BR112020007395A2 - uso do fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos, e, método de tratamento de uma infecção pulmonar por micobactérias não tuberculosas refratária - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a métodos de tratamento de indivíduos que sofrem de uma infecção pulmonar por NTM refratária ao tratamento, por exemplo, a tratamento antibiótico.

Description

USO DO FATOR ESTIMULADOR DE COLÔNIAS DE GRANULÓCITOS E MACRÓFAGOS, E, MÉTODO DE TRATAMENTO DE UMA INFECÇÃO PULMONAR POR MICOBACTÉRIAS NÃO

TUBERCULOSAS REFRATÁRIA Campo técnico

[001] A presente invenção refere-se a métodos de tratamento de indivíduos que sofrem de uma infecção pulmonar por NTM refratária ao tratamento, por exemplo, ao tratamento antibiótico.

Fundamentos

[002] A doença pulmonar devida a micobactérias não tuberculosas (NTM) é um problema crescente nos EUA e na maioria dos países ocidentais. As NTMs causam destruição progressiva do pulmão, resultando em uma variedade de sintomas incluindo tosse, falta de ar e perda de peso.

[003] As NTMs são onipresentes no solo e na água em nosso meio ambiente. Dados por amostragem sugerem que o número de NTM está crescendo, especialmente nas fontes de água, por motivos que não inteiramente claros. Inicialmente destacando-se como uma infecção sistêmica no cenário de doença avançada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), as NTM são agora reconhecidas como uma causa importante de doença pulmonar crônica e, especialmente, Bronquiectasia, em pessoas aparentemente imunocompetentes. A partir da década de noventa, houve um aumento dramático no número de pacientes diagnosticados com doença pulmonar por NTM. Ao longo do mesmo período, NTMs também se tornaram um problema significativo em pacientes com fibrose cística. Refletindo a experiência nos EUA, em Queensland, Austrália, onde NTM é uma doença que requer notificação, a incidência aumentou em 45% entre 1995 e 2005. Esse aumento foi atribuído a 1) melhorias nas técnicas diagnósticas, 2) reconhecimento aumentado por médicos de NTM causadoras de doença, 3) o envelhecimento da população, pois esta é uma doença que ocorre em grupos etários mais velhos e 4) um aumento real na prevalência da doença possivelmente devido à maior exposição ambiental.

[004] As estimativas atuais da prevalência de doença por NTM nos EUA variam de 3 a 7 casos por 100.000 pessoas, com variação considerável entre diferentes regiões. Dado que a frequência da doença aumenta acentuadamente com a idade, a prevalência relatada no grupo acima de 65 anos é -50 por 100.000. Taxas semelhantes de prevalência são relatadas na maioria dos países ocidentais. É provável que essas taxas de prevalência estejam significativamente subestimadas. Coerentemente com o sub- reconhecimento da doença nos EUA, com a notificação compulsória da doença por NTM em Queensland, a prevalência da doença por NTM na população em geral foi 15,1 por 100.000 em 2010.

[005] O tratamento da infecção por NTM é difícil, tipicamente necessitando de pelo menos 3 antibióticos durante, no mínimo, 18 meses. Esse esquema de tratamento é mal tolerado, sendo que até 14 dos pacientes não são capazes de tolerar o tratamento pelo grande número de efeitos colaterais, incluindo náusea, vômitos, diarreia, neuropatia periférica, perda de visão e audição, insuficiência hepática, insuficiência renal e supressão da medula óssea. Naqueles que de fato toleram o tratamento, as melhores taxas de sucesso relatadas são 70-80%, de modo que a taxa global de sucesso da terapia é por volta de 50%. Mesmo naqueles com tratamento antibiótico aparentemente bem-sucedido, quase 50% readquiriram ou a doença reativou no período de 3 anos. Novos métodos de tratamento são necessários.

Sumário

[006] A presente invenção provê um método de tratamento de uma infecção pulmonar por NTM refratária ao tratamento antibiótico em um indivíduo que precisa do mesmo, o qual compreende administrar ao indivíduo, através de administração pulmonar, uma quantidade eficaz do fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) ou de um homólogo funcional do mesmo.

[007] Além disso, é provido um kit de peças que compreende doses unitárias de GM-CSF para um inalador e instruções de uso, para uso em um método de tratamento de uma infecção pulmonar por NTM refratária ao tratamento antibiótico conforme aqui descrito.

Descrição dos desenhos

[008] Figura 1 Macrófagos invadidos por bactérias não tuberculosas, visualizados por coloração rápida com ácido.

Descrição detalhada

[009] A invenção é como definida nas reivindicações.

Definições

[0010] Refratária: no presente contexto, o termo refratária, quando aplicado a uma doença ou infecção por NTM, refere-se a uma doença ou infecção por NTM que é refratária ao tratamento, por exemplo, tratamento por antibióticos. Isso pode dever-se à resistência inerente da NTM a ser tratada, ou pode ser uma consequência do paciente ser intolerante ao tratamento. Em outras palavras, uma doença ou infecção refratária por NTM refere-se a uma doença ou infecção por NTM que é resistente ao tratamento.

Micobactérias não tuberculosas

[0011] As micobactérias são uma família de bacilos pequenos em forma de bastonetes que podem ser classificadas em 3 grupos principais para fins diagnósticos ou de tratamento: - O complexo Mycobacterium tuberculosis que pode causar tuberculoses: M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti e M. canetti;, - M. leprae e M. lepromatosis que causam a hanseníase ou lepra; - Micobactérias não tuberculosas (NTM) que são todas as outras micobactérias que podem causar doença pulmonar assemelhando-se à tuberculose, linfandenite, doença cutânea ou doença disseminada.

[0012] As micobactériass não tuberculosas (NTM), também conhecidas como micobactérias ambientais, micobactérias atípicas e micobactérias outras que não Mycobacterium tuberculosis (MOTT), são micobactérias que não causam tuberculose nem hanseníase. As NTM causam doenças pulmonares que se assemelham à tuberculose. O termo micobacteriose refere-se a qualquer uma dessas enfermidades e normalmente destina-se a excluir tuberculose.

[0013] Descreve-se no presente que a administração de uma quantidade eficaz de GM-CSF ou de um homólogo funcional do mesmo, por administração — intratraqueal, —intrabrônquica ou broncoalveolar, é especialmente útil em aliviar sintomas e/ou tratar indivíduos que sofrem de infecções por micobactérias não tuberculosas (NTM), especialmente aquelas infecções que são causadas por NTM que são refratárias ao tratamento, tal como tratamento antibiótico.

[0014] A classificação de Runyon é normalmente empregada para ordenar as NTM em um dos quatro grupos seguintes:

1. Fotocromógenas, que desenvolvem pigmentos ao serem ou depois de expostas à luz. Os exemplos incluem M. kansasii, M. simiae e M. marinum.

[0015] ii. Escotocromógenas, que se tornam pigmentadas no escuro. Os exemplos incluem M. scrofulaceum e M. szulgai.

[0016] ili. Não cromógenas, que incluem um grupo de patógenos oportunistas prevalentes denominados complexo M. avium (MAC). Outros exemplos são M. ulcerans, M. xenopi, M. malmoense, M. terrae, M. haemophilum e M. genavense.

[0017] iv. Micobactérias de crescimento rápido, incluindo quatro espécies bem reconhecidas não cromogênicas, patogênicas de rápido crescimento: M. chelonae, M. abscessus, M. fortuitum e M. peregrinum.

Outros exemplos raramente causam doença, tais como M. smegmatis e M. Jlavescens.

[0018] Embora mais de 160 espécies de NTM causem doença em seres humanos, as mais comuns nos EUA são M. avium e M. intracellulare e, em algumas regiões, M. kansasii. M. abscessus é também um problema nos EUA, pois é uma infecção muito mais agressiva do que por outras NTM com evoluções piores dos pacientes e requer terapia intravenosa e oral. Apesar de não serem nem de perto tão contagiosas quanto ao M. tuberculosis, as NTM são transmissíveis de humano para humano e, no caso de M. abscessos, essa pode ser a principal via de aquisição.

[0019] No contexto da presente invenção, a NTM pode pertencer a qualquer dos quatro grupos acima. Assim, a NTM que é refratária ao tratamento, tal como tratamento antibiótico, pode ser fotocromógena, escotocromógena, não cromógena ou uma de crescimento rápido.

[0020] Em uma modalidade, a NTM é fotocromógena, tal como Mycobacterium kansasii, Mycobacterium simiae ou Mycobacterium marinum. Em outra modalidade, a NTM é escotocromógena, tal como Mycobacterium scrofulaceum ou Mycobacterium szulgai. Em outra modalidade, a NTM é não cromógena, tal como complexo Mycobacterium avium (MAO), Mycobacterium — ulcerans, “Mycobacterium xenopi,i, Mycobacterium malmoense, Mycobacterium terrae, Mycobacterium haemophilum ou Mycobacterium genavense. Em outra modalidade, a NTM é uma de crescimento rápido, tal como Mycobacterium chelonae, Mycobacterium abscessusó, — Mycobacterium —fortuitiIm Mycobacterium peregrinum, Mycobacterium smegmatis ou M. flavescens. Em modalidades preferidas, a NTM é selecionada a partir do grupo que consiste em M. abscessus, MAC, M. Jortuitum e M. kansasii. Em modalidades ainda mais preferidas, a NTM é M. abscessus ou MAC.

Indivíduos com necessidade de tratamento

[0021] Os métodos aqui descritos são especialmente úteis para tratar infecções por NTM que são refratárias ao tratamento, tal como tratamento antibiótico. Uma infecção por NTM é refratária ao tratamento quando o tratamento não tem efeito e não consegue regredir a infecção, ou quando o indivíduo com a uma infecção não é capaz de tolerar o tratamento. Por exemplo, uma infecção por NTM é refratária ao tratamento antibiótico quando o tratamento antibiótico não tem efeito e não consegue regredir a infecção, ou quando o indivíduo com uma infecção não é capaz de tolerar o tratamento antibiótico.

[0022] Em algumas modalidades, os indivíduos com necessidade de tratamento foram diagnosticados com NTM e já receberam um tratamento, tal qual um tratamento antibiótico, como é conhecido na técnica.

[0023] O técnico no assunto sabe como diagnosticar uma infecção por NTM. As infecções por NTM são, às vezes, diagnosticadas tardiamente porque os sintomas são vagos e nem sempre reconhecidos pelos indivíduos infectados. Os sintomas típicos são perda de peso e fadiga.

[0024] A avaliação mínima de um paciente com suspeita de doença por NTM tipicamente inclui: (1) Uma radiografia de tórax ou, na ausência de cavitação, um exame de tomografia computadorizada de alta resolução (TCAR) do tórax; (2) Três ou quatro amostras de escarro para análise de bacilos ácido-álcool resistentes (BAAR); (3) Exclusão de outros transtornos, tais como tuberculose.

[0025] Embora esses critérios sejam mais adequados para MAC, M. abscessus e M. kansasii, acredita-se, sem estar vinculado por teoria, que eles são igualmente úteis para o diagnósticos de outras doenças por NTM.

[0026] O diagnóstico é tipicamente realizado determinando a carga micobacteriana nos pulmões de um indivíduo, por exemplo, por múltiplas culturas de escarro e a determinação da presença de NTMs, ou pela cultura de

NTM no lavado brônquico ou biópsia do pulmão, ou uma combinação dos mesmos. As culturas de NTM, por exemplo, culturas de escarro ou culturas do lavado broncoalveolar, podem ser coradas utilizando uma coloração que seja específica para NTM. Alternativamente ou além de, pode-se realizar PCR quantitativa para detectar a presença de NTM nas culturas.

[0027] Outras ferramentas podem ser utilizadas quando houver suspeita da presença de uma infecção por NTM. Uma delas é o questionário de qualidade de vida — Bronquiectasia (QOL-B), como descrito em Quittner et al., 2015. O QOL-B é uma medida de resultados relatados pelo paciente que é auto-administrado e, apesar de ter sido desenvolvido para avaliar a função de pacientes com bronquiectasia não por fibrose cística, ele pode ser usado também para avaliar infecções por NTM, as quais frequentemente acompanham a bronquiectasia. O QOL-B inclui 37 itens em 8 escalas (sintomas respiratórios, domínio físico, funcional, emocional, social, vitalidade, percepção de saúde, carga de tratamento). O questionário QOL-B pode ser especialmente útil para avaliar a eficácia de um tratamento, medindo-se a melhoria potencial durante todo o período de tratamento.

[0028] Uma revisão de métodos diagnósticos úteis é provida em Griffith er al., 2007, que também descreve o modo como cultivar NTMs.

[0029] A natureza do tratamento, por exemplo, o tratamento antibiótico, administrado a indivíduos diagnosticados com uma infecção por NTM pode depender da natureza da NTM. Griffith et al., 2007, proveem uma visão geral dos métodos existentes para tratar várias infecções por NTM.

[0030] Os indivíduos que sofrem de infecções pelo MAC podem tipicamente — receber tratamento com macrolídeos, em particular claritromicina, e azalídeos, como azitromicina, e etambutol. Esses podem combinados com fármacos complementares (companion drugs), tals como rifamicina e opcionalmente um aminoglicosídeo injetável. As doses podem variar dependendo da gravidade da doença.

[0031] Indivíduos que sofrem de infecções por M. abscessus podem tipicamente envolver terapia supressora, por exemplo, terapia antibiótica parenteral periódica ou terapia com macrolídeo oral. Etambutol, rifampicina, azitromicina, clofazimina, linezolida, amicacina, cefoxitina, pirazinamida e izoniazida são antibióticos que são comumente usados para tratar tais infecções. Fármacos não antibióticos, tais como lumacaftor/ivacaftor, podem também ser utilizados.

[0032] Indivíduos que sofrem de infecções por M. kansasii podem tipicamente — receber rifampícina, izoniazida, etambutol, etionamida, estreptomicina ou claritromicina ou combinações dos mesmos.

[0033] Os indivíduos que sofrem de uma infecção por NTM que é refratária ao tratamento, tal como tratamento antibiótico, podem, assim, já ter recebido qualquer um dos tratamentos que são conhecidos na técnica, incluindo, entre outros, os tratamentos mencionados acima. Em algumas modalidades, a infecção refratária ao tratamento, tal como tratamento antibiótico, estava presente durante pelo menos três meses, tal como pelo menos quatro meses, tal como pelo menos cinco meses, tal como pelo menos seis meses ou mais, tal como um ano ou mais, tal como dezoito meses ou mais. A infecção é refratária quando nenhuma melhora é observada ao longo do período de tratamento, tal como tratamento antibiótico, por qualquer um dos métodos diagnósticos ou de avaliação conhecidos na técnica, incluindo os métodos aqui descritos.

[0034] O tratamento original, o tratamento antibiótico em particular, pode, em algumas modalidades, ser descontinuado quando o indivíduo começa a receber administração pulmonar de GM-CSF. Em outras modalidades, o tratamento antibiótico em particular, não é descontinuado.

[0035] Qualquer um dos métodos diagnósticos conhecidos na técnica, incluindo os métodos mencionados acima, pode também ser utilizado para avaliar a melhora ao longo do tempo depois que a administração pulmonar de

GM-CSF, por exemplo, por inalação, tiver iniciado.

[0036] Alguns pacientes podem ser propensos a efeitos colaterais ao receberem tratamento, tratamento antibiótico em particular. Os presentes métodos podem também ser utilizados para tratar tais pacientes. Dado que esses pacientes não conseguem tolerar o tratamento, a infeção da qual eles sofrem pode igualmente ser considerada refratária.

[0037] Efeitos colaterais comuns são aqui descritos. Pacientes que recebem etambutol podem desenvolver neurite óptica, isto é, podem perder ou perder parcialmente a capacidade para discriminar as cores vermelho e verde e a acuidade visual. Em tais casos, recomenda-se descontinuar a administração do fármaco imediatamente e monitorar o desenvolvimento de neurite óptica.

[0038] Pacientes que recebem rifampicina e rifabutina podem apresentar descoloração alaranjada de secreções e da urina, bem como o aparecimento de manchas em lentes de contato gelatinosas. Outros efeitos colaterais “incluem distúrbios gastrointestinais (náusea, vômitos), hipersensibilidade (febre, erupção cutânea), hepatite, aumento do metabolismo hepático de inúmeros agentes (por exemplo, pílulas de controle da natalidade, cetoconazol, quinidina, prednisona, hipoglicêmicos orais, digitálicos, metadona, varfarina, claritromicina e inibidores de protease), síndrome gripal, trombocitopenia e/ou insuficiência renal.

[0039] Pacientes que recebem azitromicina e claritromicina pode apresentar distúrbios gastrointestinais (náusea, vômitos, diarreia), perda da audição, ou desenvolver hepatite.

[0040] A administração de claritromicina pode ser seguida por inibição do metabolismo hepático de diversos agentes, incluindo rifabutina e alguns inibidores de protease.

[0041] Inúmeros efeitos colaterais podem também ser causados por outros fármacos comumente usados para terapia ou profilaxia de NTM, como detalhados na Tabela 6 de Griffith er al., 2007. Pacientes que apresentam algum dos ditos efeitos colaterais podem preferir descontinuar o tratamento caso eles se tornem desconfortáveis demais. Para tais pacientes, a inalação de GM-CSF, como aqui descrita, é, assim, igualmente relevante.

GM-CSF

[0042] Os fatores estimuladores de colônias são glicoproteínas que estimulam o crescimento de progenitores hematopoiéticos e reforçam a atividade funcional de células efetoras maduras.

[0043] GM-CSF humano maduro (SEQ ID Nº: 1) é uma proteína monomérica de 127 aminoácidos com diversos sítios potenciais de glicosilação. É gerado a partir de um precursor da pré-proteína com 144 aminoácidos. O grau variável de glicosilação resulta em uma faixa de peso molecular entre 14kDa e 35kDa. GM-CSF não glicosilado e glicosilado mostram atividade similar in vitro. Existem duas variantes conhecidas da sequência de GM-CSF. Em uma modalidade, GM-CSF, como usado no presente, é GM-CSF maduro com uma metionina inicial no N-terminal.

SEQIDNº:1 >spIPO4141/18-144

APARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNE TVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYK

QHCPPTPETSCATQUITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE SEQID Nº: 2 Precursor de GM-CSF. O peptídeo sinal é mostrado em negrito.

>sp|PO4141ICSF2 Fator — estimulador de colônia de granulócitos-macrófagos HUMANO

MWLQSLLLLGTVACSISAPARSPSPSTQPWEHVNAIQE ARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRG SLTKLKGPLTMMASHY KQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVI PFDCWEPVQE

[0044] GM-CSF exerce sua atividade biológica quando se liga a seu receptor. A formação do complexo GM-CSF-receptor trimérico leva à ativação de cascatas de sinalização do complexo.

[0045] Além de sua atividade estimuladora de crescimento hematopoiético e diferenciação, GM-CSF atua especialmente como uma citocina pró-inflamatória. Macrófagos, por exemplo, macrófagos alveolares tipo I e II, e monócitos bem como neutrófilos e eosinófilos tornam-se ativados por GM-CSF, resultando na liberação de outras citocinas e quimiocinas, proteases envolvida na degradação da matriz, expressão aumentada de HLA e maior expressão de moléculas de adesão celular ou receptores para CC- quimiocinas, o que, por sua vez, aumenta a quimiotaxia de células inflamatórias para o tecido inflamado.

[0046] Ao longo das últimas décadas, vários estudos contribuíram significativamente para o entendimento da farmacologia de GM-CSF acerca da ontogenia, manutenção e função dos macrófagos alveolares, homeostase do surfactante pulmonar na superfície alveolar, estabilidade alveolar, função pulmonar e defesa pulmonar do hospedeiro. Por exemplo, GM-CSF pulmonar é necessário para a diferenciação terminal de macrófagos alveolares e a aquisição de inúmeras funções, incluindo a expressão de receptor múltiplo, endocitose e fagocitose não específicas e mediadas por receptor, resposta de citocinas pró-inflamatórias estimulada por patógenos, recrutamento de neutrófilos pulmonares durante a infecção, depuração de bactérias, vírus, micobactérias e outros patógenos, depuração de surfactante. GM-CSF pulmonar é também um dos fatores alveolares endógenos necessários para determinação fenotípica do macrófago alveolar e para determinar o tamanho da população de macrófagos alveolares (via feedback recíproco contínuo). Foi relatado que a administração de rhGM-CSF por inalação a pacientes com aPAP melhora as funções de macrófagos alveolares, relevantes ao mecanismo de ação terapêutico, incluindo a capacidade de depuração do surfactante bem como as funções de defesa do hospedeiro. Além disso, o efeito de GM-CSF foi avaliado em estudos de inalação em modelos animais onde GM-CSF demonstrou reduzir a proteinose alveolar e melhorar a resposta do sistema imune inato no pulmão.

[0047] Existem diversas formas de GM-CSF humano recombinante: molgramostim é o rhGM-CSF produzido em Escherichia coli; sargramostim refere-se ao rhGM-CSF expresso em Saccharomyces cerevisiae; E regramostim refere-se ao rhGM-CSF derivado de células de ovário de hamster chinês (CHO). Por serem produzidos em sistemas eucarióticos, sargramostim e regramostim são glicosilados, enquanto molgramostim não é. Nenhuma diferença significativa entre os efeitos de molgramostim e sargramostim foram identificadas até o momento. Os métodos de tratamento aqui descritos podem, assim, ser baseados na administração pulmonar de qualquer uma das formas acima de GM-CSF, a saber sargramostim, molgramostim e regramostim. Em uma modalidade, GM-CSF é molgramostim.

Homólogos funcionais

[0048] Os métodos de tratamento aqui descritos podem, em algumas modalidades, compreender a administração de um homólogo funcional de GM-CSF.

[0049] Um homólogo funcional de GM-CSF é um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID Nº. 1 e tem uma ou mais funções de GM-CSF, tais como a estimulação do crescimento e diferenciação de células precursoras hematopoiéticas de várias linhagens, incluindo granulócitos, macrófagos, eosinófilos e eritrócitos.

[0050] GM-CSF regula múltiplas funções dos macrófagos alveolares (AM). Foi documentado que a estimulação por GM-CSF de AM realça a resposta seletiva de macrófagos alveolares a materiais ingeridos (ingestants) nocivos, isto é, na estimulação de inflamação durante a fagocitose bacteriana,

materiais ingeridos não nocivos são em geral atenuados, isto é, respostas anti- inflamatórias durante a fagocitose de células apoptóticas. Outras funções de AM são também reforçadas pela estimulação de GM-CSF com subsequente proliferação, diferenciação, acúmulo e ativação. Esses efeitos de GM-CSF também abrangem adesão celular, quimiotaxia melhorada, expressão do receptor Fc, fagocitose mediada por anticorpos e pelo complemento, metabolismo oxidativo, eliminação intracelular de bactérias, fungos, protozoários e vírus, sinalização de citocinas e apresentação de antígenos. Além disso, GM-CSF reforça defeitos na adesão celular de AM, receptores com padrão molecular associado a patógenos, tipo receptores do tipo Toll, e sinalização transmembrana de TLR, absorção e degradação de proteínas do surfactante e de lipídios (Trapnell BC e Whitsett JA. 2002).

[0051] GM-CSF também interige com os receptores de reconhecimento de AM, os assim chamados receptores do tipo toll (TLR). GM-CSF é importante na defesa pulmonar do hospedeiro na pneumonia por sua interação com a participação de TLR na defesa do hospedeiro, reforçando a depuração do microrganismo causador (Chen et al. 2007). O pulmão tem sua própria produção de GM-CSF inato, que é reduzida na pneumonia e hiperóxia, em relação à exposição elevada a O,, como visto em, por exemplo, a pneumonia associada à ventilação mecânica (PAVM) que contribui para o comprometimento da defesa do hospedeiro secundária à apoptose com resposta insatisfatória a infecções. A lesão hiperóxica parece ser neutralizada pela ativação de macrófagos alveolares com GM-CSF (Altemeier et al. 2007 & Baleeiro et al. 2006) com depuração subsequente de P. aeruginosa mediante a expressão da via de sinalização de TLR (Baleeiro et al., 2006).

[0052] Finalmente, GM-CSF produz a conversão in vitro de AM em células dendríticas (DC) imaturas (DC), as quais podem ser amadurecidas adicionalmente com agentes específicos no que se refere a ativar O endereçamento de DC amadurecidas para um receptor especificado ou alvo

(Zobywalski et al. 2007).

[0053] De preferência, a conservação evolutiva entre GM-CSF de diferentes espécies intimamente relacionadas, por exemplo, avaliada pelo alinhamento de sequências, pode ser usada para identificar o grau de pressão evolutiva sobre resíduos individuais. De preferência, as sequências de GM- CSF são comparadas entre espécies em que a função de GM-CSF é conservada, por exemplo, mas não se limitando a mamíferos, incluindo roedores, macacos e gorilas. Resíduos sob alta pressão seletiva mais provavelmente representam aminoácidos essenciais que não podem ser facilmente substituídos do que resíduos que mudam entre espécies. É evidente pelo exposto acima que um número razoável de modificações ou alterações da sequência de GM-CSF humano não interfere com a atividade da molécula de GM-CSF de acordo com a invenção. Tais moléculas de GM-CSF são referidas no presente como equivalentes funcionais do GM-CSF humano, e podem ser assim variantes e fragmentos do GM-CSF humano nativo como descrito abaixo.

[0054] Neste relatório descritivo, a expressão “variante” refere-se a polipeptídeos ou proteínas que são homólogos à proteína básica, a qual é adequadamente GM-CSF humano, mas que diferem da sequência de base da qual são derivados pelo fato de um ou mais aminoácidos dentro da sequência serem substituídos por outros aminoácidos. As substituições de aminoácidos podem ser consideradas “conservadoras” quando um aminoácido é substituído por um aminoácido diferente com propriedades em linhas gerais semelhantes. Substituições não conservadoras são aquelas em que os aminoácidos são substituídos por aminoácidos de um tipo diferente. De um modo geral, menos substituições não conservadoras serão possíveis sem alterar a alterar a atividade biológica do polipeptídeo.

[0055] O técnico no assunto saberá fazer e avaliar substituições “conservadoras” de aminoácidos, pelas quais um aminoácido é substituído por outro com uma ou mais características químicas e/ou físicas compartilhadas. As substituições conservadoras de aminoácido mais provavelmente não afetam a funcionalidade da proteína. Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com características compartilhadas. Uma substituição conservadora de aminoácido é uma substituição de um aminoácido dentro de um grupo predeterminado de aminoácidos por outro aminoácido dentro do mesmo grupo, em que os aminoácidos dentro de grupos predeterminados exibem características semelhantes ou substancialmente semelhantes. Dentro do significado do termo “substituição conservadora de aminoácido”, como aplicado no presente, um aminoácido pode ser substituído por outro dentro de grupos de aminoácidos distinguidos por terem: i) cadeias laterais polares (Asp, Glu, Lys, Arg, His, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr e Cys,) 11) cadeias laterais não polares (Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro e Met) iii) cadeias laterais alifáticas (Gly, Ala Val, Leu, Ile) 1v) cadeias laterais cíclicas (Phe, Tyr, Trp, His, Pro) v) cadeias laterais aromáticas (Phe, Tyr, Trp) vi) cadeias laterais ácidas (Asp, Glu) vii) cadeias laterais básicas (Lys, Arg, His) viii) cadeias laterais com amina (Asn, Gln) ix) cadeias laterais com hidroxila (Ser, Thr) x) cadeias laterais contendo enxofre (Cys, Met) e xi) aminoácidos que são ácidos monoamino-dicarboxílicos ou ácidos monoamino-monocarboxílicos-monoamidocarboxílicos (Asp, Glu, Asn, Gln).

[0056] Um homólogo funcional no âmbito da presente invenção é um polipeptídeo que exibe pelo menos 50% de identidade de sequência com GM- CSF humano, conforme identificado pela SEQ ID Nº. 1, de preferência pelo menos 60%, 70% de identidade de sequência, preferivelmente homólogos funcionais com pelo menos 75% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 80% de identidade de sequência, tal como pelo menos 85% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 90% de identidade de sequência, como pelo menos 91% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 91% de identidade de sequência, como pelo menos 92% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 93% de identidade de sequência, como pelo menos 94% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 95% de identidade de sequência, como pelo menos 96% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 97% de identidade de sequência, como pelo menos 98% de identidade de sequência, por exemplo, 99% de identidade de sequência com a SEQ ID Nº: 1.

[0057] A identidade de sequência pode ser calculada utilizando vários algoritmos bem conhecidos e aplicando várias penalidades diferentes por lacuna (gap). Qualquer algoritmo de alinhamento de sequências, como, entre outros, FASTA, BLAST ou GETSEQ, pode ser utilizado na busca por homólogos e para calcular a identidade de sequência. Além disso, quando adequado, qualquer matriz de substituição comumente conhecida, como, entre outras, as matrizes PAM, BLOSSUM ou PSSM, podem ser aplicadas com o algoritmo de busca. Por exemplo, uma PSSM (matriz de pontuação de posições específicas) pode ser aplicada através do programa PSI-BLAST. Além disso, os alinhamentos de sequência podem ser realizados utilizando um conjunto de penalidades para abertura e extensão de lacunas. Por exemplo, o algoritmo BLAST pode ser utilizado com uma penalidade para abertura de lacuna na faixa de 5-12 e uma penalidade para extensão de lacuna na faixa de 1-2.

[0058] Deste modo, uma variante ou um fragmento da mesma de acordo com a invenção pode compreender, dentro da mesma variante da sequência ou fragmentos da mesma, ou entre diferentes variantes da sequência ou fragmentos da mesma, pelo menos uma substituição, tal como uma pluralidade de substituições introduzidas independentemente uma da outra.

[0059] É evidente pela descrição acima que a mesma variante, ou fragmento da mesma, pode compreender mais de uma substituição conservadora de aminoácido de mais de um grupo de aminoácidos conservadores, conforme definidos acima.

[0060] Além dos vinte aminoácidos padrão e dois aminoácidos especiais, selenocisteína e pirrolisina, existe um grande número de “aminoácidos não padrão” que não estão incorporados em proteínas in vivo. Os exemplos de aminoácidos não padrão incluem a taurina contendo enxofre e os neurotransmissores GABA e dopamina. Outros exemplos são lantionina, ácido 2-aminoisobutírico e desidroalanina. Aminos não padrão adicionais são ornitina e citrulina.

[0061] Aminoácidos não padrão são normalmente formados através de modificações aos aminoácidos padrão. Por exemplo, taurina pode ser formada pela descarboxilação de cisteína, enquanto dopamina é sintetizada a partir de tirosina e hidroxiprolina é produzida por uma modificação pós- traducional de prolina (comum em colágeno).

[0062] Tanto resíduos de aminoácidos padrão como os não padrão aqui descritos podem estar na forma isomérica “D” ou “L”.

[0063] É contemplado que um equivalente funcional de acordo com a invenção pode compreender qualquer aminoácido incluindo aminoácidos não padrão. Em modalidades preferidas, um equivalente funcional compreende somente aminoácidos padrão.

[0064] Os aminoácidos padrão e/ou os que não são padrão podem ser unidos por ligações peptídicas ou por ligações não peptídicas. O termo peptídeo também abrange modificações pós-traducionais introduzidas por reações químicas ou catalisadas por enzimas, conforme conhecidas na técnica.

Tais modificações pós-traducionais podem ser introduzidas antes do particionamento, se desejado. Os aminoácidos, como aqui especificados, estarão preferencialmente na forma estereoisomérica L. Análogos dos aminoácidos podem ser empregados em vez dos 20 aminoácidos naturais. Diversos de tais análogos são conhecidos, incluindo fluorofenilalanina, norleucina, ácido azetidina-2-carboxílico, S-aminoetil-cisteína, 4-metil triptofano e similares.

[0065] Os — equivalentes funcionais podem compreender adicionalmente modificações químicas tais como ubiquitinação, marcação (por exemplo, com radionuclídeos, várias enzimas etc.), peguilação (derivatização com polietilenoglicol) ou por inserção (ou substituição por síntese química) de aminoácidos (aminoácidos), tais como ornitina, que não ocorrem naturalmente em proteínas humanas.

[0066] Além dos compostos peptídicos aqui descritos, compostos estericamente semelhantes podem ser formulados para imitar as porções fundamentais da estrutura peptídica, e tais compostos podem igualmente ser utilizados da mesma maneira que os peptídeos da invenção. Isso pode ser realizado por técnicas de modelamento e desenho químico conhecidas pelos técnicos no assunto. Por exemplo, pode-se empregar esterificação e outras alquilações para modificar a terminação amino de, por exemplo, uma cadeia principal peptídica de di-arginina, para imitar uma estrutura tetrapeptídica. Será entendido que todas as tais construções estericamente semelhantes enquadram-se no âmbito da presente invenção.

[0067] Peptídeos com alquilações N-terminais e esterificações C- terminais são também abrangidos pela presente invenção. Equivalentes funcionais também compreendem conjugados glicosilados e covalentes ou agregativos formados com as mesmas moléculas, incluindo dímeros ou grupamentos químicos não relacionados. Tais equivalentes funcionais são preparados pela ligação de funcionalidades ao grupos que são encontrados no fragmento, incluindo em qualquer ou em ambos, o N- e o C-terminal, por meios conhecidos na técnica.

[0068] O termo “fragmento do mesmo” pode referir-se a qualquer porção da sequência de aminoácidos provida. Os fragmentos podem compreender mais de uma porção retirada da proteína completa, unidos uma à outra. Os fragmentos adequados podem ser mutantes por deleção ou adição. À adição de pelo menos um aminoácido pode ser uma adição preferivelmente de 2 a 250 aminoácidos, tal como de 10 a 20 aminoácidos, por exemplo, de 20 a 30 aminoácidos, tal como de 40 a 50 aminoácidos. Os fragmentos podem incluir pequenas regiões da proteína ou combinações das mesmas.

[0069] Os fragmentos adequados podem ser mutantes por deleção ou adição. A adição ou deleção de pelo menos um aminoácido pode ser uma adição ou deleção preferivelmente de 2 a 250 aminoácidos, tal como de 10 a aminoácidos, por exemplo, de 20 a 30 aminoácidos, tal como de 40 a 50 aminoácidos. A deleção e/ou a adição pode — independentemente uma da outra — ser uma deleção e/ou um adição dentro de uma sequência e/ou no final de uma sequência.

[0070] Os mutantes por deleção compreendem adequadamente pelo menos 20 ou 40 e mais aminoácidos consecutivos, de preferência pelo menos 80 ou 100 aminoácidos consecutivos de comprimento. Assim, tal fragmento pode ser uma sequência mais curta da sequência identificada por SEQ ID Nº: 1, que compreende pelo menos 20 aminoácidos consecutivos, por exemplo, pelo menos 30 aminoácidos consecutivos, tal como pelo menos 40 aminoácidos consecutivos, por exemplo, pelo menos 50 aminoácidos consecutivos, como pelo menos 60 aminoácidos consecutivos, em que o dito mutante por deleção, de preferência possui pelo menos 75% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 80% de identidade de sequência, como pelo menos 85% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 90% de identidade de sequência, como pelo menos 91% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 91% de identidade de sequência, como pelo menos 92% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 93% de identidade de sequência, como pelo menos 94% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 95% de identidade de sequência, como pelo menos 96% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 97% de identidade de sequência, como pelo menos 98% de identidade de sequência, por exemplo, 99% de identidade de sequência com a SEQ ID Nº:

1.

[0071] Prefere-se que os homólogos funcionais de GM-CSF compreendam no máximo 500, mais preferivelmente, no máximo 400, mesmo mais preferivelmente, no máximo 300, ainda mais preferivelmente, no máximo 200, como no máximo 175, por exemplo, no máximo 160, como no máximo 150 aminoácidos, por exemplo, no máximo 144 aminoácidos.

[0072] O termo “fragmento do mesmo” pode referir-se a qualquer porção da sequência de aminoácidos provida. Os fragmentos podem compreender mais de uma porção retirada da proteína completa, unidas uma à outra. As porções compreenderão adequadamente pelo menos 5 e, de preferência, pelo menos 10 aminoácidos consecutivos da sequência básica. Eles podem incluir pequenas regiões da proteína ou combinações das mesmas.

[0073] Existem duas variantes conhecidas do GM-CSF humano; uma substituição T1151 em uma variante e uma substituição I117T na variante 2 (numeração conforme na SEQ ID Nº: 2). Desse modo, em uma modalidade da invenção, os homólogos funcionais de GM-CSF compreendem uma sequência com alta identidade de sequência com a SEQ ID Nº: 1 ou qualquer uma das variantes de splicing.

[0074] Análogos de GM-CSF são, por exemplo, descritos nas Patentes norte-americanas Nº 5.229, ,496, 5.393.870 e 5.391.485, concedidas à Deeley, et al. Tais análogos são também equivalentes funcionais abrangidos pela presente invenção.

Produção recombinante

[0075] A presente invenção refere-se à administração pulmonar do fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) ou de um homólogo funcional do mesmo, independentemente de como preparados, para tratar uma infecção pulmonar por NTM refratária ao tratamento, por exemplo, tratamento antibiótico, em um indivíduo que precisa do mesmo. GM-CSF pode ser produzidos de várias maneiras, tais como a partir do isolamento de, por exemplo, soro humano ou animal ou da expressão em células, como células procarióticas, células de leveduras, células de insetos, células de mamíferos ou em sistemas livres de células.

[0076] Em uma modalidade da invenção, GM-CSF é produzido de modo recombinante por células hospedeiras.

[0077] Assim, em um aspecto da presente invenção, GM-CSF é produzido por células hospedeiras que compreende uma primeira sequência de ácido nucleico codificadora do GM-CSF, operacionalmente associada com um segundo ácido nucleico capaz de direcionar a expressão nas ditas células hospedeiras. A segunda sequência de ácido nucleico pode compreender, assim, ou mesmo consistir em um promotor que direcionará a expressão para a proteína de interesse nas ditas células. O técnico no assunto será prontamente capaz de identificar uma segunda sequência de ácido nucleico útil para o uso em uma dada célula hospedeira.

[0078] O processo de produção de GM-CSF recombinante, em geral, compreende as etapas de: - prover uma célula hospedeira; - preparar uma construção para expressão gênica, compreendendo um primeiro ácido nucleico que codifica GM-CSF, operacionalmente ligado a um segundo ácido nucleico capaz de direcionar a expressão para a dita proteína de interesse na célula hospedeira;

- transformar a célula hospedeira com a construção, - cultivar a célula hospedeira, obtendo, com isso, a expressão de GM-CSF.

[0079] O GM-CSF recombinante assim produzido pode ser isolado por qualquer método convencional, tal como qualquer um dos métodos para isolamento de proteínas descritos abaixo. O técnico no assunto será capaz de identificar etapas adequadas do isolamento de proteínas para purificar GM- CSF.

[0080] Em uma modalidade da invenção, o GM-CSF produzido por recombinação é excretado pelas células hospedeiras. Quando o GM-CSF é excretado, o processo de produção de uma proteína recombinante de interesse pode compreender as etapas seguintes: - prover uma célula hospedeira; - preparar uma construção para expressão gênica, compreendendo um primeiro ácido nucleico que codifica GM-CSF, operacionalmente ligado a um segundo ácido nucleico capaz de direcionar a expressão para a dita proteína de interesse na dita célula hospedeira; - transformar a dita célula hospedeira com a construção, - cultivar a célula hospedeira, obtendo, com isso, a expressão de GM-CSF e a secreção de GM-CSF no meio de cultura.

obtendo, com isso, o meio de cultura compreendendo GM- CSF.

[0081] AÀ composição compreendendo GM-CSF e ácidos nucleicos pode, assim, nessa modalidade da invenção, ser o meio de cultura ou uma composição preparada a partir do meio de cultura.

[0082] Em outra modalidade da invenção, a dita composição é um extrato preparado a partir de animais, partes dos mesmos ou células, ou uma fração isolada de tal extrato.

[0083] Em uma modalidade da invenção, GM-CSF é produzido por recombinação in vitro em células hospedeiras e isolado do lisado celular, extrato celular ou do sobrenadante da cultura de tecido. Em uma modalidade mais preferida, GM-CSF é produzido por células hospedeiras que são modificadas de tal maneira a expressaaeem GM-CSF. Em uma modalidade ainda mais preferida da invenção, as ditas células hospedeiras são transformadas para produzir e excretar GM-CSF. Administração

[0084] Os métodos para administração intratraqueal, intrabrônquica ou broncoalveolar incluem, entre outros, pulverização, lavagem, inalação, flushing ou instilação, utilizando como líquido uma composição fisiologicamente aceitável na qual GM-CSF tenha sido dissolvido. Neste relatório descritivo, os termos “administração intratraqueal, intrabrônquica ou intra-alveolar” incluem todas as formas de uma tal administração pela qual GM-CSF é aplicado na traqueia, nos brônquios ou nos alvéolos, respectivamente, quer pela instilação de uma solução de GM-CSF, pela aplicação de GM-CSF em forma de pó ou deixando que GM-CSF atinja a parte relevante das vias aéreas por inalação de GM-CSF em uma solução ou suspensão em aerossol ou para nebulização ou pó para inalação ou gel, com ou sem estabilizantes outro excipientes adicionados.

[0085] Os métodos para administração intrabrônquica/alveolar incluem, entre outros, lavado broncoalveolar (BAL) de acordo com métodos bem conhecidos pelos técnicos no assunto, usando como líquido do lavado uma composição fisiologicamente aceitável na qual GM-CSF foi dissolvido ou, de fato, por qualquer outra forma eficaz de administração intrabrônquica incluindo o uso de pós para inalação contendo GM-CSF em forma seca, com ou sem excipientes, ou a aplicação direta de GM-CSF, em forma de solução ou suspensão ou de pó durante a broncoscopia. Os métodos para administração intratraqueal incluem, entre outros, lavado traqueal às cegas com uma solução semelhante de GM-CSF dissolvido ou uma suspensão de

GM-CSF, ou a inalação por nebulização de gotículas fluidas contendo GM- CSF dissolvido ou uma suspensão de GM-CSF obtidas pelo uso de qualquer aparelho de nebulização para essa finalidade.

[0086] Em outra modalidade, a administração intratraqueal, intrabrônquica ou intra-alveolar não inclui inalação do produto, mas a instilação ou aplicação de uma solução de GM-CSF ou um pó ou um gel contendo GM-CSF na traqueia ou nas vias aéreas inferiores.

[0087] Outros métodos preferidos de administração podem incluir o uso dos seguintes dispositivos:

1. Nebulizadores pressurizados utilizando uma mistura de ar/oxigênio comprimidos;

2. Nebulizadores ultrassônicos

3. Nebulizadores eletrônicos com microbomba (por exemplo, Nebulizador Profissional Aeroneb)

4. Inalador dosimetrado (MDI)

5. Sistemas de inalação de pó seco (DPI)

6. Nebulizador eletrônico com rede vibratória.

[0088] O aerossol pode ser entregue através de a) máscaras faciais ou b) por sondas endotraqueais em pacientes intubados durante a ventilação mecânica (dispositivos 1, 2, 3 e 6). Os dispositivos 4, 5 e 6 podem também ser usados pelo paciente sem assistência, desde que o paciente seja capaz de auto- ativar o dispositivo ou nebulizador de aerossóis. O termo “inalador” pode referir-se no presente a qualquer um dos dispositivos acima, bem como qualquer dispositivo que permite a liberação via inalação.

[0089] As concentrações preferidas para uma solução compreendendo GM-CSF e/ou homólogos funcionais ou variantes de GM-CSF estão na faixa de 0,1 ug a 10000 ug de ingrediente ativo por mL de solução. As concentrações adequadas estão frequentemente na faixa entre 0,1 ug e 5000 ug por mL de solução, tal como na faixa entre aproximadamente 0,1 ug e

3000 ug por mL de solução e, e especialmente, na faixa entre aproximadamente 0,1 ug e 1000 ug por mL de solução, tal como na faixa entre aproximadamente 0,1 ug e 250 ug por mL de solução. De preferência, GM-CSF é provido por um nebulizador eletrônico com rede vibratória que libera uma solução de GM-CSF em uma faixa entre 100 e 500 ug por mL de solução, tal como entre 150 e 400 ug por mL de solução, tal como entre 200 e 300 ug por mL de solução, tal como aproximadamente 250 ug por mL de solução. Composição farmacêutica

[0090] As composições ou formulações farmacêuticas para uso na presente invenção incluem GM-CSF ou um homólogo funcional do mesmo em combinação com, de preferência dissolvido em um veículo farmaceuticamente aceitável, preferivelmente um veículo ou diluente aquoso, ou transportado até as vias aéreas inferiores como um preparado peguilhado ou um preparado de lipossomas ou nanopartículas, administrado como um aerossol via inalação, ou como um líquido de lavagem administrado por broncoscópio como um broncoalveloar ou como lavagem ou lavado intratraqueal às cegas. Vários veículos aquosos podem ser utilizados, incluindo, entre outros, solução salina 0,9%, solução salina tamponada, tampões fisiologicamente compatíveis e similares. As composições podem ser esterilizadas por técnicas convencionais bem conhecidas pelos entendidos no assunto. As soluções aquosas resultantes podem ser embaladas para uso ou ser filtradas sob condições assépticas e liofilizadas, sendo o preparado liofilizado dissolvido em solução aquosa estéril antes da administração.

[0091] Em uma modalidade, um preparado liofilizado de GM-CSF pode ser pré-embalado, por exemplo, em doses unitárias isoladas. Em uma modalidade ainda mais preferida, a dose unitária isolada é ajustada ao paciente.

[0092] As composições podem conter substâncias auxiliares ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, incluindo, sem limitação, agentes para ajuste do pH e de tamponamento e/ou agentes para ajuste da tonicidade, tais como, por exemplo, acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, etc.

[0093] Uma solução de GM-CSF adequada para nebulização, por exemplo, molgramostim, pode conter um ou mais excipientes, tais como manitol, polietilenoglicol 4000, Recombumin& Prime, fosfato dissódico (anidro), ácido cítrico (monoidratado) e água. Em tais soluções, a atividade biológica específica pode ser aproximadamente 13 x 10º Ul/mg em vários lotes do princípio ativo, tal como um lote do princípio ativo, dois lotes do princípio ativo, três lotes do princípio ativo, quatro lotes do princípio ativo, cinco lotes do princípio ativo, seis lotes do princípio ativo, sete lotes do princípio ativo, oito lotes do princípio ativo, nove lotes do princípio ativo, dez lotes do princípio ativo ou mais. Em algumas modalidades, a atividade biológica específica é entre 1 x 10º UI/mg e 50 x 10º UI/mg, tal como entre 5 x 10º Ul/mg e 40 x 10º UIl/mg, como entre 7,5 x 10º UIl/mg e 30 x 10º Ul/mg, como entre 8 x 10º UI/mg e 25 x 10º UI/mg, como entre 9 x 10º UI/mg e 20 x 10º Ul/mg, como entre 10 x 10º UI/mg e 18 x 10º Ul/mg, como entre 11 x 10º Ul/mg e 16 x 10º Ul/mg, como entre 12 x 10º Ul/mg e 14 x 10º Ul/mg, tal como 13 x 10º Ul/mg.

[0094] As formulações podem conter veículos e excipientes farmaceuticamente —* aceitáveis, incluindo —microesferas, lipossomas, microcápsulas, nanopartículas ou similares. Os lipossomas convencionais são tipicamente compostos por fosfolipídios (neutros ou com carga negativa) e/ou colesterol. Os lipossomas são estruturas vesiculares à base de bicamadas lipídicas envolvendo compartimentos aquosos. Eles podem variar em suas propriedades físico-químicas, tais como tamanho, composição de lipídios, carga superficial e número e fluidez das bicamadas de fosfolipídios. Os lipídios mais frequentemente utilizados para a formação de lipossomas são:

1,2-Dilauroil-sn-Glicero-3-Fosfocolina (DLPC), 1,2-Dimiristoil-sn-Glicero-3- Fosfocolina (DMPC), 1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-Fosfocolina (DPPC), 1,2- Diestearoil-sn-Glicero-3-Fosfocolina — (DSPC), 1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3- Fosfocolina (DOPC), 1,2-Dimiristoil-sn-Glicero-3-Fosfoetanolamina (DMPE), 1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-Fosfoetanolamina — (DPPE), 1,2- Dioleoil-sn-Glicero-3-Fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-Dimiristoil-sn-Glicero- 3-Fosfato (Sal monossódico) (DMPA), 1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-Fosfato (Sal — monossódico) (DPPA), 1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-Fosfato (Sal monossódico) (DOPA), 1,2-Dimiristoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-rac-(1-glicerol)] (Sal sódico) (DMPG), 1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-rac-(1-glicerol)] (Sal sódico) (DPPG), 1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-rac-(1-glicerol)] (Sal sódico) (DOPG), 1,2-Dimiristoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-L-Serina] (Sal sódico) (DMPS), 1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-L-Serina) (Sal sódico) (DPPS), 1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-L-Serina] (Sal sódico) (DOPS), 1,2- Dioleoil-sn-Glicero-3-Fosfoetanolamina-N-(glutaril) (Sal sódico) e 1,1',2,2'- Tetramiristoil Cardiolipina (Sal de amônio). Formulações compostas por DPPC em combinação com outros lipídios ou modificadores de lipossomas são preferidas, por exemplo, em combinação com colesterol e/ou fosfatidilcolina.

[0095] Lipossomas de longa circulação são distinguidos por sua capacidade para extravasar em locais do corpo onde a permeabilidade da parede vascular está aumentada. A maneira mais popular para produzir lipossomas de longa circulação é anexar covalentemente um polímero hidrofílico de polietilenoglicol (PEG) à superfície externa do lipossoma. Alguns dos lipídios preferidos são: 1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3- Fosfoetanolamina-N-[Metoxi(Polietilenoglicol)-2000] (Sal de amônio), 1,2- Dipalmitoil-sn-Glicero-3-Fosfoetanolamina-N-[Metoxi(Polietilenoglicol)- 5000] (Sal de amônio), 1,2-Dioleoil-3-Trimetilamônio-Propano (Sal cloreto) (DOTAP).

[0096] Lipídios possíveis para aplicação em lipossomas são providos pela Avanti, Polar Lipids, Inc, Alabaster, AL. Além disso, a suspensão de lipossomas pode incluir agentes protetores de lipídios que protegem os lipídios contra danos por radicais livres e por peroxidação dos lipídios durante o armazenamento. Extintores (quenchers) lipofílicos de radicais livres, como alfa-tocoferol, e quelantes solúveis em água específicos para ferro, como ferrioxianina, são preferidos.

[0097] Existe disponível uma variedade de métodos para preparação de lipossomas, como descritos em, por exemplo, Szoka et al. (1980), Patentes norte-americanas Nº 4 235.871, 4.501.728 e 4.837.028, todas as quais aqui incorporadas por referência. Outro método produz vesículas multilamelares de tamanhos heterogêneos. Nesse método, os lipídios formadores das vesículas são dissolvidos em um solvente orgânico adequado ou sistema de solventes e seco sob vácuo ou um gás inerte para forma uma película lipídica fina. Se desejado, a película pode voltar a ser dissolvida em um solvente adequado, como butanol terciário, e então liofilizada para formar uma mistura lipídica mais homogênea, a qual é uma forma do tipo pó mais facilmente hidratada. Essa película é revestida com uma solução aquosa do fármaco direcionado e o componente de direcionamento e deixada hidratar, tipicamente ao longo de um período de 15-60 minutos com agitação. À distribuição de tamanho das vesículas multilamelares pode ser desviada para tamanho menores hidratando-se os lipídios sob condições mais vigorosas de agitação ou adicionando detergentes solubilizantes tais como desoxicolato.

[0098] Micelas são formadas por tensoativos (moléculas que contêm uma porção hidrofóbica e um ou mais grupos iônicos ou de outra forma fortemente hidrofílicos) em solução aquosa.

[0099] Tensoativos comuns bem conhecidos pelo técnico no assunto podem ser utilizados nas micelas da presente invenção. Os tensoativos adequados incluem laureato de sódio, oleato de sódio, lauril sulfato de sódio,

éter monododecílico de octaoxietilenoglicol, octoxinol 9 e PLURONIC F-127 (Wyandotte Chemicals Corp.). Os tensoativos preferidos são detergentes não iônicos de polioxietileno e polioxipropileno, compatíveis com injeção IV tais como, TWEEN-80, PLURONIC F-68, n-octil-beta-D-glicopiranosídeo e similares. Além disso, fosfolipídios, como aqueles descritos para uso na produção de lipossomas, podem também ser utilizados para formação de micelas.

[00100] Em alguns casos, será vantajoso incluir um composto que promove a liberação da substância ativa a seu alvo.

Dose

[00101] Por “quantidade eficaz” de GM-CSF, entende-se uma dose, que, quando provida por administração pulmonar, alcança uma concentração nas vias aéreas e/ou parênquima pulmonar do indivíduo que permite o tratamento de uma infecção refratária por NTM. A melhora já é observada depois de uma semana, depois de duas semanas, depois de três semanas, um mês, depois de dois meses, depois de três meses, depois de seis meses, depois de um ano ou depois de dezoito meses ou mais.

[00102] Os preparados são administrados de maneira compatível com a formulação da dose, e em tal quantidade quanto será terapeuticamente eficaz. A quantidade a ser administrada depende do indivíduo a ser tratado, incluindo, por exemplo, o peso e a idade do indivíduo, a doença a ser tratada e o estágio da doença. As faixas de doses adequadas estão normalmente na ordem de diversas centenas de ug do ingrediente ativo por administração com uma faixa preferida entre aproximadamente 100 e 1000 ug por administração. As doses previstas para prover uma quantidade eficaz de GM-CSF compreendem GM-CSF frequentemente na faixa entre 100 e 1000 ug, tal como entre 100 e 900 ug, tal como entre 100 e 800 ug, tal como entre 125 e 700 ug, tal como entre 150 e 600 ug, tal como entre 200 e 400 ug, tal como entre 250 e 350 ug, como 250 ug ou 300 ug providos por administração pulmonar. Em uma modalidade, a administração pulmonar é por inalação. À administração pode ocorrer uma vez ou duas vezes ao dia, de preferência, a administração ocorre uma vez ao dia. A administração pode ocorrer uma vez ou dia vezes por semana, ou a administração pode ocorrer uma vez ou duas vezes diariamente a cada duas semanas.

[00103] Com o uso de formas monoméricas dos compostos, as doses adequadas estão frequentemente na faixa entre 100 e 1000 ug, tal como entre 100 e 900 ug, tal como entre 200 e 800 ug, tal como entre 300 e 700 ug, tal como entre 400 e 600 ug, como 500 ug ao dia, quando baseadas em formas monoméricas tendo uma sequência idêntica à sequência ID Nº: 1; para homólogos funcionais e fragmentos, a dose é calculada tendo por base o peso molecular da forma monomérica contra o peso molecular dos homólogos ou fragmentos.

[00104] GM-CSF pode ser administrado a uma dose entre 100 e 500 ug, tal como entre 125 e 450 ug, tal como entre 150 e 400 ug, tal como entre 175 e 375 ug, tal como entre 200 e 350 ug, tal como entre 225 e 325 ug, tal como entre 250 e 325 ug, tal como entre 275 e 325 ug, como 250 ug ou 300 ng.

[00105] A duração da administração variará tipicamente de 1 dia a aproximadamente 18 meses, tal como de uma semana a aproximadamente 16 meses, tal como de duas semanas a aproximadamente 14 meses, tal como de um mês a aproximadamente 12 meses, tal como de 6 semanas a aproximadamente 10 meses, tal como de 2 meses a aproximadamente 8 meses, tal como de 3 meses a aproximadamente 6 meses, como 3, 4, 5 ou 6 meses. Qualquer uma dessas durações pode ser utilizada com qualquer uma das doses definidas acima. Em alguns casos, pode ser vantajoso continuar a administração por mais 18 meses.

[00106] As frequências adequadas de administração são uma vez ao dia, uma vez a cada dois dias, uma vez a cada três dias, três vezes por semana,

duas vezes por semana ou uma vez por semana. Qualquer uma dessas frequências pode ser utilizada com qualquer uma das doses definidas acima.

[00107] Em algumas modalidades, o GM-CSF é administrado até que o indivíduo não mostre mais sinais de infecções por NTM. GM-CSF pode, assim, ser descontinuado após um ou mais dos seguintes terem sido observados em amostras originárias do indivíduo: - culturas de escarro negativas para NTM,; - coloração negativa para NTM; - PCR quantitativa indicando ausência de NTM em culturas; - culturas do lavado brônquico negativas para NTM; - biópsia pulmonar mostrando ausência de NTM.

Embalagem médica

[00108] Os compostos utilizados na invenção podem ser administrados isoladamente ou em combinação com veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, quer em dose única ou em múltiplas. As formulações podem ser apresentadas convenientemente em forma de dose unitária por métodos conhecidos pelos técnicos no assunto.

[00109] É preferido que os compostos de acordo com a invenção sejam providos em um kit. Tal kit tipicamente contém um composto ativo em formas farmacêuticas para administração. Uma forma farmacêutica contém uma quantidade suficiente de composto ativo tal que um efeito desejado possa ser obtido quando administrada a um indivíduo.

[00110] Assim, é preferido que a embalagem médica compreenda uma quantidade de doses unitárias correspondentes ao esquema posológico relevante. Desse modo, em uma modalidade, a embalagem médica compreende uma composição farmacêutica compreendendo um composto como definido acima, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e veículos, transportadores e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, a dita embalagem compreendendo de 1 a 7 dose unitárias, pelo qual contendo dose unitárias para um ou mais dias, ou de 7 a 28 dose unitárias, ou múltiplos dos mesmos, pelo qual contendo dose unitárias para uma semana de administração ou diversas semanas de administração.

[00111] As dose unitárias podem ser como definidas acima. À embalagem médica pode estar em qualquer forma adequada para administração intratraqueal, intrabrônquica ou intra-alveolar. Em uma modalidade preferida, a embalagem está na forma de um frasco-ampola, ampola, tubo, embalagem Blister, cartucho ou cápsula.

[00112] Quando a embalagem médica compreende mais de uma dose unitária, prefere-se que a embalagem médica disponha de um mecanismo para ajustar cada administração para uma dose unitária somente.

[00113] De preferência, um kit contém instruções indicando o uso da forma farmacêutica para alcançar um efeito desejável e a quantidade de forma farmacêutica a ser tomada ao longo de um período especificado de tempo. Desse modo, em uma modalidade, a embalagem médica compreende instruções para administração da composição farmacêutica.

[00114] Em algumas modalidades, um preparado de GM-CSF liofilizado pode ser pré-embalado, por exemplo, em doses unitárias isoladas. Em uma modalidade ainda mais preferida, a dose unitária isolada é ajustada para o paciente.

[00115] Em algumas modalidades, a dose unitária de GM-CSF é provida como uma solução em um frasco-ampola de vidro, o qual é adequado para uso com um nebulizador, tal como um nebulizador elétrico com rede vibratória. Diversos frascos-ampolas de vidro podem ser reunidos em um recipiente. Um volume adequado da solução contida em um frasco-ampola de vidro é 1,2 mL.

Exemplos Exemplo 1 - Estudo A: GM-CSF por inalação além de terapia antibiótica em pacientes refratários à terapia atual.

Critérios de inclusão:

[00116] Pacientes que continuaram a apresentar NTM na cultura de escarro apesar de 6 meses de terapia antibiótica padrão (3 fármacos) e continuarão em terapia antibiótica.

[00117] Caso 1: Paciente do sexo feminino de 65 anos de idade com história de bronquiectasia por 6 anos, complicada por múltiplas infecções, incluindo por Mycobacterium intracellulare e M. abscessus. Sua doença é distinguida por sintomas pulmonares, achados cavitários e nodulares na radiografia de tórax e bronquiectasia multifocal no exame de TCAR. Quinze meses antes da inclusão no estudo, foi diagnosticada com M. intracellulare e recebeu tratamento com os antibióticos etambutol e rifampicina e, 10 meses mais tarde, foi adicionada azitromicina. Ao ser incluída no estudo, ela começou o tratamento diário com 300 ug de GM-CSF (molgramostim) por inalação, além do tratamento triplo-combinado antimicobacteriano em andamento.

[00118] Na triagem, o esfregaço de escarro era positivo 1+ para bacilos ácido-álcool resistente (BAAR) e a cultura descreveu crescimento de M. intracellulare. No basal, o esfregaço de escarro mostrou BAAR ocasional, mas o isolado não consegui crescer em cultura.

[00119] Após 4, 8, 12 e 16 e 20 semanas de tratamento, o esfregaço de escarro foi negativo. Não houve crescimento de NTM depois de 4, 8 e 12 semanas; as culturas da 16º e 20º semana estão em processamento.

[00120] Após 12 semanas de tratamento, a paciente relatou melhora no cansaço de 5 para 1 em uma Escala Visual Analógica (EVA) de 10 cm, a qual foi mantida por 16 semanas.

Exemplo 2 - Estudo B;: GM-CSF em monoterapia por inalação em pacientes com doença refratária por NTM resistente à terapia antibiótica Critérios de inclusão:

[00121] Pacientes que continuaram a apresentar NTM na cultura de escarro apesar de pelo menos 6 meses de terapia antibiótica padrão (3 fármacos) nos últimos 3 anos e que não desejam, ou seus médicos reiniciar a terapia antibiótica.

[00122] Caso 2: Paciente do sexo feminino de 10 anos de idade apresentou história de colonização persistente de M. abscessus de 3,5 anos. O indivíduo era homozigoto para a mutação AF508 no gene CTFR (regulador da condutância transmembrana na fibrose cística), conhecido por ser responsável por fibrose cística.

[00123] Infiltrados nodulares e declínio clínico motivaram o tratamento antibiótico (amicacina e cefoxitina intravenosas e linezolida oral) por 2 anos. Cefoxitina foi descontinuada depois de 1 mês devido à erupção cutânea, apesar de ser tentada dessensibilização de cefoxitina. Ototoxicidade devida à amicacina foi observada depois de 4 meses; a amicacina intravenosa foi então substituída por amicacina em aerossol. Apesar da terapia com linezolida (1.v.) e amicacina (inalação), a função pulmonar e a massa corporal declinaram, e amostras do lavado broncoalveolar (BAL) voltaram a ser positivas para muitos organismos e crescimento intenso de M. absessus. O organismo exibiu sensibilidade intermediária à amicacina e cefoxitina, enquanto sensível à linezolida.

[00124] GM-CSF em aerossol (Sargramostimy Genenzyme, Cambridge, MA, 250 ug, duas vezes ao dia, diluído em 2 cm? de solução salina) foi adicionado e administrado em semanas alternadas através de um nebulizador. Houve melhora clínica bem como diminuição em opacidades radiológicas dentro de áreas de extensa bronquiectasia varicoide e cística. Foram observadas melhora clínica e estabilidade. GM-CSF foi continuado e os antibióticos foram descontinuados depois de 3 meses. Após permanecer sem antibióticos por 3 meses, tomou-se uma decisão para recombinar GM- CSF em aerossol com linezolida (i.v.) e amicacina (inalação). Depois de 4 meses de terapia combinada, o esfregado e as culturas para bacilos ácido-

álcool resistentes (BAAR) tornaram-se negativos. A paciente permanece em terapia com GM-CSF por inalação apenas.

[Caso (ao [EM-ESF EvF VEF, aso (nº) Duração da terapia (semanas) (prevista) (prevista) La BS E ago

[00125] Tabela 1. GM-CSF: fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos. CVF: capacidade vital forçada. VEF;: volume expiratório forçado no primeiro segundo. BAL: lavado broncoalveolar. BAAR: bacilo ácido-álcool resistente...

[00126] Caso 3: Paciente do sexo masculino de 25 anos de idade, homozigoto para AF5SO8 com diabetes mellitus relacionada à fibrose cística apresentou uma história de 13 anos de M. abscessos persistente. Novos infiltrados nodulares no exame radiológico, perda de peso e queda na função pulmonar foram observados apesar do uso contínuo de lumacaftor/ivacaftor. O esfregaço para BAAR mostrou muitos organismos.

[00127] A administração de GM-CSF em aerossol, 250 ug duas vezes ao dia a cada duas semanas (uma semana sim/uma semana não) foi iniciada sem terapia antibiótica. Melhora clínica foi notada, sem observação de toxicidade. Após 6 meses de GM-CSF, os esfregaços de escarro tornaram-se negativos e a carga na cultura diminuiu para | colônia por placa. Subsequentemente, a carga na cultura ficou negativa.

á Duração da terapia (semanas) (prevista) prevista) La a o ss2 = Lo Ba og Lol 2 | 86 [| 6&o ||

[00128] Tabela 2. GM-CSF: fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos. CVF: capacidade vital forçada. VEF;: volume expiratório forçado no primeiro segundo. BAL: lavado broncoalveolar. BAAR: bacilo ácido-álcool resistente.

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Generation of clinical grade dendritic cells with capacity to produce biologically active IL-12p70. J Transl Med.

Abril de 2007 12;5:18

Claims (31)

REIVINDICAÇÕES

1. Uso do fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) em um método de tratamento de uma infecção pulmonar por NTM refratária a um tratamento, tal como um tratamento antibiótico em um indivíduo que precisa do mesmo, o dito método caracterizado pelo fato de que compreende administrar, ao indivíduo, via administração pulmonar, o fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF).

2. Uso de GM-CSF de acordo com a reivindicação |, caracterizado pelo fato de que GM-CSF é administrado a uma dose entre 100 e 1000 ug, tal como entre 100 e 900 ug, tal como entre 100 e 800 ug, tal como entre 125 e 700 ug, tal como entre 150 e 600 ug, tal como entre 200 e 400 ug, tal como entre 250 e 350 ug, tal como 250 ug ou 300 ug.

3. Uso de GM-CSF de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que GM-CSF é administrado uma vez ao dia, uma vez a cada dois dias, uma vez a cada três dias, três vezes por semana, duas vezes por semana ou uma vez por semana.

4. Uso de GM-CSF de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a NTM é um fotocromógena, tal como Mycobacterium kansasii, Mycobacterium simiae ou Mycobacterium marinum;, um escotocromógena tal como Mycobacterium scrofulaceum ou Mycobacterium szulgai, um não cromógena tal como o complexo Mycobacterium avium (MAC), Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium malmoense, Mycobacterium terrae, Mycobacterium haemophilum ou Mycobacterium genavense; ou uma de rápido crescimento como Mycobacterium chelonae, Mycobacterium abscessusó, — Mycobacterium —fortuitim» Mycobacterium peregrinum, Mycobacterium smegmatis ou M. flavescens.

5. Uso de GM-CSF de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a NTM é selecionada a partir do grupo que consiste em MAC, M. abscessus, M. fortuitum e M. kansasii.

6. Uso de GM-CSF de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que GM-CSF é administrado por via intratraqueal, intrabrônquica ou intra-alveolar.

7. Uso de GM-CSF de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é administrado, ao indivíduo, GM-CSF em solução ou suspensão para nebulização.

8. Uso de GM-CSF de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é administrado, ao indivíduo, GM-CSF em aerossol para nebulização ou uma forma em pó para inalação.

9. Uso de GM-CSF de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.

10. Uso de GM-CSF de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o indivíduo sofreu anteriormente de pelo menos uma infeção por NTM.

11. Uso de GM-CSF de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a dita infecção pulmonar por NTM é refratária ao tratamento com um antibiótico, opcionalmente em combinação com rifamicina ou um aminoglicosídeo injetável.

12. Uso de GM-CSF de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o antibiótico é selecionado dentre um macrolídeo e um azalídeo, tal como azitromicina, rifampina, izoniazida, etambutol, etionamida, estreptomicina ou claritromicina, ou combinações dos mesmos.

13. Uso de GM-CSF de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o antibiótico é selecionado dentre etambutol, rifampiícina, azitromicina, clofazimina, linezolida, amicacina, cefoxitina, pirazinamida e izoniazida.

14. Uso de GM-CSF de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o indivíduo foi diagnosticado, conforme medido por múltiplas culturas de NTM no escarro, opcionalmente seguido por coloração de NTM e PCR quantitativa, ou cultura de NTM no lavado brônquico ou por uma biópsia de pulmão.

15. Uso de GM-CSF de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a dita infecção pulmonar por NTM recebeu um tratamento, tal como um tratamento antibiótico durante pelo menos um mês, e o indivíduo ainda apresenta NTM em seu escarro, tal como durante pelo menos dois meses, por exemplo, pelo menos três meses, tal como pelo menos quatro meses, por exemplo, pelo menos cinco meses, tal como pelo menos seis meses.

16. Uso de GM-CSF de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o dito tratamento, tal como tratamento antibiótico, é continuado junto com a terapia com GM-CSF.

17. Uso de GM-CSF de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que GM-CSF é administrado ao indivíduo até que as culturas de NTM no escarro e/ou a coloração de NTM e/ou a PCR quantitativa e/ou a cultura de NTM no lavado brônquico e/ou uma biópsia do pulmão mostre que o indivíduo não sofre mais de uma infecção por NTM.

18. Método de tratamento de uma infecção pulmonar por micobactérias não tuberculosas (NTM) refratária a um tratamento, tal como um tratamento antibiótico, em um indivíduo que precisa do mesmo, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende administrar ao indivíduo, via administração pulmonar, uma quantidade eficaz do fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF).

19. Método de tratamento de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que GM-CSF é administrado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.

20. Método de tratamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que a NTM é como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.

21. Método de tratamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizado pelo fato de que uma quantidade eficaz de GM-CSF é administrada por via intratraqueal, intrabrônquica ou intra- alveolar.

22. Método de tratamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, caracterizado pelo fato de ser administrado, ao indivíduo, GM-CSF em solução ou suspensão para nebulização.

23. Método de tratamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, caracterizado pelo fato de ser administrado, ao indivíduo, GM-CSF em aerossol para nebulização ou uma forma em pó para inalação.

24. Método de tratamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 23, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.

25. Método de tratamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 24, caracterizado pelo fato de que o indivíduo sofreu anteriormente de pelo menos uma infeção por NTM.

26. Método de tratamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 25, caracterizado pelo fato de que a dita infecção pulmonar por NTM é refratária ao tratamento com um antibiótico, opcionalmente em combinação com rifamicina ou um aminoglicosídeo injetável.

27. Método de tratamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 26, caracterizado pelo fato de que o antibiótico é selecionado dentre um macrolídeo e um azalídeo, tal como azitromicina, rifampina, izoniaziday etambutol, etionamida, estreptomicina ou claritromicina, ou combinações dos mesmos.

28. Método de tratamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 27, caracterizado pelo fato de que o antibiótico é selecionado dentre etambutol, rifampicina, azitromicina, clofazimina, linezolida, amicacina, cefoxitina, pirazinamida e izoniazida.

29. Método de tratamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 28, caracterizado pelo fato de que o indivíduo foi diagnosticado, conforme medido por múltiplas culturas de NTM no escarro, opcionalmente, seguido por coloração de NTM e PCR quantitativa, ou cultura de NTM no lavado brônquico, por uma biópsia de pulmão.

30. Método de tratamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 29, caracterizado pelo fato de que a dita infecção pulmonar por NTM recebeu um tratamento, tal como um tratamento antibiótico, durante pelo menos um mês e o indivíduo ainda apresenta NTM em seu escarro, tal como pelo menos dois meses, por exemplo, pelo menos três meses, tal como pelo menos quatro meses, por exemplo, pelo menos cinco meses, tal como pelo menos seis meses.

31. Método de tratamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 30, caracterizado pelo fato de que o dito tratamento, tal como tratamento antibiótico, é continuado junto com a terapia com GM-CSF.