BR112020008771A2

BR112020008771A2 - Vetores

Info

Publication number: BR112020008771A2
Application number: BR112020008771-8A
Authority: BR
Inventors: Simon Thomas; Shimobi Onuoha; Shaun Cordoba
Original assignee: Autolus Limited
Priority date: 2017-11-01
Filing date: 2018-10-31
Publication date: 2020-12-29
Also published as: GB201718088D0; AU2018361810A1; JP2021500905A; IL274278A; EP3703713A1; KR20200083554A; CL2020001135A1; CA3080299A1; CN111278982A; RU2020117772A; US20210214748A1; SG11202003682SA; WO2019086865A1; MX2020007225A

Abstract

vetores a presente invenção fornece um kit de vetores compreendendo: (i) um primeiro vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um primeiro componente marcador; e (ii) um segundo vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um segundo componente marcador, em que, quando uma célula é transduzida com o primeiro e o segundo vetores, o primeiro e o segundo componentes marcadores são expressos pela célula e associados formando um hetero-marcador multimérico que é reconhecido por um reagente de seleção de células, enquanto que, quando uma célula é transduzida apenas com o primeiro ou o segundo vetor, a expressão do primeiro ou do segundo componente de marcador sozinho não é reconhecida pelo reagente de seleção de células.

Description

VETORES CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a um kit de vetores. Por exemplo, vetores retrovirais para a transdução de uma célula. Em particular, a invenção se refere a um kit compreendendo um primeiro vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica um primeiro componente marcador e um segundo vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica um segundo componente marcador. Quando uma célula é transduzida com os dois vetores, os dois componentes marcadores são expressos na célula e eles se associam para formar um marcador heteromultimérico detectável. A invenção também se refere a métodos de produção e detecção de uma célula transduzida com esses vetores, bem como composições farmacêuticas e métodos para tratamento / prevenção de uma doença compreendendo a administração de composições dessas células.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Os vetores virais têm sido usados para transduzir células T para expressar polipeptídeos de interesse há décadas. Esses vetores exploram os mecanismos moleculares especializados desenvolvidos nos vírus para transferir eficientemente seu genoma dentro da célula que infectam. No entanto, eles têm uma capacidade de transferência finita que geralmente é considerada em torno de 8 a 10 kilobases (kb). O limite é devido à eficiência da embalagem ser inversamente proporcional ao tamanho da inserção.

[003] Outros mecanismos não virais potenciais da terapia gênica baseada em células T com maior capacidade de inserção são conhecidos, mas estes são frequentemente dificultados pela baixa eficiência da transdução e / ou efeitos tóxicos que produzem baixos números de células T.

[004] A fim de transduzir um tamanho grande de inserção em uma célula T, mantendo alta eficiência, os genes codificados em um vetor viral podem ser divididos em dois ou mais vetores separados. Cada vetor é usado para produzir o vírus e todos os vetores são reunidos para transduzir as células. No entanto, essa abordagem de transdução múltipla geralmente resulta em células que são transduzidas com alguns, mas não com todos os vetores desejados. Isso leva a uma população celular não uniforme compreendendo diferentes vetores de vetores, que não expressarão todos os genes desejados.

[005] É necessário fornecer métodos aprimorados de transdução e transfecção de células T com tamanhos de inserção maiores.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[006] A Figura 1 mostra um diagrama esquemático que ilustra um marcador heterodimérico. O primeiro componente marcador é um ectodomínio CD79a e o segundo componente marcador é uma fusão entre o ectodomínio CD79b. e o domínio transmembranar e um endodomínio truncado de CD19. O primeiro e o segundo componentes marcadores associam-se através de uma ligação dissulfureto.

[007] A Figura 2 mostra um diagrama esquemático que ilustra outro marcador heterodimérico. O primeiro componente marcador é um domínio constante Kappa e o segundo componente marcador é uma fusão entre o domínio CH1 de lgG1 e o domínio transmembranar e um endodomínio truncado de CD19. O primeiro e o segundo marcadores associam-se via a uma ligação dissulfureto.

[008] A Figura 3 mostra um Ddiagrama esquemático que ilustra um marcador heterotrimérico. O primeiro componente marcador é um domínio constante Kappa; o segundo componente marcador é uma fusão entre o ectodomínio CD79b e o domínio transmembranar e um endodomínio truncado de CD19; e o terceiro marcador é uma fusão entre o ectodomínio CD79a e um domínio CH1 de IgGl. O primeiro, segundo e terceiro componentes do marcador se associam através de duas ligações di-sulfureto para formar um marcador hetero-trimérico.

[009] A Figura 4 mostra sequências de aminoácidos codificadas pelo primeiro e segundo vetores de um kit. Os vetores codificam o primeiro e o segundo componentes marcadores que se associam para formar um marcador heterodimérico, como mostrado na Figura 2.

[0010] A Figura 5 mostra sequências de aminoácidos codificadas pelo primeiro, segundo e terceiro vetores de um kit. Os vetores codificam primeiro, segundo e terceiro componentes marcadores que se associam para formar um marcador heterotrimérico, como mostrado na Figura 3.

[0011] A Figura 6A mostra um diagrama esquemático que ilustra um primeiro vetor e um segundo vetor, o primeiro vetor codificando um primeiro receptor de antígeno quimérico (CAR), local de clivagem de peptídeo 2A e um primeiro marcador (CAR1-2A-Ma); e o segundo vetor que codifica um segundo local de clivagem do peptídeo CAR, 2A e um segundo marcador (CAR2-2A-IV ^). O local de clivagem do peptídeo 2A está localizado entre o marcador e o CAR em cada vetor. A Figura 6B mostra um diagrama esquemático que ilustra o efeito da transdução de uma célula com um ou ambos os vetores ilustrados na Figura 6A. Quando a célula é transduzida apenas com o primeiro ou o segundo vetor, o transgene é expresso (CAR1 ou CAR2), mas nenhum marcador detectável é expresso na superfície da célula. Quando a célula é transduzida com o primeiro e o segundo vetores, ambos os CARs são expressos e a associação do primeiro e do segundo componentes do marcador forma um marcador heterodimérico estável, que também é expresso na superfície celular.

[0012] A Figura 7A mostra um diagrama esquemático de um primeiro vetor, segundo e terceiro vetor. O primeiro vetor codifica um primeiro local de clivagem de peptídeo CAR, a2A e primeiro marcador (CAR1-2A-Ma); o segundo vetor codifica um segundo CAR, um local de clivagem de peptídeo 2A e um segundo marcador (CAR2-2A-IV ^); e o terceiro vetor codifica um terceiro CAR, um local de clivagem de peptídeo 2A e um terceiro marcador (CAR3-2A-MY). O local de clivagem do peptídeo 2A está localizado entre o marcador e o CAR em cada vetor. A Figura 7B mostra um diagrama esquemático que ilustra o efeito da transdução de uma célula com um, dois ou todos os três vetores mostrados na Figura 7A. Quando a célula é transduzida com um ou dois dos vetores, o transgene relevante (isto é, CAR) é expresso, mas nenhum marcador detectável é expresso na superfície da célula. Todos os três vetores devem ser transduzidos para expressão do marcador. Após a transdução do primeiro, segundo e terceiro vetores, todos os três CARs são expressos e a associação do primeiro, segundo e terceiro componentes do marcador forma um marcador hetero- trimérico estável, que é expresso na superfície da célula.

[0013] A Figura 8 mostra sequências de sinal do tipo selvagem e mutadas adequadas para uso para alterar o parente da expressão dos componentes do marcador em um kit. Um vetor pode codificar a sequência peptídica de sinal do tipo selvagem e o outro vetor pode codificar uma das sequências alteradas mostradas como "mutação 1" para "mutação 7". As sequências alteradas são peptídeo sinal menos eficiente, de modo que o componente marcador codificado pelo vetor com o peptídeo sinal alterado será expresso em um nível mais baixo na célula do que o componente marcador codificado pelo vetor com o peptídeo sinal do tipo selvagem. A expressão relativa de outros transgene (s) na mesma construção que o marcador será afetada de maneira semelhante, de modo que o (s) polipeptídeo (s) de interesse codificado pelo vetor com o peptídeo sinal alterado seja expresso em um nível mais baixo na célula que o polipeptídeo de interesse codificado pelo vetor com o peptídeo sinal selvagem.

[0014] As Figura 9 (A e B) mostram expressão superficial de um marcador heterodímero em células T 293 (A.) e células T humanas primárias (B.) e um marcador heterotrímero em células 293T (C). As células A e B: 293T foram transfectadas individualmente com cada cadeia do marcador heterodímero (vetor 1 e vetor 2) ou transfectadas duas vezes com ambos (vetor 1 + vetor 2). A montagem bem sucedida do marcador heterodímero em células duplamente transfectadas foi avaliada por citometria de fluxo por coloração com anticorpo anti-cadeia Kappa humano, anticorpo Fab anti-humano e usando CD19 solúvel. Um plasmídeo que codifica para as duas cadeias do marcador heterodímero foi usado como controle positivo. Tanto a célula T 293K como os resultados primários da transdução de células T humanas (usando 4 amostras de doadores saudáveis) demonstram que a expressão seletiva do marcador heterodímero ocorre apenas em células T duplas transduzidas com o mínimo de fundo detectado em células T únicas transduzidas. As células C: 293T foram transfectadas individualmente com cada cadeia de um marcador heterotrímero (vetor 1, vetor 2 e vetor 3) ou transfectadas duas vezes com o vetor 1 e vetor 2 (vetor 1 + vetor 2) ou transfectadas triplamente com as três cadeias de o marcador heterotrímero (vetor 1 + vetor 2 + vetor 3). A montagem bem sucedida do marcador heterotrímero foi avaliada por coloração para CD19 solúvel usando citometria de fluxo. Os resultados mostram que quando uma célula é transduzida com um ou dois dos vetores, nenhum marcador detectável é expresso na superfície da célula. Todos os três vetores devem ser transduzidos para expressão do marcador.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0015] Os inventores desenvolveram um kit de vetores compreendendo sequências de ácidos nucleicos, cada uma das quais codificando um componente marcador. Os componentes marcadores estabilizam após a associação e formam um marcador heteromultimérico detectável.

[0016] Assim, em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um kit de vetores compreendendo: (i) um primeiro vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um primeiro componente marcador; e (ii) um segundo vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um segundo componente marcador.

[0017] Quando uma célula é transduzida com o primeiro e o segundo vetores, o primeiro e o segundo componentes marcadores são expressos pela célula e se associam formando um marcador heteromultimérico que é reconhecível com um agente como um reagente de seleção de células.

[0018] Quando uma célula é transduzida apenas com o primeiro ou o segundo vetor, a expressão do primeiro ou do segundo componente marcador sozinha não é reconhecida pelo reagente de seleção de células.

[0019] O primeiro componente do marcador pode ser instável quando não associado ao segundo componente do marcador. Nesse arranjo, o agente ou reagente de seleção de células pode reconhecer o primeiro componente marcador.

[0020] Alternativamente, o primeiro e o segundo componentes do marcador podem ser instáveis quando não associados. Nesse arranjo, o agente ou reagente de seleção de células pode reconhecer o primeiro ou o segundo componente marcador.

[0021] O primeiro componente marcador pode estar ligado à membrana e o segundo componente marcador pode ser secretado na ausência do primeiro componente marcador. Nesse arranjo, o agente ou reagente de seleção de células pode reconhecer o segundo componente marcador.

[0022] Um componente marcador pode compreender um domínio constante Kappa e o outro componente marcador pode compreender o domínio CH1 de lgG1.

[0023] Um componente marcador pode compreender um ectodomínio CD79a e o outro componente marcador pode compreender um ectodomínio CD79b.

[0024] O kit pode compreender um terceiro vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um terceiro marcador.

[0025] Quando uma célula é transduzida com o primeiro, segundo e terceiro vetores, os primeiro, segundo e terceiro componentes marcadores podem ser expressos pela célula e associados, formando um marcador heteromultimérico que é reconhecido por um reagente de classificação celular;

[0026] Quando uma célula é transduzida com um ou dois do primeiro, segundo ou terceiro vetor (s), a expressão de um ou dois dos primeiro, segundo ou terceiro componente (s) marcador (s) pode não ser reconhecida pelo reagente de classificação celular.

[0027] O primeiro, segundo e / ou terceiro componente do marcador podem ser instáveis quando não associados ao marcador heteromultimérico.

[0028] O primeiro componente marcador pode estar ligado à membrana; o segundo componente marcador pode ser secretado na ausência do primeiro componente marcador; e o terceiro componente marcador pode ser secretado, a menos que o primeiro e o segundo componentes marcador também sejam expressos. Nesse arranjo, o agente ou reagente de seleção de células pode reconhecer o terceiro componente marcador.

[0029] O primeiro componente marcador pode compreender um ectodomínio CD79a ligado à membrana; o segundo marcador pode compreender um domínio CH1 de lgG1 e um ectodomínio CD79a, e o terceiro marcador pode compreender um domínio constante Kappa.

[0030] Pelo menos um dos vetores no kit do primeiro aspecto da invenção também pode compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico ou um receptor de célula T.

[0031] Quando os vetores no kit são expressos dentro de uma célula, o nível de expressão de um componente marcador pode ser diferente do nível de expressão na célula de outro componente marcador.

[0032] Os vetores que codificam os dois componentes marcadores podem compreender diferentes sequências de sinal.

[0033] Em um segundo aspecto, a presente invenção também fornece um marcador heteromultimérico de superfície celular para uso na detecção de uma população de células transduzidas, em que o marcador heteromultimérico compreende pelo menos dois componentes de marcador, o primeiro componente de marcador codificado por uma sequência de ácido nucleico em um primeiro vetor e o segundo componente marcador codificado por uma sequência de ácido nucleico em um segundo vetor, em que o primeiro marcador e o segundo componente marcador se associam.

[0034] O primeiro e / ou o segundo componente (s) marcador (s) podem ser instáveis quando não associados.

[0035] O segundo componente marcador pode ser secretado pela célula na ausência do primeiro componente marcador.

[0036] Num terceiro aspecto, a presente invenção fornece uma célula que compreende um marcador heteromultimérico de acordo com o segundo aspecto da invenção e / ou uma célula transduzida com um kit de vetores de acordo com o primeiro aspecto da invenção.

[0037] A célula pode ser uma célula imune, como uma célula T ou uma célula natural killer (NK).

[0038] Num quarto aspecto, a presente invenção fornece um método para fabricar uma célula, de acordo com o terceiro aspecto da invenção, que compreende a etapa de transduzir ou transfectar uma célula com um kit de vetores de acordo com o primeiro aspecto da invenção.

[0039] Num quinto aspecto, a presente invenção fornece um método para preparar uma composição de células de acordo com o terceiro aspecto da invenção, que compreende as seguintes etapas: (i) transdução ou transfecção de uma amostra de células com um kit de vetores de acordo com o primeiro aspecto da invenção; (ii) detectar a expressão do marcador heteromultimérico usando um agente como um reagente de seleção de células; e (iii) selecionar ou classificar as células detectadas para preparar uma composição de células que expressam o marcador heteromultimérico.

[0040] O reagente de seleção de células pode ser uma proteína recombinante solúvel e as células podem ser selecionadas ou classificadas na etapa (iii) usando uma matriz que reconhece a proteína recombinante solúvel.

[0041] O reagente de seleção de células pode ser uma proteína recombinante solúvel marcada por fluorescência e as células podem ser selecionadas ou classificadas na etapa (iii) por citometria de fluxo.

[0042] O reagente de seleção de células pode ser uma proteína recombinante solúvel ligada a uma esfera e as células são selecionadas ou classificadas na etapa (iii) por separação das esferas da amostra de células transduzidas / transfectadas.

[0043] Num sexto aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo uma pluralidade de células de acordo com o terceiro aspecto da invenção.

[0044] Num sétimo aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica de acordo com o sexto aspecto da invenção para uso no tratamento e / ou prevenção de uma doença.

[0045] Num oitavo aspecto, a presente invenção fornece um método para o tratamento e / ou prevenção de uma doença, que compreende a etapa de administração de uma composição farmacêutica de acordo com o sexto aspecto da invenção a um sujeito.

[0046] O método pode compreender as seguintes etapas: I. isolamento de uma amostra contendo células de um indivíduo II. transdução ou transfecção da amostra contendo células com um kit de vetores de acordo com o primeiro aspecto da invenção III. detectar a expressão do marcador heteromultimérico usando um reagente de seleção de células, identificando assim uma população de células transduzidas / transfectadas a partir da amostra, IV. selecionar ou classificar a população de células de (III) para alcançar uma subpopulação purificada de células transduzidas / transfectadas, e V. administrar a subpopulação de (IV) que expressa o marcador heteromultimérico ao sujeito.

[0047] Num nono aspecto, a presente invenção fornece o uso de uma composição farmacêutica de acordo com o sexto aspecto da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento e / ou prevenção de uma doença.

[0048] A doença pode ser câncer.

[0049] A presente invenção fornece um kit de vetores que codificam componentes marcadores que se estabilizam após a associação, formando um marcador heteromultimérico detectável capaz de expressão da superfície celular. Quando uma célula é transduzida com ambos ou todos os vetores do kit, o marcador heteromultimérico é expresso na superfície da célula que é detectável com um agente como um reagente de seleção de células. No entanto, quando uma célula é transduzida com um subconjunto dos vetores (por exemplo, um vetor sozinho ou dois de três vetores), nenhum marcador é expresso na superfície da célula que é detectável pelo agente.

[0050] Portanto, é possível identificar células que foram transduzidas com todos os vetores no kit pela detecção da expressão de um único marcador na superfície da célula. Isso oferece vantagens consideráveis sobre os métodos que envolvem a detecção de vários marcadores (isto é, um para cada vetor) em termos de complexidade reduzida e melhor rendimento das células após a classificação das células.

[0051] É possível dividir inserções grandes entre múltiplos vetores e selecionar células transduzidas com todos os vetores usando o princípio da invenção que envolve a detecção de um único marcador heteromultimérico. Portanto, é possível aumentar o tamanho total da inserção que pode ser transduzido em uma célula sem aumentar a complexidade do método para identificar e classificar células que contêm toda a inserção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO KIT DE VETORES

[0052] O primeiro aspecto da invenção fornece um kit de vetores. O kit de vetores compreende mais de um vetor. O kit de vetores compreende pelo menos um primeiro vetor e um segundo vetor e, em uma modalidade, o kit de vetores compreende um primeiro vetor, um segundo vetor e um terceiro vetor. O kit pode conter 2, 3, 4 ou 5 vetores. O número de vetores no kit da presente invenção está relacionado ao tamanho total da inserção desejada para ser transduzida na célula hospedeira: onde o tamanho total da inserção é grande, pode ser dividido em um número maior de vetores.

[0053] Os vetores separados no kit da presente invenção entregam sequências separadas de ácido nucleico na célula hospedeira, de modo que, quando uma célula é transduzida com todos os vetores do kit, todos os polipeptídeos de interesse desejados (POI) são expressos pelo célula. Por exemplo, o kit pode expressar três POIs, como um primeiro CAR, segundo CAR e gene suicida na célula hospedeira.

[0054] A divisão da inserção completa entre vários vetores oferece vantagens sobre um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica vários polipeptídeos de interesse dentro da mesma cassete. O arranjo de vetor único resulta em problemas com eficiência de tradução e transcrição devido a, por exemplo, "interferência do promotor", em que um promotor domina e causa silenciamento do segundo promotor. Além disso, diferentes promotores trabalham de maneira diferente em diferentes contextos celulares e isso dificulta a "sintonia" consistente da expressão relativa de cada transgene.

VETORES

[0055] Os vetores podem ser vetores virais, como vetores retrovirais ou vetores lentivirais.

[0056] O vetor pode ser um plasmídeo.

[0057] Os vetores também podem ser vetores baseados em transposons ou mRNA sintético. Os vetores podem ser capazes de transfectar ou transduzir células imunes, como uma célula T ou uma célula NK.

VETORES RETROVIRIAIS

[0058] Retrovírus e lentivírus podem ser usados como um vetor ou sistema de entrega para a transferência de um polipeptídeo de interesse (POI), ou uma pluralidade de POIs, para uma célula alvo. A transferência pode ocorrer in vitro, ex vivo ou in vivo. Quando usados dessa maneira, os vírus são tipicamente chamados de vetores virais.

[0059] O POI pode, por exemplo, codificar um receptor de célula T ou um receptor de antígeno quimérico (CAR) e /

ou um gene suicida.

[0060] Os vetores gama-retrovirais, vetores retrovirais comumente designados, foram o primeiro vetor viral empregado em ensaios clínicos de terapia gênica em 1990 e ainda são um dos mais utilizados.

[0061] Mais recentemente, o interesse em vetores lentivirais, derivados de retrovírus complexos, como o vírus da imunodeficiência humana (HIV), aumentou devido à sua capacidade de transduzir células não-divisórias.

[0062] As características mais atraentes dos vetores retrovirais e lentivirais como ferramentas de transferência gênica incluem a capacidade de grande carga útil genética (até cerca de 8 a 10 kb), resposta imunológica mínima do paciente, alta eficiência de transdução in vivo e in vitro e a capacidade de modificar permanentemente o conteúdo genético da célula alvo, sustentando uma expressão a longo prazo do gene entregue.

[0063] O vetor retroviral pode ser baseado em qualquer retrovírus adequado que seja capaz de fornecer informações genéticas para células eucarióticas. Por exemplo, o vetor retroviral pode ser um vetor alpharetroviral, um vetor gammaretroviral, um vetor lentiviral ou um vetor spumaretroviral. Tais vetores têm sido amplamente utilizados em tratamentos de terapia gênica e outras aplicações de entrega de genes.

[0064] O vetor viral da presente invenção pode ser um vetor retroviral, como um vetor gama-retroviral. O vetor viral pode ser baseado no vírus da imunodeficiência humana.

[0065] O vetor viral da presente invenção pode ser um vetor lentiviral. O vetor pode ser baseado em um lentivírus não primata, como o vírus da anemia infecciosa dos equídeos (EIAV).

COMPONENTES MARCADORES E MARCADORES HETERODIMÉRICOS

[0066] Cada vetor do kit da presente invenção compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um componente marcador. O primeiro vetor compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um primeiro componente marcador e o segundo vetor compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um segundo componente marcador.

[0067] O componente marcador pode ser instável e incapaz de ser expresso na superfície celular pela célula hospedeira transduzida sem associação com um segundo componente marcador recíproco expresso a partir de um vetor separado. O componente marcador recíproco também pode ser instável sem associação.

[0068] Após associação, o primeiro componente marcador e o segundo componente marcador (recíproco ao primeiro marcador) formam um complexo heteromultimérico estável que é expresso na superfície celular da célula hospedeira.

[0069] Abaixo estão exemplos de primeiro e segundo componentes marcadores que se associam para formar um marcador heterodimérico estável e detectável capaz de expressão da superfície celular. Na ausência de associação, o primeiro e o segundo componentes marcadores são instáveis e não são expressos na superfície da célula. CD79a / CD79b

[0070] CD79 (agrupamento de diferenciação 79) é uma proteína que forma um complexo com um receptor de células B e gera um sinal após o reconhecimento de um antígeno.

[0071] CD79 é composto por duas cadeias distintas chamadas CD79a e CD79b (anteriormente conhecidas como ig- alfa e Ig-beta); estes formam um heterodímero na superfície de uma ligação dissulfeto b estabilizada de células B. CD79a (UniProt: P11912) e CD79b (UniProt: P40259) são ambos membros da superfamília da imunoglobulina.

[0072] Ambas as cadeias CD79 contêm um motivo de ativação baseado em tirosina imunoreceptora (! TAM) em suas caudas intracelulares que elas usam para propagar um sinal em uma célula B, de maneira semelhante à transdução de sinal gerada por CD3 observada durante a ativação do receptor de célula T em células T .

[0073] Um componente marcador pode compreender o ectodomínio de CD79a ou CD79b. As sequências de aminoácidos para esses domínios são apresentadas na Figura 5. Um kit de vetores pode compreender um vetor que codifica um componente marcador que compreende o ectodomínio de CD79a e outro vetor que codifica um componente marcador que compreende o ectodomínio de CD79b. Um ou outro marcador pode estar ligado à membrana, por exemplo, tendo uma sequência transmembranar.

[0074] Um arranjo de marcador heterodimérico é mostrado na Figura 1, em que o primeiro componente marcador compreende um ectodomínio CD79a e o segundo componente marcador compreende um ectodomínio CD79b fundido a um domínio transmembranar.

[0075] Após a transdução celular bem-sucedida com ambos os vetores, o componente marcador de ectodomínio CD79a e o componente marcador de ectodomínio CD79b (compreendendo um domínio transmembranar CD19) são expressos e associados, formando um marcador heterodimérico estável que é expresso na superfície da célula.

[0076] Se o componente marcador CD79a ou o componente marcador CD79b forem expressos isoladamente na célula, eles são instáveis e não expressos na superfície celular. CH1 do domínio constante kappa IgG1 / IgG1

[0077] Os anticorpos IgG são proteínas de múltiplos domínios com interações complexas entre domínios. As cadeias pesadas de IgG humana associam-se a cadeias leves para formar anticorpos maduros capazes de se ligar ao antígeno. As cadeias leves podem ser do isotipo Kappa ou gama.

[0078] A associação de domínios constantes pesados e leves forma um heterodímero estável. Um componente marcador pode compreender uma região constante da cadeia pesada ou da cadeia leve. As sequências de aminoácidos para uma região constante da cadeia Kappa e uma região CH1 de lgG1 são apresentadas na Figura 4, mas são conhecidas muitas outras sequências adequadas de outros anticorpos.

[0079] Um kit de vetores pode compreender um vetor que codifica um componente marcador que compreende uma região constante da cadeia pesada e outro vetor que codifica um componente marcador que compreende uma região constante da cadeia leve. Um ou outro marcador pode estar ligado à membrana, por exemplo, tendo uma sequência transmembranar.

[0080] Um arranjo de marcador heterodimérico é mostrado na Figura 2, em que o primeiro componente marcador compreende um domínio constante Kappa e o segundo componente marcador compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio CH1 de lgG1 fundido a um domínio transmembranar.

[0081] Após a transdução celular bem-sucedida com ambos os vetores, o componente marcador de domínio constante Kappa e o componente marcador CH1 (compreendendo um domínio transmembranar CD19) são expressos e associados, formando um marcador heterodimérico estável que é expresso na superfície da célula.

[0082] Se o componente marcador de domínio constante Kappa ou o componente marcador CH1 forem expressos isoladamente na célula, eles são instáveis e não expressos na superfície celular.

[0083] A Tabela 1 fornece uma lista não limitativa de primeiro e segundo componentes de marcadores, incluindo pares de marcadores adicionais não descritos acima. O primeiro e o segundo pares de componentes marcadores abaixo podem associar-se espontaneamente para formar um marcador hetero-dimérico da presente invenção: Tabela 1 Primeiro componente marcador Segundo componente marcador CD79a (UniProt: P11912) CD79b (UniProt: P40259) Domínio constante Kappa CH1 de IgG1 TRDC (UniProt: B7Z8K6) TRGC (UniProt: P03986 ou P03986)

CD1A (UniProt: P06126) Beta-2-microglobulina (UniProt: P61760)

TRBC TRAC MARCADORES HETEROTRIMÉRICOS

[0084] O kit de vetores pode compreender um primeiro, segundo e terceiro vetor que codificam primeiro, segundo e terceiro componentes marcadores, respectivamente.

[0085] Um dos componentes marcadores pode ser ligado à membrana, por exemplo, tendo um domínio transmembranar.

[0086] Um arranjo de marcador hetero-trimérico é mostrado na Figura 3. Nesse arranjo, o primeiro componente de marcador compreende um domínio constante Kappa, o segundo componente de marcador compreende um ectodomínio CD79b com um domínio transmembranar CD19 e o terceiro componente de marcador compreende um ectodomínio CD79a fundido para um domínio CH1 do domínio lgG1.

[0087] O marcador de domínio constante Kappa no primeiro componente do marcador se associa ao domínio CH1 de lgG1 no terceiro componente do marcador. O ectodomain CD79a do terceiro componente marcador associa-se ao ectodomain CD79b no segundo componente marcador. Quando todos os três componentes marcadores são expressos numa célula, forma-se um complexo heterotrimérico estável que é detectável na superfície da célula com um agente que reconhece o domínio constante Kappa. Quando apenas um ou dois dos componentes marcadores são expressos na célula, nenhum complexo é formado na superfície da célula que é detectável com um agente que recignifica o domínio constante kapa.

[0088] O marcador heterotrimérico pode ser formado a partir de quaisquer dois pares de marcadores associados espontaneamente, como os marcadores descritos na Tabela 1. A formação do marcador hetero-trimérico não se limita aos pares descritos acima, e outros marcadores associados espontaneamente são previstos.

[0089] Este arranjo permite efetivamente a detecção de três componentes do marcador em três vetores separados em virtude da detecção de um único marcador hetero-trimérico.

[0090] Arranjos semelhantes são possíveis para marcadores hetero-multiméricos com mais de três componentes marcadores. Por exemplo, o marcador hereromultimérico pode compreender 4, 5 ou mais componentes do marcador. O marcador heteromultimérico pode ser detectável por um agente que reconhece um componente marcador que apenas faz parte do marcador heteromultimérico quando todos os componentes marcadores são expressos na célula. MARCADORES LIGADOS À MEMBRANA E SOLÚVEIS, SECRETADOS

[0091] Um componente marcador pode ser solúvel quando expresso sozinho, no sentido de que é capaz de se difundir livremente no citosol da célula.

[0092] Um componente marcador pode ser secretado, no sentido de que quando é expresso por uma célula na ausência de outros componentes marcadores, é secretado pela célula.

[0093] Um componente marcador pode estar ligado à membrana, no sentido em que está efetivamente ancorado a uma membrana.

[0094] Um marcador ligado à membrana pode, por exemplo, compreender um domínio transmembranar, uma sequência de transferência de parada, uma âncora GPI ou um local de miristoilação / prenilação / palmitoilação.

[0095] Um domínio transmembranar pode ser derivado de uma proteína no componente marcador (por exemplo, o domínio transmembranar de CD79a ou CD79b), ou uma sequência que codifica um domínio transmembranar pode ser manipulada no vetor que codifica o componente marcador.

MARCADOR HETEROMULTIMÉRICO DETECTÁVEL

[0096] Num primeiro aspecto, a presente invenção fornece um kit de vetores, cada um codificando um componente marcador. Quando uma célula é transduzida com todos os vetores do kit, os componentes marcadores expressos se associam para formar um marcador heteromultimérico detectável.

[0097] Num segundo aspecto, a presente invenção fornece um marcador heteromultimérico detectável para uso na detecção de uma população de células transduzidas, em que o marcador heteromultimérico compreende pelo menos dois componentes de marcador que se associam.

[0098] O marcador heteromultimérico compreende pelo menos dois componentes de marcador, mas pode compreender três, quatro ou mais componentes de marcador, que se associam para formar um marcador heteromultimérico detectável, estável. Um ou mais dos componentes marcadores que formam o marcador heteromultimérico podem ser instáveis quando não associados. Por exemplo, um componente marcador compreendendo o ectodomínio de CD79a e um componente marcador compreendendo o ectodomínio de CD79b pode ser instável quando os domínios CD79a e CD79b não estão associados juntos.

[0099] O termo associado ou associação ou associar é sinônimo de dimerizar, dimerização ou dimerizado e / ou ligação, ligado ou ligar. A associação pode formar ligações covalentes, como ligações dissulfureto, entre um marcador e o outro marcador.

[00100] O marcador heteromultimérico pode compreender vários componentes do marcador, os quais, a menos que estejam associados a todos os outros componentes marcadores restantes do marcador hetero-multimérico, são incapazes de expressão da superfície celular.

[00101] Alternativamente, um ou alguns dos componentes marcadores codificados pelo kit podem ser capazes de expressão da superfície celular isoladamente, enquanto um componente marcador é expresso apenas na superfície celular quando associado ao (s) outro (s) marcador (s). Nesse caso, o uso de um agente que reconheça especificamente esse último componente marcador indica que a célula foi transduzida com todos os vetores do kit.

[00102] O marcador heteromultimérico detectável é detectável pelo uso de um agente específico para qualquer um dos componentes do marcador. O agente é específico para um componente marcador que é expresso apenas na superfície celular quando co-expresso com o (s) outro (s) componente (s) marcador (s) do kit, ou seja, é expresso apenas na superfície celular como parte do complexo hetermultimérico.

AGENTE

[00103] O marcador heteromultimérico da presente invenção é detectável usando um agente, tal como um agente de detecção ou seleção de células. Para os fins da presente invenção, o termo "reagente de classificação celular" inclui agentes capazes de identificar células que expressam o marcador heteromultimérico: não está limitado a agentes capazes de identificar e classificar células que expressam o marcador heteromultimérico.

[00104] O agente pode, por exemplo, derivar de um ligante, molécula pequena ou anticorpo.

[00105] O agente pode se ligar especificamente a qualquer um dos componentes marcadores do marcador heteromultimérico.

[00106] O agente pode se ligar a um componente marcador solúvel ou segregado. O agente pode se ligar a um componente marcador transmembranar se depender da presença de um ou outro componente marcador para expressão estável da superfície celular.

[00107] O agente pode se ligar especificamente ao ectodomínio CD79a (veja o arranjo ilustrado na Figura 1).

[00108] O agente pode se ligar especificamente ao domínio Kappa Constant (consulte os arranjos ilustrados nas Figuras 2 e 3).

[00109] Um exemplo de um agente de molécula pequena para a detecção de um marcador heterodimérico da invenção é a estreptavidina. Nesse caso, o componente marcador a ser detectado pode ser manipulado para incluir um peptídeo StrepTag. O StrepTag é um peptídeo sintético que consiste em oito aminoácidos (YSHPQFEK - SEQ ID Nº 1) que podem ser conectados ao componente marcador a ser detectado. Esta sequência peptídica exibe afinidade intrínseca à estreptavidina.

[00110] A detecção do peptídeo StepTag pode envolver o sistema Strep-tag®, que permite a detecção por cromatografia de afinidade.

[00111] Outros exemplos de agentes para detectar um marcador heteromultimérico incluem:

1. Proteína A que detecta CH2-CH2 no marcador detectável;

2. Glutationa que detecta uma Glutationa S- transferase (GST) no marcador detectável; ou

3. NTA de níquel, que detecta uma etiqueta His no marcador detectável.

CLASSIFICAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE CÉLULAS DA POPULAÇÃO TRANSDUZIDA

[00112] O agente pode ser usado para selecionar ou classificar a população de células transduzidas. Isso pode ser usado no contexto de purificação das células transduzidas antes da administração a um indivíduo, por exemplo, para tratamento de uma condição ou doença.

[00113] Nanoparticias magnéticas conjugadas a um agente, seja um anticorpo, ligante ou molécula pequena, como descrito acima, fazem com que as células que expressam o marcador ao qual o agente se liga, se liguem ao forte campo magnético. Nesta etapa, as células ligadas às nanopartículas permanecem na coluna, enquanto as outras células (que não expressam o marcador) fluem. Dessa forma, as células podem ser separadas positiva ou negativamente em relação ao marcador específico

[00114] Alternativamente, o agente marcado com fluorescência no marcador de interesse pode servir para a separação de células em relação às células que expressam o marcador hetero-temporizador.

DOMÍNIO TRANSMEMBRANAR

[00115] O domínio transmembranar é o domínio de um polipeptídeo que atravessa a membrana. O componente marcador da invenção pode compreender um domínio transmembranar, de modo que o marcador heteromultimérico esteja ligado à membrana.

[00116] Um domínio transmembranar pode ser qualquer estrutura proteica, que é termodinamicamente estável em uma membrana. Esta é tipicamente uma hélice alfa que compreende vários resíduos hidrofóbicos. O domínio transmembranar de qualquer proteína transmembranar pode ser usado para fornecer a porção transmembranar da invenção. A presença e extensão de um domínio transmembranar de uma proteína podem ser determinadas pelos especialistas na técnica usando o algoritmo TMHMM (http://www.cbs. Dtu.dk/services/TMHMM-

2.0/). Domínios de TM projetados artificialmente também podem ser usados.

[00117] O domínio transmembranar pode, por exemplo, ser derivado de CD19 ou CD28.

SEQUÊNCIA DE SINAIS

[00118] Os marcadores codificados pela sequência de ácido nucleico da invenção podem compreender uma sequência de sinal de modo que, quando o marcador é associado e expresso dentro de uma célula, a proteína nascente é direcionada para o retículo endoplasmático (ER).

[00119] O termo "sequência de sinal" é sinônimo de

"peptídeo sinal".

[00120] Uma sequência de sinal é um peptídeo curto, geralmente de 5 a 30 aminoácidos, presente no terminal N da maioria das proteínas recém-sintetizadas que são destinadas à via secretora. Essas proteínas incluem aquelas que residem dentro de certas organelas (por exemplo, retículo endoplasmático, golgi ou endossomas), são secretadas pela célula e proteínas transmembranares.

[00121] A sequência de sinal geralmente contém uma sequência central que é um longo trecho de aminoácidos hidrofóbicos que tem uma tendência a formar uma única hélice alfa. A sequência de sinal pode começar com um pequeno trecho de aminoácidos com carga positiva, o que ajuda a impor a topologia adequada do polipeptídeo durante a translocação. No final da sequência de sinal, há tipicamente um trecho de aminoácidos que é reconhecido e clivado pela peptidase de sinal. A peptidase de sinal pode clivar durante ou após a conclusão da translocação para gerar uma sequência de sinal livre e uma proteína madura. As sequências de sinais livres são então digeridas por proteases específicas.

[00122] A sequência de sinal é comumente posicionada no terminal amino da molécula, embora alguns peptídeos de sinal do terminal carboxi sejam conhecidos.

[00123] As sequências de sinais têm uma estrutura tripartida, consistindo de uma região central hidrofóbica (região h) flanqueada por uma região n e c. Este último contém o local de clivagem de consenso da peptidase sinal (SPase). Normalmente, as sequências de sinal são clivadas co-translacionalmente, as sequências de sinal clivadas resultantes são denominadas peptídeos de sinal.

[00124] No peptídeo sinal da região V-11 da cadeia kapa Ig de murino, que possui a sequência: METDTLILWVLLLLVPGSTG: a região n possui a sequência METD; a região h (mostrada em negrito) tem a sequência TLILWVLLLV; e a região c tem a sequência PGSTG.

SEQUÊNCIA DE SINAL MUTADA

[00125] Uma sequência de sinal mutada pode diferir em sua região h da sequência de sinal do tipo selvagem. Um polipeptídeo (que tem maior expressão relativa) tem um número maior de aminoácidos hidrofóbicos na região h que o outro polipeptídeo (que tem menor expressão relativa). O peptídeo sinal do polipeptídeo com menor expressão relativa pode compreender uma ou mais mutações de aminoácidos, como substituições ou deleções, de aminoácidos hidrofóbicos na região h do que o peptídeo sinal do polipeptídeo com menor expressão relativa.

[00126] O primeiro peptídeo sinal e o segundo peptídeo sinal podem ter substancialmente as mesmas regiões n e c, mas diferem na região h, como explicado acima. "Substancialmente o mesmo" indica que as regiões n e c podem ser idênticas entre o primeiro e o segundo peptídeo sinal ou podem diferir em um, dois ou três aminoácidos na cadeia n ou c, sem afetar a função do peptídeo sinal.

[00127] Os aminoácidos hidrofóbicos no núcleo podem, por exemplo, ser: Alanina (A); Valina (V); Isoleucina (I); Leucina (L); Metionina (M); Fenilalanina (P); Tirosina (Y); ou triptofano (W).

[00128] Os ácidos hidrofóbicos mutados para alterar a eficiência do peptídeo sinal podem ser os da lista acima, em particular: Valina (V); Isoleucina (I); Leucina (L); e triptofano (W).

[00129] Dos resíduos na região h, um peptídeo sinal (por exemplo, o peptídeo sinal alterado) pode compreender pelo menos 10%, 20%, 30%, 40% ou 50% menos aminoácidos hidrofóbicos do que o outro peptídeo sinal (por exemplo, o peptídeo sinal inalterado).

[00130] Onde a região h compreende 5-15 aminoácidos, um peptídeo sinal pode compreender 1, 2, 3, 4 ou 5 mais aminoácidos hidrofóbicos do que o outro peptídeo sinal.

[00131] O peptídeo sinal alterado pode compreender 1, 2, 3, 4 ou 5 deleções de aminoácidos ou substituições de aminoácidos hidrofóbicos. Os aminoácidos hidrofóbicos podem ser substituídos por aminoácidos não hidrofóbicos, como aminoácidos hidrofílicos ou neutros.

[00132] Exemplos de sequências de sinal mutadas adequadas para um componente marcador com base no peptídeo sinal da região V-lll da cadeia Ig kappa murina estão listados na Figura 8.

[00133] As seqüências de sinais podem ser detectadas ou previstas usando técnicas de software (veja, por exemplo, http://www.predisi.de/).

[00134] Um número muito grande de seqüências de sinais é conhecido e está disponível em bancos de dados. Por exemplo, http://www.signalpeptide.d - lista 2109 de peptídeos de sinal de mamíferos confirmados em seu banco de dados.

NÍVEL DE EXPRESSÃO DE UM PRIMEIRO MARCADOR E NÍVEL DE EXPRESSÃO DE UM SEGUNDO MARCADOR

[00135] O nível de expressão de um componente marcador pode ser diferente do nível de expressão de outro componente marcador. Isso pode ser conseguido usando um ou mais sinal (s) de retenção intracelular, como descrito no documento WO2016/174408, ou usando peptídeos de sinal alternativos, como descrito aqui e no documento WO2016/174409.

[00136] Quando o kit de vetores codifica um ou mais componentes marcadores que são / são solúveis ou segregados e um componente marcador que é ligado à membrana, a expressão relativa pode ser adaptada de modo que o componente marcador ligado à membrana seja expresso em uma nível superior aos componentes marcadores solúveis / segregados.

[00137] Diferentes peptídeos de sinal fornecem um método para controlar o nível de expressão de um polipeptídeo de interesse no primeiro vetor em comparação com outro polipeptídeo de interesse em um segundo vetor, onde se deseja que os polipeptídeos de interesse sejam expressos em uma célula em diferentes níveis. Pode ser vantajoso selecionar uma população celular transduzida que tenha uma expressão mais alta de uma sequência polipeptídica de interesse que outra.

[00138] Um exemplo de onde a expressão diferencial de dois polipeptídeos expressos em uma célula é útil é quando um polipeptídeo de interesse é um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou receptor de célula T manipulado (TCR) e outro polipeptídeo de interesse é um gene suicida. Os genes suicidas atuam como um "desligado", fornecendo um mecanismo para matar as células que expressam CAR ou TCR, por exemplo, diante da toxicidade. Um gene suicida pode ser mais eficaz na morte da célula em que é expresso se estiver presente na célula transduzida em um nível mais alto que o CAR ou TCR.

[00139] Ao alterar o nível de expressão dos componentes do fabricante que são expressos na mesma construção que os polipeptídeos de interesse, é possível distorcer a identificação ou classificação de células para células transduzidas que expressam um nível mais alto de um componente marcador que é indicativo da expressão de um nível mais alto do PI, expresso a partir da mesma construção. POLIPEPTÍDEOS DE INTERESSE (POI)

[00140] POI da presente invenção pode ser qualquer polipeptídeo que se deseja expressar na população de células transduzidas. O POI pode, por exemplo, ser um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um receptor de células T manipulado (TCR). O POI pode ser um polipeptídeo que codifica um gene suicida.

CÉLULA

[00141] É fornecida uma célula que transduziu ou transfectou com um kit de vetores da presente invenção.

[00142] A célula pode ser uma célula imune citolítica, como uma célula T ou uma célula NK.

[00143] As células T ou linfócitos T são um tipo de linfócito que desempenha um papel central na imunidade mediada por células. Eles podem ser diferenciados de outros linfócitos, como células B e células assassinas naturais (células NK), pela presença de um receptor de células T (TCR) na superfície celular. Existem vários tipos de células T,

como resumido abaixo.

[00144] As células auxiliares T auxiliares (células TH) auxiliam outros glóbulos brancos nos processos imunológicos, incluindo a maturação das células B em células plasmáticas e células B de memória e a ativação de células T citotóxicas e macrófagos. As células TH expressam CD4 em sua superfície. As células TH tornam-se ativadas quando são apresentadas com antígenos peptídicos pelas moléculas do MHC classe II na superfície das células apresentadoras de antígenos (APCs). Essas células podem se diferenciar em um dos vários subtipos, incluindo TH1, TH2, TH3, TH17, Th9 ou TFH, que secretam diferentes citocinas para facilitar diferentes tipos de respostas imunes.

[00145] As células T citolíticas (células TC ou CTLs) destroem células infectadas por vírus e células tumorais e também estão implicadas na rejeição de transplantes. Os CTLs expressam o CD8 em sua superfície. Essas células reconhecem seus alvos ligando-se ao antígeno associado ao MHC classe I, presente na superfície de todas as células nucleadas. Através da IL-10, adenosina e outras moléculas secretadas pelas células T reguladoras, as células CD8 + podem ser inativadas para um estado anérgico, o que evita doenças autoimunes, como a encefalomielite autoimune experimental.

[00146] As células T da memória são um subconjunto de células T específicas do antígeno que persistem a longo prazo após a resolução de uma infecção. Eles rapidamente se expandem para um grande número de células T efetoras após a exposição ao antígeno cognato, fornecendo, assim, ao sistema imunológico "memória" contra infecções passadas. As células

T de memória compreendem três subtipos: células T de memória central (células TCM) e dois tipos de células T de memória efetora (células TEM e células TEMRA). As células de memória podem ser CD4 + ou CD8 +. As células T de memória expressam tipicamente a proteína da superfície celular CD45RO.

[00147] As células T reguladoras (células Treg), anteriormente conhecidas como células T supressoras, são cruciais para a manutenção da tolerância imunológica. Seu principal papel é desligar a imunidade mediada por células T no final de uma reação imune e suprimir células T auto- reativas que escaparam do processo de seleção negativa no timo.

[00148] Duas classes principais de células Treg CD4 + foram descritas - células Treg de ocorrência natural e células Treg adaptativas.

[00149] As células Treg de ocorrência natural (também conhecidas como células Treg CD4 + CD25 + FoxP3 +) surgem no timo e têm sido associadas a interações entre células T em desenvolvimento com células dendríticas mielóides (CD1 1c +) e plasmocitoides (CD123 +) ativadas com TSLP . As células Treg de ocorrência natural podem ser diferenciadas de outras células T pela presença de uma molécula intracelular chamada FoxP3. Mutações no gene FOXP3 podem impedir o desenvolvimento regulador de células T, causando a doença autoimune fatal IPEX.

[00150] As células Treg adaptativas (também conhecidas como células Tr1 ou Th3) podem se originar durante uma resposta imune normal.

[00151] A célula pode ser uma célula Natural Killer

(ou célula NK). As células NK fazem parte do sistema imunológico inato. As células NK fornecem respostas rápidas a sinais inatos de células infectadas por vírus de maneira independente do MHC

[00152] As células NK (pertencentes ao grupo de células linfóides inatas) são definidas como linfócitos granulares grandes (LGL) e constituem o terceiro tipo de células diferenciadas do progenitor linfóide comum que gera linfócitos B e T. Sabe-se que as células NK se diferenciam e amadurecem na medula óssea, linfonodo, baço, amígdalas e timo, onde entram então na circulação.

[00153] As células da invenção podem ser qualquer um dos tipos de células mencionados acima.

[00154] As células transduzidas podem ser criadas ex vivo a partir do sangue periférico do próprio paciente (1ª parte) ou no cenário de um transplante de células-tronco hematopoiéticas do sangue periférico do doador (2ª parte) ou sangue periférico de um doador não conectado (3ª parte) )

[00155] Alternativamente, as células podem ser derivadas da diferenciação ex vivo de células progenitoras induzíveis ou células progenitoras embrionárias para, por exemplo, células T ou NK. Alternativamente, pode ser utilizada uma linha de células T imortalizada que retém sua função lítica e poderia atuar como terapêutica.

[00156] Em todas essas modalidades, as células que expressam marcador e POI são geradas através da introdução de DNA ou RNA que codifica para o marcador e POI por um dos muitos meios, incluindo transdução com um vetor viral, transfecção com DNA ou RNA.

[00157] A célula da invenção pode ser uma célula ex vivo de um sujeito. A célula pode ser de uma amostra de células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Tais células podem ser ativadas e / ou expandidas antes de serem transduzidas com ácido nucleico que codifica as moléculas que fornecem o kit de vetores de acordo com o primeiro aspecto da invenção, por exemplo, por tratamento com um anticorpo monoclonal anti-CD3.

[00158] A célula da invenção pode ser feita por: (i) isolamento de uma amostra contendo células de um sujeito ou de outras fontes listadas acima; e (ii) transdução ou transfecção da célula com um kit de vetores de acordo com o primeiro aspecto da invenção.

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

[00159] A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica contendo uma pluralidade de células de acordo com a invenção.

[00160] A composição farmacêutica pode adicionalmente compreender um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode opcionalmente compreender um ou mais polipeptídeos e / ou compostos farmaceuticamente ativos. Uma tal formulação pode, por exemplo, estar numa forma adequada para infusão intravenosa.

MÉTODO DE TRATAMENTO

[00161] A presente invenção fornece um método para tratar e / ou prevenir uma doença que compreende a etapa de administração das células da presente invenção (por exemplo, em uma composição farmacêutica como descrita acima) a um sujeito.

[00162] Um método para o tratamento de uma doença refere-se ao uso terapêutico das células da presente invenção. Aqui as células podem ser administradas a um sujeito com uma doença ou condição existente, a fim de diminuir, reduzir ou melhorar pelo menos um sintoma associado à doença e / ou desacelerar, reduzir ou bloquear a progressão da doença.

[00163] O método para prevenir uma doença refere-se ao uso profilático das células da presente invenção. Aqui, essas células podem ser administradas a um indivíduo que ainda não contraiu a doença e / ou que não está apresentando nenhum sintoma da doença para prevenir ou prejudicar a causa da doença ou reduzir ou impedir o desenvolvimento de pelo menos um sintoma associado a a doença. O sujeito pode ter uma predisposição para, ou se pensa estar em risco de desenvolver a doença.

[00164] O método pode envolver as etapas de: I. isolamento de uma amostra contendo células de um indivíduo II. transdução ou transfecção da amostra contendo células com um kit de vetores da presente invenção, III. detectar a expressão do marcador heteromultimérico usando um agente, identificando assim uma população de células transduzidas a partir da amostra, IV. selecionar ou classificar a população de células de (III) para alcançar uma subpopulação purificada e V. administrar a subpopulação de (IV) que expressa o marcador heteromultimérico ao sujeito.

[00165] A presente invenção fornece uma composição celular para uso no tratamento e / ou prevenção de uma doença.

[00166] A invenção também se refere ao uso de uma composição farmacêutica compreendendo uma população de células transduzidas como descrito acima na fabricação de um medicamento para o tratamento e / ou prevenção de uma doença.

[00167] A doença a ser tratada e / ou prevenida pelos métodos da presente invenção pode ser uma doença cancerígena, como leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfoblástica crônica (LLC), câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de cólon, câncer endometrial, câncer de rim (célula renal), leucemia, câncer de pulmão, melanoma, linfoma não-Hodgkin, câncer de pâncreas, câncer de próstata e câncer de tireóide.

[00168] As células da presente invenção podem ser capazes de matar células alvo, tais como células cancerígenas. A célula alvo pode ser caracterizada pela presença de um ligante segregado por um tumor ou ligando quimiocina na vizinhança da célula alvo. A célula alvo pode ser caracterizada pela presença de um ligante solúvel em conjunto com a expressão de um antígeno associado ao tumor (TAA) na superfície da célula alvo.

[00169] As células e composições farmacêuticas da presente invenção podem ser utilizadas no tratamento e / ou prevenção das doenças descritas acima.

[00170] As células e composições farmacêuticas da presente invenção podem ser utilizadas em qualquer um dos métodos descritos acima.

[00171] A invenção será agora descrita adicionalmente por meio de Exemplos, que devem servir para auxiliar um versado na técnica na realização da invenção e não se destinam de forma alguma a limitar o escopo da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1: Expressão superficial de um marcador heterodimérico em células T duplas transduzidas

[00172] Um primeiro vetor que codifica um componente marcador de domínio constante Kappa, um local de clivagem de peptídeo 2A e uma proteína fluorescente verde aprimorada (Kappa-2A-eGFP) é misturada na proporção de 1:1 com um segundo vetor codificando um componente marcador que é uma fusão de um domínio CH1 de lgG1 com um domínio transmembranar CD19 ;, um local de clivagem de peptídeo 2A e um gene mTagBFP2 (CH1 CD19TM-2A-mTagBFP2) e usado para transduzir células T. As células T transduzidas resultantes são uma mistura de células transduzidas apenas com o primeiro vetor (positivo para eGFP) ou o segundo vetor (positivo para mTagBFP2) ou transduzido duplo com ambos os vetores (positivo para eGFP e mTagBFP2).

[00173] A mistura de células é corada com um anticorpo anti-Kappa conjugado com APC para mostrar que a expressão superficial do marcador heterodimérico está presente apenas em células T duplas transduzidas (por exemplo, células que são duplamente positivas para eGFP e mTagBFP2). O marcador heterodimérico estável resultante é como representado na Figura 2.

[00174] As células duplas transduzidas são purificadas usando esferas magnéticas anti-Kappa e a pureza é analisada observando a porcentagem de células duplamente positivas para eGFP e mTagBFP2 por citometria de fluxo (análise FACs).

[00175] Como controle negativo, as células T são transduzidas com apenas um vetor (o primeiro ou o segundo vetor) e coradas com um anticorpo anti-Kappa conjugado à APC. Nenhuma das células T é capaz de expressar o marcador Kappa instável porque o marcador do vetor único é incapaz de se associar e estabilizar. Na experiência de controle, o anticorpo anti-Kappa conjugado à APC é incapaz de se ligar a qualquer uma das células, uma vez que elas não são capazes de expressar um marcador. Exemplo 2: Expressão superficial de um marcador heterotrimérico em células T triplas transduzidas

[00176] Um primeiro vetor, segundo e terceiro vetor são misturados na proporção de 1:1:1 e usados para transduzir células T. O primeiro vetor codifica um componente marcador que é uma fusão de um domínio constante Kappa e um domínio CH1 de lgG1, um local de clivagem 2A e eGFP (Kappa-2A-eGFP). O segundo vetor codifica um componente marcador que é uma fusão do domínio CHI de lgG1 com um domínio transmembranar CD19, um local de clivagem 2A e um gene mTagBFP2 (CD79b- CD19TM-2A-mTagBFP2). O terceiro vetor codifica um componente marcador que é um domínio constante Kappa, um local de clivagem de peptídeo 2A e mKate2 (CH1-CD79a-2A-mKate2).

[00177] As células T transduzidas resultantes são uma mistura de células transduzidas apenas com o primeiro vetor (positivo para eGFP), segundo vetor (positivo para mTagBFP2), terceiro vetor sozinho (mKate2) ou dois dos três vetores disponíveis (por exemplo, positivo para eGFP e mTagBFP2; ou mKate2 e mTagBFP2).

[00178] A mistura de células T é corada com um anticorpo anti-Kappa conjugado com APC para mostrar que a expressão superficial do marcador heterotrimérico está presente apenas em células T triplas transduzidas (por exemplo, células que são triplamente positivas para eGFP, mTagBFP2 e mKate2) . O marcador heterotrimérico estável resultante é o marcador representado na Figura 3.

[00179] Essa população de células transduzidas triplas é então purificada para formar uma subpopulação de células, usando esferas magnéticas anti-Kappa e a pureza é analisada observando a porcentagem de células triplamente positivas para eGFP, mTagBFP2 e mKate2 por citometria de fluxo (análise FACS).

[00180] Como controle negativo, as células T são transduzidas com um ou dois dos vetores acima. Isso pode ser, mas não está limitado, ao primeiro ou segundo vetor ou ao primeiro e segundo vetores. A mistura de controle é corada com um anticorpo anti-Kappa conjugado com APC.

[00181] Em contraste com as células transduzidas triplas, nenhuma das células T é capaz de expressar o marcador Kappa instável porque os marcadores do (s) vetor (s) único (s) ou duplo (s) são incapazes de se associar totalmente e, portanto, incapazes de se estabilizar ou expressar na célula. No experimento de controle, o anticorpo anti-Kappa conjugado à APC é incapaz de se ligar a qualquer uma das células.

Exemplo 3: Seleção preferencial de células com um nível de expressão diferencial de uma sequência polipeptídica em relação a outra sequência polipeptídica.

[00182] Uma amostra de célula é transduzida com um kit com um primeiro vetor que codifica um componente marcador e um receptor de antígeno quimérico (Kappa-2A-CAR) e um segundo vetor que codifica um componente marcador e um gene suicida, RapCasp9 (CH 1CD19TM-2A-Rapcasp9). O gene suicida RapCasp9 é descrito em WO2016 / 151315. O segundo vetor inclui uma sequência de sinal mutado a montante da sequência do componente marcador, por exemplo, CH1CD19TM. A sequência de sinal mutada pode ser qualquer uma das sequências de sinal subótimas listadas na Figura 8. A sequência de sinal mutada diminui o nível de expressão do marcador CH1 CD19TM a jusante codificado no segundo vetor em comparação com o nível de expressão do marcador Kappa codificado pelo primeiro vetor na célula. Como a associação do primeiro e do segundo marcadores deve estar na proporção de 1: 1, a seleção é inclinada para células que expressam alto nível do gene suicida Rapcasp9, em comparação com o nível de expressão do CAR. Isso é útil porque genes suicidas como o RapCasp9 podem ser mais eficazes quando seu nível de expressão é mais alto na célula do que o nível de expressão do CAR. Exemplo 4: Expressão superficial do heterodímero e marcador de heterotrímero em células 293T e células T humanas primárias. Tabela 2 Cadeia Construção

Vetor 1 SFGmR.aCD19_HD37_LC-2A-RQR8 Vetor 2 SFGmR.eGFP-2A-aCD19_HD37_Fab_H-CD28TM-41BBz Vetor 3 SGF.V5-full_human_CD19ecto-9xHis.I.eBFP Controle SFGmR.aCD19_HD37_Fab_H-CD28TM-41BBz-2A-RQR8 Positivo

[00183] As células 293T foram transfectadas isoladamente com cada cadeia do marcador heterodímero (vetor 1 ou vetor 2) e transfectadas duas vezes com ambos (vetor 1 e vetor 2). Veja a tabela 2 para as construções vetoriais.

[00184] A transfecção transitória das células 293T foi realizada usando GeneJuice (Millipore), com um plasmídeo que codifica gag-pol (pEQ-Pam3-E36), um plasmídeo que codifica o envelope RD1 14 (RDF37) e o plasmídeo vetorial de transferência retroviral desejado. O sobrenadante viral foi coletado às 48 horas e 72 horas e as células 293T foram coradas para eficiência da transfecção. Quando as co- culturas foram montadas, as células 293T foram contadas 48 horas após a transfecção e plaqueadas na proporção de 1: 1 por mais 24 horas antes da coloração para o marcador heterodimérico.

[00185] A montagem bem-sucedida do marcador heterodímero em células duplamente transfectadas foi avaliada por citometria de fluxo por coloração com anticorpo anti-cadeia Kappa humano, anticorpo Fab anti-humano e usando CD19 solúvel, mostrado na Figura 9A, usando um protocolo padrão de coloração de superfície. 1x10 5 células foram coradas em placas de 96 poços de fundo redondo. Os anticorpos de superfície foram diluídos com tampão de coloração (1% de FBS em PBS) e adicionados às células a 10 µμΙ por amostra. Os seguintes anticorpos foram utilizados de acordo com o protocolo do fabricante: anti-CD34 APC ou PE (clone QBEndIO, sistemas de P&D), anti-Kappa APC (BD Biosciences), anti- humano Fab APC (Jackson ImmunoResearch), anti-His PE (Abeam).

[00186] Um plasmídeo que codifica para as duas cadeias do marcador heterodímero foi usado como controle positivo.

[00187] Da mesma forma, em experimentos primários de transdução de células T humanas (usando 4 amostras de doadores saudáveis), foi demonstrado que a expressão seletiva do marcador heterodímero ocorre apenas em células T transduzidas duplas com fundo mínimo detectado em células T transduzidas únicas. Veja a Figura 9B.

[00188] As células mononucleares do sangue periférico foram isoladas por centrifugação em gradiente Ficoll (GE Healthcare) e estimuladas com anticorpos anti-CD3 / 28 a 50 ng / mL. Adicionou-se suplementação à interleucina-2 (IL-2) (100 lU / mL) após estimulação durante a noite. No dia 3, as células T foram colhidas, plaqueadas em retronectina e sobrenadante retroviral e centrifugadas a 1000g por 40 minutos. A eficiência da transdução foi avaliada 5 dias depois, utilizando citometria de fluxo, como descrito acima.

[00189] A Figura 9C mostra células 293T transfectadas individualmente com cada cadeia de um marcador heterotrímero (vetor 1, vetor 2 e vetor 3), transfectadas duas vezes (vetor 1 e vetor 2) e transfectadas triplamente com todas as três cadeias do marcador heterotrímero (vetor 1 e vetor 2 e vetor

3), usando o método de transfecção descrito acima.

Foram utilizadas as construções do vetor 1, vetor 2 e vetor 3, como mostrado na tabela 2. A montagem bem sucedida do marcador heterotrímero foi avaliada por coloração de CD19 solúvel usando citometria de fluxo, como descrito acima.

Todas as publicações mencionadas na especificação acima são aqui incorporadas por referência.

Várias modificações e variações dos métodos e sistemas descritos da invenção serão evidentes para os especialistas na técnica, sem se afastar do escopo e espírito da invenção.

Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com modalidades preferenciais específicas, deve ser entendido que a invenção como reivindicada não deve ser indevidamente limitada a essas modalidades específicas.

De fato, várias modificações dos modos descritos para a realização da invenção, que são óbvias para os especialistas em biologia molecular ou campos relacionados, devem estar dentro do escopo das reivindicações a seguir.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Kit de vetores caracterizado pelo fato de que compreende: (i) um primeiro vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um primeiro componente marcador; e (ii) um segundo vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um segundo componente marcador, em que, quando uma célula é transduzida com o primeiro e o segundo vetores, o primeiro e o segundo componentes marcador são expressos pela célula e se associam formando um marcador hetero-multimérico que é reconhecido por um reagente de seleção de células ao passo que, quando uma célula é transduzida com o primeiro ou segundo vetor sozinho, a expressão do primeiro ou do segundo componente marcador sozinho não é reconhecida pelo reagente de seleção de células.

2. Kit, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro componente marcador é instável quando não está associado ao segundo componente marcador, e o reagente de seleção de células reconhece o primeiro componente marcador.

3. Kit, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que tanto o primeiro quanto o segundo componente marcador são instáveis quando não associados, e o reagente de seleção de células reconhece o primeiro ou o segundo componente marcador.

4. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o primeiro componente marcador é ligado à membrana, e o segundo componente marcador é segregado na ausência do primeiro componente marcador e o reagente de seleção de células reconhece o segundo componente marcador.

5. Kit de vetores, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos vetores compreende ainda uma sequência de ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico.

6. Marcador heteromultimérico de superfície celular para uso na detecção de uma população de células transduzidas, caracterizado pelo fato de que o marcador heteromultimérico compreende pelo menos dois componentes marcadores, o primeiro componente marcador codificado por uma sequência de ácido nucleico em um primeiro vetor e o segundo marcador componente codificado por uma sequência de ácido nucleico em um segundo vetor, em que o primeiro marcador e o segundo marcador componentes se associam.

7. Marcador hetero-multimérico, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o primeiro marcador e / ou ´segundo componente marcador são instáveis quando não associados.

8. Marcador hetero-multimérico, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o segundo componente marcador é secretado pela célula na ausência do primeiro componente do marcador.

9. Método para produzir uma célula transduzida, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de transdução ou transfecção de uma célula com um kit de vetores conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ex vivo.

10. Método para preparar uma composição de células transduzidas caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (i) transduzir ou transfectar uma amostra de células com um kit de vetores conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ex vivo; (ii) detectar a expressão do marcador hetero- multimérico usando um reagente de seleção de células; e (iii) selecionar ou classificar as células detectadas para preparar uma composição de células que expressam o marcador heteromultimérico.

11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade de células transduzidas obtidas por um método conforme definido pela reivindicação

10.

12. Uso de uma composição farmacêutica conforme definida pela reivindicação 11 caracterizada pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratamento de uma doença.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o tratamento compreende as seguintes etapas: (i) isolar uma amostra contendo células de um sujeito; (ii) transduzir ou transfectar a amostra contendo células com um kit de vetores conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 5; (iii) detectar a expressão do marcador hetero- multimérico usando um reagente de seleção de células, identificando, assim, uma população de células transduzidas

/ transfectadas da amostra, (iv) selecionar ou classificar a população de células de (iii) para atingir uma subpopulação purificada de células transduzidas / transfectadas, e (v) administrar a subpopulação de (iv) que expressa o marcador hetero-multimérico ao sujeito.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que a doença é câncer.

1 / 10

FIGURA 1

Ectodomínio CD79a Ectodomínio CD79b

Transmembrana

Transmembrana CD19 e endodomínio truncado

2 / 10

FIGURA 2

Domínio constante Kappa Domínio CH1 de IgG1

Transmembrana

Transmembrana CD19 e endodomínio truncado

3 / 10

FIGURA 3

Domínio constante Kappa

Transmembrana

Transmembrana CD19 e endodomínio truncado

4 / 10 FIGURA 4 Sequência de aminoácido codificada pelo vetor 1 eGFP:

MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTY

GVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKE

DGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNH YLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKRA (SEQ ID No. 2) 2A: EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID No. 3) Peptídeo sinal: MSGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID No. 4) Cadeia Kappa:

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECRA (SEQ ID No. 5) Sequência de aminoácido codificada pelo vetor 2 mTagBFP2:

MVSKGEELIKENMHMKLYMEGTVDNHHFKCTSEGEGKPYEGTQTMRIKVVEGGPLPFAFDILATSF

LYGSKTFINHTQGIPDFFKQSFPEGFTWERVTTYEDGGVLTATQDTSLQDGCLIYNVKIRGVNFTSN

GPVMQKKTLGWEAFTETLYPADGGLEGRNDMALKLVGGSHLIANAKTTYRSKKPAKNLKMPGVYY VDYRLERIKEANNETYVEQHEVAVARYCDLPSKLGHKLN (SEQ ID No. 6) 2A: EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID No. 3) Peptídeo sinal: METDTLILWVLLLLVPGSTG (SEQ ID No. 7) CH1:

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID No. 8) CD19TM: AVTLAYLIFCLCSLVGILHL (SEQ ID No. 9) dCD19: QRALVLRRKRKRMTDPTRR (SEQ ID No. 10)

5 / 10 FIGURA 5 Sequência de aminoácido codificada pelo vetor 1 eGFP:

MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTY

GVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKE

DGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNH YLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKRA (SEQ ID No. 2) 2A: EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID No. 3) Peptídeo sinal: METDTLILWVLLLLVPGSTG (SEQ ID No. 7) CH1:

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID No. 8) CD79a:

LWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNGTLIIQNV NKSHGGIYVCRVQEGNESYQQSCGTYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNR (SEQ ID No. 11) Sequência de aminoácido codificada pelo vetor 2 mTagBFP2:

MVSKGEELIKENMHMKLYMEGTVDNHHFKCTSEGEGKPYEGTQTMRIKVVEGGPLPFAFDILATSF

LYGSKTFINHTQGIPDFFKQSFPEGFTWERVTTYEDGGVLTATQDTSLQDGCLIYNVKIRGVNFTSN

GPVMQKKTLGWEAFTETLYPADGGLEGRNDMALKLVGGSHLIANAKTTYRSKKPAKNLKMPGVYY VDYRLERIKEANNETYVEQHEVAVARYCDLPSKLGHKLN (SEQ ID No. 6) 2A: EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID No. 3) Peptídeo sinal: METDTLILWVLLLLVPGSTG (SEQ ID No. 7) CD79b:

ARSEDRYRNPKGSACSRIWQSPRFIARKRGFTVKMHCYMNSASGNVSWLWKQEMDENPQQLKL

EKGRMEESQNESLATLTIQGIRFEDNGIYFCQQKCNNTSEVYQGCGTELRVMGFSTLAQLKQRNTL KD (SEQ ID No. 12) CD19TM: AVTLAYLIFCLCSLVGILHL (SEQ ID No. 9) dCD19: QRALVLRRKRKRMTDPTRR (SEQ ID No. 10) Sequência de aminoácido codificada pelo vetor 3 mKate2:

SELIKENMHMKLYMEGTVNNHHFKCTSEGEGKPYEGTQTMRIKAVEGGPLPFAFDILATSFMYGSK

TFINHTQGIPDFFKQSFPEGFTWERVTTYEDGGVLTATQDTSLQDGCLIYNVKIRGVNFPSNGPVM

QKKTLGWEASTETLYPADGGLEGRADMALKLVGGGHLICNLKTTYRSKKPAKNLKMPGVYYVDRR LERIKEADKETYVEQHEVAVARYCDLPSKLGHR (SEQ ID No. 13) 2A: EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID No. 3) Peptídeo sinal: MSGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID No. 4) Cadeia constante Kappa:

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECRA (SEQ ID No. 5)

6 / 10 FIGURA 6

A Marcador_α Marcador_β Vetor 1 Vetor 2 Vetor 1 sozinho Vetor 2 sozinho Vetor 1 e vetor 2

B

7 / 10 FIGURA 7

A Marcador_γ Marcador_β Marcador_α Vetor 1 Vetor 2 Vetor 3 Vetor 1 sozinho Vetor 2 sozinho Vetor 3 sozinho

B Vetor 1 e vetor 2 Vetor 2 e vetor 3 Vetor 1 e vetor 3 Vetor 1 e vetor 2 e vetor 3

8 / 10

FIGURA 8

WT: METDTLILWVLLLLVPGSTG (SEQ ID No. 7)

Mutação 1: METDTLILWVLLLVPGSTG (SEQ ID No. 14)

Mutação 2: METDTLILWVLLVPGSTG (SEQ ID No. 15)

Mutação 3: METDTLILWVLVPGSTG (SEQ ID No. 16)

Mutação 4: METDTLILWLVPGSTG (SEQ ID No. 17)

Mutação 5: METDTLILLVPGSTG (SEQ ID No. 18)

Mutação 6: METDTLILVPGSTG (SEQ ID No. 19)

Mutação 7: METDTLLVPGSTG (SEQ ID No. 20)

.

.. A.

B. Percentagem kappa + células transduzidas Percentagem kappa + células transduzidas P e r c e n t K a p p a + tr a n s d u c e d c e lls P e r c e n t K a p p a + tr a n s d u c e d c e lls 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0

N N

T T

V V e e Petição 870200159012, de 18/12/2020, pág. 16/17 c c to to r r 1 1

V V V V e e e e c c c c to to to to r r r r 1 2 1 2 + +

V V Heterodímero e e Heterodímero c T -c e lls H e te r o P c P to to o o s r s r ti 2 ti 2 v v e e 2 9 3 T H e t e r o d 293T im e r c c células o o n n d i m e rT tr tr o o l l Percentagem fab + células transduzidas Percentagem Fab + células transduzidas P e r c e n t F a b + tr a n s d u c e d c e lls P e r c e n t F a b + tr a n s d u c e d c e lls 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0

N N

T T

V V e e c c to to r r 1 1

V V V V e e e e c c c c to to to to 9 / 10 r r r r 1 2 1 2 + + FIGURA 9

V V Heterodímero Heterodímero e e T -c e lls H e te r o P c P c to to o o s r s r ti 2 ti 2 v v 293T e e 2 9 3 T H e te r o d im e r c c células o o n n d i m e rT tr tr o o l l Percentagem CD19 solúvel + células transduzidas Percentagem CD19 solúvel + células transduzidas P e r c e n t s o lu b le C D 1 9 + tr a n s d u c e d c e lls P e r c e n t s o lu b le C D 1 9 + tr a n s d u c e d c e lls 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0

N N

T T

V V e e c c to to r r 1 1

V V V V e e e e c c c c to to to to r r r r 1 2 1 2 + + Heterodímero

V V e e P c P c to to o o s r s r ti 2 ti 2 v v Heterodímero 293T e e 2 9 3 T H e te r o d im e r c c o o T -c e lls H e te r o d im e r n n células T tr tr o o l l

. C.

Petição 870200159012, de 18/12/2020, pág. 17/17 Percentagem CD19 solúvel + células transduzidas P e r c e n t s o lu b le C D 1 9 + tr a n s d u c e d c e lls 0 20 40 60 80 100

N

T

V e c to r 1

V e c to V r e V 2 c 10 / 10 e V to c e r to c 1 r to 1 r 2Heterotrímero + V + 3 e V c e to c 9 3 T H e t e r o293T r to FIGURA 9 (continuação) 2 r + 2 tr im e r

V e c to r 3