BR112020006484A2 - método implementado por computador, aparelho, mídia de armazenamento não transitório, programa de computador e kit para inferir a atividade de uma via de sinalização celular notch em um indivíduo, kit para medir níveis de expressão de cinco ou mais genes-alvo da via de sinalização celular notch em uma amostra de um indivíduo e uso do kit - Google Patents

método implementado por computador, aparelho, mídia de armazenamento não transitório, programa de computador e kit para inferir a atividade de uma via de sinalização celular notch em um indivíduo, kit para medir níveis de expressão de cinco ou mais genes-alvo da via de sinalização celular notch em uma amostra de um indivíduo e uso do kit Download PDF

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Laurentius Henricus Franciscus Maria Holtzer
Wilhelmus Franciscus Johannes Verhaegh
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Abstract

A presente invenção se refere a um método implementado por computador para inferir a atividade de uma via de sinalização celular Notch em um indivíduo com base em níveis de expressão de três ou mais genes-alvo da via de sinalização celular Notch medidos em uma amostra do indivíduo. A presente invenção se refere adicionalmente a um aparelho, a uma mídia de armazenamento não transitório e a um programa de computador para inferir a atividade de uma via de sinalização celular Notch em um indivíduo. A presente invenção se refere ainda a um kit para medir níveis de expressão de três ou mais genes-alvo da via de sinalização celular Notch em uma amostra de um indivíduo, a um kit para inferir a atividade de uma via de sinalização celular Notch em um indivíduo e ao uso de tais kits na execução do método.

Description

MÉTODO IMPLEMENTADO POR COMPUTADOR, APARELHO, MÍDIA DE ARMAZENAMENTO NÃO TRANSITÓRIO, PROGRAMA DE COMPUTADOR E KIT PARA INFERIR A ATIVIDADE DE UMA VIA DE SINALIZAÇÃO CELULAR NOTCH EM UM INDIVÍDUO, KIT PARA MEDIR NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE CINCO OU MAIS GENES-ALVO DA VIA DE SINALIZAÇÃO CELULAR NOTCH EM UMA
AMOSTRA DE UM INDIVÍDUO E USO DO KIT Campo da invenção
[001] A presente invenção se refere, de modo geral, ao campo de bioinformática, processamento genômico, processamento proteômico e técnicas relacionadas. Mais particularmente, a presente invenção se refere a um método implementado por computador para inferir a atividade de uma via de sinalização celular Notch em um indivíduo, sendo o método executado por um dispositivo de processamento digital, e sendo que à inferência é baseada em níveis de expressão de cinco ou mais genes-alvo da via de sinalização celular Notch medidos em uma amostra do indivíduo. A presente invenção se refere adicionalmente a um aparelho para inferir a atividade de uma via de sinalização celular Notch em um indivíduo, o aparelho compreendendo um processador digital configurado para executar o método; a uma mídia de armazenamento não transitório para inferir a atividade de uma via de sinalização celular Notch em um indivíduo, a mídia armazenando instruções que são executáveis por um dispositivo de processamento digital para executar o método; e a um programa de computador para inferir a atividade de uma via de sinalização celular Notch em um indivíduo, o programa compreendendo meios de código de programa para fazer com que um dispositivo de processamento digital execute o método quando o programa de computador for executado no dispositivo de processamento digital. A presente invenção se refere ainda a um kit para medir os níveis de expressão de cinco ou mais genes-alvo da via de sinalização celular Notch em uma amostra de um indivíduo, a um kit para inferir a atividade de uma via de sinalização celular Notch em um indivíduo e a usos dos kits na execução do método.
Antecedentes da invenção
[002] As análises genômicas e proteômicas têm promessas realizadas e potenciais para aplicação clínica em campos médicos como oncologia, onde vários tipos de câncer são conhecidos por estarem associados a combinações específicas de mutações/variações genômicas, e/ou níveis altos ou baixos de expressão para genes específicos, os quais exercem um papel no crescimento e na evolução de câncer, por exemplo, na proliferação celular e na metástase.
[003] Notch é um fator de transcrição induzível que regula a expressão de muitos genes envolvidos no desenvolvimento embrionário, na resposta imunológica e no câncer. No que se refere a distúrbios patológicos, como câncer (por exemplo, câncer de mama ou de ovário), a atividade anormal da via de sinalização celular Notch desempenha uma função importante (vide Aster J.C. et al., “The varied roles of Notch in cancer”, Annual Review of Pathology, Vol. 12, nº 1, dezembro de 2016, páginas 245 a 275). A via de sinalização celular Notch consiste em um receptor de proteína da família Notch e uma família de ligantes (fixados nas células) (família DSL) que induzem a clivagem do receptor ligado, sobre o qual o fragmento intracelular clivado se move até o núcleo, onde ele forma, juntamente com outras proteínas, um complexo de fator de transcrição ativo que liga e faz a transativação de um conjunto bem definido de genes-alvo (vide também a Figura l, que se baseia em Guruharsha K.G. et al., “The Notch signaling system: recent insights into the complexity of a conserved pathway”, Nature Reviews Genetics, Vol. 13, setembro de 2012, páginas 654 a 666).
[004] Em relação à sinalização da via Notch em, por exemplo, câncer, é importante que se tenha a capacidade de detectar uma atividade anormal de sinalização da via Notch para permitir a escolha certa da terapia dirigida com fármacos. Terapias anti-Notch estão sendo desenvolvidas (vide Espinoza IT. e Miele L., “Notch inhibitors for cancer treatment”, Pharmacology & Therapeutics, Vol. 139, nº 2, agosto de 2013, páginas 95 a 110). Entretanto, no momento não há ensaio clínico disponível para avaliar o estado funcional ou atividade da via de sinalização celular Notch, que em seu estado ativo indica que ela é, por exemplo, mais propensa a ser uma promotora tumoral em comparação com seu estado passivo. Portanto, é desejável ter a capacidade de aperfeiçoar as possibilidades de caracterização de pacientes portadores de uma doença, como câncer, por exemplo, câncer de mama, do colo do útero, do endométrio, de ovário, pancreático ou de próstata, ou um distúrbio imunológico que é, ao menos parcialmente, desencadeada por uma atividade anormal da via de sinalização celular Notch, e que sejam, portanto, propensos a responder a inibidores da via de sinalização celular Notch.
Sumário da invenção
[005] De acordo com um aspecto principal da presente invenção, o problema acima é resolvido por meio de um método implementado por computador para inferir a atividade de uma via de sinalização celular Notch em um indivíduo, o método sendo executado por um dispositivo de processamento digital, e em que a inferência compreende:
[006] receber níveis de expressão de cinco ou mais, por exemplo seis, sete, oito, nove, dez, onze ou mais genes-alvo da via de sinalização celular Notch medidos em uma amostra do indivíduo,
[007] determinar um nível de atividade de um elemento de fator de transcrição (TF) da via Notch na amostra do indivíduo, em que o elemento de TF da via Notch controla a transcrição dos cinco ou mais genes-alvo da via Notch, sendo que a determinação tem por base a avaliação de um modelo de via de sinalização matemático calibrado que relaciona os níveis de expressão dos cinco ou mais genes-alvo da via Notch ao nível de atividade do elemento de TF da via Notch, e
[008] inferir a atividade da via de sinalização celular Notch no indivíduo com base no nível de atividade determinado do elemento de TF da via Notch na amostra do indivíduo,
[009] sendo que os cinco ou mais genes-alvo da via Notch são selecionados do grupo que consiste em: DTX1, EPHB3, HES1, HES4, HES5, HEY2, MYC, NFKB2, NRARP, PINl, PLXND1, and SOX9 sendo que dois ou mais, por exemplo, três, quatro, cinco, seis ou mais, genes-alvo da via Notch são selecionados do grupo que consiste em: DTX1, HESl, HES4, HES5, HEY2, MYC e NRARP, e três ou mais, por exemplo, quatro ou mais, genes- alvo da via Notch são selecionados do grupo que consiste em: EPHB3, NFKB2, PINl, PLXND1 e SOX9.
[010] No presente documento, o “nível de atividade” de um elemento de TF denota o nível de atividade do elemento de TF em relação à transcrição de seus genes-alvo.
[011] A presente invenção tem por base a inovação dos inventores de que um modo adequado de identificar efeitos que ocorrem na via de sinalização celular Notch pode ser baseado em uma medição da saída de sinalização da via de sinalização celular Notch, que é - entre outras coisas - a transcrição dos genes-alvo, a qual é controlada por um fator de transcrição (TF) da via Notch, que é controlado pela via de sinalização celular Notch. Essa inovação pelos inventores presume que o nível de atividade de TF esteja em um estado quase estacionário na amostra, que pode ser detectado por meio - entre outras coisas - dos valores de expressão dos genes- alvo da via Notch. A via de sinalização celular Notch dirigida aqui revelada é conhecida por controlar muitas funções em muitos tipos de célula em seres humanos, como proliferação, diferenciação e cura de ferimentos. No que se refere à distúrbios patológicos, como câncer (por exemplo, de mama, do colo do útero, do endométrio, de ovário, pancreático ou de próstata), a atividade anormal da sinalização celular Notch desempenha um papel importante, que é detectável nos perfis de expressão dos genes-alvo e, dessa forma, explorada por meio de um modelo de via de sinalização matemático calibrado.
[012] A presente invenção possibilita determinar a atividade da via de sinalização celular Notch em um indivíduo mediante (1) a determinação de um nível de atividade de um elemento de TF da via Notch na amostra do indivíduo, em que a determinação tem por base a avaliação de um modelo matemático calibrado que relaciona os níveis de expressão de cinco ou mais genes-alvo da via de sinalização celular Notch, cuja transcrição é controlada pelo elemento de TF da via Notch, ao nível de atividade do elemento de TF da via Notch, e (ii) a inferência da atividade da via de sinalização celular Notch no indivíduo com base no nível de atividade determinado do elemento de TF da via Notch na amostra do indivíduo. Isso permite, de preferência, aperfeiçoar as possibilidades de caracterização de pacientes portadores de uma doença, como câncer, por exemplo, câncer de mama, do colo do útero, do endométrio, de ovário, pancreático ou de próstata que é, ao menos parcialmente, desencadeado por uma atividade anormal da via de sinalização celular Notch, e que são, portanto, propensos a responder a inibidores da via de sinalização celular Notch. Em modalidades particulares, a determinação do tratamento pode ser com base em uma atividade de via de sinalização celular Notch específica. Em uma modalidade particular, o estado da sinalização celular Notch pode ser ajustado a um valor de corte de probabilidades de a via de sinalização celular Notch ser ativa de, por exemplo, 10:1, 5:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4, 1:5 ou 1:10.
[013] Para uso na presente invenção, o termo “elemento de fator de transcrição Notch” ou “elemento de TF da via Notch” ou “elemento de TF” é definido para ser um complexo de proteínas contendo pelo menos um domínio intracelular de uma das proteínas Notch (Notchl, Notch2, Notch3 e Notch4, com os correspondentes domínios intracelulares N1ICD, N2ICD, N3ICD e N4ICD), com um cofator, como o fator de transcrição de ligação de DNA CSL (CBF1/RBP-JKx, Su(H) e LAG-l), que é capaz de se ligar a sequências de DNA específicas, e, de preferência, uma proteína coativadora da família de proteínas similares a Mastermind (MAML) (MAMLl1, MAML2 e MAML3), que é necessária para ativar a transcrição, controlando assim a transcrição de genes-alvo. De preferência, o termo se refere a um fator transcricional de proteína ou complexo de proteínas acionado pela clivagem de uma das proteínas Notch (Notchl, Notch2, Notch3 e Notch4) resultando em um domínio intracelular Notch (N1ICD, N2ICD, N3ICD e N41ICD). Por exemplo, sabe-se que os ligantes DSL (DLL1, DLL3, DLL4, Jaggedl e Jagged2) expressados em células vizinhas, se ligam ao domínio extracelular da proteína/receptor Notch, iniciando a via de sinalização Notch intracelular e que o domínio intracelular Notch participa na cascata de sinalização Notch que controla a expressão.
[014] O modelo de via de sinalização matemático calibrado pode ser um modelo probabilístico, de preferência, um modelo de rede bayesiana, baseado em probabilidades condicionais que relacionam o nível de atividade do elemento de TF da via Notch e os níveis de expressão dos cinco ou mais genes-alvo da via Notch, ou o modelo de via de sinalização matemático pode ser baseado em uma ou mais combinações lineares dos níveis de expressão dos cinco ou mais genes-alvo da via Notch. Em particular, a inferência da atividade da via de sinalização celular Notch pode ser realizada conforme revelado no pedido de patente internacional publicado WO 2013/011479 A2 (“Assessment of cellular signaling pathway activity using probabilistic modeling of target gene expression”), ou conforme descrito no pedido de patente internacional publicado WO 2014/102668 A2 (“Assessment of cellular signaling pathway activity using linear combination(s) of target gene expressions”), cujo conteúdo está aqui incorporado em sua totalidade a título de referência. Detalhes adicionais sobre a inferência de atividade de via de sinalização celular com o uso de modelagem matemática da expressão de genes-alvo podem ser encontrados em Verhaegh W. et al., “Selection of personalized patient therapy through the use of knowledge-based computational models that identify tumor- driving signal transduction pathways”, Cancer Research, Vol. 74, nº 11, 2014, páginas 2936 a 2945.
[015] O termo “indivíduo”, como usado aqui, se refere a qualquer ser vivo. Em algumas modalidades, oO indivíduo é um animal, de preferência um mamífero. Em certas modalidades, o indivíduo é um ser humano, de preferência um paciente. Em ainda outras modalidades, o indivíduo é uma linhagem celular.
[016] O termo “gene-alvo”, como usado aqui, significa um gene cuja transcrição é controlada direta ou indiretamente por um elemento de fator de transcrição Notch. O “gene-alvo” pode ser um “gene-alvo direto” e/ou um “gene- alvo indireto” (conforme aqui descrito). Além disso, os “genes-alvo” podem ser “genes-alvo diretos” e/ou “genes-alvo indiretos” (conforme aqui descrito).
[017] Os genes-alvo da via Notch particularmente adequados são descritos nos parágrafos a seguir, bem como nos exemplos abaixo (vide, por exemplo, as Tabelas 1 a 3 abaixo).
[018] Dessa forma, de acordo com uma modalidade preferencial, os genes-alvo da via Notch são selecionados do grupo que consiste nos genes-alvo da via Notch mostrados na Tabela 1, na Tabela 2 ou na Tabela 3 abaixo.
[019] Os presentes inventores descobriram que os genes-alvo da via Notch nas listas sucessivamente mais restritas se tornam cada vez mais probatórios para a determinação da atividade da via de sinalização celular Notch.
[020] Outro aspecto da presente invenção se refere a um método (conforme aqui descrito) que compreende, ainda:
[021] determinar se a via de sinalização celular Notch opera de modo irregular no indivíduo, com base na atividade inferida da via de sinalização celular Notch no indivíduo.
[022] A presente invenção se refere, também, a um método (conforme aqui descrito) que compreende, adicionalmente:
[023] recomendar a prescrição, ao paciente, de um medicamento que corrige a operação anormal da via de sinalização celular Notch,
[024] sendo que a recomendação é feita se for determinado que a via de sinalização celular Notch está funcionando de forma anormal com base na atividade inferida da via de sinalização celular Notch.
[025] A expressão “a via de sinalização celular opera de forma anormal” se refere ao caso em que a “atividade” da via não é a esperada, sendo que o termo “atividade” pode se referir à atividade do complexo de fator de transcrição na condução dos genes-alvo para expressão, isto é, a velocidade na qual os genes-alvo são transcritos. “Normal” pode ser quando está inativo no tecido no qual espera-se que esteja inativo e ativo no qual espera-se que esteja ativo. Além disso, pode haver um certo nível de atividade que é considerado “normal”, e qualquer um acima ou abaixo pode ser considerado “anormal”.
[026] A presente invenção se refere também a um método (conforme descrito aqui), em que o funcionamento anormal da via de sinalização celular Notch é uma operação na qual a via de sinalização celular Notch funciona como um promotor de tumor no indivíduo.
[027] A amostra (ou amostras) a ser usada de acordo com a presente invenção pode ser uma amostra extraída, isto é, uma amostra que foi extraída do indivíduo.
Exemplos da dita amostra incluem, mas não se limitam a, um tecido, células, sangue e/ou um fluido corpóreo de um indivíduo.
Se o indivíduo for um paciente que tem ou pode ter câncer, por exemplo, a amostra pode ser uma amostra obtida de uma lesão causada por câncer, ou de uma lesão suspeita de ter sido causada por câncer, ou de um tumor metastático, ou de uma cavidade corporal na qual há presença de fluido contaminado com células cancerosas (por exemplo, cavidade pleural ou abdominal ou cavidade da bexiga), ou de outros fluidos corpóreos contendo células de câncer, e assim por diante, de preferência, através de um procedimento de biópsia ou outro procedimento de extração de amostra.
As células das quais uma amostra é extraída também podem ser células tumorais de malignidades hematológicas (como leucemia ou linfoma). Em alguns casos, a amostra de células pode ser também de células tumorais circulantes, ou seja, células tumorais que entraram na corrente sanguínea e podem ser extraídas com o uso de técnicas adequadas de isolamento, por exemplo, aférese ou coleta de sangue venoso convencional.
Com exceção do sangue, um fluido corpóreo do qual uma amostra é extraída pode ser urina, conteúdo gastrointestinal, ou um extravasamento.
O termo “amostra”, para uso na presente invenção, abrange também o caso em que um tecido e/ou células e/ou um fluido corpóreo do indivíduo foram retirados do indivíduo e, por exemplo, colocados em uma lâmina para microscópio, e o caso em que, para executar o método reivindicado, uma porção dessa amostra é extraída, por exemplo, por meio de microdissecção e captura a laser (LCM) ou remoção por raspagem das células de interesse da lâmina, ou por técnicas de separação de células ativadas por fluorescência. Além disso, o termo “amostra”, como usado aqui, abrange também o caso em que, por exemplo, um tecido e/ou células e/ou um fluido corpóreo do indivíduo tenham sido extraídos do mesmo e colocados em uma lâmina para microscópio, e o método reivindicado executado sobre a lâmina. Além disso, o termo “amostra”, como usado aqui, abrange também o caso em que. por exemplo, uma linhagem celular e/ou cultura celular foi gerada com base nas células/tecido/fluido corpóreo que foram obtidos do indivíduo.
[028] De acordo com um outro aspecto revelado, um aparelho para inferir a atividade de uma via de sinalização celular Notch em um indivíduo compreende um processador digital configurado para executar o método da presente invenção, conforme aqui descrito.
[029] De acordo com um outro aspecto revelado, uma mídia de armazenamento não transitório para inferir a atividade de uma via de sinalização celular Notch em um indivíduo armazena instruções que são executáveis por um dispositivo de processamento digital para executar o método da presente invenção, conforme aqui descrito. A mídia de armazenamento não transitório pode ser uma mídia de armazenamento legível por computador, como um disco rígido ou outra mídia de armazenamento magnético, um disco óptico ou outra mídia de armazenamento óptico, uma memória de acesso aleatório (RAM), memória somente de leitura (ROM), memória flash ou outra mídia de armazenamento eletrônico, um servidor de rede, e assim por diante. O dispositivo de processamento digital pode ser um dispositivo portátil (por exemplo, um assistente de dados pessoal ou um telefone inteligente), um computador do tipo notebook, um computador do tipo desktop, um computador ou dispositivo do tipo tablet, um servidor de rede remoto, e assim por diante.
[030] De acordo com um outro aspecto revelado, um programa de computador para inferir a atividade de uma via de sinalização celular Notch em um indivíduo compreende meios de código de programa para fazer com que um dispositivo de processamento digital execute o método da presente invenção, conforme aqui descrito, quando o programa de computador for executado no dispositivo de processamento digital. o dispositivo de processamento digital pode ser um dispositivo portátil (por exemplo, um assistente de dados pessoal ou um telefone inteligente), um computador do tipo notebook, um computador do tipo desktop, um computador ou dispositivo do tipo tablet, um servidor de rede remoto, e assim por diante.
[031] De acordo com um outro aspecto revelado, um kit para medir níveis de expressão de cinco ou mais, por exemplo seis, sete, oito, nove, dez, onze ou mais genes-alvo da via de sinalização celular Notch em uma amostra do indivíduo compreende:
[032] um ou mais componentes para determinar os níveis de expressão de cinco ou mais genes-alvo da via Notch na amostra do indivíduo,
[033] sendo que os cinco ou mais genes-alvo da via Notch são selecionados do grupo que consiste em: DTX1, EPHB3, HES1, HES4, HES5, HEY2, MYC, NFKB2, NRARP, PINl, PLXND1 e SOX9, sendo que dois ou mais, por exemplo, três, quatro, cinco, seis ou mais, genes-alvo da via Notch são selecionados do grupo que consiste em: DTX1, HES1, HES4, HES5, HEY2, MYC e NRARP e três ou mais, por exemplo quatro ou mais, genes-alvo da via Notch são selecionados do grupo que consiste em: EPHB3, NFKB2, PINl, PLXND1 e SOX9.
[034] O um ou mais componentes ou meios para medir os níveis de expressão dos cinco ou mais genes-alvo da via Notch podem ser selecionados do grupo que consiste em: uma micromatriz de DNA, uma micromatriz de oligonucleotídeo, uma micromatriz de proteína, um anticorpo, uma pluralidade de sondas, por exemplo, sondas “marcadas, um conjunto de componentes de sequenciamento de transcriptase reversa de RNA, e/ou iniciadores de amplificação de RNA ou DNA, incluindo cDNA. Em uma modalidade, o kit inclui um conjunto de sondas marcadas direcionadas a uma porção de uma sequência de mRNA ou de cDNA dos cinco ou mais genes-alvo da via Notch conforme aqui descrito. Em uma modalidade, o kit inclui um conjunto de iniciadores e sondas direcionados a uma porção de uma sequência de mRNA ou de cDNA dos cinco ou mais genes-alvo da via Notch. Em uma modalidade, as sondas marcadas são contidas em uma microplaca padronizada de 96 poços (também chamados de “vasos”, “células” ou “celas”). Em uma modalidade, o kit inclui adicionalmente iniciadores ou sondas direcionados a um conjunto de genes de referência. Tais genes de referência podem ser, por exemplo, genes expressados constitutivamente que são úteis para normalizar ou padronizar níveis de expressão dos níveis de expressão de genes-alvo aqui descritos.
[035] Em uma modalidade, o kit para medir os níveis de expressão de cinco ou mais, por exemplo seis, sete, oito, nove, dez, onze ou mais genes-alvo da via de sinalização celular Notch em uma amostra do indivíduo compreende:
[036] iniciadores da reação em cadeia da polimerase direcionados aos cinco ou mais genes-alvo da via Notch,
[037] sondas direcionadas aos cinco ou mais genes- alvo da via Notch,
[038] sendo que os cinco ou mais genes-alvo da via Notch são selecionados do grupo que consiste em: DTX1, EPHB3, HES1, HES4, HES5, HEY2, MYC, NFKB2, NRARP, PINl, PLXND1 e SOX9, sendo que dois ou mais, por exemplo três, quatro, cinco, seis ou mais, genes-alvo da via Notch são selecionados do grupo que consiste em: DTX1, HESl, HES4, HES5, HEY2, MYC e NRARP e três ou mais, por exemplo quatro ou mais, genes-alvo da via Notch são selecionados do grupo que consiste em: EPHB3, NFKB2, PINl, PLXND1 e SOX9.
[039] De acordo com um outro aspecto revelado, um kit para inferir a atividade de uma via de sinalização celular Notch em um indivíduo compreende:
[040] o kit da presente invenção conforme aqui descrito, e
[041] o aparelho da presente invenção conforme aqui descrito, a mídia de armazenamento não transitório da presente invenção conforme aqui descrito, ou o programa de computador da presente invenção conforme aqui descrito.
[042] De acordo com um outro aspecto revelado, os kits da presente invenção conforme aqui descrito são usados na execução do método da presente invenção conforme aqui descrito.
[043] A presente invenção, conforme aqui descrita, pode, por exemplo, também ser usada vantajosamente em ao menos uma das seguintes atividades:
[044] diagnóstico com base na atividade inferida da via de sinalização celular Notch no indivíduo;
[045] prognóstico com base na atividade inferida da via de sinalização celular Notch no indivíduo;
[046] prescrição de medicamento com base na atividade inferida da via de sinalização celular Notch no indivíduo;
[047] previsão de eficácia do medicamento com base na atividade inferida da via de sinalização celular Notch no indivíduo;
[048] previsão de efeitos adversos com base na atividade inferida da via de sinalização celular Notch no indivíduo;
[049] monitoramento de eficácia do medicamento;
[050] desenvolvimento do medicamento;
[051] desenvolvimento do ensaio;
[052] pesquisa de via;
[053] estadiamento de câncer;
[054] inscrição do indivíduo em um teste clínico com base na atividade inferida da via de sinalização celular Notch no indivíduo;
[055] seleção de teste subsequente a ser realizado; e
[056] seleção de testes de diagnóstico complementar.
[057] As vantagens adicionais se tornarão evidentes para os versados na técnica mediante a leitura e entendimento das figuras anexas, da descrição a seguir e, em particular, mediante a leitura de alguns exemplos detalhados fornecidos mais adiante neste documento.
[058] Será entendido que o método da reivindicação 1, o aparelho da reivindicação 9, a mídia de armazenamento não transitório da reivindicação 10, o programa de computador da reivindicação 11, os kits das reivindicações 12 a 14 e o uso dos kits da reivindicação 15 têm modalidades preferenciais similares e/ou idênticas, em particular conforme definido nas reivindicações dependentes.
[059] Deve-se compreender que uma modalidade preferencial da presente invenção também pode ser qualquer combinação das reivindicações dependentes ou das modalidades acima com a respectiva reivindicação independente.
[060] Esses e outros aspectos da invenção ficarão evidentes e serão elucidados com referência às modalidades descritas a seguir.
[061] Breve descrição dos desenhos
[062] A Figura 1 mostra de forma esquemática e exemplificadora a via de sinalização celular Notch. A via de sinalização é ativada quando o domínio extracelular Notch se liga a um ligante DSL. Após a clivagem do receptor, o domínio intracelular Notch se move para o núcleo e forma, juntamente com outras proteínas, um complexo de fator de transcrição ativo (vide Guruharsha K.G. et al., “The Notch signaling system: recent insights into the complexity of a conserved pathway” Nature Reviews Genetics, Vol. 13, setembro de 2012, páginas 654 a 666; “TS” = “interruptor” transcricional; “TG” = genes-alvo).
[063] A Figura 2 mostra de forma esquemática e exemplificadora um modelo matemático, na presente invenção um modelo de rede bayesiana, usado para modelar o programa transcricional da via de sinalização celular Notch.
[064] A Figura 3 mostra um fluxograma que ilustra de forma exemplificadora um processo para inferir a atividade da via de sinalização celular Notch em um indivíduo, com base nos níveis de expressão de genes-alvo da via de sinalização celular Notch medidos em uma amostra de um indivíduo.
[065] A Figura 4 mostra um fluxograma que ilustra de forma exemplificadora um processo para obter um modelo de via de sinalização matemático calibrado conforme aqui descrito.
[066] A Figura 5 mostra um fluxograma que ilustra de forma exemplificadora um processo para determinar um nível de atividade de um elemento de fator de transcrição (TF) da via Notch em uma amostra de um indivíduo, conforme aqui descrito.
[067] A Figura 6 mostra um fluxograma que ilustra de forma exemplificadora um processo para inferir a atividade de uma via de sinalização celular Notch em um indivíduo, com o uso de parâmetros detectáveis discretizados.
[068] A Figura 7 mostra um fluxograma que ilustra de forma exemplificadora um processo para inferir a atividade de uma via de sinalização celular Notch em um indivíduo, com o uso de parâmetros detectáveis contínuos.
[069] A Figura 8 mostra um fluxograma que ilustra de forma exemplificadora um processo para determinar valores Cq a partir da análise RT-qPCR dos genes-alvo da via de sinalização celular Notch.
[070] A Figura 9 mostra os resultados de calibração do modelo de rede bayesiana com base na lista restrita de 18 genes-alvo da Tabela 2 e nos métodos aqui descritos com o uso de conjuntos de dados de expressão publicamente disponíveis de 11 amostras normais de ovário (grupo 1) e 20 amostras de câncer de ovário seroso papilar de alto grau (grupo 2) (subconjunto de amostras obtido dos conjuntos de dados GSE2109, GSE9891, GSE7307, GSE18520, GSE29450, GSE36668).
[071] A Figura 10 mostra os resultados de calibração do modelo de rede bayesiana com base na lista organizada de evidências de genes-alvo (lista de 26 genes- alvo) da Tabela 1 e nos métodos aqui descritos com o uso de conjuntos de dados de expressão publicamente disponíveis de 11 amostras normais de ovário (grupo 1) e 20 amostras de câncer de ovário seroso papilar de alto grau (grupo 2) (subconjunto de amostras obtido dos conjuntos de dados GSE2109, GSE9891, GSE7307, GSE18520, GSE29450, GSE36668).
[072] A Figura 11 mostra previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista restrita de 18 genes-alvo da Tabela 2 em três culturas independentes da linhagem celular MOLT4 do conjunto de dados GSE6495.
[073] A Figura 12 mostra previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista organizada de evidências de genes-alvo (lista de 26 genes-alvo) da Tabela 2 em três culturas independentes da linhagem celular MOLT4 do conjunto de dados GSE6495.
[074] A Figura 13 mostra previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista restrita de 18 genes-alvo da Tabela 2 em células IMR32 que foram transfectadas com um construto intracelular Notch3 induzível.
[075] A Figura 14 mostra previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista restrita de 18 genes-alvo da Tabela 2 em HPCs CD34+CD45RA-Lin que foram cultivadas durante 72 horas com doses graduadas de ligante Notch plástico imobilizado Deltalext-IgG (conjunto de dados GSE29524).
[076] A Figura 15 mostra previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista restrita de 18 genes- alvo da Tabela 2 em células CUTLL1, que são conhecidas por ter alta atividade da via Notch.
[077] A Figura 16 mostra previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista organizada de evidências de genes-alvo (lista de 26 genes- alvo) da Tabela 1 em células CUTLL1, que são conhecidas por ter alta atividade da via Notch.
[078] A Figura 17 mostra previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista restrita de 18 genes-alvo da Tabela 2 em células HUVEC que foram transfectadas com siRNA COUP-TFII (conjunto de dados GSE33301).
[079] A Figura 18 mostra previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista restrita de 18 genes-alvo da Tabela 2 em subgrupos de câncer de mama em amostras dos conjuntos de dados GSE6532, GSE9195, GSE1l2276, GSEZ20685, GSE21653 e EMTAB365.
[080] A Figura 19 mostra previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista restrita de 12 genes-alvo da Tabela 3 em HPCs CD34+CD45RA-Lin que foram cultivadas durante 72 horas com doses graduadas de ligante Notch plástico imobilizado Deltalext-IgG (conjunto de dados GSE29524).
[081] A Figura 20 mostra previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista restrita de 12 genes- alvo da Tabela 3 em células CUTLL1, que são conhecidas por ter alta atividade da via Notch.
[082] A Figura 21 mostra a correlação entre o modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista organizada de evidências de genes-alvo (26 genes- alvo) da Tabela 1 e a lista restrita de 12 genes-alvo da Tabela 3, respectivamente.
[083] A Figura 22 mostra uma comparação das previsões de via de sinalização celular Notch entre a lista de 7 genes-alvo da via Notch e a lista de 10 genes-alvo da via Notch.
[084] A Figura 23 mostra uma comparação das previsões de via de sinalização celular Notch entre a lista de 8 genes-alvo da via Notch e a lista de 12 genes-alvo da via Notch.
[085] A Figura 24 mostra os resultados da calibração do modelo bayesiana com base na lista de 10 genes- alvo de camundongo da Tabela 6 e dos métodos aqui descritos com o uso do conjunto de dados de expressão publicamente disponíveis GSE1l5268 contendo 2 células-tronco embrionárias
(ESc) de controle, 2 células progenitoras mesodermais (MPc) de controle, 2 amostras de ESc contendo um construto NERT induzível de tamoxifeno (NotchIC), não tratadas com OHT, 2 amostras ESc contendo um construto NERT induzível de tamoxifeno (NotchIC), tratadas com OHT, 4 amostras de MPc contendo um construto NERT induzível de tamoxifeno (NotchIC), não tratadas com OHT e 4 amostras de MPc contendo um construto NERT induzível de tamoxifeno (NotchIC), tratadas com OHT.
[086] A Figura 25 mostra previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista de 10 genes-alvo de camundongo da Tabela 6 nas glândulas mamárias de camundongo com um domínio intracelular Notch1 (NICD1) induzível constitutivamente ativo (conjunto de dados GSE51628).
[087] A Figura 26 mostra previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista de 10 genes-alvo de camundongo da Tabela 6 em tecido de saco vitelino de camundongo com um sistema transgênico condicional para ativar Notchl e tecido de saco vitelino de camundongo obtido de camundongo transgênico com perda de função de RBPJ (parte do complexo de fator de transcrição Notch) (conjunto de dados GSE22418).
[088] A Figura 27 mostra previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista de 10 genes-alvo de camundongo da Tabela 6 em células da medula óssea de camundongo (progenitoras mielo eritroide adultas) com um ganho condicional de função de alelo do receptor Notch2 (conjunto de dados GSE46724).
[089] Descrição detalhada das modalidades
[090] Os seguintes exemplos ilustram meramente métodos particularmente preferenciais e aspectos selecionados em conjunto com os mesmos. A instrução fornecida em tais exemplos pode ser usada para construir vários testes e/ou kits, por exemplo, para detectar, prever e/ou diagnosticar a atividade anormal da via de sinalização celular Notch. Além disso, com o uso de métodos conforme descrito na presente invenção, a prescrição de medicamento pode ser vantajosamente dirigida, a previsão da resposta do medicamento e o monitoramento da eficácia do medicamento (e/ou efeitos adversos) podem ser feitos, a resistência a medicamentos pode ser prevista e monitorada, por exemplo, para selecionar um teste (ou testes) subsequente a ser realizado (como um teste de diagnóstico complementar). Os seguintes exemplos não devem ser interpretados como uma limitação ao escopo da presente invenção.
[091] Exemplo 1: Construção de modelo matemático
[092] Conforme descrito com detalhes no pedido de patente internacional publicado WO 2013/011479 A2 (“Assessment of cellular signaling pathway activity using probabilistic modeling of target gene expression”), mediante a construção de um modelo probabilístico, por exemplo, um modelo de rede bayesiana, e a incorporação de relações probabilísticas condicionais entre níveis de expressão de cinco ou mais genes-alvo de uma via de sinalização celular, na presente invenção a via de sinalização celular Notch, e o nível de um elemento de fator de transcrição (TF), na presente invenção o elemento de TF da via Notch, em que o elemento de TF controla a transcrição dos cinco ou mais genes-alvo da via de sinalização celular, tal modelo pode ser usado para determinar a atividade da via de sinalização celular com um alto grau de exatidão. Além disso, o modelo probabilístico pode ser prontamente atualizado para incorporar conhecimento adicional obtido por estudos clínicos mais recentes, ajustando as probabilidades condicionais e/ou incluindo novos nós ao modelo para representar fontes de informações adicionais. Desse modo, o modelo probabilístico pode ser atualizado conforme for adequado para incorporar o conhecimento médico mais recente.
[093] Em outra abordagem de fácil compreensão e interpretação, descrita com detalhes no pedido de patente internacional publicado WO 2014/102668 A2 (“Assessment of cellular signaling pathway activity using linear combination(s) of target gene expressions”), a atividade de uma via de sinalização celular, na presente invenção a via de sinalização celular Notch, pode ser determinada mediante a construção e avaliação de um modelo linear ou pseudolinear que incorpora as relações entre os níveis de expressão de cinco ou mais genes-alvo da via de sinalização celular e o nível de um elemento de fator de transcrição (TF), na presente invenção o elemento de TF da via Notch, em que o elemento de TF controla a transcrição dos cinco ou mais genes-alvo da via de sinalização celular, e em que o modelo tem por base uma ou mais combinações lineares de níveis de expressão dos cinco ou mais genes-alvo.
[094] Em ambas as abordagens, os níveis de expressão dos cinco ou mais genes-alvo podem, de preferência, ser medições do nível de mRNA, as quais podem ser o resultado, por exemplo, de técnicas de (RT)-PCR e micromatriz com o uso de sondas associadas às sequências de mRNA dos genes-alvo, e de sequenciamento de RNA. Em outra modalidade, os níveis de expressão dos cinco ou mais genes-alvo podem ser medidos por meio dos níveis de proteína, por exemplo, as concentrações e/ou atividade da proteína (ou proteínas) codificada pelo gene-alvo (ou genes-alvo).
[095] Os níveis de expressão supracitados podem ser, opcionalmente, convertidos de muitos modos que podem ou não se adequar melhor à aplicação. Por exemplo, quatro transformações diferentes dos níveis de expressão, por exemplo, níveis de mRNA baseados em micromatriz, podem ser: - “dados contínuos”, isto é, níveis de expressão conforme obtidos após o pré-processamento de micromatrizes com o uso de algoritmos bem conhecidos, como MAS5.0 e fRMA, - “escore 2”, isto é, níveis de expressão contínuos em escala, de modo que a média ao longo de todas as amostras seja O e o desvio padrão seja 1, - “discreta”, isto é, toda expressão acima de um certo limiar está definida em 1 e, abaixo disso, em O (por exemplo, o limiar para um conjunto de sondas pode ser escolhido como a mediana (ponderada) de seu valor em um conjunto de várias amostras clínicas positivas e do mesmo número de amostras clínicas negativas), - “difusa”, isto é, os níveis de expressão contínuos são convertidos em valores entre 0 e 1 com o uso de uma função sigmoide do seguinte formato: 1 / (1 + exp((thr - expr) / se)), sendo expr os níveis de expressão contínuos, thr o limiar conforme mencionado anteriormente e se um parâmetro de suavização influenciando a diferença entre 0 e 1.
[096] Um dos modelos lineares mais simples que podem ser construídos é um modelo que tem um nó representando o elemento de fator de transcrição (TF), na presente invenção o elemento de TF da via Notch, em uma primeira camada, e nós ponderados representando medições diretas dos níveis de expressão de gene-alvo, por exemplo, por um conjunto de sondas que tem correlação particularmente alta com o gene-alvo específico, por exemplo, em experimentos de micromatriz ou (q) PCR, em uma segunda camada.
Os pesos podem ser baseados em cálculos a partir de um conjunto de dados de treinamento ou baseados em conhecimento especializado.
Essa abordagem de uso, no caso em que possivelmente múltiplos níveis de expressão são medidos por gene-alvo (por exemplo, no caso de experimentos de micromatriz, em que um gene-alvo pode ser medido com múltiplos conjuntos de sondas), apenas um nível de expressão por gene-alvo é preferencial devido ao fato de que é particularmente simples.
Um modo específico de selecionar o nível de expressão que é usado para um gene-alvo particular é usar o nível de expressão a partir do conjunto de sondas que tem a capacidade de melhor separar amostras ativas e passivas de um conjunto de dados de treinamento.
Um método para determinar esse conjunto de sondas é executar um teste estatístico, por exemplo, o teste t, e selecionar o conjunto de sondas com o valor p mais baixo.
Os níveis de expressão do conjunto de dados de treinamento de conjunto de sondas com o valor p mais baixo é, por definição, o conjunto de sondas com a menor probabilidade de os níveis de expressão das amostras ativas e passivas (conhecidas) se sobreporem.
Um outro método de seleção tem por base razões de probabilidades.
Em tal modelo, um ou mais níveis de expressão são fornecidos para cada um dos cinco ou mais genes-alvo e a uma ou mais combinações lineares compreendem uma combinação linear incluindo, para cada um dos cinco ou mais genes-alvo, um termo ponderado, sendo que cada termo ponderado se baseia em apenas um nível de expressão do um ou mais níveis de expressão fornecidos para o respectivo gene-alvo. Se apenas um nível de expressão for escolhido por gene-alvo conforme descrito acima, o modelo poderá ser chamado de modelo de “conjuntos de sondas mais discriminantes”.
[097] Em uma alternativa ao modelo de “conjuntos de sondas mais discriminantes”, é possível, no caso em que, possivelmente, múltiplos níveis de expressão são medidos por gene-alvo, para fazer uso de todos os níveis de expressão que são fornecidos por gene-alvo. Em tal modelo, um ou mais níveis de expressão são fornecidos para cada um dos cinco ou mais genes-alvo, e a uma ou mais combinações lineares compreendem uma combinação linear de todos os níveis de expressão do um ou mais níveis de expressão fornecidos para os cinco ou mais genes-alvo. Em outras palavras, para cada um dos cinco ou mais genes-alvo, cada um do um ou mais níveis de expressão fornecidos para o respectivo gene-alvo pode ser ponderado na combinação linear por seu próprio peso (individual). Essa variante pode ser chamada de um modelo de “todos os conjuntos de sondas”. Isso tem uma vantagem de ser relativamente simples, ao mesmo tempo em que faz uso de todos os níveis de expressão fornecidos.
[098] Ambos os modelos, conforme descrito acima, têm em comum o fato de poderem ser considerados modelos “de camada única”, nos quais o nível de atividade do elemento de TF é calculado com base em uma combinação linear de níveis de expressão do um ou mais conjuntos de sonda dos cinco ou mais genes-alvo.
[099] Depois de o nível de atividade do elemento de TF, na presente invenção o elemento de TF da via Notch, ter sido determinado mediante a avaliação do respectivo modelo, o nível de atividade de elemento de TF determinado pode ser submetido a um limiar a fim de se inferir a atividade da via de sinalização celular, na presente invenção a via de sinalização celular Notch. Um método preferencial para calcular esse limiar adequado consiste na comparação dos níveis de atividade do elemento de TF determinados wlc (combinação linear ponderada) entre as amostras de treinamento conhecidas por terem uma via de sinalização celular passiva e as amostras de treinamento com uma via de sinalização celular ativa. Um método que faz isso e também considera a variância nesses grupos é dado por meio do uso de um limiar mr = Iwlepas Bwltezcr T IwtezceMwlepas o Iwlepas F Iwlesor
[100] em que o e py são o desvio padrão e a média dos níveis de atividade de elemento de TF determinados wlc para as amostras de treinamento. Em caso de ser disponibilizado apenas um pequeno número de amostras nas amostras de treinamento ativas e/ou passivas, uma pseudocontagem pode ser adicionada às variâncias calculadas com base na média das variâncias dos dois grupos: = Vwleace + Vwlepas 2 ua = E 0a Dime (2) x+Naee=1 2 XS+ Gras N)UVwicpas Vwlepas xt nas=1
[101] em que v é a variância dos níveis de atividade de elemento de TF determinados wlc dos grupos, x é uma pseudocontagem positiva, por exemplo, 1 ou 10, e nact E nNpas são o número de amostras ativas e passivas, respectivamente. O desvio padrão o pode, então, ser obtido mediante o cálculo da raiz quadrada da variância v.
[102] O limiar pode ser subtraído do dos níveis de atividade de elemento de TF determinados wlc para facilitar a interpretação, resultando em um escore de atividade da via de sinalização celular em que tais valores negativos correspondem a uma via de sinalização celular passiva e os valores positivos correspondem a uma via de sinalização celular ativa.
[103] Como uma alternativa aos modelos “de camada única” acima descritos, um modelo “de duas camadas” também pode ser usado em um exemplo. Nesse tipo de modelo, é calculado um valor de resumo para cada gene-alvo, mediante o uso de uma combinação linear baseada nas intensidades medidas de seus conjuntos de sondas associados (“primeira camada (inferior)”). O valor de resumo calculado é subsequentemente combinado aos valores de resumo dos outros genes-alvo da via de sinalização celular, mediante o uso de uma combinação linear adicional (“segunda camada (superior)”). Novamente, os pesos podem ser aprendidos a partir de um conjunto de dados de treinamento, ou ser baseados em conhecimento especializado, ou uma combinação dos mesmos. Dito de outra forma, no modelo de “duas camadas”, um ou mais níveis de expressão são fornecidos para cada um dos cinco ou mais genes-alvo, e a uma ou mais combinações lineares compreendem, para cada um dos cinco ou mais genes-alvo, uma primeira combinação linear de todos os níveis de expressão do um ou mais níveis de expressão fornecidos para o respectivo gene-alvo (“primeira camada (camada inferior)”). O modelo é baseado também em uma combinação linear adicional que inclui para cada um dos cinco ou mais genes-alvo um termo ponderado, sendo cada termo ponderado baseado na primeira combinação linear para o respectivo gene-alvo (“segunda camada (camada superior)”).
[104] O cálculo dos valores de resumo pode, em uma versão preferencial do modelo de “duas camadas”, incluir a definição de um limiar para cada gene-alvo com o uso dos dados de treinamento e mediante a subtração do limiar da combinação linear calculada, proporcionando o resumo do gene- alvo. Aqui, o limiar pode ser escolhido de modo que um nível de resumo de gene negativo corresponda a um gene-alvo regulado de modo descendente, e que um nível de resumo de gene positivo corresponda a um gene-alvo regulado de modo ascendente. Além disso, é possível que os valores de resumo do gene-alvo sejam transformados com o uso de, por exemplo, uma das transformações acima descritas (difusa, discreta etc.) antes de serem combinadas na “segunda camada (superior)”.
[105] Depois que o nível de atividade do elemento de TF é determinado mediante a avaliação do modelo de “duas camadas”, o nível de atividade determinado do elemento de TF pode ser limitado para inferir a atividade da via de sinalização celular, conforme descrito acima.
[106] A seguir, os modelos descritos acima são coletivamente indicados como modelos “(pseudo)lineares”. Uma descrição mais detalhada do treinamento e uso de modelos probabilísticos, por exemplo um modelo de rede bayesiana, é fornecida no Exemplo 3, abaixo.
Exemplo 2: Seleção de genes-alvo
[107] Um fator de transcrição (TF) é um complexo de proteínas (isto é, uma combinação de proteínas ligadas umas às outras em uma estrutura específica) ou uma proteína que tem a capacidade de regular a transcrição de genes-alvo mediante a ligação a sequências de DNA específicas, controlando, assim, a transcrição de informações genéticas de DNA para mRNA. O mRNA produzido diretamente devido a essa ação do complexo de TF é mencionado, na presente invenção, como um “gene-alvo direto” (do fator de transcrição). A ativação de via de sinalização celular também pode resultar em transcrição de gene mais secundária, chamada de “genes-alvo indiretos”. Na sequência, os modelos pseudo (lineares) ou os modelos de rede bayesiana (como modelos matemáticos exemplificadores) que compreendem ou que consistem em genes-alvo diretos como ligações diretas entre a atividade de via de sinalização celular e o nível de mRNA são preferenciais, entretanto a distinção entre genes-alvo diretos e indiretos nem sempre é evidente. Aqui, é apresentado um método para selecionar genes-alvo diretos com o uso de uma função de escore com base em dados de literatura científica disponíveis. Não obstante, uma seleção acidental de genes-alvo indiretos não pode ser descartada devido às informações limitadas, bem como às variações e incertezas biológicas. Para a seleção dos genes- alvo, a base de dados MEDLINE do National Institute of Health, acessível em “www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed” e na presente invenção também referida como “Pubmed”, foi empregada para gerar uma lista de genes-alvo. Além disso, duas listas adicionais de genes-alvo foram selecionadas com base na natureza probatória de sua expressão.
[108] Publicações contendo genes-alvo da via Notch putativos foram pesquisadas usando-se termos de consulta como (“Notch” e “gene-alvo”) no período do quarto trimestre de 2016 e no primeiro trimestre de 2017. A via de sinalização Notch é uma via de sinalização embrionária que ativa perfis de genes- alvo diferentes (mas que se sobrepõem) dependendo da linhagem embrionária (vide Meier-Stiegen F. et al., “Activated Notchl target genes during embryonic cell differentiation depend on the cellular context and include lineage determinants and inhibitors”, PLoS One, Vol. 5, nº 7, julho de 2010). A consulta concentrou-se em conjuntos de genes-alvo que são expressados de modo diferente entre derivadas de tipo de célula/tecido/órgão a partir das três linhagens embrionárias diferentes (ectoderme, endoderme, mesoderme), que ênfase especial em genes-alvo que são expressados em órgão/tecidos/células derivados de ectoderme e endoderme. As publicações resultantes foram adicionalmente analisadas manualmente, seguindo a metodologia descrita com mais detalhes abaixo.
[109] Os genes-alvo de mRNA de via de sinalização celular específica foram selecionados da literatura científica, por meio do uso de um sistema de classificação no qual foi dada uma classificação a uma evidência científica para um gene-alvo específico, dependendo do tipo de experimentos científicos nos quais a evidência foi coletada. Embora alguma evidência experimental seja meramente sugestiva de um gene ser um gene- alvo direto como, por exemplo, um aumento de mRNA conforme detectado por meio de uma intensidade crescente de um conjunto de sondas em um micromatriz de uma linhagem celular na qual se sabe que a via de sinalização celular Notch está ativa, outra evidência pode ser muito forte, como a combinação de um sítio de ligação de TF de via de sinalização celular Notch identificado e a recuperação desse sítio em um ensaio de imunoprecipitação de cromatina (ChIP), após o estímulo da via de sinalização celular específica na célula, e o aumento no mRNA após o estímulo específico da via de sinalização celular em uma linhagem celular.
[110] Vários tipos de experimentos para encontrar os genes-alvo de via de sinalização celular específicos podem ser identificados na literatura científica:
1. Experimentos de ChIP nos quais é mostrada a ligação direta de um TF de via de sinalização celular de interesse ao seu sítio de ligação no genoma. Exemplo: Com o uso de tecnologia de imunoprecipitação de cromatina (ChIP), foram identificados sítios de ligação de TF da via Notch funcionais putativos no DNA de linhagens celulares com e sem indução ativa da via de sinalização celular Notch, por exemplo, por estímulo com um ligante Notch ou transfecção com NICD, como um subconjunto dos sítios de ligação reconhecidos puramente com base na sequência de nucleotídeos. A funcionalidade putativa foi identificada como evidência derivada de ChIP de que foi constatado que o TF se liga ao sítio de ligação de DNA.
2. Ensaios de Desvio de Mobilidade Eletroforética (EMSA) que mostram ligação in vitro de um TF a um fragmento de DNA contendo a sequência de ligação. Em comparação com a evidência baseada em ChIP, a evidência baseada em EMSA é menos forte, visto que não pode ser traduzida para a situação in vivo.
3. Estímulo da via de sinalização celular e medição da expressão de mRNA com o uso de um micromatriz, sequenciamento de RNA, PCR quantitativa ou outras técnicas, usando linhagens celulares induzíveis por via de sinalização celular Notch e medição de perfis de mRNA medidos em ao menos um, mas de preferência em vários pontos no tempo após a indução - na presença de cicloeximida, que inibe a tradução para proteína, e, dessa forma, presume-se que os mRNAs induzidos sejam genes-alvo diretos.
4. De modo similar ao item 3 acima, porém de modo alternativo, medir a expressão de mRNAs mais a jusante com medições com abundância de proteínas, como a técnica Western blot.
5. Inibição da via de sinalização celular com o uso de um inibidor da via Notch, por exemplo, um inibidor Gama-Secretase (GSI) e medição da expressão de mRNA com o uso de uma micromatriz, sequenciamento de RNA, PCR quantitativa ou outras técnicas, com o uso de linhagens celulares ativas de via de sinalização celular Notch e medição de perfis de mMRNA medidos em pelo menos um, mas de preferência em vários pontos no tempo após a inibição.
6. De modo similar ao item 5 acima, porém de modo alternativo, medir a expressão de mRNAs mais a jusante com medições com abundância de proteínas, como a técnica Western blot.
7. Identificação de sítios de ligação de TF no genoma, com o uso de uma abordagem de bioinformática. Exemplo para o elemento de TF da via Notch: Com o uso do motivo de ligação de CSL/RBP-J 5'-CGTGGGAA-3', um programa de software foi executado na sequência genômica humana, e foram identificados sítios de ligação potenciais, tanto em regiões promotoras de genes como em outras regiões genômicas.
8. De modo similar ao item 3, apenas na ausência de cicloeximida.
9. De modo similar ao item 4, apenas na ausência de cicloeximida.
[111] Na forma mais simples, pode-se atribuir a cada possível gene, 1 ponto para cada uma dessas abordagens experimentais nas quais o gene foi identificado como sendo um gene-alvo da família Notch de fatores de transcrição. Com o uso dessa estratégia de classificação relativa, pode-se fazer uma lista de genes-alvo mais confiável.
[112] Alternativamente, a classificação feita de outra forma pode ser usada para identificar os genes-alvo que têm a maior probabilidade de serem genes-alvo diretos, atribuindo-se um número maior de pontos à tecnologia que fornece mais evidência para um gene-alvo direto in vivo. Na lista acima, isso significaria 9 pontos para a abordagem experimental 1), 8 para a abordagem experimental 2) e diminuindo até 1 ponto para a abordagem experimental 9). Essa lista pode ser chamada de “lista geral de genes-alvo”.
[113] Apesar das incertezas e das variações biológicas, os inventores presumiram que os genes-alvo diretos têm a maior probabilidade de serem induzidos de maneira independente de tecido. Uma lista desses genes-alvo pode ser chamada de “lista organizada de evidências de genes-alvo”. Esse tipo de lista organizada de evidências de genes-alvo tem sido usado para construir modelos computacionais da via de sinalização celular Notch que podem ser aplicados a amostras de tecidos provenientes de diferentes origens.
[114] O disposto a seguir ilustrará de forma exemplificadora como a seleção de uma lista organizada de evidências de genes-alvo foi especificamente construída para a via de sinalização celular Notch.
[115] Foi introduzida uma função de escore que atribuiu um ponto a cada tipo de evidência experimental, como
ChIP, EMSA, expressão diferencial, “knock down"/“knock out”, ensaio com gene-repórter de luciferase, análise de sequências, que foi mencionada em uma publicação. Foi realizada uma análise adicional para permitir somente genes que tinham tipos vários de evidência experimental, e não apenas um ou dois tipos de evidência experimental, por exemplo, expressão diferencial. Foram selecionados os genes que tinham mais de dois tipos de evidência experimental disponível (conforme mostrado na Tabela 1).
[116] os inventores fizeram uma seleção adicional da lista organizada de evidências de genes-alvo (mostrados na Tabela 2, “Lista restrita de 18 genes-alvo”) Essa seleção foi feita mediante a remoção de genes-alvo da lista organizada de evidências que tinham relativamente pouca evidência, por exemplo foi encontrada evidência em apenas um manuscrito, e/ou que eram altamente específicos, por exemplo para sangue ou tecido cerebral. Os genes-alvo da “lista restrita de 18 genes-alvo” que foram comprovadamente mais probatórios na determinação da atividade da via de sinalização Notch das amostras de treinamento foram selecionados para a “lista restrita de 12 genes-alvo” (mostrados na Tabela 3, “Lista restrita de 12 genes-alvo”). Na presente invenção, foram selecionados os 12 genes-alvo que exibiram a razão de probabilidades mais alta (vide abaixo) entre amostras de paciente obtidas, respectivamente, de um conjunto de pacientes com câncer de ovário seroso papilar de alto grau (ativas para Notch, subconjunto obtido dos conjuntos de dados GSE2109 e GSE9891, obtidos junto à base de dados Gene Expression Omnibus (GEO, www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/, último acesso em 3 de dezembro de 2016), e um conjunto correspondente de amostras de tecido de ovário normal (inativas para Notch, um subconjunto obtido dos conjuntos de dados GSE7307, GSE18520, GSE29450 e GSE36668), e/ou que tiveram um escore muito alto na classificação de evidência.
Tabela 1: “Lista organizada de evidências de genes- alvo” (lista de 26 genes-alvo) da via de sinalização celular Notch usada nos modelos de via de sinalização celular Notch e conjuntos de sondas associados usados para medir o nível de expressão de mRNA dos genes-alvo.
sondas | Eres] fases o [ousa | [roses | Bessa o [mess meo fase | Jesse isto fee] fame mese DOI Tabela 2: “Lista restrita de 18 genes-alvo” de genes-alvo da via Notch baseada na lista organizada de evidências de genes-alvo da via Notch. (Os conjuntos de sondas associados são os mesmos que os da Tabela 1.) HES7 NFKB2
NRARP
PLXND1 Tabela 3: “Lista restrita de 12 genes-alvo” de genes-alvo da via Notch baseada na lista organizada de evidências de genes-alvo da via Notch. (Os conjuntos de sondas associados são os mesmos que os da Tabela 1.) Gene-alvo HESA4 Exemplo 3: Treinamento e uso do modelo matemático
[117] Antes que o modelo matemático possa ser usado para inferir a atividade da via de sinalização celular, na presente invenção a via de sinalização celular Notch, em um indivíduo, o modelo precisa ser adequadamente treinado.
[118] Se o modelo de via de sinalização matemático for um modelo probabilístico, por exemplo, um modelo de rede bayesiana, com base nas probabilidades condicionais em relação ao nível de atividade do elemento de TF da via Notch e aos níveis de expressão de cinco ou mais genes-alvo da via de sinalização celular Notch medidos na amostra do indivíduo, o treinamento pode, de preferência, ser realizado conforme descrito com detalhes no pedido de patente internacional publicado WO 2013/011479 A2 (“Assessment of cellular signaling pathway activity using probabilistic modeling of target gene expression”).
[119] Se o modelo de via de sinalização matemático tiver como base uma ou mais combinações dos níveis de expressão de cinco ou mais genes-alvo da via de sinalização celular de Notch medidos na amostra do indivíduo, o treinamento pode, de preferência, ser realizado conforme descrito com detalhes no pedido de patente internacional publicado WO 2014/102668 A2 (“Assessment of cellular signaling pathway activity using linear combination(s) of target gene expressions”).
[120] Na presente invenção, um modelo de rede bayesiana exemplificadora, conforme mostrado na Figura 2, foi usado para modelar de maneira simples o programa transcricional da via de sinalização celular Notch. O modelo consiste em três tipos de nós: (a) um elemento de fator de transcrição (TF) (com os estados “ausente” e “presente”) em uma primeira camada 1; (b) genes-alvo TG:i, TGo, TGn (com os estados “para baixo” e “para cima”) em uma segunda camada 2; e (c) nós de medição ligados aos níveis de expressão dos genes-alvo em uma terceira camada 3. Estes podem ser conjuntos de sondas de micromatriz PS1i,1, PS1,2, PS1,3, PS2,1, PSn1, PSnm (com os estados “baixo” e “alto”), de preferência conforme usado na presente invenção, mas poderiam ser também outras medições de expressão de genes como RNAseq ou RT-qPCR.
[121] Uma implementação adequada do modelo matemático, na presente invenção o modelo de rede bayesiana exemplificadora, tem por base dados de micromatriz. O modelo descreve (i) como os níveis de expressão dos genes-alvo dependem da ativação do elemento de TF, e (ii) como as intensidades de conjuntos de sondas, por sua vez, dependem dos níveis de expressão dos respectivos genes-alvo. Para estes últimos, as intensidades dos conjuntos de sondas podem ser obtidas de micromatrizes Affymetrix HG-Ul33Plus2.0 fRMA pré- processadas, que estão amplamente disponíveis junto à base de dados Gene Expression Omnibus (GEO, www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) e ao repositório ArrayExpress (www.ebi.ac.uk/arrayexpress).
[122] Como o modelo de rede bayesiana exemplificadora é uma simplificação da biologia de uma via de sinalização celular, na presente invenção a via de sinalização celular Notch, e como as medições biológicas geralmente contêm ruído, optou-se por uma abordagem probabilística, isto é, as relações entre (1) o elemento de TF e os genes-alvo, e (ii) os genes-alvo e seus respectivos conjuntos de sondas são descritas em termos probabilísticos. Além disso, presumiu-se que a atividade da via de sinalização celular oncogênica que favorece o crescimento tumoral não é alterada temporária e dinamicamente, mas alterada em longo prazo Ou Mesmo irreversivelmente. Portanto, o modelo de rede bayesiana exemplificadora foi desenvolvido para interpretação de uma condição celular estática. Por essa razão, recursos dinâmicos complexos de via de sinalização celular não foram incorporados ao modelo.
[123] Depois de criado Ee calibrado (vide abaixo), o modelo de rede bayesiana pode ser usado em dados de micromatriz de uma nova amostra, mediante a entrada de medições do conjunto de sondas como observações na terceira camada 3,
e mediante a inferência retroativa, no modelo, quanto à qual teria sido a probabilidade para que o elemento de TF estivesse “presente”. Neste documento, “presente” é considerado como sendo o fenômeno de que o elemento de TF está ligado ao DNA e está controlando a transcrição dos genes-alvo da via de sinalização celular, e “ausente” é o caso no qual o elemento de TF não está controlando a transcrição. Essa probabilidade é, portanto, a principal leitura que pode ser usada para indicar atividade da via de sinalização celular, na presente invenção a via de sinalização celular Notch, que pode, em seguida, ser traduzida nas probabilidades de a via de sinalização celular estar ativa, tomando-se a razão da probabilidade de a mesma estar ativa versus a mesma estar passiva (isto é, as probabilidades são dadas por p/(1-p), em que p é a probabilidade prevista de a via de sinalização celular estar ativa).
[124] No modelo de rede bayesiana exemplificadora, as relações probabilísticas foram tornadas quantitativas para permitir um raciocínio probabilístico quantitativo. Para melhorar o comportamento de generalização para todos os tipos de tecido, os parâmetros que descrevem as relações probabilísticas entre (i) o elemento de TF e os genes-alvo foram cuidadosamente selecionados. Se o elemento de TF estiver “ausente”, é muito provável que o gene-alvo esteja “para baixo” e, portanto, uma probabilidade de 0,95 é escolhida para isso, e uma probabilidade de 0,05 para o gene- alvo estar “para cima”. Esta última probabilidade (diferente de zero) é usada para se levar em conta a (rara) possibilidade de que o gene-alvo seja regulado outros fatores ou que o mesmo seja acidentalmente observado como estando “para cima” (por exemplo, devido aos ruídos presentes nas medições). Se o elemento de TF estiver “presente”, então com uma probabilidade de 0,70 o gene-alvo é considerado “para cima”, e com uma probabilidade de 0,30 o gene-alvo é considerado “para baixo”. Os valores acima são escolhidos dessa maneira, uma vez que pode haver várias razões pelas quais um gene-alvo não é altamente expressado, embora o elemento de TF esteja presente, por exemplo, porque a região promotora do gene está metilada.
No caso de um gene-alvo não ser regulado positivamente pelo elemento de TF, mas sim regulado negativamente, as probabilidades são escolhidas de maneira similar, porém refletindo a regulação negativa na presença do elemento de TF.
Os parâmetros que descrevem as relações entre (ii) os genes-alvo e seus respectivos conjuntos de sondas foram calibrados em dados experimentais.
Para estes últimos, nesse exemplo, foram usados dados de micromatriz de amostras de paciente que são conhecidas por ter uma via de sinalização celular Notch ativa enquanto que amostras saudáveis normais de um conjunto diferente de dados foram usadas como amostras de via de sinalização celular Notch passiva, mas isso poderia também ser feito com o uso de experimentos de linhagem celular ou outras amostras de paciente com o estado de atividade da via de sinalização celular conhecido.
As tabelas resultantes de probabilidade condicional são dadas por:
A: para genes-alvo com regulação positiva
[O ae seme [cam
TG:i = negativo FP PA
AL,, + AH,,+2 AL,, + AH,,+2
1. PL,,+1 PH,,+1 TG: O positivo) pr pH, 12 PL, + PH,,+2 B: para genes-alvo com regulação negativa [O aces [o cas , PL,,+1 PH,,+1 TG: = negativo| pr PH, +2 PL, +PH,,+2 1 AL, ,+1 AH,,+1 TG: = positivo AL, + AH, +2 AL, + AH, ,+2
[125] Nessas tabelas, as variáveis ALi,j, AHi,j, PLi,j, & PHi,j indicam o número de amostras de calibração com um complexo de transcrição “ausente” (A) ou “presente” (P) que tem uma intensidade de conjunto de sondas “baixa” (L) ou “alta” (H), respectivamente. Foram adicionadas contagens simuladas (“dummy”) para evitar probabilidades extremas de O e 1.
[126] Para discretizar as intensidades de conjunto de sondas observadas, para cada conjunto de sondas PSi,j, um limiar ti,j foi usado, abaixo do qual a observação é chamada de “baixa”, e acima do qual a mesma é chamada de “alta”. Esse limiar foi escolhido para ser a intensidade mediana (ponderada) do conjunto de sondas no conjunto de dados de calibração utilizado. Devido ao ruído dos dados de micromatriz, foi usado um método difuso para comparar uma intensidade de conjunto de sondas observada com seu limiar, presumindo-se uma distribuição normal com um desvio padrão de 0,25 (em uma escala de log2) ao redor da intensidade relatada e determinando-se a massa de probabilidade abaixo e acima do limiar.
[127] Se, em vez da rede bayesiana exemplificadora descrita acima, um modelo (pseudo)linear conforme descrito no Exemplo 1 acima tiver sido empregado, os pesos que indicam o sinal e a magnitude da correlação entre os nós e um limiar para prever se um nó está ou “ausente” ou “presente” precisariam ser determinados antes de o modelo poder ser usado para inferir a atividade de via de sinalização celular em uma amostra de teste. Poder-se-ia usar conhecimento especializado para preencher os pesos e o limiar a priori, mas tipicamente o modelo seria treinado usando-se um conjunto representativo de amostras de treinamento, do qual, de preferência, seriam conhecidos os dados factuais, por exemplo, dados de expressão de conjuntos de sondas em amostras com um complexo de fator de transcrição conhecido “presente” (= via de sinalização celular ativa), ou “ausente” complexo de fator de transcrição (= via de sinalização celular passiva).
[128] No campo da técnica é conhecida uma variedade de algoritmos de treinamento (por exemplo, regressão) que levam em conta a topologia do modelo e alteram os parâmetros do modelo, aqui, os pesos e o limiar, de modo que a saída do modelo, aqui, um escore linear ponderado, seja otimizado. Alternativamente, é também possível calcular os pesos diretamente a partir dos níveis de expressão observados sem a necessidade de um algoritmo de otimização.
[129] Um primeiro método, aqui chamado “método preto e branco”, é basicamente um sistema ternário, no qual cada peso é um elemento do conjunto (-1, O, 1). Colocado num contexto biológico, os valores -l1 e 1 correspondem a genes- alvo ou conjuntos de sondas com regulação, respectivamente, positiva e negativa no caso de atividade de via de sinalização celular. Se não for possível provar estatisticamente que um conjunto de sondas ou gene-alvo apresenta uma regulação “positiva” ou “negativa”, o mesmo recebe um peso de 0. Por exemplo, pode-se usar um teste t de duas amostras de lado esquerdo e lado direito dos níveis de expressão das amostras de via de sinalização celular ativas versus os níveis de expressão das amostras com uma via de sinalização celular passiva, para determinar se uma sonda ou gene apresenta uma regulação “positiva” ou “negativa” com base nos dados de treinamento. Nos casos em que a média das amostras ativas é estatisticamente maior que as amostras passivas, isto é, oO valor p está abaixo de um certo limiar, por exemplo, 0,3, é determinado que o gene-alvo ou conjunto de sondas é regulado “positivamente”. Em contraste, nos casos em que a média das amostras ativas é estatisticamente menor que as amostras passivas, é determinado que o gene-alvo ou conjunto de sondas é regulado “negativamente”, mediante ativação da via de sinalização celular. No caso de o menor valor p (lado esquerdo ou direito) exceder o limiar supracitado, o peso do gene-alvo ou conjunto de sondas pode ser definido como sendo 0.
[130] Um segundo método, aqui chamado de “pesos de possibilidades logarítmicas”, tem por base o logaritmo (por exemplo, base e) da razão de possibilidades. A razão de probabilidade para gene-alvo ou conjunto de sondas é calculada com base no número de amostras de treinamento positivas e negativas para as quais o nível de conjunto de sondas/gene-alvo está acima e abaixo de um limiar correspondente, por exemplo, a mediana (ponderada) de todas as amostras de treinamento. Uma pseudocontagem pode ser adicionada para contornar as ocorrências de divisão por zero. Um refinamento adicional é contar as amostras acima/abaixo do limiar de maneira um pouco mais probabilística, presumindo-se que os níveis de conjunto de sondas/genes-alvo são, por exemplo, distribuídos normalmente em torno de seu valor observado com um certo desvio padrão especificado (por exemplo, 0,25 em uma escala logarítmica de base 2), e contar a massa de probabilidade acima e abaixo do limiar. Aqui, uma razão de possibilidades calculada em combinação com uma pseudocontagem e com o uso de massas de probabilidade em vez de valores de medições determinísticas é chamada de razão de possibilidades “suave”.
[131] Detalhes adicionais sobre a inferência de atividade de via de sinalização celular com o uso de modelagem matemática da expressão de genes-alvo podem ser encontrados em Verhaegh W. et al., “Selection of personalized patient therapy through the use of knowledge-based computational models that identify tumor-driving signal transduction pathways”, Cancer Research, Vol. 74, nº 11, 2014, páginas 2936 a 2945.
[132] Na presente invenção foram utilizados dados publicamente disponíveis na expressão de amostras de paciente obtida, respectivamente, de um conjunto de pacientes com câncer de ovário seroso papilar de alto grau (conjuntos de dados GSE2109 e GSE9891, obtidos junto à base de dados Gene Expression Omnibus (GEO, www.ncbi.nlm. nih.gov/geo/, último acesso em 3 de dezembro de 2016), e um conjunto correspondente de amostras de tecido de ovário normal (conjuntos de dados GSE7307, GSE18520, GSE29450 e GSE36668). O câncer de ovário seroso de alto grau é conhecido por ter uma via de sinalização celular Notch ativa na maior parte dos casos, enquanto as amostras de tecido de ovário normal têm uma via de sinalização celular Notch passiva. Antes da seleção das amostras de calibração, foi realizado um controle de qualidade nos conjuntos de dados para assegurar que as amostras eram confiáveis. Para propósitos de calibração, as amostras de câncer de ovário da via Notch mais ativa foram escolhidas dentre os conjuntos disponíveis, conforme determinado pela adição de valores de expressão de mRNA Affymetrix para todos os genes-alvo, para cada amostra e subsequentemente a classificação das amostras de acordo com valor total. As 20 amostras com classificação mais alta foram consideradas ativas para Notch. Das 12 amostras de ovário normais aprovadas pelo controle de qualidade, 11 amostras foram escolhidas como amostras de calibração passivas para Notch (1 amostra de ovário normal foi considerada ativa para Notch), com números de amostra: GSM176237, GSM729048, GSM462651, GSM729050, GSM729051, GSM175789, GSM462652, GSM176131, GSM176318, GSM898306, GSM898307. (As amostras do conjunto de dados GSE42259 também foram consideradas como amostras de calibração passivas para Notch, mas após um controle de qualidade nenhuma dessas amostras permaneceram.) Elas foram usadas para calibrar o modelo para atividade e passividade para Notch, respectivamente. O modelo calibrado foi avaliado em vários conjuntos de dados públicos da base de dados GEO, que continha dados factuais em relação à atividade da via Notch, ou seja, linhagens celulares nas quais a atividade da via Notch foi induzida ou inibida (por exemplo, tratada com um inibidor da via Notch como gama-secretase, Ou tendo a possibilidade de induzir o construto Notch3 intracelular). Como um exemplo de aplicação, o modelo foi executado em um conjunto de dados de amostras de câncer de mama para as quais os dados de sobrevida são conhecidos.
[133] A Figura 9 mostra os resultados de calibração do modelo de rede bayesiana com base na lista restrita de 18 genes-alvo da Tabela 2 e nos métodos aqui descritos com o uso de conjuntos de dados de expressão publicamente disponíveis de 11 amostras normais de ovário (grupo 1) e 20 amostras de câncer de ovário seroso papilar de alto grau (grupo 2) (subconjunto de amostras obtido dos conjuntos de dados GSE2109, GSE9891, GSE7307, GSE18520, GSE29450, GSE36668). No diagrama, O eixo geométrico vertical indica as probabilidades de que oO elemento de TF esteja “presente” em vez de “ausente”, o que corresponde à via de sinalização celular Notch estar inativa em vez de ativa, em que os valores acima do eixo geométrico horizontal "correspondem ao elemento de TF estar mais provavelmente “presente”/ativo, e valores abaixo do eixo geométrico horizontal indicam que as probabilidades de que o elemento de TF esteja “ausente”/inativo são maiores que as probabilidades de que esteja “presente”/ativo. O modelo foi capaz de separar claramente as amostras de calibração ativas das inativas.
[134] A Figura 10 mostra os resultados de calibração do modelo de rede bayesiana com base na lista organizada de evidências de genes-alvo (lista de 26 genes-alvo) da Tabela 1 e nos métodos aqui descritos com o uso de conjuntos de dados de expressão publicamente disponíveis de 11 amostras normais de ovário (grupo 1) e 20 amostras de câncer de ovário seroso papilar de alto grau (grupo 2) (subconjunto de amostras obtido dos conjuntos de dados GSE2109, GSE9891, GSE7307, GSE18520, GSE29450, GSE36668). No diagrama, o eixo geométrico vertical indica as probabilidades de que o elemento de TF esteja “presente” em vez de “ausente”, o que corresponde à via de sinalização celular Notch estar inativa em vez de ativa, em que os valores acima do eixo geométrico horizontal correspondem ao elemento de TF estar mais provavelmente “presente”/ativo, e valores abaixo do eixo geométrico horizontal indicam que as probabilidades de que o elemento de TF esteja “ausente”/inativo são maiores que as probabilidades de que esteja “presente”/ativo. Novamente, o modelo foi capaz de separar claramente as amostras de calibração ativas das inativas.
[135] A seguir, os resultados de validação dos modelos de rede bayesiana exemplificadores treinados que usam a lista organizada de evidências de genes-alvo (lista de 26 genes- alvo) e a lista restrita de 18 genes-alvo, respectivamente, são mostrados nas Figuras 11 a 18.
[136] A Figura 11 mostra previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista restrita de 18 genes- alvo da Tabela 2 em três culturas independentes da linhagem celular MOLT4 do conjunto de dados GSEG6495. No diagrama, O eixo geométrico vertical indica as probabilidades de que o elemento de TF esteja “presente” em vez de “ausente”, o que corresponde à via de sinalização celular Notch estar inativa em vez de ativa, em que os valores acima do eixo geométrico horizontal correspondem ao elemento de TF estar mais provavelmente “presente” /ativo, e valores abaixo do eixo geométrico horizontal indicam que as probabilidades de que o elemento de TF esteja “ausente”/inativo são maiores que as probabilidades de que esteja “presente”/ativo. A linhagem celular de MOLT4Pl é conhecida por ter alta sinalização da via Notch, que o modelo previu corretamente (grupo 1). As células foram tratadas durante 48 horas com 5 puM de DAPT, um inibidor de gama-secretase (GSI) (grupo 2). GSIS são conhecidos por inibir a sinalização da via Notch e o modelo detectou corretamente uma diminuição na atividade da via Notch neste grupo (vide Dohda T. et al., “Notch signaling induces SKP2 expression and promotes reduction of p27Kipl in T-cell acute lymphoblastic leukemia cell”, Experimental Cell Research, Vol. 313, nº 14, agosto de 2007, páginas 3141 a 3152).
[137] A Figura 12 mostra previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista organizada de evidências de genes-alvo (lista de 26 genes-alvo) da Tabela 1 em três culturas independentes da linhagem celular MOLT4 do conjunto de dados GSE6495. No diagrama, o eixo geométrico vertical indica as probabilidades de que o elemento de TF esteja “presente” em vez de “ausente”, o que corresponde à via de sinalização celular Notch estar inativa em vez de ativa, em que os valores acima do eixo geométrico horizontal correspondem ao elemento de TF estar mais provavelmente “presente”/ativo, e valores abaixo do eixo geométrico horizontal indicam que as probabilidades de que o elemento de TF esteja “ausente”/inativo são maiores que as probabilidades de que esteja “presente”/ativo. A linhagem celular de MOLT4P1l é conhecida por ter alta sinalização da via Notch, que o modelo previu corretamente (grupo 1). As células foram tratadas durante 48 horas com 5 puM de DAPT, um inibidor de gama-secretase (GSI) (grupo 2). GSIs são conhecidos por inibir a sinalização da via Notch e o modelo detectou corretamente uma diminuição na atividade da via Notch neste grupo (vide Dohda T. et al., “Notch signaling induces SKP2 expression and promotes reduction of p27Kipl in T-cell acute lymphoblastic leukemia cell”, Experimental Cell Research, Vol. 313, nº 14, agosto de 2007, páginas 3141 a 3152).
[138] A Figura 13 mostra previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista restrita de 18 genes-alvo da Tabela 2 em células IMR32 que foram transfectadas com um construto intracelular Notch3 induzível. No diagrama, o eixo geométrico vertical indica as probabilidades de que oO elemento de TF esteja “presente” em vez de “ausente”, o que corresponde à via de sinalização celular Notch estar inativa em vez de ativa, em que os valores acima do eixo geométrico horizontal “correspondem ao elemento de TF estar mais provavelmente “presente”/ativo, e valores abaixo do eixo geométrico horizontal indicam que as probabilidades de que o elemento de TF esteja “ausente”/inativo são maiores que as probabilidades de que esteja “presente”/ativo. São mostrados dois clones derivado de célula única independentes (c6, c8) que acionam a expressão intracelular Notch3 na presença de 50 ng/ml de doxiciclina. Em t=0O h, para ambos os clones, o modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado usando a lista restrita de 18 genes-alvo da Tabela 2 detecta baixa atividade da via Notch. Após a indução de Notch3 intracelular, observou-se corretamente que a atividade da via Notch aumenta em ambos os clones e estabiliza em t = 24 h (conjunto de dados GSE16477, van Nes J. et al., “A NOTCH3 Transcriptional Module Induces Cell Motility in Neuroblastoma”, Clinical Cancer Research, Vol. 19, nº 13, julho de 2013, páginas 3485 a 3494).
[139] A Figura 14 mostra previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista restrita de 18 genes- alvo da Tabela 2 em HPCs CD34+CD45RA-Lin que foram cultivadas durante 72 horas com doses graduadas de ligante Notch plástico imobilizado Deltalext-IgG (conjunto de dados GSE29524). No diagrama, o eixo geométrico vertical indica as probabilidades de que o elemento de TF esteja “presente” em vez de “ausente”, o que corresponde à via de sinalização celular Notch estar inativa em vez de ativa, em que os valores acima do eixo geométrico horizontal correspondem ao elemento de TF estar mais provavelmente “presente”/ativo, e valores abaixo do eixo geométrico horizontal indicam que as probabilidades de que o elemento de TF esteja “ausente”/inativo são maiores que as probabilidades de que esteja “presente”/ativo. O modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista restrita de 18 genes-alvo da Tabela 2 prevê corretamente uma atividade maior da via Notch nas células cultivadas em Deltalext-IgG (grupo 2) em comparação com o controle (grupo 1).
[140] A Figura 15 mostra previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista restrita de 18 genes-alvo da Tabela 2 em células CUTLL1, que são conhecidas por ter alta atividade da via Notch. No diagrama, oO eixo geométrico vertical indica as probabilidades de que o elemento de TF esteja “presente” em vez de “ausente”, o que corresponde à via de sinalização celular Notch estar inativa em vez de ativa, em que os valores acima do eixo geométrico horizontal correspondem ao elemento de TF estar mais provavelmente “presente” /ativo, e valores abaixo do eixo geométrico horizontal indicam que as probabilidades de que o elemento de TF esteja “ausente”/inativo são maiores que as probabilidades de que esteja “presente”/ativo. O tratamento com um inibidor de gama-secretase (GSI) inibe a sinalização da via Notch. No conjunto de dados GSE29544, foi observado que a atividade da via Notch é alta 2 horas após uma lavagem de GST. Nessa figura, os dados de células CUTLL1 não tratadas e de células CUTLL1 após a lavagem de GSI são agrupados, uma vez que em ambos os casos se espera que a atividade da Notch seja alta. Seis grupos podem ser distinguidos: 1) Células CUTLL1 não tratadas e células CUTLL1 após a lavagem de GSI. Aqui, o modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista restrita de 18 genes-alvo prevê corretamente a alta atividade da via Notch nesse grupo. 2) Células CUTLL1 tratadas com GSI para as quais o modelo prevê corretamente a baixa atividade da via Notch. 3+4) Células CUTLL1 tratadas com um retrovírus MigRI vazio, oO qual não se espera que afete a sinalização da via Notch. Aqui, o modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista restrita de 18 genes-alvo da Tabela 2 prevê corretamente alta atividade da via Notch para células após a lavagem de GSI (grupo 3) e as células tratadas com GSI (grupo 4). 5+6) Células CUTLL transduzidas com vírus MAML1 de MigRI dominante-negativo. DNMAML1 é um antagonista Notch e espera-se que a sinalização da via Notch seja baixa nessas células. O modelo prevê corretamente a baixa atividade da via Notch tanto para células após a lavagem de GSI (grupo 5) como para células tratadas com GSI (grupo 6) (vide Wang H. et al., “Genome-wide analysis reveals conserved and divergent features of Notch1/RBPJ binding in human and murine T-lymphoblastic leukemia cells”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, Vol. 108, nº 36, 2011, páginas 14908 a 14913).
[141] A Figura 16 mostra previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista organizada de evidências de genes-alvo (lista de 26 genes-alvo) da Tabela 1 em células CUTLL1, que são conhecidas por ter alta atividade da via Notch.
No diagrama, o eixo geométrico vertical indica as probabilidades de que o elemento de TF esteja “presente” em vez de “ausente”, o que corresponde à via de sinalização celular Notch estar inativa em vez de ativa, em que os valores acima do eixo geométrico horizontal correspondem ao elemento de TF estar mais provavelmente “presente”/ativo, e valores abaixo do eixo geométrico horizontal indicam que as probabilidades de que o elemento de TF esteja “ausente”/inativo são maiores que as probabilidades de que esteja “presente”/ativo.
O tratamento com um inibidor de gama-secretase (GSI) inibe a sinalização da via Notch.
No conjunto de dados GSE29544, foi observado que a atividade da via Notch é alta 2 horas após uma lavagem de GSI.
Nessa figura, os dados de células CUTLL1 não tratadas e de células CUTLL1 após a lavagem de GSI são agrupados, uma vez que em ambos os casos se espera que à atividade da Notch seja alta.
Seis grupos podem ser distinguidos: 1) Células CUTLL1 não tratadas e células CUTLL1 após a lavagem de GSI.
Aqui, o modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista restrita de 18 genes-alvo prevê corretamente a alta atividade da via Notch nesse grupo. 2) Células CUTLL1 tratadas com GSI para as quais o modelo prevê corretamente a baixa atividade da via Notch. 3+4) Células CUTLL1 tratadas com um retrovírus MigRI vazio, O qual não se espera que afete a sinalização da via Notch.
Aqui, o modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista organizada de evidências de genes- alvo (lista de 26 genes-alvo) da Tabela 1 prevê corretamente alta atividade da via Notch para células após a lavagem de GSI (grupo 3) e de células tratadas com GSI (grupo 4). 5+6) Células
CUTLL transduzidas com vírus MAML1 de MigRI dominante-negativo. DNMAML1 é um antagonista Notch e espera-se que a sinalização da via Notch seja baixa nessas células. O modelo prevê corretamente a baixa atividade da via Notch tanto para células após a lavagem de GSI (grupo 5) como para células tratadas com GSI (grupo 6) (vide Wang H. et al., “Genome-wide analysis reveals conserved and divergent features of Notch1/RBPJ binding in human and murine T-lymphoblastic leukemia cells” Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, Vol. 108, nº 36, 2011, páginas 14908 a 14913).
[142] A Figura 17 mostra previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista restrita de 18 genes-alvo da Tabela 2 em células HUVEC que foram transfectadas com siRNA COUP-TFII (conjunto de dados GSE33301). No diagrama, o eixo geométrico vertical indica as probabilidades de que o elemento de TF esteja “presente” em vez de “ausente”, o que corresponde à via de sinalização celular Notch estar inativa em vez de ativa, em que os valores acima do eixo geométrico horizontal “correspondem ao elemento de TF estar mais provavelmente “presente”/ativo, e valores abaixo do eixo geométrico horizontal indicam que as probabilidades de que o elemento de TF esteja “ausente”/inativo são maiores que as probabilidades de que esteja “presente”/ativo. COUP-TFII é conhecido por suprimir a sinalização da via Notch (vide You L.R. et al., “Suppression of Notch signaling by the COUP-TFII transcription factor regulates vein identity”, Vol. 435, nº 7038, May 2005, páginas 98 a 104). O modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista restrita de 18 genes-alvo da Tabela 2 detecta corretamente uma atividade mais alta da via Notch em células transfectadas siRNA COUP-TFII (grupo 2) em comparação com as células de controle (grupo 1) (vide Chen X. et al., “COUP-TFII is a major regulator of cell cycle and Notch signaling pathways”, Molecular Endocrinology, Vol. 26, nº 8, agosto de 2012, páginas 1268 a 1277).
[143] A Figura 18 mostra previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificador treinado com o uso da lista restrita de 18 genes-alvo em subgrupos de câncer de mama em amostras dos conjuntos de dados GSE6532, GSE9195, GSEl2276, GSE20685, GSE21653 e EMTAB365. No diagrama, o eixo geométrico vertical indica as probabilidades de que o elemento de TF esteja “presente” em vez de “ausente”, o que corresponde à via de sinalização celular Notch ser ativa em vez de passiva. Deve- se observar que a atividade da via Notch é alta em todas as amostras de câncer de mama nesses conjuntos de dados. Os resultados da execução de uma análise de variância unidirecional seguida de um teste post-hoc Games-Howell mostram que quase todos os grupos têm diferenças significativas com exceção de Norml. versus Basal e LumA versus HER2 (vide Tabela 4) (subgrupos: Basal, HER2, LumA = Luminal A, LumB = Luminal B, Norml = Normal-like) Tabela 4: Resultados do teste post-hoc Games-Howell comparando diferentes subgrupos de amostras de câncer de mama conforme mostrado na Figura 18. Valores p < 0,05 são considerados significativos.
(comparação |pess |
LumA-HER2 1 LumB-HER2 1,5e-03
[144] A Tabela 5 mostra os resultados da regressão de Cox para a atividade da via Notch no modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista restrita de 18 genes-alvo nos conjuntos de dados usados na Figura 18. Para todas as amostras juntas e mais especificamente para Luminal A e Luminal B há um prognóstico significativamente pior com o aumento da atividade da via Notch prevista pelo modelo da invenção. Esse fato é apoiado por uma recente publicação que revela que pacientes que testaram positivo para Notch1l tinham sobrevida livre de doença mais curta (vide Zhong Y. et al., “NOTCH1 is a Poor Prognostic Factor for Breast Cancer and Is Associated With Breast Cancer Stem Cells”, Oncotargets and Therapy, Vol. 9, novembro de 2016, páginas 6865 a 6871).
Tabela 5: Resultados da regressão de Cox para a atividade da via Notch no modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista restrita de 18 genes-alvo da Tabela 2 nos conjuntos de dados usados na Figura
18.
de Cox)
[emma [o,005356 — 1009107 [0,0460s — [1,621967 0,066%6 |
[145] A Figura 19 mostra previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista restrita de 12 genes- alvo da Tabela 3 em HPCs CD34+CD45RA-Lin que foram cultivadas durante 72 horas com doses graduadas de ligante Notch plástico imobilizado Deltalext-IgG (conjunto de dados GSE29524). No diagrama, o eixo geométrico vertical indica as probabilidades de que o elemento de TF esteja “presente” em vez de “ausente”, o que corresponde à via de sinalização celular Notch estar inativa em vez de ativa, em que os valores acima do eixo geométrico horizontal correspondem ao elemento de TF estar mais provavelmente “presente”/ativo, e valores abaixo do eixo geométrico horizontal indicam que as probabilidades de que o elemento de TF esteja “ausente”/inativo são maiores que as probabilidades de que esteja “presente”/ativo. O modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista restrita de 12 genes-alvo da Tabela 3 prevê corretamente uma atividade maior da via Notch nas células cultivadas em Deltalext-IgG (grupo 2) em comparação com o controle (grupo 1).
[146] A Figura 20 mostra previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista restrita de 12 genes- alvo da Tabela 3 em células CUTLL1, que são conhecidas por ter alta atividade da via Notch. No diagrama, o eixo geométrico vertical indica as probabilidades de que o elemento de TF esteja “presente” em vez de “ausente”, o que corresponde à via de sinalização celular Notch estar inativa em vez de ativa, em que os valores acima do eixo geométrico horizontal correspondem ao elemento de TF estar mais provavelmente “presente”/ativo, e valores abaixo do eixo geométrico horizontal indicam que as probabilidades de que o elemento de TF esteja “ausente”/inativo são maiores que as probabilidades de que esteja “presente” /ativo.
O tratamento com um inibidor de gama-secretase (GSI) inibe a sinalização da via Notch.
No conjunto de dados GSE29544, foi observado que a atividade da via Notch é alta 2 horas após uma lavagem de GSI.
Nessa figura, os dados de células CUTLL1 não tratadas e de células CUTLL1 após a lavagem de GSI são agrupados, uma vez que em ambos OS casos se espera que a atividade da Notch seja alta.
Seis grupos podem ser distinguidos: 1) Células CUTLL1 não tratadas e células CUTLL1 após a lavagem de GSI.
Aqui, o modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista restrita de 18 genes-alvo prevê corretamente a alta atividade da via Notch nesse grupo. 2) Células CUTLL1 tratadas com GSI para as quais o modelo prevê corretamente a baixa atividade da via Notch. 3+4) Células CUTLL1 tratadas com um retrovírus MigRI vazio, o qual não se espera que afete a sinalização da via Notch.
Aqui, o modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista restrita de 12 genes- alvo da Tabela 3 prevê corretamente alta atividade da via Notch para células após a lavagem de GSI (grupo 3) e as células tratadas com GSI (grupo 4). 5+6) Células CUTLL transduzidas com vírus MAML1l de MigRI dominante-negativo.
DNMAML1I é um antagonista Notch e espera-se que a sinalização da via Notch seja baixa nessas células.
O modelo prevê corretamente a baixa atividade da via Notch tanto para células após a lavagem de GSI (grupo 5) como para células tratadas com GSI (grupo 6) (vide
Wang H. et al., “Genome-wide analysis reveals conserved and divergent features of Notch1/RBPJ binding in human and murine T-lymphoblastic leukemia cells”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, Vol. 108, nº 36, 2011, páginas 14908 a 14913).
[147] A Figura 21 mostra a correlação entre o modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista organizada de evidências de genes-alvo (26 genes-alvo) da Tabela 1 e a lista restrita de 12 genes-alvo da Tabela 3, respectivamente. No diagrama, o eixo geométrico horizontal indicas as probabilidades (em uma escala log2) que o elemento de TF está “presente” em vez de “ausente”, o que corresponde à via de sinalização celular Notch ser ativa em vez de passiva, conforme previsto pelo modele de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista organizada de evidências de genes- alvo (lista de 26 genes-alvo) da Tabela 1. O eixo vertical indica as mesmas informações, conforme previsto pelo modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista restrita de 12 genes-alvo da Tabela 3 (conjuntos de dados GSES682, GSE5S716, GSE6G495, GSE9339, GSEl4995, GSE15947, GSE1l6477, GSEl6906, GSE18198, GSE20011, GSE20285, GSE20667, GSE24199, GSE27424, GSE29524, GSE29544, GSE29850, GSE29959, GSE32375, GSE33301, GSE33562, GSE34602, GSE35340, GSE36176, GSE37645, GSE39223, GSE42259, GSE46909, GSE49673, GSES53537, GSE54378, GSE57022, GSE61827, GSE74996, GSE81156, GSE82298). Os dois modelos são significativamente correlacionados com um valor p de 2,2e-l16 e um coeficiente de correlação de 0,929.
[148] As Figuras 22 e 23 mostram comparações adicionais de previsões da atividade da via de sinalização celular Notch a partir de um modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso de (i) uma lista de 7 genes-alvo da via Notch (DTX1, HESl, HES4, HES5, HEY2, MYC e NRARP) e uma lista de 10 genes-alvo da via Notch (os 7 genes- alvo da via Notch mais EPHB3, SOX9 e NFKB2), e (ii) uma lista de 8 genes-alvo da via Notch (DTXl, HESl, HES4, HES5, HEY2, MYC, NRARP e PTCRA) e uma lista de 12 genes-alvo da via Notch (os 8 genes-alvo da via Notch mais HEYL, HEY1l, PLXND1 e GFAP). Os 7 genes-alvo da via Notch são incluídos em cada uma das listas de genes-alvo das Tabelas 1 a 3, e os 8 genes-alvo da via Notch incluem um gene-alvo adicional (PTCRA) que só é incluído na lista organizada de evidências de genes-alvo (lista de 26 genes-alvo) da Tabela l1. O 3 genes-alvo adicionais da lista de 10 genes-alvo da via Notch foram obtidos da lista restrita de 12 genes-alvo da Tabela 3, e os 4 genes-alvo adicionais da lista de 12 genes-alvo da via Notch, que diferem dos 3 genes-alvo adicionais, foram obtidos da lista organizada de evidências de genes-alvo (lista de 26 genes-alvo) da Tabela l. As comparações mostram de modo exemplificador que as previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso de uma lista de 7 genes- alvo da via Notch, que é um subconjunto de cada uma das listas de genes-alvo das Tabelas 1 a 3, e de uma lista de 8 genes- alvo da via Notch, que é um subconjunto da lista organizada de evidências dos genes-alvo (lista de 26 genes-alvo) da Tabela 1, podem ser melhoradas ainda mais com a adição de outros genes-alvo a partir de suas respectivas listas. Em mais detalhe:
[149] A Figura 22 mostra uma comparação das previsões de via de sinalização celular Notch entre a lista de
7 genes-alvo da via Notch e a lista de 10 genes-alvo da via Notch. Os modelos foram executados em amostras de células IMR32 que foram transfectadas com um construto intracelular Notch3 induzível. No diagrama, o eixo geométrico horizontal indica o tempo em horas e o eixo geométrico vertical indica a via de sinalização celular Notch relativa (em uma escala log20dds). Ambos os modelos mostram corretamente o aumento esperado na atividade da via Notch após a indução do construto Notch3 intracelular. O modelo de 10 genes-alvo (linha pontilhada), no entanto, mostra um aumento maior na atividade em comparação com o modelo de 7 genes-alvo (linha contínua). A atividade da via Notch foi ajustada para 0 em t=0O hora, para facilitar a comparação (conjunto de dados GSE1l6477; vide também van Nes J. et al., “A NOTCH3 Transcriptional Module Induces Cell Motility in Neuroblastoma”, Clinical Cancer Research, Vol. 19, nº 13, julho de 2013, páginas 3485 a 3494).
[150] A Figura 23 mostra uma comparação das previsões de via de sinalização celular Notch entre a lista de 8 genes-alvo da via Notch e a lista de 12 genes-alvo da via Notch. Os modelos foram executados em amostras de células estromais do endométrio que foram infectadas por um retrovírus Jagl (conjunto de dados GSE16906). Jagl é um ligante Notch que induz a clivagem do receptor Notch mediante ligação, induzindo, por fim, a transcrição de genes-alvo da via Notch. O modelo de 12 genes-alvo (lado direito do gráfico) mostra uma separação melhor da atividade da via Notch (dada no eixo geométrico vertical como log2odds) entre o controle (“C” na figura) e às células infectadas com Jagl (“Jagl INF” na figura) em comparação com o modelo de 8 genes-alvo (lado esquerdo do gráfico) (vide também Mikhailik A. et al. “Notch ligand-
dependent gene expression in human endometrial stromal cells”, Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 388, nº 3, outubro de 2009, páginas 479 a 482).
[151] Em vez de aplicar o modelo matemático calibrado, por exemplo, o modelo de rede bayesiana exemplificadora em dados de entrada de mRNA provenientes de micromatrizes ou sequenciamento de RNA, pode ser benéfico em aplicações clínicas desenvolver ensaios específicos para realizar as medições de amostra, por exemplo, em uma plataforma integrada que usa qPCR para determinar os níveis de mRNA de genes-alvo. As sequências de RNA/DNA dos genes- alvo revelados podem ser, então, usadas para determinar quais primers e sondas selecionar em tal plataforma.
[152] A validação de tal ensaio específico pode ser realizada com base em modelos matemáticos baseados em micromatriz como um modelo de referência, e na verificação de se os ensaios desenvolvidos proporcionam resultados similares em um conjunto de amostras de validação. Além de um ensaio dedicado, isso também pode ser feito para construir e calibrar modelos matemáticos similares com o uso de dados de sequenciamento de RNA como medições de entrada.
[153] O conjunto de genes-alvo que se descobriu indicarem melhor a atividade de via de sinalização celular específicas, por exemplo, Tabelas 1 a 3, com base na investigação baseada em sequenciamento de micromatriz/RNA com o uso do modelo matemático calibrado, por exemplo, o modelo de rede bayesiana exemplificadora, pode ser traduzido em um ensaio de PCR multiplex quantitativo a ser executado em uma amostra do indivíduo, e/ou um computador para interpretar as medições de expressão e/ou para inferir a atividade da via de sinalização celular Notch. Para desenvolver esse tipo de teste (por exemplo, um teste aprovado pela FDA ou dispensado pela CLIA em um laboratório de serviço central ou um teste desenvolvido em laboratório para uso em pesquisa apenas) para a atividade de via de sinalização celular, é necessário o desenvolvimento de um kit de teste padronizado, que precisa ser clinicamente validado em testes clínicos para obter aprovação regulamentar.
[154] A presente invenção se refere a um método implementado por computador para inferir a atividade de uma via de sinalização celular Notch em um indivíduo, executado por um dispositivo de processamento digital, em que a inferência é baseada em níveis de expressão de cinco ou mais genes-alvo da via de sinalização celular Notch medidos em uma amostra do indivíduo. A presente invenção se refere adicionalmente a um aparelho para inferir a atividade de uma via de sinalização celular Notch em um indivíduo, que compreende um processador digital configurado para executar o método, a uma mídia de armazenamento não transitório para inferir a atividade de uma via de sinalização celular Notch em um indivíduo, que armazena instruções que são executáveis por um dispositivo de processamento digital para executar o método, e a um programa de computador para inferir a atividade de uma via de sinalização celular Notch em um indivíduo, que compreende meios de código de programa para fazer com que um dispositivo de processamento digital execute o método, quando o programa de computador for executado no dispositivo de processamento digital.
[155] O método pode ser usado, por exemplo, no diagnóstico de uma atividade (anormal) da via de sinalização celular Notch, no prognóstico baseado na atividade inferida da via de sinalização celular Notch, na inscrição de um indivíduo em um teste clínico com base na atividade inferida da via de sinalização celular Notch, na seleção de um ou mais testes subsequentes a serem realizados, na seleção de testes diagnósticos complementares, em sistemas de suporte a decisões clínicas ou similares. Nesse sentido, é feita referência ao pedido de patente internacional publicado WO 2013/011479 A2 (“Assessment of cellular signaling pathway activity using probabilistic modeling of target gene expression”), ao pedido de patente internacional “publicado WO 2014/102668 A2 (“Assessment of cellular signaling pathway activity using linear combination(s) of target gene expressions”) e ao documento Verhaegh W. et al., “Selection of personalized patient therapy through the use of knowledge-based computational models that identify tumor-driving signal transduction pathways”, Cancer Research, Volume 74, Nº 11, 2014, páginas 2936 a 2945, que descrevem com mais detalhes essas aplicações.
Exemplo 4: Resultados adicionais para tecido de camundongo
[156] As rotas de transdução de sinal são frequentemente conservadas em diferentes espécies, tendo uma função similar e genes-alvo diretos similares. Contudo, os genes-alvo diretos não são exatamente os mesmos, e a sequência de DNA/MRNA do gene é, em geral, diferente entre espécies diferentes. A similaridade de sequência de genes (homologia) entre espécies depende da distância evolutiva entre essas espécies, por exemplo a diferença entre o camundongo e o ser humano é menor que a diferença entre o humano e o lagarto.
[157] Devido a essas semelhanças entre espécies, modelos de animais são frequentemente usados para estudar processos biológicos, como desenvolvimento (de órgãos/tecidos), divisão celular e doenças. O camundongo é um organismo de modelo popular devido à sua proximidade genética com os seres humanos. Um exemplo é o uso de modelos de camundongo para estudar distúrbios neurológicos, como a epilepsia e a doença de Alzheimer. Para tais distúrbios, é uma prática invasiva obter tecido humano (contrariamente ao câncer onde frequentemente uma biópsia do tumor é extraída de qualquer maneira) e foram desenvolvidos modelos de camundongo que imitam o distúrbio.
[158] Ser capaz de avaliar a atividade da rota de transdução de sinal em modelos de camundongo é muito útil, uma vez que isso nos diz algo sobre o estado funcional de células no tecido extraído. No caso de um modelo de camundongo de doença, a atividade da rota de transdução de sinal pode fornecer informações sobre a versão humana da doença, uma vez que esses modelos de camundongo são geralmente criados para refletir a doença humana da melhor maneira possível.
[159] O modelo de via de sinalização celular Notch foi originalmente desenvolvido para tecido humano, isto é, os genes-alvo selecionados nas Tabelas 1 a 3 são genes-alvo diretos no ser humano, a entrada para o modelo são os níveis de expressão de mRNA humano (por exemplo, obtidos a partir de micromatrizes, qPCR, ou experimentos de RNAseq), e a calibração é feita em os dados de expressão obtidos a partir de amostras humanas.
[160] Aqui, mostramos também um modelo de via de sinalização celular Notch para uso em camundongo. Selecionando-se genes-alvo diretos da via de sinalização celular Notch em camundongo e usando-se amostras de calibração adequadas (dados de micromatriz Affymetrix de uma base de dados pública), foi criado um modelo que usa os níveis de expressão de mRNA de camundongo como entrada e que infere a atividade da via de sinalização celular Notch a partir dessa entrada. O modelo foi então validado com o uso de amostras independentes (dados de micromatriz Affymetrix de uma base de dados pública) para mostrar que ele mede corretamente a atividade da via de sinalização celular Notch em camundongo.
[161] A seleção de genes-alvo diretos para o modelo de via de sinalização celular Notch para camundongo foi feita de maneira similar à descrita anteriormente. A lista de 26 genes utilizada para o modelo humano da via Notch foi usada como um ponto de partida. A lista foi classificada em termos de escore de evidência (que é calculado conforme descrito acima) e foi pesquisada na literatura o gene de classificação mais alta, com o uso de palavras-chave de busca como (“camundongo” e “gene-alvo direto”) e referências obtidas da literatura previamente consultada para genes-alvo diretos humanos.
[162] Primeiramente, foi confirmado que o gene realmente existe em camundongo e então foi confirmado que o gene era também um gene-alvo direto da via Notch em camundongo. Isso foi feito com o uso de evidências semelhantes usadas para os genes-alvo humanos (isto é, a presença de um sítio de ligação de complexo de fator de transcrição, evidências experimentais, como ChIP, ensaio de luciferase, expressão diferencial, tratamento com GSI, etc.). Se fossem encontradas múltiplas fontes de evidência, o gene seria aceito como sendo um gene-alvo direto de camundongo para a via Notch. Dessa maneira, foi feita uma seleção de 10 genes-alvo diretos para o modelo de camundongo da via Notch, conforme mostrado na Tabela 6.
Tabela 6: “Lista de 10 genes-alvo de camundongo” de genes-alvo da via Notch com base na lista organizada de evidências de genes-alvo da via Notch (da matriz Affymetrix Mouse Genome 430 2.0).
a [ass Dtx1 es — Es Hes5 e ss Sox9
[163] O modelo de camundongo da via Notch foi calibrado em amostras obtidas do conjunto de dados GSE15268, um conjunto de dados disponível publicamente junto à base de dados GEO (Gene Expression Omnibus). Esse conjunto de dados contém dados de micromatriz Affymetrix a partir de células estaminais embrionárias de camundongo com um construto induzível NotchIC (Domínio Intracelular Notch) (induzido pela adição de hidrotamoxifeno (OHT)). A partir desse conjunto de dados, 4 amostras, onde NotchIC não foi induzido, foram usadas como amostras inativas da via Notch (GSM381312, GSM381313, GSM381317, GSM381316) e 4 amostras, onde a via Notch foi induzida pela adição de OHT, foram usadas como amostras ativas da via Notch (GSM381324, GSM381325, GSM381320, GSM381321).
[164] O modelo de camundongo da via Notch calibrado foi então executado em vários conjuntos de dados: o conjunto de calibração e vários conjuntos de validação independentes, para mostrar que o modelo pode distinguir com sucesso amostras ativas de amostras inativas da via Notch. Esses resultados são mostrados nas Figuras 24 a 27.
[165] A Figura 24 mostra os resultados de calibração do modelo bayesiano com base na lista de 10 genes- alvo de camundongo da Tabela 6 e dos métodos aqui descritos com o uso de um conjunto de dados de expressões GSE15268, publicamente disponível contendo 2 células-tronco embrionárias de controle (“C ESC” na figura) 2 células progenitoras mesodermais de controle (“C MPC” na figura), 2 amostras de ESc contendo um construto NERT induzível de tamoxifeno (NotchIC), não tratadas com OHT (“NERT ESc, no OHT” na figura), 2 amostras de ESc contendo um construto NERT induzível de tamoxifeno (NotchIC), tratado com OHT (“NERT ESc, OHT” na figura), 4 amostras de MPc contendo um construto NERT induzível de tamoxifeno (NotchIC), não tratadas com OHT (“NERT MPc, no OHT” na figura) e 4 amostras de MPc contendo um construto NERT induzível de tamoxifeno (NotchIC), tratadas com OHT (“NERT MPc, OHT” na figura). O modelo foi capaz de separar claramente as amostras de calibração inativas (ESc de controle e MPc de controle) das amostras de calibração ativas (NERT MPc, OHT). As outras amostras no conjunto de dados também foram separadas corretamente (vide também Meier-Stiegen F. et al. “Activated Notchl Target Genes during Embryonic Cell Differentiation Depend on the Cellular Context and Include Lineage Determinants and Inhibitors”, PLoS One, Vol. 5, nº 7, julho de 2010).
[166] A Figura 25 mostra previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista de 10 genes-alvo de camundongo da Tabela 6 nas glândulas mamárias de camundongo com um domínio intracelular Notchl (NICD1) induzível constitutivamente ativo (conjunto de dados GSE5S1628). Para amostras de glândulas mamárias onde NICD1 não foi induzido (“M 9” na figura), o modelo de camundongo da via Notch (10 genes-alvo) detectou baixa atividade da via Notch. Como esperado, as amostras de glândulas mamárias onde NICD1 foi induzido com o uso de doxiciclina corretamente (“M 9, NICDIl a” na figura) mostra uma atividade da via Notch significativamente mais alta. Os pontos no tempo equivalentes a 48 horas e 96 horas foram combinados na figura (vide também Abravanel D.L. et al. “Notch promotes recurrence of dormant tumor cells following HER2/neu-targeted therapy”, Journal of Clinical Investigation, Vol. 125, nº 6, junho de 2015, páginas 2484 a 2496).
[167] A Figura 26 mostra previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista de 10 genes-alvo de camundongo da Tabela 6 em tecido de saco vitelino de camundongo com um sistema transgênico condicional para ativar Notchl e tecido de saco vitelino de camundongo obtido de camundongo transgênico com perda de função de RBPJ
(parte do complexo de fator de transcrição Notch) (conjunto de dados GSE22418). Ambas as amostras tipo selvagem (“W t” na figura) e as amostras de perda de função RBPJ (“RBPJ l-o-f” na figura) mostram baixa atividade da via Notch, e as amostras extraídas de tecido de saco vitelino onde Notchl é ativado (“Notchl a” na figura) mostram elevada atividade da via Notch, conforme esperado (vide também Copeland J.N. et al. “Notch signaling regulates remodeling and vessel diameter in the extraembryonic yolk sac”, BMC Developmental Biology, fevereiro de 2011).
[168] A Figura 27 mostra previsões da atividade da via de sinalização celular Notch do modelo de rede bayesiana exemplificadora treinado com o uso da lista de 10 genes-alvo de camundongo da Tabela 6 em células da medula óssea de camundongo (progenitoras mielo eritroide adultas) com um ganho condicional de função de alelo do receptor Notch2 (conjunto de dados GSE46724). O modelo de camundongo da via Notch (10 genes-alvo) calcula corretamente a atividade mais alta da via Notch para as amostras ICN2 positivas (IntraCellular Notch2) (“ICN2 p” na figura), em comparação com as amostras ICN2 negativas (“ICN2 p” na figura) (vide também Oh P. et al. “In vivo mapping of notch pathway activity in normal and stress hematopoiesis”, Cell Stem Cell, Vol. 13, nº 1, agosto de 2013, páginas 190 a 204).
Exemplo 5: Informações adicionais para ilustrar a presente invenção (1) Medição de níveis de expressão de genes
[169] Os dados derivados do conjunto exclusivo de genes-alvo aqui descritos são usados adicionalmente para inferir uma atividade da via de sinalização celular Notch com o uso dos métodos descritos no presente documento.
[170] De modo geral, são conhecidos métodos para análise de níveis de expressão de genes em amostras extraídas. Por exemplo, métodos como Northern blot, o uso de PCR, PCR aninhada, PCR em tempo real quantitativa (qPCR), RNA-seqgq, Ou micromatrizes (microarranjos) podem todos ser usados para obter dados de níveis de expressão de genes. A presente revelação contempla todos os métodos conhecidos na técnica para analisar a expressão gênica dos genes-alvo.
[171] Os métodos de determinação do produto de expressão de um gene com o uso de técnicas baseadas em PCR podem ser particularmente úteis. Para quantificar o nível de expressão gênica com o uso da PCR, a quantidade de cada produto de PCR de interesse é tipicamente estimada usando-se PCR em tempo real quantitativa (qPCR) convencional para medir o acúmulo de produtos de PCR em tempo real após cada ciclo de amplificação. Essa técnica usa, tipicamente, um repórter detectável como um corante intercalante, corante de ligação de sulcos menores, Ou sonda fluorogênica pela qual a aplicação de luz excita o repórter até exibir fluorescência e a fluorescência resultante é tipicamente detectada com o uso de uma câmera CCD ou sistema de detecção fotomultiplicador, como aquele revelado na patente US nº 6.713.297, a qual está aqui incorporada em sua totalidade a título de referência.
[172] Em algumas modalidades, as sondas usadas na detecção de produtos de PCR no ensaio de PCR em tempo real quantitativa (qPCR) podem incluir um marcador fluorescente. Existem inúmeros marcadores fluorescentes comercialmente disponíveis. Por exemplo, a Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR, EUA) comercializa uma ampla variedade de corantes fluorescentes. Exemplos não limitadores incluem Cy5, Cy3,
TAMRA, R6G, R110, ROX, JOE, FAM, Texas Red", e Oregon Green*". Exemplos adicionais de marcadores fluorescentes podem incluir sondas de duplo “quencher” IDT ZEN com sondas de hidrólise 5' tradicionais em ensaios de qPCR. Essas sondas podem conter, por exemplo, um corante 5' FAM com um “quencher” 3" TAMRA, um “quencher”3'” Black Hole (BHQ, Biosearch Technologies), ou um “quencher” ZEN interno e um “quencher” 3 TITowa Black Fluorescent (IBFQ).
[173] Os corantes fluorescentes úteis de acordo com a invenção podem ser ligados aos iniciadores de oligonucleotídeos usando-se métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, uma maneira comum de adicionar um marcador fluorescente a um oligonucleotídeo é fazer reagir um éster de N-hidróxi succínico (NHS) do corante com um grupo amino reativo no alvo. Os nucleotídeos podem ser modificados para transportar um grupo amino reativo mediante, por exemplo, a inclusão de um grupo alilamina na base nucleica. A marcação através de alilamina é descrita, por exemplo, nas patentes US nºs 5.476.928 e
5.958.691, as quais estão aqui incorporadas em sua totalidade a título de referência. Outros meios de marcar de forma fluorescente nucleotídeos, oligonucleotídeos e polinucleotídeos são bem conhecidos pelos versados na técnica.
[174] Outras abordagens fluorogênicas incluem o uso de sistemas de detecção genérica como corante SYBR Green, que exibe fluorescência quando intercalado com o DNA amplificado do produto de qualquer expressão de genes, conforme revelado nas patentes US nºs 5.436.134 e 5.658.751, as quais estão aqui incorporadas em sua totalidade a título de referência.
[175] Um outro método útil para determinar níveis de expressão de genes-alvo inclui RNA-seq, uma poderosa ferramenta analítica usada para análises de transcriptoma, incluindo a diferença de níveis de expressão de genes entre condições fisiológicas diferentes, ou alterações que ocorrem durante o desenvolvimento ou ao longo do curso da progressão da doença.
[176] Outra abordagem para determinar níveis de expressão de genes inclui o uso de micromatrizes, por exemplo, micromatriz de RNA e DNA, que são bem conhecidas na técnica. As micromatrizes podem ser usadas para quantificar a expressão de um número grande de genes simultaneamente.
(2) Fluxo de trabalho generalizado para determinar a atividade de sinalização celular Notch
[177] Um fluxograma que ilustra de modo exemplificador um processo para inferir a atividade de sinalização celular Notch a partir de uma amostra isolada de um indivíduo é mostrado na Figura 3. Primeiramente, o mMRNA de uma amostra é isolado (11). Segundo, os níveis de expressão de mRNA de um conjunto único de pelo menos cinco ou mais genes-alvo Notch, conforme descrito no presente documento, são medidos (12) com uso de métodos para medir a expressão de gene que são conhecidos na técnica. Na sequência, determina- se um nível de atividade de um elemento de fator de transcrição (TF) (13) da via Notch com o uso de um modelo matemático calibrado de via de sinalização (14) que relaciona os níveis de expressão dos cinco ou mais genes-alvo com o nível de atividade do elemento de TF da via Notch. Finalmente, a atividade da via de sinalização celular adicional no indivíduo é inferida (15) com base no nível de atividade determinado do elemento de TF na amostra do indivíduo. Por exemplo, a via de sinalização celular Notch é determinada para ser ativa se a atividade estiver acima de um certo limiar e pode ser categorizada como passiva se a atividade cair abaixo de um certo limiar.
(3) Modelo de via de sinalização matemático calibrado
[178] Conforme contemplado no presente documento, os níveis de expressão do conjunto único de cinco ou mais genes- alvo da via Notch descritos no presente documento são usados para determinar um nível de atividade de um elemento de TF da via Notch com uso de um modelo de via de sinalização matemático calibrado, conforme descrito adicionalmente no presente documento. O modelo de via de sinalização matemático calibrado relaciona os níveis de expressão dos cinco ou mais genes-alvo da via Notch ao nível de atividade do elemento de TF da via Notch.
[179] Conforme contemplado no presente documento, o modelo de via de sinalização matemático calibrado é baseado na aplicação de um modelo matemático de via de sinalização. Por exemplo, o modelo de via de sinalização matemático calibrado pode ser baseado em um modelo probabilístico, por exemplo, um modelo de rede bayesiana ou um modelo linear ou pseudolinear.
[180] Em uma modalidade, o modelo de via de sinalização matemático calibrado é um modelo probabilístico que incorpora relações probabilísticas condicionais em relação ao elemento de TF da via Notch e aos níveis de expressão dos cinco ou mais genes-alvo da via Notch. Em uma modalidade, o modelo probabilístico é um modelo de rede bayesiana.
[181] Em uma modalidade alternativa, Oo modelo de via de sinalização matemático calibrado pode ser um modelo linear ou pseudolinear. Em uma modalidade, o modelo linear ou pseudolinear é um modelo de combinação linear ou pseudolinear, conforme descrito adicionalmente no presente documento.
[182] Um fluxograma que ilustra de modo exemplificador um processo para gerar um modelo de via de sinalização matemático calibrado é mostrado na Figura 4. Como etapa inicial, os dados de treinamento para os níveis de expressão de mRNA são coletados e normalizados. Os dados podem ser coletados com uso de, por exemplo, intensidades de conjunto de sondas de micromatriz (101), valores de Cq de PCR em tempo real (102), leituras de sequência de RNA bruta (103) ou modalidades de medição alternativa (104) conhecidas na técnica. Os dados de nível de expressão bruta podem ser, então, normalizados para cada método, respectivamente, por normalização com uso de um algoritmo de normalização, por exemplo, análise de múltiplas matrizes robusta congelada (fRMA, de “frozen Robust Multiarray Analysis”) ou MAS5.0 (111), normalização para Cq médio de genes de referência (112), normalização de leituras em leituras/fragmentos por quilobase de transcrito por milhão de leituras mapeadas (RPKM/FPKM) (113), ou normalização em relação a genes de referência/proteínas (114). Esse procedimento de normalização leva a uma intensidade de conjunto de sondas normalizada (121), valores de Cq normalizados (122), RPKM/FPKM normalizada (123) ou medição normalizada (124) para cada método, respectivamente, o que indica níveis de expressão de gene-alvo dentro das amostras de treino.
[183] Uma vez que os dados de treinamento foram normalizados, uma ID ou IDs de amostra de treino (131) é obtida e os dados de treinamento dessas amostras específicas são obtidos a partir de um dentre os métodos para determinar a expressão de gene (132). A expressão de gene final resulta a partir da emissão da amostra de treino como dados de treinamento (133). Todos os dados de várias amostras de treino são incorporados para calibrar o modelo (incluindo, por exemplo, limiares, CPTs, por exemplo, no caso da probabilística ou rede bayesiana, pesos, por exemplo, no caso do modelo linear ou pseudolinear etc.) (144). Além disso, os genes-alvo da via e os nós de medição (141) são usados para gerar a estrutura de modelo, por exemplo, conforme descrito na Figura 2 (142). A estrutura de modelo resultante (143) da via é, então, incorporada aos dados de treinamento (133) para calibrar o modelo (144), em que os níveis de expressão de gene dos genes-alvo são indicativos do fator de atividade de elemento de transcrição. Como resultado da determinação de elemento de TF nas amostras de treino, é gerado um modelo de via calibrado (145), que atribui a atividade da via de sinalização celular Notch a uma amostra de interesse subsequentemente examinada, por exemplo, de um indivíduo com um câncer, com base nos níveis de expressão de gene-alvo nas amostras de treino.
(4) Determinação de elemento de TF
[184] Um fluxograma que ilustra de modo exemplificador um processo para determinar um nível de atividade de um elemento de TF é mostrado na Figura 5. Os dados de nível de expressão (dados de teste) (163) de uma amostra extraída de um indivíduo são inseridos no modelo de via de sinalização matemático calibrado (145). O modelo de via de sinalização matemático pode ser um modelo probabilístico, por exemplo, um modelo de rede bayesiana, um modelo linear ou um modelo pseudolinear.
[185] O modelo de via de sinalização matemático pode ser um modelo probabilístico, por exemplo, um modelo de rede bayesiana, baseado em probabilidades condicionais que relacionam o elemento de TF da via Notch e níveis de expressão dos cinco ou mais genes-alvo da via de sinalização celular Notch medidos na amostra do indivíduo, ou o modelo matemático pode ser baseado em uma ou mais combinação (ou combinações) linear de níveis de expressão dos cinco ou mais genes-alvo da via de sinalização celular Notch medidos na amostra do indivíduo. Em particular, a determinação da atividade da via de sinalização celular Notch pode ser realizada conforme revelado no pedido de patente internacional publicado WO 2013/011479 A2 (“Assessment of cellular signaling pathway activity using probabilistic modeling of target gene expression”), cujo conteúdo é incorporado ao presente documento, em sua totalidade. Brevemente, os dados são inseridos em uma chamada de motor de interferência de rede bayesiana (BN) (por exemplo, uma caixa de ferramentas ENT) (154). Isso leva a um conjunto de valores pra as probabilidades de BN marginal calculadas de todos os nós no BN (155). A partir dessas probabilidades, a probabilidade de nó de fator de transcrição (TF) (156) é determinada e estabelece o nível de atividade do elemento de TF (157).
[186] Alternativamente, o modelo matemático pode ser um modelo linear. Por exemplo, um modelo linear pode ser usado conforme descrito no pedido de patente internacional publicado WO 2014/102668 A2 (“Assessment of cellular signaling pathway activity using linear combination(s) of target gene expressions”), cujo conteúdo é incorporado ao presente documento, em sua totalidade. Os detalhes adicionais em relação ao cálculo/determinação de atividade de via de sinalização celular com uso de modelagem matemática de expressão de gene-alvo também podem ser encontrados em Verhaegh W. et al., “Selection of personalized patient therapy through the use of knowledge-based computational models that identify tumor-driving signal transduction pathways”, Cancer Research, Volume 74, nº 11, 2014, páginas 2936 a 2945. Brevemente, os dados são inseridos em um escore de combinação linear ponderada calculado (w/c) (151). Isso leva a um conjunto de valores para o escore de combinação linear ponderada calculado (152). A partir desses escores de combinação linear ponderada, o escore de combinação linear ponderada do nó de fator de transcrição (TF) (153) é determinado e estabelece o nível de atividade de elemento do TF (157).
(5) Procedimento para parâmetros detectáveis discretizados
[187] Um fluxograma que ilustra de modo exemplificador um processo para inferir a atividade de uma via de sinalização celular Notch em um indivíduo como um parâmetro detectável discretizado é mostrado na Figura 6. Primeiro, a amostra de teste é extraída e obtém uma ID de amostra de teste (161). A seguir, os dados de teste para os níveis de expressão de mRNA são coletados e normalizados (162). Os dados de teste podem ser coletados com uso dos mesmos métodos conforme discutido para as amostras de treino na Figura 5, com uso de intensidades de conjunto de sondas de micromatriz (101), valores de Cq de PCR em tempo real (102), leituras de sequência de RNA bruta (103)
ou modalidades de medição alternativa (104). Os dados de nível de expressão bruta podem ser, então, normalizados para cada método, respectivamente, por normalização com uso de um algoritmo, por exemplo, fRMA ou MAS5.0 (111), normalização para Cq médio de genes de referência (112), normalização de leituras em RPKM/FPKM (113) e normalização em relação a genes de referência/proteínas (114). Esse procedimento de normalização leva a uma intensidade de conjunto de sondas normalizada (121), valores de Cq normalizados (122), RPKM/FPKM normalizada (123) ou medição normalizada (124) para cada método, respectivamente.
[188] Uma vez que os dados de teste foram normalizados, os dados de teste resultantes (163) são analisados em uma etapa de impor limiar (164) com base no modelo de via de sinalização matemático calibrado (145), resultando nos dados de teste com limiar (165). No uso parâmetros detectáveis discretos, em um exemplo não limitador, toda expressão acima de um certo limiar é, por exemplo, dado um valor de 1 e a valores abaixo do limiar são dados um valor de 0, ou em uma modalidade alternativa, a massa de probabilidade acima do limiar, conforme descrito no presente documento, é usada como um valor de limiar. Com base no modelo de via de sinalização matemático calibrado, esse valor representa o nível de atividade do elemento de TF (157), que é, então, usado para calcular a atividade da via de sinalização celular (171). A emissão final gera a atividade da via de sinalização celular (172) no indivíduo.
(6) Procedimento para parâmetros detectáveis contínuos
[189] Um fluxograma que ilustra de modo exemplificador um processo para inferir a atividade de uma via de sinalização celular Notch em um indivíduo como um parâmetro detectável contínuo é mostrado na Figura 7. Primeiro, a amostra de teste é extraída e obtém uma ID de amostra de teste (161). A seguir, os dados de teste para os níveis de expressão de mRNA são coletados e normalizados (162). Os dados de teste podem ser coletados com uso dos mesmos métodos conforme discutido para as amostras de treino na Figura 5, com uso de intensidades de conjunto de sondas de micromatriz (101), valores de Cq de PCR em tempo real (102), leituras de sequência de RNA bruta (103) ou modalidades de medição alternativa (104). Os dados de nível de expressão bruta podem ser, então, normalizados para cada método, respectivamente, por normalização com uso de um algoritmo, por exemplo, fRMA (111), normalização para Cq médio de genes de referência (112), normalização de leituras em RPKM/FPKM (113) e normalização em relação a genes de referência/proteínas (114). Esse procedimento de normalização leva a uma intensidade de conjunto de sondas normalizada (121) valores de Cq normalizados (122), RPKM/FPKM normalizada (123) ou medição normalizada (124) para cada método, respectivamente.
[190] Uma vez que os dados de teste foram normalizados, os dados de teste resultantes (163) são analisados no modelo de via de sinalização matemático calibrado (145). No uso de parâmetros detectáveis contínuos, como exemplo não limitador, os níveis de expressão são convertidos para valores entre 0 e 1 com uso de uma função sigmoide, conforme descrito em detalhes adicionais no presente documento. A determinação de elemento de TF, conforme descrito no presente documento, é usada para interpretar os dados de teste em combinação com o modelo de via de sinalização matemático calibrado, em que o valor resultante representa o nível de atividade do elemento de TF (157), que é, então, usado para calcular a atividade da via de sinalização celular (171). A emissão final gera a atividade da via de sinalização celular (172) no indivíduo.
(7) Procedimento de determinação do nível de expressão de genes
[191] A Figura 8 mostra um fluxograma que ilustra, de forma exemplificadora, um processo para determinar níveis de expressão de genes-alvo a partir de uma amostra extraída de um indivíduo. Em uma modalidade exemplificadora, as amostras são recebidas e registradas em um laboratório. As amostras podem incluir, por exemplo, amostras fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE) (181) ou amostras congeladas frescas (FF) (180). As amostras FF podem ser lisadas diretamente (183). Para amostras FFPE, a parafina pode ser removida com uma etapa de incubação aquecida mediante adição de Proteínase K (182). As células são então lisadas (183), processo que destrói a célula e as membranas nucleares disponibilizando o ácido nucleico (NA) para processamento adicional. O ácido nucleico é ligado a uma fase sólida (184) que poderia, por exemplo, ser partículas ou um filtro. O ácido nucleico é, então, lavado com tampões de lavagem para remover todos os resíduos de célula que possam ainda estar presentes após a lise (185). O ácido nucleico limpo é, então, separado da fase sólida com um tampão de eluição (186). O DNA é removido por tratamento de DNAse para assegurar que apenas RNA está presente na amostra (187). A amostra de ácido nucleico pode, então, ser usada diretamente na mistura de amostras de RT-qPCR (188). A mistura de amostras RT-qPCR contém a amostra de RNA, a enzima RT para preparar o cDNA obtido da amostra RNA e uma enzima PCR para amplificar o cDNA, uma solução tampão para assegurar o funcionamento das enzimas, e pode conter potencialmente água de grau molecular para definir um volume de concentração fixo. A mistura de amostras pode, então, ser adicionada a uma microplaca de múltiplos poços (isto é, uma microplaca de 96 poços ou de 384 poços) que contém ensaios de RT-qgPCR secos (189). A RT-qPCR pode, então, ser realizada em uma máquina de PCR de acordo com um protocolo especificado (190). Um exemplo de protocolo de PCR inclui i) 30 minutos a 50ºC; ii) minutos a 95ºC; iii) 15 segundos a 95ºC; iv) 45 segundos a 60ºC; v) 50 ciclos de repetição das etapas iii e iv. Os valores de Cq são, então, determinados com os dados brutos com o uso do método de segunda derivada (191). Os valores de Cq são exportados para análise (192).
(8) Doenças e distúrbios mediados pela via Notch e métodos de tratamento
[192] Conforme contemplado no presente documento, os métodos e aparelhos da presente invenção podem ser utilizados para avaliar a atividade da via de sinalização celular Notch em um indivíduo, por exemplo, um indivíduo com suspeita de ter ou que tem uma doença ou distúrbio em que o estado da via de sinalização Notch é probatória, total ou parcialmente, de presença ou de progressão de doença. Em uma modalidade, a presente invenção revela um método para tratar um indivíduo, em que o método compreende receber informações referentes ao estado de atividade de uma via de sinalização celular Notch derivada de uma amostra extraída do indivíduo com uso dos métodos aqui descritos, e administrar ao indivíduo um inibidor da via Notch caso as informações sobre a atividade da via de sinalização celular Notch sejam indicativas de uma via de sinalização Notch ativa. Em uma modalidade particular,
a indicação de atividade de via de sinalização celular Notch é definida em um valor de corte de chances da via de sinalização celular Notch ser ativada de 10:1, 5:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4, 1:5, 1:10.
[193] Os inibidores da via Notch que podem ser usados na presente invenção são bem conhecidos. Exemplos de inibidores da via Notch incluem, mas não se limitam a, DAPT, PF-03084014, MK-0752, RO-4929097, LY450139, BMS-708163, LY3039478, IMR-1, Dibenzoacepina, LY411575, FLI-O6.
[194] A via Notch desempenha uma função em um grande número de doenças, e notavelmente em diferentes tipos de neoplasias, por exemplo, carcinomas, sarcomas e malignidades hematológicas, doenças mediadas pelo sistema imunológico, doenças degenerativas, doenças inflamatórias, doenças infecciosas. Estes podem ser categorizados de acordo com o órgão ou tecido derivado da linhagem embrionária em que eles ocorrem principalmente, por exemplo, cérebro, mama, pele, esôfago, trato gastrointestinal, sangue (hematológico), ovário, etc.
[195] Em uma modalidade particular, o indivíduo está sofrendo, ou suspeita-se estar sofrendo, de um câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer pancreático, câncer cerebral, câncer hematológico, câncer de ovário. Em uma modalidade particular, o indivíduo está sofrendo, ou suspeita- se estar sofrendo, de um câncer de mama.
[196] Em outra modalidade particular, o indivíduo está sofrendo, ou suspeita-se estar sofrendo, de um câncer cerebral ou de um câncer neuroblastoma. Em ainda outra modalidade particular, o indivíduo está sofrendo, ou suspeita-se estar sofrendo, de um câncer hematológico ou de leucemia linfoblástica de células T.
[197] Este pedido descreve várias modalidades preferenciais. Modificações e alterações podem ocorrer a outros após a leitura e o entendimento da descrição detalhada acima. A intenção é de que o pedido seja interpretado com incluindo todas essas modificações e alterações na medida em que as mesmas estejam contidas no escopo das reivindicações anexas ou equivalentes das mesmas.
[198] Outras variações às modalidades reveladas podem ser compreendidas e executadas pelos versados na técnica ao praticar a invenção reivindicada, a partir de um estudo dos desenhos, da revelação e das reivindicações anexas.
[199] Nas reivindicações, a expressão “que compreende” não exclui outros elementos ou outras etapas, e o artigo indefinido “um” ou “uma” não exclui uma pluralidade.
[200] Uma unidade ou um dispositivo único pode exercer as funções de vários itens mencionados nas reivindicações. O simples fato de certas medidas serem mencionadas em reivindicações dependentes mutuamente diferentes não indica que uma combinação dessas medidas não possa ser usada com vantagem.
[201] Cálculos, como a determinação do escore de risco, feitos por uma ou por várias unidades ou dispositivos podem ser feitos por qualquer outro número de unidades ou dispositivos.
[202] Um programa de computador pode ser armazenado/distribuído em uma mídia adequada, como uma mídia de armazenamento óptico ou uma mídia de estado sólido, fornecida juntamente com outro hardware, ou como parte do mesmo, porém pode também ser distribuído de outras formas,
como através da Internet ou outros sistemas de telecomunicação com ou sem fio.
Exemplo 5: Listagens de sequência usadas no pedido Listagem de sequência: seq. nº Gene: Sega. 1 CD28 Seq. 2 CD44 seg. 3 DLGAP5 Seq. 4 DTX1 Seq. 5 EPHB3 Seq. 6 FABP7 seq. 7 GFAP Seq. 8 GIMAP5 Seq. 9 HES1 Sega. 10 HES4 Seq. 11 HES5 Seq. 12 HES7 seq. 13 HEY1 Seq. 14 HEY2 Seq. 15 HEYL Seq. 16 KLF5 Sega. 17 MYC Seq. 18 NFKB2 Seq. 19 NOX1 Seq. 20 NRARP Seq. 21 PBX1 Seq. 22 PINl Seq. 23 PLXND1 Seq. 24 PTCRA Seq. 25 SOX9

Claims (12)

REIVINDICAÇÕES
1. MÉTODO IMPLEMENTADO POR COMPUTADOR PARA INFERIR
A ATIVIDADE DE UMA VIA DE SINALIZAÇÃO CELULAR NOTCH EM UM INDIVÍDUO, executado por um dispositivo de processamento digital, sendo o método caracterizado pela inferência compreender: receber níveis de expressão de cinco ou mais genes- alvo da via de sinalização celular Notch medidos em uma amostra do indivíduo, determinar um nível de atividade de um elemento de fator de transcrição (TF) da via Notch na amostra do indivíduo, em que o elemento de TF da via Notch controla a transcrição dos cinco ou mais genes-alvo da via Notch, sendo que a determinação tem por base a avaliação de um modelo de via de sinalização matemático calibrado que relaciona os níveis de expressão dos três ou mais genes-alvo da via Notch ao nível de atividade do elemento de TF da via Notch, e inferir a atividade da via de sinalização celular Notch no indivíduo com base no nível de atividade determinado do elemento de TF da via Notch na amostra do indivíduo, sendo que os cinco ou mais genes-alvo da via Notch são selecionados do grupo que consiste em: DTX1, EPHB3, HES1, HES4, HES5, HEY2, MYC, NFKB2, NRARP, PINl, PLXND1l e SOX9, sendo que dois ou mais genes-alvo da via Notch são selecionados do grupo que consiste em: DTX1, HESl, HES4, HES5, HEY2, MYC e NRARP, e três ou mais genes-alvo da via Notch são selecionados do grupo que consiste em: EPHB3, NFKB2, PINl, PLXND1 e SOX9.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente:
determinar se a via de sinalização celular Notch opera de modo irregular no indivíduo, com base na atividade inferida da via de sinalização celular Notch no indivíduo.
3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender adicionalmente: recomendar a prescrição, ao paciente, de um medicamento que corrige a operação anormal da via de sinalização celular Notch, sendo que a recomendação é feita se for determinado que a via de sinalização celular Notch está funcionando de forma anormal com base na atividade inferida da via de sinalização celular Notch.
4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 3, caracterizada pela operação anormal da via de sinalização celular Notch ser uma operação na qual a via de sinalização celular Notch funciona como um promotor de tumor no indivíduo.
5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, sendo o método caracterizado por ser usado em pelo menos uma das seguintes atividades: diagnóstico com base na atividade inferida da via de sinalização celular Notch no indivíduo; prognóstico com base na atividade inferida da via de sinalização celular Notch no indivíduo; prescrição de medicamento com base na atividade inferida da via de sinalização celular Notch no indivíduo; previsão de eficácia do medicamento com base na atividade inferida da via de sinalização celular Notch no indivíduo;
previsão de efeitos adversos com base na atividade inferida da via de sinalização celular Notch no indivíduo; monitoramento de eficácia do medicamento; desenvolvimento do medicamento; desenvolvimento do ensaio; pesquisa de via; estadiamento de câncer; inscrição do indivíduo em um teste clínico com base na atividade inferida da via de sinalização celular Notch no indivíduo; seleção de teste subsequente a ser realizado; e seleção de testes de diagnóstico complementar.
6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo modelo de via de sinalização matemático calibrado ser um modelo probabilístico, de preferência, um modelo de rede bayesiana, baseado em probabilidades condicionais que relacionam o nível de atividade do elemento de TF da via Notch e os níveis de expressão dos três ou mais genes-alvo da via Notch, ou pelo modelo de via de sinalização matemático ser baseado em uma ou mais combinações lineares dos níveis de expressão dos três ou mais genes-alvo da via Notch.
7. APARELHO PARA INFERIR A ATIVIDADE DE UMA VIA DE SINALIZAÇÃO CELULAR NOTCH EM UM INDIVÍDUO, sendo o aparelho caracterizado por compreender um processador digital configurado para executar o método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
8. MÍDIA DE ARMAZENAMENTO NÃO TRANSITÓRIO PARA INFERIR
A ATIVIDADE DE UMA VIA DE SINALIZAÇÃO CELULAR NOTCH EM UM INDIVÍDUO, caracterizada por armazenar instruções que são executáveis por um dispositivo de processamento digital para executar o método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
9. PROGRAMA DE COMPUTADOR PARA INFERIR A ATIVIDADE DE UMA VIA DE SINALIZAÇÃO CELULAR NOTCH EM UM INDIVÍDUO, sendo o programa de computador caracterizado por compreender meios de código de programa para fazer com que um dispositivo de processamento digital execute o método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, quando o programa de computador for executado no dispositivo de processamento digital.
10. KIT PARA MEDIR NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE CINCO OU MAIS GENES-ALVO DA VIA DE SINALIZAÇÃO CELULAR NOTCH EM UMA AMOSTRA DE UM INDIVÍDUO, sendo o kit caracterizado por compreender: iniciadores da reação em cadeia da polimerase direcionados aos três ou mais genes-alvo da via Notch, sondas direcionadas aos cinco ou mais genes-alvo da via Notch, e o aparelho conforme definido na reivindicação 7, a mídia de armazenamento não transitório conforme definida na reivindicação 8, ou o programa de computador conforme definido na reivindicação 9, sendo que os cinco ou mais genes-alvo da via Notch são selecionados do grupo que consiste em: DTX1, EPHB3, HES1l, HES4, HES5, HEY2, MYC, NFKB2, NRARP, PIN1, PLXND1 e SOX9, sendo que dois ou mais genes-alvo da via Notch são selecionados do grupo que consiste em: DTX1, HES1l, HES4, HES5, HEY2, MYC e NRARP, e três ou mais genes-alvo da via Notch são selecionados do grupo que consiste em: EPHB3, NFKB2, PINl, PLXND1 e SOX9.
11. KIT PARA INFERIR A ATIVIDADE DE UMA VIA DE SINALIZAÇÃO CELULAR NOTCH EM UM INDIVÍDUO, sendo o kit caracterizado por compreender: um ou mais componentes para determinar níveis de expressão de cinco ou mais genes-alvo da via de sinalização celular Notch em uma amostra do indivíduo, e o aparelho conforme definido na reivindicação 7, a mídia de armazenamento não transitório conforme definida na reivindicação 8, ou o programa de computador conforme definido na reivindicação 9, sendo que o um ou mais componentes são, de preferência, selecionados do grupo que consiste em: uma micromatriz de DNA, uma micromatriz de oligonucleotídeo, uma micromatriz de proteína, um anticorpo, uma pluralidade de sondas, por exemplo, sondas “marcadas, um conjunto de componentes de sequenciamento de transcriptase reversa de RNA, e/ou iniciadores (“primers”) de amplificação de RNA ou DNA, incluindo cDNA, sendo que os cinco ou mais genes-alvo da via Notch são selecionados do grupo que consiste em: DTX1, EPHB3, HES1l, HES4, HES5, HEY2, MYC, NFKB2, NRARP, PINl, PLXND1 e SOX9, sendo que dois ou mais genes-alvo da via Notch são selecionados do grupo que consiste em: DTXl1, HESl, HES4, HES5, HEY2, MYC e NRARP, e três ou mais genes-alvo da via Notch são selecionados do grupo que consiste em: EPHB3, NFKB2, PINl, PLXND1 e SOX9.
12. USO DO KIT, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 10 ou 11, caracterizado por se destinar a executar o método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
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