BR112018072575B1

BR112018072575B1 - Composições microbianas altamente eficazes e multifuncionais e usos

Info

Publication number: BR112018072575B1
Application number: BR112018072575-7A
Authority: BR
Inventors: Gary E. Harman; Molly Cadle-Davidson; Walid Nosir
Original assignee: Advanced Biological Marketing, Inc
Priority date: 2016-05-02
Filing date: 2016-05-02
Publication date: 2022-05-31
Also published as: MX2018013444A; EP3452435A1; EP3452435A4; BR112018072575A2; WO2017192117A1; US20190274311A1

Abstract

A divulgação geralmente descreve a descoberta de um trem de Trichoderma gamsii (NRRL B-50520) que tem capacidades múltiplas para vários usos na agricultura de planta e desenvolvimento de sistemas para o seu uso. Este pedido de patente compara as suas capacidade para realçar a agricultura de planta para várias aplicações com vários outros agentes microbianos e que estão contidos dentro de formulações úteis. Embora outras cepas ou misturas tenham capacidades para conferir um traço ou um outro, esta cepa parece ser unicamente versátil nas suas capacidades. A mesma pode ser usada na agricultura convencional ou orgânica para a promoção de crescimento de planta e aumento nos rendimentos da safra quando aplicada topicamente como uma pulverização foliar ou como um revestimento de semente. Os produtos altamente ativos também são esperados aumentar a produtividade da planta e melhorar a qualidade de frutas, vegetais, flores ou outros produtos vegetais.

Description

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[0001] A presente tecnologia se refere geralmente às composições e métodos de uma cepa altamente eficaz e multifuncional de Trichoderma gamsti (antigamente T. viride).

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0002] A seguinte descrição é fornecida para auxiliar o entendimento do leitor. O nome da informação fornecida ou referências citadas são admitidas ser técnica anterior da presente invenção. Agentes microbianos aplicados como tratamentos de semente ou outros métodos de aplicação foram mostrados aumentar o crescimento e desenvolvimento de planta. O mais eficaz destes organismos coloniza as raízes da planta internamente e induz mudanças benéficas na expressão de gene e que, portanto, dão origens a mudanças na fisiologia da planta. Estas alternâncias na fisiologia da planta incluem supra-regulagem coordenada de caminhos bioquímicos inteiros em plantas. Não obstante, a necessidade permanece quanto a tratamentos de semente altamente funcionais e aplicações que melhorem a técnica anterior, onde mudanças eficientes e eficazes neste aspecto incluem (i) promoção de crescimento e rendimento de planta confiáveis e consistentes, (ii) crescimento de raiz realçada e desenvolvimento resultante em sistemas radiculares maiores e mais profundos, (iii) resistência melhorada a tal estresse abiótico incluindo muito pouca ou água em demasia, sal e contaminação do solo, (iv) eficiência no uso de fertilizante aumentada e especialmente eficiência no uso de fertilizante nitrogênio, níveis de antioxidante realçados na produção, onde todos os efeitos mencionados acima requerem oponentes, e podem apenas ocorrer se a fotossíntese for realçada. Estes agentes microbianos eficientemente melhoram a fotossíntese.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0003] A presente tecnologia se refere geralmente às composições, métodos e sistemas que requerem um ou mais agentes microbianos possuindo capacidades multifuncionais selecionadas do grupo consistindo de um aumento em um ou mais atributos de planta benéficos compreendendo crescimento de planta, rendimento, desenvolvimento de raiz, resistência aos estresses abióticos, eficiência fotossintética, redução de doença foliar, controle de nematóides, indução de mudanças sistêmicas na expressão de gene vegetal, permanecer localizado no sistema radicular da planta, proteger as sementes plantadas de patógenos transmitidos pelo solo (do inglês, soil- borne), e controlar populações de pragas de inseto, em que o aumento em um ou mais atributos de planta benéficos é comparado a uma planta ou sistema de planta sem o um ou mais agentes microbianos: e um carreador agronômico.

[0004] Em modalidades ilustrativas, o mediador agronômico é selecionado do grupo consistindo ou ácido húmico, ácido fúlvico, proteínas contendo nitrogênio, uréia, nitrato de amônio, sódio, fósforo, potássio, cálcio, magnésio, enxofre, ferro, manganês, magnésio, cobre, boro, grânulo, e/ou composições compósitas para estimular a formulação de grânulos, poeira, pós, pastas fluidas (do inglês, slurries), películas, suspensões líquidas, revestimento, peletização e/ou combinações dos mesmos. Em modalidades ilustrativas, o um ou mais agentes microbianos é um agente microbiano único possuindo todos do um ou mais atributos de planta benéficos. Em modalidades ilustrativas, o um ou mais mediadores agronômicos e/ou o pelo menos um agente microbiano e/ou um ingrediente adicional, possuem constituintes, sozinhos ou em combinação, que não ocorrem naturalmente juntos na natureza.

[0005] Em modalidades ilustrativas, o agente microbiano único é Trichoderma gamsii (NRRL B-50520). Em modalidades ilustrativas, o carreador agronômico é selecionado do grupo consistindo de composições compósitas para estimular a formulação de grânulos, poeira, pós, pastas fluidas, películas, suspensões líquidas, revestimento, peletização e/ou combinações dos mesmos. Em modalidades ilustrativas, as composições compreendem ainda o ingrediente ativo Ômega (Iocten- 3-ol). Em modalidades ilustrativas, as composições compreendem ainda um adjuvante. Em modalidades ilustrativas, o adjuvante é selecionado de ácido húmico, ácido fumárico, uma fonte de nutriente de planta, e extrato de levedura, entre outros, e combinações dos mesmos. Em modalidades ilustrativas, o meio de plantação é uma cera, líquido, sólido, aerossol, semi-sólido, pasta fluida e combinações dos mesmos. Em modalidades ilustrativas, o um ou mais nutrientes e/ou adjuvantes são selecionados do grupo consistindo de ácido húmico, ácido fúlvico, proteínas contendo nitrogênio, uréia, nitrato de amônio, sódio, fósforo, potássio, cálcio, magnésio, enxofre, ferro, manganês, magnésio, cobre, e boro, e combinações dos mesmos.

[0006] Em modalidades ilustrativas, os estresses abióticos são selecionados do grupo consistindo de seca, estresse osmótico, salinidade aumentada ou diminuída e alagamento. Em modalidades ilustrativas, a eficiência fotossintética aumenta mais sob condições de estresse comparada às condições não estressadas. Em modalidades ilustrativas, os patógenos transmitidos pelo solo são selecionados do grupo consistindo de Fusarium, Pythium e Rhizoctonia solani, e combinações dos mesmos. Em modalidades ilustrativas, o controle de nematóide é demonstrado pela inibição da deposição de ovo, irritação da raiz e/ou números de nematóides. Em modalidades ilustrativas, as pragas de insetos são moscas brancas e/ou afídios. Em modalidades ilustrativas, o metabólito microbiano, ou mistura de metabólitos microbianos, que aumentam a resistência de plantas às pragas e doenças são incluídos. Em modalidades ilustrativas, os metabólitos são derivados de Trichoderma spp. Em modalidades ilustrativas, os metabólitos podem incluir 6-pentil pirona, ácido harziânico, hydtra 1, harzinolida e/ou 1-octeno-3-ol. Em modalidades ilustrativas, os metabólitos são derivados de Bacillus spp.

[0007] Em modalidades ilustrativas, os metabólitos incluem sufactina, iturina, fengicinas várias formas destes, e outros metabólitos bacterianos incluindo policetídeos. Em modalidades ilustrativas, o um ou mais agentes microbianos é uma combinação de duas ou mais espécies de Trichoderma, Clonostachys, Bacillus ou Pseudomonas spp. Em modalidades ilustrativas, as composições compreendem ainda um constituinte opcional, que não ocorre naturalmente.

[0008] Em um aspecto a presente tecnologia requer um método compreendendo selecionar um ou mais agentes microbianos possuindo capacidades multifuncionais selecionadas do grupo consistindo de um aumento em um ou mais atributos de planta benéficos compreendendo crescimento de planta, rendimento, desenvolvimento de raiz, resistência aos estresses abióticos, eficiência fotossintética, redução de doença foliar, controle de nematóides, indução de mudanças sistêmicas na expressão de gene vegetal, permanecer localizado no sistema radicular da planta, proteger as sementes plantadas dos patógenos transmitidos pelo solo, e controlar populações de pragas de insetos, em que o aumento em um ou mais atributos de planta benéficos é comparado a uma planta ou sistema de planta sem o um ou mais agentes microbianos; selecionar um mediador agronômico selecionado do grupo consistindo de um adjuvante, um carreador, um meio de plantação, e/ou um ou mais nutrientes, em que pelo menos um componente dos mediadores agronômicos não ocorrem naturalmente em combinação com o um ou mais agentes microbianos; e contatar uma planta ou sistema de planta com o um ou mais agentes microbianos e mediadores agronômicos.

[0009] Em modalidades ilustrativas, o método requer contatar é selecionado de um meio ou grupo consistindo de aplicação por dispersão, aplicação por aerossol, aplicação seca por pulverização, líquido, seco, pó, névoa, atomizado, semi-sólido, gel, revestimento, loção, material ligado ou ligador, material, aplicação no rego do arado, aplicação por pulverização, irrigação, injeção, polvilhação, peletização, ou revestimento de planta ou semente de planta ou o meio de plantação com o agente. Em modalidades ilustrativas, o método requer contato ou aplicação que ocorrem em qualquer tempo e em qualquer quantidade suficiente para efetuar o um ou mais atributos de planta benéficos. Em modalidades ilustrativas, o método requer um ou mais atributos de planta benéficos compreende ainda realce, sustentabilidade, durabilidade, força, aumento, e/ou benefício da planta. Em modalidades ilustrativas, o método requer o um ou mais agentes microbianos e mediadores agronômicos são aplicados em uma maneira separada simultânea ou sequencial.

[0010] Em modalidades ilustrativas, o método requer o um ou mais agentes microbianos é um agente microbiano único possuindo todos do um ou mais atributos de planta benéficos. Em modalidades ilustrativas, o agente microbiano único é Trichoderma gamsii (NRRL B50520). Em modalidades ilustrativas, o carreador agronômico é selecionado do grupo consistindo de composições compósitas para estimular a formulação de grânulos, poeira, pós, pastas fluidas, películas, suspensões líquidas, revestimento, peletização e/ou combinações dos mesmos. Em modalidades ilustrativas, as composições compreendem ainda Ômega (1-octen-3-ol) como um ingrediente ativo. Em modalidades ilustrativas, o meio de plantação é uma cera, líquido, sólido, aerossol, semi-sólido, pasta fluida e combinações dos mesmos.

[0011] Em modalidades ilustrativas, o um ou mais nutrientes selecionados do grupo consistindo de ácido húmico, ácido fúlvico, proteínas contendo nitrogênio, uréia, nitrato de amônio, sódio, fósforo, potássio, cálcio, magnésio, enxofre, ferro, manganês, magnésio, cobre, e boro, e combinações dos mesmos. Em modalidades ilustrativas, os estresses abióticos são selecionados do grupo consistindo de seca, estresse osmótico, salinidade aumentada ou diminuída e alagamento. Em modalidades ilustrativas, a eficiência fotossintética aumenta mais sob condições de estresse comparado as condições não estressadas. Em modalidades ilustrativas, os patógenos transmitidos pelo solo são selecionados do grupo consistindo de Fusarium, Pythium e Rhizoctonia solani, e combinações dos mesmos. Em modalidades ilustrativas, o controle de nematóide é um ou mais de: uma inibição da deposição de ovo, redução na irritação da raiz, ou redução nos números de nematóide no solo que circunda as raízes.

[0012] Em modalidades ilustrativas, as pragas de insetos são moscas brancas e/ou afídios. Em modalidades ilustrativas, o metabólito microbiano, ou mistura de metabólitos microbianos, que aumentam a resistência de plantas as pragas e doenças são incluídos. Em modalidades ilustrativas, os metabólitos são derivados de Trichoderma spp. Em modalidades ilustrativas, os metabólitos podem incluir 6-pentil pirona, ácido harziânico, hydtra 1, harzinolida e/ou 1-octeno-3-ol. Em modalidades ilustrativas, os metabólitos são derivados de Bacillus spp. Em modalidades ilustrativas, os metabólitos incluem sufactina, iturina, fengicinas várias formas destes, e outros metabólitos bacterianos incluindo policetídeos. Em modalidades ilustrativas, o um ou mais agentes microbianos são uma combinação de duas ou mais espécies de Trichoderma, Clonostachys, Bacillus ou Pseudomonas spp.

[0013] Em um aspecto, a tecnologia requer um método, sistema ou composição para o controle de praga ou doença compreendendo uma emulsão contendo água e um óleo vegetal em razões de cerca de 1:1 (variando até 0,5:4), lecitina (0,5 a 1,2 % p:v) e tensoativo suficiente para formar uma emulsão estável que possa ser diluída mais do que 100 vezes em água sem separação de fase. Em modalidades ilustrativas, os métodos compreendendo ainda adicionar estearato de sódio ou outro ácido graxo em uma faixa de 1 a 3 % em peso do concentrado antes da diluição são incluídos. Em modalidades ilustrativas, o óleo vegetal é qualquer óleo disponível, preferivelmente soja, milho, canola ou açafrão (do inflês, safflower).

[0014] Em modalidades ilustrativas, a lecitina é de qualquer fonte comercial, incluindo planta e animais, incluindo soja e ovo. Em modalidades ilustrativas, o metabólito microbiano, ou mistura de metabólitos microbianos, que aumentam a resistência de plantas às pragas e doenças são incluídos. Em modalidades ilustrativas, os metabólitos são derivados de Trichoderma spp. Em modalidades ilustrativas, os metabólitos podem incluir 6-pentil pirona, ácido harziânico, hydtra 1, harzinolida e/ou 1-octeno-3-ol. Em modalidades ilustrativas, os metabólitos são derivados de Bacillus spp. Em modalidades ilustrativas, os metabólitos incluem sufactina, iturina, fengicina várias formas destes, e outros metabólitos bacterianos incluindo policetídeos.

[0015] Em modalidades ilustrativas, o contato é realizado pela aplicação por dispersão, aplicação líquida ou seca no rego do arado, aplicação por pulverização, irrigação, injeção, polvilhação, peletização, ou revestimento de planta ou semente de planta ou o meio de plantação com cepa de Trichoderma. Em modalidades ilustrativas, as bactérias são selecionadas de Bacillus ou Pseudomonas spp. Em modalidades ilustrativas, a emulsão contém água e um óleo vegetal em razões de cerca de 1:1 (variando até 0,5:4), lecitina (0,5 a 1,2 % w:v) e tensoativo suficiente para formar uma emulsão estável que possa ser diluída mais do que 100 vezes em água sem separação de fase. Em um aspecto, a tecnologia requer um método de enriquecimento de biomassa para ecossistemas agrícolas, compreendendo: (a) fornecer um ou mais biomoduladores capazes de promover o desempenho da planta vascular: (b) deixar o um ou mais biomoduladores para interagir com pelo menos uma espécie da planta vascular, em que a interação realça a eficiência fotossintética (biorrecurso ou fotossíntese) de pelo menos uma espécie da planta vascular: e (b) manter o crescimento máximo do córtex radicular de pelo menos uma espécie da planta vascular para enriquecer a biomassa do solo, em que a biomassa enriquecida promove a capacidade reservatório do solo para absorção e armazenagem elementares. Em modalidades ilustrativas, os métodos opcionalmente compreendendo ainda a etapa de adicionar um constituinte que não ocorre naturalmente.

[0016] Em um aspecto, a presente divulgação fornece métodos, sistemas e composições para realçar o crescimento de plantas, aumentar o rendimento da safra, realçar a resistência de plantas os estresses abióticos, realçar a fotossíntese, realçar o metabolismo de planta, facilitar a liberação de um agente, realçar a germinação, desenvolvimento de raiz, aumentar os níveis de antioxidantes, lixiviação de nitratos no solo e água, realçar a atividade muitos herbicidas comerciais e potenciais e/ou reduzir pragas de planta compreendendo: a. aplicar um agente a um ou mais locais na, sobre, em torno, próximo e/ou em uma planta, semente, safra, raiz, ou organismo de interesse, ou qualquer outro componente dos métodos e sistemas aqui divulgados, em que a aplicação ocorre no local e/ou em uma tal via que impacta a planta ou organismo de interesse em uma maneira benéfica: e em que, b. o agente compreende um ou mais componentes capazes de efetuar o realce, sustentabilidade, durabilidade, força, aumento, e/ou benefício.

[0017] Em modalidades ilustrativas, o biorrecurso é a fotossíntese, e/ou em que ainda a planta é rizosfera competente, e/ou em que o aumento de biomassa é mediado pela planta enraizada, e/ou em que a interação medeia a modulação da capacidade reservatório do solo para absorção e armazenagem elementares. Em modalidades ilustrativas, a planta é selecionada do grupo consistindo de alfafa, arroz, trigo, cevada, aveias, centeio, algodão, sorgo, girassol, amendoim, batata, batata doce, feijão, ervilha, chicória, alface, endívia, repolho, couve de bruxelas, beterraba, pastinaca, nabo, couve-flor, brócolis, rabanete, espinafre, cebola, alho, berinjela, pimenta, aipo, cenoura, abóbora, jerimum, abobrinha italiana, pepino, maçã, pêra, melão, cítricos, morango, uva, framboesa, abacaxi, feijão de soja, fumo, tomate, milho, trevo, cana de açúcar, Arabidopsis thaliana, Saintpaulia, petúnia, pelargônio, poinsétia, crisântemo, cravo, zínia, rosa, boca-de-leão, gerânio, zínia, lírio, dailily, Echinacea, dália, hosta, tulipa, narciso, peônia, phlox, ervas, arbustos ornamentais, gramas ornamentais, switchgrass, e relvado, ou qualquer outra planta ou semente ou safra, ou combinações das mesmas.

[0018] Em modalidades ilustrativas, a aplicação é selecionada de um meio ou grupo consistindo de aplicação por dispersão, aplicação por aerossol, aplicação seca por pulverização, líquido, seco, pó, névoa, atomizado, semi-sólido, gel, revestimento, loção, material ligado ou ligador, material, aplicação no rego do arado, aplicação por pulverização, irrigação, injeção, polvilhação, granulação, ou revestimento de planta ou semente de planta ou o meio de plantação com o agente. Em modalidades ilustrativas, a aplicação ocorre em qualquer tempo e em qualquer quantidade suficiente para efetuar o realce, sustentabilidade, durabilidade, força, aumento e/ou benefício. Em modalidades ilustrativas, o agente é aplicado com um segundo ou agentes adicionais em uma maneira separada, simultânea ou sequencial.

[0019] Em modalidades ilustrativas, o agente é selecionado do grupo consistindo de um ou mais de um agente biológico, um adjuvante, um ácido, uma base, um paleta, um agente livre de GNO, um agente herbicida, um agente pesticida, um agente promotor de crescimento, um micróbio, um ou mais espécies bacterianas, espécies virais, espécies fúngicas, espécies de levedura, espécies de planta, esporos, componentes celulares, metabólitos, compostos, tensoativos, emulsificadores, metais, elementos, nutrientes, derivados, meios, meio, cepa de Trichoderma K1, K2, K3, K4, K5, e cepas de Bacillus As1, As2, As3, As4 e As5, e ou qualquer outras composições, misturas, agentes aqui descritos, e/ou combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o agente está, sozinho ou em combinação com as outras cepas microbianas aqui citadas, selecionadas do grupo consistindo de (a) cepas de Trichoderma K1 e K5, (b) cepas de Bacillus TR4, As3, As2 e Ph1 e (iii) cepas de Bacillus HHHB e TRH13, e combinações das mesmas. Em modalidades ilustrativas, a praga ou o controle de praga compreende pragas ou controles selecionados do grupo consistindo de nematóides, insetos, atrópodes, animais, micróbios, um ou mais espécies bacterianas, espécies virais, espécies fúngicas, espécies de levedura, prions, espécies de planta, esporos, e/ou controle foliar da doença sistêmica, ou qualquer combinação dos mesmos. Em modalidades ilustrativas, os métodos opcionalmente compreendendo ainda a etapa de adicionar um constituinte que não ocorre naturalmente.

[0020] Em um aspecto. a presente tecnologia fornece métodos para realçar o crescimento de plantas compreendendo: contatar uma cepa de Trichoderma com uma planta ou uma planta semente sob condições eficazes para a cepa de Trichoderma para colonizar as raízes da planta ou uma planta cultivada a partir da semente da planta, criando deste modo um sistema de planta-Trichoderma e cultivando a planta ou semente da planta sob condições eficazes para sustentar o sistema de planta- Trichoderma em um meio de plantação e para realçar o crescimento de planta, em que a cepa de Trichoderma é Trichoderma viride ou cepa de T. gamsii NRRL 50520. Em modalidades ilustrativas, os métodos compreendem ainda adiciona uma fonte suplementar de nutrientes ao sistema de planta-Trichoderma.

[0021] Em modalidades ilustrativas, os nutrientes são selecionados do grupo consistindo de ácidos húmicos ou fúlvicos: solo: água: proteínas incluindo fontes de nitrogênio, uréia, nitrato de amônio, sódio, fósforo, potássio, cálcio, magnésio, enxofre, ferro, manganês, magnésio, cobre, boro e/ou outros micronutrientes. Em modalidades ilustrativas, uma ou mais cepas de Trichoderma são fornecidas como um grânulo, poeira, pó, pasta fluida, película, suspensão líquida, ou combinações dos mesmos. Em modalidades ilustrativas, o contato é realizado pela aplicação por dispersão, aplicação líquida ou seca no rego do arado, aplicação por pulverização, irrigação, injeção, polvilhação, peletização, ou revestimento de planta ou semente de planta ou o meio de plantação com cepa de Trichoderma.

[0022] Em modalidades ilustrativas, o contato é realizado antes que a planta ou semente da planta fosse introduzida no meio da plantação. Em modalidades ilustrativas, a planta ou semente da planta são de uma planta de safra selecionadas do grupo consistindo de alfafa, arroz, trigo, cevada, aveias, centeio, algodão, sorgo, girassol, amendoim, batata, batata doce, feijão, ervilha, chicória, alface, endívia, repolho, couve de bruxelas, beterraba, pastinaca, nabo, couve-flor, brócolis, rabanete, espinafre, cebola, alho, berinjela, pimenta, aipo, cenoura, abóbora, jerimum, abobrinha italiana, pepino, maçã, pêra, melão, cítricos, morango, uva, framboesa, abacaxi, feijão de soja, fumo, tomate, milho, trevo, e cana de açúcar.

[0023] Em modalidades ilustrativas, a planta ou semente da planta são uma planta ornamental selecionadas do grupo consistindo de Arabidopsis thaliana, Saintpaulia, petúnia, pelargônio, poinsétia, crisântemo, cravo, zínia, rosa, boca-de-leão, gerânio, zínia, lírio, daylily, Echinacea, dália, hosta, tulipa, narciso, peônia, flox, ervas, arbustos ornamentais, gramas ornamentais, switchgrass e relvado. Em modalidades ilustrativas, o realce do crescimento de planta está na forma de massa de raiz maior, profundidade maior de enraizamento, massa e broto maior, comprimento maior de brotos, verdura de folha aumentada, rendimentos aumentados, e sustentação ou vigor de planta melhorados. Em modalidades ilustrativas, os métodos opcionalmente compreendendo ainda a etapa de adicionar um constituinte que não ocorre naturalmente.

[0024] Em modalidades ilustrativas, um método, sistema e/ou composição são fornecidos para realçar a resistência de plantas os estresses abióticos compreendendo: contatar uma cepa de Trichoderma com a planta ou uma semente da planta sob condições eficazes para a cepa de Trichoderma para colonizar as raízes da planta ou uma planta cultivada a partir da semente da planta, criando deste modo um sistema de planta-Trichoderma e cultivando a planta ou semente da planta sob condições eficazes para sustenta o sistema de planta-Trichoderma em um meio de plantação e para realçar a resistência ou plantas os estresses abióticos, em que a cepa de Trichoderma é Trichoderma viride ou cepa de T. gamsii NRRL 50520.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0025] A FIG. 1 é um gráfico mostrando o número de acertos de BLAST para genes de identificação de espécie do genoma K5. Dos genes que produzem acertos, aqueles com a maior frequência e identidade de sequência mais alta foram todas de Trichoderma gamsii. Os acertos de Trichoderma viride foram muito menos frequentes e de identidade de sequência mais baixa. O número de acertos é mostrado no eixo y, os resultados para resultados de pesquisa de sequência de gene individual estão no eixo x (mostrado apenas como espécie para facilidade de leitura).

[0026] A FIG. 2 é uma imagem mostrando a aparência de plantas de milho em testes de estufa.

[0027] A FIG. 3 é uma imagem mostrando testes de estufa de pulverizações foliares sobe mudas de trigo. K5 na esquerda e não tratado (apenas água) na direita mostra aumento de crescimento significante com aplicação foliar da cepa K5.

[0028] A FIG. 4 mostra plotagens de caixa e bigodes mostrando as diferenças médias e a distribuição de dados para caracteres de volume de raiz (p = 0,0198), peso de raiz (p = 0,0082), espiga (p = 0,0375), e comprimento da haste (p = 0,0057) para feijões de soja na estufa tendo sido a semente tratada com a cepa K5 de Trichoderma.

[0029] A FIG. 5 mostra fotomicrografias de radículas emergentes de milho de sementes tratadas com conídia da cepa K1, tingidas com Calcoflúor e visualizadas com microscopia epifluorescente. Sem tingimento e iluminação, as raízes com e sem o organismo parecem idênticas. O aparecimento de radícula 48 horas depois da embebeção começando exatamente depois que a radícula emergiu do revestimento de semente (Esquerda). A membrana azul é o organismo; as hifas são de cerca de 4 μm de largura. A imagem no tom de cinza (usada para realçar contraste) de uma raiz 72 horas depois da embebeção. O crescimento do organismo é mais pronunciado e as filíades são visíveis (seta) (Direita)).

[0030] A FIG. 6 mostra a aparência do milho e espigas do milho em Illinois na seca de 2012. As plantas na fileira à esquerda foram cultivados com sementes tratadas com uma mistura de fungicida-inseticida comercial com a mesma mistura de fungicida mais SabrEx.

[0031] A FIG. 7 é uma imagem mostrando as diferenças no broto da planta e crescimento com a variedade 6490 nos testes de campo em ABM15. Os painéis A mostram a aparência de plantas e raízes das mesmas plantas a seguir dos tratamentos sem nada (apenas o tratamento químico da semente), e o mesmo tratamento com SabrEx, K2+K4 mais Ômega, e K5As2 + Ômega. Em B é mostrado a mesma planta de controle quando comparada com apenas Ômega. As plantas maiores tiveram mais do que 270 cm de altura.

[0032] A FIG. 8 é uma representação diagramática das interações entre cepas de Trichoderma endofíticas e plantas. Os fungos (representados pela caixa e o termo micróbios benéficos) colonizam as raízes, e são restritos para as células corticais. A microfotografia eletrônica no canto inferior direito são de um outro microorganismo endofítico, uma cepa de T. asperellum e é de (Yedidia, Benhamou, et al., 1999). As estruturas rotuladas T são hifas do microorganismo nas células da raiz. A presença do fungo induz a deposição na parede celular e previne a infecção do organismo por toda a planta (Yedidia, Benhamou, et al., 1999) mas as cepas usadas neste estudo continuam a proliferar na planta e, como mostrado, induzem efeitos de longa estação (Harman. Howell, et al., 2004. Shoresh, Mastouri, et al., 2010). Estes fungos produzem uma variedade de metabólitos que podem imitar o efeito dos organismos e estes são supostos ligar aos receptores nas células de planta; os metabólitos são indicados pelos símbolos amarelos e os símbolos verdes representam receptores de planta. Um tal metabólito é 1-octen-3-ol.

[0033] Como uma consequência, as plantas respondem com numerosas mudanças na expressão de gene vegetal (Djonovic, Pozo, et al., 2006, Marra, Ambrosino, et al., 2006. Mastouri, Bjorkman, et al., 2012. Shoresh e Harman, 2008). Isto, resulta em mudanças substanciais na fisiologia e desempenho da planta, incluindo biomassa aumentada tanto de brotos quanto de raízes (dados neste documento e em outro lugar), a eficiência fotossintética realçada (este documento), resistência às doenças (Djonovic, Pozo, et al., 2006, Shoresh, Mastouri, et al., 2010), resistência aos estresses abióticos tais como seca, sal (Mastouri. Bjorkman, et al., 2012), e alagamento (este documento), eficiência no uso de nitrogênio aumentada (Harman e Mastouri, 2010) e este documento, e níveis de antioxidante realçados na produção (Harman, não publicado).

[0034] A FIG. 9 é uma representação diagramática das interações de ROS nas plantas e no controle destes compostos negativos pelo OIRE induzido pelas cepas de Trichoderma. O diagrama na direita superior mostra o caminho global da formação de ROS (Nath. Jajoo, et al., 2013) enquanto o diagrama na direita superior mostra as foto-reações envolvidas na excitação excessiva da clorofila pela luz de (Mittler, 2002).

[0035] A FIG. 10 mostra o crescimento microscópio de hifas K5 sobre radículas emergentes de sementes tratadas com esta cepa 72 horas depois que a embebeção começou.

[0036] A FIG. 11 mostra uma imagem da variedade 5445 da Chemgro, onde as sementes foram de plantas cultivadas com sementes tratadas com SabrEx depois do plaqueamento das sementes filhas durante quatro dias no meio PDA.

[0037] A FIG. 12 é um gráfico mostrando dados de semente de girassol onde as sementes foram tratadas com vários microorganismos e plantadas no solo infestado com nematóides parasíticos de planta. Depois que as plantas foram maduras, as raízes foram colhidas e classificadas quanto à irritação da raiz causada pelos nematóides.

[0038] As FIGs. 13A-C são gráficos mostrando resultados de testes com Pythium e Rhizoctonia solani nós plantamos sementes de feijão de soja e para Fusarium spp., nós usamos Fusarium gratnincola com trigo como o sistema de teste (Harman, Taylor, et al., 1989). Os dados são mostrados na FIG. 13 para os vários patógenos. Os valores de médias são mostrados e as barras de erro representam desvios padrão. Cada gráfico mostra os dados combinados para % de germinação de semente, crescimento de broto, e volume de raiz para todos os três patógenos.

[0039] A FIG. 14 é um gráfico mostrando a classificação do míldio pulverulento (% de área de folha coberta, eixo y) depois de vários tratamentos. As barras de erro representam o erro padrão (três réplicas de cada planta).

[0040] As FIGs. 15A-B mostram gráficos, onde OPB e um controle (água) foram pulverizados sobre plantas de alfafa em um campo comercial na taxa de 6 ml/L e duas semanas mais tarde. Porções de 12 pés quadrados (1,1 m2) foram colhidas (três réplicas). Além disso, 1-octen-3-ol também foi aplicado, como o foi uma mistura de OPB + 1-octen-3-ol e nutrientes de planta mais um produto de ácido húmico.

[0041] As FIGs. 16A-B mostram dados para controlar moscas brancas.

[0042] As FIGs. 17A-B mostram conjuntos de dados de réplicas para controlar moscas brancas.

[0043] A FIG. 18 mostra dados para controlar afídios.

[0044] A FIG. 19 é um diagrama de correlações com atividade de cepas específicas em testes diferentes conduzidos na estufa (ensaios com base em feijões de soja ou, para ensaios de mosca branca, em pepinos, ou inibição in vitro pelas diferentes cepas de patógenos de planta). As caixas que são azul escuro mostram atividades que são fortemente correlacionadas, e aquelas que são vermelho vivo são de modo forte negativamente correlacionadas. Os graus mais baixos de correlações positivas ou negativas são indicados pelos sombreados mais claros ou mais escuro de azul e vermelho, respectivamente.

[0045] A FIG. 20 é uma análise de rede de cepas ABM mostrando relações entre as cepas tendo efeitos que impactam traços mostrados (cor codificada por legenda de figura). O tamanho dos vértices indica o número de vezes um ápice (traço ou cepa/tratamento) foi testado, assim círculos grandes mostram avaliações repetidas. As cores das linhas indicam se uma cepa ultrapassa o controle para um dado traço, as linhas cinzas mostram equivalência com o controle, as linhas verdes 1 a 5X o controle, e as linhas azuis escuro mais do que 5 vezes o controle.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0046] Deve ser avaliado que certos aspectos, modos, modalidades, variações e características da invenção são descritos abaixo em vários níveis de detalhe de modo a fornecer um entendimento substancial do presente.

[0047] Na seguinte descrição detalhada, referência é feita aos desenhos anexos, que formam uma parte desta. Nos desenhos, símbolos similares tipicamente identificam componentes similares, a menos que o contexto dite de outro modo. As modalidades ilustrativas descritas na descrição detalhada, desenhos, e reivindicações não são intencionadas a ser limitantes. Outras modalidades podem ser utilizadas, e outras mudanças podem ser feitas, sem divergir do espírito ou escopo da matéria objeto aqui apresentada. Será facilmente entendido que os aspectos da presente divulgação, como geralmente aqui descritos, e ilustrados nas figuras, podem ser arranjados, submetidos, combinados, separados, e designados em uma ampla variedade de configurações diferentes, todos dos quais são aqui explicitamente considerados.

[0048] Na prática da presente invenção, muitas técnicas convencionais na biologia molecular, bioquímica de proteína, biologia celular, imunologia, microbiologia e DNA recombinante são usados. Estas técnicas são bem conhecidas e são explicadas, por exemplo em, Current Protocols in Molecular Biology, Vols. I-III, Ausubel, Ed. (1997); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I e II, Glover, Ed. (1985); Oligonucleotide Synthesis, Gait, Ed. (1984); Nucleic Acid Hybridization, Hames & Higgins, Eds. (1985); Transcription and Translation, Hames & Higgins, Eds. (1984); Animal Cell Culture, Freshney, Ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Meth. Enzymol., (Academic Press, Inc., 1984); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Miller & Cabs, Eds. (Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1987); e Meth. Enzymol., Vols. 154 e 155, Wu & Grossman, and Wu, Eds., respectivamente. Métodos para detectar e medir níveis de produtos de expressão de gene de polipeptíde (isto é, nível de tradução de gene) são bem conhecidos na técnica e incluem o uso de métodos de detecção de polipeptídeo tal como detecção de anticorpo e técnicas de quantificação. (Ver também, Strachan & Read, Human Molecular Genetics, Segunda Edição. (John Wiley and Sons, Inc., Nova Iorque (1999))

[0049] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados geralmente têm o mesmo significado como habitualmente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica a qual esta invenção pertença. Como usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um,” “uma” e “o/a” incluem referentes plurais a menos que o conteúdo dite claramente de outro modo. Por exemplo, referência a “uma célula” inclui combinação de duas ou mais células, e os semelhantes. Geralmente, a nomenclatura aqui usada e os procedimentos laboratoriais na cultura celular, genéticas moleculares, química orgânica, química analítica e química do ácido nucléico e hibridização descrita abaixo são aqueles bem conhecidos e habitualmente utilizados na técnica. Todas as referências aqui citadas são aqui incorporadas por referência em sua totalidade e para todos os propósitos no mesmo grau como se cada publicação individual, patente, ou pedido de patente fosse específica e individualmente incorporada por referência em sua totalidade para todos os propósitos.

[0050] Na prática da presente invenção, muitas técnicas convencionais na biologia molecular, bioquímica de proteína, biologia celular, imunologia, microbiologia e DNA recombinante são usados. Estas técnicas são bem conhecidas e são explicadas, por exemplo em, Current Protocols in Molecular Biology, Vols. I-Ill, Ausubel, Ed. (1997); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I e II, Glover, Ed. (1985); Oligonucleotide Synthesis, Gait, Ed, (1984); Nucleic Acid Hybridization, Hames & Higgins, Eds. (1985); Transcription and Translation, Hanes & Higgins, Eds. (1984); Animal Cell Culture, Freshney, Ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning: the series, Meth. Enzymol., (Academic Press, Inc., 1984); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Miller & Cafes, Eds. (Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1987); e Meth. Enzymol., Vols. 154 e 155, Wu & Grossman, e Wu, Eds., respectivamente.

[0051] Definições. As definições de certos termos como usado neste relatório descritivo são fornecidos abaixo. As definições de outros termos podem ser encontradas na Illustrated Dictionary of Immunology, 2a Edição (Cruse, J. M. e Lewis, RE., Eds., Boca Raton, FL: CRC Press, 1995). A menos que indicado de outro modo, o termo “biomarcador” quando aqui usado se refere ao biomarcador humano, por exemplo, uma proteína humana e gene. Tais definições de certos termos como usados neste relatório descritivo são fornecidos abaixo. A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados geralmente têm o mesmo significado como habitualmente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica a qual esta invenção pertença.

[0052] Como usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma” e “o/a” incluem referentes plurais a menos que o conteúdo dite claramente de outro modo. Por exemplo, referência a “uma célula” inclui combinação de duas ou mais células, e os semelhantes.

[0053] Como aqui usado, “cerca de” será entendido por pessoas de habilidade comum na técnica e variará em algum grau dependendo do contexto no qual o mesmo é usado. Se houver usos do termo que não estejam claros para as pessoas de habilidade comum na técnica, dado o contexto no qual o mesmo é usado, “cerca de” significará até mais ou menos 10 % do volume enumerado.

[0054] Como aqui usado, a “administração” de um agente, micróbio, composições, fármaco, ou peptídeo a uma planta objeto e/ou sistema de planta inclui qualquer via ou modalidade de incluir ou distribuir o agente ou composição para realizar sua função pretendida.

[0055] Como aqui usado, o termo “aminoácido” inclui aminoácidos que ocorrem naturalmente e aminoácidos sintéticos, assim como análogos de aminoácido e miméticos de aminoácido que funciona em uma maneira similar aos aminoácidos que ocorrem naturalmente. Os aminoácidos que ocorrem naturalmente são aqueles codificados pelo código genético, assim como aqueles aminoácidos que são modificados mais tarde, por exemplo, hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, e 0- fosfoserina. Análogos de aminoácido se referem aos compostos que tem a mesma estrutura química básica como um aminoácido que ocorre naturalmente, isto é, um carbono α que é ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino, e um grupo R, por exemplo, homosserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfônio. Tais análogos têm grupos R modificados (por exemplo, norleucina) ou cadeias principais peptídicas modificadas, mas retém a mesma estrutura química básica como um aminoácido que ocorre naturalmente. Miméticos de aminoácido se referem aos compostos químicos que têm uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, que funciona em uma maneira similar a um aminoácido que ocorre naturalmente. Os aminoácidos podem ser aqui aludidos pelos seus símbolos de três letras ou pelos símbolos de uma letra habitualmente conhecidos recomendados pela IUPAC-1UB Biochemical Nomenclature Commission.

[0056] Como aqui usado, os termos “amplificação” ou “ampliar” significam um ou mais métodos conhecidos na técnica para copiar um ácido nucléico alvo, por exemplo, mRNA biomarcador, aumentando deste modo o número de cópias de uma sequência de ácido nucléico selecionada. A amplificação pode ser exponencial ou linear. Um ácido nucléico alvo pode ser DNA ou RNA. As sequências amplificadas desta maneira formam um “amplicon”. Embora os métodos exemplares descritos a seguir se refiram à amplificação usando a reação da cadeia da polimerase (PCR), numerosos estes métodos são conhecidos na técnica para a amplificação de ácidos nucléicos (por exemplo, métodos isotérmicos, métodos de círculo rolante, etc.). O técnico habilitado entenderá que estes outros métodos podem ser usados no lugar de, ou juntos com, os métodos PCR. Ver, por exemplo,. Saiki, “Amplification of Genomic DNA” in PCR Protocols, Innis et al., Eds., Academic Press, San Diego, CA 1990, pp. 13-20; Wharam, Nucleic Acids Res., 2001, 29(11):E54-E54; Hafner et al,. Biotechniques 2001, 30(4):852-6, 858, 860; Zhong et al., Biotechniques, 2001, 30(4):852-6, 858, 860.

[0057] Como aqui usado, os termos “agregação” ou “agregação de célula” se referem a um processo por meio do qual biomoléculas, tais como polipeptídeos, ou células estavelmente associadas entre si para formar um complexo multimérico insolúvel, que não desassociam sob condições fisiológicas a menos que uma etapa de desagregação seja realizada.

[0058] Como aqui usado, os termos “anfipático” ou “anfifílico” são intencionados a se referir a qualquer material que seja capaz de interações polares e não polares, ou hidrofóbicas e hidrofílicas. Estas interações anfipáticas podem ocorrer no mesmo tempo ou em resposta a um estímulo externo em tempos diferentes. Por exemplo, quando um material específico, revestimento, um ligador, matriz ou suporte, são ditos ser “anfipáticos” é intencionado que o revestimento possa ser hidrofóbico ou hidrofílico dependendo das variáveis externas, tais como, por exemplo, temperatura.

[0059] Como aqui usado, a frase “diferença do nível” se refere às diferenças na quantidade de um marcador particular, tal como um antígeno de superfície celular, proteína biomarcadora, ácido nucléico, ou uma diferença na resposta de um tipo de célula particular a um estímulo, por exemplo, uma mudança na adesão superficial, em uma amostra quando comparada a um nível de controle ou referência. Em modalidades ilustrativas, uma “diferença de um nível” é uma diferença entre o nível de um marcador presente em uma amostra quando comparada a um controle de pelo menos cerca de 1 %, pelo menos cerca de 2 %, pelo menos cerca de 3 %, pelo menos cerca de 5 %, pelo menos cerca de 10 %, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 35 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 % ou mais.

[0060] Como aqui usado, os termos “expressão” ou “expressão de gene” se referem ao processo de converter informação genética codificada em um gene em RNA, por exemplo, mRNA, rRNA, tRNA, ou snRNA, através da transcrição do gene, isto é, via a ação enzimática de uma RNA polimerase, e para os genes que codificam a proteína, em proteína através da tradução de mRNA. A expressão de gene pode ser regulado em muitos estágios no processo. “Supra-regulagem” ou “ativação” se referem à regulagem que aumenta a produção de produtos da expressão de gene, isto é, RNA ou proteína, enquanto “infra-regulagem” ou “repressão” ou “nocaute” se referem à regulagem que diminui a produção. Moléculas, por exemplo, fatores de transcrição que estão envolvidos na supra-regulagem ou infra-regulagem são frequentemente chamados de “ativadores” e “repressores”, respectivamente.

[0061] Como aqui usado, os termos “matriz extracelular”, “ECM,” ou “película apical” são usados intercambiavelmente, e abrangem várias misturas de proteína líquidas, gelatinosas, semi-sólidas, ou sólidas congruentes com o ambiente extracelular complexo encontrado em muitos tecidos. A matriz extracelular pode ser utilizada como um substrato para as preparações de cultura de célula e tecido ou como uma superfície para a adesão celular para uma matriz de cristal líquido. A “matriz extracelular” também pode incluir extrato de membrana de base e/ou matriz quente de Engelbreth-Holm-S (ENS).

[0062] Como aqui usado, o termo “epítopo” significa um determinante de proteína capaz de ligação específica a um anticorpo. Os epítopos usualmente consistem de agrupamentos superficiais quimicamente ativos de moléculas tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e usualmente têm características estruturais tridimensionais específicas, assim como características de carga específicas. Os epítopos conformacionais e não conformacionais são distinguidos em que a ligação ao primeiro, mas não ao último é perdida na presença de solventes desnaturantes. Em algumas modalidades, um “epítopo” de um biomarcador é uma região na proteína biomarcadora à qual o agente de ligação biomarcador da invenção se liga.

[0063] Como aqui usado, o termo “composição” se refere a um produto com ingredientes especificados nas quantidades especificadas, assim como qualquer produto que resulte, direta ou indiretamente, da combinação dos ingredientes especificados nas quantidades especificadas.

[0064] Como aqui usado, os termos “produção”, “safras”, “componente alimentício”, “componente de sistema”, “variável de aumento” ou “sujeito” se referem a uma planta, fungo, colônia microbiana, mamífero, tal como um ser humano, mas também pode ser um outro animal tal como um animal doméstico, por exemplo, um cão, gato, ou afins, um animal de fazenda, por exemplo, uma vaca, uma ovelha, um porco, um cavalo, ou afins, ou um animal de laboratório, por exemplo, um macaco, um rato, um camundongo, um coelho, um porquinho da Índia, ou afins.

[0065] Como aqui usado, os termos “matriz” ou “suporte” ou “matriz de hidrogel” são usados intercambiavelmente, e abrangem hidrogéis com base em polímero e não polímero, incluindo, por exemplo, poli(ácido hialurônico), poli(alginato de sódio), poli(etileno glicol), diacrilato, quitosano, e hidrogéis com base em poli(álcool vinílico). “Hidrogel” ou “gel” também são intencionados a se referirem a todas as outras composições de hidrogel aqui divulgadas, incluindo hidrogéis que contenham polímeros, copolímeros, terpolímero, e hidrogéis de polímero complexado, isto é, hidrogéis que contenham uma, duas, três, quatro ou mais unidades constituintes monoméricas ou multiméricas. Hidrogéis são tipicamente redes contínuas de polímeros hidrofílicos que absorvem água.

[0066] Como aqui usado, o termo “polímero” se refere uma macromolécula fabricada de unidade de repetição monoméricas ou multiméricas. Os polímeros da presente divulgação, incluem, mas não são limitados a, celulose, laminarina, amido, quitina, quitosano, glicanos, hemicelulose, poli(ácido hialurônico), poli(alginato de sódio), poli(etileno glicol) (PEG), polímeros do poli(ácido láctico), polímeros do poli(ácido glicólico), poli(lactídeo-co-glicolídeos) (PLGA), poli (uretanos), poli(siloxanos) ou silicones, poli(etileno), poli(vinil pirrolidona), poli(metacrilato de 2- hidróxi etila), poli(N-vinil pirrolidona), poli(metilmetacrilato), poli(álcool vinílico) (PVA), poli(ácido acrílico), poli (acetato de vinila), poliacrilamida, poli(etileno-co-acetato de vinila), poli(ácido metacrílico), ácido poliláctico (PLA), ácidos poliglicólico (PGA), náilons, poliamidas, polianidridos, poli(etileno-co-álcool vinílico) (EVOH), policaprolactona, hidróxido de polivinila, poli(óxido de etileno) (PEO), e poliortoésteres ou um copolímero ou terpolímero formado de pelo menos dois ou três membros dos grupos, respectivamente.

[0067] Como aqui usado, o termo “nível de referência” se refere a um nível ou medição de uma substância ou variável que possam ser de interesse para propósitos comparativos. Em algumas modalidades, um nível de referência pode ser um teor de umidade especificado como uma média do teor de umidade recolhido de um sujeito/planta de controle. Em outras modalidades, o nível de referência pode ser o nível no mesmo sujeito/planta em um tempo diferente, por exemplo, um curso de tempo de administrar ou aplicar uma composição ou formulação particulares.

[0068] Como aqui usados, os termos “esqueleto” ou “substrato” ou “matriz de sustentação”, usados no contexto de um biomarcador, etc., se referem a qualquer superfície ou estrutura capazes de sustentar uma matriz, incluindo compostos, formulações, marcadores, micróbios, etc., cultivados com ela. Tais suportes ou substratos têm várias superfícies consideradas, e/ou são compostos de materiais, que incluem, mas não são limitados a, materiais de encapsulação, cera, vidro, metal, plástico, e/ou materiais revestidos com polímeros para revestimento, ligação e/ou imobilização de um ou mais materiais, por exemplo, poli(N-isopropilacrilamida) (PIPAAm), copolímero de butil metacrilato de isopropilacrilamida (IBc), metacrilato de butila (BMA), poli-NIPAAm-co-AAc-cotBAAm (lAtB), N,N-dimetilaminopropilacrilamida (DMAPAAm), poli(Nacriloilpiperidina)-cisteamina (pAP), PIPAAM-sulfonato/sulfato de carboximetil dextrano benzilamida (PIPAAm-CMDBS), ou polímero reticulado com N,N-metileno-bis-acrilamida, PIPAAm-PEG, ou quaisquer combinações dos mesmos.

[0069] Como aqui usado, os termos “tratando” ou “tratamento” ou “alívio” se referem tanto ao tratamento terapêutico quanto às medidas profiláticas ou preventivas, onde o objetivo é prevenir ou diminuir (reduzir) a velocidade da doença, condição ou distúrbio alvos. Um sujeito/planta é “tratado” com êxito quanto a um distúrbio se, depois de receber intervenção/aplicação terapêuticas de acordo com os métodos da presente, o sujeito/planta apresenta redução observável e/ou mensurável na ou ausência de uma ou mais doença, condição ou distúrbio alvejados. Em modalidades ilustrativas, o tratamento bem-sucedido resulta no controle da doença, controle de inseto, controle de nematóide, crescimento ou desempenho de planta realçados, susceptibilidade reduzida aos estresses abióticos, absorção de nutriente melhorada e eficiência fotossintética realçada.

[0070] Como aqui usados, os termos “material termorresponsivo” ou “polímero termorresponsivo” se referem a um composto, material, monômero, polímero. copolímero, terpolímero, ou qualquer combinação dos mesmos, que sejam capazes de alterar o seu estado ou propriedade, isto é, hidrofobicidade ou hidrofilicidade, em resposta a uma mudança na temperatura.

[0071] Um polipeptídeo ou peptídeo “isolado” ou “purificado” é substancialmente livre de material celular ou outros polipeptídeos contaminantes da fonte de célula ou tecido a partir da qual o agente é derivado, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizados. Por exemplo, um peptídeo aromático-catiônico isolado seria livre de materiais que interfeririam com usos em diagnóstico ou terapêuticos do agente. Tais materiais interferentes podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos e não proteináceos.

[0072] Como aqui usado, os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são aqui usados intercambiavelmente para significar um polímero compreendendo dois ou mais aminoácidos unidos entre si pelas ligações peptídicas ou ligações peptídicas modificadas, isto é, isósteros peptídicos. Polipeptídeo se refere tanto às cadeias curtas, habitualmente aludidas como peptídeos, glicopeptídeos ou oligômeros, e às cadeias mais longas, geralmente aludidas como proteínas. Os polipeptídeos podem conter aminoácidos outros que não os 20 aminoácidos codificados pelo gene. Os polipeptídeos incluem sequências de aminoácido modificadas pelos processos naturais, tais como processamento pós-traducionais, ou pelas técnicas de modificação química que são bem conhecidas na técnica.

[0073] Como aqui usado, o termo uso terapêutico “simultâneo” se refere à administração de pelo menos dois ingredientes ativos pela mesma via e ao mesmo tempo ou substancialmente ao mesmo tempo.

[0074] Como aqui usado, o termo uso terapêutico “separado” se refere a uma administração de pelo menos dois ingredientes ativos ao mesmo tempo ou substancialmente ao mesmo tempo pelas vias diferentes.

[0075] Como aqui usado, o termo uso terapêutico “sequencial” se refere à administração de pelo menos dois ingredientes ativos em tempos diferentes, a via de administração sendo idêntica ou diferente. Mais particularmente, o uso sequencial se refere à administração inteira de um dos ingredientes ativos antes da administração do outro ou outros implementos. É assim possível administrar um dos ingredientes ativos em diversos minutos, horas, ou dias antes da administração dos outros ingredientes ativos ou ingredientes. Não há nenhum tratamento simultâneo neste caso.

[0076] Como aqui usado, os termos “valor p” ou “p” se referem uma medida de probabilidade que uma diferença entre grupos aconteceu ao acaso. Por exemplo, uma diferença entre dois grupos tendo um valor p de 0,01 (ou p = 0,01) significa que existe uma chance de 1 em 100 o resultado ocorresse ao acaso. Em modalidades ilustrativas, os valores p adequados incluem, mas não são limitados a, 0,1, 0,05, 0,025, 0,02, 0,01,0,005, 0,001, e 0,0001. Em modalidades adequadas, e por todos os Exemplos aqui fornecidos, as letras de significância estão em P = 0,10 com a interface R studio.

Vista Geral e Descrição Geral

[0077] A presente invenção se refere, inter alia, à descoberta e desenvolvimento de um sistema biológico de promoção do crescimento de planta pela aplicação de uma cepa altamente eficaz de T viride. Em modalidades ilustrativas, “promoção do crescimento” inclui, mas não é limitado a, controle de doença de planta, controle de inseto, alívio de estresses abióticos, absorção de nutriente melhorada e/ou eficiência fotossintética melhorada. Não obstante, esta cepa supera as melhores cepas correntes de Trichoderma usadas para este propósito comercialmente disponíveis. A mesma pode ser usada em agricultura convencional ou orgânica para a promoção do crescimento de planta e aumento nos rendimentos de safra quando aplicada topicamente como uma pulverização foliar ou como um revestimento de semente. A mesma consiste de uma cepa biologicamente ativa de Trichoderma viride.

[0078] Os produtos altamente ativos também aumentam a produtividade da planta e melhoram a qualidade de frutas, vegetais, flores ou outros produtos vegetais. Os agentes microbianos aplicados como tratamentos de semente ou outros métodos de aplicação foram mostrados aumentar o crescimento e desenvolvimento de planta. Em algumas modalidades, os mais eficazes destes organismos colonizam as raízes da planta internamente e induzem mudanças benéficas na expressão de gene e que, portanto, dão origem às mudanças na fisiologia da planta. Estas alternações na fisiologia da planta incluem a supra-regulagem coordenada de caminhos bioquímicos inteiros nas plantas. Estas mudanças compreendem: promoção do crescimento e rendimento de planta confiável e consistente; crescimento de raiz realçada e desenvolvimento resultante em sistemas radiculares maiores e mais profundos; resistência melhorada a tais estresses abióticos incluindo muito pouca ou muita água, sal e contaminação do solo; eficiência do uso de fertilizante aumentada e especialmente eficiência do uso do fertilizante nitrogênio; e níveis antioxidantes realçados na produção.

[0079] Todos os efeitos mencionados acima requerem energia, e podem apenas ocorrer se a fotossíntese for realçada. Estes agentes microbianos eficientemente melhoram a fotossíntese. Os microorganismos benéficos com as capacidades descritas acima, em algumas modalidades, têm sido e são usados comercialmente. O produto anterior pode requerer misturas de um fungo no gênero Trichoderma e uma bactéria no gênero Bacillus, por exemplo, vendido como QuickRoots®. Uma versão mais recente de Quick Roots em testes ABM aumentou os rendimentos, mas o seu desempenho foi relativamente inconsistente (dados empíricos ABM). Este produto aumentou rendimentos, mas em numerosos testes reproduzidos o mesmo foi relativamente inconsistente (Advanced Biological Marketing dados empíricos não publicados). Uma melhora na consistência do desempenho foi desenvolvida pela Advanced Biological Marketing onde as cepas de Trichoderma spp. puderam ser combinadas (misturas de cepas específicas diferentes estão presentes nos produtos vendidos para safras diferentes), e foram vendidas sob a marca SabrEx®. Estes produtos fornecem a vantagem há pouco enumerada acima, em algumas modalidades, e fornecem melhoras de rendimento consistentes de cerca de 8,5 bushels (0,035 m3) de milho por acre. Em algumas modalidades, outras safras fornecem resultados comparáveis e incluem feijões soja, arroz, algodão, vegetais, alfafa e outros legumes forrageiros, e grãos pequenos incluindo o trigo.

[0080] A presente invenção, além disso, diz respeito à cepa Trichoderma virens ou Trichoderrna gamsii NRRL. B-50520, que foi isolada de um composto de esterco de galinha. A mesma, junto com dois outros fungos, foi selecionada quanto às suas capacidades de produzir amônia e aminoácidos a partir de penas de aves por causa dos seus altos níveis de atividade de proteinase em certas modalidades. A amônia e aminoácidos fornecem nitrogênio às plantas, enquanto as penas por si só são decompostas muito lentamente e não fornecem nutrientes imediatos para o crescimento de planta. Em outras modalidades da invenção reivindicada, a cepa 50520 é explorada para liberar nutrientes para o crescimento de planta.

[0081] Na presente invenção, nós descrevemos o uso desta cepa como agente promotor do crescimento de planta em modalidades adequadas. A mesma fornece vantagens de crescimento de planta superior quando comparada com a técnica anterior, incluindo SabrEx, que é provavelmente o produto mais eficaz comercialmente disponível para a promoção do crescimento de planta. Os presentes inventores descobriram que, o modo primário de ação da invenção reivindicada é via tratamento de semente, com outras aplicações e modalidades demonstrando eficácia com respeito às aplicações foliares nas várias fontes de planta, tais como, por exemplo, trigo. Visto que a mesma é eficaz como um tratamento de semente e como um foliar, existem várias outras modalidades e aplicações que são eficazes, tais como, por exemplo, incluindo: aplicações como uma aplicação de grânulo no rego do arado como um ensopamento do solo onde o organismo entrará em contato com as raízes e colonizará as raízes; aplicação como um tratamento de raiz, por exemplo, durante as operações de transplante; e como um componente de fertilizantes líquidos ou sólidos. Em muitas modalidades, o organismo entra em contato com as raízes e estabelece uma relação benéfica com a planta levando à promoção do crescimento de planta.

[0082] Igualmente, a presente invenção também é altamente eficaz no controle de vários organismos nocivos incluindo bactérias, fungos e nematóides patogênicos de planta. Os nematóides contêm proteínas estruturais (colágenos) na superfície externa e em ovos. Em outro trabalho, as cepas de Trichoderma com altos níveis de enzimas eficazes que degradam proteínas tais como queratina (nas penas) ou colágeno são eficazes no controle de nematóides parasíticos de planta (Sharon, Bar-Eyal et al. 2001), inclui ovos e as próprias larvas. Assim, a presente invenção inclui reivindicações para o controle tanto de nematóide quanto de microorganismos patogênicos de planta.

[0083] Os microorganismos benéficos com as capacidades descritas acima são usados comercialmente. Um tal produto é uma mistura de um fungo no gênero Trichoderma e uma bactéria no gênero Bacillus, e é vendido como QuickRoots® pela Novozymes. Este produto aumenta rendimentos, mas em numerosos testes reproduzidos o mesmo foi relativamente inconsistente (Advanced Biological Marketing dados não publicados). As cepas de Trichoderma spp. aqui descritas e anteriormente identificadas pela ABM envolvem misturas de cepas específicas combinadas, isto é, diferentes que estão presentes em tais formulações para safras diferentes, composições para vários usos. Estes produtos dão as vantagens há pouco enumeradas acima, e fornecem melhoras de rendimento consistentes de cerca de 8,5 bushels (0,035 m3) de milho por acre. Outras safras dão resultados comparáveis e incluem feijões soja, arroz, algodão, vegetais, alfafa e outros legumes forrageiros, e grãos pequenos incluindo trigo.

[0084] De acordo com o precedente, a presente divulgação descreve uma cepa de Trichoderma gamsii (NRRL B-50520) que tem capacidades múltiplas para vários usos na agricultura e desenvolvimento de planta de sistemas para o seu uso. A presente divulgação, em modalidades ilustrativas, compara as suas capacidades para realçar a agricultura de planta para várias aplicações com vários outros agentes microbianos e que estão contidos dentro de formulações úteis. Embora outras cepas ou misturas tenham capacidades para conferir um traço ou um outro, as cepas e composições da presente divulgação são de modo único versáteis em capacidades funcionais. Em algumas modalidades, as composições da presente invenção podem ser usadas na agricultura convencional ou orgânica para a promoção do crescimento de planta e aumento nos rendimentos de safra quando aplicados topicamente como uma pulverização foliar ou como um revestimento de semente. Os produtos altamente ativos também possuem a capacidade para aumentar a produtividade da planta e melhorar a qualidade das frutas, vegetais, flores ou outros produtos de planta. A multifuncionalidade das cepas e composições da presente divulgação, por exemplo, Trichoderma gamsii (NRRL B-50520), são demonstradas por um alto nível de atividade em todos os casos mencionados abaixo em relação às outras cepas, e com respeito à aplicação como um tratamento de semente para aumentar: (i) o crescimento e rendimento de planta, (ii) o desenvolvimento da raiz da planta, (iii) a resistência ao estresse abiótico tal como seca, sal e alagamento, (iv) a eficiência fotossintética, especialmente sob condições de estresse.

[0085] Igualmente, os benefícios também incluem pontos finais tais como: (v) resultante em uma redução de doença foliar, (vi) controle de nematóides, com tem capacidades particulares para inibir a reprodução (deposição de ovo), prevenindo assim o desenvolvimento adicional da praga. Esta capacidade ocorreu não apenas onde o organismo foi aplicado, mas também na divisão de raízes onde nematóides, mas não o organismo de biocontrole, foi aplicado, (vii) e, quando aplicado como um tratamento de semente, o mesmo induz mudanças sistêmicas na expressão de gene vegetal e resulta em efeitos de longo período. Além disso, as composições e cepas da presente divulgação, (viii) permanecem localizadas no sistema radicular e não proliferam ou se espalham para as partes acima do solo de plantas, incluindo sementes usadas como alimento para seres humanos ou animais, enquanto concomitantemente, (ix) protege as sementes plantadas de patógenos transmitidos pelo solo tais como Fusarium. Pythiurn e Rhizoctonia solani. Como um organismo apropriadamente formulado topicamente aplicado às folhas de plantas, as composições e cepas da presente divulgação, (x) populações de controle de pragas de insetos (moscas brancas e afídios).

[0086] Como tal, a presente invenção se refere, em parte, ao Trichoderma gamsii NRRL B50520 (que foi antigamente classificado como T viride). Ver a Patente U.S. No. 9.249.061, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade. A cepa 50520 foi isolada de um composto de esterco de galinha. O mesmo, junto com dois outros fungos, foram selecionados quanto às suas capacidades para produzir amônia e aminoácidos a partir de penas de aves por causa dos seus altos níveis de atividade de proteinase. A amônia e aminoácidos fornecem nitrogênio às plantas, enquanto as penas por si só são decompostas muito lentamente e não fornecem nutrientes imediatos para o crescimento de planta.

[0087] Em um aspecto, a presente invenção se refere às composições e métodos para utilizar as cepas e composições aqui divulgadas, por exemplo, Trichoderma gamsii NRRL B50520, como agentes promotores do crescimento de planta. Em algumas modalidades, as cepas e composições aqui divulgadas, por exemplo, Trichoderma gamsii NRRL B-50520, fornecem vantagens de crescimento de planta aos produtos comerciais correntemente disponíveis. O uso primário da cepa e composições aqui divulgadas, por exemplo, Trichoderma gamsii NRRL B-50520, é via tratamento de semente, mas também é eficaz como uma aplicação foliar sobre o trigo e outras safras. Visto que a mesma é eficaz como um tratamento de semente e como um foliar, várias outras aplicações provêem eficácia incluindo também (i) como um grânulo no rego do arado, (ii) como um enxarcamento de solo onde o organismo entrará em contato com as raízes e colonizará as raízes, (iii) como um tratamento de raiz, por exemplo, durante operações de transplante, e (iv) como um componente de fertilizantes líquidos ou sólidos.

[0088] Em todas as modalidades e aplicações precedentes, o organismo, cepa e/ou composições da presente divulgação entram em contato com as raízes e estabelecem uma relação benéfica com a planta levando à promoção do crescimento de planta. Consequentemente, nestas modalidades, o organismo, cepa e/ou composições da presente divulgação são tipicamente aplicados ao sistema de plantas em formulações apropriadas, como ainda detalhado aqui.

[0089] As misturas contêm ingredientes que são elegíveis para a lista orgânica. Ingredientes que são seguros e não tóxicos, em alguns casos disponíveis para venda em alimentos habitualmente consumidos. Isto permitirá registros com reentradas muito curtas e intervalos de colheita depois da aplicação se o ingrediente ativo também tem características apropriadas. Está presente em uma emulsão que seja estável tanto na forma concentrada quanto em diluições usadas para aplicações no campo. Pode ser usada como uma mistura que atua como um desfoliante ou para a morte direta de ervas daninhas.

[0090] O fertilizante orgânico descrito no Pedido de Patente U.S. Número Serial 14/360.520, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade, descreve certos aspectos de K5 e pode prover um bloco de construção para o desenvolvimento contínuo de Ômega, Ômega com resistência induzindo fungos e metabólitos de planta, K5, e para o controle de praga que pode formar a base para EPA e outros registros de agência para praguicidas.

EXEMPLOS

[0091] A presente invenção é ilustrada ainda pelos seguintes exemplos, que não devem ser de nenhum modo interpretados como limitantes.

Exemplo 1 — Classificação e Singularidade da Cepa

[0092] A identificação de espécie da cepa de Trichoderma K5 (cepa B-50520) foi anteriormente determinada pelo Dr. Stephen Peterson (USDA, comunicação pessoal). Entretanto, esta espécie raramente ocorre e muitas cepas que foram originalmente classificadas como T viride foram, entretanto, reclassificadas como T gamsii (Jaklitsch et al 2006, Samuels 1996). É alegação da ABM que K5 também deva ser reclassificada como T gumsii. Para sustentar esta reivindicação nós sequenciamos o genoma de k5 inteiro usando tecnologias de Sequenciamento de Nova Geração (Illumina) e pesquisamos estes dados quanto à espécie dos genes indicadores reconhecidos pelo International Subcommittee on Trichoderma and Hypocrea Taxonomy (15TH) (Tabela 1). As sequências tanto de T. viride quanto de T. gamsii foram testadas usando o algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, NICBI, Altschul et al 1990) junto com várias sequências de espécie de controle (atroviride. aureoviride, e clirinoviride) (Tabela 2). Como mostrado na Tabela 2. Nem todas as sequências testadas contra o genoma de K5 foram encontradas; entretanto todas as sequências de T gamsii testadas foram presentes.

[0093] A Figura 1 mostra a frequência e qualidade dos resultados de BLAST de topo. É notável que todas as sequências de T. gamsii testadas retornaram acertos de uma pesquisa do genoma K5 além do fato de que a vasta maioria destes acertos foram de alta identidade de sequência. Existe uma diferenciação clara entre a capacidade das sequências de T. gamsii para alinhar ao K5 versus qualquer outra das sequências testadas. Quando juntos, estes dados sustentam a asserção da ABM de que a cepa K5 (NRRL cepa B-50520) é T gamsii e não T viride, como anteriormente indicado.

[0094] Tabela 1 Genes identificadores usados para pesquisar o genoma K5 quanto a designação informada pelos dados de espécie.

[0095] Tabela 2 Número de sequências de gene usadas para pesquisar o genoma K5 organizado por espécie. O número total de sequências testadas versus o número que foi de fato encontrado é mostrado. Estes números não fornecem nenhuma informação sobre a qualidade do acerto (identidade de sequência).

[0096] Estes dados claramente demonstram que há uma alta similaridade com as sequências genéticas de T. gamsii, mas que as similaridades com T viride são muito menores. Assim, a conclusão é que NRRL B50520 é corretamente classificada como T gamsii. Métodos mais antigos de avaliações taxonômicas foram incapazes de fazer estas distinções e, como indicado mais no princípio é agora impossível esboçar qualquer conclusão como para identidades de espécie no pedido de Sensibaugh. Portanto, estes dados corroboram a conclusão de que a menção de T. viride no pedido de Sensibaugh é impossível se referir à espécie ou cepas de Trichoderma.

Exemplo 2 — Cepa K5 de Trichoderma Aumenta o Crescimento em Milho, Trigo e Feijões Soja na Estufa

[0097] Testes de milho na estufa, os testes de estufa mostraram que as sementes de milho tratadas com T. virens NRRL 50520 resultaram em plantas com crescimento e melhorados. A FIG. 2 mostra plantas de milho cultivadas a partir de sementes tratadas com K5. As diferenças de crescimento são claramente evidentes.

[0098] A cepa de Trichoderma KS aumenta o crescimento em estufa do trigo quando aplicada como um tratamento foliar. Como mostrado na FIG. 3, os resultados destes tratamentos com a amostra K5 (à esquerda) sendo claramente maior e mais vigorosa que o controle (as mudas de trigo foram plantadas em recipientes bem drenados na estufa e tratadas com uma pulverização foliar a seguir da emergência). As plantas de controle foram pulverizadas apenas com água. A FIG. 3, além disso, mostra os resultados destes tratamentos com a amostra K5 (à esquerda) sendo claramente maior e mais vigorosa que o controle (à direita).

[0099] A cepa de Trichoderma K5 aumenta o crescimento em feijão de soja na estufa quando aplicada como um tratamento de semente. Sementes de feijão de soja foram tratadas com T. virens cepa NRRL B-5025 ou deixadas não tratadas sem nenhum outro tratamento microbiano ou químico sendo aplicado. Estas foram plantadas em tubos de areia e os dados de cultivo foram coletados conforme as sementes emergiram e as mudas cresceram. O tratamento com Trichoderma foi descoberto aumentar significantemente o crescimento da muda de feijão de soja nestes experimentos como demonstrado na FIG. 4 mostrando o comprimento da haste, leituras do medidor Spad, peso da raiz, e volume da raiz. Todas as diferenças mostradas na FIG. 4 são significantes em alfa = 0,05 ou 0,01,

[0100] Os dados neste pedido de patente claramente demonstram que T. viride cepa NRRL B50250 realça o crescimento e produtividade tanto de monocotilédones quanto de dicotilédones, como demonstrado pelos testes no milho, feijão de soja e trigo. Nos feijões de soja na estufa, as hastes foram significantemente maiores do que com as plantas de controle e as folhas tiveram teor de clorofila realçado como evidenciado pelas leituras do medidor SPAD (SPAD é produto da Minolta Corporation e mede o verdor das folhas, que é uma medida direta do teor de clorofila). Os dados claramente mostram que esta cepa consideravelmente realça a produtividade da planta mais do que as melhores cepas que são comercialmente disponíveis.

Exemplo 3 — Realce do Crescimento, Rendimento e Resistência ao Estresse do Milho no Campo

[0101] Testes de Campo (ABM14 ou 1o Teste de Campo). Rendimento, biomassa, e outros caracteres medidos durante o primeiro teste de campo (ABM14) e segundo teste de campo (ABM15) deste exemplo, as estações de cultivo foram analisadas usando a análise estatística como descrito nas Tabelas 3 e 5. Os testes de ANOVA e Diferença Significante Mínima (alfa = 0,1) foram realizadas em todos os subconjuntos usando os métodos descritos nas Tabelas.

[0102] Um experimento de campo foi estabelecido no milho (Zea mays) próximo a Phelps, NY (Baar Scientific, LLC) para os testes ABM 14. As sementes de um híbrido comercial transgênico, resistente ao glifosato, A91-92R foram obtidos da Albert Lea Seeds, Albert Lea, MN. As sementes foram comercialmente tratadas com Acceleron®, uma mistura de pesticida contendo ipconazoI, metalaxil, trifloxistrobin (fungicidas) e clotianidin (inseticida). As sementes foram supertratadas com uma mistura em formulação líquida de K2 e K4, que é o produto comercial SabrEx LQ, de acordo com as instruções do fabricante. Outras sementes foram tratadas com uma mistura comercial de um produto de ácido húmico e nutrientes menores, daqui em diante designados MJ, juntos com K2, K5 + As2, ou K2 + As2. As cepas fúngicas usadas foram uma suspensão líquida de conídia a 8 x 108 cfu/ml, e a concentração de As2 foi de 8 x 109 cfu/ml. As suspensões microbianas foram usadas para tratar sementes na taxa de 0,9 ml/kg de semente para cada organismo. Este é a mesma taxa de tratamento de semente com Trichoderma como é recomendada com o produto SabrEx. Os experimentos preliminares têm demonstrado que todos os organismos usados no supertratamento são estáveis na presença dos pesticidas químicos (dados não mostrados).

[0103] As plotagens foram estabelecidas em um solo arenoso-argiloso com potencial de rendimento moderado. Estes testes foram conduzidos em um planejamento de bloco duplicado com quatro réplicas. Cada tratamento + réplica consistiu de quatro fileiras separadas 76 cm e 6 m de comprimento plantadas em uma orientação morte-sul. As sementes foram plantadas em 17 de junho a seguir de uma primavera fria úmida, a colheita da silagem foi em 15 de setembro e a colheita dos grãos em ou em torno de 20 de novembro. A primeira geada devastadora foi na última semana de outubro. As ervas daninhas foram controladas com herbicida glifosato seguindo as recomendações do fabricante. A fertilização no momento do plantio foi com 46 kg reais de N/Ha em uma formulação 19:19:19. Isto foi seguido com uma adubagem lateral de 96 kg em meados de julho como uma aplicação superficial por dispersão. Toda a colheita para rendimento foi das duas fileiras intermediárias de cada réplica de tratamento. Para o rendimento de grão, os 4,6 m intermediários das fileiras foram colhidos e para silagem os 2,3 m setentrionais foram colhidos. Para as medições de raiz e outras amostragens destrutivas, as plantas foram escavadas ou de outro modo colhidas das fileiras externas longe das áreas que seriam colhidas para rendimento. As densidades de planta não foram significantemente diferentes entre os tratamentos e foi de cerca de 63.000 plantas por Ha.

[0104] A altura da planta foi medida duas vezes durante a estação: exatamente antes de pendoar e na colheita. Os pesos da silagem e grão (rendimento) foram coletados depois da colheita, e a % de nitrogênio e carbono foi ensaiada por serviço comercial (A&L Laboratories ou the Cornell Nutriente Analysis Laboratory).

[0105] Os testes de campo foram conduzidos mais uma vez (ABM15) para computar qualquer rendimento de grão que fosse limitado nos testes ABM14 pelos limites de desempenho da variedade usada dos testes anteriores mencionados acima. Isto é, aumentos na fotossíntese aparentemente foram convertidos para a biomassa vegetativa mais eficientemente do que para o rendimento de grão (Tabela 3). Portanto, no segundo dos testes de campo cinco variedades de milho foram testadas como descrito pelo fornecedor como determinado pelos tipos de espiga (2 variedades), semi-Flex (2 variedades), e full flex (1 variedade). Estas foram providas pela Chemgro Company e são designadas como 5469 RSX, 5018 G3 (determinado): 5245 RDP, 5455 RDP (semi-flex) e 6490 (full flex). Todas as sementes usadas nos experimentos foram tratadas com uma mistura de inseticida/fungicida (Cruiser Maxx 250, Syngenta Safra Protection) que contém tiametoxam, fludioxonil, mefenoxam, azoxistrobin e tiabendazol.

[0106] Antes do plantio, as subamostras de cada variedade foram tratadas com SabrEx LQ de acordo com as instruções do fabricante. Outras subamostras foram tratadas com K2 + K4 + As2, K5 + As2, ou K2 + As2 em combinação com uma mistura que nós designamos Ômega, contendo 20 g de humato (xisto Leondarite), 5 g de extrato de levedura, e 100 μl de 1-octen-3-ol (Sigma Chemical Co.) em 1 L de água, e ajustados ao pH 6,2. Ômega® também foi usado sozinho como um tratamento separado sem nenhum agente microbiano. Esta mistura foi aplicada na taxa de 0,65 ml/kg de sementes e foi desenvolvido para prover uma substituição quimicamente definida para o material de humato usado no primeiro dos testes. Uma concentração baixa de 1-octen-3-ol (álcool de cogumelo), que é um metabólito volátil das cepas Trichoderma, foi incluída porque a mesma induz resistência às doenças de planta como também foi relatado por outros (Morath, Hung, et al., 2012) e nós observamos que o mesmo é um indutor potente de crescimento de planta realçado em concentrações muito baixas.

[0107] Este teste foi localizado em um solo argiloso próximo a Waterloo, NY. Os canteiros foram dispostos por variedade através do campo como duas fileiras de 22,5 m de comprimento. Cada tratamento x variedade foi colhido para silagem e grão. Para esta colheita, cada conjunto de fileiras foi dividido em quatro blocos cada um de 1,8 m de comprimento para colheita de silagem intercalados com quatro blocos de 3,6 m de comprimento cada para colheita de grão. Os canteiros receberam 227.000 L de esterco fresco incorporado antes do plantio que resultou na aplicação de cerca de 155 Kg de N/acre e mais 150 K de N foram aplicados como uma molhadura lateral em suspensão líquida contendo 32% de N a cerca de V4.

[0108] Além disso, a área dos canteiros recebeu chuva intensiva de mais do que 20 cm durante um período de três semanas exatamente depois da emergência (a última semana de maio até as primeiras duas semanas de junho). Os canteiros foram planejados tal que durante este período de 3 semanas inteiro uma porção do campo foi saturado ou, durante uma parte substancial de tempo, completamente submergido. Esta área do campo coincidiu quase exatamente com aquela plantada com 5245 RDP, e foi de modo relativa uniformemente alagada. Assim, os testes com esta variedade proporcionaram uma boa oportunidade para examinar a capacidade dos tratamentos de semente para auxiliar o milho na recuperação do estresse pelo alagamento. O resto das variedades foram em terras mais altas e assim não foram submetidas a este estresse. A colheita e análises de dados foram como descrito para os canteiros para ABM14.

[0109] Observações Microscópicas. Dentro de 48 horas, os fungos cresceram como hifas sobre as superfícies das radículas e dentro de 72 horas cobriu amplamente a superfície das radículas e produziram fiálides e conídias (FIG. 5). As observações mostradas são com a cepa K2, mas todos os fungos usados neste estudo tiveram germinação rápida similar de esporos, crescimento de hifas na superfície do radículo e proliferação rápida e conclusão do ciclo de vida.

[0110] Observações de Campo. Em Illinois em 2012 houve uma seca severa, com perda de safra generalizada. Na época, algumas sementes de milho foram tratadas com SabrEx® (cepas K2 e K4). Diferenças na susceptibilidade à seca foram óbvias na safra madura, embora as plantas tivessem mais de 2 metros de altura e as sementes tivessem sido tratadas vários meses antes da seca tornar-se aguda. Estas diferenças foram observadas como sobrevivência da planta, no crescimento da espiga, e enchimento de grão. Especialmente proeminente foi o grau de escurecimento e morte de folha aparente entre os tratamentos (FIG. 6). Nos testes conduzidos para ABM15, entretanto, houve diferenças pronunciadas no tamanho da planta tanto dos brotos quanto das raízes (FIG. 7). Diferenças no tamanho visíveis similares foram observadas nos testes de campo ABM14 (dados não mostrados).

[0111] Experimentos de Campo ABM14. Em Large diferenças na altura da planta foram medidas entre tratamentos na estação intermediária. Entretanto, estas diferenças desapareceram na colheita (Tabela 3). A altura na planta do milho moderna é um caractere determinante e na colheita as alturas das plantas foram similares. Entretanto, os tratamentos de semente resultaram em plantas mais robustas, como medido pelo diâmetro da haste, e altura da planta, (Tabela 3)( FIG. 7). As raízes também foram muito maiores e mais robustas quando as cepas mais eficazes foram usadas como tratamentos de semente. Este aumento na robustez da planta acima do solo resultou em um aumento de mais do que 10 t/ha na biomassa total (silagem) no momento da colheita (exatamente depois da segunda medição da altura da planta), ou exatamente um pouco mais do que um aumento de 30% na biomassa da planta (silagem). Entretanto, o aumento no rendimento de grão foi um tanto mais baixo do que o aumento no rendimento da silagem, cerca de 24% (Tabela 3).

[0112] Os tratamentos mais eficazes foram a cepa K5 + As2 com MJ, K5 com MJ, e K2 + MJ. Estas deram melhorias no rendimento acima do produto comercial SabrEx (K2 + K4). Estas formulações de tratamento de semente também resultaram em uma redução na murchidão da folha do milho setentrional (agente causal Exserohilum turcicum), mas a ferrugem do milho (Pueeinia sorghi) aumentou nas plantas cultivadas a partir das sementes tratadas. Com base nos resultados com tomate (dados/materiais apoiadores, (Mastouri, Bjorkman, et al., 2012)) nós esperávamos que houvesse um aumento líquido na fotossíntese nos testes do milho. Nós portanto medimos o teor de C total da biomassa que foi colhida. Nós também esperávamos um aumento no nitrogênio incorporado e assim medimos o N total na biomassa.

[0113] Resultados de Campo para ABM15. Os resultados de ABM14 sugeriram que mesmo se o milho fosse mais robusto, nem todos destes é traduzido em rendimento de grão. Assim, haveria um componente genético para o rendimento de grão que não leva vantagem completa full do crescimento e desenvolvimento de planta aumentados. As variedades de milho comerciais diferem em caractere de espiga; alguns são determinantes, o que significa que uma única espiga de um certo tamanho será produzida por haste independente da quantidade de fotossíntese que estiver disponível para a planta, outros são semi-flex, que permite algum aumento no tamanho das espigas dependendo dos recursos da planta, enquanto outros ainda são full flex, que permite a plasticidade no tamanho das espigas, com espigas maiores dependendo dos recursos de fotossíntese. Portanto, para os testes de campo ABM15, nos testes conduzidos nos cinco híbridos de milho comerciais diferentes que diferiram neste caractere (Tabela 5). Os tratamentos também aumentaram a absorção de N total tanto no ABM14 quanto no ABM15; com aumentos de 80 a 170 kg/h dependendo da variedade e ano.

[0114] Durante o período úmido do início da estação até meados de junho todos os tratamentos com a variedade 5245 foram em condições alagadas e cresceram até alturas de planta de menos do que 30 cm. Depois deste ponto na estação, as condições de desenvolvimento melhoraram acentuadamente, e as plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com os agentes biológicos pareceram ser muito mais robustas e recuperaram do episódio de alagamento mais completamente do que aqueles sem os produtos biológicos. Houve um aumento substancial no crescimento no final de julho com plantas tratadas com os agentes microbianos e um aumento grande na biomassa (FIG. 7) que também traduz para rendimento de grão (Tabela 5). Os tratamentos de semente globais dão resultados diferentes através das variedades. No geral, o tratamento SabrEx deu a maior resposta em biomassa, mas o maior aumento do rendimento de grão foi com K5As2 (Tabela 5). Os tratamentos também aumentaram a absorção de N total tanto em ABM14 quanto ABM15; com aumentos de 80 a 170 kg/h dependendo em variedade e ano.

[0115] Bem distante da interação de estresse ao alagamento, houve uma diferença substancial no crescimento e desenvolvimento das diferentes variedades na reação aos tratamentos de semente biológica. Uma variedade, 6490, respondeu com um aumento muito grande na biomassa (87,5 %). Outras linhas responderam com menos aumentos; no geral, as linhagens desenvolvidas para grão como oposto aos propósitos duais deram menos aumentos, e não significantes, na biomassa de planta mas em ambos os tipos de planta, o rendimento de grãos foram similarmente aumentado (Tabela 5).

[0116] Debate e Cepas Microbianas e os Benefícios Conferidos. Em nossa experiência a eficácia e capacidades de agentes microbianos para a agricultura de planta é específico de cepa. Nós fomos incapazes de generalizar com respeito aos benefícios em qualquer um dos critérios de nível das espécies — exatamente porque uma cepa de T harzianurn, por exemplo, é eficaz para uma função particular não é indicador de que uma outra cepa da mesma espécie será. Neste trabalho, nós testamos e avaliamos a função de duas cepas de T harzianum (K2, K3), uma cepa de T. atroviride (K4), uma cepa de T. gamsii (K5), e uma cepa de Bacillus amiloliquifaciens, isoladamente ou em combinação. K2, K3 e K4, junto com a cepa K1 de T. virens, são todos componentes de produtos comerciais que estão em ampla escala de uso em uma safra ou uma outra enquanto uma cepa mais recente, a T22, é ampla e bem sucedidamente usada, especialmente em horticultura e aplicações de estufa (Harman, 2000)(www.bioworksinc.com). Entretanto, como um tratamento de semente no milho, o seu desempenho foi descoberto ser inconsistente (Harman, 2006, Harman, Bjorkman, et al., 2008). Por esta razão, K2, K3, e K4 foram desenvolvidos e amplamente testados e usados no campo. Além disso, para aplicações comerciais, as misturas de cepas (por exemplo, K2 + K4 são ABM’s SabrExLQ® para o milho) foram produzidos para o uso com safras diferentes, enquanto K2 e K3 foram usados para os tratamentos de semente de trigo (SabrExLQ® para o trigo). Ao contrário, K1 é usado para tratamentos de feijão de soja em combinação com cepas de Bradyrhizobium (por exemplo, Excalibre®) mas o teste de campo de K1 indica que esta cepa tem impacto negativo sobre o milho. A seleção destas misturas é amplamente empírica mas é essencial para uso bem sucedido destes e organismos similares em agricultura comercial.

[0117] Para os presentes exemplos, examinações usando microscopia confocal demonstraram que as cepas têm uma capacidade acentuável para proliferar rapidamente como tratamentos de semente para as raízes de mudas do milho em desenvolvimento. É importante observar que este crescimento rápido nas sementes, que deve utilizar recursos da planta para crescer, ocorre sem qualquer um dos sintomas visíveis ou inibição do crescimento da muda. De fato, como demonstrado usando sementes de outras espécies de planta, o desenvolvimento da muda mesmo em estágios iniciais usualmente é realçado (Harman, Howell, et al., 2004, Lindsey e Baker, 1967). Assim, o crescimento de planta realçando as capacidades destas cepas selecionadas devem depender do estabelecimento inicial das relações simbióticas de fungo-planta muito rapidamente na germinação de semente (Mastouri, Bjorkman, et al., 2010). Certos metabólitos dos fungos imitam este efeito rápido no crescimento de planta, incluindo 1-octen-3-ol como aqui indicado. Esta capacidade rápida para colonizar radículas que emergem do milho, que é concorrente com a expressão de melhorias nas qualidades de semente e cultivo (Mastouri. Bjorkman, et al., 2010) pode ser um componente destas capacidades para melhorar o crescimento de milho e tem afetado a sua seleção empírica como um melhorador confiável de desempenho de mudas.

[0118] Algumas cepas de Trichoderma claramente evoluíram com as plantas e podem ser caracterizadas como simbiontas de planta endofítica (Harman, Howell, et al., 2004), mas a maior parte das cepas selvagens carecem desta capacidade. É digno observar que os números totais de Trichoderma nos solos de campo típicos são até 10.000 vezes ou mais alto do que os níveis adicionados com os tratamentos de semente neste documento, mas estas cepas nativas estão sem efeitos observáveis no crescimento de planta. Assim, embora a maioria das cepas que habitam o solo tenham pouco efeito sobre o desempenho da planta, a adição de cepas simbióticas específicas de planta endofítica pode fazer uma grande diferença. As cepas de Trichoderma não são o único dos organismos que incluem cepas que têm capacidades qualitativamente similares para realçar o desempenho de planta. Os fungos no Sebicales, tais como Piriformaspora indica, mycorrhizae e rhizobactérias que promovem o crescimento de planta todos incluem pelo menos algumas cepas que podem ser consideradas como simbiontes de planta endofítica e todas podem aumentar o crescimento de planta e induzir outras mudanças dentro da planta que contribuem para o desempenho da planta, tal como resistência às doenças, resistência aos estresses abióticos de planta, e eficiência melhorado de uso do nitrogênio (Shoresh, Mastouri, et al., 2010). Elas também frequentemente são confinadas às raízes mas induzem mudanças sistêmicas na expressão de gene vegetal, que implica na produção de compostos deflagradores. Entretanto, é altamente improvável que estes grupos geneticamente muito diversos de microorganismos expressem as mesmas moléculas deflagradoras. Por esta razão, mesmo se seus efeitos qualitativos forem similares, seus mecanismos específicos são prováveis de diferir. Como um exemplo, as cepas tanto de Bacillus spp. quanto de Trichoderma produzem metabólitos anfifílicos que são ativos em concentrações muito baixas (menores do que 1 μmol), mas elas são quimicamente dissimilares. Em Bacillus estas incluem lipopeptídeos e produção do lipopeptídeo específico, surfactina, tem sido implicado na indução de resistência à doença sistêmica de planta em plantas (Cawoy, Mariutto, et al., 2014), Em Trichoderma, proteínas hidrofóbicas provavelmente têm um papel similar na indução da resistência e outras respostas de planta.

[0119] Os dados aqui relatados indicam que nós fomos bem sucedidos no desenvolvimento de combinações e formulações de cepas eficazes. Os testes de estufa no tomate demonstrou a eficácia de cada cepa individual nos parâmetros que levam à eficiência fotossintética e verdor de folha melhoradas especialmente na presença de água ou estresse salino (dados/materiais apoiadores). Em pesquisas anteriores, nós demonstramos que a presença da cepa T22 resultou na superexpressão de uma variedade de genes e produtos de gene envolvidos na ciclagem antioxidante ou degradação direta de ROS (Mastouri, Bjorkman. et al., 2010. Mastouri, Bjorkman. et al., 2012).

[0120] Desempenho de Planta Realçado. Nos estudos tanto de ABM14 quanto de ABM15, o maior rendimento de grãos foi com tratamentos contendo K5 ou K5 + As2, mas em ABM15 os rendimentos de silagem foram maiores com SabrEx do que com as combinações de K5. O crescimento e rendimentos de planta foram acompanhados também pelos aumentos acentuados no desenvolvimento de raiz. A combinação de K2 + K4 + As2 foi geralmente menos eficaz do que as outras combinações, embora as mesmas cepas estivessem presentes nesta mistura. Estas combinações podem ser um detrimento para o desempenho, embora cada uma das cepas desempenhe bem individualmente ou como componentes de misturas similares. É possível que elas compitam através da sinalização competitiva ou outros caminhos. Em ABM15 houve diferenças nos tipos de milho usados. Para o rendimento de grão aumentado, as melhores formulações de cepa foram todas eficazes mas para a biomassa total aumentada apenas as variedades de uso duplo deram aumentos grandes no rendimento. No melhor caso (6490) a biomassa foi quase dobrada. Isto foi acompanhado pelas diferenças visuais fortes no crescimento de planta, desenvolvimento de raiz e diâmetro de haste (Tabela 3, FIG. 7),

[0121] Mecanismos de Ação. As capacidades simbióticas em ação no estudo corrente são realizadas como a capacidade de fungos contidos na raiz para estabelecer comunicação química com a planta e para propagar este sinal sistemicamente, induzindo as mudanças amplas na planta. Estas mudanças sistêmicas resultam na expressão de gene alterada na planta (Shoresh. Gal-on, et al., 2006, Shoresh, Mastouri, et al., 2010). Centenas de genes são supra-regulados (Djonovic, Vargas, et al., 2007, Shoresh e Harman, 2008, Yedidia, Benhamou, et al., 2000) incluindo a supra-regulagem coordenada de caminhos inteiros, ao invés de realce na expressão de padrão de gene ou proteína únicos. Isto resulta em plantas que têm (a) resistência realçada à doença, (b) resistência acentuadamente realçada aos estresses abióticos tais como seca, sal, alagamento e outros, (c) raízes maiores e mais profundas, (d) capacidades aumentadas para utilizar nitrogênio e outros fertilizantes, e (e) germinação de semente realçada (Harman. Cadle-Davidson, et al., 2015, Mastouri, Bjorkman, et al. 2010, Shoresh. Mastouri, et al., 2010). Isto é mostrado diagramaticamente na FIG. 4: todos estes benefícios são intensivos em energia, e não podem ocorrer sem capacidade fotossintética melhorada da planta (Shoresh e Harman, 2008).

[0122] Os conceitos que sustentam a indução de resistência ao estresse nas plantas são únicos. As plantas sofrem de acúmulo excessivo de espécies de oxigênio reativo (ROS) como uma consequência de estresses, tais como seca, sal, temperatura (Mastouri. Bjorkmari, et al., 2010, Mastouri, Bjorkman, et al., 2012), ou alagamento, e como um subproduto da excitação excessiva de sistemas fotossintéticos. Assim, o ambiente interno das plantas frequentemente contém um equilíbrio redox desfavorável. Entre os caminhos suprarregulados pelos nossos organismos estão aqueles que minimizam o acúmulo de ROS nocivo (Mastouri. Bjorkman. et al., 2012). Nós demonstramos que na presença de nossos organismos, as plantas ganham um Ambiente de Redox Interno Otimizado (DIRE) através da ciclagem mediada por antioxidante rápida de ROS para formas reduzidas permitindo assim que as plantas por si só tamponizem contra os estresses que gerem ROS (FIG. 9). Além disso, diversas linhas de evidência (Shoresh e Harman, 2008, Vargas, Crutcher, et al., 2010) indicam que o mecanismo fotossintético total em plantas é realçado. A própria fotossíntese dá origem às ROS como um subproduto da excitação excessiva de pigmentos fotossintéticos.

[0123] Os sistemas que levam às OIRE estáveis parecem ser indutíveis se tanto estresse quanto os organismos benéficos estão presentes (Dados/materiais sustentadores). Os dados sugerem que a indução é via uma resposta de preparação como foi frequentemente descrita para resistência induzida aos patógenos (Goellner e Conrath, 2008). A preparação é indicada visto que na presença tanto de estresse quanto dos fungos benéficos, todos os parâmetros aumentaram em relação a cada estresse e na maioria dos casos acentuadamente, isto é a resposta dos organismos vegetais na ausência de estresse foi menor quando ambos os estímulos foram presentes (Dados/materiais sustentadores). Este efeito de preparação ocorre sistematicamente nas plantas, e é expresso como capacidade fotossintética melhorada (Dados/materiais sustentadores) embora os organismos. pelo menos os fungos, são restritos às raízes de modo não fotossintético.

[0124] Surpreendentemente, uma formulação contendo 1-octen-3-ol forneceu melhorias de estação longa também no crescimento e rendimento, embora o tratamento incluísse menos do que 1 μl deste metabólito/semente. Estes resultados fortemente implicam que o produto químico pode por si só induzir mudanças de duração relativamente longas na expressão de gene vegetal, talvez através dos meios epigenéticos. A capacidade destas concentrações baixas para fornecer benefícios de planta de longa duração é consistente com o modelo mostrado na Fig. 8. Vários ativadores de planta químicos de resistência à doença de planta foram mostrados induzir modificações da cromatina nos genes de defesa normalmente encontrados nos genes ativos embora os próprios genes não sejam expressos. Estas mudanças resultam em padrões de modificação de histona na cromatina para permitir que os genes sejam total e rapidamente expressos quando estímulos apropriados estão presentes (Jaskiewicz. Conrath, et al., 2011), resultando na reprogramação da expressão de gene na planta (Waller. Achatz, et al.. 2005). Se este for o caso com nossos sistemas, então o modo específico de ação para a indução de contagens de genes na presença de nossos agentes seria a modificação de histona da cromatina da planta. Isto explicaria o paradoxo aparente da presença de níveis extremamente baixos de compostos tais como 1-octen-3-ol tendo efeitos no desempenho da planta durante meses depois da aplicação. As capacidades destes níveis baixos deste metabólito são compatíveis com o conceito da ação dos agentes microbianos atuando via níveis baixos de metabólitos microbianos deflagradores.

[0125] Superação Biótica e Estresse Abiótico. Os resultados deste documento também documentam melhoras na tolerância ou resistência ao estresse biótico ou estresse abiótico. Nos experimentos ABM14, as plantas tratadas com os agentes biológicos tiveram níveis mais baixos de murchidão da folha setentrional, embora a ferrugem da folha fosse realçada. A resistência à murchidão da folha é quase seguramente devido à resistência à doença sistêmica induzida, visto que é um patógeno de folha e os agentes biológicos são confinados às raízes e/ou sementes. Níveis mais altos de N aumentam a incidência de ferrugem nas folhas (Danial e Parlevliet, 1995); o que pode sugerir que a eficiência no uso de nitrogênio realçada pode estar relacionada com a incidência da doença. Os dados dos exemplos aqui demonstram que os estresses causados pelo alagamento (Tabela 5) ou seca (FIG. 6) foram superados em testes de campo de milho. Uma ampla variedade de dados de estufa demonstra que o estresse salino e mesmo estresses de poluição do solo (Dados/materiais sustentadores) (Harman, 2011, Harman, 2011) podem ser superados pela aplicação de nossos micróbios endofíticos ou seus metabólitos como resumido na FIG. 8. Todas as tabelas para este exemplo (exemplo 3; Tabelas 3-6) podem ser encontradas no final do documento). Exemplo 4. K5 e outras cepas de Trichoderma colonizam raízes rapidamente quando aplicadas como tratamentos de semente, mas não colonizam as partes superiores das plantas.

[0126] A literatura científica passada demonstra que as cepas endofítica de Trichoderma são restritas às regiões corticais das raízes embora elas induzam respostas de planta de amplo sistema (ver também o Exemplo 3; FIG. 7). Por exemplo, Yedida et al (Yedidia, Benhamou, et al, 1999) primeiro demonstraram este fenômeno em tomate com uma cepa de T asperellum. Foi demonstrado ainda com a cepa 129522 de T. harzianum no milho que as raízes cultivadas de sementes tratadas com o organismo foram colonizadas pesadamente com o organismo a seguir do tratamento de semente, mas que as hastes não foram, e não diferente daqueles cultivados do controle não tratado (Harman. Petzoldt, et al, 2004).

[0127] O Exemplo 2 acima demonstra o crescimento rápido da cepa K2 nas raízes de sementes tratadas com o mesmo; dentro de 2 a 3 dias depois da embebeção colonização pesada ocorreu. Como parte dos mesmos experimentos, K5 também foi testado com o mesmo resultado (FIG. 10). Assim, as raízes são pesadamente colonizadas. No Exemplo 3, os tratamentos que incluíram K5 deram rendimentos e resistência ao estresse melhorados. Entretanto, em vista do mecanismo discernido descrito no Exemplo 3, FIG. 7, esta melhoria no desempenho da planta deve ocorrer na ausência de colonização da planta acima do solo. Portanto, sementes/grãos produzidos a partir de sementes tratadas com esta e outras cepas similares devem estar livres do organismo. Para testar isto, 200 sementes produzidas de cada uma das variedades e tratamentos mostrados no Exemplo 2, Tabelas foram plaqueadas sobre dextrose de batata ágar acidificada (Difco) corrigida com Igepal co630, que é um tensoativo. Este meio permite a enumeração de fungos nas sementes e outras partes da planta mas limita o crescimento bacteriano que pode confundir resultados. Outros experimentos foram feitos apenas com dextrose de batata ágar (sem acidificação), que permite a visualização tanto de fungos quanto de bactérias. Estes meios são rotineiramente usados nos labs da ABM para enumerar números de colônias de Trichoderma como parte do processo de controle de qualidade. Se presente, K5 ou qualquer uma das outras cepas fúngicas que são parte das sementes mostradas no Exemplo 3, crescem rapidamente e bem, e facilmente diagnosticado em relação a outros fungos ou bactérias pelas suas características de crescimento. Um exemplo é mostrado na FIG. 11, que mostra sementes da Chemgro variedade 5445. As sementes foram de plantas cultivadas com sementes tratadas com SabrEx depois do plaqueamento das sementes filhas durante quatro dias no meio PDA. As sementes são todas colonizadas pelos microorganismos; as colônias azuladas são putativamente identificadas como fungos no gênero Penicillium enquanto que o crescimento mucóide disseminado é provavelmente uma cepa de Bacillus. Estes são todos organismos saprofíticos que contaminaram ou colonizaram as sementes. Entretanto, as cepas Trichoderma nunca foram observadas, mas são facilmente reconhecidas, mesmo aquelas que as sementes plantadas foram pesadamente colonizadas (ver a FIG. 11 e Exemplo 3). As cepas de Trichoderma foram restritas às raízes embora elas tivessem efeitos significantes e substanciais sobre o desempenho da planta como descrito no Exemplo 3.

[0128] Assim, neste experimento, 5 variedades de milho x todos os tratamentos de semente foram comparados, para um total de 4000 sementes. Nenhuma delas deu origem a qualquer uma das colônias de Trichoderma qualquer que fosse, embora uma variedade de outros fungos saprofíticos (por exemplo, Penicillum, Fusarium, Rhizopus ou Mucor experimentalmente identificadas pela morfologia da colônia) foram facilmente detectadas. Isto demonstra que as cepas que dão origem ao desempenho melhorado de planta descritas no Exemplo 3 não foram transmitidas para as sementes, e que o modelo fornecido no Exemplo 3, Fig. 7) está correto. As cepas fúngicas fornecem benefícios para as plantas, colonizam as raízes, mas não estão presentes nas sementes,

Exemplo 5. Controle de Nematóide

[0129] Nematóides são nematelmintos que têm várias espécies que são parasíticos/patogênicas nas plantas, usualmente nas raízes. Existem 197 gêneros e 4300 espécies que são parasíticas de planta; todas estas têm um estilete oco protrusível que eles usam para perfurar e extrair nutrição das raízes da planta.

[0130] Visto que eles são animais primitivos, pesticidas químicos típicos (por exemplo, fungicidas e nematocidas são ineficazes). Visto que eles vivem no solo, os produtos químicos tóxicos não são econômicos nem ecológicos visto que grandes quantidades teriam que ser usadas para tratar o solo como um todo, que tem um peso de cerca de 2 milhões de kg/ha. Portanto, produtos com modos únicos de ação, por exemplo, aqueles que induzem resistência em plantas aos organismos e/ou que são patogênicos para os vermes têm recebido atenção crescente para um problema difícil na agricultura. Por exemplo, Pasieuria nishizawae é uma bactéria que forma micela e endósporo que é parasítica em algumas espécies de nematóides que danificam plantas (Sayre, Wergin, et al., 1991) que foi comercializada pela Syngenta para o controle de nematóide cístico do feijão de soja como Clariva®. Similarmente, Bacillus firmis cepa 1-1582, o ingrediente ativo do produto de controle de feijão de soja VOTiVO (Bayer) utiliza um modo biológico de ação com uma única cepa bacteriana que vive e cresce com raízes jovens, criando uma barreira viva que impede os nematóides de causar dano, de acordo com o website da companhia. Um estudo no Estado de Michigan (2013 Seef Treatments for SCN por P.I. George W. Bird) indica que o organismo induz resistência sistêmica nas plantas cujas raízes o mesmo coloniza. Ambos destes produtos são vendidos pelo fabricante em combinação com pesticidas químicos para o controle de fungos patogênicos de planta transportados pelo solo. Em pelo menos muitos estados, o dano pelos nematóides está aumentando.

[0131] Visto que os nematóides são um problema contínuo e crescente, mais alternativas para o controle destas pragas seriam muito úteis. A cepa K5 é um produtor forte de enzimas proteolíticas, e seria esperado produzisse quantidades de enzimas quitinolíticas, visto que esta é uma marca das cepas de Trichoderma. As cepas com capacidades realçadas foram relatadas ter maior atividade contra estas pragas do que as cepas não alteradas (Sharon, Bar-Eyal, et al., 2001). Uma cepa ideal: (i) seria rizosférica e endofiticamente competente e persistiria com as raízes da planta por toda a estação, (ii) teria atividade nematocida forte durante um período prolongado de tempo no campo, (iii) seria capaz de controlar fungos patogênicos de planta que atacam as raízes, aumentando deste modo a sua versatilidade como um agente de biocontrole, (iv) teria capacidade para aumentar o crescimento e rendimento de planta além das capacidades em 1-3 acima, e (v) teria capacidade para induzir resistência aos estresses abióticos. A cepa K5 tem todas estas propriedades. Exemplos mais no princípio debateram as capacidades nos pontos 1,4 e 5. este exemplo trata do ponto 3.

[0132] Teste de Campo em Iowa. O presente teste A em um campo pesadamente infestado com nematóides foi estabelecido em Bancroft, Iowa. Os tratamentos incluídos foram como segue: 1. Controles não tratados: 2. Excalibre líquido (com Bradyrhizobium T virens cepa K1)); 3. K5 + MJ (uma mistura de elementos traços e estimulante de crescimento de planta; 4. K5 + As2 + MJ; e 5. K2 + As2 + MJ.

[0133] Por toda a estação, o tratamento 3 teve as plantas maiores e mais vigorosas. Os rendimentos foram como segue na tabela A:

[0134] Os presentes valores de rendimento médio seguido pelas letras dissimilares são significantes em P = 0,05 (ANOVA LSD). Estes dados indicam que K5 deu excelente desempenho, e que a inclusão de As2 (cepa de Bacillus amyloliquificiens) pioraram o desempenho. A formulação Excalibre, pelo menos numericamente, deu os rendimentos mais insatisfatórios.

[0135] Testes de campo com girassóis em Campo na África do Sul. Os testes foram conduzidos na República da África do Sul. As sementes de girassol foram tratadas com vários microorganismos e plantadas no solo infestado com nematóides parasíticos de planta. Depois que as plantas foram maduras, as raízes foram colhidas e classificadas quanto à irritação da raiz causada pelos nematóides. Os resultados são mostrados na FIG. 12, A variabilidade foi bastante grande neste campo naturalmente infestado. Entretanto, o índice de irritação numericamente mais baixo dos tratamentos biológicos foi com sementes tratadas com K5, e K5 + As2, como no exemplo anterior deu resultados mais insuficientes. Os tratamentos com K1-K4 também deram resultados numericamente mais insuficientes. Entretanto, a aplicação de MJ por si só deu resultados similares àqueles de K5 + MJ. Estes resultados são compatíveis com aqueles no subexemplo anterior.

[0136] Avaliação compreensiva das cepas em testes de estufa. Os subexemplos anteriores foram sugestivos mas os resultados não foram conclusivos. É difícil obter resultados estatisticamente válidos diretamente no controle de nematóide de infestações naturais visto que os níveis de nematóides diferem amplamente em um nível de microlocal. Portanto, testes de estufa controlados foram conduzidos com a Nemlab, uma companhia na África do Sul que se especializou no teste de controle de nematóide.

[0137] Este teste foi designado para considerar mecanismos assim como controle de contato direto. Como mencionado mais no princípio, a indução de resistência sistêmica foi considerada altamente desejável, e seria esperada dados os mecanismos generalizados de ação descritos no Exemplo 3, FIG. 8. Para avaliar este caractere, plantas de tomate foram cultivadas durante 6 semanas e depois as raízes foram divididas em duas, e cada metade de raiz foi colocada em um vaso separado com um único broto. Exceto para os controles de água, 500 a 1000 ovos do nematóide do nó da raiz, Meloidgyne javanica foram colocados dentro de cada sistema de raiz, mas apenas um lado, os vários tratamentos foram colocados os agentes de biocontrole a 108 cfu/g de solo. Assim, um sistema de raiz de cada planta conteve nematóides apenas enquanto o outro conteve nematóides mais os tratamentos. Os tratamentos são mostrados abaixo; houve seis réplicas por tratamento. Além dos tratamentos mostrados abaixo na Tabela 3, houve um outro controle possuindo raízes únicas às quais os nematóides não foram adicionados.

[0138] O experimento foi designado para avaliar a capacidade de cada cepa para controlar diretamente (vaso 2) e para controlar em uma distância, os nematóides. O controle das populações de nematóide ou o seu dano à planta no vaso I seria fortemente sugestivo de resistência sistêmica. Houve várias avaliações feitas nas plantas no final do experimento, e as mais importantes são mostradas abaixo na Tabela 4 (índice de Irritação).

[0139] A irritação da raiz é um índice da formação de ‘nós’ nas raízes que dão ao nematóide do nó da raiz o seu nome e é um índice de dano à raiz. As irritações são as áreas onde o nematóide está nematóide está infestando a raiz e depositando os seus ovos. A escala = 0, nenhuma irritação, 1, irritação visível, 2, 25 % das raízes com irritações. 3, 50 % das raízes com irritações, 4, 75%, e 5, 100 %. Tabela 5. Números de nematóides fêmeas/raiz.

[0140] Estes dados indicam que diversos dos tratamentos tiveram fortes efeitos no controle e sobrevivência de nematóide. O nível de irritação foi reduzida em cerca de 60 %, números de nematóides fêmeas em torno da mesma quantidade, e os números de ovos em cerca de 99 % nos tratamentos mais eficazes. A diferença substancial em % entre os números de nematóides fêmeas e ovos fortemente sugere que, embora os nematóides fossem capazes de sobreviver, eles foram incapazes de botar ovos, o que dramaticamente reduzirá os números das pragas nas gerações sucessivas. Assim, embora dano direto como evidenciado pela redução na irritação e nos números de pragas, o maior efeito foi na postura de ovos e portanto na fertilidade do nematóide.

[0141] Embora diversas cepas e combinações de cepa fossem eficazes, no geral o tratamento mais eficaz foi K5. Outras misturas tiveram um efeito quase tão bom, especialmente As2 e K2 + K3. Na maioria dos casos, as combinações de cepas foram menos eficazes do que as cepas isoladas. Em alguns exemplos específicos, as combinações de 4 ou 5 cepas foram significantemente menos eficazes do que algumas das cepas isoladas usadas sozinhas, embora as cepas isoladas estivessem na mistura. Uma explicação possível pode ser deduzida do Exemplo 3, FIG. 8 — cada cepa individual tem misturas diferentes de moléculas evocadoras/deflagradoras, e a combinação de cepas pode fornecer sinalização contrária para as plantas.

[0142] Além disso, a hipótese de resistência sistêmica induzida como indicado no Exemplo 3, FIG. 8, foi confirmada. Em todos os casos eficazes, a meia raiz apenas com nematóide resultou em efeitos similares à meia raiz com nematóide + agente. O único modo possível para isto ocorrer, visto que os agentes não estiveram em contato com as raízes apenas com nematóide foi através de mudanças fisiológicas induzidas pela presença da praga e do agente juntos. Uma explicação alternativa seria que as metades de raiz apenas com nematóide foram contaminadas pelos agentes durante o curso do experimento. Esta alternativa parece improvável visto que se a contaminação fosse a causa, então os nematóides também deveriam ter aumentado e isto não ocorreu ou, no caso das contagens de ovo, foi extremamente pequena. Exemplo 6. Controle de Doença

[0143] As capacidades de K5 e outras cepas para controlar doença foram avaliadas. Controle foliar de doença com agentes aplicados como tratamentos de semente. As diferentes cepas e misturas para controlar doenças foliares foram observadas mesmo se os organismos foram aplicados como tratamentos de semente. Visto que pelo menos as cepas de Trichoderma não colonizam as partes de planta acima do solo, o controle observado ocorreu em uma distância do local físico dos sintomas da doença. Tais capacidades foram observadas com outras cepas (Harman, Howell, et al., 2004, Harman, Petzoldt, et al., 2004), mas são uma contribuição importante para as capacidades globais de K5 e dos outros produtos descritos nesta patente. Estes resultados são apresentados na forma de tabela no Exemplo 3. Estes dados mostram que uma infecção natural do patógeno foi diminuída pelos tratamentos biológicos, com misturas contendo K5 sendo as mais eficazes. Todas as sementes incluindo o controle tiveram uma tratamento com base fungicida:inseticida como descrito no Exemplo 3.

[0144] Controle de doenças transportadas pelo solo usando tratamentos de semente. Um atributo importante de tratamentos biológicos de semente é as suas capacidades para controlar uma faixa de patógenos transmitidos pelo solo. Entre os mais importantes são os Oomicetos. Especialmente Pythium spp., que apodrecem as sementes e causam a podridão da raiz; Rhizoctonia solani, que não está relacionado com Pythium spp., e são fungos Basidomicetos, e Fusariurn spp, que mais uma vez não estão relacionados com os outros dois, e são fungos Ascomicetos. Os primeiros dois patógenos infectam uma ampla faixa de plantas hospedeiras, mas Fusarium spp. são relativamente específicos, com espécies/biotipos particulares sendo relativamente específicos para plantas particulares (Chupp e Sherf, 1960). Neste exemplo, nós usamos métodos anteriormente publicados (Harman, Taylor, et al., 1989). Os solos foram infestados com os vários patógenos em níveis que dariam cerca de 60% de morte de sementes ou plantas no solo. Para os testes com Pythium e Rhizoctonia solani nós plantamos sementes de feijão de soja e para Fusarium spp., nós usamos Fusariurn gratnincola com trigo como o sistema de teste (Harman. Taylor, et al., 1989). Os dados são mostrados na FIG. 13A-C para os vários patógenos. Os valores das médias são mostrados e as barras de erro representam desvios padrão. Cada gráfico mostra os dados combinados para % de germinação de semente, crescimento de broto, e volume de raiz para todos os três patógenos. Visto que os feijões de soja foram as safras de teste para Pythium e Rhizoctonia, e trigo foi usado nos testes com Fusarium, os dados são é indicativos das capacidades das cepas para proteger mudas contra diversos Oomicetos e patógenos fúngicos e que capacidades similares ocorrem em um dicotilédone (feijões de soja) e com um monocotilédone (trigo). Ver as FIG. 13A-C.

[0145] Estes dados demonstram que todas as cepas têm capacidades para controlar todos os três patógenos e prevenir perdas na germinação de semente. Ver a FIG. 13A-C. Além disso, a proteção da planta depois da germinação é demonstrada pelo crescimento de broto realçado e mais importantemente, como volume de raiz. Todos os três patógenos são patógenos de raiz sérios e o dano das zonas de raiz impede o crescimento adequado da planta. É importante observar que os fungicidas químicos para o tratamento químico de semente frequentemente não controlam o nó de raiz visto que a sua atividade é restrita à própria semente. Como observado nos exemplos anteriores, estes agentes microbianos têm atividade sistêmica e portanto protegem as plantas e raízes durante períodos muito mais longos de tempo do que os produtos químicos. Uma observação importante é que misturas complexas de cepas, por exemplo, K1 até K4 ou K5, não desempenham assim como as cepas isoladas, especialmente K1 e K5 (ver especialmente os dados de volume de raiz), um fenômeno também observado com os dados do controle de nematóide. Ver as FIGs. 13A-C.

Exemplo 7. Controle de Pragas de Inseto Foliares

[0146] É imperativo que as plantas sejam protegidas quanto às doenças causadas por vários insetos e ácaros, fungos, Oomycetos, e bactérias para evitar perdas inaceitáveis. Existe uma ampla variedade de produtos químicos sintéticos usados para este propósito. Entretanto, em muitos casos, as pragas de planta desenvolveram resistência a estes, especialmente aqueles que têm mecanismos específicos e que são os mais seguros de usar. Além disso, as agências reguladoras em torno do mundo têm restrições fortes contra os pesticidas sintéticos; por exemplo, a EU recentemente baniu um grande grupo de inseticidas que têm sido amplamente usados. Ver The Guardian “Bee-harming pesticides banned in Europe: EU member states vote ushers in continent-wide suspension of neonicotinoid pesticides,” Publicado em 29 de abril de 2013. Por estas razões, mais um custo muito alto de descoberta e regulagem, existem agora muitos poucos novos produtos químicos potenciais sendo desenvolvidos como pesticidas agrícolas comerciais.

[0147] Além disso, alguns usuários preferem, e podem insistir em produtos que podem ser certificados como orgânicos. Existem uns poucos destes no mercado tais como MilStop, um produto com base no bicarbonato de sódio ou potássio, e vários óleos miscíveis em água tais como Óleo de Sylet e óleo de Neem. Além disso, são vários os microorganismos que ocorrem naturalmente, e seus metabólitos, que resultam no biocontrole de pragas e em melhoras no crescimento e produtividade de planta. Esta invenção está direcionada para o desenvolvimento de um pesticida(s) orgânico(s) natural(is) que possua(m) (i) capacidades para suprimir ou controlar tanto doenças de planta quanto pragas de inseto de plantas, (ii) aumento do crescimento e produtividade de planta, e (iii) realizem estes benefícios em uma maneira econômica. Como tal, este exemplo é direcionado para a produção de novos pesticidas naturais não tóxicos modernos e eficazes com capacidades para controlar uma ampla faixa de pragas.

[0148] Como mencionado mais no princípio, existem uns poucos produtos que estão comercialmente disponíveis que funcionam como pesticidas naturais, não tóxicos. Alguns destes incluem o bicarbonato e materiais com base em óleo descritos acima. Existem também extratos de plantas, incluindo Óleo de Neem, Safer's Soaps, que contêm sais de ácidos graxos como os ingredientes ativos, e também incluindo extratos de Reynoutria sachalinensi. O óleo de Neem é eficaz contra insetos, e os extratos de R. sachalinensi são registrados para controle de uma faixa de pragas fúngicas, Oomyceto e umas poucas bacterianas. Diversos produtos com base em micróbios também estão disponíveis, na maior parte com bactérias do gênero Bacillus como o ingrediente ativo. Como tal, este aspecto é direcionado para o desenvolvimento de novos produtos pesticidas com atividade forte, de longa duração contra uma variedade de pragas. Nesta família de invenções estão novas combinações de metabólitos microbianos altamente ativos combinados sinergisticamente com composições com base em óleo.

[0149] Nos exemplos apresentados mais no princípio, as aplicações foram primariamente como tratamentos de semente, e contiveram formulantes que realçam a atividade/facilidade de uso dos produtos. Para aplicações foliares, os formulantes também são necessários. Nós desenvolvemos uma composição formulante designada especificamente para o uso nas superfícies de planta. Os pesticidas químicos todos são formulados para realçar a sua atividade mas esta necessidade tem sido ligadas abordadas no desenvolvimento de agentes biológico, mas isto é remediado neste pedido. As exigências quanto a um formulante precisam de vários critérios para o sucesso; estas são enumeradas como segue (i) a formulação precisa conter tensoativos para permitir que adiram nas superfícies cerosas das folhas de plantas, (ii) o formulante precisa ser designado como um concentrado, de modo que grandes volumes não tenha que ser despachados e transportados. (iii) o formulante precisa ser miscível em água, de modo que quando o mesmo é diluído com água forme uma emulsão ou solução estáveis de modo que os ingredientes não separem enquanto são aplicados, e (iv) idealmente, o formulante seria por si só de valor no controle da praga ou outros atributos para os quais os efeitos de qualquer um dos agentes microbianos seriam aditivos ou sinergísticos.

[0150] A meta foi alcançada. Uma mistura contendo os seguintes ingredientes simples, todos dos quais podem ser obtidos como formas organicamente registráveis é mostrada abaixo. A mistura, designada Base Pesticida Orgânica (OPB) segue (qualquer mistura contendo múltiplos desta mistura básica é apropriada): 20 ml de óleo de soja (outros óleos vegetais podem ser substituídos), 20 ml de água desionizada, 0,5 g de lecitina de soja (outras quitinas vegetais podem ser substituídas e 6 ml de EcoSil Wet (outro tensoativo similar pode ser substituído. Este material é um concentrado e é tipicamente diluído para 3 a 10 ml/L de água para aplicação no campo. Os agentes biológicos são estáveis na mistura diluída, e assim a expectativa, e prática nos testes que seguem, é que suspensões concentradas de agentes microbianos seriam misturados com a OPB diluída dentro de umas poucas horas de aplicação.

[0151] Atividade de OPB sozinha - Controle de míldio pulverulento. As plantas de abóbora (Cucurbita pepo 'Sweet Dumpling') foram cultivadas na estufa e, quando elas estavam no estágio da primeira folha verdadeira, elas foram colocadas próximas de plantas maiores que foram pesadamente infectadas com míldio pulverulento (Podosphaera xanthii (anteriormente conhecido como Sphaerotheca fuliginea e S. fitsca) e/ou Erysiphe cichoraceartim. Sob condições de cultivo, que fossem favoráveis para o patógeno, um epifitótico ocorreu e as plantas não tratadas foram rapidamente cobertas pelo patógeno, algumas vezes resultando na morte da planta. Assim, nestes testes, a doença progrediu rapidamente e as classificações em intervalos semanais mostram a progressão da doença. As plantas foram pulverizadas até o escoamento com os materiais de teste descritos com cada experimento individual em uma base semanal. O controle não tratado foi pulverizado apenas com água. As pulverizações para as barras azuis rotuladas 1o foram depois uma pulverização única, e aquelas barras laranjas rotuladas 2o foram depois duas pulverizações. As áreas de folhas cobertas com míldio pulverulento foram estimadas 7 dias depois das pulverizações, e a formulação 1 foi aplicada a 3 ml/L enquanto que a formulação 2 foi aplicada a 6 rnl/L (Tabela 12). Os dois produtos têm aproximadamente o mesmo nível de óleo de soja e EcoSil Wet, mas a inclusão do estearato de sódio necessitou uma inclusão maior de água para manter o produto líquido. Os resultados são mostrados na FIG. 14.

[0152] Nestes experimentos, o epifitótico de míldio pulverulento desenvolveu-se rapidamente; o valor do controle não tratado demonstra que a maior parte das áreas de folha destas plantas foi totalmente coberta pela doença esporulante. Tanto Milstop quanto as duas formulações reduziram a doença, e os melhores resultados foram obtidos com a formulação base descrita acima com a inclusão do sabão estearato de sódio. A formulação 1 é a formulação base. Com estes tratamentos, o nível de míldio foi quase zero nestes experimentos. Estes dados demonstram que OPB é superior ao produto orgânico comercial (Milstop).

[0153] Controle de afídios. As plantas de couve (Brassica oleracea ‘Nagoya Blanc’) foram cultivadas na estufa e uma infestação de afídios do pêssego verde (Myzus persicae) foi estabelecida. Quando as plantas tiveram 6 a 8 folhas, elas foram tratadas com a formulação 1 ou 2, ou ainda com o produto orgânico comercialmente disponível Óleo de Stylet®, que tem 97,1% de óleo de parafina como seu ingrediente ativo. O rótulo do Óleo de Stylet® estabelece que o óleo usado “é um óleo mineral técnico de grau superior submetido às etapas de refino suficientes para remover as impurezas encontradas no óleos de pulverização típicos”. O mesmo foi misturado com água de acordo com as instruções do fabricante a 10 ml/L. As formulações 1 ou 2 foram misturadas com água na taxa de 6 ml/L. Como um controle, as plantas foram pulverizadas apenas com água. Diversos experimentos foram conduzidos; os dados representativos são mostrados abaixo. Seis plantas únicas foram usadas como réplicas e os tratamentos foram contidos dentro de gaiolas de tela, prevenindo assim a disseminação de afídios entre tratamentos e réplicas. A Tabela 7 é mostrada abaixo, onde todos os dados avaliados quanto à separação média dentro das colunas individuais usando P = 0,1. Em parênteses estão a alteração no aumento dos números da contagem pré-tratamento.

[0154] No teste/experimento 1, o número em parênteses reflete o aumento percentual nos números de afídios em relação às contagens no pré-tratamento. Estes dados consistentemente mostram que ambas das formulações descritas neste exemplo, assim como Óleo de Sylet, reduziram a taxa de aumento de afídios (Teste 1) assim como o número de afídios nas plantas tratadas (tanto o Teste I quanto o 2). A diferença entre os dois testes é que no Teste 1, as populações de afídio se expandiram rapidamente, mas na cultura mais madura no Teste 2 as populações de afídio não cresceram mais. No geral, tanto a taxa de aumento quanto os números absolutos finais foram menores com cada uma das duas formulações do que com o produto estabelecido, Óleo de Stylet. Houve um alto nível de variabilidade nestes experimentos, assim na maioria dos casos as diferenças não foram significantes em P=0,1 mas as tendências em todos os experimentos foram compatíveis.

[0155] Além disso, a razão da formulação ou produto para água foi menor com as duas formulações do que com o Óleo de Stylet, demonstrando que, em uma relação de volume:volume, as duas formulações foram mais eficazes do que o Óleo de Stylet. Além disso, embora o Óleo de Stylet fosse registrado para o uso orgânico, o mesmo não é um produto natural (o mesmo está fundamentado no óleo de petróleo) enquanto nossas formulações são mais do que 85% de produtos vegetais naturais. Estes dados geralmente indicam que nossos produtos são superiores a outros produtos orgânicos no mercado.

[0156] Rendimento Realçado de alfafa. OPB e um controle (água) foram pulverizados sobre plantas de alfafa em um campo comercial na taxa de 6 ml/L e duas semanas mais tarde, porções de 12 pés quadrados (1,1 m2) foram colhidas (três réplicas). Além disso, 1-octen-3-ol também foi aplicado, como foi uma mistura de OPB + 1-octen-3-ol e nutrientes de planta mais um produto de ácido húmico. Os resultados são mostrados nas FIGs. 15A-B. As mesmas plantas foram deixadas retomar o crescimento durante cerca de 4 semanas depois da colheita e novamente colhidas com os resultados mostrados abaixo. Estes resultados demonstram que OPB ou OPB mais outros ingredientes mortos resultaram em crescimento de planta realçado durante um período prolongado de tempo. OPB é por si só um produto agrícola útil que resulta em (i) controle de míldio pulverulento, (ii) controle de afídios, (iii) crescimento de planta realçado, e (iv) além disso, o mesmo forma uma emulsão diluível estável que pode ser usada para liberar agentes microbianos.

[0157] Controle de moscas brancas com OPB + cepas microbianas. Plantas experimentais: tomates cultivados em estufa. Praga: Moscas brancas, (Bremia spp.). Protocolo: As plantas de tomate foram infestadas com moscas brancas e mantidas em gaiolas à prova de inseto para prevenir a transferência de insetos para outras plantas e entre tratamentos.

[0158] As plantas que foram pesadamente infestadas foram pulverizadas com água (controle) ou com agentes microbianos no adjuvante OPB (base pesticida orgânica). Para preparações contendo bactérias, uma suspensão de I a 2 x 108 unidades formadores de colônia foram preparadas, e 3 ml desta suspensão foram adicionados por litro de suspensão de pulverização. Para as cepas de Trichoderma, uma suspensão de 1 a 2 x 108 cfu/ml foi usada. Três ml da formulação de OBP foram usados em cada pulverização. A OPB contém 20 ml de óleo de soja orgânico, 20 ml de água deionizada, 0,5 g de lecitina de soja, e 6 ml de EcoSil Wet (Momentive). As plantas foram pulverizadas uma única vez e depois as populações da praga foram monitoradas com o tempo contando-se as moscas brancas sobre as plantas em uma base semanal. No tempo zero houve cerca de 150 moscas brancas por planta.

[0159] Os organismos testados foram Trichoderma virens cepa 41 (ABM K1), T. viride cepa NRRL 50521 (K5) e cepas de Bacillus (as espécies seguem em parênteses, aqueles sem designações são amyloliqifaciens) PH2 (pumilus), HHB (licheniformis), TRH13 (grupo Paenibacillus lentimorbus/alvei/popilliae), PH1 (pumilus), grupo AL1, AS1, TR4 (thuringensis ,cereus)/anthracis, BC5, AS3, AS2, HHHB1, TRH10 (grupo thuringensis /cereus)/anthracis) e BC3 grupo thuringensis /cereus/anthracis). Estas são todas cepas que ocorrem naturalmente isoladas próximo a Geneva, NY que foram associadas com plantas ou produtos de planta. A primeira letra designa a fonte, com P indicando tubérculos de batata recém escavados do solo. HH indicando as cascas da noz hickory que caem no chão da floresta. TR indicando raízes de tomate. BC designando compósito de casca de madeira dura, AS e AL designando hastes e folhas de alfafa, respectivamente.

[0160] Os resultados mostram que em uns poucos casos, a pulverização das preparações de esporo microbiano resultaram em letalidade imediata para as moscas brancas. Estas foram BC3, AS3, PH1, e TRH13. Uma semana depois da pulverização, o seguinte resultado foi obtido (CO indica controle de água). As cepas foram previamente triadas e assim a maior parte das cepas pareceram ter eficácia, mas uma cepa (AL1) foi incluída porque os resultados preliminares indicaram que a mesma não foi muito eficaz. O controle obtido foi presumido ser uma consequência da toxicidade direta das cepas, ou algum componente da mistura contendo o micróbio foi tóxico. As diferenças entre a lista de cepas que forneceram letalidade imediata vs os resultados em uma semana são provavelmente devido a uma toxina de ação lenta (as endotoxinas de B. thurinigensis têm este atributo por exemplo). Há também uma possibilidade de que alguns dos organismos infectariam e causariam enfermidade nos insetos. Ver as FIGs. 16A-B.

[0161] Resultados. As plantas nas suas gaiolas foram retidas e as mesmas plantas foram novamente avaliadas. Foi esperado que desta vez, os efeitos tóxicos dos organismos tivessem se dissipado. Em duas semanas os resultados foram bastante similares àqueles em uma semana. Dado isto, nós continuamos o experimento, mas nós também colocamos moscas brancas adicionais dentro de cada gaiola colocando- se uma planta infestada dentro das gaiolas com aquelas tratadas. Nós não tivemos plantas suficientes para tratar todas as plantas assim aquelas com as infestações adicionadas estão em marrom na figura abaixo (na figura a gaiola com TRH13 também recebeu moscas brancas adicionais mas não houve nenhuma mosca viva assim não houve nenhuma cor), que é três semanas depois do tratamento e cinco dias depois que as moscas brancas suplementares foram fornecidas. Ver as FIGs. 17A-C. Na FIG. 17A, este experimento foi prolongado durante uma outra semana e os resultados mostrados abaixo são 33 dias depois da aplicação dos materiais experimentais. Na FIG. 17B, observe que os números totais de moscas são mais baixa do que antes, isto é esperado visto que as plantas maduras e as colônias de mosca branca são menos vigorosas. Não obstante, os números com os tratamentos eficazes são crescentes entre este e os tratamentos anteriores. Isto indica, como seria esperado, que estes tratamentos estão finalmente perdendo a sua eficácia. Entretanto, esta duração prolongada de controle é excelente e igual a quase qualquer inseticida químico. Para resumo e propósitos de comparação, o conjunto de dados inteiro é mostrado na FIG. 17C.

[0162] Controle de afídios. Um outro experimento foi conduzido, mas desta vez com infestação de afídio (o afídio do repolho Brevicoryne brassicae) de repolho. O plano experimental foi como descrito acima. Neste experimento, as pulverizações foram aplicadas apenas no dia 1, assim o controle de longa duração foi obtido. Os resultados são mostrados na FIG 18. Os experimentos diferiram um pouco nas cepas usadas, visto que nós testamos apenas aquelas eficazes nas moscas brancas. FO foi adicionada, esta é uma formulação contendo 1-octen-3-ol e nenhum microorganismos. Dos dois experimentos combinados nós tiramos as seguintes conclusões: (i) OPB mata as moscas brancas e afídios, com os afídios mais afetados do que as moscas brancas, (ii) algumas cepas foram altamente eficazes. Estas incluíram (a) cepas K1 e K5 de Trichoderma, (b), cepas de Bacillus com resultados compatíveis através de ambos experimentos: TR4, As3, As2, e Phi, e (iii) cepa de Bacillus com resultados inconsistentes através dos dois experimentos: HHHB e TRH13.

[0163] Este experimento claramente demonstra que alguns tratamentos que originalmente (1 semana depois da aplicação) pareceram eficazes foram menos depois de um certo tempo. Um bom exemplo é TRH10 que, 1 semana depois da pulverização as moscas brancas foram bem controladas, mas em três semanas elas se desenvolveram novamente a um alto nível de infestação. Isto é provavelmente uma indicação de que houve um tóxico aplicado com o organismo, mas uma vez o efeito deste material putativo foi dissipado, depois as moscas puderam se desenvolver as suas populações.

[0164] Outras cepas tiveram boa atividade inicial e os efeitos continuaram pelo menos três semanas. Os resultados exemplares foram com K1, K5, TRH13, AS2, e AS3. Este efeito deve ser devido à resistência induzida nas plantas, de modo que elas se tornassem plantas nas quais as moscas não pudessem obter nutrição ou que fossem diretamente tóxicas. Esta conclusão é sustentada pelo fato de que as plantas continuaram a crescer de modo que as folhas pulverizadas foram apenas uma pequena parte das plantas em crescimento e assim porções substanciais das plantas foram compostas de folhas não pulverizadas. Um efeito sistêmico é requerido para os resultados aqui obtidos. Os tecidos destas mesmas plantas serão coletados e usados para experimentos RNA SEQ para definir os genes de tomate que são supra- regulados para dar o efeito de resistência proposta. Estes resultados são altamente úteis comercialmente. Uma das desvantagens do controle biológico é que os efeitos são apenas de curta duração. Entretanto, estes dados indicam que os efeitos podem ser de longa duração e podem ser altamente eficazes se as cepas que induzem resistência sistêmica são usados. A possibilidade de infecção e parasitismo pelos micróbios também é um mecanismo possível. Os dados também indicam que OPB por si só tem atividade contra moscas brancas, mas a atividade dos agentes microbianos foi pelo menos aditiva ao efeito de OPB. É essencial que os agentes biológicos sejam apropriadamente formulados, como com OPB, se eles devam ser eficazes. Exemplo 8. Bacillus amyloliquifaciens cepa As2 e outros Bacillus spp.

[0165] Descoberta de novas cepas de Bacillus e o conceito de Diversidade Microbiana Focalizada (FMD)® — Desenvolvimento do conceito da Diversidade Genética Focalizada®. As combinações específicas de micróbios, incluindo cepas múltiplas de Trichoderma e Bacillus, realçam a produtividade da planta mais do que as cepas isoladas de cada um. Os micróbios específicos têm “paletas” de atividades únicas, por exemplo na sua capacidade para controlar patógenos específicos, insetos ou para aumentar o crescimento e produtividade de planta. As capacidades desejáveis para agricultura são estritamente específicos de cepa e mesmo dentro de uma espécie microbiana específica, existe enorme diversidade nas capacidades. Dentro de qualquer espécie, cepas individuais possuirão ou carecerão de atividades desejáveis. Isto claramente demonstra que, dentro da espécie, cepas específicas podem ser identificadas que contêm ou carecem de genes particulares, e que isto amplamente explica as suas variações na atividade. As cepas tanto fúngicas quanto bacterianas possuem genes únicos e existe enorme diversidade dentro destes organismos.

[0166] Esta probabilidade explica as “paletas” de atividades. Ver a FIG. 19, e legenda abaixo.

[0167] Portanto, isto deve significar que existem oportunidades maiores para sinergia entre as cepas. Além disso, nós acreditamos que a atividade destas cepas é primariamente através de metabólitos que têm atividade antibiótica, interações com receptores de planta e outras atividades. Existe tremenda diversidade na faixa destes metabólitos. Bacillus e Trichoderma provavelmente têm pouco, se alguma coisa, em comum. Estes metabólitos têm efeitos fenotípicos similares sobre as plantas, mas claramente por mecanismos diferentes. Nós podemos identificar os metabólitos através de meios bioquímicos, e nós provavelmente temos 50 ou mais candidatos. Nós conhecemos a maioria dos genes que codificam estes metabólitos. Portanto, nós podemos criar combinações de cepa novas e sinergísticas pelo alavancamento das genéticas específicas de cepa que sustentam as suas paletas fenotípicas. Aqui nós agora temos oportunidades únicas para transformar a agricultura de planta e fornecer produtos únicos. IP e conhecimento científico.

[0168] Conceito de Paleta - Um número substancial de fungos no gênero Trichoderma estão disponíveis na coleção mantida pela ARM De modo a obter bactérias no gênero Bacillus, várias plantas e materiais com base em plantas foram aquecidos durante duas horas a 45°C. Os Bacillus spp. são altamente termotolerantes, e este tratamento térmico é suficiente para inativar a maioria dos outros microorganismos. Os materiais de planta foram triturados e as bactérias foram extraídas misturando-se com solução salina fisiológica. As misturas resultantes foram diluídas no mesmo meio e depois plaqueadas sobre dextrose de batata ágar (Difco Laboratories) ou tripticase de soja ágar (Difco Laboratories). As placas foram incubadas a 30°C e colônias bem isoladas foram removidas do meio de isolação e riscadas sobre meios similares. A planta ou fontes relacionadas com a planta foram de tubérculos de batata recém escavados, cascas da nós hickory selvagem deixadas cair pelos esquilos forrageiros, rizosfera do tomate (raízes do tomate e solo aderente, rizosfera de relvado, hastes e folhas de alfafa, e casca de madeira dura compostada. Ver a FIG. 19 e legenda acima

[0169] Este processo deu um total de 65 cepas distintas of Bacillus spp., e estas foram submetidas às seguintes seleções: A capacidade para matar ou de outro modo controlar moscas brancas; a capacidade para promover ou realçar o crescimento e produtividade de planta; a capacidade para inibir o crescimento de uma variedade de patógenos fúngicos; as capacidades da faixa de cepas bacterianas para afetar os critérios acima é mostrado nas Figs. 3 e 4 desta seção. A partir desta análise, está evidente que cepas diferentes têm perfis de atividade muito diferentes. Um sumário destes perfis é mostrado na forma diagramática nas Figuras 3 e 4 desta seção.

[0170] Estes dados claramente demonstram que cepas diferentes, mesmo se elas forem da mesma ou espécie similar, têm capacidades muito diferentes para o realce de crescimento de planta, controle de patógeno ou inseto. Por exemplo, a capacidade das cepas para controlar moscas brancas foi positivamente correlacionada com a inibição de P. ultimum e S nodorum, mas fracamente ou mesmo negativamente correlacionada com outros atributos tais como volumes de raiz realçados ou classificações de medidor SPAD, que são dois atributos com enorme valor na melhora do crescimento e produtividade de planta. Nos dados não mostrados, não houve nenhuma correlação positiva entre a identificação de espécie de cepas e suas capacidades para realizar qualquer um dos atributos mostrados nesta seção.

[0171] Estes dados demonstram que enorme diversidade existe entre as cepas e dentro da espécie de Bacillus. Dado isto, é possível identificar agrupamentos de cepa diferentes com tipos diferentes de atividades. Por exemplo, um grupo fornece promoção do crescimento de planta, um outro controla Pythium. Siagonospora nodorum e moscas brancas, um terceiro tem atividade in vitro contra muitos dos outros patógenos mostrados acima, e um quarto grupo tem pouca ou nenhuma atividade detectável em qualquer um destes testes. Estes agrupamentos são designados como paletas de atividade. Ver a FIG. 19.

[0172] A análise de redes de cepas da ABM mostrando relações entre cepas tendo efeitos que impactam traços mostrados (cor codificada pela legenda da figura). O tamanho de vértices indica o número de vezes que um pico (traço ou cepa/tratamento) foi testado, assim os círculos grandes mostram avaliações repetidas. As cores de linha indicam se uma cepa ultrapassa o controle para um dado traço.

[0173] As linhas cinzas mostram equivalência com controle, as linhas verdes 1 a 5X o controle, e as linhas azul escuras maior do que 5 vezes o controle. Ver as FIGs. 20A-B.

[0174] A Identidade de As2 (NRRL). Em muitos dos exemplos anteriores, a cepa As2 de Bacillus foi usada junto com várias cepas fúngicas, particularmente K5. O que segue é a documentação da sua identidade como uma cepa de Bacillus amyloliquifaciens. A sequência genômica parcial da cepa AS2 da ABM foi gerada usando o instrumento MinION da Oxford Nanopore Technologies como parte do programa de acesso inicial. Os comprimentos de leitura variaram de aproximadamente 100 bases para mais do que 6000 bases. Uma amostra aleatória de 500 leituras foi submetida ao BLAST e a identificação de espécie dos acertos resultantes está resumida abaixo. Todas das sequências mostrando similaridade significante para as sequências de AS2 são anotadas como Bacillus amyloliquifaciens e nós portanto designamos esta cepa também como B. amiloliquifaciens.

[0175] Bases/proporção de genoma avaliado: 121 contíguos através de aproximadamente 5% do genoma de referência de Bacillus amyloliquifaciens (Cepa DSM7: NCBI BioProject ID 41719) foram avaliadas quanto à sua similaridade. Um total de 8270 polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) foram detectados entre AS2 e o genoma de referência de B. amyloliquifaciens em 584337 bases avaliadas. Isto indica que embora haja identidade significante para o genoma de referência (98,6% nas regiões avaliadas), um grande número de SNPs também foram encontrados indicando que AS2 e a referência são cepas diferentes.

[0176] Comparação de AS2 com a cepa TrigoCor1448 de B. amyloliquefaciens. Na determinação da espécie AS2 a maioria das leituras mostraram similaridade significante para a cepa TrigoCor1488 de B. amyloliquefaciens (Crane J. M., M., et al., 2013). Portanto, a sequência de genoma parcial de AS2 foi alinhada com TrigoCor1488 para avaliar esta relação. Nas regiões avaliadas, 3130 SNPs foram detectados indicando 99,2% de identidade entre as duas cepas. Assim, mesmo a cepa mais intimamente relacionada com sequência depositada no Genbank mostra diferenças de sequência significantes com AS2. Estas diferenças demonstram que esta cepa contém sequências únicas não encontradas em outras cepas.

Exemplo 9 Dados/materiais sustentadores e Informação

[0177] O uso de micróbios endofíticos para superar os efeitos de estresse nos estudos em estufa. O propósito desta informação foi (a) demonstrar as capacidades dos micróbios endofíticos e outros para superarem o estresse em uma planta dicotilédone, tomate, e (b) para demonstrar a natureza indutível e alguns mecanismos da resposta.

[0178] Métodos. As cepas de Trichoderma K1 (T virens cepa ATCC 20906), K2, K3, K4, e K5, a cepa As2 de B. amyloliquifaciens assim como a combinação de K1- K4 (todas as quatro cepas) e K5As2 foram aplicadas ao solo de vaso (Sungrow) nas taxas de 108 cfu/g de solo para as cepas de Trichoderma e 109 cfg/g de solo para As2. Cinco sementes foram plantadas por vaso, e depois da emergência as plantas foram diminuídas para duas/vaso. Todas as plantas foram tratadas de modo idêntico com rega completa de estufa durante cinco semanas e depois em um conjunto de três vasos por tratamento, a rega foi reduzida para manter uma capacidade de água no solo de 60 a 70% de saturação (medida pela pesagem repetida dos vasos). Houve quatro réplicas, cada uma consistindo de um vaso com duas plantas (os valores das duas plantas foram calculados em média), e houve quatro réplicas por tratamento. Este experimento foi similar a um outro com tomates que deu resultados muito similares. As temperaturas foram mantidas de 20°C a 25°C.

[0179] Vários parâmetros foram medidos no final dos 30 dia de período de estresse. Estes incluíram alturas de planta e teor de clorofila (na folha da ponta do 5o conjunto de folhas) estimado usando um medidor de clorofila (SPAD-502. Minolta. LTD. Japão). Nos experimentos preliminares os resultados obtidos com o instrumento SPAD foram similares àqueles usando um protocolo de extração (Casa. Castaldi, et al., 2015). Além disso, a eficiência fotossintética foi determinada usando as cinéticas de fluorescência da clorofila usando um PEA manual (HansaTech) na folha mais jovem totalmente enrolada por planta de tomate. As folhas a serem testadas foram adaptadas ao escuro durante 30 min usando os grampos de folha (Um experimento preliminar foi conduzido em mudas de tomate para determinar o período mínimo requerido para adaptação ao escuro: dados não mostrados). As determinações foram realizadas de três a cinco horas depois do início do fotoperíodo. Diversos parâmetros fotossintéticos foram medidos: a fluorescência mínima (F0) e máxima (Fm) e o índice de desempenho (PI) são aqui apresentados visto que eles foram os mais úteis. Fv/Fm é uma medida da expressão do rendimento de quantum máximo da fotoquímica primária. O índice de desempenho é um parâmetro desenvolvido para quantificar os efeitos de fatores ambientais sobre a fotossíntese e que combina as três etapas funcionais principais que ocorrem em PSII (absorção de energia luminosa, aprisionamento da energia de excitação e conversão da energia de excitação para o transporte de elétron) (Strauss, Krueger, et al., 2006). PI foi gerado diretamente pelo software contido com o aparelho HansaTech. Tanto Fv/Fm quanto PI foram amplamente usados como medidas diretas como uma medida de interações bióticas, abióticas ou genéticas que afetam a fotossíntese (Christen, Schoenmann, et al., 2007, Ghothi-Ravandi, Shahbazi, et al.. 2014. Oukarroum, El Madidi, et al., 2007, Sheratmeti. Tripathi, et al., 2008).

[0180] Resultados. Os resultados deste experimento são fornecidos nas figuras que seguem. As barras com letras dissimilares são significantemente diferentes em P = 0,05 (testes da Agricola LSD), Ver as FIGs. A variação em torno de cada medição é mostrada pelas barras de erro (desvios padrão). A maioria dos tratamentos significantemente aumentaram o peso das plantas de tomate, com os melhores tratamentos o aumento foi de cerca de 20 %. As condições de estresse de água foram moderadas. e levemente (mas não significantemente) diminuíram o crescimento dos tomates: isto foi superado com os tratamentos.

[0181] O verdor das folhas (correlacionado com o teor de clorofila) nas plantas na presença das cepas fúngicas variou na ausência de estresse, mas a maioria das plantas dos tratamentos foram mais verdes do que as plantas de controle. Em alguns casos, as diferenças não foram significantes, mas em outros casos foram. Entretanto, na presença de estresse e dos fungos benéficos, os níveis de verdor de folha aumentou acentuadamente até cerca de 50 % mais com K5As2 vs o controle não tratado.

[0182] As medidas fotossintéticas com base na fluorescência da clorofila adaptada ao escuro nas mesmas plantas diferiram de acordo com as unidades medidas. A Fv/Fm, que mede o rendimento máximo do fotossistema II (Ghotbi-Ravandi, Shahbazi, et al. 2014), foi suavemente melhorada, mas os resultados não foram significantes (dados não mostrados). Efeitos pequenos similares de seca neste parâmetro foram também mostrados em cevada (Ghotbi-Ravandi, Shahbazi, et al., 2014). Uma medida mais complexa da fotossíntese é o Índice de Desempenho (PI). Este parâmetro integra o processo fotoquímico principal, incluindo a densidade de centros de reação, absorção e aprisionamento da energia de excitação e transferência de elétron além do plastoquinoma (Christen, Schoenmann, et al., 2007, Lepedus, Brkic, et al., 2012). Entretanto, na ausência de estresse, a presença dos fungos aumentou os níveis de PI, e na presença de estresse, os valores de PI foram muito mais altos. de 80 para mais de 100%, em relação ao controle não estressado não tratado e ainda mais em relação aos controles estressados. Assim, esta medida complexa da função fotossintética global foi realçada e ativada pela combinação de estresse e dos organismos, mas diminuiu no estresse na ausência dos micróbios.

[0183] Referências. Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) “Basic local alignment search tool.” J. Mol. Biol. 215:403-410; Cawoy, H., M. Mariutto, G. Henry, C. Fisher, N. Vasilyeva, P. Thonart, et al. 2014. Plant Defense Stimulation by Natural Isolates of Bacillus Depends on Efficient Surfactin Production. Molecular Plant-Microbe Interactions 27: 87-100. doi:10.1094/mpmi-09-13-0262-r.; Chupp, C. e A.F. Sherf. 1960. Vegetable Diseases and their Control The Ronald Press, New York.; Crane J. M., G.D. M., V.R. . e B.G. C. 2013. Iturin levels on wheat spikes linked to biological control of Fusarium head blight by Bacillus amyloliquefaciens. Phytopathology 103: 146-155.; Danial, D.L. e J.E. Parlevliet. 1995. Effects of nitrogen fertilization on disease severity and infection type of yellow rust on wheat genotypes varying in quantitative resistance. Journal of Phytopathology (Berlin) 143: 679-681. doi:10.1111/j.1439- 0434.1995.tb00222.x.;Djonovic, S., W.A. Vargas, M.V. Kolomiets, M. Horndeski, A. Weist and C.M. Kenerley. 2007. A proteinaceous elicitor Sml from the beneficial fungus Trichoderma virens is required for systemic resistance in maize. Plant Physiol. 145: 875- 889.;Goellner, K. and U. Conrath. 2008. Priming: it's all the world to induced disease resistance. European Journal of Plant Pathology 121: 233- 242.;Harman, G.E. 2000. Myths and dogmas of biocontrol. Changes in perceptions derived from research on Trichoderma harzianum T-22. Plant Dis. 84: 377-393.; Harman, G.E. 2006. Overview of mechanisms and uses of Trichoderma spp. Phytopathology 96: 190-194.;Harman, G.E. 2011. Multifunctional fungal plant symbionts: new tools to enhance plant growth and productivity. New Phytol. 189: 647649; Harman, G.E. 2011. Trichoderma--not just for biocontrol anymore. Phytoparasitica 39: 103-108.; Harman, G.E., A.G. Taylor e T.E. Stasz. 1989. Combining effective strains of Trichoderma harzianum and solid matrix priming to improve biological seed treatments. Plant Dis. 73: 631-637.; Harman, G.E., C.R. Howell, A. Viterbo, I. Chet and M. Lorito. 2004. Trichoderma species—opportunistic, avirulent plant symbionts. Nature Rev. Microbiol. 2: 43-56.; Harman, G.E., M. Cadle- Davidson, A. Pasquale and W. Nosir. 2015. Increasing photosynthetic efficiency and inducible resistance to drought and other stresses by application of endophytic fungi to the root phytobiome. Molec Plant Microbe Interact Submitted.; Harman, G.E., R. Petzoldt, A. Comis and J. Chen. 2004. Interactions between Trichoderma harzianum strain vinT22 and maize inbred line Mo17 and effects of these interactions on diseases caused by Pythium ultimum and Colletotrichum graminicola. Phytopathology 94: 147153.; Harman, G.E., T. Bjorkman, K.L. Ondik and M. Shoresh. 2008. Changing paradigms on the mode of action and uses of T richoderma spp. for biocontrol. Outlooks Pest Manag. 19: 24-29.; Jaklitsch, W. M., Samuels, G. J., Dodd, S. L., Lu, B.-S., & Druzhinina, I. S. (2006). Hypocrea rufa/Trichoderma viride: a reassessment, and description of five closely related species with and without wanted conidia. Studies in Mycology, 56, 135-177; doi:10.3114/sim.2006.56.04; Jaskiewicz, M., U. Conrath and C. Peterhaensel. 2011. Chromatin modification acts as a memory for systemic acquired resistance in the plant stress response. EMBO Reports 12: 50-55. doi:10.1038/ embor.2010.186.; Lindsey, D.L. and R. Baker. 1967. Effect of certain fungi on dwarf tomatoes grown under gnotobiotic conditions. Phytopathology 57: 12621263.; Mastouri, F., T. Bjorkman and G.E. Harman. 2010. Seed treatments with Trichoderma harzianum alleviate biotic, abiotic and physiological stresses in germinating seeds and seedlings. Phytopathology 100: 1213-1221.; Mastouri, F., T. Bjorkman and G.E. Harman. 2012. Trichoderma harzianum strain T22 enhances antioxidant defense of tomato seedlings and resistance to water deficit. Molec. Plant Microbe Interact. 25: 1264-1271.; Morath, S.U., R. Hung and J.W. Bennett. 2012. Fungal volatile organic compounds: A review with emphasis on their biotechnological potential. Fungal Biol. Rev. 26: 73-83.; Samuels GJ (1996) Trichoderma: a review of biology and systematics of the genus. Mycol Res 100:923-935;Sayre, R.M., W.P. Wergin, J.M. Schmidt and M.P. Starr. 1991. Pasteuria nishizawae sp. nov., a mycelial and endosporeforming bacterium parasitic on cyst nematodes of genera Heterodera and Globodera. Res. Microbiology 142: 551-564.; Sharon, E., M. Bar-Eyal, I. Chet, A. Herrera-Estrella, 0. Kleifeld and Y. Spiegel. 2001. Biological control of the root-knot nematode Meloidogyne javanica by Trichoderma harzianum. Phytopathology 91: 687693. doi:10.1094/ phyto.2001.91.7.687.; Shoresh, M. and G.E. Harman. 2008. The molecular basis of maize responses to Trichoderma harzianum T22 inoculation: a proteomic approach. Plant Physiol. 147: 2147-2163.;Shoresh, M. and G.E. Harman. 2008. The relationship between increased growth and resistance induced in plants by root colonizing microbes. Plant Signal. Behavior 3: 737-739.; Shoresh, M., A. Gal-on, D. Liebman and I. Chet. 2006. Characterization of a mitogen-activated protein kinase gene from cucumber required for Trichoderma-conferred plant resistance. Plant Physiol. 142: 1169-1179.; Shoresh, M., F. Mastouri and G.E. Harman. 2010. Induced systemic resistance and plant responses to fungal biocontrol agents. Annu. Rev. Phytopathol. 48: 21-43.; Vargas, W., F. Crutcher and C. Kenerley. 2010. Functional characterization of a plant-like sucrose transporter from the beneficial fungus Trichoderma virens. Regulation of the symbiotic association with plants by sucrose metabolism inside the fungal cells. New Phytol. 189: 777-789.; Vargas, W.A., J.C. Mandawe and C.M. Kenerley. 2009. Plant-derived sucrose is a key element in the symbiotic association between Trichoderma virens and maize plants. Plant Physiol 151: 792-808.; Waller, F., B. Achatz, H. Baltruschat, J. Fodor, K. Becker, M. Fischer, et al. 2005. The endophytic fungus Piriformospora indica reprograms barley to saltstress tolerance, disease resistance, and higher yield. PNAS 102: 13386-13391.; Yedidia, I., N. Benhamou and I. Chet. 1999. Induction of defense responses in cucumber plants (Cucumis sativus L.) by the biocontrol agent Trichoderma harzianum. Appl. Environ. Microbiol. 65: 1061-1070.;nYedidia, I., N. Benhamou, Y. Kapulnik and I. Chet. 2000. Induction and accumulation of PR proteins activity during early stages of root colonization by the mycoparasite Trichoderma harzianum strain T-203. Plant Physiol. Biochem. 38: 863-873.Casa, R., F. Castaldi, S. Pascucci and S. Pignatti. 2015. Chlorophyll estimation in field crops: an assessment of handheld leaf meters and spectral reflectance measurements. Journal of Agricultural Science 153: 876-890. doi:10.1017/s0021859614000483.; Christen, D., S. Schoenmann, M. Jermini, R.J. Strasser and G. Defago. 2007. Characterization and early detection of grapevine (Vitis vinifera) stress responses to esca disease by in situ chlorophyll fluorescence and comparison with drought stress. Environmental and Experimental Botany 60: 504-514. doi:10.1016 /j.envexpbot.2007.02.003.; Ghotbi-Ravandi, A.A., M. Shahbazi, M. Shariati and P. Mulo. 2014. Effects of mild and severe drought on photosynthetic efficiency in tolerant and susceptible barley (Hordeum vulgare L.) genotypes. j. Agron Crop Sci 200: 403- 415.;nLepedus, H., I. Brkic, V. Cesar, V. Jurkovic, J. Antunovic, A. Jambrovic, et al. 2012. Chlorophyll fluorescence analysis of photosynthetic performance in seven maize inbred lines under water-limited conditions. Periodicum Biologorum 114: 73-76.; Oukarroum, A., S. El Madidi, G. Schansker and R.J. Strasser. 2007. Probing the responses of barley cultivars (Hordeum vulgare L.) by chlorophyll a fluorescence OLKJIP under drought stress and re-watering. Environmental and Experimental Botany 60: 438-446.; Sheratmeti, I., S. Tripathi, A. Varma and R. Oelmueller. 2008. The root-colonizing endophyte Piriformospora indica confers drought tolerance in Arabidopsis by stimulating the expression of drought stress- related genes in leaves. Molec. Plant Microbe Interact. 21: 799-807.; and Strauss, A.T., G.H.J. Krueger, R.J. Strasser and P.D.R. Van Heerden. 2006. Ranking of dark chilling tolerance in soybean genotypes probed by the chlorophyll a fluorescence transient O- J-I-P. Environmental and Experimental Botany 56: 147-157. doi:10.1016/j.envexpbot.2005.01.011.

[0184] A presente invenção não deve ser limitada em termos das modalidades particulares descritas neste pedido, que são pretendidas como ilustrações únicas de aspectos individuais da invenção. Muitas modificações e variações desta invenção podem ser feitas sem divergir do seu espírito e escopo, como estará evidente para aqueles de habilidade na técnica. Métodos e aparelhos funcionalmente equivalentes dentro do escopo da invenção, além daqueles aqui enumerados, estarão evidentes para aqueles versados na técnica das descrições precedentes. Tais modificações e variações são pretendidas situar-se dentro do escopo das reivindicações anexas. A presente invenção deve ser limitada apenas pelos termos das reivindicações anexas, junto com o escopo completo de equivalentes para os quais tais reivindicações são designadas.

[0185] Deve ser entendido que esta invenção não é limitada aos métodos, reagentes, compostos, composições ou sistemas biológicos particulares, que podem, naturalmente, variar. Também deve ser entendido que a terminologia aqui usada é para o propósito de descrever apenas modalidades particulares, e não é pretendida ser limitante. Além disso, onde características ou aspectos da divulgação são descritos em termos de grupos Markush, aqueles versados na técnica reconhecerão que a divulgação também de por meio deste descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo Markush.

[0186] Como será entendido por uma pessoa versada na técnica, para quaisquer e todos os propósitos, particularmente em termos de fornecer uma descrição escrita, todas as faixas aqui divulgadas também abrangem quaisquer e todas as subfaixas possíveis e combinações de subfaixas das mesmas. Qualquer faixa listada pode ser facilmente reconhecida como suficientemente descrevendo e habilitando a mesma faixa que é decomposta em pelo menos metades, terças, quartas, quintas, décimas, etc. partes iguais. Como um exemplo não limitante, cada faixa aqui debatida pode ser facilmente decomposta em um terço inferior, terço intermediário e terço superior, etc. Como também será entendido por uma pessoa versada na técnica toda a linguagem tal como “até”, “pelo menos”, “maior do que, “menor do que”, e os semelhantes, incluem os números citados e se referem às faixas que podem ser subsequentemente decompostas em subfaixas como debatido acima. Finalmente, como será entendido por uma pessoa versada na técnica, uma faixa inclui cada membro individual. Assim, por exemplo, um grupo tendo 1-3 células se refere a grupos tendo 1, 2, ou 3 células. Similarmente, um grupo tendo 1-5 células se refere a grupos tendo 1, 2, 3, 4, ou 5 células, e assim por diante. Todas as patentes, pedidos de patente, pedidos provisórios, e publicações aqui aludidas ou citadas são incorporadas por referência em sua totalidade, incluindo todas as figuras e tabelas, até o grau que não sejam incompatíveis com as divulgações explicitas deste relatório descritivo. Outras modalidades são apresentadas dentro das seguintes reivindicações.

Claims

1. Composição para tratar plantas, sementes de planta, um sistema de planta ou um meio de planta caracterizada pelo fato de que compreende: a. um único agente microbiano consistindo de cepa Trichoderma NRRL B- 50520 (K5), e opcionalmente, pelo menos um metabólito derivado do mesmo, dito agente microbiano e/ou metabólito possuindo uma ou mais capacidades multifuncionais selecionadas do grupo consistindo de um aumento em um ou mais atributos benéficos para a plantacompreendendo crescimento de planta aumentado, rendimento aumentado, desenvolvimento de raiz aumentado, resistência aos estresses abióticos aumentado, eficiência fotossintética aumentada, redução de doença foliar aumentada, controle de nematoides aumentado, indução de mudanças sistêmicas na expressão de gene de planta, proteção das sementes plantadas de patógenos transportados pelo solo aumentada, controle de populações de pragas de inseto aumentada e combinações dos mesmos, em que o aumento ou indução no um ou mais atributos benéficos para a planta é como comparado a uma planta ou sistema de planta sem cepa Trichoderma NRRL B-50520 (K5); e b. um mediador agronômico selecionado do grupo consistindo de ácido húmico, ácido fúlvico, uréia, nitrato de amônio, sódio, fósforo, potássio, cálcio, magnésio, enxofre, ferro, manganês, magnésio, cobre, boro, composições compósitas para estimular a formulação de grânulos, poeira, pós, pastas fluidas, películas, suspensões líquidas, revestimento, peletização e combinações dos mesmos.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os estresses abióticos são selecionados do grupo consistindo de seca, estresse osmótico, uma salinidade aumentada, uma salinidade diminuída, alagamento e combinações dos mesmos.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a eficiência fotossintética aumenta mais sob condições de estresse abiótico comparada com condições não estressadas.

4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os patógenos transmitidos pelo solo são selecionados do grupo consistindo de Fusarium spp, Pythium spp, Rhizoctonia solani, e combinações dos mesmos.

5. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o controle de nematoide aumentado compreende um ou mais de: uma inibição da deposição de ovo, uma redução na irritação da raiz, uma redução nos números de nematóide no solo que circunda as raízes das plantas ou uma combinação dos mesmos.

6. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as pragas de inseto são moscas brancas, afídeos ou combinações dos mesmos.

7. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos um metabólito está presente.

8. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um metabólito compreende um ou mais de 6-pentil pirona, ácido harziânico, hydtra 1, harzinolida, 1-octen-3-ol, ou misturas dos mesmos.

9. Método de tratar uma planta, uma semente de planta, sistema de planta ou meio de planta caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. selecionar um único agente microbiano consistindo de cepa Trichoderma NRRL B-50520 (K5), e opcionalmente pelo menos um metabólito derivado do mesmo, dito agente microbiano e/ou metabólito possuindo uma ou mais capacidades multifuncionais selecionadas do grupo consistindo de um aumento em um ou mais atributos benéficos para a planta, compreendendo de crescimento de planta aumentado, rendimento aumentado, desenvolvimento de raiz aumentado, resistência aos estresses abióticos aumentado, eficiência fotossintética aumentada, redução de doença foliar aumentada, controle de nematoides aumentado, indução de mudanças sistêmicas na expressão de gene da planta aumentada, proteção das sementes plantadas de patógenos transportados pelo solo aumentada, controle de populações de pragas de inseto aumentada, e combinações dos mesmos, em que o aumento no um ou mais atributos benéficos para a planta é como comparado a uma planta ou sistema de planta sem a cepa Trichoderma NRRL B-50520 (K5); b. selecionar um ou mais mediadores agronômico selecionado do grupo consistindo de ácido húmico, ácido fúlvico, uréia, nitrato de amônio, sódio, fósforo, potássio, cálcio, magnésio, enxofre, ferro, manganês, magnésio, cobre, boro, composições compósitas para estimular a formulação de grânulos, poeira, pós, pastas fluidas, películas, suspensões líquidas, revestimento, peletização e combinações dos mesmos; e c. contatar uma planta, semente de planta, sistema de planta ou meio de planta com a cepa Trichoderma NRRL B-50520 (K5), opcionalmente um metabólito derivado deste e um ou mais mediadores agronômicos.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a etapa de contatar compreende um ou mais métodos selecionados do grupo consistindo de aplicação por dispersão, aplicação aerossol, aplicação por pulverização seca, aplicação líquida, aplicação seca, aplicação de pó, aplicação por névoa, aplicação atomizada, aplicação semi-sólida, aplicação em gel, aplicação por revestimento, aplicação de loção, aplicação de material ligado ou ligante, aplicação no rego do arado, aplicação por pulverização, aplicação por irrigação, aplicação por injeção, aplicação por empoamento, peletização, ou revestimento das plantas, sementes de planta, sistema de planta ou meio de plantação com a cepa Trichoderma NRRL B-50520 (K5), opcionalmente um metabólito derivado deste e um ou mais dos mediadores agronômicos.

11. Método de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato de que o contato ocorre em qualquer tempo e em qualquer quantidade suficiente para efetuar o um ou mais atributos de planta benéficos.

12. Método de acordo com a reivindicação 9 caracterizado pelo fato de que a cepa Trichoderma NRRL B-50520 (K5), opcionalmente um metabólito derivado deste e um ou mais dos mediadores agronômicos são aplicados em uma de uma maneira separada, simultânea, ou sequencial.

13. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o um mais metabólitos está presente e compreende pelo menos um de 6-pentil pirona, ácido harziânico, hydtra 1, harzinolida, 1-octeno-3-ol ou misturas dos mesmos.

14. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que os estresses abióticos são selecionados do grupo consistindo de seca, estresse osmótico, salinidade aumentada, salinidade diminuída, alagamento e combinação dos mesmos.

15. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a eficiência fotossintética aumentada aumenta mais sob condições de estresse abiótico comparada com condições não estressadas.

16. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que os patógenos transmitidos pelo solo são selecionados do grupo consistindo de Fusarium spp, Pythium spp, Rhizoctonia solani, e combinações dos mesmos.

17. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o controle de nematoide aumentado compreende um ou mais de: uma inibição da deposição de ovo, uma redução na irritação da raiz, uma redução nos números de nematóides no solo que circunda as raízes das plantas ou uma combinação dos mesmos.

18. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as pragas de inseto são moscas brancas, afídeos ou uma combinação dos mesmos.

19. Composição para controle de praga e doença em plantas caracterizada pelo fato de que compreende; uma emulsão contendo água e um óleo vegetal em razões de 1:1 a 0,5:4 , de 0,5 a 1,25 p/v de lecitina e tensoativo suficiente para formar uma emulsão estável; e adicionado a dita emulsão um ou mais metabólitos microbianos selecionados do grupo consistindo de 6-penti-1 pirona, ácido harziânico, hydtra 1, harzinolida, 1-octeno-3-ol e mistura dos mesmos, e opcionalmente um único agente microbiano consistindo de cepa Trichoderma NRRL B-50520 (K5), em que dita composição pode ser diluída mais do que 100 vezes em água sem separação de fase.

20. Composição de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que compreende ainda estearato de sódio ou outro ácido graxo em uma quantidade de 1 a 3% em peso com base no peso total da composição.

21. Composição de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o óleo vegetal é selecionado de óleo de soja, óleo de milho, óleo de canola, óleo de açafrão e misturas dos mesmos.