CN111278982A - 载体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了载体的试剂盒，其包含：(i)第一载体，其包含编码第一标志物组分的核酸序列；和(ii)第二载体，其包含编码第二标志物组分的核酸序列，其中，当用第一和第二载体两者转导细胞时，细胞表达第一和第二标志物组分并缔合形成由细胞分选试剂识别的异多聚体标志物，然而，当用单独的第一或第二载体转导细胞时，细胞分选试剂不识别单独的第一或第二标志物组分的表达。

Description

载体
本发明涉及载体的试剂盒。例如，用于转导细胞的逆转录病毒载体。
具体而言，本发明涉及一种试剂盒，其包括包含编码第一标志物组分的核酸的第一载体和包含编码第二标志物组分的核酸的第二载体。当用两种载体转导细胞时，两种标志物组分都在细胞中表达，并且它们缔合以形成可检测的异多聚体标志物。
本发明还涉及制造和检测用此类载体转导的细胞的方法，以及用于治疗/预防疾病的药物组合物和方法，所述方法包括施用此类细胞的组合物。
发明背景
数十年来，病毒载体已被用于转导T细胞以表达感兴趣的多肽。这些载体利用病毒中进化的专门分子机制以将其基因组有效地转移到它们感染的细胞内。但是，它们具有有限的转移能力，通常认为约为8至10千个碱基(kb)。该限制是由于包装效率与插入物大小成反比。
具有更高插入能力的基于T细胞的基因疗法的其他潜在的非病毒机制是已知的，但是这些通常因转导效率低和/或产生低T细胞数量的毒性作用而受到阻碍。
为了在保持高效率的同时将大的插入物大小转导至T细胞中，可以将病毒载体上编码的基因分成两个或更多个单独的载体。每个载体都用于制备病毒，然后将所有载体汇集以转导细胞。然而，该多重转导方法通常导致细胞被转导一些但不是所有所期望的载体。这导致包含不同载体整合体的非均匀细胞群体，其将不表达所有所期望的基因。
需要提供用大插入物大小转导和转染T细胞的改善的方法。
附图说明
图1–阐明异二聚体标志物的示意图。第一标志物组分是CD79a胞外域，并且第二标志物组分是CD79b胞外域与来自CD19的跨膜结构域和截短的胞内域之间的融合物。第一和第二标志物组分经由二硫键缔合。
图2–阐明另一种异二聚体标志物的示意图。第一标志物组分是Kappa恒定结构域，并且第二标志物组分是来自IgG1的CH1结构域与来自CD19的跨膜结构域和截短的胞内域之间的融合物。第一和第二标志物经由二硫键缔合。
图3–阐明异三聚体标志物的示意图。第一标志物组分是Kappa恒定结构域；第二标志物组分是CD79b胞外域与来自CD19的跨膜结构域和截短的胞内域之间的融合物；并且第三标志物是CD79a胞外域与来自IgG1的CH1结构域之间的融合物。第一、第二和第三标志物组分经由两个二硫键缔合以形成异三聚体标志物。
图4–由试剂盒的第一和第二载体编码的氨基酸序列。载体编码第一和第二标志物组分，所述第一和第二标志物组分缔合以形成如图2中所示的异二聚体标志物。
图5–由试剂盒的第一、第二和第三载体编码的氨基酸序列。载体编码第一、第二和第三标志物组分，所述第一、第二和第三标志物组分缔合以形成如图3中所示的异三聚体标志物。
图6A：阐明第一载体和第二载体的示意图，第一载体编码第一嵌合抗原受体(CAR)、2A肽切割位点和第一标志物(CAR1-2A-Mα)；并且第二载体编码第二CAR、2A肽切割位点和第二标志物(CAR2-2A-Mβ)。在每个载体上2A肽切割位点位于标志物和CAR之间。
B：阐明用图6A中所示的一种或两种载体转导细胞的效果的示意图。当用单独的第一或第二载体转导细胞时，转基因得以表达(CAR1或CAR2)，但在细胞表面没有可检测的标志物表达。当用第一和第二载体两者转导细胞时，两种CAR都得以表达，并且第一和第二标志物组分的缔合形成稳定的异二聚体标志物，其也在细胞表面表达。
图7A：第一载体、第二载体和第三载体的示意图。第一载体编码第一CAR、2A肽切割位点和第一标志物(CAR1-2A-Mα)；第二载体编码第二CAR、2A肽切割位点和第二标志物(CAR2-2A-Mβ)；并且第三载体编码第三CAR、2A肽切割位点和第三标志物(CAR3-2A-Mγ)。在每个载体上2A肽切割位点位于标志物和CAR之间。
B：阐明用图7中所示的一种、两种或所有三种载体转导细胞的作用的示意图。当用一种或两种载体转导细胞时，相关的转基因(即CAR)得以表达，但在细胞表面没有可检测的标志物表达。必须转导所有三种载体用于标志物表达。在转导第一、第二和第三载体时，所有三种CAR均得以表达，并且第一、第二和第三标志物组分的缔合形成了稳定的异三聚体标志物，其在细胞表面表达。
图8–野生型和突变的信号序列，其适用于改变试剂盒中标志物组分的相对表达。一个载体可以编码野生型信号肽序列，而另一个载体可以编码显示为“突变1”至“突变7”的改变的序列之一。改变的序列是效率较低的信号肽，因此由具有改变的信号肽的载体编码的标志物组分在细胞中的表达水平将低于由具有野生型信号肽的载体编码的标志物组分。与标志物在相同构建体上的其他转基因的相对表达将受到类似的影响，因此由具有改变的信号肽的载体编码的感兴趣的多肽在细胞中的表达水平将低于由具有野生型信号肽的载体编码的感兴趣的多肽。
图9(A.和B.)–异二聚体标志物在293T细胞(A.)和原代人T细胞(B.)中的表面表达以及异三聚体标志物在293T细胞(C.)中的表面表达。
A和B：将293T细胞用异二聚体标志物的每条链(载体1和载体2)进行单转染，或用两者(载体1+载体2)进行双转染。通过用抗人Kappa链抗体、抗人Fab抗体和使用可溶性CD19染色的流式细胞术评估异二聚体标志物在双转染细胞中的成功组装。编码异二聚体标志物的两条链的质粒用作阳性对照。293K T细胞和原代人T细胞转导两者结果(使用4个健康供体样品)均表明，异二聚体标志物的选择性表达仅在双转导的T细胞中发生，而在单转导的T细胞中检测到最小的背景。
C：将293T细胞用异三聚体标志物的每条链(载体1、载体2和载体3)进行单转染，或用载体1和载体2(载体1+载体2)进行双转染，或用异三聚体标志物的所有三条链(载体1+载体2+载体3)进行三转染。使用流式细胞术通过对可溶性CD19染色来评估异三聚体标志物的成功组装。结果表明，当用一种或两种载体转导细胞时，在细胞表面没有可检测的标志物表达。必须转导所有三种载体用于标志物表达。
发明概述
发明人已经开发了包含核酸序列的载体的试剂盒，每个核酸序列编码标志物组分。标志物组分在缔合后稳定并形成可检测的异多聚体标志物。
因此，在第一方面，本发明提供了载体的试剂盒，其包含：
(i)第一载体，其包含编码第一标志物组分的核酸序列；和
(ii)第二载体，其包含编码第二标志物组分的核酸序列。
当用第一和第二载体两者转导细胞时，细胞表达第一和第二标志物组分并缔合形成可用试剂如细胞分选试剂识别的异多聚体标志物。
当用单独的第一或第二载体转导细胞时，细胞分选试剂不识别单独的第一或第二标志物组分的表达。
第一标志物组分在不与第二标志物组分缔合时可以是不稳定的。在这种排列中，试剂或细胞分选试剂可以识别第一标志物组分。
或者，第一和第二标志物组分两者在未缔合时可以是不稳定的。在这种排列中，试剂或细胞分选试剂可以识别第一或第二标志物组分。
第一标志物组分可以是膜结合的，并且在不存在第一标志物组分的情况下，第二标志物组分可以被分泌。在这种排列中，试剂或细胞分选试剂可以识别第二标志物组分。
一个标志物组分可以包含Kappa恒定结构域，而另一个标志物组分可以包含来自IgG1的CH1结构域。
一个标志物组分可以包含CD79a胞外域，而另一个标志物组分可以包含CD79b胞外域。
试剂盒可以包含第三载体，所述第三载体包含编码第三标志物的核酸序列。
当用第一、第二和第三载体转导细胞时，细胞可以表达第一、第二和第三标志物组分并缔合形成由细胞分选试剂识别的异多聚体标志物。
当用第一、第二或第三载体的一个或两个转导细胞时，细胞分选试剂可以不识别第一、第二或第三标志物组分的一个或两个的表达。
第一、第二和/或第三标志物组分在不作为异多聚体标志物缔合时可以是不稳定的。
第一标志物组分可以是膜结合的；在不存在第一标志物组分的情况下，第二标志物组分可以被分泌；除非还表达了第一和第二标志物组分，否则第三标志物组分可以被分泌。在这种排列中，试剂或细胞分选试剂可以识别第三标志物组分。
第一标志物组分可以包含膜结合的CD79a胞外域；第二标志物可以包含来自IgG1的CH1结构域和CD79a胞外域，并且第三标志物可以包含Kappa恒定结构域。
本发明的第一方面的试剂盒中的载体的至少一个还可以包含编码嵌合抗原受体或T细胞受体的核酸序列。
当试剂盒中的载体在细胞内表达时，一种标志物组分的表达水平可以不同于另一种标志物组分在细胞中的表达水平。
编码两种标志物组分的载体可以包含不同的信号序列。
在第二方面，本发明还提供了细胞表面异多聚体标志物，其用于检测经转导的细胞群体，其中异多聚体标志物包含至少两种标志物组分，第一标志物组分由第一载体中的核酸序列编码，并且第二标志物组分由第二载体中的核酸序列编码，其中第一标志物和第二标志物组分缔合。
第一和/或第二标志物组分在未缔合时可以是不稳定的。
第二标志物组分在不存在第一标志物组分的情况下可以由细胞分泌。
在第三方面，本发明提供了包含根据本发明的第二方面的异多聚体标志物的细胞和/或用根据本发明的第一方面的载体的试剂盒转导的细胞。
细胞可以是免疫细胞，如T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
在第四方面，本发明提供了用于制备根据本发明的第三方面的细胞的方法，其包括用根据本发明的第一方面的载体的试剂盒转导或转染细胞的步骤。
在第五方面，本发明提供了用于制备根据本发明的第三方面的细胞的组合物的方法，其包括以下步骤：
(i)用根据本发明的第一方面的载体的试剂盒转导或转染细胞样品；
(ii)使用试剂如细胞分选试剂检测异多聚体标志物的表达；和
(iii)选择或分选经检测的细胞以制备表达异多聚体标志物的细胞的组合物。
细胞分选试剂可以是可溶性重组蛋白，并且可以在步骤(iii)中使用识别可溶性重组蛋白的基质选择或分选细胞。
细胞分选试剂可以是荧光标记的可溶性重组蛋白，并且可以在步骤(iii)中通过流式细胞术选择或分选细胞。
细胞分选试剂可以是附着于珠子的可溶性重组蛋白，并且在步骤(iii)中通过从经转导/转染的细胞样品中分离珠子来选择或分选细胞。
在第六方面，本发明提供了药物组合物，其包含多个根据本发明的第三方面的细胞。
在第七方面，本发明提供了根据本发明的第六方面的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。
在第八方面，本发明提供了用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括将根据本发明的第六方面的药物组合物施用于受试者的步骤。
方法可以包括以下步骤：
I.从受试者中分离含细胞的样品，
II.用根据本发明的第一方面的载体的试剂盒转导或转染含细胞的样品，
III.使用细胞分选试剂检测异多聚体标志物的表达，从而从样品中鉴定经转导/转染的细胞群体，
IV.选择或分选(III)的细胞群体以获得经转导/转染的细胞的纯化亚群，以及
V.将表达异多聚体标志物的(IV)的亚群施用于受试者。
在第九方面，本发明提供了根据本发明的第六方面的药物组合物在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
疾病可以是癌症。
本发明提供了编码标志物组分的载体的试剂盒，所述标志物组分在缔合后稳定，形成能够细胞表面表达的可检测的异多聚体标志物。当用试剂盒的两种或所有载体转导细胞时，异多聚体标志物在细胞表面表达，其可用试剂如细胞分选试剂检测到。然而，当用载体的亚组(例如单独的一种载体，或三种载体中的两种)转导细胞时，没有可由试剂检测到的标志物在细胞表面表达。
因此，有可能通过检测单个标志物在细胞表面的表达来鉴定已用试剂盒中所有载体转导的细胞。就降低复杂性和在细胞分选后细胞更好的产率而言，这相对于涉及检测多个标志物(即每个载体一个标志物)的方法具有相当大的优势。
使用涉及检测单个异多聚体标志物的本发明的原理，有可能将大的插入物在多个载体之间分裂，并选择用所有载体转导的细胞。因此，有可能增加可以转导到细胞中的总插入物大小，而不增加用于识别和分选含有所有插入物的细胞的方法的复杂性。
发明详述
载体的试剂盒
本发明的第一方面提供了载体的试剂盒。载体的试剂盒包含超过一种载体。载体的试剂盒包含至少第一载体和第二载体，并且在一个实施方案中，载体的试剂盒包含第一载体、第二载体和第三载体。试剂盒可以含有2、3、4或5种载体。本发明的试剂盒中载体的数量与期望被转导到宿主细胞中的插入物的总大小有关：在总插入物大小较大的情况下，可以将其分成更多数量的载体。
本发明的试剂盒中的单独的载体将单独的核酸序列递送到宿主细胞中，使得当用试剂盒的所有载体转导细胞时，细胞表达所有期望的感兴趣的多肽(POI)都。例如，试剂盒可以在宿主细胞中表达三个POI，如第一CAR、第二CAR和自杀基因。
与在同一表达盒内包含编码多个感兴趣的多肽的核酸序列的载体相比，将完整插入物在多个载体之间分裂提供了优势。单个载体排列由于例如通过一个启动子占主导并导致第二启动子沉默的“启动子干扰”而导致翻译和转录效率的问题。此外，不同的启动子在不同的细胞环境中的作用不同，这使得难以实现每个转基因相对表达的一致“调整”。
载体
载体可以是病毒载体，如逆转录病毒载体或慢病毒载体。
载体可以是质粒。
载体也可以是基于转座子的载体或合成的mRNA。载体可以能够转染或转导免疫细胞，如T细胞或NK细胞。
逆转录病毒载体
逆转录病毒和慢病毒可以用作载体或递送系统，用于将感兴趣的多肽(POI)或多个POI转移到靶细胞中。转移可以在体外、离体或体内发生。当以这种方式使用时，病毒通常称为病毒载体。
POI可以例如编码T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)和/或自杀基因。
Gamma逆转录病毒载体，通常称为逆转录病毒载体，是1990年在基因疗法临床试验中采用的第一种病毒载体，并且至今仍是最常用的一种。
最近，对衍生自复杂逆转录病毒如人免疫缺陷病毒(HIV)的慢病毒载体的兴趣日益浓厚，这是由于它们转导非分裂细胞的能力。
逆转录病毒和慢病毒载体作为基因转移工具的最吸引人的特征包括大的遗传有效载荷(高达约8-10kb)、最小的患者免疫应答、体内和体外高转导效率以及永久修饰靶细胞的遗传组分从而维持递送的基因的长期表达的能力。
逆转录病毒载体可以基于能够将遗传信息递送至真核细胞的任何合适的逆转录病毒。例如，逆转录病毒载体可以是alpha逆转录病毒载体、gamma逆转录病毒载体、慢病毒载体或泡沫逆转录病毒(spumaretroviral)载体。此类载体已广泛用于基因疗法治疗和其他基因递送应用中。
本发明的病毒载体可以是逆转录病毒载体，如gamma逆转录病毒载体。病毒载体可以基于人免疫缺陷病毒。
本发明的病毒载体可以是慢病毒载体。载体可以基于非灵长类慢病毒，如马传染性贫血病毒(EIAV)。
标志物组分和异二聚体标志物
本发明的试剂盒的每个载体包含编码标志物组分的核酸序列。第一载体包含编码第一标志物组分的核酸序列，并且第二载体包含编码第二标志物组分的核酸序列。
标志物组分在不与从单独载体表达的第二相互(reciprocal)标志物组分缔合的情况下可以是不稳定的并且不能由转导的宿主细胞在细胞表面表达。相互标志物组分在未缔合的情况下也可以是不稳定的。
缔合后，第一标志物组分和第二标志物组分(与第一标志物是相互的)形成稳定的异多聚体复合物，其在宿主细胞的细胞表面表达。
以下是第一和第二标志物组分的实例，其缔合以形成能够细胞表面表达的稳定且可检测的异二聚体标志物。在不存在缔合的情况下，第一和第二标志物组分是不稳定的，并且不在细胞的表面表达。
CD79a/CD79b
CD79(分化簇79)是与B细胞受体形成复合物并在识别抗原后产生信号的蛋白质。
CD79由两条不同的称为CD79a和CD79b(以前称为Ig-alpha和Ig-beta)的链组成；它们在B细胞的表面上形成由二硫键稳定化的异二聚体。CD79a(UniProt：P11912)和CD79b(UniProt：P40259)两者都是免疫球蛋白超家族的成员。
两条CD79链在其细胞内尾部均含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)，它们将其用于在B细胞中传播信号，其方式类似于在T细胞上T细胞受体激活期间观察到的CD3产生的信号转导。
标志物组分可以包含来自CD79a或CD79b的胞外域。这些结构域的氨基酸序列在图5中给出。载体的试剂盒可以包含编码包含CD79a的胞外域的标志物组分的一个载体和编码包含CD79b的胞外域的标志物组分的另一个载体。一个或其他标志物可以是膜结合的，例如通过具有跨膜结构域实现。
异二聚体标志物排列显示于图1中，其中第一标志物组分包含CD79a胞外域，而第二标志物组分包含与跨膜结构域融合的CD79b胞外域。
在用两种载体成功转导细胞后，CD79a胞外域标志物组分和CD79b胞外域标志物组分(包含CD19跨膜结构域)标志物表达并缔合，从而形成在细胞的表面上表达的稳定异二聚体标志物。
如果CD79a标志物组分或CD79b标志物组分在细胞中单独表达，它们将是不稳定的并且不在细胞表面表达。
来自IgG1的CH1/Kappa恒定结构域IgG1
IgG抗体是具有复杂结构域间相互作用的多结构域蛋白质。人IgG重链与轻链缔合以形成能够结合抗原的成熟抗体。轻链可以是Kappa或gamma同种型的。
重和轻恒定结构域的缔合形成稳定的异二聚体。标志物组分可以包含重链或轻链恒定区。Kappa链恒定区和来自IgG1的CH1区的氨基酸序列在图4中给出，但是来自其他抗体的许多其他合适的序列是已知的。
载体的试剂盒可以包含编码包含重链恒定区的标志物组分的一个载体和编码包含轻链恒定区的标志物组分的另一个载体。一个或其他标志物可以是膜结合的，例如通过具有跨膜结构域。
异二聚体标志物排列如图2中所示，其中第一标志物组分包含Kappa恒定结构域，而第二标志物组分包含编码与跨膜结构域融合的来自IgG1的CH1结构域的核酸序列。
在用两种载体成功转导细胞后，Kappa恒定结构域标志物组分和CH1标志物组分(包含CD19跨膜结构域)标志物表达并缔合，从而形成在细胞的表面上表达的稳定异二聚体标志物。
如果Kappa恒定结构域标志物组分或CH1标志物组分在细胞中单独表达，它们将是不稳定的并且不在细胞表面表达。
表1提供了第一和第二标志物组分的非限制性列表，包括上面未描述的另外的标志物对。下面的第一和第二标志物组分对可以自发缔合以形成本发明的异二聚体标志物：
表1
第一标志物组分 第二标志物组分
CD79a(UniProt:P11912) CD79b(UniProt:P40259)
Kappa恒定结构域 来自IgG1的CH1
TRDC(UniProt:B7Z8K6) TRGC(UniProt:P03986或P03986)
CD1A(UniProt:P06126) Beta-2-微球蛋白(UniProt:P61760)
TRBC TRAC
异三聚体标志物
载体的试剂盒可以包含分别编码第一、第二和第三标志物组分的第一、第二和第三载体。
标志物组分之一可以是膜结合的，例如通过具有跨膜结构域实现。
异三聚体标志物排列如图3中所示。在这种排列中，第一标志物组分包含Kappa恒定结构域，第二标志物组分包含具有CD19跨膜结构域的CD79b胞外域，而第三标志物组分包含与来自IgG1结构域的与CH1结构域融合的CD79a胞外域。
第一标志物组分上的Kappa恒定结构域标志物与第三标志物组分上的来自IgG1的CH1结构域缔合。第三标志物组分的CD79a胞外域与第二标志物组分上的CD79b胞外域缔合。当所有三个标志物组分都在细胞中表达时，形成稳定的异三聚体复合物，其可用识别Kappa恒定结构域的试剂在细胞表面检测到。当在细胞中仅表达标志物组分的一种或任何两种时，在细胞表面上没有形成可用识别kappa恒定结构域的试剂检测到的复合物。
异三聚体标志物可以由任意两个自发缔合的标志物对形成，如表1中所述的标志物。异三聚体标志物的形成不限于上述对，并且可以想到其他自发缔合的标志物。
这种排列借助检测单个异三聚体标志物而有效地允许检测三个单独的载体上的三个标志物组分。
对于具有超出三个标志物组分的异多聚体标志物，类似的排列是有可能的。例如，异多聚体标志物可以包含4、5或更多个标志物组分。异多聚体标志物可以由识别一种标志物组分的试剂检测，该标志物组分仅当异多聚体标志物在细胞中表达时形成异多聚体标志物的一部分。
可溶性、分泌的和膜结合标志物
就标志物组分能够在细胞的胞质溶胶中自由扩散的意义而言，标志物组分在单独表达时可以是可溶的。
就标志物组分在不存在其他标志物组分的情况下由细胞表达时其由细胞分泌的意义而言，标志物组分可以是分泌的。
就有效地锚定到膜的意义而言，标志物组分可以是膜结合的。
膜结合的标志物可以例如包含跨膜结构域、终止转移序列、GPI锚或豆蔻酰化/异戊二烯化/棕榈酰化位点。
跨膜结构域可以衍生自标志物组分中的蛋白质(例如CD79a或CD79b的跨膜结构域)，或者可以将编码跨膜结构域的序列工程化改造到编码标志物组分的载体中。
可检测的异多聚体标志物
在第一方面，本发明提供了载体的试剂盒，每个载体编码标志物组分。当用试剂盒的所有载体转导细胞时，表达的标志物组分缔合以形成可检测的异多聚体标志物。
在第二方面，本发明提供了用于检测经转导的细胞群体的可检测的异多聚体标志物，其中异多聚体标志物包含缔合的至少两个标志物组分。
异多聚体标志物包含至少两个标志物组分，但是可以包含三个、四个或更多个标志物组分，其缔合在一起以形成稳定的、可检测的异多聚体标志物。当未缔合在一起时，形成异多聚体标志物的一个或多个标志物组分可以是不稳定的。例如，当CD79a和CD79b结构域未缔合在一起时，包含CD79a的胞外域的标志物组分和包含CD79b的胞外域的标志物组分可以是不稳定的。
术语缔合与二聚化和/或结合同义。缔合可以在一个标志物和另一个标志物之间形成共价键如二硫键。
异多聚体标志物可以包含多个标志物组分，除非与异多聚体标志物的所有其他剩余的标志物组分缔合，否则其不能细胞表面表达。
或者，由试剂盒编码的一个或一些标志物组分可以能够单独细胞表面表达，而一个标志物组分仅当与其他标志物缔合时在细胞表面表达。在这种情况下，使用特异性识别后者标志物组分的试剂表明试剂盒中的所有载体都已转导细胞。
可通过使用对任何一种标志物组分具有特异性的试剂检测可检测的异多聚体标志物。试剂对标志物组分具有特异性，该标志物组分仅在与试剂盒的其他标志物组分共表达时在细胞表面表达，即其仅作为异多聚体复合物的一部分在细胞表面表达。
试剂
本发明的异多聚体标志物可使用试剂如细胞检测或细胞分选剂检测。为了本发明的目的，术语“细胞分选试剂”包括能够鉴定表达异多聚体标志物的细胞的试剂：其不限于能够鉴定和分选表达异多聚体标志物的细胞的试剂。
试剂可以例如衍生自配体、小分子或抗体。
试剂可以特异性结合异多聚体标志物的任何一种标志物组分。
试剂可以结合可溶性或分泌的标志物组分。试剂可以结合跨膜标志物组分，如果该跨膜标志物的稳定细胞表达依赖于其它或每个其它组分的存在。
试剂可以特异性结合CD79a胞外域(参见图1中所示的排列)。
试剂可以特异性结合Kappa恒定结构域(参见图2和3中所示的排列)。
用于检测本发明的异二聚体标志物的小分子试剂的实例是链霉抗生物素蛋白。在这种情况下，待检测的标志物组分可以经工程化以包括StrepTag肽。StrepTag是由八个氨基酸(YSHPQFEK-SEQ ID No.1)组成的合成肽，其可以附接至待检测的标志物组分上。该肽序列表现出对链霉抗生物素蛋白的固有亲和力。
StepTag肽的检测可以涉及
Figure BDA0002472993010000131
系统，其允许通过亲和色谱法进行检测。
用于检测异多聚体标志物的试剂的其他实例包括：
1.蛋白A，其检测可检测标志物上的CH2-CH2；
2.谷胱甘肽，其检测可检测标志物上的谷胱甘肽S-转移酶(GST)；或
3.镍NTA，其检测可检测标志物上的His标签。
经转导的细胞群体的细胞分选和纯化
试剂可以用于选择或分选经转导的细胞群体。这可以用于在向受试者施用之前纯化经转导的细胞的情况下，例如用于治疗状况或疾病。
与试剂(如上所述的抗体、配体或小分子)缀合的磁性纳米颗粒导致表达试剂结合的标志物的细胞附着至强磁场。在此步骤中，附着至纳米颗粒的细胞留在柱子上，而其他细胞(不表达标志物)则流过。这样，细胞可以相对于特定标志物正向或负向分离。
或者，针对感兴趣的标志物的荧光标记的试剂可以用于表达异多聚体标志物的细胞的细胞分离。
跨膜结构域
跨膜结构域是跨越膜的肽的结构域。本发明的标志物组分可以包含跨膜结构域使得异多聚体标志物是膜结合的。
跨膜结构域可以是在膜中热力学稳定的任何蛋白质结构。这通常是包含几个疏水残基的alpha螺旋。任何跨膜蛋白质的跨膜结构域可以用于提供本发明的跨膜部分。蛋白质的跨膜结构域的存在和跨度可以由本领域技术人员使用TMHMM算法(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)确定。也可以使用人工设计的TM结构域。
跨膜结构域可以例如衍生自CD19或CD28。
信号序列
由本发明的核酸序列编码的标志物可以包含信号序列，使得当标志物缔合并在细胞内表达时，新生蛋白质被引导至内质网(ER)。
术语“信号序列”与“信号肽”同义。
信号序列是短肽，通常5-30个氨基酸长，存在于注定要进入分泌途径的大多数新合成的蛋白质的N端。这些蛋白质包括驻留在某些细胞器(例如，内质网、高尔基体或内体)内的蛋白质、从细胞分泌的蛋白质以及跨膜蛋白质。
信号序列通常含有核心序列，其是长段的疏水性氨基酸，具有形成单个alpha螺旋的倾向于形成。信号序列可以以短的带正电荷的氨基酸段开始，该氨基酸段有助于在移位期间实施多肽的正确拓扑。在信号序列的末端处，典型地存在一段由信号肽酶识别并切割的氨基酸。信号肽酶可以在移位期间或移位完成后切割以生成游离信号序列和成熟蛋白质。然后通过特异性蛋白酶消化游离信号序列。
尽管已知一些羧基端信号肽，但是信号序列通常位于分子的氨基端。
信号序列具有三部分结构，由疏水核心区(h区)、侧接的n区和c区组成。后者包含信号肽酶(SP酶(SPase))共有切割位点。通常，信号序列被共翻译地切割掉，所得切割的信号序列称为信号肽。
在来自鼠Ig kappa链V-III区的信号肽中，其具有序列：METDTLILWVLLLLVPGSTG：n区具有序列METD；h区(以粗体显示)具有序列TLILWVLLLV；并且c区具有序列PGSTG。
突变的信号序列
突变的信号序列可以在其h区不同于野生型信号序列。一个多肽(其具有较高的相对表达)在h区中的疏水性氨基酸的数量大于另一个多肽(其具有较低的相对表达)。具有较低相对表达的多肽的信号肽可以在h区中包含疏水性氨基酸的一个或多个氨基酸突变，例如取代或缺失。
如上所述，第一信号肽和第二信号肽可以具有基本上相同的n和c区，但是在h区中不同。“基本上相同”表示n和c区可以在第一和第二信号肽之间相同，或者可以在n或c链中相差一个、两个或三个氨基酸，而不影响信号肽的功能。
核心中的疏水氨基酸可以例如是：丙氨酸(A)；缬氨酸(V)；异亮氨酸(I)；亮氨酸(L)；甲硫氨酸(M)；苯丙氨酸(P)；酪氨酸(Y)；或色氨酸(W)。
为了改变信号肽效率而突变的疏水性氨基酸可以是以上列表中的任何一种，特别是：缬氨酸(V)；异亮氨酸(I)；亮氨酸(L)；和色氨酸(W)。
在h区中的残基中，一个信号肽(例如，经改变的信号肽)可以比另一个信号肽(例如，未经改变的信号肽)包含至少10％、20％、30％、40％或50％更少的疏水氨基酸。
在h区包含5-15个氨基酸的情况下，一个信号肽可以比另一个信号肽包含1、2、3、4或5个更多的疏水氨基酸。
经改变的信号肽可以包含疏水性氨基酸的1、2、3、4或5个氨基酸缺失或取代。疏水氨基酸可以用非疏水氨基酸(如亲水或中性氨基酸)替换。
图8中列出了基于来自鼠Ig kappa链V-III区的信号肽的标志物组分的合适的突变信号序列的实例。
可以使用软件技术来检测或预测信号序列(参见例如，http://www.predisi.de/)。
大量的信号序列是已知的，并且可以在数据库中获得。例如，http://www.signalpeptide.de在其数据库中列出了2109个已确认的哺乳动物信号肽。
第一标志物的表达水平和第二标志物的表达水平
一个标志物组分的表达水平可以不同于另一标志物组分的表达水平。这可以使用如WO2016/174408中所述的一个或多个细胞内保留信号，或通过使用如本文中以及WO2016/174409中所述的替代信号肽来实现。
在载体的试剂盒编码一种或多种可溶或分泌的标志物组分和膜结合的标志物组分的情况下，可以调整相对表达，使得膜结合的标志物组分以低于可溶性/分泌性标志物组分的水平表达。
不同的信号肽提供了与第二载体中另一个感兴趣的多肽相比控制第一载体中的一个感兴趣的多肽的表达水平的方法，其中期望感兴趣的多肽在细胞中以不同的水平表达。选择具有一种感兴趣的多肽序列比另一种表达更高的经转导的细胞群体可能是有利的。
在细胞中表达的两种多肽的差异表达有用的实例是其中一种感兴趣的多肽是嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)，而另一种感兴趣的多肽是自杀基因。自杀基因充当“开关”，例如在面对毒性时，提供用于杀伤表达CAR或TCR的细胞的机制。如果自杀基因以比CAR或TCR更高的水平存在于经转导的细胞中，则它可以更有效地杀伤表达它的细胞。
通过改变在与感兴趣的多肽相同的构建体上表达的标志物组分的表达水平，可以使细胞鉴定或分选倾向于表达较高水平的标志物组分的经转导的细胞，较高水平的标志物组分指示从相同构建体表达的POI的较高水平的表达。
感兴趣的多肽(POI)
本发明的POI可以是期望在经转导的细胞群体中表达的任何多肽。POI可以是例如嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。POI可以是编码自杀基因的多肽。
细胞
提供了用本发明的载体的试剂盒转导或转染的细胞。
细胞可以是细胞裂解性免疫细胞，如T细胞或NK细胞。
T细胞或T淋巴细胞是在细胞介导的免疫中发挥中心作用的淋巴细胞类型。通过细胞表面上T细胞受体(TCR)的存在，它们可以与其他淋巴细胞如B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)区分。存在多种类型的T细胞，如下文所总结。
辅助性T辅助细胞(TH细胞)在免疫学过程中辅助其他白细胞，包括B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及激活细胞毒性T细胞和巨噬细胞。TH细胞在其表面上表达CD4。当TH细胞通过抗原呈递细胞(APC)的表面上的MHC II类分子呈递肽抗原时，TH细胞被激活。这些细胞可以分化成几种亚型之一，包括TH1、TH2、TH3、TH17、Th9或TFH，其分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。
细胞毒性T细胞(TC细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且也涉及移植排斥。CTL在其表面处表达CD8。这些细胞通过与存在于所有有核细胞的表面上的MHC I类缔合的抗原结合而识别其靶标。通过调节性T细胞分泌的IL-10、腺苷和其他分子，可以使CD8+细胞失活至无反应性(anergic)状态，其阻止自身免疫性疾病，如实验性自身免疫性脑脊髓炎。
记忆T细胞是在感染已经消退之后长期持续的抗原特异性T细胞的子集。它们在再次暴露于其关联抗原后迅速扩增为大量效应T细胞，从而为免疫系统提供针对过去感染的“记忆”。记忆T细胞包含三种亚型：中央记忆T细胞(TCM细胞)和两种类型的效应记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)。记忆细胞可以是CD4+或CD8+。记忆T细胞通常表达细胞表面蛋白CD45RO。
调节性T细胞(Treg细胞)，以前称为抑制性T细胞，对于维持免疫耐受性至关重要。它们的主要作用是关闭T细胞介导的免疫以朝向免疫反应的结束，以及阻抑逃脱胸腺中阴性选择的过程的自身反应性T细胞。
已经描述了两种主要类型的CD4+Treg细胞，即天然存在的Treg细胞和适应性Treg细胞。
天然存在的Treg细胞(也称为CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞)出现在胸腺中，并已经与发育中的T细胞和已经用TSLP激活的髓样(CD11c+)和浆细胞样(CD123+)树突状细胞之间的相互作用相关。天然存在的Treg细胞可以通过称为FoxP3的细胞内分子的存在与其他T细胞区分开来。FOXP3基因的突变可以阻止调节性T细胞发育，导致致命的自身免疫性疾病IPEX。
适应性Treg细胞(也称为Tr1细胞或Th3细胞)可以在正常免疫应答期间产生。
细胞可以是自然杀伤细胞(或NK细胞)。NK细胞形成先天免疫系统的一部分。NK细胞以MHC非依赖性方式对来自病毒感染细胞的先天信号提供快速应答。
NK细胞(属于先天性淋巴样细胞群)被定义为大颗粒淋巴细胞(LGL)，并构成从产生B和T淋巴细胞的共同淋巴样祖细胞分化的第三种细胞。已知NK细胞在骨髓、淋巴结、脾、扁桃体和胸腺中分化和成熟，在那里它们进入到循环中。
本发明的细胞可以是上述任何细胞类型。
经转导的细胞可以从患者自己的外周血(第1方)离体产生，或者在来自供体外周血的造血干细胞移植物(第2方)或来自不相关供体的外周血(第3方)的背景中产生。
或者，细胞可以衍生自诱导型祖细胞或胚胎祖细胞离体分化为例如T细胞或NK细胞。或者，可以使用保留其裂解功能并且可以充当治疗剂的永生化T细胞系。
在所有这些实施方案中，可以通过包括用病毒载体转导、用DNA或RNA转染的许多方式之一引入编码标志物和POI的DNA或RNA来生成表达标志物或POI的细胞。
本发明的细胞可以是来自受试者的离体细胞。细胞可以来自外周血单核细胞(PBMC)样品。此类细胞可以在用编码提供根据本发明第一方面的载体的试剂盒的分子的核酸转导之前激活和/或扩增，例如通过用抗CD3单克隆抗体处理。
本发明的细胞可以通过以下制备：
(i)从受试者或上文列出的其他来源分离含有细胞的样品；和
(ii)用根据本发明的第一方面的载体的试剂盒转导或转染细胞。
药物组合物
本发明还涉及含有多个根据本发明的细胞的药物组合物。
药物组合物可以另外包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。药物组合物可以任选地包含一种或多种另外的药学活性多肽和/或化合物。此类剂型可以是例如以适合用于静脉内输注的形式。
治疗方法
本发明提供了治疗和/或预防疾病的方法，其包括将本发明的细胞(例如在上文所述的药物组合物中)施用于受试者的步骤。
治疗疾病的方法涉及本发明细胞的治疗性用途。本文中，可以对患有现有疾病或病况的受试者施用细胞以减轻、降低或改善至少一种与疾病相关的症状和/或减缓、降低或阻断疾病的进展。
预防疾病的方法涉及本发明的细胞的预防性用途。本文中，可以对尚未感染疾病和/或未显示任何疾病症状的受试者施用此类细胞，以预防或削弱疾病的起因，或减少或预防至少一种与此类病有关的症状的形成。受试者可以具有疾病的素因，或认为有形成疾病的风险。
方法可以包括以下步骤：
I.从受试者中分离含细胞的样品，
II.用本发明的载体的试剂盒转导或转染含细胞的样品，
III.使用试剂检测异多聚体标志物的表达，从而从样品中鉴定经转导的细胞群体，
IV.选择或分选(III)的细胞群体以获得纯化的亚群，以及
V.将表达异多聚体标志物的(IV)的亚群施用于受试者。
本发明提供了细胞组合物，其用于治疗和/或预防疾病。
本发明还涉及包含如上所述的经转导的细胞群体的药物组合物在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
通过本发明的方法治疗和/或预防的疾病可以是癌性疾病，如急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴母细胞性白血病(CLL)、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、肾癌(肾细胞)、白血病、肺癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌和甲状腺癌。
本发明的细胞可以能够杀伤靶细胞，如癌细胞。靶细胞的特征可以在于在靶细胞附近存在肿瘤分泌性配体或趋化因子配体。靶细胞的特征可以在于在靶细胞表面上存在可溶性配体以及肿瘤相关抗原(TAA)的表达。
本发明的细胞和药物组合物可以用于治疗和/或预防上述疾病。
本发明的细胞和药物组合物可以用于上述任何方法。
现在将通过实施例的方式进一步描述本发明，所述实施例旨在帮助本领域的普通技术人员实施本发明，而不意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：异二聚体标志物在双转导的T细胞上的表面表达
将编码Kappa恒定结构域标志物组分、2A肽切割位点和增强型绿色荧光蛋白的第一载体(Kappa-2A-eGFP)与编码作为来自IgG1的CH1结构域与CD19跨膜结构域的融合物的标志物组分、2A肽切割位点和mTagBFP2基因的第二载体(CH1CD19TM-2A-mTagBFP2)以1:1比例混合，并且用于转导T细胞。所得的经转导的T细胞是用单独的第一载体转导的细胞(eGFP阳性)或用单独的第二载体转导的细胞(mTagBFP2阳性)或用两种载体双转导的细胞(对eGFP和mTagBFP2呈阳性)的混合物。
细胞混合物用与APC缀合的抗Kappa抗体染色以显示异二聚体标志物的表面表达仅存在于双转导的T细胞(例如，对eGFP和mTagBFP2呈双阳性的细胞)。所得的稳定的异二聚体标志物如图2中所示。
使用抗Kappa磁珠纯化双转导的细胞，并通过流式细胞术(FAC分析)观察eGFP和mTagBFP2双阳性细胞的百分比来分析纯度。
作为阴性对照，仅用一种载体(第一或第二载体)转导T细胞，并用与APC缀合的抗Kappa抗体染色。由于单个载体的标志物不能缔合和稳定，因此没有T细胞能够表达不稳定的Kappa标志物。在对照实验中，与APC缀合的抗Kappa抗体不能与任何细胞结合，因为它们不能表达标志物。
实施例2：异三聚体标志物在三转导的T细胞上的表面表达
将第一载体、第二载体和第三载体以1:1:1比例混合在一起，并用于转导T细胞。第一载体编码作为Kappa恒定结构域与来自IgG1的CH1结构域的融合物的标志物组分、2A切割位点和eGFP(Kappa-2A-eGFP)。第二载体编码作为来自IgG1的CH1结构域与CD19跨膜结构域的融合物的标志物组分、2A切割位点和mTagBFP2基因(CD79b-CD19TM-2A-mTagBFP2)。第三载体编码作为Kappa恒定结构域的标志物组分、2A肽切割位点和mKate2(CH1-CD79a-2A-mKate2)。
所得的经转导的T细胞是用单独的第一载体转导的细胞(eGFP阳性)、用单独的第二载体转导的细胞(mTagBFP2阳性)、用单独的第三载体转导的细胞(mKate2)或三个可用载体中的两个转导的细胞(例如，对eGFP和mTagBFP2；或mKate2和mTagBFP2呈阳性)的混合物。
T细胞的混合物用与APC缀合的抗Kappa抗体染色以显示异三聚体标志物的表面表达仅存在于三转导的T细胞(例如，对eGFP、mTagBFP2和mKate2呈三阳性的细胞)。所得的稳定的异三聚体标志物是图3中所示的标志物。
然后使用抗Kappa磁珠纯化此三转导的细胞的群体以形成细胞亚群，并通过流式细胞术(FACS分析)观察eGFP、mTagBFP2和mKate2三阳性细胞的百分比来分析纯度。
作为阴性对照，用上述载体的一种或两种转导T细胞。这可以是，但不限于第一或第二载体或第一和第二载体。对照混合物用与APC缀合的抗Kappa抗体染色。
与三转导的细胞相反，没有T细胞能够表达不稳定的Kappa标志物，因为单或双载体的标志物不能完全缔合，并因此不能在细胞中稳定或表达。在对照实验中，与APC缀合的抗Kappa抗体不能与任何细胞结合。
实施例3：具有一种多肽序列相对于另一多肽序列差异表达水平的细胞的优先选择。
用具有编码标志物组分和嵌合抗原受体的第一载体(Kappa-2A-CAR)和编码标志物组分和自杀基因RapCasp9的第二载体(CH1CD19TM-2A-Rapcasp9)的试剂盒转导细胞样品。RapCasp9自杀基因描述于WO2016/151315中。第二载体包括在标志物组分序列例如CH1CD19TM上游的突变的信号序列。突变的信号序列可以是图8中列出的次优信号序列的任一个。
与细胞中第一载体编码的Kappa标志物的表达水平相比，突变的信号序列降低了第二载体编码的下游CH1CD19TM标志物的表达水平。由于第一标志物和第二标志物的缔合必须为1:1比例，因此与CAR表达水平相比，选择偏向于表达高水平自杀基因Rapcasp9的细胞。这是有用的，因为当自杀基因(如RapCasp9)在细胞中的表达水平高于CAR的表达水平时其可以更有效。
实施例4：异二聚体和异三聚体标志物在293T细胞和原代人T细胞中的表面表达。
表2
Figure BDA0002472993010000211
Figure BDA0002472993010000221
293T细胞分别用异二聚体标志物的每条链(载体1或载体2)转染，并用二者双转染(载体1和载体2)。载体构建体见表2。
使用GeneJuice(Millipore)，与编码gag-pol的质粒(pEQ-Pam3-E36)、编码RD114包膜的质粒(RDF37)和期望的逆转录病毒转移载体质粒，对293T细胞进行瞬时转染。对于转染效率，在48小时和72小时收集病毒上清液，并对293T细胞染色。建立共培养物时，转染后48小时对293T细胞进行计数，并以1:1比例铺板再24小时，然后对于异二聚体标志物进行染色。
使用标准表面染色方案，如图9A所示，通过用抗人Kappa链抗体、抗人Fab抗体并使用可溶性CD19进行染色，通过流式细胞术评估异二聚体标志物在双转染细胞中的成功组装。在圆底96孔板中对1x105个细胞进行染色。将表面抗体用染色缓冲液(PBS中1％FBS)稀释，并以每样品100μl添加到细胞中。根据制造商的方案使用以下抗体：抗CD34 APC或PE(克隆QBEnd10，R&D systems)、抗Kappa APC(BD Biosciences)、抗人Fab APC(JacksonImmunoResearch)、抗His PE(Abcam)。
编码异二聚体标志物的两条链的质粒用作阳性对照。
同样，在原代人T细胞转导实验中(使用4个健康供体样品)，已证明异二聚体标志物的选择性表达仅在双转导的T细胞中发生，而在单转导的T细胞中检测到最小的背景。参见图9B。
通过Ficoll(GE Healthcare)梯度离心分离外周血单核细胞，并用50ng/mL的抗CD3/28抗体刺激。过夜刺激后添加白介素2(IL-2)补充(100IU/mL)。在第3天，收获T细胞，将其铺在retronectin和逆转录病毒上清液上，并以1000g离心40分钟。如上所述，5天后使用流式细胞术对转导效率进行评价。
图9C显示使用上述转染方法，将293T细胞用异三聚体标志物的每条链(载体1、载体2和载体3)进行单转染，双转染(载体1和载体2)以及用异三聚体标志物的所有三条链(载体1和载体2和载体3)进行三转染。使用如表2中所示的载体1、载体2和载体3构建体。如上所述，使用流式细胞术通过对可溶性CD19染色来评估评价异三聚体标志物的成功组装。以上说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领结构域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合特定的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，要求保护的本发明不应不适当地限制于此类特定的实施方案。实际上，对于分子生物学或相关领域的技术人员来说显而易见的所描述的用于实施本发明的方式的各种修改都旨在所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 奥托路斯有限公司
<120> 载体
<130> P113572PCT
<150> GB 1718088.6
<151> 2017-11-01
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> StrepTag合成肽
<400> 1
Tyr Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 2
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由载体1编码的eGFP序列
<400> 2
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Arg
225 230 235 240
Ala
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由载体1编码的2A序列
<400> 3
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由载体1编码的信号肽序列
<400> 4
Met Ser Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr
1 5 10 15
Gly Val His Ser
20
<210> 5
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由载体1编码的Kappa链序列
<400> 5
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Arg Ala
100 105
<210> 6
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由载体2编码的mTagBFP2序列
<400> 6
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met His Met Lys
1 5 10 15
Leu Tyr Met Glu Gly Thr Val Asp Asn His His Phe Lys Cys Thr Ser
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Met Arg Ile Lys
35 40 45
Val Val Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Thr
50 55 60
Ser Phe Leu Tyr Gly Ser Lys Thr Phe Ile Asn His Thr Gln Gly Ile
65 70 75 80
Pro Asp Phe Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg
85 90 95
Val Thr Thr Tyr Glu Asp Gly Gly Val Leu Thr Ala Thr Gln Asp Thr
100 105 110
Ser Leu Gln Asp Gly Cys Leu Ile Tyr Asn Val Lys Ile Arg Gly Val
115 120 125
Asn Phe Thr Ser Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Gly Trp
130 135 140
Glu Ala Phe Thr Glu Thr Leu Tyr Pro Ala Asp Gly Gly Leu Glu Gly
145 150 155 160
Arg Asn Asp Met Ala Leu Lys Leu Val Gly Gly Ser His Leu Ile Ala
165 170 175
Asn Ala Lys Thr Thr Tyr Arg Ser Lys Lys Pro Ala Lys Asn Leu Lys
180 185 190
Met Pro Gly Val Tyr Tyr Val Asp Tyr Arg Leu Glu Arg Ile Lys Glu
195 200 205
Ala Asn Asn Glu Thr Tyr Val Glu Gln His Glu Val Ala Val Ala Arg
210 215 220
Tyr Cys Asp Leu Pro Ser Lys Leu Gly His Lys Leu Asn
225 230 235
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由载体2编码的信号肽序列
<400> 7
Met Glu Thr Asp Thr Leu Ile Leu Trp Val Leu Leu Leu Leu Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly
20
<210> 8
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由载体2编码的CH1序列
<400> 8
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val
<210> 9
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由载体2编码的CD19TM序列
<400> 9
Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys Ser Leu Val Gly
1 5 10 15
Ile Leu His Leu
20
<210> 10
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由载体2编码的dCD19序列
<400> 10
Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg Lys Arg Lys Arg Met Thr Asp Pro
1 5 10 15
Thr Arg Arg
<210> 11
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由载体1编码的CD79a序列
<400> 11
Leu Trp Met His Lys Val Pro Ala Ser Leu Met Val Ser Leu Gly Glu
1 5 10 15
Asp Ala His Phe Gln Cys Pro His Asn Ser Ser Asn Asn Ala Asn Val
20 25 30
Thr Trp Trp Arg Val Leu His Gly Asn Tyr Thr Trp Pro Pro Glu Phe
35 40 45
Leu Gly Pro Gly Glu Asp Pro Asn Gly Thr Leu Ile Ile Gln Asn Val
50 55 60
Asn Lys Ser His Gly Gly Ile Tyr Val Cys Arg Val Gln Glu Gly Asn
65 70 75 80
Glu Ser Tyr Gln Gln Ser Cys Gly Thr Tyr Leu Arg Val Arg Gln Pro
85 90 95
Pro Pro Arg Pro Phe Leu Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn Arg
100 105 110
<210> 12
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由载体2编码的CD79b序列
<400> 12
Ala Arg Ser Glu Asp Arg Tyr Arg Asn Pro Lys Gly Ser Ala Cys Ser
1 5 10 15
Arg Ile Trp Gln Ser Pro Arg Phe Ile Ala Arg Lys Arg Gly Phe Thr
20 25 30
Val Lys Met His Cys Tyr Met Asn Ser Ala Ser Gly Asn Val Ser Trp
35 40 45
Leu Trp Lys Gln Glu Met Asp Glu Asn Pro Gln Gln Leu Lys Leu Glu
50 55 60
Lys Gly Arg Met Glu Glu Ser Gln Asn Glu Ser Leu Ala Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Gln Gly Ile Arg Phe Glu Asp Asn Gly Ile Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
Lys Cys Asn Asn Thr Ser Glu Val Tyr Gln Gly Cys Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Arg Val Met Gly Phe Ser Thr Leu Ala Gln Leu Lys Gln Arg Asn Thr
115 120 125
Leu Lys Asp
130
<210> 13
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由载体3编码的mKate2序列
<400> 13
Ser Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met His Met Lys Leu Tyr Met Glu Gly
1 5 10 15
Thr Val Asn Asn His His Phe Lys Cys Thr Ser Glu Gly Glu Gly Lys
20 25 30
Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Met Arg Ile Lys Ala Val Glu Gly Gly
35 40 45
Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Thr Ser Phe Met Tyr Gly
50 55 60
Ser Lys Thr Phe Ile Asn His Thr Gln Gly Ile Pro Asp Phe Phe Lys
65 70 75 80
Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Val Thr Thr Tyr Glu
85 90 95
Asp Gly Gly Val Leu Thr Ala Thr Gln Asp Thr Ser Leu Gln Asp Gly
100 105 110
Cys Leu Ile Tyr Asn Val Lys Ile Arg Gly Val Asn Phe Pro Ser Asn
115 120 125
Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Gly Trp Glu Ala Ser Thr Glu
130 135 140
Thr Leu Tyr Pro Ala Asp Gly Gly Leu Glu Gly Arg Ala Asp Met Ala
145 150 155 160
Leu Lys Leu Val Gly Gly Gly His Leu Ile Cys Asn Leu Lys Thr Thr
165 170 175
Tyr Arg Ser Lys Lys Pro Ala Lys Asn Leu Lys Met Pro Gly Val Tyr
180 185 190
Tyr Val Asp Arg Arg Leu Glu Arg Ile Lys Glu Ala Asp Lys Glu Thr
195 200 205
Tyr Val Glu Gln His Glu Val Ala Val Ala Arg Tyr Cys Asp Leu Pro
210 215 220
Ser Lys Leu Gly His Arg
225 230
<210> 14
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变的信号序列, 突变1
<400> 14
Met Glu Thr Asp Thr Leu Ile Leu Trp Val Leu Leu Leu Val Pro Gly
1 5 10 15
Ser Thr Gly
<210> 15
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变的信号序列, 突变2
<400> 15
Met Glu Thr Asp Thr Leu Ile Leu Trp Val Leu Leu Val Pro Gly Ser
1 5 10 15
Thr Gly
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变的信号序列, 突变3
<400> 16
Met Glu Thr Asp Thr Leu Ile Leu Trp Val Leu Val Pro Gly Ser Thr
1 5 10 15
Gly
<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变的信号序列, 突变4
<400> 17
Met Glu Thr Asp Thr Leu Ile Leu Trp Leu Val Pro Gly Ser Thr Gly
1 5 10 15
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变的信号序列, 突变5
<400> 18
Met Glu Thr Asp Thr Leu Ile Leu Leu Val Pro Gly Ser Thr Gly
1 5 10 15
<210> 19
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变的信号序列, 突变6
<400> 19
Met Glu Thr Asp Thr Leu Ile Leu Val Pro Gly Ser Thr Gly
1 5 10
<210> 20
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变的信号序列, 突变7
<400> 20
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Val Pro Gly Ser Thr Gly
1 5 10
<210> 21
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自信号肽序列的n区
<400> 21
Met Glu Thr Asp
1
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自信号肽序列的h区
<400> 22
Thr Leu Ile Leu Trp Val Leu Leu Leu Val
1 5 10
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自信号肽序列的c区
<400> 23
Pro Gly Ser Thr Gly
1 5

Claims (31)

1.载体的试剂盒，其包含：
(i)第一载体，其包含编码第一标志物组分的核酸序列；和
(ii)第二载体，其包含编码第二标志物组分的核酸序列，
其中，当用所述第一和第二载体两者转导细胞时，所述细胞表达所述第一和第二标志物组分并且它们缔合形成由细胞分选试剂识别的异多聚体标志物，
而当用单独的所述第一或第二载体转导细胞时，所述细胞分选试剂不识别单独的所述第一或第二标志物组分的表达。
2.根据权利要求1的试剂盒，其中所述第一标志物组分在不与所述第二标志物组分缔合时是不稳定的，并且所述细胞分选试剂识别所述第一标志物组分。
3.根据权利要求1或2的试剂盒，其中所述第一和第二标志物组分两者在未缔合时都是不稳定的，并且所述细胞分选试剂识别所述第一或第二标志物组分。
4.根据权利要求1至3中任一项的试剂盒，其中所述第一标志物组分是膜结合的，并且在不存在所述第一标志物组分的情况下，所述第二标志物组分被分泌，且所述细胞分选试剂识别所述第二标志物组分。
5.根据前述权利要求中任一项的试剂盒，其中一个标志物组分包含Kappa恒定结构域，而另一个标志物组分包含来自IgG1的CH1结构域。
6.根据权利要求1至4中任一项的试剂盒，其中一个标志物组分包含CD79a胞外域，而另一个标志物组分包含CD79b胞外域。
7.根据权利要求1的试剂盒，其包含第三载体，所述第三载体包含编码第三标志物组分的核酸序列，
其中，当用所述第一、第二和第三载体转导细胞时，所述细胞表达所述第一、第二和第三标志物组分并且它们缔合形成由细胞分选试剂识别的异多聚体标志物；
而当用所述第一、第二或第三载体中的一个或两个转导细胞时，所述细胞分选试剂不识别所述第一、第二或第三标志物组分中的一个或两个的表达。
8.根据权利要求7的试剂盒，其中所述第一、第二和/或第三标志物组分在不作为所述异多聚体标志物缔合时是不稳定的。
9.根据权利要求8的试剂盒，其中所述第一标志物组分是膜结合的；在不存在所述第一标志物组分的情况下，所述第二标志物组分被分泌；除非还表达了所述第一和第二标志物组分，否则所述第三标志物组分被分泌；并且其中所述细胞分选试剂识别所述第三标志物组分。
10.根据权利要求9的试剂盒，其中所述第一标志物组分包含膜结合的CD79a胞外域，并且所述第二标志物包含来自IgG1的CH1结构域和CD79a胞外域，并且所述第三标志物包含Kappa恒定结构域。
11.根据前述权利要求中任一项的载体的试剂盒，其中所述载体中的至少一个进一步包含编码嵌合抗原受体的核酸序列。
12.根据前述权利要求中任一项的试剂盒，其中一种标志物组分在所述细胞中的表达水平不同于另一种标志物组分在所述细胞中的表达水平。
13.根据权利要求12的试剂盒，其中编码所述两种标志物组分的载体包含不同的信号序列。
14.细胞表面异多聚体标志物，其用于检测经转导的细胞群体，其中所述异多聚体标志物包含至少两种标志物组分，所述第一标志物组分由第一载体中的核酸序列编码，并且所述第二标志物组分由第二载体中的核酸序列编码，其中所述第一标志物和第二标志物组分缔合。
15.根据权利要求14的异多聚体标志物，其中所述第一标志物和/或第二标志物组分在未缔合时是不稳定的。
16.根据权利要求14的异多聚体标志物，其中所述第二标志物组分在不存在所述第一标志物组分的情况下由所述细胞分泌。
17.细胞，其包含根据权利要求14至16中任一项的异多聚体标志物。
18.用根据权利要求1至13中任一项的载体的试剂盒转导的细胞。
19.根据权利要求17或18的细胞，其是免疫细胞。
20.根据权利要求19的细胞，其是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
21.用于制备根据权利要求17至20中任一项的细胞的方法，其包括用根据权利要求1至13中任一项的载体的试剂盒转导或转染细胞的步骤。
22.用于制备根据权利要求17至20中任一项的细胞的组合物的方法，其包括以下步骤：
(i)用根据权利要求1至13中任一项的载体的试剂盒转导或转染细胞样品；
(ii)使用细胞分选试剂检测所述异多聚体标志物的表达；和
(iii)选择或分选经检测的细胞以制备表达所述异多聚体标志物的细胞的组合物。
23.根据权利要求22的方法，其中所述细胞分选试剂是可溶性重组蛋白，并且在步骤(iii)中使用识别所述可溶性重组蛋白的基质选择或分选所述细胞。
24.根据权利要求22的方法，其中所述细胞分选试剂是荧光标记的可溶性重组蛋白，并且在步骤(iii)中通过流式细胞术选择或分选所述细胞。
25.根据权利要求22的方法，其中所述细胞分选试剂是附着于珠子的可溶性重组蛋白，并且在步骤(iii)中通过从经转导/转染的细胞样品中分离所述珠子来选择或分选所述细胞。
26.药物组合物，其包含多个根据权利要求17至20中任一项的细胞。
27.根据权利要求26的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。
28.用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括将根据权利要求26的药物组合物施用于受试者的步骤。
29.根据权利要求28的方法，其包括以下步骤：
I.从受试者中分离含细胞的样品，
II.用根据权利要求1至13中任一项的载体的试剂盒转导或转染所述含细胞的样品，
III.使用细胞分选试剂检测所述异多聚体标志物的表达，从而从所述样品中鉴定经转导/转染的细胞群体，
IV.选择或分选(III)的细胞群体以获得经转导/转染的细胞的纯化亚群，以及
V.将表达所述异多聚体标志物的(IV)的亚群施用于所述受试者。
30.根据权利要求26的药物组合物在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
31.根据权利要求30的药物组合物的用途或根据权利要求28或29的方法，其中所述疾病是癌症。
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