BR112020008227A2

BR112020008227A2 - formulações de tratamento de semente microbiana endofítica e métodos relacionados às mesmas para desempenho de planta aprimorado

Info

Publication number: BR112020008227A2
Application number: BR112020008227-9A
Authority: BR
Inventors: Gary Harman; Andrea Shelley Marino; Molly Cadle-Davidson
Original assignee: Advanced Biological Marketing, Inc.
Priority date: 2017-10-25
Filing date: 2018-10-25
Publication date: 2020-10-27
Also published as: WO2019084324A8; US11477952B2; WO2019084324A1; US20190174692A1; CA3084716A1; MX2020004521A

Abstract

  Esta invenção descreve a constatação e o desenvolvimento de um sistema biológico de promoção de crescimento de planta e aprimoramento ambiental por sequestro de carbono e/ou utilização de nitrogênio por aplicação de um agente microbiano, por exemplo, uma cepa altamente eficaz de T. viride, particularmente cepas NRRL B-50520 e/ou K5. Essa cepa tem melhor desempenho que as melhores cepas atuais de Trichoderma usadas para esse propósito comercialmente disponíveis. Também é esperado que os produtos altamente ativos também aumentam a produtividade de planta e aprimorem a qualidade de frutas, vegetais, flores ou outros produtos vegetais. A invenção também descreve e demonstra que combinações de cepa incluindo Bacillus amiloliquifaciens AS2 ou AS3, assim como metabólitos revelados, promovem crescimento de planta. Isso é verdadeiro em relação a monocotiledôneas e dicotiledôneas, tratamentos de semente e aspersões foliares. No campo, a altura de planta, o peso de broto, peso de raiz e fotossíntese (leituras de medição de Spad) foram todos aumentados em comparação com o controle não tratado, assim como os tratamentos biológicos de semente líderes. A invenção também descreve a utilização de metabólito para intensificar o crescimento de planta.

Description

“FORMULAÇÕES DE TRATAMENTO DE SEMENTE MICROBIANA ENDOFÍTICA E MÉTODOS RELACIONADOS ÀS MESMAS PARA DESEMPENHO DE PLANTA APRIMORADO”

[0001] Este pedido inclui material que é submetido à proteção de direitos autorais. O proprietário dos direitos autorais não se opõe à reprodução por fac-símile, por qualquer pessoa, da revelação da patente, visto que aparece nos arquivos ou registros do Escritório de Patente e Marca Registrada, de outro modo, no entanto, reserva todos os direitos autorais.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0002] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisório de nº de Série U.S. 62/576.684, depositado em 25 de outubro de 2017, intitulado “Improving Plant Performance with Endophytic Microbial Seed Treatment Formulations: Making Better Holobionts” que se encontra aqui incorporado a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos.

DECLARAÇÃO RELACIONADA À PESQUISA OU AO DESENVOLVIMENTO FEDERALMENTE PATROCINADOS

[0003] Inexistente. REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA, TABELA OU LISTAGEM DE

PROGRAMA DE COMPUTADOR

[0004] Não Aplicável

CAMPO DA TÉCNICA

[0005] A presente invenção se refere, de modo geral, à constatação, ao desenvolvimento e modificação proveitosa de sistemas vegetais, que conferem promoção de crescimento de planta por uma variedade de mecanismos usando múltiplas modalidades, enquanto suporta estabilidade ambiental por sequestro de carbono.

ANTECEDENTES DA REVELAÇÃO

[0006] A seguinte descrição é fornecida para auxiliar o entendimento da leitura. Não se admite que nenhuma das informações fornecidas ou referências citadas seja técnica anterior.

[0007] O bioma de raiz de planta é um sistema interativo complexo que inclui micróbios associados à raiz, micróbios associados ao solo, a raiz de planta e outros organismos. Alguns micróbios, como Trichoderma spp., tem sido conhecidos e sugeridos por décadas como agentes para o controle de micróbios patogênicos vegetais (Weindling, 1932, Weindling and Fawcett, 1936). Desde então, o entendimento e o uso desses fungos, e outros, têm sido o teor amplo e evolutivo do conhecimento (Harman, 2000, Harman, 2011, Harman, Howell, et al., 2004). Originalmente, como sugerido por autores como Weindling, esperava-se que as capacidades de biocontrole desses organismos ocorressem como uma consequência de micoparasitismo, antibiose (Weindling, 1932, Weindling e Emerson, 1936, Weindling and Fawcett, 1936) e, simplesmente, competição. Avanços significativos incluíram a constatação das capacidades de cepas muito específicas de serem competentes na rizosfera, isto é, de serem capazes de colonizar, persistir e crescer com raízes para fornecer benefícios a longo prazo (Ahmad, 1987, Sivan and Harman, 1991). Além disso, algumas cepas mostraram penetrar e se tornarem estabelecidas assintomaticamente em células corticais de raiz. Essas cepas induziram a planta a emparedar e limitar o organismo às primeiras poucas camadas de células de raiz (Yedidia, Benhamou, et al., 1999). Isso foi acompanhado pela sinalização à planta para fornecer resistência sistêmica induzida por meio de um mecanismo tipo preparação (Yedidia, Benhamou, et al., 2000, Yedidia, Shoresh, et al., 2003). A sinalização de MAPK foi necessária para o efeito sistêmico (Shoresh, Gal-on, et al., 2006). A capacidade de certas cepas selecionadas se tornarem estabelecidas internamente em raízes, crescerem com raízes e induzirem alterações sistêmicas na planta são aqui definidas como competência endofítica e rizosférica. Essa capacidade está associada à indução de grandes alterações no gene vegetal e expressão de proteína, com as maiores alterações ocorrendo nas partes acima do solo das plantas, embora as cepas competentes estejam localizadas apenas nas raízes (Shoresh and Harman, 2008).

SUMÁRIO

[0008] Os estudos em campo e estufa foram conduzidos com cepas de

Trichoderma competentes em rozosfera endofíticas ou um de seus metabólitos, 1- octen-3-ol, que foram aplicados como tratamentos de semente ao milho. Em alguns casos, os mesmos foram coaplicados com uma cepa de Bacillus amiloliquifaciens e/ou materiais adjuvantes. As cepas de Trichoderma, como exemplificado por T. afroharzianum cepa K2, demonstraram colonizar radículas de sementes de milho germinantes rapidamente. Todas as cepas colonizaram raízes de milho e soja endofiticamente, porém, foram restringidas às raízes e não colonizaram partes de planta acima do solo ou sementes. Em teste de campo ao longo dos anos, os tratamentos microbianos e biorracionais forneceram aumentos no crescimento de planta tanto de brotos quanto de raízes, e aumentaram os rendimentos de grão e silagem na maioria dos casos, porém, para a silagem, os rendimentos de híbridos comerciais desenvolvidos como silagem e grão de propósito duplo forneceram maiores respostas do que aqueles reproduzidos apenas para produção de grão. As práticas culturais, especialmente níveis de N, afetaram os rendimentos tanto de grão quanto de silagem. As raízes cultivadas a partir de sementes tratadas foram maiores e mais profundas do que aquelas de plantas de controle. A porcentagem de C, N e outros nutrientes em silagem colhida não foi alterada como uma consequência dos tratamentos de semente. Entretanto, os níveis totais a uma base por hectare foram substancialmente aumentados por até 12 T/C ha. É esperado que esse aumento em C reflita as capacidades fotossintéticas totais das plantas e represente o sequestro de C da atmosfera. N e outros nutrientes também aumentaram, porém, devem ter sido absorvidos do solo por raízes. Notavelmente, até mesmo quantidades muito pequenas do metabólito mais adjuvantes forneceram aprimoramentos pela duração da estação no crescimento e rendimento sugerindo alterações alongo prazo na fisiologia de planta e/ou as comunidades microbianas na rizosfera (tanto interna quanto externa). As plantas derivadas dos tratamentos de semente biológica ou biorracional são chamados de holobiontes intensificados e são propensos a terem efeitos significativos sobre o sequestro de C e sobre o material orgânico de solo embora não sejam diferentes geneticamente das plantas produzidas de sementes sem os tratamentos.

[0009] O microbioma da maioria dos organismos é composto por uma montagem de espécies diferentes que formam uma unidade ecológica (https://en.wikipedia.org/wiki/Holobiont). Estas incluem plantas e suas comunidades microbianas associadas; a planta (ou os organismos) mais sua microflora associada é denominada de holobionte (Gopal e Gupta 2016). As interações complexas de comunidades microbianas com seu hospedeiro vegetal, ou o fitobioma (www.phytobiomes.org/roadmap), afetam a função e fisiologia do hospedeiro. Entender as interações e seus efeitos é crítico para desenvolver sistemas previsíveis que solucionam desafios enfrentados por sociedades modernas como a fome e mudança climática (Blaser et al. 2016). A composição e fisiologia genética de raiz e planta, o meio ambiente e suas comunidades microbianas e genéticas afetam a absorção de nutrientes, a eficácia de uso de água, tolerância a uma variedade de fatores de estresse e são diretamente responsáveis por muitos traços limitantes de rendimento (cf) (Adl 2016). Os micróbios que colonizam internamente podem ter efeitos patogênicos, simbióticos ou neutros sobre as plantas. Ademais, esses organismos podem ser parte da microflora natural de plantas, ou podem ser introduzidos com a intenção de alterar o desempenho da planta.

[0010] Inúmeros organismos diversos adotaram um estilo de vida simbiótico com raízes de planta e podem contribuir notavelmente para o crescimento e desempenho de planta. Os exemplos incluem Rhizobiaceae de fixação de nitrogênio, rizobactérias de promoção de crescimento de planta (PGPR), fungos Basidiomyeteous em sebiacales como Piriformaspora indica, micorrizas e cepas específicas de Ascomycetous Trichoderma spp (Harman et al. 2004b; Shoresh et al. 2010). Alguns desses são restritos às associações com plantas específicas, como o Rhizobiaceae, enquanto outros como Trichoderma e PGPR são mais generalizados. Todos esses organismos diversos parecem ter capacidades para intensificar o crescimento e desempenho de plantas incluindo respostas fisiológicas e fenotípicas qualitativamente similares; foram feitas comparações das vantagens do crescimento de planta qualitativamente similar fornecido por Trichoderma spp., Piriformaspora indica e PGPR incluem crescimento de broto e raiz aumentado, resistência sistêmica a doenças, crescimento de raiz acidental intensificado, eficácia de uso e absorção de nutriente intensificadas e resistência intensificada ao estresse oxidante (Shoresh et al. 2010) Essas alterações fenotípicas são associadas a inúmeras alterações em expressão genética vegetal (Djonovic et al. 2006; Marra et al. 2006; Mastouri et al. 2012; Shoresh and Harman 2008b). As micorrizas também fornecem benefícios similares e modos de ação, consultar (Mo et al. 2016). Tanto micorrizas quanto as cepas de Trichoderma descritas no presente documento colonizam apenas sistemas de raiz, porém, induz alterações sistêmicas em gene vegetal e expressão de proteína, alterando, assim, a fisiologia da planta. As alterações de expressão genética em plantas pelos diversos organismos resultam em regulação crescente de trajetórias inteiras, como aquelas que governam níveis de redox de planta e atividade fotossintética (Han e Lee 2005; Kogel et al. 2003; Mastouri et al. 2012; Waller et al. 2005).

[0011] Portanto, é um objetivo da presente invenção fornecer uma formulação e método para criar respostas vegetais a esses diversos organismos mediadas por produção de metabólitos que interagem com plantas e dão origem a efeitos sistêmicos benéficos. Os organismos geneticamente diversos induzem tipos similares de alterações que são mediadas por metabólitos, e os mecanismos de indução são diferentes, visto que os metabolomas desses organismos diversos são bastante diferentes em diferentes grupos de micróbios. Por exemplo, com espécies de Bacillus no grupo de PGRP, a produção de lipopeptídeos como surfactina é crítica para a indução de resistência à doença sistêmica induzida (Cawoy et al. 2014), enquanto os metabólitos ativos produzidos por Trichoderma spp. são quimicamente diversos entre si e daqueles de outros micróbios como Bacillus spp. Os mesmos incluem compostos apolares voláteis, por exemplo, 6-pentil-α-pirona (6PP) e 1-octen-3-ol, compostos não voláteis como ácido heptelídico ou ácido coníngico; peptaibióticos e peptaibóis e hidrofobinas. Estes também induzem resistência sistêmica a doenças de planta (Lorito et al. 2010). Não apenas os compostos são bastante diferentes quimicamente, mas, os mesmos diferem quanto à sua localização. Por exemplo, alguns estão presentes em espaços superiores e, presumidamente, na forma volátil no solo, enquanto outros são solúveis em água, como ácido heptelídico ou ácido conínico, enquanto as hidrofobinas são parcialmente embutidas e parte da hifa de Trichoderma e paredes celulares e esporos (Feofilova 2010). A localização diferencial e estrutura química dos mesmos fornecem vias diferentes de percepções dentro de interações de planta- micróbio.

[0012] Os aprimoramentos no desempenho da planta, rendimento e resistência a estresses abióticos e bióticos são desejados. As alterações climáticas globais são propensas a aumentar as perturbações de padrões de clima terrestres, que limitarão a produção de cultura (Comitê sobre Geoengenharia Climática de 2015 (Committee on Geoengineering Climate 2015)). Essas alterações, juntamente com níveis crescentes do mar, desertificação e urbanização aumentada reduzirão as áreas de terra adequadas para o cultivo. Consequentemente, terras agrícolas crescentemente estressadas e reduzidas precisarão alimentar uma população humana crescente, com uma estimativa de 2 bilhões de pessoas a mais necessitando serem alimentadas até 2050 (https://www.census.gov/population/international/data/idb/worldpopgraph.php). Sugere-se que os suprimentos alimentícios disponíveis precisam ser dobrados, através de produtividade de planta intensificada ou uma ampla redução no desperdício alimentício (Adl 2016).

[0013] A modificação proposital do holobionte é potencialmente útil para intensificar a produtividade de planta e para superar os efeitos prejudiciais de estresses bióticos e abióticos. Para que suas vantagens sejam realizadas, estas modificações devem ser aplicáveis a sistemas agrícolas. Isso significa que devem ser facilmente aplicadas, confiáveis e relativamente não dispendiosas em comparação com outros insumos agrícolas. Assim, estudos precisam ser conduzidos no campo usando práticas agrícolas padrão.

[0014] O objetivo geral deste trabalho foi avaliar modificações propositais do holobionte de milho e seu impacto no desempenho de cultura. Os objetivos específicos do estudo relatado no presente documento foram os de avaliar tratamentos de semente com tratamentos de semente de milho biológicos ou biorracionais aplicados sobre pesticidas químicos padrão para alterar o holobionte de milho e avaliar: (1) o crescimento dos agentes microbianos em radículas que surgem de sementes tratadas, e localização subsequente desses agentes sobre e nas plantas e suas sementes; (2) avaliar esses tratamentos de semente com cepas altamente selecionadas por sua utilidade para aumentar o rendimento, sequestrar C e aprimorar a absorção de nutrientes no campo; e (3) avaliar as capacidades dos tratamentos de semente para intensificar o crescimento de raiz ao longo de uma estação inteira.

[0015] Consequentemente, há inúmeras aplicações da presente tecnologia, conforme a seguir: (i) alimentar um mundo faminto. Espera-se que a população mundial cresça a cerca de 9 bilhões de pessoas até 2050, de 7 bilhões atualmente, e os rendimentos de produtos de cultura principais precisarão aumentar para atender essa necessidade (Tailor, 2015). A pesquisa proposta descreve o potencial de uma alteração significativa no fitobioma de milho que tem potencial para aprimorar a capacidade fotossintética fundamental dessa cultura que resultará em aprimoramentos de rendimento significativos. Ademais, embora esse projeto seja primariamente direcionado ao grande agbio no mundo desenvolvido, a tecnologia básica é apropriada também para pequenos cultivadores nas nações emergentes; e (ii) solucionar níveis de gases do efeito estufa na atmosfera. Em 2010, houve um aumento líquido de cerca de 33 bilhões de toneladas de CO2 na atmosfera, que contribui para o aquecimento global. Recentemente, um grupo de líderes empresariais solicitou aumentos líquidos zero nesse gás na atmosfera.

[0016] A presente invenção fornece adicionalmente produtos e/ou tratamento de sementes aplicados por agricultor através de tratamento de semente ou companhias de semente, de modo que agricultores obtenham uma solução certa, em que a aplicação direta por agricultores e a aplicação variável quanto ao correspondente possam ser modificadas e/ou evitadas.

[0017] Para atingir este objetivo, não apenas as emissões precisam diminuir, mas métodos para remoção de CO2 precisam ser implementados. A pesquisa proposta contempla um sistema que pode remover até 91 t/ha de CO2 por meio de fotossíntese. As culturas anuais não foram consideradas como candidatas para sequestro e remoção desse gás da atmosfera, visto que a cultura é utilizada e o CO2 liberado novamente para a atmosfera. Entretanto, apenas cerca de 50% das culturas são tipicamente colhidas eventualmente, enquanto as raízes e outros tecidos subterrâneos são localizados no solo, em que se decompõem gradualmente e são convertidos em matéria orgânica no solo. A tecnologia proposta foi demonstrada para aumentar a biomassa de raiz (até dobrar) com plantas cultivadas a partir de sementes tratadas. Isso resulta no solo se tornando um reservatório de carbono sequestrado e também resulta em um aumento na matéria orgânica no solo, que resulta em solos mais produtivos com lavoura superior. Além disso, a tecnologia proposta aumenta as capacidades de plantas de milho para absorver nitrogênio, e isso pode resultar em diminuições de lixiviação de nitratos e nitritos na água do solo, e diminuições na liberação de óxido nitroso para a atmosfera. Os nitratos e nitritos são poluentes potentes de vias aquáticas e o óxido nitroso contribui para o aquecimento global. Assim, as alterações induzidas no milho podem torná-lo parte das soluções para o aquecimento global e a poluição da água em vez de ser parte dos problemas.

[0018] O sumário supracitado é apenas ilustrativo e não está destinado a ser limitativo de maneira alguma. Além dos aspectos ilustrativos, as modalidades e recursos descritos acima, aspectos adicionais, modalidades e recursos se tornarão evidentes por referência aos seguintes desenhos e à descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0019] Os objetivos, recursos e vantagens supracitados, entre outros, da revelação estarão evidentes a partir da seguinte descrição de modalidades como ilustrado nos desenhos anexos, em que caracteres de referência se referem às mesmas partes ao longo das várias vistas. Os desenhos não estão necessariamente em escala, em vez disso, é colocada ênfase mediante os princípios de ilustração da revelação:

[0020] A Figura 1 ilustra uma representação diagramática das interações entre cepas de Trichoderma e plantas endofíticas.

[0021] As Figuras 2A a 2B representam gráficos mostrando um aumento no rendimento de silagem (Figura 2A) ou grão (Figura 2B) em dois tipos de híbridos. Os dados mostrados são de dois híbridos de cada tipo e quatro tratamentos biológicos separados. Os dados de cada variedade x tratamento consistiram na média de quatro réplicas.

[0022] A Figura 3 representa a configuração de campo para testes, em que dois híbridos, de cinco que são esperados em cada teste, são mostrados, com representativos de cada classe importante (grão vs uso duplo; tipo de espiga determinado e indeterminado) são incluídos. N1 a N4 representam níveis diferentes de N que serão aplicados primariamente em V4 a V6 para fornecer uma faixa entre 100 e 400 kg/ha, incluindo o fertilizante de partida que será usado.

[0023] A Figura 4 representa um gráfico mostrando relações entre variedades, nível de N e rendimento, sugerindo que, em baixos níveis de N, a presença de Trichoderma aumentará os rendimentos. Os dados de níveis de N padrão são mostrados, como a consequência de vigor aprimorado em altos níveis de N.

[0024] A Figura 5A mostra plantas cultivadas de plantas tratadas sem nada (esquerda) e com K5 (direita).

[0025] A Figura 5B mostra plantas cultivadas do teste de campo de sementes tratadas com K5+MJ (esquerda), SABREX (intermediário) e sem nada (direita).

[0026] A Figura 5C mostra espigas em desenvolvimento de sementes tratadas sem nada (esquerda) e com K5 (direita).

[0027] A Figura 6 representa um gráfico que mostra plotagens de caixas e linhas para leituras de medição SPAD no teste de campo de milho comparando K5 com SABREX SA e o controle não tratado. Embora a distribuição de dados para K5 seja ampla, esse tratamento é significativamente melhor que o controle como mostrado na Tabela 1.

[0028] A Figura 7A representa um gráfico que mostra plotagens de caixas e linhas para peso de broto de não tratado (esquerda), K5-MJ (intermediário) e SABREX SA (direita).

[0029] A Figura 7B representa um gráfico que mostra plotagens de caixas e linhas para altura de planta de não tratado (esquerda), K5-MJ (intermediário) e SABREX SA (direita).

[0030] A Figura 8 representa plântulas de trigo de testes de estufa de aspersões foliares. O K5 na esquerda e não tratado (apenas água) na direita mostra aumento de crescimento significativo com aplicação foliar de cepa K5.

[0031] A Figura 9 representa um gráfico mostrando volume de raiz de soja de estufa com um controle (esquerda) e K5 (direita).

[0032] A Figura 10 representa um gráfico mostrando peso de raiz de soja de estufa com um controle (esquerda) e K5 (direita).

[0033] A Figura 11 representa um gráfico que mostra medição de SPAD de soja de estufa com um controle (esquerda) e K5 (direita).

[0034] A Figura 12 representa um gráfico que mostra comprimento de tronco de soja de estufa com um controle (esquerda) e K5 (direita).

[0035] A Figura 13A representa um fotomicrográfico de um radícula emergente de milho de sementes tratadas com conídio de cepa K2, manchado com Calcofluor e visualizado com microscopia epifluorescente.

[0036] A Figura 13B representa uma imagem em tons de cinza (usada para intensificar o contraste) de uma raiz 72 horas após a embebição.

[0037] As Figuras 14A a 14D representam rendimentos de grão e silagem de teste de campo no milho em 2014 (Híbrido A91-92R) e 2015 (os outros cinco híbridos) e estimam o C e N total em biomassa na colheita.

[0038] As Figuras 15A a 15C representam rendimentos e aumentos de rendimento de três cultivares de milho do teste de campo em Wisconsin na presença de três tratamentos de semente biológicos diferentes, mais um controle e ao longo de quatro taxas de fertilizante de nitrogênio. Cada valor é a média de quatro réplicas e as barras no conjunto da esquerda de gráficos representam desvios-padrão.

[0039] As Figuras 16A a 16C representam dados lineares para rendimentos e aumentos de rendimento de três cultivares de milho do teste de campo em Wisconsin na presença de três tratamentos de semente biológicos diferentes, mais um controle e ao longo de quatro taxas de fertilizante de nitrogênio.

[0040] A Figura 17A representa uma fotografia da aparência do solo acima e raízes de híbrido 6490 do teste de campo para o qual os dados são mostrados nas Figuras 14A a 14D.

[0041] A Figura 17B representa a aparência de milho e espigas do milho em Illinois na seca de 2012. As plantas na fileira na esquerda foram cultivadas com sementes tratadas com uma mistura de fungicida-inseticida comercial com a mesma mistura de fungicida mais SABREX.

[0042] A Figura 17C representa uma fotografia da aparência de raízes de híbrido 6490 do teste de campo para o qual os dados são mostrados nas Figuras 14A a 14D.

[0043] A Figura 18 representa os comprimentos e pesos frescos de raízes de híbrido 5343 cujas sementes foram tratadas com os tratamentos mostrados e cultivadas em canos de PVC 20 cm de diâmetro x 214 cm de comprimento preenchido com solo de campo com fertilidade e água adequadas. Houve 3 ou 4 réplicas por tratamento; as barras mostradas refletem desvios-padrão, e letras em caixa baixa indicam significância estatística em P=0,10.

[0044] A Figura 19 representa a aparência de raízes individuais que foram parte das medições na Figura 18. O comprimento total da fotografia é 289 cm; algumas raízes nos tubos alcançaram e excederam o comprimento do tubo

[0045] A Figura 20 representa observações únicas de raízes em teste de campo lidando com gerenciamento de milho. O milho de híbrido 6538 foi cultivado no campo após os tratamentos de semente sem tratamento biológico (C), SABREX (S), K5As2 (K5As2) sem adjuvantes, e OMEGA (O).

[0046] As Figuras 21A a 21D representam dados laboratoriais demonstrando capacidades intensificadas de tomates cultivados na presença de cepas da presente invenção na ausência de estresse ou sob condições de déficit de água (umidade do solo mantida a 60 a 70% de saturação). São mostradas leituras de SPAD de Clorofila e eficácia fotossintética.

[0047] A Figura 22 representa plantas cultivadas no campo na presença e ausência de Trichoderma, e compara o controle (esquerda), tratamento com os produtos de SABREX (intermediário) e os tratamentos da formulação da presente invenção (direita). Descrição Detalhada das Modalidades Preferenciais

[0048] Na seguinte descrição detalhada, é feita referência aos desenhos anexos, que formam uma parte do presente documento. Nos desenhos, símbolos similares tipicamente identificam componentes similares, exceto se o contexto indicar de outro modo. As modalidades ilustrativas descritas na descrição detalhada, desenhos e reivindicações não se destinam a ser limitantes. Outras modalidades podem ser utilizadas, e outras alterações podem ser realizadas, sem que se afaste do espírito ou escopo da matéria aqui apresentada. Será prontamente entendido que os aspectos da presente revelação, como geralmente descrito no presente documento, e ilustrado nas Figuras, podem ser dispostos, substituídos, combinados, separados e desenhados em uma ampla variedade de diferentes configurações, todas as quais são explicitamente contempladas no presente documento.

[0049] Na prática da presente invenção, muitas técnicas convencionais em biologia molecular, bioquímica de proteína, biologia celular, imunologia, microbiologia e DNA recombinante são usadas. Essas técnicas são bem conhecidas e são explicadas, por exemplo, em Current Protocols in Molecular Biology, volumes I a III, Ausubel, Ed. (1997); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York (1989)); DNA Cloning: A Practical Approach, volumes I e II, Glover, Ed. (1985); Oligonuchotide Synthesis, Gait, Ed. (1984); Nucleic Acid Hybridization, Hames & Higgins, Eds. (1985); Transcription and Translation, Hames & Higgins, Eds. (1984); Animal Cell Culture, Freshney, Ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning; a série, Meth. Enzymol., (Academic Press, Inc., 1984); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Miller & Calos, Eds. (Cold Spring Harbor Laboratory, Nova York (1987)); e Meth. Enzymol., volumes 154 e 155, Wu & Grossman e Wu, Eds., respectivamente. Os métodos para detectar e medir níveis de produtos de expressão genética de polipeptídeo (isto é, nível de tradução de gene) são bem conhecidos na técnica e incluem o uso de métodos de detecção de polipeptídeo como técnicas de detecção e quantificação de anticorpo. (Consultar ainda, Strachan & Read, Human Molecular Genetics, segunda edição. (John Wiley e Sons, Inc., Nova York (1999).)

[0050] Salvo se definido de outro modo, todos os termos científicos e técnicos usados na presente invenção geralmente têm o mesmo significado conforme comumente compreendido pelo indivíduo versado na técnica à qual a esta invenção pertence. Como usado neste relatório específico e nas reivindicações anexas, as formas no singular “um”, “uma” e “o/a” incluem referências no plural, salvo se o conteúdo indicar claramente de outro modo. Por exemplo, a referência a “uma célula” inclui uma combinação de duas ou mais células e similares. Geralmente, a nomenclatura usada no presente documento e os procedimentos laboratoriais em cultura celular, genética molecular, química orgânica, química analítica e química de ácido nucleico e hibridização descritos abaixo são aqueles bem conhecidos e comumente empregados na técnica. Todas as referências citadas no presente documento são incorporadas no presente documento a título de referência em suas totalidades e para todos os propósitos à mesma extensão em que seriam se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse especifica e individualmente incorporado a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos.

[0051] Definições. As definições de certos termos conforme usados neste relatório descritivo são fornecidas abaixo. As definições de outros termos podem ser encontradas no Illustrated Dictionary of Immunology, 2 a edição (Cruse, J.M. e Lewis, R.E., Eds., Boca Raton, FL: CRC Press, 1995). Exceto se indicado de outro modo, o termo “biomarcador”, quando usado no presente documento, se refere ao biomarcador humano, por exemplo, uma proteína e gene humanos.

[0052] Como usado no presente documento, exceto se indicado de outro modo, as formas singulares “um”, “uma" e “o/a” incluem referência no plural. Assim, por exemplo, uma referência a “um organismo” ou “o organismo” inclui uma pluralidade dos mesmos.

[0053] Como usado no presente documento, o termo “cerca de” será entendido por pessoas de habilidade comum na técnica e irá variar até certo ponto, dependendo do contexto em que é usado. Se houver usos do termo que não são claros para pessoas de habilidade comum na técnica, considerando-se o contexto em que é usado, o termo “cerca de” em referência a valores quantitativos significará até mais ou menos 10% do valor enumerado.

[0054] Como usado no presente documento, o termo “composição” se refere a um produto com ingredientes especificados nas quantidades especificadas, assim como qualquer produto que resulta, direta ou indiretamente, da combinação dos ingredientes especificados nas quantidades especificadas.

[0055] Como usado no presente documento, o termo “nível de referência” se refere a um nível ou medição de uma substância ou variável que pode ser de interesse para propósitos comparativos. Em algumas modalidades, um nível de referência pode ser um teor de umidade especificado como uma média do teor de umidade tomado a partir de um indivíduo/planta de controle. Em outras modalidades, o nível de referência pode ser o nível no mesmo indivíduo/planta em um tempo diferente, por exemplo, um curso de tempo de administração ou aplicação de uma composição ou formulação particular.

[0056] Como usado no presente documento, os termos “produto”, “culturas”, “componente alimentício”, “componente de sistema”, “variável de aumento” ou “indivíduo” se referem a uma planta, fungo, colônia microbiana, mamífero, como um ser humano, mas, também pode ser outro animal como um animal doméstico, por exemplo, um cachorro, gato ou similares, um animal agrícola, por exemplo, uma vaca, uma ovelha, um porco, um cavalo ou similares, ou um animal de laboratório, por exemplo, um macaco, um rato, um camundongo, um coelho, um cobaia ou similares.

[0057] Como usado no presente documento, os termos “tratar” ou “tratamento” ou “alívio” se referem tanto a tratamento terapêutico e profilático quanto medições preventivas, em que o objetivo é prevenir ou retardar (reduzir) a doença alvejada, afecção ou distúrbio. Um indivíduo/planta é “tratado” de modo bem-sucedido para um distúrbio se, após receber intervenção/aplicação terapêutica de acordo com os métodos da presente invenção, o indivíduo/planta mostrar redução observável e/ou mensurável em ou ausência de uma ou mais doença, afecção ou distúrbio alvejado.

[0058] Como usado no presente documento, os termos “anfipático” ou “anfifílico” se destinam a fazer referência a qualquer material que é capaz de interações polares e não polares ou hidrofóbicas e hidrofílicas. Essas interações anfipáticas podem ocorrer ao mesmo tempo ou em resposta a estímulos externos em momentos diferentes. Por exemplo, quando é dito que um material específico, revestimento, um ligante, matriz ou suporte é “anfipático", isso significa que o revestimento pode ser hidrofóbico ou hidrofílico dependendo de variáveis externas, como, por exemplo, temperatura.

[0059] Como usado no presente documento, os termos “matriz” ou “suporte” ou “matriz de hidrogel” são usados de modo intercambiável, e englobam hidrogéis à base de polímero e não à base polímero, incluindo, por exemplo, hidrogéis à base de ácido poli(hialurônico), alginato poli(sódico), poli(etileno glicol), diacrilato, quitosano e álcool poli(vinílico). “Hidrogel” ou “gel” também se destina a fazer referência a todas as outras composições de hidrogel reveladas no presente documento incluindo hidrogéis que contêm polímeros, copolímeros, terpolímero e hidrogéis de políimero complexado, isto é, hidrogéis que contêm um, dois, três, quatro ou mais unidades constituintes monoméricas ou multiméricas. Os hidrogéis são tipicamente redes contínuas de polímeros hidrofílicos que absorvem água.

[0060] Como usado no presente documento, o termo “polímero” se refere a uma macromolécula produzida a partir de unidades monoméricas ou multiméricas de repetição. Os polímeros da presente revelação incluem, porém, sem limitações, polímeros de ácido poli(hialurônico), alginato poli(sódico), poli(etileno glicol) (PEG), ácido poli(lático), polímeros de ácido poli(glicólico), poli(lactídeo-coglicolídeos) (PLGA), poli(uretanos), poli(siloxanos) ou silicones, poli(etileno), poli(vinil pirrolidona), poli(2-hidroxi etil metacrilato), poli(N-vinil pirrolidona), poli(metil metacrilato), álcool poli(vinílico) (PVA), ácido poli(acrílico), acetato de poli(vinila), poliacrilamida, acetato de poli(etileno-covinila), ácido poli(metacrílico), ácido polilático (PLA), ácidos poliglicólicos (PGA), náilons, poliamidas, polianidridos, álcool poli(etileno-covinílico) (EVOH), policaprolactona, hidróxido polivinílico, óxido de poli(etileno) (PEO) e poliortoésteres ou um copolímero ou terpolímero formado a partir de pelo menos dois ou três membros dos grupos, respectivamente.

[0061] Como usado no presente documento, o termo “introduzir” se refere à incorporação de uma célula eucariota ou procariota ou componente da mesma à ou em uma planta ou cultura, em que a célula ou componente pode ser incorporado na formulação de interesse. O termo inclui tal meio de introdução de ácido nucleico como transfecção, transformação e transdução.

[0062] Os micróbios da presente invenção pertencem ao gênero fúngico Trichoderma em algumas modalidades, embora organismos adicionais sejam usados no conceito de Diversidade Microbiana Focalizada, como discutido adicionalmente no presente documento. Tais agentes são aplicados como sementes tratadas com os esporos vivos em vários aspectos da presente invenção. E, embora esses fungos tenham sido identificados a cerca de 90 anos como tendo potencial na agricultura (Weindling, 1932, Weindling, 1934), apenas através da presente inovação a seleção de cepa e desenvolvimento de tecnologia permitiram a aplicação bem-sucedida e eficácia inesperada. Mais d 10.000 cepas foram examinadas, por exemplo, T. virens cepa 41, T. harzianum cepas T22, número de acesso de ATCC de cepa PTA 9707 e 9708, cepa de T. atroviride número de acesso PTA 9709, algumas das quais são empregadas como ingredientes ativos de vários aspectos da tecnologia em várias modalidades também, por exemplo, como caixa de plantador (PB) aplicada por agricultor, e para tratadores de semente comercial como um alto concentrado (HC) seco e como um produto líquido (LQ). A especificidade de cepa é um componente integral da presente tecnologia pelo menos até o ponto em que não pode ser presumido que, visto que uma cepa, por exemplo, de T. harzianum é eficaz, outra cepa será. De fato, esses fungos são muito comuns no solo, e a quantidade total de cepas selvagens no solo provavelmente irá superar os números das cepas aplicadas como tratamentos de semente por 10.000x ou mais.

[0063] As cepas da presente invenção são exclusivas e eficazes. Em certas modalidades, um exame primário é realizado para averiguar a capacidade das cepas para colonizar raízes e se estabelecer endofiticamente no córtex de raiz. Quando aplicadas às sementes e as sementes são plantadas, as cepas crescem muito rapidamente na radícula emergente da maioria das sementes—nas primeiras 48 a 72 horas, suas populações podem aumentar em até 10.000 vezes. Adicionalmente, logo em seguida, as capilaridades de raiz se tornam colonizadas (consultar as Figuras 13A a 13B). As hifas são restringidas ao cortex, porém, são capazes, então, de crescer com e colonizar a raiz inteira, fornecendo benefícios pela duração da estação. Essa capacidade de cepas muito altamente selecionadas de serem endofiticamente e rizóficamente competentes é de importância fundamental, não compartilhada pela maioria das cepas. Isso permite que as mesmas se tornem totalmente integradas à planta e funcionem como simbiontes vegetais verdadeiros (Harman, 2000, Harman, 2011, Harman, Howell, et al., 2004, Shoresh, Mastouri, et al., 2010).

[0064] A Figura 1 mostra uma representação diagramática das interações entre cepas de Trichoderma e plantas endofíticas. Os fungos (representados pela caixa e o termo micróbios benéficos) colonizam as raízes, e são restringidos às células corticais. As cepas usadas neste estudo continuam a proliferar na planta e, como mostrado, induzem efeitos ao longo da estação (Harman et al. 2004; Shoresh et al. 2010). Esses fungos produzem uma variedade de metabólitos que podem simular o efeito dos organismos e esses, hipoteticamente se ligam aos receptores nas células vegetais. Um de tal metabólito é 1-octen-3-ol usado na presente invenção. Como uma consequência, as plantas respondem com inúmeras alterações na expressão genética vegetal (Djonovic et al. 2006; Marra et al. 2006; Mastouri et al. 2012; Shoresh and Harman 2008). Isso resulta em alterações substanciais na fisiologia de planta e desempenho, incluindo biomassa aumentada tanto de brotos quanto de raízes, eficácia fotossintética intensificada (consultar ainda (Doni et al. 2017; Vargas et al. 2009)), resistência a doenças (Djonovic et al. 2006; Shoresh et al. 2010), resistência a estresses abióticos como seca, sal (Guler et al. 2016; Mastouri et al. 2012), e inundações (a presente revelação), eficácia aumentada de uso de nitrogênio (Guler et al. 2016; Harman and Mastouri 2010) e a presente revelação, e níveis intensificados de antioxidante no produto.

[0065] As capacidades simbióticas são realizadas pela habilidade dos fungos contidos na raiz de estabelecer comunicação química com a planta, e de transmitir tal sinal sistematicamente, fornecendo alterações por toda a planta (Shoresh, Gal-on, et al., 2006, Shoresh, Mastouri, et al., 2010). Essas alterações sistêmicas resultam em alterações na expressão genética vegetal; centenas de genes são regulados de modo crescente (Shoresh and Harman, 2008). Isso inclui regulação crescente coordenada de trajetórias inteiras, e não apenas intensificação de expressão de gene ou proteína aleatória. Isso resulta em plantas que (a) têm resistência intensificada a doenças, (b)

resistência notavelmente intensificada a estresses abióticos como seca, sal, inundações e outros, (c) raízes maiores e mais profundas, (d) habilidades aumentadas para utilizar nitrogênio e outros fertilizantes, e intensificação de germinação de semente (Harman, Cadle-Davidson, et al., 2015, Mastouri, Bjorkman, et al., 2010, Shoresh, Mastouri, et al., 2010). Isso é mostrado diagramaticamente no micrográfico de elétron acima a partir de (Yedidia, Benhamou, et al., 1999). Todos esses benefícios são de energia intensiva, e não são possíveis sem capacidade fotossintética aprimorada da planta (Shoresh and Harman, 2008).

[0066] Os conceitos subjacentes à indução de resistência ao estresse em plantas são exclusivos. As plantas sofrem de acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS) como uma consequência de estresse, como seca, sal, temperatura ou inundações e como um subproduto de superexcitação de sistemas fotossintéticos. Assim, o ambiente interno de plantas frequentemente contém um equilíbrio de redox desfavorável. Os presentes organismos benéficos induzem alterações na expressão genética vegetal incluindo regulação crescente de trajetórias inteiras. Dentre essas trajetórias que são intensificadas estão aquelas que minimizam o acúmulo de ROS prejudiciais. Na presença dos presentes organismos, as plantas têm um ambiente de redox interno otimizado (OIRE) que fornece muitos benefícios. A indução das trajetórias de planta levando ao OIRE na presença de estresse parece ser um sistema preparado induzível, assim como a resistência às doenças (Harman, Cadle-Davidson, et al., 2015). Além disso, várias linhas de evidência indicam que o maquinário fotossintético total em plantas é intensificado (Shoresh and Harman, 2008, Vargas, Mandawe, et al., 2009). A própria fotossíntese dá origem a ROS como um subproduto de superexcitação de pigmentos fotossintéticos e, portanto, também resulta em ROS. Essa interação complexa é facilitada pelas combinações de cepas na presente revelação para regular de modo ascendente toda a trajetória de controle de redox levando ao OIRE, que é importante para o controle de estresses abióticos e para fornecer fotossintato adicional para o crescimento de planta.

[0067] Com milho, em centenas de testes, promoção e intensificação de crescimento de planta, aprimoramento de tamanho de raiz e quase sempre há uma melhora de estresses abióticos como seca. Em alguns casos, mas não sempre, esse crescimento de planta aumentado é traduzido em rendimentos de planta aumentados, rendimento de biomassa (silagem) e/ou grão, embora pareça ser uma tradução menos ou mais eficaz dependendo da variedade. As cepas anteriormente desenvolvidas de T. harzianum (T22) pelos presentes inventores foram analisadas usando teste de campo extensivo com T22 em milho, e constatou-se que os rendimentos e crescimento aumentados de T22 na maioria dos genótipos de milho, em que cerca de 20% dos genótipos não tiveram aumento no rendimento. Testes de campo adicionais nessas cepas, e diferentes combinações de cepas, foram usados para diferentes culturas, com T. harzianum cepa K2 (PTA ATCC 9708) e T. atroviride cepa K4 (PTA ATCC 9707). Consultar, por exemplo, Patentes n os U.S. 8.716.001 e 8.887.480. Contemplação de terras e instalações para grandes testes adicionais contemplados. Os mesmos também têm acesso às capacidades de detecção remota que são necessárias. Esses fornecedores proporcionarão os dados transregionais necessários para o sucesso da presente invenção, e permitirão acesso imediato aos seus sistemas agrícolas de precisão que permitirão a implementação rápida das tais composições e métodos.

[0068] Em alguns aspectos da presente invenção, os produtos e cepas biológicos colonizam raízes através de suas associações endofíticas e as alterações na expressão genética. O resultado é uma planta que pode regular de modo crescente mais de 100 genes específicos. Esses genes regulados de modo crescente não são aleatórios, mas, são organizados de modo coordenado em trajetórias de planta específicas. O resultado é uma planta não modificada geneticamente que, no entanto, funciona de modo muito diferente das plantas sem os agentes microbianos. As plantas assim produzidas são basicamente plantas inovadoras que diferem consideravelmente da mesma variedade sem o organismo. De modo similar, o milho e muitas outras culturas respondem de modo confiável à colonização de raiz por cepas de Trichoderma conhecidas para fornecer os seguintes resultados confiáveis e reproduzíveis.

[0069] O crescimento e verdor de folha intensificados em plantas jovens (para milho, isso é tipicamente os estágios de crescimento (V4 a V6), com aumentos associados no crescimento de raiz. Por exemplo, em GH15 e teste de campo de GH 15, cinco variedades diferentes foram avaliadas e o aumento médio no crescimento inicial foi de cerca de 12%, que, com uma exceção, foram estatisticamente significativos em P=0,01 com o tratamento de semente comercial SabrEx LQ™ (SABREX. LQ) comercializado junto à Advanced Biological Marketing. Essas diferenças de altura de planta são visíveis no campo e frequentemente associadas ao verdor de folha aumentado (Harman, 2000). Isso ocorre embora o tratamento biológico seja aplicado sobre combinações padrão de fungicida-inseticida.

[0070] Resistência consistente e confiável aos estresses abióticos como seca, inundações e sal. A recuperação de inundações foi demonstrada no teste de campo de GH15, em que uma variedade foi localizada em uma parte baixa do campo e, em uma primavera muito úmida, as plântulas emergiram e, então, foram submersas por cerca de três semanas, após as quais tiveram boas condições de crescimento. O crescimento inicial durante o estágio submerso foi muito insatisfatório, porém, após as condições serem aprimoradas, as plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com SabrEx™ (SABREX) se recuperaram e cresceram com vigor maior. O rendimento de grão das plantas não tratadas com tais produtos foi de cerca de 9,5 t/ha, porém, na presença de SABREX, o rendimento foi de 13 t/ha, que foi 36% melhor, enquanto o crescimento de planta foi intensificado ainda mais, e as plantas foram 85% maiores. Estes aprimoramentos foram atribuíveis à recuperação de inundações e também devido à habilidade intrínseca das cepas para intensificar o crescimento e desempenho de planta.

[0071] Os efeitos da variedade de milho respondem com crescimento aprimorado, melhor resistência ao estresse e capacidade fotossintética intensificada, porém, a tradução dos benefícios é dependente do genótipo de milho. Os presentes resultados no teste de campo de GH15 indicam que o tipo de milho, independentemente de ser destinado como uma silagem de propósito duplo (biomassa total) ou estritamente para grão, afetaram fortemente os resultados. Isso é mostrado nas Figuras 2A a 2B. Os dados, que são de testes de campo replicados através de dois híbridos de cada tipo e quatro tratamentos biológicos separados, demonstram que a resposta de rendimento de silagem aos presentes tratamentos biológicos é pequena a inexistente nos híbridos de grão, porém, bastante grande em híbridos de propósito duplo.

[0072] Entretanto, os aprimoramentos nos rendimentos de grão foram similares com ambos os tipos de híbridos. Adicionalmente, em ambos os casos, como observado nas informações gerais acima, houve diferenças substanciais e significativas no crescimento vegetativo de todas as variedades cerca de 2 meses após a plantação, portanto, todas as linhagens responderam aos tratamentos biológicos. Por fim, deve ser enfatizado que os rendimentos com todas as linhagens foram consideravelmente bons com rendimentos de silagem de 50 a <70 t/ha e rendimentos de grão de 12 a <15 t/ha. Em todo caso, os tratamentos biológicos resultaram em aumentos de rendimento estatisticamente significativos em silagem e/ou grão. Claramente, os híbridos destinados a grão e como propósito duplo geralmente diferem na resposta aos agentes microbianos (Figuras 2A a 2B). Um componente importante destes parece estar no tipo de amido—as variedades de grão podem ter uma densidade volumétrica superior visto que contêm mais amido vítreo, enquanto as variedades de silagem têm uma densidade volumétrica inferior, que é reflexiva de um endospermas mais farináceo, em que os amidos são ligados de modo mais solto em uma matriz de cepa:proteína (Mahanna e Thomas, 2015).

[0073] Independentemente dos mecanismos, as diferenças na resposta demonstram que diferentes genótipos de milho fornecem diferenças na resposta de agente genético x microbiano, e essas podem ser imprevisíveis na ausência de dados empíricos. No caso observado acima, há a hipótese de que o fotossintato para carregamento de amido no grão seja diferente. Todas as variedades testadas responderam positivamente ao tratamento biológico, porém, o resultado final foi diferente. Os dados como estes são, de fato, muito importantes para agricultores e usuários de milho. Entretanto, quando se considera o potencial para sequestro de carbono na melhora de gás-estufa, então, a biomassa total se torna muito importante. Obviamente, os híbridos tipo propósito duplo serão mais eficazes na assimilação de carbono que as variedades de grão.

[0074] Os efeitos de fertilização de nitrogênio também são relevantes à presente invenção. O cultivo de milho exige altos níveis de nitrogênio para melhores rendimentos, de biomassa (silagem) ou de grão. A resposta de rendimento à fertilização de N foi modelada e, embora modelos específicos difiram, é evidente que há um aumento inicial de rendimento, visto que as taxas de N aumentam, porém, que, então, segue um nivelamento da resposta, que é designado o platô de rendimento e, acima do qual, ocorre pouca resposta de rendimento adicional (Cerrato e Blackmer, 1990). O nível do platô ocorre em aproximadamente 150 a 200 kg de N/ha. Entretanto, várias linhagens de evidência sugerem que o modelo não é adequado para descrever a relação entre N/rendimento na presença da planta alterada, que ocorre como uma consequência de colonização endofítica com os presentes organismos. Algumas destas linhagens de evidência são conforme a seguir. O platô de rendimento começa em um nível inferior (isto é, menos N é necessário para obter níveis de rendimento similares) (Harman, 2000).

[0075] Em uma modalidade da presente invenção, a absorção de nitrogênio facilitada por OIRE continua a aumentar à medida que os rendimentos aumentam. Não há evidência de que o milho na presença de N exige menos N para uma resposta de rendimento específica na presença dos presentes endófitos, e o aumento nos rendimentos que são frequentemente observados é acompanhado por uma absorção de N total superior. Nos testes de campo de GH14, a biomassa foi aumentada por 31% e N total, como medido por análises da biomassa, aumentaram para cerca de 760 vs 560 kg/ha, enquanto no teste de GH15, o maior aumento de rendimento de biomassa foi quase duplicado, e o N total foi cerca de 1.000 kg vs, novamente, 560 kg. Os altos valores são em excesso considerável do fertilizante de N aplicado, que sugere que as raízes de milho colonizadas por endófito são mais eficazes na obtenção de N que aquelas não tratadas. A razão pela qual o N continua a acumular e a acionar os rendimentos ainda mais é uma função da presença de maiores níveis de fotossintato e energia geral superior para a planta. Os maiores níveis de fotossintato fornecem o arcabouço de carbono em que os aminoácidos podem ser localizados. Obviamente, o maior volume e profundidade de penetração de raiz auxiliam nesse resultado. Independentemente, esses dados sugerem que o milho na presença das composições da presente invenção pode usar, efetivamente, mais N e converter o mesmo em biomassa, do que o milho não tratado. Esses dados, a respeito tanto do tipo de híbrido de milho quanto de utilização de N demonstram que o milho (e, por extensão, outras plantas) são dissimilares em respostas ao milho não colonizado. Isso é evidência adicional de que as plantas tratadas são plantas inovadoras e modelos inovadores para milho e seu uso precisa ser desenvolvido.

[0076] Tal evidência é adicionalmente sustentada por dados em tempo real sobre o desempenho da cultura à medida que se desenvolve. Nos testes de grande escala que são contemplados, as medições diretas no solo não são práticas. O uso de meios de observação conhecidos, como veículos aéreos sem tripulação (UAVs), podem ser usados para capturar dados de imagens de luz visível e Índice de Vegetação de Diferença Normalizada (NDVI). Essas estratégias se tornam rapidamente uma parte funcional da agricultura com previsões de rendimento à base de satélite e/ou UAV sendo fornecidas por várias companhias ao redor dos EUA (por exemplo, http://www.agrinetix.com/, http://www.precisiondrone.com/, http://www.ursula- agriculture.com/). Com base na refletância ao longo de múltiplos comprimentos de onda de infravermelho, essas alterações de medições de dados na fotossíntese que foram correlacionadas à seca, estresse de nitrogênio ou outras condições (Clay, Kim, et al., 2006, Osborne, Schepers, et al., 2002, Zaman-Allah, Vergara, et al., 2015). Além disso, de uso potencial no presente documento, é a medição de refletância na banda de verde visível, que se mostrou correlacionar mais especificamente ao estresse de nitrogênio (Clay, Kim, et al., 2006, Osborne, Schepers, et al., 2002). O Índice de Refletância de Nitrogênio (NRI) é uma comparação de quase infravermelho (NIR) e refletância de banda verde (Bausch e Duke, 1996); entretanto, obter os comprimentos de onda apropriados exige câmeras multiespectrais ou hiperespectrais que não são comumente disponíveis com serviços UAV agrícolas devido aos seus custos. Outra alternativa é LiDAR, que usa feixes de laser refletidos para medir a topografia e, após uma cultura ter crescido, para medir a altura de planta. Usando tais técnicas, dados de NRI de amostra são obtidos para determinar estresse/teor de nitrogênio de planta.

Usando esses métodos, os caráteres de crescimento de planta e condições de estresse podem ser monitorados em poucos minutos em vez das várias horas—ou até mesmo dias—que levaria para técnicos de campo no solo. Essa captura rápida de dados também reduz a variabilidade causada pela hora do dia, condições climáticas variáveis e outros fatores de confusão e, assim, aumenta a qualidade de dados para as análises de associação posteriores.

[0077] Para conduzir testes de campo compreensivos para determinar as interações complexas dos produtos microbianos da presente invenção para x tipos de híbridos de milho x níveis de fertilidade de nitrogênio são considerações atreladas à presente tecnologia. De modo similar, é contemplado o aprimoramento das capacidades de detecção remota para a previsão e validação de critérios de desempenho de milho. Tais testes serão conduzidos em campos de cultivo em várias localizações ao redor do país e consistirão em pelo menos cinco híbridos de milho comerciais diferentes adaptados ao clima e área em que os testes ocorrerem. Cada um destes receberá cinco níveis separados de fertilizante de nitrogênio, variando de cerca de 100 a 400 kg N/ha. Vários tratamentos e controles são realizados (o controle não tratado e todos os produtos biológicos já serão tratados com fungicidas e inseticidas padrão apropriados para a cultura e área).

[0078] Os exemplos de tratamentos conhecidos incluem tratamento de semente com SABREX LQ, que é um produto atualmente comercializado, e que contém T. afroharzianum cepa K2 e T. atroviride cepa K4 em uma formulação líquida em 1 x 109 unidades de formação de colônia por ml. Este produto será usado a uma taxa de 0,7 ml/kg de sementes, que é a taxa comercialmente recomendada. K5As2. As sementes serão tratadas com essa mistura nas taxas conforme indicado acima, exceto pelo fato de que B. amiloiquifaciens pode ser usado na taxa de 1 x 1010 unidades de formação de colônia por ml. O tratamento de semente OMEGA™, comercializado junto à Advanced Biological Marketing (OMEGA) também será usado. Esse material contém, como o ingrediente ativo, um metabólito de Trichoderma que é fortemente ativo na promoção de crescimento de planta e indução de resistência a doença de planta. Esse material, em experimentos anteriores, foi ativo em concentrações muito baixas (menos de 1 µl/semente) e teve atividade que persistiu em plântulas por pelo menos dois meses após a plantação. O agente não microbiano também conterá um componente de humato e uma substância nutritiva de planta. Esse material confere muitas das vantagens dos presentes organismos vivos e isso foi constatado como parte dos presentes estudos aprofundados sobre mecanismos. Esse produto parece ser vantajoso quando os clientes desejam usar uma formulação biologicamente incompatível, mas, ainda tem as vantagens dos agentes microbianos. O controle não tratado, porém, que incluirá misturas padrão de standard fungicida/inseticida, como será o caso para todos os tratamentos. Os testes são conduzidos no campo com cada representante de tratamento x consistindo em pelo menos 12 fileiras de sementes tratadas. Um exemplo da configuração de campo é fornecido na Figura 3, em que dois híbridos, de cinco que são esperados em cada teste, são mostrados, com representativos de cada classe importante (grão vs uso duplo; tipo de espiga determinado e indeterminado) são incluídos. N1 a N4 representam níveis diferentes de N que serão aplicados primariamente em V4 a V6 para fornecer uma faixa entre 100 e 400 kg/ha, incluindo o fertilizante de partida que será usado.

[0079] Esses testes foram estabelecidos, em 2 localizações geográficas e os seguintes dados foram coletados em uma localização: análise de solo, altura de planta, densidade de erguimento, diâmetro de tronco, teor de nitrogênio no talo e perfil de expressão genética vegetal.

[0080] Para essa coleta de dados, tanto quanto possível é obtido através de obtenção remota usando NVDI ou, preferencialmente, imageamento LIDAR ou multiespectral. Esses sistemas remotos removem muito da exigência para amostragem de solo real. Entretanto, a amostragem de folha, como indicado, é conduzida também, e as medições de diâmetro de tronco também são conduzidas por meio de amostragem de solo. Adicionalmente, espera-se que possa haver problemas ambientais que surgem, como surtos de doença, seca ou outros fatores. Esses podem ser detectados inicialmente por meio de detecção remota, porém, então, a verdade sobre o solo deverá ser determinada por observações reais por equipe treinada.

[0081] Além dessas análises, também são medidos rendimentos finais tanto de biomassa (silagem) quanto rendimento de grão. Para estes dois últimos tipos de dados, as plotagens serão colhidas por máquina que inclui telemetria e monitores de rendimento. Espera-se que estas forneçam pseudorréplicas através de diferentes localizações específicas no campo e evitem a necessidade de colheita manual. Uma vez que as amostras de silagem e grão forem obtidas, sua qualidade é avaliada. Isso inclui análises de teor de C, N, quantidade de proteína, níveis de proteína, amido e carboidratos digeríveis e não estruturais, lignina e análises elementares tanto de grão quanto de silagem. Os dados e análises preditivas são realizados em quatro réplicas separadas para cada parâmetro medido. Os dados foram analisados para determinar diferenças usando o pacote estatístico R (A Plataforma de Fundamento de R para Computação Estatística). Uma grande quantidade de informações sobre o desempenho de cultura que definirão o desempenho das plantas de milho que irão diferir de sistemas existentes esperados tipicamente. Esses são como mostrado abaixo.

[0082] A relação de rendimento tanto de rendimentos de grão quanto de silagem através de variedades e níveis de N diferentes é mostrada na Figura 4. As expectativas são que esses sejam diferentes de linhagens não tratadas e são exibidas. Os dados indicando que híbridos diferentes terão um desempenho diferente foram obtidos e níveis superiores de fotossintato são contemplados, o que se traduz em rendimentos aumentados se o N não for limitante. Entretanto, é apenas através de curvas de resposta à dosagem de N na presença ou ausência de Trichoderma e através de diferentes tipos de milho que as relações reais podem ser averiguadas. As análises de regressão com base em dados através de níveis de N são análises-padrão e estas são realizadas (Cerrato e Blackmer, 1990).

[0083] Estas análises fornecem informações sobre as relações e são confirmadas através de múltiplos anos e regiões geográficas e climáticas. Ganhar habilidades de prever desempenho da planta primariamente com base na detecção remota dados também é um aspecto da presente invenção. Por exemplo, a validação dos presentes modelos para sequestro de C é proporcional aos rendimentos de biomassa. Isso é validado usando medições de NVDI além de, se necessário, LIDAR, que mede alturas de planta. Os valores obtidos a partir das medições de detecção remota podem ser correlacionados com rendimentos de planta conforme medido a partir de medições de silagem (biomassa total acima do solo). Ademais, é possível ser capaz de prever, para tipo de milho através de aplicações de N, qual rendimento final é propenso a ser a partir da medição em V4 a V6, que é, então, empregado como uma recomendação prescritiva para rendimentos em níveis específicos.

[0084] Os dados discutidos acima e obtidos como detalhado adicionalmente no presente documento fornecem refinamento de ambos os tipos de detecção remota e modelos previsíveis de rendimento, se necessário. Tais sistemas são usados como previsão de rendimentos de acordo com entradas e para validação de sequestro de C para uso em qualquer sistema que é desenvolvido para remoção de gases do efeito estufa, uma modalidade preferencial da presente invenção.

[0085] Nos sistemas descritos no presente documento, os rendimentos de cultura são aumentados e, portanto, satisfazem desafios de uma população mundial crescente, e para atenuar a mudança climática global. A adoção de métodos, sistemas e programas para a implementação mundial imediata pela comunidade agrícola também é contemplada. Para alcançar isso, os testes de campo são conduzidos em várias localizações geográficas para a validação.

[0086] Os aspectos da presente invenção fornecem vantagens com base em métodos e produtos que exploram mecanismo microbianos vantajosos. Embora outras tecnologias tenham abordagens de curso envolvendo pontuações de avaliação de micróbios ao longo de centenas de testes e, então, usar abordagens estatísticas para a constatação e, então, o desenvolvimento de produtos com base em micróbios eficazes, a presente invenção inclui o desenvolvimento de combinações de cepas compreendendo seus mecanismos de ação, desenvolvendo tecnologias capacitantes (por exemplo, formulações eficazes), e têm examinação preditiva de campo em testes laboratoriais extensivos. Os testes de campo são usados para confirmar resultados, e, se necessário, retornar ao trabalho de desenvolvimento no laboratório e o campo para curar efeitos negativos. Isso é acompanhado pelo sequenciamento completo de cepas e identificação de metabólitos ativos e é buscada a ligação de metabólitos e genes microbianos específicos a funções específicas e alterações na expressão genética em plantas. De tal modo, os presentes métodos são eficientes e eficazes, e é o único sistema possível fornecendo o crescimento de planta aumentado e a estabilidade, enquanto aprimora o ambiente. O desenvolvimento evolucionário das presentes tecnologias também fornecem a modelagem preditiva com base na detecção remota.

[0087] Deslocamento de Carbono - As previsões atuais para deslocamentos de carbono por tonelada de CO2 sequestrado variam de $7 a $170 entre agora e 2050. Essas estimativas são baseadas na extrapolação da experiência do Esquema de Troca de Emissão da União Europeia (European Union Emission Trading Scheme (EU ETS)) que estabeleceu um mercado de carbono funcional com um sistema de troca e limitação de emissões de grande escala. Entre abril de 2005 e abril de 2006, o preço à vista tem média em aproximadamente £22 por tonelada de deslocamento de carbono. Esses preços têm premissa na suposição de que as indústrias e fontes que emitem CO2 podem trocar suas emissões por deslocamentos de carbono que reduzem emissões equivalentes em outro local. Os desafios do sistema incluíram o fato de que a redução nas emissões são difíceis de se verificar e que as reduções de deslocamento na emissão teriam ocorrido de qualquer modo (reduzindo, assim, o valor dos deslocamentos). Novas propostas para sistemas de Limitação e Troca estão foram discutidos antes da reunião de Copenhagen em Copenhagen 2009.

[0088] Os métodos de sequestro de carbono da presente invenção são imunes a ambas estas dificuldades. Primeiramente, o carbono sequestrado é fisicamente disponível para análise e pode ser documentado sem qualquer ambiguidade. Em segundo lugar, nenhuma parte da biomassa teria sido criada de outro modo. O propósito do esquema é inteiramente para criar biomassa adicional de recursos abundantes sem deslocar outras atividades alimentícias de geração de biomassa ou fixação de carbono 60 (e sem criar novas fontes de emissão de CO2, por exemplo, através da queima de combustível fóssil para gerar a potência necessária para operar o sistema). A intensidade de carbono de OTEC tradicional já é inferior àquela da potência hidroelétrica.

[0089] Com base nessas vantagens, os métodos do presente documento se qualificam para as classificações de deslocamento de carbono de mais alta qualidade e podem assegurar as recompensas máximas disponíveis através de pagamentos diretos. Alternativamente, a receita pode ser gerada a partir da biomassa gerada juntamente com o CaCO3, tornando o sistema independente do mercado de deslocamento de carbono.

[0090] A presente invenção se refere, entre outros, à constatação e ao desenvolvimento de um sistema biológico de promoção de crescimento de planta por aplicação de uma cepa altamente eficaz de T. viride. Essa cepa tem melhor desempenho que as melhores cepas atuais de Trichoderma usadas para esse propósito comercialmente disponíveis. A mesma pode ser usada em agricultura convencional ou orgânica para a promoção de crescimento de planta e aumento nos rendimentos de cultura quando aplicada topicamente como uma aspersão foliar ou como um revestimento de semente. A mesma consiste em uma cepa biologicamente ativa de Trichoderma viride.

[0091] O bioma de raiz de planta é um sistema interativo complexo que inclui micróbios associados à raiz, micróbios associados ao solo, a raiz de planta e outros organismos. Alguns micróbios, como Trichoderma spp., tem sido conhecidos e sugeridos por décadas como agentes para o controle de micróbios patogênicos vegetais (Weindling, 1932, Weindling and Fawcett, 1936). Desde então, o entendimento e o uso desses fungos, e outros, têm sido o teor amplo e evolutivo do conhecimento (Harman, 2000, Harman, 2011, Harman, Howell, et al., 2004). Originalmente, como sugerido por autores como Weindling, esperava-se que as capacidades de biocontrole desses organismos ocorressem como uma consequência de micoparasitismo, antibiose (Weindling, 1932, Weindling e Emerson, 1936, Weindling and Fawcett, 1936) e, simplesmente, competição. Avanços significativos incluíram a constatação das capacidades de cepas muito específicas de serem competentes na rizosfera, isto é, de serem capazes de colonizar, persistir e crescer com raízes para fornecer benefícios a longo prazo (Ahmad, 1987, Sivan and Harman, 1991). Além disso, algumas cepas mostraram penetrar e se tornarem estabelecidas assintomaticamente em células corticais de raiz. Essas cepas induziram a planta a emparedar e limitar o organismo às primeiras poucas camadas de células de raiz (Yedidia, Benhamou, et al., 1999). Isso foi acompanhado pela sinalização à planta para fornecer resistência sistêmica induzida por meio de um mecanismo tipo preparação (Yedidia, Benhamou, et al., 2000, Yedidia, Shoresh, et al., 2003). A sinalização de MAPK foi necessária para o efeito sistêmico (Shoresh, Gal-on, et al., 2006). A capacidade de certas cepas selecionadas se tornarem estabelecidas internamente em raízes, crescerem com raízes e induzirem alterações sistêmicas na planta são aqui definidas como competência endofítica e rizosférica. Essa capacidade está associada à indução de grandes alterações no gene vegetal e expressão de proteína, com as maiores alterações ocorrendo nas partes acima do solo das plantas, embora as cepas competentes sejam localizadas apenas nas raízes (Shoresh and Harman, 2008).

[0092] Estes micro-organismos endofíticos, com frequência, são totalmente simbióticos com plantas (Harman, Howell, et al., 2004). Estes simbióticos endofíticos têm habilidades para induzir múltiplos efeitos benéficos em plantas, incluindo resistência induzida às doenças e potencialmente outras pragas; resistência aos estresses abióticos como seca, sal e inundações; eficiência aprimorada de usos de nitrogênio e outros nutrientes vegetais; intensificação de germinação de semente e vigor de plântula; e crescimento e desenvolvimento de planta intensificados. Há inúmeros gêneros diversos de micróbios que induzem pelo menos a maioria destas alterações no desempenho da planta, incluindo micorrizas, rizobactérias de promoção de crescimento de planta, e fungos Basidomycetous nos Sebaciles como Piriformaspora indica. Esses organismos têm estilo de vida endofítico versus um patogênico de planta (Shoresh, Mastouri, et al., 2010) tipico de outros inúmeros micro- organismos associados à planta. As alterações sistêmicas na expressão genética vegetal são presumidos como sendo induzidos pela produção dos metabólitos de acionamento específico desses organismos diferentes. Esses metabólitos devem ser diferentes desses organismos diversos, visto que os organismo eficazes têm uma relação muito distante e alguns são até mesmo em reinos diferentes, portanto, é improvável que as mesmas trajetórias específicas de regulação crescente de expressão genética e mesmo se os genes de planta específicos regulados de modo crescente forem iguais. Inúmeros metabólitos microbianos que são fortemente ativos na alteração de fenótipos de planta em baixas concentrações (< 1 µmolar) foram identificados; por exemplo, lipopeptídeos de Bacillus spp. (Cawoy, Mariutto, et al., 2014, Debois, Fernandez, et al., 2015), e proteínas hidrofóbicas (Djonovic, Vargas, et al., 2007, Ruoccco, Lanzuise, et al., 2015) e metabólitos voláteis e não voláteis de Trichoderma spp. (Vinale, Sivasithamparam, et al., 2008). No presente trabalho preliminar, foi constatado que, em concentrações muito baixas, 1-octeno-3-ol (álcool de cogumelo), um metabólito de T. harzianum e outras espécies (Hung, 2014), intensifica fortemente o crescimento de planta e é altamente eficaz na indução de resistência à doença de planta.

[0093] Em uma modalidade adicional, uma coleção de sessenta e oito Bacillus spp. isolados de partes de planta ou raízes foram examinados quanto às suas habilidades para induzir qualitativamente as mesmas respostas positivas em plantas que as presentes cepas selecionadas de Trichoderma induzem. Suas habilidades foram avaliadas para induzir aumentos no crescimento de planta e para conferir doença e resistência ao estresse. A cepa As2 de troncos de alfalfa foi uma cepa de desempenho forte. Entretanto, como observado acima, Bacillus spp. não pode produzir os mesmos metabólitos ou afetar plantas por meio dos mesmos mecanismos. Por essa razão, uma modalidade da presente invenção utiliza cepas combinadas de Trichoderma com As2. Além disso, formulações à base de humato são incluídas para eficácia máxima e fornecem desempenho superior ao produto comercial atual, SABREX. Isso forneceu as formulações usadas no teste de GH15, apresentadas no presente documento, que foram consideradas altamente eficazes.

[0094] Um componente prático da presente invenção foi avaliar o produto comercial atual, SABREX (composto por cepas K2 e K4), e para desenvolver produtos de tratamentos de semente que aprimoraram as capacidades deste produto. O desenvolvimento da cepa ou misturas de metabólitos usadas neste estudo foi baseado no conceito de Diversidade Microbiana Focalizada (FMD). FMD tem os seguintes componentes: (1) cada uma das cepas microbianas individualmente são rizosféricas e endofiticamente competentes. Além disso, (2) é esperado que os metabólitos sejam os gatilhos específicos de alterações na expressão genética vegetal, de modo que o conceito de FMD também inclua os compostos de gatilho. Em tal definição, a FMD exige metabólitos que fornecem benefícios por um período de meses (para metabólitos) ou pelo menos uma estação (micróbios) e cepas ou metabólitos que são eficazes quando adicionados como tratamentos de semente nos níveis de cerca de 70 mg/ha (micróbios) ou em menos de 1 µl/semente (metabólitos). As cepas eficazes, metabólitos eficazes ou misturas eficazes dos dois são, então, combinadas em tratamentos únicos que se espera que forneçam melhores resultados que qualquer um dos componentes usados sozinho. Visto que cada componente é fortemente capaz de colonizar raízes de planta e se tornar um componente integral e de longa duração da planta (micróbios) ou de ter efeitos a longo prazo (tanto micróbios quanto metabólitos) as alterações substanciais e benéficas no fitobioma de planta que levam aos benefícios a longo prazo no desempenho da planta são possíveis.

[0095] Inicialmente, estes organismos e metabólitos foram implicados na resistência intensificada às doenças de planta. Entretanto, as capacidades tanto de micróbios quanto de metabólitos mostraram recentemente que têm faixas de ação muito mais amplas. Por exemplo, a Trichoderma spp. demonstrou aprimorar o desempenho de semente e plântula de sementes envelhecidas e induzir resistência aos estresses como estresse de água e seca (Mastouri, Bjorkman, et al., 2010, Mastouri, Bjorkman, et al., 2012). Em ambos esses casos, o alívio desses estresses diversos se devem, em grande parte, à melhora dos efeitos tóxicos e negativos de espécies reativas de oxigênio (ROS) que se acumulam na planta sob estresse. Em plantas confrontadas por seca ou sal, os níveis de antioxidantes em plantas (ascorbato ou glutationa) foram inalterados, porém, a razão de formas reduzidas para oxidadas aumentou nas plantas cujas raízes foram colonizadas por T. harzianum, enquanto a razão diminuiu em plantas sob estresse sem conter o organismo. A razão mais alta foi quando tanto o estresse quando o fungo estavam presentes. Ademais, ambos os níveis de enzimas catalisando a ciclagem de formas oxidadas para reduzidas dos antioxidantes e expressão dos genes codificando as enzimas, todos aumentaram. Por fim, a presença do fungo reduziu os efeitos tóxicos de viologênio de metila, que induz fortemente a formação de ROS. Assim, os efeitos do fungo, em parte, atuam como um agente para otimizar os níveis de ROS em plantas.

[0096] Todos estes aprimoramentos no desempenho da planta observados no presente documento são de energia intensiva, e para micróbios específicos induzirem essas alterações, as plantas também devem ter eficácia fotossinética aprimorada (Shoresh and Harman, 2008). No suporte do conceito de um aprimoramento no nível basal de fotossíntese, estão os seguintes: há muitos relatos de verdor de folha intensificado como uma consequência de inoculação com agentes microbianos (consultar (Harman, 2000).Isso é evidenciado por resultados de expressão genética e/ou estudos proteômicos que demonstram que os elementos fotossintéticos estão entre aqueles superexpressados. Estes incluem proteína de complexo de evolução de oxigênio de rubisco e fotossistema II (Shoresh and Harman, 2008, Vargas, Mandawe, et al., 2009). Se a fotossíntese for intensificada, então, o recurso disponível, como amido, também deve ser aumentado e isso ocorre (Shoresh and Harman, 2008). Justificando as expectativas de que essas alterações afetem diretamente a fotossíntese de planta estava a demonstração de que uma cepa de T. virens resultou em um aumento de sequestro de carbono em milho mais que 60% (Vargas, Mandawe, et al., 2009).

[0097] Ademais, a fotossíntese e o maquinário fotossintético são altamente suscetíveis a danos por espécies reativas de oxigênio (ROS). Os estresses como seca, sal e inundações resultam no acúmulo de níveis de ROS que são altamente prejudiciais aos mesmos (Nath, Jajoo, et al., 2013). Até mesmo outras condições de crescimento, de outro modo ideais, luz em excesso de sua utilização na fotossíntese resulta na produção de ROS, incluindo o ânion superóxido, que são prejudiciais aos pigmentos, proteínas e lipídeos.

[0098] Portanto, os danos nos sistemas fotossintéticos ocorrem como uma consequência do acúmulo de ROS que pode ser induzidos por estresses ou até mesmo por condições, de outro modo, ideais em altos níveis de luz. Isso tem uma consequência séria, visto que a fotossíntese é, portanto, o fator limitante principal no crescimento de plantas. Infelizmente, a fotossíntese de melhor medição é de apenas cerca de 20% das taxas de conversão máximas teóricas (que são de 0,1 e 0,13 para plantas de C3 e C4) e isso não foi notavelmente aprimorado através de esforços de aprimoramento de planta. Assim, os rendimentos aumentaram sem aprimorar a taxa fotossintética, que é o fator limitante fundamental (Long, Marshall-Colon, et al., 2015). A taxa de aumento nos aprimoramentos de rendimento de culturas principais diminuiu nos últimos anos, em parte, devido ao fato de que outros insumos e aprimoramentos estão se tornando limitados pela falta de aprimoramento na eficácia fotossinética (Long, Marshall-Colon, et al., 2015).

[0099] O potencial de rendimento (YP) de plantas de cultura pode ser aproximado como o produto da radiação solar recebida sobre a unidade de terra em uma única estação de crescimento (Q), as eficiências da planta para interceptar a radiação (E1), conversão de energia de radiação em energia de biomassa (E2), e particionamento da biomassa nas partes passíveis de colheita das plantas (E3) (YP = Q∙E1∙E2∙E3) (Long, Marshall-Colon, et al., 2015).

[0100] Os desenvolvimentos modernos no aprimoramento de planta, como exemplificado por avanços na revolução verde, focaram primariamente em E1 e E3, enquanto E2, um traço não avaliado facilmente na maioria dos programas de reprodução, não foi alvejado. E1 é a proporção de luz disponível interceptada pelo erguimento de plantas e é atualmente cerca de 90%, enquanto E3 foi aprimorado pela seleção de variedades que convertem mais de sua biomassa em produto passível de colheita do que biomassa total. Para o trigo, os aprimoramentos em E3 foram alcançados por genótipos de seminanismo que reduziram a quantidade de biomassa alocada ao tronco em relação àquela incorporada no grão. Para o milho (maís), E3 foi intensificada limitando geneticamente o número de espigas por planta a um de um tamanho máximo predeterminado geneticamente, embora alguns genótipos tenham o potencial para produzir mais espigas/talo ou espigas maiores. As estratégias de desenvolvimento de E3 têm sido primariamente para fornecer os maiores rendimentos em plantas em que o fotossintato é o fator limitante primário. Para culturas em que a biomassa máxima é necessária, como cana de açúcar e milho para silagem, a necessidade de aprimoramento em E2 é particularmente importante. Adicionalmente, se E2 foi aprimorado, parte dos dogmas-padrão de reprodução vegetal—por exemplo, apenas uma espiga/talo de milho, estratégias de E3 podem ser menos desejáveis do que é o caso atualmente. Outras estratégias de E2 são mais comuns para milho de campo; as espigas podem ser determinadas (de tamanho fixo e uma espiga por talo) ou semiflexíveis ou flexíveis (espigas são capazes de aumentar de tamanho em resposta a recursos adicionais de planta, primariamente fotossintato).

[0101] Esses dados implicam ou indicam que tanto a resistência a estresse abiótico quanto eficácia fotossinética funcional intensificada podem ser aprimoradas em plantas de cultura através da manutenção de um potencial de redox otimizado em plantas. Isso pode ocorrer através da capacidade de cepas selecionadas de Trichoderma spp. para colonizar raízes e induzir alterações sistêmicas na expressão genética vegetal, especialmente nas trajetórias e enzimas envolvidas em ciclagem de antioxidante e desintoxicação de espécies reativas de oxigênio como o ânion superóxido. Isso exige a regulação crescente coordenada dos conjuntos genéticos inteiros envolvidos nessas reações.

[0102] Portanto, espera-se que a colonização de raiz por cepas selecionadas desses fungos tenha inúmeras vantagens no desempenho da planta, incluindo todas aquelas observadas anteriormente. Presume-se que a capacidade das cepas para melhorar ROS para níveis não tóxicos tenha inúmeros benefícios e seria esperado que estes resultem em desempenho da planta aprimorado e intensificação de rendimento no campo. Ademais, com base nas observações anteriores e em analogia com a resistência induzida por patógenos, hipoteticamente, a resistência aos estresses, como a seca, são propensas a envolverem eventos de preparação de gene; isto é, em que os genes são expressados mais rapidamente e em níveis superiores após um evento estressante. Esses genes são preparados para atividade, talvez através de modificações específicas de histona a genes específicos na cromatina (Jaskiewicz, Conrath, et al., 2011).

[0103] Adicionalmente, as capacidades desses organismos para aprimorar pelo menos a eficácia fotossinética de nível de campo (eficácia de fotossíntese funcional (FPE)) fornecem um maior reservatório de energia de biomassa (fotossintato) às plantas. A FPE é definida como a evitação de perda dos níveis já baixos de eficácia fotossinética devido aos níveis de ROS induzidos por estresses ou até mesmo alta intensidade de luz. Obviamente, pode ocorrer ainda, que não apenas a FPE possa ser obtida, mas também, a eficácia fotossinética total (TPE) pode ser aprimorada, como sugerido pela observação de que a presença de uma cepa de T. virens resultou em um aumento de 69% na taxa de fotossíntese no milho (Vargas, Crutcher, et al., 2010). Se os níveis aprimorados de energia de biomassa forem disponíveis através de FPE ou FTE induzida por fungos endofíticos, então, é possível que os rendimentos de culturas importantes podem ser notavelmente aprimorados. Entretanto, se os níveis de produtividade de planta forem limitados pelas estratégias de E3, isto é, correspondência de rendimentos aos níveis atualmente esperados de fotossintato, então, estratégias alternativas de E2 podem ser úteis, as quais não têm sido práticas até o momento. Claramente, a genética de plantas é importante em sua resposta aos micróbios simbióticos de planta, especialmente na determinação de respostas de rendimento de planta.

[0104] Todas estas estratégias e alternativas afetam positivamente o ambiente. Por exemplo, FPE ou FTE têm o potencial de aumentar o sequestro de carbono, e os organismos também intensificam a eficiência de uso de nitrogênio (NUE) e, assim, reduzem os gases do efeito estufa importantes, CO2 e NO. Além disso, uma NUE maior é propensa a reduzir a poluição da água de NO3 e NO2 de escoamento de campos fertilizados (Harman, 2011). Se este potencial estiver sendo realizado, então, uma maior incorporação total de C e N deve estar presente em biomassa colhida. Claramente, se níveis maiores de C ou N forem sequestrados ou incorporados em plantas de cultura, então, os mesmos não estão presentes na atmosfera ou vias aquáticas. O impacto de culturas anuais nestes fatores ambientais não foi seriamente considerado com culturas anuais, visto que C ou N sequestrados são rapidamente ciclados de volta para o ambiente como os produtos vegetais são colhidos e usados. Entretanto, isso não leva em consideração a biomassa em raízes, que é grande e aumentado pelo fitobioma alterado que resulta do uso destes organismos. O C e N contido na biomassa de raiz é lentamente degradado e os materiais orgânicos e incorporado em materiais orgânicos no solo. Assim, o solo se torna um reservatório de ambos estes elementos e, com sistemas de raiz maiores, material orgânico de solo e, portanto, lavoura de solo e produtividade, são intensificados.

[0105] Portanto, em uma modalidade do presente invenção, o sistema focaliza nos eventos precoces de colonização de semente e plântula de cepas de Trichoderma endofíticas selecionadas. As capacidades das mesmas cepas para alterar o crescimento de tomate, eficácia fotossinética e verdor de folha sob condições estressantes na estufa foram avaliadas como fornecido no presente documento. Para relatar resultados com milho para estresse de seca no campo e avaliar resultados de experimento de campo usando variedades de milho que diferem em suas capacidades para utilizar fotossintato para biomassa total ou peso de grão, os seguintes dados foram obtidos. As variedades de espiga determinantes que têm pouca ou nenhuma capacidade para aumentar o tamanho de espiga ou planta além de uma quantidade geneticamente limitada não aumentará rendimentos de grão tanto quanto as variedades que têm hábitos de planta e espiga indeterminados.

[0106] A FPE ou TPE intensificada aumentam o sequestro de CO2 em plantas cultivadas em campo em algumas modalidades, em que, visto que os fungos endofíticos aumentam desenvolvimento de raiz, muito deste carbono sequestrado será colocado sob o solo, em que não será repetidamente reliberado no ar. Adicionalmente, as habilidades aumentadas de plantas para utilizar de modo eficaz o nitrogênio resulta em mais nitrogênio incorporado na planta e menos que está disponível para poluir a água ou ar. Portanto, o C e N totais incorporados em milho cultivado em campo foram medidos. O rendimento e fotossíntese interagem fortemente com nitrogênio disponível para as plantas. O estudo também examinou a interação de variedades de milho diferentes com absorção de nitrogênio.

[0107] Os produtos altamente ativos da presente invenção também aumentam a produtividade de planta e aprimoram a qualidade de frutas, vegetais, flores ou outros produtos vegetais. Os agentes microbianos aplicados como tratamentos de semente ou outros métodos de aplicação mostraram aumentar o crescimento e desenvolvimento de planta. Em algumas modalidades, o mais eficaz desses organismos colonizam raízes de planta internamente e induzem alterações benéficas na expressão genética e que, portanto, geram alterações na fisiologia de planta. Essas alternações na fisiologia de planta incluem a regulação crescente coordenada de trajetórias bioquímicas inteiras em plantas. Essas alterações compreendem: crescimento de planta e promoção de rendimento confiável e consistente; crescimento e desenvolvimento de raiz intensificado resultante em sistemas de raiz maiores e mais profundos; resistência aprimorada a tais estresse abiótico incluindo bem pouca ou muita água, contaminação de sal e solo; eficiência de uso de fertilizante aumentada e especialmente fertilizante de eficiência de uso de nitrogênio; e níveis intensificados de antioxidante em produto.

[0108] Todos os efeitos observados acima exigem energia, e podem ocorrer apenas se a fotossíntese for intensificada. Em uma modalidade, agentes microbianos selecionados aprimoram de modo eficaz a fotossíntese. Os micro-organismos benéficos com as capacidades descritas acima, em algumas modalidades, foram e são usados comercialmente. O produto anterior pode implicar em misturas de um fungo no gênero Trichoderma e uma bactéria no gênero Bacillus, por exemplo, comercializada como QUICKROOTS™. Esse produto não aumenta rendimentos, porém, em inúmeros testes replicados foi relativamente inconsistente. Entretanto, as cepas de Trichoderma spp. podem ser combinadas (misturas de cepas específicas diferentes estão presentes nos produtos comercializados para diferentes culturas). Esses produtos fornecem as vantagens recém-enumeradas acima, em algumas modalidades, e fornecem aprimoramentos de rendimento consistentes de cerca de 8,5 alqueires de maís por acre. Em algumas modalidades, outras culturas fornecem resultados comparáveis e incluem soja, arroz, algodão, vegetais, alfalfa e outros legumes de forragem e grãos pequenos incluindo trigo.

[0109] A presente invenção, ademais, se refere à cepa Trichoderma virens NRRL B-50520, que foi isolada de um composto de esterco de galinha. Juntamente com outros dois fungos, esta foi selecionada por suas habilidades de produzir amônia e aminoácidos de penas de pássaro devido aos seus altos níveis de atividade de proteinase em certas modalidades. A amônia e os aminoácidos fornecem nitrogênio às plantas, enquanto as próprias penas são decompostas muito lentamente e não fornecem nutrientes imediatos para o crescimento de planta. Em outras modalidades da invenção reivindicada, a cepa 50520 é explorada para liberar nutrientes para o crescimento de planta.

[0110] Na presente invenção, o uso desta cepa é descrito como agente de promoção de crescimento de planta em modalidades adequadas. A mesma fornece vantagens superiores de crescimento de planta em comparação com a técnica anterior, incluindo SABREX, que está entre os produtos disponíveis mais eficazes para a promoção de crescimento de planta. Os presentes inventores constataram que o modo primário de ação da invenção reivindicada é por meio de tratamento de semente, com outras aplicações e modalidades demonstrando eficácia em relação às aplicações foliares em várias fontes vegetais, como, por exemplo, trigo. Visot que é eficaz como uma semente e como um tratamento foliar, há várias outras modalidades e aplicações que são eficazes, como, por exemplo, incluindo: aplicações como um grânulo em sulco; aplicação como um encharcamento de solo em que o organismo entrará em contato com as raízes e colonizar raízes; aplicação como um tratamento de raiz, por exemplo, durante operações de transplante; e como um componente de fertilizantes líquidos ou sólidos. Em muitas modalidades, o organismo entra em contato com raízes e estabelece uma relação benéfica com a planta levando à promoção de crescimento de planta.

[0111] De modo similar, a presente invenção também é altamente eficaz no controle de vários organismos prejudiciais incluindo bactérias patogênicas de planta, fungos e nematódeos. Os nematódeos contêm proteínas estruturais (colágenos) na superfície externa e em ovos. Em outro trabalho, as cepas de Trichoderma com altos níveis de enzimas eficazes que degradam proteínas como queratina (em penas) ou colágeno são eficazes no controle de nematódeos parasíticos de planta (Sharon, Bar- Eyal et al. 2001), inclui ovos e os próprios vermes. Assim, a presente invenção inclui reivindicações para controle tanto de nematódeo quanto de micro-organismos patogênicos de planta. Exemplos.

[0112] As presentes composições e métodos serão entendidos mais prontamente através da referência aos seguintes exemplos, que são fornecidos por meio de ilustração e não se destinam a ser limitantes de modo algum.

[0113] Materiais e métodos - Cepas microbianas. As cepas de Trichoderma usadas neste estudo incluíem T. virens cepa 41 (acesso de ATCC 20476; K1), T. harzianum cepa RR17Bc (acesso de ATCC PTA 9708; K2), T. harzianum F11Bab (acesso de ATCC PTA 9709; K3), T. atroviride cepa WW10TC4 (acesso de ATCC PTA 9707; K4), T. gamsii (anteriormente viride) cepa NRRL B50520 (K5) e cepa T22 (ATCC 20846). Todas as cepas, exceto 41 e B50520, foram preparadas usando o processo de fusão de protoplasto aqui descrito anteriormente (Stasz, Harman, et al., 1988). Doravante, essas cepas foram descritas como K1 a K5 e T22 e todas foram descritas anteriormente (Harman, 2014, Harman, Bjorkman, et al., 2008, Harman e Lei, Pending, Harman, Tailor, et al., 1989, Smith, Wilcox, et al., 1990). Todas estas cepas são usadas comercialmente, exceto pela K5. Também é usada uma cepa de Bacillus amiloliqifaciens isolada de troncos de alfalfa no Condado de Ontário, NY. Essa cepa também é fortemente competente em rizosfera e, como todas as cepas de Trichoderma usadas aqui, quando adicionada sozinha como tratamento de semente, aumenta fortemente o crescimento de planta em testes de estufa (dados não mostrados e resultados de campo com milho, especialmente sob condições estressantes; consultar experimentos de tomate). As cepas são endofítica e rizosfericamente competentes, com dados apresentados neste documento.

[0114] Quantificação e observações de colonização pós-plantação de plântula por cepas de Trichoderma - Sementes de milho de um híbrido comercial foram tratadas com as cepas fúngicas designadas com suspensões conidiais a 1 x 109 cfu/ml e usadas para tratar sementes na taxa de 0,9 ml/kg para cada organismo e germinadas em papéis de filtro esterilizados umedecidos. As amostras foram coletadas em 0, 24, 48 e 72 horas após a embebição com um cm de raiz sendo coletado onde possível e cortado em pedaços de um mm. O ponto no tempo de 0 hora foi coletado como uma lavagem de raiz e às 24 horas, o radical tinha emergido ou inchado drasticamente e esse tecido nascente foi colhido. Todas as amostras foram coletadas em 2,5% de Tween 80. O DNA total foi extraído usando o kit DNeasy Plant Mini 96 (Qiagen) em um instrumento QIAcubeHT. Reações de PCR quantitativas de dez microlitros foram configuradas usando o kit de PCR Rotor-gene SybrGreen (Qiagen) e iniciadores de 1 uM com base na região ITS de Trichoderma sp. (F: 5’-CGGATCTCTTGGTTCTGGCA- 3’; R: 5’-GGTTGAAATGACGCTCGGAC-3’). As condições de ciclagem foram conforme a seguir: 95 °C 15 min; 10 ciclos de aterragem de 95 °C 20 s, 65 °C 20 s diminuindo 1 °C a cada ciclo, 72 °C 20 s; 35 ciclos de PCR de 95 C° 10s, 55 °C 15 s, 72 °C 20 s; e finalizando com uma fusão de 70 °C a 95 °C aumentando 1 °C/etapa. A quantificação de DNA de Trichoderma foi alcançada incluindo uma série de diluição de DNA de Trichoderma em todos os ciclos de PCR para estabelecer uma curva- padrão. Um mínimo de três réplicas técnicas foram realizadas por amostra.

[0115] Efeitos das cepas K1 a K5 em tomates submetidos a estresse - Semente de tomate (Lycopersicum esculentum L.) cv. Supersweet 100 foram usados nesse estudo. As sementes foram plantadas em uma mistura de turfa-vermiculita (mistura Cornell) e um fertilizante foi usado para os experimentos envasados, que tinham as seguintes propriedades: pH 5,98, NO3-N 55,6 ppm, NH4-N 13,9 ppm, P 15,3 ppm, K 110 ppm , Ca 67,0 ppm , Mg 71,1 ppm, S 131 ppm, B 0,103 ppm, Fe 0,480 ppm, Mn 0,661 ppm, Cu 0,071 ppm.

[0116] As cepas de Trichoderma K1, K2, K3 e K4, assim como a combinação de K1 a K4 foram aplicadas à mistura como revestimento em grânulos de fertilizante orgânico. Os grânulos foram preparados através da adição de água suficiente ao pó de pena de galinha para produzir uma pasta fluida e, então, dissolvendo nessa pasta fluida em uma solução de gelatina (7% p/v). A pasta fluida resultante foi espalhada em uma chapa e seca ao ar, e o resultado foi uma chapa marrom plana. Esta, então, foi triturada e peneirada para fornecer partículas de cerca de 2 mm de diâmetro. Esses grânulos são compostos totalmente por proteína animal, de modo que o teor final de nitrogênio fosse 12 a 14%. A estes, foi adicionada uma pasta fluida contendo 10 6 unidades de formação de colônia (cfus) de cada cepa de Trichoderma ou a mistura de

K1 a K4, como suspensões líquidas de conídio em um volume para evitar a umectação óbvia dos grânulos. O objetivo foi obter um grânulo que teria nutrientes suficientes para o crescimento dos fungos de teste; exceto se os fungos se desenvolverem bem, os mesmos não podem colonizar raízes de planta. Foi constatado que a adição de dextrano de tapioca (Crystal-Tex, National Starch) funcionou bem (consultar a Figura 5A). Os grânulos revestidos ou não revestidos com as cepas fúngicas na presença do Crystal Tex foram adicionados à mistura de solo contida em vasos de plástico de diâmetro de 10 cm. Cinco sementes foram plantadas por vaso, e após o surgimento, as plantas foram reduzidas a três/vaso. Todas as plantas foram tratadas identicamente com regamento de estufa total por cinco semanas e, então, em um conjunto de três vasos por tratamento, o regamento foi reduzido para manter uma capacidade de água de solo de 60 a 70% de saturação (medido pela pesagem repetida de vasos), e em outro conjunto de três vasos, agendamentos de água normais foram mantidos, porém, com uma solução de 75 mM de NaCl. Isso fornece três blocos de três vasos (9 plantas) de plantas não estressadas, estressadas por água e estressadas por sal. As condições de estresse foram continuadas por 30 dias. As temperaturas foram mantidas a 20 °C a 25 °C.

[0117] Vários parâmetros foram medidos no final do período de estresse de 30 dias. Estes incluíram alturas de planta e teor de clorofila (na folha de ponta do 5o conjunto de folhetas) estimado usando um medidor de clorofila (SPAD-502, MINOLTA CO., LTD. JAPÃO). As estimativas de teor de clorofila com tais unidades parecem ser iguais àquelas obtidas usando índices de refletância espectral mais complexo e refletiva de índices de refletância espectral mais complexos com base em extrações (Casa, Castaldi, et al., 2015). Além disso, a eficácia fotossinética foi determinada usando cinética de fluorescência de clorofila usando um PEA prático (HansaTech) na folha mais jovem totalmente desenvolvida de planta por tomate. As folhas a serem testadas foram adaptadas ao escuro por 30 min usando os cortes de folha (Um experimento preliminar foi conduzido em plântulas de tomate para determinar o período mínimo necessário para adaptação escura; dados não mostrados). As determinações foram executadas três a cinco horas após o início do fotoperíodo.

Vários parâmetros fotossintéticos foram medidos: a fluorescência mínima (F0) e máxima (Fm) e o índice de desempenho (PI) são apresentados no presente documento visto que foram os mais bem sucedidos. Fv/Fm é uma medição da expressão do rendimento quântico mínimo de fotoquímica primária. O índice de desempenho é um parâmetro dividido para quantificar os efeitos de fatores ambientais em fotossíntese e que combina as três etapas funcionais principais ocorrendo em PSII (absorção de energia da luz, captura de energia de excitação e conversão de energia de excitação para transporte de elétron) (Strauss, Krueger, et al., 2006). PI foi gerado diretamente por software contido com o aparelho de HansaTech. Tanto Fv/Fm quanto PI foram amplamente usados como medidas diretas como uma medida de interações bióticas, abióticas ou genéticas afetando a fotossíntese (Christen, Schoenmann, et al., 2007, Ghotbi-Ravandi, Shahbazi, et al., 2014, Oukarroum, El Madidi, et al., 2007, Sheratmeti, Tripathi, et al., 2008).

[0118] Exemplo 1 – Colonização de sementes de milho germinantes por cepas de Trichoderma - Sementes de milho tratadas com esporos de cepas de Trichoderma K1 a K5 e germinadas em papel de filtro mostraram diferenças claras em temporização e vigor de germinação. O DNA total isolado de qualquer uma das lavagens de semente (sementes não germinadas) ou raízes de sementes germinadas foi usado para detecção de qPCR de Trichoderma ao longo do curso de tempo de germinação. Todas as cepas intensificaram a taxa de crescimento de Trichoderma em sementes germinantes. Em particular, as cepas presentes no tratamento de semente produto SABREX LQ para milho, K2 e K4, em pico por 24 horas após a embebição de 1.000 a 10.000 vezes de 0 hora após a embebição. Enquanto o estudo relatado aqui se estende para três dias após a embebição, os dados de qPCR sugere um pico precoce em biomassa seguido por um declínio para níveis muito similares por todas as cepas. Especula-se que isso pode ser devido ao sistema alcançando um ponto homostático em ou ao redor desse tempo em que a raiz de planta alcançou uma capacidade de transporte para suporte endossimbionte que é cepa independente.

[0119] Exemplo 2 – efeitos das cepas K1 a K5 em tomates submetidos a estresse - As condições de estresse de água e sal foram relativamente rigorosas, embora não letais e reduziu o crescimento de tomates substancialmente. As plantas na ausência das cepas de Trichoderma e estresse de água ou sal foram apenas 60 a 65% tão altas quanto àquelas cultivadas sem estresse. A presença das cepas de Trichoderma, que são confinadas às raízes, reduziu a redução de crescimento. Por exemplo, as plantas na presença da mistura de cepas K1 a K4 foram 35% mais altas que as plantas similares sem as cepas quando sob estresse de água, enquanto as plantas com os organismos sob estresse de sal foram 19% mais altas que aquelas com o estresse na ausência dos organismos. A maioria dos tratamentos microbianos proporcionaram um aumento na altura de planta sob estresse em relação ao controle estressado não tratado; entretanto, a cepa T22 mais velha foi muito similar ao controle. Na ausência de estresses, não houve diferença na altura de tomates tratados com os organismos.

[0120] Exemplo 3 – Vedor de folha (correlacionado ao teor de clorofila) em plantas na presença das cepas fúngicas variadas na ausência de estresse, Cepas K4 e a mistura de K1 a K4 foram mais verdes, enquanto aqueles com K2 e K3 foram inferiores e com T22 cerca do mesmo que as plantas de controle. Entretanto, na presença de estresse e os fungos benéficos, níveis de verdor de folha aumentados de modo marcado. As cepas K1, K2, K4, T22 e K1 a K4 proporcionou valores 40% superior ao controle não estressado não tratado, enquanto com K3, o nível de aumento tenha sido cerca de 20 a 25%. As medidas fotossintéticas com base em fluorescência de clorofila adaptada ao escuro nas mesmas plantas foram diferentes de acordo com as unidades medidas. Fv/Fm, que mede o rendimento máximo de fotossistema II (Ghotbi-Ravandi, Shahbazi, et al., 2014), foi intensificada pela presença de qualquer uma das cepas, independentemente da presença ou ausência de estresse. Esse parâmetro foi reduzido na presença de qualquer um dos estresses, porém, mesmo na presença de estresse, com qualquer uma das cepas microbianas, essa medida fotossintética aumentou a um alto nível consistente e não foi afetada por estresse.

[0121] Uma medida mais complexa de fotossíntese é o Índice de Desempenho (PI). Esse parâmetro integra o processo químico principal, incluindo a densidade de centros de reação, absorção e captura de energia de excitação e transferência de elétron além de plastoquinona (Christen, Schoenmann, et al., 2007, Lepedus, Brkic,

et al., 2012). Os valores de PI para plantas sem os fungos foram relativamente baixos e foram reduzidos ainda mais na presença de qualquer um dos estresses. Entretanto, na ausência de estresse, a presença dos fungos aumentou os níveis de PI, e na presença de estresse, os valores de PI foram muito superiores, por 80 a mais de 100%, em relação ao controle não estressado não tratado e ainda mais em relação aos controles estressados. Assim, essa medida complexa de função fotossintética geral foi intensificada e ativada pela combinação de estresse e os organismos, porém, reduzida quanto ao estresse na ausência dos micróbios.

[0122] Exemplo 4 – Cbservações de campo - Em Illinois, houve uma seca muito rigorosa, com falha de cultura generalizada. Nesse momento, algumas sementes de milho foram tratadas com K2 + K4 como o produto comercial SABREX™. As diferenças em suscetibilidade à seca foram óbvias na cultura madura, embora (a) as plantas tivessem aproximadamente 2 metros de altura e (b) as sementes tivessem sido tratadas vários meses antes que a seca se tornasse aguda. As diferenças foram obvias no crescimento de planta, no crescimento e desenvolvimento de espiga e no desenvolvimento de raiz. Essa observação de campo é consistente com as observações de estufa relatadas na seção anterior em tomate e em outro trabalho em tal planta (Mastouri, Bjorkman, et al., 2010, Mastouri, Bjorkman, et al., 2012).

[0123] Exemplo 5 – experimentos de campo de GH14 - testes de campo de várias formulações e misturas microbianas de tratamento de semente foram conduzidos. Esses testes registraram inúmeras variáveis. Primeiro, as alturas de planta foram medidas em dois momentos diferentes; em 5 de agosto, imediatamente antes da formação de borla, houve uma grande diferença (116 cm no controle vs cerca de 150 cm para o tratamento mais promotor), porém, no momento de colheita, não houve diferença (consultar a Tabela 1). A diferença é que o milho é geneticamente programado a cerca de uma certa altura, porém, o diâmetro de tronco e robustez geral da planta refletem essa vantagem de crescimento inicial. As raízes também são muito maiores e mais robustas com as cepas mais eficazes usadas como tratamentos de semente. Esse aumento na robustez de planta acima do solo resultou em um aumento de mais de 10 t/ha na biomassa total (silagem) no momento da colheita (logo após a segunda medição de altura de planta), ou apenas um pouco mais que um aumento de 30% na biomassa de planta (silagem). Entretanto, o aumento de rendimento de grão foi consideravelmente inferior, com cerca de um aumento de 24%.

[0124] As cepas mais eficazes foram T. viride cepa K5 mais Bacillus amiloliquefaciens na presença de um ácido húmico contendo adjuvante, K5 sozinho e T. harzianum cepa K2 mais a adição de ácido húmico. Estas proporcionaram aprimoramentos no rendimento em relação ao produto comercial SABREX, que é K2 mais T. atroviride cepa K4 (SABREX). Essas formulações de tratamento de semente também resultaram em uma redução em flagelo de folha de milho do norte (agente causal Exserohilum turcicum), porém, a ferrugem de milho (Puccinia sorghi) aumentou nas plantas cultivadas a partir das sementes tratadas.

[0125] Com base nos resultados relatados acima com o tomate, esperava-se que houvesse um aumento líquido na fotossíntese nos testes de milho. Portanto, foi medido o teor total de C da biomassa que foi colhida. Também esperava-se um aumento no nitrogênio incorporado e, portanto, o N total na biomassa foi medido. Nem as porcentagens de teor de C nem de N foram aumentadas; entretanto, houve um aumento no C e N total por hectare, visto que a biomassa aumentou notavelmente (Consultar a Tabela 2). Obviamente, a biomassa colhida foi apenas as porções acima do solo das plantas, e há uma quantidade muito significativa de biomassa de raízes subterrâneas. Portanto, estima-se a biomassa de planta total como 2× o nível colhido acima do solo. Ao fazer isto, foi constatado que havia até 4 toneladas de C/ha de aumento em relação ao controle e até 145 kg/ha de N adicional incorporado nas plantas que foram cultivadas a partir das sementes tratadas (Consultar a Tabela 2).

[0126] Experimento de campo de GH15 - Os resultados de experimentos de GH14 sugeriram que até mesmo se o milho for mais robusto, nem tudo isso é traduzido em rendimento de grão. Assim, pode haver um componente genético para altos rendimentos de grão que não aproveitaria totalmente o crescimento e desenvolvimento de planta aumentado. As variedades de milho comerciais diferem quanto ao caráter de espiga: algumas são determinantes, o que significa que uma única espiga de um certo tamanho será produzida por talo, independentemente da quantidade de fotossintato que está disponível para a planta, outras são semiflexíveis, o que permite algum aumento no tamanho de espigas dependendo dos recursos de planta, enquanto ainda outras são totalmente flexíveis, o que permite a plasticidade no tamanho de espigas, com espigas maiores dependendo dos recursos de fotossintato. Portanto, em 2015, foram conduzidos testes em cinco híbridos de milho comerciais diferentes que eram diferentes quanto a esse caráter (Tabela 3 - aparecimento de diferenças de crescimento de planta).

[0127] A estação de campo de GH15 foi muito úmida, recebendo 22,2 cm de chuva durante o mês de junho na localização de plotagem de pesquisa, e a extremidade inferior do campo compreendendo a plantação inteira de uma única variedade foi inundada por cerca de 3 semanas. Em meados de junho, todas as plantas foram muito pequenas, apenas poucos cm de altura. Em seguida, as condições de crescimento se aprimoraram notavelmente, porém, as plantas cultivadas de sementes tratadas com os agentes biológicos foram muito mais robustas e se recuperaram do episódio de inundações de modo muito mais completo que aquelas sem o agente. Houve um aumento substancial no crescimento ao final de julho com plantas tratadas com os agentes microbianos e um grande aumento na biomassa, que também se traduz em rendimento de grão (Tabela 3).

[0128] Os tratamentos de semente, em geral, proporcionaram resultados diferentes através de variedades. Em geral, o tratamento de SABREX proporcionou a maior resposta. O tratamento de semente com uma formulação da presente invenção denominada OMEGA, que contém um metabólito de Trichoderma, porém, sem organismos vivos, proporcionou resultados muito bons também. As misturas contendo ambos os micróbios e o tratamento de OMEGA forneceram menos respostas. Bem afastada da interação de estresse por inundação, houve uma diferença substancial no crescimento e desenvolvimento das variedades diferentes na reação aos tratamentos biológicos de semente. Uma variedade, 6490, respondeu com um aumento muito grande na biomassa (até 2x). Outras linhagens responderam com menos aumentos; em geral, linhagens desenvolvidas para grão como oposto a propósitos duplos proporcionaram menos aumentos e não significativos aumentam quanto à biomassa de planta (Tabela 3).

[0129] As linhagens que proporcionaram os maiores aumentos de rendimento também aumentaram a incorporação de sequestro de C e N em plantas. O maior sequestro de C (com variedade 6490) totalizou 25,6 t/ha, e as plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com SABREX, que foi uma duplicação daquele com as linhagens não tratadas. A incorporação total de N foi 1.056 kg/ha, que é um nível cerca de 3 vezes maior que aquela quantidade total de N do solo. As várias linhagens responderam de modo diferente, com um aumento de menos de uma tonelada com a variedade 5469 (Consultar a Tabela 4). Discussão - Cepas microbianas.

[0130] Exemplo 6 – A eficácia e as capacidades de agentes microbianos para agricultura de planta é, na presente experiência, totalmente específica quanto à cepa. Foi impossível realizar uma generalização a respeito de critérios de nível de espécie— apenas o fato de que uma cepa de T. harzianum, por exemplo, é eficaz para uma função particular, não é indicador que outra cepa da mesma espécie será. Nesse trabalho, foi testada e avaliada a função de três cepas de T. harzianum, uma cepa de T. atroviride, uma de T. virens, uma cepa de T. gamsii, mais uma cepa de Bacillus amiloliquifaciens, sozinhas ou em combinação. T22, K1, K2, K3 e K4 são todos componentes de produtos comerciais que são em uso de ampla escala em uma cultura ou outra. T22 e K1 foram isoladas mais de 30 anos atrás. T22 é usada de modo amplo e bem-sucedido, especialmente nas aplicações de horticultura e de estufa (Harman, 2000)(www.bioworksinc.com), porém, no milho como um tratamento de semente, foi constatado que seu desempenho é inconsistente (Harman, 2006, Harman, Bjorkman, et al., 2008). Por essa razão, K2, K3 e K4 foram desenvolvidas e amplamente testadas e usadas no campo. Adicionalmente, para aplicações comerciais, as misturas de cepas (por exemplo, K2 e K4 para o milho (SABREX LQ™ para milho)) foram produzidas para uso com diferentes culturas, enquanto K2 e K3 foram usadas para tratamentos de semente de trigo (SABREX LQ™ para trigo). Em contrapartida, K1 é usada para tratamentos de soja em combinação com cepas de Bradyrhizobium (por exemplo, Excalbre™); teste de campo de K1 com milho indica que esta cepa tem reações adversas nesta cultura. A seleção dessas misturas é amplamente empírica, porém, com base no conceito de FMD descritos anteriormente. O uso de múltiplas cepas forneceu resultados mais confiáveis que uma única cepa.

[0131] Esses primeiros critérios que se desenvolveram ao longo das décadas de teste é que as cepas precisam ser capazes de colonizar raízes (isto é, ser competente quanto à rizosfera), que, por definição, significa que precisam crescer com e fornecer benefícios a partir de uma única aplicação, para a vida de uma cultura anual. Os dados nos experimentos relatados no presente documento mais o trabalho anterior (Harman, 2000, Sivan e Harman, 1991), indicam que todas as cepas ou misturas de cepa usadas na presente invenção têm essa habilidade.

[0132] Além disso, os dados apresentados no presente documento indicam que as cepas têm uma capacidade notável de se proliferar rapidamente como tratamentos de semente para as raízes de plântulas de milho em desenvolvimento. Em 48 a 72 horas, as raízes são fortemente colonizadas e a biomassa das cepas adicionadas aumenta até 10.000 vezes nesse período de tempo. O nível de colonização é diferente entre cepas; K2 se proliferou ao nível mais alto. Essa capacidade rápida para colonizar radículas emergindo de sementes de milho pode ser um componente de suas altas capacidades para aprimorar o crescimento de milho e afetaram sua seleção empírica como um aprimorador confiável de desempenho de plântula. Provavelmente, a capacidade inicial na colonização afeta seu desempenho geral. É notável que algumas cepas claramente colonizaram radículas de plântula e esporulado na estrutura de raiz.

[0133] Entretanto, as habilidades para colonizar raízes rapidamente e estabelecer uma relação endofítica não são as únicas determinantes da eficácia geral. Uma vez que se tornam estabelecidas nas raízes, as mesmas estabelecem uma comunicação química com as plantas que colonizam, que é dependente da produção de moléculas de gatilho específicas pelo micróbio embutido na raiz que reprograma a expressão genética vegetal (Djonovic, Pozo, et al., 2006, Shoresh, Mastouri, et al., 2010, Waller, Achatz, et al., 2005, Yedidia, Benhamou, et al., 1999). Essas moléculas de gatilho induzem cascatas de sinalização que resultam em indução a longo prazo ao longo do sistema de alterações na expressão genética vegetal (Alfano, Lewis Ivey, et al., 2007,

Shoresh, Gal-on, et al., 2006, Shoresh and Harman, 2010). Mais de 100 genes de plantas mostraram ser regulados de modo crescente e alterações na expressão genética vegetal acima do solo são frequentemente maiores que nas raízes, em que os micróbios colonizadores de raiz residem (Shoresh and Harman, 2008).

[0134] Algumas cepas de Trichoderma claramente evoluíram/podem ser caracterizadas como simbiontes de planta endofítica (Harman, Howell, et al., 2004), porém, a maioria das cepas selvagens são desprovidas dessa capacidade. É válido observar que os números totais de Trichoderma em solos de campo típicos são aproximadamente 10.000 vezes superiores aos níveis adicionados com os tratamentos de semente nesse documento, porém, essas cepas nativas não têm efeitos observáveis no crescimento de planta. Assim, embora a maioria de cepas de inibição de solo tenha pouco efeito no desempenho da planta, a adição de cepas simbióticas de planta endofítica específicas pode fazer uma grande diferença.

[0135] As cepas de Trichoderma não são os únicos organismos que incluem cepas que têm habilidades similares qualitativamente para intensificar o desempenho da planta. Os fungos em Sebicales, como PIriformaspora indica, micorrizas e rizobatérias promovendo crescimento de planta todos incluem pelo menos algumas cepas que podem ser consideradas como simbiontes de planta endofítica e todos podem aumentar o crescimento de planta e induzem outras alterações na planta que contribuem para o desempenho da planta, como resistência a doenças, resistência a estresses de planta abióticos e eficiência aprimorada de uso de nitrogênio (Shoresh, Mastouri, et al., 2010). Os mesmos também são frequentemente confinados às raízes, porém, induzem as alterações sistêmicas na expressão genética vegetal, que implica na produção de compostos de gatilho. Entretanto, é provavelmente impossível que esses grupos geneticamente muito diversos de micro-organismos expressem as mesmas moléculas de gatilho. Por essa razão, mesmo se seus efeitos qualitativos forem similares, seus mecanismos específicos são propensos a serem diferentes. Como um exemplo, tanto cepas de Bacillus spp. quanto de Trichoderma produzem metabólitos anfifílicos que são muito ativos em baixas concentrações (menos de 1 µmol), porém, são quimicamente dissimilares. Em Bacillus, esses incluem lipopeptídeos; a produção da surfactina de lipopeptídeo é fortemente implicada na indução de resistência a doença de planta sistêmica em plantas (Cawoy, Mariutto, et al., 2014). Em Trichoderma, as proteínas hidrofóbicas provavelmente têm uma função similar na indução de resistência e outras respostas vegetais.

[0136] Os dados relatados no presente documento indicam que houve êxito no desenvolvimento de combinações de cepa e formulações eficazes. Os testes de estufa em tomates demonstraram a eficácia de cada cepa individual em parâmetros levando à eficácia fotossinética e verdor de folha aprimorados, especialmente na presença de estresse de água ou sal. Em pesquisa anterior, foi demonstrado que a presença de cepa T22 resultou em superexpressão de uma variedade de genes e produtos de gene envolvidos em ciclagem de antioxidante ou degradação direta de ROS (Mastouri, Bjorkman, et al., 2010, Mastouri, Bjorkman, et al., 2012). Esse processo exige regulação crescente coordenada das trajetórias inteiras como aquelas envolvidas em controle de redox e não apenas regulação crescente de genes únicos aleatoriamente. Portanto, os efeitos do organismo benéfico incluem manutenção de um ambiente de redox interno otimizado (OIRE) na planta através de uma ampla variedade de ambientes e esse OIRE induzido por esses simbiontes de planta endofítica é de importância fundamental nos benefícios de planta observados neste documento.

[0137] Ademais, os sistemas levando ao OIRE estável parecem ser induzíveis se tanto o estresse quanto os organismos benéficos estiverem presentes. Na presença de estresse e na ausência dos micro-organismos, todos os parâmetros, exceto o verdor de folha, diminuíram. Entretanto, na presença tanto do estresse quanto dos fungos benéficos, todos os parâmetros aumentaram em relação a um dos estresses na maioria dos casos aumentaram, por vezes, de modo notável. Entretanto, na ausência de estresse, nem o verdor de folha nem PI foram aprimorados, isso sugere a operação de um sistema induzível análogo à resposta de preparação frequentemente observada por estes mesmos fungos na resistência induzida a doenças de planta (Goellner e Conrath, 2008).

[0138] No teste de campo, a combinação de K5 + As2 e K5 sozinha, proporcionou resultados superiores ao SABREX. Em certos testes de GH15, essas misturas de cepa, na presença de uma formulação contendo ácido húmico e 1-octeno-3-ol também forneceu um aprimoramento importante em relação ao SABREX. Surpreendentemente, uma formulação contendo a formulação e 1-octeno-3-ol sem micro-organismos forneceu resultados muito bons também, embora cada semente tratada contivesse menos de 1 µl desse metabólito de Trichoderma. Esses resultados implicam fortemente que o próprio agente químico pode induzir alterações relativamente a longo prazo na expressão genética vegetal, talvez, através de modificação da estrutura de cromatina de planta. Vários elicitadores de planta químicos de resistência a doença de planta mostraram induzir modificações de cromatina em genes de defesa normalmente encontrados de genes ativos, embora os próprios genes não sejam expressados. Essas alterações resultam em padrões de modificação de histona na cromatina que permitem que os genes se expressem completa e rapidamente quando apropriadamente estimulados (Jaskiewicz, Conrath, et al., 2011), resultando na reprogramação de expressão genética vegetal (Waller, Achatz, et al., 2005). Nessa circunstância, o modo específico de ação para a indução de pontuações de genes na presença de tais agentes seria compatível com a modificação de histona de cromatina de planta, que elucidaria a incongruência de níveis extremamente baixos de compostos como 1-octeno-3-ol tendo efeitos mediante o desempenho da planta por meses após a aplicação.

[0139] Exemplo 7 – Efeitos de cepas de Trichoderma na fotossíntese - Como indicado no presente documento, há um grande número de benefícios para o uso de cepas microbianas e metabólitos benéficos no desempenho da planta. Entretanto, essencialmente todos esses benefícios exigem energia—há um custo de energia/adequação até mesmo para as respostas fisiológicas como resistência induzida (Deitrich, Poss, et al., 2006). Obviamente, as exigências de energia para crescimento de broto e raiz intensificados demonstradas neste trabalho também exigem grandes quantidades de energia e a única fonte para energia nas plantas é a fotossíntese. Portanto, se os efeitos observados forem corretos, as taxas fotossintéticas e capacidades de plantas devem aumentar (Shoresh and Harman,

2008).

[0140] Há inúmeros relatos de que as cepas de Trichoderma e, sem dúvidas, outros micróbios e metabólitos benéficos, têm essa capacidade. Com a presente invenção, o verdor de folha e Fv/Fm, uma medida da saída quântica máxima do fotossistema II também aumenta. Todas essas medições e observações são indicações de que a capacidade fotossintética total de plantas colonizadas com as cepas de Trichoderma aumenta em relação às plantas não colonizadas. A título de comparação, outro organismo endofítico que aprimora o desempenho da planta foi desprovido da capacidade de aprimorar a saída quântica do fotossistema II na ausência da seca (Sheratmeti, Tripathi, et al., 2008). Os resultados destes estudos sobre o tomate foram amplamente confirmados pelo teste de campo com milho; o aumento notável no sequestro de carbono com algumas linhagens dos testes de GH14 e GH15, que demonstra uma intensificação na capacidade fotossintética no milho, porém, parece haver uma forte diferença varietal.

[0141] Exemplo 8 – A relação entre a fotossíntese e a resistência ao estresse - Como já discutido, os estresses, como a seca, sal, inundações e estresse biótico geram níveis altamente prejudiciais de ROS. Uma razão principal para a color bronze das plantas de controle provavelmente se deve à degradação de pigmentos fotossintéticos e outros pigmentos por ROS. Assim, a manutenção de OIRE em plantas é muito importante para o crescimento e rendimento de planta. O OIRE manterá FPE a um nível máximo.

[0142] Os sistemas fotossintéticos (assim como outros sistemas e trajetória nas plantas) são danificados por estresses como seca, sal e calor ainda mais do que pela superexcitação pela luz. O índice de desempenho de fotossíntese de cevada (uma medida que integra vários aspectos diferentes da fotossíntese) foi reduzido em 14 a 28% sob estresse de seca moderada e rigorosa em um cultivar resistente à seca e em 23 a 49% nas mesmas duas condições em um cultivar suscetível. Essa redução na fotossíntese medida foi acompanhada por reduções no teor de clorofila, teor carotenoide e níveis da proteína D1 em cloroplastos (estes são pigmentos críticos e uma proteína estrutural crucial em centros de reação fotossintética, respectivamente).

Essas alterações também foram associadas às alterações na condutância estomatal e taxa de assimilação de CO2, que são outras medidas críticas da fotossíntese. Todas essas alterações foram indicativas de danos mediados pela seca aos sistemas fotossintéticos nas plantas afetadas pela seca. As plantas resistentes foram mais capazes de reparar danos a estes sistemas, um traço associado aos níveis superiores do antioxidante vegetal α-tocoferol que desintoxica ROS. Sob condições de estresse, os níveis de α-tocoferol aumentaram na linhagem resistente, porém, não na linhagem suscetível.

[0143] Os aprimoramentos em FPE pelos vários micróbios e o metabólito usado neste estudo são óbvios. No tomate, a medição direta especialmente de PI demonstrou isso. Além disso, nos estudos de campo de GH14 e GH15, os níveis de carbono sequestrado (“sequestro de C”) aumentaram notavelmente como uma consequência dos tratamentos de semente. Também é evidente que diferentes cepas e formulações têm efeitos similares. No tomate, todas as cepas aprimoraram o verdor de folha e as medidas fotossintéticas, porém, não ao mesmo nível. Adicionalmente, nenhum dos componentes do tratamento de SABREX está presente no tratamento de OMEGA de K5As2, e o OMEGA sozinho (a.i. 1-octeno-3-ol) também aprimorou o sequestro de C a uma base de área (Consultar a Tabela 2). Esse aprimoramento no sequestro de C, que deve, ou pelo menos primariamente, deve surgir da fotossíntese. Também é evidente que esse aumento no sequestro de C não resulta de um aumento em níveis de C em uma base de porcentagem, porém, ocorre como uma consequência de assimilação total ao longo de toda a área da plantação. Isso sugere que, pelo menos no final da estação, o carbono assimilado é convertido em biomassa de planta (que, no milho, consiste no rendimento de silagem).

[0144] Entretanto, a conversão de rendimento de grão como uma consequência de plantas maiores não foi totalmente refletida no rendimento de grão. Há variantes de genética de maís comercial, para genótipo de espiga incluindo flexível, fixa, determinada, indeterminada e prolífica. Os tipos de espiga determinada e fixo são limitados em sua resposta ao ambiente. Os tipos de espiga flexível e/ou indeterminado, em contraste, podem se ajustar às condições de crescimento por alterações no tamanho de espiga. As variedades ou linhagens que podem expandir tanto os números de fileiras de cerne quanto o comprimento de acordo com as condições ambientais são disponíveis.

[0145] Parece que a variedade usada em testes de GH14 foi fixa em número e comprimento de fileira de cerne. Uma variedade mais plástica para esse caráter pode ser útil; a genética de milho afetará o aumento no rendimento que se obtém. Portanto, em GH15, cinco variedades de milho foram examinadas, as quais diferem nesse caráter, e a variedade de espiga flexível respondeu mais fortemente que as variedades semiflexíveis ou determinadas.

[0146] Houve uma diferença na reação de milho aos agentes microbianos em GH14 vs GH15. Em GH14, a linhagem única usada respondeu para fornecer resultados consideravelmente melhores com K5As2 + o adjuvante usado em relação ao SABREX. Em GH15, SABREX foi claramente o tratamento mais eficaz. Essa diferença pode ter ocorrido devido às alterações na formulação. Em GH15, 1-octeno- 3-ol foi adicionado à formulação de K5As2, enquanto, em GH14, esse componente não foi incluído. K5, As2 e OMEGA, todos, proporcionaram resultados positivos quando usados sozinhos e, nos testes de GH15, o agente químico foi usado na formações de OMEGA, que também proporcionou resultados muito positivos quando usados com agentes microbianos. Entretanto, a combinação desses efeitos promotores de planta individualmente pode ter gerado uma interação negativa quando usados em combinações. Assim, os componentes de FMD devem ser testados em combinação quando efeitos positivos sinérgicos são suspeitados.

[0147] Além disso, os resultados especialmente de GH15 demonstram que o nitrogênio interage fortemente com a variedade de milho x combinações microbianas. Foi necessário muito mais N para produzir os rendimentos especialmente de 6490 + SABREX do que outras variedades ou os controles (Tabela 4) ou do que foi adicionado como fertilizante de N às plotagens. Esses resultados indicam que as variedades podem diferir quanto às suas capacidades de absorver grandes quantidades de N do solo na presença dos agentes microbianos, portanto, a interação de variedade x agentes microbianos x nitrogênio é de importância vital. Isso também sugere que rendimentos muito superiores podem ocorrer na presença das cepas, porém, que, para muitas variedades, mais N pode precisar ser aplicado do que o normal. Assim, a variedade/genética de milho x cepa microbiana x fertilidade de nitrogênio precisa ser examinada em detalhes.

[0148] Exemplo 9 – Implicações na segurança ambiental e alimentícia - As emissões totais líquidas (após a correção para sequestro por plantas e outros métodos de remoção) de CO2 de atividades humanas totalizou cerca de 33 bilhões de toneladas em 2010, com outras 2 milhões de toneladas de CO2 como óxido nitroso. Claramente, muitas atividades precisam ocorrer juntas para reduzir esse acúmulo de gases do efeito estufa globais, visto que alteram rapidamente o clima da Terra e tornam o globo menos hospitaleiro para uma população crescente (http://www.epa.gov/climatechange/science/indicators/ghg/global-ghg- emissions.html).

[0149] Certamente as plantas precisam ser mais bem adaptadas aos estresses como a seca e inundações. Portanto, é uma modalidade exemplificativa da presente invenção que a colonização de raiz por micróbios benéficos pode aprimorar as capacidades de plantas para lidar com alterações e estresses ambientais. Pode ser que as alterações genéticas de planta também possam fornecer tais benefícios, porém, as alterações na resistência ao estresse pelos presentes organismos e metabólitos são imediatas e não exigem manipulação genética de planta de qualquer tipo. Os organismos endofíticos alteram a expressão genética através de plantas diversas de formas que são previsíveis e que permitem que os genomas de planta expressem trajetórias que geram uma forte resistência a estresses.

[0150] Também é verdade que há a necessidade de haver um aumento no alimento para uma população crescente. Até 2050, haverá uma estimativa de 9 bilhões de pessoas na Terra, que consiste em 2 bilhões a mais que a população atual (Tailor, 2015). Os aprimoramentos no rendimento e na resistência ao estresse mostrados no presente documento são componentes atrativos para sanar dificuldades tanto de um ponto de vista de alteração climática quanto simplesmente do fornecimento de mais alimento de uma das culturas alimentícias mais importantes no mundo.

[0151] Além disso, esses sistemas são apropriados para a remoção e o sequestro de CO2 do ar. A Tabela 2 demonstra que quantidades significativas de Carbono são sequestradas—em 2014, as maiores plantas sequestraram uma estimativa de 17,2 toneladas de C/ha com 4 toneladas a mais na presença de K5As2, do que em sua ausência, enquanto, em 2015, o aumento foi ainda maior—até 25,6 toneladas com a variedade mais eficiente.

[0152] Essas 17,2 ou 25,6 toneladas foram calculadas a partir da % de C real medida na biomassa acima do solo multiplicada por 2 para considerar o C contido nas raízes. Se houver até 25,6 toneladas sequestradas no milho, essa pareceria uma ferramenta útil para combater o aquecimento global. O dogma atualmente é que as culturas anuais não são úteis para sequestro de C de longo prazo, visto que as culturas são colhidas e utilizadas, o que resulta na reliberação de carbono para o ar. Entretanto, isso não considera as raízes das plantas. Seria esperado e é necessário que as raízes contenham uma proporção similar do C sequestrado àquela nas partes acima do solo, e a presente estimativa de C total presume que 50% da biomassa total é subterrânea. Entretanto, o enraizamento foi notavelmente diferente no milho entre os tratamentos (Tabela 1, Figura 3, desta seção).

[0153] Adicionalmente, em estudos anteriores com tratamentos de semente com T22, os números de intercepções de raiz de milho em uma superfície de solo expostas adjacentes (a até 15 cm dos talos) revelaram o dobro de intercepções de raiz com as plantas tratadas, ao contrário das plantas não tradas 25 a 75 cm abaixo da superfície de solo (Harman, 2000). Os resultados no presente documento demonstram a proliferação de raízes próximas à superfície e o estudo anterior demonstra que a profundida e densidade de enraizamento são ambas aumentadas.

[0154] Em conjunto, esses dados demonstram que os tratamentos biológicos descritos na presente invenção aumentam notavelmente as raízes no solo, assim como aumentam os parâmetros de rendimento acima do solo. As raízes, obviamente, não são colhidas no milho e permanecem no solo, em que as mesmas gradualmente se decompõem na matéria orgânica no solo. Assim, o solo se torna um reservatório para o C sequestrado e, à medida que as raízes se decompõem, a matéria orgânica no solo aumenta e a matéria orgânica no solo é um componente importante de saúde e qualidade de solo aprimoradas. Assim, de acordo com a presente invenção, C pode ser sequestrado e a qualidade do solo aprimorada ao mesmo tempo.

[0155] Os níveis de sequestro de C na presente invenção são significativos. A Tabela 4 demonstra um sequestro de C total nos melhores tratamentos de milho de cerca de 25 t/ha. Ou seja, obviamente, apenas C, e o CO2 total representado por esta Figura é 91 t/ha de CO2. Presume-se que 50% deste total esteja em armazenamento relativamente a longo prazo nos solos, então, cerca de 45 t/ha seriam removidos e armazenados neste sistema. Houve cerca de 100 milhão de ha (39 bilhões de alqueires/300 bu/ha de rendimento) de milho colhido em 2014 (http://www.worldofcorn.com/#) e, portanto, em 91 t/ha, o total que poderia ser removido usando este sistema é de cerca de 9,1 bilhões de t mundialmente. Se 50% disso for representado por raízes no solo, que é uma fração razoável, (cerca de 14%) das emissões líquidas totais de CO2 de 33 bilhões de toneladas em 2010. Obviamente, nem todo o milho será tratado com os presentes sistemas biológicos, porém, por outro lado, resultados similares podem ser esperados para outras culturas especialmente legumes e grãos pequenos plantados amplamente incluindo trigo e arroz.

[0156] Além disso, o N total incorporado no milho nas plotagens de 2014 foi substancialmente maior (1.056 kg vs cerca de 563 kg) com o milho tratado do que o milho não tratado. O nitrogênio aplicado ao milho como fertilizante pode ser liberado no ambiente, como NO gasoso ou como NO3 em solução. No primeiro caso, o NO liberado se torna parte das misturas de gás do efeito estufa que levam ao aquecimento global. No segundo, NO3 ou NO2 no solo e águas de superfície é um componente significativo que leva à eutrofização de vias aquáticas e à formação de “Zonas Mortas” em estuários em que as cargas de nutriente em excesso dos rios levam ao crescimento de plâncton excessivo e levam à anóxia em que organismos não podem sobreviver. Claramente, se o N aplicado for absorvido por plantas, esse N não está mais disponível para poluir o ar ou a água. A quantidade de N total incorporada em plantas é cerca de 3x aquela aplicada, sugerindo uma forte habilidade de algumas cepas para “minar” o nitrogênio do solo; o enraizamento mais profundo e a maior exploração do volume do solo podem ser responsáveis por pelo menos uma porção deste aumento. Entretanto, algumas linhagens foram incapazes de aumentar a absorção de N quase igualmente à variedade 6490. Com estas linhagens, a absorção de N foi maior do que com a 6490, porém, o aumento na absorção de N foi menor. Isso sugere que, para alcançar sucesso máximo na intensificação de rendimento ou sequestro de C, mais N pode precisar ser aplicado. Isso não é propenso a aumentar a poluição da água, visto que o enraizamento mais profundo e as capacidades das plantas cultivadas das sementes tratadas são propensas a serem intensificadas em relação às plantas não tradas.

[0157] Em todo caso, com o milho ao longo dos dois anos de estudos de campo, mais N foi incorporado no milho do que foi adicionado a partir da aplicação de fertilizante de N. Isso indica que o próprio milho pode colher N residual do solo, de formas solúveis ou, mais provavelmente, da matéria orgânica no solo. Essa, entretanto, é, em grande parte, retornada ao solo na forma de raízes não colhidas e outros detritos vegetativos. O efeito líquido pelo menos dos tratamentos mais eficazes seria intensificar o material orgânico de solo e, assim, a saúde do solo.

[0158] Esses dados sugerem que o tratamento de sementes de planta com micróbios ou metabólitos benéficos selecionados poderia ser um método econômico para reduzir níveis de gases de efeito estufa atmosféricos. Se foi empregado como um sistema de limitação e troca de carbono, então, a verificação e validação da eficácia do tratamento provavelmente seriam necessárias. Avanços recentes na detecção remota a partir de drones ou satélites podem registrar imagens multiespectrais que podem tanto medir características de folha de planta incluindo aquelas que podem medir níveis superiores de fotossíntese e teor de clorofila, quanto características de solo incluindo matéria orgânica. O anterior (índice de densidade de vegetação normalizada) poderia ser usado como validação da eficácia do tratamento, e o último poderia ser usado para avaliação de múltiplas estações da previsão de teor do solo orgânico superior produzido pelos tratamentos. Estes sistemas remotos poderiam ser usados em conjunto com a aplicação dos micróbios no presente documento, especialmente se estes micróbios fossem usados com genética de planta (por exemplo, milho de espiga flexível), para a validação, modelagem e verificação dos processos recém-descritos. A modelagem de parâmetros de crescimento de planta usando detecção remota para prever rendimentos e outros parâmetros a partir da interação complexa de variedade x cepa microbiana x níveis de fertilidade de nitrogênio é provavelmente essencial.

[0159] Experimentos de campo - Os experimentos de campo foram estabelecidos no milho (Zea Mays) próximo a Phelps, NY em GH14. As sementes de um híbrido comercial transgênico resistente a glifosato, A91-92R foram obtidas junto à Albert Lea Seeds, Albert Lea, MN. As sementes foram comercialmente tratadas com Acceleron™ (ACCELERON), uma mistura de pesticida contendo ipconazol, metalaxil, trifloxistrobina (fungicidas) e clotianidina (inseticida). As sementes foram supertratadas com uma mistura de formulação líquida de K2 e K4, que é o produto comercial SABREX LQ, de acordo com as orientações do fabricante. Outras sementes foram tratadas com uma mescla comercial de um produto de ácido húmico e nutrientes menores, junto com K2, K5 + As2 ou K2 + As2. As cepas fúngicas usadas foram uma suspensão líquida de conídio a 8 x 108 cfu/ml, e a concentração de As2 foi de 8 x 109 cfu/ml. As suspensões microbianas foram usadas para tratar sementes à taxa de 0,9 ml/kg para cada organismo. Esta é a mesma taxa de tratamento de semente de Trichoderma que é recomendada com o produto de SABREX. Os experimentos preliminares demonstraram que todos os organismos usados no supertratamento são estáveis na presença dos pesticidas químicos (dados não mostrados).

[0160] As plotagens foram estabelecidas em um solo de argila arenosa com potencial de rendimento moderado. Estes testes foram conduzidos em um projeto em blocos replicado com quatro réplicas. Cada tratamento + réplica consistiu em quatro fileiras a 76 cm de distância e 6 m de comprimento plantadas em uma orientação norte-sul. As sementes foram plantadas em 17 de junho após uma primavera úmida fria, a colheita de silagem foi em 15 de setembro e a colheita de grão em ou cerca de 20 de novembro. A primeira geada exterminadora foi na última semana de outubro.

As ervas-daninhas foram controladas com herbicida de glifosato seguindo as recomendações do fabricante. A fertilização no momento da plantação foi com 46 kg de N/Ha real em uma formulação de 19:19:19. Isso foi seguido por uma peliculização lateral de 96 kg em meados de julho como uma aplicação por difusão de superfície. Toda a colheita para rendimento foi apenas nas duas fileiras intermediárias. Para o rendimento de grão, os 4,6 m intermediários das fileiras foram colhidos e para a silagem, os 2,3 m ao norte foram colhidos. Para as medições de raiz e outra amostragem destrutiva, as plantas foram cavadas ou, de outro modo, colhidas das fileiras externas, na direção oposta às áreas que seriam colhidas. As densidades de planta não foram significativamente diferentes entre os tratamentos e foram cerca de

63.000 plantas por Ha. O crescimento de planta foi medido ao longo da estação. Os pesos de silagem e grão foram coletados após a colheita, e as % de nitrogênio e carbono foram submetidas a ensaio por um serviço comercial (A&L Laboratories ou Cornell Nutrient Analysis Laboratory.

[0161] Experimentos de campo (GH15) - testes de campo foram conduzidos novamente em GH15. Os dados em GH14 sugeriram fortemente que os rendimentos de grão foram limitados pelos limites genéticos da variedade usada. Portanto, em GH15, cinco variedades de milho foram testadas, as quais incluem variedades que são descritas pelo fornecedor com tipos de espiga como determinada (2 variedades), semiflexível (2 variedades) e totalmente flexível (1 variedade). Estas foram fornecidas por Chemgro Company, são designadas como 5469 RSX, 5018 G3 (determinadas); 5245 RDP, 5455 RDP (semiflexíveis) e 6490 (totalmente flexível). Hipoteticamente, visto que os tipos de espiga determinada, semiflexível e flexível são diferentes em suas habilidades para traduzir recursos de biomassa aprimorados (fotossintato) em grão, que a razão de grão para rendimento de biomassa seria diferente se os tratamentos de semente (a) resultassem em um aumento nos recursos fotossintéticos, e (b) as variedades diferem em suas habilidades para utilizar fotossintato. Todas as sementes usadas nos experimentos foram tratadas com uma mistura de inseticida/fungicida (Cruiser Maxx 250, Syngenta Crop Protection) que contém tiametoxame, fludioxonila, mefenoxame, azoxistrobina e tiabendazol.

[0162] Antes da plantação, subamostras de cada variedade foram tratadas com SABREX LQ de acordo com a orientação do fabricante. Os tratamentos adicionais às subamostras separadas foram uma mistura designada OMEGA, que contém 20 g de humato (Leondarite shale), 5 g de extrato de levedura, e 100 µl de 1-octeno-3-ol (Sigma Chemical Co.), todos suspensos em 1 l de água e, então, o pH foi ajustado a 6,2. Essa mistura foi aplicada à taxa de 0,65 ml/kg de sementes. Essa mistura foi desenvolvida para fornecer uma substituição definida quimicamente para o material de humato usado em 2014. Uma baixa concentração de 1-octeno-3-ol (álcool de cogumelo), que é um metabólito volátil de cepas de Trichoderma, foi incluído pelo fato de que os experimentos preliminares indicaram que foi um promotor de crescimento de planta potente e pelo fato de que induz resistência a doenças de planta, como também foi relatado por outros (Morath, Hung, et al., 2012).

[0163] Além disso, outras subamostras de sementes foram tratadas com OMEGA mais K5As2 ou OMEGA mais K2As2. Os micróbios foram adicionados à mesma taxa indicada para os testes de GH14. Este teste foi localizado em um solo francoargiloso próximo a Waterloo, NY. As plotagens foram disposta por variedade através do campo, como duas fileiras com 22,5 m de comprimento. Cada tratamento x variedade foi colhida para silagem e grão. Para esta colheita, cada conjunto de fileiras foi dividido em quatro blocos, cada um com 1,8 m de comprimento, por colheita de silagem intercaladas com quatro blocos, cada um 3,6 comprimento para a colheita de grão. Além disso, a área das plotagens recebeu chuva intensa de mais de 20 cm ao longo de um período de três semanas logo após as plântulas emergirem nas plotagens (a última semana de maio até as primeiras duas semanas de junho). As plotagens foram dispostas de modo que, pela totalidade deste período de 3, uma porção do campo estivesse saturada ou, por grande parte do tempo, completamente submersa. Esta área do campo coincidiu quase exatamente com aquela plantada com 5245 RDP, e foi inundada de modo relativamente uniforme. Assim, os testes com esta variedade proporcionaram uma boa oportunidade para examinar a capacidade dos tratamentos de semente para auxiliar o milho na recuperação de estresse de inundações. O restante das variedades estava em solo mais alto e, portanto, não foi submetido a esse estresse.

[0164] A coleta e análises de dados foram conforme descrito para as plotagens em GH14 - Exemplo 10 – A análise de dados qPCR A por curva-padrão de experimento de DNA de Trichoderma foi calculado pelo software de séries Rotor-gene Q e todas as amostras experimentais foram comparadas com este para determinar a quantidade do presente DNA fúngico. O aumento multiplicado em relação ao controle não tratado foi calculado a partir desses dados e plotado em uma escala de log versus o tempo. Dados de Campo, rendimento, biomassa e outros caráteres medidos durante as estações de cultivo GH14 e GH15 foram analisados usando alfa = 0,1 para testes de ANOVA e Diferença Menos Significativa e os sistemas analíticos descritos nas tabelas. Tabela 1. Parâmetros de cultivo, taxas de doença e rendimentos de milho tratado com diferentes cepas ou misturas de cepa em GH14. Peso Peso de % de % de Diâmetro de raiz Flagelo Ht em 5 Ht em broto aumento aumento de talo em 4 Ferrugem de Rendimento Rendimento de 20 de em 4 em em em 5 de de de folha folha de grão de Silagem TRT agosto outubro de relação à relação agosto agosto de milho do (toneladas/h (toneladas/h de 2014 de 2014 agosto silagem ao grão 1 1 de 2014 de (%)4 norte a)5 a6) (cm) (cm) 2 de 4 de de (mm) 2014 (%) 2014 3 controle controle (g) (g)3 K2AS 152,5a 86,2a 16,8a 558a 134a 4,33b 5,0bc 11,7a 62,2ab 19,2 20,6 2 MJ K5As2 145,9a 87,5a 17,2a 522a 133a 4,3c 4,6c 12,0a 68,6a 31,4 23,7

MJ K5 MJ 135,4ab 85,5a 16,8a 452ab 95b 5,4a 5,44bc 12,0a 62,5ab 24,9 23,7 SabrE 122,5b 84,3a 16,4a 363b 69bc 4,3b 6,1b 10,8ab 59,5b 13,9 11,3 x LQ Contro 116b 81,3a 14,7b 342b 56,5c 3,81bc 8,0a 9,7b 52,2c le

[0165] Número seguidos por letras dissimilares às colunas são significativamente diferentes em P=0,10 (RMN de Duncan). Havia 4 réplicas/tratamento em um projeto de plotagem randomizado.

[0166] 1 Altura média de 10 plantas do centro das plotagens.

[0167] 2 Diâmetro de talo em nível do solo medido, média em relação a 10 plantas/plotagem.

[0168] 3 Peso médio de brotos ou raízes de 10 plantas/plotagem de fora da área colhida.

[0169] 4 ferrugem de milho e flagelo de folha (média através de 20 plantas/plotagem) estimado pela % de área de folha com doença.

[0170] 5 Rendimento de grão de média através de réplicas calculado a partir de bu/acre. As ponderações de teste foram consistentemente 53 lb/acre.

[0171] 6 Rendimento de silagem médio (biomassa total) por ha a 70% de teor de umidade. Tabela 2. Biomassa e teores de carbono e nitrogênio de milho colhido em GH14 Tratamento Peso % de % de carbono nitrogênio C total, N total, Aumento Aumento seco carbono1 nitrogênio2 sequestrado incorporado brotos brotos e líquido de líquido de (kg/ha) (t/ha) (kg/ha) e raízes C em N em raízes (kg, relação relação (t, est)3 est)3 ao ao controle controle K2As2 MJ 18.660 42,31 1,73 7,9 323 15,8 646 2,6 83 K5As2 MJ 20.460 42,18 1,73 8,6 354 17,2 708 4 145 K5 MJ 18.750 42,4 1,78 7,9 334 15,8 668 2,6 105 SabrEx 17.850 42,8 1,8 7,6 321 15,2 642 2 79 Controle 15.660 42,4 1,8 6,6 282 13,2 563 -- --

[0172] 1 C total foi determinado no Cornell Nutrition Analytical Laboratory, usando um método de combustão automatizado por meio de condutividade térmica.

[0173] 2 N total foi determinado por A&L Analytical Laboratories Inc, Memphis, TN usando método de AOAC 4.2.08

[0174] 3 C e N de broto e raiz total foi estimado presumindo-se que as raízes constituem 50% da biomassa de milho. Tabela 3. Os dados de rendimento e condições de campo de plotagens de GH15. Cada variedade estava em um bloco separado e, portanto, os meios podem ser apenas estatisticamente comparados dentro das variedades. Houve uma diferença de elevação de cerca de 5 a 10 m no campo, e as variedades são dispostas a partir da plotagem situada mais baixa para a plotagem situada mais alta. Logo após as plântulas emergirem, a área recebeu cerca de 25 cm de chuva em três semanas e por esse período de tempo, a plântula na plotagem situada mais baixa (5245) foi submersa, como a extremidade adjacente da próxima plotagem. Assim, essa parte do experimento é um teste das capacidades dos tratamentos para auxiliar as plantas na recuperação deste estresse. As doenças foliares não foram vistas nestas plotagens. A densidade de semeadura foi proporcionada para fornecer 80.279 plantas/ha para todas as variedades, e a densidade de planta medida final de

74.100/ha. Variedade1 Tratamento Altura de Diâmetro de Leitura de Rendimento de planta (cm) talo (mm) 7,21 a SPAD (verdor Silagem (t/ha) 7,21 a 25 7,25 de folha) (ajustado a 70% de (7,20 a 25) umidade) 5245 RDP— Omega 112,1b 24,6b 49,6ab 50,3ab propósito duplo SabrEx LQ (K2 + K4) 106,1c 28,1a 50,9a 59,4a Semiflexível K2K4As2 Omega 117,2b 22,3a 47,9bc 56,5ab Plântulas K5As2 Omega 125,8a 28,6a 51,0a 46,7b submersas por três Controle 99,3d 21,4c 46,7c 32,0c semanas após o surgimento 5469 RSX--grão Omega 200,3 31,9a 33,3a 73,9a Determinado SabrEx LQ (K2 + K4) 191,4c 29,5b 30,4ab 71,4a K2K4As2 Omega 203,0ab 27,8b 27,5b 59,8a K5As2 Omega 210,1a 28,4b 31,0ab 57,8a Controle 174,5d 22,2c 17,5c 68,6a 5455 RDP--grão Omega 194,3b 25,7b 51,4a 65,3a Semiflexível SabrEx LQ (K2 + K4) 196,0b 28,3a 51,3a 65,7a K2K4As2 Omega 203,5ab 29,5a 47,9b 61,8a K5As2 Omega 211,3a 28,5a 51,1a 65,2a Controle 174,5c 22,5c 45,5c 56,9a 5018G3— Omega 193,4ab 25,7b 49,8a 72,5ab propósito duplo SabrEx LQ (K2 + K4) 190,5b 28,1ab 53,2a 73,3a Determinado K2K4As2 Omega 205,6ab 28,6a 49,0a 56,2bc K5As2 Omega 208,1a 28,4ab 62,1a 68,7ab Controle 174,0c 22,4c 47,1a 49,4c 6490—propósito Omega 200,9ab 28,1b 50,8a 80,1b

Variedade1 Tratamento Altura de Diâmetro de Leitura de Rendimento de planta (cm) talo (mm) 7,21 a SPAD (verdor Silagem (t/ha) 7,21 a 25 7,25 de folha) (ajustado a 70% de (7,20 a 25) umidade) duplo SabrEx LQ (K2 + K4) 195,4b 28,6b 49,7a 100,5a Totalmente flexível K2K4As2 Omega 208,5a 27,7b 50,7a 58,6c K5As2 Omega 192,8b 30,9a 50,6a 68,7bc Controle 170,5c 22,3c 46,3b 53,6c

[0175] Inúmeros seguidos por letras dissimilares são significativamente diferentes P=0,1 como determinado por testes de LSD agrícola.

[0176] As letras e os números após o número varietal indicam caráter transgênico; RDP indica resistência a glifosato, broca europeia do milho e lagarta de espiga de milho/lagarta-do-cartucho do outono; RSX indica resistência ao glifosato, glufosinato, broca europeia do milho, crisomelídeo do sistema radicular do milho e lagarta de espiga e lagarta-do-cartucho do milho; G3 indica resistência a glifosato, glufosinato, broca europeia do milho, crisomelídeo do sistema radicular do milho e lagarta de espiga e lagarta-do-cartucho do milho. 1 As letras e os números após o número varietal indicam caráter transgênico; RDP indica resistência a glifosato, broca europeia do milho e lagarta de espiga de milho/lagarta-do-cartucho do outono; RSX indica resistência ao glifosato, glufosinato, broca europeia do milho, crisomelídeo do sistema radicular do milho e lagarta de espiga e lagarta-do-cartucho do milho; G3 indica resistência a glifosato, glufosinato, broca europeia do milho, crisomelídeo do sistema radicular do milho e lagarta de espiga e lagarta-do-cartucho do milho. Algumas variedades são reproduzidas para o rendimento de grão e algumas como propósito duplo (grão e silagem), e comercializadas dessa forma pelo fornecedor, Chemgro Seeds. Tabela 4. Biomassa e teores de carbono e nitrogênio de milho colhido em GH15 através de variedades para o tratamento mais eficaz de semente (SABREX) vs o controle.

Tratamento Peso % de % de carbono nitrogênio C N Aumento Aumento seco carbono1 nitrogênio2 sequestrado incorpora total, total, líquido de líquido de (kg/ha) (t/ha) do (kg/ha) brotos brotos C em N em e e relação ao relação raízes raízes controle ao (t, (kg, controle est)3 est)3 5245 17.820 42,5 1,75 7,6 311 15,2 622 7 286 SabrEx 5245 9.600 42,5 1,75 4,1 168 8,2 336 -- -- Controle 5469 21.420 42,5 1,75 9,1 374 18,2 748 0,8 28 SabrEx 20.580 42,5 1,75 8,7 360 17,4 720 -- 6 5469 19.710 42,5 1,75 8,4 345 16,8 690 4,2 178 Controle 17.070 42,5 1,75 7,3 342 14,6 684 -- 494 5455 21.990 42,5 1,75 9,3 384 18,6 768 6 -- SabrEx 14.820 42,5 1,75 6,3 295 12,6 590 -- 5455 30.150 42,5 1,75 12,8 528 25,6 1056 12,8 Controle 16.080 42,5 1,75 6,4 281 12,8 562 -- 5018 SabrEx 5018 Controle 6490 SabrEx 6490 Controle

[0177] Exemplo 11: A cepa de Trichoderma K5 aumenta o crescimento em maís na estufa e no campo quando aplicado como um tratamento de semente. Os testes de campo e estufa no interior de NY mostraram que as sementes de milho tratadas com T. virens NRRL 50520 resultaram em plantas com crescimento, desenvolvimento e rendimento aprimorados. A Figura 1 desta seção mostra plantas de milho cultivadas a partir de sementes tratadas com tratamento de K5 em comparação com os produtos de SABREX existente assim como um controle não tratado. Os tratamentos também incluíram um adjuvante que é identificado como MJ. Este adjuvante, que é proprietário, é um tratamento de semente que intensifica adicionalmente os efeitos da cepa K5. A Figura 5C mostra espigas primárias e secundárias de plantas de milho no mesmo teste experimental conforme mostrado na Figura 5A. As espigas primárias de plantas cultivadas de tratamento de sementes tratadas com K5 mostraram duas fileiras de cerne adicionais (16 vs 18) em comparação com o controle não tratado. O número de fileiras de cerne é um componente de rendimento importante em seleção de variedade de milho avançada com mais fileiras traduzindo em rendimento aprimorado. As fileiras de cerne extras também foram vistas na espiga secundária e espigas secundárias foram mais desenvolvidas. Os números de fileiras de milho e o desenvolvimento de espigas secundárias são determinantes primários de rendimento de maís. Em todo caso, o crescimento e o desenvolvimento de plantas e espigas foi visualmente superior àqueles cultivados com sementes tratadas com SABREX ou sem tratamento de semente.

[0178] A análise estatística destes dados de campo é conforme a seguir. Altura de planta, peso de broto (Figuras 7A a 7B), e medidor de Spad (fotossíntese; consultar a Figura 6) ambos mostraram ser significativamente aprimorados no tratamento de K5. Ambos esses caráteres são críticos para rendimento de silagem e se traduzem em rendimento de grão, especialmente quando os números de fileira de cerne em espigas primárias e secundárias também são considerados. Testes de separações de médias (LSD, alfa = 0,05) demonstraram que o peso de broto e a altura de planta no tratamento de K5 foram ambos significativamente aprimorados em relação tanto ao controle não tratado, assim como SABREX, o tratamento biológico de semente de milho de alto desempenho existente.

[0179] Exemplo 12 desta seção – cepa de Trichoderma K5 aumenta o crescimento em trigo cultivado em estufa quando aplicada como um foliar. A Figura 4 desta seção mostra os resultados destes tratamentos com a amostra de K5 (na esquerda) sendo claramente maior e mais vigorosa que o controle (no Trigo, as plântulas foram plantadas em recipientes bem drenados na estufa e tratados com uma aspersão foliar seguindo o surgimento). As plantas de controle foram aspergidas apenas com água. A Figura 8 mostra os resultados destes tratamentos com a amostra de K5 (na esquerda) sendo claramente maiores e mais vigorosos que o controle (na direita).

[0180] Exemplo 13 desta seção – cepa de Trichoderma K5 aumenta o crescimento em soja na estufa quando aplicada como um tratamento de semente. As sementes de soja foram tratadas com cepa de T. virens NRRL B-5025 ou deixadas sem tratamento sem outros tratamentos microbianos ou químicos sendo aplicados. Estas foram plantadas em tubos de areia e os dados de crescimento foram coletados à medida que as sementes surgiram e as plântulas cresceram. Foi constatado que o tratamento de Trichoderma aumenta significativamente o crescimento de plântula de soja nestes experimentos conforme demonstrado na Figura 5 mostrando o comprimento de tronco, leituras de medição de Spad, peso de raiz e volume de raiz. Todas as diferenças mostradas nas Figuras 9 a 12 são significativas em alfa = 0,05 ou 0,01.

[0181] As Figuras 9 a 12 mostram plotagens de caixa e linhas mostrando diferenças de média e distribuição de dados para caracteres volume de raiz (p = 0,0198), peso de raiz (p = 0,0082), spad (p = 0,0375) e comprimento de tronco (p = 0,0057) para soja na estufa, a semente tendo sido tratada com cepa de Trichoderma K5.

[0182] Portanto, FMD—conforme se refere à presente invenção em certas modalidades—tem os seguintes componentes: (1) cada uma das cepas microbianas individualmente são rizosféricas e endofiticamente competentes. Além disso, (2) é esperado que os metabólitos sejam os gatilhos específicos de alterações na expressão genética vegetal, de modo que o conceito de FMD também inclua os compostos de gatilho. Em tal definição, a FMD exige metabólitos que fornecem benefícios por um período de meses (para metabólitos) ou pelo menos uma estação (micróbios) e cepas ou metabólitos que são eficazes quando adicionados como tratamentos de semente nos níveis de cerca de 70 mg/ha (micróbios) ou em menos de 1 µl/semente (metabólitos). As cepas eficazes, metabólitos eficazes ou misturas eficazes dos dois são, então, combinadas em tratamentos únicos que se espera que forneçam melhores resultados que qualquer um dos componentes usados sozinho. Visto que cada componente é fortemente capaz de colonizar raízes de planta e se tornar um componente integral e de longa duração da planta (micróbios) ou de ter efeitos a longo prazo (tanto micróbios quanto metabólitos) são contempladas alterações substanciais e benéficas no fitobioma de planta que levam aos benefícios a longo prazo no desempenho da planta.

[0183] Estes agentes também intensificam ou mantêm a eficácia fotossinética em plantas. Todos estes aprimoramentos no desempenho da planta observados acima são de energia intensiva, e para micróbios específicos induzirem essas alterações, as plantas também devem ter eficácia fotossinética aprimorada. No suporte do conceito de um aprimoramento no nível basal de fotossíntese, estão os seguintes: há muitos relatos de verdor de folha intensificado como uma consequência de inoculação com agentes microbianos. Isso é evidenciado por resultados de expressão genética e/ou estudos proteômicos que demonstram que elementos fotossintéticos estão dentre aqueles superexpressados. Estes incluem proteína de complexo de evolução de oxigênio de rubisco e fotossistema II. Quando a fotossíntese for intensificada, então, o recurso disponível, como amido, também é aumentado. Justificando as expectativas de que essas alterações afetem diretamente a fotossíntese de planta estava a demonstração de que uma cepa de T. virens resultou em um aumento de sequestro de carbono em milho mais que 60%. Ademais, a fotossíntese e o maquinário fotossintético são altamente suscetíveis a danos por espécies reativas de oxigênio (ROS). Os estresses como seca, sal e inundações resultam no acúmulo de níveis de ROS que são altamente prejudiciais aos mesmos. Até mesmo outras condições de crescimento, de outro modo ideais, luz em excesso de sua utilização na fotossíntese resulta na produção de ROS, incluindo o ânion superóxido, que são prejudiciais aos pigmentos, proteínas e lipídeos.

[0184] Portanto, os danos nos sistemas fotossintéticos ocorrem como uma consequência do acúmulo de ROS que pode ser induzidos por estresses ou até mesmo por condições, de outro modo, ideais em altos níveis de luz. Isso tem uma consequência séria, visto que a fotossíntese é, portanto, o fator limitante principal no crescimento de plantas. Infelizmente, a fotossíntese de melhor medição é de apenas cerca de 20% das taxas de conversão máximas teóricas (que são de 0,1 e 0,13 para plantas de C3 e C4) e isso não foi notavelmente aprimorado através de esforços de aprimoramento de planta. Assim, os rendimentos aumentaram sem aprimorar a taxa fotossintética, que é o fator limitante fundamental. A taxa de aumento nos aprimoramentos de rendimento de culturas principais diminuiu nos últimos anos, em parte, devido ao fato de que outros insumos e aprimoramentos estão se tornando limitados pela falta de aprimoramento na eficácia fotossinética. O potencial de rendimento (YP) de plantas de cultura, igualmente, pode ser aproximado como o produto da radiação solar recebida sobre a unidade de terra em uma única estação de crescimento (Q), as eficiências da planta para interceptar a radiação (E1), conversão de energia de radiação em energia de biomassa (E2), e particionamento da biomassa nas partes passíveis de colheita das plantas (E3) (YP = Q∙E1∙E2∙E3).

[0185] Todas estas estratégias e alternativas afetam positivamente o ambiente. Por exemplo, FPE ou FTE têm o potencial de aumentar o sequestro de carbono, e os organismos também intensificam a eficiência de uso de nitrogênio (NUE) e, assim, reduzem os gases do efeito estufa importantes, CO2 e NO. Além disso, uma NUE maior é propensa a reduzir a poluição da água de NO3 e NO2 de escoamento de campos fertilizados (Harman, 2011). Se este potencial estiver sendo realizado, então, uma maior incorporação total de C e N deve estar presente em biomassa colhida. Claramente, se níveis maiores de C ou N forem sequestrados ou incorporados em plantas de cultura, então, os mesmos não estão presentes na atmosfera ou vias aquáticas. O impacto de culturas anuais nestes fatores ambientais não foi seriamente considerado com culturas anuais, visto que C ou N sequestrados são rapidamente ciclados de volta para o ambiente como os produtos vegetais são colhidos e usados. Entretanto, isso não leva em consideração a biomassa em raízes, que é grande e aumentado pelo fitobioma alterado que resulta do uso destes organismos. O C e N contidos na biomassa de raiz são lentamente degradados e os materiais orgânicos e incorporados em materiais orgânicos no solo. Assim, o solo se torna um reservatório de ambos estes elementos e, com sistemas de raiz maiores, material orgânico de solo e, portanto, lavoura de solo e produtividade, são intensificados.

[0186] Os experimentos de variedade de milho, adicionalmente, confiram suas habilidades para utilizar fotossintato para biomassa total ou peso de grão, em que as variedades de espiga determinadas que têm pouca ou nenhuma capacidade para aumentar o tamanho de espiga ou planta além de uma quantidade geneticamente limitada não aumentará rendimentos de grão tanto quanto as variedades que têm hábitos de planta e espiga indeterminados. O FPE ou TPE intensificado desta forma aumenta o sequestro de CO2 em plantas cultivadas em campo e visto que os fungos endofíticos aumentam desenvolvimento de raiz, muito desse carbono sequestrado será colocado sob o solo, em que não será rapidamente reliberado no ar. Adicionalmente, as habilidades aumentadas de plantas para utilizar o nitrogênio de modo eficaz resultarão em mais nitrogênio incorporado na planta e menos que está disponível para poluir a água ou ar. Portanto, o C e N totais incorporados em milho cultivado em campo foram medidos. O rendimento e fotossíntese interagem fortemente com nitrogênio disponível para as plantas. O estudo também examinou a interação de variedades de milho diferentes com absorção de nitrogênio.

[0187] As cepas endofítica e rizosfericamente competentes Trichoderma na presente invenção utilizam T. afroharzianum (anteriormente T. harzianum) cepa RR17Bc (acesso de ATCC PTA 9708; K2) , T. harzianum (anteriormente T. harzianum) F11Bab (acesso de ATCC PTA 9709; K3), T. atroviride cepa WW10TC4 (acesso de ATCC PTA 9707; K4) e T. atroviride (anteriormente viride) cepa NRRL B50520 (K5) todas as quais foram descritas anteriormente. Também é usada uma cepa de Bacillus amiloliquefaciens (As2) isolada de troncos de alfalfa no Condado de Ontário, NY.

[0188] Exemplo 14: O cultivo dos agentes microbianos em radículas emergentes das sementes tratadas, e sua localização sobre e nas plantas e na próxima geração de sementes.

[0189] Microscopia As sementes de milho de um híbrido comercial (Viking Seed Co. MX00029) sem um tratamento de fungicida foram tratados com suspensões de esporo conidial fúngico a 1 x 109 cfu (unidades de formação de colônia)/ml e usadas para tratar sementes na taxa de 0,9 ml/kg para cada organismo e germinadas em papéis de filtro esterilizados umedecidos por 48 a 72 horas. As radículas emergiram a partir destas sementes em menos de 48 horas, e as superfícies das radículas emergidas foram imageadas com microscopia fluorescente. As observações microscópicas confocais foram conduzidas após a aplicação de cepa de azul Calcofluor-Evans usada de acordo com as orientações do fabricante (18909 Calcofluor White Stain, Sigma Aldrich, St. Louis MO). A microscopia foi realizada no Cornell University Plant Cell Imaging Center em um Microscópio Confocal de Varredura a Laser Leica TCS SP5.

[0190] Colonização de broto e raiz a partir de sementes tratadas na estufa. As sementes de milho ou soja foram tratadas com agentes microbianos diferentes ou não tratadas e plantadas na estufa em uma mistura de envasamento padrão (Sungro Professional Potting Mix). As sementes de milho foram tratadas pelo fornecedor com uma mistura de fungicida (Cruiser Maxx 250, Syngenta Crop Protection, que contém tiametoxame, fludioxonila, mefenoxame, azoxistrobina e tiabendazol) e os tratamentos biológicos foram aplicados sobre os tratamentos químicos. As sementes de soja usadas não tinham tratamento químico. Após 20 a 35 dias de cultivo, as plantas foram removidas de mistura de envasamento e as raízes foram cuidadosamente lavadas. Após a colheita, os segmentos de raiz e broto foram separados e a superfície esterilizada. Duas raízes foram escolhidas a partir de cada planta e foram amostradas em três locais; em relação à semente, eram proximais, mediais e distais. Todos os segmentos de broto ou raiz foram dispostos em placas em PDA acidificado (Remel) contendo um restritor de colônia, o tensoativo Igepal c630 (Alfa Aesar) (Ig de PDA) e examinado quanto à presença de Trichoderma. Os detalhes de tratamentos e condições testados são fornecidos na Tabela 5 (abaixo).

[0191] Colonização de grão produzido no campo a partir de sementes tratadas. As sementes de milho ou soja de plantas que foram cultivadas a partir de sementes de Trichoderma tratadas foram colhidas do teste de campo (próxima seção) em 2015 e testadas quanto à presença de Trichoderma ou bactérias. As sojas de 2015 foram colhidas a partir de plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com o produto comercial GraphExSA™ que contém T. virens cepa K1. Vários milhares de sementes de milho e soja foram dispostas em placa em ágar de dextrose de batata. Além disso, tanto as sementes de milho quanto de soja tiveram a superfície esterilizada conforme descrito acima, foram esmagadas e, então, dispostas em placa em ágar de dextrose de batata. Esta etapa posterior foi incluída especificamente para detectar fungos transportados internamente.

[0192] Experimentos de campo. Um experimento de campo foi estabelecido em milho (Zea mays) próximo a Phelps, NY (Baar Scientific, LLC) em 2014. As sementes de um híbrido comercial transgênico resistente a glifosato, A91-92R foram obtidas junto à Albert Lea Seeds, Albert Lea, MN. As sementes foram comercialmente tratadas com ACCELERON, uma mistura de pesticida contendo ipconazol, metalaxil, trifloxistrobina (fungicidas) e clotianidina (inseticida). As sementes foram supertratadas com uma mistura de formulação líquida de K2 e K4, que é o produto comercial SABREX LQ, de acordo com as orientações do fabricante. Outras sementes foram tratadas com um adjuvante consistindo em uma mescla de um produto de ácido húmico e nutrientes menores, doravante designados MJ, junto com K2, K5 + As2, ou K2 + As2. As cepas fúngicas usadas foram uma suspensão líquida de conídio a 8 x 108 cfu/ml, e a concentração de As2 foi de 8 x 109 cfu/ml. As suspensões microbianas foram usadas para tratar sementes à taxa de 0,9 ml/kg de semente para cada organismo. Essa é a taxa de tratamento de semente de Trichoderma recomendada para um produto comercial (SABREX LQ™, www.abm1st.com). Os experimentos preliminares demonstraram que todos os organismos usados no supertratamento são estáveis na presença dos pesticidas químicos (dados não mostrados).

[0193] As plotagens foram estabelecidas em um solo de argila arenosa com potencial de rendimento moderado. Estes testes foram conduzidos em um projeto em blocos replicado com quatro réplicas. Cada tratamento + réplica consistiu em quatro fileiras a 76 cm de distância e 6 m de comprimento plantadas em uma orientação norte-sul. As sementes foram plantadas em 17 de junho após uma primavera úmida fria, a colheita de silagem foi em 15 de setembro e a colheita de grão em ou cerca de 20 de novembro. A primeira geada exterminadora foi na última semana de outubro. As ervas-daninhas foram controladas com herbicida de glifosato seguindo as recomendações do fabricante. A fertilização no momento da plantação foi com 46 kg de N/Ha real em uma formulação de 19:19:19. Isso foi seguido por uma peliculização de 96 kg em meados de julho como uma aplicação por difusão de superfície e uma terceira aplicação similar em meados de agosto. Toda a colheita para o rendimento foi das duas fileiras intermediárias de cada réplica de tratamento. Para o rendimento de grão, os 4,6 m intermediários das fileiras foram colhidos e para a silagem, os 2,3 m ao norte foram colhidos. Para as medições de raiz e outra amostragem destrutiva, as plantas foram cavadas ou, de outro modo, colhidas das fileiras externas, na direção oposta às áreas que seriam colhidas para rendimento.

[0194] A altura de planta foi medida duas vezes durante a estação: imediatamente antes da formação de borla e na colheita. Os pesos de silagem e grão (rendimento) foram coletados após a colheita, e as % de nitrogênio e carbono foram submetidas a ensaio por um serviço comercial (A&L Laboratories ou Cornell Nutrient Analysis Laboratory.

[0195] Experimentos de campo, 2015. Os testes de campo foram conduzidos novamente em 2015. Os dados em 2014 sugeriram que os rendimentos de grão foram limitados pelos limites de desempenho da variedade usada. Ou seja, aumentos em fotossintato aparentemente foram convertidos em biomassa vegetativa de modo mais eficaz do que para o rendimento de grão (Tabela 8). Portanto, em 2015, foram testadas cinco variedades de milho descritas pelo fornecedor como tipos de espiga determinates (2 variedades), semiflexíveis (2 variedades) e totalmente flexível (1 variedade) ou como grão ou propósito duplo (produção de silagem e grão). Estes foram fornecidos pela Chemgro Company e são designados como 5469 RSX (determinante, grão), 5018 G3 (determinante, propósito duplo); 5245 RDP (semiflexíveis, propósito duplo), 5455 RDP (semiflexíveis, grão) e 6490 (propósito duplo, totalmente flexível). Todas as sementes usadas nos experimentos foram tratadas com uma mistura de inseticida/fungicida (Cruiser Maxx 250, Syngenta Crop Protection) que contém tiametoxame, fludioxonila, mefenoxame, azoxistrobina e tiabendazol.

[0196] Antes da plantação, subamostras de cada variedade foram tratadas com SABREX LQ de acordo com orientações do fabricante. Outras subamostras foram tratadas com K5 + As2 ou K2 + As2 em combinação com uma modalidade da presente invenção designada OMEGA™, contendo 20 g de ácido húmico (Leondarite shale), 5 g de extrato de levedura e 100 µl de 1-octen-3-ol (Sigma Chemical Co.) em 1 l de água, e ajustado ao pH 6,2. OMEGA™ também foi usado sozinho como um tratamento separado sem agentes microbianos. Esta mistura foi aplicada à taxa de 0,65 ml/kg de sementes e foi desenvolvida para fornecer uma substituição definida quimicamente para o material de humato usado em 2014. Uma baixa concentração de 1-octen-3-ol

(álcool de cogumelo), que é um metabólito volátil de cepas de Trichoderma, foi incluída, visto que induz resistência às doenças de planta como também foi relatado por terceiros e foi observado que é um indutor potente de crescimento de planta intensificado em concentrações muito baixas.

[0197] Este teste foi localizado em um solo francoargiloso próximo a Waterloo, NY. As plotagens foram dispostas por variedade através do campo, como duas fileiras com 22,5 m de comprimento. Cada tratamento x variedade foi colhido para silagem e grão. Para esta colheita, cada conjunto de fileiras foi dividido em quatro blocos, cada um com 1,8 m de comprimento, por colheita de silagem intercaladas com quatro blocos, cada um 3,6 comprimento para a colheita de grão. As plotagens receberam cerca de

56.000 l/ha de esterco fresco incorporado antes da plantação que resultou em uma aplicação de cerca de 155 Kg N/acre e outros 150 Kg de N foram aplicados como uma peliculização lateral de suspensão líquida contendo 32% de N em cerca de V4.

[0198] As plotagens receberam chuva intensa de mais de 20 cm ao longo de um período de três semanas logo após a emergência (a última semana de maio até as primeiras duas semanas de junho). As plotagens foram disposta de modo que, pela totalidade deste período de 3, uma porção do campo estivesse saturada ou, por grande parte do tempo, completamente submersa. Esta área do campo coincidiu quase exatamente com aquela plantada com 5245 RDP, e foi inundada de modo relativamente uniforme. Assim, os testes com esta variedade proporcionaram uma boa oportunidade para examinar a capacidade dos tratamentos de semente para auxiliar o milho na recuperação de estresse de inundações. O restante das variedades estava em solo mais alto e, portanto, não foi submetido a esse estresse.

[0199] O grão e silagem foram colhidos manualmente. Cada bloco foi dividido em quatro segmentos e 10 espigas de grão e 10 plantas para silagem foram colhidas para cada tratamento.

[0200] Experimentos de Campo de 2016. Os testes em 2014 foram limitados a uma variedade e aquelas em 2015 foram pequenas. Portanto, um teste compreensivo maior foi conduzido para verificar os dados iniciais. Esse teste foi conduzido em Whitewater, WI com Consultoria de Agri-Tech, com cooperação com aplicantes. Os híbridos 5245 de Chemgro (semiflexíveis, propósito duplo), 5445 (semiflexíveis, grão) e 5469 (determinado, grão) foram usados para a segunda estação. Essas sementes destes foram tratadas com Cruiser Maxx como descrito acima e, então, supertratada sem nada (controle), K2 + K4 (SABREX), com 1-octeno-3-ol (identificado OMEGA e usando a mesma formulação descrita para 2015) ou com K5 formulações líquidas usando as taxas de tratamento mostradas acima. Nenhum adjuvante ou outros micróbios foram usados com o K2 + K4 ou os tratamentos de K5.

[0201] Um tratamento de fertilizante de base foi aplicado para fornecer 138 kgNha como ureia e, além de uma aplicação de peliculização lateral como ureia para fornecer 78, 190, 302 e 414 kg N/ha também foi aplicada como uma peliculização lateral. As plotagens foram estabelecidas usando um bloco completo randomizado para cada nível de N e cada nível de N estava em um bloco adjacente separado. O solo foi uma argila sedimentosa de Milford profunda com 3,4% de matéria orgânica no solo. As plotagens receberam umidade adequada ao longo da estação, e as condições foram excelentes para crescimento de milho.

[0202] As plotagens similares foram estabelecidas próximas a Lyons, NY em uma argila saibrosa rochosa. Infelizmente, em algumas plotagens, o milho foi cultivado de modo muito insatisfatório. Entretanto, em outras partes do campo, o milho foi cultivado normalmente e foi possível observar crescimento de raiz como descrito no Objetivo abaixo.

[0203] O crescimento de raiz intensificado. A partir do teste de campo e outros testes, foi evidente que os tratamentos usados nos testes de campo de 2014 e 2015 intensificaram o crescimento e desenvolvimento de raiz. Entretanto, enquanto os testes de estufa fornecerem informações sobre plantas jovens, foi difícil na colheita e medição de crescimento de raiz sobre a estação inteira no campo. Portanto, o desenvolvimento foi um sistema permitindo o crescimento de plantas ao longo de uma estação completa em canos de PVC após o qual a massa de raiz inteira foi removida do solo e medido. Além disso, testes de observação foram conduzidos em plantas únicas em tubos similares acima do solo, que continham uma janela para medir o comprimento de raiz ao longo do tempo e no campo em Lyons, NY, em que o milho foi cultivado normalmente.

[0204] Experimentos em canos de PVC. As sementes foram tratadas como descrito no objetivo anterior. As sementes de híbrido 5245 foram iniciadas na estufa, e após um crescimento de cerca de 2 semanas, as mesmas foram transplantadas em solo de campo contido em canos de PVC de 20 cm de diâmetro x 210 cm de comprimento com uma limitação de PVC em que orifícios foram perfurados para drenagem. Esses tubos foram preenchidos com solo para fornecer um tubo de solo de cerca de 200 cm de comprimento. Os canos foram colocados verticalmente no solo e um solo de campo de argila sedimentosa foi adicionado aos canos e, então, regados para compactar o solo. Os comprimentos de raiz dos tratamentos mais bem-sucedidos completamente preencheram os tubos do topo ao fundo.

[0205] Observações de raiz no campo. Os testes de observação foram conduzidos em raízes no campo em Lyons, NY, em plotagens lado a lado, em que o milho foi cultivado normalmente. As áreas escolhidas suportaram um bom crescimento de raiz e receberam um total de 414 kg/ha de nitrogênio como uma aplicação pré-planta de 78 kg/ha seguida pela peliculização lateral em cerca de V4 para fornecer o N restante.

[0206] Análise de Dados. Rendimento, biomassa e outros caracteres medidos durante as estações de cultivo de 2014 e 2015 foram analisados usando as análises estatísticas realizadas usando RStudio (https://www.rstudio.com/) como descrito nos resultados a seguir.

[0207] Resultados - Crescimento dos agentes microbianos em radículas emergindo de sementes tratadas.

[0208] O método mais simples e mais eficaz para aplicar os micróbios endofíticos é por meio de tratamento de semente. As cepas de Trichoderma foram aplicadas às sementes como conídio, e para que os tratamentos descritos no presente documento sejam eficazes, o conídio deve germinar rapidamente e colonizar a radícula. Isso foi avaliado microscopicamente com a cepa K2 (Figuras 13A a 13B). A microscopia de fluorescência confocal revelou que esta cepa colonizou a radícula como hifa após 48 horas da embebição de semente. Aos três dias, um crescimento pesado do fungo foi observado, junto com a formação de phialades para a próxima geração de conídio.

[0209] As Figuras 13A a 13B ilustram a colonização inicial de plântulas de um tratamento de semente. À esquerda é mostrado um fotomicrográfico de uma radícula emergente de milho de sementes tratadas com conídio de cepa K2, manchado com Calcofluor e visualizado com microscopia epifluorescente. Sem manchamento e iluminação, o organismo não pode ser visto. Foi tomada a imagem da radícula 48 horas após a embebição se iniciada, logo após a radícula emergir do revestimento de semente (Figura 13A). A reticulação azul é o organismo; hifas são cerca de 4 µm de largura. A Figura 13B mostra uma imagem em tons de cinza (usada para intensificar o contraste) de uma raiz 72 horas após a embebição. O crescimento do organismo é mais pronunciado e philiades são visíveis (seta).

[0210] A localização sobre e nas plantas e grão produzidos a partir de sementes tratadas. A habilidade de cinco cepas aqui apresentadas, representando três espécies de Trichoderma endofítica foi investigada dispondo-se em placas os segmentos de broto ou raiz de superfície esterilizada de soja ou milho. Os segmentos de raiz de plântulas jovens cultivados a partir de sementes tratadas foram frequentemente, mas nem sempre, colonizados pelas cepas de Trichoderma. Visto que os segmentos de raiz tiveram a superfície esterilizada, as cepas de Trichoderma que foram cultivadas mostraram ter colonizado as porções internas das raízes e, portanto, foram endófitos. Uma porcentagem significativamente inferior dos segmentos de raiz de sementes não tratadas também foi colonizada por algumas cepas de Trichoderma (consultar a Tabela 5, abaixo). Visto que as cepas de Trichoderma são ubíquas na maioria dos ambientes, é considerado que a colonização de raízes de controle pode ter surgido a partir de contaminantes no ambiente. Para avaliar esta hipótese, os fungos de algumas das raízes de plantas de controle de milho híbrido 4250 foram isolados em PDA, o DNA foi isolado e o DNA do TEF1 (fator 1 de alongamento de translocação de codificação) e ITS (espaçados transcrito interno de codificação) foi ampliado. Essas sequências são frequentemente usadas para taxonomia de cepas de Trichoderma (Samuels e Hebbar 2015). Os resultados de três dos contaminantes presumidos indicaram que duas das cepas foram T. asperellum, enquanto a terceira foi T. virens. Claramente, duas das três foram de espécies diferentes, que qualquer uma das presentes cepas, confirmando, assim, a hipótese d que as cepas colonizando as raízes de plantas de controle eram de espécies contaminantes. Embora as raízes tenham sido colonizadas, nenhum dos brotos foram (Tabela 5), indicando fortemente, assim, essas cepas de Trichoderma endofíticas foram localizadas nas raízes e não colonizaram os brotos.

[0211] A ausência de qualquer uma das cepas em sementes produzidas a partir de plantas cultivadas de sementes de Trichoderma tratadas. Tabela 5: Testes comparando a colonização de brotos ou raízes com Trichoderma. Variedade Dias de % de segmentos % de segmentos probabilidade de crescimento de broto de raiz teste de Dunnett colonizados colonizados - raízes* Híbrido de milho 6490 20 0 88 0,00167 SabrEx 0 14 Controle Híbrido de Milho 4250 K1 21 0 89 < 0,001 K2 0 75 0,0554 K3 0 69 0,01993 K4 0 78 0,00283 K5 0 69 0,01988 Controle 0 36 Soja-Viking MX000209 K1 31 0 83 0,00166 K2 0 75 0,00373 Controle 0 12

[0212] Os valores fornecidos na Tabela 5 são a probabilidade (usando Constrastes de Dunnett) de que a porcentagem de raízes colonizadas e colhidas a partir das sementes tratadas não foi diferente da porcentagem das raízes cultivadas a partir de sementes de controlo (não tratadas). Para cada comparação, seis plântulas foram cultivadas e duas raízes foram colhidas de cada. Três segmentos de 1 cm foram tomados de cada raiz para representar partes proximais, mediais e distais das raízes em relação à semente e, então, superfície esterilizada. Os valores apresentados são a porcentagem de segmentos de raiz totais das seis plantas que foram colonizadas como evidenciado pela disposição em placa em ágar de dextrose de batata acidificado com o restritor de colônia Igepal Co630.

[0213] Uma consideração importante para autoridades reguladoras é se as sementes da próxima geração de sementes produzidas a partir de plantas cultivadas de sementes tratadas serão colonizadas por Trichoderma. Para estas avaliações, as sementes de milho de cinco híbridos produzidas a partir de plotagens mostradas na Figura 3 foram colhidas e dispostas em placa em Ig de PDA. De modo similar, as sementes de três variedades foram colhidas de soja cultivada no campo e tratadas ou não tratadas com K1 + Bradyrhizobium japonicum. O teste foi conduzido em 5.000 sementes de milho e 1.200 sementes de soja. Nenhuma cepa de Trichoderma foi detectada em quaisquer sementes embora houvesse colonização abundante por bactérias contaminantes (com base na morfologia de colônia provavelmente Bacillus spp.) e fungos (como Penicillium e Fusarium spp), no meio (consultar Tabelas 6 e 7, abaixo). Tabela 6: Os números de sementes de milho de plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com Trichoderma (200 sementes foram testadas) que deram origem a Trichoderma spp., e, onde testadas, outros micro-organismos.

Híbrido Tratamento no 2a geração de % de % de sementes sementes/200 sementes com com testadas dando outras contaminação origem à infecção contaminações bacteriana de Trichoderma fúngicas em Ig de PDA 6490 K2 + K4 0 Não realizado Não realizado 6490 Metabólito 0 Não realizado Não realizado 6490 apenas 0 Não realizado Não realizado 6490 K2 + K4 + As2 0 Não realizado Não realizado 6490 K5 + As2 0 Não realizado Não realizado Controle 5018 K2 + K4 0 Não realizado Não realizado 5018 Metabólito 0 Não realizado Não realizado 5018 apenas 0 Não realizado Não realizado 5018 K2 + K4 + As2 0 Não realizado Não realizado 5018 K5 + As2 0 Não realizado Não realizado

Híbrido Tratamento no 2a geração de % de % de sementes sementes/200 sementes com com testadas dando outras contaminação origem à infecção contaminações bacteriana de Trichoderma fúngicas em Ig de PDA Controle 5469 K2 + K4 0 Não realizado Não realizado 5469 Metabólito 0 Não realizado Não realizado 5469 apenas 0 Não realizado Não realizado 5469 K2 + K4 + As2 0 92 85 5469 K5 + As2 0 Não realizado Não realizado Controle 5245 K2 + K4 0 Não realizado Não realizado 5245 Metabólito 0 Não realizado Não realizado 5245 apenas 0 Não realizado Não realizado 5245 K2 + K4 + As2 0 79 98 5245 K5 + As2 0 Não realizado Não realizado Controle 5445 K2 + K4 0 76 95 5445 Metabólito 0 84 95 5445 apenas 0 80 90 5445 K2 + K4 + As2 0 82 83 5445 K5 + As2 0 72 96 Controle

Tabela 7: Os números de sementes de soja de plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com Trichoderma (200 sementes foram testadas) que deram origem a Trichoderma spp., e, onde testadas, outros micro-organismos.

Variedade Tratamento no 2a geração de % de % de sementes sementes/200 testadas sementes com com dando origem à infecção outras contaminação de Trichoderma em Ig de contaminações bacteriana PDA fúngicas

1445 K1 + 0 Não realizado Não realizado 1445 Bradyrhizobium 0 Não realizado Não realizado Controle

Variedade Tratamento no 2a geração de % de % de sementes sementes/200 testadas sementes com com dando origem à infecção outras contaminação de Trichoderma em Ig de contaminações bacteriana PDA fúngicas 1749 K1 + 0 Não realizado Não realizado 1749 Bradyrhizobium 0 Não realizado Não realizado Controle 1948 K1 + 0 38 97 1948 Bradyrhizobium 0 88 67 Controle

[0214] Entretanto, pode-se argumentar que estes outros micróbios preveniram o crescimento das cepas de Trichoderma. Também é possível que as sementes em si tenham prevenido o crescimento de contaminação interna de Trichoderma spp. devido às limitações físicas. Esses problemas foram solucionados por esterilização de superfície de sementes adicionais seguidas por esmagamento das mesmas com alicates antes da plantação das sementes em Ig de PDA. As cinquenta sementes de milho híbrido 5469 e variedade de soja 1445 foram submetidas a estes tratamentos. Das 50 sementes de cada tipo, nenhuma das sementes esmagadas de superfície esterilizada deu origem a quaisquer cepas de Trichoderma. Entretanto, outros organismos colonizaram estas sementes; os colonistas internos incluíram, com base na morfologia de colônia, Epicoccum, fungos com hifas estéreis e Fusarium spp.

[0215] Os resultados da plantação de broto-raiz e os estudos de colonização de semente indicam fortemente que as cepas de Trichoderma usadas em tais estudos colonizam as raízes, porém, não brotos ou sementes.

[0216] Os testes de campo, 2014 e 2015. Em 2014, os rendimentos (tanto grão quanto silagem) e parâmetros de crescimento e desenvolvimento foram medidos em uma única variedade. As alturas de planta, o diâmetro de tronco e pesos de broto foram todos aumentados significativamente pelos tratamentos de semente (isto é,

K5+As2 com o adjuvante, K5 com o adjuvante e SABREX) em relação ao controle quando medido no campo imediatamente antes da formação de borla (Tabela 8). Entretanto, as alturas de planta de tratamento não foram significativamente diferentes quando medidas após as plantas amadurecerem (dados não mostrados). Os rendimentos tanto de grão quanto de silagem foram significativamente aumentados por tratamento com K5 + As2, com K5 e, a uma extensão menos, por SABREX, (1 o conjunto de colunas nas Figura 3 e Tabela 3), porém, o aumento de 9 a 12 t/ha com o tratamento de SABREX não foi significativo com o tratamento de SABREX. K5 sem As2 forneceu resultados muito similares àqueles de K5 + As2 (rendimentos de grão de ambos foram 11,7 t/ha e os rendimentos de silagem foram 68,6 e 62,5 t/ha, respectivamente, para K5 + As2 e K5 sozinho)(consultar as Figuras 14A a 14D). No final da estação, as doenças de folha foram evidentes. O tratamento com os agentes biológicos resultou em uma redução significativa em flagelo de folha do norte, porém, um aumento na ferrugem de folha de milho (Tabela 8). Tabela 8: Medições de crescimento de planta e desenvolvimento em 2014.

Tratamento Altura de Diâmetro Peso de Peso de % de % de Planta de Talo broto/plant raiz (g) Ferrugem Flagelo de (cm) (mm) a (g) de Folha Folha do de Milho Norte Controle 116 14,7 342 56,5 3,8 8 K5 As2 MJ 146 17,2 522 133 4,3 4,6 K5 MJ 135 16,8 452 95 5,4 5,4 SabrEx 123 16,4 363 69 4,3 4,3

[0217] Com referência à Tabela 8, todas as análises estatísticas foram conduzidas com versão 8 de ARM (Gilling Data Mangement, Brooking SD 57006). Os dados de altura de planta foram coletados em 5 de agosto 2014 e cada valor representa a média de 10 alturas de planta do centro da plotagem aproximadamente no estágio de crescimento Vt. O CV foi 11,44%, o valor de Barlett X2 foi de 3,234. A probabilidade de que médias de valores de réplica tenham sido similares foi de 0,78 e que as médias de tratamento foram similares foi de 0,031.

[0218] Os dados de diâmetro de talo e peso de broto foram coletados em 5 de agosto de 2014, e cada valor representa a média de diâmetros de talo de 10 plantas do centro da plotagem aproximadamente no estágio de crescimento Vt. O CV foi 9,16%, o valor de Barlett X2 foi de 14,90, e a probabilidade de que as médias de réplica foram similares foi de 0,27 e que as médias de tratamento foram similares foi de 0,012.

[0219] Os dados de peso de raiz foram coletados em 4 de agosto de 2014 e cada valor representa a média de pesos de raiz cavadas de 10 plantas/plotagem de fora da área colhida. O CV foi 18,8%, o valor de Barlett X2 foi de 3,44, e a probabilidade de que as médias de réplica foram similares foi de 0,03 e que as médias de tratamento foram similares foi de 0,0026.

[0220] Os dados de ferrugem de folha de milho foram coletados no final da estação e representam a média de % de área de folha coberta por doença de 20 plantas. O CV foi 14,79%, o valor de Barlett X2 foi de 10,44, e a probabilidade de que as médias de réplica foram similares foi de 0,107 e que as médias de tratamento foram similares foi de 0,0087.

[0221] Os dados de flagelo de folha do norte foram coletados no final da estação e representam a média de % de área de folha coberta por doença de 20 plantas. O CV foi 18,67%, o valor de Barlett X2 foi de 6,497. A probabilidade de que médias de valores de réplica tenham sido similares foi de 0,002 e que as médias de tratamento foram similares foi de 0,0064.

[0222] Em 2015, os testes foram conduzidos através de cinco variedades com diferentes tipos de espiga. Os tratamentos de semente avaliados adicionalmente incluíram o uso de OMEGA, que continha o metabólito e uma mistura de adjuvante consistindo em extrato de levedura e um material de ácido húmico e nenhum agente microbiano. Parâmetros de crescimento e desenvolvimento consideravelmente diferentes foram medidos em 2015 e em 2014, porém, a altura de planta imediatamente antes da formação de borla e diâmetros de talo foram aumentados com todos os tratamentos e através de todos os híbridos (Tabela 9). Entretanto, novamente como 2015, as diferenças de altura foram menores na colheita do que antes da formação de borla. O vedor de folha conforme medido usando SPAD portátil foi medido e aumentou como uma consequência do tratamento de semente. Tabela 9. Medições de crescimento de planta e desenvolvimento em 2015. Híbrido Tipo de Espiga Tratamento Altura de Diâmetro de leitura de Observações e Propósito Planta (cm) Talo (mm) SPAD (verdor de folha) 5245 Semiflexível, Controle 99 21 47 Inundado por propósito duplo 3 semanas K5As2 126 29 48 Omega Omega 112 21 50 SabrEx 106 28 59 5469 Determinante, Controle 175 22 18 grão K5As2 210 28 28 Omega Omega 200 32 33 SabrEx 191 26 30 5455 Semiflexível, Controle 175 23 46 grão K5As2 125 29 51 Omega Omega 194 26 51 SabrEx 196 28 51 5018 Determinante, Controle 174 22 47 propósito duplo K5As2 208 28 62 Omega Omega 193 26 50 SabrEx 191 38 53 6490 Totalmente Controle 171 22 46 flexível, K5As2 193 31 51 propósito duplo Omega Omega 201 38 51 SabEx 195 29 50

[0223] Com referência à Tabela 9, cada variedade estava em um bloco separado e, portanto, os meios podem ser apenas estatisticamente comparados dentro das variedades. Houve uma diferença de elevação de cerca de 5 a 10 m no campo, e as variedades são dispostas a partir da plotagem situada mais baixa para a plotagem situada mais alta. Logo após as plântulas emergirem, a área recebeu cerca de 25 cm de chuva em três semanas e por esse período de tempo, a plântula na plotagem situada mais baixa (5245) foi submersa, como a extremidade adjacente da próxima plotagem. Assim, essa parte do experimento é um teste das capacidades dos tratamentos para auxiliar as plantas na recuperação deste estresse. As doenças foliares não foram vistas nestas plotagens. As alturas de planta, os diâmetros de talo e leituras de SPAD foram tomados aproximadamente em V12, imediatamente antes da formação de borla. A densidade de semeadura foi proporcionada para fornecer

80.279 plantas/ha para todas as variedades, e a densidade de planta medida final de

74.100/ha.

[0224] Como em 2014, os rendimentos aumentados de tratamentos de grão, porém, a diferença não foi significativa com o híbrido 5469 (Figura 14C). Os rendimentos de silagem também foram geralmente aumentados, porém, várias combinações de híbridos × tratamentos foram não significativos. Mais notavelmente, os dois híbridos designados para uso com grão, e não silagem (5469 e 5455), forneceram alterações pequenas e não significativas, enquanto outros que são híbridos de propósito duplo para uso tanto para produção de grão quanto de silagem, forneceram melhores resultados (Figuras 14A a 14D).

[0225] Com referência às Figuras 14A a 14D, antes da plantação, todas as sementes foram tratadas com um pesticida comercial (Acceleron em 2014 e Cruiser Max em 2015). Em 2014, as sementes diferentes do controle foram tratadas com o produto comercial de Trichoderma, SABREX LQ (cepas de T. afroharzianum K2 e T. atroviride K4), com Trichoderma atroviride cepa K5, com K5 mais Bacillus amiloliquifaciens cepa As2, ou com K5 sozinho. Em 2015, as sementes foram tratadas com SABREX LQ, com K5 + As2 ou com uma formulação contendo o metabólito 1- octen-3-ol. Os adjuvantes usados nos tratamentos de K5As2 foram diferentes entre os tratamentos em 2014 e 2015. As plotagens foram em blocos randomizados com 4 réplicas/tratamento em 2014 e em 2015, em testes de faixa que foram divididos em 4 réplicas por tratamento. As análises estatísticas totais são apresentadas na Tabela 3 usando múltiplas comparações de meios usando contrastes de Dunnet. Para as comparações nesta Figura, as barras representando desvios-padrão e as letras em caixa baixa que indicam níveis de significância são P = 0,10 são mostrados. As análises comparam apenas tratamentos diferentes através de híbridos específicos e não refletem diferenças entre híbridos diferentes. Os dois gráficos inferiores fornecem os níveis totais estimados de C e N em plantas produzidas com os tratamentos diferentes de semente. Em cada ano, não houve diferença na porcentagem de C ou N em plantas através dos tratamentos. Os valores mostrados representam a % de C ou N x a biomassa de silagem x uma estimativa da contribuição das raízes à biomassa total de acordo com a seguinte equação:

[0226] C ou N total por hectare = DW S x PRNouC x RCE,

[0227] em que:

[0228] DW S é o peso seco de silagem por hectare por tratamento.

[0229] PRNouC é a proporção fracionária de C ou N na planta.

[0230] RCE é a contribuição relativa de raízes para a biomassa total. Com base nos experimentos de tubo de raiz, a biomassa total foi estimada a ser 1,88 x o peso da silagem acima do solo para o controle, 2 x o peso com SABREX, 2,05 x o peso com K5 e K5As2 e 2,1 x o peso com OMEGA. Em outras palavras, as raízes pareceram ser proporcionalmente maiores que os brotos nos experimentos descritos para os experimentos de cano mostrados posteriormente.

[0231] Em contraste com as espectativas, a mistura de tratamento de OMEGA intensificou o crescimento e desenvolvimento de planta pela estação de cultivo inteira aproximadamente tão eficientemente quanto as misturas microbianas quando usadas sozinhas.

[0232] Os dois tratamentos microbianos foram diferentes entre si, o tratamento de SABREX não continha adjuvantes, e apenas cepas de T. afroharzianum, enquanto K5+ As2 foi uma mistura de T. atroviride cepa K5 + B. amiloquifaciens cepa As2. Ambas as misturas de cepas foram usadas em 2014, porém, a composição do tratamento de semente de K5 + As2 foi diferente entre os anos: em 2014, o tratamento foi extrato de levedura mais humato, e em 2015, essa mistura de cepa foi aplicada em combinação com o metabólito na formulação de OMEGA.

[0233] Nesse teste, o híbrido 5245 foi localizado na parte mais baixa do campo, e devido a chuvas muito pesadas por cerca de 3 semanas imediatamente após a plantação, essa variedade foi inundada ou submersa por essas três semanas. O crescimento foi substancialmente impedido, porém, após o período de inundações, crescimento normal foi retomado. Ao longo da estação, em seguida, diferenças visíveis foram evidentes mesmo tão tardia quanto a formação de borla em termos de altura de planta, diâmetro de tronco e verdor de folha (Tabela 2B). Na colheita, os rendimentos de grão foram aumentados de 23 a 44% em plantas cultivadas a partir de sementes tratadas em relação ao controle, e os rendimentos de silagem foram 46 a 85% a mais que o controle. Estes aumentos de rendimento substanciais são pelo menos parcialmente devidos à rápida recuperação de estresse de inundações pelos tratamentos biológicos ou biorracionais.

[0234] Tanto em 2014 quanto em 2015, os aumentos na massa de raiz também foram observados (Tabela 8 e Figura 17C). Entretanto, em solo de campo, não foi possível quantificar precisamente estas diferenças ao longo da profundidade do solo.

[0235] Determina-se que o teor de C, N, Ca, P, Mg, K e S em amostras de silagem no final das estações de 2014 e 2015 (Tabela 4). Os teores de C e N medidos no presente documento estão em conformidade com a literatura publicada; o tecido de tronco de milho cultivado no Texas continha 43% de C e 1,1% de N e o tecido de raiz de milho continha 43% de N e 1,6% de N (Zibilske e Materon 2005); valores similares àqueles relatados no presente documento.

[0236] Embora não haja diferenças em qualquer um destes elementos em uma base de porcentagem, houve um aumento dimensionável na quantidade total em uma base por hectare, devido aos aumentos na biomassa total. Adicionalmente, como observado nas medições no teste de campo (Tabela 5) não apenas a biomassa de planta acima do solo foi maior, mas, as raízes também foram maiores (Figura 17C). A Figura 14C e a Figura 14D fornecem o C e N totais calculados contidos com as plantas quando tanto as raízes quanto os brotos são considerados; os métodos e suposições para calcular a biomassa total são fornecidos na Tabela 11. Tabela 10: Rendimentos de grão de 2014 Múltiplas comparações de médias: Contrastes de Dunnett Fit: aov(fórmula = GrainYld.T.Ha._twt ~ tratamento, dados = d) Hipóstese lineares: Padrão de estimativa valor t de erro Pr(>|t|) K5 - Controle == 0 2,4681 0,9674 2,551 0,0628 . K5As2 - Controle == 0 2,4707 0,9674 2,554 0,0628 . SabrEx - Controle == 0 1,2116 0,9674 1,252 0,4790 --- Códigos signif.: 0 ‘***’ 0,001 ‘**’ 0,01 ‘*’ 0,05 ‘.’ 0,1 ‘ ’ 1 (Valores de p ajustados relatados -- método de etapa única)

Rendimentos de silagem de 2014 Fit: aov(fórmula = Silagem..t.ha. ~ tratamento, dados = d) Hipósteses lineares: Padrão de estimativa valor t de erro Pr(>|t|) K5 - Controle == 0 17,853 5,956 2,997 0,02836 * K5As2 - Controle == 0 25,620 5,956 4,301 0,00256 ** SabrEx - Controle == 0 13,726 5,956 2,304 0,09683 . --- Códigos signif.: 0 ‘***’ 0,001 ‘**’ 0,01 ‘*’ 0,05 ‘.’ 0,1 ‘ ’ 1 (Valores de p ajustados relatados -- método de etapa única)  test.dunnett = glht(aov.out, linfct=mcp(tratamento="Dunnett"))  confint(test.dunnett)

Rendimentos de grão de 2015 Geral  my.aov<-aov(Yield_t.ha15pctMC ~ VAR + REP + TRT, dados=d)  sumário(my.aov)

Df Som Sq Média Sq F valor Pr(>F) VAR 1 53,95 53,95 18,912 3,50e-05 *** REP 1 0,29 0,29 0,102 0,75 TRT 4 103,04 25,76 9,029 3,31e-06 *** Residuais 93 265,31 2,85 Códigos signif.: 0 ‘***’ 0,001 ‘**’ 0,01 ‘*’ 0,05 ‘.’ 0,1 ‘ ’ 1

5245  my.aov<-aov(Yield_t.ha15pctMC ~ REP + TRT, dados=v5018)  sumário(my.aov) Df Som Sq Média Sq F valor Pr(>F) REP 1 2,353 2,353 1,452 0,2482 TRT 4 23,396 5,849 3,608 0,0319 * Residuais 14 22,693 1,621 Códigos signif.: 0 ‘***’ 0,001 ‘**’ 0,01 ‘*’ 0,05 ‘.’ 0,1 ‘ ’ 1

5469 my.aov<-aov(Yield_t.ha15pctMC ~ REP + TRT, dados=v5469)  sumário(my.aov) Df Som Sq Média Sq F valor Pr(>F) REP 1 2,846 2,846 1,644 0,221 TRT 4 15,443 3,861 2,230 0,118 Residuais 14 24,240 1,731

5445  my.aov<-aov(Yield_t.ha15pctMC ~ REP + TRT, dados=v5445)  sumário(my.aov) Df Som Sq Média Sq F valor Pr(>F) REP 1 0,47 0,472 0,496 0,493 TRT 4 32,79 8,196 8,616 0,001 **

Residuais 14 13,32 0,951

5018  my.aov<-aov(Yield_t.ha15pctMC ~ REP + TRT, dados=v5018)  sumário(my.aov) Df Som Sq Média Sq F valor Pr(>F) REP 1 2,353 2,353 1,452 0,2482 TRT 4 23,396 5,849 3,608 0,0319 * Residuais 14 22,693 1,621

6490 my.aov<-aov(Yield_t.ha15pctMC ~ REP + TRT, dados=v6490)  sumário(my.aov) Df Som Sq Média Sq F valor Pr(>F) REP 1 0,78 0,778 0,459 0,50936 TRT 4 37,44 9,361 5,517 0,00701 ** Residuais 14 23,75 1,697 Códigos signif.: 0 ‘***’ 0,001 ‘**’ 0,01 ‘*’ 0,05 ‘.’ 0,1 ‘ ’ 1

Rendimentos de silagem de 2015 Geral aov.out = aov(revHaWT ~ TRT*VAR, dados=d)  sumário(aov.out) Df Som Sq Média Sq F valor Pr(>F) TRT 4 5754 1.438,6 7,375 3,55e-05 *** VAR 1 2326 2325,8 11,923 0,000851 *** TRT:VAR 4 1613 403,3 2,067 0,091769 , Residuais 89 17.362 195,1 Códigos signif.: 0 ‘***’ 0,001 ‘**’ 0,01 ‘*’ 0,05 ‘.’ 0,1 ‘ ’ 1

Por Híbrido 5245 Df Som Sq Média Sq F valor Pr(>F) TRT 4 1.831 457,8 5,666 0,00553 ** Residuais 15 1.212 80,8 --- Códigos signif.: 0 ‘***’ 0,001 ‘**’ 0,01 ‘*’ 0,05 ‘.’ 0,1 ‘ ’ 1 Múltiplas comparações de médias: Contrastes de Dunnett Fit: aov(fórmula = revHaWT ~ TRT, dados = d5245) Hipósteses lineares: Padrão de estimativa valor t de erro K5As2 Omega - Controle == 0 14,625 6,356 2,301 Omega - Controle == 0 18,250 6,356 2,871 SabrExLQ - Controle == 0 27.300 6.356 4.295 Pr(>|t|) K5As2 Omega - Controle == 0 0,11012 Omega - Controle == 0 0,03782 * SabrExLQ - Controle == 0 0,00231 ** --- Códigos signif.: 0 ‘***’ 0,001 ‘**’ 0,01 ‘*’ 0,05 ‘.’ 0,1 ‘ ’ 1 (Valores de p ajustados relatados -- método de etapa única)

5469 aov.out = aov(revHaWT ~ TRT, dados=d5469)  sumário(aov.out) Df Som Sq Média Sq F valor Pr(>F) TRT 4 750,6 187,7 0,903 0,489 Residuais 14 2.910,6 207,9 Múltiplas comparações de médias: Contrastes de Dunnett Fit: aov(fórmula = revHaWT ~ TRT, dados = d5469)

Hipósteses lineares: Padrão de estimativa valor t de erro K5As2 Omega - Controle == 0 -10,850 10,196 -1,064 Omega - Controle == 0 5,217 11,012 0,474 SabrExLQ - Controle == 0 2,725 10,196 0,267 Pr(>|t|) K5As2 Omega - Controle == 0 0,680 Omega - Controle == 0 0,970 SabrExLQ - Controle == 0 0,996 (Valores de p ajustados relatados -- método de etapa única)

5445  aov.out = aov(revHaWT ~ TRT, dados=d5455)  sumário(aov.out) Df Som Sq Média Sq F valor Pr(>F) TRT 4 226 56,51 0,554 0,699 Residuais 15 1.529 101,95  lsd<-LSD.test(aov.out, "TRT", alfa=0.1)  lsd Múltiplas comparações de médias: Contrastes de Dunnett Fit: aov(fórmula = revHaWT ~ TRT, dados = d5455) Hipósteses lineares: Padrão de estimativa valor t de erro K5As2 Omega - Controle == 0 8,350 7,140 1,170 Omega - Controle == 0 8,400 7,140 1,177 SabrExLQ - Controle == 0 8,850 7,140 1,240 Pr(>|t|) K5As2 Omega - Controle == 0 0,604 Omega - Controle == 0 0,599 SabrExLQ - Controle == 0 0,558

(Valores de p ajustados relatados -- método de etapa única)

5018  aov,out = aov(revHaWT ~ TRT, dados=d5018)  sumário(aov,out) Df Som Sq Média Sq F valor Pr(>F) TRT 4 1.820 455,1 2,302 0,106 Residuais 15 2966 197,7  lsd<-LSD,test(aov,out, "TRT", alfa=0,1)  lsd $estatística CV de Média MSerror LSD 64,075 21,94518 197,7222 17,43039 Múltiplas comparações de médias: Contrastes de Dunnett Fit: aov(fórmula = revHaWT ~ TRT, dados = d5018) Hipósteses lineares: Padrão de estimativa valor t de erro K5As2 Omega - Controle == 0 19,375 9,943 1,949 Omega - Controle == 0 23,050 9,943 2,318 SabrExLQ - Controle == 0 24,025 9,943 2,416 Pr(>|t|) K5As2 Omega - Controle == 0 0,2022 Omega - Controle == 0 0,1069 SabrExLQ - Controle == 0 0,0894 ** --- Códigos signif,: 0 ‘***’ 0,001 ‘**’ 0,01 ‘*’ 0,05 ‘,’ 0,1 ‘ ’ 1 (Valores de p ajustados relatados -- método de etapa única)

6490  aov,out = aov(revHaWT ~ TRT, dados=d6490)

 sumário(aov,out) Df Som Sq Média Sq F valor Pr(>F) TRT 4 5643 1410,8 9,029 0,00064 *** Residuais 15 2.344 156,3 --- Códigos signif.: 0 ‘***’ 0,001 ‘**’ 0,01 ‘*’ 0,05 ‘.’ 0,1 ‘ ’ 1 Múltiplas comparações de médias: Contrastes de Dunnett Fit: aov(fórmula = revHaWT ~ TRT, dados = d6490) Hipósteses lineares: Padrão de estimativa valor t de erro K5As2 - Controle == 0 15,200 8,839 1,720 Omega - Controle == 0 26,375 8,839 2,984 SabrEx - Controle == 0 47,000 8,839 5,317 Pr(>|t|) K5As2 - Controle == 0 0,2910 Omega - Controle == 0 0,0305 * SabrEx - Controle == 0 <0,001 *** --- Códigos signif.: 0 ‘***’ 0,001 ‘**’ 0,01 ‘*’ 0,05 ‘.’ 0,1 ‘ ’ 1 (Valores de p ajustados relatados -- método de etapa única)

[0237] Testes de Campo, 2016. Os resultados de campo em rendimentos de grão em 2015 foram validades em 2016 ao longo de três dos mesmos híbridos usados em NY em 2015 (Figuras 14A a 14D, Figuras 15A a 15C e Figuras 16A a 16C). Além disso, hipoteticamente os níveis de fertilização de N podem contribuir com resultados e, portanto, sistemas de gerenciamento de N testados que utilizam os tratamentos de semente descritos no presente documento. AS condições de cultivo em 2016 foram aproximadamente ideais e os testes foram conduzidos em solos de argila sedimentosos profundos com bom teor de matéria orgânica. Deve-se observar que o tratamento de K5 foi diferente daquele em 2014 ou 2015, no sentido de que, em 2016,

K5 foi usado sozinho sem outro tratamento biológico ou adjuvante.

[0238] Todos os tratamentos de semente resultaram em maiores rendimentos do que o controle (Figuras 15A a 15C e Figuras 16A a 16C). Os rendimentos totais para cada variedade através dos diferentes níveis de N são mostrados no painel esquerdo. Visto que as alterações nos rendimentos são difíceis de ver nestes gráficos, as alterações de rendimento com cada híbrido e tratamento são mostradas no painel da direita (Figura 4). As diferenças gerais nos rendimentos de todas as variáveis (tratamento, híbrido e nível de N foram altamente significativos (Figura 4). Os níveis de fertilidade de N produziram uma grande diferença; com o nível mais baixo de N fornecendo rendimentos menores e menos uniformes do que os níveis superiores. À medida que o N aumentou, os termos de erro (consultar as barras representando SD) diminuíram, e os tratamentos de semente também diminuíram os termos de erro. Os níveis superiores de variabilidade foram os mais notáveis nos níveis de N inferiores. Através de todos os tratamentos e níveis de N, os rendimentos foram maiores quando as sementes tratadas foram usadas, com a única exceção sendo com OMEGA a 336 kg de N/ha. Em muitos casos, o aumento de rendimento foi grande, até cerca de 2,5 Kg/Ha. Em geral, os aumentos de rendimento associados ao OMEGA foram maiores nos níveis de N inferiores.

[0239] Com referência às Figuras 15A a 15C e Figuras 16A a 16C, são mostrados rendimentos e aumentos de rendimento de três cultivares de milho do teste de campo em Wisconsin na presença de três tratamentos de semente biológicos diferentes, mais um controle e ao longo de quatro taxas de fertilizante de nitrogênio. Cada valor é a média de quatro réplicas e as barras no conjunto da esquerda de gráficos representam desvios-padrão. Houve altos níveis de significância e inúmeras interações. Tabela 10: fornecimento de análises estatísticas gerais usando contrastes de Dunnett a seguir: Variável Df Som Sq Média Sq F valor Pr(>F) tratamento 3 6.981 2.327 4,116 0,0075 ** híbrido 1 21.176 21.176 37,459 5,96e-09 *** nitrogênio 1 190.618 190.618 337,186 < 2e-16 ***

Réplica 1 31 31 0,055 0,8150 TRT:híbrido 3 1.594 531 0,940 0,4226 TRT:nitrogênio 3 1.204 401 0,710 0,5474 híbrido:nitrogênio 1 1.078 1.078 1,907 0,1690 TRT:híbrido:nitrogênio 3 105 35 0,062 0,9797 Residuais 175 98.931 565 --- Códigos signif.: 0 ‘***’ 0,001 ‘**’ 0,01 ‘*’ 0,05 ‘.’ 0,1 ‘ ’ 1

[0240] Observações de campo. Em Illinois, em 2012, houve uma seca rigorosa, com falha de cultura generalizada. As diferenças na suscetibilidade à seca foram óbvias na cultura madura entre os campos que receberam a semente de SABREX vs não (todos recebendo o tratamento químico padrão). O tratamento de semente foi aplicado vários meses antes que a seca se tornasse aguda. Essas diferenças foram observadas como sobrevivência de planta, em crescimento de espiga, e preenchimento de grão. Especialmente proeminente, foi o grau de acastanhamento e morte de folha aparente entre os tratamentos (Figura 17B).

[0241] Também são mostradas apresentações visuais de plantas dos testes de

2015. Tanto os brotos quanto as raízes foram substancialmente maiores (Figura 17A), e isso é consistente com os tamanhos de planta medidos em 2014 e 2015. As diferenças em tamanhos de planta observadas antes da formação de borla podem não ser reflexivas de tamanhos de planta finais; com alguns tipos de planta (grão vs propósito duplo); o crescimento inicial de plantas pode não se traduzir como para a biomassa de silagem (Figura 15A a 15C). Medição de Tamanhos de Raiz.

[0242] Em experimentos de campo e estufa, foi observado que os tratamentos de semente com os tratamentos de semente biológicos e biorracionais descritos no presente documento aumentam o crescimento de raiz (Tabela 8, Figura 17C). Entretanto, foi impossível examinar as raízes maduras em detalhes quando as plantas são cultivadas no campo. Portanto, o sistema de cano de PVC foi estabelecido, em que as plantas são cultivadas em solo de campo, porém, contidas nos canos de PVC (20 cm de diâmetro x 178 cm de comprimento), com os canos sendo enterrados para manter temperaturas de solo apropriadas. No final da estação, os canos foram removidos do solo, abertos para expor as raízes e o solo, e o solo foi cuidadosamente removido por lavagem. Os comprimentos de raiz foram substancialmente aumentados nas plantas cultivadas a partir de sementes tratadas (Figura 17C), com até um aumento de 2 vezes em biomassa de raiz (peso fresco) com o tratamento de K5. Em outros experimentos (dados não mostrados) um experimento não replicado foi conduzido de modo similar, porém, os tubos estavam acima do solo e continham uma seção transparente através da qual os comprimentos de raiz poderiam ser medidos visualmente. Com este tratamento, o alongamento de raiz nos tratamentos de controle cessou aproximadamente no momento da formação de borla, que, com os tratamentos, o crescimento de raiz persistiu até a maturidade e morte de planta.

[0243] É reconhecido que este é um sistema consideravelmente artificial, portanto, em plotagens de planta cultivadas no campo, são cavadas transeções e, com uma pá, o solo foi removido para expor o sistema de raiz. Todos os tratamentos resultaram em plantas com sistemas de raiz maiores que o controle; estas observações únicas foram conduzidas para validar os experimentos de cano (Figura 19).

[0244] Agora com referência às Figuras 17A a 17C, são ilustradas as aparências acima do solo e raízes do híbrido 6490 do teste de campo para o qual os dados são mostrados; as porções acima do solo mostradas são das mesmas plantas para cada tratamento. Os tratamentos são o controle (C), SABREX (S), K5As2 (K5As2) e OMEGA. As fotografias foram compósitas para agrupar todos os tratamentos na mesma Figura. O painel na direita (C) mostra a aparência de milho e espigas do milho em Illinois na seca de 2012. As plantas na fileira na esquerda foram cultivadas com sementes tratadas com uma mistura de fungicida-inseticida comercial com a mesma mistura de fungicida mais SABREX.

[0245] Agora com referência à Figura 18, são mostrados os comprimentos e pesos frescos de raízes de híbrido 5343 cujas sementes foram tratadas com os tratamentos mostrados e cultivadas em canos de PVC 20 cm de diâmetro x 214 cm de comprimento preenchido com solo de campo com fertilidade e água adequadas. Houve 3 ou 4 réplicas por tratamento; as barras mostradas refletem desvios-padrão, e letras em caixa baixa indicam significância estatística em P=0,10. Os comprimentos de raiz dos tratamentos mais bem-sucedidos completamente preencheram os tubos do topo ao fundo. Observa-se que, neste experimento, as sementes foram tratadas com K5 sozinho, e não K5As2 como nos experimentos anteriores.

[0246] Referindo-se à Figura 19, é mostrada a aparência de raízes individuais que foram parte das medições na Figura 6A. As raízes designadas por C são raízes de controle, S é de raízes cultivadas a partir de sementes tratadas com SABREX, K5 é de sementes tratadas com K5 e O é de sementes tratadas com OMEGA. O comprimento total da fotografia é 289 cm; algumas raízes nos tubos alcançaram e excederam o comprimento do tubo.

[0247] Agora, referindo-se à Figura 20, são mostradas observações únicas de raízes no teste de campo em 2016 que foi parte de um teste de multilocalizações maior que lida com gerenciamento de milho. O milho de híbrido 6538 foi cultivado no campo após os tratamentos de semente sem tratamento biológico (C), SABREX (S), K5As2 (K5As2) sem adjuvantes, e OMEGA (O). Essas plotagens foram expostas a condições de umidade muito baixa a partir do surgimento à formação de borla, com umidade adequada em seguida. As plotagens originalmente receberam 70 kg/ha de N, e foram peliculizadas lateralmente 4 semanas após o surgimento com 370 kg/ha de N. Em seguida, as plotagens foram colhidas, trincheiras transversais foram cavadas e as raízes expostas nos lados verticais da trincheira. Os comprimentos de raízes foram medidos a partir da superfície do solo à ponta de raiz visível mais longa.

[0248] As modalidades apresentadas no presente documento demonstram que os tratamentos de semente com os materiais microbianos ou biorracionais forneceram rendimentos superiores e tinham outras qualidades úteis em comparação com as plantas sem os tratamentos. Todas as plantas em um único híbrido continham o mesmo genoma, porém, os holobiontes produzidos a partir de sementes com os tratamentos microbianos ou biorracionais forneceram respostas diferenciais às condições ambientais em relação às sementes tratadas apenas com químicas de tratamento de semente padrão. Doravante, as plantas produzidas a partir de tratamentos biológicos ou biorracionais no presente documento são descritas como Holobiontes Intensificados (EH), e aquelas produzidas por tratamentos diferentes são EH + o nome do tratamento (por exemplo, EH SABREX OMEGA, etc). As vantagens com o EH incluíram o crescimento de broto e raiz aumentado, rendimentos superiores, resistência aprimorada aos estresses abióticos e capacidade fotossintética intensificada (este último atributo é discutido de modo mais completo posteriormente nesta discussão). Em 2014, a resistência induzida a doença foi observada e, no trabalho recente, o dano de nematódeo foi menor nas plotagens de EH do que nos controles (dados não publicados pelos autores). Embora a utilidade de tratamentos de EH tenha sido demonstrada neste trabalho, seu uso e manipulação no ambiente de campo pode exigir o desenvolvimento de práticas de gerenciamento agrícola alteradas. Por exemplo, em 2016, o aumento de rendimento como uma porcentagem do controle foi substancialmente menor em níveis de fertilidade de N superiores do que nos inferiores. O ABM conduziu várias centenas de testes comerciais com SABREX ao longo dos últimos vários anos, as vantagens de rendimento foram observadas cerca de 2/3 das vezes. Embora os resultados descritos no presente documento sejam promissores, é provável que as plantas com genética avançada, que funcionam de modo eficaz com os materiais microbianos e biorracionais descritos no presente documento possam aprimorar os resultados descritos no presente documento.

[0249] Os resultados descritos no presente documento são com cepas selecionadas ao longo de várias décadas que têm os recursos criticamente importantes de competência endofítica e rizosférica. Estas cepas colonizaram rapidamente as raízes internamente. As mesmas são contidas nas raízes e não se proliferam nas partes acima do solo das plantas, incluindo as sementes e o grão. Os organismos podem ser aplicados de modo eficiente e eficaz como tratamentos de semente, a partir dos quais se tornam integrados nas plantas e se tornam uma parte permanente do fitobioma de planta interno. Isso, então, se torna um simbionte de planta-micróbio que resulta no crescimento e desenvolvimento de planta intensificados.

[0250] Surpreendentemente, em vista das vantagens aparentes aos componentes fúngicos desta simbiose endofítica, isso significa uma capacidade rara entre as cepas de Trichoderma. Isso é demonstrado de modo mais convincente pelo fato de que estes fungos são muito prevalentes nos ecossistemas de cultura ao redor do mundo. Os números totais destes fungos em solos de campo superam a quantidade adicionada pelos tratamentos de semente descritos no presente documento por vários milhares de vezes, contudo, as cepas selvagens claramente não intensificam os rendimentos ou aproveitam o estilo de vida endofítico. Se o fizessem, as cepas como adicionadas como tratamentos de semente não seriam propensas a proporcionar as vantagens aqui demonstradas, visto que a microflora nativa estaria em uma vantagem competitiva e, portanto, controlaria os aprimoramentos acionados por simbiose no desempenho da planta.

[0251] Entretanto, outras cepas de Trichoderma com capacidades endofíticas são conhecidas conforme descrito na introdução. Uma cepa de T. asperellum demonstrou colonizar endofiticamente raízes de pepino e induzir muitas das vantagens mostradas. A cepa T22 de T. harzianum (agora, T. afroharzianum) colonizou raízes, porém, não brotos de milho e resistência induzida a antracnose foliar, e uma cepa de T. viride que intensificou a eficácia fotossintética foi limitada à colonização de córtices de raiz de plantas. A cepa de T. asperellum aumentou a eficácia de uso de água e a fotossíntese no arroz. Estes exemplos e os dados incluídos no presente documento demonstram que a colonização de raiz altamente eficiente e indução de alterações sistêmicas na fisiologia de planta são específicas de cepa e aparentemente, têm pouca relação com espécies em que são incluídas.

[0252] É inesperado o efeito dos tratamentos de semente biorracionais de OMEGA que contêm o metabólito fúngico 1-octen-3-ol, extrato de levedura e ácido húmico (xisto de Leonardita). O metabólito foi usado a uma concentração extremamente baixa de 65 pl/semente. Na estufa, foram testadas concentrações superiores, variando de 200 a 20.000 pl em diferentes formulações e consistentemente foram observados efeitos promotores de crescimento de planta no crescimento de plântula (dados não mostrados). O ácido húmico foi aplicado a 16 µg por semente, e o extrato de levedura, 4 µg/semente. Portanto, as quantidades aplicadas são muito pequenas e não podem crescer ou se proliferar sobre ou dentro de plantas, portanto, foi esperado que seus efeitos fossem transitórios. Entretanto, conforme demonstrado no teste de campo aqui relatado, os efeitos duraram por toda a estação= em dois anos diferentes em dois estados separados sob condições ambientais bem diferentes. Não apenas o crescimento de broto (como evidenciado por aumentos em silagem) e o rendimento de grão são aprimorados, mas, o comprimento de raiz foi aumentado também.

[0253] As preparações de ácido húmico, incluindo xisto de Leonardita como usado neste estudo, mostraram aumentar o crescimento de planta e intensificar os processos fotossintéticos, entretanto, os baixos níveis usados não parecem propensos a fornecer efeitos diretos a longo prazo. Ademais, pelo menos o extrato de levedura e o 1-octeno- 3-ol são prontamente degradados por microflora e o metabólito é volátil, portanto, nenhum destes materiais é propenso a persistir na espermosfera apenas por curtos períodos de tempo. Embora o metabólito persista de alguma forma, à medida que as plantas crescem, a concentração é diluída a níveis minúsculos. Estes materiais exercem influências muito tempo depois, e em partes de planta, remotas, do momento e sítio em que foram aplicados. Assim, nos testes relatados aqui, os efeitos foram separados do tempo de aplicação/semeadura de semente tanto espacial quanto temporariamente. Outro relatório indica que metabólitos de Trichoderma aumentaram a resistência à doença, níveis de antioxidante e crescimento de planta na uva quando o sítio de aplicação foi espacialmente distante do sítio do efeito.

[0254] Há inúmeras explicações possíveis para estas observações, incluindo alterações na estrutura de cromatina levando a alterações na expressão genética vegetal envolvida no desempenho da planta, ou recrutamento de habitantes de rizosfera adicionais com a habilidade para intensificar o desempenho da planta. Em suporte desta hipótese, foi avaliado o microbioma das raízes de plantas de EH OMEGA, K5As2 e Sabrex. Houve alterações significativas nos perfis microbianos de plantas cultivadas no campo amostradas próximo à formação de borla (Ms em preparação). Em relação à primeira hipótese, vários elicitadores de planta químicos de resistência à doença de planta mostraram induzir modificações de cromatina. Estas alterações resultam em padrões de modificação de histona na cromatina de genes de defesa que permitem que os genes sejam total e rapidamente expressados quando estímulos apropriados estão presentes, resultando na reprogramação de expressão genética vegetal. Se este for o caso com os presentes sistemas, então, o modo específico de ação para a indução de pontuações de genes na presença dos presentes agentes pode ser a modificação de cromatina de planta, embora haja outras possibilidades também.

[0255] Como é evidente a partir de modalidades apresentadas no presente documento, diferentes cepas de Trichoderma ou Trichoderma mais Bacillus também induzem alterações similares. Conceitualmente, é consideravelmente mais fácil contemplar os efeitos destes micróbios, visto que pelo menos as cepas de Trichoderma colonizam endofiticamente e persistem sobre e dentro das raízes e produzem moléculas de sinal como 1-octen-3-ol percebidas pelo componente vegetal do holobionte. Isso gera as alterações no fenótipo de planta que são indicadas e são acompanhadas por alterações no gene vegetal e expressão de proteína. Considerando-se a magnitude das respostas vegetais demonstradas no presente documento, desenvolver um sistema altamente reproduzível de implementação da planta de cultura EH em agricultura comercial pode ser de enorme benefício à luz das alterações previstas no clima, população mundial e situação de terra arável.

[0256] O C total com base em área foi substancialmente aumentado em plantas produzidas a partir de sementes tratadas com os tratamentos microbianos e biorracionais, embora nos presentes testes e naqueles de terceiros (Zibilske e Materon 2005), o milho maduro continha uma grande constância de 42 a 43% de C. Em um caso (híbrido 6490) cultivado a partir de sementes tratadas com EH K5As2, o C total por hectare foi aproximadamente dobrado, embora aumentos mais modestos tenham sido frequentemente observados. A fonte deste C adicional é provavelmente derivada do sequestro de C do ar. Um recurso crítico dos EHs aprimorados descritos no presente documento logicamente inclui eficácia fotossinética aprimorada. Terceiros também relataram aumentos significativos em taxas fotossintéticas induzidos por tratamento com outras cepas (Mastouri 2010; Vargas et al. 2009). Todos os fenótipos de milho aprimorados descritos no presente documento, variando de crescimento e desenvolvimento de raiz aumentado à resistência aprimorada aos estresses abióticos e resistência à doença, consumem energia. Em plantas, a energia adicional deve ser proveniente de níveis intensificados de fotossintato. Assim, as plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com qualquer um dos tratamentos biológicos ou biorracionais devem ter habilidades aprimoradas para intensificar a eficácia fotossinética.

[0257] A eficácia fotossintética é o limite superior fundamental na cultura e um que não foi fundamentalmente aprimorado por esforços de reprodução vegetal. Como uma consequência, o avanço historicamente rápido em rendimentos de cultura foi retardado. A necessidade para fornecer mais alimento para a população humana, que se espera que aumente, é crítica, especialmente em face dos estresses bióticos e abióticos que se espera que aumentem causados pela mudança climática global.

[0258] Entretanto, avanços recentes em detecção remota à base de satélite com base em medições de fluorescência de clorofila induzida pelo Sol (SCIF) indicam que algumas das regiões mais ativas fotossinteticamente no planeta estão no Cinturão do Milho. Os sistemas agrícolas altamente gerenciados que foram desenvolvidos ali são baseados em plantas reproduzidas para rendimentos máximos e cultivadas de uma forma intensiva. O C incorporado em plantas foi estimado em >15 g de C/m2/dia ou 150 kg de C/ha/dia. Se isso continuar nesse nível por 60 dias, renderá um total de 9,0 t de C/ha/estação (Guanter et al. 2014). Visto que o milho tipicamente cresce por 90 a 120 dias dependendo do híbrido, e o fato de que, claramente plantas menores ou mais senescentes ocupam o campo em momentos diferentes, essas 9 t de C/ha/estação parecem um número aproximadamente útil.

[0259] Isso se compara razoavelmente bem com rendimentos de biomassa de milho típicas. Rendimentos bons, porém, não notavelmente altos de silagem no Cinturão do Milho nos EUA são 25 toneladas/acre nos EUA. Isso é tipicamente 30% de matéria seca e com 42% de C, isso totaliza 7.062 t de C/ha/estação. Obviamente, essa quantidade representa apenas a porção acima do solo colhida da planta. As raízes também contêm cerca de 42% de C e, se as biomassas de planta acima e abaixo do solo forem iguais, então, o C total fixo em um hectare de terra seria aproximadamente 14 t de C/ha.

[0260] Nesse trabalho, nos testes de campo de 2014 e 2015, é estimado que o nível de C, tanto em porções acima e abaixo do solo, seja de 13,5 t de C/ha nas plantas de controle, que é perto dos valores observados acima e representados nas Figuras 14A a 14D (consultar a Tabela 10 para métodos de cálculo). Entretanto, com os tratamentos de EH, o C total estimado é superior (até cerca de 25 t de C/ha no nível mais alto), em quase todos os casos, que aquele do controlo. Assim, os tratamentos de EH forneceram um forte aumento em C sequestrado, porém, foram diferentes de acordo com o híbrido escolhido, e se espera que também varie de acordo com práticas de gerenciamento agrícola como foi evidente no efeito de fertilizante de N nos testes de 2016 em rendimento de grão.

[0261] Assim, os tratamentos de EH aumentam a eficácia fotossinética foram suportados por estes dados de rendimento, como foi esperado com base em outro trabalho resumido no presente documento.

[0262] Os estresses de todos os tipos são principalmente impedimentos à fotossíntese otimizada e rendimento máximo. As plantas sob estresse superproduzem espécies reativas de oxigênio (ROS) que são destrutivos para biomoléculas. É sugerido que os tratamentos de EH induziram plantas a superar os efeitos prejudiciais de ROS. As plantas acumulam ROS através de vários mecanismos incluindo superexcitação de eficácia fotossinética em ambientes de alta luz e como uma consequência de estresses impostos através de fatores ambientais abióticos e bióticos adversos. No trabalho anterior com tomates e T. afroharzianum cepa T22, foi mostrado que a seca, o sal ou até mesmo efeitos de sementes de vigor baixo foram amplamente superados pela regulação crescente das trajetórias minimizando o acúmulo de ROS prejudiciais (Mastouri et al. 2010, 2012); resultados similares foram descritos para outras combinações de planta-Trichoderma (Guler et al. 2016); e como resumido na Figura 1. Hipoteticamente, no sentido de que a presença dos presentes organismos ou metabólito, as plantas têm sistemas de produtividade superior de ciclagem mediada por antioxidante de ROS e, assim, obter um ambiente de redox interno favorável.

[0263] Ao mesmo tempo, os tratamentos de EH aumentaram N e outros nutrientes em plantas a uma base por hectare, porém, não a uma base de porcentagem de biomassa total. A fonte destes nutrientes, diferente de C, deve ser derivada de fertilizantes ou N endógenos no solo. Hipoteticamente, essa absorção intensificada se torna possível pelas raízes mais profundas observadas com os tratamentos de EH e pelos níveis maiores de fotossintato. Estes níveis superiores de fotossintato são, certamente, necessários para a energia extra necessária para absorção e utilização de nutrientes que residem no solo. Ademais, uma vez que o nitrogênio é absorvido na planta, o mesmo deve ser descarregado nos tecidos e convertido em aminoácidos, ácidos nucleicos e outros compostos contendo C e N, que exige novamente fotossintato adicional, tanto para suportar a fisiologia de planta quanto como compostos de armazenamento. Seria esperado que essa maior utilização total de nitrogênio e os compostos reduzam poluição de nitrato em vias aquáticas, um efeito que seria intensificado pelas raízes mais profundas que podem interceptar o nitrato que, de outro modo, pode lixiviar em vias aquáticas. Outra fonte de poluição por compostos de nitrogênio essa evolução de óxido nitroso na atmosfera; pelo menos um relatório indica que a evolução de óxido nitroso é reduzida por plantas cultivadas na presença de T. viride. As alterações na estrutura de comunidade microbiana ao redor de raízes crescentes podem afetar de modo notável a geração de óxido nitroso. Os efeitos combinados diretamente dos micróbios e sobre alterações em microflora de raiz associada que ocorrem com as plantas de EH deve afetar ar e poluição da água de compostos nitrogenosos, assim como nos níveis de C.

[0264] Há vantagens substanciais no acúmulo intensificado de C em plantas de EH. Paustian et al (Paustian et al. 2016) estima que uma duplicação de raízes pode resultar em um aumento de >5 t/ha/ano em C incorporado no solo. Esse nível de aumento intensificará a matéria orgânica no solo e sequestrar C para evitar essa contribuição para a mudança climática global. Uma tonelada de C é equivalente a cerca de 2,3 t de CO2, portanto, 5 t de C em solo resulta na remoção de 11,9 t de CO2 da atmosfera. Os presentes dados (das Figuras 14A a 14D) estimam um aumento em níveis de C nas plantas de 0 a 12 t de C total; se 50% estiver nas raízes, os níveis de C que se movem no solo seria igual a 0 a 6 t/ha e, portanto, são consistentes com os aumentos em biomassa de raiz nos presentes experimentos de tubo de raiz (Figura 18). Se esse C for incorporado na matéria orgânica no solo, isso também aumentaria o N que é contido no solo; a matéria orgânica no solo tem uma razão de C:N de cerca de 10:1 (Paustian et al. 2016) portanto, um aumento em solo C, como teor orgânico no solo, também aumenta a capacidade de transporte de N no solo e, portanto, minimiza a poluição de água e ar. Também é antecipado que o enraizamento mais profundo aumente a matéria orgânica no solo mais que apenas massa de raiz intensificada sozinha. As camadas de solo mais profundas tipicamente contêm C menos orgânico do que as camadas superiores e, portanto, têm uma capacidade maior para armazenamento de C, e é esperado que os solos mais profundos metabolizem C em CO2 a uma taxa mais lenta que ocorre em camadas superiores visto que tensões de oxigênio tipicamente são inferiores e há menos perturbação de sistemas de cultivo. Mundialmente, 25 a 50% de aumentos na C de raiz com aumentos moderados em enraizamento mais profundo podem aumentar os armazenamentos de C em solo por 35 a 100 Mt/ano (Paustian et al. 2016) (igual a 80,5 a 230 Mt de CO2 atmosférico) e, portanto, podem contribuir significativamente para reduzir gases do efeito estufa contribuindo para a mudança climática global (A quantidade total de aumento de CO2 na atmosfera é cerca de 16 GT anualmente (Committee on Geoengineering Climate 2015)) e, obviamente, podem ser continuados por muitos anos.

[0265] Um aumento no teor orgânico no solo também é necessário para a manutenção e aumento a produtividade de solo. As práticas agrícolas modernas ao longo do tempo resultaram em uma perda de 20 a 80 t/h de C como perda de matéria orgânica no solo (SOM), a maior parte do qual foi emitido na atmosfera. A agricultura intensiva moderna incluindo cultura de milho intensivo, que é o foco primário deste documento, contribuiu significativamente para a perda de SOM. As perdas no teor orgânico no solo (SOC) resultam em produtividade de solo inferior; um aumento em

SOC de 1 t/ha pode aumentar a produtividade de planta em solos degradados e 1 a 40 kg/ha dependendo da cultura. Os solos degradados têm estrutura menos satisfatória (agregação, densidade de volume, infiltração de água e porosidade), fertilidade, capacidade de retenção de água e diversidade microbiana reduzida. A degradação de solos pode ser mascarada por práticas de fertilização e gerenciamento, porém, não é sustentável. Os aumentos em SOM contribuem para a produtividade agrícola.

[0266] O milho é uma escolha óbvia para aprimorar o sequestro de C e aprimoramentos consequentes em SOM visto que a agricultura de milho já fornece o nível mais alto de fotossíntese no planeta. Entretanto, as limitações no nível de sequestro de C e SOM existem independentemente do método de aumento biomassa de raiz. Os solos têm uma capacidade máxima para o sequestro de C. Se C for continuamente adicionado ao solo, eventualmente, haverá um platô em que emissões CO2 de processos oxidativos iguais à quantidade adicionada. Onde esse equilíbrio é estabelecido depende de muitos fatores, incluindo tipo e profundidade de solo e lavoura. Os solos não perturbados mantidos através de sistemas de lavoura mínima ou outros sistemas de lavoura de conservação podem permitir o acúmulo de C, porém, a aragem profunda ou outros sistemas perturbadores podem resultar em perda rápida de C de solo para a atmosfera.

[0267] Este documento demonstra que o milho aprimorado, incluindo fenótipos de raiz, ocorrem nas plantas de EH. Estes são similares àqueles chamados para e sugeridos como urgentes por vários autores pelas razões recém-descritas. O método óbvio para aprimorar os fenótipos de raiz é a reprodução vegetal incluindo modificação genética da planta, porém, claramente a alteração da raiz de fitobioma de planta pode dar origem a holobiontes que são substancialmente aprimorados para essa característica. As plantas de EH estão disponíveis agora sem fase de retardamento para a seleção e desenvolvimento de genótipos de planta geneticamente alterados.

[0268] Entretanto, há etapas de otimização óbvias que precisam ocorrer. Primeiro, parece que nem todos os híbridos de milho respondem igualmente; os presentes dados sugerem que tipos adaptados ao propósito duplo ou apenas silagem são propensos a fornecer as maiores respostas. Sem dúvidas, há emparelhamentos de genótipo de planta específico e endófitos microbianos ou metabólitos que fornecerão resultados superiores à seleção não alvejada de híbridos de milho usada neste trabalho. Isto é indubitavelmente verdadeiro para outros fenótipos holobiontes úteis incluindo resistência à seca, estresse, doenças e nematódeos. Os estudos sobre a combinação de otimização de micróbio e genótipo de planta devem fornecer um progresso rápido no desenvolvimento de produtos superiores para agricultura moderna. Sem dúvidas, a formulação de produtos eficazes é importante. A formulação e possíveis combinações microbianas ou de metabólito precisam ser buscadas.

[0269] Em suma, as sementes tratadas com cepas de Trichoderma endofíticas ou formulações do metabólito 1-octen-3-ol geraram EHs com características aprimoradas. As cepas de Trichoderma colonizaram raízes de milho ou soja internamente, e as plantas de milho foram maiores, e no final da estação, proporcionaram rendimentos aumentados de grão e silagem. O crescimento de raiz, em particular, foi aumentado. Ademais, a uma base por hectare, o C de cultura total foi aumentado, o que sugere fortemente um aumento na eficácia fotossinética. Os níveis totais de outros componentes vegetais como N, P, K e Ca também foram aumentados a uma base por acre. Adicionalmente, as plantas de EH exibiram resistência aos estresses abióticos como inundações ou estresse de água. Os dados limitados no presente trabalho, mais outros dados não publicados suportam a resistência intensificada às doenças foliares, embora os fungos benéficos estejam presentes apenas nas raízes. Espera-se que estes resultados, tanto com os fungos endofíticos quanto o metabólito, resultem das alterações na expressão genética vegetal como mostrado na Figura 1. Ademais, foram recentemente observados deslocamentos substanciais na raiz microbioma como uma consequência dos tratamentos de semente (Ms em preparação). Assim, tanto os agentes colonizadores de raiz simbióticos endofíticos quanto seus metabólitos alteram substancialmente o fenótipo pelo menos na vida de uma cultura anual. Esses EHs devem ser considerados como plantas de cultura aprimoradas que diferem quanto às suas propriedades e vantagens em comparação com plantas sem as modificações de holobionte, embora os genomas de plantas sejam idênticos. A otimização de combinações de planta:micróbio, sistemas de gerenciamento de campo e formulação microbiana, todos, precisam ser realizadas. Entretanto, as chamadas recentes por plantas com fenótipos de raiz aprimorado em culturas como milho para aprimorar os rendimentos, matéria orgânica no solo intensificada e maior sequestro de C para minimizar a mudança climática global podem ser amplamente satisfeitas com os holobiontes intensificados através da alteração do fitobioma, como descrito no presente documento, sem o consumo de tempo e modificação de planta dispendiosa que, de outro modo, seria necessário. Recentemente, uma exigência de redução real de níveis de CO2, em vez da manutenção de níveis atuais, foi sugerida para evitar danos graves aos ecossistemas da Terra foi proposta, visto que muitos dos efeitos de níveis atuais de GHG têm tempos de reação lentos. Para que tais “emissões negativas” sejam alcançadas, a depuração de C da atmosfera por sistemas vegetais seria a abordagem menos dispendiosa (Hansen et al. 2016). O sistema à base de milho descrito no presente documento é claramente bem adequada a esta necessidade.

[0270] Os rendimentos de milho e outras culturas são dependentes da conversão de luz solar em carboidratos devido à fotossíntese. Os carboidratos são, então, convertidas em proteínas e todos os outros componentes da planta, incluindo rendimento de grão ou silagem. A exigência fundamental para maiores rendimentos é a fotossíntese.

[0271] Infelizmente, o rendimento básico de fotossíntese não aprimorou notavelmente em relação aos anos de reprodução. Os rendimentos aumentaram, obviamente, devido aos aprimoramentos nas (a) habilidade de plantas para interceptar a luz, e (b) a distribuição máxima do carboidrato na porção colhida da planta. Entretanto, o recurso fundamental, a habilidade do maquinário de fotossíntese para converter de modo mais eficaz a energia da luz em energia de biomassa não aumentou.

[0272] Este nível baixo de conversão (cerca de 20% sob as condições mais favoráveis) é substancialmente reduzido no campo. Mesmo sob boas condições de crescimento, altas intensidades de luz superexcitam os pigmentos fotossintéticos (primariamente a clorofila) e resultam na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). Esses ROS são prejudiciais à eficácia fotossinética. Alto teor de luz reagindo com plantas é um pouco como deixar uma bateria em alta carga por um período de tempo estendido. Ambos causam um fluxo de elétrons que pode danificar sistemas a jusante. Nas plantas, muito do excesso de fluxo de elétron reage com oxigênio no ar, e o oxigênio ativado resultante é muito prejudicial. Considera-se o que ocorreria se um campo de milho fosse aspergido com o peróxido de hidrogênio de ROS; muitos dos produtos imediatos do excesso de fluxo de elétron em plantas são mais tóxicos do que o peróxido de hidrogênio. Os níveis de ROS aumentam ainda mais sob condições estressantes. Por exemplo, sob condições de seca, os níveis de ROS aumentam a níveis muito prejudiciais. Esta é uma razão primária pela qual as plantas sujeitas à seca perdem sua cor verde e se tornam castanhas—o ROS destrói e inativa o aparelho fotossintético.

[0273] Em uma modalidade exemplificativa, micróbios superiores e composições de formulação são tratamentos de semente altamente eficazes. Os micróbios são selecionados pelo desempenho superior. Os mesmos colonizam raízes de planta e se tornam partes funcionais das plantas. Os mesmos são restringidos às camadas externas da raiz e não colonizam as partes acima do solo das plantas. Os mesmos crescem com o sistema de raiz de planta e resultam em benefícios pela duração da estação às plantas. A partir de sua localização na raiz, os mesmos interagem com a planta e induzem alterações por todo o sistema na expressão genética das plantas. Em termos de fotossíntese, estas alterações por todo o sistema incluem níveis intensificados dos sistemas fotossintéticos, portanto, as plantas frequentemente são mais verdes. Em alguns estudos, os níveis de fotossíntese de base no milho aumentaram 45%, o que pode ser imediatamente usado pela planta no fornecimento da base para intensificação de rendimento. Adicionalmente, as plantas têm sistemas de enzima que intensificam a degradação de ROS em compostos não tóxicos. As cepas de Trichoderma de ABM em SABREX e nas composições da presente invenção fornecem resistência à seca, em grande parte, protegendo os fotossistemas críticos de ROS. Assim, um alto nível de resistência à seca e outros estresses é frequentemente visto.

[0274] As capacidades fotossintéticas intensificadas em plantas cultivadas a partir das sementes tratadas com SABREX fornecem carboidratos suficientes para produzir plantas maiores, mais saudáveis e mais robustas com sistemas de raiz maiores. Estas plantas maiores são mais resistentes para alojar e absorver nutrientes com mais eficácia que aquelas de sementes não tratadas. Nenhum outro sistema microbiano é conhecido por combinar estas vantagens.

[0275] Entretanto, para obter maiores rendimentos de grão, deve ser tomado cuidado para corresponder a genética de milho correta com os sistemas microbianos. Algumas linhagens de milho proporcionam espigas de tamanho predeterminado e estas podem ser incapazes de crescer suficientemente para aproveitar a vantagem dos carboidratos maiores produzidos pelos sintomas mais eficazes de fotossíntese sistemas de plantas cujas raízes são colonizadas por cepas de elite. Entretanto, outras variedades produzem espigas que são capazes de uma resposta flexível, isto é, capazes de usar e continuar a crescer se carboidratos adequados estiverem disponíveis. A combinação da genética em tais cepas de Trichoderma de elite e a melhor genética de milho produz uma combinação sinérgica potente para rendimentos máximos e ROI para o agricultor.

[0276] Desse modo, a eficácia fotossinética de planta máxima se provou recalcitrante ao aprimoramento através de sistemas de reprodução convencionais, e começa a formar um limite superior aos esforços para aprimorar o desempenho e rendimento da planta. Ademais, a eficácia fotossinética funcional (FPE) é substancialmente menor que a máxima, devido aos fatores de estresse óbvios e não óbvios. A fotossíntese e maquinário de fotossíntese são altamente suscetíveis a danos por espécies reativas de oxigênio (ROS). Os ROS podem ser produzidos sob condições de tal intensidade de luz (um fator de estresse não óbvio) e mais ainda, por estresses óbvios, como a seca. Em contrapartida, os fungos benéficos (Trichoderma spp.) colonizam raízes e aumentam os níveis basal de fotossíntese em pelo menos 45%. As plantas têm sistemas de ciclagem de redox para a manutenção de níveis ideais de redox nas plantas. Entretanto, esses sistemas de ciclagem são geralmente insuficientes para lidas com os altos níveis de ROS que ocorrem, mesmo sob boas condições de crescimento de campo, muito menos sob altos níveis de estresse como a seca. As espécies de Trichoderma induzem a regulação crescente coordenada de enzimas de ciclagem de redox de planta que podem manter e aprimorar a produtividade de planta na presença tanto de estresses óbvios quanto não óbvios. Esse sistema mediado por micróbio para manter o FPE, permite uma maior produtividade de plantas de formas que não foram alcançadas através de estratégias de aprimoramento de genética e reprodução vegetal usadas até o presente momento. Os agentes microbianos que acionam estes efeitos são atualmente produzidos e comercialmente disponíveis. As capacidades destas cepas criam novas oportunidades para intensificar a produtividade de planta através de genética de planta, assim como através de alterações em práticas agronômicas. Este aprimoramento de FPE tem aplicações na redução de CO2 como um gás do efeito estufa.

[0277] Todo o alimento que é consumido, e o oxigênio respirável no ar são produzidas por energia do Sol. A conversão de luz solar em alimento e oxigênio ocorre por meio de fotossíntese. A clorofila nas plantas (ou em ambientes aquáticos, algas e outros organismos) é organizada em estruturas especiais e catalisa a divisão de CO2 em oxigênio e carbono, com o carbono subsequentemente sintetizado em açúcares, fornecendo energia para as plantas. Por fim, este mesmo açúcar é convertido em todo o alimento que é consumido. Não há outra fonte para alimento ou oxigênio. A fotossíntese é, portanto, o fator limitante principal no crescimento de plantas. Sem fornecimento adequados de açúcares, as plantas não podem se desenvolver. Com fornecimentos adequados de açúcares e os materiais nos quais estes são convertidos, as plantas e todos os organismos que dependem das mesmas, desde os seres humanos às bactérias, podem se desenvolver e prosperar.

[0278] O potencial de rendimento (YP) de plantas de cultura pode ser aproximado como o produto da radiação solar recebida sobre a unidade de terra em uma única estação de crescimento (Q), as eficiências da planta para interceptar a radiação (E1),

conversão de energia de radiação em energia de biomassa (E2), e particionamento da biomassa nas partes passíveis de colheita das plantas (E3) (YP = Q∙E1∙E2∙E3) (Long, Marshall-Colon, et al. 2015).

[0279] Os desenvolvimentos modernos no aprimoramento de planta, como exemplificado por avanços na revolução verde, focaram primariamente em E1 e E3, enquanto E2, um traço não avaliado facilmente na maioria dos programas de reprodução, não foi alvejado. E1 é a proporção de luz disponível interceptada pelo erguimento de plantas e é atualmente cerca de 90%, enquanto E3 foi aprimorado pela seleção de variedades que convertem mais de sua biomassa em produto passível de colheita do que biomassa total. Para o trigo, os aprimoramentos em E3 foram alcançados por genótipos de nanismo que reduziram a quantidade de biomassa alocada ao tronco em relação àquela incorporada no grão. Para o milho (maís), E3 foi intensificado limitando-se geneticamente o número de espigas por planta a um, embora algumas plantas tenham tido potencial para produzir mais espigas/talo ou espigas maiores. As estratégias de desenvolvimento de E3 têm sido primariamente para fornecer os maiores rendimentos em plantas em que o fotossintato é o fator limitante primário. Para culturas em que a biomassa máxima é necessária, como cana de açúcar e milho para silagem, a necessidade de aprimoramento em E2 é particularmente importante. Adicionalmente, se E2 foi aprimorado, parte dos dogmas- padrão de reprodução vegetal—por exemplo, apenas uma espiga/talo de milho, estratégias de E3 podem ser menos desejáveis do que é o caso atualmente.

[0280] Infelizmente, as melhores taxas de fotossíntese (E2) observadas atualmente são apenas cerca de 20% do máximo teórico, e isso não foi notavelmente aprimorado através dos esforços de aprimoramento de planta. Dito desta forma, os rendimentos aumentaram sem aprimorar a taxa fotossintética, que é o fator limitante fundamental. A taxa de aumento nos aprimoramentos de rendimento de culturas principais diminuiu nos últimos anos, em parte, devido ao fato de que outros insumos e aprimoramentos estão se tornando limitados pela falta de aprimoramento na eficácia fotossinética. Recentemente, dez abordagens para aumentar a eficácia fotossinética foram propostas; todas estas exigem engenharia transgênica complexa da planta,

incluindo, em alguns casos, modificação real da estrutura de planta em relação aos sítios ativos fotossinteticamente.

[0281] Esta falta é ainda mais aguda, visto que a avaliação de E2 foi conduzida sob condições ideais, porém, no campo, as condições ideais raramente ocorrem, se ocorrerem. Até mesmo pequenas variações ambientais podem ter efeitos. Por exemplo, um fator significativo é relacionado ao fato de que taxas fotossintéticas máximas, em relação aos insumos de luz, ocorrem em níveis de luz baixos. Quando as folhas são expostas a níveis de luz superiores, a eficácia fotossinética sofre uma queda. Isso, em parte, ocorre porque, em altos níveis de luz, as moléculas de clorofila permanecem altamente excitadas e transferem excesso de energia a espécies de oxigênio, que, por sua vez, produzem espécies reativas de oxigênio (ROS), que são tóxicas e destrutivas. Isso resulta em danos ao maquinário fotossintético básico, incluindo pigmentos, proteínas e lipídeos, prejudicando, assim, o aparelho fotossintético. Isso pode ser exacerbado por flutuações nos níveis de luz, portanto, até tais fatores aparentemente triviais, como a sombra de folha transitória pode uma folha sobre a outra pode resultar em danos ao aparelho fotossintético e afetar adversamente a fotossíntese. Os sistemas fotossintéticos (assim como outros sistemas e trajetória nas plantas) são adicionalmente danificados por estresses mais sérios, como seca, sal e calor.

[0282] O índice de desempenho de fotossíntese de cevada (uma medida que integra vários aspectos diferentes da fotossíntese) foi reduzido em 14 a 28% sob estresse de seca moderado e rigoroso em um cultivar resistente à seca e em 23 a 49% nas mesmas duas condições em um cultivar suscetível. Essa redução na fotossíntese medida foi acompanhada por reduções no teor de clorofila, teor carotenoide e níveis da proteína D1 em cloroplastos (estes são pigmentos críticos e uma proteína estrutural crucial em centros de reação fotossintética, respectivamente). Essas alterações também foram associadas às alterações na condutância estomatal e taxa de assimilação de CO2, que são outras medidas críticas da fotossíntese. Todas essas alterações foram indicativas de danos mediados pela seca aos sistemas fotossintéticos nas plantas afetadas pela seca. As plantas resistentes foram mais capazes de reparar danos a estes sistemas, um traço associado aos níveis superiores do antioxidante vegetal α-tocoferol que desintoxica ROS. Sob condições de estresse, os níveis de α-tocoferol aumentaram na linhagem resistente, porém, não na linhagem suscetível.

[0283] Isso demonstra que a eficácia fotossinética é um parâmetro de desempenho da planta que não foi aumentado pelos esforços de reprodução vegetal, e que o limite superior para intensificação adicional de rendimento de planta se aproximará cada vez mais do teto imposto pela eficácia fotossinética. Adicionalmente, a eficácia fotossinética funcional (FPE), é negativamente afetada no campo. Mesmo sob boas condições de crescimento, alta intensidade de luz ou intensidade de luz variável irá saturar a clorofila, dando origem aos níveis tóxicos e prejudiciais de ROS. Outros fatores, como estresse de seca, degradarão adicionalmente a eficácia fotossinética e resultarão em degradação física e química de todo o sistema fotossintético.

[0284] O gerenciamento do ambiente redox da célula vegetal. A saúde celular vegetal é determinada, em parte, por níveis de redução/oxidação. A produção de altos níveis de ROS faz com que o equilíbrio se desloque para estados altamente oxidados que são prejudiciais aos processos celulares e que causam destruição física dos componentes celulares e organelas que são essenciais para a operação eficaz de fotossíntese e outros sistemas celulares básicos nas plantas.

[0285] As plantas contêm um sistema de ciclagem de alta eficácia para manter os níveis de redox apropriados no ambiente celular. Estes envolvem reduzir compostos (antioxidantes) incluindo ácido ascórbico e glutationa, junto com outros químicos como α-tocoferol. Estes compostos reduzem e desintoxicam ROS de modo eficaz, porém, isso resulta na conversão de antioxidantes em formas oxidadas inativas. As células vegetais contêm várias trajetórias bioquímicas, como o ciclo de água-água, o ciclo de glutationa-ascorbato, catalase e dismutase de superóxido. Todas estas trajetórias e enzimas têm uma função similar, que é converter as formas oxidadas destes antioxidantes de volta na forma ativa reduzida. O resultado consiste em sistemas pelo quais os antioxidantes de planta realizam um ciclo repetidamente entre a forma reduzida e ativa. Este é um processo que precisa fortemente de energia, com um custo para a planta, porém, quanto mais rápido os ciclos processam o substrato, mais antioxidantes reduzidos ficam disponíveis para a planta. As trajetórias de redox são todas conhecidas, e os genes que codificam as proteínas necessárias também são conhecidos e entendidos.

[0286] A modulação microbiana do ciclo de redox. Certos micro-organismos colonizam raízes de planta internamente e atuam como endófitos benéficos. Esses organismos, a partir de sua localização nas raízes de planta, produz sinais químicos que atuam mediante os receptores de planta que, por sua vez, geram os sinais vegetais que induzem cascatas de proteínas que regulam de modo crescente as trajetórias inteiras. Dentre as trajetórias cujas atividades são aumentadas, estão aquelas envolvidas nas trajetórias de redox. Os mais proeminentes e bem conhecidos são os fungos no gênero Trichoderma, e existem vários destes como produtos comerciais (consultar iGET in www.abm1st.com). Estas cepas têm inúmeros benefícios para as plantas, isto é, as mesmas aumentam o crescimento de planta (especialmente raízes), intensificam a eficácia de absorção de nutrientes, aumentam os níveis de clorofila (verdor de planta) e induzem resistência a patógenos vegetais.

[0287] O crescimento e desenvolvimento aumentados devem ser associados aos níveis aumentados de fotossíntese para suprir a energia para os vários processos que sabemos que são induzidos. Isso é justificado pelos dados indicando que as plantas colonizadas por tais cepas são frequentemente mais verdes que aquelas em que isso não ocorre. Nos estudos sobre outra cepa de Trichoderma, a absorção de CO2 foi aumentada em cerca de 45% (Vargas, Mandawe et al. 2009), enquanto naquele e outros estudos, a expressão de proteínas envolvidas mostraram aumentar na ausência aparente de estresse (Shoresh and Harman 2008).

[0288] Isso permite que as plantas fiquem maiores e produzam rendimentos gerais superiores tanto de produtos passíveis de colheita quanto de biomassa total. É um efeito que não foi percebido por muitas abordagens para intensificar a eficácia de cultura e as informações apresentadas acima demonstraram que a maximização de rendimento passível de colheita vs. biomassa total foi uma abordagem bem-sucedida na reprodução vegetal (Long, Marshall-Colon et al. 2015).

[0289] Este maior nível de fotossíntese é provavelmente, em parte, devido ao maior nível de maquinário fotossintético total (por exemplo, clorofila e proteínas críticas) como descrito no parágrafo anterior. Contudo, no campo, a otimização de FPE por modulação do potencial de redox das plantas é provavelmente ainda mais importante, visto que, mesmo fontes não óbvias de estresse, como luz muito alta e alterações de nível de luz podem resultar na produção de ROS induzida por superexcitação transitória de clorofila.

[0290] Ademais, os fungos benéficos podem otimizar o potencial de redox de plantas e, assim, intensificar o FPE sob estresses como a seca. A presença dos micróbios benéficos resulta em concentrações aumentadas de enzimas de ciclagem de redox por meio da regulação crescente dos genes que codificam estas enzimas. A expressão destas alterações induzíveis é maior sob estresses como a seca, assim como foi observado nos níveis de α-tocoferol em cevada resistente à seca. Com plantas colonizadas por Trichoderma, os níveis de antioxidantes totais (ácido ascórbico e glutationa) não são afetados, porém, a razão de formas reduzidas para oxidadas é aumentada especialmente na presença de seca (Mastouri, Bjorkman et al. 2012). Assim, a indução de genes que são envolvidos em eliminação de ROS inclui trajetórias inteiras que são coordenadamente reguladas de acordo com as exigências da planta.

[0291] Em outra modalidade, a maximização de estratégias de produção de cultura de FPE pode ser intensificada. No teste de campo com os presentes melhores inoculantes microbianos no milho, os rendimentos de planta foram intensificados. Com a composição de cepas da presente invenção, a biomassa (rendimento de silagem) aumentou em cerca de 50%, de 23 a 34 toneladas/acre, que é um aumento de 47%. O rendimento de grão aumentou menos, de 163 a 202 bu/acre, que é “apenas” um aumento de rendimento de 24%. Ambos os aumentos foram estatisticamente significativos (P= 0,10), e ambos foram cultivados a partir de sementes primeiro tratadas com os fungicidas e inseticidas recomendados. Entretanto, com o inoculante microbiano mais eficaz, duas espigas formaram na maioria dos talos, o que não ocorreu frequentemente nas plantas cultivadas sem os inoculantes. Entretanto, aproximadamente no momento de florescimento feminino, as espigas secundárias abortaram, de modo que os números de espigas colhidas não tenham sido afetados. Além disso, as espigas que não se formaram eram grandes e completamente preenchidas, sugerindo que, para o número de talos em uma espiga/talo, se está provavelmente próximo do potencial de rendimento máximo de grão para tal variedade em tal densidade de planta.

[0292] Estes resultados demonstraram que, nas plantas cultivadas com inoculantes microbianos, E3 desviou das normas aceitas, visto que a biomassa foi substancialmente maior do que com as plantas de controle. Isso proporcionou benefícios no rendimento, especialmente na silagem, em que plantas pequenas otimizadas para particionamento de recurso em grão foi menos desejável. Isso sugere que é necessário otimizar as condições de crescimento/genótipos de planta para aproveitar o máximo das oportunidades que os inoculantes microbianos de ABM fornecem. Em particular, a habilidade das cepas para intensificar o FPE proporciona benefícios que, de outro modo, não poderiam ser realizados.

[0293] Com melhor eficácia fotossinética, as plantas têm mais fotossintato e, portanto, mais energia para produzir biomassa e produto final. Isso sugere, por exemplo, que uma planta de milho com cepas microbianas da 3 a geração, tem os recursos para produzir mais de uma espiga/planta, ou espigas maiores, sem diluir seu fotossintato a um nível de energia de biomassa que é insuficiente para esta carga de cultura. Há variantes de genética de maís comercial, para genótipo de espiga incluindo flexível, fixa, determinada, indeterminada e prolífica. Os tipos de espiga determinada e fixo são limitados em sua resposta ao ambiente. Os tipos de espiga flexível e/ou indeterminado, em contraste, podem se ajustar às condições de crescimento por alterações no tamanho de espiga. As variedades ou linhagens que podem expandir tanto os números de fileiras de cerne quanto o comprimento de acordo com as condições ambientais são disponíveis.

[0294] Os rendimentos de milho foram aprimorados em todas as três estações de cultivo quando os rendimentos foram baixos, isto é, estresses em plantas foram os mais altos. Os aprimoramentos de rendimento reduziram em rendimentos intermediários e foram baixos ou inexistentes nos rendimentos mais altos. Obviamente, estes dados foram obtidos usando micróbios de 2 a geração de ABM e se espera que os produtos da 3a geração sejam mais eficazes através de todas as faixas de rendimento. No entanto, parece que as variedades com tamanho e rendimento determinante foram usadas em muitos e, portanto, os aumentos, embora tenham intensificado o fotossintato e o desenvolvimento de cultura, não ocorreram devido aos limites geneticamente impostos da variedade de milho. Isso proporcionaria um teto no aumento possível nos rendimentos nos níveis de rendimento mais altos. Se as variedades com a capacidade para aumentar rendimentos quando os níveis de fotossintato permitidos tivessem sido usados, este limite superior aparente de aprimoramento de rendimento talvez não tivesse ocorrido. Em certos testes, a variedade usada foi categorizada como “semiflexível.” Isso significa que tem alguma capacidade genética para responder a níveis superiores de fotossintato e/ou para superar efeitos de baixas densidades de planta. Entretanto, tem uma capacidade inferior nestes sentidos do que as variedades mais responsivas.

[0295] O sequestro de CO2 e os gases do efeito estufa global. Estas constatações têm implicações óbvias para o gerenciamento e a redução de gases do efeito estufa. Como indicado acima, o sequestro de CO2 como um resultado da indução por cepas de Trichoderma pode ser aumentado em 45%. Isso significa que uma planta de cultura cultivada com Trichoderma pode remover muito mais CO2 da atmosfera do que uma em que isso não ocorre. Esta é apenas uma alteração transitória em plantas anuais, ao que diz respeito às partes acima do solo das plantas, visto que o carbono fixado será liberado rapidamente de volta para a atmosfera à medida que as culturas são consumidas ou usadas de outro modo, e os resíduos na superfície do solo irão se decompor rapidamente e liberar CO2 de volta para o ar. Entretanto, a colonização de Trichoderma também resulta em um maior desenvolvimento de raiz, e o carbono sequestrado para a biomassa de raiz é muito mais duradouro. A decomposição do tecido de raiz é mais lenta, porém, mesmo quando a decomposição por fim ocorre, o carbono sequestrado se torna parte do material orgânico no solo. Este aumento na matéria orgânica no solo aprimora o solo e resulta em um melhor potencial de lavoura e rendimento de solo. Como uma consequência, o solo se torna uma esponja para armazenamento de longo prazo de carbono que, de outro modo, contribuiria para a mudança climática global. O anexo fornece dados e imagens demonstrando a eficácia do sistema de FPE à base de Trichoderma.

[0296] As Figuras 21A a 21D fornecem dados laboratoriais demonstrando capacidades intensificadas de tomates cultivados na presença de cepas de Trichoderma de elite na ausência de estresse ou sob condições de déficit de água (umidade do solo mantida a 60 a 70% de saturação).

[0297] As Figuras 21A a 21D mostram o verdor de folha (devido aos níveis diferentes de clorofila) conforme medido com um medidor Minolta SPAD na presença e ausência de condições de seca brandas, e a eficácia fotossinética (índice de desempenho) conforme determinado com um Aparelho de Eficácia Fotossintética HansaTech com base na cinética de fluorescência de clorofila. Observa-se que ambas as medidas são maiores na presença do déficit de água, sugerindo ativação intensificada do aparelho de otimização de ROS e níveis aumentados de ciclagem de antioxidante. Em contrapartida, na ausência das cepas, tanto o teor de clorofila quanto a eficácia fotossinética são produzidos por estresse de seca/água. As cepas K1, K2, K3 e K4 são cepas comercializadas junto à ABM em seus sistemas iGET, enquanto T22 é uma cepa mais antiga de Trichoderma. Consulta, ainda, a Figura 17B.

[0298] A Figura 22 mostra fotografias de plantas cultivadas no campo na presença e ausência de Trichoderma, e que se comparam que as capacidades dos produtos de SABREX (de 2a geração) atuais da ABM e os produtos futuros da 3a geração. A ABM acredita que as capacidades induzidas pelo menos pelas plantas de 3 a geração pode suportar prontamente e fornecer fotossintato adequado para suportar mais do que uma única espiga por planta. Isso, por sua vez, resultaria em maiores rendimentos e deve maximizar os benefícios destes simbióticos Trichoderma e/ou misturas de cepas de Trichoderma endofítica e Bacillus.

[0299] Portanto, em uma modalidade exemplificativa da presente invenção, as formulações de terceira geração são fornecidas compreendendo: (1) uma cepa de

Trichoderma simbiótica, como: Trichoderma viride cepa K5, Trichoderma viride cepa NRRL B-50520, ou T. atroviride cepa WW10TC4; (2) uma cepa simbiótica de Bacillus, como: Bacillus amloliqofaciens As1, As2, e/ou As3; e (3) a metabólito como 6-pentil pirona, ácido harziânico, hidtra 1, harzinolida e 1-octeno-3-ol. A formulação de terceira geração pode compreender adicionalmente ácidos húmicos e lectina associados ao metabólito.

[0300] Em referência aos dados de teste associados às formulações de terceira geração apresentada no presente documento, os seguintes dados apresentam dados de rendimento medidos comparados com os rendimentos de base (controle) de vários testes de campo (consultar as Tabelas 11 a 14, em que referências a SABREX e EXCALIBRESA representam vários produtos comerciais, OMEGA representa produto de metabólito sozinho, OMEGA CD representa uma formulação encapsulada por ciclodextrina de OMEGA e várias referências ao K5, incluindo K5AS2 representa composições exemplificativas da presente invenção). Em cada um dos testes de campo, o rendimento foi comparado com os rendimentos de base, que são considerados a variável de controle. A Menor Diferença Estatística (LSD) é apresentada na Tabela 14 em relação aos vários testes de campo. Tabela 11. 2018 Linden, IN, Teste de Campo para variedades de trigo envolvendo os produtos comerciais existentes e produtos da presente invenção. Dif. Dif. Peso da da Exp. Cultura/ Unidades de Desvio de Rendimen base base Num Ano Variedade Tratamento FORM Rendimento Rendimento Padrão Teste to (kg/ha) (ild) (%) Trigo / FS 3 2018 624 Omega LQ 96,36 bu/ac 1,94 59,80 6.464,26 1,14 1,19 Trigo / FS K5AS2 + 3 2018 624 Omega LQ 95,28 bu/ac 1,80 59,70 6.381,57 0,06 0,07 Trigo / FS 3 2018 624 K5AS2 LQ 94,52 bu/ac 2,02 59,70 6.330,32 -0,70 -0,74 3 2018 Trigo / FS Omega LQ 94,28 bu/ac 2,69 58,50 6.187,43 4,03 4,46

Dif.

Peso da da Exp.

Cultura/ Unidades de Desvio de Rendimen base base Num Ano Variedade Tratamento FORM Rendimento Rendimento Padrão Teste to (kg/ha) (ild) (%)

624

Trigo / FS SabrEx 3 2018 624 para Trigo LQ 93,26 bu/ac 1,92 59,60 6.235,70 -1,96 -2,06

Trigo / FS K5AS2 + 3 2018 624 Omega LQ 91,23 bu/ac 1,57 58,50 5.987,32 0,98 1,08

Trigo / FS 3 2018 624 K5AS2 LQ 88,57 bu/ac 2,10 58,60 5.822,88 -1,68 -1,86

Trigo / FS SabrEx 3 2018 624 para Trigo LQ 88,49 bu/ac 2,21 58,40 5.797,78 -1,76 -1,95

Trigo / SabrEx 3 2018 Madsen para Trigo 87,98 bu/ac 1,91 58,80 5.803,41 -2,31 -2,56

Trigo / SabrEx 3 2018 Madsen para Trigo 74,21 bu/ac 1,80 58,50 4.870,39 2,59 3,62

Tabela 12 (abaixo). 2018 Whitewater, WI, teste de campo para variedades de soja envolvendo produtos comerciais existentes e produtos da presente invenção.

Dif.

Peso da da Exp.

Cultura/ Unidades de Desvio de Rendimento base base Num Ano Variedade Tratamento FORM Rendimento Rendimento Padrão Teste (kg/ha) (ild) (%) ExcalibreS 5 2018 Soja A K1+K5 WP 82,02 bu/ac 3,63 58,58 5.389,93 6,27 8,27 ExcalibreS 5 2018 Soja A K5 WP 80,50 bu/ac 1,20 58,65 5.296,82 4,75 6,26 ExcalibreS 5 2018 Soja A WP 78,94 bu/ac 3,55 58,50 5.180,89 3,19 4,20

Tabela 13 (abaixo). 2018 Harvard, IL, teste de campo para variedades de milho envolvendo produtos comerciais existentes e produtos da presente invenção.

Dif. Dif. Peso da da Exp. Cultura/ Unidades de Desvio de Rendimento base base Num Ano Variedade Tratamento FORM Rendimento Rendimento Padrão Teste (kg/ha) (ild) (%) SabrEx para Milho 14,0 8 2018 Milho em Sulco LQ 258,00 bu/ac 5,49 56,80 16.440,15 0 5,74 13,0 8 2018 Milho Omega CD LQ 257,00 bu/ac 7,74 56,70 16.347,59 0 5,33 SabrEx 8 2018 Milho para Milho LQ 253,00 bu/ac 9,06 56,80 16.121,54 9,00 3,69 SabrEx para Milho 12,0 8 2018 Milho em Sulco LQ 222,00 bu/ac 4,66 57,40 14.295,60 0 5,71 8 2018 Milho Omega CD LQ 219,00 bu/ac 8,51 57,40 14.102,42 9,00 4,29 SabrEx 8 2018 Milho para Milho LQ 211,00 bu/ac 5,88 57,40 13.587,26 1,00 0,48 Tabela 14. Dados estatísticos do teste de campo (Tabelas 11 a 13). Cultura/ Exp Variedade Localização LOC_avg LOC_sd LOC_t LOC_pvalue LOC_lsd AltYLD_lsd Trigo / FS Whitewater WI 3 624 2.9OM 58,5 0,207275 0,141256 0,988879 0,280368 Trigo / FS Whitewater WI 3 624 5.1OM 59,72857 0,135693 0,282609 0,938743 0,180082 8 Milho Harvard IL 57,4225 0,109749 1,598425 0,160786 0,123465 1,617109 5 Soja Whitewater WI 79,6 0 1,734064 0 3,327972 0 Trigo / Whitewater WI 3 Madsen 2.9OM 89,1325 2,280587 2,488142 0,166 2,845689 Trigo / Whitewater WI 3 Madsen 5.1OM 72,91625 2,362867 3,127156 0,127 2,843274

[0301] Os versados na técnica irão reconhecer que os métodos e composições da presente invenção podem ser implementados de muitas maneiras e, assim, não devem ser limitados pelas modalidades exemplificativas e exemplos supracitados. Nesse sentido, qualquer número dos recursos das diferentes modalidades descritas no presente documento pode ser combinado em modalidades únicas ou múltiplas, e modalidades alternativas que têm menos, ou mais, todos os recursos descritos no presente documento são possíveis.

[0302] Embora várias modalidades tenham sido descritas para propósitos desta revelação, tais modalidades não devem ser consideradas limitantes do ensinamento desta revelação. Várias alterações e modificações podem ser realizadas aos elementos e operações descritos acima para se obter um resultado que permanece dentro do escopo do sistemas e processos descritos nesta revelação.

[0303] Os documentos incorporados no presente documento a título de referência:

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[0360] Shoresh, M., Mastouri, F., e Harman, G. E. 2010. Induced systemic resistance and plant responses to fungal biocontrol agents. Annu. Rev. Phytopathol. 48:21 a 43.

[0361] Vargas, W. A., Mandawe, J. C., e Kenerley, C. M. 2009. Plant-derived sucrose is a key element in the symbiotic association between Trichoderma virens and maize plants. Plant Physiol 151:792 a 808.

[0362] Yedidia, I., Benhamou, N., e Chet, I. 1999. Induction of defense responses in cucumber plants (Cucumis sativus L.) by the biocontrol agent Trichoderma harzianum. Patente Environ. Microbiol. 65:1061 a 1070.

[0363] A presente revelação contempla que muitas alterações e modificações podem ser realizadas. Portanto, embora a forma aqui preferencial do sistema tenha sido mostrada e descrita, e várias modificações e alternativas discutidas, as pessoas versadas na arte observarão prontamente que várias alterações e modificações adicionais podem ser realizadas sem que se afaste do espírito da revelação, como definido e diferenciado pelas seguintes reivindicações.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de sequestro de dióxido de carbono da atmosfera caracterizado pelo fato de que compreende: (a) aplicar um ou mais agentes microbianos a pelo menos uma planta, em que o agente microbiano selecionado a partir do grupo que consiste em Bradyrhizobium spp., Trichoderma spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp. e Clonostachys spp. ou qualquer combinação dos mesmos, em que o um ou mais agentes microbianos são aplicados ao córtex de raiz da planta; (b) intensificar processos fotossintéticos da pelo menos uma planta; e (c) aumentar a biomassa da raiz, em que o dióxido de carbono é sequestrado devido à biomassa aumentada da raiz.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente microbiano é selecionado a partir do grupo que consiste em T. harzianum (T22), T. harzianum cepa K2 (PTA ATCC 9708), T. atroviride cepa K4 (PTA ATCC 9707), T. viride cepa K5, T. viride cepa NRRL B-50520, T. harzianum cepa RR17Bc (número de acesso de ATCC PTA 9708), T. harzianum cepa F11Bab (número de acesso de ATCC PTA 9709), T. atroviride cepa WW10TC4 (número de acesso de ATCC PTA 9707), Bacillus amloliqofaciens As1, As2, e/ou As3 ou qualquer combinação dos mesmos.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a utilização de nitrogênio é intensificada.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o rendimento de cultura é aumentado.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada a partir do grupo que consiste em alfalfa, arroz, trigo, cevada, aveias, centeio, algodão, sorgo, girassol, amendoim, batata, batata-doce, feijão, ervilha, chicória, alface, endívia, repolho, couve-de-bruxelas, beterraba, pastinaca, nabo, couve-flor, brócolis, rabanete, espinafre, cebola, alho, beringela, pimenta, aipo, cenoura, abóbora, moranga, abobrinha, pepino, maçã, pêra, melão, fruta cítrica, morango, uva, framboesa, abacaxi, soja, tabaco, tomate, maís, trevo, cana de açúcar,

Arabidopsis thaliana, Saintpaulia, petúnia, Pelargonium, poinsétia, crisântemo, cravo, zínia, rosas, flor-crânio-do-dragão, gerânio, zínia, lírio, lírio tigre, Echinacea, dália, hosta, tulipa, narciso, peônia, phlox, ervas, arbustos ornamentais, gramíneas ornamentais, switchgrass, e relva ou qualquer outra planta ou semente ou cultura ou combinações dos mesmos.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a aplicação é selecionada a partir de um meio ou grupo que consiste em aplicação por difusão, aplicação por aerossol, aplicação por aspersão seca, material líquido, seco, em pó, vapor, atomizado, semissólido, gel, revestimento, loção, material ligado ou ligante, material, aplicação em sulco, aplicação por aspersão, irrigação, injeção, pulverização, peletização ou revestimento da planta ou da semente de planta ou do meio de plantação com o agente microbiano.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente microbiano é um agente físico selecionado a partir do grupo que consiste em: um agente biológico, um adjuvante, um ácido, uma base, uma paleta, um agente livre de GMO, um agente herbicida, um agente pesticida, um agente de promoção de crescimento, um micróbio, uma ou mais espécies bacterianas, espécies virais, espécies fúngicas, espécies de levedura, espécies de planta, esporos, componentes celulares, metabólitos, compostos, tensoativos, emulsificantes, metais, elementos, nutrientes, derivados, meios, meio, K1, K2, K3, K4, K5, As1, As2, As3 e quaisquer misturas ou combinações dos mesmos.

8. Composição para intensificar o crescimento de plantas caracterizada pelo fato de que compreende: uma cepa de Trichoderma capaz de entrar em contato com uma planta ou uma semente de planta sob condições eficazes para que a cepa de Trichoderma colonize as raízes da planta ou um crescimento de planta a partir da semente de planta, criando, assim, um sistema de planta-Trichoderma e cultivando a planta ou semente de planta sob condições eficazes para sustentar o sistema de planta-Trichoderma em um meio de plantação e para intensificar o crescimento de planta, em que a cepa de Trichoderma é Trichoderma viride cepa NRRL 50520.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que uma ou mais cepas de Trichoderma são fornecidas como um grânulo, poeira, pó, pasta fluida, filme, suspensão líquida ou combinações dos mesmos.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o dito contato é realizado pela aplicação por difusão, aplicação líquida ou seca em sulco, aplicação por aspersão, irrigação, injeção, pulverização, peletização ou revestimento da planta ou da semente de planta ou do meio de plantação com cepa de Trichoderma.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que os metabólitos são derivados de Trichoderma spp.

12. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ou mais metabólitos selecionados a partir de um grupo que consiste em: 6-pentil pirona, ácido harziânico, hydtra 1, harzinolida e/ou 1-octeno- 3-ol.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que os metabólitos são derivados de Bacillus spp.

14. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que os metabólitos incluem sufactina, iturina, fengicina várias formas destes, e outros metabólitos bacterianos incluindo policetidas.

15. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que os metabólitos são derivados de fontes eucariotas e procariotas.

16. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que os metabólitos são de Trichoderma (fonte eucariota) e Bacillus (fonte procariota).

17. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o agente microbiano é selecionado a partir de um grupo que consiste em Trichoderma, Clonostachys, Bacillus, Pseudomonas spp ou combinações dos mesmos.

18. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a planta ou semente de planta é uma planta de cultura selecionada a partir do grupo que consiste em alfalfa, arroz, trigo, cevada, aveias, centeio, algodão, sorgo,

girassol, amendoim, batata, batata-doce, feijão, ervilha, chicória, alface, endívia, repolho, couve-de-bruxelas, beterraba, pastinaca, nabo, couve-flor, brócolis, rabanete, espinafre, cebola, alho, beringela, pimenta, aipo, cenoura, abóbora, moranga, abobrinha, pepino, maçã, pêra, melão, fruta cítrica, morango, uva, framboesa, abacaxi, soja, tabaco, tomate, maís, trevo e cana de açúcar.

19. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a intensificação de crescimento de planta é na forma de massa de raiz maior, profundidade maior de enraizamento, massa de broto maior, comprimento maior de brotos, verdor de folha aumentado, rendimentos aumentados, erguimento aprimorado, vigor de planta, eficácia de uso de nitrogênio aumentada ou resistência ao estresse abiótico.

20. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a dita composição reduz emissões de óxido nitroso no ar e lixiviação de nitratos no solo e água.

21. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a dita composição intensifica o sequestro de carbono do ar.

22. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o dito contato é por aplicação por difusão, aplicação líquida ou seca em sulco, aplicação por aspersão, irrigação, injeção, pulverização, peletização ou revestimento da planta ou da semente de planta ou o meio de plantação com cepa de Bacillus.

23. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que uma cepa de Bacillus é misturada por adição ainda com uma ou mais cepas de Trichoderma spp.

24. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais cepas de Trichoderma são selecionadas a partir de um grupo que consiste em: Trichoderma harzianum cepa RR17Bc (número de acesso de ATCC PTA 9708), Trichoderma harzianum cepa F11Bab (número de acesso de ATCC PTA 9709) e/ou Trichoderma atroviride cepa WW10TC4 (número de acesso de ATCC PTA 9707).

25. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a cepa adicional de Bacillus é Bacillus amloliqofaciens As3.

26. Sistema de planta-Trichoderma caracterizado pelo fato de que compreende: uma planta ou uma semente de planta e uma cepa de Trichoderma que é Trichoderma viride cepa NRRL B-50520, em que a cepa de Trichoderma é colocada em contato com a planta ou semente de planta sob condições eficazes para que a cepa de Trichoderma colonize as raízes da planta ou um crescimento de planta a partir da semente de planta.

27. Sistema de planta-Trichoderma, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a cepa de Trichoderma é T. viride cepa K5.

28. Sistema de planta-Trichoderma, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente Bacillus amloliqofaciens As1, As2 e/ou As3, ou quaisquer combinações dos mesmos.

29. Sistema de planta-Trichoderma, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um ou mais metabólitos selecionados a partir de um grupo que consiste em: 6-pentil pirona, ácido harziânico, hydtra 1, harzinolida e 1-octeno-3-ol.

30. Sistema de planta-Trichoderma, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que é capaz de intensificar a resistência de plantas aos estresses abióticos.

31. Sistema de planta-Trichoderma, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que é capaz de aumentar a eficácia de uso de nitrogênio em plantas.

32. Sistema de planta-Trichoderma, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que é capaz de reduzir emissões de óxido nitroso no ar e lixiviação de nitratos no solo e água.

33. Sistema de planta-Trichoderma, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que é capaz de intensificar o sequestro de carbono do ar.

Eficiência fotossintética intensificada

Resistência a pragas Resistência a estresse abiótico/biótico

Petição 870200051237, de 24/04/2020, pág. 153/188 NUE aumentado

Qualidade nutritiva aprimorada

Raízes maiores e mais Regulação crescente de trajetória inteira profundas

Cascatas de sinalização (MAPK) 1/26

Moléculas de gatilho Trichoderma

Rendimento de

Petição 870200051237, de 24/04/2020, pág. 154/188 tratamento de silagem vs. controle

% de aprimoramento em relação ao controle 2/26

Propósito geral Grão

Petição 870200051237, de 24/04/2020, pág. 155/188 Rendimento de tratamento de grão vs. controle % de aprimoramento em relação ao controle 3/26

Propósito geral Grão

Híbrido 2 Híbrido 1

Interações hipotéticas de variedade/N Petição 870200051237, de 24/04/2020, pág. 157/188 Linhagem de alto desempenho + T Controle Melhor vigor de planta de

OIRE 5/26 al/acre Valor de N de ponto único típico Concentração de N

Controle não tratado

Controle SabrEx

Petição 870200051237, de 24/04/2020, pág. 159/188 Leituras de medidor SPAD (fotossíntese) de milho de 2014 7/26 leitura de medidor de SPAD Sabrex SA Não tratado

Tratamento

Petição 870200051237, de 24/04/2020, pág. 160/188 Peso de broto de milho de 2014 vs. tratamento Altura de planta de milho de 2014 vs. tratamento 8/26

Altura de planta

Peso de broto (g) Não tratado Sabrex SA Não tratado Sabrex SA

Tratamento Tratamento

Volume de raiz de soja de GH

Cepa

Volume de raiz (ml)

Volume de raiz de soja de GH

Cepa

Peso de raiz (g)

Spad de soja de GH

Cepa

Leitura de medidor de Spad

Comprimento de tronco de soja de GH

Cepa

Comprimento de tronco (mm)

Controle

Grão de 2014 Grão de 2015

Petição 870200051237, de 24/04/2020, pág. 167/188 15/26

Híbrido

Controle Controle

Silagem de 2014 Silagem de 2015

Híbrido

Controle

C total/Ha de 2014 C total/Ha de 2015

Petição 870200051237, de 24/04/2020, pág. 168/188 Híbrido

Controle 16/26

Controle

N total/Ha de 2014 N total/Ha de 2015

Híbrido

Controle

Rendimento em T/Ha

Controle Rendimento em T/Ha

Híbrido Controle

Petição 870200051237, de 24/04/2020, pág. 170/188 Aumento de rendimento em Kg/Ha Rendimento de Diferença Kg/Ha Aumento de rendimento em Kg/Ha 18/26

Comprimento e peso de raízes

Petição 870200051237, de 24/04/2020, pág. 173/188 Peso (g)

Comprimento (cm) 21/26

Controle Tratamento Peso de raiz Comprimento de raiz

Tratamento Tratamento

Leituras de SPAD Leituras de SPAD

Tratamento

PI (unidade relativa) PI (unidade relativa)