위의 범주를 한정하지 않는다.

Claims (26)

  1. 세포 및 핵산이 배치되는 음향 챔버; 및
    상기 음향 챔버 내에 음향 정재파를 생성하도록 구동될 수 있는 압전 물질을 포함하는 초음파 변환기;
    를 포함하는 음향영동 장치에 세포 및 핵산을 배치하는 단계; 및
    상기 초음파 변환기를 2 MHz 내지 20 MHz의 주파수로 구동하여 다-차원 음향 정재파를 생성하는, 구동 단계;를 포함하며,
    여기서, 적어도 세포는 음향 정재파에 의해 유지되며, 상기 핵산은 2차 입자-간 힘에 의해 세포와 함께-위치되어 세포 내로 외래 핵산의 도입을 가능하게 하는, 외래 핵산을 세포 내로 도입하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 핵산은 바이러스 벡터인, 외래 핵산을 세포 내로 도입하는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 세포를 핵산과 함께-위치시키기 전에 세포의 세포막에서 기공을 개방시키는 단계를 더욱 포함하는, 외래 핵산을 세포 내로 도입하는 방법.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 기공은, 전기 천공법, 세포 천공법, 또는 인산 칼슘에 노출에 의해 개방되는, 외래 핵산을 세포 내로 도입하는 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 음향영동 장치는, 음향 챔버에 연결된 재순환 루프를 더욱 포함하고; 상기 세포 또는 핵산 중 하나 이상은 음향 챔버를 통해 재순환되는, 외래 핵산을 세포 내로 도입하는 방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 세포는, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0 하이브리도마 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 인간 세포, 조절 T-세포, 헬퍼 T-세포, 세포독성 T-세포, 기억 T-세포, 이펙터 T-세포, 감마 델타 T-세포, Jurkat T-세포, CAR-T 세포, B 세포, 또는 NK 세포, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs), 조류, 식물 세포, 또는 박테리아인, 외래 핵산을 세포 내로 도입하는 방법.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 음향 정재파는, 다-차원 음향 정재파, 평면 정재파, 또는 다-차원 음향 정재파와 평면 정재파의 조합인, 외래 핵산을 세포 내로 도입하는 방법.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 음향 정재파의 주파수는, 스윕 패턴으로 변화되어 상기 핵산에 대해 상기 세포를 이동시키는, 외래 핵산을 세포 내로 도입하는 방법.
  9. 세포 및 바이러스 벡터가 배치되는 음향 챔버; 및
    상기 음향 챔버 내에 음향 정재파를 생성하도록 구동될 수 있는 압전 물질을 포함하는 초음파 변환기;
    를 포함하는 음향영동 장치에 핵산을 포함하는 바이러스 벡터 및 세포를 음향영동 장치에 배치하는 단계; 및
    상기 초음파 변환기를 2 MHz 내지 20 MHz의 주파수로 구동하여 구동하여 다-차원 음향 정재파를 생성하는, 구동 단계;를 포함하며,
    여기서, 상기 세포 및 바이러스 벡터는 음향 정재파 및 2차 입자-간 힘에 의해 함께-위치되어 세포의 형질도입을 가능하게 하는, 세포의 형질도입을 일으키는 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 세포 및 바이러스 벡터는 유체에서 현탁되는, 세포의 형질도입을 일으키는 방법.
  11. 청구항 9에 있어서,
    상기 세포는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0 하이브리도마 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 인간 세포, 조절 T-세포, 헬퍼 T-세포, 세포독성 T-세포, 기억 T-세포, 이펙터 T-세포, 감마 델타 T-세포, Jurkat T-세포, CAR-T 세포, B 세포, 또는 NK 세포, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs), 조류, 식물 세포, 또는 박테리아인, 세포의 형질도입을 일으키는 방법.
  12. 청구항 9에 있어서,
    상기 음향영동 장치는, 상기 음향 챔버에 연결된 재순환 루프를 더욱 포함하고; 상기 세포 또는 핵산 중 하나 이상은 음향 챔버를 통해 재순환되는, 세포의 형질도입을 일으키는 방법.
  13. 청구항 9에 있어서,
    상기 음향 정재파의 주파수는 스윕 패턴으로 변화되어 상기 바이러스 벡터에 대해 세포를 이동시키는, 세포의 형질도입을 일으키는 방법.
  14. 세포의 세포막에 기공을 개방하는 단계;
    세포 및 핵산이 배치되는 음향 챔버; 및
    상기 음향 챔버 내에 음향 정재파를 생성하도록 구동될 수 있는 압전 물질을 포함하는 초음파 변환기;
    를 포함하는 음향영동 장치에 세포 및 핵산을 배치하는 단계; 및
    상기 초음파 변환기를 2 MHz 내지 20 MHz의 주파수로 구동하여 음향 정재파를 생성하는, 구동 단계;를 포함하며,
    여기서, 상기 세포 및 핵산은 세포의 형질감염을 일으키기 위해 음향 정재파 및 2차 입자-간 힘에 의해 함께-위치되는, 세포의 형질감염을 일으키는 방법.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 기공은 전기 천공법, 세포 천공법, 또는 인산 칼슘에 노출에 의해 개방되는, 세포의 형질감염을 일으키는 방법.
  16. 청구항 14에 있어서,
    상기 기공은 세포가 음향영동 장치에 배치되기 전 또는 후에 개방되는, 세포의 형질감염을 일으키는 방법.
  17. 청구항 14에 있어서,
    상기 음향영동 장치는 상기 음향 챔버에 연결된 재순환 루프를 더욱 포함하고; 상기 세포 또는 핵산 중 하나 이상은 음향 챔버를 통해 재순환되는, 세포의 형질감염을 일으키는 방법.
  18. 청구항 14에 있어서,
    상기 세포는, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0 하이브리도마 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 인간 세포, 조절 T-세포, 헬퍼 T-세포, 세포독성 T-세포, 기억 T-세포, 이펙터 T-세포, 감마 델타 T-세포, Jurkat T-세포, CAR-T 세포, B 세포, 또는 NK 세포, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs), 조류, 식물 세포 또는 박테리아인, 세포의 형질감염을 일으키는 방법.
  19. 청구항 14에 있어서,
    상기 음향 정재파는 다-차원 음향 정재파, 평면 정재파, 또는 다-차원 음향 정재파와 평면 정재파의 조합인, 세포의 형질감염을 일으키는 방법.
  20. 청구항 14에 있어서,
    상기 음향 정재파의 주파수는 스윕 패턴으로 변화되어 상기 세포를 핵산에 대해 이동시키는, 세포의 형질감염을 일으키는 방법.
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